特表 2023-524573 ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合する単一ドメイン抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-12

(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合する単一ドメイン抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230605BHJP

   C07K 16/10 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230605BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230605BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20230605BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230605BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230605BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230605BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20230605BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230605BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/10

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12Q1/70

C12M1/34 B

C12M1/34 F

A61P31/14

A61K39/395 N

A61K39/395 D

G01N33/569 L

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022567557

(86)(22)【出願日】2021-05-04

(85)【翻訳文提出日】2023-01-04

(86)【国際出願番号】 GB2021051069

(87)【国際公開番号】W WO2021224606

(87)【国際公開日】2021-11-11

(31)【優先権主張番号】2006589.2

(32)【優先日】2020-05-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2010861.9

(32)【優先日】2020-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 刊行物名・巻数／Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７ 発行年月日／令和２年７月１３日

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522432435

【氏名又は名称】ザ・ロザリンド・フランクリン・インスティテュート

(71)【出願人】

【識別番号】516348474

【氏名又は名称】ダイアモンド ライト ソース リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】507226592

【氏名又は名称】オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100187540

【弁理士】

【氏名又は名称】國枝 由紀子

(72)【発明者】

【氏名】フオ，ジアーンドーン

(72)【発明者】

【氏名】オーウェンス，レイモンド

(72)【発明者】

【氏名】ナイスミス，ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】スチュアート，デビッド

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB13

4B029BB17

4B029FA05

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ10

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR72

4B063QR79

4B063QS33

4B063QX01

4B063QX02

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA15

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA29

4H045EA53

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする改善された単一ドメイン抗体、コロナウイルスの治療及び／又は予防における前記単一ドメイン抗体の使用、並びに様々な方法、アッセイ及びキットを使用するコロナウイルスの検出及び診断における前記単一ドメイン抗体の使用に関する。
【選択図】図５Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、及び６０からなる群から選択される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体であって、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、０～７個のアミノ酸修飾を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項2】

単一抗体ドメインが、
（ａ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号３を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号５を含むＣＤＲ２及び配列番号６を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号８を含むＣＤＲ２及び配列番号９を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１を含むＣＤＲ２及び配列番号１２を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号１４を含むＣＤＲ２及び配列番号１５を含むＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号１７を含むＣＤＲ２及び配列番号１８を含むＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号２０を含むＣＤＲ２及び配列番号２１を含むＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号２３を含むＣＤＲ２及び配列番号２４を含むＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号２６を含むＣＤＲ２及び配列番号２７を含むＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号２９を含むＣＤＲ２及び配列番号３０を含むＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号３２を含むＣＤＲ２及び配列番号３３を含むＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号３５を含むＣＤＲ２及び配列番号３６を含むＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号３８を含むＣＤＲ２及び配列番号３９を含むＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｏ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｐ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｒ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４５を含むＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４６を含むＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４７を含むＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４８を含むＣＤＲ３；
（ｗ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４９を含むＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５０を含むＣＤＲ３；
（ｙ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５１を含むＣＤＲ３；
（ｚ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５２を含むＣＤＲ３；
（ａａ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５３を含むＣＤＲ３；
（ｂｂ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５４を含むＣＤＲ３；
（ｃｃ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５５を含むＣＤＲ３；
（ｄｄ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５６を含むＣＤＲ３；
（ｅｅ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５７を含むＣＤＲ３；
（ｆｆ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５８を含むＣＤＲ３；
（ｇｇ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５９を含むＣＤＲ３；
（ｈｈ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号６０を含むＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、０～４個のアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項3】

単一抗体ドメインが、
（ａ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号３を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号４を含むＣＤＲ１、配列番号５を含むＣＤＲ２及び配列番号６を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号７を含むＣＤＲ１、配列番号８を含むＣＤＲ２及び配列番号９を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０を含むＣＤＲ１、配列番号１１を含むＣＤＲ２及び配列番号１２を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号１３を含むＣＤＲ１、配列番号１４を含むＣＤＲ２及び配列番号１５を含むＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号１６を含むＣＤＲ１、配列番号１７を含むＣＤＲ２及び配列番号１８を含むＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号１９を含むＣＤＲ１、配列番号２０を含むＣＤＲ２及び配列番号２１を含むＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号２２を含むＣＤＲ１、配列番号２３を含むＣＤＲ２及び配列番号２４を含むＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号２５を含むＣＤＲ１、配列番号２６を含むＣＤＲ２及び配列番号２７を含むＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号２８を含むＣＤＲ１、配列番号２９を含むＣＤＲ２及び配列番号３０を含むＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号３１を含むＣＤＲ１、配列番号３２を含むＣＤＲ２及び配列番号３３を含むＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２及び配列番号３６を含むＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号３７を含むＣＤＲ１、配列番号３８を含むＣＤＲ２及び配列番号３９を含むＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｏ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｐ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｒ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４５を含むＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４６を含むＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４７を含むＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４８を含むＣＤＲ３；
（ｗ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４９を含むＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５０を含むＣＤＲ３；
（ｙ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５１を含むＣＤＲ３；
（ｚ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５２を含むＣＤＲ３；
（ａａ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５３を含むＣＤＲ３；
（ｂｂ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５４を含むＣＤＲ３；
（ｃｃ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５５を含むＣＤＲ３；
（ｄｄ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５６を含むＣＤＲ３；
（ｅｅ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５７を含むＣＤＲ３；
（ｆｆ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５８を含むＣＤＲ３；
（ｇｇ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５９を含むＣＤＲ３；
（ｈｈ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号６０を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、０～４個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、０～４個のアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項4】

アミノ酸修飾が、置換、挿入又は欠失である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項5】

配列番号１を含むＣＤＲ１と、配列番号２を含むＣＤＲ２と、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、請求項１～４に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項6】

配列番号１を含むＣＤＲ１と、配列番号２を含むＣＤＲ２と、配列番号４０、４１、４２、４３及び４４から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。請求項１～４に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項7】

４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を更に含む、請求項１～６に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項8】

配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、及び１０７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項9】

配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、及び９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体。

【請求項10】

請求項１～９に記載の単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項11】

請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞又は細胞株。

【請求項13】

請求項１２に記載の宿主細胞を、発現ベクターのポリヌクレオチド配列を発現する条件下で、培養培地中で培養する工程を含む、単一ドメイン抗体の産生のための方法。

【請求項14】

請求項１～９に記載の単一ドメイン抗体を含む医薬組成物。

【請求項15】

医療における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体又は請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

コロナウイルス感染症の治療又は予防における使用のための、請求項１～９に記載の単一ドメイン抗体又は請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項17】

コロナウイルスの治療又は予防のための方法であって、治療活性量の、請求項１～９のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体を対象に投与する工程を含む、方法。

【請求項18】

コロナウイルスの治療における使用のための医薬品の製造における、請求項１～９に記載の単一ドメイン抗体の使用。

【請求項19】

コロナウイルスが、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、及びＣＯＶＩＤ－１９からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用のための単一ドメイン抗体、又は請求項１７に記載のコロナウイルスの治療若しくは予防のための方法、又は請求項１８に記載の単一ドメイン抗体の使用。

【請求項20】

請求項１～９に記載の単一ドメイン抗体を含む医薬デバイスであって、吸入を介した単一ドメイン抗体の送達のために好適である、医薬デバイス。

【請求項21】

対象においてコロナウイルス感染症を診断するための方法であって、
（ａ）単離された試料を、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、
（ｂ）抗体－抗原複合体の数を検出する工程と、
（ｃ）試料中のコロナウイルスの存在を検出する工程とを含み、
複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスの陽性診断を提供する、方法。

【請求項22】

対象においてコロナウイルスタンパク質を検出するための方法であって、
（ａ）対象から試料を得る工程と、
（ｂ）対象からの試料を、請求項１～１６に記載の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、
（ｃ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、
複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスタンパク質の存在を示す、方法。

【請求項23】

患者からの試料中のコロナウイルスタンパク質を検出するための方法であって、
（ａ）対象からの試料を、請求項１～１６に記載の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、
（ｂ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、
複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスタンパク質の存在を示す、方法。

【請求項24】

コロナウイルスが、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）からなる群から選択される、請求項２１、２２又は２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

コロナウイルスの検出のためのアッセイであって、患者から得られた試料を、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体と接触させる工程を含み、単一ドメイン抗体が、患者試料中のコロナウイルスを選択的に分離するために検出可能な標識又はレポーター分子を含み、任意選択で、アッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）である、アッセイ。

【請求項26】

コロナウイルスの検出のためのキットであって、
（ａ）検出可能なマーカーと、
（ｂ）請求項１～１６のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体とを含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする改善された単一ドメイン抗体、コロナウイルスの治療及び／又は予防における前記単一ドメイン抗体の使用、並びに様々な方法、アッセイ及びキットを使用するコロナウイルスの検出及び診断における前記単一ドメイン抗体の使用を提供する。

【背景技術】

【0002】

単一ドメイン抗体又はナノボディは、ラクダ免疫グロブリン重鎖のみのサブセットに由来する組換え抗原特異的可変ドメイン（ＶＨＨ）である。それらの小さい分子サイズ、容易な発現、高い親和性及び安定性は合わさって、それらを生物医学における多数の用途を備えたユニークな標的化試薬にする。ナノボディは、診断用試薬の開発のための、及び非侵襲的バイオイメージングで使用するための従来の抗体に代わるものとして登場した。ナノボディの治療可能性は、腫瘍学的及び炎症性疾患を含む多くの適応症で調査されている（Ｒｅｖｅｔｓ，Ｄｅ Ｂａｅｔｓｅｌｉｅｒら、２００５、Ｃｈａｎｉｅｒ及びＣｈａｍｅｓ、２０１９）。

【0003】

ＳＡＲＳ－ｎコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２）のごく最近の出現（Ｚｈｏｕ，Ｙａｎｇら、２０２０）により、ウイルスの基礎生物学の研究のためのウイルス学において、また可能な抗ウイルス薬としてもナノボディの使用に焦点が絞られた。明らかに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の重要なタンパク質の構造－機能関係は、ワクチン及び治療法を開発するために必要である。他のコロナウイルスと共通して、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２の一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムは、４つの主な構造タンパク質、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）及びヌクレオカプシド（ＮＰ）をコードする。これらのうちで、Ｓタンパク質は、宿主細胞におけるウイルス付着、融合及び侵入において重要な役割意を果たし、ウイルス－受容体結合に関与するＮ－末端（Ｓ１）サブユニット及び膜融合を媒介するＣ－末端ドメイン（Ｓ２）を含む（Ｌｉ、２０１６）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する細胞表面受容体は、関連するコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）であり、相互作用は、Ｓ１においておよそ３００個のアミノ酸受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）にマッピングされている（Ｗａｎ，Ｓｈａｎｇら、２０２０、Ｙａｎ，Ｚｈａｎｇら、２０２０）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明者らは、ファージディスプレイ技術によりネイティブラマＶＨＨライブラリーをインビトロでスクリーニングすることによって、ＲＢＤに対して高親和性を有する多数のナノボディの驚くべき同定を報告する。本発明者らは、最も高い親和性（Ｋｄ＝５．２ｎＭ）を有し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ－２とＲＢＤドメインとの間の相互作用をブロックするＶＨＨの結合特性を解析した。

【0005】

現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患であるＣＯＶＩＤ－１９に対する治療法はなく、したがって、有効な治療法に対する重要なニーズが存在する。更に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の迅速かつ効率的な検出のための好適なツールが、ウイルスの正確な診断及びモニタリングを可能にするために必要である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質の受容体結合ドメインに特異的に結合する単一ドメイン抗体を提供する。
第１の態様では、相補性決定領域、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む単一ドメイン抗体が提供される。

【0007】

第２の態様では、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体が提供される。
第３の態様では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体が提供される。

【0008】

更なる態様では、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。

【0009】

更なる態様では、本発明の単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。
更なる態様では、本発明の単一ドメイン抗体の親和性成熟した変異体が提供される。

【0010】

更なる態様では、本発明の単一ドメイン抗体を産生するための方法が提供される。
更なる態様では、本発明の単一ドメイン抗体を含む医薬組成物が提供される。
更なる態様では、医療における使用のための本発明の単一ドメイン抗体又は本発明の医薬組成物が提供される。

【0011】

更なる態様では、治療活性量の本発明の単一ドメイン抗体を対象に投与する工程を含む、対象におけるコロナウイルスの治療のための方法が提供される。
更なる態様では、コロナウイルスの治療及び／又は予防における使用のための医薬品の製造における本発明の単一ドメイン抗体の使用が提供される。

【0012】

更なる態様では、コロナウイルスタンパク質の検出のための方法が提供される。
更なる態様では、対象においてコロナウイルス感染症を診断するための方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質が感染を促進する。（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の概略図である。スパイクタンパク質は、Ｓ１及びＳ２サブユニットから構成される。Ｓ１ドメインは、赤色で強調されている受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有する。ＲＢＤを使用して、三量体スパイク分子は、ヒト細胞上のＡＣＥ２に結合する。（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との間で共有されるＲＢＤの選択された残基が、灰色で強調され（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、明るい灰色のテキストで示されている（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）。ＡＣＥ２と接触する残基は、各配列の太字で強調されている。他の配列の違いは、黒色のテキストで示され、保存的置換は、下のコロン（：）により示されている。Ｈ１１－Ｈ４ナノボディと接触する残基は、ボックスで囲まれている。（ｃ）ラクダ科は、一本鎖の二量体である抗体を有する。定常領域は黒色であり、可変領域は灰色である。ＶＨＨドメインがそれ自体で表現される場合、ナノボディと呼ばれる。トポロジー図は、ナノボディが２つのｂ－シートから構成されていることを示す。３つのループ－相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３－は、抗原結合を制御し、より濃い灰色で強調されている。

【図2A】実験室で成熟させたナノボディは、高い親和性でＲＢＤ及びスパイクタンパク質に結合する。（ａ）Ｈ１１のＣＤＲ３領域の変異誘発による成熟は、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４をもたらした。親からの５つの変化は、太字で示されている。（ｂ）５ｎＭの親和性でＲＢＤ（チップ上のＲＢＤ－Ｆｃとして固定化された）に結合されたＨ１１－Ｈ４を示すＳＰＲセンサーグラムである。繰り返し実験は図６Ｃに示され、Ｈ１１－Ｄ４データは図６Ｄに提供される。（ｃ）ＲＢＤは、ＡＣＥ２（チップ上のＡＣＥ２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合はなく、Ｈ１１－Ｈ４とＡＣＥ２とがＲＢＤへの結合で競合することを示している。ＲＢＤの代わりにスパイクタンパク質を使用しても、同様の結果が観察された。抗体Ｅ０８Ｒ（抗Ｃａｓｐｒ２ Ｆａｂ）を、陰性対照として使用した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｅに提供されている。（ｄ）ＲＢＤは、ＣＲ３０２２（チップ上のＣＲ３０２２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合は同様なオンとオフレートで発生し、Ｈ１１－Ｈ４とＣＲ３０２２とがＲＢＤ上の異なるエピトープを認識することを示している。ＲＢＤ Ｈ１１－Ｈ４混合物に対する応答はより大きく、ＣＲ３０２２へのＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体の結合と一致した。抗体Ｅ０８Ｒをまた、陰性対照として使用した。スパイクタンパク質は、Ｈ１１－Ｈ４の存在又は非存在下でＣＲ３０２２への結合を示した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｆに提供される。（ｅ）ＩＴＣ測定は、１２±１．５ｎＭのＫＤ及びＨ１１－Ｈ４とＲＢＤとの会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ａに提供されている。（ｆ）ＩＴＣ測定は、４４±３ｎＭのＫＤ及びスパイクタンパク質とＨ１１－Ｈ４との会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ｂに提供されている。

【図2B】実験室で成熟させたナノボディは、高い親和性でＲＢＤ及びスパイクタンパク質に結合する。（ａ）Ｈ１１のＣＤＲ３領域の変異誘発による成熟は、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４をもたらした。親からの５つの変化は、太字で示されている。（ｂ）５ｎＭの親和性でＲＢＤ（チップ上のＲＢＤ－Ｆｃとして固定化された）に結合されたＨ１１－Ｈ４を示すＳＰＲセンサーグラムである。繰り返し実験は図６Ｃに示され、Ｈ１１－Ｄ４データは図６Ｄに提供される。（ｃ）ＲＢＤは、ＡＣＥ２（チップ上のＡＣＥ２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合はなく、Ｈ１１－Ｈ４とＡＣＥ２とがＲＢＤへの結合で競合することを示している。ＲＢＤの代わりにスパイクタンパク質を使用しても、同様の結果が観察された。抗体Ｅ０８Ｒ（抗Ｃａｓｐｒ２ Ｆａｂ）を、陰性対照として使用した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｅに提供されている。（ｄ）ＲＢＤは、ＣＲ３０２２（チップ上のＣＲ３０２２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合は同様なオンとオフレートで発生し、Ｈ１１－Ｈ４とＣＲ３０２２とがＲＢＤ上の異なるエピトープを認識することを示している。ＲＢＤ Ｈ１１－Ｈ４混合物に対する応答はより大きく、ＣＲ３０２２へのＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体の結合と一致した。抗体Ｅ０８Ｒをまた、陰性対照として使用した。スパイクタンパク質は、Ｈ１１－Ｈ４の存在又は非存在下でＣＲ３０２２への結合を示した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｆに提供される。（ｅ）ＩＴＣ測定は、１２±１．５ｎＭのＫＤ及びＨ１１－Ｈ４とＲＢＤとの会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ａに提供されている。（ｆ）ＩＴＣ測定は、４４±３ｎＭのＫＤ及びスパイクタンパク質とＨ１１－Ｈ４との会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ｂに提供されている。

【図2C】実験室で成熟させたナノボディは、高い親和性でＲＢＤ及びスパイクタンパク質に結合する。（ａ）Ｈ１１のＣＤＲ３領域の変異誘発による成熟は、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４をもたらした。親からの５つの変化は、太字で示されている。（ｂ）５ｎＭの親和性でＲＢＤ（チップ上のＲＢＤ－Ｆｃとして固定化された）に結合されたＨ１１－Ｈ４を示すＳＰＲセンサーグラムである。繰り返し実験は図６Ｃに示され、Ｈ１１－Ｄ４データは図６Ｄに提供される。（ｃ）ＲＢＤは、ＡＣＥ２（チップ上のＡＣＥ２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合はなく、Ｈ１１－Ｈ４とＡＣＥ２とがＲＢＤへの結合で競合することを示している。ＲＢＤの代わりにスパイクタンパク質を使用しても、同様の結果が観察された。抗体Ｅ０８Ｒ（抗Ｃａｓｐｒ２ Ｆａｂ）を、陰性対照として使用した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｅに提供されている。（ｄ）ＲＢＤは、ＣＲ３０２２（チップ上のＣＲ３０２２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合は同様なオンとオフレートで発生し、Ｈ１１－Ｈ４とＣＲ３０２２とがＲＢＤ上の異なるエピトープを認識することを示している。ＲＢＤ Ｈ１１－Ｈ４混合物に対する応答はより大きく、ＣＲ３０２２へのＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体の結合と一致した。抗体Ｅ０８Ｒをまた、陰性対照として使用した。スパイクタンパク質は、Ｈ１１－Ｈ４の存在又は非存在下でＣＲ３０２２への結合を示した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｆに提供される。（ｅ）ＩＴＣ測定は、１２±１．５ｎＭのＫＤ及びＨ１１－Ｈ４とＲＢＤとの会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ａに提供されている。（ｆ）ＩＴＣ測定は、４４±３ｎＭのＫＤ及びスパイクタンパク質とＨ１１－Ｈ４との会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ｂに提供されている。

【図2D】実験室で成熟させたナノボディは、高い親和性でＲＢＤ及びスパイクタンパク質に結合する。（ａ）Ｈ１１のＣＤＲ３領域の変異誘発による成熟は、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４をもたらした。親からの５つの変化は、太字で示されている。（ｂ）５ｎＭの親和性でＲＢＤ（チップ上のＲＢＤ－Ｆｃとして固定化された）に結合されたＨ１１－Ｈ４を示すＳＰＲセンサーグラムである。繰り返し実験は図６Ｃに示され、Ｈ１１－Ｄ４データは図６Ｄに提供される。（ｃ）ＲＢＤは、ＡＣＥ２（チップ上のＡＣＥ２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合はなく、Ｈ１１－Ｈ４とＡＣＥ２とがＲＢＤへの結合で競合することを示している。ＲＢＤの代わりにスパイクタンパク質を使用しても、同様の結果が観察された。抗体Ｅ０８Ｒ（抗Ｃａｓｐｒ２ Ｆａｂ）を、陰性対照として使用した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｅに提供されている。（ｄ）ＲＢＤは、ＣＲ３０２２（チップ上のＣＲ３０２２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合は同様なオンとオフレートで発生し、Ｈ１１－Ｈ４とＣＲ３０２２とがＲＢＤ上の異なるエピトープを認識することを示している。ＲＢＤ Ｈ１１－Ｈ４混合物に対する応答はより大きく、ＣＲ３０２２へのＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体の結合と一致した。抗体Ｅ０８Ｒをまた、陰性対照として使用した。スパイクタンパク質は、Ｈ１１－Ｈ４の存在又は非存在下でＣＲ３０２２への結合を示した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｆに提供される。（ｅ）ＩＴＣ測定は、１２±１．５ｎＭのＫＤ及びＨ１１－Ｈ４とＲＢＤとの会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ａに提供されている。（ｆ）ＩＴＣ測定は、４４±３ｎＭのＫＤ及びスパイクタンパク質とＨ１１－Ｈ４との会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ｂに提供されている。

【図2E】実験室で成熟させたナノボディは、高い親和性でＲＢＤ及びスパイクタンパク質に結合する。（ａ）Ｈ１１のＣＤＲ３領域の変異誘発による成熟は、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４をもたらした。親からの５つの変化は、太字で示されている。（ｂ）５ｎＭの親和性でＲＢＤ（チップ上のＲＢＤ－Ｆｃとして固定化された）に結合されたＨ１１－Ｈ４を示すＳＰＲセンサーグラムである。繰り返し実験は図６Ｃに示され、Ｈ１１－Ｄ４データは図６Ｄに提供される。（ｃ）ＲＢＤは、ＡＣＥ２（チップ上のＡＣＥ２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合はなく、Ｈ１１－Ｈ４とＡＣＥ２とがＲＢＤへの結合で競合することを示している。ＲＢＤの代わりにスパイクタンパク質を使用しても、同様の結果が観察された。抗体Ｅ０８Ｒ（抗Ｃａｓｐｒ２ Ｆａｂ）を、陰性対照として使用した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｅに提供されている。（ｄ）ＲＢＤは、ＣＲ３０２２（チップ上のＣＲ３０２２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合は同様なオンとオフレートで発生し、Ｈ１１－Ｈ４とＣＲ３０２２とがＲＢＤ上の異なるエピトープを認識することを示している。ＲＢＤ Ｈ１１－Ｈ４混合物に対する応答はより大きく、ＣＲ３０２２へのＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体の結合と一致した。抗体Ｅ０８Ｒをまた、陰性対照として使用した。スパイクタンパク質は、Ｈ１１－Ｈ４の存在又は非存在下でＣＲ３０２２への結合を示した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｆに提供される。（ｅ）ＩＴＣ測定は、１２±１．５ｎＭのＫＤ及びＨ１１－Ｈ４とＲＢＤとの会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ａに提供されている。（ｆ）ＩＴＣ測定は、４４±３ｎＭのＫＤ及びスパイクタンパク質とＨ１１－Ｈ４との会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ｂに提供されている。

【図2F】実験室で成熟させたナノボディは、高い親和性でＲＢＤ及びスパイクタンパク質に結合する。（ａ）Ｈ１１のＣＤＲ３領域の変異誘発による成熟は、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４をもたらした。親からの５つの変化は、太字で示されている。（ｂ）５ｎＭの親和性でＲＢＤ（チップ上のＲＢＤ－Ｆｃとして固定化された）に結合されたＨ１１－Ｈ４を示すＳＰＲセンサーグラムである。繰り返し実験は図６Ｃに示され、Ｈ１１－Ｄ４データは図６Ｄに提供される。（ｃ）ＲＢＤは、ＡＣＥ２（チップ上のＡＣＥ２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合はなく、Ｈ１１－Ｈ４とＡＣＥ２とがＲＢＤへの結合で競合することを示している。ＲＢＤの代わりにスパイクタンパク質を使用しても、同様の結果が観察された。抗体Ｅ０８Ｒ（抗Ｃａｓｐｒ２ Ｆａｂ）を、陰性対照として使用した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｅに提供されている。（ｄ）ＲＢＤは、ＣＲ３０２２（チップ上のＣＲ３０２２－Ｆｃとして固定化された）で結合された。ＲＢＤがＨ１１－Ｈ４と予混合された場合、結合は同様なオンとオフレートで発生し、Ｈ１１－Ｈ４とＣＲ３０２２とがＲＢＤ上の異なるエピトープを認識することを示している。ＲＢＤ Ｈ１１－Ｈ４混合物に対する応答はより大きく、ＣＲ３０２２へのＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体の結合と一致した。抗体Ｅ０８Ｒをまた、陰性対照として使用した。スパイクタンパク質は、Ｈ１１－Ｈ４の存在又は非存在下でＣＲ３０２２への結合を示した。Ｈ１１－Ｄ４についてのデータは、図６Ｆに提供される。（ｅ）ＩＴＣ測定は、１２±１．５ｎＭのＫＤ及びＨ１１－Ｈ４とＲＢＤとの会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ａに提供されている。（ｆ）ＩＴＣ測定は、４４±３ｎＭのＫＤ及びスパイクタンパク質とＨ１１－Ｈ４との会合の１：１の比を示す。Ｈ１１－Ｄ４についての反復及びデータは、図７Ｂに提供されている。

【図3A】Ｈ１１－Ｈ４のインビトロ生物学的活性である。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ、インビトロアッセイで使用されたＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の概略図である。（ｂ）ビオチン化ＲＢＤを被分析物と様々な割合で混合し、次いでヒトＡＣＥ２を安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＲＢＤの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｃ）ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃを被分析物と様々な割合で混合し、次いでＲＢＤを安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）及びＨ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）は、生きた野生型ウイルスの強力な中和を示す。９５％信頼区間は、破線で示される。生データのプロットは図８に示されている。（ｅ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃは、オックスフォードにおけるＶｅｒｏ細胞ベースのアッセイで生きた野生型ウイルスの同様な中和（ＮＤ５０ ４ｎＭ）を示す。ＣＲ３０２２は、このアッセイシステムでは陽性対照として示され、以前の報告と同様である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。実験プレートは、図８に示されている。

【図3B】Ｈ１１－Ｈ４のインビトロ生物学的活性である。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ、インビトロアッセイで使用されたＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の概略図である。（ｂ）ビオチン化ＲＢＤを被分析物と様々な割合で混合し、次いでヒトＡＣＥ２を安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＲＢＤの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｃ）ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃを被分析物と様々な割合で混合し、次いでＲＢＤを安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）及びＨ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）は、生きた野生型ウイルスの強力な中和を示す。９５％信頼区間は、破線で示される。生データのプロットは図８に示されている。（ｅ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃは、オックスフォードにおけるＶｅｒｏ細胞ベースのアッセイで生きた野生型ウイルスの同様な中和（ＮＤ５０ ４ｎＭ）を示す。ＣＲ３０２２は、このアッセイシステムでは陽性対照として示され、以前の報告と同様である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。実験プレートは、図８に示されている。

【図3C】Ｈ１１－Ｈ４のインビトロ生物学的活性である。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ、インビトロアッセイで使用されたＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の概略図である。（ｂ）ビオチン化ＲＢＤを被分析物と様々な割合で混合し、次いでヒトＡＣＥ２を安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＲＢＤの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｃ）ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃを被分析物と様々な割合で混合し、次いでＲＢＤを安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）及びＨ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）は、生きた野生型ウイルスの強力な中和を示す。９５％信頼区間は、破線で示される。生データのプロットは図８に示されている。（ｅ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃは、オックスフォードにおけるＶｅｒｏ細胞ベースのアッセイで生きた野生型ウイルスの同様な中和（ＮＤ５０ ４ｎＭ）を示す。ＣＲ３０２２は、このアッセイシステムでは陽性対照として示され、以前の報告と同様である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。実験プレートは、図８に示されている。

【図3D】Ｈ１１－Ｈ４のインビトロ生物学的活性である。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ、インビトロアッセイで使用されたＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の概略図である。（ｂ）ビオチン化ＲＢＤを被分析物と様々な割合で混合し、次いでヒトＡＣＥ２を安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＲＢＤの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｃ）ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃを被分析物と様々な割合で混合し、次いでＲＢＤを安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）及びＨ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）は、生きた野生型ウイルスの強力な中和を示す。９５％信頼区間は、破線で示される。生データのプロットは図８に示されている。（ｅ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃは、オックスフォードにおけるＶｅｒｏ細胞ベースのアッセイで生きた野生型ウイルスの同様な中和（ＮＤ５０ ４ｎＭ）を示す。ＣＲ３０２２は、このアッセイシステムでは陽性対照として示され、以前の報告と同様である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。実験プレートは、図８に示されている。

【図3E】Ｈ１１－Ｈ４のインビトロ生物学的活性である。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ、インビトロアッセイで使用されたＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の概略図である。（ｂ）ビオチン化ＲＢＤを被分析物と様々な割合で混合し、次いでヒトＡＣＥ２を安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＲＢＤの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｃ）ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃを被分析物と様々な割合で混合し、次いでＲＢＤを安定して発現するＭＤＣＫＳＩＡＴ１細胞に添加した。結合したビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃの量を測定した。実験は二通りで行われ、平均値±ＳＤが示される。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）及びＨ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）は、生きた野生型ウイルスの強力な中和を示す。９５％信頼区間は、破線で示される。生データのプロットは図８に示されている。（ｅ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃは、オックスフォードにおけるＶｅｒｏ細胞ベースのアッセイで生きた野生型ウイルスの同様な中和（ＮＤ５０ ４ｎＭ）を示す。ＣＲ３０２２は、このアッセイシステムでは陽性対照として示され、以前の報告と同様である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。実験プレートは、図８に示されている。

【図4A】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図4B】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図4C】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図4D】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図4E】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図4F】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図4G】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図4H】スパイク及びＲＢＤに結合したＨ１１－Ｈ４の構造生物学である。（ａ）１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合した３本の鎖の各々を有するスパイク（Ｓ１）三量体のＥＭ構造である。スパイクの「アップ型」配置単量体は、そのＲＢＤが赤色で強調されて明るいピンクで着色されている。他の単量体は、全体的に淡いシアン及び小麦色で着色されている。スパイクの各単量体は、１つのＨ１１－Ｈ４ナノボディに結合しており、３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディは黄色で着色されている。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造は、ＲＢＤ（赤色）を介して重ね合わされ、両方のナノボディが同じＲＢＤエピトープを認識することを示している。Ｈ１１－Ｄ４は、オレンジ色で着色され、Ｈ１１－Ｈ４は黄色で着色されている。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４との間には７°のピボットがあり、これは、ナノボディがシフトしていることを意味する。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４のループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、認識を制御し、マゼンタで着色されている。（ｅ）図４で示される構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触している残基を示す。Ｈ１１－Ｈ４残基は、炭素原子が黄色で、窒素原子が青色で、酸素原子が赤色で着色されて、黄色でラベル付けされている。ＲＢＤは、濃い灰色で強調された接触点（＜４．０Å）を有する白色表面として示されている。（ｆ）Ｈ１１－Ｈ４（省略されている）と接触したＲＢＤ残基を示す、図４ｃと同じ図である。選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、他の原子が図４ｃのように着色されて、ラベル付けされている。（ｇ）Ｈ１１－Ｈ４（灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述するＬｉｇＰｌｏｔである。水素結合は、黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は、明るい灰色の破線で示されている。（ｈ）Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２のＡｒｇ５２がＲＢＤのＰｈｅ４９０に積み重なり、Ｇｌｕ４８４と塩接触する。加えて、主鎖Ｓｅｒ１０３（図では側鎖は省略されている）及びＴｙｒ１０９への水素結合を作製する。

【図5A】Ｈ１１－Ｈ４及びＣＲ３０２２は、ＲＢＤに対する異なる結合エピトープを有し、追加の中和活性を示す。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体のＲＢＤドメイン（図４ｅのように着色された）とＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体１０（淡い青色で着色されたＡＣＥ２）とを使用する重ね合わせである。Ｈ１１－Ｈ４がＲＢＤに結合するとき、これは立体衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ）によりＡＣＥ２結合を妨害する。（ｂ）ＡＣＥ２にのみ関与するＲＢＤの領域は、Ｈ１１－Ｈ４によって認識されるその領域との小さな重複を有する。ＲＢＤは、分子表面として示され、ＡＣＥ２とだけ接触しているそれらの領域が、濃い青色で強調されており、一方Ｈ１１－Ｈ４とだけ接触しているものが赤色で強調されている。ＲＢＤと接触するＡＣＥ２の２つのヘリックス及びターンはカートーンで示され、図５ａのように着色されている。Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ１、２及び３はラベル付けされ、カートーンで示され、黄色で着色されている。両方の結合部位に大きく寄与するＴｙｒ４８９及びＧｌｎ４９３は、淡い緑色で強調されている。（ｃ）三元複合体Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２は、ナノボディ及び抗体が、完全に異なるエピトープを認識することを示す。ＣＲ３０２２は、淡いピンク及びサーモンピンクで着色され、その他は図４ｂのように着色されている。（ｄ）８４ｎＭの一定濃度でのＣＲ３０２２の存在下のＨ１１－Ｈ４－Ｆｃについての中和アッセイである。灰色の実線は、中和剤を含まない対照値を表す。破線は、それぞれ、対照に対して５０％及び１０％である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ中和曲線及び２ｎＭの測定されたＮＤ５０は、加法性を示す。実験プレートは、図９Ｄに示されている。

【図5B】Ｈ１１－Ｈ４及びＣＲ３０２２は、ＲＢＤに対する異なる結合エピトープを有し、追加の中和活性を示す。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体のＲＢＤドメイン（図４ｅのように着色された）とＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体１０（淡い青色で着色されたＡＣＥ２）とを使用する重ね合わせである。Ｈ１１－Ｈ４がＲＢＤに結合するとき、これは立体衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ）によりＡＣＥ２結合を妨害する。（ｂ）ＡＣＥ２にのみ関与するＲＢＤの領域は、Ｈ１１－Ｈ４によって認識されるその領域との小さな重複を有する。ＲＢＤは、分子表面として示され、ＡＣＥ２とだけ接触しているそれらの領域が、濃い青色で強調されており、一方Ｈ１１－Ｈ４とだけ接触しているものが赤色で強調されている。ＲＢＤと接触するＡＣＥ２の２つのヘリックス及びターンはカートーンで示され、図５ａのように着色されている。Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ１、２及び３はラベル付けされ、カートーンで示され、黄色で着色されている。両方の結合部位に大きく寄与するＴｙｒ４８９及びＧｌｎ４９３は、淡い緑色で強調されている。（ｃ）三元複合体Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２は、ナノボディ及び抗体が、完全に異なるエピトープを認識することを示す。ＣＲ３０２２は、淡いピンク及びサーモンピンクで着色され、その他は図４ｂのように着色されている。（ｄ）８４ｎＭの一定濃度でのＣＲ３０２２の存在下のＨ１１－Ｈ４－Ｆｃについての中和アッセイである。灰色の実線は、中和剤を含まない対照値を表す。破線は、それぞれ、対照に対して５０％及び１０％である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ中和曲線及び２ｎＭの測定されたＮＤ５０は、加法性を示す。実験プレートは、図９Ｄに示されている。

【図5C】Ｈ１１－Ｈ４及びＣＲ３０２２は、ＲＢＤに対する異なる結合エピトープを有し、追加の中和活性を示す。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体のＲＢＤドメイン（図４ｅのように着色された）とＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体１０（淡い青色で着色されたＡＣＥ２）とを使用する重ね合わせである。Ｈ１１－Ｈ４がＲＢＤに結合するとき、これは立体衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ）によりＡＣＥ２結合を妨害する。（ｂ）ＡＣＥ２にのみ関与するＲＢＤの領域は、Ｈ１１－Ｈ４によって認識されるその領域との小さな重複を有する。ＲＢＤは、分子表面として示され、ＡＣＥ２とだけ接触しているそれらの領域が、濃い青色で強調されており、一方Ｈ１１－Ｈ４とだけ接触しているものが赤色で強調されている。ＲＢＤと接触するＡＣＥ２の２つのヘリックス及びターンはカートーンで示され、図５ａのように着色されている。Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ１、２及び３はラベル付けされ、カートーンで示され、黄色で着色されている。両方の結合部位に大きく寄与するＴｙｒ４８９及びＧｌｎ４９３は、淡い緑色で強調されている。（ｃ）三元複合体Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２は、ナノボディ及び抗体が、完全に異なるエピトープを認識することを示す。ＣＲ３０２２は、淡いピンク及びサーモンピンクで着色され、その他は図４ｂのように着色されている。（ｄ）８４ｎＭの一定濃度でのＣＲ３０２２の存在下のＨ１１－Ｈ４－Ｆｃについての中和アッセイである。灰色の実線は、中和剤を含まない対照値を表す。破線は、それぞれ、対照に対して５０％及び１０％である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ中和曲線及び２ｎＭの測定されたＮＤ５０は、加法性を示す。実験プレートは、図９Ｄに示されている。

【図5D】Ｈ１１－Ｈ４及びＣＲ３０２２は、ＲＢＤに対する異なる結合エピトープを有し、追加の中和活性を示す。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体のＲＢＤドメイン（図４ｅのように着色された）とＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体１０（淡い青色で着色されたＡＣＥ２）とを使用する重ね合わせである。Ｈ１１－Ｈ４がＲＢＤに結合するとき、これは立体衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ）によりＡＣＥ２結合を妨害する。（ｂ）ＡＣＥ２にのみ関与するＲＢＤの領域は、Ｈ１１－Ｈ４によって認識されるその領域との小さな重複を有する。ＲＢＤは、分子表面として示され、ＡＣＥ２とだけ接触しているそれらの領域が、濃い青色で強調されており、一方Ｈ１１－Ｈ４とだけ接触しているものが赤色で強調されている。ＲＢＤと接触するＡＣＥ２の２つのヘリックス及びターンはカートーンで示され、図５ａのように着色されている。Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ１、２及び３はラベル付けされ、カートーンで示され、黄色で着色されている。両方の結合部位に大きく寄与するＴｙｒ４８９及びＧｌｎ４９３は、淡い緑色で強調されている。（ｃ）三元複合体Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２は、ナノボディ及び抗体が、完全に異なるエピトープを認識することを示す。ＣＲ３０２２は、淡いピンク及びサーモンピンクで着色され、その他は図４ｂのように着色されている。（ｄ）８４ｎＭの一定濃度でのＣＲ３０２２の存在下のＨ１１－Ｈ４－Ｆｃについての中和アッセイである。灰色の実線は、中和剤を含まない対照値を表す。破線は、それぞれ、対照に対して５０％及び１０％である。データは、ｎ＝２の技術的反復の平均値及び標準偏差として表される。Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ中和曲線及び２ｎＭの測定されたＮＤ５０は、加法性を示す。実験プレートは、図９Ｄに示されている。

【図6A】ＲＢＤに結合するナノボディの生物物理学である。（ａ）ネイティブライブラリースクリーンから同定されたＨ１１親ナノボディについての生センサーグラムである。（ｂ）Ｈ１１親ナノボディのＫＤの計算である。（ｃ）図２Ｂの繰り返し、ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｄ）ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｅ）被分析物のチップ上に固定されたＡＣＥ２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｃ）挙動した。（ｆ）被分析物のチップ上に固定されたＣＲ２０２２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｄ）挙動した。

【図6B】ＲＢＤに結合するナノボディの生物物理学である。（ａ）ネイティブライブラリースクリーンから同定されたＨ１１親ナノボディについての生センサーグラムである。（ｂ）Ｈ１１親ナノボディのＫＤの計算である。（ｃ）図２Ｂの繰り返し、ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｄ）ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｅ）被分析物のチップ上に固定されたＡＣＥ２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｃ）挙動した。（ｆ）被分析物のチップ上に固定されたＣＲ２０２２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｄ）挙動した。

【図6C】ＲＢＤに結合するナノボディの生物物理学である。（ａ）ネイティブライブラリースクリーンから同定されたＨ１１親ナノボディについての生センサーグラムである。（ｂ）Ｈ１１親ナノボディのＫＤの計算である。（ｃ）図２Ｂの繰り返し、ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｄ）ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｅ）被分析物のチップ上に固定されたＡＣＥ２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｃ）挙動した。（ｆ）被分析物のチップ上に固定されたＣＲ２０２２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｄ）挙動した。

【図6D】ＲＢＤに結合するナノボディの生物物理学である。（ａ）ネイティブライブラリースクリーンから同定されたＨ１１親ナノボディについての生センサーグラムである。（ｂ）Ｈ１１親ナノボディのＫＤの計算である。（ｃ）図２Ｂの繰り返し、ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｄ）ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｅ）被分析物のチップ上に固定されたＡＣＥ２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｃ）挙動した。（ｆ）被分析物のチップ上に固定されたＣＲ２０２２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｄ）挙動した。

【図6E】ＲＢＤに結合するナノボディの生物物理学である。（ａ）ネイティブライブラリースクリーンから同定されたＨ１１親ナノボディについての生センサーグラムである。（ｂ）Ｈ１１親ナノボディのＫＤの計算である。（ｃ）図２Ｂの繰り返し、ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｄ）ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｅ）被分析物のチップ上に固定されたＡＣＥ２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｃ）挙動した。（ｆ）被分析物のチップ上に固定されたＣＲ２０２２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｄ）挙動した。

【図6F】ＲＢＤに結合するナノボディの生物物理学である。（ａ）ネイティブライブラリースクリーンから同定されたＨ１１親ナノボディについての生センサーグラムである。（ｂ）Ｈ１１親ナノボディのＫＤの計算である。（ｃ）図２Ｂの繰り返し、ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｄ）ＲＢＤ－Ｆｃに結合するＨ１１－Ｈ４についてのセンサーグラムである。（ｅ）被分析物のチップ上に固定されたＡＣＥ２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｃ）挙動した。（ｆ）被分析物のチップ上に固定されたＣＲ２０２２－Ｆｃへの結合である。Ｈ１１－Ｄ４は、Ｈ１１－Ｈ４と同じように（図２Ｄ）挙動した。

【図7A-1】ＲＢＤ又はスパイクに結合するナノボディのＩＴＣ測定である。（ａ）ＲＢＤに結合するＨ１１－Ｈ４及びＨ１１－Ｄ４の３つの独立したＩＴＣ測定である。誤差は、図２Ｄに示されるものを含む、３つの独立した実験に対するｓ．ｅ．ｍである。（ｂ）上記の通りであるが、スパイクタンパク質を有する。

【図7A-2】ＲＢＤ又はスパイクに結合するナノボディのＩＴＣ測定である。（ａ）ＲＢＤに結合するＨ１１－Ｈ４及びＨ１１－Ｄ４の３つの独立したＩＴＣ測定である。誤差は、図２Ｄに示されるものを含む、３つの独立した実験に対するｓ．ｅ．ｍである。（ｂ）上記の通りであるが、スパイクタンパク質を有する。

【図7B-1】ＲＢＤ又はスパイクに結合するナノボディのＩＴＣ測定である。（ａ）ＲＢＤに結合するＨ１１－Ｈ４及びＨ１１－Ｄ４の３つの独立したＩＴＣ測定である。誤差は、図２Ｄに示されるものを含む、３つの独立した実験に対するｓ．ｅ．ｍである。（ｂ）上記の通りであるが、スパイクタンパク質を有する。

【図7B-2】ＲＢＤ又はスパイクに結合するナノボディのＩＴＣ測定である。（ａ）ＲＢＤに結合するＨ１１－Ｈ４及びＨ１１－Ｄ４の３つの独立したＩＴＣ測定である。誤差は、図２Ｄに示されるものを含む、３つの独立した実験に対するｓ．ｅ．ｍである。（ｂ）上記の通りであるが、スパイクタンパク質を有する。

【図8A】英国公衆衛生庁での生きたウイルスの中和である。ウイルスから生じるプラークの減少パーセンテージを、（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）（ｂ）Ｈ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）の（左から右に）増加する濃度に対してプロットする。信頼区間は、破線で示されている。図３ｄ、ｅ、５ｄでは、感染％（感染％＝１００－プラーク減少％）は、薬剤の減少する（左から右）濃度に対してプロットされる。（ｃ）コード付きの実験プレートを下に記載する。ウイルスによって引き起こされたプラークが見える。

【図8B】英国公衆衛生庁での生きたウイルスの中和である。ウイルスから生じるプラークの減少パーセンテージを、（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）（ｂ）Ｈ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）の（左から右に）増加する濃度に対してプロットする。信頼区間は、破線で示されている。図３ｄ、ｅ、５ｄでは、感染％（感染％＝１００－プラーク減少％）は、薬剤の減少する（左から右）濃度に対してプロットされる。（ｃ）コード付きの実験プレートを下に記載する。ウイルスによって引き起こされたプラークが見える。

【図8C】英国公衆衛生庁での生きたウイルスの中和である。ウイルスから生じるプラークの減少パーセンテージを、（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ（６ｎＭ、９５％ＣＩ ３～９ｎＭ）（ｂ）Ｈ１１－Ｄ４－Ｆｃ（１８ｎＭ、９５％ＣＩ ９～６８ｎＭ）の（左から右に）増加する濃度に対してプロットする。信頼区間は、破線で示されている。図３ｄ、ｅ、５ｄでは、感染％（感染％＝１００－プラーク減少％）は、薬剤の減少する（左から右）濃度に対してプロットされる。（ｃ）コード付きの実験プレートを下に記載する。ウイルスによって引き起こされたプラークが見える。

【図9A】オックスフォード大学での生きたウイルスの中和である。中和剤の濃度を行全体で一定に保ち、後続の行で減少させた。薬剤を高ウイルス濃度及び低ウイルス濃度に対してテストした。（ａ）薬剤を含まない対照プレートである。（ｂ）ＣＲ３０２２である。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃである。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃを変化させ、ＣＲ３０２２を８４ｎＭで一定に保った。左側の画像は、ペンカウンティング前のプラークを示し、右側の画像はペンカウントを示す。

【図9B】オックスフォード大学での生きたウイルスの中和である。中和剤の濃度を行全体で一定に保ち、後続の行で減少させた。薬剤を高ウイルス濃度及び低ウイルス濃度に対してテストした。（ａ）薬剤を含まない対照プレートである。（ｂ）ＣＲ３０２２である。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃである。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃを変化させ、ＣＲ３０２２を８４ｎＭで一定に保った。左側の画像は、ペンカウンティング前のプラークを示し、右側の画像はペンカウントを示す。

【図9C】オックスフォード大学での生きたウイルスの中和である。中和剤の濃度を行全体で一定に保ち、後続の行で減少させた。薬剤を高ウイルス濃度及び低ウイルス濃度に対してテストした。（ａ）薬剤を含まない対照プレートである。（ｂ）ＣＲ３０２２である。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃである。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃを変化させ、ＣＲ３０２２を８４ｎＭで一定に保った。左側の画像は、ペンカウンティング前のプラークを示し、右側の画像はペンカウントを示す。

【図9D】オックスフォード大学での生きたウイルスの中和である。中和剤の濃度を行全体で一定に保ち、後続の行で減少させた。薬剤を高ウイルス濃度及び低ウイルス濃度に対してテストした。（ａ）薬剤を含まない対照プレートである。（ｂ）ＣＲ３０２２である。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃである。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃを変化させ、ＣＲ３０２２を８４ｎＭで一定に保った。左側の画像は、ペンカウンティング前のプラークを示し、右側の画像はペンカウントを示す。

【図10A】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10B】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10C】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10D】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10E】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10F】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10G】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10H】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図10I】Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体のクライオ（Ｃｒｙｏ）－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで４ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで４ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｉで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11A】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11B】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11C】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11D】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11E】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11F】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11G】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11H】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図11I】Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体のクライオ－ＥＭである。（ａ）Ｈ１１－Ｈ４－スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）複合体の無バイアス２Ｄクラス平均である。（ｂ）更なる処理のために選択された２Ｄクラス平均である。（ｃ）ＦＳＣ基準を使用する推定分解能である。（ｄ）最終マップのための粒子配向分布は、好ましい配向を示さなかった。（ｅ）最終クライオ－ＥＭマップ（局所分解能に従ってシェーディング）である。（ｆ）複合体のリボンダイヤグラム（キメラで３．８ｓで輪郭を描いた灰色のボリュームとして示されたクライオ－ＥＭマップ）である。（ｇ、ｈ、ｉ）キメラで３．８ｓで輪郭を描いた、ＲＢＤに結合した３つのＨ１１－Ｈ４ナノボディの各々についてのリボンを用いたクライオ－ＥＭ密度である。パネルｆ～ｌで使用されたクライオ－ＥＭマップは、ＬｏｃＳｃａｌｅを使用する精密化座標に基づいてスケーリングされたその振幅を有していた。

【図12A】クライオ－ＥＭナノボディ－スパイク複合体の更なる解析である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体は、図４ａのように着色されている。（ｂ）表面で示され、図４ａで着色されたＨ１１－Ｈ４－スパイク複合体は、ダウン型サブユニットに結合したＨ１１－Ｈ４とアップ型ＲＢＤとの間に相互作用があることを明らかにした。（ｃ）図９ａで示された相互作用の大写し図である。濃い青色で示されているのは、スパイク構造（６ｖｙｂ１３）からのダウン型ＲＢＤである。ダウン型ＲＢＤは、約２Åだけシフトしている。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４に結合したスパイクの閉鎖構造から構築されたモデルは、崩壊がないことを示し、ナノボディがこの形態も認識することを示している。モデルは、スパイクの閉鎖形態（６ｖｘｘ１３）のＥＭ構造上にＨ１１－Ｈ４ ＲＢＤ複合体を重ね合わせることによって構築した。

【図12B】クライオ－ＥＭナノボディ－スパイク複合体の更なる解析である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体は、図４ａのように着色されている。（ｂ）表面で示され、図４ａで着色されたＨ１１－Ｈ４－スパイク複合体は、ダウン型サブユニットに結合したＨ１１－Ｈ４とアップ型ＲＢＤとの間に相互作用があることを明らかにした。（ｃ）図９ａで示された相互作用の大写し図である。濃い青色で示されているのは、スパイク構造（６ｖｙｂ１３）からのダウン型ＲＢＤである。ダウン型ＲＢＤは、約２Åだけシフトしている。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４に結合したスパイクの閉鎖構造から構築されたモデルは、崩壊がないことを示し、ナノボディがこの形態も認識することを示している。モデルは、スパイクの閉鎖形態（６ｖｘｘ１３）のＥＭ構造上にＨ１１－Ｈ４ ＲＢＤ複合体を重ね合わせることによって構築した。

【図12C】クライオ－ＥＭナノボディ－スパイク複合体の更なる解析である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体は、図４ａのように着色されている。（ｂ）表面で示され、図４ａで着色されたＨ１１－Ｈ４－スパイク複合体は、ダウン型サブユニットに結合したＨ１１－Ｈ４とアップ型ＲＢＤとの間に相互作用があることを明らかにした。（ｃ）図９ａで示された相互作用の大写し図である。濃い青色で示されているのは、スパイク構造（６ｖｙｂ１３）からのダウン型ＲＢＤである。ダウン型ＲＢＤは、約２Åだけシフトしている。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４に結合したスパイクの閉鎖構造から構築されたモデルは、崩壊がないことを示し、ナノボディがこの形態も認識することを示している。モデルは、スパイクの閉鎖形態（６ｖｘｘ１３）のＥＭ構造上にＨ１１－Ｈ４ ＲＢＤ複合体を重ね合わせることによって構築した。

【図12D】クライオ－ＥＭナノボディ－スパイク複合体の更なる解析である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－スパイク複合体は、図４ａのように着色されている。（ｂ）表面で示され、図４ａで着色されたＨ１１－Ｈ４－スパイク複合体は、ダウン型サブユニットに結合したＨ１１－Ｈ４とアップ型ＲＢＤとの間に相互作用があることを明らかにした。（ｃ）図９ａで示された相互作用の大写し図である。濃い青色で示されているのは、スパイク構造（６ｖｙｂ１３）からのダウン型ＲＢＤである。ダウン型ＲＢＤは、約２Åだけシフトしている。（ｄ）Ｈ１１－Ｈ４に結合したスパイクの閉鎖構造から構築されたモデルは、崩壊がないことを示し、ナノボディがこの形態も認識することを示している。モデルは、スパイクの閉鎖形態（６ｖｘｘ１３）のＥＭ構造上にＨ１１－Ｈ４ ＲＢＤ複合体を重ね合わせることによって構築した。

【図13A】ナノボディ－ＲＢＤ結晶構造の更なる構造解析である。（ａ）ＡＣＥ２との複合体からのＲＢＤ（明るい灰色で着色されたＰＤＢ ６ｍ０ｊ）とＨ１１－Ｈ４との複合体からのＲＢＤを重ね合わせる。示された残基４８４～５１０を使用することによって、ＲＢＤ内にヒンジ運動がおこる。このヒンジの結果として、Ｈｉｓ５１９のＣαは２．１Åシフトした。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４の結合は、ＡＣＥ２複合体１０、１１からのＲＢＤのＶａｌ４８３における局所シフトをもたらす。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。

【図13B】ナノボディ－ＲＢＤ結晶構造の更なる構造解析である。（ａ）ＡＣＥ２との複合体からのＲＢＤ（明るい灰色で着色されたＰＤＢ ６ｍ０ｊ）とＨ１１－Ｈ４との複合体からのＲＢＤを重ね合わせる。示された残基４８４～５１０を使用することによって、ＲＢＤ内にヒンジ運動がおこる。このヒンジの結果として、Ｈｉｓ５１９のＣαは２．１Åシフトした。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４の結合は、ＡＣＥ２複合体１０、１１からのＲＢＤのＶａｌ４８３における局所シフトをもたらす。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。

【図13C】ナノボディ－ＲＢＤ結晶構造の更なる構造解析である。（ａ）ＡＣＥ２との複合体からのＲＢＤ（明るい灰色で着色されたＰＤＢ ６ｍ０ｊ）とＨ１１－Ｈ４との複合体からのＲＢＤを重ね合わせる。示された残基４８４～５１０を使用することによって、ＲＢＤ内にヒンジ運動がおこる。このヒンジの結果として、Ｈｉｓ５１９のＣαは２．１Åシフトした。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４の結合は、ＡＣＥ２複合体１０、１１からのＲＢＤのＶａｌ４８３における局所シフトをもたらす。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。

【図13D】ナノボディ－ＲＢＤ結晶構造の更なる構造解析である。（ａ）ＡＣＥ２との複合体からのＲＢＤ（明るい灰色で着色されたＰＤＢ ６ｍ０ｊ）とＨ１１－Ｈ４との複合体からのＲＢＤを重ね合わせる。示された残基４８４～５１０を使用することによって、ＲＢＤ内にヒンジ運動がおこる。このヒンジの結果として、Ｈｉｓ５１９のＣαは２．１Åシフトした。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４の結合は、ＡＣＥ２複合体１０、１１からのＲＢＤのＶａｌ４８３における局所シフトをもたらす。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ界面における残基に対して２ｓで輪郭を描いた２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップである。

【図14A】Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体、ＶＨＨ７ ＭＥＲＳ ＲＢＤ複合体及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキング（Ｃｒｙｓｔａｌ ｐａｃｋｉｎｇ）の解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行ｂ－シート型相互作用を明らかにした。 ［図１４Ａ］Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体１８（ＰＤＢ ６ＹＬＡ）、ＶＨＨ７２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤ複合体２５（ＰＤＢ ６ＷＡＱ）及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキングの解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行β－シート型相互作用を明らかにした。

【図14B】Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体、ＶＨＨ７ ＭＥＲＳ ＲＢＤ複合体及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキング（Ｃｒｙｓｔａｌ ｐａｃｋｉｎｇ）の解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行ｂ－シート型相互作用を明らかにした。 ［図１４Ｂ］Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体１８（ＰＤＢ ６ＹＬＡ）、ＶＨＨ７２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤ複合体２５（ＰＤＢ ６ＷＡＱ）及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキングの解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行β－シート型相互作用を明らかにした。

【図14C】Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体、ＶＨＨ７ ＭＥＲＳ ＲＢＤ複合体及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキング（Ｃｒｙｓｔａｌ ｐａｃｋｉｎｇ）の解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行ｂ－シート型相互作用を明らかにした。 ［図１４Ｃ］Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体１８（ＰＤＢ ６ＹＬＡ）、ＶＨＨ７２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤ複合体２５（ＰＤＢ ６ＷＡＱ）及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキングの解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行β－シート型相互作用を明らかにした。

【図14D】Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体、ＶＨＨ７ ＭＥＲＳ ＲＢＤ複合体及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキング（Ｃｒｙｓｔａｌ ｐａｃｋｉｎｇ）の解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行ｂ－シート型相互作用を明らかにした。 ［図１４Ｄ］Ｈ１１－Ｈ４及びＶＨＨ７２は、異なるエピトープを認識する。（ａ）ＶＨＨ７２（黒色）及びＨ１１－Ｈ４（黄色）は、ＲＢＤ（赤色）上の異なるエピトープを認識する。（ｂ）ＶＨＨ７２及びＣＲ３０２２のエピトープ（薄いピンク及び薄紫色）は重複している。ＣＲ３００２ ＲＢＤ複合体１８（ＰＤＢ ６ＹＬＡ）、ＶＨＨ７２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤ複合体２５（ＰＤＢ ６ＷＡＱ）及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体からのＲＢＤを重ね合わせることによって図を作成した。（ｃ）Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体中のクリスタルパッキングの解析は、結晶接触がＲＢＤ上の同じエピトープを使用することを明らかにした。Ｈ１１－Ｈ４によって使用される結晶接触面は、ＶＨＨ７２によって使用されるものとは異なる（ナノボディは、ナノボディの中心を通過する垂直軸の周りで１８０°だけ回転している）。（ｄ）結晶接触の大写し図は、逆平行β－シート型相互作用を明らかにした。

【図15A】ＲＢＤドメインに結合したＨ１１－Ｄ４ナノボディの構造である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造である。エピトープ認識を制御するループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、濃い灰色で強調されている。（ｂ）パネルに示された構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触する残基を示している。ＲＢＤは、接点（４．０Å）を有する表面として示されている。（ｃ）ＬｉｇＰｌｏｔ^４２は、Ｈ１１－Ｄ４（明るい灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述する。結晶構造に規則正しく整っていないＡｒｇ２７は、この解析には含まれなかった。水素結合は黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は薄い灰色の破線で示されている。（ｄ）パネルｂでのものと同じ図は、Ｈ１１－Ｄ４と接触するＲＢＤ残基を示す。選択されたＲＢＤは、残基は、炭素が灰色で着色されて、黒色でラベル付けされている。

【図15B】ＲＢＤドメインに結合したＨ１１－Ｄ４ナノボディの構造である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造である。エピトープ認識を制御するループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、濃い灰色で強調されている。（ｂ）パネルに示された構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触する残基を示している。ＲＢＤは、接点（４．０Å）を有する表面として示されている。（ｃ）ＬｉｇＰｌｏｔ^４２は、Ｈ１１－Ｄ４（明るい灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述する。結晶構造に規則正しく整っていないＡｒｇ２７は、この解析には含まれなかった。水素結合は黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は薄い灰色の破線で示されている。（ｄ）パネルｂでのものと同じ図は、Ｈ１１－Ｄ４と接触するＲＢＤ残基を示す。選択されたＲＢＤは、残基は、炭素が灰色で着色されて、黒色でラベル付けされている。

【図15C】ＲＢＤドメインに結合したＨ１１－Ｄ４ナノボディの構造である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造である。エピトープ認識を制御するループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、濃い灰色で強調されている。（ｂ）パネルに示された構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触する残基を示している。ＲＢＤは、接点（４．０Å）を有する表面として示されている。（ｃ）ＬｉｇＰｌｏｔ^４２は、Ｈ１１－Ｄ４（明るい灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述する。結晶構造に規則正しく整っていないＡｒｇ２７は、この解析には含まれなかった。水素結合は黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は薄い灰色の破線で示されている。（ｄ）パネルｂでのものと同じ図は、Ｈ１１－Ｄ４と接触するＲＢＤ残基を示す。選択されたＲＢＤは、残基は、炭素が灰色で着色されて、黒色でラベル付けされている。

【図15D】ＲＢＤドメインに結合したＨ１１－Ｄ４ナノボディの構造である。（ａ）Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の結晶構造である。エピトープ認識を制御するループＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、濃い灰色で強調されている。（ｂ）パネルに示された構造の９０°の回転であり、ＲＢＤと接触する残基を示している。ＲＢＤは、接点（４．０Å）を有する表面として示されている。（ｃ）ＬｉｇＰｌｏｔ^４２は、Ｈ１１－Ｄ４（明るい灰色で示された残基、上部）とＲＢＤ（黒色で示された残基、下部）との間の相互作用を詳述する。結晶構造に規則正しく整っていないＡｒｇ２７は、この解析には含まれなかった。水素結合は黒色の破線で示され、ファンデルワールス相互作用は薄い灰色の破線で示されている。（ｄ）パネルｂでのものと同じ図は、Ｈ１１－Ｄ４と接触するＲＢＤ残基を示す。選択されたＲＢＤは、残基は、炭素が灰色で着色されて、黒色でラベル付けされている。

【図16A】Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体を安定化する重要な相互作用である。（ａ）ＲＢＤ中のＴｙｒ４４９の芳香族環は、Ａｓｎ１０１においてＨ１１－Ｄ４上の疎水性パッチに対して積み重なる。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４のＡｒｇ５２及びＣＤＲ２は、ＲＢＤのＰｈｅ４９０に対して積み重なり、Ｇｌｕ４８４との塩ブリッジ接点を作製する。加えて、これはＳｅｒ１０３及びＴｙｒ１０９に対する水素結合を作製する。（ｃ）Ａｒｇ９８は、ＲＢＤとは接触しないＣＤＲ３ループ内でだけ変化し、その代わりに、この残基はループ構造を安定化する。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４のＧｌｕ１０８、Ａｒｇ１０３及びＴｒｐ１１３は、ＣＤＲ３ループを安定化するうえで重要な役割を果たす。

【図16B】Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体を安定化する重要な相互作用である。（ａ）ＲＢＤ中のＴｙｒ４４９の芳香族環は、Ａｓｎ１０１においてＨ１１－Ｄ４上の疎水性パッチに対して積み重なる。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４のＡｒｇ５２及びＣＤＲ２は、ＲＢＤのＰｈｅ４９０に対して積み重なり、Ｇｌｕ４８４との塩ブリッジ接点を作製する。加えて、これはＳｅｒ１０３及びＴｙｒ１０９に対する水素結合を作製する。（ｃ）Ａｒｇ９８は、ＲＢＤとは接触しないＣＤＲ３ループ内でだけ変化し、その代わりに、この残基はループ構造を安定化する。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４のＧｌｕ１０８、Ａｒｇ１０３及びＴｒｐ１１３は、ＣＤＲ３ループを安定化するうえで重要な役割を果たす。

【図16C】Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体を安定化する重要な相互作用である。（ａ）ＲＢＤ中のＴｙｒ４４９の芳香族環は、Ａｓｎ１０１においてＨ１１－Ｄ４上の疎水性パッチに対して積み重なる。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４のＡｒｇ５２及びＣＤＲ２は、ＲＢＤのＰｈｅ４９０に対して積み重なり、Ｇｌｕ４８４との塩ブリッジ接点を作製する。加えて、これはＳｅｒ１０３及びＴｙｒ１０９に対する水素結合を作製する。（ｃ）Ａｒｇ９８は、ＲＢＤとは接触しないＣＤＲ３ループ内でだけ変化し、その代わりに、この残基はループ構造を安定化する。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４のＧｌｕ１０８、Ａｒｇ１０３及びＴｒｐ１１３は、ＣＤＲ３ループを安定化するうえで重要な役割を果たす。

【図16D】Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体を安定化する重要な相互作用である。（ａ）ＲＢＤ中のＴｙｒ４４９の芳香族環は、Ａｓｎ１０１においてＨ１１－Ｄ４上の疎水性パッチに対して積み重なる。（ｂ）Ｈ１１－Ｈ４のＡｒｇ５２及びＣＤＲ２は、ＲＢＤのＰｈｅ４９０に対して積み重なり、Ｇｌｕ４８４との塩ブリッジ接点を作製する。加えて、これはＳｅｒ１０３及びＴｙｒ１０９に対する水素結合を作製する。（ｃ）Ａｒｇ９８は、ＲＢＤとは接触しないＣＤＲ３ループ内でだけ変化し、その代わりに、この残基はループ構造を安定化する。（ｄ）Ｈ１１－Ｄ４のＧｌｕ１０８、Ａｒｇ１０３及びＴｒｐ１１３は、ＣＤＲ３ループを安定化するうえで重要な役割を果たす。

【図17】ＳＡＲＳ－２受容体結合ドメインとナノボディＨ１１との間の相互作用である。精製されたＲＢＤ（レーン１）、精製されたＮｂ Ｈ１１（レーン２）及びサイズ排除カラムから共溶出されたＲＢＤ－Ｎｂ１１のＳＤＳ ｐａｇｅは、１：１の複合体への組み立てを示している。

【図18A】（ａ）ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４のセンサチップに固定化されたＡＣＥ２－Ｆｃ ＩｇＧとの競合アッセイである。ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４は、ＲＢＤへの結合についてＡＣＥ－２と競合する。（ｂ）ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４のセンサチップに固定化されたＣＲ３０２２ ＩｇＧとの競合アッセイである。Ｅ０８Ｒ Ｆａｂは、陰性対照である。ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４は、ＲＢＤへの結合についてＣＲ３０２２とは競合しない。

【図18B】（ａ）ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４のセンサチップに固定化されたＡＣＥ２－Ｆｃ ＩｇＧとの競合アッセイである。ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４は、ＲＢＤへの結合についてＡＣＥ－２と競合する。（ｂ）ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４のセンサチップに固定化されたＣＲ３０２２ ＩｇＧとの競合アッセイである。Ｅ０８Ｒ Ｆａｂは、陰性対照である。ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４は、ＲＢＤへの結合についてＣＲ３０２２とは競合しない。

【図19A】（ａ）スパイクＳ１三量体中の全ての３つのＲＢＤは、ＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４と結合する。「アップ型」配置の鎖は、ＲＢＤが赤色で強調され、結合したナノボディが黄色で強調されて、オレンジ色で着色されている。Ｓ１タンパク質の「ダウン型」鎖のうちの１つは、淡い青色で着色され、ナノボディは薄い紫色で着色されており、他の「ダウン型」鎖は、その結合したナノボディが褐色で着色されて、緑色で着色されている。（ｂ）ＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４ ＲＢＤ界面を形成する残基の大写し図であり選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、酸素が赤色、窒素が青色で着色されて、黒色でラベル付けされている。選択されたＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４原子は、炭素が黄色で、他の原子がＲＢＤとして着色されて、黄色でラベル付けされている。

【図19B】（ａ）スパイクＳ１三量体中の全ての３つのＲＢＤは、ＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４と結合する。「アップ型」配置の鎖は、ＲＢＤが赤色で強調され、結合したナノボディが黄色で強調されて、オレンジ色で着色されている。Ｓ１タンパク質の「ダウン型」鎖のうちの１つは、淡い青色で着色され、ナノボディは薄い紫色で着色されており、他の「ダウン型」鎖は、その結合したナノボディが褐色で着色されて、緑色で着色されている。（ｂ）ＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４ ＲＢＤ界面を形成する残基の大写し図であり選択されたＲＢＤ残基は、炭素が灰色で着色され、酸素が赤色、窒素が青色で着色されて、黒色でラベル付けされている。選択されたＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４原子は、炭素が黄色で、他の原子がＲＢＤとして着色されて、黄色でラベル付けされている。

【図20】ＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４とＲＢＤとの間の相互作用を詳述するＬｉｇｐｌｏｔ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ，２０１１）である。

【図21】三元複合体ＣＤＲ３０２２、ＲＢＤ及びＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４は、ナノボディ及び抗体が、完全に異なるエピトープを認識することを示す。

【図22】図２１に示された三元複合体からのＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４及びＲＢＤのＲＢＤ ＡＣＥ－２複合体との重ね合わせ｛Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０，＃５５９７４｝は、ＮＢＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４がＲＢＤに結合するとき、それが立体衝突によりＡＣＥ－２がＲＢＤに結合することを妨害することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する様々な抗体及び単一ドメイン抗体が知られており、例えば、それらは、ＣＮ１１１３０３２７９、ＣＮ１１１６４７０７６、ＣＮ１１１３３３７２２である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ，ｖｏｌ． ２７，ｐｇ ８９１－８９８，１４．０５．２０２０）及びＤｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｖｏｌ ９（１），ｐｇ １０３４－１０３６，２２．０５．２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又は関連するＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質に対して作られたナノボディを含む抗体は、両方ともウイルス－受容体結合絵をブロックし、場合によっては、インビトロ及びインビボの両方でウイルスを中和することが示されている（Ｚｈｕ，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉら、２００７、Ｚｈａｏ，Ｈｅら、２０１８）。感染患者由来の抗体がＳタンパク質に結合することも示されている（Ｊａｎ ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ Ｅｄｗａｒｄ Ｎ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ Ｌｅｏ Ｌ．Ｍ．Ｐｏｏｎ ２００６、Ｐｒａｂａｋａｒａｎ，Ｇａｎら、２００６、Ｚｈｕ，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉら、２００７）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の病原性におけるＳタンパク質の役割、及びワクチン並びに治療薬開発のための標的としての可能性（Ｄｕ、Ｈｅら、２００９）を考慮して、本発明者らは、構造及び機能研究のために、ウイルスのＲＢＤに対する単一ドメイン抗体を産生することに焦点を当てた。

【0015】

本明細書で使用される「保存的置換」は、タンパク質の機能（例えば、特定の標的に、特に、本発明の範疇におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルススパイクタンパク質に結合する能力、又は対象において免疫応答を引き起こすための能力）に重要な影響を及ぼさないアミノ酸置換を指す。当業者であれば、アミノ酸の特性を容易に理解し、得られたポリペプチドの特性に重要な変更を与えることなく保存的置換を容易に行うことができる。保尊的置換の例を、以下の表に提供する。

【0016】

【表1】

【0017】

本明細書で使用される「欠失」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の除去（すなわち、アミノ酸配列の長さが１つのアミノ酸だけ短くなるように、１つのアミノ酸がいかなるアミノ酸でも置き換えられないこと）を指す。欠失は、ポリヌクレオチド配列に言及することができ、ポリヌクレオチド配列からの１つの核酸の除去（ポリヌクレオチド配列の長さが１つの核酸だけ短くなるように、１つの核酸がいかなる核酸でも置き換えられないこと）を指す場合もある。

【0018】

本明細書で使用される「同一性」は、ポリヌクレオチド配列の２つ以上のポリペプチドを比較することによって決定されるような、２つの配列が関連している程度である。同一性は、２つの配列がどの程度一致するかの測定値を提供するための２つの配列の関連度を使用して決定することができる。ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を比較するための多数のプログラムが、当業者に周知であり、例えば、限定されないが、様々なＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬプログラムがある。パーセンテージ同一性を使用して、配列同一性を定量化することができる。パーセンテージ同一性を計算するために、２つの配列（ポリペプチド又はヌクレオチド）が最適にアラインされる（すなわち、２つの配列が各対応する位置で最大数の同一の残基を有し、したがって最大のパーセンテージ同一性を有するように配置され）、各位置のアミノ酸又は核酸残基がその位置での対応するアミノ酸又は核酸と比較される。場合によっては、最適な配列アラインメントは、配列中に空間（複数可）を挿入し第２の配列に最適に適合させることによって達成することができる。同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの数は、パーセンテージ同一性を提供し、すなわち、１０個の残基のうちの９個の残基が、比較されている２つの配列の間で同一である場合、同一性％は、９０％である。パーセンテージ同一性は、一般に、比較される２つの配列の完全長に沿って計算される。

【0019】

「挿入」はポリペプチド配列中のアミノ酸の付加を指す（すなわち、１つのアミノ酸の挿入は、アミノ酸配列の長さが１つのアミノ酸だけ長くなるように、１つの新しいアミノ酸が既存のアミノ酸配列中に付加されることを意味する）。挿入は、ポリヌクレオチド配列に言及することができ、ポリヌクレオチド配列への１つの核酸の付加を指す場合もある（核酸の長さが１つのアミノ酸だけ長くなるように、１つの新しい核酸が既存のポリヌクレオチド配列に付加されることを意味する）。

【0020】

本明細書で使用される「修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸残基の変更を指す。修飾は、本明細書で定義されるように、置換、欠失又は挿入であり得る。修飾はまた、ポリヌクレオチド配列に言及することができる。

【0021】

本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖の可変領域を指し、この可変領域は、ラクダ科免疫グロブリンの重鎖のみの（すなわち、軽鎖を欠いている）サブセットに由来する。単一ドメイン抗体という用語は、（ラクダ科ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ抗体の可変ドメイン、ＶＨＨ）及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）と互換的に使用され得る。本発明の範疇において、単一ドメイン抗体は、この名ウイルス、好ましくはＳＡＲ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる単一重鎖可変領域を指すように使用される。抗体は、本明細書に記載されるように、親和性成熟され、ヒト化又は修飾され得る。この単一ドメイン抗体は、他の成分と結合することができる。

【0022】

本明細書で使用される「置換」は、アミノ酸の異なるアミノ酸との置き換えを指す。置換は又ポリヌクレオチド配列に言及することができ、すなわち、１つの核酸の異なる核酸との置き換えを指す。置換は、上で定義されたように、保存的置換であり得る。

【0023】

本発明の単一ドメイン抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の受容体結合ドメインに対して積極的な結合を有する１３個のＶＨＨ配列、すなわち、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１、ＮｂＲＢＤ＿Ａ７、ＮｂＲＢＤ＿Ｆ９、ＮｂＲＢＤ＿Ｃ１０、ＮｂＲＢＤ＿Ｂ１１、ＮｂＲＤＢ＿Ｅ１１、ＮｂＲＢＤ＿Ｄ１、ＮｂＲＢＤ＿ｚｉ－７、ＮｂＲＢＤ＿Ｆ５、ＮｂＲＢＤ＿Ｇ１１、ＮｂＲＢＤ＿Ｂ４、ＮｂＲＢＤ＿Ｇ９及びＮｂＲＢＤ＿Ｃ７（それぞれ、アミノ酸配列は配列番号６１～７３で提供され、ポリヌクレオチド配列は、配列番号７４～８６で提供される）に基づく。ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１の親和性成熟バージョンも提供されており、すなわち、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ４、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｈ４、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｈ６、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ａ１０、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｂ５、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ａ７、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｆ７、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｆ６、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－ｚｉ－８、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ１、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ａ９、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｃ６、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｅ３、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｆ４、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｃ５、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｃ２、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｂ１１、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ａ３、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ１２、ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｄ６及びＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１－Ｆ８である（それぞれ、アミノ酸配列は配列番号８７～１０７で提供され、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０８～１２８で提供される）。

【0024】

特定されたＣＤＲのアミノ酸配列を定義するために、特定のアミノ酸配列が本明細書に提供される。便宜上、これらを、以下の表１及び表２にリストする。これらの特定されたＣＤＲ配列を含む本発明の単一ドメイン抗体は、本明細書に詳説されるように１つ以上の修飾を含み得、コロナウイルスペプチドに対する、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の受容体結合ドメインに対する結合親和性を保持する。

【0025】

【表2】

【0026】

【表3】

【0027】

一態様では、相補性決定領域、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、単一ドメインが、ＣＤＲ１、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）又は相補性決定領域３（ＣＤＲ３）から選択される相補性決定領域を含むように提供される。一実施形態では、単一ドメイン抗体が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３から選択される少なくとも１つの相補性決定領域を含むように提供される。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３から選択される少なくとも２つの相補性決定領域を含む。一実施形態では、単一ドメイン抗体が、３つの相補性決定領域：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むように提供される。

【0028】

一実施形態では、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０からなる群から選択される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む単一ドメイン抗体が提供され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～１０個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０からなる群から選択される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む単一ドメイン抗体が提供され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個及び０～１個のアミノ酸修飾を含む。修飾は、置換、欠失、又は挿入であり得る。一実施形態では、修飾は置換である。

【0029】

一実施形態では、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０からなる群から選択される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む単一ドメイン抗体が提供され、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０のアミノ酸配列のＣＤＲ３領域は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、配列番号１２、１５、１８、２７、３０、３３及び３６のアミノ酸配列のＣＤＲ３領域は、０～５個のアミノ酸修飾を含み、配列番号９、２４及び３９のアミノ酸配列のＣＤＲ３領域は、０～３個のアミノ酸修飾を含む。

【0030】

好ましい実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０からなる群から選択される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）は、４０、４１、４２、４３及び４４からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）は、配列番号４１である。一実施形態では、ＣＤＲ３は、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。修飾は、置換、欠失、又は挿入であり得る。一実施形態では、修飾は置換である。

【0031】

一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ２領域を更に含み得る。ＣＤＲ２領域は、本明細書に開示される配列番号に従って定義され得る。更なる実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域を更に含み得る。ＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域は、本明細書に開示される配列番号に従って定義され得る。各実施形態では、単一ドメイン抗体は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を更に含んでもよい。

【0032】

一態様では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が、提供され、単一抗体ドメインは、
（ａ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号３を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号５を含むＣＤＲ２及び配列番号６を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号８を含むＣＤＲ２及び配列番号９を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１を含むＣＤＲ２及び配列番号１２を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号１４を含むＣＤＲ２及び配列番号１５を含むＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号１７を含むＣＤＲ２及び配列番号１８を含むＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号２０を含むＣＤＲ２及び配列番号２１を含むＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号２３を含むＣＤＲ２及び配列番号２４を含むＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号２６を含むＣＤＲ２及び配列番号２７を含むＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号２９を含むＣＤＲ２及び配列番号３０を含むＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号３２を含むＣＤＲ２及び配列番号３３を含むＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号３５を含むＣＤＲ２及び配列番号３６を含むＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号３８を含むＣＤＲ２及び配列番号３９を含むＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｏ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｐ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｒ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４５を含むＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４６を含むＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４７を含むＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４８を含むＣＤＲ３；
（ｗ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４９を含むＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５０を含むＣＤＲ３；
（ｙ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５１を含むＣＤＲ３；
（ｚ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５２を含むＣＤＲ３；
（ａａ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５３を含むＣＤＲ３；
（ｂｂ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５４を含むＣＤＲ３；
（ｃｃ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５５を含むＣＤＲ３；
（ｄｄ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５６を含むＣＤＲ３；
（ｅｅ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５７を含むＣＤＲ３；
（ｆｆ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５８を含むＣＤＲ３；
（ｇｇ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５９を含むＣＤＲ３；
（ｈｈ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号６０を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、０～４個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ２領域は、０～３個、０～２個、０～４個、０～１個のアミノ酸修飾を含む。

【0033】

一実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供され、単一抗体ドメインは、
（ａ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４５を含むＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４６を含むＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４７を含むＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４８を含むＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４９を含むＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５０を含むＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５１を含むＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５２を含むＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５３を含むＣＤＲ３；
（ｏ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５４を含むＣＤＲ３；
（ｐ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５５を含むＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５６を含むＣＤＲ３；
（ｒ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５７を含むＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５８を含むＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５９を含むＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号６０を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、０～４個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ２領域は、０～３個、０～２個、０～４個、０～１個のアミノ酸修飾を含む。

【0034】

一実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供され、単一抗体ドメインは、
（ａ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、０～４個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ２領域は、０～３個、０～２個、０～４個、０～１個のアミノ酸修飾を含む。

【0035】

一実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供され、単一抗体ドメインは、
（ａ）配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、０～４個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ２領域は、０～３個、０～２個、０～４個、０～１個のアミノ酸修飾を含む。

【0036】

一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１領域を更に含み得る。ＣＤＲ１領域は、本明細書に開示される配列番号に従って定義され得る。各実施形態では、単一ドメイン抗体は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を更に含んでもよい。

【0037】

一態様では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供され、単一抗体ドメインは、
（ａ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号３を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号４を含むＣＤＲ１、配列番号５を含むＣＤＲ２及び配列番号６を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号７を含むＣＤＲ１、配列番号８を含むＣＤＲ２及び配列番号９を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０を含むＣＤＲ１、配列番号１１を含むＣＤＲ２及び配列番号１２を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号１３を含むＣＤＲ１、配列番号１４を含むＣＤＲ２及び配列番号１５を含むＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号１６を含むＣＤＲ１、配列番号１７を含むＣＤＲ２及び配列番号１８を含むＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号１９を含むＣＤＲ１、配列番号２０を含むＣＤＲ２及び配列番号２１を含むＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号２２を含むＣＤＲ１、配列番号２３を含むＣＤＲ２及び配列番号２４を含むＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号２５を含むＣＤＲ１、配列番号２６を含むＣＤＲ２及び配列番号２７を含むＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号２８を含むＣＤＲ１、配列番号２９を含むＣＤＲ２及び配列番号３０を含むＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号３１を含むＣＤＲ１、配列番号３２を含むＣＤＲ２及び配列番号３３を含むＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２及び配列番号３６を含むＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号３７を含むＣＤＲ１、配列番号３８を含むＣＤＲ２及び配列番号３９を含むＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｏ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｐ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｒ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４５を含むＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４６を含むＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４７を含むＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４８を含むＣＤＲ３；
（ｗ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４９を含むＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５０を含むＣＤＲ３；
（ｙ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５１を含むＣＤＲ３；
（ｚ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５２を含むＣＤＲ３；
（ａａ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５３を含むＣＤＲ３；
（ｂｂ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５４を含むＣＤＲ３；
（ｃｃ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５５を含むＣＤＲ３；
（ｄｄ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５６を含むＣＤＲ３；
（ｅｅ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５７を含むＣＤＲ３；
（ｆｆ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５８を含むＣＤＲ３；
（ｇｇ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５９を含むＣＤＲ３；
（ｈｈ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号６０を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、０～４個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、０～４のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ２領域は、０～３個、０～２個、０～４個、０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ１領域は、０～３個、０～２個、０～４個、０～１個のアミノ酸修飾を含む。

【0038】

一態様では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供され、単一抗体ドメインは、
（ａ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４５を含むＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４６を含むＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４７を含むＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４８を含むＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４９を含むＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５０を含むＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５１を含むＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５２を含むＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５３を含むＣＤＲ３；
（ｏ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５４を含むＣＤＲ３；
（ｐ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５５を含むＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５６を含むＣＤＲ３；
（ｒ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５７を含むＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５８を含むＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号５９を含むＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号６０を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、０～４個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、０～４のアミノ酸修飾を含む。

【0039】

一態様では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供され、単一抗体ドメインは、
（ａ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４０を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４１を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４２を含むＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４３を含むＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２及び配列番号４４を含むＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、０～７個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、０～４個のアミノ酸修飾を含み、ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、０～４のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は、配列番号４１である。

【0040】

一実施形態では、配列番号１を含むＣＤＲ１と、配列番号２を含むＣＤＲ２と、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。

【0041】

一実施形態では、配列番号１を含むＣＤＲ１と、配列番号２を含むＣＤＲ２と、配列番号４０、４１、４２、４３及び４４から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、配列番号１を含むＣＤＲ１と、配列番号２を含むＣＤＲ２と、配列番号４１を含むＣＤＲ３とを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。

【0042】

一実施形態では、一本鎖抗体は、４つのフレームワーク領域を含む。フレームワーク領域はＣＤＲ配列を分離する。一実施形態では、４つのフレームワーク領域は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、及びフレームワーク領域４（ＦＲ４）であり、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の間に散在している（すなわち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４）。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、４つのフレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含むか、又はそれらから本質的になる。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、４つのフレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）からなる。

【0043】

いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、ＣＤＲ領域（単数又は複数）中にある。他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、フレームワーク領域中にあり、すなわち、ＣＤＲ領域（単数又は複数）中にはない。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、ＣＤＲ領域（単数又は複数）中にある。他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド酸修飾は、フレームワーク領域中にあり、すなわち、ＣＤＲ領域（単数又は複数）中にはない。

【0044】

一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、０～７個、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個及び０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ２領域は、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＣＤＲ１領域は、０～４個、０～３個、０～２個又は０～１個のアミノ酸修飾を含む。修飾は、置換、欠失又は挿入であり得る。一実施形態では、修飾は置換である。

【0045】

一実施形態では、１つ以上の修飾を含む本発明の単一ドメイン抗体は、いかなる修飾も含まない特定された配列と実質的に等しいか、又はそれよりも良好な（例えば、低いＫｄ値）である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の受容体結合ドメインに対する結合親和性を有する。

【0046】

一態様では、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。これらの配列の各々は、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）とを含む。一実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７からなる群から選択される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有し、任意選択で、７５～１００％、８０～１００％、８５～１００％、９０～１００％、９１～１００％、９２～１００％、９３～１００％、９４～１００％、９５～１００％、９６～１００％、９７～１００％、９８～１００％の同一性を有する。一実施形態では、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７を含むか、又はそれらから本質的になる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。

【0047】

本明細書及び全体にわたって、少なくともは、いくつかの実施形態では、列挙されたパーセンテージから１００％までを意味する。例えば、少なくとも７５％は、いくつかの実施形態では、７５％～１００％を意味する。

【0048】

一態様では、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。これらの配列の各々は、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）とを含み、ＣＤＲ３領域は、親和性成熟されている。一実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７からなる群から選択される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有し、任意選択で、７５～１００％、８０～１００％、８５～１００％、９０～１００％、９１～１００％、９２～１００％、９３～１００％、９４～１００％、９５～１００％、９６～１００％、９７～１００％、９８～１００％の同一性を有する。一実施形態では、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７を含むか、又はそれらから本質的になる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。

【0049】

一態様では、配列番号８７、８８、８９、９０及び９１からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号８７、８８、８９、９０及び９１からなる群から選択される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有し、任意選択で、７５～１００％、８０～１００％、８５～１００％、９０～１００％、９１～１００％、９２～１００％、９３～１００％、９４～１００％、９５～１００％、９６～１００％、９７～１００％、９８～１００％の同一性を有する。一実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号８７、８８、８９、９０及び９１からなる群から選択される。

【0050】

一態様では、配列番号８８と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体である。一実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号８８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有し、任意選択で、７５～１００％、８０～１００％、８５～１００％、９０～１００％、９１～１００％、９２～１００％、９３～１００％、９４～１００％、９５～１００％、９６～１００％、９７～１００％、９８～１００％の同一性を有する。一実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号８８である。

【0051】

一態様では、本発明の単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである。そのような核酸配列は、遺伝子構築物の形態であり得る。

【0052】

一実施形態では、配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなるか、又はそれらから本質的になる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。

【0053】

一実施形態では、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなるか、又はそれらから本質的になる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。

【0054】

一実施形態では、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１及び１１２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一ドメイン抗体が提供される。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１及び１１２からなる群から選択される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１及び１１２からなる群から選択される。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０９である。

【0055】

本発明の単一ドメイン抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の受容体結合ドメインに結合する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合ドメインのアンジオテンシン変換酵素２受容体（ＡＣＥ２受容体）への結合を阻害し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合ドメインのＡＣＥ２受容体への結合が、少なくとも１０％、任意選択で、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％少なくとも９５％又は１００％阻害される。ＡＣＥ２受容体への結合のパーセンテージ阻害は、表面プラズモン共鳴が挙げられるが、これに限定されない、当業者に十分に理解される多くの方法で測定することができる。

【0056】

コロナウイルススパイクタンパク質とその標的との間の相互作用を妨害することによって、本発明の単一ドメイン抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和することができる。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．１μＭ未満、又は０．０１μＭ未満のＮＤ５０値（ＮＤ５０＝感染細胞の数を５０％だけ低減させる抗体の濃度）を有する。

【0057】

一実施形態では、単一ドメイン抗体は、０．１μＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭのＮＤ５０値を有する。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、０．１μＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、１ｐＭ未満、０．５ｐＭ未満、又は０．１ｐＭ未満のＮＤ５０値を有する。ＮＤ５０は、本明細書に開示されるものを含む、任意の標準的な中和アッセイを使用して決定することができる。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、非中和ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染拡大を防止することができる。

【0058】

一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、又は０．１ｎＭ未満のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、特にスパイクタンパク質の受容体結合ドメインに対するＫｄ値を有する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、１ｐＭ未満、０．５ｐＭ未満、又は０．１ｐＭ未満のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するＫｄ値を有する。抗体の結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴を含む、いくつかの標準的な周知の技術に従って測定することができる。一実施形態では、本明細書に特定される１つ以上の修飾を有する本発明の単一ドメイン抗体は、１つ以上の修飾を含まない対応する単一ドメイン抗体の結合親和性値の２０％以内である（１つ以上の修飾を含まない対応する単一ドメイン抗体の結合親和性値を２０％下回るか又は２０％上回る範囲内である）結合親和性値を有する。一実施形態では、本明細書に特定される１つ以上の修飾を有する本発明の単一ドメイン抗体の結合親和性値は、１つ以上の修飾を含まない対応する単一ドメイン抗体の結合親和性値の１０％以内、任意選択で５％、４％、３％、２％、又は１％以内である。

【0059】

更に、本発明の単一ドメイン抗体は、コロナウイルス性を調節、低減又は防ぐことができる。本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルスの標的宿主細胞への融合を調節、遮断又は阻害することができる。本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルスの標的宿主細胞への侵入を調節、遮断又は阻害することができる。

【0060】

一態様では、本発明の単一ドメイン抗体の親和性成熟された変異体が提供される。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ１が、親和性成熟される。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ２が、親和性成熟される。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ３が、親和性成熟される。一実施形態では、ＣＤＲ３が親和性成熟され、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２のいずれかも親和性成熟される。一実施形態では、ＣＤＲ３が親和性成熟され、ＣＤＲ２も親和性成熟される。一実施形態では、ＣＤＲ３が親和性成熟され、ＣＤＲ１も親和性成熟される。一実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各々が親和性成熟される。一実施形態では、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てが親和性成熟される。一実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各々が、親和性成熟される。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体の親和性成熟された変異体の親和性は、それが誘導された親抗体よりも高い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する親和性を有する。

【0061】

配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０のＣＤＲ３配列は、配列番号３のＣＤＲ３配列の親和性成熟されたバリアント（ＮｂＲＢＤ＿Ｈ１１）である。驚くべきことに、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ３領域の７つのアミノ酸長の領域中の変動が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質に対する特に改善された親和性をもたらし、７つのアミノ酸配列がＣＤＲ３配列における２番目のアミノ酸から開始して、配列における８番目のアミノ酸で終了する（すなわち、１位は、ＣＤＲ３配列の開始アラニン（Ａ）を指す）ことが発見された。一実施形態では、ＣＤＲ３領域は、ＣＤＲ３の７つのアミノ酸長領域中に修飾を含み、７つのアミノ酸長領域は、ＣＤＲ３の２位で開始し、ＣＤＲ３の８位で終了する。

【0062】

一態様では、本発明のヒト化単一ドメイン抗体が提供される。ヒト化は、抗体のアミノ酸配列の修飾を必要とする。本発明の単一ドメイン抗体の免疫原性を低減させる方法としては、例えば、部位特異的変異導入による、抗体フレームワーク足場へのＣＤＲグラフティング又は可変表面残基のリモデリングが挙げられる。ナノボディ（登録商標）のヒト化の方法は当業者に既知であり、例えば、Ｖｉｎｃｋｅら、２００９を参照されたい。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ１がヒト化されている。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ２がヒト化されている。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ３がヒト化されている。一実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ又は少なくとも２つがヒト化されている。一実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各々がヒト化されている。一実施形態では、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は４つ全てがヒト化されている。一実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各々がヒト化されている。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、例えば、より良好な抗原結合を保持するために、保存的にヒト化されている。

【0063】

一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に融合又は結合されている。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、ｓｃＦｖ領域に融合又は結合されている。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、二価又は多価抗体である。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、二重特異性又は多重特異性抗体である。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、キメラ抗体である。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、２本のＶＨＨ鎖を構成し、このＶＨＨ鎖は、本明細書に開示される単一ドメイン抗体のいずれかであり得る。一実施形態では、本発明の配列を含む免疫学的に活性な分子（抗体、ポリペプチド又は免疫グロブリン分子が提供され）、例えば、免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）及びそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；並びにダイアボディである。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体を含むタンパク質又は融合発現産物が提供される。

【0064】

一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体を発現するのに好適なベクターが提供される。ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、ファージ又は人工染色体であり得る。一態様では、発現ベクター又はプラスミドを含む宿主細胞であって、発現ベクター又はプラスミドが、本発明のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞が提供される。一実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれた本発明のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞、又は真核細胞、例えば、酵母細胞若しくは哺乳動物細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞又はＣＨＯ細胞である。

【0065】

一態様では、（ａ）本明細書に提供される宿主細胞を、単一ドメイン抗体を産生するのに好適な条件下で培養して、単一ドメイン抗体を含有する培養物を得る工程と、（ｂ）前記単一ドメイン抗体を培養物から単離する工程とを含む、本発明の単一ドメイン抗体を産生するための方法が提供される。

【0066】

本発明の一態様は、上で定義された本発明の単一ドメイン抗体を組成物又は医薬組成物で提供する。組成物は、本発明の単一ドメイン抗体を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。

【0067】

一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、人間医学及び獣医学においてヒト又は動物の使用のためのものであり得る。医薬組成物は、投与の経路に従って製剤化され得る。一実施形態では、医薬組成物は、経口、鼻腔、眼、口腔、膣、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、又は皮下投与用に製剤化される。好ましい投与経路では、医薬組成物は、吸入による投与用に、任意選択で鼻孔吸入又は経口吸入用に製剤化される。この形態の医薬組成物は、エアロゾル、微粒子又は微粉を含み得る。

【0068】

一実施形態では、組成物又は医薬組成物は、任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。一実施形態では、組成物又は医薬組成物は、任意選択で、１つ以上の薬学的に許容されるアジュバントを含む。一実施形態では、組成物又は医薬組成物は、任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と混合される。そのような医薬組成物の異なる形態に好適な賦形剤の例は、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４）、Ａ Ｗａｄｅ ａｎｄ ＰＪ Ｗｅｌｌｅｒ編集で見出すことができる。

【0069】

組成物又は医薬組成物は、１つ以上の追加の成分を含んでもよい。一実施形態では、組成物又は医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。一実施形態では、担体は、肺送達に好適である。一実施形態では、組成物又は医薬組成物は、治療活性剤を更に含む。

【0070】

一実施形態では、組成物又は医薬組成物は、タンパク質又は生物学的活性分子に接合若しくは結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されてもよい。一実施形態では、組成物又は医薬組成物は、融合タンパク質の一部であり、１つ以上のタンパク質又は生物学的活性分子に融合される。タンパク質又は生物学的活性分子は、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、スプリット蛍光タンパク質（すなわち、薬物の存在下で一緒に結合する２つ以上の部分に分割する）、スプリット生物発光タンパク質、バイオセンサー、蛍光バイオセンサー、スプリット若しくはヒンジ付きバイオセンサーであり得る。

【0071】

一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体を含むワクチンが提供される。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンが提供される。

【0072】

本発明の組成物、医薬組成物、及びワクチンは、対象において免疫応答、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、病魚免疫応答である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の症状又は重症度を低減させる。

【0073】

いくつかの実施形態では、限定されないが、Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃが含まれる、本発明の抗体の投与は、非中和ウイルスが複製及び／又は蔓延することを防止若しくは実質的に低減する。これは、プラーク減少中和試験データによって裏付けられ：限定されないが、Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃが含まれる、本発明の抗体の存在下において、形成されるプラークは、通常予想されるものよりも強い差異（図９）。いくつかの実施形態では、限定されないが、Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃが含まれる、本発明の抗体は、陽性対照、例えば、ＣＲ３０２２の存在下のものよりも５％小さいプラークを形成することが可能である。いくつかの実施形態では、プラークは、陽性対照（例えば、ＣＲ３０２２）の存在下のものよりも１０％小さく、いくつかの実施形態では、プラークは陽性対照（例えば、ＣＲ３０２２）の存在下のものよりも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％小さい。

【0074】

医薬デバイス、例えば、本発明の医薬組成物を投与するのに好適な吸入器も提供される。一実施形態では、医薬デバイス、例えば吸入器は、本発明の単一ドメイン抗体を含む。
本発明の単一ドメイン抗体を提供するキットも提供される。そのようなキットは、使用説明書及び／又は追加の薬学的に活性な成分を含み得る。単一ドメイン抗体と追加の薬学的に活性な成分とは、一緒に製剤化されてもよく、又はあるいは、いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体と追加の薬学的に活性な成分とは、キット内に別個に存在してもよい。

【0075】

一態様では、医療における使用のための本発明の単一ドメイン抗体又は本発明の医薬組成物が提供される。本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルスを治療するために、任意選択で、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）を治療するために、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９を治療するために使用することができる。本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のその標的、アンジオテンシン変換酵素２受容体との間の相互作用をブロック又は修正するために使用することができる。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のその標的、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体との結合をブロック、低減又は阻害する。スパイクタンパク質とその標的との間の相互作用を妨害することによって、本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルスを中和することができ、及び／又はコロナウイルス感染力を調節、低減若しくは防止することができる。本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルスの標的宿主細胞への融合を調節、ブロック又は阻害することができる。本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルスの標的宿主細胞への侵入を調節、ブロック又は阻害することができる。

【0076】

本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物は、コロナウイルス感染症、特にＣＯＶＩＤ－１９感染症の治療又は予防に使用することができる。一実施形態では、コロナウイルス感染症、任意選択で、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９の治療又は予防における使用のための、本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物が提供される。一実施形態では、ＣＯＶＩＤ－１９の治療又は予防における使用のための、本発明の単一ドメイン抗体又は医薬組成物が提供される。

【0077】

一態様では、治療活性量の本発明の単一ドメイン抗体を対象に投与する工程を含む、対象におけるコロナウイルスの治療のための方法が提供される。一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。

【0078】

一態様では、コロナウイルスの治療及び／又は予防における使用のための医薬品の製造における、本発明の単一ドメイン抗体の使用が提供される。一実施形態では、コロナウイルスの治療における使用のための医薬品の製造における、本発明の単一ドメイン抗体の使用が提供される。

【0079】

一実施形態では、コロナウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＣＯＶＩＤ－１９からなる群から選択される。一実施形態では、コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である。本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９の重篤な症状を表す対象を治療することに関し、又はあるいはＣＯＶＩＤ－１９のより軽度の症状を示す対象を治療することに関する。いくつかの実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、コロナウイルス感染症と関連するサイトカインストームを治療するために有用である。

【0080】

一実施形態では、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスタンパク質の検出のための方法が提供される。好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の検出のための方法が提供される。一実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質の存在を検出するための方法が提供される。一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の存在を検出するための方法が提供される。

【0081】

一実施形態では、試料中のコロナウイルスタンパク質を検出するための方法が提供され、この方法は、（ａ）試料を本発明の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、（ｂ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、複合体の存在が、コロナウイルスタンパク質の存在を示す。方法の工程（ａ）において、試料は、抗体－抗原複合体が形成するのに好適な条件下で、単一ドメイン抗体と接触される。抗原は、コロナウイルスタンパク質である。一実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質の存在を検出するための方法が提供される。一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質、任意選択で、Ｓタンパク質の受容体結合ドメインの存在を検出するための方法が提供される。

【0082】

試料は、生体試料、任意選択で、血液、血清、鼻汁、唾液、血漿、尿又はせき髄液などの退役であり得る。一実施形態では、生体試料は、咽頭・鼻腔ぬぐいを使用して得られた体液である。試料は、哺乳動物、好ましくはヒトから得ることができるか、又は単離することができる。一実施形態では、試料は、コロナウイルスを保有することが疑われる対象から得られるか、又は単離される。

【0083】

試料中のコロナウイルスタンパク質の存在を検出することは、対象がコロナウイルスに感染していることの明確な表示を与える。一実施形態では、検出の方法の結果は、コロナウイルスに関して対象を診断するために使用される。検出の方法におけるコロナウイルスタンパク質の存在は、コロナウイルスに対する陽性診断を提供する。検出の方法はまた、コロナウイルス感染症の感染に関する予後予測を提供するために使用されてもよい。

【0084】

一実施形態では、対象においてコロナウイルスタンパク質を検出するための方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明の単一ドメイン抗体を対象に投与する工程と、（ｂ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスタンパク質の存在を示す。一実施形態では、対象においてコロナウイルスタンパク質を検出するための方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明の単一ドメイン抗体を対象に投与する工程と、（ｂ）対象から試料を得、試料を本発明の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、（ｃ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスタンパク質の存在を示す。抗原は、コロナウイルスタンパク質である。一実施形態では、対象においてコロナウイルスタンパク質を検出するための方法が提供され、この方法は、（ａ）対象から試料を得る工程と、（ｂ）対象からの試料を本発明の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、（ｃ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスタンパク質の存在を示す。試料は、単離された（すなわち、対象から以前に得られた）試料であり得る。

【0085】

一態様では、対象においてコロナウイルス感染症を診断するための方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明の単一ドメイン抗体を対象に投与する工程と、（ｂ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスの陽性診断を提供する。一実施形態では、対象においてコロナウイルス感染症を診断するための方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明の単一ドメイン抗体を対象に投与する工程と、（ｂ）対象から試料を得、試料を本発明の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、（ｃ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスの陽性診断を提供する。一実施形態では、対象においてコロナウイルス感染症を診断するための方法が提供され、この方法は、（ａ）対象から試料を得る工程と、（ｂ）対象からの試料を本発明の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、（ｃ）抗体－抗原複合体を検出する工程とを含み、複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスの陽性診断を提供する。一実施形態では、対象においてコロナウイルス感染症を診断するための方法が提供され、この方法は、（ａ）試料を本発明の単一ドメイン抗体と接触させる工程と、（ｂ）抗体－ポリペプチド複合体の数を検出する工程と、（ｃ）試料中のコロナウイルスの存在を検出する工程とを含み、複合体の存在が、対象におけるコロナウイルスの陽性診断を提供する。試料は、単離された（すなわち、対象から以前に得られた）試料であり得る。

【0086】

一実施形態では、本方法は、試料を抗体－抗原複合体のレベルについて参照試料値と比較する工程を含む。参照試料値を上回る抗原－抗体複合体値は、コロナウイルス感染症の明確な表示を与える。試料は、単離された（すなわち、対象から以前に得られた）試料であり得る。

【0087】

いくつかの実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、放射性標識マーカー、イメージングマーカー、ＭＲＩ－マーカー、蛍光マーカー又は他の検出可能なマーカーなどのマーカーを更に含んでもよい。そのような抗体は、対象における抗体のリアルタイムの検出を可能にするために、本明細書に記載の検出又は診断法の各々で使用され得る。そのような抗体はまた、対象から単離若しくは得られた組織又は血液試料などの試料中の抗体の検出を可能にするために、本明細書に記載の検出又は診断法の各々で使用され得る。

【0088】

一実施形態では、コロナウイルスを検出するためのアッセイが提供され、アッセイは、（ａ）患者から得られた試料を、本発明の単一ドメイン抗体と接触させる工程を含み、単一ドメイン抗体は、患者試料中のコロナウイルスを選択的に単離するために検出可能な標識又はレポーター分子を含む。一実施形態では、コロナウイルスを検出するためのアッセイが提供され、アッセイは、（ａ）患者から得られた試料を、本発明の単一ドメイン抗体及びバイオセンサー、任意選択で蛍光又はヒンジ付きバイオセンサーを含む融合タンパク質と接触させる工程を含む。アッセイは、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）であり得る。検出可能な標識又はレポーター分子は、蛍光分子若しくは化学分子（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、若しくはローダミン）、バイオセンサー、放射性同位元素、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はルシフェラーゼ）であり得る。

【0089】

一実施形態では、キットが提供され、キットは、（ａ）検出可能なマーカーと、（ｂ）本発明の単一ドメイン抗体とを含む。検出可能な標識又はレポーター分子は、蛍光分子若しくは化学分子（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、若しくはローダミン）、バイオセンサー、任意選択で蛍光若しくはヒンジ付きバイセンサー、又は放射性同位元素、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はルシフェラーゼ）であり得る。

【0090】

本明細書に記載の方法は、インビトロ又はエクスビボで行われ得る。本明細書に記載の方法は、インビボでも実施され得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して説明される。

【実施例】

【0091】

方法
タンパク質産生
残基６８２－６８５（フリン切断部位）でのＲＲＡＲ＞ＧＳＡＳ及び残基９８６－９８７でのＫＶ＞ＰＰの変異、並びにＣ末端でのＴ４フィブリチン三量体化ドメイン、ＨＲＶ３Ｃ切断部位、６ｘＨｉｓタグ、及びのＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグの包含｛Ｗｒａｐｐら、２０２０｝を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質外部ドメインのアミノ酸１～１２０８コードする遺伝子を合成し、ＡｇｅｌとＸｈｏＩ制限部位の間でｐＨＬ－ｓｅｃベクターにサブクローニングした。クローンの有効性を、配列決定によって確認した。

【0092】

組換えスパイク外部ドメインを、ＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３０２２）での３０℃で９日間の一過性トランスフェクションによって発現した。条件培地を、２ｘＰＢＳ緩衝液に対して透析した。スパイク外部ドメインを、コバルトを充填したＴａｌｏｎ樹脂（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用した固定化金属親和性クロマトグラフィー、続いて１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、０．０２％のＮａＮ_３でＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム４℃を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。スパイク細胞外ドメインを含む最終画分を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより特定し、プールし、１００ｋＤａのＭＷＣＯ濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｍｅｒｃｋ）を使用して濃縮し、１６℃で保存した。

【0093】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＮ９０８９４７）の受容体結合ドメイン（ＲＢＤアミノ酸３３０～５３２）、及びヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２アミノ酸１９～６１５）のコドン最適化Ｇｅｎｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＣ末端ＢｉｒＡ－Ｈｉｓ６タグ及びｐＯＰＩＮＴＴＧｎｅｏ－３Ｃ－Ｆｃを組み込むベクターｐＯＰＩＮＴＴＧｎｅｏ（Ｎｅｔｔｌｅｓｈｉｐ、Ｗａｔｓｏｎら、２０１５）に挿入して、ヒトＩｇＧ ＦｃへのＣ末端融合体を作製した。組換えＲＢＤとＣＲ３０２２ ＦａｂフラグメントをＥｘｐｉ２９３（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）で一過性に発現させ、タンパク質を、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）で実装した自動化したプロトコル、続いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４の緩衝液を使用したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラムを使用して、固定化金属親和性によって培養上清から精製した（Ｎｅｔｔｌｅｓｈｉｐ、Ｒａｈｍａｎ－Ｈｕｑら、２００９）。ビオチンタンパク質リガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ，Ｃｏ，ＵＳＡ）とのインキュベーションにより、精製タンパク質をインビトロでビオチン化した。
ＮｂＮＨ１１の親和性成熟
ＮｂＮＨ１１のＣＤＲ３中の変異を、７対のフォワードプライマー及びリバースプライマーフォワードプライマー（Ｈ１１＿ＡＭ＿ＣＤＲ３＿Ｒ１－７と組み合わせたＨ１１＿ＡＭ＿ＣＤＲ３＿Ｆ１－７）を使用したＰＣＲによって導入した。変異断片をプライマーＨ１１＿Ｐｈｄ＿Ｆ及びＨ１１＿Ｐｈｄ＿Ｒで増幅し（表３ａ）、ＳｆｉＩ制限酵素で消化し、ｐＡＤＬ－２３ｃファージミド（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングした。連結されたベクターをエレクトロポレーションによりＴＧ１細胞に形質転換して、約２×１０^９個の独立したクローンからなるファージライブラリーを得た。ライブラリーのバイオパニングを２ラウンド、それぞれ５ｎＭ及び１ｎＭのＲＢＤで上述されたように実施し、陽性ファージをＥＬＩＳＡによって特定し、配列決定した。

【0094】

【表4】

【0095】

【表5-1】

【0096】

【表5-2】

【0097】

単一ドメイン抗体の産生
選択されたクローンから増幅したファージミドをＷＫ６ Ｅ．Ｃｏｌｉ株に形質転換し、ＴＢ培地（１００ｐｇ／ｍＬのアンピシリン及び１ｍＭのＭｇＣｌ２を補充）で増殖させ、ＯＤ約１．２で１ｍＭのＩＰＴＧによるタンパク質発現を誘導させながら、２２５ｒｐｍ及び３７℃で振盪し、２２５ｒｐｍ及び２０℃で震盪しながら一晩増殖させた。細菌細胞をペレット化し、ＴＥＳ緩衝液（０．２ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５Ｍのスクロース）に一晩再懸濁し、続いてＴＥＳ／４緩衝液（水で４倍に希釈したＴＥＳ）に２時間懸濁した。１６８００ｒｐｍ及び４℃での遠心分離によって上清を回収し、続いてＧＦ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１０倍に希釈した。タンパク質を、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）（Ｎｅｔｔｌｅｓｈｉｐ、Ｗａｔｓｏｎら、２０１５）で実装した自動化したプロトコル、続いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４の緩衝液を使用して、Ｈｉｌｏａｄ １６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５又はＳｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００ＧＬカラムを使用して、固定化された金属親和性によって精製した。単一ドメイン抗体のＦｃ融合体を生成するために、配列をｐＯＰＩＮＴＴＧ－３Ｃ－Ｆｃに挿入し、ＡＣＥ－２及びＲＢＤについて記載したようにタンパク質を精製した。

【0098】

ＶＨＨライブラリースクリーニング
ベクターｐＡＤＬ－２０ｃ中で構築され、約１×１０^１０個の独立したクローンを含むＶＨＨファージディスプレイライブラリー（Ａｂｃｏｒｅ Ｉｎｃ．Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、２×ＴＹＡ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した２×ＴＹ）に接種し、Ｍ１３ヘルパーファージに感染させて、ＶＨＨ提示ファージのライブラリーを得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに特異的なＶＨＨを表示するファージは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で捕捉することにより、それぞれ５０ｎＭ及び５ｎＭのＲＢＤで２回のバイオパニングを行った後に濃縮した。パニングの各ラウンドで、最初にＤｙｎａｂｅａｄｓとファージをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間ブロックし、ファージをＲＢＤと１時間インキュベートし、次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と５分間インキュベートし、その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳで６回、ＰＢＳで１回洗浄した。保持されたファージを、ＴＢＳＣ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２）及び１ｍｇ／ｍＬのトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）との３０分間のインキュベーションにより溶出した。収集したファージを指数関数的に増殖するＴＧ１ Ｅ．Ｃｏｌｉ中で増幅し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した ２×ＴＹ寒天プレートに播種した。パニングの各ラウンド後の濃縮は、細胞培養物を１０倍連続希釈液でプレーティングすることによって決定した。２回目のパンニングの後、９３個の個々のクローンを採取して２×ＴＹＡに接種し、２５０ｒｐｍ及び３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。翌日、一晩培養したものを用いて２×ＴＹＡに接種し、Ｍ１３ヘルパーファージに感染させて、クローンＶＨＨ提示ファージを得た。

【0099】

酵素結合免疫吸着測定法
マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、高～中結合）のウェルを、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の５μｇ／ｍＬのニュートラアビジンで、４℃にて一晩コーティングした。翌日、ウェルを５０ｎＭのビオチン化ＲＢＤでコーティングし、次いで、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の３％粉乳でブロックした。クローンファージの上清を各ウェルに添加し、ウェルをＨＲＰ結合抗Ｍ１３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートすることによって、結合を検出した。洗浄後、１００μＬのＴＭＢ基質（ＳｅｒａＣａｒｅ）を添加し、４０５ｎＭでの吸光度を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて測定した。

【0100】

ＳＰＲ及び等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して ＳＰＲ実験を実施した。全てのアッセイは、２５℃で０．００５％（ｖ／ｖ）のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を補充したＰＢＳ ｐＨ７．４のランニング緩衝液を使用して、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実行した。

【0101】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対するナノボディＨ１１の結合親和性を決定するために、センサチップの試料フローセルにＲＢＤ－Ｆｃを固定した。参照フローセルは空のままにした。ナノボディＨ１１を、２．５μＭからの連続２倍希釈によって調製した８つの濃度範囲で、３０μＬ／分の流速で、会合時間６０秒及び解離時間６０秒で、２つのフローセルに注入した。データを１：１結合モデルに適合させ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してＫ_Ｄを計算した。

【0102】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤとナノボディＨ１１－Ｈ４／Ｈ１１－Ｄ４との間の結合動態を決定するために、センサチップの試料フローセルにＲＢＤ－Ｆｃを固定化した。参照フローセルは空のままにした。ナノボディＨ１１－Ｈ４／Ｈ１１－Ｄ４を２つのフローセルに、結合時間６０秒、解離時間６０秒のシングルサイクル動力学プログラムを使用して、３０μＬ／分の流量で、５０ｎＭから連続２倍希釈して調製した５つの濃度範囲で注入した。バックグラウンド減算のために同じプログラムを使用して、ランニング緩衝液も注入した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１を使用して、全てのデータを１：１結合モデルに適合させた。

【0103】

ＣＲ３０２２－Ｆｃ又はＡＣＥ２－Ｆｃをリガンドとして使用した競合アッセイでは、約１０００ＲＵのＣＲ３０２２－Ｆｃ又はＡＣＥ２－Ｆｃを固定化させた。以下の試料を注入した：（１）１μＭのナノボディＨ１１－Ｈ４／Ｈ１１－Ｄ４と０．１μＭのＲＢＤの混合物；（２）１μＭのＥ０８Ｒ（抗 Ｃａｓｐｒ２ Ｆａｂ）Ｆａｂと０．１μＭのＲＢＤの混合物；（３）０．１μＭのＲＢＤ；（４）１μＭのナノボディＨ１１－Ｈ４／Ｈ１１－Ｄ４と０．１μＭのスパイクの混合物；（５）１μＭのＥ０８Ｒ Ｆａｂと０．１μＭのスパイクの混合物；（６）０．１μＭのスパイク；（７）１μＭのナノボディＨ１１－Ｈ４／Ｈ１１－Ｄ４；（８）１μＭのＥ０８Ｒ Ｆａｂ。全ての注入は、結合時間６０秒、解離時間６００秒で実行した。全ての曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットした。

【0104】

ＩＴＣ測定を、２５℃でｉＴＣ２００ ＭｉｃｒｏＣａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実行した。スパイク、ＲＢＤ、及びナノボディを調製し、同じ緩衝液、すなわちＰＢＳで透析した。ナノボディは、約７２μＭのナノボディ及び６μＭのスパイク、又は２５０μＭのナノボディ及び２５μＭのＲＢＤに対応するスパイク又はＲＢＤ溶液中で滴定した。各実験を、０．４μＬの最初の注入と、７５０ｒｐｍで攪拌しながら、スパイク又はＲＢＤのいずれかを含むセルへの２．４μＬのナノボディ溶液の１６回の注入で構成した。Ｏｒｉｇｉｎ科学的グラフ作成及び分析ソフトウェアパッケージ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を使用して、データの取得と分析を実行した。データ分析は、以下のパラメータを使用して結合等温線と最良適合を生成することにより実行した：ｎ（サイトの数）、ΔＨ（カロリー／モル）、ΔＳ（カロリー／モル／℃）、及びＫ（モル^－１の結合定数）。データ分析の後、Ｋを解離定数（Ｋ_Ｄ）（ｎＭ）に変換した。

【0105】

ＡＣＥ２ブロッキング及び中和実験
ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞を、第２世代レンチウイルスベクターシステムを使用して、コドン最適化されたヒトＡＣＥ２ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０２１８０４．１）で安定してトランスフェクトし、ＦＡＣＳが高度に発現する集団についてソーティングした。アッセイの前日に、平底の９６ウェルプレートに細胞（ウェル当たり３×１０^４個）を播種した。ＲＢＤ－６Ｈ（アミノ酸３４０－５３８；ＮＩＴＮ．ＧＰＫＫ）を、ＥＺ－ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ （Ａ３９２５６；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して化学的にビオチン化した。分析物と対照の連続半対数希釈（１μＭ～０．１ｎＭの範囲）は、３０μＬのＵ底９６ウェルプレートで実行した。等量の２５ｎＭのビオチン化ＲＢＤを添加し、得られた各混合液５０μＬをＭＤＣＫ－ＡＣＥ２細胞に１時間添加した。次いで、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡ（３７５２５；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１：１，６００に希釈した第２層のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓ９１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、ＰＯＤ基質（１１４８４２８１００１、Ｒｏｃｈｅ）を５分間添加することによってシグナルを発生させた後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。プレートを、Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーで、ＯＤ４５０で読み取った。対照分析物（非ブロッキング抗インフルエンザＮ１抗体）を使用して最大のシグナルを取得し、ＰＢＳのみのウェルを使用してバックグラウンドを決定した。グラフを、ビオチン化ＲＢＤのＡＣＥ２への結合％としてプロットした。結合％＝（Ｘ－Ｍｉｎ）／（Ｍａｘ－Ｍｉｎ）＊１００、式中、Ｘ＝競合成分の測定値、Ｍｉｎ＝結合剤ビオチン化ＲＢＤ－６Ｈを含まない緩衝液、Ｍａｘ＝ビオチン化ＲＢＤ－６Ｈのみ。ＡＣＥ２に対するナノボディの５０％での阻害濃度（ＩＣ_５０）は、非線形回帰［阻害剤］対ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用した正規化された応答曲線適合を使用して決定した。

【0106】

ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞を、ヘマグルチニンＨ７（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１２５／２０１７）（ＥＰＩ９７７３９５）の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに、第２世代レンチウイルスベクターシステムを使用して、表面発現用の短いリンカー（配列ＴＧＳＧＧＳＧＫＬＳＳＧＹＫＤＶＩＬＷＦＳＦＧＡＳＣＦＩＬＬＡＩＶＭＧＬＶＦＩＣＶＫＮＧＮＭＲＣＴＩＣＩ^＊）を介して融合されたＲＢＤ（アミノ酸３４０－５３８ＮＩＴＮ．ＧＰＫＫ）を用いて安定的にトランスフェクトした。ＣＲ３０２２抗体を用いてＲＢＤ発現細胞をＦＡＣＳソーティングした。アッセイの前日に、平底の９６ウェルプレートに細胞（ウェル当たり３×１０^４個）を播種した。ＡＣＥ２－Ｆｃは上記のようにビオチン化した。分析物と対照の連続半対数希釈（１μＭ～０．１ｎＭの範囲）を、３０μＬのＵ底９６ウェルプレートで実行した。５ｎＭの３０μＬのビオチン化Ａｃｅ２－Ｆｃを、滴定した分析物に添加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＡＣＥ２と検体の各混合物を細胞に移し、室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：１，６００に希釈した第２層のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓ９１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に１時間インキュベートし、上記のように発色させた。グラフを、ＲＢＤ へのビオチン化ＡＣＥ２の結合％としてプロットした。結合％＝（Ｘ－Ｍｉｎ）／（Ｍａｘ－Ｍｉｎ）^＊１００、式中、Ｘ＝競合する成分の測定値、Ｍｉｎ＝結合剤ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃを含まない緩衝液、Ｍａｘ＝ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃのみ。ＡＣＥ２に対するナノボディの５０％での阻害濃度（ＩＣ_５０）は、非線形回帰［阻害剤］対ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用した正規化された応答曲線適合を使用して決定した。

【0107】

英国公衆衛生局のプラーク減少中和試験では、９３３ｐｆｕ／ｍＬ（７０ｐｆｕ／５０μＬ）の濃度に希釈し、９６ウェルＶ底プレートで抗体希釈を２ 倍にする、１％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）を含有する、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に５０：５０で混合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（オーストラリア／ＶＩＣ０１／２０２０）^４３を使用した。プレートを加湿ボックス内で、３７℃で１時間インキュベートして、中和させた。その後、ウイルス抗体混合物を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＭＥＭで培養されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＥＣＡＣＣ ８５０２０２０６；ＰＨＥ、ＵＫ）のコンフルエントな単層を含む、ダルベッコのＰＢＳで２回洗浄された２４ウェルプレートのウェルに移した。加湿ボックス内で、３７℃で更に１時間、ウイルスを細胞に吸着させ、１．５％のカルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）、４％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含むＭＥＭを細胞に重ねた。加湿ボックス内で、３７℃で５日間インキュベートした後、プレートを２０％のホルマリン／ＰＢＳ（ｖ／ｖ）で一晩固定化し、水道水で洗浄した後、０．２％のクリスタルバイオレット溶液（Ｓｉｇｍａ）で染色し、プラークをカウントした。中間点プロビット分析（統計計算とグラフィックス用にＲプログラミング言語で記述）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスプラークをウイルスのみの対照（ｎ＝５）と比較して５０％（ＮＤ_５０）減少させるために必要な抗体の希釈を決定するために使用した。Ｒで使用されるスクリプトは、以前に報告されたソーススクリプト^４４に基づいていた。抗体の希釈液を２回繰り返して実行し、ＰＲＮＴアッセイの内部陽性対照も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することが知られている熱不活化（５６℃で３０分間）されたヒトＭＥＲＳ回復期血清の試料（英国国立生物基準管理研究所）を使用して２回実行した。プレートを図８ｃに示す。

【0108】

オックスフォードでのプラーク減少中和試験は、確立された方法論^４５を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／０１／２０２０４３の継代４を使用して実施した。簡単に説明すると、ウイルスストック（９．７５×１０^４ｐｆｕ／ｍＬ）を１０倍及び１００倍に希釈し、測定について、Ｈ１１－Ｈ４の最終濃度が１００、３２、１０、３．２ｎＭになるように、１％のＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ１；１００μＬ）をＤ１で希釈したナノボディ－Ｆｃ（１００μＬ）と混合した。陽性対照として、ＣＲ３０２２を３３３、１６７、８４及び４２ｎＭを含む溶液を調製した。各実験は、２４ウェル組織培養プレートで３回実施した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、Ｄ１中のＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単一細胞懸濁液０．５ｍＬを５×１０^５／ｍＬで添加した。プレートを３７℃で更に２時間インキュベートした後、カルボキシメチルセルロース（１．５％）を添加した０．５ｍＬのＤ１を重ねた。得られた培養物を３７℃で更に４日間インキュベートした後、酢酸／メタノール中のアミドブラックで細胞単層を染色してプラークを明らかにした（図９ａ、ｂ、ｃ、ｄ）。ＣＲ３０２２とＨ１１－Ｈ４が相加性であるかどうかを調べるために、１００、３２、１０、３．２ｎＭのＨ１１－Ｈ４の溶液をそれぞれ、最終濃度８４ｎＭのＣＲ３０２２と３０分間インキュベートした。得られた混合物を上記のように３回の実験で分析し、ウェルを図９ｄに示す。

【0109】

細胞株
オックスフォードの中和には、Ｖｅｒｏ Ｃｃｌ－８１（元々はＡＴＣＣからの株由来）を使用した。ＰＨＥ中和には、ＥＣＡＣＣから購入したＶｅｒｏＥ６ 細胞を使用した。細胞ベースの競合アッセイでは、商用供給源（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に由来する ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞を使用した。全ての哺乳動物タンパク質発現は、購入した２９３Ｅｘｐｉ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して実行した。

【0110】

スパイクを有するナノボディ複合体、調製、及びクライオ－ＥＭデータ収集
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌで精製したスパイクタンパク質を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌで精製されたＨ１１－Ｈ４とモル比１：３．６（スパイク三量体：ナノボディ）で、１６℃で一晩インキュベートした。スパイクタンパク質は、最終濃度１ｍｇ／ｍＬ で使用した。混合物を、グリッド調製前に１６℃で、２１０００ｇで遠心分離した。Ｈ１１－Ｄ４－スパイクについては、モル比１：６（スパイク三量体：ナノボディ）の混合物を２０℃で１０分間インキュベートした。

【0111】

得られたＨ１１－Ｄ４－スパイク試料３μＬを、次いで、２０秒間高で新たにグロー放電された穴あきカーボンコーティングされた２００メッシュ銅グリッド（Ｃ－Ｆｌａｔ，ＣＦ－２／１，Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ）に塗布した（Ｐｌａｓｍａ Ｃｌｅａｎｅｒ ＰＤＣ－００２－ＣＥ，Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ）。４．５℃、相対湿度１００％で、ビトロボット濾紙（グレード５９５，Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）を使用して、－１のブロッティング力で６秒間ブロッティングすることにより、過剰な液体を除去した。次いで、ブロットされたグリッドを、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して直ちに急速冷凍した。

【0112】

凍結したグリッドを、３００ｋＶでＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で撮像する前に、２００ｋＶで動作するＧｌａｃｉｏｓ顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で最初にスクリーニングした。ムービー（各４０フレーム）を、カスタムＥＰＵバージョン２．５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した超分解能計数モードで、Ｋ３検出器（Ｇａｔａｎ）で、圧縮ｔｉｆｆ形式で収集した（表４）。

【0113】

【表6】

【0114】

Ｒｅｌｉｏｎ（ｖ３．１）^４６と５×５のパッチベースのアラインメントを使用して、２×ビニングした超分解能ムービーのモーション補正とアラインメントを実行した。フルフレームの重み付けされていない顕微鏡写真のＣＴＦ推定を、ＧＣＴＦ（ｖ１．０６）を使用して実行し、非テンプレート駆動の粒子ピッキングを、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ（ｖ２．１４．１－ｌｉｖｅ）^４７内で実行し、その後、複数回の２Ｄ分類を実行した。スパイク三量体と一致する結果の２Ｄクラス平均を、Ｃ１対称性を使用した２Ｄ及び３Ｄ分類の更なるラウンドの前に、テンプレート駆動の粒子ピッキングに使用した。最も人口の多いクラスから得られたマップは、カスタムｐｙＥＭスクリプト^４８（ｃｓｐａｒｃ２ｓｔａｒ．ｐｙ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｓａｒｎｏｗ／ｐｙｅｍ）を使用してＲｅｌｉｏｎ形式のｓｔａｒファイルに変換する前に、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣでシャープ化し、Ｒｅｌｉｏｎ内で更にＣＴＦを精密化した。

【0115】

スパイクの初期モデルをＰＤＢ ６ＶＸＸ^２６を使用して生成し、剛体をＣｈｉｍｅｒａ^４９、続いてＣｏｏｔ^５０を使用してマップに適合した。Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ結晶構造をＣｏｏｔの裸のスパイクモデルに重ね、密度に適合するかどうかをチェックした。各サブユニットのサブドメインに分割されたＳ１／Ｓ２ドメイン（残基２７～３０７；３０８～３２１及び５９１～７００；３２２～３３３及び５２９～５９０；７０１～１１４７）を、次いで、最終的な相関係数０．８をもたらすＲｅａｄｙＳｅｔ^５１を使用して水素原子を追加したＰＨＥＮＩＸ^５１による最終的な実空間の精密化の前に、Ｃｏｏｔ^５０に独立してリジッドボディ適合させた。Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ結晶構造を、密度のためにスパイクの精密化中に参照構造の制約として使用した。Ｃｏｏｔ^５０での手動検査とＰＨＥＮＩＸ^５１での実空間の精密化を経て、最終モデルが完成した。データ処理及び精密化の統計を表４に示す。

【0116】

Ｈ１１－Ｈ４スパイク試料では、ＳＰＴ Ｌａｂｔｅｃｈプロトタイプ３００メッシュ１．２／２．０ナノワイヤグリッドを使用し、非常に再現性の高い長方形のバー断面を使用した。ナノワイヤを活性化するために、グリッドを ９０ 秒間ローでグロー放電させた（Ｐｌａｓｍａ Ｃｌｅａｎｅｒ ＰＤＣ－００２－ＣＥ，Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ）。Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ ＥＰシステム（ＳＰＴ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、８１％の相対湿度及び周囲温度で、約６ｎＬの複合体をグリッドに適用した。

【0117】

凍結したグリッドをスクリーニングし、３００ｋＶで動作するＢｉｏｑｕａｔｕｍ－Ｋ３検出器（Ｇａｔａｎ，ＵＫ）を備えたＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してデータを収集しました。ムービー（各５０フレーム）を、カスタムＥＰＵバージョン２．５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して超解像計数モードで、圧縮ｔｉｆｆ形式で収集した。

【0118】

ムービーの２Ｄ分類までの処理は、ｅＢＩＣで実装されたＲｅｌｉｏｎ＿ＩＴ．ｐｙ処理パイプラインを使用して自動的に行った。詳細には、５×５のパッチベースのアラインメントを備えた Ｒｅｌｉｏｎ（ｖ３．０８）^４６を使用して、２×ビニングされた超分解能ムービーのモーション補正とアラインメントを実行した。フルフレームの重み付けされていない顕微鏡写真のＣＴＦ推定は、ＧＣＴＦ（ｖ１．０６）を使用して実行され、非テンプレート駆動の粒子ピッキングをｃｒＹＯＬＯ^５２内で実行し、続いて２Ｄ分類を実行した。スパイク複合体と一致する詳細を明確に示す最良の２Ｄクラスを、更に処理するために選択した。３Ｄ分類を、６０Åにローパスフィルターをかけたｅｍｄ＿２１３７４を使用して行った。当初、データはＣ３として処理したが、ＲＢＤとナノボディ密度が低かったため、Ｃ１に緩和した。最高のＣ１ ３Ｄクラスを選択し、Ｒｅｌｉｏｎ内での更なる精密化、ＣＴＦ精密化、及び粒子研磨を行った。

【0119】

スパイク－Ｈ１１－Ｄ４構造からの座標を、キメラ^４９のスパイク－Ｈ１１－Ｈ４クライオ－ＥＭ密度にリジッドボディドッキングし、次いで、ＣＣＰ－ＥＭ ＧＵＩ^{５３、５４}を介してＲｅｆＭａｃ５、及び最終的な相関係数０．７８をもたらすｃｏｏｔを手動で介入を使用して数回のゼリーボディ精密化メントで精密化した。クライオ－ＥＭマップのナノボディ密度の分解能が限られているため、最終モデルでは、精密化されたナノボディ構造をドッキングしたＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ結晶構造に置き換えた。最後に、キメラ^４９を使用してナノボディを剛体としてクライオ－ＥＭ密度にドッキングし、その位置を最適化した。データ処理及び精密化の統計を表４に示す。

【0120】

Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２結晶構造
精製ＲＢＤ、Ｆａｂ ＣＲ３０２２及びＨ１１－Ｄ４をモル比１：１：１で最終濃度約７ｍｇ／ｍＬまで一緒に混合し、室温で１時間インキュベートした。最初のスクリーニングを、ナノリットルシッティングドロップ蒸気拡散法を使用して９６ウェルプレートで実行した。最良の結晶を、０．１ Ｍのクエン酸三ナトリウム二水和物、ｐＨ５．０、１０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール６０００を含む条件で成長させた。

【0121】

精製ＲＢＤ、Ｆａｂ ＣＲ３０２２、及びナノボディＨ１１－Ｈ４を１：１：．１１のモル比で混合し、室温で１時間インキュベートし、ゲル濾過カラムにかけた。最初のスクリーニングを、ナノリットルシッティングドロップ蒸気拡散法を使用して９６ウェルプレートで実行した。上記のように、２０ｍｇ／ｍＬのＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２複合体０．１μＬを０．１μＬの結晶化緩衝液と混合することにより、最良の結晶が成長させた。結晶を７０～７５％の貯蔵器溶液と２０～２５％のグリセロールを含む凍結保護剤に数秒間浸し、ループに取り付け、英国ダイヤモンド光源のビームラインＩ０３でのデータ収集前に液体窒素で凍結させた。

【0122】

Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２の２つの結晶形態が得た（表５）。収集した第１の形態については、それぞれ３６０°の３つの結晶をマージして、７８倍の冗長性を有する３．３Åの分解能の最終データセットを得た。第２の形態は後に現れ、データは異方性であったが、単結晶から２．７Åを生成した。Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２の単結晶を採取した。

【0123】

【表7】

【0124】

データを、自動化されたデータ処理プログラムＸｉａ２－ｄｉａｌｓ^{５５、５６}で索引付け、統合、スケーリングした。Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２ 複合体の第１の結晶の結晶構造を、（ＰＤＢ ６ＹＬＡ１８）とナノボディ９Ｇ８（ＰＤＢ ４ＫＲＰ５７）を使用した分子置換によって解明した。その後、Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体の高分解能構造が利用可能になり、その後の溶液で使用した。電子密度Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２は、低分解能のＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２構造に見られるように、ナノボディには不十分であり；研究の比較的低い分解能の反映であった。

【0125】

モデルの再構築をＣＯＯＴ^５０で行い、最初にＰＨＥＮＩＸ^５１で精密化し、次いで、ＰＤＢ－ＲＥＤＯ^５９、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ^６０、及びＴＬＳＭＤサーバ^６１によって支援されたＲＥＦＭＡＣ５^５８で精密化した。

【0126】

Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ結晶構造
各ナノボディを２．９ｍｇ／ｍＬの８．７ｍｇのＲＢＤとナノボディ：ＲＢＤ１．１：１のモル比で混合し、複合体を２ｒｐｍで攪拌しながら冷蔵室で３時間インキュベートした。複合体中のＲＢＤは、０．４ｍｇのＥｎｄｏＨグリコシダーゼを添加することによって脱グリコシル化し、２ｒｐｍで攪拌しながら室温で一晩インキュベートした。次いで、混合物を５ｋＤａのＭＷＣＯ濃縮器で１ｍＬに濃縮し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００（ＧＥ）を使用してゲル濾過に注入した。ピーク画分をプールし、５ｋＤａのＭＷＣＯ濃縮器を使用して１０ ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、及び２９ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0127】

結晶化スクリーニングを、ＨａｒｗｅｌｌのＤｉａｍｏｎｄ／ＲＣａＨ／ＲＦＩ ＨＴＰ結晶化施設で実施した。Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ の結晶を、０．２Ｍの酢酸ナトリウム三水和物、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００を含む結晶化緩衝液０．１μＬと０．２μＬの１８ ｍｇ／ｍＬの複合体を混合することにより、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して２０℃で成長させた。Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ結晶は一晩で成長し、３０％（ｖ／ｖ） のエチレングリコールを含む母液を含む溶液でフラッシュ冷却されました。Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤの結晶を１８ｍｇ／ｍＬの複合体を０．２Ｍの硫酸リチウム、０．１ＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓ、ｐＨ５．５、２５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０を含む結晶化緩衝液０．１μＬと混合することにより、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して２０℃で成長させた。Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤの結晶は一晩で成長し、３０％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ４００を含む母液を含む溶液でフラッシュ冷却した。回折データも収集され、ダイヤモンド光源（ＤＬＳ）のビームラインＩ０３で処理した。Ｈ１１－Ｄ－ＲＢＤ構造は、上記の三元複合体からのＲＢＤ及びＨ１１－Ｄ４モノマーを使用した分子置換によって解明した。三元複合体について上記に記載されるように精製を行った。Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体は、Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体を使用して解明した。Ｘ線データの収集と構造の精密化に関する統計を表５に示す。両方の複合体の電子密度を図１３ｃ、ｄに示す。

【0128】

Ｈ１１－Ｄ４ ＲＢＤ複合体の構造解析
Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体とＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体の高分解能により、両者の微妙な違いが明らかになった。主な記事はＨ１１－Ｈ４－ＲＢＤに焦点を当てており、このノートではＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤを分析している。Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体（図１５Ａ）では、ＣＤＲ１は界面にほとんど寄与していない（図１５Ａ）。ＣＤＲ２では、残基Ａｒｇ５２、Ｓｅｒ５４及びＳｅｒ５７がＲＢＤと接触している（図１５Ａ及び１５Ｂ）。ＣＤＲ３から、Ｇｌｕ１００－Ｌｅｕ１０６がＲＢＤと接触する（図１５Ｂ）。２つのタンパク質間の全ての接触を図１５Ｃに示す。Ｈ１１－Ｄ４と接触するＲＢＤの表面は、Ｌｙｓ４４４－Ｐｈｅ４５６及びＧｌｙ４８２－Ｓｅｒ４９４によって形成される（図１５Ｄ）。ＲＢＤ配列のこれら２つの延伸は、埋もれた表面積の９０％以上を構成し、Ｈ１１－Ｄ４と全ての水素結合を形成する（図１５Ｃ）。

【0129】

ＲＢＤのＴｙｒ４４９の芳香環は、Ａｓｎ１０１のＨ１１－Ｄ４上の疎水性パッチに対してスタックする（図１６Ａ）。ＲＢＤ残基Ｇｌｕ４８４（二価塩橋）及びＰｈｅ４９０（ｐ－カチオン相互作用２８）を含む相互作用のネットワークの中心に位置する、Ｈ１１－Ｄ４のＣＤＲ２からのＡｒｇ５２の重要な役割に注目する（図１６Ｂ）。Ａｒｇ５２は、Ａｒｇ１０３、Ｓｅｒ１０４の主鎖カルボニル、及びＴｙｒ１０９の側鎖に水素結合を形成するため、Ｈ１１のＣＤＲ３ループのコンフォメーションを安定化する役割も果たしているようである（図１６Ｂ）。成熟中に変化したＨ１１－Ｄ４ＣＤＲ３領域の７残基の延伸は、複合体によって埋められた表面積の６０％以上に寄与し、ＲＢＤへの５つの水素結合を形成する（図１６Ｃ）。Ａｒｇ９８は、ＲＢＤと接触しないＣＤＲ３ループの唯一の成熟変化である（図１６Ｃ）。むしろ、この残基はＧｌｕ１００に塩橋をかけ、ＣＤＲ１のいくつかの残基に水素結合を形成し、ＣＤＲ３及びＣＤＲ１ループの順序付けに重要であることを示唆している。Ｈ１１－Ｄ４のＴｒｐ１１２は、ＣＤＲ３領域の構造にとっても重要であると思われる相互作用である、Ａｒｇ１０３－Ａｓｐ１０８塩橋に対してスタックする２つのコンフォメーションを採用する（図１６Ｄ）。

【0130】

結果
スパイク結合ナノボディの同定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの精製ＲＢＤを使用して、インビトロでのファージディスプレイ技術によりナイーブラマＶＨＨライブラリーでその結合パートナーを特定した。ＲＢＤに結合するいくつかのナノボディを特定した。Ｈ１１と名付けた最も緊密に結合するナノボディのＫ_Ｄは１μＭ未満であった（図６ａ、ｂ）。ランダム変異誘発アプローチを使用して、ＣＤＲ３内の５つの残基でＨ１１及び互いに異なる２つの親和性成熟変異体、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４を特定した（図１ｃ、２ａ）。Ｈ１１－Ｈ４及びＨ１１－Ｄ４は、それぞれ５ｎＭ及び１０ｎＭの推定Ｋ_Ｄで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＲＢＤに結合することが示された（図２ｂ、図６ｃ、ｄ）。ＡＣＥ２－Ｆｃが固定化され、ＲＢＤの結合がＨ１１－Ｈ４又はＨ１１－Ｄ４の存在下又は非存在下でモニタリングされるＳＰＲベースの競合アッセイを実行し；同様の実験で、スパイクの結合もモニタリングした（ＲＢＤの代わりに）。両方のナノボディは、ＲＢＤとスパイクの両方のＡＣＥ２への結合を阻害した（図２ｃ、図６ｅ）。これは、ナノボディエピトープがスパイクの ＲＢＤ上のＡＣＥ２結合部位と重複していることを示唆している。ＣＲ３０２２－Ｆｃを固定し、ＲＢＤの結合を測定したとき、Ｈ１１－Ｈ４又はＨ１１－Ｄ４の有無にかかわらず、ＲＢＤがＣＲ３０２２に結合することが分かった（図２ｄ、図６ｆ）。これは、ＣＲ３０２２とナノボディがＲＢＤ上の非重複エピトープを認識したことを示している。スパイクでこの実験を繰り返すと、Ｈ１１－Ｈ４の存在下及び非存在下でも結合を示した（図２ｄ、図６ｆ）。

【0131】

結合の化学量論と熱力学は、等温滴定熱量測定によって特徴付けられた。Ｈ１１－Ｈ４は１２±１．５ｎＭのＫ_ＤでＲＢＤに結合し、Ｈ１１－Ｄ４は３９±２ｎＭのＫ_Ｄで結合し、両方とも１：１の化学量論を示した（図２ｅ、図７ａ）。全長三量体スパイクを使用したとき、１：１ナノボディ：モノマー（３：１のナノボディ：スパイク）の化学量論比で単一の結合イベントが観察され、Ｈ１１－Ｈ４では４４±３ｎＭのＫ_Ｄ、Ｈ１１－Ｄ４では７９±２ｎＭのＫ_Ｄであった（図２ｆ、図７ｂ）。エンタルピーが増加したにもかかわらず、Ｈ１１－Ｄ４は、結合時のエントロピーペナルティが増加した結果、Ｈ１１－Ｈ４よりも弱く結合した。両方のナノボディのスパイクとＲＢＤを比較すると、同じエンタルピーエントロピー補償が観察される。スパイクタンパク質が、溶液中で複数のコンフォメーション状態で存在することが提示しているが^２６、ＩＴＣは単純な結合曲線を示した（図２ｆ）。ナノボディが存在する全てのコンフォメーション状態に均等に結合しているか、これらの状態間の平衡が結合イベントよりも速かったかのいずれかである。オン率が非常に高いことを考えると、後者の可能性は低いと思われる（図２ｂ）。

【0132】

ＲＢＤ結合についてＡＣＥ２と競合する二価Ｆｃ－ナノボディ融合体
ナノボディをヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合させて、二価結合が可能なホモ二量体キメラタンパク質を生成した（図３ａ）。これらのコンストラクトがＡＣＥ２のＲＢＤへの結合をブロックする能力を２つのアッセイで試験した。

【0133】

第１のアッセイでは、ヒトＡＣＥ２を安定的に発現するＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞（ＭＤＣＫ－ＡＣＥ２）をプレートに播種し、ＲＢＤの結合をブロックする様々な分析物（Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ、Ｈ１１－Ｄ４－Ｆｃ、ＡＣＥ２－Ｆｃ、ＣＲ３０２２^１８、及びＶＨＨ７２－Ｆｃ）の能力を測定した（図３ｂ）。ＶＨＨ７２^２５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクに対して交差反応性である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイクで免疫したラマから分離されたナノボディである。ＭＤＣＫ－ＡＣＥ２細胞結合アッセイは、Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃについて６１ｎＭ、Ｈ１１－Ｄ４－Ｆｃについて１６１ｎＭ、及びＶＨＨ７２－Ｆｃ２５について２６２ｎＭのＩＣ_５０をもたらした。

【0134】

第２の競合アッセイでは、分析物（Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ、Ｈ１１－Ｄ４－Ｆｃ、ＡＣＥ２－Ｆｃ、ＣＲ３０２２^１８、ＶＨＨ７２－Ｆｃ^２５）を、表面にＲＢＤを発現したＭＤＣＫ細胞へのＡＣＥ２の結合をブロックする能力について評価した（図３ｃ）。このアッセイは、Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃについて３４ｎＭ、Ｈ１１－Ｄ４－Ｆｃについて２８ｎＭ、ＶＨＨ７２－Ｆｃ^２５について３３ｎＭのＩＣ_５０をもたらした。予想通り、ＣＲ３０２２はＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用をブロックしないため、どちらのアッセイでも強い応答を示さない^{１７、１８}。

【0135】

Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃ及びＨ１１－Ｄ４－Ｆｃのウイルスの中和
キメラ融合を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの英国公衆衛生研究所でのプラーク減少中和試験で試験し、Ｈ１１－Ｈ４－ＦｃのＮＤ_５０は６ｎＭ（９５％信頼区間（ＣＩ）３～９ｎＭ）、Ｈ１１－Ｄ４－ＦｃのＮＤ_５０は１８ｎＭ（９５％のＣＩ９～６８ｎＭ）を示した（図３ｄ、図８）。Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃの中和をオックスフォード大学で再現し、４ｎＭのＮＤ５０が得られた。ＣＲ３０２２を陽性対照として使用し、これらの条件下で、以前の報告と同様に９３ｎＭのＮＤ_５０が観察された^１８（図３ｅ）。生のプレートを図９に示し、Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃの存在下で小さなプラーク表現型が観察されたが、陽性対照ＣＲ３０２２では観察されなかった。これは、Ｈ１１－Ｈ４－Ｆｃが中和されていないウイルスの拡散を防ぐ能力があることを示しているため、特に驚くべきことである。

【0136】

我々のアッセイ法は、英国の基準に沿って、細胞とのインキュベーション後にウイルスと中和剤を除去しなかったことに注意する必要がある。一部のラボでは、アッセイ中にウイルスと中和剤を除去する中和アッセイプロトコルが報告されているが、正確なプロトコルの違いが、ＣＲ３０２２中和の報告された違いの原因である可能性がある^{１７、１８}。

【0137】

ナノボディ－スパイク及びナノボディ－ＲＢＤ複合体の構造
ナノボディをそれぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の精製された融合前に安定化された外部ドメイン１３（スパイク（三量体）：ナノボディ＝１：４）と室温でインキュベートし、その後、クライオＥＭグリッド上でガラス化した。スパイクのこのバリアントのクライオＥＭ単一粒子構造は、主に３つのＲＢＤの「アップ－ダウン－ダウン型」配置を持つ三量体であることが示されている^１３。データの収集と処理（表４、図１０、１１）の後、マップは、Ｈ１１－Ｄ４及びＨ１１－Ｈ４複合体（図１０、１１）の３つのＲＢＤ 全てで追加の密度を明確に同定した。クーロンポテンシャルマップの改善により、両方の構造の各ＲＢＤでナノボディを追加の密度に適合させることができた（表４、オンライン法、図４ａ及び図１０、１１、１２ａ）。「アップ型」のＲＢＤに結合したナノボディの密度は弱いが、それでも明確に識別できるが、「ダウン型」のＲＢＤに結合したナノボディの密度はより明確である（図１０、６）。Ｈ１１－Ｈ４－スパイク複合体（図４ａ）とＨ１１－Ｄ４－スパイク複合体（図１２ａ）の構造は、分解能が高いため区別できない（表４）。ここでは、親和性の高いナノボディであるＨ１１－Ｈ４との複合体に焦点を当てて記載する。

【0138】

ナノボディと接触しているＲＢＤの領域は、ナノボディ複合体で秩序化されているが、ＥＭ融合前に安定化されたホロスパイク構造（ＰＤＢ ６ＶＳＢ、６ＶＹＢ、６ＶＸＸ）では無秩序であり、詳細な分析はできない。しかしながら、ナノボディ－スパイク複合体では、「アップ型」ＲＢＤ（サブユニットＡ）が「ダウン」ＲＢＤ（サブユニットＣ）に結合しているナノボディと接触し；ホロスパイクにはないものに接触することに注目した（図１２ｂ）。これらの接触は、非複合体と比較した場合、ＲＢＤドメインのシフトをもたらした^{１３、２６}（図１２ｃ）。以前のレポート^２６と一致して、ホロスパイクタンパク質のグリッド上に２つの形態（「スリーダウン型」及び「ワンアップツーダウン型」）の混合物が見られた。ナノボディの存在下では、「ワンアップツーダウン型」形態のみが観察され、ナノボディ結合がコンフォメーションの不均一性を低減したことを示している。ＲＢＤと比較した場合、追加の相互作用がこの観察と、スパイクへのナノボディの結合で観察されるより高いエンタルピーとより大きなエントロピーペナルティの原因であることを示唆している（図２ｅ、ｆ）。

【0139】

ナノボディは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる３つの可変ループに依存して、抗原結合部位を形成する（図１ｃ）。認識の分子基盤への洞察を得るために、Ｈ１１－Ｈ４－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ複合体及びＨ１１－Ｄ４－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ複合体の結晶構造をそれぞれ１．８５及び１．８０Åの分解能で決定した（表５）。どちらの結晶構造も、非対称ユニットに複合体のコピーが１つある。２つの複合体の重ね合わせにより、両方のナノボディが同じエピトープを認識することが確認された（図４ｂ）。構造を比較すると、複合体全体が平均二乗偏差３２２ 個のＣα原子で１．０Å、個々のＲＢＤが平均二乗偏差１９５個のＣα原子で０．５Å、個々のナノボディが平均二乗偏差１２７個のＣα原子で０．４Å重なっていることが分かる。より高い複合体についての平均二乗偏差は、互いに対するナノボディの７°ピボット運動から生じているためである（図４ｃ）。複合体間の類似性が非常に高いことを考慮して、Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体に再び焦点を当てて記載した（図４ｄ）。ＣＤＲ３ループの配列変化により、Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体と比較して違いがあり、Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ界面の詳細な説明は、図１５～１６及び「Ｈ１１－Ｄ４ ＲＢＰ複合体の構造解析」に記載している。

【0140】

複合体では、Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ１ループはインターフェイスにほとんど寄与していない（図４ｅ）。ＣＤＲ２から、残基Ａｒｇ５２、Ｓｅｒ５４、及びＳｅｒ５７がＲＢＤと接触している（図４ｄ、ｅ）。ＣＤＲ３、Ｈｉｓ１００からＬｅｕ１０６まで、成熟中に変更された領域がＲＢＤと接触した（図４ｄ、ｅ）。Ｈ１１－Ｈ４に接触するＲＢＤの表面は、Ｌｙｓ４４４からＰｈｅ４５６まで及びＧｌｙ４８２からＳｅｒ４９４までよって形成される（図４ｆ）。ＲＢＤ配列のこれら２つの延伸は、埋もれた表面積の９０％を構成し、Ｈ１１－Ｈ４と全ての水素結合を形成する（図４ｇ）。これらの直接的な接触に加えて、複数の架橋水分子がある。驚いたことには、ＰＩＳＡサーバ^２７が、どちらのナノボディ及びＲＢＤ複合体も安定しているとは特定しない。

【0141】

Ｈ１１－Ｈ４のＣＤＲ２に由来するＡｒｇ５２は、二価の塩結合を形成したＲＢＤ残基Ｇｌｕ４８４やπ－カチオン相互作用を形成したＰｈｅ４９０ など、相互作用のネットワークの中心にあることが分かった^２８（図４ｈ）。Ａｒｇ５２はまた、Ｓｅｒ１０３の主鎖カルボニルとＴｙｒ１０９の側鎖に水素結合を形成し（図４ｈ）、ＣＤＲ３ループの立体構造を安定化させる可能性がある。成熟中に変化したＨ１１－Ｈ４ ＣＤＲ３領域の７残基延伸は、複合体によって埋められた表面積の６０％以上に寄与し、ＲＢＤに５つの水素結合を形成する（図４ｇ）。

【0142】

Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ複合体を使用して、スパイク２６の「ダウン」（閉じた）形態に結合した３つのナノボディのモデルを作出した（図１２ｄ）。このモデルはいかなる衝突を開示しておらず、単純なＩＴＣ曲線と一致する全てのコンフォメーション状態でナノボディがスパイクタンパク質に結合することを示唆している（図２ｅ）。

【0143】

他のＲＢＤバインダと比較したナノボディエピトープ
Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ複合体へのＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体^{２９、３０}の重ね合わせは、生物物理学（図２ｃ）、プレートアッセイ（図３ｂ、ｃ）及び中和実験（図３ｄ）と一致するＨ１１－Ｈ４が、ＡＣＥ２がＲＢＤに結合するのを防ぐ（図５ａ）ことを明らかにするこれは、主にＲＢＤと接触していないＨ１１－Ｈ４の領域とＡＣＥ２の領域（ＲＢＤと接触していない）の間のファンデルワールス衝突によるものである（図５ａ）。興味深いことに、ＲＢＤ上のＨ１１－Ｈ４の接触面は、ＡＣＥ２の接触面とわずかに重なっているだけである（図１ｂ、図５ｂ）。ＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体との比較^{２９、３０}は、ＲＢＤの残基４４５－５００がＨ１１－Ｈ４結合時に固定ユニットとして移動するように見えることを明らかにしている（図１３ａ）。ＲＢＤのＶａｌ４８３を中心とするループの構造は、Ｈ１１－Ｈ４の結合により変化した（図１３ｂ）。

【0144】

異なるエピトープを認識する抗体及び／又はナノボディの組み合わせから生じる相加効果及び相乗効果の可能性を考えると、三元複合体Ｈ１１－Ｈ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２（３．３Å）及びＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２（２．７Å）の結晶が得られた（表５）。構造は類似しており、より分解能の高いＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２複合体に注目する。予想どおり、ナノボディと抗体は重複しないエピトープに結合する（図５ｃ）。更に、Ｈ１１－Ｄ４－ＲＢＤ－ＣＲ３０２２三元複合体とＨ１１－Ｄ４－ＲＢＤ 複合体及びＲＢＤ－ＣＲ３０２２複合体の両方との比較^{１７、１８}は、ナノボディの結合が抗体の認識を混乱させず、逆もまた同様であることを示した。これは、ＣＲ３０２２がＲＢＤとナノボディＲＢＤ複合体に等しくよく結合することを示す生物物理学的分析と一致している（図２ｄ、図６ｆ）。

【0145】

考察
ウイルスのライフサイクル中、スパイク三量体は、全て「ダウン型」配置と混合された「アップダウン型」状態の間の平衡状態で存在すると想定される^１３。スパイクタンパク質は、ＲＢＤが「アップ型」状態のＡＣＥ２にだけ結合でき^１１、これにより三量体が解離する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクよりも１０倍～２０倍高い親和性（約１５ｎＭのＫ_Ｄ）でＡＣＥ２に結合する。これは、より高い感染性を促進することが提案されている事実である^{１３、３１}。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して同定されてきた中和抗体は、Ｓｐｉｋｅタンパク質のＲＢＤに結合し、多くはＡＣＥ２結合をブロックすることによって結合するが^３２、ＣＲ３０２２は異なる機構で動作する^１８。我々は、ＣＤＲ３ループ内の５つの残基で配列が異なるＨ１１－Ｈ４とＨ１１－Ｄ４の２つのナノボディを同定し（図２ａ）、特性にいくつかの微妙な違いを示した（図２、３）。Ｈ１１－Ｈ４ ナノボディはＲＢＤに対してより高い親和性を有しているため（図２ｅ、ｆ）、議論はこのバリアントに焦点を当てているが、明示的に述べられていない限り、Ｈ１１－Ｄ４に対しても同様に有効である。

【0146】

Ｈ１１－Ｈ４がＲＢＤに高い親和性で結合し（図２ｂ、ｅ、ｆ）、ＡＣＥ２結合をブロックし（図２ｃ、３ｂ、ｃ）、ウイルスを中和する（図３ｄ、ｅ）ことを示した。我々の分析は、Ｈ１１－Ｈ４がスパイク内のＲＢＤの「オールダウン型」及び「ツーダウンワンアップ型」コンフォメーションの両方に結合することを示唆している（図４ａ及び図２ｃ）。Ｈ１１－Ｈ４によって認識されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ上のエピトープは、ＡＣＥ２結合領域とごく限られた程度しか重複していない（図５ａ、ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤのこの領域は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤと比較すると、いくつかの配列の変更がある（図１ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ＲＢＤ構造のＰｒｏ４６９－Ｐｒｏ４７０ターンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶａｌ４８３－Ｇｌｕ４８４の構造とは大きく異なる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間の追加の配列と構造の変化（Ｔｙｒ４４２－＞Ｌｅｕ４５５、Ｔｒｐ４７６－＞Ｐｈｅ４９０、Ａｓｎ４７９－＞Ｇｌｎ４９３）が組み合わさって、非常に異なるエピトープを提示し、Ｈ１１－Ｈ４の交差反応性を排除すると考えられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間のＨ１１－Ｈ４ エピトープの保存の欠如は、ＡＣＥ２受容体結合を保持しているがＨ１１－Ｈ４又はその類縁体（ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）によって認識されなくなったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントが出現する可能性を高める。可能性の高いエスケープ変異の少なくともいくつかは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の親和性の増加に重要な相互作用であるＡＣＥ２の裂け目（ｃｌｅｆｔ）に挿入されるＰｈｅ４８６の位置を乱す可能性がある^３０。ナイーブライブラリーのスクリーニングから成熟及び徹底的な特性評価までの迅速なパイプラインは、Ｈ１１－Ｈ４を回避したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して新しいナノボディを生成できる可能性を提供する。

【0147】

交差反応性（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｋ_Ｄ ７ｎＭ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｋ_Ｄ ４０ｎＭ）ナノボディＶＨＨ７２の特徴付けが最近報告され^２５。このナノボディはＡＣＥ２結合をブロックし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルスに対して中和活性（ＮＤ５０ ０．２μｇ／ｍＬ）を示す^２５。ＶＨＨ７２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ２５由来のＲＢＤとの複合体の結晶構造は、ＶＨＨ７２がＨ１１－Ｈ４によって結合されるものとは異なるエピトープを認識することを示した（図１４Ａ）。ＶＨＨ７２が結合するエピトープは、ＣＲ３０２２１８が結合するエピトープと部分的に重複し（図１４Ｂ）、複合体中のＨ１１－Ｈ４とＲＢＤとの間の結晶接触で見られる（図１４Ｃ及び１４Ｄ）。ＣＲ３０２２ のように、ＡＣＥ２結合をブロックせずにウイルスを中和する別の抗体も公開されているが^３４、それ以上の構造の詳細はない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する強力な中和活性を持つヒト化ナノボディ（Ｖｅｒｏ細胞で最も強力なＮＤ５０ １７～３６ｎＭ）が報告されている^３５。これらのナノボディの全てではないが、一部がＡＣＥ２結合をブロックし、その作用機序に関する分子的洞察は報告されていない^３５。プレプリントでは、偽ウイルスを中和し、ＡＣＥ２結合をブロックするラマ抗体Ｔｙ１が報告されているが^３６、ＥＭ構造の座標は利用できなかった。

【0148】

回復期血清の使用は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ３７及び最近ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２９の重症患者で臨床的に有望であることを示しており；そのような受動免疫療法には、医学において長い歴史がある^３８。実験室で製造された試薬を使用すると、ヒト血清の使用に起因する感染リスクの一部が回避され、少量で投与できる。治療法としての抗体の使用は十分に確立されているが、ナノボディは、１つのＣａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ^２３が承認されて現在臨床試験に入ったばかりである。ナノボディの直接注射は、コブラ毒中毒のマウスモデルでも有望であることが示している^３９。ラクダ科動物のＶＨＨ ドメインは、ヒトのカウンターパートで高度に保存されており、それらの免疫原性は低いと提示しているが^４０、ヒト化戦略は十分に開発されている^４１。

【0149】

インビボでの半減期を延長し、活性を強化するために、様々な手段でナノボディを多量体化できる^２２。インビトロでの結合アッセイ（図３ｂ、ｃ）及び中和実験（図３ｄ、ｅ）のために、二量体Ｆｃ融合コンストラクト（図３ａ）を作出した。ＣＲ３０２２抗体^{１７、１８}はＨ１１－Ｈ４とは異なるエピトープを認識したため（図２ｄ、５ｃ）、Ｈ１１－Ｈ４とＣＲ３０２２の組み合わせを調査した（ＣＲ３０２２濃度は８４ｎＭに固定）。これらのアッセイ条件下で、相加効果の証拠を観察した（図５ｄ）。そのような相加的な組み合わせは、ウイルスが変異によって回避する傾向を減らすためのよく知られた戦略である。

【0150】

この研究は、ナノボディ成熟技術を転換して、出現するウイルスの脅威に対してリアルタイムで高度中和剤を生成することができることを確立している。このアプローチは、動物免疫化アプローチによって同定されたものに対して相補的なエピトープを同定するのに有用であり得る。Ｈ１１－Ｈ４及びＨ１１－Ｄ４ナノボディは、重症のＣＯＶＩＤ－１９患者の受動免疫化のために供与された実験室で合成された中和抗体のカクテルで適用され得る。

【0151】

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【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A-1】

【図7A-2】

【図7B-1】

【図7B-2】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

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【国際調査報告】