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特表2023-524633父親の高年齢に関連するエピジェネティックな調節異常を同定するための方法およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-13
(54)【発明の名称】父親の高年齢に関連するエピジェネティックな調節異常を同定するための方法およびキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20230606BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022562725
(86)(22)【出願日】2021-04-21
(85)【翻訳文提出日】2022-10-25
(86)【国際出願番号】 US2021028422
(87)【国際公開番号】W WO2021216726
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】63/013,090
(32)【優先日】2020-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521311285
【氏名又は名称】ファーティリティ ラボ サイエンシーズ， エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】カッツ－ジャフィ， マンディ
(72)【発明者】
【氏名】ティニャネッリ， ミケーレ エム．
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR72
4B063QR77
(57)【要約】
胚盤胞、精子、または精子個体群におけるエピジェネティックな調節異常の同定およびスクリーニングのための方法およびキットが提供される。エピジェネティックな調節異常の同定およびスクリーニングは、特に、自閉症スペクトラム障害遺伝子、統合失調症遺伝子、双極性障害遺伝子、またはオピオイドシグナル伝達経路遺伝子と呼ばれる複数の候補遺伝子に関連する。該方法は、対象となる胚盤胞、精子、または精子個体群を取得すること、および胚盤胞内のＤＮＡメチル化エラーを同定することを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エピジェネティックな調節異常が増加する胚盤胞を同定するための方法であって、胚盤胞を得ること、および
前記胚盤胞内のＤＮＡメチル化エラーを同定することであって、その結果、エピジェネティックな調節異常が、
（ｉ）全体的な低メチル化のシフトを備えたＤＮＡを有する胚盤胞と相関する、または
（ｉｉ）高メチル化されている一つ以上の自閉症スペクトラム障害、統合失調症、双極性障害、および／またはオピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子と相関する、同定すること、を含む、方法。
【請求項2】
前記自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、およびＵＢＥ３Ｂから選択される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記統合失調症の候補遺伝子は、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記双極性障害の候補遺伝子は、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４，ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２，ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、ＣＡＣＮＡ１Ｈ，ＧＲＩＮ１およびＰＲＫＣＺからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
胚盤胞内のエピジェネティック状態を決定する方法であって、前記胚盤胞内の一つ以上の神経発達障害の候補遺伝子におけるメチル化のレベルを決定することを含み、
前記一つ以上の神経発達障害遺伝子における前記メチル化のレベルおよび遺伝子発現は、前記胚盤胞の前記エピジェネティック状態を提供する、方法。
【請求項7】
前記一つ以上の神経発達障害遺伝子における前記メチル化のレベルを、正常なエピジェネティック状態を有する前記胚盤胞として定義される条件下で、同じ一つ以上の神経発達障害遺伝子に対するメチル化のレベルと比較すること、をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記一つ以上の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＯＭＴ、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＤＲＤ４、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＭＢＰ、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＲＫＣＺ、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＣＦ３、ＴＥＴ２、ＴＲＰＭ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、およびＵＢＥ３Ｂからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
胚盤胞内のエピジェネティック状態を決定する方法であって、前記胚盤胞のグローバルＤＮＡのメチル化を決定することを含み、
前記胚盤胞のグローバルＤＮＡのメチル化のレベルは、前記胚盤胞の前記エピジェネティック状態を提供し、その結果、前記グローバルＤＮＡのメチル化胚盤胞内の低メチル化または高メチル化のシフトが、異常なエピジェネティック状態である、方法。
【請求項10】
エピジェネティックな調節異常のリスクが増加する精子細胞ドナーを同定するための方法であって、精液試料を、前記精子細胞ドナーから取得すること、および
精子個体群内のＤＮＡメチル化エラーを同定することであって、その結果、エピジェネティックな調節異常が、
（ｉ）全体的な低メチル化のシフトを備えたＤＮＡを有する精子個体群と相関する、または
（ｉｉ）高メチル化されている一つ以上の自閉症スペクトラム障害、統合失調症、双極性障害、および／またはオピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子と相関する、同定すること、を含む、方法。
【請求項11】
前記自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、およびＵＢＥ３Ｂからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記統合失調症の候補遺伝子は、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記双極性障害の候補遺伝子は、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４，ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２，ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、ＣＡＣＮＡ１Ｈ，ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
精子個体群内のエピジェネティック状態を決定する方法であって、前記精子個体群内の一つ以上の神経発達障害の候補遺伝子におけるメチル化の程度を決定することを含み、
前記一つ以上の神経発達障害遺伝子におけるメチル化のレベルは、前記精子試料の前記エピジェネティック状態を提供する、方法。
【請求項16】
前記一つ以上の神経発達障害遺伝子における前記メチル化のレベルを、正常なエピジェネティック状態を有する前記精子個体群として定義される条件下で、同じ一つ以上の神経発達障害遺伝子に対するメチル化のレベルと比較すること、をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記一つ以上の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＯＭＴ、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＤＲＤ４、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＭＢＰ、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＲＫＣＺ、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＣＦ３、ＴＥＴ２、ＴＲＰＭ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、およびＵＢＥ３Ｂからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
精子個体群内のエピジェネティック状態を決定する方法であって、前記精子個体群のグローバルＤＮＡのメチル化の程度を決定することを含み、
前記精子個体群のグローバルＤＮＡのメチル化の程度は、前記精子個体群の前記エピジェネティックな状態を提供し、その結果、前記グローバルＤＮＡのメチル化の精子個体群における低メチル化または高メチル化のシフトが、異常なエピジェネティック状態である、方法。
【請求項19】
精子個体群のエピジェネティック状態を検査するためのキットであって、前記胚盤胞内の一つ以上の標的遺伝子における前記精子個体群のメチル化の程度を決定するための手段、を含む、キット。
【請求項20】
前記一つ以上の標的遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＯＭＴ、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＤＲＤ４、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＭＢＰ、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＲＫＣＺ、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＣＦ３、ＴＥＴ２、ＴＲＰＭ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、およびＵＢＥ３Ｂからなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２１日出願の米国仮特許出願第６３／０１３，０９０号「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐａｔｅｒｎａｌ Ａｇｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」の利点を主張するものである。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２１日出願の米国仮特許出願第６３／０１３，０９０号「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐａｔｅｒｎａｌ Ａｇｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」の利点を主張するものである。
【0002】
本発明は、父親の高年齢と、胚発生中のエピジェネティック事象のリスクの増加との関連に関する。本発明はまた、胚発生中の有害転帰に関連するエピジェネティックなスクリーニング用のマーカーとして作用する、複数の遺伝子の同定に関する。
【背景技術】
【0003】
父親の高年齢（ＡＰＡ）は、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、および双極性障害などの先天性欠損および小児神経発達疾患を含む有害転帰に関連する。それにもかかわらず、米国で初めて母親・父親になる平均年齢は上昇し、その結果、女性の第一子妊娠の平均年齢は、過去２５年間で、約２５歳から約２６歳に上昇した。同様の傾向が、第一子を授かる父親にも見られ、その男性の平均年齢は、１９８０年代以降で約３年上昇した。そのため、ＡＰＡに関連する有害転帰の発生率は、今後も上昇し続けると予想され得る。ＡＰＡである個人に対するリスク因子を特定し、診断スクリーニングを開発する能力は、当技術分野では必要とされており、その結果、個人がより高齢になって子供をもうけることを選択する際に、新生児に有害転帰がみられる親自身のリスクが制限され得る。
【0004】
本発明は、上記で論じた問題を一つ以上、解決することを対象とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本明細書において、胚発生中のエピジェネティックな調節異常、例えば、胚盤胞内のエピジェネティックな調節異常の同定、スクリーニング、および診断に有用な方法およびキットが開示される。
【0006】
本明細書の実施形態は、例えば、エピジェネティックな調節異常、特に、胚発生中の有害転帰に関連するエピジェネティックな調節異常が増加した胚盤胞、精子、または精子個体群を同定するための方法を含む。該方法は、対象となる胚盤胞、精子、または精子個体群を取得すること、および胚盤胞内のＤＮＡメチル化エラーを同定することを含む。有害転帰のリスクの増加は、全体的な低メチル化のシフトを備えたグローバルＤＮＡを有する胚盤胞、精子、または精子個体群におけるエピジェネティックな調節異常と相関する、または高メチル化されている一つ以上の、または二つ以上の、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、または双極性障害の候補遺伝子を有する胚盤胞と相関する。本事例の態様では、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、およびＵＢＥ３Ｂを含む。本事例の一部の態様では、統合失調症の候補遺伝子には、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａが含まれる。本事例の一部の態様では、双極性障害の候補遺伝子には、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４、ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２、ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａが含まれる。本事例の一部の態様では、オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、上述の神経発達疾患の候補遺伝子のいずれかを含む。一部の事例では、方法は、エピジェネティックな調節異常に対して、胚盤胞、精子、または精子個体群をスクリーニングするために使用することができるが、上述のようなエピジェネティックな調節異常を有する胚盤胞、精子、または精子個体群は、インビトロでの受精中の着床処置用に使用されず、または精子の場合、卵子の受精には使用されないであろう。一部の事例では、方法は、エピジェネティックな調節異常に対して、胚盤胞、精子、または精子個体群をスクリーニングするために使用することができ、胚盤胞、精子、または精子個体群をランク付けして、着床陽の最も健康な胚の選択、または最も健康な精子を受精用に使用することが可能である。
【0007】
他の実施形態では、胚盤胞のエピジェネティック状態を決定するための方法が提供される。方法は、胚盤胞内の一つ以上の、または二つ以上の自閉症スペクトラム障害、統合失調症、または双極性障害の候補遺伝子におけるメチル化のレベルおよび遺伝子発現を決定することを含む。一部の態様では、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、または双極性障害遺伝子におけるメチル化のレベルおよび遺伝子発現は、正常または非表現型のエピジェネティック状態を有する公知の対照と比較される（場合により、正常または非表現型のエピジェネティック状態は、典型的には３５歳未満の若年の父親の精子に見られる、同じ一つ以上の、または二つ以上の、自閉症スペクトラム障害遺伝子のメチル化と関連する）。上述のように、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１，ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、またはＵＢＥ３Ｂのいずれか一つであり得る。統合失調症の候補遺伝子は、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。双極性障害の候補遺伝子は、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４，ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２、ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、上述の神経発達疾患の候補遺伝子、例えば、ＣＡＣＮＡ１Ｈ，ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺのいずれかであり得る。
【0008】
胚盤胞のエピジェネティック状態を決定するための代替的な方法において、該方法は、胚盤胞のグローバルＤＮＡのメチル化を決定することを含み、正常なエピジェネティック状態と比較して、グローバルＤＮＡのメチル化における低メチル化または高メチル化のシフトは、異常なエピジェネティック状態とみなされる。異常なエピジェネティック状態は、正常なエピジェネティック状態を有する胚盤胞と比較して、胚盤胞が有害な結果をもたらすより高いリスクと関連する。
【0009】
最後に、本明細書の実施形態は、一つ以上の細胞のエピジェネティック状態を検査するためのキットを含む。一つの態様では、一つ以上の細胞は、胚盤胞由来であり、キットは、胚盤胞のメチル化レベルを決定するための手段、および胚盤胞内の二つ以上の標的遺伝子における遺伝子発現を決定するための手段を含む。胚盤胞内の二つ以上の遺伝子は、自閉症スペクトラム障害遺伝子であり得る。一部のキットでは、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子に対する正常な範囲のメチル化および遺伝子発現用の標準的な範囲の値を含む指示が提供される。指示には、メチル化および遺伝子発現試験を実施するための方法も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【0011】
【図2-1】図２Ａ～２Ｌは、精子メチル化検証結果のプロットを提供する。各プロットは、有意なＤＭＲ内の別個のＣｐＧ部位における選択された検証遺伝子に対するパイロシーケンシングの結果を表す。図２Ａ－ＣＡＣＮＡ１Ｈ、図２Ｂ－ＣＯＭＴ、図２Ｃ－ＤＲＤ４、図２Ｄ－ＧＲＩＮ１、図２Ｅ－ＫＣＮＱ１、図２Ｆ－ＰＲＫＣＺ、図２Ｇ－ＳＨＡＮＫ２、図２Ｈ－ＳＨＡＮＫ３、図２Ｉ－ＴＣＦ３、図２Ｊ－ＴＲＰＭ２、図２Ｋ－ＣＮＴＮＡＰ２、図２Ｌ－ＭＢＰ、図２Ｍ－ＺＮＦ８０４Ａ。Ｘ軸上のＣｐＧ部位の後、若年（灰色）およびＡＰＡ（黒色）個体に対するすべてのＣｐＧにわたる平均パーセントのメチル化が続く。各線は、個々の精子試料（ｎ＝１８の若年およびｎ＝１８のＡＰＡ精子試料）の結果を表す。若年と比較したＡＰＡにおける有意な低メチル化は、プロット（Ａ～Ｊ）で示され、若年と比較したＡＰＡにおける有意な高メチル化は、プロット（Ｋ～Ｍ）で示され、＊ｐ≦．０１、＊＊ｐ≦．００１である。
【図2-2】同上。
【図2-3】同上。
【0012】
【図3-1】図３は、父親の年齢による精子ＤＮＡメチル化の変化を示すプロットを提供する。線形回帰モデルは、ＡＰＡの父親（≧５０歳、ｎ＝１８のＡＰＡ精子試料）において、精子ＤＮＡのメチル化と父親の年齢との間に有意な負の関連性を示す。モデルは、デフォルト引数を有するＲのｌｍ（）関数を使用して適合され、ｐ≦．０５を有するものは、有意とみなされた。Ｒ二乗、勾配、およびｐ値は、各プロット上に示されており、各黒の回帰線の周りの灰色の陰表示の領域は、９５％信頼区間を表す。
【図3-2】同上。
【0013】
【図4A】図４Ａおよび図４Ｂは、ＣＡＣＮＡ１ＨおよびＳＨＡＮＫ２に対する精子および胚盤胞ＤＮＡメチル化の検証結果を示す。棒プロットは、若年（灰色）およびＡＰＡ（黒色）父親に対する精子（ｎ＝１２）および胚盤胞（ｎ＝１２）における、二つの選択された検証遺伝子、ＣＡＣＮＡ１Ｈ（図１Ａ）およびＳＨＡＮＫ２（図１Ｂ）に対する有意なＤＭＲ内の平均メチル化の変化を示す。エラーバーは、一つの標準偏差を表す。有意な低メチル化は、ＣＡＣＮＡ１Ｈでは精子および胚盤胞の両方について、およびＳＨＡＮＫ２では精子について実証される。＊ｐ≦０．０５である。
【図4B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0014】
ゲノムにおけるエピジェネティックな変化に関する研究は、多くの病態の理解および治療における進歩をもたらした。特に、エピジェネティックな修飾は、特定の癌、認知機能障害、自己免疫疾患、および可能性のある生殖障害の要因として現在、同定されている。本明細書における特定の関連性のうち、発明者らは、新生児における有害転帰のより高い可能性、例えば、先天性欠損、自閉症スペクトラム障害などと相関する胚発生中に発生する多数のエピジェネティック事象を特定した。本明細書に開示されるように、「エピジェネティック事象」は、ＤＮＡ配列を変化させることなく、遺伝子活性を変化させる任意のプロセスである。一つの態様では、エピジェネティック事象は、ＤＮＡメチル化である。驚くべきことに、発明者らは、これらの特定されたエピジェネティック事象が、父親ドナーがＡＰＡである場合に起こる可能性がより高いことを見い出した。
【0015】
本開示以前に、父親の年齢の影響の基礎となる原因機構は解明されておらず、また遺伝形式も決定的には確立されなかった。本明細書に記載されるように、ＤＮＡメチル化などの修飾可能および遺伝性のエピジェネティック情報は、世代的に遺伝され得る。一連のエピジェネティック再プログラミング事象は、配偶子形成中および受精直後で発生する（Ｒｅｉｋ，Ｄｅａｎ，＆Ｗａｌｔｅｒ，２００１）。メチル化マークの抹消および配偶子に特異的な確立は、原始生殖細胞の発生中に起こる。受精直後、オスの前核が、急速な活性脱メチル化プロセスを受ける一方、メスの前核は、発生中の胚において再定着する前に、受動的複製依存性脱メチル化を受ける。刷り込み遺伝子、およびおそらく他の発生的に重要な領域は、エピジェネティック再プログラミングの胚部分を溶出し、エピジェネティックな世代遺伝を可能にする（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．，２０１２）。
【0016】
本明細書に開示され、実施例に提供されるデータによって実証されるのは、老齢の精子におけるＤＮＡメチル化プロファイルが損なわれた結果として、精子形成中の不完全な再プログラミングが生じるという知見である。発明者らは、父親の高年齢に関連する、変化したヒトメチル化特性の精子および胚における世代間相関を初めて実証し、ヒト胚盤胞ゲノム全体にわたって、メチル化再定着の非等価な効率に寄与する。異常なエピジェネティック再プログラミングは、ＡＰＡ精子および胚盤胞の両方の神経学的発達に必要不可欠な遺伝子において著しく強化され、父親の年齢の影響と子孫の神経発達障害との間の機構的関連性を提供する。
【0017】
本明細書に開示されるように、有害転帰の可能性が高くなることと相関するエピジェネティック事象としては、（１）グローバル胚盤胞ＤＮＡ内の低メチル化のシフトと、（２）胚盤胞内の任意の一つ以上の遺伝子が、異常なメチル化および異常な遺伝子発現（増加または減少）の両方を示すより高い可能性と、（３）胚盤胞内の以下の遺伝子であるＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、またはＵＢＥ３Ｂ（本明細書では、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子と称される）、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａ（本明細書では、統合失調症の候補遺伝子と称される）、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４、ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２、ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａ（本明細書において双極性候補遺伝子と称される）の一つ以上、または少なくとも二つ以上、三つ以上、四つ以上などにおける高メチル化と、または（４）胚盤胞内の任意の一つ以上の自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子、統合失調症の候補遺伝子、または双極性障害の候補遺伝子における高メチル化および遺伝子発現の減少と、が含まれる。
【0018】
上記のエピジェネティック事象のうちの一つが胚盤胞内で特定される場合、胚盤胞を、可能なインビトロ受精候補として除去するために使用することができる。これは、特に、胚盤胞に対する精子ドナーがＡＰＡである場合、または精子ドナーが、エピジェネティック情報に対して、飢餓もしくは他の何らかのストレスの多い環境的もしくは情動的な崩壊状態を経験した場合に当てはまる。他の態様では、一つ以上の胚盤胞は、最も健康な胚盤胞が着床用に選択され得るように、エピジェネティック事象の程度または量によってランク付けされ得る。
【0019】
自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子、統合失調症の候補遺伝子、および／または双極性障害の候補遺伝子は、エピジェネティック試験のマーカーとして、特に、胚発生中の潜在的有害事象のマーカーとして使用することができることも本明細書に開示される。これらの遺伝子は、メチル化の変化（高または低のいずれか）および発現の変化（増加または減少のいずれか）と関連付けられ、現在ではＡＰＡとの関連が（本明細書に）示される。これらの知見により、新しいスクリーニング戦略の開発が可能である。
【0020】
本明細書の実施形態は、エピジェネティック事象、特に、生殖中の有害転帰に関連するエピジェネティック事象に対する胚盤胞の同定および／またはスクリーニングのための方法およびキットを提供する。本明細書の実施形態は、エピジェネティック事象、例えば、子孫の神経発達障害に関連するエピジェネティック事象に対する精子の同定および／またはスクリーニングのための方法およびキットを提供する。
【0021】
本明細書の実施形態は、エピジェネティックな調節異常が増加、特に、胚発生中の有害転帰、すなわち、子孫に神経発達障害をもたらす有害転帰に関連するエピジェネティックな調節異常が増加する胚盤胞を同定するための方法を含む。該方法は、対象となる胚盤胞を取得すること、および胚盤胞中のＤＮＡメチル化エラーを同定することを含む。エピジェネティックな調節異常のリスクの増加は、全体的な低メチル化のシフトを備えたグローバルＤＮＡを有する胚盤胞と相関する、または高メチル化されている一つ以上の、もしくは二つ以上の、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、もしくは双極性障害の候補遺伝子を有する胚盤胞と相関する。本事例の態様では、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、またはＵＢＥ３Ｂを含む。統合失調症の候補遺伝子には、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａが含まれる。双極性障害の候補遺伝子には、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４、ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２、ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａが含まれる。オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、上述の神経発達疾患の候補遺伝子、例えば、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺのいずれかであり得る。
【0022】
一部の事例では、該方法は、エピジェネティックな調節異常を有する胚盤胞を着床処置に使用しないであろう、エピジェネティックな調節異常に対して、胚盤胞をスクリーニングするために使用することができる。
【0023】
本明細書の他の実施形態では、胚盤胞のエピジェネティック状態を決定するための方法が提供される。方法は、胚盤胞内の一つ以上の、または二つ以上の自閉症スペクトラム障害、統合失調症、または双極性障害の候補遺伝子におけるメチル化のレベルおよび遺伝子発現を決定することを含む。一部の態様では、一つ以上の、または二つ以上の自閉症スペクトラム障害、統合失調症、または双極性障害の遺伝子におけるメチル化のレベルおよび遺伝子発現は、正常または非表現型のエピジェネティック状態を有する公知の対照と比較される。上述のように、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、またはＵＢＥ３Ｂのいずれか一つであり得る。統合失調症の候補遺伝子は、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。双極性障害の候補遺伝子は、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４、ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２、ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、上述の神経発達疾患の候補遺伝子、例えば、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺのいずれかであり得る。
【0024】
胚盤胞のエピジェネティック状態を決定するための代替的な方法において、該方法は、胚盤胞のグローバルＤＮＡのメチル化を決定することを含み、正常なエピジェネティック状態と比較して、グローバルＤＮＡのメチル化における低メチル化または高メチル化のシフトは、異常なエピジェネティック状態とみなされる。
【0025】
最後に、本明細書の実施形態は、胚盤胞のエピジェネティックな状態を検査するためのキットを含み、これには、胚盤胞のメチル化レベルを決定するための手段、および胚盤胞内の二つ以上の標的遺伝子における遺伝子発現を決定するための手段が含まれる。胚盤胞内の二つ以上の遺伝子は、自閉症スペクトラム障害遺伝子、統合失調症遺伝子、または双極性障害遺伝子であり得る。標準的な対照値および試験の実施方法の指示も提供することができる。
【0026】
本明細書の実施形態には、神経発達障害を有する子孫を産生する素因を有する精子または精子ドナーを同定するための方法が含まれる。方法は、精液試料を精子ドナーから得ること、精子個体群におけるＤＮＡメチル化エラーの程度を特定すること、およびドナー精子個体群におけるＤＮＡメチル化エラーの程度を、対照試料におけるＤＮＡメチル化エラーの程度と比較することを含む。ドナーの精子個体群におけるＤＮＡメチル化エラーの程度が、エピジェネティックな調節異常の累積リスクを示す閾値を超える場合、ドナーの精子は、インビトロでの受精に使用される卵子の受精には使用されない。一部の態様では、精子または精子個体群におけるエピジェネティックな変化の程度により、インビトロ受精で使用するための最も健康な精子または精子試料を決定するための精子または試料のランク付けが可能になる。累積リスクは、全体的な低メチル化のシフトを備えたグローバルＤＮＡを有する精子個体群と相関する、または高メチル化されている一つ以上の、または二つ以上の、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、または双極性障害の候補遺伝子におけるＤＮＡメチル化エラーの閾値度を有する精子個体群と相関する。本事例の態様では、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、またはＵＢＥ３Ｂを含む。統合失調症の候補遺伝子は、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。双極性障害の候補遺伝子は、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４、ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２、ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、上述の神経発達疾患の候補遺伝子、例えば、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺのいずれかであり得る。
【0027】
一部の事例では、該方法は、エピジェネティックな調節異常を呈する精子を同定するために使用でき、エピジェネティックな調節異常を有する精子は、インビトロでの受精には使用されない。一部の態様では、方法は、精子または精子個体群をランク付けして、インビトロでの受精のための最も健康な精子の選択を可能にするために使用することができる。
【0028】
本明細書の他の実施形態では、個々の精子のエピジェネティック状態、または精子ドナーから得られた精子個体群のエピジェネティック状態を決定するための方法が提供される。方法は、精子または精子個体群における一つ以上の、または二つ以上の自閉症スペクトラム障害、統合失調症、および／または双極性障害の候補遺伝子におけるメチル化のレベルおよび遺伝子発現を決定することを含む。一部の態様では、一つ以上の、または二つ以上の、自閉症スペクトラム障害の統合失調症、および／または双極性障害の遺伝子におけるメチル化のレベルおよび遺伝子発現は、正常または非表現型のエピジェネティック状態を有する公知の対照と比較される。上述のように、自閉症スペクトラム障害の候補遺伝子は、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ７、ＡＤＳＬ、ＡＮＫＲＤ１１，ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＤＣ８８Ｃ、ＣＤＨ１１、ＣＩＣ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＳＭＤ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＣＲ７、ＤＰＰ６、ＥＨＭＴ１、ＦＬＴ１、ＧＬＩＳ１、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＮ１、ＧＲＭ８、ＨＤＡＣ６、ＩＴＧＢ７、ＫＣＮＱ２、ＮＲＰ２、ＮＳＤ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＣＳ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＸＤＮ、ＳＧＳＨ、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＴＥＴ２、ＴＴ１２、ＺＮＦ８０４Ａ、またはＵＢＥ３Ｂのいずれか一つであり得る。統合失調症の候補遺伝子は、ＴＣＦ３およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。双極性障害の候補遺伝子は、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４、ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２、ＴＲＰＭ２、およびＺＮＦ８０４Ａであり得る。オピオイドシグナル伝達経路の候補遺伝子は、上述の神経発達疾患の候補遺伝子、例えば、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺのいずれかであり得る。
【0029】
精子または精子個体群のエピジェネティック状態を決定するための代替的な方法において、該方法は、精子または精子個体群のグローバルＤＮＡのメチル化を決定することを含み、正常なエピジェネティック状態と比較して、グローバルＤＮＡのメチル化における低メチル化または高メチル化のシフトは、異常なエピジェネティック状態とみなされる。
【0030】
最後に、本明細書の実施形態は、精子または精子個体群のエピジェネティック状態を検査するためのキットを含み、このキットには、精子個体群のメチル化レベルを決定するための手段、および精子中の一つ以上の、または二つ以上の標的遺伝子における遺伝子発現を決定するための手段が含まれる。精子中の遺伝子は、自閉症スペクトラム障害遺伝子、統合失調症遺伝子、および／または双極性障害遺伝子であり得る。標準的な対照値および試験の実施方法の指示も提供することができる。
【0031】
本発明は、複数の実施形態を参照して特に示され、説明されているものの、形態および詳細は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される様々な実施形態に対して変更されてもよく、本明細書に開示される様々な実施形態は、特許請求の範囲の限定として作用することを意図するものではないことが当業者には理解されるであろう。
【実施例】
【0032】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。統計解析には、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法が含まれ、有意性はｐ＜０．０５であった。
【0033】
実施例１：メチル化は、胚盤胞のエピジェネティックな調節異常において役割を果たす
目的：ＡＰＡは、自閉症スペクトラム障害などの先天性欠損および小児神経発達疾患を含む有害転帰と関連している。高齢の父親からの遺伝性ＤＮＡメチル化エラーなどのエピジェネティックな調節異常は、子孫における永久的な遺伝子発現の変化をもたらし、臨床表現型をもたらす可能性がある。この実施例の目的は、ＡＰＡと関連するヒト胚盤胞のメチロームおよびその後のトランスクリプトームを調査することであった。
目的：ＡＰＡは、自閉症スペクトラム障害などの先天性欠損および小児神経発達疾患を含む有害転帰と関連している。高齢の父親からの遺伝性ＤＮＡメチル化エラーなどのエピジェネティックな調節異常は、子孫における永久的な遺伝子発現の変化をもたらし、臨床表現型をもたらす可能性がある。この実施例の目的は、ＡＰＡと関連するヒト胚盤胞のメチロームおよびその後のトランスクリプトームを調査することであった。
【0034】
材料および方法：凍結保存され、伝達性の品質を持つヒト胚盤胞は、ＩＲＢ承認および患者の同意を得て寄付された。Ｎｏｒｍｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉｃの高齢の父親（ＡＰＡ；≧５０歳）を、既知の女性因子を除去するために、ドナー卵母細胞のみを有するｎｏｒｍｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉｃの若年の父親（若年；≦３５歳）と比較した。胚盤胞ＤＮＡ（ｎ＝１２）を、メチル－ＭａｘｉＳｅｑ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して亜硫酸塩に変換し配列決定する一方で、胚盤胞ＲＮＡ（ｎ＝１２）を小細胞数のＲＮＡシーケンス（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）に供した。結果を、経路解析と併せて解析した（ＤＡＶＩＤ ６．８）。転写検証（ｎ＝２４）を、ＲＥＳＴ ２００９によるｑＰＣＲを使用して実施し、メチル化検証（ｎ＝１０）では、ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ２４高度システム（Ｑｉａｇｅｎ社）を利用した。統計解析には、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ＲにおけるＡＮＯＶＡ、Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定、およびペアワイズ固定再配分無作為化検定（該当する場合）が含まれ、有意性はｐ＜０．０５であった。
【0035】
結果：５７，２８６の低メチル化ＣｐＧ部位、および４９，７０９の高メチル化ＣｐＧ部位を備えたＡＰＡ胚盤胞（３４％のＡＰＡ対４０％の若年；ｐ＜０．０５）において、低メチル化に対する全体的なシフトが観察された（ｐ＜０．０５）。ＲＮＡシーケンシングにより、７５１個の遺伝子に発現が有意に減少し、１９５個の遺伝子に発現が有意に増加したことが判明した（ｐ＜０．０５）。メチロームとトランスクリプトームのデータセットを組み合わせると、３１９個の遺伝子は、有意にかつ方向性の両方の点で改変された（ｐ＜０．０５）。経路解析では、知的障害、腫瘍抑制遺伝子、神経変性、および自閉症スペクトラム障害を含む、極めて重要な主要の機能的注釈カテゴリーとして、「疾患変異」が同定された。これまでに、自閉症スペクトラムの候補遺伝子ＳＨＡＮＫ２（４５％ ＡＰＡ対３３％ 若年；ｐ＜０．０５）およびＡＮＫＲＤ１１（７５％ ＡＰＡ ｖｓ．４３％若年；ｐ＜０．０５）に対するメチル化増加の検証が行われ、その遺伝子発現に対する観察上の減少効果が確認された（ｐ＜０．０５）。
【0036】
結論：この新たな研究では、胚発生中のエピジェネティック事象に対するＡＰＡの影響を調査した。その結果、高齢の父親に由来する胚盤胞内の全体的な低メチル化のシフトが明らかになり、有意に改変された転写がもたらされる。興味深いことに、自閉症スペクトラムの候補遺伝子は、主に高メチル化され、その後に遺伝子発現が減少し、父親の高年齢の影響と小児の神経発達障害との間に機構的な相関がもたらされた。
【0037】
実施例２：両親の年齢の増加が、低メチル化を顕著に悪化させた
六つの若年（≦３５歳）および六つのＡＰＡ（≧５０歳）のノルモススペルマ精子試料を、修飾され還元された表示亜硫酸塩配列（ＲＲＢＳ；Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のメチルＭｉｎｉ－Ｓｅｑプラットフォーム）法を使用したグローバルメチローム分析に使用し、グローバルメチル化の増加を、ＡＰＡ精子エピゲノム中に観察し、ＬＩＮＥ１の亜硫酸塩パイロシーケンシングにより確認した。図１を参照されたい。
六つの若年（≦３５歳）および六つのＡＰＡ（≧５０歳）のノルモススペルマ精子試料を、修飾され還元された表示亜硫酸塩配列（ＲＲＢＳ；Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のメチルＭｉｎｉ－Ｓｅｑプラットフォーム）法を使用したグローバルメチローム分析に使用し、グローバルメチル化の増加を、ＡＰＡ精子エピゲノム中に観察し、ＬＩＮＥ１の亜硫酸塩パイロシーケンシングにより確認した。図１を参照されたい。
【0038】
精子試料を、二層ＰｕｒｅＳｐｅｒｍ密度勾配遠心分離（Ｎｉｄａｃｏｎ）、続いて、細胞溶解を使用して調製し、円形細胞の汚染を除去し、溶解緩衝液（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ）中に保存した。凍結保存胚盤胞を、ＩＶＦ治療中の男女パートナーから、インフォームドコンセントおよびＩＲＢの承認を得て過剰に取得した。同様に、六つの若年および六つのＡＰＡ胚盤胞試料を、全ゲノム亜硫酸塩シーケンシング（ＷＧＢＳ、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のメチルＭａｘｉ－Ｓｅｑプラットフォーム）を使用して、分析した。精子および胚盤胞について、若年群とＡＰＡ群との間で４９，７２２および１０６，９９５ ＣｐＧｓが統計的に有意（ｐ＜０．０５）であると同定した後、分析により、３，４０５個の精子ＤＭＲおよび３，９９７個の胚盤胞ＤＭＲがもたらされた。
【表1-1】
【表1-2】
【0039】
ＡＰＡ精子中の低メチル化ＤＭＲを、ＣｐＧアイランド（ｐ＝１．８０Ｅ－２２）、シェルフ（ｐ＝１．１６Ｅ－１７５）、およびショア（ｐ＝１．７６Ｅ－２６）で有意に濃縮した。ＣｐＧアイランド注釈を、ＵＣＳＣゲノムブラウザｈｇ１９からダウンロードした。ＡＰＡ胚盤胞内の低メチル化ＤＭＲについて、同様の傾向が観察された。
【0040】
精子と胚盤胞ＤＭＲ関連遺伝子を比較すると、父親の老化に伴い、二つのメチローム間で非常に有意な遺伝子濃縮が得られた（ｐ＝３．４６Ｅ－５５）。二つのメチローム間の１６７個の低メチル化遺伝子および６１個の高メチル化遺伝子の同定が行われ、１０個の遺伝子が、低メチル化ＤＭＲおよび高メチル化ＤＭＲの両方を呈した。
【表2】
【0041】
追加の１２個の若年および１２個のＡＰＡ由来の精子のＮｏｒｍｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉｃ試料を、メチル化の検証に使用した。図２を参照されたい。メチル化の検証用に選択された遺伝子には、改変ＤＭＲ、有意な経路で同定された遺伝子、神経発達障害に関与する遺伝子、有意な細胞バンドに局在化された遺伝子、刷り込み遺伝子、および老化精子に関する公表文献に対応する遺伝子が含まれた。表３を参照されたい。線形回帰モデルを使用すると、父親の年齢が５０歳から６０歳を超えるまで増加したため、低メチル化は有意に悪化した。図３を参照されたい。
表３：加齢したヒト精子において以前に同定されたＤＭＲ関連の遺伝子
表３：加齢したヒト精子において以前に同定されたＤＭＲ関連の遺伝子
【表3】
【0042】
１２個の胚盤胞（若年齢の父親に由来する）および１２個のＡＰＡ胚盤胞を、神経発達障害に関連する二つの遺伝子からのＤＭＲにおける胚盤胞メチル化の検証用に選択した。パイロシーケンシングデータは、増幅されたＣＡＣＮＡ１Ｈ ＤＭＲ領域に沿った有意な低メチル化（若年者に対して４０％の平均メチル化、ＡＰＡに対して２５％の平均メチル化、ｐ、０．０５）を確認した一方、ＳＨＡＮＫ２胚盤胞ＤＭＲの検証は、低メチル化の傾向であった（若年７５％、ＡＰＡ ５６％、ｐ＜０．１）。図４および表４を参照されたい。
【表4】
【0043】
実施例３：特定の染色体領域は、加齢性メチル化改変に対してより感受性がある
個々の細胞バンドにおけるＤＭＲ関連の遺伝子密度に対する染色体濃縮を分析し、特定の染色体領域が、加齢性メチル化改変に対してより感受性が高いかどうかを判定した。メチル化改変は、ゲノム全体にわたって無作為に分布しなかったが、特定の染色体位置にクラスター状に分布し、染色体１９は、若年試料とＡＰＡ試料との間に最も大きな有意性を呈する（精子ｐ＝５．５１Ｅ－７、胚盤胞ｐ＝９．０１Ｅ－１３、重複ｐ＝７．２８Ｅ－６）。有意な濃縮は、ＡＰＡ精子中の５つの細胞バンドで同定され、五つのうち四つは、独立してＡＰＡ胚盤胞メチロームで濃縮され、３つは重複ＡＰＡ精子および胚盤胞遺伝子のリストにおいて有意であった。表５を参照されたい。
表５：統計的に有意な細胞バンド
個々の細胞バンドにおけるＤＭＲ関連の遺伝子密度に対する染色体濃縮を分析し、特定の染色体領域が、加齢性メチル化改変に対してより感受性が高いかどうかを判定した。メチル化改変は、ゲノム全体にわたって無作為に分布しなかったが、特定の染色体位置にクラスター状に分布し、染色体１９は、若年試料とＡＰＡ試料との間に最も大きな有意性を呈する（精子ｐ＝５．５１Ｅ－７、胚盤胞ｐ＝９．０１Ｅ－１３、重複ｐ＝７．２８Ｅ－６）。有意な濃縮は、ＡＰＡ精子中の５つの細胞バンドで同定され、五つのうち四つは、独立してＡＰＡ胚盤胞メチロームで濃縮され、３つは重複ＡＰＡ精子および胚盤胞遺伝子のリストにおいて有意であった。表５を参照されたい。
表５：統計的に有意な細胞バンド
【表5】
【0044】
三つのデータセットすべてに対する最大の濃縮は、ｃｈｒ１９ｐ１３．３であった（精子ｐ＝４．３２Ｅ－１９、胚盤胞ｐ＝３．７６Ｅ－２２、重複ｐ＝５．６２Ｅ－１６）。ＤＭＲ関連の遺伝子と、精子中のヌクレオソーム保持の既知の領域との共局在化の分析により、ＡＰＡ精子ＤＭＲに対するモノヌクレオソーム（ｐ＝９．３６Ｅ－２９）および抑制ヒストンマークＨ３Ｋ２７ｍｅ３の存在（ｐ＝７．２１Ｅ－６）により、統計的に有意な濃縮が同定された。モノヌクレオソームとのこの共局在化は、精子および胚盤胞データセットの両方で同定された方向性に重複するＤＭＲに対して強化された（ｐ＝２．５２Ｅ－１８）。表６を参照されたい。
【表6】
【0045】
実施例４：神経発達障害に関連する遺伝子における父親の老化の改変メチル化の影響
神経学的シグナル伝達経路は、ＡＰＡ試料で特異的にメチル化されたゲノム領域間で表示されることが見出された。オピオイドシグナル伝達経路は、ＡＰＡ精子および胚盤胞のデータセットの両方に見られる、方向性重複遺伝子に対する上位経路であった。オピオイドシグナル伝達経路から首尾よく検証された遺伝子には、ＡＰＡ精子中のＣＡＣＮＡ１Ｈ，ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺ、ならびにＡＰＡ胚盤胞中のＣＡＣＮＡ１Ｈが含まれる。ニューロンにおけるｎＮＯＳシグナル伝達に関与する経路は、ＡＰＡ精子メテリソーム（ｐ＝２．０８×１０－４）において影響を受けた上位の正準経路として強調され、これはまた、類似の首尾よく検証された遺伝子（ＧＲＩＮ１およびＰＲＫＣＺ）を含む。父親の高年齢によって影響を受ける追加の経路は、表７で参照できる。
神経学的シグナル伝達経路は、ＡＰＡ試料で特異的にメチル化されたゲノム領域間で表示されることが見出された。オピオイドシグナル伝達経路は、ＡＰＡ精子および胚盤胞のデータセットの両方に見られる、方向性重複遺伝子に対する上位経路であった。オピオイドシグナル伝達経路から首尾よく検証された遺伝子には、ＡＰＡ精子中のＣＡＣＮＡ１Ｈ，ＧＲＩＮ１、およびＰＲＫＣＺ、ならびにＡＰＡ胚盤胞中のＣＡＣＮＡ１Ｈが含まれる。ニューロンにおけるｎＮＯＳシグナル伝達に関与する経路は、ＡＰＡ精子メテリソーム（ｐ＝２．０８×１０－４）において影響を受けた上位の正準経路として強調され、これはまた、類似の首尾よく検証された遺伝子（ＧＲＩＮ１およびＰＲＫＣＺ）を含む。父親の高年齢によって影響を受ける追加の経路は、表７で参照できる。
【表7】
【0046】
公開されている遺伝子リストをＤＭＲと比較し、三つの神経学的障害、具体的には、自閉症スペクトラム障害（ｐ＝１．９４Ｅ－４）、統合失調症（ｐ＝５．５５Ｅ－４）、および双極性障害（ｐ＝４．７３Ｅ－５）において、遺伝子に対する非常に有意な濃縮が同定された。この濃縮は、ＡＰＡ精子ＤＭＲおよびＡＰＡ胚盤胞ＤＭＲにおいて、独立して同定された。表８を参照されたい。遺伝子を、自閉症スペクトラム障害（ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＮＴＮＡＰ２、ＧＲＩＮ１、ＳＨＡＮＫ２、ＳＨＡＮＫ３、ＺＮＦ８０４Ａ）、統合失調症（ＴＣＦ３、ＺＮＦ８０４Ａ）、双極性障害（ＣＯＭＴ、ＤＲＤ４、ＧＲＩＮ１、ＭＢＰ、ＰＲＫＣＺ、ＳＨＡＮＫ２，ＴＲＰＭ２，ＺＮＦ８０４Ａ）、およびＡＰＡ胚盤胞（ＣＡＣＮＡ１Ｈ）に関連するＡＰＡ精子で検証した。オピオイドシグナル伝達経路は、三つの神経発達遺伝子候補リストすべてによって共有される。表９を参照されたい。
【表8】
【表9-1】
【表9-2】
【0047】
公開されているメチル化プロファイリングアレイを使用して、自閉症および非自閉症試料からの二つの脳組織を分析した。１４１（自閉）および６２（非自閉）のＤＭＲが同定された。これらのＤＭＲ内の遺伝子は、ＡＰＡ精子（前頭皮質ｐ＝５．７８Ｅ－９、有糸状皮質ｐ＝１．６２Ｅ－４）およびＡＰＡ胚盤胞（前頭皮質ｐ＝１．９４Ｅ－１６、有糸状皮質ｐ＝３．２４Ｅ－５）ＤＭＲ関連遺伝子リストと有意に重複した。前頭皮質は、ＤＭＲに関連する遺伝子の経路解析を使用して、オピオイドシグナル伝達（ｐ＝２．１４Ｅ－３）に対して有意に濃縮されると判定された。表１０を参照されたい。
【表10】
【0048】
ＡＰＡデータセットを、公知および推定上のヒト刷り込み遺伝子の現在のリストとさらに比較した。ＡＰＡ精子は、刷り込み遺伝子に関連する１９個の低メチル化および７個の高メチル化の有意なＤＭＲを有した。ＡＰＡ胚盤胞は、刷り込み遺伝子に関連する２２個の低メチル化および１０個の高メチル化の有意なＤＭＲを有し、両方のデータセットで６個の刷り込み遺伝子が重複した（ｐ＜０．０５）。表１１を参照されたい。
【表11-1】
【表11-2】
【表11-3】
【0049】
結論
上記の研究は、ヒト精子から着床前胚へのエピジェネティックな調節異常の世代間遺伝を初めて示すものである。この結果により、精子から子孫への父親の年齢の影響のメカニズムが示され、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、および双極性障害に関連する神経発達遺伝子において顕著な感受性が確認されている。さらに、我々の研究で同定された遺伝子は、自閉性脳の前頭皮質および帯状皮質内にも特異的にメチル化された遺伝子と有意に重複した（Ｎａｒｄｏｎｅら．，２０１４）。グローバルメチル化の増加が、ＡＰＡ精子エピゲノムにおいて観察された。しかしながら、ＤＭＲ解析により、同等の数の高メチル化領域および低メチル化領域が同定された。驚くべきことに、個体間で、これらのメチル化変化は、元の精子コホートと独立した精子コホートの両方に見られる、検証された遺伝子の各ＣｐＧ部位で緊密な一貫性を持って生じた。さらに、線形回帰分析により、父親の年齢が増加するにつれて、顕著な進行性のメチル化の変化が明確に示された。興味深いことに、若年の精子試料とＡＰＡ精子試料との間でかなりのＤＮＡメチル化の変化が特定された一方、低分子ＲＮＡの差次的発現は観察されず（データは示さず）、ｍｉＲＮＡ制御が父親の年齢の進行により影響されるエピジェネティックなメカニズムではないことを示唆する。
上記の研究は、ヒト精子から着床前胚へのエピジェネティックな調節異常の世代間遺伝を初めて示すものである。この結果により、精子から子孫への父親の年齢の影響のメカニズムが示され、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、および双極性障害に関連する神経発達遺伝子において顕著な感受性が確認されている。さらに、我々の研究で同定された遺伝子は、自閉性脳の前頭皮質および帯状皮質内にも特異的にメチル化された遺伝子と有意に重複した（Ｎａｒｄｏｎｅら．，２０１４）。グローバルメチル化の増加が、ＡＰＡ精子エピゲノムにおいて観察された。しかしながら、ＤＭＲ解析により、同等の数の高メチル化領域および低メチル化領域が同定された。驚くべきことに、個体間で、これらのメチル化変化は、元の精子コホートと独立した精子コホートの両方に見られる、検証された遺伝子の各ＣｐＧ部位で緊密な一貫性を持って生じた。さらに、線形回帰分析により、父親の年齢が増加するにつれて、顕著な進行性のメチル化の変化が明確に示された。興味深いことに、若年の精子試料とＡＰＡ精子試料との間でかなりのＤＮＡメチル化の変化が特定された一方、低分子ＲＮＡの差次的発現は観察されず（データは示さず）、ｍｉＲＮＡ制御が父親の年齢の進行により影響されるエピジェネティックなメカニズムではないことを示唆する。
【0050】
父親の老化に伴い、精子と胚盤胞のメチロームとの間にＤＭＲ関連遺伝子の非常に顕著な重複があり、同じゲノム領域が、メチル化調節異常によって影響を受けることを示唆する。我々のデータセットにおけるメチル化の変化は、ゲノム全体にランダムに分布するのではなく、特定の染色体位置にクラスター状に現れる。サブテロメア領域を、精子および胚盤胞の両方について、メチル化の変化、特に、細胞バンド１９ｐ１３．３について高度に濃縮した。この細胞バンドは、多数の遺伝子（細胞バンド１６ｐ１３．３に次いで二番目であり、また三つの群すべてで有意）を担持する。これらの遺伝子へのアクセスには、より緩いクロマチン構造が必要となり、エピジェネティックな変化に対する脆弱性が生じる可能性がある。このようなサブテロメア領域におけるメチル化は、大規模なエピジェネティック再プログラミング事象を回避する可能性があり、したがって、破損および子孫への遺伝に対する感受性の可能性を有する。
【0051】
メチル化の変化はランダムに分布しなかったことで、ＡＰＡ精子中のクロマチン凝縮の特定の特徴は、エピジェネティックエラーに脆弱性があることが示唆され、胚盤胞の同じ領域内で異常な再プログラミングが生じる。発明者らは、ＡＰＡ精子において同定されたＤＭＲは、保持ヒストンの領域と共局在化したと推測した。精子形成の間、大部分のヒストンはプロタミンと交換されるが、最大１５％のヌクレオソームが、高ＣｐＧ密度の領域に保持され、発生遺伝子プロモーター、刷り込み遺伝子座、およびｍｉＲＮＡをコードする遺伝子を含む、発生的重要性を持つ座位で濃縮される（ｄｅ Ｖｒｉｅｓら．，２０１３；Ｈａｍｍｏｕｄら．，２００９）。上記で提供されたデータを、Ｈａｍｍｏｕｄら．，２００９からのＣｈＩＰデータによって以前に同定された、保持ヒストンに推定上結合したデータと比較することによって、ＡＰＡ精子ＤＭＲ関連遺伝子の統計的に有意な濃縮は、ヌクレオソーム保持と相関した。同等の濃縮が、精子および胚盤胞の両方のデータセットで同定された方向性重複ＤＭＲについて観察された。したがって、加齢によって誘発される父親の生殖系列メチル化の変化は、クロマチン環境下で遺伝される。特に、低メチル化ＤＭＲは、遺伝子と関連付けられる可能性がより高く、ＣｐＧアイランドおよび隣接領域と関連付けられる可能性がより高く、モノヌクレオソームと共局在化する可能性がより高い。驚くべきことに、ＤＭＲ関連遺伝子が保持ヒストンと有意に共局在化した一方、ＡＰＡ精子におけるｍｉＲＮＡ発現に有意な影響を与えずに、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の近くに少数のＤＭＲのみが配置された。
【0052】
ＡＰＡ精子および胚盤胞ＤＭＲは両方とも、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、および双極性障害に関連する神経発達遺伝子に対して有意な濃縮を示した。これらの神経精神症状の発生率は、父親の年齢が増加すると漸進的に増加することが知られており（ｄｅ Ｋｌｕｉｖｅｒら．，２０１７）、同様にＤＮＡメチル化の変化もこれらの障害と関連している（Ｒｕｔｔｅｎ＆Ｍｉｌｌ，２００９；Ｗｏｃｋｎｅｒら．，２０１４；Ｗｏｎｇら．，２０１４）。ゲノム刷り込みは、ＤＮＡメチル化を利用して、遺伝子発現を一つの遺伝性対立遺伝子のみに制限するエピジェネティック現象である。刷り込み遺伝子は、脳の発達において重要な役割を果たし、したがって、神経発達状態の病因に寄与する可能性がある（Ｃｒｅｓｐｉ，２００８）。多くの刷り込み障害は、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ-Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群（ｃｈｒ１１ｐ１５．５）、Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群、およびＰｒａｄｅｒ-Ｗｉｌｌｉ症候群（ｃｈｒ１５ｑ１１－１３）（Ｃｒｅｓｐｉ、２００８）を含む、自閉症様の特徴を持って存在する。刷り込みは生殖系列に定着し、広範なエピジェネティックリプログラミングを回避することで、子孫を通して持続することから、介在性ＡＰＡの影響への関与を考慮することは妥当である。実際に、高齢の父親の年齢は、マウスモデルにおける脳発現型刷り込み座位のメチル化の差異と関連し、行動変化が同時にみられた（Ｓｍｉｔｈら．，２０１３）。両方のＡＰＡデータセットは、様々なヒト刷り込み遺伝子を示した。自閉症の発症に関連があるＤＬＧＡＰ２（Ｎａｒｄｏｎｅら．，２０１４；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，＆Ｓｉｌａｈｔａｒｏｇｌｕ，２０１７；Ｓｏｌｅｒら．，２０１８）は、ＡＰＡ精子群および胚盤胞群の両方で有意に低メチル化した。さらに、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ－Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群（ｃｈｒ１１ｐ１５．５）の古典的原因である細胞バンドは、ＡＰＡ精子ならびにＤＭＲ関連遺伝子の重複群において有意に影響を受けた。ＫＣＮＱ１での低メチル化は、ＡＰＡ精子および胚盤胞内で統計的に有意であり、高齢のヒト精子において以前に観察された低メチル化に従い、我々のＡＰＡ精子試料において検証された（Ｊｅｎｋｉｎｓら．，２０１４）。
【0053】
子孫における神経発達障害はまた、ＡＰＡ精子における、オピオイドシグナル伝達経路を含む、神経学的発達および機能に関連する遺伝子におけるエピジェネティックエラーとして現れることがある。オピオイドシグナル伝達は、ＡＰＡ精子および胚盤胞、ならびに複合方向性重複ＤＭＲで影響を受ける一次経路として特定され、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、および双極性障害の三つの候補遺伝子リストすべてによって共有された。自閉症脳の前頭皮質はまた、オピオイドシグナル伝達経路の遺伝子に対して有意に濃縮され、我々のＡＰＡ精子および胚盤胞ＤＭＲ関連遺伝子リストに有意に重複した（Ｎａｒｄｏｎｅら．，２０１４）。脳内のオピオイドシグナル伝達経路は、気分調節に関与する神経伝達物質系であり、異常な脳オピオイド活性は、神経発達障害の発生に関与する可能性が高い。オピオイド受容体の増加は、自閉症および統合失調症の事例で報告され（Ｐｅｌｌｉｓｓｉｅｒ，Ｇａｎｄｉａ，Ｌａｂｏｕｔｅ，Ｂｅｃｋｅｒ，＆Ｌｅ Ｍｅｒｒｅｒ，２０１８；Ｖｏｌｋ，Ｒａｄｃｈｅｎｋｏｖａ，Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｅｎｇｕｐｔａ，＆Ｌｅｗｉｓ，２０１２）、アヘン嗜癖の症状と自閉症の症状の間には著しい類似性がある（Ｋａｌａｔ，１９７８）。逆に、自閉症様の症状は、重度に精神的な障害のある者において、オピオイド遮断によって減弱されることが示されている（Ｓａｎｄｍａｎら．，１９８３）。これらの相反する反応は、過剰または欠損のいずれかが自閉症様の症状を生じ得る、オピオイドシグナル伝達経路に繊細なバランスが必要であることを示唆している（Ｐｅｌｌｉｓｓｉｅｒら．，２０１８）。
【0054】
ＣＡＣＮＡ１Ｈは、オピオイドシグナル伝達経路で同定された一つの遺伝子である。これは、脳に豊富に発現し、ニューロン機能および脳の発生に関与するＴ型カルシウムチャネルである、ＣａＶ３．２をコードする。この遺伝子は、鎮痛に介在するオピオイドシグナル伝達経路において、オピオイド受容体と相互作用し（Ａｌｔｉｅｒ＆Ｚａｍｐｏｎｉ，２００８）、自閉症スペクトラム障害を抱える個人においてミスセンス変異が同定された（Ｓｐｌａｗｓｋｉら．，２００６）。ＣＡＣＮＡ１Ｈでの低メチル化は、同一個体の若年時と比較された、高齢のヒト精子で以前に観察された（Ｊｅｎｋｉｎｓら．，２０１４）。異常なＤＭＲ低メチル化が、ＡＰＡ精子メチロームおよび検証データにおいてこの同一遺伝子について確認されただけでなく、着床前胚盤胞メチロームにおけるＤＭＲ低メチル化は、ＡＰＡ父親に由来する胚において評価・検証された。明らかに、ある程度のメチル化保持は、胚盤胞内のＣＡＣＮＡ１Ｈにとって必要であり、その後、ＡＰＡ父親に由来するものにおいて失われる。ＣａＶ３．２カルシウムチャネル活性の変化は、最終的に、これらの子孫において影響を受ける神経機能と脳の発達につながる可能性がある。
【0055】
精子形成中のＤＮＡメチル化は、次世代に遺伝され得るエラーの影響を受けやすい。大量の精子の精液をエピジェネティックな変化について分析することができる一方、受精に利用される単一の精子からの一つのメチル化パターンのみが、胚盤胞への潜在的な遺伝を有する。
【0056】
ＡＰＡは、ヒト個体群に対する微妙で変動する影響であり、同様に、神経発達障害は、相当な範囲の症状の重症度により、スペクトラム上に存在する。ＡＰＡ父親から生まれたすべての子供が、自閉症であるわけではない。そのため、全てのＡＰＡ父親または誘導されたＡＰＡ胚盤胞内の精子ＤＮＡのメチル化において、遺伝子変異またはノックアウトと類似した大幅な改変を予期することは不合理である。
【0057】
累積リスクの閾値は、超越されれば、最終的に、疾患に対する素因、および最終的に観察された子孫の表現型となる、精子における異常なエピジェネティックな変化に関して存在する。上記のデータは、精子の年齢としてＤＮＡメチル化プロファイルがますます損なわれていることを実証し、ＡＰＡに関連する改変ヒトメチル化特性の精子および胚における世代間相関を示し、神経発達障害に関連する遺伝子において有意な感受性がみられる。
【図1A】
【図1B】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4A】
【図4B】
【国際調査報告】