▶ ラッシュ・ユニバーシティ・メディカル・センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-13
(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤ－１９治療用ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/04 20060101AFI20230606BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230606BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230606BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230606BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230606BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230606BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20230606BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20230606BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230606BHJP
【ＦＩ】
C07K7/04 ZNA
A61P31/14
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K39/395 A
A61K38/10
A61K47/64
A61K9/72
C07K14/165
C12N15/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022564349
(86)(22)【出願日】2021-04-21
(85)【翻訳文提出日】2022-12-20
(86)【国際出願番号】 US2021028369
(87)【国際公開番号】W WO2021216687
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】63/078,547
(32)【優先日】2020-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/704,091
(32)【優先日】2020-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】302057661
【氏名又は名称】ラッシュ・ユニバーシティ・メディカル・センター
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】パハン， カリパーダ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA93
4C076BB25
4C076CC35
4C076EE41N
4C076EE59N
4C076FF34
4C076FF68
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA18
4C084BA23
4C084MA13
4C084MA59
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZB382
4C084ZC751
4C085AA13
4C085EE03
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
開示される発明は、一般に、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害するための組成物に関し、開示される。ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法も開示されており、ＣＯＶＩＤ－１９のｉｎ ｖｉｖｏのモデルを作製する方法も開示されている。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）の活性を阻害せずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１とＡＣＥ－２との間の会合を阻害する、単離されたペプチドを含む組成物。
【請求項2】
組成物が、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含み、ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号９と少なくとも７５％の同一性を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ペプチドが、配列番号３または配列番号４と少なくとも７５％の同一性を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
ペプチドが、配列番号５と少なくとも７５％の同一性を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
ペプチドが、配列番号６と少なくとも７５％の同一性を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項6】
ペプチドが、配列番号７と少なくとも７５％の同一性を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項7】
ペプチドが、配列番号９と少なくとも７５％の同一性を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項8】
ペプチドが、配列番号３または配列番号４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
ペプチドが配列番号５を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
ペプチドが配列番号６を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
ペプチドが配列番号７を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
ペプチドが配列番号９を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有するペプチドからなる群から選択される２つ以上のペプチドを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項14】
単離されたペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合した配列番号１３の細胞透過性ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法であって、それを必要とする対象に第１の薬剤を投与することを含み、第１の薬剤が、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）の活性を阻害することなくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１とＡＣＥ－２との間の会合を阻害する単離されたペプチドを含む、方法。
【請求項16】
第１の薬剤が、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含み、ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号９と少なくとも７５％の同一性を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
第１の薬剤が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号９と少なくとも７５％の同一性を有するペプチドからなる群から選択される２つ以上のペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
第２の薬剤の１つまたは複数を投与することをさらに含み、第２の薬剤が、抗体、コルチコステロイド、抗ウイルス薬、抗マラリア薬、および回復期血漿から選択される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
第１の薬剤が鼻腔的にまたは吸入によって送達される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
第２の薬剤が全身的に送達される、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０２０年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０７８，５４７号および２０２０年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７０４，０９１号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２０年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０７８，５４７号および２０２０年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７０４，０９１号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＧ０５０４３１、ＡＴ０１０９８０およびＮＳ１０８０２５、ならびに米国復員軍人省によって授与された助成金番号１１Ｋ６ ＢＸ００４９８２の政府の支援を受けてなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＧ０５０４３１、ＡＴ０１０９８０およびＮＳ１０８０２５、ならびに米国復員軍人省によって授与された助成金番号１１Ｋ６ ＢＸ００４９８２の政府の支援を受けてなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月２０日に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、Ｒ６３５－ＵＳ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズが５ＫＢである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月２０日に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、Ｒ６３５－ＵＳ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズが５ＫＢである。
【0004】
開示される発明は、一般に、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害するための組成物に関し、開示される。ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法も開示されており、ＣＯＶＩＤ－１９のｉｎ ｖｉｖｏのモデルを作製する方法も開示されている。
【背景技術】
【0005】
ＣＯＶＩＤ－１９は、ウイルス株重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる感染性呼吸器疾患である。ＣＯＶＩＤ－１９の一般的な症候は、発熱、咳、および息切れであり、死亡率は約４～５％であり、インフルエンザよりも１０倍超致死である。誰もがＣＯＶＩＤ－１９に容易く感染するが、６０歳を超える人、または高血圧症、肥満、喘息、もしくは糖尿病などの既存の状態を有する人は、重度の症候に対してより脆弱である。例えば、Ｌｅｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５８０，３１１－３１２，（２０２０）；Ｍａｃｈｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，ｓ１１４８１（２０２０）を参照されたい。これまで、いずれの有効な治療法も、このウイルスパンデミックに対処するために利用できていない。
【0006】
宿主細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入は、おそらくＣＯＶＩＤ－１９の疾患の過程において最も重要な事象である。古典的なレニン－アンジオテンシン系の主要なエフェクターであるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、肺、心臓および腎臓で優勢な細胞表面の受容体である。Ｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １：６２１－６３６，（２００２）を参照されたい。ＡＣＥ２の典型的な機能は、血管収縮物質であるアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）を血管拡張物質であるＡｎｇ１－７に変換し、それによって心血管疾患の病態生理学において重要な役割を果たすことであるが、最近、ＡＣＥ２は、ＣＯＶＩＤ－１９が宿主細胞に入るためにそれを要求することに起因して、新たに注目されるようになった。Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：１４８３８－１４８４３，（２００２）。ＣＯＶＩＤ－１９は、その表面のＳタンパク質を介してＡＣＥ２に結合することが見出されている（２，５）。感染している間、Ｓタンパク質はＳ１およびＳ２サブユニットに切断され、Ｓ１サブユニットは受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を包含する。したがって、このサブユニットは、ＣＯＶＩＤ－１９がＡＣＥ２のペプチダーゼドメインに直接結合することを可能にする。Ｓｔｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：４６５，（２０２０）も参照されたい。
【0007】
ＡＣＥ２は有益な分子であるので、ＡＣＥ２の阻害またはノックダウンは有効な選択肢ではない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、宿主細胞に入るためアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合するので、ＣＯＶＩＤ－１９を治療の角度から標的化するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１とＡＣＥ－２との間の会合を阻害する薬剤が必要である。
【発明の概要】
【0008】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）の活性を阻害せずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１とＡＣＥ－２との間の会合を阻害する、単離されたペプチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含み得、ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号９と少なくとも７５％の同一性を含む。
【0009】
ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法も提供される。この方法は、それを必要とする対象に第１の薬剤を投与することを含み、第１の薬剤は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）の活性を阻害することなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１とＡＣＥ－２との間の会合を阻害する、単離されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の薬剤を投与することを含み、第１の薬剤は、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含み、ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号９と少なくとも７５％の同一性を含む。
【0010】
ＣＯＶＩＤ－１９のｉｎ ｖｉｖｏのモデルを作製する方法も提供される。この方法は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質を動物に鼻腔投与することを含む。
【0011】
上記は、以下の詳細な説明がよりよく理解され得るように、本開示の特徴および技術的利点をかなり広く概説した。本願の特許請求の範囲の主題を形成する、本開示のさらなる特徴および利点が、以下に記載される。開示された概念および特定の実施形態は、本開示の同じ目的を実行するための他の実施形態を修正または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。そのような同等の実施形態が添付の特許請求の範囲に記載された開示の精神および範囲から逸脱しないことも、当業者によって理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１Ａ～１Ｋは、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との相互作用を破壊するためのペプチドを設計するための概略図である。図１Ａは、ヒトＡＣＥ２（緑色）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（マゼンタ）の剛体のインシリコのドッキングポーズを示す。図１Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＡＩＤＳ）ペプチドの野生型（配列番号３）および変異（配列番号７）ＡＣＥ２相互作用ドメインの配列を示す。変異の位置には下線を付している。図１Ｃは、ｍＡＩＤＳではなく、ｗｔＡＩＤＳ、ペプチド．による、ＩＬ－６およびＩＬ－１βスパイクＳ１結合の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２発現に対するＡＣＥ２の阻害を示す。＊＊＊ｐ＜０．００１、対スパイクＳ１。異なる濃度のｗｔＡＩＤＳおよびｍＡＩＤＳペプチドで１５分間前処理したヒトＡ５４９肺細胞を、無血清の条件下で、１ｎｇ／ｍｌの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１で４時間刺激し、引き続いてＩＬ－６（図１Ｄ）およびＩＬ－１β（図１Ｅ）のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲによってモニタリングした。同様に、ＩＬ－６（図１Ｆ、図１Ｈ、および図１Ｊ）およびＩＬ－１β（図１Ｇ、図１Ｉ、および図１Ｋ）のｍＲＮＡ発現に対するｗｔＡＩＤＳおよびｍＡＩＤＳペプチドの効果を、ポリＩＣ－（図１Ｆおよび図１Ｇ）、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ－（図１Ｈおよび図１Ｉ）およびフラジェリン－（図１Ｊおよび図１Ｋ）刺激Ａ５４９細胞において、リアルタイムＰＣＲによって調べた。＊＊＊ｐ＜０．００１対スパイクＳ１。
【図2】図２Ａ～２Ｉは、ＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおけるｗｔＡＩＤＳペプチドの鼻腔内送達の結果が、発熱を減少させ、肺浸潤および炎症を減少させることを示す。両方の性の６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝６）を、ｗｔＡＩＤＳまたはｍＡＩＤＳペプチド（１００ｎｇ／マウス／日）で鼻腔内で治療した。１０分後、鼻腔内経路を介して組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス日）で、マウスを中毒にさせた。図２Ａは、実験の概略を提示したものである。治療の７日後、体温（図２Ｂ）をＣａｒｄｉｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｕａｌ Ｓｃａｌｅデジタル直腸温度計によってモニターした。肺の切片をＨ＆Ｅ（図２Ｃ、異なる倍率の画像；図２Ｄ、上皮細胞数；図２Ｅ、好中球細胞数；図２Ｆ、上皮細胞のパーセントとしての浸潤細胞）によって、分析した。１群あたり５匹のマウス（ｎ＝５）のそれぞれの２つの切片から細胞を計数した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。リアルタイムＰＣＲによって、ＩＬ－６（図２Ｇ）およびＩＬ－１β（図２Ｈ）のｍＲＮＡの発現を、肺組織においてモニターした。ＩＬ－６タンパク質を、ＥＬＩＳＡ（図２Ｉ）によって肺組織ホモジネートで測定した。結果は、群あたり６匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図3】図３Ａ～３Ｋは、ｗｔＡＩＤＳペプチドの鼻腔内送達後の結果がＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおいて心機能を保護していることを示す。両方の性の６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝６）を、ｗｔＡＩＤＳまたはｍＡＩＤＳペプチド（１００ｎｇ／マウス／日）で鼻腔内で治療した。１０分後、鼻腔内経路を介して組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）で、マウスを中毒にさせた。治療の７日後、ＰｏｗｅｒＬａｂ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して非侵襲的心電図検査（ＥＣＧ）によって心機能をモニタリングした。（図３Ａは、対照マウスのクロマトグラム、図３Ｂは、スパイクＳ１中毒マウスのクロマトグラム、図３Ｃは、（スパイクＳ１＋ｗｔＡＩＤＳ）治療マウスのクロマトグラム、図３Ｄは、（スパイクＳ１＋ｍＡＩＤＳ）治療マウスのクロマトグラム、図３Ｅは、心拍数、図３Ｆは、ＲＲの間隔、図３Ｇは、ＪＴの間隔、図３Ｈは、Ｒ振幅、図３Ｉは、心拍数の変動、図３Ｊは、ＱＲＳの間隔、図３Ｋは、ＱＴの間隔）。結果は、群あたり６匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図4】図４Ａ～４Ｃは、ヒトＡ５４９肺細胞における組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１によるＩＬ－６およびＩＬ－１βの用量依存的誘導の結果を示す。ヒトＡ５４９肺細胞を異なる用量の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１で、無血清条件下で４時間刺激し、続いて半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（図４Ａ）およびリアルタイムＰＣＲ（図４Ｂは、ＩＬ－６、図４Ｃは、ＩＬ－１β）によって、ＩＬ－６およびＩＬ－１βのｍＲＮＡの発現をモニタリングした。並行実験で、細胞はまた、沸騰したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１で刺激した。この場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１を５分間煮沸した。結果は、３回の独立した実験の平均＋ＳＤである。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図5】図５Ａ～５Ｃは、スパイクＳ１に対する中和抗体による、ヒトＡ５４９肺細胞におけるＩＬ－６およびＩＬ－１βのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１介在性発現の抑制を示す。様々な濃度の抗スパイクＳ１抗体または対照ＩｇＧで５分間前処理したヒトＡ５４９肺細胞を、無血清条件下で１ｎｇ／ｍｌの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１で、４時間刺激し、引き続いて半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（図５Ａ）およびリアルタイムＰＣＲ（図５ＢはＩＬ－６、図５ＣはＩＬ－１β）によってＩＬ－６およびＩＬ－１βのｍＲＮＡ発現をモニタリングした。結果は、３回の独立した実験の平均＋ＳＤである。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図6】図６Ａ～図６Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１－、ポリＩＣ－、ＨＩＶ ｔａｔ－、およびフラジェリン－刺激ヒトＡ５４９肺細胞における、ＩＬ－６およびＩＬ－１βのｍＲＮＡ発現に対するｗｔＡＩＤＳおよびｍＡＩＤＳペプチドの効果を示す。異なる濃度のｗｔＡＩＤＳおよびｍＡＩＤＳペプチドで１５分間前処理したヒトＡ５４９肺細胞を、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（図６Ａ）、ポリＩＣ（図６Ｂ）、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ－（図６Ｃ）、およびフラジェリン（図６Ｄ）で、無血清条件下で、４時間刺激し、引き続いて半定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、ＩＬ－６およびＩＬ－１βのｍＲＮＡ発現をモニタリングした。結果は３つの独立した実験を表す。
【図7】異なる心臓のパラメータの概略的な提示である。
【図8】図８Ａ～８Ｅは、ｗｔＡＩＤＳペプチドの鼻腔内送達が、ＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおいて自発運動活性を改善する結果を示す。両方の性の６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝６）を、ｗｔＡＩＤＳまたはｍＡＩＤＳペプチド（１００ｎｇ／マウス／日）で鼻腔内で治療した。１０分後、鼻腔内経路を介して組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）で、マウスを中毒にさせた。治療の７日後、マウスを一般的な自発運動活性について試験した（図８Ａ、ヒートマップ、図８Ｂ、移動距離、図８Ｃ、速度、図８Ｄ、累積持続時間、図８Ｅ、ロータロッド待ち時間）。結果は、群あたり６匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図9】図９Ａ～９Ｃは、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との相互作用を破壊するためのＡＣＥ２受容体（ＳＰＩＤＡＲ）ペプチドのスパイクＳ１相互作用ドメインの設計を示す。図９Ａ）ヒトＡＣＥ２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の剛体インシリコドッキング態勢。図９Ｂは、野生型（配列番号８）および変異（配列番号９）ＳＰＩＤＡＲペプチドの配列。変異の位置には下線を付している。図９Ｃ）ｍＳＰＩＤＡＲではなくｗｔＳＰＩＤＡＲペプチドによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１結合に対するＡＣＥ２の阻害。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１対スパイクＳ１。
【図10】図１０Ａ～１０Ｇは、ＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおけるｗｔＳＰＩＤＡＲの鼻腔内送達の結果が肺の炎症を減少させ、発熱を減少させることを示す。両方の性の６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）に、鼻腔内経路を介して、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）を中毒にさせた。治療の５日後、すべてのマウスが１００°Ｆを超える体温を示したとき、マウスをｗｔＳＰＩＤＡＲまたはｍＳＰＩＤＡＲ（１００ｎｇ／マウス／日）で鼻腔内で治療した。図１０Ａ）、実験の概略を提示したものである。図１０Ｂ）治療の７日後、リアルタイムＰＣＲによる肺におけるＩＬ－６（Ｂ）およびＩＬ－１β（図１０Ｃ）のｍＲＮＡ発現。ＩＬ－６タンパク質を、ＥＬＩＳＡ（図１０Ｄ）によって肺組織ホモジネートで測定した。ＩＬ－６（図１０Ｅ）およびＣＲＰ（図１０Ｆ）のレベルも、ＥＬＩＳＡによって血清中で定量した。体温（図１０Ｇ）を、Ｃａｒｄｉｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｕａｌ Ｓｃａｌｅデジタル直腸温度計によってモニターした。結果は、群あたり５匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳは、有意ではない。
【図11】図１１Ａ～１１Ｅは、ｗｔＳＰＩＤＡＲの鼻腔内送達後の結果が、ＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおける肺の浸潤を減少させることを示す。両方の性の６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）に、鼻腔内経路を介して組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）を中毒にさせた。治療の５日後、すべてのマウスが１００°Ｆを超える体温を示したとき、マウスをｗｔＳＰＩＤＡＲまたはｍＳＰＩＤＡＲ（１００ｎｇ／マウス／日）で鼻腔内で治療した。治療の７日後、肺の切片をＨ＆Ｅによって分析した（図１１Ａは、異なる倍率の画像、図１１Ｂは、好中球細胞数、図１１Ｃは、上皮細胞数、図１１Ｄは、上皮細胞のパーセントとしての浸潤細胞、図１１Ｅは、肺傷害スコア）。１群あたり５匹のマウス（ｎ＝５）のそれぞれの２つの切片から細胞を計数した。結果は、群あたり５匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図12】図１２Ａ～１２Ｊは、ｗｔＳＰＩＤＡＲの鼻腔内送達後の結果がＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおいて心機能を保護することを示す。両方の性の６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）に、鼻腔内経路を介して組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）を中毒にさせた。治療の５日後、すべてのマウスが１００°Ｆを超える体温を示したとき、マウスをｗｔＳＰＩＤＡＲまたはｍＳＰＩＤＡＲ（１００ｎｇ／マウス／日）で鼻腔内で治療した。治療の７日後、ＰｏｗｅｒＬａｂ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して非侵襲的心電図検査（ＥＣＧ）によって心機能をモニタリングした［図１２Ａは、対照マウスのクロマトグラム、図１２Ｂは、スパイクＳ１中毒マウスのクロマトグラム、図１２Ｃは、（スパイクＳ１＋ｗｔＳＰＩＤＡＲ）治療マウスのクロマトグラム、図１２Ｄは、（スパイクＳ１＋ｍＳＰＩＤＡＲ）治療マウスのクロマトグラム、図１２Ｅは、心拍数、図１２Ｆは、ＱＲＳの間隔、図１２Ｇは、ＱＴの間隔、図１２Ｈは、ＲＲ振幅、図１２Ｉは、心拍数の変動］、図１２Ｊ）Ｓｉｇｍａのアッセイキットを使用して血清ＬＤＨを定量した。結果は、群あたり５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図13】図１３Ａ～１３Ｆは、ｗｔＳＰＩＤＡＲの鼻腔内送達がＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおいて自発運動活性を改善する結果を示す。両方の性の６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）に、鼻腔内経路を介して組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）を中毒にさせた。治療の５日後、すべてのマウスが１００°Ｆを超える体温を示したとき、マウスをｗｔＳＰＩＤＡＲまたはｍＳＰＩＤＡＲ（１００ｎｇ／マウス／日）で鼻腔内で治療した。治療の７日後、マウスを一般的な自発運動活性について試験した（図１３Ａ、ヒートマップ、図１３Ｂ、移動した距離、図１３Ｃ、速度、図１３Ｄ、累積持続時間、図１３Ｅ、中心ゾーン周波数、図１３Ｆ、ロータロッド待ち時間）。結果は、群あたり５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下に開示される実施形態は、網羅的であること、または本開示の範囲を以下の説明における正確な形態に限定することを目的とするものではない。むしろ、実施形態は、当業者がその教示を利用することができるように、例として選択され説明される。
【0014】
本開示を通して、量、サイズ、寸法、割合などの様々な量が、範囲形式で提示される。範囲形式の量の説明は、単に便宜および簡潔さのためのものであり、任意の実施形態の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、文脈上他に明確に指示されない限り、すべての可能な部分範囲ならびにその範囲内のすべての個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の値、例えば１．１、２、２．３、４．６２、５、および５．９を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。これらの介在範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲の任意の具体的に除外された限界を条件として、本開示内に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、文脈上他に明確に指示されない限り、それらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
【0015】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、任意の実施形態を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および／または「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、記載された特徴、整数、ステップ、動作、要素、および／または成分の存在を指定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、成分、および／またはそれらの群の存在または追加を排除するものではないことがさらに理解されよう。本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる組み合わせを含む。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つ」の形式の列挙に含まれる項目は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（ＡおよびＢ）、（ＢおよびＣ）、（ＡおよびＣ）、または（Ａ、Ｂ、およびＣ）を意味することができることを理解されたい。同様に、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つ」の形式で列挙された項目は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（ＡおよびＢ）、（ＢおよびＣ）、（ＡおよびＣ）、または（Ａ、Ｂ、およびＣ）を意味することができる。
【0016】
本明細書で使用される場合、具体的に記載されていない限り、または文脈から明らかでない限り、数または数の範囲に関する「約」という用語は、記載された数およびその数の＋／－１０％、またはある範囲について記載された値について記載された下限を１０％下回り、上限を１０％上回ることを意味すると理解される。
【0017】
ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の結合の特異的標的化のための組成物および方法が提供される。組換えペプチドを、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（ＡＩＤＳ）のＡＣＥ２相互作用ドメインに対応して設計した。本明細書に記載されるペプチドを使用してＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法も提供される。いくつかの態様では、組換えペプチドは、ＩＬ－６およびＩＬ－１βの二本鎖ＲＮＡ（ポリＩＣ）およびＨＩＶ－１ Ｔａｔ媒介発現を調節することなく、肺細胞におけるＩＬ－６およびＩＬ－１βのスパイクＳ１媒介誘導を特異的に減少させた。
【0018】
ＣＯＶＩＤ－１９のｉｎ ｖｉｖｏのモデルも提供される。
【0019】
「アミノ酸」という用語は、特に、２０個の標準的なタンパク質産生ａ－アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ）のいずれか１つだけでなく、非タンパク質産生および／または非標準ａ－アミノ酸（例えば、オルニチン、シトルリン、ホモリジン、ピロリジン、４－ヒドロキシプロリン、ａ－メチルアラニン（すなわち、２－アミノイソ酪酸）、ノルバリン、ノルロイシン、テルロイシン（ｔｅｒｔ－ロイシン）、ラビオニン、または側鎖が環状基で置換されたアラニンもしくはグリシン、例えば、シクロペンチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、またはフェニルグリシン）、ならびにβ－アミノ酸（例えば、β－アラニン）、γ－アミノ酸（例えば、ｙ－アミノ酪酸、イソグルタミン、またはスタチン）および／またはδ－アミノ酸、ならびに少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのアミノ基を含む任意の他の化合物も指す。他に定義されない限り、「アミノ酸」は、好ましくはａ－アミノ酸、より好ましくは２０種の標準的なタンパク質産生ａ－アミノ酸（Ｌ－異性体またはＤ－異性体として存在することができ、好ましくはＬ－異性体として存在する）のいずれか１つを指す。
【0020】
「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシル基との間に形成されるアミド結合を介して連結された２つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。ペプチドまたはポリペプチドという用語は、ペプチドまたはポリペプチド自体、ならびにその任意の生理的に許容される塩、またはそれに対して行われる任意の化学修飾を含むことを意味し、当業者には明らかであるかまたは公知である。アミノ酸残基とも呼ばれる、ペプチドまたはポリペプチドに含まれるアミノ酸は、２０個の標準的なタンパク質産生ａ－アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ）から選択され得るが、非タンパク質産生および／または非標準ａ－アミノ酸（例えば、オルニチン、シトルリン、ホモリジン、ピロリジン、４－ヒドロキシプロリン、ａ－メチルアラニン（すなわち、２－アミノイソ酪酸）、ノルバリン、ノルロイシン、テルロイシン（ｔｅｒｔ－ロイシン）、ラビオニン、または環状基で側鎖が置換されたアラニンもしくはグリシン、例えばシクロペンチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、シクロヘキシルグリシンまたはフェニルグリシン）ならびにβ－アミノ酸（例えば、β－アラニン）、γ－アミノ酸（例えば、γ－アミノ酪酸、イソギウタミン、またはスタチン）およびδ－アミノ酸からも選択され得る。好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドに含まれるアミノ酸残基は、ａ－アミノ酸、より好ましくは２０種の標準的なタンパク質産生ａ－アミノ酸（これらはＬ－異性体またはＤ－異性体として存在することができ、好ましくはすべてＬ－異性体として存在する）から選択される。ペプチドまたはポリペプチドは、非修飾のものでもよく、または例えば、そのＮ末端、そのＣ末端および／またはそのアミノ酸残基のいずれかの側鎖の官能基で（特に、１つ以上のＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕおよび／またはＡｒｇ残基の側鎖官能基において）修飾されたのでもよい。そのような修飾としては、例えば、Ｗｕｔｓ ＰＧ＆Ｇｒｅｅｎｅ ＴＷ，’’Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，’’Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００６に対応する官能基について記載されている保護基のいずれかの結合が挙げられ得る。そのような修飾には、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の共有結合（ＰＥＧ化ペプチドまたはポリペプチドの形成）、グリコシル化および／または１つ以上の脂肪酸によるアシル化（例えば、１つ以上のＣ８～３０アルカン酸またはアルケン酸、脂肪酸アシル化ペプチドまたはポリペプチドの形成）も含まれ得る。さらに、そのような修飾されたペプチドまたはタンパク質はまた、アミド結合（１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシル基との間に形成される）を介して連結された少なくとも２つのアミノ酸を含むことを条件として、ペプチド模倣物を含み得る。ペプチドまたはポリペプチドに含まれるアミノ酸残基は、例えば、線状分子鎖（直鎖状ペプチドまたはタンパク質を形成する）として存在してもよく、または１つ以上の環（環状ペプチドまたはポリペプチドに対応する）を形成してもよい。ペプチドまたはポリペプチドはまた、２つ以上の同一または異なる分子からなるオリゴマーを形成し得る。
【0021】
「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えばペプチドまたはポリペプチド間の全体的な関連性を指す。提供される２つのポリペプチド配列間の同一性の割合の計算方法は公知である。２つのポリペプチド配列の同一性の割合の計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適なアラインメントのために第１の配列および第２の配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非同一配列を無視することができる）。次いで、対応する位置のアミノ酸を比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合は、任意選択でギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があり得る。配列の比較またはアラインメントおよび２つの配列間の同一性の割合の決定は、ＢＬＡＳＴ（基本的局所アラインメント検索ツール）などの数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合（例えば、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％、または９５～１００％）、互いに「ホモログ」であると見なされる。
【0022】
同一性の割合を計算するために、比較される配列は、典型的には、配列間の最大一致を与えるように整列される。市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、アミノ酸または核酸配列の比較に利用可能なアルゴリズムの一例は、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴである。例示的なプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，’’Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，’’Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），’’Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），’’Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
【0023】
類似の配列を特定することに加えて、上述のプログラムは、一般に、類似度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、対応する残基の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上が、関連する残基ストレッチ（例えば、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％、または９５～１００％）にわたって類似および／または同一である場合、２つの配列は実質的に類似であると見なされる。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは完全な配列である。
【0024】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、哺乳動物、いくつかの態様ではヒトを指す。
【0025】
治療剤、例えばペプチドの「治療的有効量」、「有効用量」、「有効量」または「治療有効用量」は、単独でまたは別の治療剤と組み合わせて使用される場合、病徴の重症度の低下、病徴のない期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の罹患による機能障害もしくは能力障害の予防によって証明される、疾患の発症から対象を保護するか、または疾患の後退を促進する任意の量である。治療剤は、障害、および／または障害の症候のいずれか１つを阻害（その重症度を軽減またはその発生を排除）および／または予防することができる。疾患の後退を促進する治療剤の能力は、臨床治験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによってなど、当業者に公知の様々な方法を使用して評価することができる。
【0026】
本開示の文脈内の「治療すること」、「治療する」、または「治療」は、障害もしくは疾患に関連する症候の緩和、またはそれらの症候のさらなる進行もしくは悪化の停止、または疾患もしくは障害の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎもしくはｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を意味する。例えば、本開示の文脈内で、治療の成功は、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する症候の緩和を含み得る。治療は、障害もしくは疾患に関連する症候の緩和、またはそれらの症候のさらなる進行もしくは悪化の停止、または疾患もしくは障害の予防もしくは予防をもたらす有効量のペプチドを対象に投与することを含み得る。
【0027】
いくつかの実施形態では、本開示の実施は、別途指示がない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある分子生物学、免疫学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。
【0028】
組換えペプチド
組換えペプチドを、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１のＡＣＥ２相互作用ドメイン（ＡＩＤＳ）およびＡＣＥ２受容体のスパイクＳ１相互作用ドメイン（ＳＰＩＤＡＲ）に対応して設計した。本明細書で使用される組換えペプチドは、天然アミノ酸のみから構築され得る。あるいは、組換えペプチドは、限定されないが、修飾されたアミノ酸を含む非天然アミノ酸を含み得る。修飾されたアミノ酸には、アミノ酸に天然に存在しない基を含むように化学修飾された天然アミノ酸が含まれる。組換えペプチドは、Ｄ－アミノ酸をさらに含み得る。またさらに、組換えペプチドは、アミノ酸アナログを含み得る。
組換えペプチドを、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１のＡＣＥ２相互作用ドメイン（ＡＩＤＳ）およびＡＣＥ２受容体のスパイクＳ１相互作用ドメイン（ＳＰＩＤＡＲ）に対応して設計した。本明細書で使用される組換えペプチドは、天然アミノ酸のみから構築され得る。あるいは、組換えペプチドは、限定されないが、修飾されたアミノ酸を含む非天然アミノ酸を含み得る。修飾されたアミノ酸には、アミノ酸に天然に存在しない基を含むように化学修飾された天然アミノ酸が含まれる。組換えペプチドは、Ｄ－アミノ酸をさらに含み得る。またさらに、組換えペプチドは、アミノ酸アナログを含み得る。
【0029】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１を配列番号１に示す。
ＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬ ＭＧＣＶＡＥＴＧＴＱ ＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬ ＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲ ＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲ ＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬ ＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷ ＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮ ＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬ ＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳ ＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷ ＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴ ＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴ ＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱ ＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹ ＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥ ＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮ ＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰ ＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧ ＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦ ＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹ ＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲ ＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥ ＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮ ＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬ ＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳ ＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡ ＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴ ＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴ ＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤ
ＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫ ＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱ ＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥ ＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮ ＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡ ＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮ ＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤ ＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦ ＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰ ＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮ ＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧ ＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱ ＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫ ＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩ ＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫ ＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲ ＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ ＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱ ＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥ ＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳ ＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧ ＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳ ＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶ ＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶ ＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮ ＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥ ＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱ ＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤ ＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩ ＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧ
ＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴ ＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤ ＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩ ＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲ ＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱ ＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥ ＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩ ＰＩ（配列番号１）
ＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬ ＭＧＣＶＡＥＴＧＴＱ ＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬ ＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲ ＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲ ＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬ ＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷ ＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮ ＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬ ＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳ ＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷ ＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴ ＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴ ＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱ ＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹ ＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥ ＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮ ＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰ ＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧ ＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦ ＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹ ＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲ ＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥ ＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮ ＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬ ＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳ ＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡ ＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴ ＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴ ＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤ
ＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫ ＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱ ＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥ ＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮ ＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡ ＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮ ＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤ ＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦ ＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰ ＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮ ＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧ ＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱ ＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫ ＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩ ＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫ ＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲ ＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ ＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱ ＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥ ＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳ ＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧ ＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳ ＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶ ＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶ ＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮ ＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥ ＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱ ＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤ ＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩ ＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧ
ＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴ ＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤ ＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩ ＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲ ＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱ ＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥ ＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩ ＰＩ（配列番号１）
【0030】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は配列番号２に示される。
ＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳ ＬＶＡＶＴＡＡＱＳＴ ＩＥＥＱＡＫＴＦＬＤ ＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦ ＹＱＳＳＬＡＳＷＮＹ
ＮＴＮＩＴＥＥＮＶＱ ＮＭＮＮＡＧＤＫＷＳ ＡＦＬＫＥＱＳＴＬＡ ＱＭＹＰＬＱＥＩＱＮ ＬＴＶＫＬＱＬＱＡＬ
ＱＱＮＧＳＳＶＬＳＥ ＤＫＳＫＲＬＮＴＩＬ ＮＴＭＳＴＩＹＳＴＧ ＫＶＣＮＰＤＮＰＱＥ ＣＬＬＬＥＰＧＬＮＥ
ＩＭＡＮＳＬＤＹＮＥ ＲＬＷＡＷＥＳＷＲＳ ＥＶＧＫＱＬＲＰＬＹ ＥＥＹＶＶＬＫＮＥＭ ＡＲＡＮＨＹＥＤＹＧ ＤＹＷＲＧＤＹＥＶＮ ＧＶＤＧＹＤＹＳＲＧ ＱＬＩＥＤＶＥＨＴＦ ＥＥＩＫＰＬＹＥＨＬ ＨＡＹＶＲＡＫＬＭＮ ＡＹＰＳＹＩＳＰＩＧ ＣＬＰＡＨＬＬＧＤＭ ＷＧＲＦＷＴＮＬＹＳ ＬＴＶＰＦＧＱＫＰＮ ＩＤＶＴＤＡＭＶＤＱ ＡＷＤＡＱＲＩＦＫＥ ＡＥＫＦＦＶＳＶＧＬ ＰＮＭＴＱＧＦＷＥＮ ＳＭＬＴＤＰＧＮＶＱ ＫＡＶＣＨＰＴＡＷＤ ＬＧＫＧＤＦＲＩＬＭ ＣＴＫＶＴＭＤＤＦＬ ＴＡＨＨＥＭＧＨＩＱ ＹＤＭＡＹＡＡＱＰＦ ＬＬＲＮＧＡＮＥＧＦ
ＨＥＡＶＧＥＩＭＳＬ ＳＡＡＴＰＫＨＬＫＳ ＩＧＬＬＳＰＤＦＱＥ ＤＮＥＴＥＩＮＦＬＬ ＫＱＡＬＴＩＶＧＴＬ
ＰＦＴＹＭＬＥＫＷＲ ＷＭＶＦＫＧＥＩＰＫ ＤＱＷＭＫＫＷＷＥＭ ＫＲＥＩＶＧＶＶＥＰ ＶＰＨＤＥＴＹＣＤＰ ＡＳＬＦＨＶＳＮＤＹ ＳＦＩＲＹＹＴＲＴＬ ＹＱＦＱＦＱＥＡＬＣ ＱＡＡＫＨＥＧＰＬＨ ＫＣＤＩＳＮＳＴＥＡ ＧＱＫＬＦＮＭＬＲＬ ＧＫＳＥＰＷＴＬＡＬ ＥＮＶＶＧＡＫＮＭＮ ＶＲＰＬＬＮＹＦＥＰ ＬＦＴＷＬＫＤＱＮＫ ＮＳＦＶＧＷＳＴＤＷ ＳＰＹＡＤＱＳＩＫＶ ＲＩＳＬＫＳＡＬＧＤ ＫＡＹＥＷＮＤＮＥＭ ＹＬＦＲＳＳＶＡＹＡ ＭＲＱＹＦＬＫＶＫＮ ＱＭＩＬＦＧＥＥＤＶ ＲＶＡＮＬＫＰＲＩＳ ＦＮＦＦＶＴＡＰＫＮ ＶＳＤＩＩＰＲＴＥＶ ＥＫＡＩＲＭＳＲＳＲ ＩＮＤＡＦＲＬＮＤＮ ＳＬＥＦＬＧＩＱＰＴ ＬＧＰＰＮＱＰＰＶＳ ＩＷＬＩＶＦＧＶＶＭ ＧＶＩＶＶＧＩＶＩＬ ＩＦＴＧＩＲＤＲＫＫ ＫＮＫＡＲＳＧＥＮＰ ＹＡＳＩＤＩＳＫＧＥ ＮＮＰＧＦＱＮＴＤＤ ＶＱＴＳＦ（配列番号２）
ＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳ ＬＶＡＶＴＡＡＱＳＴ ＩＥＥＱＡＫＴＦＬＤ ＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦ ＹＱＳＳＬＡＳＷＮＹ
ＮＴＮＩＴＥＥＮＶＱ ＮＭＮＮＡＧＤＫＷＳ ＡＦＬＫＥＱＳＴＬＡ ＱＭＹＰＬＱＥＩＱＮ ＬＴＶＫＬＱＬＱＡＬ
ＱＱＮＧＳＳＶＬＳＥ ＤＫＳＫＲＬＮＴＩＬ ＮＴＭＳＴＩＹＳＴＧ ＫＶＣＮＰＤＮＰＱＥ ＣＬＬＬＥＰＧＬＮＥ
ＩＭＡＮＳＬＤＹＮＥ ＲＬＷＡＷＥＳＷＲＳ ＥＶＧＫＱＬＲＰＬＹ ＥＥＹＶＶＬＫＮＥＭ ＡＲＡＮＨＹＥＤＹＧ ＤＹＷＲＧＤＹＥＶＮ ＧＶＤＧＹＤＹＳＲＧ ＱＬＩＥＤＶＥＨＴＦ ＥＥＩＫＰＬＹＥＨＬ ＨＡＹＶＲＡＫＬＭＮ ＡＹＰＳＹＩＳＰＩＧ ＣＬＰＡＨＬＬＧＤＭ ＷＧＲＦＷＴＮＬＹＳ ＬＴＶＰＦＧＱＫＰＮ ＩＤＶＴＤＡＭＶＤＱ ＡＷＤＡＱＲＩＦＫＥ ＡＥＫＦＦＶＳＶＧＬ ＰＮＭＴＱＧＦＷＥＮ ＳＭＬＴＤＰＧＮＶＱ ＫＡＶＣＨＰＴＡＷＤ ＬＧＫＧＤＦＲＩＬＭ ＣＴＫＶＴＭＤＤＦＬ ＴＡＨＨＥＭＧＨＩＱ ＹＤＭＡＹＡＡＱＰＦ ＬＬＲＮＧＡＮＥＧＦ
ＨＥＡＶＧＥＩＭＳＬ ＳＡＡＴＰＫＨＬＫＳ ＩＧＬＬＳＰＤＦＱＥ ＤＮＥＴＥＩＮＦＬＬ ＫＱＡＬＴＩＶＧＴＬ
ＰＦＴＹＭＬＥＫＷＲ ＷＭＶＦＫＧＥＩＰＫ ＤＱＷＭＫＫＷＷＥＭ ＫＲＥＩＶＧＶＶＥＰ ＶＰＨＤＥＴＹＣＤＰ ＡＳＬＦＨＶＳＮＤＹ ＳＦＩＲＹＹＴＲＴＬ ＹＱＦＱＦＱＥＡＬＣ ＱＡＡＫＨＥＧＰＬＨ ＫＣＤＩＳＮＳＴＥＡ ＧＱＫＬＦＮＭＬＲＬ ＧＫＳＥＰＷＴＬＡＬ ＥＮＶＶＧＡＫＮＭＮ ＶＲＰＬＬＮＹＦＥＰ ＬＦＴＷＬＫＤＱＮＫ ＮＳＦＶＧＷＳＴＤＷ ＳＰＹＡＤＱＳＩＫＶ ＲＩＳＬＫＳＡＬＧＤ ＫＡＹＥＷＮＤＮＥＭ ＹＬＦＲＳＳＶＡＹＡ ＭＲＱＹＦＬＫＶＫＮ ＱＭＩＬＦＧＥＥＤＶ ＲＶＡＮＬＫＰＲＩＳ ＦＮＦＦＶＴＡＰＫＮ ＶＳＤＩＩＰＲＴＥＶ ＥＫＡＩＲＭＳＲＳＲ ＩＮＤＡＦＲＬＮＤＮ ＳＬＥＦＬＧＩＱＰＴ ＬＧＰＰＮＱＰＰＶＳ ＩＷＬＩＶＦＧＶＶＭ ＧＶＩＶＶＧＩＶＩＬ ＩＦＴＧＩＲＤＲＫＫ ＫＮＫＡＲＳＧＥＮＰ ＹＡＳＩＤＩＳＫＧＥ ＮＮＰＧＦＱＮＴＤＤ ＶＱＴＳＦ（配列番号２）
【0031】
ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害する組換えペプチドは、ＮＧＶＧＹ（配列番号３）のコア配列、および少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれに対して１００％の同一性、例えば、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％、または９５～１００％）を有するペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、組換えペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性、例えばコア配列ＴＮＧＶＧＹ（配列番号４）と７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％または９５～１００％）の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、組換えペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性、例えば、ＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹ（配列番号５）と７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％または９５～１００％）の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号２のコア配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質のアミノ酸５０１～５０５を標的とする。さらに他の実施形態では、組換えペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性、例えばコア配列ＰＬＱＳＹＧ（配列番号６）と７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％または９５～１００％）の同一性を有し得る。さらに他の実施形態では、組換えペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性、例えばコアＥＤＬＦＹＱＳ（配列番号７）と７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％または９５～１００％）の同一性を有し得る。さらに他の実施形態では、組換えペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性、例えばコアＥＤＬＦＹＱ（配列番号９）と７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、８５～９５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～１００％または９５～１００％）の同一性を有し得る。いくつかの態様では、１、２、３またはそれより多い組換えペプチドを一緒に使用することができる。非限定的な例として、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５の組換えペプチドは、配列番号６、配列番号７および／または配列番号９混合させて対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えペプチドは、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含む組成物に存在し得る。
【0032】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えペプチドは、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含む組成物にあり得、コア配列のＮ末端もしくはＣ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に付加された、５、６もしくは７個のアミノ酸に加えてそれぞれ最大１０、９もしくは８個のさらなるアミノ酸のコア配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えペプチドは、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含む組成物にあってもよく、ＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦ（配列番号１１）またはＦＬＤＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦＹＱＳＳＬＡＳＷＮＹＮ（配列番号１２）に基づいてコア配列から連続した順序で、コア配列のＮ末端もしくはＣ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に付加され、合計で１５個以下のアミノ酸についていずれかの方向に伸長する、それぞれ５、６または７個のアミノ酸と最大１０、９または８個の追加アミノ酸とのコア配列（下線）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えペプチドは、１５個以下のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含む組成物にあり得、コア配列のＮ末端もしくはＣ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に付加された、５、６もしくは７個のアミノ酸に加えてそれぞれ１０、９もしくは８個未満のさらなるアミノ酸のコア配列を含み得る。いくつかの実施形態では、組換えペプチドは、コア配列の１つもしくは２つのアミノ酸変異を有する、またはコア配列のＮ末端もしくはＣ末端またはＮ末端とＣ末端の両方に付加された、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および／もしくは配列番号９、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および／もしくは配列番号９から本質的になる。
【0033】
いくつかの実施形態では、組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を除去するための追加のペプチドを含み得る。追加のペプチドは、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害する単離されたペプチドの中枢神経系への浸透を促進し得る。いくつかの実施形態では、追加のペプチドは、アンテナペディアホメオドメイン由来であり得る。いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１３）であり得る。細胞透過性ペプチドは、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害する上記のペプチドのいずれかのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【0034】
非限定的な例として、脳および脊髄からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を除去するためのＡＩＤＳペプチドは、ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＴＮＧＶＧＹ（配列番号１４）であり得、脳および脊髄からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を除去するためのＳＰＩＤＡＲペプチドは、ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＥＤＬＦＹＱ（配列番号１５）であり得る。いくつかの実施形態において、ＡＩＤＳペプチドファミリーメンバーのいずれかは、細胞透過性ペプチドにカップリングされ得る。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＤＡＲペプチドファミリーメンバーのいずれかが、細胞透過性ペプチドにカップリングされ得る。
【0035】
第２の薬剤
本発明のペプチドのいずれも、第２の薬剤と共に投与することができると考えられる。第２の薬剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療に有効であることが当業者に知られている任意の薬剤であり得る。当業者は、第２の薬剤が薬物または抗体であり得ることを認識するであろう。薬物は抗ウイルス剤であり得る。第２の薬剤は、限定されないが、抗体、例えばバンラニビマブ、カシリビマブ、インデビマブ、エテセビマブ、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、抗ウイルス剤、例えばレムデシビル、バリシチニブ、抗マラリア剤、例えばヒドロキシクロロキンまたはクロロキニンの１つまたは複数を含むことができる。第２の薬剤はまた、回復期血漿であり得る。
本発明のペプチドのいずれも、第２の薬剤と共に投与することができると考えられる。第２の薬剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療に有効であることが当業者に知られている任意の薬剤であり得る。当業者は、第２の薬剤が薬物または抗体であり得ることを認識するであろう。薬物は抗ウイルス剤であり得る。第２の薬剤は、限定されないが、抗体、例えばバンラニビマブ、カシリビマブ、インデビマブ、エテセビマブ、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、抗ウイルス剤、例えばレムデシビル、バリシチニブ、抗マラリア剤、例えばヒドロキシクロロキンまたはクロロキニンの１つまたは複数を含むことができる。第２の薬剤はまた、回復期血漿であり得る。
【0036】
薬学的組成物
本明細書に記載されるペプチドは、単独で、または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と一緒に組成物において使用され得る。本明細書に開示される薬学的組成物は、治療的有効量の１つまたはそれを超えるペプチドを、１つまたはそれを超える薬学的に許容される担体と一緒に含む場合がある。いくつかの実施形態では、ペプチドは、他の活性薬剤がペプチドと共に投与されないように、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に単独で使用される。
本明細書に記載されるペプチドは、単独で、または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と一緒に組成物において使用され得る。本明細書に開示される薬学的組成物は、治療的有効量の１つまたはそれを超えるペプチドを、１つまたはそれを超える薬学的に許容される担体と一緒に含む場合がある。いくつかの実施形態では、ペプチドは、他の活性薬剤がペプチドと共に投与されないように、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に単独で使用される。
【0037】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、任意の種類の非毒性の不活性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料または処方助剤を意味する。薬学的に許容される担体として機能し得る物質のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；コーンスターチ、ジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油などの油；ベニバナ油；ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール類；かかるプロピレングリコール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウムや水酸化アルミニウムなどのバッファー；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸バッファー、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性の適合性潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤も、配合者の判断に従って、組成物に存在させ得る。他の適切な薬学的に許容される賦形剤は、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）に記載されている。
【0038】
本明細書に記載されるペプチドは、必要に応じて、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する投与単位製剤でヒトおよび動物に投与され得る。
【0039】
製剤の方法は当該技術分野で周知であり、例えばＴｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）に開示されている。本開示で使用するための薬学的組成物は、滅菌された非発熱原性液体溶液もしくは懸濁液、コーティングされたカプセルもしくは脂質粒子、凍結乾燥粉末、または当該技術分野で公知の他の形態の形態であり得る。
【0040】
本明細書で使用されるペプチドは、液体、エアロゾルまたは吸入可能な乾燥粉末として送達するために製剤化され得る。ペプチドは、鼻腔的にまたは吸入によって送達され得る。液体エアロゾル製剤は、主に、終末細気管支および呼吸細気管支に送達することができる粒径に噴霧することができる。
【0041】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。ペプチドに加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有し得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤および芳香剤などのアジュバントも含むことができる。
【0042】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形では、ペプチドは、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムおよび／またはａ）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロースおよびアカシア、ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩および炭酸ナトリウム、ｅ）溶液遅延剤、例えばパラフィン、ｆ）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えばアセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど、ｈ）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイトクレー、ならびにｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形はバッファーも含み得る。
【0043】
同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用することもできる。
【0044】
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。それらは、場合により乳白剤を含有してもよく、活性成分のみを、または優先的に、腸管の特定の部分において、場合により遅延する様式で放出する組成物であってもよい。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【0045】
ペプチドはまた、上記のように１つ以上の賦形剤と共にマイクロカプセル化された形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび医薬製剤分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。そのような固体剤形では、ペプチドは、スクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。そのような剤形はまた、通常の慣行のように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば錠剤化潤滑剤および他の錠剤化助剤、例えばステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースを含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形はバッファー剤も含み得る。それらは、場合により乳白剤を含有してもよく、活性成分のみを、または優先的に、腸管の特定の部分において、場合により遅延する様式で放出する組成物であってもよい。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【0046】
ペプチドの局所投与または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチが含まれる。活性成分は、滅菌条件下で薬学的に許容される担体および必要に応じて任意の必要な防腐剤またはバッファーと混合される。眼科用製剤、点耳剤などもまた、本開示の範囲内であると考えられる。
【0047】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、ペプチドに加えて、賦形剤、例えば動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含み得る。
【0048】
ペプチドはまた、ペプチドに加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有し得る局所用粉末およびスプレーとして使用するために製剤化され得る。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素などの慣用的な噴射剤をさらに含むことができる。
【0049】
経皮パッチはまた、身体へのペプチドの制御された送達をもたらすために使用され得る。そのような剤形は、ペプチドを適切な培地に溶解または分注することによって作製することができる。吸収エンハンサーを使用して、皮膚を越えるペプチドの流動を増加させることもできる。速度は、速度制御膜を設けることによって、またはポリマーマトリックスもしくはゲルにペプチドを分散させることによって、制御することができる。ペプチドは、リポソームの形態で投与することもできる。当該技術分野で公知のように、リポソームは、一般に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒体に分散された単層または多層の水和液晶によって形成される。リポソームを形成することができる任意の非毒性の生理的に許容され得る代謝可能な脂質を使用することができる。リポソームの形態の本組成物は、ペプチドに加えて、安定剤、防腐剤、賦形剤などを含有することができる。好ましい脂質は、天然および合成の両方のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ（ｅｄ．），’’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，’’Ｖｏｌｕｍｅ ＸＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６を参照されたい。
【0050】
本明細書に記載のペプチドのエアロゾル化製剤は、好ましくは主に１～５μｍの質量媒体平均直径を有するエアロゾル粒子の形成を可能にするように選択された、ジェット、振動多孔質プレートまたは超音波噴霧器などのエアロゾル形成装置を使用して送達され得る。さらに、製剤は、好ましくは、バランスのとれた浸透圧イオン強度および塩化物の濃度、ならびに有効な用量のペプチドを治療部位に送達することができる最小のエアロゾル化可能な体積を有する。さらに、エアロゾル化製剤は、好ましくは、気道の機能性を負に損なわず、望ましくない副作用を引き起こさない。
【0051】
ペプチドのエアロゾル製剤の投与に適したエアロゾル化装置としては、例えば、主に１～５μｍのサイズの範囲のエアロゾル粒径にペプチドの製剤を噴霧することができるジェット、振動多孔質プレート、超音波噴霧器、および通電乾燥粉末吸入器が挙げられる。主に、本願では、生成されたすべてのエアロゾル粒子の少なくとも７０％、好ましくは９０％超が１～５μｍの範囲内にあることを意味する。ジェット式噴霧器は、空気圧によって作動し、液体溶液をエアロゾル液滴に分解する。振動多孔質板噴霧器は、急速に振動する多孔質板によって生成される音波真空を使用して、多孔質板を通して溶媒液滴を押し出すことによって機能する。超音波噴霧器は、液体をせん断して小さなエアロゾル液滴にする圧電結晶によって機能する。様々な適切な装置が利用可能であり、当業者に周知であり、本発明での使用に適している。
【0052】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルジョン、例えば１，３－プロパンジオールまたは１，３－ブタンジオールの溶液であってもよい。使用され得る許容され得るビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、米国薬局方および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製での使用を見出する。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
【0053】
薬物の効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることがしばしば望ましい。これは、水の溶解度が低い結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。そのとき、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、ひいては、溶解速度は結晶のサイズおよび結晶の形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延での吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成され得る。注射可能なデポー形態は、ポリ乳酸－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーに薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することによって、調製され得る。
【0054】
本明細書に記載のペプチドは、単独で、または他の薬剤と組み合わせて投与することができ、可能な併用療法は互い違いにするか、または互いに独立して与えることができる。上述のように、他の治療戦略に関連したアジュバント療法と同様に、長期治療も等しく可能である。他の可能な治療は、初期治療後の患者の状態を維持するための治療、または例えばリスクのある患者における予防的療法でさえある。
【0055】
ペプチドの有効量は、一般に、症候の阻害または緩和を検出可能にするのに十分な任意の量を含む。単一投与形態を生成するために担体材料と混合することができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変化する。しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルは、使用される特定のペプチドの活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の組み合わせ、および治療を受けている特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存することが理解されよう。所与の状況に対する治療的有効量は、常套的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医の技能および判断の範囲内である。
【0056】
ペプチドが別の化合物と組み合わせて投与される場合、「有効な量」という用語は、所望の効果を達成するための追加の化合物と組み合わせたペプチドの量を意味すると理解される。換言すれば、本開示による適切な併用療法は、ペプチドの量および追加の化合物の量を包含し、そのいずれかが、その特定の用量で単独で与えられた場合、有効量を構成しないが、組み合わせて投与された場合、「有効な量」になる。
【0057】
しかしながら、本開示のペプチドおよび組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；使用される特定のペプチドの活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；使用される特定のペプチドの投与時間、投与経路および排泄速度；治療期間；使用される特定のペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存するであろう。
【0058】
温血動物、例えば体重約７０ｋｇのヒトに投与されるペプチドの用量は、好ましくは約３ｍｇ～約５ｇ、より好ましくは約１０ｍｇ～約１．５ｇ、最も好ましくは約１００ｍｇ～約１０００ｍｇ／人／日であり、好ましくは例えば同じサイズであり得る１～３回の単回用量に分割される。通常、小児は成人の用量の半分を受ける。
【0059】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｉｎ ｖｉｖｏのモデル
ＣＯＶＩＤ－１９のｉｎ ｖｉｖｏのモデルが本明細書に含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏのモデルは、対照動物に対して、発熱、肺炎症の悪化、肺への好中球の浸潤の増加、心機能の低下、および自発運動活性の障害を含むがこれらに限定されないＣＯＶＩＤ－１９の１つ以上の症候を発症するウイルス不含モデルである。このｉｎ ｖｉｖｏのモデルは、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質を動物に鼻腔投与することによって調製される。非限定的な例として、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１は、配列番号１であり得るが、ただし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の他の配列変異体も使用され得る。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１は、動物の一方または両方の鼻孔に鼻腔的に送達され得る。いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１は吸入によって送達され得る。いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質は生理食塩水で送達される。
ＣＯＶＩＤ－１９のｉｎ ｖｉｖｏのモデルが本明細書に含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏのモデルは、対照動物に対して、発熱、肺炎症の悪化、肺への好中球の浸潤の増加、心機能の低下、および自発運動活性の障害を含むがこれらに限定されないＣＯＶＩＤ－１９の１つ以上の症候を発症するウイルス不含モデルである。このｉｎ ｖｉｖｏのモデルは、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質を動物に鼻腔投与することによって調製される。非限定的な例として、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１は、配列番号１であり得るが、ただし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の他の配列変異体も使用され得る。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１は、動物の一方または両方の鼻孔に鼻腔的に送達され得る。いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１は吸入によって送達され得る。いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質は生理食塩水で送達される。
【0060】
以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態を例示することを意図しており、決して特許請求の範囲の開示または範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【0061】
実施例１
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ２相互作用ドメイン（ＡＩＤＳ）に対応するペプチドの設計
結果
ＣＯＶＩＤ－１９には特異的な治療法がないので、治療の角度から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体ＡＣＥ２との間の相互作用を標的とすることを決定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＡＣＥ２との相互作用に関与している。例えば、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７，２２６－２３６，（２００９）を参照されたい。したがって、剛体タンパク質－タンパク質相互作用ツールを適用して、スパイクタンパク質Ｓ１サブユニットのＲＢＤとＡＣＥ２との間の相互作用をモデル化した。インシリコモデル化分析から明白なように、ＡＣＥ２およびＳ１ ＲＢＤ複合体のドッキングポーズは、スパイクＳ１のＡｓｎ５０１とＡＣＥ２のＬｙｓ３５３との間の強いＨ結合を明らかにした。また、スパイクＳ１のＴｙｒ５０５は、ＡＣＥ２のＧｌｎ４２およびＬｙｓ３５３の側鎖と疎水性相互作用を示した（図１Ａ）。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＡＣＥ２との間の相互作用を不安定にするために、Ｓ１サブユニットのＲＢＤからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ２相互作用ドメイン（ＡＩＤＳ）に対応するヘキサペプチド（図１Ｂ）を設計した（変異の位置に下線を引いている）：
野生型（ｗｔ）ＡＩＤＳ：５００ＴＮＧＶＧＹ５０５（配列番号４）
変異型（ｍ）ＡＩＤＳ：５００ＴＧＧＶＧＤ ５０５（配列番号８）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ２相互作用ドメイン（ＡＩＤＳ）に対応するペプチドの設計
結果
ＣＯＶＩＤ－１９には特異的な治療法がないので、治療の角度から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体ＡＣＥ２との間の相互作用を標的とすることを決定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＡＣＥ２との相互作用に関与している。例えば、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７，２２６－２３６，（２００９）を参照されたい。したがって、剛体タンパク質－タンパク質相互作用ツールを適用して、スパイクタンパク質Ｓ１サブユニットのＲＢＤとＡＣＥ２との間の相互作用をモデル化した。インシリコモデル化分析から明白なように、ＡＣＥ２およびＳ１ ＲＢＤ複合体のドッキングポーズは、スパイクＳ１のＡｓｎ５０１とＡＣＥ２のＬｙｓ３５３との間の強いＨ結合を明らかにした。また、スパイクＳ１のＴｙｒ５０５は、ＡＣＥ２のＧｌｎ４２およびＬｙｓ３５３の側鎖と疎水性相互作用を示した（図１Ａ）。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＡＣＥ２との間の相互作用を不安定にするために、Ｓ１サブユニットのＲＢＤからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ２相互作用ドメイン（ＡＩＤＳ）に対応するヘキサペプチド（図１Ｂ）を設計した（変異の位置に下線を引いている）：
野生型（ｗｔ）ＡＩＤＳ：５００ＴＮＧＶＧＹ５０５（配列番号４）
変異型（ｍ）ＡＩＤＳ：５００ＴＧＧＶＧＤ ５０５（配列番号８）
【0062】
次に、ｗｔＡＩＤＳペプチドがＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との結合を阻害するかどうかを調べるために、化学発光に基づくＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１結合を、アッセイキット（カタログ＃７９９３６；ＢＰＳバイオサイエンス）を使用して採用した。図１Ｃから明らかなように、固定化されたＡＣＥ２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の結合は、ｗｔＡＩＤＳペプチドによって強く阻害された。しかし、ｍＡＩＤＳペプチド（図１Ｃ）ではそのような阻害は見られず、効果の特異性を示した。
【0063】
ＡＩＤＳペプチドは、二本鎖ＲＮＡ（ポリＩＣ）、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ、および細菌フラジェリンではなくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１によって誘導される肺細胞炎症を阻害する：最終的に急性肺傷害をもたらす肺炎症は、ＩＣＵを訪れるＣＯＶＩＤ－１９の患者の特徴となりつつある。Ｐｉａ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｓ４１５７７を参照のこと。（２０２０）。ＣＯＶＩＤ－１９に加えて、肺合併症もまた、種々の細菌感染およびウイルス感染において明らかである。Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０，４５９－４７１，（２０１２）；ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２，２５２－２６２，（２０１４）を参照されたい。したがって、ＡＩＤＳペプチドが、異なる刺激によって誘導されたヒトＡ５４９肺細胞における炎症促進性分子の発現を抑制することができるかどうかを調べた。
【0064】
異なる濃度のｗｔＡＩＤＳおよびｍＡＩＤＳペプチドで１５分間前処理したＡ５４９細胞を、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１、ポリＩＣ、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ、および細菌フラジェリンで刺激した。最初に、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１がＡ５４９肺細胞において炎症促進性サイトカインを誘導することができるかどうかを調べた。用量依存性分析は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１が炎症促進性サイトカインの誘導において非常に強力であり、スパイクＳ１が０．２ｎｇ／ｍｌの用量でさえ肺の細胞においてＩＬ－６およびＩＬ－１βのｍＲＮＡ発現を顕著に誘導し、最大の誘導は１ｎｇ／ｍｌであったことを示した（図１Ａ～Ｃ）。煮沸した組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１がＡ５４９細胞においてＩＬ－６およびＩＬ－１βの発現を誘導することができないこと（図１Ａ～Ｃ）、ならびに抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１抗体によるこれらのサイトカインのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１媒介発現の中和（図２Ａ～Ｃ）は、肺の細胞における炎症促進性分子の誘導がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質に起因することを示唆する。さらに、これらの結果は、一部のＣＯＶＩＤ－１９患者に見られるいわゆる「サイトカインストーム」がスパイクＳ１の機能によるものであり得ることも示唆している。
【0065】
同様に、ポリＩＣ（図１Ｆ～Ｇ、図３Ｂ）、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ（図１Ｈ、図１Ｉ、図３Ｃ）およびフラジェリン（図１Ｊ～Ｋ、図３Ｄ）もまた、Ａ５４９細胞においてＩＬ－６およびＩＬ－１βの発現を増加させた。しかし、ｗｔＡＩＤＳペプチドは、Ａ５４９細胞におけるＩＬ－６およびＩＬ－１βのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１媒介誘導を阻害した（図１Ｄ～Ｅ、図３Ａ）。対照的に、ｗｔＡＩＤＳペプチドは、ポリＩＣ（図１Ｆ～Ｇ、図３Ｂ）、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ（図１Ｈ、図１Ｉ、図３Ｃ）およびフラジェリン（図１Ｊ～Ｋ、図３Ｄ）によって誘導されるＩＬ－６およびＩＬ－１βの発現を減少させることができないままであった。これらの結果は、ｍＡＩＤＳペプチドが、使用された刺激のいずれかによって誘導されたＩＬ－６およびＩＬ－βの発現に影響を及ぼさなかったので特異的であった。
【0066】
実施例２：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の鼻腔内投与は発熱および肺炎症を引き起こす：ｗｔＡＩＤＳペプチドによる保護
結果
ＣＯＶＩＤ－１９の最も一般的な症候の１つは発熱である。例えば、Ｐａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５，１７４－１８０，（２０２０）を参照のこと。興味深いことに、超低用量（図２Ａ）でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の毎日の鼻腔内投与は、体温の上昇をもたらした（図２Ｂ）。息切れはＩＣＵのＣＯＶＩＤ－１９患者の重要な問題であるため（Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ３５，９６３－９７０，（２０２０）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の鼻腔内投与がＣＯＶＩＤ－１９の肺の特徴の一部を模倣できるかどうかを調べた。生理食塩水のみを投与した対照マウスと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスの肺への好中球の広範な浸潤が起こることが認められた（図２Ｃ）。細胞の計数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒後の上皮細胞の喪失（図２Ｄ）および肺への好中球浸潤の著しい増加（図２Ｅ～Ｆ）を示した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の鼻腔内投与は発熱および肺炎症を引き起こす：ｗｔＡＩＤＳペプチドによる保護
結果
ＣＯＶＩＤ－１９の最も一般的な症候の１つは発熱である。例えば、Ｐａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５，１７４－１８０，（２０２０）を参照のこと。興味深いことに、超低用量（図２Ａ）でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の毎日の鼻腔内投与は、体温の上昇をもたらした（図２Ｂ）。息切れはＩＣＵのＣＯＶＩＤ－１９患者の重要な問題であるため（Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ３５，９６３－９７０，（２０２０）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の鼻腔内投与がＣＯＶＩＤ－１９の肺の特徴の一部を模倣できるかどうかを調べた。生理食塩水のみを投与した対照マウスと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスの肺への好中球の広範な浸潤が起こることが認められた（図２Ｃ）。細胞の計数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒後の上皮細胞の喪失（図２Ｄ）および肺への好中球浸潤の著しい増加（図２Ｅ～Ｆ）を示した。
【0067】
一部のＣＯＶＩＤ－１９患者では、疾患の進行は「サイトカインストーム」につながり、これらのサイトカインの中でも、ＩＬ－６の上昇したレベルは重篤な疾患と密接に相関するため、ＩＬ－６は重要な役割を果たす。Ｃｏｓｔｅｌａ－Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ，（２０２０）を参照されたい。したがって、ＩＬ－６のレベルを調べたところ、生理食塩水のみを投与した対照マウスと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスの肺におけるＩＬ－６ ｍＲＮＡ（図２Ｇ）およびタンパク質（図２Ｈ）ならびにＩＬ－１β ｍＲＮＡ（図２Ｉ）において顕著な増加が見られた。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒はまた、血清のＩＬ－６レベルを増加させた（図２Ｊ）。しかしながら、ｗｔＡＩＤＳペプチドの鼻腔内治療は、体温を正常化し（図２Ｂ）、肺の好中球の浸潤を減少させ（図２Ｃ～図２Ｆ）、肺におけるＩＬ－６ ｍＲＮＡおよびタンパク質ならびにＩＬ－１β ｍＲＮＡのレベルを低下させ（図２Ｇ、図２Ｈ、図２Ｉ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスにおける血清ＩＬ－６のレベルを低下させた（図２Ｊ）。これらの結果は、ｍＡＩＤＳペプチドがそのような阻害効果を有さなかったので特異的であった。
【0068】
実施例３：
ｗｔＡＩＤＳペプチドは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクＳ１中毒マウスにおいて心機能を回復させ、自発運動活性を改善する
ＩＣＵの多くのＣＯＶＩＤ－１９患者は心不整脈を発症する。Ｋａｒａｍｃｈａｎｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｖａｓｃ Ａｎｅｓｔｈ，ｄ（２０２０）を参照されたい。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９のこれらの心臓の特徴をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスにおいてモデル化できるかどうかを調べた。異なる心臓のパラメータが図４に概略的に示されている。スパイクＳ１中毒は、非侵襲的ＥＣＧ（図３Ａ～Ｂ）、心拍数（図３Ｅ）、ＲＲの間隔（図３Ｆ）、ＪＴの間隔（図３Ｇ）およびＲ振幅（図３Ｈ）の増加、ならびに心拍数の変動（図３Ｉ）、ＱＲＳの間隔（図３Ｊ）、およびＱＴの間隔（図３Ｋ）の減少によって示されるように、マウスにおいて心臓の不整脈を引き起こした。しかし、ｍＡＩＤＳではなくｗｔＡＩＤＳペプチドでの治療は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスにおいてＥＣＧの正常化（図３Ａ～図３Ｄ）ならびに心拍数（図３Ｅ）、ＲＲの間隔（図３Ｆ）、ＪＴの間隔（図３Ｇ）、Ｒ振幅（図３Ｈ）、心拍数の変動（図３Ｉ）、ＱＲＳの間隔（図３Ｊ）およびＱＴの間隔（図３Ｋ）の安定化をもたらした。
ｗｔＡＩＤＳペプチドは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクＳ１中毒マウスにおいて心機能を回復させ、自発運動活性を改善する
ＩＣＵの多くのＣＯＶＩＤ－１９患者は心不整脈を発症する。Ｋａｒａｍｃｈａｎｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｖａｓｃ Ａｎｅｓｔｈ，ｄ（２０２０）を参照されたい。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９のこれらの心臓の特徴をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスにおいてモデル化できるかどうかを調べた。異なる心臓のパラメータが図４に概略的に示されている。スパイクＳ１中毒は、非侵襲的ＥＣＧ（図３Ａ～Ｂ）、心拍数（図３Ｅ）、ＲＲの間隔（図３Ｆ）、ＪＴの間隔（図３Ｇ）およびＲ振幅（図３Ｈ）の増加、ならびに心拍数の変動（図３Ｉ）、ＱＲＳの間隔（図３Ｊ）、およびＱＴの間隔（図３Ｋ）の減少によって示されるように、マウスにおいて心臓の不整脈を引き起こした。しかし、ｍＡＩＤＳではなくｗｔＡＩＤＳペプチドでの治療は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスにおいてＥＣＧの正常化（図３Ａ～図３Ｄ）ならびに心拍数（図３Ｅ）、ＲＲの間隔（図３Ｆ）、ＪＴの間隔（図３Ｇ）、Ｒ振幅（図３Ｈ）、心拍数の変動（図３Ｉ）、ＱＲＳの間隔（図３Ｊ）およびＱＴの間隔（図３Ｋ）の安定化をもたらした。
【0069】
次に、スパイクＳ１中毒がまた、機能障害を引き起こすかどうかを調べるために、自発運動およびオープンフィールドの活動をモニタリングした。スパイクＳ１傷害は、ヒートマップ（図５Ａ）、移動距離（図５Ｂ）、速度（図５Ｃ）、累積持続時間（図５Ｄ）、およびロータロッド成績（図５Ｅ）によって明らかなように、全体的な自発運動活性を減少させた。心機能の正常化と同様に、ｍＡＩＤＳではないｗｔＡＩＤＳペプチドはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１によって誘導される運動低下を改善した（図５）。
【0070】
考察
これまで、世界中で約９０万人がＣＯＶＩＤ－１９のために死亡した。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の疾患のプロセスの機序を解明し、疾患を減速させ、死を止めるための効果的な治療の手法を設計することが最も重要である。古典的なレニン－アンジオテンシン経路の主要なプレーヤであるＡＣＥ２は、血管の疾患において重要な役割を果たす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＡＣＥ２に結合し、その内部移行をヒト細胞に侵入させるので、ＣＯＶＩＤ－１９は、基幹の心血管の問題を有する患者にとって特に有害である。ＡＣＥ２阻害剤が利用可能であり（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｌ １１，４１３－４２６，（２０１４））、そのような阻害剤はヒト細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進入を停止させ得るが、この有益な分子を阻害することは不可能である。
これまで、世界中で約９０万人がＣＯＶＩＤ－１９のために死亡した。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の疾患のプロセスの機序を解明し、疾患を減速させ、死を止めるための効果的な治療の手法を設計することが最も重要である。古典的なレニン－アンジオテンシン経路の主要なプレーヤであるＡＣＥ２は、血管の疾患において重要な役割を果たす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＡＣＥ２に結合し、その内部移行をヒト細胞に侵入させるので、ＣＯＶＩＤ－１９は、基幹の心血管の問題を有する患者にとって特に有害である。ＡＣＥ２阻害剤が利用可能であり（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｌ １１，４１３－４２６，（２０１４））、そのような阻害剤はヒト細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進入を停止させ得るが、この有益な分子を阻害することは不可能である。
【0071】
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＡＣＥ２との間の相互作用の構造解析を通して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ２相互作用ドメイン（ＡＩＤＳ）に対応する小さなヘキサペプチドを設計した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ１はＡＣＥ２と相互作用するので、ｗｔＡＩＤＳペプチドはＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の会合を不安定にした。
【0072】
重度のＣＯＶＩＤ－１９の症候を有する患者のサブグループがサイトカインストームに罹患していることが示されているが、根底にある機序は知られていなかった。Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３９５，１０３３－１０３４，（２０２０）を参照されたい。非常に低用量でさえＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１によるヒトＡ５４９肺の細胞における炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－６およびＩＬ－１β）の顕著な誘導は、このスパイクサブユニットがＣＯＶＩＤ－１９の患者におけるサイトカインストームに寄与し得ることを示唆する。ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の会合の阻害と一致して、ｗｔＡＩＤＳペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒Ａ５４９肺細胞におけるＩＬ－６およびＩＬ－１βの発現を阻害した。対照的に、ｗｔＡＩＤＳペプチドは、ポリＩＣ（ウイルス二本鎖ＲＮＡ模倣物）、Ｔａｔ（ＨＩＶ－１転写のトランス活性化因子）およびフラジェリン（細菌感染の成分）によって誘導される炎症促進性サイトカインの発現を阻害せず、ｗｔＡＩＤＳペプチドの選択的性質を示した。最も重要なことに、この発見は、ｗｔＡＩＤＳペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のペプチド配列に対応することを示している。したがって、それは、ＡＣＥ２の基礎レベルおよび有益な機能に影響を及ぼすことなく、ＡＣＥ２とのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合のみを阻害する。さらに、それはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下でのみ機能する。
【0073】
小動物モデル系を開発することは、ＣＯＶＩＤ－１９の致命的な心血管および肺の問題に関連するメカニズムを理解し、この世界的なパンデミックのための有効な薬物を評価する上で重要なステップである。生のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を扱うことには多くのバイオセーフティ要件があるが、ここで本発明者らは、マウスにおいてＣＯＶＩＤ－１９の重要な心臓および呼吸器症候を模倣する非常に単純で生のウイルスを含まないモデルの開発について説明する。ＲＢＤ配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１は、スパイクタンパク質のＮ末端に位置する。ほとんどの中和エピトープはスパイクＳ１内に位置するため、このスパイクサブユニットはワクチン開発の重要な候補となっている。興味深いことに、ここで、同じスパイクＳ１の鼻腔内の投与が、正常なマウスにおいてＣＯＶＩＤ－１９の多くの重要な特徴（発熱、肺炎症、肺の好中球の浸潤、血清ＩＬ－６の増加、および不整脈）を誘導することができることが本明細書で実証された。したがって、鼻腔的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスは、ＣＯＶＩＤ－１９に対する異なる治療選択肢を試験するためのウイルス非含有マウスモデルとして使用することができる。
【0074】
これまで、有効な治療法はなく、ＣＯＶＩＤ－１９用の承認済みワクチンもない。ヒドロキシクロロキンは当初いくらかの有望性を示したが、いくつかの臨床治験はＣＯＶＩＤ－１９におけるヒドロキシクロロキンの使用を除外している。唯一、レムデシビルはＣＯＶＩＤ－１９での緊急使用が承認されている。Ｌａｍｂ，Ｄｒｕｇｓ，ｓ４０２６５（２０２０）。一部のＩＣＵ患者へのＩＦＮ β－１ｂの皮下注射は死亡率の低下をもたらしたが（Ｒａｈｍａｎｉ他、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ、８８、１０６９０３、（２０２０））、この多発性硬化症薬による生存利益の正確な推定のためには、大きな試料サイズを用いたさらなる無作為化臨床治験が必要である。ｗｔＡＩＤＳペプチドによる鼻腔内の治療によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１中毒マウスにおける発熱の減少、肺の保護、心機能の正常化および自発運動活性の改善は、ｗｔＡＩＤＳペプチドによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：ＡＣＥ２接触の選択的な標的化が、ＣＯＶＩＤ－１９にとって有益であり得ることを示唆している。ｗｔＡＩＤＳペプチドは、ＡＣＥ２の正常な生理的機能を阻害することなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２依存性ＡＣＥ２経路のみを標的とするはずである。したがって、対照マウスの群において、本発明者らはまた、鼻腔内のｗｔＡＩＤＳペプチドによる治療の際のいかなる薬物関連副作用（例えば、脱毛、食欲不振、体重の減少、不都合な感染および刺激など）にも気づいていなかった。要約すると、本明細書に提示される研究では、ＣＯＶＩＤ－１９患者の一次治療選択肢または補助治療選択肢として鼻腔内ＡＩＤＳペプチドが特定されている。
【0075】
材料および方法
ヒトＡ５４９肺癌細胞株（カタログ番号ＣＣＬ－１８５）およびＦ－１２Ｋ培地（カタログ番号３０－２００４）をＡＴＣＣから購入した。ハンクス平衡塩類溶液、０．０５％トリプシン、および抗生物質－抗真菌剤は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（ワシントンＤＣ）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手した。ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号７９９３６）はＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。組換えＣＯＶＩＤ－１９ Ｓｐｉｋｅタンパク質Ｓ１は、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（カタログ番号ＭＢＳ５５３７２２）およびＡｂｅｏｍｉｃｓ（カタログ番号ＭＢＳ５５３７２２）から購入した。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１抗体（カタログ番号Ａ３０００－５０）をＢｉｏＶｉｓｉｏｎから購入した。ヒトＩＬ－１β ＥＬＩＳＡおよびＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキットをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。
ヒトＡ５４９肺癌細胞株（カタログ番号ＣＣＬ－１８５）およびＦ－１２Ｋ培地（カタログ番号３０－２００４）をＡＴＣＣから購入した。ハンクス平衡塩類溶液、０．０５％トリプシン、および抗生物質－抗真菌剤は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（ワシントンＤＣ）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手した。ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号７９９３６）はＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。組換えＣＯＶＩＤ－１９ Ｓｐｉｋｅタンパク質Ｓ１は、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（カタログ番号ＭＢＳ５５３７２２）およびＡｂｅｏｍｉｃｓ（カタログ番号ＭＢＳ５５３７２２）から購入した。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１抗体（カタログ番号Ａ３０００－５０）をＢｉｏＶｉｓｉｏｎから購入した。ヒトＩＬ－１β ＥＬＩＳＡおよびＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキットをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。
【0076】
動物およびＡＩＤＳペプチドの鼻腔内送達
マウスを維持し、実験をＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのガイドラインに従って行い、Ｒｕｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ＩＡＣＵＣによって承認された。両方の性のＣ５７／ＢＬ６マウス（６～８週齢；エンビーゴ）を、ｗｔＡＩＤＳまたはｍＡＩＤＳペプチド（１００ｎｇ／マウス／日）で７日間鼻腔内治療した。簡潔には、ＡＩＤＳペプチドを２μｌの生理食塩水に溶解し、マウスを仰臥位で保持し、ピペットを使用して１μｌ容量を各鼻孔に送達した。
マウスを維持し、実験をＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのガイドラインに従って行い、Ｒｕｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ＩＡＣＵＣによって承認された。両方の性のＣ５７／ＢＬ６マウス（６～８週齢；エンビーゴ）を、ｗｔＡＩＤＳまたはｍＡＩＤＳペプチド（１００ｎｇ／マウス／日）で７日間鼻腔内治療した。簡潔には、ＡＩＤＳペプチドを２μｌの生理食塩水に溶解し、マウスを仰臥位で保持し、ピペットを使用して１μｌ容量を各鼻孔に送達した。
【0077】
典型的には、誤差のマージン＝０．０５で９９％信頼区間を達成するために、計算に基づいて６匹のマウス（ｎ＝６）を各群で使用した。
【0078】
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１によるＣ５７／ＢＬ６マウスの中毒化
両方の性のＣ５７／ＢＬ６マウス（６～８週齢；エンビーゴ）が、鼻腔内に組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）で中毒にさせた。簡潔には、組換えスパイクＳ１を２μｌの生理食塩水に溶解し、マウスを仰臥位で保持し、ピペットマンを用いて１μｌの体積を各鼻孔に送達した。対照マウスには２μｌの生理食塩水のみを与えた。
両方の性のＣ５７／ＢＬ６マウス（６～８週齢；エンビーゴ）が、鼻腔内に組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１（５０ｎｇ／マウス／日）で中毒にさせた。簡潔には、組換えスパイクＳ１を２μｌの生理食塩水に溶解し、マウスを仰臥位で保持し、ピペットマンを用いて１μｌの体積を各鼻孔に送達した。対照マウスには２μｌの生理食塩水のみを与えた。
【0079】
非侵襲的ＥＣＧ記録
ＥＣＧ記録の前に、マウスをＥＣＧパルス変換器パッド（ＡＤ計測器ＴＮ０１２／ＳＴ、米国）および実験的収容条件に順応させた。ＥＣＧパルス変換器パッドを各動物の心臓の周囲に配置し、ＥＣＧ記録を１２０秒間行った。ＥＣＧ分析のために、Ｌａｂｃｈａｒｔ ｐｒｏ，ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０（Ｐｏｗｅｒ Ｌａｂ ４／３５モデル）から心電図データを生データのフォーマットとしてエクスポートし、このソフトウェアを使用してデジタル信号処理を行った。記録を１２０秒間行い、ＥＣＧシグナルを、マウスＥＣＧ分析のためのソフトウェアで推奨されるように４拍／秒のサンプリングレートで２０ｍＶのサンプリングの範囲で記録した。不整脈または他の異常複合体の可能性を特定するために、ＥＣＧの追跡を視覚的に概観した。データを分析する前に、Ｌａｂｃｈａｒｔ ｐｒｏソフトウェアにおいて、ＥＣＧ設定データソースを、複数のチャネルのうちのチャネル１として選択され、マウスの種に特異的なチャネル全体について選択されたＥＣＧチャネルについて保持した。検出設定では、典型的なＱＲＳの幅は１０ｍｓで確保され、Ｒ波は少なくとも６０ｍｓ離れたままであり、アライメントはＱＲＳの最大値に維持された。分析部分では、プレ－ベースラインを１０ｍｓに維持し、最大５０ｍｓに維持した。げっ歯類の波を選択し、１０ｍｓの高さでＳＴセグメントの高さを測定した。ＰＱの間隔、ＱＲＳの間隔、ＱＴの間隔、Ｔ持続時間、ＪＴの間隔、ならびにＰ振幅、Ｑ振幅、Ｒ振幅、Ｓ振幅、Ｔ振幅を含むすべてのＥＣＧパラメータを計算した。記録および分析の設定は、この研究に含まれるすべての実験マウスについて同じままにした。
ＥＣＧ記録の前に、マウスをＥＣＧパルス変換器パッド（ＡＤ計測器ＴＮ０１２／ＳＴ、米国）および実験的収容条件に順応させた。ＥＣＧパルス変換器パッドを各動物の心臓の周囲に配置し、ＥＣＧ記録を１２０秒間行った。ＥＣＧ分析のために、Ｌａｂｃｈａｒｔ ｐｒｏ，ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０（Ｐｏｗｅｒ Ｌａｂ ４／３５モデル）から心電図データを生データのフォーマットとしてエクスポートし、このソフトウェアを使用してデジタル信号処理を行った。記録を１２０秒間行い、ＥＣＧシグナルを、マウスＥＣＧ分析のためのソフトウェアで推奨されるように４拍／秒のサンプリングレートで２０ｍＶのサンプリングの範囲で記録した。不整脈または他の異常複合体の可能性を特定するために、ＥＣＧの追跡を視覚的に概観した。データを分析する前に、Ｌａｂｃｈａｒｔ ｐｒｏソフトウェアにおいて、ＥＣＧ設定データソースを、複数のチャネルのうちのチャネル１として選択され、マウスの種に特異的なチャネル全体について選択されたＥＣＧチャネルについて保持した。検出設定では、典型的なＱＲＳの幅は１０ｍｓで確保され、Ｒ波は少なくとも６０ｍｓ離れたままであり、アライメントはＱＲＳの最大値に維持された。分析部分では、プレ－ベースラインを１０ｍｓに維持し、最大５０ｍｓに維持した。げっ歯類の波を選択し、１０ｍｓの高さでＳＴセグメントの高さを測定した。ＰＱの間隔、ＱＲＳの間隔、ＱＴの間隔、Ｔ持続時間、ＪＴの間隔、ならびにＰ振幅、Ｑ振幅、Ｒ振幅、Ｓ振幅、Ｔ振幅を含むすべてのＥＣＧパラメータを計算した。記録および分析の設定は、この研究に含まれるすべての実験マウスについて同じままにした。
【0080】
肺の浸潤および病態のモニタリング
治療後、ケタミン／キシラジン注射液で動物を麻酔し、続いて経心腔的灌流を行った。肺を回収し、組織学的研究のために処理した。ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）染色を、厚さ４μｍのパラフィン包埋切片から行い、一般的な肺組織の形態を研究するために使用した。ＩｍａｇｅＪによって、上皮細胞の数、ならびに肺胞腔および間質腔における浸潤好中球の数を分析した。上皮および浸潤好中球の計数のために、各群から少なくとも１０の４０倍の視野を選択した。
治療後、ケタミン／キシラジン注射液で動物を麻酔し、続いて経心腔的灌流を行った。肺を回収し、組織学的研究のために処理した。ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）染色を、厚さ４μｍのパラフィン包埋切片から行い、一般的な肺組織の形態を研究するために使用した。ＩｍａｇｅＪによって、上皮細胞の数、ならびに肺胞腔および間質腔における浸潤好中球の数を分析した。上皮および浸潤好中球の計数のために、各群から少なくとも１０の４０倍の視野を選択した。
【0081】
インシリコの構造解析
Ｒａｎｇａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２８，４２９７－４３１２，（２０１８）；およびＲｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２２，２５３－２６５，（２０１５）に記載されているように、インシリコの構造解析を行った。手短に言えば、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．プラットフォームから得たタンパク質調製ツールを利用することによって、ヒトＡＣＥ２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の結晶構造の品質を評価した。結晶構造の質を評価した後、水素を水素結合配向に加え、液体シミュレーションの最適化電位（ＯＰＬＳ３）力場で電荷を加え、続いて両方のタンパク質の異なる残留物の欠損原子および側鎖を加えた。最後に、複合構造体をＯＰＬＳ３力場でエネルギーの最小化に供し、これをねじれのない状態にした。タンパク質の捕捉後、スパイクタンパク質をＡＣＥ２から抽出し、次いで、２つの構造間の潜在的な水素結合を見つけるために動的水素結合モジュールを適用した。Ｈ結合を評価した後、図１Ａに示すような２つの構造間の疎水性相互作用などの他の相互作用も評価した。
Ｒａｎｇａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２８，４２９７－４３１２，（２０１８）；およびＲｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２２，２５３－２６５，（２０１５）に記載されているように、インシリコの構造解析を行った。手短に言えば、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．プラットフォームから得たタンパク質調製ツールを利用することによって、ヒトＡＣＥ２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１の結晶構造の品質を評価した。結晶構造の質を評価した後、水素を水素結合配向に加え、液体シミュレーションの最適化電位（ＯＰＬＳ３）力場で電荷を加え、続いて両方のタンパク質の異なる残留物の欠損原子および側鎖を加えた。最後に、複合構造体をＯＰＬＳ３力場でエネルギーの最小化に供し、これをねじれのない状態にした。タンパク質の捕捉後、スパイクタンパク質をＡＣＥ２から抽出し、次いで、２つの構造間の潜在的な水素結合を見つけるために動的水素結合モジュールを適用した。Ｈ結合を評価した後、図１Ａに示すような２つの構造間の疎水性相互作用などの他の相互作用も評価した。
【0082】
ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク結合アッセイ
ＡＣＥ２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの結合に対するｗｔＡＩＤＳおよびｍＡＩＤＳペプチドの効果を、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤スクリーニングアッセイキット（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、製造者の説明書に従って使用して、試験した。簡潔には、製造業者によって提供された９６ウェルニッケル処理プレートをＡＣＥ２溶液でコーティングした。免疫バッファーで洗浄し、ブロックするバッファーとインキュベートした後、異なる濃度のＡＩＤＳペプチドを各ウェルに添加し、続いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（ＲＢＤ）－Ｆｃを添加した。洗浄およびブロックするバッファーとのインキュベーションの後、プレートを抗マウスＦｃ－ＨＲＰで処理し、続いてＨＲＰ基質を添加した。得られた化学発光を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒマルチモードマイクロプレートリーダー、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ５を使用して測定した。
ＡＣＥ２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの結合に対するｗｔＡＩＤＳおよびｍＡＩＤＳペプチドの効果を、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤スクリーニングアッセイキット（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、製造者の説明書に従って使用して、試験した。簡潔には、製造業者によって提供された９６ウェルニッケル処理プレートをＡＣＥ２溶液でコーティングした。免疫バッファーで洗浄し、ブロックするバッファーとインキュベートした後、異なる濃度のＡＩＤＳペプチドを各ウェルに添加し、続いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（ＲＢＤ）－Ｆｃを添加した。洗浄およびブロックするバッファーとのインキュベーションの後、プレートを抗マウスＦｃ－ＨＲＰで処理し、続いてＨＲＰ基質を添加した。得られた化学発光を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒマルチモードマイクロプレートリーダー、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ５を使用して測定した。
【0083】
半定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析
ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（メリーランド州ゲルマンタウンのＱｉａｇｅｎ）およびＵｌｔｒａｓｐｅｃ－ＩＩ ＲＮＡ試薬（テキサス州ヒューストンのＢｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をそれぞれ使用して、Ａ５４９肺細胞およびマウスの肺から全ＲＮＡを単離した。混入しているいずれのゲノムＤＮＡも除去するために、全ＲＮＡをＤＮａｓｅで消化した。ＲＴ－ＰＣＲは、ＲＴ－ＰＣＲキット（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して他の研究（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，１８７５４－１８７５９（２００７）；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ４，７２４－７３７，（２０１３））に記載されるように行った。増幅させた産生物を１．８％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のメッセージを使用して、等量のｃＤＮＡが異なる試料から合成されたことを確認した。
ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（メリーランド州ゲルマンタウンのＱｉａｇｅｎ）およびＵｌｔｒａｓｐｅｃ－ＩＩ ＲＮＡ試薬（テキサス州ヒューストンのＢｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をそれぞれ使用して、Ａ５４９肺細胞およびマウスの肺から全ＲＮＡを単離した。混入しているいずれのゲノムＤＮＡも除去するために、全ＲＮＡをＤＮａｓｅで消化した。ＲＴ－ＰＣＲは、ＲＴ－ＰＣＲキット（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して他の研究（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，１８７５４－１８７５９（２００７）；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ４，７２４－７３７，（２０１３））に記載されるように行った。増幅させた産生物を１．８％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のメッセージを使用して、等量のｃＤＮＡが異なる試料から合成されたことを確認した。
【0084】
リアルタイムＰＣＲ分析
ＤＮａｓｅ消化ＲＮＡを、記載のようにＡＢＩ－Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてリアルタイムＰＣＲによって分析した。同上
ＤＮａｓｅ消化ＲＮＡを、記載のようにＡＢＩ－Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてリアルタイムＰＣＲによって分析した。同上
【0085】
ＩＬ－６のＥＬＩＳＡ
ＩＬ－６のＥＬＩＳＡを、標準的なアッセイキットを使用して肺ホモジネート中で行った。Ｍｏｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１７，２１５５７－２１５６７，（２０２０）を参照されたい。
ＩＬ－６のＥＬＩＳＡを、標準的なアッセイキットを使用して肺ホモジネート中で行った。Ｍｏｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１７，２１５５７－２１５６７，（２０２０）を参照されたい。
【0086】
統計分析
標準的なソフトウェアを使用して統計分析を行った。マウスの行動測定を、ＳＰＳＳを使用した独立した一方向ＡＮＯＶＡによって調べた。試験群間の分散の均一性を、Ｌｅｖｅｎｅ検定を用いて調べた。Ｔｕｋｅｙ検定を使用して事後分析を行った。他のデータは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表した。平均間の統計的差異をスチューデントのｔ検定によって計算した（両側）。０．０５未満（ｐ＜０．０５）のｐ値を統計学的に有意と見なした。
標準的なソフトウェアを使用して統計分析を行った。マウスの行動測定を、ＳＰＳＳを使用した独立した一方向ＡＮＯＶＡによって調べた。試験群間の分散の均一性を、Ｌｅｖｅｎｅ検定を用いて調べた。Ｔｕｋｅｙ検定を使用して事後分析を行った。他のデータは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表した。平均間の統計的差異をスチューデントのｔ検定によって計算した（両側）。０．０５未満（ｐ＜０．０５）のｐ値を統計学的に有意と見なした。
【0087】
実施例４：
ＡＣＥ２受容体（ＳＰＩＤＡＲ）のスパイクＳ１相互作用ドメインに対応するヘキサペプチドの設計
宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体として機能するため、ＣＯＶＩＤ－１９を治療的な角度から標的化するために、本発明者らは、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ１との間の会合を阻害するＡＣＥ２受容体（ＳＰＩＤＡＲ）のスパイクＳ１相互作用ドメイン（図９Ａ～Ｂ）に対応するヘキサペプチドを設計した（図９Ｃ）。
野生型（ｗｔ）ＳＰＩＤＡＲ：３７ＥＤＬＦＹＱ４２（配列番号９）
変異型（ｍ）ＳＰＩＤＡＲ：３７ＥＫＬＦＹＧ ４２（配列番号１０）
（変異の位置には下線を付している）。
ＡＣＥ２受容体（ＳＰＩＤＡＲ）のスパイクＳ１相互作用ドメインに対応するヘキサペプチドの設計
宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体として機能するため、ＣＯＶＩＤ－１９を治療的な角度から標的化するために、本発明者らは、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ１との間の会合を阻害するＡＣＥ２受容体（ＳＰＩＤＡＲ）のスパイクＳ１相互作用ドメイン（図９Ａ～Ｂ）に対応するヘキサペプチドを設計した（図９Ｃ）。
野生型（ｗｔ）ＳＰＩＤＡＲ：３７ＥＤＬＦＹＱ４２（配列番号９）
変異型（ｍ）ＳＰＩＤＡＲ：３７ＥＫＬＦＹＧ ４２（配列番号１０）
（変異の位置には下線を付している）。
【0088】
ｍＳＰＩＤＡＲではなく、上記のｗｔＳＰＩＤＡＲでの鼻腔内治療は、ＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルの肺および血清中の炎症促進性分子のレベルを低下させた（図１０Ａ～図１０Ｅ）。ｍＳＰＩＤＡＲではなくｗｔＳＰＩＤＡＲもまた、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血清レベルを正常化し、発熱を減少させた（図１０Ｆ～図１０Ｇ）。さらに、ｍＳＰＩＤＡＲではなくｗｔＳＰＩＤＡＲはまた、ＣＯＶＩＤ－１９のマウスモデルにおいて、肺への好中球の浸潤を減弱させ（図１１Ａ～Ｅ）、不整脈を減少させ（図１２Ａ～図１２Ｊ）、自発運動の活性を改善した（図１３）。したがって、ｗｔＳＰＩＤＡＲによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１のＡＣＥ２への相互作用の選択的標的化は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療に有益である。
【0089】
実施例５
ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害した異なるペプチドの効果を、実施例１に記載のプロトコールを用いて決定するために研究が行われる。非限定的な例として、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するペプチドを使用して、研究を行う。
ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１との間の結合を阻害した異なるペプチドの効果を、実施例１に記載のプロトコールを用いて決定するために研究が行われる。非限定的な例として、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するペプチドを使用して、研究を行う。
【0090】
本明細書に開示および特許請求されるすべての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製および実行することができる。本発明は多くの異なる形態で具体化され得るが、本発明の特定の好ましい実施形態が本明細書に詳細に記載されている。本開示は、本発明の原理の例示であり、本発明を例示された特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
【0091】
さらに、本発明は、本明細書に記載の様々な実施形態の一部または全部のありとあらゆる可能な組み合わせを包含する。本明細書に記載されているこの好ましい実施形態に対する様々な変更および修正が当業者には明らかであることも理解されるべきである。そのような変更および修正は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつその意図された利点を減少させることなく行うことができる。したがって、そのような変更および修正は、添付の特許請求の範囲によって網羅されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】