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特表2023-524814がん及び感染症に対する免疫療法のための融合タンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-13
(54)【発明の名称】がん及び感染症に対する免疫療法のための融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230606BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230606BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230606BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230606BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230606BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230606BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230606BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230606BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230606BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230606BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230606BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230606BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230606BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230606BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20230606BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230606BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230606BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230606BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230606BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230606BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20230606BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230606BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20230606BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230606BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230606BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230606BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230606BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/21 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/29 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/205 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/285 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/13 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/165 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/20 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/25 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/235 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/015 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/08 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/05 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/112 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/108 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/04 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/10 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/102 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/095 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/09 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/125 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/15 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/07 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/002 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/106 20060101ALI20230606BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20230606BHJP
C12P 21/00 20060101ALN20230606BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230606BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K16/28 ZNA
C07K14/705
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N15/12
A61K39/395 N
A61K38/16
A61P1/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P11/00
A61P13/12
A61P15/00
A61P13/10
A61P17/00
A61P25/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P31/04
A61P13/08
A61P37/04
A61P31/06
A61P31/12
A61P31/18
A61P31/16
A61P31/20
A61P31/14
A61K39/00 H
A61K39/12
A61K39/21
A61K39/145
A61K39/29
A61K39/215
A61K39/245
A61K39/205
A61K39/285
A61K39/13
A61K39/165
A61K39/20
A61K39/25
A61K39/235
A61K39/015
A61K39/08
A61K39/05
A61K39/112
A61K39/108
A61K39/04
A61K39/10
A61K39/102
A61K39/095
A61K39/09
A61K39/125
A61K39/15
A61K39/07
A61K39/002
A61K39/106
A61K39/02
C12P21/00 C
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022567573
(86)(22)【出願日】2021-04-26
(85)【翻訳文提出日】2022-12-28
(86)【国際出願番号】 US2021029203
(87)【国際公開番号】W WO2021225820
(87)【国際公開日】2021-11-11
(31)【優先権主張番号】63/020,545
(32)【優先日】2020-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522432642
【氏名又は名称】ナビキュア バイオファーマシューティカルズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】ウー， チア－マオ
【テーマコード（参考）】
4B064
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG27
4B064AG31
4B064CA19
4B064DA05
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA41
4C084CA53
4C084DC50
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA591
4C084ZA661
4C084ZA751
4C084ZA811
4C084ZA891
4C084ZB091
4C084ZB261
4C084ZB271
4C084ZB331
4C084ZB351
4C084ZB381
4C085AA03
4C085AA14
4C085AA16
4C085BA02
4C085BA06
4C085BA08
4C085BA09
4C085BA10
4C085BA11
4C085BA12
4C085BA14
4C085BA16
4C085BA17
4C085BA18
4C085BA20
4C085BA21
4C085BA23
4C085BA24
4C085BA46
4C085BA47
4C085BA51
4C085BA52
4C085BA53
4C085BA55
4C085BA56
4C085BA58
4C085BA61
4C085BA62
4C085BA63
4C085BA64
4C085BA69
4C085BA71
4C085BA74
4C085BA77
4C085BA79
4C085BA80
4C085BA86
4C085BA87
4C085BA88
4C085BA89
4C085BA92
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045CA41
4H045DA50
4H045DA76
4H045DA86
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
がん及び感染症に対する免疫療法のための融合タンパク質を開示する。本発明の融合タンパク質は、ＣＤ４０結合ドメインと、抗原と、ＣＤ４０結合ドメインと抗原との間に位置するトランスロケーションドメインとを含む。フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、融合タンパク質におけるＣＤ４０結合ドメインとトランスロケーションドメインとの間に位置する。抗原は、病原体の抗原又は腫瘍抗原である。フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、フーリン及び／又はカテプシンＬ切断を介して融合タンパク質からＣＤ４０結合ドメインを除去することを可能にする。医薬組成物、発現ベクター、並びに抗原特異的細胞性免疫応答を誘導して対象における腫瘍及び／又は病原体に起因する疾患を治療する本発明の融合タンパク質の使用をさらに開示する。
【選択図】図１１
【選択図】図１１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
融合タンパク質であって、（ａ）ＣＤ４０結合ドメインと、
（ｂ）抗原と、
（ｃ）前記ＣＤ４０結合ドメインと前記抗原との間に位置するトランスロケーションドメインと、
を含み、
前記融合タンパク質において、前記ＣＤ４０結合ドメインと前記トランスロケーションドメインとの間にフーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位が存在する、融合タンパク質。
【請求項2】
前記トランスロケーションドメインは、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）トランスロケーションペプチドであり、前記ＣＤ４０結合ドメインは、前記融合タンパク質のＮ末端に位置する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記トランスロケーションドメインは、長さで２６－１１２アミノ酸残基から構成されるＰＥトランスロケーションペプチドであり、前記ＰＥトランスロケーションペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記トランスロケーションドメインは、志賀毒素（Ｓｔｘ）トランスロケーションペプチドであり、前記抗原は、前記融合タンパク質のＮ末端に位置する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記トランスロケーションドメインは、長さで８－８４アミノ酸残基から構成されるＳｔｘトランスロケーションペプチドであり、前記Ｓｔｘトランスロケーションペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、フーリン及び／又はカテプシンＬ切断を介して前記融合タンパク質からＣＤ４０結合ドメインを除去することを可能にする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ＣＤ４０結合ドメインと前記トランスロケーションドメインとの間に位置するフーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位を含むペプチドリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記ＣＤ４０結合ドメインは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はその機能的断片である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記ＣＤ４０結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はその機能的断片であり、前記ＣＤ４０Ｌ又はその機能的断片は、長さで１５４－２６１アミノ酸残基を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記ＣＤ４０結合ドメインは、ＣＤ４０特異的抗体若しくはその結合断片、又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、前記ＣＤ４０特異的抗体又はｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬを含み、
（ａ）前記ＶＨは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記ＶＬは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記ＣＤ４０結合ドメインは、ＣＤ４０特異的抗体又はその結合断片であり、前記ＣＤ４０特異的抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、前記ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、（ｉ）前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４、２５及び２６のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２７、２８及び２９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記抗原は、腫瘍抗原であり、前記腫瘍は、乳がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、子宮内膜がん、腎臓がん、胃がん、膠芽腫、肝細胞がん、胆管がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、甲状腺がんからなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、インフルエンザウイルス、デングウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ジカウイルス、狂犬病ウイルス、天然痘ウイルス、チクングニアウイルス、ウエスナイルウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ハンタウイルス、日本脳炎ウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ムンプスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、セルコピテシンヘルペスウイルス－１（ＣＨＶ－１）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、リフトバレー熱ウイルス、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、リケッチア・プロワゼキー、チフスリケッチア、オリエンティア・ツツガムシ、ボレリア・ブルグドルフェリ、エルシニア・ペスティス、三日熱マラリア原虫、マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、炭疽菌、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリヌス、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、サルモネラ・エンテリカ血清型チフス、サルモネラ・エンテリカ血清型パラチフスＡ、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）、シゲラ・ダイセンテリア、志賀赤痢菌、志賀フレキシネル菌、志賀ソンネ菌、エンタメーバ・ヒストリチカ、コレラ菌、結核菌、髄膜炎菌、百日咳菌、インフルエンザ菌Ｂ型（ＨｉＢ）、破傷風菌、リステリア・モノサイトゲネス及び肺炎レンサ球菌からなる群より選択される病原体の抗原である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
抗原特異的細胞性免疫応答を誘導して対象における腫瘍及び／又は病原体に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項16】
前記抗原のＣ末端に位置する小胞体（ＥＲ）保持配列をさらに含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記ＣＤ４０結合ドメインと前記フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位との間に位置するＣＤ２８活性化ペプチドをさらに含み、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、長さが２８－５３アミノ酸残基であり、配列番号３５、３６及び３７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２又は４に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む、発現ベクター。
【請求項19】
前記ＰＥトランスロケーションペプチドは、配列番号５、６、７、８及び９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記Ｓｔｘトランスロケーションペプチドは、配列番号１２、１３、１４、１５及び１６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、融合タンパク質に関し、具体的には、腫瘍及び感染症に対するT細胞媒介性免疫応答を誘導するための融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
適応免疫系は、体液性免疫成分と細胞性免疫成分の両方を含み、侵入する病原体を破壊する。適応免疫応答を実行する細胞は、リンパ球として知られる白血球である。Ｂ細胞とＴ細胞は、２つの異なるタイプのリンパ球であり、抗体応答と細胞性免疫応答を実行する。適応免疫は、病原体への暴露によって活性化され、その病原体との将来の遭遇に対する免疫応答の強化につながる。ワクチンは、適応免疫細胞に抗原特異的記憶を誘導し、標的病原体に対する防御を可能にする。病原体によって引き起こされるがんや感染症などの疾患を治療するための新しい治療用ワクチンは、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0003】
一態様では、本発明は、融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、（ａ）ＣＤ４０結合ドメイン、（ｂ）抗原、及び（ｃ）前記ＣＤ４０結合ドメインと前記抗原との間に位置するトランスロケーションドメインを含み、前記融合タンパク質において、前記ＣＤ４０結合ドメインと前記トランスロケーションドメインとの間にフーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位が存在する。
【0004】
別の態様では、本発明は、本発明に係る融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関する。本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターにも関する。
【0005】
別の態様では、本発明は、本発明に係る融合タンパク質、薬学的に許容される担体及び／又は補助剤を含む医薬組成物に関する。
【0006】
別の態様では、本発明は、抗原特異的細胞性免疫応答を誘導して対象における腫瘍及び／又は病原体に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における本発明の融合タンパク質又は医薬組成物の使用に関する。本発明は、抗原特異的細胞性免疫応答を誘導して対象における腫瘍及び／又は病原体に起因する疾患を治療するために使用される本発明の融合タンパク質又は医薬組成物にも関する。
【0007】
代替的に、本発明は、抗原特異的細胞性免疫応答を誘導して対象における腫瘍及び／又は病原体に起因する疾患を治療するための方法に関する。この方法は、前記対象に有効量の本発明に係る融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ベクターマップである。
【0009】
【図2】ベクターマップである。ＭＣＳ：マルチクローニングサイト
【0010】
【図3】ベクターマップである。
【0011】
【図4】ベクターマップである。
【0012】
【0013】
【図6】各動物群における相対サイトカイン誘導を示す図である。
【0014】
【図7】各動物群からの脾臓細胞におけるＩＦＮ－γ＋免疫スポットを示す図である。
【0015】
【図8】各動物群における血清ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的抗体のレベルを示す図である。
【0016】
【図9】各動物群における血清ＨＰＶ１８ Ｅ７特異的抗体のレベルを示す図である。
【0017】
【図10】免疫化スケジュール及び指定融合タンパク質で処理された又は処理されていない動物群を示す。
【0018】
【図11】指定融合タンパク質で処理された又は処理されていない各動物群における腫瘍サイズを示す図である。
【0019】
【図12】指定融合タンパク質で処理された又は処理されていない各動物群の生存率を示す図である。
【0020】
【図13】指定融合タンパク質で処理された又は処理されていない各動物群の無腫瘍率を示す図である。
【0021】
【図14】指定された様々な投与量の融合タンパク質１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７で処理された又は処理されていない各動物群における腫瘍サイズを示す図である。
【0022】
【図15】指定された様々な投与量の融合タンパク質Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌで処理された又は処理されていない各動物群における腫瘍サイズを示す図である。
【0023】
【図16】融合タンパク質ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの免疫化スキーム（上図）、動物群及びそれぞれの投与スケジュール（下図）を示す。
【0024】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、以下の定義は、本発明を説明するために使用される様々な用語の意味及び範囲を例示及び定義するために記載される。
【0027】
定義
【0028】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）又はアクセサリー細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成した抗原を表面に表示する細胞である。このプロセスは、抗原提示として知られている。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識することができる。ＡＰＣは抗原を処理し、Ｔ細胞に提示する。
【0029】
抗原提示細胞は、プロフェッショナルと非プロフェッショナルの２つのカテゴリに分類される。共刺激分子及びパターン認識受容体とともにＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と呼ばれる。専門的抗原提示細胞の主なタイプは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、及びＢ細胞である。非専門的ＡＰＣは、体内の全ての有核細胞タイプを含むＭＨＣクラスＩ分子を発現する。
【0030】
専門的ＡＰＣは、Ｔ細胞への抗原提示を専門としている。それらは、ファゴサイトーシス又は受容体媒介エンドサイトーシスのいずれかによって抗原を内在化し、抗原をペプチド断片に処理し、それらのペプチド（クラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合）を膜上に表示するのに非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原クラスＩＩ ＭＨＣ分子複合体を認識し、相互作用する。次に、追加の共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、Ｔ細胞を活性化する。全ての専門的ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩ分子も発現する。
【0031】
専門的プロフェッショナルＡＰＣと非専門的ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩ分子を用いて細胞膜に内因性ペプチドを表示する。これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子を使用する専門的ＡＰＣによって表示される外因性抗原とは対照的に、細胞自体に由来する。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される抗原と相互作用することができる。
【0032】
ＣＤ４０は抗原提示細胞で発現されるる共刺激タンパク質である（例えば、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞）。ＣＤ４０ＬがＣＤ４０に結合すると、抗原提示細胞が活性化され、様々なダウンストリーム効果が誘導される。ＣＤ４０は、がん免疫療法の創薬標的である。
【0033】
「ＣＤ４０結合ドメイン」という用語は、ＣＤ４０を認識して結合することができるタンパク質を指す。ＣＤ４０結合ドメインは、「ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はその機能的断片」、「抗ＣＤ４０抗体又はその機能的断片」の１つから選択され得る。
【0034】
「ＣＤ４０Ｌ」、「ＣＤ４０リガンド」及び「ＣＤ１５４」という用語は交換可能である。ＣＤ４０Ｌは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ４０（タンパク質）に結合し、標的細胞の種類に応じて多くの効果をもたらす。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞のプライミング及びＣＤ４０発現免疫細胞の活性化を介した免疫応答の共刺激及び調節において中心的な役割を果たす。ＵＳ５，９６２，４０６は、ＣＤ４０Ｌの核酸及びアミノ酸配列を開示している。
【0035】
「抗ＣＤ４０抗体」及び「ＣＤ４０特異的抗体」という用語は交換可能である。
【0036】
「実質的にから構成される」又は「実質的にからなる」という用語がポリペプチドのアミノ酸配列を記述する際に使用される場合、タンパク質の翻訳要求に応じて、ポリペプチドがポリペプチドの一部としてＮ末端に開始アミノ酸「Ｍ」（開始コドンＡＵＧから翻訳されたもの）を持っている場合と持っていない場合があることを意味する。例えば、抗原ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質（配列番号３９）が別のポリペプチド（例えば、別の抗原）に融合された場合、開始アミノ酸「Ｍ」は省略又は保持されてもよい。
【0037】
本明細書において、「トランスロケーションドメイン」は、融合タンパク質内の抗原を、エンドソーム膜を通過してＣＤ４０発現細胞の細胞質基質にトランスロケーションする生物活性を有するポリペプチドである。トランスロケーションドメインは、抗原提示のためのクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ－１）経路（即ち、細胞障害性Ｔ細胞経路）に向かって抗原を誘導又は促進する。
【0038】
「シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）トランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）」という用語は、トランスロケーション生物活性を有するＰＥドメインＩＩペプチド又はその機能的断片を指す。
【0039】
「志賀毒素（Ｓｔｘ）トランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）」という用語とは、トランスロケーションにおいて生物学的活性を有するＳｔｘトランスロケーションドメイン又はその機能的断片を指す。
【0040】
「フーリン及び／又はカテプシンＬ」又は「フーリン／カテプシンＬ」という用語は、交換可能である。フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位とは、プロテアーゼ（フーリン及び／又はカテプシンＬ）感受性部位を指す。それは、フーリン若しくはカテプシンＬ、又はフーリンとカテプシンＬの両方によって切断可能な短いペプチド配列である。それは、融合タンパク質に導入される前記切断部位を含むペプチドリンカー、又は融合タンパク質のトランスロケーションドメインに存在する固有のプロテアーゼ切断部位であり得る。
【0041】
「抗原」と「免疫原」という用語は交換可能である。抗原は、腫瘍抗原（がん由来の抗原又はがんに関連する抗原）又は病原体の抗原（病原体由来の抗原）であり得る抗原性タンパク質を指す。
【0042】
「腫瘍」と「がん」という用語は交換可能である。
【0043】
「がん細胞の抗原」と「腫瘍抗原」という用語は交換可能である。
【0044】
「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍特異的抗原及び／又は腫瘍関連抗原を指す。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の表面で発現されるタンパク質又はポリペプチドであり得る。
【0045】
分化クラスター２８（ＣＤ２８）は、Ｔ細胞特異的な表面糖タンパク質である。ＣＤ２８受容体は、Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触中に刺激される。その機能は、Ｔ細胞の活性化、細胞増殖の誘導、サイトカイン産生、及びＴ細胞の生存の促進に関与する。
【0046】
「有効量」という用語は、治療対象に治療効果を与えるのに必要な活性融合タンパク質の量を指す。有効用量は、当業者によって認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、及び他の治療処置との同時使用の可能性に応じて変化する。
【0047】
「治療する」又は「治療」という用語は、それを必要とする対象に有効量の融合タンパク質を投与することを指す。前記対象は、疾患、その症状又はその素因を治癒、軽減、緩和、治療、改善又は予防する目的で、がん若しくは感染症、又はそのような疾患の症状若しくは素因を有する。このような対象は、任意の適切な診断方法からの結果に基づいて、ヘルスケアの専門家によって特定され得る。
【0048】
「０～１２繰り返し」又は「２～６繰り返し」とは、「０～１２」又は「２～６」の範囲内の全ての整数単位量が本発明の一部として具体的に開示されていることを意味する。したがって、０、１、２、３、４、・・・１０、１１及び１２」又は「２、３、４、５及び６」単位の量が、本発明の実施形態として含まれる。
【0049】
一態様では、本発明は、（ｉ）ＣＤ４０結合ドメイン、（ｉｉ）抗原、及び（ｉｉｉ）前記ＣＤ４０結合ドメインと前記抗原との間に位置するトランスロケーションドメインを含む融合タンパク質に関する。前記融合タンパク質において、前記ＣＤ４０結合ドメインと前記トランスロケーションドメインとの間にフーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位が存在する。
【0050】
本発明の融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ抗原提示経路を介して抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる。それらは共通の作用メカニズムを共有する。以下、融合タンパク質１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７を例として作用メカニズムを説明する。
【0051】
（１）前記融合タンパク質は、ＣＤ４０発現細胞（例えば、樹状細胞又はマクロファージ）に結合し、ＣＤ４０媒介エンドサイトーシスにより内在化される。
（２）前記融合タンパク質は、エンドソーム内でフーリンプロテアーゼ及び／又はカテプシンＬプロテアーゼにより切断されるこれによって、１８ｓＣＤ４０Ｌ断片はＴＰＥ－Ｅ７断片から除去される。
（３）ＴＰＥ－Ｅ７断片は、エンドソームのエンドソーム膜を通過して細胞質基質に入る。
（４）ＴＰＥ－Ｅ７断片は、細胞質基質プロテアソームによって消化され、エピトープを持つ小さなＥ７抗原を生成する。
（５）Ｅ７抗原は、抗原提示のためにＭＨＣクラスＩ経路に送達される。
（６）ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的免疫応答は、Ｔ細胞が提示されたこれらの抗原を認識するによって誘導又は増強される。
（２）前記融合タンパク質は、エンドソーム内でフーリンプロテアーゼ及び／又はカテプシンＬプロテアーゼにより切断されるこれによって、１８ｓＣＤ４０Ｌ断片はＴＰＥ－Ｅ７断片から除去される。
（３）ＴＰＥ－Ｅ７断片は、エンドソームのエンドソーム膜を通過して細胞質基質に入る。
（４）ＴＰＥ－Ｅ７断片は、細胞質基質プロテアソームによって消化され、エピトープを持つ小さなＥ７抗原を生成する。
（５）Ｅ７抗原は、抗原提示のためにＭＨＣクラスＩ経路に送達される。
（６）ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的免疫応答は、Ｔ細胞が提示されたこれらの抗原を認識するによって誘導又は増強される。
【0052】
上記の作用メカニズムは、前記融合タンパク質Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌに適用される。この場合、フーリン及び／又はカテプシンＬプロテアーゼによる切断により、Ｅ７－ＴＳｔｘ断片は１８ｓＣＤ４０Ｌ断片から除去される。そうすると、Ｅ７－ＴＳｔｘ断片は、エンドソームのエンドソーム膜を通過して細胞質基質に入り、細胞質基質プロテアソームによって消化されてエピトープを持つ小さなＥ７抗原を生成する。Ｅ７抗原は、抗原提示のためにＭＨＣクラスＩ経路に送達される。ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的免疫応答は、Ｔ細胞が提示されたこれらの抗原を認識するによって誘導又は増強される。
【0053】
本発明によれば、前記融合タンパク質において、前記抗原と前記トランスロケーションドメインとの間に、フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位が存在しない。
【0054】
フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位の存在及び融合タンパク質におけるその位置により、フーリン及び／又はカテプシンＬ切断後の融合タンパク質からのＣＤ４０結合ドメインの除去は可能になる。
【0055】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ペプチドリンカーをさらに含む。前記リンカーは、前記融合タンパク質における前記ＣＤ４０結合ドメインと前記トランスロケーションドメインとの間に存在するフーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位を含む。
【0056】
前記トランスロケーションドメイン及び抗原は、トランスロケーションドメインにより、抗原がエンドソーム膜を横切って細胞質基質に入るように抗原をトランスロケーションさせ、その後、ＣＤ４０発現細胞における抗原提示のために抗原をＭＨＣクラスＩ経路へ促進可能なような方向及び／又は関係で前記融合タンパク質内に位置する。
【0057】
一実施形態において、前記トランスロケーションドメインは、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）に由来する。別の実施形態において、前記トランスロケーションドメインは、志賀毒素（Ｓｔｘ）に由来する。
【0058】
一実施形態において、前記トランスロケーションドメインは、ＣＤ４０結合ドメインが前記融合タンパク質のＮ末端に位置する場合、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）トランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）を含むか又はそれである。
【0059】
別の実施形態において、前記トランスロケーションドメインは、前記抗原が前記融合タンパク質のＮ末端に位置する場合、志賀毒素（Ｓｔｘ）トランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）を含むか又はそれである。
【0060】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、（ｉ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置するＣＤ４０結合ドメイン、（ｉｉ）ＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）を含むトランスロケーションドメイン、及び（ｉｉｉ）前記融合タンパク質のＣ末端に位置する抗原を順次含む。フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、前記融合タンパク質におけるＣＤ４０結合ドメインと前記トランスロケーションドメインとの間に存在する。
【0061】
別の実施形態において、前記トランスロケーションドメインは、ＴＰＥの機能的部分であり、前記フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、ＰＥからの固有フーリン切断部位である。
【0062】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、（ｉ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置するＣＤ４０結合ドメイン、（ｉｉ）フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位を含むペプチドリンカー、（ｉｉｉ）ＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）を含むトランスロケーションドメイン、及び（ｉｖ）病原体抗原又は腫瘍抗原を順次含む。
【0063】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、（ｉ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置する抗原、（ｉｉ）Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）を含むトランスロケーションドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ４０結合ドメインを順次含む。フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、前記融合タンパク質における前記ＣＤ４０結合ドメインと前記トランスロケーションドメインとの間に存在する。
【0064】
一実施形態において、前記トランスロケーションドメインは、ＴＳｔｘの機能的部分であり、前記フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、Ｓｔｘからの固有フーリン切断部位である。
【0065】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、（ｉ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置する抗原、（ｉｉ）Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）を含むトランスロケーションドメイン、（ｉｉｉ）フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位を含む切断可能なリンカー、及び（ｉｖ）ＣＤ４０結合ドメインを順次含む。
【0066】
一実施形態において、フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位は、配列番号１若しくは２のアミノ酸配列を含むか、それであるか、又はそれからなる。
【0067】
別の実施形態において、ＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）は、シュードモナス外毒素Ａタンパク質（全長ＰＥ；配列番号４）のドメインＩＩ（アミノ酸残基２５３－３６４；配列番号９）である。
【0068】
別の実施形態において、ＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）は、最小機能的断片ＧＷＥＱＬＥＱＣＧＹＰＶＱＲＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号５）を含む。
【0069】
別の実施形態において、ＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）は、２６－１１２アミノ酸残基から構成され、前記ＰＥトランスロケーションペプチドは、最小機能的断片ＧＷＥＱＬＥＱＣＧＹＰＶＱＲＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号５）を含む。
【0070】
別の実施形態において、ＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）は、配列番号５、６、７、８又は９と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0071】
別の実施形態において、ＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）は、ＰＥ２８０－３０５（配列番号５）、ＰＥ２８０－３１３（配列番号６）、ＰＥ２６８－３１３（配列番号７）、ＰＥ２５３－３１３（配列番号８）、及びＰＥ２５３－３６４（配列番号９；全長ＰＥドメインＩＩ）からなる群より選択される。
【0072】
一実施形態において、Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）は、志賀毒素（Ｓｔｘ）サブユニットＡ（配列番号１０）又は志賀様毒素Ｉ（Ｓｌｔ－Ｉ）サブユニットＡ（配列番号１１）の機能的断片である。本発明によれば、Ｓｔｘトランスロケーションペプチドは、トランスロケーション機能を有するが、サブユニットＡの細胞毒性効果を有しない。志賀毒素（Ｓｔｘ）サブユニットＡとＳｌｔ－ＩサブユニットＡとの間の配列同一性は９９％であり、両者のアミノ酸の違いは１つだけである。
【0073】
別の実施形態において、Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）は、長さで８－８４アミノ酸残基から構成される。
【0074】
別の実施形態において、Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）は、ＬＮＣＨＨＨＡＳ（配列番号１２）の最小機能的断片を含む。
【0075】
別の実施形態において、Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）は、長さで８－８４アミノ酸残基から構成され、前記ＴＳｔｘは、ＬＮＣＨＨＨＡＳ（配列番号１２）の最小断片を含む。
【0076】
別の実施形態において、Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）は、配列番号１２、１３、１４、１５及び１６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0077】
別の実施形態において、Ｓｔｘトランスロケーションペプチドは、配列番号１２、１３、１４、１５及び１６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0078】
別の実施形態において、トランスロケーションペプチド（ＴＳｔｘ）は、ＳｔｘサブユニットＡのＳｔｘ２４０－２４７（配列番号１２）、Ｓｔｘ２４０－２５１（配列番号１３）、Ｓｔｘ２１１－２４７（配列番号１４）、Ｓｔｘ２１１－２５１（配列番号１５）及びＳｔｘ１６８－２５１（配列番号１６）からなる群より選択される。
【0079】
ＣＤ４０結合ドメインは、ＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０タンパク質に結合する生物活性を有するポリペプチドである。ＣＤ４０結合ドメインにより、本発明の融合タンパク質は、ＣＤ４０発現細胞（例えば、樹状細胞又はマクロファージ）上のＣＤ４０受容体に結合することができる。
【0080】
一実施形態において、ＣＤ４０結合ドメインは、（ｉ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はその機能的断片、及び（ｉｉ）抗CＤ４０抗体又はその機能的断片からなる群より選択される。
【0081】
ＣＤ４０Ｌ、抗CＤ４０抗体及びそれらのそれぞれの機能的断片は、全てＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０タンパク質に結合する生物活性を有する。
【0082】
ＣＤ４０Ｌの機能的断片は、全長ＣＤ４０Ｌ１－２６１タンパク質（配列番号１７）の膜貫通及び細胞質領域を実質的に欠いている生物活性を有する短縮型ＣＤ４０Ｌである。
【0083】
別の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ又はその機能的断片は、長さで１５４－２６１アミノ酸残基から構成される。
【0084】
別の実施形態において、機能的活性を有する短縮型ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌ４７－２６１（配列番号１８）及びＣＤ４０Ｌ１０８－２６１（１８ｓＣＤ４０Ｌ；配列番号１９）からなる群より選択される。
【0085】
別の実施形態において、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はその機能的断片は、長さで１５４－２６１アミノ酸残基から構成され、前記機能的断片は、ＣＤ４０Ｌ１０８－２６１（配列番号１９）を含む。
【0086】
別の実施形態において、CD40Lは、配列番号17、18又は19と少なくとも90%、95%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。前記CD40Lは、CD40発現細胞上のCD40タンパク質に結合する生物活性を有する。
【0087】
別の実施形態において、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、ＣＤ４０Ｌ４７－２６１（配列番号１８）、ＣＤ４０Ｌ１０８－２６１（配列番号１９；１８ｓＣＤ４０Ｌと呼ばれる）及びＣＤ４０Ｌ１－２６１（配列番号１７）からなる群より選択される。
【0088】
別の実施形態において、ＣＤ４０結合ドメインは、ＣＤ４０特異的抗体（又は抗CＤ４０抗体）である。ＣＤ４０特異的抗体は、ＣＤ４０タンパク質に対して特異的な抗体である。ＣＤ４０特異的抗体は、ＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０タンパク質に結合することができる。
【0089】
一実施形態において、前記ＣＤ４０特異的抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ＶＨは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【0090】
別の実施形態において、本発明のＣＤ４０特異的抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｓｃＦｖ）、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｃ－ＣＨ３、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦａｂ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆａｂ２、ミニボディ及び完全抗体からなる群より選択される。
【0091】
別の実施形態において、本発明のＣＤ４０結合ドメインは、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ 重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びｔｈｅ ＶＨとＶＬとを結合するフレキシブルなリンカー（Ｌ）を含むＣＤ４０特異的ｓｃＦｖ（抗CＤ４０ ｓｃＦｖ）である。
【0092】
一実施形態において、ＣＤ４０特異的ｓｃＦｖは、配列番号２０又は２１のアミノ酸配列を含む。
【0093】
別の実施形態において、本発明のＣＤ４０結合ドメインは、（ｉ）ＣＤ４０特異的抗体若しくはその結合断片、又は（ｉｉ）ＣＤ４０特異的一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）若しくはその結合断片である。前記ＣＤ４０特異的抗体又はＣＤ４０特異的ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬを含む。（ａ）前記ＶＨは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記ＶＬは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【0094】
別の実施形態において、前記ＣＤ４０特異的抗体又はＣＤ４０特異的ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬを含む。前記ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含む。（ｉ）前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４、２５及び２６のアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２７、２８及び２９のアミノ酸配列を含む。
【0095】
別の実施形態において、前記ＣＤ４０結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含むＣＤ４０特異的ｓｃＦｖである。（ａ）前記ＶＨは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記ＶＬは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【0096】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、トランスロケーションドメインがＰＥトランスロケーションペプチド（ＴＰＥ）を含む場合、抗原のＣ末端に位置する小胞体（ＥＲ）保持配列をさらに含む。
【0097】
別の実施形態において、前記ＥＲ保持配列は、配列番号３０、３１、３２、３３及び３４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0098】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＣＤ４０結合ドメインと、フーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位との間に位置するＣＤ２８活性化ペプチドをさらに含む。
【0099】
別の実施形態において、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、長さで２８－５３アミノ酸残基から構成される。
【0100】
別の実施形態において、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、長さが２８－５３アミノ酸残基であり、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、配列番号３５、３６及び３７から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0101】
別の実施形態において、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、長さが２８－５３アミノ酸残基であり、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
【0102】
別の実施形態において、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、配列番号３５、３６及び３７から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0103】
別の実施形態において、前記ＣＤ２８活性化ペプチドは、配列番号３５、３６又は３７と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0104】
本発明の融合タンパク質の抗原は、病原体抗原又は腫瘍抗原である。
【0105】
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、インフルエンザウイルス、デングウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ジカウイルス、狂犬病ウイルス、天然痘ウイルス、チクングニアウイルス、ウエスナイルウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ハンタウイルス、日本脳炎ウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ムンプスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、セルコピテシンヘルペスウイルス－１（ＣＨＶ－１）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、リフトバレー熱ウイルス、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、リケッチア・プロワゼキー、チフスリケッチア、オリエンティア・ツツガムシ、ボレリア・ブルグドルフェリ、エルシニア・ペスティス、三日熱マラリア原虫、マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、炭疽菌、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリヌス、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、サルモネラ・エンテリカ血清型チフス、サルモネラ・エンテリカ血清型パラチフスＡ、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）、シゲラ・ダイセンテリア、志賀赤痢菌、志賀フレキシネル菌、志賀ソンネ菌、エンタメーバ・ヒストリチカ、コレラ菌、結核菌、髄膜炎菌、百日咳菌、インフルエンザ菌Ｂ型（ＨｉＢ）、破傷風菌、リステリア・モノサイトゲネス及び肺炎レンサ球菌からなる群より選択され得る。
【0106】
別の実施形態において、前記病原体は、ＨＰＶ、ＨＩＶ－１、インフルエンザウイルス、デングウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群より選択される。より具体的には、前記病原体は、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群より選択される。
【0107】
別の実施形態において、前記抗原は、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＢＶ Ｘタンパク質（ＨＢｘ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ１タンパク質、ＨＣＶコアタンパク質（ＨＣＶコア）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＣｏＶ２Ｓ）からなる群より選択される病原性抗原である。
【0108】
別の実施形態において、前記抗原は、望ましい免疫応答を誘導するための少なくとも１つのエピトープ、好ましくは１から３０個のエピトープ、より好ましくは１から１５個のエピトープを含む。
【0109】
別の実施形態において、前記抗原は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２又は４３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は実質的にそれから構成される病原性抗原である。
【0110】
別の実施形態において、前記抗原は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２又は４３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は実質的にそれから構成される病原性抗原である。
【0111】
別の実施形態において、前記抗原は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２及び４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0112】
別の実施形態において、前記抗原は、腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。
【0113】
一実施形態において、前記腫瘍又はがんは、乳がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、子宮内膜がん、腎臓がん、胃がん、膠芽腫、肝細胞がん、胆管がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、甲状腺がんからなる群より選択される。
【0114】
別の実施形態において、腫瘍関連抗原は、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｉＬＲＰ、ＷＴ１２－２８１、ＲＮＦ４３、ＣＥＡ－ＮＥ３、ＡＦＰ、ＡＬＫ、前側勾配２（ＡＧＲ２）、ＢＡＧＥタンパク質、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ－８、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリンＢ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩｌｌ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（例えば、ＧＡＧＥ－１、－２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（例えば、ＭＡＧＥ－１、－２、－３、－４、－６及び－１２）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン、ＭＬ－ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳ０１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、Ｓｔｅａｐ－１、Ｓｔｅａｐ－２、サバイビン、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ及びウロプラキン－３からなる群より選択される。
【0115】
別の実施形態において、前記抗原は、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｉＬＲＰ、ＷＴ１２－２８１、ＲＮＦ４３及びＣＥＡ－ＮＥ３からなる群より選択される腫瘍関連抗原である。
【0116】
別の実施形態において、前記抗原は、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む腫瘍関連抗原である。
【0117】
別の実施形態において、前記抗原は、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む腫瘍関連抗原である。
【0118】
抗原は、単一抗原若しくはその抗原性断片、又は少なくとも２つの抗原が融合した融合抗原であってもよい。例えば、抗原は、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質の単一抗原、又はＨＰＶ１６ Ｅ７とＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を含む融合抗原であってもよい。融合抗原は、異なる抗原を結合するリンカーを有しても有しなくてもよい。
【0119】
別の実施形態において、前記抗原は、異なる抗原を結合する少なくとも１つのリンカーを有する融合抗原である。
【0120】
別の実施形態において、前記抗原は、異なる抗原を結合する剛性リンカー（ＥＡＡＡＡＫ）ｎを有する融合抗原である。ここで、ｎは、０－１２、好ましくは２－６、より好ましくは３－４の整数である。言い換えれば、前記剛性リンカーは、０－１２、２－６又は３－４繰り返しの配列ＥＡＡＡＡＫ（配列番号５６）を含む。
【0121】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＣＤ４０結合ドメインとフーリン及び／又はカテプシンＬ切断部位との間に剛性リンカーをさらに含む。前記剛性リンカーは、０－１２繰り返しのアミノ酸配列ＥＡＡＡＡＫ（配列番号５６）を含むペプチドリンカーであってもよい。
【0122】
前記剛性リンカーは、（ＥＡＡＡＡＫ）ｎ又は（配列番号５６）であってもよい。ここで、ｎは、０－１２、好ましくは２－６、より好ましくは３－４の整数である。
【0123】
別の実施形態において、前記剛性リンカーは、２－６又は３－４繰り返しの配列番号５６を含む。
【0124】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号５１、５２、５３、５４又は５５と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は実質的にそれから構成される。
【0125】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号５１、５２、５３、５４及び５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、又は実質的にそれから構成される。
【0126】
別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関する。本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターに関する。本発明は、さらに、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体及び／又は補助剤とを含む医薬組成物に関する。
【0127】
前記医薬組成物は、経皮、経粘膜、鼻咽頭、肺若しくは直接注射、又は全身（例えば、非経口）若しくは局所（例えば、腫瘍内又は病巣内注射）投与に適用される経腸又は非経口剤形であってもよい。 非経口注射は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は皮内経路を介して行うことができる。
【0128】
適切な補助剤は、サポニン系補助剤又はトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト補助剤を含むが、これらに限定されない。サポニン系補助剤は、ＧＰＩ－０１００、Ｑｕｉｌ Ａ又はＱＳ－２１であってもよい。ＴＬＲアゴニスト補助剤は、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）又はＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クラスＡ ＣｐＧ：ＣｐＧ１５８５、ＣｐＧ２２１６又はＣｐＧ２３３６；クラスＢ ＣｐＧ：ＣｐＧ１６６８、ＣｐＧ１８２６、ＣｐＧ２００６、ＣｐＧ２００７、ＣｐＧ ＢＷ００６又はＣｐＧ Ｄ－ＳＬ０１；クラスＣ ＣｐＧ：ＣｐＧ２３９５、ＣｐＧ Ｍ３６２又はＣｐＧ Ｄ－ＳＬ０３）であってもよい。一実施形態において、前記補助剤は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【0129】
前記医薬組成物は、例えば、錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬及び軟ゼラチンカプセルの形態で経口投与することもできる。
【0130】
融合タンパク質の投与量は、制御すべき疾患、患者の年齢及び個々の状態、ならびに投与態様に応じて変化し得る。投与量は、所望の治療応答を達成するための本発明の融合タンパク質の治療有効量を得るために、それぞれの特定の場合における個々の要件に合わせることができる。
【0131】
成人患者の場合、１回の投与量は約０．１～５０ｍｇ、特に約０．１～５ｍｇが考慮される。疾患の重症度と正確な薬物動態プロファイルに応じて、前記融合タンパク質は、週、隔週、又は月に１回の投薬単位で投与することができ、そのような治療を満たすために、サイクルごとに合計で１から６回の投薬単位を与える。
【0132】
別の態様では、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導して対象における感染症若しくは腫瘍を保護及び／又は治療するための医薬品の製造における本発明の融合タンパク質又は医薬組成物の使用に関する。
【0133】
略語
Ｒａｐ１：Ｒａｓ－ｐｒｏｘｉｍａｔｅ－１又はＲａｓ関連タンパク質１
ＣＤ４０：分化抗原群４０
ＣＤＲ：相補性決定領域
Ｒａｐ１：Ｒａｓ－ｐｒｏｘｉｍａｔｅ－１又はＲａｓ関連タンパク質１
ＣＤ４０：分化抗原群４０
ＣＤＲ：相補性決定領域
【0134】
実施例
【0135】
動物腫瘍モデル
【0136】
実施例の６－８のインビボ効力アッセイのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺上皮細胞からのＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７発現腫瘍細胞株を用いてマウスＨＰＶ１６腫瘍モデルを構築した。腫瘍細胞をＦＢＳ（１０％）及びペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシンＢ（５０ユニット／ｍＬ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で増殖させた。
【0137】
配列番号及び組成
【0138】
表１は、配列番号、対応するペプチド、ポリペプチド及び融合タンパク質
【表1】
【0139】
フローサイトメトリー
脾臓細胞を抗原性刺激因子で３７℃で２時間刺激した後、５０μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ及びモネンシンで３７℃で２時間処理した。細胞を回収して０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、ＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ＣＤ３抗体、ｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ４抗体、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８抗体、ＰＥ結合抗ＣＤ４４抗体及びＡＰＣ結合抗ＣＤ６２Ｌ抗体で同時に染色した。洗浄した後、細胞を透過処理し、固定し、ＰＥ結合抗ＩＦＮ－γ抗体、ＰＥ／Ｃｙ７結合抗ＩＬ－２抗体及びｅＦｌｕｏｒ４５０結合抗ＴＮＦ－α抗体で同時に細胞内染色した。ＣＤ８＋又はＣＤ４＋メモリーＴ細胞表現型（ＣＤ３＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）を有する脾臓細胞の細胞内サイトカイン特性（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α）は、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーター及びＫａｌｕｚａソフトウェアによってさらに分析された。
脾臓細胞を抗原性刺激因子で３７℃で２時間刺激した後、５０μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ及びモネンシンで３７℃で２時間処理した。細胞を回収して０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、ＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ＣＤ３抗体、ｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ４抗体、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８抗体、ＰＥ結合抗ＣＤ４４抗体及びＡＰＣ結合抗ＣＤ６２Ｌ抗体で同時に染色した。洗浄した後、細胞を透過処理し、固定し、ＰＥ結合抗ＩＦＮ－γ抗体、ＰＥ／Ｃｙ７結合抗ＩＬ－２抗体及びｅＦｌｕｏｒ４５０結合抗ＴＮＦ－α抗体で同時に細胞内染色した。ＣＤ８＋又はＣＤ４＋メモリーＴ細胞表現型（ＣＤ３＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）を有する脾臓細胞の細胞内サイトカイン特性（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α）は、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーター及びＫａｌｕｚａソフトウェアによってさらに分析された。
【0140】
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ
脾臓細胞を、抗原性刺激因子の存在下又は非存在下で、前処理したマウスＩＦＮ－γ捕捉９６ウェルプレート（ＣＴＬ ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標））に２ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度でトリプリケートで播種した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を廃棄した。洗浄後、捕捉されたＩＦＮ－γをビオチン結合抗マウスＩＦＮ－γ抗体によって室温で２時間検出し、製造元の指示に従ってＩＦＮ－γ免疫スポットを作成した。ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ｓ５マイクロアナライザー（ＣＴＬ）によりＩＦＮ－γ－免疫スポットのスキャンと計数を実行した。
脾臓細胞を、抗原性刺激因子の存在下又は非存在下で、前処理したマウスＩＦＮ－γ捕捉９６ウェルプレート（ＣＴＬ ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標））に２ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度でトリプリケートで播種した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を廃棄した。洗浄後、捕捉されたＩＦＮ－γをビオチン結合抗マウスＩＦＮ－γ抗体によって室温で２時間検出し、製造元の指示に従ってＩＦＮ－γ免疫スポットを作成した。ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ｓ５マイクロアナライザー（ＣＴＬ）によりＩＦＮ－γ－免疫スポットのスキャンと計数を実行した。
【0141】
間接酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
採取した全血サンプルを４℃で３０～６０分間静置した後、５，０００ｇで１０分間遠心分離して血餅をペレット化した。サンプルを－２０°Ｃで保存した。抗原特異的抗体結合用の精製コーティングタンパク質をグアニジンコーティングバッファー（２Ｍ塩酸グアニジン、５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭクエン酸、ｐＨ４．０～４．４）で希釈し、１μｇ／ウェルで９６ウェルプレートに分配した。４℃で一晩インキュベーションした後、９６ウェルプレートをＰＢＳ中の１％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロックした。血清サンプルを解凍した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０倍連続希釈した。コーティングされたタンパク質を、１０００倍に希釈した血清サンプル１００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した後、抗原特異的抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００希釈、カタログ番号３１４３０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）により３７°Ｃで３０分間検出した。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ基質の存在下でＨＲＰ媒介発色を触媒し、１００μＬの１Ｎ ＨＣｌでクエンチした。４５０ｎｍでの吸光度で血清サンプル中の抗原特異的抗体の相対力価を決定した。
採取した全血サンプルを４℃で３０～６０分間静置した後、５，０００ｇで１０分間遠心分離して血餅をペレット化した。サンプルを－２０°Ｃで保存した。抗原特異的抗体結合用の精製コーティングタンパク質をグアニジンコーティングバッファー（２Ｍ塩酸グアニジン、５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭクエン酸、ｐＨ４．０～４．４）で希釈し、１μｇ／ウェルで９６ウェルプレートに分配した。４℃で一晩インキュベーションした後、９６ウェルプレートをＰＢＳ中の１％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロックした。血清サンプルを解凍した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０倍連続希釈した。コーティングされたタンパク質を、１０００倍に希釈した血清サンプル１００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した後、抗原特異的抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００希釈、カタログ番号３１４３０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）により３７°Ｃで３０分間検出した。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ基質の存在下でＨＲＰ媒介発色を触媒し、１００μＬの１Ｎ ＨＣｌでクエンチした。４５０ｎｍでの吸光度で血清サンプル中の抗原特異的抗体の相対力価を決定した。
【0142】
統計分析
ｔ検定により全ての比較の有意性を計算し、ｐ＜０．０５の場合、結果は有意であると見なされた。
ｔ検定により全ての比較の有意性を計算し、ｐ＜０．０５の場合、結果は有意であると見なされた。
【0143】
実施例１
【0144】
ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７及び１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７の発現ベクターの構築
【0145】
図５Ａ－Ｅは、本発明の融合タンパク質の様々な実施形態を示す。
【0146】
融合タンパク質ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７（配列番号５１；図５Ａ）は、（ａ）短縮型ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌ４７－２６１（配列番号１８）、（ｂ）（ＥＡＡＡＡＫ）３（配列番号３）及びＲＸ１ＲＸ２Ｘ３Ｒ（配列番号２）（ここで、Ｘ１はＡ、Ｘ２はＹ、Ｘ３はＫである）を含む切断可能なリンカー、（ｃ）配列番号５のＰＥトランスロケーションペプチド（ＰＥ２８０－３０５）、及び（ｄ）配列番号３８のＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質及び配列番号３９のＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を含む融合抗原ＨＰＶ１６／１８ Ｅ７を含む。
【0147】
以下のようにＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７（図１）の発現ベクターを構築する。
ＣＤ４０Ｌ４７－２６１、切断可能なリンカー及びＰＥトランスロケーションペプチド（ＰＥ２８０－３０５）を含むＨｉｎｄＩＩＩＣＤ４０Ｌ-リンカー-ＰＥＮｃｏＩ，ＸｈｏＩ，ＳａｌＩをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ切断部位を持つプラスミドｐＴＡＣ－ＭＡＴ－Ｔａｇ－２に結合してプラスミドＰ０７－Ｈｉｓ－ｐＮＣを得た（図２）。その後、Ｈｉｓタグ付き融合抗原ＨＰＶ１６／１８ Ｅ７をコードするＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩを介してプラスミドＰ０７－Ｈｉｓ－ｐＮＣ（図２）に挿入し、融合タンパク質ＣＤ４０ Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７の発現ベクターを生成した（図１）。
ＣＤ４０Ｌ４７－２６１、切断可能なリンカー及びＰＥトランスロケーションペプチド（ＰＥ２８０－３０５）を含むＨｉｎｄＩＩＩＣＤ４０Ｌ-リンカー-ＰＥＮｃｏＩ，ＸｈｏＩ，ＳａｌＩをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ切断部位を持つプラスミドｐＴＡＣ－ＭＡＴ－Ｔａｇ－２に結合してプラスミドＰ０７－Ｈｉｓ－ｐＮＣを得た（図２）。その後、Ｈｉｓタグ付き融合抗原ＨＰＶ１６／１８ Ｅ７をコードするＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩを介してプラスミドＰ０７－Ｈｉｓ－ｐＮＣ（図２）に挿入し、融合タンパク質ＣＤ４０ Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７の発現ベクターを生成した（図１）。
【0148】
切断可能なリンカーにより、フーリン及び／又はカテプシンＬプロテアーゼは、融合タンパク質を切断してＴＰＥ－Ｅ７断片を融合タンパク質から放出することができる。
【0149】
【0150】
上記の同様の方法により、融合タンパク質１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７（配列番号５２；図５Ｂ）の発現ベクターを構築した。ここで、短縮型ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌ４７－２６１（配列番号１８）の代わりに、他の短縮型ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌ１０８－２６１（配列番号１９）である１８ｓＣＤ４０Ｌを用いた。
【0151】
実施例２
【0152】
Ｅ７－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１及びＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの発現ベクターの構築
【0153】
融合タンパク質Ｅ７－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１（配列番号５３；図５Ｃ）は、（ａ）融合抗原ＨＰＶ１６／１８ Ｅ７（ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質（配列番号３８）及びＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質（配列番号３９）を含む）、（ｂ）配列番号１４のＳｔｘトランスロケーションペプチド（Ｓｔｘ２１１－２４７）、（ｃ）配列番号１のＲＸ１Ｘ２Ｒ（Ｘ１はＶ、Ｘ２はＡである）及び配列番号３の（ＥＡＡＡＡＫ）３を含む切断可能なリンカー、並びに（ｄ）配列番号１８の短縮型ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ４７－２６１）を含む。
【0154】
以下のように、Ｅ７－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１（図３）の発現ベクターを構築する。
【0155】
Ｓｔｘトランスロケーションペプチド（Ｓｔｘ２１１－２４７）、切断可能なリンカー及びＣＤ４０Ｌ４７－２６１を含むＨｉｎｄＩＩＩ， ＸｈｏＩＳｔｘ－リンカー－ＣＤ４０ＬＳａｌＩをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ切断部位を有するプラスミドｐＴＡＣ－ＭＡＴ－Ｔａｇ－２バックボーンに結合してプラスミドＰ０８（ＲＰ）－Ｈｉｓ－ｐＮＣを得た（図４）。その後、Ｈｉｓタグ付き融合抗原ＨＰＶ１６／１８ Ｅ７をコードする他のＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩを介してプラスミドＰ０８（ＲＰ）－Ｈｉｓ－ｐＮＣ（図４）に挿入し、発現ベクターＥ７－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１を生成した（図３）。
【0156】
切断可能なリンカーは、本発明の融合タンパク質にとって重要である。切断可能なリンカーにより、融合タンパク質は、Ｅ７－ＴＳｔｘ断片が融合タンパク質から放出されるようにフーリン及び／又はカテプシンＬプロテアーゼによって切断され得る。．例えば、図５Ｃを参照されたい。
【0157】
上記と同様の方法により、様々な病原体又はがんからの他の目的の抗原を用いてＥ７を置換し、図４のプラスミドに挿入して、本発明の目的抗原を含む融合タンパク質のための図３のプラスミドに類似する発現ベクターを生成することができる。
【0158】
上記の同様の方法により、融合タンパク質Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（配列番号５４；図５Ｄ）の発現ベクターを構築した。ここで、短縮型ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌ４７－２６１（配列番号１８）の代わりに、他の短縮型ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌ１０８－２６１（配列番号１９）である１８ｓＣＤ４０Ｌを用いた。
【0159】
比較のために、米国特許第９，４８１，７１４Ｂ２号に開示された従来の構築物（実施例１）とほぼ同一であり、融合タンパク質ＲＡＰ１－ＣＤ２８ｃｏｎｖＰＥｔ－Ｅ７－Ｋ３（本発明において「ＲＡＰ１－Ｅ７」とも呼ばれる）を構築した。ＲＡＰ１－ＣＤ２８ｃｏｎｖＰＥｔ－Ｅ７－Ｋ３（本発明において「ＲＡＰ１－Ｅ７」とも呼ばれる）は、ＲＡＰ１ドメインＩＩＩ、ＣＤ２８配列、リンカー、ＰＥトランスロケーションドメインＩＩ（ＰＥ２６８－３１３）、抗原Ｅ７タンパク質、及び小胞体保持配列を含む。本明細書で使用される抗原Ｅ７タンパク質は、融合抗原ＨＰＶ１６／１８ Ｅ７であり、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質（配列番号３８）及びＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質（配列番号３９）を含むのに対し、先行技術で使用される抗原Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質である。
【0160】
実施例3
【0161】
ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの発現ベクターの構築
【0162】
融合タンパク質ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（配列番号５５；図５Ｅ）は、（ａ）配列番号４０のＨＢＸタンパク質及び配列番号４１のＨＢＶ ｐｒｅＳ１タンパク質を含む融合抗原ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１、（ｂ）配列番号１４のＳｔｘトランスロケーションペプチド（Ｓｔｘ２１１－２４７）、（ｃ）配列番号１のＲＸ１Ｘ２Ｒ（Ｘ１はＶ、Ｘ２はＡである）及び配列番号３の（ＥＡＡＡＡＫ）３を含む切断可能なリンカー、並びに（ｄ）配列番号１９の短縮型ＣＤ４０リガンド（１８ｓＣＤ４０Ｌ）を含む。
【0163】
実施例２と同様の方法により、融合タンパク質ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの発現ベクターを構築した。ここで、上記のように、使用される短縮型ＣＤ４０リガンドは、１８ｓＣＤ４０Ｌであり、使用される抗原は、融合抗原ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１であった。
【0164】
実施例４
【0165】
タンパク質発現
【0166】
タンパク質発現ベクターＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７を含む大腸菌ＢＬ２１細胞を、選択した抗生物質を適切な濃度で含むＺＹ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン及び５ｇ／Ｌ酵母抽出物）に３７°Ｃで接種した。培養が初期対数期に達したとき（ＯＤ６００＝２～５）、イソプロピル－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（０．５～２ｍＭ）により融合タンパク質の発現を誘導した。４時間のＩＰＴＧ誘導後に細胞を回収し、超音波処理により破壊した。過剰発現した融合タンパク質を回収するために、封入体を分離し、可溶化バッファー（６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．４）で可溶化した。精製後、２０～５０倍量の透析緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ）において４℃で一晩透析することにより融合タンパク質のリフォールディングを行った。リフォールディングされた融合タンパク質を、還元（ジチオスレイトールあり；＋ＤＴＴ）及び非還元（ジチオスレイトールなし；－ＤＴＴ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析にかけ、適切にリフォールディングされたかどうかを評価した。
【0167】
以下の融合タンパク質も、上記と同様の方法により発現及びリフォールディングされた。（１）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７、（２）Ｅ７－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１、（３）Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ、（４）ＲＡＰ１－Ｅ７、（５）ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１、（６）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１、（７）ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１、（８）ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ、（９）ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－ＨＣＶコア、（１０）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－ＨＣＶコア、（１１）ＨＣＶコア－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１、（１２）ＨＣＶコア－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ、（１３）ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－ＣｏＶ２Ｓ、（１４）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－ＣｏＶ２Ｓ、（１５）ＣｏＶ２Ｓ－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１、（１６）ＣｏＶ２Ｓ－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ、（１７）ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－ＳＳＸ２、（１８）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－ＳＳＸ２、（１９）ＳＳＸ２－ＴＳｔｘ－ＣＤ４０Ｌ４７－２６１、（２０）ＳＳＸ２－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ。融合タンパク質ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７、Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ、ＲＡＰ１－Ｅ７及びＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌは、以下の実験において免疫原性分析又は有効性分析にさらに供された。
【0168】
実施例５
【0169】
融合タンパク質の免疫原性分析
【0170】
雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢｌｔｗマウス（５－６週齢）を５群（ｎ＝５）にランダムに分けた。（Ａ）プラセボ（即ち、ＰＢＳ）、（Ｂ）融合タンパク質ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７（１００μｇ）、（Ｃ）融合タンパク質１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７（１００μｇ）、（Ｄ）融合タンパク質Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（１００μｇ）、及び（Ｅ）融合タンパク質ＲＡＰ１－Ｅ７（１００μｇ）。融合タンパク質をＰＢＳに透析した。動物群ＢからＥでは、ＣｐＧ１８２６（５０μｇ）を補助剤として使用した。各群については、０日目から７日間隔で皮下（ｓ．ｃ．）で３回の免疫化を受けた。血液サンプルを０、７及び１４日目に収集した。２１日目に、血液サンプルを採取し、脾臓細胞をＦＢＳ（１０％）及びＰＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。
【0171】
脾臓細胞を使用して、抗原刺激の存在下又は非存在下で、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋メモリーＴ細胞における細胞内サイトカイン誘導（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及び ＴＮＦ－α）を分析した。簡単に言えば、各動物群からの脾臓細胞を、抗原Ｅ７タンパク質（２μｇ／ｍＬのＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプール）の有無にかかわらず処理した後、フローサイトメトリーで分析した。各マウス群における細胞内サイトカイン誘導の程度又はレベルは、相対サイトカイン誘導として表され、刺激抗原Ｅ７の存在下でのサイトカイン＋／ＣＤ８＋及びサイトカイン＋／ＣＤ４＋脾臓細胞の頻度を非刺激（未処理）対照の頻度に正規化することによって得られた。
【0172】
脾臓細胞は、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用して、抗原刺激（２μｇ／ｍＬのＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプール）の存在下又は非存在下でのＩＦＮ－γ分泌脾臓細胞の頻度を分析するためにも使用された。結果は、百万個の脾臓細胞あたりのＩＦＮ－γ＋免疫スポットとして表された。
【0173】
血液サンプルを用いてＥＬＩＳＡにより血清ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的及びＨＰＶ１８ Ｅ７特異的抗体のレベルを分析した。精製されたＨＰＶ１６ Ｅ７及びＨＰＶ１８ Ｅ７組換えタンパク質は、それぞれコーティングタンパク質として使用された。
【0174】
図６は、ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプールによる脾臓細胞の抗原刺激後のサイトカイン誘導結果を示す。融合タンパク質ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７又はＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（群Ｂ－Ｄ）で免疫化した動物からのＣＤ８＋メモリーＴ細胞におけるＩＬ２ではなくＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの相対サイトカイン誘導は全て、ＲＡＰ１－Ｅ７処理群（群Ｅ）又はプラセボ群（群Ａ）と比較して顕著に増加した。動物群Ｂ－Ｅでは、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞におけるＩＬ－２及びＣＤ４＋メモリーＴ細胞におけるサイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－αの相対サイトカイン誘導は、わずかに増加したが、プラセボ群（群Ａ）と比較して有意差を示さなかった。
【0175】
それにもかかわらず、本発明の融合タンパク質は、抗原ＨＰＶ１６ Ｅ７の刺激に応答してＣＤ８＋メモリーＴ細胞においてＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの発現を誘導する点で、先行技術の融合タンパク質よりも優れていると結論付けることができる。
【0176】
図７は、インビトロでＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプールで刺激された脾臓細胞におけるＩＦＮ－γ＋免疫スポットを示す。それぞれＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７、Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ及びＲＡＰ１－Ｅ７（群Ｂ－Ｅ）で刺激された動物群からのＩＦＮ－γ分泌脾臓細胞の頻度は、プラセボ群と比較して顕著に増加した。特に、Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７と比較して顕著により高いＩＦＮ－γ分泌細胞の頻度を誘導した（ｐ＝０．０３５）。
【0177】
この結果は、本発明の融合タンパク質が抗原性ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプールによる刺激時又は刺激後にＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞集団を顕著に増加できることを示している。
【0178】
図８は、様々な融合タンパク質で０、７及び１４日目に刺激された動物における血清ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的抗体のレベルを示す。ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７又はＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌを接種した動物（それぞれ群Ｂ－Ｄ）では、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的抗体のレベルは、７日目の２回目のワクチン接種後に増加し始め、１４日目の３回目のワクチン接種後にさらに上昇した。２１日目に、群Ｂ－Ｄ動物では、血清ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的抗体のレベルは、プラセボ及びＲＡＰ１－Ｅ７（即ち、ＲＡＰ１－ＣＤ２８ｃｏｎｖＰＥｔ－ Ｅ７－Ｋ３）を接種した動物群よりも高い。
【0179】
融合タンパク質ＲＡＰ１－Ｅ７（ＲＡＰ１－ＣＤ２８ｃｏｎｖＰＥｔ－Ｅ７－Ｋ３）は、２回のワクチン接種（０日目及び７日目）後にＨＰＶ１６ Ｅ７特異的抗体レベルを誘発することができなかった。それは１４日目の３回目のワクチン接種後にＨＰＶ１６ Ｅ７特異的抗体を誘導し始め、血清抗体レベルはグループＢ～Ｄと比較して２１日目にわずかであった。それに対し、本発明の融合タンパク質は、０日目及び７日目にワクチンを２回接種した後、血清ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的抗体レベルを誘導した。
【0180】
上記と同じレジメンと免疫化スケジュールを使用して動物にＲＡＰ１－ＣＤ２８ｃｏｎｖＰＥｔ－ＨＢｘ－Ｋ３（「ＲＡＰ１－ＨＢｘ」と呼ぶ）をワクチン接種した場合にも、ＨＢｘ特異的抗体の誘導における同様の効果が観察された。融合タンパク質ＲＡＰ１－ＨＢｘは、ＲＡＰ１－Ｅ７（ＲＡＰ１－ＣＤ２８ｃｏｎｖＰＥｔ－Ｅ７－Ｋ３）のＥ７抗原の代わりにＨＢｘ抗原を使用して生成された。融合タンパク質ＲＡＰ１－ＨＢｘは、１４日目の３回目のワクチン接種後に血清ＨＢｘ特異的抗体レベルを誘導し、２１日目の血清抗体レベルは、本発明の融合タンパク質をワクチン接種された動物と比較してわずか（modest）であった（データは示していない）。
【0181】
図９は、様々な融合タンパク質で０、７及び１４日目に免疫化した動物における血清ＨＰＶ１８ Ｅ７特異的抗体のレベルを示す。融合タンパク質ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７及びＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（それぞれ群Ｂ－Ｄ）は、プラセボ群と比較して血清ＨＰＶ１８ Ｅ７特異的抗体のレベルを顕著に増加させた。
【0182】
したがって、本発明の融合タンパク質は、抗原特異的抗体の誘導に有効であり、抗体の誘導は２回のワクチン接種後に起こる。
【0183】
以上より、本発明の融合タンパク質は、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導し、炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの発現を増加させ、抗原特異的抗体応答を引き起こすことができる。
【0184】
実施例６
【0185】
融合タンパク質のインビボ効力アッセイ
【0186】
雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢｌｔｗマウス（５から６週齢）を５群にランダムに分け、ＰＢＳ（群Ａ、プラセボ、ｎ＝４）又は下記の融合タンパク質の１つで処理した：群Ｂ、ＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７（２５μｇ；ｎ＝５）；群Ｃ、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７（２５μｇ；ｎ＝４）；群Ｄ、Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（２５μｇ；ｎ＝５）；及び群Ｅ、ＲＡＰ１－Ｅ７（２５μｇ；ｎ＝５）。融合タンパク質をＰＢＳに溶解し、ＣｐＧ１８２６（５０μｇ）を群ＢからＥの動物にワクチン接種する際の補助剤として使用した。図１０は、免疫化スケジュール、融合タンパク質及び投与量を示す。
【0187】
マウスにチャレンジするために、腫瘍細胞（１×１０５／０．１ｍＬ）を０日目に各マウスの左側腹部に皮下注射した。７日目、１４日目、２１日目に３回の免疫化が皮下で行われた。腫瘍サイズは、修正された楕円体式（腫瘍サイズ＝１／２（長さ×幅２））に基づくキャリパー測定値を乗算することにより、週に２回決定した。生存率及び無腫瘍率を計算した。腫瘍の長さが２ｃｍを超えるマウスは死亡したと見なされ、測定可能又は触知可能な腫瘍塊のないマウスは腫瘍がないと見なされた。
【0188】
接種された腫瘍はプラセボ群で急速に発達し、２匹の動物が２５日目に死亡したため、プラセボ群のデータは２１日目までしか示さなかった（図１１）。群Ｃ及び群Ｄの動物（それぞれ１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７及びＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌで免疫）の腫瘍塊は、少なくとも全実験期間中（最終日は３９日目）ほぼ完全に抑制された。群Ｂ及び群Ｅの動物（それぞれＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７及びＲＡＰ１－Ｅ７で免疫）の腫瘍は、最初は十分に制御されたが、免疫化を中止すると徐々に成長した。
【0189】
上記の結果は、本発明の融合タンパク質、特に融合タンパク質１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７及びＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌが腫瘍の増殖を効果的に抑制できることを示している。
【0190】
動物群Ｂ－Ｅ（それぞれＣＤ４０Ｌ４７－２６１－ＴＰＥ－Ｅ７、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７、Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ及びＲＡＰ１－Ｅ７で免疫化した）の生存率は、３５日目に０％に低下したプラセボ群と比較して３５日目に１００％維持された（図１２）。
【0191】
上記の結果は、本発明の融合タンパク質が動物腫瘍モデルにおいて生存率を効果的に維持できることを示している。
【0192】
実験期間全体（３９日間）を通して、群Ａ、Ｂ及びＥの動物には腫瘍のない動物が見つからなかった（図１３）。群Ｃの１匹（２５％）と群Ｄの３匹（６０％）（それぞれ１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７及びＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌで免疫化した）は測定可能又は触知可能な腫瘍なしで生存していることが分かった。特に、これらの腫瘍のないマウスでは、１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７又はＥ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌによる３回の免疫化の完了直後に、腫瘍塊が全て排除された。
【0193】
上記の結果は、本発明の融合タンパク質が腫瘍を有する動物の無腫瘍率の向上において、先行技術の融合タンパク質ＲＡＰ１－Ｅ７よりも効果的である。
【0194】
実施例７
【0195】
１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７の異なる用量でのインビボ有効性分析
【0196】
雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢｌｔｗマウス（４から６週齢）を５群にランダムに分けた（ｎ＝５／群）：（Ａ）プラセボ（ＰＢＳ）；（Ｂ）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ（１００μｇ；融合抗原Ｅ７なし）；（Ｃ）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７（１００μｇ）；（Ｄ）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７（５０μｇ）；（Ｅ）１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７（２５μｇ）。群ＢからＥにおいて、融合タンパク質をＰＢＳに溶解し、ＣｐＧ１８２６（５０μｇ）を補助剤として使用した。腫瘍細胞（１×１０６／０．１ｍＬ）を０日目に各マウスの左側腹部に皮下注射した。チャレンジの２週間後、腫瘍マウスに１４日目、２１日目、２８日目に３回ワクチン接種した。
【0197】
腫瘍体積を決定した。融合タンパク質１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥ－Ｅ７の全ての投与量（２５μｇ、５０μｇ又は１００μｇ）は、強力な腫瘍増殖抑制効果を示した。融合タンパク質による腫瘍サイズの抑制は、１４日目の最初の注射後に見られ、３４日目の観察の最終日まで、実験期間全体を通して持続した。プラセボ及び１８ｓＣＤ４０Ｌ－ＴＰＥは、どちらも抗原Ｅ７を欠き、腫瘍増殖抑制に効果がなかった（図１４）。
【0198】
実施例８
【0199】
Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの異なる用量でのインビボ有効性分析
【0200】
マウスをグループ分けし、腫瘍細胞でチャレンジし、１４、２１、２８日目に融合タンパク質を投与し、実施例７と同様の方法を使用して腫瘍サイズを測定した。なお、群ＢからＥのマウスに以下のようにワクチン接種した：それぞれ（Ｂ）ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（１００μｇ；融合抗原Ｅ７なし）；（Ｃ）Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（１００μｇ）；（Ｄ）Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（５０μｇ）；及び（Ｅ）Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（２５μｇ）。融合タンパク質Ｅ７－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの全ての投与量（２５μｇ、５０μｇ又は１００μｇ）は、腫瘍増殖の抑制に強力な効果を示した（図１５）。融合タンパク質による腫瘍サイズの抑制は、最初の接種後に見られ、３４日目の観察の最終日まで、実験期間全体を通して持続した。プラセボ及びＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌは、どちらも抗原Ｅ７を欠き、腫瘍増殖抑制に効果がなかった（図１５）。
【0201】
したがって、本発明の融合タンパク質は、優れた治療効果で腫瘍増殖を抑制する強力な効果を有する。
【0202】
実施例９
【0203】
ワクチン接種回数：ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの免疫原性分析
【0204】
図１６は、各動物群の投与スケジュールを示す。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雌マウス（５週齢）を４群にランダムに分けた（ｎ＝５／群）：（１）プラセボ群；（２）Ｄ０－Ｄ７－Ｄ１４群（３回投与、０、７、１４日目にワクチン接種）；（３）Ｄ７－Ｄ１４群（２回投与、７、１４日目にワクチン投与）；及び（４）Ｄ１４群（１回投与、１４日目にワクチン接種）。プラセボ群については、０、７及び１４日目にＰＢＳを皮下投与した。他の群のマウスについては、図１６に示される投与スケジュールに従ってＣｐＧ１８２６ＯＤＮ（５０μｇ）を補助剤として添加したＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌ（１００ μｇ）を皮下投与した。血液サンプルを０、７、１４及び２１日目に採取した。２１日目に、動物を安楽死させ、脾臓細胞を収集して培養した。抗原性刺激因子（ＨＢｘ特異的ペプチドプール、即ち、ＨＢＶ３２ａａ重複９ペプチド）の存在下及び非存在下でのＩＦＮ－γ分泌脾臓細胞の頻度を、それぞれＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより分析した。血清ＨＢｘ特異的抗体のレベルを、精製ＨＢｘ組換えタンパク質をコーティングタンパク質として使用したＥＬＩＳＡにより分析した。
【0205】
図１７は、各動物群においてインビトロでＨＢＶ ３２ａａ重複９ペプチドプールで刺激された脾臓細胞におけるＩＦＮ－γ＋免疫スポットを示す。結果として、３回投与、２回投与及び１回投与で免疫化した動物群（それぞれ群Ｄ０－Ｄ７－Ｄ１４、Ｄ７－Ｄ１４及びＤ１４）からの脾臓細胞は全て、プラセボ群と比較してＩＦＮ－γ分泌脾臓細胞の頻度において顕著な増加を示した。ＩＦＮ－γ分泌脾臓細胞の頻度は、免疫の回数と正の相関があった。群Ｄ０－Ｄ７－Ｄ１４（３回ワクチン接種）は、ＩＦＮ－γ分泌脾臓細胞の最良の誘導を示した。
【0206】
対照的に、ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌの単一の初回投与（Ｄ１４群）は、明らかにＨＢｘ特異的抗体応答を誘導しなかった。しかし、２回目の免疫化は抗体レベルを中程度に増加させ（Ｄ７－Ｄ１４群）、動物群Ｄ０－Ｄ７－Ｄ１４で示されるように、３回目の投与は抗体レベルをさらに増加させた（図１８）。体液性応答の誘導における投与回数依存効果は、細胞性免疫応答の誘導における効果と一致する。融合タンパク質は、投与回数依存的にＩＦＮ－γ産生を誘導するのに有効である（図１７）。
【0207】
したがって、融合タンパク質ＨＢｘ－ｐｒｅＳ１－ＴＳｔｘ－１８ｓＣＤ４０Ｌは、２回の免疫化後、ＨＢｘ特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答及びＨＢｘ特異的体液性免疫応答を効果的に誘導することができ、複数回のワクチン接種によってさらに促進することができる。
【0208】
例示的な実施形態の前述の説明は、例示及び説明のみを目的として提示されたものであり、開示された正確な形態に本発明を限定するために網羅的であることを意図していない。本明細書で引用及び議論された全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、各参考文献が個々に参照により組み込まれるのと同程度に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】