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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-13
(54)【発明の名称】改変されたｉＰＳＣ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230606BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230606BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230606BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230606BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20230606BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20230606BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230606BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230606BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12N5/10 ZNA
C12N15/85 Z
A61P35/00
A61K35/545
A61K35/28
A61K45/00
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568380
(86)(22)【出願日】2021-05-11
(85)【翻訳文提出日】2022-11-09
(86)【国際出願番号】 GB2021051125
(87)【国際公開番号】W WO2021229212
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】2006903.5
(32)【優先日】2020-05-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517122578
【氏名又は名称】アダプティミューン・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハミルトン ガース
(72)【発明者】
【氏名】ザイドル クリスティーヌ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA21
4B065BB12
4B065BB19
4B065BB34
4B065BB37
4B065BC11
4B065BD15
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA14
4C084ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB44
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、細胞ゲノムに組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞、及びその使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞であって、細胞ゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、前記改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項2】
異種ＴＣＲをコードする前記少なくとも１つの異種核酸配列が、発現可能な異種核酸配列である、請求項１に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項3】
前記改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞が、好ましくは前記細胞表面で発現または提示される核酸配列をコードする異種ＴＣＲによってコードされる、前記少なくとも１つの異種ＴＣＲを発現または提示する、請求項１または２に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項4】
前記改変された造血系細胞が、前記改変されたｉＰＳＣに由来する、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項5】
前記造血系細胞が、以下のうちのいずれか１つから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞：（ａ）場合によっては中胚葉マーカー、ブラキュリ、グーセコイド、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ（ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２としても知られる）、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６またはＰＤＧＦアルファＲのいずれか１つ以上を発現し得る、中胚葉細胞、
（ｂ）場合によっては（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または（ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－（ＣＤ１８４－）であり得る、造血内皮細胞、
（ｃ）場合によっては（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、または（ｃ）ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ＋、ＣＤ３８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ３４＋及び／またはＣＤ４５＋、（ｄ）ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ１＋、ＣＤ３８－であり得る、造血前駆細胞
（ｄ）場合によっては（ａ）ＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋、または（ｂ）ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋であり得る、前駆Ｔ細胞、
（ｅ）場合によっては（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋ＣＤ８＋であり得る、二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、
（ｆ）場合によっては（ａ）ＣＤ４＋、（ｂ）ＣＤ８＋、（ｃ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり得る、単独陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、あるいは
（ｇ）場合によってはアルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞（ＴＨ）、ＣＤ８＋である細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）であり得る、成熟Ｔ細胞。
【請求項6】
ＲＡＧ１発現が、低減または排除される、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項7】
ｒａｇ１遺伝子が、不活性化またはノックアウトされている、請求項６に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項8】
異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記細胞ゲノムにおける前記遺伝子座の１つまたは両方の対立遺伝子にまたはその中に組み込まれている、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項9】
前記遺伝子座が、前記細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子である、請求項６に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項10】
異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記内因性タンパク質をコードする前記遺伝子に隣接してまたはその中に組み込まれている、請求項７に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項11】
異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記内因性タンパク質をコードする前記遺伝子のイントロンまたはエクソン、場合によっては３’エクソン内に組み込まれている、請求項９または１０に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項12】
異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記内因性タンパク質をコードする前記遺伝子または核酸配列のＴＡＧ終止配列の前の前記３’エクソン内に組み込まれている、請求項９に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項13】
異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列の前記組み込みが、前記内因性タンパク質の産生に対して妨害的ではない、請求項７～１０のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項14】
前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸と前記内因性遺伝子をコードする前記核酸との間の融合配列、好ましくは前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸と前記内因性タンパク質をコードする前記核酸との間の融合遺伝子もしくは配列、またはマルチシストロニック融合遺伝子もしくは配列を含む、請求項９～１３のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項15】
前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸が、酵素による切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列によって、前記内因性タンパク質をコードする核酸に接続されている、請求項１４に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項16】
前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸が、場合によっては酵素による切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列を含む、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含む、請求項１４または１５に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項17】
リボソームスキッピングを媒介する前記核酸配列が、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列である、請求項１５または１６に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項18】
酵素による切断部位を含むペプチドをコードする前記核酸配列が、フーリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲをコードする、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項19】
前記異種ＴＣＲ及び前記内因性タンパク質の転写及び発現が、同じプロモーターからのものである、請求項９～１８のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項20】
前記異種ＴＣＲが、場合によっては酵素による切断部位、好ましくはフーリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲ、及び／またはリボソームスキップ配列、好ましくはＴ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列を含むペプチドによって接続された、前記内因性タンパク質との融合タンパク質として発現する、請求項９～１９のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項21】
前記異種ＴＣＲが、好ましくは前記細胞表面で発現及び／または提示される、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む新生異種ＴＣＲとして前記細胞において発現及び／または提示される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項22】
前記内因性タンパク質が、場合によっては分泌経路を介して、前記細胞表面に及び／または細胞膜に輸送されるタンパク質である、請求項９～２１のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項23】
前記内因性タンパク質が、膜タンパク質または膜貫通タンパク質、場合によっては受容体タンパク質、好ましくは受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、好ましくはＣＤ４５またはタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ、すなわちＰＴＰＲＣである、請求項３～２２のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項24】
前記遺伝子座が、膜タンパク質または膜貫通タンパク質、場合によっては受容体タンパク質、好ましくは受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、好ましくはＣＤ４５またはタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ、すなわちＰＴＰＲＣをコードする遺伝子であるか、またはその中に存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項25】
前記遺伝子座が、１番染色体上の前記ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子であるか、またはその中に存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項26】
前記組み込みが、前記ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子のエクソン３３に、場合によっては、ＴＡＧ終止コドンの前に、または前記ＴＡＧ終止コドンの真隣及び／または直前に存在する、請求項２５に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項27】
前記融合遺伝子もしくは配列、またはマルチシストロニック融合遺伝子もしくは配列が、前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸と、ＰＴＰＲＣをコードする核酸、酵素による切断部位、好ましくはフーリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び好ましくはＴ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列から選択されるリボソームスキッピングを媒介する核酸配列を含み、前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸配列が、酵素による切断部位、好ましくはフーリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び好ましくはＴ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列から選択されるリボソームスキッピングを媒介する核酸配列を含む、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含む、請求項１４～２６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項28】
前記異種ＴＣＲが、以下から選択される抗原もしくはそのペプチド抗原に結合するか、または特異的に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞：（ａ）がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原、または
（ｂ）がん状態に関連する、及び／または腫瘍またはがん細胞もしくは組織によって提示される、がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原。
【請求項29】
前記がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原が、以下から選択される、請求項２８に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞：（ａ）がん－精巣抗原、
（ｂ）ＭＡＧＥ抗原、
（ｃ）ＭＡＧＥ Ａ４もしくはそのペプチド抗原、場合によっては、配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号２）を含むペプチド抗原、または
（ｄ）ＡＦＰもしくはそのペプチド抗原、場合によっては、配列ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むペプチド抗原。
【請求項30】
前記がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原が、ペプチド提示分子、場合によっては主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、場合によってはクラスＩまたはクラスＩＩ、場合によってはＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ＊０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２０１と複合体を形成する、請求項２８または２９に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項31】
前記異種ＴＣＲが、以下を有するＴＣＲを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞：（ａ）配列番号９、もしくは配列番号６のアミノ酸残基１～１３６の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファ鎖可変ドメイン、及び／または配列番号１０、もしくは配列番号７のアミノ酸残基１～１３３の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むベータ鎖可変ドメイン、または
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファ鎖可変ドメイン、及び／または配列番号２３のアミノ酸残基１～１１２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むベータ鎖可変ドメイン。
【請求項32】
前記ｉＰＳＣまたは造血系細胞が、異種共受容体をコードする核酸を更に含み、及び／または異種共受容体を発現もしくは提示し、場合によっては、前記共受容体が、ＣＤ８共受容体である、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項33】
前記異種ＣＤ８共受容体が、ヘテロ二量体またはホモ二量体、ＣＤ８αｂヘテロ二量体またはＣＤ８ααホモ二量体である、請求項３２に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項34】
前記異種ＣＤ８共受容体が、以下を含む、請求項３２または３３に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞：（ａ）アミノ酸配列ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＬＳＱＮＫＰＫ、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性のＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＬＳＮＳＩＭ、配列番号１９に対して少なくとも８０％の配列同一性のＣＤＲ３、または
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸番号２２～２３５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項35】
前記ｉＰＳＣまたは造血系細胞が、異種共刺激リガンド、場合によっては４－１ＢＢＬもしくはＣＤ８０をコードする核酸を更に含む、及び／または異種共刺激リガンド、場合によっては４－１ＢＢＬもしくはＣＤ８０を発現もしくは提示する、先行請求項のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞。
【請求項36】
前記がん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原、または請求項２８～３０のいずれか１項に記載の前記がん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原を発現もしくは提示しているがん及び／または腫瘍細胞もしくは組織への、前記ｉＰＳＣまたは造血系細胞及び／または異種ＴＣＲの前記結合が、場合によっては、以下のうちのいずれか１つ以上によって決定される、前記ｉＰＳＣまたは造血系細胞の活性化を人工する、請求項１～３５のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞：（ａ）Ｔ細胞活性化マーカー、例えばＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及び／またはＣＤ２５のいずれかのアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生のアップレギュレーション、例えばＩＦＮガンマ、ＩＬ－２または、グランザイムＢのいずれか１つ以上、
（ｃ）前記抗原もしくは抗原ペプチドの存在下での細胞毒性活性の誘導、または
（ｄ）前記抗原もしくは抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞を死滅させる能力。
【請求項37】
先行請求項のいずれか１項に記載の異種ＴＣＲをコードする核酸領域と、前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸領域の組み込みのための、前記細胞ゲノムにおける前記遺伝子座の核酸領域に相同な核酸領域を含む少なくとも１つの相同領域と、を含む、核酸構築物またはベクター。
【請求項38】
前記遺伝子座が、膜タンパク質または膜貫通タンパク質、場合によっては受容体タンパク質、好ましくは受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、好ましくはＣＤ４５またはタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ、すなわちＰＴＰＲＣをコードする遺伝子であるか、またはその中に存在する、請求項３７に記載の核酸構築物またはベクター。
【請求項39】
前記遺伝子座が、１番染色体上の前記ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子であるかまたはその中に存在する、請求項３７または３８に記載の核酸構築物またはベクター。
【請求項40】
前記遺伝子座が、前記ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子のエクソン３３に、場合によっては、ＴＡＧ終止コドンの前に、または前記ＴＡＧ終止コドンの真隣及び／または直前に存在する、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の核酸構築物またはベクター。
【請求項41】
前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸が、場合によっては、酵素による切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列、好ましくはフーリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲ及び／またはリボソームスキップ配列、好ましくはＴ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列を含む、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含む、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の核酸構築物またはベクター。
【請求項42】
前記構築物またはベクターが、前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸領域の組み込みのための、前記細胞ゲノムにおける前記遺伝子座の核酸領域に各々相同であり、かつ前記組み込み部位の反対側に隣接する、左手及び右手相同領域を含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の核酸構築物またはベクター。
【請求項43】
前記構築物またはベクターが、以下のうちのいずれか１つ以上を更に含む、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の核酸構築物またはベクター：（ａ）組換え標的配列、好ましくはｌｏｘＰ（Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座）配列、
（ｂ）発現可能な選択マーカー配列、好ましくはプロモーター、例えばＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現する、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、及び場合によってはネオマイシン耐性遺伝子。
【請求項44】
前記構築物またはベクターが、配列番号４５の配列を含む前記異種ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列と、配列番号４３及び配列番号４４の配列を含む相同領域と、配列番号４８を含む組換え標的配列と、配列番号４７及び配列番号４９を含む発現可能な選択マーカー配列と、を含む、請求項３７～４３のいずれか１項に記載の核酸構築物またはベクター。
【請求項45】
請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を産生するプロセスであって、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする前記核酸配列を前記細胞ゲノムにおける前記遺伝子座にまたはその中に組み込むことを可能にする条件下で、請求項３７～４４のいずれか１項に記載の核酸構築物またはベクターを、場合によっては請求項５に定義される改変されていない人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞に導入し、場合によっては、前記改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を単離することを含む、前記プロセス。
【請求項46】
請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項47】
療法及び／または医学における使用のための、請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項48】
個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、またはその進行の遅延における使用のための、請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または請求項４６に記載の薬学的組成物であって、場合によっては、前記治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、前記改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または前記薬学的組成物。
【請求項49】
個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の前記治療のための医薬品の製造における、請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または請求項４６に記載の薬学的組成物の使用であって、場合によっては、前記治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、前記使用。
【請求項50】
個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療、防止、またはその進行を遅延させる方法であって、前記個体に、請求項１～３４のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または請求項４４に記載の薬学的組成物を投与することを含み、場合によっては、前記治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、前記方法。
【請求項51】
前記がん及び／または腫瘍が、固形腫瘍である、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項５０に記載の方法における使用のための、請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項52】
前記改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または前記薬学的組成物が、１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するためのものであるか、もしくはそのように使用されるか、場合によっては、別々に、順次、もしくは同時に投与されるか、もしくはそのような投与のためのものである、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項５０に記載の方法における使用のための、請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項53】
以下を含む、キット：（ａ）個体もしくは対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、もしくはその進行を遅延させるための、請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、もしくは請求項４６に記載の薬学的組成物と、それらの使用説明書を含む添付文書、または
（ｂ）個体もしくは対象におけるがん及び／または腫瘍を治療、防止、もしくはその進行を遅延させるための、場合によっては別々に、順次、もしくは同時に投与されるか、もしくは投与するための１つ以上の更なる治療剤と組み合わせられた、請求項１～３６のいずれか１項に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、もしくは請求項４６に記載の薬学的組成物と、それらの使用説明書を含む添付文書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
序論
本発明は、細胞ゲノムに組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞、及びその使用を提供する。
本発明は、細胞ゲノムに組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞、及びその使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
養子Ｔ細胞療法は、がん治療のための重要な療法的介入として広く認識されている。ほとんどの現行のアプローチは、自己または患者由来のＴ細胞を使用する。これらとしては、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）または親和性が向上されたＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を発現するようにウイルス形質導入された、ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）またはＴ細胞が挙げられる。
【0003】
自己療法の１つの欠点は、それらの製造に関連する複雑さである。代替的な「既製の」アプローチは、健康なドナー由来のＴ細胞またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化させたＴ細胞などの、同種異系源からの操作されたＴ細胞の産生である。加えて、患者は、アフェレシススロットが自身のリンパ球を収集し、Ｔ細胞製品が作製される作製時間の間待つ必要があり、加えて、患者はまた、最初から製造に利用可能な細胞の数及び機能性が低いので、Ｔ細胞機能不全を罹患し得るか、または以前の化学療法を数回受ける場合があり、自身のリンパ球数及び機能が損なわれる。
【0004】
同種異系アプローチは、改善された応答に関連する、より機能的かつ強力な抗がん能力と関連するＴ細胞表現型についてスクリーニングすることができる均一な細胞産生物のより容易に入手可能な供給を提供し得るので、特に有利である。要するに、患者ごとに変動することのない、より定義されたＴ細胞表現型によって、患者は、より早く治療を受けることになる。遺伝子編集は、最も侵襲的かつ耐性の高い疾患を有する非常に広範な患者群に、低減されたコストで、標準化された高品質のＴ細胞産生物としてのＴ細胞療法への迅速なアクセスを提供することができると予想される。
【0005】
本発明は、定義された腫瘍抗原特異性の組換え異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＳＰＥＡＲ ＴＣＲ（親和性が向上された特定のペプチド受容体（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））を発現する同種異系ｈｉＰＳＣ由来のＴ細胞（ｉＴ細胞）を提供する。
【0006】
αβＴＣＲを使用する任意の同種異系Ｔ細胞産生物の前提条件は、クローンＴ細胞集団の産生である。これは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを軽減するために必要である。定義されたαβＴＣＲの発現が制限されたｉＴ細胞は、特定のＴＣＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたｈｉＰＳＣのクローンから成功裏に産生されている［Ｍｉｎａｇａｗａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８．２３（６）：ｐ．８５０－８５８ ｅ４］。関連する研究では、分化したｉＴ細胞におけるαβＴＣＲ発現の制限は、ＴＣＲ対立遺伝子の排除によって駆動され、これは、内因性ＴＣＲ遺伝子の誤った再編成を防止することが示唆されている。しかしながら、プロモーターサイレンシングの現象に起因して、レンチウイルス形質導入は、ｈｉＰＳＣ及び分化した細胞における安定な導入遺伝子発現を促進するには非効率的な方法である［Ｚｏｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｉｄａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｆｒｏｍ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ，２０１１．１１７（２１）：ｐ．５５６１－７２］。加えて、Ｔ細胞を発現する組換え異種Ｔ細胞受容体に由来するＴｉＰＳＣの開発は、初期Ｔ細胞材料に存在する天然ＴＣＲの発現を防止するための追加の介入を必要とするであろう。
【0007】
代替的なアプローチは、分化したｉＴ細胞における内因性ＴＣＲ発現を防止するように、ｈｉＰＳＣを遺伝子操作することである。これは、両方の対立遺伝子における複数の遺伝子、例えば、ＴＣＲ定常ドメイン（ＴＲＢＣ１／２及びＴＲＡＣ）、または異種Ｔ細胞受容体ノックインと併せてＴＣＲ遺伝子再編成に関与する可能性のある遺伝子（例えば、ＲＡＧ１／２）の不活性化を必要とするので、困難なアプローチである。しかしながら、分化したｉＴ細胞においてＴＣＲ発現を可能にするためにどの遺伝子座を標的とするかを確認することは、困難かつ予測不可能である。本明細書では、標的とされる組換え異種Ｔ細胞受容体配列の挿入によって、分化したｉＴ細胞においてその発現を可能にする最小限の編集戦略に基づくデータを提示する。
【発明の概要】
【0008】
本発明によれば、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞であって、細胞ゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。
【0009】
本発明によれば、異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列は、発現可能な異種核酸配列であり得る。例えば、核酸配列は、コード遺伝子もしくは複数の遺伝子の発現を可能にする及び／または調節することが可能な１つ以上のコードオープンリーディングフレーム及び／または１つ以上の調節核酸配列、または細胞内の１つ以上のコードオープンリーディング、例えば、コードされた配列もしくは遺伝子の転写及び／または転写後修飾及び／または翻訳を可能にする配列を有し得る。好適な調節配列は、転写もしくは翻訳の開始配列、終止配列、または終結配列、オペレーター配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、末端反復、リボソーム結合部位、キャップ配列、ポリＡテール配列のうちのいずれかを含み得る。
【0010】
好ましくは、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、好ましくは細胞表面に発現または提示される異種ＴＣＲコード配列によってコードされる少なくとも１つの異種ＴＣＲを発現または提示する。好ましくは、少なくとも１つの異種ＴＣＲは、膜結合機能性ＴＣＲ、好ましくは膜固定ヘテロ二量体ＴＣＲタンパク質、好ましくは可変アルファ（α）及びベータ（β）鎖を含み、好ましくはインバリアントＣＤ３鎖分子との複合体として発現される好ましくはアルファ；ベータＴＣＲ（場合によってはガンマ：デルタ）として、細胞表面に提示される。好ましくは、少なくとも１つの異種ＴＣＲは、がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド、及び／または腫瘍及び／またはがん細胞（例えば、がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチドを発現する）、及び／またはそれらからのペプチドもしくは抗原ペプチドに結合するか、または特異的に結合することが可能である。好ましくは、ＴＣＲの結合は、本明細書に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の活性化、及び／または本明細書に記載のＴ細胞活性の活性化を促進する。
【0011】
本発明によれば、改変された造血系細胞は、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣに由来し得る。例えば、改変されていない人工多能性幹細胞ｉＰＳＣは、細胞ゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含むように、例えば、改変された人工多能性幹細胞を産生し、次いでそれを改変された造血系細胞に分化させることができるように、改変または操作、例えば、組換え操作され得る。あるいは、改変されていない造血系細胞は、例えば分化プロセスによって、改変されていない人工多能性幹細胞ｉＰＳＣから誘導され得、次いで、細胞ゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含むように改変または操作され得る。
【0012】
本発明によれば、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞は、以下のうちのいずれか１つから選択され得る：
（ａ）場合によっては、中胚葉マーカー、ブラキュリ、グーセコイド、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ（ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２としても知られる）、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６またはＰＤＧＦアルファＲのうちのいずれか１つ以上を発現し得る、中胚葉細胞、
（ｂ）場合によっては、（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または（ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－（ＣＤ１８４－）であり得る、造血内皮細胞、
（ｃ）場合によっては、（ａ）ＣＤ３４＋または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋または（ｃ）ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ＋、ＣＤ３８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ３４＋及び／またはＣＤ４５＋、（ｄ）ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ１＋、ＣＤ３８－であり得る、造血前駆細胞、
（ｄ）場合によっては、（ａ）ＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋、または（ｂ）ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋であり得る、前駆Ｔ細胞、
（ｅ）二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、場合によっては（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋ＣＤ８＋、
（ｆ）場合によっては、（ａ）ＣＤ４＋、（ｂ）ＣＤ８＋、（ｃ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋、またはＣＤ８＋であり得る、単独陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、
（ｇ）成熟Ｔ細胞、場合によっては、アルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞（ＴＨ）、ＣＤ８＋である細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）、あるいは
（ｈ）人工多能性幹細胞ｉＰＳＣ、場合によっては、ＣＤ３４＋前駆細胞から誘導または作製されたヒト人工多能性幹細胞ｉＰＳＣ、場合によっては臍帯血から単離された、更に場合によってはｐＥＢ－Ｃ５及びｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用した、ヒト人工多能性幹細胞ｉＰＳＣ。
（ａ）場合によっては、中胚葉マーカー、ブラキュリ、グーセコイド、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ（ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２としても知られる）、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６またはＰＤＧＦアルファＲのうちのいずれか１つ以上を発現し得る、中胚葉細胞、
（ｂ）場合によっては、（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または（ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－（ＣＤ１８４－）であり得る、造血内皮細胞、
（ｃ）場合によっては、（ａ）ＣＤ３４＋または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋または（ｃ）ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ＋、ＣＤ３８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ３４＋及び／またはＣＤ４５＋、（ｄ）ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ１＋、ＣＤ３８－であり得る、造血前駆細胞、
（ｄ）場合によっては、（ａ）ＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋、または（ｂ）ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋であり得る、前駆Ｔ細胞、
（ｅ）二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、場合によっては（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋ＣＤ８＋、
（ｆ）場合によっては、（ａ）ＣＤ４＋、（ｂ）ＣＤ８＋、（ｃ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋、またはＣＤ８＋であり得る、単独陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、
（ｇ）成熟Ｔ細胞、場合によっては、アルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞（ＴＨ）、ＣＤ８＋である細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）、あるいは
（ｈ）人工多能性幹細胞ｉＰＳＣ、場合によっては、ＣＤ３４＋前駆細胞から誘導または作製されたヒト人工多能性幹細胞ｉＰＳＣ、場合によっては臍帯血から単離された、更に場合によってはｐＥＢ－Ｃ５及びｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用した、ヒト人工多能性幹細胞ｉＰＳＣ。
【0013】
したがって、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣは、好ましくはＣＤ３４＋前駆細胞から誘導または作製され、場合によっては好ましくは臍帯血から単離され、更に場合によってはｐＥＢ－Ｃ５及び／またはｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用して単離された、人工多能性幹細胞及び／またはヒト人工多能性幹細胞ｉＰＳＣである。
【0014】
本発明の実施形態では、ｉＰＳＣは、例えば、ＲＡＧ１遺伝子の不活性化またはノックアウトによって、ＲＡＧ１発現を低減または排除するように改変され得る。
【0015】
改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、及び胚性幹細胞を含むそれらの前駆体を含む、リンパ系の細胞、ならびに多能性幹細胞（例えば、それからリンパ球が分化され得るもの）であり得る。Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、細胞媒介性免疫を主に担い、また適応免疫系に関与するリンパ球であり得る。本発明によれば、Ｔ細胞としては、限定されないが、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹細胞様メモリーＴ細胞）、及び２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞：例えば、ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞を含む）、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ならびにガンマ－デルタＴ細胞を挙げることができる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することが可能なＴリンパ球のサブセットである。好ましくは、Ｔ細胞は、場合によっては、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはそのようなＴ細胞の集団、場合によっては、ＣＤ４＋Ｔ細胞；またはＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団である。
【0016】
本発明によれば、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞ゲノムにおける、すなわち、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞のゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込まれる。遺伝子座は、例えば、特定の遺伝子または遺伝子マーカーが位置する染色体上の特定の及び／または固定された位置であり得、遺伝子もしくは遺伝子マーカーもしくは遺伝子要素の特定の及び／または固定された位置、及び／または遺伝子もしくは例えば、遺伝子のイントロンもしくはエクソン、または遺伝子の調節エレメント（例えば、転写もしくは翻訳の開始配列、終止配列、または終結配列、オペレーター配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、末端反復、リボソーム結合部位、キャップ配列、ポリＡテール配列）などの遺伝子の遺伝子要素の、内の特定の固定された位置であり得る。
【0017】
本発明によれば、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞ゲノムにおける遺伝子座の１つまたは両方の対立遺伝子にまたはその中に組み込まれ得る。例えば、遺伝子座が、遺伝子もしくは内因性遺伝子、または染色体上の特定の位置及び／または固定された位置、及び／または人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の特定の遺伝子もしくは内因性遺伝子が位置する位置である場合、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、遺伝子座のいずれか１つまたは両方の対立遺伝子に組み込まれ得る。
【0018】
したがって、遺伝子座は、遺伝子であり得るか、または細胞、もしくは人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子内に存在する。
【0019】
本発明によれば、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞、または人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子に隣接して、またはその中に組み込まれ得る。場合によっては、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞、または人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子または核酸配列のイントロンまたはエクソン内、場合によっては５’エクソンまたは３’エクソン、好ましくは３’エクソン内に組み込まれ得る。
【0020】
本発明によれば、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、内因性タンパク質をコードする遺伝子のＴＡＧ終止配列の前の３’エクソン内に組み込まれ得る。好ましくは、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列の組み込みは、内因性タンパク質の産生に対して妨害的ではない。例えば、改変された細胞による内因性タンパク質の産生は、天然タンパク質と同等に翻訳及び／または産生及び／またはプロセシングされ得る内因性タンパク質配列の全てまたは実質的に全てを提供するべきである。例えば、内因性タンパク質をコードする遺伝子は、依然として転写及び／または転写後プロセシング及び／または翻訳が可能であり得、内因性タンパク質配列または内因性タンパク質配列の実質的に全てを産生し、これらは、場合によっては、細胞において翻訳後プロセシング及び／または輸送され得る。好ましくは、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列の組み込みは、内因性タンパク質をコードする遺伝子の欠失もしくは置換、及び／または産生される内因性タンパク質の欠失及び／または不活性化を生じず、場合によっては、融合遺伝子の結果物及び／または遺伝子産生物が、融合タンパク質として産生されるように、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列と、内因性タンパク質をコードする核酸配列または遺伝子との連結を生じ得る。
【0021】
本発明によれば、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、例えば、異種ＴＣＲをコードする核酸の組み込みによって生成される、異種ＴＣＲをコードする核酸と内因性タンパク質をコードする核酸との間の融合配列、例えば、異種ＴＣＲをコードする核酸と内因性タンパク質をコードする核酸との間の融合遺伝子もしくは配列またはマルチシストロニック融合遺伝子もしくは配列を含み得、例えば、異種ＴＣＲの発現が、内因性タンパク質の発現に関連し、及び／または異種ＴＣＲが、遺伝子座における遺伝子の遺伝子産生物、例えば、内因性遺伝子をコードする核酸と同時転写及び／または同時翻訳及び／または同時発現し得る。
【0022】
したがって、本発明は、異種ＴＣＲをコードする核酸が、酵素による切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列によって、内因性タンパク質をコードする核酸に接続され得る、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。
【0023】
したがって、本発明は、異種ＴＣＲをコードする核酸が、酵素による切断部位を含むペプチドをコードする少なくとも１つ、場合によっては２つの核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する少なくとも１つ、場合によっては２つの核酸配列によって、内因性タンパク質をコードする核酸に接続され得る、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。リボソームスキッピングを媒介する核酸配列は、Ｔ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列のいずれかであり得る。酵素による切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列は、フーリン切断部位をコードし得、コードされるフーリン部位の配列は、好ましくはＲＡＫＲであり得る。
【0024】
本発明によれば、異種ＴＣＲをコードする核酸は、場合によっては、酵素による切断部位を含むペプチドをコードする少なくとも１つ、場合によっては２つの介在核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する少なくとも１つ、場合によっては２つの核酸配列を含む、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ鎖のコード配列を含み得る。リボソームスキッピングを媒介する核酸配列は、Ｔ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列のいずれかであり得る。酵素による切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列は、フーリン切断部位をコードし得、コードされるフーリン部位の配列は、好ましくはＲＡＫＲであり得る。
【0025】
したがって、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞の異種ＴＣＲ及び内因性タンパク質の転写及び／または発現は、同じプロモーターからのものであり得る。したがって、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列及び内因性タンパク質をコードする核酸配列または遺伝子は、本明細書で言及される転写及び／または転写後修飾、または同時転写修飾及び／または翻訳の調節配列のための同じ調節配列を共有し得る。転写後修飾または同時転写は、成熟した機能的ＲＮＡ分子を産生するための転写後のＲＮＡ一次転写産生物のプロセシングを含み得、及び／または、ｍＲＮＡプロセシング、及び／または５’プロセシング、及び／またはキャッピング、及び／または３’プロセシング、及び／または切断及びポリアデニル化、及び／またはイントロンスプライシング、及び／またはヒストンｍＲＮＡプロセシングのうちのいずれかを含み得る。
【0026】
本発明は、異種ＴＣＲが、場合によっては、酵素による切断部位、好ましくはフーリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲ及び／またはリボソームスキップ配列、好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列を含むペプチドによって接続される、内因性タンパク質との融合タンパク質として発現される、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。
【0027】
したがって、融合タンパク質は、場合によっては、酵素による切断部位もしくはフーリン切断部位の切断、及び／または場合によっては細胞の小胞体内で実施されるスキップ配列ペプチドの除去によって、新生、遊離、または天然の異種ＴＣＲを放出するように細胞においてプロセシングされ得る。
【0028】
本発明は、好ましくは細胞表面で発現及び／または提示される、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む新生異種ＴＣＲとして、異種ＴＣＲが細胞において発現及び／または提示される、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。新生タンパク質は、融合タンパク質から分離され得、それによって、例えば、細胞内での翻訳後プロセシング中に内因性タンパク質から分離され得、そのようなタンパク質は、細胞小胞体またはゴルジに存在し、次いで、がんもしくは腫瘍抗原もしくはそのペプチドに、及び／または腫瘍及び／またはがん細胞及び／または腫瘍及び／またはがん組織及び／またはそれらからのペプチドもしくは抗原ペプチドに結合するか、または特異的に結合すること、及び／または本明細書に記載の改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の活性化を促進すること、及び／または本明細書に記載のＴ細胞活性を活性化することが場合によっては可能な、膜結合機能的ＴＣＲ、好ましくは膜固定ヘテロ二量体ＴＣＲタンパク質、好ましくはアルファ；ベータＴＣＲとして、場合によっては輸送され、及び／または細胞表面に提示される。
【0029】
本発明によれば、内因性タンパク質は、場合によっては分泌経路を介して細胞表面に、及び／または細胞の細胞膜に、輸送されるタンパク質であり得る。好ましくは、内因性タンパク質は、膜タンパク質及び／または膜貫通タンパク質、場合によっては受容体タンパク質、好ましくは受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、好ましくはＣＤ４５またはタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ、すなわちＰＴＰＲＣである。
【0030】
本発明によれば、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列は、細胞ゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込まれ得、遺伝子座が、膜タンパク質もしくは膜貫通タンパク質、場合によっては受容体タンパク質、好ましくは受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、好ましくはＣＤ４５またはタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ型すなわちＰＴＰＲＣをコードする遺伝子であるか、またはその中に存在する。好ましくは、遺伝子座は、１番染色体上のＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子であるか、はその中に存在する。
【0031】
本発明によれば、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列は、細胞ゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込まれ得、遺伝子座または組み込み部位が、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子のエクソン３３に、好ましくは、１番染色体上のＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子に、場合によっては、ＴＡＧ終止コドンの前に、またはＴＡＧ終止コドンの真隣及び／または直前に存在する。
【0032】
本発明は、融合遺伝子もしくは配列、またはマルチシストロニック融合遺伝子もしくは配列が、異種ＴＣＲをコードする核酸と、酵素による切断部位、好ましくはフーリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び／または、好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列から選択される、リボソームスキッピングを媒介する核酸配列を含むＰＴＰＲＣをコードする核酸と、を含み、異種ＴＣＲをコードする核酸配列が、好ましくは酵素による切断部位、好ましくはフーリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び／または好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列から選択される、リボソームスキッピングを媒介する核酸配列を含む、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含む、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。
【0033】
ＴＣＲ結合
本発明によれば、異種ＴＣＲは、以下のうちのいずれかである抗原またはペプチド抗原に結合し得るか、または特異的に結合し得る：
（ａ）がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原、または
（ｂ）がん状態に関連する、及び／または腫瘍またはがん細胞もしくは組織によって提示されるがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原。
本発明によれば、異種ＴＣＲは、以下のうちのいずれかである抗原またはペプチド抗原に結合し得るか、または特異的に結合し得る：
（ａ）がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原、または
（ｂ）がん状態に関連する、及び／または腫瘍またはがん細胞もしくは組織によって提示されるがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原。
【0034】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、場合によっては、がん及び／または腫瘍によって、及び／またはペプチド提示分子、例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはＨＬＡとの複合体において提示されるか、あるいは（例えば、内因性に発現されるがん及び／または腫瘍細胞表面抗原またはペプチド抗原として）ペプチド提示分子を含まずに提示される、抗原またはそのペプチド抗原に、例えば、がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に、結合し得るか、または特異的及び／または選択的に結合し得る。がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原は、正常な細胞または組織よりも高いレベル、好ましくは顕著に高いレベル、例えば、１０、１００、１０００、１０００、１０，０００、１００，０００、１０００，０００倍超高いレベルで、がん及び／または腫瘍細胞もしくは組織によって発現される抗原またはそのペプチド抗原であり得、好ましくは、抗原またはそのペプチド抗原は、正常な細胞または組織によって発現されない。がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原は、がん－精巣抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１（Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍｓ腫瘍１）、ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫で優先的に発現される抗原）、ｐ５３、ＨＰＶ－Ｅ６／ＨＰＶ－Ｅ７（ヒトパピローマウイルス）、ＨＢＶ、ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、チログロビン、ＴＧＦＢＩＩフレームシフト抗原、ＬＡＧＥ－１Ａ、ＫＲＡＳ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＭＡＧＥ、黒色腫関連抗原もしくはＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのメンバー、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、及びＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、もしくはＭＡＧＥ－Ａ１２、またはそれらのペプチド抗原のうちのいずれかであり得る。
【0035】
本発明によれば、ＴＣＲは、ＭＡＧＥ Ａ４またはその抗原ペプチド、例えば、配列番号１のヒトＭＡＧＥ Ａ４もしくはＭＡＧＥ Ａ４、またはその抗原ペプチドに結合し得る。ＴＣＲは、配列番号２、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを含むＭＡＧＥ Ａ４の抗原ペプチドに結合し得る。あるいは、ＴＣＲは、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、またはその抗原ペプチド、例えば、配列番号２０のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）もしくはＡＦＰのペプチド抗原、またはＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むＡＦＰのペプチド抗原、またはアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）配列番号２０に由来する残基１５８～１６６に結合し得る。
【0036】
ＴＣＲは、以下を含むＡＦＰ抗原ペプチドに結合し得る：
（ａ）配列番号２０の残基１５８～１６６（ＡＦＰ１５８）、
（ｂ）配列番号２０の残基１３７～１４５（ＡＦＰ１３７）、
（ｃ）配列番号２０の残基３２５～３３４（ＡＦＰ３２５）、
（ｄ）配列番号２０の残基５４２～５５０（ＡＦＰ５４２）、または
（ｅ）残基ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）。
（ａ）配列番号２０の残基１５８～１６６（ＡＦＰ１５８）、
（ｂ）配列番号２０の残基１３７～１４５（ＡＦＰ１３７）、
（ｃ）配列番号２０の残基３２５～３３４（ＡＦＰ３２５）、
（ｄ）配列番号２０の残基５４２～５５０（ＡＦＰ５４２）、または
（ｅ）残基ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）。
【0037】
特異的結合ＴＣＲ
本発明によれば、異種ＴＣＲは、抗原またはそのペプチド抗原、場合によっては、がん性状態に関連する、例えば、本明細書に記載の、及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に結合し得るか、または特異的に結合し得る。
本発明によれば、異種ＴＣＲは、抗原またはそのペプチド抗原、場合によっては、がん性状態に関連する、例えば、本明細書に記載の、及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に結合し得るか、または特異的に結合し得る。
【0038】
特異性は、異種ＴＣＲと特異的標的がん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原との間の結合の強度を表し、受容体－リガンド系の結合状態と非結合状態との間の比である解離定数Ｋｄによって説明され得る。加えて、異種ＴＣＲが結合することができる異なるがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原が少ないほど、その結合特異性は高い。
【0039】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２つ未満の異なるがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に結合し得る。
【0040】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、抗原またはそのペプチド抗原、例えば、がん及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原、例えば、配列番号１のＭＡＧＥ Ａ４、配列番号２を含むＭＡＧＥ Ａ４の抗原ペプチド、配列番号２０のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、または、ＡＦＰのペプチド抗原、またはＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むＡＦＰのペプチド抗原に、場合によっては表面プラズモン共鳴で、場合によっては２５℃で、場合によっては６．５～６．９または７．０～７．５のｐＨで測定して、０．０１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～５０μＭ、０．０１μＭ～２０μＭ、０．０５μΜ～２０μΜ、または０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１μΜ、０．１５μΜ、０．２μΜ、０．２５μΜ、０．３μΜ、０．３５μΜ、０．４μΜ、０．４５μΜ、０．５μΜ、０．５５μΜ、０．６μΜ、０．６５μΜ、０．７μΜ、０．７５μΜ、０．８μΜ、０．８５μΜ、０．９μΜ、０．９５μΜ、１．０μΜ、１．５μΜ、２．０μΜ、２．５μΜ、３．０μΜ、３．５μΜ、４．０μΜ、４．５μΜ、５．０μΜ、５．５μΜ、６．０μΜ、６．５μΜ、７．０μΜ、７．５μΜ、８．０μΜ、８．５μΜ、９．０μΜ、９．５μΜ、１０．０μΜ、または１０μΜ～１０００μΜ、１０μＭ～５００μΜ、５０μΜ～５００μΜまたは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μΜ、１５０μΜ、２００μΜ、２５０μΜ、３００μΜ、３５０μΜ、４００μΜ、４５０μΜ、５００μΜの解離定数で結合し得る。解離定数、ＫＤまたはｋｏｆｆ／ｋｏｎは、解離速度定数ｋｏｆｆ、及び会合速度定数ｋｏｎを実験によって測定することによって決定され得る。ＴＣＲ解離定数は、ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む、ＴＣＲの可溶性形態を使用して測定され得る。
【0041】
本発明によれば、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び／または異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変された細胞は、ペプチド提示分子、例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはＨＬＡ、場合によってはクラスＩまたはＩＩ、例えばＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２、もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０７から選択されるもの、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２との複合体の、またはそれらによって提示される、抗原またはそのペプチド抗原、例えば、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原に、例えば、本明細書に上述の、好ましくは５０μΜ、１００μΜ、２００μΜ、５００μΜなどの０．０１μΜ～１００μΜ、好ましくは０．０５μΜ～２０．０μΜの解離定数で特異的に、及び／または高い親和性で、及び／または選択的に結合し得る。
【0042】
本発明によれば、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び／または異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変された細胞は、場合によってはＨＬＡ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０７から選択されるＨＬＡ－Ａ＊０２、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１またはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体の、ＭＡＧＥ Ａ４（配列番号１）、そのペプチド抗原、または配列番号２ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを含むその抗原ペプチドに、例えば、本明細書に上述の、好ましくは５０μΜ、１００μΜ、２００μΜ、５００μΜなどの０．０１μΜ～１００μΜ、好ましくは０．０５μΜ～２０．０μΜの解離定数で特異的に、及び／または高い親和性で、及び／または選択的に結合し得る。
【0043】
本発明によれば、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び／または異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変された細胞は、場合によっては、ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２、もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０７から選択される任意のＨＬＡ、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２との複合体の、ＡＦＰ（配列番号２０）、そのペプチド抗原、または配列ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むペプチド抗原に、例えば、本明細書に上述の、好ましくは５０μΜ、１００μΜ、２００μΜ、５００μΜなどの０．０１μΜ～１００μΜ、好ましくは０．０５μΜ～２０．０μΜの解離定数で特異的に、及び／または高い親和性で、及び／または選択的に結合し得る。
【0044】
あるいは、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変された細胞は、抗原またはそのペプチド抗原に、例えば、内因的に発現されるがん及び／または腫瘍細胞表面抗原またはペプチド抗原（例えば、ＡＦＰもしくはＭＡＧＥ Ａ４、またはその抗原ペプチド）として本明細書に記載の、がん及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原に、例えば、本明細書に上述の、好ましくは、５０μΜ、１００μΜ、２００μΜ、５００μΜなどの０．０１μΜ～１００μΜ、好ましくは０．０５μΜ～２０．０μΜの解離定数で、結合し得るか、または特異的に及び／または選択的に結合し得、及び／または高い親和性で結合し得、場合によっては、結合が、ペプチド提示分子または抗原提示分子との複合体、例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）または主要組織適合複合体クラス関連タンパク質（ＭＲ）１としての、細胞表面抗原の提示に依存しない。
【0045】
本発明によれば、ＴＣＲ結合は、密接に関連するがん及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原配列と比較して、場合によってはがん及び／または腫瘍細胞表面上に発現される際に、１つの抗原またはそのペプチド抗原、例えば、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原（例えば、ＡＦＰもしくはＭＡＧＥ Ａ４またはその抗原ペプチド）に特異的であり得る。密接に関連するがん及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原配列は、同様のまたは同一の長さであり得、及び／または同様の数または同一の数のアミノ酸残基を有し得る。密接に関連するペプチド抗原配列は、５０または６０または７０または８０～９０％の同一性、好ましくは、８０～９０％の同一性を共有し得、及び／または１、２、３、または４つのアミノ酸残基が異なり得る。例えば、密接に関連するペプチド配列は、配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ、配列番号２、またはＦＭＮＫＦＩＹＥＩ、配列番号２１を含むかまたは有するポリペプチド配列に由来し得る。
【0046】
結合親和性は、平衡方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動態（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）によって決定され得る。アビディティは、例えば、相互作用の価数を考慮して、複数の部位において２つの分子が互いに結合する強度の合計である。本発明によれば、改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、異種ＴＣＲを欠く細胞または代替的な異種ＴＣＲもしくはＣＡＲを有する細胞と比較して、がん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原、またはがん細胞もしくは組織の腫瘍によって提示され、異種ＴＣＲによって認識されるがん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原に対する改善された親和性及び／またはアビディティを示し得る。
【0047】
選択的結合は、異種ＴＣＲが、別のものと比較して、１つのがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に対してより高い親和性で結合することを示す。選択的結合は、異種ＴＣＲとの複合体における別のリガンド抗原の１つのリガンド抗原による置き換えについての平衡定数によって示される。
【0048】
異種ＴＣＲ
本発明によれば、細胞ゲノムにおける遺伝子座に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。抗原に結合すると、改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、抗原を担持する細胞に対してＴ細胞エフェクター機能及び／または細胞溶解作用を呈し得、及び／または増殖及び／または細胞分裂を行い得る。ある特定の実施形態では、ＴＣＲを含む改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、同じがん及び／または腫瘍抗原及び／またはペプチド（抗原ペプチド）を標的とする形質導入されたＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のいずれかを含むＴ細胞と比較して、同等またはより良好な治療効力を呈する。活性化された改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、限定されないが、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮｙ、及びＩＬ２を含み得る、抗腫瘍サイトカインを分泌し得る。
本発明によれば、細胞ゲノムにおける遺伝子座に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。抗原に結合すると、改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、抗原を担持する細胞に対してＴ細胞エフェクター機能及び／または細胞溶解作用を呈し得、及び／または増殖及び／または細胞分裂を行い得る。ある特定の実施形態では、ＴＣＲを含む改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、同じがん及び／または腫瘍抗原及び／またはペプチド（抗原ペプチド）を標的とする形質導入されたＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のいずれかを含むＴ細胞と比較して、同等またはより良好な治療効力を呈する。活性化された改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、限定されないが、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮｙ、及びＩＬ２を含み得る、抗腫瘍サイトカインを分泌し得る。
【0049】
「異種」または「外因性」という用語は、細胞または宿主細胞などの特定の生物学的系にとって外来のものであり、その系において自然に存在せず、人工的または組換え的手段によって系に導入され得るポリペプチドまたは核酸を指す。したがって、異種であるＴＣＲの発現は、それによって、多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞、例えば、Ｔ細胞の免疫原性の特異性を変化させ得るので、それらは、がんを有する個体のがん細胞の表面上に存在する、本明細書に記載の１つ以上の腫瘍またはがん抗原及び／またはペプチドを認識し、それらの改善された認識を示す。免疫原性細胞またはＴ細胞の改変及びその後の増殖は、インビトロ及び／またはエクスビボで実施され得る。
【0050】
ＴＣＲ構造
好ましくは、異種ＴＣＲは、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞によって、自然に、すなわち改変前に、または内因的に発現しない（すなわち、ＴＣＲは外因性または異種である）。異種ＴＣＲは、αβＴＣＲヘテロ二量体を含み得る。異種ＴＣＲは、組換えまたは合成または人工的ＴＣＲ、すなわち、自然に存在しないＴＣＲであり得る。例えば、異種ＴＣＲは、特定のがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に対するその親和性またはアビディティを増加させるように操作され得る（すなわち、親和性が向上されたＴＣＲまたは親和性が向上された特定のペプチド受容体（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲ）。親和性が向上されたＴＣＲまたは（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲは、自然に存在するＴＣＲと比較して１つ以上の変異、例えば、ＴＣＲα及びβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）における１つ以上の変異を含み得る。これらの変異は、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に対する、または場合によっては、腫瘍及び／またはがん細胞によって発現される場合、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原を示すＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させることができる。親和性が向上されたかまたは成熟したＴＣＲを生成する好適な方法は、ファージまたは酵母ディスプレイを使用するＴＣＲ変異体のライブラリーをスクリーニングすることを含み、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）１８０（９）：６１１６、Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８（３）２８１－２８３、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２ ３４８－２５６、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５ ９０１）を参照されたい）。親和性が向上された好ましいＴＣＲは、本明細書に記載のＭＡＧＥファミリーの腫瘍抗原、またはＡＦＰもしくはそのペプチド抗原を発現している腫瘍またはがん細胞に結合し得る。
好ましくは、異種ＴＣＲは、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞によって、自然に、すなわち改変前に、または内因的に発現しない（すなわち、ＴＣＲは外因性または異種である）。異種ＴＣＲは、αβＴＣＲヘテロ二量体を含み得る。異種ＴＣＲは、組換えまたは合成または人工的ＴＣＲ、すなわち、自然に存在しないＴＣＲであり得る。例えば、異種ＴＣＲは、特定のがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に対するその親和性またはアビディティを増加させるように操作され得る（すなわち、親和性が向上されたＴＣＲまたは親和性が向上された特定のペプチド受容体（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲ）。親和性が向上されたＴＣＲまたは（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲは、自然に存在するＴＣＲと比較して１つ以上の変異、例えば、ＴＣＲα及びβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）における１つ以上の変異を含み得る。これらの変異は、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原に対する、または場合によっては、腫瘍及び／またはがん細胞によって発現される場合、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原またはそのペプチド抗原を示すＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させることができる。親和性が向上されたかまたは成熟したＴＣＲを生成する好適な方法は、ファージまたは酵母ディスプレイを使用するＴＣＲ変異体のライブラリーをスクリーニングすることを含み、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）１８０（９）：６１１６、Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８（３）２８１－２８３、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２ ３４８－２５６、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５ ９０１）を参照されたい）。親和性が向上された好ましいＴＣＲは、本明細書に記載のＭＡＧＥファミリーの腫瘍抗原、またはＡＦＰもしくはそのペプチド抗原を発現している腫瘍またはがん細胞に結合し得る。
【0051】
ＭＡＧＥＡ４／ＡＦＰ ＴＣＲ
本発明によれば、異種ＴＣＲは、配列番号５のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、配列番号７のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、を含み得る、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲであり得る。あるいは、異種ＴＣＲは、配列番号２２のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、配列番号２３のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、を含み得る、ＡＦＰ ＴＣＲであり得る。
本発明によれば、異種ＴＣＲは、配列番号５のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、配列番号７のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、を含み得る、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲであり得る。あるいは、異種ＴＣＲは、配列番号２２のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、配列番号２３のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと、を含み得る、ＡＦＰ ＴＣＲであり得る。
【0052】
バリアントは、参照アミノ酸配列に対して（例えば、α鎖参照配列及び／またはβ鎖参照配列のいずれかに関して）少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＴＣＲは、配列番号６のα鎖参照ヌクレオチド配列もしくはそのバリアント、及び配列番号８のβ鎖参照ヌクレオチド配列もしくはそのバリアント（ＭＡＧＥ Ａ４）、または配列番号２４のα鎖参照ヌクレオチド配列もしくはそのバリアント、及び配列番号２５のβ鎖参照ヌクレオチド配列（ＡＦＰ）もしくはそのバリアントによってコードされ得る。バリアントは、参照ヌクレオチド酸配列に対して（例えば、ＡＦＰまたはＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲのα鎖参照配列及び／またはβ鎖参照配列のいずれかに関して）少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列を有し得る。
【0053】
ＴＣＲ ＣＤＲ
本発明によれば、例えば、ＭＡＧＥ Ａ４では、異種ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み得、
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含み、
ＶＳＰＦＳＮ（αＣＤＲ１）、配列番号１１、もしくは配列番号５のアミノ酸４８～５３、
ＬＴＦＳＥＮ（αＣＤＲ２）、配列番号１２、もしくは配列番号５のアミノ酸７１～７６、及び
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ（αＣＤＲ３）、配列番号１３、もしくは配列番号５のアミノ酸１１１～１２５、及び／または
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含む
ＫＧＨＤＲ（βＣＤＲ１）、配列番号１４、もしくは配列番号７のアミノ酸４６～５０、
ＳＦＤＶＫＤ（βＣＤＲ２）、配列番号１５、もしくは配列番号７のアミノ酸６８～７３、及び
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ（βＣＤＲ３）、配列番号１６、もしくは配列番号７のアミノ酸１１０～１２３、もしくはそれに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、場合によってはそれに対してそれぞれ１００％の配列同一性を有する配列。
本発明によれば、例えば、ＭＡＧＥ Ａ４では、異種ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み得、
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含み、
ＶＳＰＦＳＮ（αＣＤＲ１）、配列番号１１、もしくは配列番号５のアミノ酸４８～５３、
ＬＴＦＳＥＮ（αＣＤＲ２）、配列番号１２、もしくは配列番号５のアミノ酸７１～７６、及び
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ（αＣＤＲ３）、配列番号１３、もしくは配列番号５のアミノ酸１１１～１２５、及び／または
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含む
ＫＧＨＤＲ（βＣＤＲ１）、配列番号１４、もしくは配列番号７のアミノ酸４６～５０、
ＳＦＤＶＫＤ（βＣＤＲ２）、配列番号１５、もしくは配列番号７のアミノ酸６８～７３、及び
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ（βＣＤＲ３）、配列番号１６、もしくは配列番号７のアミノ酸１１０～１２３、もしくはそれに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、場合によってはそれに対してそれぞれ１００％の配列同一性を有する配列。
【0054】
本発明によれば、例えば、ＡＦＰでは、異種ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み得、
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインが、配列を有するＣＤＲを含み、
配列番号２６、または配列番号２２のアミノ酸２７～３２、またはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、
配列番号２７、または配列番号２２のアミノ酸５０～５５、またはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、及び
配列番号２８、または配列番号２２のアミノ酸９０～１０１、またはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、ならびに
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含む
配列番号２９、または配列番号２３のアミノ酸２７～３１、またはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、
配列番号３０、または配列番号２３のアミノ酸４９～５４、またはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、及び
配列番号３１、または配列番号２３のアミノ酸９２～１０２、またはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列；場合によっては、配列同一性は、それぞれ少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、場合によっては１００％の配列同一性のうちのいずれかであり得る。
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインが、配列を有するＣＤＲを含み、
【化1】
【化2】
【化3】
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含む
【化4】
【化5】
【化6】
【0055】
ＴＣＲ可変ドメイン
本発明によれば、異種ＴＣＲは、アルファ鎖可変ドメインが、配列番号９、もしくは配列番号５のアミノ酸残基１～１３６の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／またはベータ鎖可変ドメインが、配列番号１０、もしくは配列番号７のアミノ酸残基１～１３３の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９６％、９７％、９８％、または９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲ、例えば、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲを含み得る。
本発明によれば、異種ＴＣＲは、アルファ鎖可変ドメインが、配列番号９、もしくは配列番号５のアミノ酸残基１～１３６の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／またはベータ鎖可変ドメインが、配列番号１０、もしくは配列番号７のアミノ酸残基１～１３３の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９６％、９７％、９８％、または９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲ、例えば、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲを含み得る。
【0056】
本発明によれば、異種ＴＣＲ、例えば、ＡＦＰ ＴＣＲは、アルファ鎖可変ドメインが、配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／またはベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３のアミノ酸残基１～１１２の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９６％、９７％、９８％、または９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0057】
ＭＡＧＥ Ａ４＆ＡＦＰ ＴＣＲ ＣＤＲ及びフレームワーク
「前駆ＴＣＲ」または「親ＴＣＲ」という用語は、本明細書において、配列番号５及び７のＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖及びＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖をそれぞれ含むＴＣＲ、または配列番号２２及び２３のＡＦＰ ＴＣＲα鎖及びＡＦＰ ＴＣＲβ鎖をそれぞれ含むＴＣＲを指すために使用される。
「前駆ＴＣＲ」または「親ＴＣＲ」という用語は、本明細書において、配列番号５及び７のＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖及びＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖をそれぞれ含むＴＣＲ、または配列番号２２及び２３のＡＦＰ ＴＣＲα鎖及びＡＦＰ ＴＣＲβ鎖をそれぞれ含むＴＣＲを指すために使用される。
【0058】
ペプチド－ＨＬＡ複合体では、前駆ＴＣＲと比較して、同等、等価、もしくはより高い親和性を有し、及び／または同等、等価、もしくは前駆ＴＣＲよりも遅いオフレートを有する、変異または改変された異種ＴＣＲを提供することが望ましい。本発明によれば、異種ＴＣＲは、前駆ＴＣＲと比較して、アルファ鎖可変ドメイン及び／またはベータ鎖可変ドメインに存在する２つ以上の変異を有し得、「操作されたＴＣＲ」または「変異ＴＣＲ」と示され得る。これらの変異（複数可）は、標的ＡＦＰもしくはＭＡＧＥ Ａ４またはそのペプチド抗原に対する結合親和性及び／または特異性及び／または選択性及び／またはアビディティを改善し得る。ある特定の実施形態では、アルファ鎖可変ドメインに、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの変異、例えば４もしくは８つの変異、及び／またはベータ鎖可変ドメインに、１、２、３、４、もしくは５つの変異、例えば５つの変異が存在する。いくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号９（ＭＡＧＥ Ａ４）のアミノ酸残基または配列番号２２（ＡＦＰ）のアミノ酸１～１１２の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号１０（ＭＡＧＥ Ａ４）のアミノ酸残基または配列番号２３（ＡＦＰ）のアミノ酸１～１１２の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0059】
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えば、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ）は、アルファ鎖可変ドメインが、配列番号９、または配列番号５のアミノ酸残基１～１３６のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１～４７、５４～７０、７７～１１０、及び１２６～１３６がそれぞれ、配列番号９のアミノ酸残基１～４７、５４～７０、７７～１１０、及び１２６～１３６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有し、及び／またはアミノ酸残基４８～５３、７１～７６、及び１１１～１２５、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、それぞれ配列番号９のアミノ酸残基４８～５３、７１～７６、及び１１１～１２５、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0060】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、アルファ鎖可変ドメインにおいて、以下の配列が、以下のとおりである、ＴＣＲを含み得る：
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４７が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基１～４７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号９の残基１～４７と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基４８～５３が、ＶＳＰＦＳＮ、ＣＤＲ１、配列番号１１、または配列番号９のアミノ酸４８～５３であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７０が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基７１～７６が、ＬＴＦＳＥＮ、ＣＤＲ２、配列番号１２、または配列番号９のアミノ酸７１～７６であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基７７～１１０が、配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸１１１～１２５が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ、ＣＤＲ３、配列番号１３、または配列番号９のアミノ酸１１１～１２５であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２６～１３６が、配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４７が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基１～４７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号９の残基１～４７と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基４８～５３が、ＶＳＰＦＳＮ、ＣＤＲ１、配列番号１１、または配列番号９のアミノ酸４８～５３であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７０が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基７１～７６が、ＬＴＦＳＥＮ、ＣＤＲ２、配列番号１２、または配列番号９のアミノ酸７１～７６であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基７７～１１０が、配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸１１１～１２５が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ、ＣＤＲ３、配列番号１３、または配列番号９のアミノ酸１１１～１２５であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２６～１３６が、配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
【0061】
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えば、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ）は、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１～４５、５１～６７、７４～１０９、及び１２４～１３３が、それぞれ配列番号１０のアミノ酸残基１～４５、５１～６７、７４～１０９、及び１２４～１３３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基４６～５０、６８～７３、及び１１０～１２３が、それぞれ配列番号１０のアミノ酸残基４６～５０、６８～７３、及び１１０～１２３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0062】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、ベータ鎖可変ドメインにおいて、以下の配列が、以下のとおりである、ＴＣＲを含み得る：
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４５が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基１～４５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号１０の残基１～４５と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０が、ＫＧＨＤＲ、ＣＤＲ１、配列番号１４、または配列番号１０のアミノ酸４６～５０であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７３が、ＳＦＤＶＫＤ、ＣＤＲ２、配列番号１５、または配列番号１０のアミノ酸６８～７３であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基７４～１０９が、配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列と比較して、１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸１１０～１２３が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ、ＣＤＲ３、配列番号１６、または配列番号１０のアミノ酸１１０～１２３であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３３が、配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４５が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基１～４５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号１０の残基１～４５と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０が、ＫＧＨＤＲ、ＣＤＲ１、配列番号１４、または配列番号１０のアミノ酸４６～５０であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７３が、ＳＦＤＶＫＤ、ＣＤＲ２、配列番号１５、または配列番号１０のアミノ酸６８～７３であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基７４～１０９が、配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列と比較して、１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸１１０～１２３が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ、ＣＤＲ３、配列番号１６、または配列番号１０のアミノ酸１１０～１２３であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３３が、配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
【0063】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、配列番号９のアルファ鎖可変ドメイン及び／または配列番号１０のベータ鎖可変ドメインを含む、ＴＣＲを含み得る。本発明によれば、ＴＣＲは、配列番号５のアルファ鎖及び／または配列番号７のベータ鎖を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0064】
ＡＦＰ ＴＣＲ ＣＤＲ及びフレームワーク
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、アルファ鎖可変ドメインが、配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２が、それぞれ配列番号２２のアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有し、及び／またはアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、それぞれ配列番号２２のアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列に対してそれぞれ少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、アルファ鎖可変ドメインが、配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２が、それぞれ配列番号２２のアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有し、及び／またはアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、それぞれ配列番号２２のアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列に対してそれぞれ少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0065】
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、アルファ鎖可変ドメインにおいて、以下の配列が、以下のとおりである、ＴＣＲを含み得る：
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２の残基１～２６と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３２が、
αＣＤＲ１、配列番号２６、または配列番号２２のアミノ酸２７～３２であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３～４９が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基５０～５５が、
αＣＤＲ２、配列番号２７、または配列番号２２のアミノ酸５０～５５であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基５６～８９が、配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸９０～１０１が、
αＣＤＲ３、配列番号２８、または配列番号２２のアミノ酸９０～１０１であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１０２～１１２が、配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２の残基１～２６と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３２が、
【化7】
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３～４９が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基５０～５５が、
【化8】
（ｖ）そのアミノ酸残基５６～８９が、配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸９０～１０１が、
【化9】
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１０２～１１２が、配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
【0066】
本発明によれば、ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３のアミノ酸残基１～１１２のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１～２６、３２～４８、５５～９１、及び１０３～１１２が、それぞれ配列番号２３のアミノ酸残基１～２６、３２～４８、５５～９１、及び１０３～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７～３１、４９～５４、及び９２～１０２がそれぞれ、それぞれ配列番号２３のアミノ酸残基２７～３１、４９～５４、及び９２～１０２、βＣＤＲ１、βＣＤＲ２、βＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0067】
本発明によれば、ＴＣＲは、ベータ鎖可変ドメインにおいて、以下の配列が、以下のとおりである、ＴＣＲを含み得る：
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３の残基１～２６と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３１が、
βＣＤＲ１、配列番号２９、または配列番号２３のアミノ酸２７～３１であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３２～４８が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基４９～５４が、
βＣＤＲ２、配列番号３０、または配列番号２３のアミノ酸４９～５４であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基５５～９１が、配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸９２～１０２が、
βＣＤＲ３、配列番号３１、または配列番号２３のアミノ酸９２～１０２であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１０３～１１２が、配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３の残基１～２６と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３１が、
【化10】
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３２～４８が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基４９～５４が、
【化11】
（ｖ）そのアミノ酸残基５５～９１が、配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸９２～１０２が、
【化12】
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１０３～１１２が、配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
【0068】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、アルファ鎖が、配列番号４１のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３または配列番号４２のアミノ酸残基を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0069】
変異体ＡＦＰ ＴＣＲ
本発明の実施形態は、親ＡＦＰ ＴＣＲ（アルファ鎖が、配列番号２２のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３のアミノ酸残基を含む）、またはアルファ鎖が、配列番号４１のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３または配列番号４２のアミノ酸残基を含む、ＡＦＰ ＴＣＲと比較して変異した異種ＴＣＲを含み得る。
本発明の実施形態は、親ＡＦＰ ＴＣＲ（アルファ鎖が、配列番号２２のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３のアミノ酸残基を含む）、またはアルファ鎖が、配列番号４１のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３または配列番号４２のアミノ酸残基を含む、ＡＦＰ ＴＣＲと比較して変異した異種ＴＣＲを含み得る。
【0070】
したがって、そのような変異した異種ＴＣＲは、以下を含み得る：
ａ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１、配列番号３２
ｂ．配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３３
ｃ．配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３４
ｄ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１、配列番号３２、及び配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３４
ｅ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３５
ｆ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３６
ｇ．配列ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号４０
ｈ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１、配列番号３２、及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３５
ｉ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＶＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３６
ｊ．配列ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３７
ｋ．配列ＤＲＧＳＦＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３８
ｌ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９
ｍ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９、及びＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３３、
ｎ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９、及び配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３３
ｏ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９、及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３５
ａ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１、配列番号３２
ｂ．配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３３
ｃ．配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３４
ｄ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１、配列番号３２、及び配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３４
ｅ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３５
ｆ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３６
ｇ．配列ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号４０
ｈ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１、配列番号３２、及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３５
ｉ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＶＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３６
ｊ．配列ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３７
ｋ．配列ＤＲＧＳＦＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３８
ｌ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９
ｍ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９、及びＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３３、
ｎ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９、及び配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３３
ｏ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１、配列番号３９、及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦを有するαＣＤＲ２、配列番号３５
【0071】
本発明によれば、異種ＴＣＲまたは異種変異ＴＣＲは、以下に対応するアミノ酸のうちの１つ以上に変異を含むアルファ鎖可変ドメインを含み得る：配列番号２２に示される付番を参照して、３１Ｑ、３２Ｓ、９４Ｄ、９５Ｓ、９６Ｇ、９７Ｙ、及び９８Ａ。例えば、アルファ鎖可変ドメインは、以下の変異のうちの１つ以上を有し得る：配列番号２２に示される付番に従って、Ｑ３１Ｆ／Ｙ、Ｓ３２Ａ、Ｄ９４Ｑ、Ｓ９５Ｎ、Ｇ９６Ｓ、Ｙ９７Ｖ、Ａ９８Ｓ。
【0072】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、配列番号２２のＴＣＲアルファ鎖可変ドメインを含み得るが、それは、以下に対応するアミノ酸のうちの１つ以上に変異を含む：配列番号２２に示される付番に従って、３１Ｑ、３２Ｓ、９４Ｄ、９５Ｓ、９６Ｇ、９７Ｙ、及び９８Ａ、例えば、Ｑ３１Ｆ／Ｙ、Ｓ３２Ａ、Ｄ９４Ｑ、Ｓ９５Ｎ、Ｇ９６Ｓ、Ｙ９７Ｖ、Ａ９８Ｓのうちの１つ以上、及び／または配列番号２３もしくは配列番号４２のＤ１～Ｔ１１２を含むベータ鎖可変ドメイン。
【0073】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み得、
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインは、以下の配列を有するＣＤＲを含み、
配列番号３２、または配列番号４１のアミノ酸２７～３２、
配列番号２７、または配列番号２２のアミノ酸５０～５５、及び
配列番号３５、または配列番号４１のアミノ酸９０～１０１、
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含む
配列番号２９、または配列番号２３のアミノ酸２７～３１、
配列番号３０、または配列番号２３のアミノ酸４９～５４、及び
配列番号３１、または配列番号２３のアミノ酸９２～１０２。
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインは、以下の配列を有するＣＤＲを含み、
【化13】
【化14】
【化15】
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインが、以下の配列を有するＣＤＲを含む
【化16】
【化17】
【化18】
【0074】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、アルファ鎖可変ドメインが、配列番号４１のアミノ酸残基１～１１２を含み、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号３３または配列番号４２のアミノ酸残基１～１１２を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0075】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、アルファ鎖が、配列番号４１のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが、配列番号３３または配列番号４２のアミノ酸残基１～１１２を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0076】
ＴＣＲバリアント
アミノ酸及びヌクレオチド配列同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（商標），Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を参照して定義される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を使用して２つの完全な配列を整列させ、これによって一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般に、ギャップ作成ペナルティ＝１２、及びギャップ伸長ペナルティ＝４のデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ、またはＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）、または一般にデフォルトパラメータを用いるＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）が使用され得る。
アミノ酸及びヌクレオチド配列同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（商標），Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を参照して定義される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を使用して２つの完全な配列を整列させ、これによって一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般に、ギャップ作成ペナルティ＝１２、及びギャップ伸長ペナルティ＝４のデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ、またはＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）、または一般にデフォルトパラメータを用いるＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）が使用され得る。
【0077】
特定のアミノ酸配列バリアントは、１つのアミノ酸、２、３、４、５～１０、１０～２０、または２０～３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換、または欠失によって、参照配列とは異なり得る。いくつかの実施形態では、バリアント配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の残基を挿入、欠失、または置換した参照配列を含み得る。例えば、最大１５、最大２０、最大３０、または最大４０個の残基が、挿入、欠失、または置換され得る。
【0078】
いくつかの好ましい実施形態では、バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の保存的置換によって、参照配列とは異なり得る。保存的置換は、同様の特性を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを伴う。例えば、脂肪族残基は、別の脂肪族残基によって置き換えられ得るか、非極性残基は、別の非極性残基によって置き換えられ得るか、酸性残基は、別の酸性残基によって置き換えられ得るか、塩基性残基は、別の塩基性残基によって置き換えられ得るか、極性残基は、別の極性残基によって置き換えられ得るか、または芳香族残基は、別の芳香族残基によって置き換えられ得る。保存的置換は、例えば、以下の基内のアミノ酸間であり得る：
アラニン及びグリシン；
グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、及びアスパラギン；
アルギニン及びリジン；
アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸
イソロイシン、ロイシン及びバリン；
フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
セリン、スレオニン、及びシステイン。
アラニン及びグリシン；
グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、及びアスパラギン；
アルギニン及びリジン；
アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸
イソロイシン、ロイシン及びバリン；
フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
セリン、スレオニン、及びシステイン。
【0079】
ＣＤ８α共受容体
本発明によれば、細胞ゲノムにおける遺伝子座に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含み、及び／または本発明による異種ＴＣＲを発現または提示する改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、異種共受容体を更に発現または提示し得る（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、共受容体をコードする核酸、例えばＣＤ８共受容体で形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。異種共受容体は、ＣＤ８共受容体であり得る。ＣＤ８共受容体は、ＣＤ８－α及びＣＤ８－β鎖、またはＣＤ８－α及びＣＤ８－α鎖を含む、ＣＤ８鎖の二量体または対を含み得る。好ましくは、ＣＤ８共受容体は、ＣＤ８－α及びＣＤ８－α鎖を含むＣＤ８αα共受容体である。ＣＤ８α共受容体は、配列番号３、配列番号３、またはそのバリアントに対して少なくとも８０％の同一性のアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ８α共受容体は、ホモ二量体であり得る。
本発明によれば、細胞ゲノムにおける遺伝子座に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含み、及び／または本発明による異種ＴＣＲを発現または提示する改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、異種共受容体を更に発現または提示し得る（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、共受容体をコードする核酸、例えばＣＤ８共受容体で形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。異種共受容体は、ＣＤ８共受容体であり得る。ＣＤ８共受容体は、ＣＤ８－α及びＣＤ８－β鎖、またはＣＤ８－α及びＣＤ８－α鎖を含む、ＣＤ８鎖の二量体または対を含み得る。好ましくは、ＣＤ８共受容体は、ＣＤ８－α及びＣＤ８－α鎖を含むＣＤ８αα共受容体である。ＣＤ８α共受容体は、配列番号３、配列番号３、またはそのバリアントに対して少なくとも８０％の同一性のアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ８α共受容体は、ホモ二量体であり得る。
【0080】
好ましくは、ＣＤ８共受容体は、クラス１のＭＨＣに結合し、ＴＣＲシグナル伝達を強化する。本発明によれば、ＣＤ８共受容体は、配列番号３の参照アミノ酸配列を含み得るか、またはそのバリアントであり得る。バリアントは、参照アミノ酸配列配列番号３に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＣＤ８共受容体は、配列番号４の参照ヌクレオチド配列によってコードされ得るか、またはそのバリアントであり得る。バリアントは、参照ヌクレオチド配列配列番号４に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。
【0081】
本発明によれば、異種ＣＤ８共受容体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインに以下の配列を有するＣＤＲを含む、ＣＤ８共受容体を含み得る：
（ｉ）ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、ＣＤＲ１、配列番号１７、もしくは配列番号３のアミノ酸４５～５３、
（ｉｉ）ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２、配列番号１８、もしくは配列番号３のアミノ酸７２～７９、
（ｉｉｉ）ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３、配列番号１９、もしくは配列番号３のアミノ酸８０～１１７、
または、それらに対して、それぞれ少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列。
（ｉ）ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、ＣＤＲ１、配列番号１７、もしくは配列番号３のアミノ酸４５～５３、
（ｉｉ）ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２、配列番号１８、もしくは配列番号３のアミノ酸７２～７９、
（ｉｉｉ）ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３、配列番号１９、もしくは配列番号３のアミノ酸８０～１１７、
または、それらに対して、それぞれ少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列。
【0082】
本発明によれば、異種ＣＤ８共受容体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインに配列番号３のアミノ酸配列の残基２２～１３５、またはそのアミノ酸残基２２～４４、５４～７１、８０～１１７、１２４～１３５が、それぞれ配列番号３のアミノ酸残基２２～４４、５４～７１、８０～１１７、１２４～１３５、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し、それぞれアミノ酸残基４５～５３、７２～７９、及び１１８～１２３が、配列番号３のアミノ酸残基４５～５３、７２～７９、及び１１８～１２３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む、ＣＤ８共受容体を含み得る。
【0083】
本発明によれば、ＣＤ８共受容体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインに以下の配列を有する、ＣＤ８共受容体を含み得る：
（ｉ）そのアミノ酸残基２２～４４が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基２２～４４の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３の残基２２～４４と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基４５～５３が、ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、配列番号１７、ＣＤＲ１、または配列番号３のアミノ酸４５～５３であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７１が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基７２～７９が、ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２、配列番号１８、または配列番号３のアミノ酸７２～７９であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基８０～１１７が、配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列と比較して、１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸１１８～１２３が、ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３、配列番号１９、または配列番号３のアミノ酸８０～１１７であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３５が、配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基２２～４４が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基２２～４４の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３の残基２２～４４と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｉ）アミノ酸残基４５～５３が、ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、配列番号１７、ＣＤＲ１、または配列番号３のアミノ酸４５～５３であり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７１が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列と比較して、１、２、もしくは３つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失され得、
（ｉｖ）アミノ酸残基７２～７９が、ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２、配列番号１８、または配列番号３のアミノ酸７２～７９であり得、
（ｖ）そのアミノ酸残基８０～１１７が、配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列と比較して、１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得、
（ｖｉ）アミノ酸１１８～１２３が、ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３、配列番号１９、または配列番号３のアミノ酸８０～１１７であり得、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３５が、配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または、配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列と比較して、１、２、または３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る。
【0084】
異種ＣＤ８共受容体をコードする核酸を含む、及び／または異種ＣＤ８共受容体を発現する改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、本明細書に開示のアッセイによって決定可能であるように、異種ＣＤ８共受容体を発現しない改変された細胞（例えば、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞）と比較して、場合によっては、ＨＬＡに存在する場合、抗原ペプチド、腫瘍、またはがん抗原による刺激に対してまたはその刺激の際に改善された親和性及び／またはアビディティ及び／または改善されたＴ細胞活性化を示し得る。改変された細胞の異種ＣＤ８は、ＭＨＣと相互作用するかまたは特異的に結合し得、ＭＨＣは、クラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、ＨＬＡ－Ｉ分子、またはＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ／Ｂ２Ｍ二量体を含むＨＬＡ－Ｉ分子であり得、好ましくはＣＤ８－αは、好ましくはＣＤ８のＩｇＶ様ドメインを介して、クラスＩ ＭＨＣのα３部分（残基２２３と２２９との間）と相互作用する。したがって、異種ＣＤ８は、異種ＣＤ８を欠く細胞と比較して、場合によっては、抗原提示細胞、樹状細胞、及び／または腫瘍もしくはがん細胞、腫瘍もしくはがん組織の表面上での、ＨＬＡ ｐＭＨＣＩまたはｐＨＬＡによって結合または提示される、ＨＬＡ及び／または抗原ペプチドへの細胞のＴＣＲ結合を改善する。したがって、異種ＣＤ８は、異種ＣＤ８を欠く細胞（ｉＰＳＣまたは造血系細胞）と比較して、場合によっては、抗原提示細胞、樹状細胞、及び／または腫瘍もしくはがん細胞、または腫瘍もしくはがん組織の表面上での、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞の、細胞（ＴＣＲ）／ペプチド－主要組織適合複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）相互作用のオフレート（ｋｏｆｆ）、したがって、その半減期を改善または増加させ得、それによって、改善されたライゲーション親和性及び／またはアビディティをも提供し得る。異種ＣＤ８は、幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞表面上でのＴＣＲの組織化を改善して、ｐＨＬＡ結合における協働性を可能し得、改善された治療的アビディティを提供し得る。したがって、異種ＣＤ８共受容体、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣ、または造血系細胞は、亜鉛依存的な様式でＬＣＫ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）に結合またはそれと相互作用して、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、及びＡＰ－１のような転写因子の活性化をもたらし得る。
【0085】
本発明によれば、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、異種ＣＤ８共受容体を欠く多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞と比較して、場合によっては、腫瘍のがん細胞または組織によって提示される、場合によっては、がん、及び／または腫瘍抗原、またはそのペプチド抗原に応答して、改善または増加された、ＣＤ４０Ｌの発現、サイトカイン産生、細胞毒性活性、樹状細胞成熟の誘導、または樹状細胞サイトカイン産生の誘導を有し得る。
【0086】
共刺激リガンド
本発明によれば、改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、外因性または異種または組換え共刺激リガンド、少なくとも１つの共刺激リガンドを、場合によっては１、２、３、または４つ更に含み得る（例えば、発現し得るかまたは提示し得る）（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、共刺激リガンドをコードする核酸で形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。改変された細胞または複数の細胞は、異種ＴＣＲ及び少なくとも１つの外因性共刺激リガンドを同時発現し得る。異種ＴＣＲと少なくとも１つの外因性共刺激リガンドとの間の相互作用は、非抗原特異的シグナル及び細胞の活性化を提供し得る。共刺激リガンドとしては、限定されないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバー、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのリガンドが挙げられる。ＴＮＦは、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとしては、限定されないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤｌ５４、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ－アルファ、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦＰ）／リンフォトキシン－アルファ（ＬＴａ）、リンフォトキシン－ベータ（ＴＴｂ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ－ｌ、グルコルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられる。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合、または接着プロセスに関与する、細胞表面タンパク質及び可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンドメイン（フォールド）を有する免疫グロブリンと、構造的特色を共有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとしては、限定されないが、ＣＤ２８の両方のリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６が挙げられる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２７５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。少なくとも１つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬまたはＣＤ８０であり得、好ましくは、少なくとも１つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬである。改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、２つの外因性または組換え共刺激リガンドを含み得、好ましくは、２つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ及びＣＤ８０である。
本発明によれば、改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、外因性または異種または組換え共刺激リガンド、少なくとも１つの共刺激リガンドを、場合によっては１、２、３、または４つ更に含み得る（例えば、発現し得るかまたは提示し得る）（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、共刺激リガンドをコードする核酸で形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。改変された細胞または複数の細胞は、異種ＴＣＲ及び少なくとも１つの外因性共刺激リガンドを同時発現し得る。異種ＴＣＲと少なくとも１つの外因性共刺激リガンドとの間の相互作用は、非抗原特異的シグナル及び細胞の活性化を提供し得る。共刺激リガンドとしては、限定されないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバー、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのリガンドが挙げられる。ＴＮＦは、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとしては、限定されないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤｌ５４、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ－アルファ、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦＰ）／リンフォトキシン－アルファ（ＬＴａ）、リンフォトキシン－ベータ（ＴＴｂ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ－ｌ、グルコルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられる。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合、または接着プロセスに関与する、細胞表面タンパク質及び可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンドメイン（フォールド）を有する免疫グロブリンと、構造的特色を共有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとしては、限定されないが、ＣＤ２８の両方のリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６が挙げられる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２７５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。少なくとも１つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬまたはＣＤ８０であり得、好ましくは、少なくとも１つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬである。改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞は、２つの外因性または組換え共刺激リガンドを含み得、好ましくは、２つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ及びＣＤ８０である。
【0087】
改変された細胞は、免疫抑制性腫瘍微小環境を克服する外因性のまたは組換えられた、少なくとも１つの構築物を含み得る（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、少なくとも１つの構築物をコードする核酸で形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。そのような構築物は、限定されないが、環式ＡＭＰホスホジエステラーゼ及び優性－劣性形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）受容体ＩＩであり得る。改変された幹細胞ｉＰＳＣ、または造血系細胞、改変されたＴ細胞、または改変されたＴ細胞の集団は、当該細胞の細胞溶解活性に正の効果を有するサイトカインを放出するように操作され得る。そのようなサイトカインとしては、限定されないが、インターロイキン－７、インターロイキン－１５、及びインターロイキン－２１が挙げられる。
【0088】
細胞機能及び活性化
本発明は、ｉＰＳＣまたは造血系細胞及び／または異種ＴＣＲの、抗原またはペプチド抗原、例えば、がん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原、または本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原を発現もしくは提示するがん及び／または腫瘍細胞もしくは組織に結合することが、場合によっては、以下のうちのいずれか１つ以上によって決定される、ｉＰＳＣまたは造血系細胞の活性化及び／または機能を誘導することができる、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する：
（ａ）Ｔ細胞活性化マーカー、例えばＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及び／またはＣＤ２５のいずれかのアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生のアップレギュレーション、例えばＩＦＮガンマ、ＩＬ－２または、グランザイムＢのいずれか１つ以上、
（ｃ）抗原もしくは抗原ペプチドの存在下での細胞毒性活性の誘導、
（ｄ）抗原もしくは抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞を死滅させる能力、
（ｅ）サイトカイン及び／またはインターフェロンのｉＰＳＣまたは造血系細胞分泌の増加、
（ｆ）例えば、細胞マーカーによって判定される（例えば、Ｋｉ６７発現レベルによって判定される）、ｉＰＳＣもしくは造血系細胞増殖の増加、
（ｇ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞抗原応答性の増加、
（ｈ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の標的細胞の死滅の増加、
（ｉ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞のＣＤ２８シグナル伝達の増加、
（ｊ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の腫瘍に浸潤する能力の増加、
（ｋ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の、樹状細胞が提示した抗原を認識しそれに結合する能力の増加、
（ｌ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の、例えば、Ｔ－ｒｅｇに対する抑制応答の低減、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現、もしくはＣＣＬ３、ＩＬ８、ＩＬ１β、ＣＸＣＬ１０、もしくはｓＩＬ２Ｒαから選択される血清サイトカインレベル、もしくはＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、もしくはＴＩＧＩＴから選択される阻害性受容体のレベルによって決定される、Ｔ細胞抑制因子に抵抗する能力の増加、または
（ｍ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞による、インターフェロン－γ、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びグランザイムＢなどのサイトカイン産生のレベルの増加。
本発明は、ｉＰＳＣまたは造血系細胞及び／または異種ＴＣＲの、抗原またはペプチド抗原、例えば、がん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原、または本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原を発現もしくは提示するがん及び／または腫瘍細胞もしくは組織に結合することが、場合によっては、以下のうちのいずれか１つ以上によって決定される、ｉＰＳＣまたは造血系細胞の活性化及び／または機能を誘導することができる、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する：
（ａ）Ｔ細胞活性化マーカー、例えばＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及び／またはＣＤ２５のいずれかのアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生のアップレギュレーション、例えばＩＦＮガンマ、ＩＬ－２または、グランザイムＢのいずれか１つ以上、
（ｃ）抗原もしくは抗原ペプチドの存在下での細胞毒性活性の誘導、
（ｄ）抗原もしくは抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞を死滅させる能力、
（ｅ）サイトカイン及び／またはインターフェロンのｉＰＳＣまたは造血系細胞分泌の増加、
（ｆ）例えば、細胞マーカーによって判定される（例えば、Ｋｉ６７発現レベルによって判定される）、ｉＰＳＣもしくは造血系細胞増殖の増加、
（ｇ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞抗原応答性の増加、
（ｈ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の標的細胞の死滅の増加、
（ｉ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞のＣＤ２８シグナル伝達の増加、
（ｊ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の腫瘍に浸潤する能力の増加、
（ｋ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の、樹状細胞が提示した抗原を認識しそれに結合する能力の増加、
（ｌ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞の、例えば、Ｔ－ｒｅｇに対する抑制応答の低減、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現、もしくはＣＣＬ３、ＩＬ８、ＩＬ１β、ＣＸＣＬ１０、もしくはｓＩＬ２Ｒαから選択される血清サイトカインレベル、もしくはＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、もしくはＴＩＧＩＴから選択される阻害性受容体のレベルによって決定される、Ｔ細胞抑制因子に抵抗する能力の増加、または
（ｍ）ｉＰＳＣもしくは造血系細胞による、インターフェロン－γ、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びグランザイムＢなどのサイトカイン産生のレベルの増加。
【0089】
ＴＣＲ＋細胞の持続性
本発明は、例えば、本明細書に記載の異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現または提示する改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞の持続性の測定によって決定される、培養物または対象試料において改善されたＴＣＲ＋細胞持続性を示す、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。注入された操作及び改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞の持続性は、治療効果と相関し、また長期的な安全対策である。細胞持続性は、ｑＰＣＲまたはフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって決定され得る。例えば、ＤＮＡからのコード遺伝子のＰＣＲによるＴＣＲ＋（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲまたはＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ）細胞の定量化。あるいは、Ｔ細胞表現型、及び異種ＴＣＲに関連する活性の定量化は、例えば、以下の様々なアッセイによって決定され得る：
●細胞産生物／培養物中または輸液前後の対象血液中のＴ細胞系統の決定のための表現型分析。
●細胞産生物／培養物中または対象試料からのＴ細胞の老化及び活性化状態の定量化
●ＴＣＲ＋Ｔ細胞のインビボ機能を反映する可溶性因子の以下定量化。
本発明は、例えば、本明細書に記載の異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現または提示する改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞の持続性の測定によって決定される、培養物または対象試料において改善されたＴＣＲ＋細胞持続性を示す、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を提供する。注入された操作及び改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞の持続性は、治療効果と相関し、また長期的な安全対策である。細胞持続性は、ｑＰＣＲまたはフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって決定され得る。例えば、ＤＮＡからのコード遺伝子のＰＣＲによるＴＣＲ＋（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲまたはＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ）細胞の定量化。あるいは、Ｔ細胞表現型、及び異種ＴＣＲに関連する活性の定量化は、例えば、以下の様々なアッセイによって決定され得る：
●細胞産生物／培養物中または輸液前後の対象血液中のＴ細胞系統の決定のための表現型分析。
●細胞産生物／培養物中または対象試料からのＴ細胞の老化及び活性化状態の定量化
●ＴＣＲ＋Ｔ細胞のインビボ機能を反映する可溶性因子の以下定量化。
【0090】
核酸構築物またはベクター
本発明は、本発明による異種ＴＣＲをコードする核酸領域と、異種ＴＣＲをコードする核酸領域の組み込みのための、細胞ゲノムにおける遺伝子座の核酸領域に相同な核酸領域を含む少なくとも１つの相同領域と、を含む、核酸構築物またはベクターを提供する。好ましくは、遺伝子座は、本明細書に前述されるとおりである。
本発明は、本発明による異種ＴＣＲをコードする核酸領域と、異種ＴＣＲをコードする核酸領域の組み込みのための、細胞ゲノムにおける遺伝子座の核酸領域に相同な核酸領域を含む少なくとも１つの相同領域と、を含む、核酸構築物またはベクターを提供する。好ましくは、遺伝子座は、本明細書に前述されるとおりである。
【0091】
好ましくは、遺伝子座は、膜タンパク質または膜貫通タンパク質、場合によっては受容体タンパク質、好ましくは受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、好ましくはＣＤ４５またはタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ、すなわちＰＴＰＲＣをコードする遺伝子であるか、またはその中に存在する。したがってかつ好ましくは、遺伝子座は、１番染色体上のＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子に存在するか、またはその中に存在し、場合によっては、遺伝子座は、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子のエクソン３３に、場合によっては、ＴＡＧ終止コドンの前に、またはＴＡＧ終止コドンの真隣及び／または直前に存在する。
【0092】
異種ＴＣＲをコードする核酸は、場合によっては、酵素による切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列を含む、例えば本明細書に記載のＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ鎖のコード配列を含み得、好ましくは、酵素による切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列が、フーリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲをコードし、好ましくはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列が、リボソームスキップ配列、好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列である。
【0093】
本発明によれば、構築物またはベクターは、異種ＴＣＲをコードする核酸領域の組み込みのための、細胞ゲノムにおける遺伝子座の核酸領域に対して、各々相同であり、場合によっては組み込み部位の反対側に隣接する、左手及び／または右手相同領域を含み得る。
【0094】
したがって、構築物またはベクターは、以下のうちのいずれか１つ以上を更に含み得る：
（ａ）組換え標的配列、好ましくはｌｏｘＰ（Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座）配列、
（ｂ）発現可能な選択マーカー配列、好ましくはプロモーター、例えばＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現する、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、場合によってはネオマイシン耐性遺伝子。
（ａ）組換え標的配列、好ましくはｌｏｘＰ（Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座）配列、
（ｂ）発現可能な選択マーカー配列、好ましくはプロモーター、例えばＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現する、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、場合によってはネオマイシン耐性遺伝子。
【0095】
本発明によれば、構築物またはベクターは、配列番号４５の配列を含む異種ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列と、配列番号４３及び配列番号４４の配列を含む相同領域と、場合によっては配列番号４８を含む組換え標的配列、及び／または配列番号４７及び配列番号４９を含む発現可能な選択マーカー配列と、を含み得る。
【0096】
本発明は、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を産生するプロセスであって、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を細胞ゲノムにおける遺伝子座にまたはその中に組み込むことを可能にする条件下で、本発明による核酸構築物またはベクターを、場合によっては本明細書に定義される改変されていない人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞に導入し、場合によっては、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞を単離することを含む、プロセスを更に提供する。このプロセスは、ＡＡＶ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または操作されたメガヌクレアーゼを用いるものなどの既知のゲノム編集方法論を使用して達成され得る。
【0097】
治療
本発明は、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を更に提供する。
本発明は、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を更に提供する。
【0098】
本発明は、治療及び／または医学における使用のための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物を更に提供する。
【0099】
本発明はまた、以下を含む、以下の医学的使用または治療する方法のうちのいずれか１つ以上を提供する：
（ａ）場合によっては、治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、またはその進行の遅延における使用のための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物、
（ｂ）場合によっては、治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療のための医薬品の製造における、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物の使用、
（ｃ）場合によっては、治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、個体に、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物を投与することを含む、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療、防止、またはその進行を遅延させる方法。
（ａ）場合によっては、治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、またはその進行の遅延における使用のための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物、
（ｂ）場合によっては、治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療のための医薬品の製造における、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物の使用、
（ｃ）場合によっては、治療が、がん免疫療法及び／または養子Ｔ細胞療法、場合によっては、同種異系養子Ｔ細胞療法である、個体に、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物を投与することを含む、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療、防止、またはその進行を遅延させる方法。
【0100】
本発明によれば、固形腫瘍であり得るがん及び／または腫瘍は、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性または進行性ＮＳＣＬＣ、扁平上皮ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、腺扁平上皮癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、卵巣癌、胃癌、尿路上皮癌、食道癌、食道胃接合部癌（ＥＧＪ）、黒色腫、膀胱癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、口腔癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉の癌、喉頭癌、扁桃腺癌、舌癌、軟口蓋癌、喉頭癌、滑膜肉腫、粘液様円形細胞型脂肪肉腫（ｍｙｘｏｉｄ ｒｏｕｎｄ ｃｅｌｌ ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）（ＭＲＳＬＣＳ）から選択され得、場合によっては、がんまたは腫瘍が、本明細書に記載のＭＡＧＥもしくはＡＦＰタンパク質ペプチド、その抗原、またはペプチド抗原、場合によっては、本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質、そのペプチド、抗原、または抗原ペプチドを発現する。
【0101】
本発明によれば、がんは、乳癌、転移性乳癌、肝臓癌、腎細胞癌、滑膜肉腫、尿路上皮癌または腫瘍、膵臓癌、結腸直腸癌、転移性胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、転移性胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、転移性肝臓癌、転移性卵巣癌、転移性膵臓癌、転移性結腸直腸癌、転移性肺癌、結腸直腸癌または腺癌、肺癌または腺癌、膵臓癌または腺癌、粘膜腺腫、膵臓の腺管癌、血液悪性疾患のうちのいずれか１つ以上から選択され得、場合によっては、がんまたは腫瘍が、本明細書に記載のＭＡＧＥもしくはＡＦＰタンパク質、そのペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原、場合によっては、本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質、そのペプチド、抗原、またはペプチド抗原を発現する。
【0102】
本発明によれば、がん及び／または腫瘍は、肝臓癌であり得るか、または胆管癌、肝臓血管肉腫、肝芽腫、肝細胞癌（ＨＣＣ）のうちのいずれかから選択される肝臓癌であり得、場合によっては、がんが、移植または切除に適さず、好ましくは、がんが、肝細胞癌（ＨＣＣ）であり、加えて、肝臓癌が、糖尿病、肥満、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝硬変のうちのいずれか１つ以上と同時であり得、場合によっては、がんまたは腫瘍が、本明細書に記載のＭＡＧＥもしくはＡＦＰタンパク質、そのペプチド、抗原、またはペプチド抗原、場合によっては、本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質、そのペプチド、抗原、またはペプチド抗原を発現する。
【0103】
本発明によれば、がんは、再発したがん、難治性のがん、または再発性のがん、または局所再発性のがん、または転移性のがん、切除不能ながん、または外科的もしくは放射線療法の選択肢がない局所に限定されたがん、または手術不能ながん、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本発明によれば、がん及び／または腫瘍は、固形腫瘍であり得る。
【0104】
本発明はまた、以下の方法における使用のための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物を提供する：
（ａ）Ｔ細胞活性化のアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生のアップレギュレーション、例えばＩＦＮガンマ、ＩＬ－２または、グランザイムＢのいずれか１つ以上、
（ｃ）抗原もしくは抗原ペプチドの存在下での細胞毒性活性の誘導、または
（ｄ）場合によっては、がん及び／または腫瘍を有する対象において、場合によっては、がん及び／または腫瘍が、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原、好ましくは本明細書に記載のＭＡＧＥもしくはＡＦＰタンパク質、そのペプチド、抗原、もしくはペプチド抗原を発現する、抗原もしくは抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞の死滅の誘導。
（ａ）Ｔ細胞活性化のアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生のアップレギュレーション、例えばＩＦＮガンマ、ＩＬ－２または、グランザイムＢのいずれか１つ以上、
（ｃ）抗原もしくは抗原ペプチドの存在下での細胞毒性活性の誘導、または
（ｄ）場合によっては、がん及び／または腫瘍を有する対象において、場合によっては、がん及び／または腫瘍が、本明細書に記載のがん及び／または腫瘍抗原もしくはそのペプチド抗原、好ましくは本明細書に記載のＭＡＧＥもしくはＡＦＰタンパク質、そのペプチド、抗原、もしくはペプチド抗原を発現する、抗原もしくは抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞の死滅の誘導。
【0105】
組み合わせ
本発明は、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物が、場合によっては別々に、順次、または同時に投与されるか、または投与するための１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するためのものであるか、またはそのように使用される、前述の医学的使用または治療する方法に従って使用するための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物を更に提供する。
本発明は、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物が、場合によっては別々に、順次、または同時に投与されるか、または投与するための１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するためのものであるか、またはそのように使用される、前述の医学的使用または治療する方法に従って使用するための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または薬学的組成物を更に提供する。
【0106】
したがって、１つ以上の更なる治療剤は、化学療法剤、ホルモン療法剤、標的化薬物、または免疫療法を含み得る。したがって、化学療法は、ゲムシタビン、ドセタキセル、ペメトレキセド、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、ビノレルビン、リポプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、フェナントリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、メトトレキサート、カペシタビン、タキサン、アントラサイクリン、パクリタキセル、ドセタキセル、パクリタキセルタンパク質結合粒子、ドキソルビシン、エピルビシン、５－フルオロウラシル、シクロホスファミド、ビンクリスチン、エトポシドのうちのいずれか１つ以上を含み得る。加えてまたはあるいは、化学療法は、以下から選択される１つ以上の化学療法剤を含み得る：ＦＥＣ：５－フルオロウラシル、エピルビシン、シクロホスファミド；ＦＡＣ：５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド；ＡＣ：ドキソルビシン、シクロホスファミド；ＥＣ：エピルビシン、シクロホスファミド。加えてまたはあるいは、１つ以上の更なる治療剤は、ソラフェニブ、ＰＤ１もしくはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストもしくは阻害剤、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、スニチニブ、ブリバニブ、エベロリムス、チバンチニブ、リニファニブ、ソラフェニブ、ＰＤ１もしくはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストもしくは阻害剤、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、スニチニブ、ブリバニブ、エベロリムス、チバンチニブ、リニファニブ、またはクリゾチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、及びアファチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤もしくは上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ペンブロリズマブもしくはニボルマブなどの免疫チェックポイント阻害剤、またはデノスマブなどの核因子カッパ－Ｂリガンドに対するモノクローナル抗体、または上皮成長因子受容体アンタゴニスト抗体、場合によってはセツキシマブのうちのいずれか１つ以上を含み得る。
【0107】
本明細書で使用される場合、「改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系細胞」という用語はまた、改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、または人工多能性幹細胞ｉＰＳＣの改変された集団もしくは造血系細胞の集団を含み得る（改変されたという用語はまた、ＩＰＳＣ（複数可）及び造血系細胞（複数可）の両方に適用される）。
【0108】
キット
本発明は、以下を含むキットを更に提供する：
（ａ）本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、もしくは薬学的組成物と、個体もしくは対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、もしくはその進行を遅延させるためのそれらの使用説明書を含む添付文書、または
（ｂ）場合によっては別々に、順次、もしくは同時に投与されるか、もしくは投与するための、場合によっては本明細書に記載の１つ以上の更なる治療剤と組み合わせられた、個体もしくは対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、もしくはその進行を遅延させるための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、もしくは薬学的組成物と、それらの使用説明書を含む添付文書。
本発明は、以下を含むキットを更に提供する：
（ａ）本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、もしくは薬学的組成物と、個体もしくは対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、もしくはその進行を遅延させるためのそれらの使用説明書を含む添付文書、または
（ｂ）場合によっては別々に、順次、もしくは同時に投与されるか、もしくは投与するための、場合によっては本明細書に記載の１つ以上の更なる治療剤と組み合わせられた、個体もしくは対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、防止、もしくはその進行を遅延させるための、本発明による改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系細胞、もしくは薬学的組成物と、それらの使用説明書を含む添付文書。
【0109】
本発明は、以下の図面及び実施例を参照することによって更に説明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0110】
【図1】ＰＴＰＲＣスプライスバリアント。ＰＴＰＲＣ遺伝子は、１番染色体上に位置し、３３個のエクソンを含有する。選択的スプライシングを介して、この遺伝子から、複数のスプライスバリアントが産生される。スプライスバリアントは、エクソン４～６でのスプライシングの結果物である。各転写産生物は、同じ３’エクソン構造を含有する。Ｔｃｈｉｌｉａｎ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒｌｅｙ ２００６．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙからの図を採用する。
【図2】ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ノックイン戦略－ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲをＰＴＰＲＣエクソン３３にノックインするように、標的化戦略を設計した。編集は、ＡＡＶで実施した。ｒＡＡＶ修復テンプレートの相同性アームは、終止コドンの上流及び下流の５００ｂｐのゲノム配列に対応する。編集によって、各ポリペプチドコーディング配列が、フーリン切断部位（ＲＡＫＲ）及び２Ａスキップペプチド（ＰＴＰＲＣ＿ＦｕＴ２Ａ＿ＴＣＲα＿ＦｕＰ２Ａ＿ＴＣＲβ）によって分離された、ＰＴＰＲＣとＡＤＰ Ａ２Ｍ４との間のマルチシストロニック融合物が作製される。この設計は、単一の編集された対立遺伝子からの３つ全てのポリペプチドの発現を可能にする。エクソン３３へのノックインはまた、複数のＰＴＰＲＣスプライスバリアントにわたるＡ２Ｍ４の発現を可能にする。耐性カセットは、ＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現したＬＯＸＰ隣接ＮＥＯ耐性遺伝子を含有する。
【図3】ベクターマップｐＡＡＶ ＭＣＳ＿ＰＴＰＲＣ＿ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４＿ＬＯＸＰ＿ＮＥＯ。相同性アーム（ＬＨＡ及びＲＨＡ）、ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ及びＮＥＯ耐性カセットを含有する標的化カセットを、ｐＡＡＶ ＭＣＳベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ）におけるＮｏｔＩ制限部位間でクローニングした。ベクター骨格を例外として、各断片をＰＣＲによって増幅させ、断片をＧｉｂｓｏｎアセンブリによってベクターにクローニングした。
【図4】ＰＣＲスクリーニング戦略。編集したクローンを、９６ウェルプレート内で限界希釈によって単離した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）を使用して、各クローンからｇＤＮＡの試料を単離した。相同性アーム領域の外側及び導入遺伝子カセット内のプライマーを用いるＰＣＲによって、クローンをスクリーニングした。プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＦＷＤ及びＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＲＥＶを使用して、ＬＨＡ境界ＰＣＲを実施した。プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＦＷＤ及びＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＲＥＶを用いて、ＲＨＡ境界ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産生物を配列決定した。３つのクローンが分化のために進行した。ＣｈｉＰＳＣ３１ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン２、ＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｄ１０及びＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ５。
【図5A】ＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞のレンチウイルス形質導入を介して、ｉＴ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現を誘導することができる。ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊを分化させ、ステージ４のＡＤＰ Ａ２Ｍ４Ｔ細胞（ＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞）を含有して発現したレンチウイルスで形質導入した。分化プロトコルを通じて、形質導入した細胞を進行させた。抗Ｖα２４抗体及びＡ２Ｍ４ ＭＡＧＥ－４デキストラマーで染色することによって測定したＦＡＣＳ及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４発現によって、細胞を表現型決定した。
【図5B】ＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞のレンチウイルス形質導入を介して、ｉＴ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現を誘導することができる。ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊを分化させ、ステージ４のＡＤＰ Ａ２Ｍ４Ｔ細胞（ＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞）を含有して発現したレンチウイルスで形質導入した。分化プロトコルを通じて、形質導入した細胞を進行させた。抗Ｖα２４抗体及びＡ２Ｍ４ ＭＡＧＥ－４デキストラマーで染色することによって測定したＦＡＣＳ及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４発現によって、細胞を表現型決定した。
【図6A】編集したｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞の表現型（ステージ５）：ＣｈｉＰＳＣ３１ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン２（単一の対立遺伝子を標的とする）から分化したｉＴ細胞。分化は、編集によって影響を受けない。編集されたクローンは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲを発現する。抗Ｖα２４抗体及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＭＡＧＥ－４デキストラマーで染色することによって測定したＦＡＣＳ及びＡ２Ｍ４発現によって、細胞を表現型決定した。単一の対立遺伝子におけるノックインは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４発現を促進するのに十分である。
【図6B】編集したｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞の表現型（ステージ５）：ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｄ１０（両方の対立遺伝子を標的とする）から分化したｉＴ細胞。分化は、編集によって影響を受けない。編集されたクローンは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲを発現する。抗Ｖα２４抗体及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＭＡＧＥ－４デキストラマーで染色することによって測定したＦＡＣＳ及びＡ２Ｍ４発現によって、細胞を表現型決定した。単一の対立遺伝子におけるノックインは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４発現を促進するのに十分である。
【図6C】編集したｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞の表現型（ステージ５）：ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ５（単一の対立遺伝子を標的とする）から分化したｉＴ細胞。分化は、編集によって影響を受けない。編集されたクローンは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲを発現する。抗Ｖα２４抗体及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＭＡＧＥ－４デキストラマーで染色することによって測定したＦＡＣＳ及びＡ２Ｍ４発現によって、細胞を表現型決定した。単一の対立遺伝子におけるノックインは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４発現を促進するのに十分である。
【図7】編集されたｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞は、特異的かつ強力な細胞溶解エフェクター機能を呈する：ｉＴ細胞溶解機能をＫＩＬＲアッセイで評価した。ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶの濃度を減少させながら（１０－５Ｍ～１０－１１Ｍ）Ｔ２細胞にパルスをかけ、ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊから分化したｉＴ細胞（ＡＤＡＰ００１＿Ｊ ＷＴ ＮＴＤ（非形質導入））、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルスで形質導入したＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ由来のｉＴ細胞（ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＷＴ Ａ２Ｍ４ ＴＤ）、及び編集したＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ１０から分化したｉＴ細胞と共にインキュベートした。細胞溶解機能について、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４形質導入ＰＢＬと健康なドナーから単離した非形質導入ＰＢＬとを比較した。
【図8】ｉＴ細胞は、抗原陽性腫瘍細胞株と共にインキュベートすると、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５をアップレギュレートする：ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ｉＰＳＣ株（ＮＴＤ非形質導入）から分化したｉＴ細胞、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルス（ＴＤ）で形質導入したＡＤＡＰｉ０１＿Ｊ由来のｉＴ細胞、及び編集されたＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ１０から分化したｉＴ細胞を、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（０．５μｇ）の存在下または不在下で、腫瘍株Ａ３７５（ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性及びＭＡＧＥ－Ａ４陽性）及びＣＯＬＯ２０５（ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性及びＭＡＧＥ－Ａ４陰性）で（２４時間）同時培養した。同時培養後、フローサイトメトリーによって、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現のアップレギュレーションが決定された。活性化マーカーの発現について、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４形質導入ＰＢＬと健康なドナーから単離した非形質導入ＰＢＬとを比較した。
【図9】ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－における２つのＲＡＧ１対立遺伝子（エクソン２）内に存在するＩＮＤＥＬの配列検証。１つの対立遺伝子（上）は、１１ｂｐの欠失を含有し、第２の対立遺伝子（下）は、１６ｂｐの欠失を含有する。両方のＩＮＤＥＬは、ＲＡＧ１を不活性化することが予測される。クローン７Ｄ１０ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－を使用して、Ａ２Ｍ４ ＴＣＲをＰＴＰＲＣ（Ｅｘｏｎ３３）にノックインした。
【図10A】ＲＡＧ１－／－ｉＴ細胞は、ＣＤ３及びＴＣＲを発現しない。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲ鎖Ｖα－２４（Ａ２Ｍ４－ＴＣＲに結合）、及びαβＴＣＲの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。分化したｉＴ細胞の表現型野生型ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ。
【図10B】ＲＡＧ１－／－ｉＴ細胞は、ＣＤ３及びＴＣＲを発現しない。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲ鎖Ｖα－２４（Ａ２Ｍ４－ＴＣＲに結合）、及びαβＴＣＲの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。分化したｉＴ細胞の表現型Ａ２Ｍ４レンチウイルス形質導入野生型ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ。
【図10C】ＲＡＧ１－／－ｉＴ細胞は、ＣＤ３及びＴＣＲを発現しない。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲ鎖Ｖα－２４（Ａ２Ｍ４－ＴＣＲに結合）、及びαβＴＣＲの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。分化したｉＴ細胞の表現型ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－。
【図10D】ＲＡＧ１－／－ｉＴ細胞は、ＣＤ３及びＴＣＲを発現しない。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲ鎖Ｖα－２４（Ａ２Ｍ４－ＴＣＲに結合）、及びαβＴＣＲの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。分化したｉＴ細胞の表現型Ａ２Ｍ４レンチウイルス形質導入ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－。
【図11A】ＰＴＰＲＣへのＡ２Ｍ４ ＴＣＲの単一の対立遺伝子ノックインによって、ＣＤ３及びＴＣＲ発現ＲＡＧ１－／－ｉＴ細胞を救出する。Ａ２Ｍ４ ＴＣＲの単一コピーを、ＲＡＧ１－／－ｉＰＳＣクローンＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿７Ｄ１０のＰＴＰＲＣ（Ｅｘｏｎ３３）にノックインした。３つのクローンを単離し、ｉＴ細胞に分化させた。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲ鎖Ｖα－２４（Ａ２Ｍ４－ＴＣＲに結合）、及びαβＴＣＲの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿１Ｂ８＿ＲＡＧ１－／－＿ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴ。
【図11B】ＰＴＰＲＣへのＡ２Ｍ４ ＴＣＲの単一の対立遺伝子ノックインによって、ＣＤ３及びＴＣＲ発現ＲＡＧ１－／－ｉＴ細胞を救出する。Ａ２Ｍ４ ＴＣＲの単一コピーを、ＲＡＧ１－／－ｉＰＳＣクローンＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿７Ｄ１０のＰＴＰＲＣ（Ｅｘｏｎ３３）にノックインした。３つのクローンを単離し、ｉＴ細胞に分化させた。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲ鎖Ｖα－２４（Ａ２Ｍ４－ＴＣＲに結合）、及びαβＴＣＲの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿２Ｄ４＿ＲＡＧ１－／－＿ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴ。
【図11C】ＰＴＰＲＣへのＡ２Ｍ４ ＴＣＲの単一の対立遺伝子ノックインによって、ＣＤ３及びＴＣＲ発現ＲＡＧ１－／－ｉＴ細胞を救出する。Ａ２Ｍ４ ＴＣＲの単一コピーを、ＲＡＧ１－／－ｉＰＳＣクローンＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿７Ｄ１０のＰＴＰＲＣ（Ｅｘｏｎ３３）にノックインした。３つのクローンを単離し、ｉＴ細胞に分化させた。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲ鎖Ｖα－２４（Ａ２Ｍ４－ＴＣＲに結合）、及びαβＴＣＲの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿２Ｅ７＿ＲＡＧ１－／－＿ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴ。
【図12】ＲＡＧ１－／－ｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞は、Ａ２Ｍ４ ＴＣＲをコードするレンチウイルスでの形質導入後、抗原陽性腫瘍細胞株を死滅させることができる。ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）ペプチド及び非パルスＧＦＰ＋ｖｅＡ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４＋ｖｅ、ＨＬＡ－Ａ２＊０２＋ｖｅ）細胞を、野生型ＡＤＰＡｉ００１＿ＪまたはＡＤＰＡｉ００１＿Ｊ＿ｃ７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－から分化させた、非形質導入またはＡ２Ｍ４形質導入ｉＴ細胞と同時培養した。緑のオブジェクト数（Ｇｒｅｅｎ ｏｂｊｅｃｔ ｃｏｕｎｔｓ）（ＧＦＰ）の減少は、ＧＦＰ＋ｖｅ Ａ３７５腫瘍細胞株の死を表している。
【図13】ＲＡＧ１－／－ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞は、抗原陽性腫瘍細胞を死滅させることができる。ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）パルス及び非パルスＧＦＰ＋ｖｅＡ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４＋ｖｅ、ＨＬＡ－Ａ２＊０２＋ｖｅ）細胞を、ｉＰＳＣクローンＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿ｃ１Ｂ８＿ＲＡＧ１－／－＿ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴ、ＡＤＰＡｉ００１＿Ｊ＿ｃ２Ｄ７＿ＲＡＧ１－／－ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴ、またはＡＤＰＡｉ００１＿Ｊ＿ｃ２Ｅ４＿ＲＡＧ１－／－ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴから分化させたｉＴ細胞と同時培養した。緑のオブジェクト数（Ｇｒｅｅｎ ｏｂｊｅｃｔ ｃｏｕｎｔｓ）（ＧＦＰ）の減少は、ＧＦＰ＋ｖｅ Ａ３７５腫瘍細胞株の死を表している。
【実施例】
【0111】
序論：
ここでは、定義された異種組換えαβＴＣＲを発現するｉＴ細胞の産生について説明する。第１の組の実験では、ＧＭＰコンプライアンスｈｉＰＳＣソースから始め、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示されるＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を認識する組換え異種Ｔ細胞受容体ＡＤＰ Ａ２Ｍ４をノックインした。抗ＴＣＲＶα２４及びデキストラマー染色によって測定して、操作されたｉＰＳＣに由来するＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを特異的に発現することを示す。同種抗原を発現する腫瘍株を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２と共にインキュベートすると、編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞は、ＣＤ２５及びＣＤ６９を含む活性化マーカーをアップレギュレートし、これらの株の強力な抗原依存的死滅を呈する。第２の組の実験では、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲをＲＡＧ１ｎｕｌｌ ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊにノックインした。以下の実施例は、治療上の価値及び活性を有するＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞の産生を可能にする、ゲノム編集が限定された同種異系ｈｉＰＳＣ由来プラットフォームの開発を表している。
ここでは、定義された異種組換えαβＴＣＲを発現するｉＴ細胞の産生について説明する。第１の組の実験では、ＧＭＰコンプライアンスｈｉＰＳＣソースから始め、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示されるＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を認識する組換え異種Ｔ細胞受容体ＡＤＰ Ａ２Ｍ４をノックインした。抗ＴＣＲＶα２４及びデキストラマー染色によって測定して、操作されたｉＰＳＣに由来するＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを特異的に発現することを示す。同種抗原を発現する腫瘍株を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２と共にインキュベートすると、編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞は、ＣＤ２５及びＣＤ６９を含む活性化マーカーをアップレギュレートし、これらの株の強力な抗原依存的死滅を呈する。第２の組の実験では、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲをＲＡＧ１ｎｕｌｌ ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊにノックインした。以下の実施例は、治療上の価値及び活性を有するＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞の産生を可能にする、ゲノム編集が限定された同種異系ｈｉＰＳＣ由来プラットフォームの開発を表している。
【0112】
ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲは、ＰＴＰＲＣ遺伝子座でのノックインによってｉＴ細胞に安定的に導入される。ＰＴＰＲＣは、ＴＣＲシグナル伝達の重要な調節因子である膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼ（ＣＤ４５）をコードする。ＰＴＰＲＣ遺伝子は、３３個のエクソンを含有し、エクソン４～６の選択的スプライシングによって生成される複数のアイソフォーム（ＣＤ４５ＲＡＢＣ、ＣＤ４５Ｒ０、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、及びＣＤ４５ＲＣ）をコードする（図１）。ＣＤ４５アイソフォームの発現は、Ｔ細胞発生、活性化、及び分化中に変化する。例えば、ＣＤ４５ＲＡは、主にナイーブＴ細胞サブセットに発現するが、ＣＤ４５ＲＯは、主にメモリーＴ細胞サブセットに発現する。
【0113】
ＰＴＰＲＣアイソフォームは全て、同じ３’エクソン構造を共有し、したがって、この領域の改変は、全てのＰＴＲＰＣアイソフォーム間で共有されるであろう。ｒＡＡＶ標的化プラスミドを生成して、ＴＡＧ終止コドンの直前のＰＴＰＲＣエクソン３３へのＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲのノックインを可能にした。ＰＴＰＲＣとＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲとの間にマルチシストロニック融合遺伝子を生成するように、構築物を設計した。これによって、内因性ＰＴＰＲＣプロモーターからのＰＴＰＲＣアイソフォーム及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４の制御された転写及び発現が可能になる。Ｔ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列ペプチドと組み合わせたフーリン切断部位は、ＰＴＰＲＣ及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲα及びＡ２Ｍ４ ＴＣＲβコード配列を分離する（図２及び３）。これによって、単一ｍＲＮＡからの複数のポリペプチドの産生が可能になる。小胞体におけるフーリンプロテアーゼによる切断によって、スキップ配列ペプチドを除去して、新生タンパク質配列の発現が可能になるであろう。
【0114】
ｉＰＳＣ細胞株の産生
ｐＥＢ－Ｃ５及びｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用する、臍帯血から単離したＣＤ３４＋前駆体の再プログラミングを介して、ｉＰＳＣ株（ＡＤＡＰｉ００１）を作製した［Ｃｈｏｕ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１１．２１（３）：ｐ．５１８－２９］。全てのＡＤＡＰｉ００１クローンは、追跡可能であり、ＧＭＰ条件下で産生される。９つのＡＤＡＰｉ００１ ｈｉＰＳＣクローンを、各クローンについて生成された早期継代番号（ｐ１０）の小さなワーキングセルバンクで特徴評価した。ｃｙｔｏ－ＳＮＰ分析、核型決定、及びＷＧＳ（全ゲノム配列決定）を介して、ゲノム安定性を評価した。ＩＨＣ（免疫組織化学）、フローサイトメトリー、及びＰｌｕｒｉｔｅｓｔを用いて、多能性を決定した［Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１．８（４）：ｐ．３１５－７］。ＡＤＡＰｉ００１ ｉＰＳＣクローンからのｉＴ細胞の分化も確認した。
ｐＥＢ－Ｃ５及びｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用する、臍帯血から単離したＣＤ３４＋前駆体の再プログラミングを介して、ｉＰＳＣ株（ＡＤＡＰｉ００１）を作製した［Ｃｈｏｕ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１１．２１（３）：ｐ．５１８－２９］。全てのＡＤＡＰｉ００１クローンは、追跡可能であり、ＧＭＰ条件下で産生される。９つのＡＤＡＰｉ００１ ｈｉＰＳＣクローンを、各クローンについて生成された早期継代番号（ｐ１０）の小さなワーキングセルバンクで特徴評価した。ｃｙｔｏ－ＳＮＰ分析、核型決定、及びＷＧＳ（全ゲノム配列決定）を介して、ゲノム安定性を評価した。ＩＨＣ（免疫組織化学）、フローサイトメトリー、及びＰｌｕｒｉｔｅｓｔを用いて、多能性を決定した［Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１．８（４）：ｐ．３１５－７］。ＡＤＡＰｉ００１ ｉＰＳＣクローンからのｉＴ細胞の分化も確認した。
【0115】
ｉＰＳＣ細胞培養
ｉＰＳＣ株ＣｈｉＰＳＣ３１（Ｔａｋａｒａ）及びＡＤＡＰｉ００１＿Ｊを編集実験に使用した。ＣｈｉＰＳＣ３１ ｉＰＳＣ株を、ＤＥＦ－ＣＳ５００培養培地（Ｔａｋａｒａ）を含むＣＯＡＴ１マトリックス上で培養した。ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。両方のｉＰＳＣ株を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いる酵素による解離に適応させ、４～５日ごとに継代させた。加湿した３７℃、５％のＯ２、５％のＣＯ２のインキュベーター内に、ｉＰＳＣ培養物を維持した。多能性マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１６０、及びＳＯＸ２）の発現、及び分化マーカーＳＳＥＡ－１の不在を、ＦＡＣＳ分析によって定期的に監視した。
ｉＰＳＣ株ＣｈｉＰＳＣ３１（Ｔａｋａｒａ）及びＡＤＡＰｉ００１＿Ｊを編集実験に使用した。ＣｈｉＰＳＣ３１ ｉＰＳＣ株を、ＤＥＦ－ＣＳ５００培養培地（Ｔａｋａｒａ）を含むＣＯＡＴ１マトリックス上で培養した。ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。両方のｉＰＳＣ株を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いる酵素による解離に適応させ、４～５日ごとに継代させた。加湿した３７℃、５％のＯ２、５％のＣＯ２のインキュベーター内に、ｉＰＳＣ培養物を維持した。多能性マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１６０、及びＳＯＸ２）の発現、及び分化マーカーＳＳＥＡ－１の不在を、ＦＡＣＳ分析によって定期的に監視した。
【0116】
ＡＡＶ標的化ベクターの生成
ｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）プラスミドをＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化させて、左右逆位末端反復（ＩＴＲ）領域間の配列を除去した。アガロースゲル抽出によって、ベクター骨格を精製した。左右の相同性アーム（ＬＨＡ、配列番号４３、及びＲＨＡ、配列番号４４）、ＦｕＴＡ＿Ａ２Ｍ４導入遺伝子カセット、配列番号４５、ならびにＬＯＰＸ、配列番号４８、隣接ＥＦ１Ａ＿Ｎｅｏ選択カセット配列番号４７及び配列番号４９を、ＰＣＲによって増幅させた。各プライマーは、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリによる標的化ベクターの生成を可能にする重複する配列を含有していた。ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊから単離したゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から、左及び右の相同性アーム配列（５００ｂｐ）を増幅させた。ＬＨＡアームは、ＲＨＡ上の１番染色体のヌクレオチド１９８７５５６７９～１９８７５６１７８に対応し、ＲＨＡは、ヌクレオチド１９８７５６１８２～１９８７５６６８１に対応する（Ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ ９９－２０２０年１月）。ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ導入遺伝子は、２つのＴＣＲ鎖間にフーリン切断部位（ＲＡＫＲ）及びＰ２Ａスキップ配列を有するＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含有する。ＬＯＸＰに隣接する選択カセットを合成によって合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。ｐＡＡＶ＿ＭＣＳ＿ＰＴＰＲＣ＿ＦｕＴ２Ａ＿ Ａ２Ｍ４＿ＬＯＸＰＮＥＯプラスミドマップを図３に示す。
ｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）プラスミドをＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化させて、左右逆位末端反復（ＩＴＲ）領域間の配列を除去した。アガロースゲル抽出によって、ベクター骨格を精製した。左右の相同性アーム（ＬＨＡ、配列番号４３、及びＲＨＡ、配列番号４４）、ＦｕＴＡ＿Ａ２Ｍ４導入遺伝子カセット、配列番号４５、ならびにＬＯＰＸ、配列番号４８、隣接ＥＦ１Ａ＿Ｎｅｏ選択カセット配列番号４７及び配列番号４９を、ＰＣＲによって増幅させた。各プライマーは、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリによる標的化ベクターの生成を可能にする重複する配列を含有していた。ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊから単離したゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から、左及び右の相同性アーム配列（５００ｂｐ）を増幅させた。ＬＨＡアームは、ＲＨＡ上の１番染色体のヌクレオチド１９８７５５６７９～１９８７５６１７８に対応し、ＲＨＡは、ヌクレオチド１９８７５６１８２～１９８７５６６８１に対応する（Ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ ９９－２０２０年１月）。ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ導入遺伝子は、２つのＴＣＲ鎖間にフーリン切断部位（ＲＡＫＲ）及びＰ２Ａスキップ配列を有するＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含有する。ＬＯＸＰに隣接する選択カセットを合成によって合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。ｐＡＡＶ＿ＭＣＳ＿ＰＴＰＲＣ＿ＦｕＴ２Ａ＿ Ａ２Ｍ４＿ＬＯＸＰＮＥＯプラスミドマップを図３に示す。
【0117】
ＡＡＶ産生
ｒＡＡＶ産生に使用したパッケージングプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ２４００７１）及びＡＡＶ－３Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ ＶＰＫ－４２３）を、ＮＥＢ（登録商標）５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ．内で増殖させた。相同性アーム、ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４、及びＮＥＯ選択カセットを含有するＡＡＶ標的化プラスミドを、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ内で増殖させた。Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全てのプラスミドＤＮＡを精製した。ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドにおけるＩＴＲの完全性を、ＡｈｄＩ及びＢｇｌＩ単一制限酵素消化液で確認した。
ｒＡＡＶ産生に使用したパッケージングプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ２４００７１）及びＡＡＶ－３Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ ＶＰＫ－４２３）を、ＮＥＢ（登録商標）５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ．内で増殖させた。相同性アーム、ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４、及びＮＥＯ選択カセットを含有するＡＡＶ標的化プラスミドを、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ内で増殖させた。Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全てのプラスミドＤＮＡを精製した。ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドにおけるＩＴＲの完全性を、ＡｈｄＩ及びＢｇｌＩ単一制限酵素消化液で確認した。
【0118】
ｒＡＡＶを産生するために使用した２９３ＡＡＶ細胞株（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、２９３ＡＡＶを２１６×１０６／５ＣＳの密度で５－ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｒｅｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、２：１：１のモル比のｒＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びＡＡＶ－３Ｒｅｐ－Ｃａｐで２９３ＡＡＶをトランスフェクトした。各トランスフェクションには、合計２．６ｍｇのプラスミドＤＮＡを使用した。細胞を７２時間培養し、その後採取し、ウイルス精製した。細胞を採取するために、６．２５ｍＭの最終濃度までＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を添加して、組織培養プラスチックからの細胞脱離を促進した。製造業者の指示に従って、イオジキサノール勾配超遠心分離またはＡＡＶｐｒｏ（登録商標）精製キット（Ｔａｋａｒａ）を介して、ｒＡＡＶウイルスを精製した。
【0119】
イオジキサノール勾配精製細胞ペレットを遠心分離（３００ｇ、５分）によって収集し、５ｍＬの細胞溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中に再懸濁させ、ドライアイス／エタノール浴及び３７℃の水浴を使用して３回凍結解凍を施した。最終解凍後、溶解物をベンゾナーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）で１時間、３７℃で処理した。残りの細片を遠心分離（１０００ｇ、２９分、４℃）によって除去し、その後イオジキサノール勾配に充填した。イオジキサノール勾配（９ｍｌの１５％イオジキサノール、６ｍｌの２５％イオジキサノール、５ｍｌの４０％イオジキサノール、及び５ｍｌの６０％イオジキサノール）は、６０％イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を希釈することによって調製した。ＰＢＳ－ＭＫ緩衝液（１×ＰＢＳ、２．７６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＫＣｌ）中に６０％イオジキサノールを希釈することによって、２５％及び４０％のイオジキサノール相を調製した。ＰＢＳ－ＭＫ緩衝液（１×ＰＢＳ、１ＭのＮａＣｌ、２．７６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＫＣｌ）中に６０％イオジキサノールを希釈することによって、１５％イオジキサノール相を調製した。これらの層を区別するために、フェノールレッドを２５％及び６０％の相に添加した。ＯｐｔｉＳｅａｌポリプロピレン遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に勾配相を段階的に添加する。細胞溶解物を１５％相の上に充填し、１８℃で９０分間、６７，０００ｒｐｍの７０Ｔｉ超遠心分離ロータで、チューブを遠心分離した。遠心分離後、４０％相からｒＡＡＶを抽出する。ｒＡＡＶウイルス調製物を、遠心分離フィルターユニット（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して更に濃縮し、緩衝液をＰＢＳ ０．００１％（ｖ／ｖ）プルロン酸（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）（Ｓｉｇｍａ）と交換した。ウイルス調製物を－８０℃で保存した。
【0120】
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するｑＰＣＲによって、ウイルス力価を確認した。プライマー及びプローブ配列を、ＩＴＲに対して設計する（Ａｕｒｎｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。プライマー配列ＩＴＲ＿Ｆ ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ、配列番号５４、ＩＴＲ＿Ｒ ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ、配列番号５５、プローブ５６－ＦＡＭ／ＣＡＣＴＣＣＣＴＣ／ＺＥＮ／ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ／３ＩＡＢｋＦＱ。既知の濃度及びコピー数のｐＡＡＶＳ由来プラスミドＤＮＡから調製した標準曲線に対して、ウイルス定量を決定した。ＰＣＲプログラムは、９５℃で１５分間の変性の１サイクル、続いて９５℃で１５秒間の変性及び６０℃で６０秒間のプライマーアニーリング／伸長の４０サイクルからなっていた。ｑＰＣＲ反応を、ＱｕａｎｔＳｕｄｉｏ７で実施し、ＱｕａｎｔＳｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアで分析した。
【0121】
遺伝子編集－ＰＴＰＲＣ遺伝子座におけるエクソン３３へのＡ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲのノックイン
ｉＰＳＣ株ＣＨｉＰＳＣ３１及びＡＤＡＰｉ００１－Ｊを、単一細胞懸濁液としてＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して酵素によって継代させた。解離後、ｉＰＳＣを計数した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２５０）。ＧＦ３を補充した完全なＤＥＦ－ＣＳ５００を含有する、コーティングした（Ｃｏａｔ１）６ウェルプレートのウェルに、ＣＨｉＰＳＣ３１（２００～３００×１０３）を播種した。翌日、培地を完全なＤＥＦ－ＣＳ５００と交換した。１×ＣｌｏｎｅＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコーティングした６ウェルプレートのウェルに、ＡＤＡＰｉ００１－Ｊ（２～３ｘ１０５）を播種した。翌日、培地をｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓと交換した。ｉＰＳＣ（ＣＨｉＰＳＣ３１またはＡＤＡＰｉ００１－Ｊ）を４８時間培養し、その後ＡＡＶ形質導入した。ＣＨｉＰＳＣ３１またはＡＤＡＰｉ００１－Ｊを、ＡＡＶ３血清型ウイルス（５００～１００００Ｖｇ／細胞）で形質導入した。形質導入の４８時間後に抗生物質選択（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、３０～１００μｇ／ｍｌ）を開始し、残りの培養物全体にわたって継続した。ウイルス形質導入の３～６日後、スクリーニング及びクローン単離のために、コーティングした９６ウェルプレートにｉＰＳＣを播種した。クローンを、１０～１６日間９６ウェルプレートで増殖させ、その後ＰＣＲスクリーニングを行った。場合によっては、陽性クローンに、限界希釈による追加のクローン単離を施した。組み込みを確認するために、ＰＣＲによって全てのクローンをスクリーニングした。全てのＰＣＲ産生物を配列検証した。
ｉＰＳＣ株ＣＨｉＰＳＣ３１及びＡＤＡＰｉ００１－Ｊを、単一細胞懸濁液としてＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して酵素によって継代させた。解離後、ｉＰＳＣを計数した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２５０）。ＧＦ３を補充した完全なＤＥＦ－ＣＳ５００を含有する、コーティングした（Ｃｏａｔ１）６ウェルプレートのウェルに、ＣＨｉＰＳＣ３１（２００～３００×１０３）を播種した。翌日、培地を完全なＤＥＦ－ＣＳ５００と交換した。１×ＣｌｏｎｅＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコーティングした６ウェルプレートのウェルに、ＡＤＡＰｉ００１－Ｊ（２～３ｘ１０５）を播種した。翌日、培地をｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓと交換した。ｉＰＳＣ（ＣＨｉＰＳＣ３１またはＡＤＡＰｉ００１－Ｊ）を４８時間培養し、その後ＡＡＶ形質導入した。ＣＨｉＰＳＣ３１またはＡＤＡＰｉ００１－Ｊを、ＡＡＶ３血清型ウイルス（５００～１００００Ｖｇ／細胞）で形質導入した。形質導入の４８時間後に抗生物質選択（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、３０～１００μｇ／ｍｌ）を開始し、残りの培養物全体にわたって継続した。ウイルス形質導入の３～６日後、スクリーニング及びクローン単離のために、コーティングした９６ウェルプレートにｉＰＳＣを播種した。クローンを、１０～１６日間９６ウェルプレートで増殖させ、その後ＰＣＲスクリーニングを行った。場合によっては、陽性クローンに、限界希釈による追加のクローン単離を施した。組み込みを確認するために、ＰＣＲによって全てのクローンをスクリーニングした。全てのＰＣＲ産生物を配列検証した。
【0122】
クローン単離及びスクリーニング
編集したｉＰＳＣ細胞プールをＧ４１８で選択した後、ｉＰＳＣクローンを単離した。ＧＦ３及びＧ４１８（５０μｇ／ｍｌ）を補充した完全なＤＥＦ－ＣＳ５００と共に、編集したＣｈｉＰＳＣ３１（３０００個の細胞）を、１０ｃｍの皿に播種した。４８時間ごとに、培地を、Ｇ４１８（５０μｇ／ｍｌ）を補充した完全なＤＥＦ－ＣＳ５００と交換した。１１日間の増殖の後、クローンを手動で採取した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡ抽出のために試料を採取した。導入遺伝子組み込みについて、ＰＣＲによってクローンをスクリーニングした（図４）。
編集したｉＰＳＣ細胞プールをＧ４１８で選択した後、ｉＰＳＣクローンを単離した。ＧＦ３及びＧ４１８（５０μｇ／ｍｌ）を補充した完全なＤＥＦ－ＣＳ５００と共に、編集したＣｈｉＰＳＣ３１（３０００個の細胞）を、１０ｃｍの皿に播種した。４８時間ごとに、培地を、Ｇ４１８（５０μｇ／ｍｌ）を補充した完全なＤＥＦ－ＣＳ５００と交換した。１１日間の増殖の後、クローンを手動で採取した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡ抽出のために試料を採取した。導入遺伝子組み込みについて、ＰＣＲによってクローンをスクリーニングした（図４）。
【0123】
ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ株から編集したクローンを、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）をコーティングした９６ウェルプレート内で限界希釈によって単離した。平均１００細胞／ウェルで、細胞を播種した。９６００個のｉＰＳＣをウェルＡ１に播種し、その後、カラム１（Ａ１～Ｈ１）で２回連続希釈した。次いで、プレートの全ての列全体で、細胞を２倍に希釈した。１×ＣｌｏｎｅＲを補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓに、編集したＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊを播種した。２日ごとに、培地を、完全なｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓと交換した。単一コロニーの存在についてウェルをスクリーニングする前に、細胞を１２～１４日間培養した。標的導入遺伝子の挿入を確認するために、クローンを拡大し、ＰＣＲによるスクリーニングのためにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。
【0124】
ＰＣＲ反応は相同性アームの境界を越えて行った。プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＦＷＤ ＣＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＡ（配列番号５０）及びＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＲＥＶ ＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＡＡＧ（配列番号５１）で、５’ＬＨＡ境界を増幅させた。プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＦＷＤは、１番染色体上のヌクレオチド１９８７５５５６２～１９８７５５５８５（＋）（Ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ ９９－２０２０年１月）に対応し、ＬＨＡ配列の９３ヌクレオチド上流に存在する。ＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＲＥＶプライマーは、Ａ２Ｍ４導入遺伝子配列に存在する。プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＦＷＤ ＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴ（配列番号５２）及びＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＲＥＶ ＴＡＧＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＣＴＴ（配列番号５３）で、３’ＲＨＡ境界を増幅させた。プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＦＷＤ１は、ＮＥＯカセットに存在し、ＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＲＥＶ１は、１番染色体上のヌクレオチド１９８７５６７２９～１９８７５６７５２（－）に対応し、ＲＨＡから４７ヌクレオチド下流に存在する。Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲプログラム変性９８℃、３０秒、１サイクル、４０サイクル変性９８℃、５秒、アニーリング６６℃、１０秒、伸長７２℃、２５秒、１サイクル伸長７２℃、５分。ＰＣＲ産生物をゲル精製し、サンガー配列決定して、組込みを確認した。陽性クローンを拡大し、小さな細胞バンクを作成した。フローサイトメトリーによって、多能性マーカー発現の維持を確認した。３つのクローンが分化のために進行した。ＣｈｉＰＳＣ３１ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン２、ＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｄ１０及びＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ５。ＣｈｉＰＳＣ３１ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン２及びＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ５は、１つの対立遺伝子でのＡＤＰ Ａ２Ｍ４のノックインを標的としていたが、ＡＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４３Ｄ１０は、両方の対立遺伝子にＡＤＰ Ａ２Ｍ４ノックインを標的としていた。
【0125】
Ｔ細胞分化
ＨｉＰＳＣ維持培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回、細胞を洗浄した。２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４Ｐｌｕｓ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｔｅｍＰｒｏ３４；サプリメントを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４基礎培地、ならびにペニシリンストレプトマイシン（１％ ｖ／ｖ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びグルタミン（２ｍＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸（５０ｍｇ／ｍｌ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びモノチオグリセロール（１００ｍＭ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、更に５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｃ）を補充した）を添加し、４時間インキュベートした。体積は、培養フラスコのサイズに依存し、典型的には、少なくとも２ｍｌ／９ｃｍ２、及び２０ｍｌ／１５０ｃｍ２である。
ＨｉＰＳＣ維持培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回、細胞を洗浄した。２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４Ｐｌｕｓ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｔｅｍＰｒｏ３４；サプリメントを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４基礎培地、ならびにペニシリンストレプトマイシン（１％ ｖ／ｖ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びグルタミン（２ｍＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸（５０ｍｇ／ｍｌ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びモノチオグリセロール（１００ｍＭ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、更に５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｃ）を補充した）を添加し、４時間インキュベートした。体積は、培養フラスコのサイズに依存し、典型的には、少なくとも２ｍｌ／９ｃｍ２、及び２０ｍｌ／１５０ｃｍ２である。
【0126】
４時間後、培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回、細胞を洗浄して、残留する高濃度アクチビンＡを除去した。５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及び５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳで培地を置き換え、４４時間インキュベートした（ステージ１培地）。次いで、新鮮なステージ１培地で培地を置き換え、１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補充し、更に４８時間培養した。
【0127】
４日目に培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回、細胞を洗浄して、残留するステージ１サイトカインを除去した。次いで、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳで培地を置き換え、４８時間インキュベートした（ステージ２培地）。次いで、培地に新鮮なステージ２培地を補充し、更に４８時間細胞を培養した。
【0128】
次いで、最小限のＳＣＦ及びＶＥＧＦを必要とするステージ３培地で培地を置き換え、４８時間ごとに半分を除去供給（ｄｅｍｉ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｅｅｄｉｎｇ）しながら、１６～１８日間細胞を培養した。これは、典型的には、遠心分離（３００ｇ、１０分）による培地の採取及び懸濁液中の細胞の収集、ならびに新鮮な培地を含む培養物（すなわち、Ｔ１５０フラスコでは２０ｍＬ）に細胞懸濁液を戻すことを伴う。
【0129】
およそ１６日目に、生じた単層からＣＤ３４＋細胞を後の培養のために単離した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる３７℃３０分間の、次いでコラーゲンＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：２ｍｇ／ｍｌ）を用いる３７℃３０分間の連続的なインキュベーションによって、ＣＤ３４＋細胞を採取した。細胞懸濁液を収集し、洗浄し（ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１２分間、３００ｇで２回の遠心分離）、その後、磁気活性化ビーズ（ＭＡＣＳ）単離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ：製造業者の指示に従って）を介して、ＣＤ３４＋細胞を単離した。
【0130】
継続的なリンパ球増殖及び分化のために、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ独自の２ステージ（リンパ球増殖／Ｔ細胞成熟）培地を用いた。
【0131】
ポロキサマーＦ１０８（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓリンパ球増殖培地中での培養中に、Ｔ細胞前駆体非編集対照株を、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを用いてレンチウイルスによって形質導入した。
【0132】
Ｔ細胞表現型
フローサイトメトリーを使用して、ｉＰＳＣ由来のＴ細胞を表現型決定した。ＣＤ３（クローンＳＫ７）、Ａ２Ｍ４デキストラマー、及び生死判定染色ＥＦ５０６で細胞を染色して、ｉＰＳＣ由来のＴ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲの発現を示した。
フローサイトメトリーを使用して、ｉＰＳＣ由来のＴ細胞を表現型決定した。ＣＤ３（クローンＳＫ７）、Ａ２Ｍ４デキストラマー、及び生死判定染色ＥＦ５０６で細胞を染色して、ｉＰＳＣ由来のＴ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲの発現を示した。
【0133】
図５は、形質導入したクローンの表現型データを示す。上述のように、ＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞のレンチウイルス形質導入を介して、ｉＴ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現を誘導することができる。ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊを分化させ、ステージ４のＡＤＰ Ａ２Ｍ４Ｔ細胞（ＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞）を含有して発現したレンチウイルスで形質導入し、分化プロトコルを通じて、形質導入した細胞を進行させた。抗ＴＣＲ抗体抗Ｖα２４及びＭＡＧＥ－Ａ４ ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ／ＨＬＡ－Ａ＊０２０１デキストラマーで染色することによって測定したＦＡＣＳ及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４発現によって、細胞を表現型決定した。
【0134】
図６は、編集したｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞の表現型データを示す（ステージ５）。パネル（Ａ）は、代替的な細胞株ＣｈｉＰＳＣ３１ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン２（単一の対立遺伝子を標的とする）から分化したｉＴ細胞を示し、パネル（Ｂ）は、ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｄ１０（両方の対立遺伝子を標的とする）から分化したｉＴ細胞を示し、パネル（Ｃ）は、ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ５（単一の対立遺伝子を標的とする）から分化したｉＴ細胞を示す。分化は、編集によって影響を受けない。フローサイトメトリーによってｉＴ細胞を表現型決定し、ＣＤ４５、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、及びＣＤ３の発現を検出した。編集されたクローンは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを発現する。抗ＴＣＲ抗体抗Ｖα２４及びＭＡＧＥ－Ａ４ ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ／ＨＬＡ－Ａ＊０２０１デキストラマーで染色することによって測定したＦＡＣＳ及びＡ２Ｍ４発現によって、細胞を表現型決定した。単一の対立遺伝子におけるノックインは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ発現を促進するのに十分であり、両方の対立遺伝子を標的とする場合、発現が改善される。
【0135】
フローサイトメトリー染色
フローサイトメトリーに、以下の抗体を使用した：ＣＤ８αβ－ＢＶ６５０（クローン２ＳＴ８．５Ｈ７）、ＴＣＲγδ－ＡＰＣ（クローンＢ１）、ＴＣＲ Ｖα２４－ＰＥ（クローンＩＰ２６）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（クローンＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８α－ＰＥ－ＣＹ７（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ６９－ＢＵＶ３９５（クローンＦＮ５０）、ＣＤ２５－ＢＶ４２１（クローンＢＣ９６）、ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＦ４８８（クローンＬ２４３）、及びＥＦ５０６－ＢＶ５１０。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで試料を取得した。
フローサイトメトリーに、以下の抗体を使用した：ＣＤ８αβ－ＢＶ６５０（クローン２ＳＴ８．５Ｈ７）、ＴＣＲγδ－ＡＰＣ（クローンＢ１）、ＴＣＲ Ｖα２４－ＰＥ（クローンＩＰ２６）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（クローンＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８α－ＰＥ－ＣＹ７（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ６９－ＢＵＶ３９５（クローンＦＮ５０）、ＣＤ２５－ＢＶ４２１（クローンＢＣ９６）、ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＦ４８８（クローンＬ２４３）、及びＥＦ５０６－ＢＶ５１０。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで試料を取得した。
【0136】
ＫＩＬＲ細胞毒性アッセイ
３８４ウェルの白色ＬＵＭＩＴＲＡＣ ６００マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェル当たり、（ＫＩＬＲ ｒｅｔｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いる形質導入によって生成された）１０，０００個のＫＩＬＲ Ｔ２を添加した。ステージ６の終了時に、ウェル当たり２０，０００個の細胞で、ｉＰＳＣ株に由来するＴ細胞を添加した。１０－５Ｍ～１０－１１Ｍの力価で、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を細胞に添加した。３７℃の酸素正常状態下で２４時間、細胞及びペプチドを同時培養し、その後、室温で１時間、ＫＩＬＲ検出溶液（ＫＩＬＲ検出キット（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ））を添加した。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダーを使用して、試料からの発光を検出した。ｉＴ細胞の細胞溶解活性を、健康なドナーからの非形質導入ＰＢＬ対照と、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルス形質導入ＰＢＬ対照とを比較した。図７は、ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ（ＡＤＡＰ００１＿Ｊ ＷＴ ＮＴＤから分化したｉＴ細胞（非形質導入））、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルスで形質導入したＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ由来のｉＴ細胞（ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＷＴ Ａ２Ｍ４ ＴＤ）、及び編集したＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ１０から分化したｉＴ細胞から分化したｉＴ細胞についてのデータを示す。シグナルの増加は、細胞死の増加を示し、データは、ノックイン編集されたＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ１０の強力な細胞溶解についてのエフェクター機能を示している。
３８４ウェルの白色ＬＵＭＩＴＲＡＣ ６００マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェル当たり、（ＫＩＬＲ ｒｅｔｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いる形質導入によって生成された）１０，０００個のＫＩＬＲ Ｔ２を添加した。ステージ６の終了時に、ウェル当たり２０，０００個の細胞で、ｉＰＳＣ株に由来するＴ細胞を添加した。１０－５Ｍ～１０－１１Ｍの力価で、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を細胞に添加した。３７℃の酸素正常状態下で２４時間、細胞及びペプチドを同時培養し、その後、室温で１時間、ＫＩＬＲ検出溶液（ＫＩＬＲ検出キット（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ））を添加した。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダーを使用して、試料からの発光を検出した。ｉＴ細胞の細胞溶解活性を、健康なドナーからの非形質導入ＰＢＬ対照と、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルス形質導入ＰＢＬ対照とを比較した。図７は、ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ（ＡＤＡＰ００１＿Ｊ ＷＴ ＮＴＤから分化したｉＴ細胞（非形質導入））、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルスで形質導入したＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ由来のｉＴ細胞（ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＷＴ Ａ２Ｍ４ ＴＤ）、及び編集したＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ１０から分化したｉＴ細胞から分化したｉＴ細胞についてのデータを示す。シグナルの増加は、細胞死の増加を示し、データは、ノックイン編集されたＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ＰＴＰＲＣ＿Ａ２Ｍ４クローン３Ｇ１０の強力な細胞溶解についてのエフェクター機能を示している。
【0137】
編集したＡＤＡＰｉ００１－Ｊ ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ３Ｄ１０ｉＴ細胞、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４形質導入及び非形質導入ＡＤＡＰｉ００１－Ｊ（ＷＴ）由来のｉＴ細胞もまた、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）の存在下または不存在下で２４時間、Ａ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）またはＣＯＬＯ２０５（ＭＡＧＥ－Ａ４－ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）と同時培養した。サイトカイン（ＩＦＮγ及びＩＬ－２）及びグランザイムＢ分泌を、ＥＬＩＳＡによって測定した。編集したＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞は、抗原依存的様式で高レベルの各サイトカインを放出することが見られた。
【0138】
抗原特異的活性化アッセイ
標的細胞として、Ａ３７５（ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性及びＭＡＧＥ－Ａ４陽性）及びＣｏｌｏ２０５（ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性及びＭＡＧＥ－Ａ４抗原陰性）腫瘍細胞株を使用した。（２時間かけて休止させた）１×１０＾６個のｉＰＳＣ由来のＴ細胞またはＰＢＬ対照のいずれかと共に、２００，０００個の標的を９６ウェル丸底プレート内で同時培養した。次いで、０．５μｇのＡＤＰ－Ａ２Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を用いてまたは用いずに、標的細胞株及びＴ細胞を培養した。加えて、ペプチド及び標的細胞を用いずに、ｉＰＳＣ由来のＴ細胞を培養した。次いで、３７℃で２４時間、全ての細胞をインキュベートし、その後細胞を染色した。同時培養後、フローサイトメトリーによって、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現のアップレギュレーションが決定された。ｉＴ細胞について、非形質導入ＰＢＬ対照と、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルス形質導入ＰＢＬ対照とを比較した（図８）。抗原陽性腫瘍細胞株と共にインキュベーションすると、編集したＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞は、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５をアップレギュレートすることが見られた。
標的細胞として、Ａ３７５（ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性及びＭＡＧＥ－Ａ４陽性）及びＣｏｌｏ２０５（ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性及びＭＡＧＥ－Ａ４抗原陰性）腫瘍細胞株を使用した。（２時間かけて休止させた）１×１０＾６個のｉＰＳＣ由来のＴ細胞またはＰＢＬ対照のいずれかと共に、２００，０００個の標的を９６ウェル丸底プレート内で同時培養した。次いで、０．５μｇのＡＤＰ－Ａ２Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を用いてまたは用いずに、標的細胞株及びＴ細胞を培養した。加えて、ペプチド及び標的細胞を用いずに、ｉＰＳＣ由来のＴ細胞を培養した。次いで、３７℃で２４時間、全ての細胞をインキュベートし、その後細胞を染色した。同時培養後、フローサイトメトリーによって、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現のアップレギュレーションが決定された。ｉＴ細胞について、非形質導入ＰＢＬ対照と、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４レンチウイルス形質導入ＰＢＬ対照とを比較した（図８）。抗原陽性腫瘍細胞株と共にインキュベーションすると、編集したＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞は、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５をアップレギュレートすることが見られた。
【0139】
ＲＡＧ１ Ｎｕｌｌ細胞ノックイン
ｉＰＳＣ細胞培養
配列によるＲＡＧ１編集、及びＰＴＰＲＣ遺伝子座へのＡ２ＭＲ ＴＣＲのノックインを、ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊで実施した。ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。両方のｉＰＳＣ株を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いる酵素による解離に適応させ、４～５日ごとに継代させた。加湿した３７℃、５％のＯ２、５％のＣＯ２のインキュベーター内に、ｉＰＳＣ培養物を維持した。多能性マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１６０、及びＳＯＸ２）の発現、及び分化マーカーＳＳＥＡ－１の不在を、ＦＡＣＳ分析によって定期的に監視した。編集実験を順次行った。ＲＡＧ１を不活性化したクローン７Ｄ１０は、野生型ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊに由来した。ＲＡＧ１－／－クローン７Ｄ１０内のＰＴＰＲＣエクソン３３へのＡ２Ｍ４ ＴＣＲのノックインを介して、クローン１Ｂ７、２Ｄ７、及び２Ｅ７（ＲＡＧ１－／－ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴ）を生成した。
ｉＰＳＣ細胞培養
配列によるＲＡＧ１編集、及びＰＴＰＲＣ遺伝子座へのＡ２ＭＲ ＴＣＲのノックインを、ｉＰＳＣ株ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊで実施した。ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ ｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。両方のｉＰＳＣ株を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いる酵素による解離に適応させ、４～５日ごとに継代させた。加湿した３７℃、５％のＯ２、５％のＣＯ２のインキュベーター内に、ｉＰＳＣ培養物を維持した。多能性マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１６０、及びＳＯＸ２）の発現、及び分化マーカーＳＳＥＡ－１の不在を、ＦＡＣＳ分析によって定期的に監視した。編集実験を順次行った。ＲＡＧ１を不活性化したクローン７Ｄ１０は、野生型ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊに由来した。ＲＡＧ１－／－クローン７Ｄ１０内のＰＴＰＲＣエクソン３３へのＡ２Ｍ４ ＴＣＲのノックインを介して、クローン１Ｂ７、２Ｄ７、及び２Ｅ７（ＲＡＧ１－／－ＰＴＰＲＣＡ２Ｍ４／ＷＴ）を生成した。
【0140】
ガイドＲＮＡ配列
ガイドＲＮＡ ＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣＣを用いて、ＲＡＧ１エクソン２を標的とした。この配列は、ヌクレオチド３６，５７３，４０５～３６，５７３，４２５、第１１染色体（ヒトＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ １０３－２０２１年２月）に対応する。ガイドＲＮＡ ＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡ（ヌクレオチド１９８７５６１５１－１９８７５６１７１、１番染色体。ヒトＧＲＣｈ３８、ヒトＧＲＣｈ３８Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ１０３－２０２１年２月）で、エクソン３３ ＰＴＰＲＣを標的とした。ＩＤＴによって、ガイドＲＮＡ配列を合成した。
ガイドＲＮＡ ＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣＣを用いて、ＲＡＧ１エクソン２を標的とした。この配列は、ヌクレオチド３６，５７３，４０５～３６，５７３，４２５、第１１染色体（ヒトＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ １０３－２０２１年２月）に対応する。ガイドＲＮＡ ＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡ（ヌクレオチド１９８７５６１５１－１９８７５６１７１、１番染色体。ヒトＧＲＣｈ３８、ヒトＧＲＣｈ３８Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ１０３－２０２１年２月）で、エクソン３３ ＰＴＰＲＣを標的とした。ＩＤＴによって、ガイドＲＮＡ配列を合成した。
【0141】
リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の調製
９５℃で５分間の初期変性によって、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをアニーリングし、その後、室温まで冷却した。室温で１５分間、等モル量のアニーリングしたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖及びＣａｓ９タンパク質をインキュベートして、１０μＭのリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を生成した。
９５℃で５分間の初期変性によって、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをアニーリングし、その後、室温まで冷却した。室温で１５分間、等モル量のアニーリングしたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖及びＣａｓ９タンパク質をインキュベートして、１０μＭのリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を生成した。
【0142】
ＲＡＧ１の不活性化
１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）ストリップ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）によるヌクレオフェクションを介して、ＲＮＰ複合体をｉＰＳＣ細胞に導入した。緩衝液Ｐ３（Ｌｏｎｚａ）中に、１００ｘ１０３のＡＤＡＰｉ－００１＿Ｊ（野生型）を再懸濁させた（５ｘ１０６／ｍｌ）。３μｌのＲＮＰ複合体（１０μＭ）を２０μｌの細胞懸濁液に添加した。プログラムＣＡ－１３７でヌクレオフェクションを実施した。１×ＣｌｏｎｅＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、以下のヌクレオフェクション細胞を直ちに播種した。２つの追加の継代のために、編集した細胞プールを増殖させ、その後、クローン単離のために播種した。平均１００細胞／ウェルで、細胞を播種した。９６００個のｉＰＳＣをウェルＡ１に播種し、その後、カラム１（Ａ１～Ｈ１）で２回連続希釈した。次いで、プレートの全ての列全体で、細胞を２倍に希釈した。１×ＣｌｏｎｅＲ（商標）を補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓに、編集したＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊを播種した。２日ごとに、培地を、完全なｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓと交換した。単一コロニーの存在についてウェルをスクリーニングする前に、細胞を１２～１４日間培養した。クローンを増殖させ、ＲＡＧ１（エクソン２）におけるＩＮＤＥＬＳを配列決定するために、ＰＣＲによるスクリーニングにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。ＦＷＤプライマーＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣ（１１番染色体ヌクレオチド３６５７３３２７～３６５７３３４６（＋）ヒトＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ１０３－２０２１年２月）及びＲＥＶプライマーＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＴＣＧ．第１１染色体ヌクレオチド３６５７３８０９～３６５７３８２９（－）ヒトＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ １０３－２０２１年２月）を使用して、ＰＣＲ反応（ＮＥＢ Ｑ５ ＨｏｔＳｔａｒｔ）を実施した。Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲプログラム変性９８℃、３０秒、１サイクル、４０サイクル変性９８℃、５サイクル、アニーリング６９℃、１０秒、伸長７２℃、３０秒、１サイクル伸長７２℃、２分。各クローンからのＰＣＲ産生物をＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）にクローニングし、プラスミドクローンをサンガー配列決定して、各編集されたｉＰＳＣクローンに存在するＩＮＤＥＬＳを特徴評価する。この分析によって、クローンＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿ｃ７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－が、１つの対立遺伝子において１１ｂｐの欠失、第２の対立遺伝子において１６ｂｐの欠失を有していたことが明らかになった。両方の変異は、ＲＡＧ１に不活性化フレームシフト変異を導入することが予測される（図１）。
１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）ストリップ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）によるヌクレオフェクションを介して、ＲＮＰ複合体をｉＰＳＣ細胞に導入した。緩衝液Ｐ３（Ｌｏｎｚａ）中に、１００ｘ１０３のＡＤＡＰｉ－００１＿Ｊ（野生型）を再懸濁させた（５ｘ１０６／ｍｌ）。３μｌのＲＮＰ複合体（１０μＭ）を２０μｌの細胞懸濁液に添加した。プログラムＣＡ－１３７でヌクレオフェクションを実施した。１×ＣｌｏｎｅＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、以下のヌクレオフェクション細胞を直ちに播種した。２つの追加の継代のために、編集した細胞プールを増殖させ、その後、クローン単離のために播種した。平均１００細胞／ウェルで、細胞を播種した。９６００個のｉＰＳＣをウェルＡ１に播種し、その後、カラム１（Ａ１～Ｈ１）で２回連続希釈した。次いで、プレートの全ての列全体で、細胞を２倍に希釈した。１×ＣｌｏｎｅＲ（商標）を補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓに、編集したＡＤＡＰｉＪ００１＿Ｊを播種した。２日ごとに、培地を、完全なｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓと交換した。単一コロニーの存在についてウェルをスクリーニングする前に、細胞を１２～１４日間培養した。クローンを増殖させ、ＲＡＧ１（エクソン２）におけるＩＮＤＥＬＳを配列決定するために、ＰＣＲによるスクリーニングにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。ＦＷＤプライマーＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣ（１１番染色体ヌクレオチド３６５７３３２７～３６５７３３４６（＋）ヒトＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ１０３－２０２１年２月）及びＲＥＶプライマーＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＴＣＧ．第１１染色体ヌクレオチド３６５７３８０９～３６５７３８２９（－）ヒトＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ １０３－２０２１年２月）を使用して、ＰＣＲ反応（ＮＥＢ Ｑ５ ＨｏｔＳｔａｒｔ）を実施した。Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲプログラム変性９８℃、３０秒、１サイクル、４０サイクル変性９８℃、５サイクル、アニーリング６９℃、１０秒、伸長７２℃、３０秒、１サイクル伸長７２℃、２分。各クローンからのＰＣＲ産生物をＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）にクローニングし、プラスミドクローンをサンガー配列決定して、各編集されたｉＰＳＣクローンに存在するＩＮＤＥＬＳを特徴評価する。この分析によって、クローンＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿ｃ７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－が、１つの対立遺伝子において１１ｂｐの欠失、第２の対立遺伝子において１６ｂｐの欠失を有していたことが明らかになった。両方の変異は、ＲＡＧ１に不活性化フレームシフト変異を導入することが予測される（図１）。
【0143】
ＰＴＰＲＣ（エクソン３３）－ＡＤＡＰｉ００１＿Ｊ＿ｃ７Ｄ１０＿ＲＡＧ１－／－へのＡ２Ｍ４ ＴＣＲのノックイン
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９及びｒＡＡＶによって供給される修復テンプレートを使用して、ＰＴＰＲＣ遺伝子座（エクソン３３）へのＡ２Ｍ４のノックインを実施した。ｇＲＮＡ配列ｇｃａａｇｔｃｃａｇｃｔｔｔａａａｔｃａ（１番染色体上のヌクレオチド１９８７５６１５２～１９８７５６１７１。ヒトＧＲＣｈ３８、Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ１０３－２０２１年２月）を用いて、編集実験を実施した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって、ｃｒＲＮＡを合成した。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９及びｒＡＡＶによって供給される修復テンプレートを使用して、ＰＴＰＲＣ遺伝子座（エクソン３３）へのＡ２Ｍ４のノックインを実施した。ｇＲＮＡ配列ｇｃａａｇｔｃｃａｇｃｔｔｔａａａｔｃａ（１番染色体上のヌクレオチド１９８７５６１５２～１９８７５６１７１。ヒトＧＲＣｈ３８、Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ１０３－２０２１年２月）を用いて、編集実験を実施した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって、ｃｒＲＮＡを合成した。
【0144】
１２ウェルプレートのウェルに１×１０５個のｉＰＳＣを播種し、２４時間後にトランスフェクトした。１×ＣｌｏｎｅｒＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した完全なｍＴｅＳＲ－Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、細胞を播種した。製造業者の指示に従って、トランスフェクション混合物を調製した。５００ｎｇのアニーリングしたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖及び２．５μｇのＣａｓ９タンパク質を、５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）及び５μｌのＣａｓ９に添加し、室温で１５分間インキュベートして、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を生成した。５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ中の３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を、ＲＮＰ複合体形成後に添加し、次いで完全なトランスフェクション混合物を細胞に添加した。トランスフェクションの４時間後に、ＰＴＰＲＣ＿ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４＿ＬＯＸＰＮＥＯをコードするｒＡＡＶ（血清型３）で、ｉＰＳＣを形質導入した（１×１０３Ｖｇ／細胞）。ｒＡＡＶ形質導入の２４時間後に、培地を、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を補充した完全なｍＴｅＳＲ－Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。１回継代するために、編集した細胞プールを増殖させ、その後、限界希釈を用いて、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）でコーティングした９６ウェルプレート内でクローンを単離した。１．５×１０４個のｉＰＳＣをウェルＡ１に播種し、その後、カラム１（Ａ１～Ｈ１）で２回連続希釈した。次いで、プレートの全ての列全体で、細胞を２倍に希釈した。１×ＣｌｏｎｅＲ（商標）を補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓに、編集したｉＰＳＣを播種した。２日ごとに、培地を、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を補充した完全なｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓと交換した。単一コロニーの存在についてウェルをスクリーニングする前に、細胞を１２～１４日間培養した。標的導入遺伝子の挿入を確認するために、クローンを拡大し、ＰＣＲによるスクリーニングのためにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。
【0145】
ＰＣＲ反応は相同性アームの境界を越えて行った。プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＦＷＤ ＣＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＡ及びＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＲＥＶ ＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＡＡＧで、５’ＬＨＡ境界を増幅させた。プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＦＷＤは、１番染色体上のヌクレオチド１９８７５５５６２～１９８７５５５８５（＋）（ヒトＧＲＣｈ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ １０３－２０２１年２月）に対応し、ＬＨＡ配列の９３ヌクレオチド上流に存在する。ＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＲＥＶプライマーは、Ａ２Ｍ４導入遺伝子配列に存在する。プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＦＷＤ ＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴ及びＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＲＥＶ ＴＡＧＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＣＴＴで、３’ＬＨＡ境界を増幅させた。プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＦＷＤ１は、ＮＥＯカセットに存在し、ＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＲＥＶ１は、１番染色体上のヌクレオチド１９８７５６７２９～１９８７５６７５２（－）に対応し、ＲＨＡから４７ヌクレオチド下流に存在する。（ヒトＧＲＣｈ３８、Ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｌｅａｓｅ１０３－２０２１年２月）。Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲプログラム変性９８℃、３０秒、１サイクル、４０サイクル変性９８℃、５秒、アニーリング６６℃、１０秒、伸長７２℃、２５秒、１サイクル伸長７２℃、５分。ＰＣＲ産生物をゲル精製し、サンガー配列決定して、組込みを確認した。陽性クローンを拡大し、小さな細胞バンクを作成した。フローサイトメトリーによって、多能性マーカー発現の維持を確認した。
【0146】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイ
２０μｌの完全なＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン）中１５００／ウェルの密度で、ＧＦＰ＋ｖｅＡ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４＋ｖｅ、ＨＬＡ－Ａ２＊０２＋ｖｅ）標的細胞を、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に播種した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍに添加し、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿したインキュベーター内でインキュベートした。
２０μｌの完全なＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン）中１５００／ウェルの密度で、ＧＦＰ＋ｖｅＡ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４＋ｖｅ、ＨＬＡ－Ａ２＊０２＋ｖｅ）標的細胞を、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に播種した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍに添加し、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿したインキュベーター内でインキュベートした。
【0147】
２４時間後に、１０μＭの最終濃度のＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）で標的にパルスをかけた。１０μｌの培地に、６０００個のｉＴ細胞を３回に分けて添加した。２時間ごとに６日間、Ｉｎｃｕｃｙｔｅで画像を撮影した。次いで、Ｔｏｐ－Ｈａｔプロセス定義を使用するＺＯＯＭ２０１８Ａソフトウェアを使用して、データを分析した。
【0148】
結論：
ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを発現するｉＴ細胞の分化を可能にする新規の編集戦略を提示してきた。編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞活性化及び細胞溶解エフェクター機能は、抗原に依存することが示された。ＣＤ５６及びＣＤ８αα発現、強力なサイトカイン及び細胞毒性を含む、編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞の表現型は、編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が先天的かつ適応可能な表現型を有することを示唆している。
ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを発現するｉＴ細胞の分化を可能にする新規の編集戦略を提示してきた。編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞活性化及び細胞溶解エフェクター機能は、抗原に依存することが示された。ＣＤ５６及びＣＤ８αα発現、強力なサイトカイン及び細胞毒性を含む、編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞の表現型は、編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が先天的かつ適応可能な表現型を有することを示唆している。
【0149】
デキストラマー染色は、編集されたＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が、ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ ＴＣＲのみを発現することを示唆しているが、この技術は、完全なＴＣＲレパートリーに適用可能である。編集されたＡ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞は、健康なドナーからのＡ２Ｍ４ ＴＣＲ形質導入ＰＢＬと比較して、同等であるか、または増加した、強力な細胞溶解性及びエフェクター機能を呈している。これは、自己Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ Ｔ細胞のように、ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が、細胞療法に有効であり、患者に臨床的利益をもたらすであろうことを示唆している。
【0150】
ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞の生成は、ｉＰＳＣ由来の同種異系プラットフォームを生成する上で重要なマイルストーンである。単一の定義された遺伝子座における遺伝子ノックインを介して、ｉＴ細胞におけるＴＣＲ発現を促進する能力は、様々な腫瘍抗原に対して特異的なＴＣＲをコードする複数のクローンｉＰＳＣバンクを生成する機会を提供する。将来的には、この「既製の」プラットフォームは、腫瘍抗原発現プロファイルに特異的な患者に、適時な様式で、様々な、定義されかつ一貫したＴ細胞療法を送達することができる。
【0151】
配列
配列番号１、ＭＡＧＥ Ａ４
配列番号２、ＭＡＧＥ Ａ４ペプチド
ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ
配列番号３、（ＣＤ８α）ＣＤＲは太字で下線付き、シグナル配列は斜体で下線付き
配列番号４、（ＣＤ８α）
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＧＡ
配列番号５、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖）ＣＤＲは太字で下線付き
配列番号６、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖コード配列）
ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡ
配列番号７、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖）ＣＤＲは太字で下線付き
配列番号８、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖コード配列）
ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣ
配列番号９、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖可変領域）１３６ＡＡ－ＣＤＲは太字で下線付き
配列番号１０、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖可変領域）１３３ＡＡ－ＣＤＲは太字で下線付き
配列番号１１、ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖、（残基４８～５３）
ＶＳＰＦＳＮ
配列番号１２、ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖、（残基７１～７６）
ＬＴＦＳＥＮ
配列番号１３、ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖、（残基１１１～１２５）
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ
配列番号１４、ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖、（残基４６～５０）
ＫＧＨＤＲ
配列番号１５、ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖、（残基６８～７３）
ＳＦＤＶＫＤ
配列番号１６、ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖、（残基１１０～１２３）
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ
配列番号１７、ＣＤＲ１ ＣＤ８α（残基４５～５３）
ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ
配列番号１８、ＣＤＲ２ ＣＤ８α（残基７２～７９）
ＹＬＳＱＮＫＰＫ
配列番号１９、ＣＤＲ３ ＣＤ８α（残基１１８～１２３）
ＬＳＮＳＩＭ
配列番号２０ ヒトアルファ－フェトプロテイン
配列番号２１ ヒトアルファ－フェトプロテインペプチド
ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ
親ＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＡＶ１２－２＊０２／ＴＲＡＪ４１＊０１／ＴＲＡＣアルファ鎖アミノ酸細胞外配列（配列番号２２）
親ＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＢＶ９＊０１／ＴＲＢＤ２／ＴＲＢＪ２－７＊０１／ＴＲＢＣ２ ベータ鎖アミノ酸細胞外配列（配列番号２３）
参照ＴＣＲアルファ鎖ＤＮＡ配列（配列番号２４）
参照ＴＣＲベータ鎖ＤＮＡ配列（配列番号２５）
ＤＲＧＳＱＳ（αＣＤＲ１）、配列番号２６
ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）、配列番号２７
ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号２８
ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）、配列番号２９
ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）、配列番号３０
ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）、配列番号３１
ＤＲＧＳＱＡ（αＣＤＲ１）、配列番号３２
ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３３
ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３４
ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３５
ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３６
ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３７
ＤＲＧＳＦＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３８
ＤＲＧＳＹＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３９
ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号４０
バリアントＡＦＰ ＴＣＲ（ＡＦＰ ＴＲＡＶ１２－２＊０２／ＴＲＡＪ４１＊０１／ＴＲＡＣアルファ鎖アミノ酸細胞外配列、ＣＤＲは下線付き（配列番号４１）
バリアントＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＢＶ９＊０１／ＴＲＢＤ２／ＴＲＢＪ２－７＊０１／ＴＲＢＣ２ベータ鎖アミノ酸細胞外配列、ＣＤＲは下線付き（配列番号４２）
左相同性アーム（ＬＨＡ）、配列番号４３
ＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＧＴＡＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＣＣＡＡＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＴＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＡＧＧＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＣＡＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡ
右相同性アーム（ＲＨＡ）、配列番号４４
ＧＡＡＡＡＧＡＣＡＴＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＧＧＴＡＴＡＣＡＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＧＣＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＧＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＣＧＴＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＧＡＡＧＴＧＴＴＡＡＣＴＴＡＧＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡ
ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４、配列番号４５
ＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＡ
合成ポリＡ配列、配列番号４６
ＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ
ＥＦ１Ａプロモーター、配列番号４７
ＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ
ＬＯＸＰ、配列番号４８
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
ＮＥＯ耐性遺伝子、配列番号４９
ＡＴＧＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡ
プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＦＷＤ（配列番号５０）
ＣＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＡ
プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＲＥＶ（配列番号５１）
ＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＡＡＧ
プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＦＷＤ（配列番号５２）
ＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴ
プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＲＥＶ（配列番号５３）
ＴＡＧＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＣＴＴ
プライマーＩＴＲ＿Ｆ（配列番号５４）
ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ
プライマーＩＴＲ＿Ｒ（配列番号５５）
ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ
配列番号１、ＭＡＧＥ Ａ４
【化19】
ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ
配列番号３、（ＣＤ８α）ＣＤＲは太字で下線付き、シグナル配列は斜体で下線付き
【化20】
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＧＡ
配列番号５、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖）ＣＤＲは太字で下線付き
【化21】
ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡ
配列番号７、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖）ＣＤＲは太字で下線付き
【化22】
ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣ
配列番号９、（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖可変領域）１３６ＡＡ－ＣＤＲは太字で下線付き
【化23】
【化24】
ＶＳＰＦＳＮ
配列番号１２、ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖、（残基７１～７６）
ＬＴＦＳＥＮ
配列番号１３、ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖、（残基１１１～１２５）
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ
配列番号１４、ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖、（残基４６～５０）
ＫＧＨＤＲ
配列番号１５、ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖、（残基６８～７３）
ＳＦＤＶＫＤ
配列番号１６、ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖、（残基１１０～１２３）
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ
配列番号１７、ＣＤＲ１ ＣＤ８α（残基４５～５３）
ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ
配列番号１８、ＣＤＲ２ ＣＤ８α（残基７２～７９）
ＹＬＳＱＮＫＰＫ
配列番号１９、ＣＤＲ３ ＣＤ８α（残基１１８～１２３）
ＬＳＮＳＩＭ
配列番号２０ ヒトアルファ－フェトプロテイン
【化25】
ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ
親ＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＡＶ１２－２＊０２／ＴＲＡＪ４１＊０１／ＴＲＡＣアルファ鎖アミノ酸細胞外配列（配列番号２２）
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）、配列番号２７
ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号２８
ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）、配列番号２９
ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）、配列番号３０
ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）、配列番号３１
ＤＲＧＳＱＡ（αＣＤＲ１）、配列番号３２
ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３３
ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３４
ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３５
ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３６
ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号３７
ＤＲＧＳＦＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３８
ＤＲＧＳＹＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３９
ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ２）、配列番号４０
バリアントＡＦＰ ＴＣＲ（ＡＦＰ ＴＲＡＶ１２－２＊０２／ＴＲＡＪ４１＊０１／ＴＲＡＣアルファ鎖アミノ酸細胞外配列、ＣＤＲは下線付き（配列番号４１）
【化30】
【化31】
ＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＧＴＡＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＣＣＡＡＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＴＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＡＧＧＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＣＡＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡ
右相同性アーム（ＲＨＡ）、配列番号４４
ＧＡＡＡＡＧＡＣＡＴＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＧＧＴＡＴＡＣＡＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＧＣＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＧＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＣＧＴＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＧＡＡＧＴＧＴＴＡＡＣＴＴＡＧＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡ
ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４、配列番号４５
ＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＡ
合成ポリＡ配列、配列番号４６
ＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ
ＥＦ１Ａプロモーター、配列番号４７
ＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ
ＬＯＸＰ、配列番号４８
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
ＮＥＯ耐性遺伝子、配列番号４９
ＡＴＧＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡ
プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＦＷＤ（配列番号５０）
ＣＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＡ
プライマーＰＴＰＲＣ－５ｉｎｔ－ＲＥＶ（配列番号５１）
ＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＡＡＧ
プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＦＷＤ（配列番号５２）
ＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴ
プライマーＰＴＰＲＣ－３ｉｎｔ－ＲＥＶ（配列番号５３）
ＴＡＧＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＣＴＴ
プライマーＩＴＲ＿Ｆ（配列番号５４）
ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ
プライマーＩＴＲ＿Ｒ（配列番号５５）
ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】