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▶ ライフ サイエンス インクバトーア ベトリープス ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-13
(54)【発明の名称】ナノ粒子の組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 9/14 20060101AFI20230606BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20230606BHJP
A61K 47/52 20170101ALI20230606BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230606BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20230606BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230606BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20230606BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230606BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230606BHJP
【ＦＩ】
A61K9/14
A61K47/04 ZNA
A61K47/52
A61K45/00
A61K38/00
A61K31/7088
A61K47/69
A61K9/51
A61P37/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568554
(86)(22)【出願日】2021-05-12
(85)【翻訳文提出日】2023-01-06
(86)【国際出願番号】 EP2021062751
(87)【国際公開番号】W WO2021229015
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】20174156.8
(32)【優先日】2020-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514225146
【氏名又は名称】ライフ サイエンス インクバトーア ベトリープス ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】キューベルベック， アルミン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC06
4C076CC07
4C076CC41
4C076DD29
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA17
4C084BA42
4C084BA44
4C084MA38
4C084MA41
4C084NA13
4C084ZB091
4C084ZB092
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA38
4C086MA41
4C086NA13
4C086ZB09
(57)【要約】
本開示は、薬学的に許容され得る化合物の担体としてのナノ粒子の組成物、組成物の調製方法、および医療目的、特に免疫予防法または免疫療法のための組成物の使用に関する。本発明はまた、組成物を含有するワクチンに関する。この組成物は、任意の種類の抗原が負荷された、二酸化ケイ素および表面上の官能基を有するナノ粒子を含み得、上記化合物は、ナノ粒子のペイロードを表し、１５０ｎｍ未満の粒径を有し得る。ナノ粒子の表面上の官能基は、そのような化合物の負電荷および正電荷を担持および／または安定化するのに適している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二酸化ケイ素および表面上の官能基を有する、薬学的に許容され得る化合物が負荷されたナノ粒子を含む組成物であって、－ 前記官能基は、前記薬学的に許容され得る化合物の負電荷および正電荷の両方を担持および／または安定化することができ、
－ 前記組成物のゼータ電位は、少なくとも±１５ｍＶの値を有し、
－ 前記ナノ粒子は、１５０ｎｍ未満の粒径を有する、
組成物。
【請求項2】
前記ナノ粒子が、ｎｍ２単位の前記ナノ粒子の表面に対する前記薬学的に許容され得る化合物の総数［分子／ｎｍ２］に関して、最大０．５の表面負荷密度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物の多分散性指数（ＰＤＩ）が０～０．３２である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物のゼータ電位が、少なくとも±３０ｍＶの値を有する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
前記負荷されたナノ粒子の合計の正味電荷が０とは異なる、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記官能基が、共有結合または吸着結合によって前記ナノ粒子の表面に結合されたリンカーＬに連結されている、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
前記リンカー化合物Ｌが、官能基として少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記リンカー化合物Ｌが、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）基を含む、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項9】
前記リンカーＬが、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－グアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ））ＮＨ２）、－ＰＯ３Ｈ２、－ＰＯ２ＣＨ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＮＲ３
＋Ｘ－の群から選択される少なくとも１つの更なる官能基Ｌ’を含む、請求項６から８までのいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
前記リンカー化合物Ｌが、少なくとも式（Ｉ）の構造単位＊－（－Ｏ）３Ｓｉ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｑ－Ｙ（Ｉ）
［式中、
Ｘは、互いに独立して、Ｈまたは負電荷であり、
Ｙは、互いに独立して、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、－ＮＨ２または－ＮＨ３ ＋であり、
ｎ、ｐおよびｑは、互いに独立して、０または１～２５の数であり、
＊－は、前記ナノ粒子との連結点である］
を含む、請求項６から９までのいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
前記薬学的に許容され得る化合物が、吸着結合によって前記ナノ粒子にコンジュゲートされている、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項12】
前記薬学的に許容され得る化合物が、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖）、核酸またはペプチド抗原を含む群から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項13】
前記薬学的に許容され得る化合物が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、欠損感染性粒子（ＤＩＰ）またはエピトープを含む群から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項14】
ＰＡＭＰが、ＴＬＲアゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）リガンド、メラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ－５）リガンド、細胞質ゾルＤＮＡセンサ（ＣＤＳ）リガンド、ＳＴＩＮＧリガンド（環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ））の群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記ペプチドが、酵素カテプシンＢにより切断可能なリンカーを有するＣ末端伸長部を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項16】
ワクチンまたは免疫賦活剤として使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
二酸化ケイ素および表面上の官能基を有し、１５０ｎｍ未満の粒径を有するナノ粒子であって、前記ナノ粒子に共有結合または吸着結合したリンカーＬを含み、前記リンカーＬが、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）基を含む、ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、薬学的に許容され得る化合物の担体としてのナノ粒子の組成物、医療目的、特に免疫予防法または免疫療法のための組成物の使用、ならびにナノ粒子自体に関する。本発明はまた、組成物および／またはナノ粒子を含有するワクチンに関する。
本発明は、薬学的に許容され得る化合物の担体としてのナノ粒子の組成物、医療目的、特に免疫予防法または免疫療法のための組成物の使用、ならびにナノ粒子自体に関する。本発明はまた、組成物および／またはナノ粒子を含有するワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ナノ医療およびナノ送達システムは、比較的新しいが急速に発展している科学であり、ナノスケール範囲の材料を使用して、診断もしくは治療ツールの手段として機能させるか、または治療薬を体内の特定の標的部位に送達される。特に、ナノ粒子は、化学療法薬、生物学的薬剤、免疫療法薬の送達、および免疫療法におけるワクチンとして知られている。
ナノ医療およびナノ送達システムは、比較的新しいが急速に発展している科学であり、ナノスケール範囲の材料を使用して、診断もしくは治療ツールの手段として機能させるか、または治療薬を体内の特定の標的部位に送達される。特に、ナノ粒子は、化学療法薬、生物学的薬剤、免疫療法薬の送達、および免疫療法におけるワクチンとして知られている。
【0003】
官能化ナノ粒子は、薬物送達系として、例えば抗原の担体としてよく知られている。文献には、特に、抗原がカプセル化されているかまたはナノ粒子の表面に結合している担体系が記載されている。
【0004】
国際公開第２００６／０３７９７９号は、アジュバントおよび抗原、例えば腫瘍および病原体抗原を含む金ナノ粒子（ＧＮＰ）、ならびに癌および感染性疾患の処置などの様々な用途におけるそれらの使用を記載している。糖質リガンドを有するナノ粒子または抗体に基づく免疫原性構造、ならびに治療目的および予防目的、ならびに糖質構造に対する抗体の単離および検出のためのそれらの使用も開示される。
【0005】
国際公開第２０１３／０３４７４１号および国際公開第２０１３／０３４７２６号は、リンカーを介して結合したエピトープペプチドを有し、例えば哺乳動物対象における腫瘍の予防的処置または治療的処置においてワクチンとしての使用が見出されるナノ粒子に関する。
【0006】
国際公開第２０１１／１５４７１１号は、インスリンなどのペプチドの送達のための担体として作用する糖化金ナノ粒子を記載している。
【0007】
国際公開第２０１０／００６７５３号は、少なくとも１つの抗原が表面に結合した二酸化ケイ素の単分散ナノ粒子を開示している。ナノ粒子は、癌の免疫予防または免疫療法に使用される。
多くのナノ粒子が、特に癌の処置に関連して調査および開発されてきたが、特にそのアジュバント効果の点で、改善された特性を有する物質を提供することへの需要は依然として高い。さらに、薬理学的に関連する薬剤を身体の免疫系に提示するための柔軟で便利なシステムとしてナノ粒子を提供する必要がある。
多くのナノ粒子が、特に癌の処置に関連して調査および開発されてきたが、特にそのアジュバント効果の点で、改善された特性を有する物質を提供することへの需要は依然として高い。さらに、薬理学的に関連する薬剤を身体の免疫系に提示するための柔軟で便利なシステムとしてナノ粒子を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２００６／０３７９７９号
【特許文献2】国際公開第２０１３／０３４７４１号
【特許文献3】国際公開第２０１３／０３４７２６号
【特許文献4】国際公開第２０１１／１５４７１１号
【特許文献5】国際公開第２０１０／００６７５３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明の要旨
したがって、本発明の目的は、特に免疫予防法または免疫療法に使用するための改善されたナノ粒子およびそれらを含む組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、医療処置のための広範囲の様々なリガンドを担持するのに適したすぐに使用可能なナノ粒子を生成するための簡単な方法を可能にするプラットフォーム技術を提供することである。これらのナノ粒子は、有効な免疫調節活性を有するべきである。
したがって、本発明の目的は、特に免疫予防法または免疫療法に使用するための改善されたナノ粒子およびそれらを含む組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、医療処置のための広範囲の様々なリガンドを担持するのに適したすぐに使用可能なナノ粒子を生成するための簡単な方法を可能にするプラットフォーム技術を提供することである。これらのナノ粒子は、有効な免疫調節活性を有するべきである。
【0010】
これらの目的は、薬学的に許容され得る化合物（好ましくは任意の種類の抗原）が負荷された、二酸化ケイ素および表面上の官能基を有するナノ粒子を含む組成物を提供することによって解決される。化合物は、ナノ粒子のペイロードを表す。ナノ粒子は、１５０ｎｍ未満の粒径を有する。ナノ粒子の表面上の官能基は、そのような化合物の負電荷および正電荷を担持および／または安定化するのに適している。組成物は、少なくとも±１５ｍＶのゼータ電位を有する。
【0011】
本発明による組成物を用いて、コロイド懸濁液の安定性の欠如という、薬物送達のためのナノ粒子の１つの基本的な問題が克服される。
【0012】
水性系において、表面電荷は本質的にコロイド系の安定性を保証する。これらの電荷は正または負であり得る。粒子の凝集を実質的に低減またはそれどころか回避するためには、同じ電荷の十分な官能基が存在することが重要であり、これが静電反発をもたらす。コロイド担体系の電荷が反対に荷電した分子の吸着によって補償される場合、凝集体が形成され、コロイド系が崩壊するであろう。
【0013】
凝集体は、著しく大きな粒径を有し、このことは体内でのこれらの大きな粒子の効果的な輸送を危険にさらし、あまり効果的でない免疫調節有効性もたらす。
【0014】
１５０ｎｍ未満の粒径および少なくとも±１５ｍＶのゼータ電位を有するナノ粒子を含む本発明による組成物は、組成物が十分に安定であることを保証する。特に生理学的条件下では、その中に分散されたナノ粒子は、体内の主要な活性部位に効果的に輸送され得る。したがって、本発明による組成物は、リンパ系への、特に投与部位から樹状細胞が位置するリンパ節へのナノ粒子の改善された輸送を可能にする。
【0015】
皮下注射によって投与される場合、本発明による粒子は、血液循環に入るには大きすぎるため、それらの迅速な排出ならびに重度の全身有害作用は本質的に回避される。同時に、それらはリンパ管に侵入し、食作用によって樹状細胞に入るくらい十分小さい。粒子を皮内、腹腔内または筋肉内に投与する場合も同様である。したがって、静脈内または動脈内投与を除いて、粒子を非経口的に投与することが好ましい。
【0016】
本発明者らは、本発明による組成物中の粒子が表面上に多数の化合物を担持できることを見出した。ナノ粒子の所望の機能を考慮して、化合物は薬学的に許容され得る。化合物の総量は、ｎｍ２（表面負荷密度）単位のナノ粒子の表面に対して最大５％（重量基準）であり得る。大量の化合物を担持するナノ粒子の適合性は、高用量のそのような化合物（例えば、抗原または原薬）が送達される場合に特に重要である。
【0017】
本発明による組成物は、二酸化ケイ素および表面上の官能基を有するナノ粒子を含む。官能基は、ナノ粒子の表面に直接的または間接的に連結することができる。本発明の好ましい実施形態では、官能基は、リンカー（以下、リンカー化合物Ｌ）を介してナノ粒子の表面に連結している。リンカー化合物Ｌは、任意の方法によって、特に共有結合または吸着結合によって、最も好ましくは共有結合によってナノ粒子の表面に連結することができる。
【0018】
特に好ましい実施形態では、リンカー化合物Ｌは、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）もしくはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基からなる群から選択される少なくとも１つの官能基および／またはグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）もしくはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）からなる群から選択される少なくとも１つの官能基を含む。好ましくは、それは、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、グアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）からなる群から選択される少なくとも１つの基との両方を含む。最も好ましいのは、リンカー化合物Ｌがカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）とを含むことである。
そのようなリンカー化合物Ｌは、アニオン性もしくはカチオン性の、また非極性の薬学的に許容され得る化合物（例えば、疎水性ペプチド）の吸着結合を可能にする。これにより、リンカーは、ナノ粒子の表面への広範囲の化学的に多様な化合物の単純なカップリングのためのプラットフォーム技術を提供する。
そのようなリンカー化合物Ｌは、アニオン性もしくはカチオン性の、また非極性の薬学的に許容され得る化合物（例えば、疎水性ペプチド）の吸着結合を可能にする。これにより、リンカーは、ナノ粒子の表面への広範囲の化学的に多様な化合物の単純なカップリングのためのプラットフォーム技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1-1】図１ａ～図１ｄは、以下のＳｉＯ２粒子のＴＥＭ画像を示す。図１ａは、粒径６８ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。図１ｂは、粒径４０ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。図１ｃは、粒径２５ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。図１ｄは、粒径１５ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
【図1-2】同上。
【図1-3】同上。
【図1-4】同上。
【図3】図３は、本発明によるナノ粒子の横断面の概略図を示す。Ａはリンカー化合物Ｌによる表面官能化を表し、Ｂは非晶質ＳｉＯ２シェルを表し、Ｃはコア材料を表し、これは空隙、水または任意の他の材料ならびに非晶質ＳｉＯ２であり得る。直径ｄ１は０～１４９ｎｍであり、ｄ２は１０～１５０ｎｍである。
【図4】図４ｂは、本発明による好ましい３つの部分からなるバイオコンジュゲートを示す。図４ｂで使用したペプチドは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１由来の極めて疎水性のエピトープである。Ｎ末端伸長のために、酵素的（カテプシンＢ）切断可能ペプチドリンカーＶａｌ－Ｃｉｔを使用して、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩに対する天然の未修飾抗原の放出を確実にした。ナノ粒子への溶解性および静電引力を高めるために、伸長部分「Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ」を使用した。また、例えばＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＡｓｐまたはＡｒｇ６による伸長も可能である。
【図6】６％ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷの負荷まで、吸着されたポリ（Ｉ：Ｃ）による粒径の増加のために、測定されたＺ平均値は増加する（図６ｂ）。また、低いＰＤＩ（＜０．１）は、滑らかな粒子負荷（図６ａ）を示す。
【図7-1】図７ａ：ナノ粒子を含まないポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ。図７ｂ：ポリ（Ｉ：Ｃ）を含まないＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子。図７ｃ：６重量％のポリ（Ｉ：Ｃ）を担持したＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子。図７ｄ：８重量％のポリ（Ｉ：Ｃ）を担持したＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子。
【図7-2】同上。
【図10】図１０ａおよび図１０ｂ：分化したＴＨＰ－１細胞をポリ（Ｉ：Ｃ））［１２．５μｇ／ｍｌ］、ＳｉＯ２－Ａｒｇ［０．５ｍｇ／ｍＬ］または新規なアジュバント（ＳｉＯ２－Ａｒｇ［０．５ｍｇ／ｍＬ］に結合したポリ（Ｉ：Ｃ）［１２．５μｇ／ｍｌ］）で刺激した後の異なる時点でのサイトカイン放出。
【図11-1】シリカナノ粒子に吸着的に結合したＴＬＲ３アゴニスト（群Ｅ）は、同じ濃度および同一の試験条件下で適用された遊離ＴＬＲ３アゴニスト（群Ｃ）よりも明らかに優れていることを示すことができた。免疫ブースターＺｅｌＮａｔｅ（登録商標）（群Ｂ）もまた、プラセボ群（群Ａ）と比較して、この研究で有意な改善を示さなかった。これは、有意な効果が観察されなかった群Ｄの未修飾シリカナノ粒子にも当てはまる（図１１ａおよび図１１ｂ）。
【図11-2】同上。
【図13】ワクチン誘導性ＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を評価するために、エクスビボ再刺激脾細胞をＩＦＮ－γ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）とそれに続くフローサイトメトリーで評価した（図１３）。
【図14】図１４は、遊離抗原ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＨＭＷ、高分子量）「遊離抗原＋ＴＬＲアゴニスト」または２３ｎｍの直径を有するアルギニル化シリカナノ粒子に両方とも吸着結合したＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＨＭＷ）のいずれかを受けたマウスの生存率を示す。
【図16】図１６：Ｈ２－Ｋｂ陽性細胞を、ＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２の有無で、天然のもしくは伸長ＯＶＡ２５７－２６４エピトープまたは全長ＯＶＡタンパク質の５μＭ溶液と６時間インキュベートした後のＯＶＡ２５７－２６４ＭＨＣ Ｉ発現。２５－Ｄ１．１６検出抗体で標識した後、フローサイトメトリーによって定量化を行った。
【図17】記載なし。
【図18】記載なし。
【発明を実施するための形態】
【0020】
発明の詳細な説明
ナノ粒子のゼータ電位は、ナノ粒子の表面電荷特性を特徴付けるために当業者に知られている一般的に使用されるパラメータである。それは、粒子の電位を反映している。粒子の凝集を回避するために、互いに反発する同じ電荷の十分な官能基が存在することが重要である。凝集体は、コロイド系を崩壊させる。結果として生じる凝集体は、個々の粒子よりも著しく大きい粒径を有し、したがって、リンパ管の有窓内皮を介した所望の輸送機構はもはや保証されない。それはコロイド系の安定性を示す尺度として受け入れられている。
ナノ粒子のゼータ電位は、ナノ粒子の表面電荷特性を特徴付けるために当業者に知られている一般的に使用されるパラメータである。それは、粒子の電位を反映している。粒子の凝集を回避するために、互いに反発する同じ電荷の十分な官能基が存在することが重要である。凝集体は、コロイド系を崩壊させる。結果として生じる凝集体は、個々の粒子よりも著しく大きい粒径を有し、したがって、リンパ管の有窓内皮を介した所望の輸送機構はもはや保証されない。それはコロイド系の安定性を示す尺度として受け入れられている。
【0021】
現在の特性評価方法は、懸濁液中の粒子の平均電気泳動移動度を測定するアンサンブル測定（例えば、位相分析光散乱、ドップラー速度測定、ストリーミング電位差測定）に基づく（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．１２ Ｄｅｃ．２０１７；７（１）：１７４７９，ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５７２７１７７）。動的光散乱（ＤＬＳ）（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、英国）を用いて本発明による組成物のゼータ電位を測定することが特に好ましい。
【0022】
本発明による組成物のゼータ電位は、少なくとも±１５ｍＶ、好ましくは±３０ｍＶ、より好ましくは±６０ｍＶ、最も好ましくは±２５～±４０ｍＶの値を有する。これにより、望ましくはコロイド懸濁液である組成物が安定化され、これは系の崩壊が本質的に回避されることを意味する。
【0023】
本発明による組成物は、１５０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍまたはそれ未満の粒径を有するナノ粒子を含有する。５０ｎｍまたはそれ未満の粒径を有するナノ粒子がより好ましく、２０～３０ｎｍの粒径を有するナノ粒子が最も好ましい。本明細書で定義される粒径は、全範囲にわたるランダムな分布は存在せず、代わりに、その範囲内の定義された粒径が選択され、その標準偏差は最大１５％、好ましくは最大１０％であり、標準偏差は常に二峰性または多峰性分布の場合の極大値に関連するように解釈されるべきである。
【0024】
ナノ粒子の粒径の指標は、Ｚ平均直径である。動的光散乱で測定されるＺ平均直径は、キュムラント平均としても知られているパラメータである。これは、本技術によって生み出される主要かつ最も信頼性の高いパラメータである。Ｚ平均直径は、典型的には、ＩＳＯ ２２４１２：２０１７に従った品質管理設定で使用される。動的光散乱技術は、強度加重分布を与え、分布における各粒子の寄与は、粒子によって散乱された光の強度に関連するであろう。強度加重分布は、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、英国）で測定することが好ましい。
【0025】
好ましい実施形態では、本発明によるナノ粒子のＺ平均直径は、ＩＳＯ ２２４１２：２０１７に従って測定して、５ｎｍ以上１５０ｎｍ未満、好ましくは１５ｎｍ以上６０ｎｍ以下、より好ましくは２０ｎｍ以上４０ｎｍ以下、さらにより好ましくは２０ｎｍ～３０ｎｍの範囲にある。
【0026】
本発明によるナノ粒子の粒径および組成物の安定性は、最大０．２μｍの孔径を有する滅菌フィルターによる濾過によってさらに確認される。しかしながら、これは直径５０ｎｍ未満のナノ粒子にのみ実用的である。
【0027】
本発明の組成物の安定性は、その多分散性指数（ＰＤＩ）によって実証され得る。ＰＤＩは、一般に、系の均一性、本発明の文脈において、コロイド状ナノ粒子懸濁液の均一性および安定性の指標である。ＰＤＩはナノ粒子サイズ分布を反映している。より広い範囲の粒径を有するサンプルはより高いＰＤＩを有するが、均一なサイズの粒子からなるサンプルはより低いＰＤＩを有する。当業者は、ＰＤＩを測定するための方法および機器、特にＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、英国）を知っている。
【0028】
０．７を超えるＰＤＩは、サンプルが広いサイズ分布を有することを示す。０．１未満のＰＤＩは単分散であると考えられる。様々なサイズ分布アルゴリズムは、これらの２つの極値の間に収まるデータを扱うこれらのパラメータの計算は、ＩＳＯ標準文書１３３２１：１９９６ ＥおよびＩＳＯ ２２４１２：２００８に定義されている。
【0029】
本発明による組成物は、０～０．３２、好ましくは０．１～０．３、より好ましくは０．１～０．２、最も好ましくは０．１未満のＰＤＩを示す。０．１未満のＰＤＩを有する本発明による組成物は、好ましくは単分散である。
【0030】
好ましい実施形態では、本発明によるナノ粒子のＺ平均直径は、２０ｎｍ以上４０ｎｍ以下の範囲内であり、ＰＤＩは０．１～０．３０であり、ゼータ電位は±２０ｍＶ～±４０ｍＶである。
【0031】
より好ましい実施形態では、本発明によるナノ粒子のＺ平均直径は２０～３０ｎｍの範囲内であり、ＰＤＩは０．１～０．２であり、ゼータ電位は±２５～±４０ｍＶである。
【0032】
最も好ましい実施形態では、本発明によるナノ粒子のＺ平均直径は２０ｎｍ～３０ｎｍの範囲内であり、ＰＤＩは０．１未満であり、ゼータ電位は±２５ｍＶ～±４０ｍＶである。
【0033】
また、ＴＥＭまたはＳＥＭにより、負荷および放出された粒子の粒径を測定することも可能である。
【0034】
本明細書で使用される場合、「透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）」という用語は、電子ビームが超薄試料を透過し、それが通過するときに試料と相互作用する顕微鏡法技術を指す。試料を透過した電子から画像が形成され、対物レンズによって拡大されて集束され、画像スクリーン、たいていのＴＥＭでは蛍光スクリーン、加えてモニタ、もしくは写真フィルムの層に現れるか、またはＣＣＤカメラなどのセンサによって検出される。
【0035】
本明細書で使用される場合、「走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）」という用語は、電子の集束ビームで表面を走査することによってサンプルの画像を生成する電子顕微鏡の一種を指す。電子はサンプル中の原子と相互作用し、サンプルの表面トポグラフィおよび組成に関する情報を含む様々な信号を生成する。電子ビームはラスタ走査パターンで走査され、ビームの位置は検出された信号の強度と組み合わされて画像を生成する。
【0036】
図１ａ～図１ｄは、以下のＳｉＯ２粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ａは、粒径６８ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ｂは、粒径４０ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ｃは、粒径２５ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ｄは、粒径１５ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ａは、粒径６８ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ｂは、粒径４０ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ｃは、粒径２５ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
図１ｄは、粒径１５ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
【0037】
図２は、粒径１５０ｎｍのＳｉＯ２ナノ粒子のＳＥＭを示す。
【0038】
本発明に関連して、「ナノ粒子」は、最終的に結合または吸着される抗原の認識点として機能する官能基をその表面上に有する粒子状結合マトリックスを意味すると解釈される。ここでの表面は、粒子内の空洞（細孔）のすべての領域、つまり外面の他に、内面も包含する。官能基は、表面に直接的または間接的に結合していてもよい。
【0039】
本発明によれば、ナノ粒子は、別の材料との混合物であってもよい二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を含む。したがって、この材料は、二酸化ケイ素が典型的には多成分系において最も高い割合を有する更なる成分と混合することもできる。本発明のナノ粒子は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の二酸化ケイ素を含むことができる。
【0040】
本発明によるナノ粒子の特に好ましい実施形態では、材料は、本質的に純粋な、すなわち調製プロセスの過程で予想される不純物のみを含む二酸化ケイ素を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ナノ粒子材料は二酸化ケイ素からなる。
【0041】
他の材料の例は、金属、金属カルコゲナイド、磁性材料、磁性合金、半導体材料、金属酸化物、ポリマー、オルガノシラン、他のセラミックまたはガラスである。金属は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｒｕ、ＲｈおよびＺｎの群、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0042】
本発明の更なる実施形態では、ナノ粒子は、二酸化ケイ素を含むコーティングを有する。コアは、金属、ポリマー、またはＦｅ２Ｏ３もしくはＦｅ３Ｏ４などの強磁性金属などの任意の他の材料を含んでもよい。コアは、二酸化ケイ素を欠いていてもよい。
【0043】
本発明による二酸化ケイ素ナノ粒子は、例えば、国際公開第２０１０／００６７５３号に記載されており、これは参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0044】
二酸化ケイ素ナノ粒子は、とりわけ、古典的なＳｔｏｅｂｅｒ合成を使用して調製することができ、この場合、定義されたサイズの単分散ナノスケール二酸化ケイ素は、水性アルコール－アンモニア媒体中でのテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）の加水分解によって調製することができる（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．１９６８，２６，６２）。
【0045】
二酸化ケイ素ナノ粒子の調製プロセスは、欧州特許第０２１６ ２７８号および国際公開第２００５／０８５１３５号に詳細に記載されており、したがって、これらの文献は、その全体が参照により本発明の開示内容に組み込まれる。少なくとも１つのアミンが、好ましくは媒体中で使用される。
【0046】
本発明によるナノ粒子の二酸化ケイ素マトリックスは、多孔質または非多孔質のいずれかであり得る。多孔度は、本質的に製造プロセスに依存する。欧州特許第０２１６２７８号に従った合成では、特に非多孔質粒子が得られる。
【0047】
本発明によれば、ナノ粒子は、その表面上に官能基を含む。これらの官能基は、負電荷および正電荷の両方を担持および／または安定化することができる。これらの電荷は、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、核酸、小分子またはペプチド抗原などの薬学的に許容され得る化合物に属し得る。
【0048】
本発明の好ましい実施形態では、薬学的に許容され得る化合物は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、欠損感染性粒子（ＤＩＰ）またはエピトープの群から選択される。
【0049】
負電荷および正電荷の両方を担持および／または安定化することができる官能基は、例えば、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－グアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ））ＮＨ２）、－ＰＯ３Ｈ２、－ＰＯ２ＣＨ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＮＲ３
＋Ｘ－である。好ましい官能基は、－ＣＯＯＨ、－グアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ））ＮＨ２）および－ＮＨ２である。官能基は、それらの塩形態で存在してもよい。
【0050】
本発明による組成物は、ｎｍ２単位のナノ粒子の表面に対する薬学的に許容され得る化合物の総数［分子／ｎｍ２］に関して、最大０．５、好ましくは０．０１～０．５、より好ましくは０．０３～０．４、最も好ましくは０．０５～０．３の表面負荷密度を有するナノ粒子を含む。
【0051】
この表面負荷密度は、完全な球体を仮定し、粒子当たりのモル負荷によって計算される。例えば、直径２５ｎｍの球状粒子は、１９６４ｎｍ２（Ａ＝π＊ｄ２）の表面積および１．６４Ｅ－８ｎｇの重量を有する（非晶質シリカの仮定密度は２０００ ｋｇ／ｍ３）。そのような粒子に５重量％のペプチドＫＫＫＶ－Ｃｉｔ－ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（Ｍ＝１，９１０．３１ｇ／ｍｏｌ）を負荷すると、４．２８３Ｅ－２２ ｍｏｌになる。この値にアボガドロ定数を乗算すると、１９６４ｎｍ２の１個の粒子に結合した２５８個の単一分子のＫＫＫＶ－Ｃｉｔ－ＹＭＬＤＬＱＰＥＴが得られる。これは、０．１３分子／ｎｍ２の表面負荷密度に相当する。
【0052】
本発明による組成物は、６．０～８．０、好ましくは６．５～７．８、より好ましくは６．８～７．５、さらにより好ましくは７．２～７．４のｐＨを有するように配合される。組成物のｐＨは、典型的には約１ｍＭ～５０ｍＭの範囲で使用される、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）またはヒスチジンなどの緩衝液の使用によって維持することができる。別の方法では、組成物のｐＨは、生理学的に許容され得る酸または塩基を使用することによって調整することができる。
【0053】
本発明の一実施形態では、官能基は－ＰＯ３Ｈ基である。本発明によるリン酸化ナノ粒子は、例えば、アンモニアの添加下で（ジエチルホスファトエチル）トリエトキシシランとシリカナノ粒子との反応によって調製することができる。
【0054】
本発明の好ましい実施形態では、官能基は、リンカーＬを介してナノ粒子に連結されている。リンカーは、例えば共有結合または吸着結合によってナノ粒子に連結することができる。
【0055】
本発明の好ましい実施形態では、リンカー化合物Ｌは、官能基として少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基を含む。
【0056】
より好ましい実施形態では、そのようなリンカーは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）をさらに含む。
【0057】
本発明の最も好ましい実施形態では、リンカー化合物Ｌは、少なくとも一般式（Ｉ）の構造単位
＊－（－Ｏ）３Ｓｉ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｑ－Ｙ（Ｉ）
［式中、
Ｘは、互いに独立して、Ｈまたは負電荷であり、
Ｙは、互いに独立して、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、－ＮＨ２または－ＮＨ３ ＋であり、
ｎ、ｐおよびｑは、互いに独立して、０または１～２５の数であり、
＊－は、ナノ粒子との連結点である］を含む。
＊－（－Ｏ）３Ｓｉ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｑ－Ｙ（Ｉ）
［式中、
Ｘは、互いに独立して、Ｈまたは負電荷であり、
Ｙは、互いに独立して、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、－ＮＨ２または－ＮＨ３ ＋であり、
ｎ、ｐおよびｑは、互いに独立して、０または１～２５の数であり、
＊－は、ナノ粒子との連結点である］を含む。
【0058】
好ましい実施形態では、リンカー化合物Ｌは、ｎが３であり、ｐが１であり、ｑが４であり、Ｙが互いに独立して－ＮＨ２または－ＮＨ３
＋基である、少なくとも式（Ｉ）の構造単位を含む。
【0059】
特に好ましい実施形態では、リンカー化合物Ｌは、ｎが３であり、ｐが１であり、ｑが３であり、Ｙが互いに独立して－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２基である、少なくとも式（Ｉ）の構造単位を含む。
【0060】
本発明の別の態様は、本発明によるナノ粒子の調製方法であって、
－ 第１のステップ（ｉ）では、水、少なくとも１つの可溶化剤および少なくとも１つのアミンまたはアンモニアを含む媒体中でのテトラアルコキシシランおよび／またはオルガノトリアルコキシシランの加水分解重縮合が行われ、ここで、まず一次粒子のゾルが生成され、その後、反応の程度に対応して制御された方法で対応するシランの連続的な計量投入によって更なる核生成が制限されるように、得られたナノ粒子が５～１５０ｎｍの範囲内の所望の粒径にされ、
－ 第２のステップ（ｉｉ）では、ステップ（ｉ）からのナノ粒子を［（３－トリエトキシシリル）プロピル］コハク酸無水物と反応させ、これを同時反応でＬ－アルギニンまたはＬ－リジンとアミドを形成させる、方法を提供することである。
－ 第１のステップ（ｉ）では、水、少なくとも１つの可溶化剤および少なくとも１つのアミンまたはアンモニアを含む媒体中でのテトラアルコキシシランおよび／またはオルガノトリアルコキシシランの加水分解重縮合が行われ、ここで、まず一次粒子のゾルが生成され、その後、反応の程度に対応して制御された方法で対応するシランの連続的な計量投入によって更なる核生成が制限されるように、得られたナノ粒子が５～１５０ｎｍの範囲内の所望の粒径にされ、
－ 第２のステップ（ｉｉ）では、ステップ（ｉ）からのナノ粒子を［（３－トリエトキシシリル）プロピル］コハク酸無水物と反応させ、これを同時反応でＬ－アルギニンまたはＬ－リジンとアミドを形成させる、方法を提供することである。
【0061】
方法のステップ（ｉｉ）でＬ－アルギニンの使用することが好ましい。
【0062】
別の実施形態では、リンカー化合物Ｌは、Ｌ－アルギニンとＮ－（３－トリエトキシシリルプロピル）マレイミドとの反応によっても得ることができた。反応は、好ましくは８を超えるｐＨ値で行われる。
【0063】
本発明の一実施形態では、［（３－トリエトキシシリル）プロピル］コハク酸無水物と、アグマチン、ヒスタミン、カダベリンまたはスペルミジンとの反応によってリンカー化合物Ｌを生成することも可能である。
【0064】
本発明の更なる実施形態は、リンカー化合物Ｌが共有結合または吸着結合した二酸化ケイ素ベースの表面を含むナノ粒子であって、リンカーＬは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）を含む。好ましい実施形態では、リンカーＬは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基とを含む。より好ましい実施形態では、リンカーＬは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基とを含む。
【0065】
本発明によるナノ粒子の一実施形態を図３に示す。
【0066】
図３は、本発明によるナノ粒子の横断面の概略図を示す。Ａはリンカー化合物Ｌによる表面官能化を表し、Ｂは非晶質ＳｉＯ２シェルを表し、Ｃはコア材料を表し、これは空隙、水または任意の他の材料ならびに非晶質ＳｉＯ２であり得る。直径ｄ１は０～１４９ｎｍであり、ｄ２は１０～１５０ｎｍである。
【0067】
本発明の一実施形態では、薬学的に許容され得る化合物は、吸着または共有結合によってナノ粒子にコンジュゲートされる。吸着結合が好ましい。
【0068】
本発明の更なる目的は、二酸化ケイ素および表面上の官能基を有し、１５０ｎｍ未満の粒径を有するナノ粒子であって、それに共有結合または吸着結合したリンカーＬを含み、リンカーＬが、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）基を含むナノ粒子である。
【0069】
薬学的に許容され得る化合物の吸着結合の主な利点は、ほとんどの共有結合性コンジュゲーションとは対照的に、副生成物が形成されないか、または「反応」混合物中に残存しないことである。共有結合の場合、反応性官能基を分子に付加することによって結合すべき分子を化学的に修飾することが必要になる可能性がある。これは、ペプチド／抗原の構造における基本的な介入であり、ＲＮＡもしくはＤＮＡベースの抗原またはアジュバントの場合、複雑な化学修飾を構成する。さらに、医薬品局によって既に承認されている既知の化合物の共有結合は、規制上の理由から新たな承認を必要とする新たな独立した物質（新規化学物質、ＮＣＥ）を作り出す。
【0070】
好ましい実施形態では、式（Ｉ）によるリンカー化合物Ｌは、正電荷もしくは負電荷を有する薬学的に許容され得る化合物を吸着によって担持および／または安定化することができる。
【0071】
特に好ましい実施形態では、式（Ｉ）によるリンカー化合物Ｌは、負電荷を有する薬学的に許容され得る化合物を吸着によって担持および／または安定化することができる。
【0072】
より好ましい実施形態では、式（Ｉ）によるリンカー化合物Ｌは、リン酸基またはホスホン酸基を有する薬学的に許容され得る化合物を吸着によって担持および／または安定化することができる。
【0073】
驚くべきことに、リンカー化合物Ｌのアルギニン基と薬学的に許容され得る化合物のリン酸基の負電荷との間の静電相互作用は、「共有結合様」安定性を有することが見出された。
【0074】
本明細書における「結合」という用語は、表面官能基と抗原との間の任意の種類の相互作用、特に共有結合および非共有結合、例えば疎水性／親水性相互作用、ファンデルワールス力、イオン結合、水素結合、リガンド－受容体相互作用、ヌクレオチドの塩基対合またはエピトープと抗体結合部位との間の相互作用に関する。
【0075】
薬学的に許容され得る化合物が疎水性、例えば疎水性ペプチドである場合、その親水性を高めることが有利である。タンパク質またはペプチドの場合、これは、例えば極性アミノ酸によるＮ末端またはＣ末端伸長によって可能である。本発明の好ましい実施形態では、タンパク質またはペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、セリン、トレオニンまたはチロシン、好ましくはリジン、アルギニン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、より好ましくはリジンを含む群から選択される１つもしくはそれを超える極性アミノ酸で伸長される。
【0076】
したがって、本発明は、特に、溶解性を向上させるための極性アミノ酸を有するＮ末端またはＣ末端伸長部を含み、吸着結合によってリンカー化合物Ｌ、リンカーユニットＵおよび図４ａに示される抗原／エピトープに連結された３つの部分からなるバイオコンジュゲートに関する。
【0077】
本発明によるリンカーユニットＵは、例えば、様々なタイプのリンカーを含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に使用される。化学的に切断可能なリンカーには、酸で切断可能な、還元可能なジスルフィドおよび外因性刺激によって切断可能なものの３つの主なタイプがある。
【0078】
ＡＤＣの例は、ゲムツズマブオゾガマイシン（ファイザー社のＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、リンカーは４－（４－アセチルフェノキシ）ブタン酸）、イノツズマブオゾガマイシン（ファイザー社のＢｅｓｐｏｎｓａ（登録商標）、リンカーは４－（４’－アセチルフェノキシ）－ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）と３－メチル－３－メルカプトブタンヒドラジド（ジメチルヒドラジドとして知られている）との縮合生成物である）、トラスツズマブエムタンシン（ロシュ社のＫａｄｃｙｌａ（登録商標）、リンカーは４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレートである）またはブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ－０３５としても知られている；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社によるＡｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）、リンカーはジペプチドバリン－シトルリンである）である。
【0079】
本発明の好ましい実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩに対して天然の未修飾抗原の放出を確実にするために酵素カテプシンＢにより切断可能なリンカー（ｃａｔＢ切断リンカー）を有するＮ末端伸長部を含むリンカーユニットＵを含む。酵素的ｃａｔＢ切断リンカーは、カテプシンＢ感受性ジペプチドＶａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－ＬｙｓまたはＶａｌ－Ｌｙｓのうちの１つを含み、好ましいジペプチドはＶａｌ－ＣｉｔまたはＴｒｐ－Ｃｉｔであり、より好ましくはＶａｌ－Ｃｉｔである。
【0080】
一実施形態では、本発明による組成物は、リン酸化ナノ粒子と、吸着結合によってナノ粒子にコンジュゲートされた１つもしくはそれを超えるペプチドとを含み、ペプチドは、カテプシンＢ感受性ジペプチドとしてＶａｌ－ＣｉｔまたはＴｒｐ－Ｃｉｔを含む。
【0081】
図４ｂは、本発明による好ましい３つの部分からなるバイオコンジュゲートを示す。図４ｂで使用したペプチドは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１由来の極めて疎水性のエピトープである。Ｎ末端伸長のために、酵素的（カテプシンＢ）切断可能ペプチドリンカーＶａｌ－Ｃｉｔを使用して、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩに対する天然の未修飾抗原の放出を確実にした。ナノ粒子への溶解性および静電引力を高めるために、伸長部分「Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ」を使用した。また、例えばＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＡｓｐまたはＡｒｇ６による伸長も可能である。
【0082】
本発明の好ましい実施形態では、ＨＰＶ１６ Ｅ７８２－９０エピトープＬＬＭＧＴＬＧＧＩＶは、酵素により切断可能なリンカーＶａｌ－Ｃｉｔおよびカチオン性可溶化配列Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＬｙｓによってＮ末端部位で拡大され、ＫＫＫＶ－Ｃｉｔ－ＬＬＭＧＴＬＧＩＶをもたらす。
【0083】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９エピトープＹＭＬＤＬＱＰＥＴは、酵素により切断可能なリンカーＴｒｐ－Ｃｉｔおよびカチオン性可溶化配列Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＬｙｓによってＮ末端部位で拡大され、ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＹＭＬＤＬＱＰＥＴをもたらす。
【0084】
更なる実施形態は、表面上にリンカー化合物Ｌを有するＳｉＯ２ナノ粒子を含む本発明による組成物であり、リンカー化合物Ｌは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、吸着結合によりリンカー化合物Ｌにコンジュゲートされている１つもしくはそれを超えるペプチドまたは抗原とを含み、ペプチドまたは抗原は、リンカーユニットＵおよび１つもしくはそれを超えるアミノ酸による親水性伸長部を含む。
【0085】
好ましい実施形態は、表面上にリンカー化合物Ｌを有するＳｉＯ２ナノ粒子を含む本発明による組成物であって、リンカー化合物Ｌは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、吸着結合によりリンカー化合物Ｌにコンジュゲートされている１つもしくはそれを超えるペプチドまたは抗原とを含み、ペプチドまたは抗原は、カテプシンＢ感受性ジペプチドおよびＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓによる親水性伸長部を含むものである。
【0086】
より好ましい実施形態は、表面上にリンカー化合物Ｌを有するＳｉＯ２ナノ粒子を含む本発明による組成物であって、リンカー化合物Ｌは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、吸着結合によりリンカー化合物Ｌにコンジュゲートされている１つもしくはそれを超えるペプチドまたは抗原とを含み、ペプチドまたは抗原は、カテプシンＢ感受性ジペプチドとしてＶａｌ－ＣｉｔまたはＴｒｐ－Ｃｉｔと、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓによる親水性伸長部とを含むものである。
【0087】
別の実施形態は、表面上にリンカー化合物Ｌを有するＳｉＯ２ナノ粒子を含む本発明による組成物であって、リンカー化合物Ｌは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基－ＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、吸着結合によりリンカー化合物Ｌにコンジュゲートされている１つもしくはそれを超えるモデルペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬとを含み、ペプチドは、カテプシンＢ感受性ジペプチドとしてＶａｌ－ＣｉｔまたはＴｒｐ－Ｃｉｔと、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓによる親水性伸長部とを含むものである。
【0088】
しかしながら、ペプチドのこの親水性修飾は、ＭＨＣＩ（すなわち、免疫優性である）へのより強い結合をもたらし、それによって標的エピトープを置換し、腫瘍細胞上に存在しないエピトープに対する免疫応答を誘発し得る。この影響を回避するために、親水化サブ分子とエピトープとの間にスペーサが必要になる可能性がある。
【0089】
本発明の任意の実施形態は、いわゆる自己犠牲スペーサ（ＰＡＢＣ、ｐ－アミノベンジルカルバメート）の使用である。そのような自己犠牲スペーサの例は、４－アミノベンジルアルコール、２－アミノベンジルアルコールまたは４－ヒドロキシベンジルアルコール、２－ヒドロキシベンジルアルコールの構造単位を含む化合物である。（欧州特許出願公開第０６４８５０３号、国際公開第２００７／０３１７３４号、国際公開第２０１５／１６２２９１号、米国特許第６，１８０，０９５号、米国特許第６，２１４，３４５号）。
【0090】
自己犠牲スペーサは、分子部分への結合の１つが放出されると、残りの結合が分割され、先に結合した分子が放出されるように、少なくとも２つの更なる分子部分に化学的に結合している分子部分として定義される。
【0091】
自己犠牲スペーサが使用される場合、スペーサは、酵素的ｃａｔＢ切断リンカーとペプチドとの間に配置されることが好ましい。一例として、以下のバイオコンジュゲートを生成することができる：（Ａｒｇ６）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）－（ＰＡＢＣ）－（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、ここで、ＳＩＩＮＦＥＫＬはモデル抗原である。
【0092】
驚くべきことに、酵素的ｃａｔＢ切断リンカー系は、自己犠牲スペーサを必要とせずに使用できることが見出された。
【0093】
治療的ワクチン接種に使用されるエピトープは、典型的には、８～１１アミノ酸（ＭＨＣ Ｉでは）およびＭＨＣ ＩＩでは最大２５アミノ酸からなる。それらのエピトープでは、はるかに大きな薬物と比較してこれらのエピトープのサイズが小さいため、自己犠牲スペーサを使用する必要はない。
【0094】
薬学的に許容され得る化合物は、好ましくは、タンパク質（例えば、抗体もしくは酵素など）、ペプチド、核酸（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）、ポリヌクレオチド、脂質、多糖類もしくは有機化合物（「小分子」、好ましくは、例えば５０～１０００Ｄａの分子量を有する化学療法薬など）またはそれらの混合物からなる群から選択される。
【0095】
好ましくは、薬学的に許容され得る化合物は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、欠損感染性粒子（ＤＩＰ）または抗原からなる群から選択される。
【0096】
本発明による「抗原」は、細胞性または体液性の免疫応答を誘導することができる構造体である。抗原は、好ましくはタンパク質原性であり、すなわち、それらはタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはそれらのフラグメントである。原則として、それらは任意のサイズ、起源および分子量を有することができる。それらは、少なくとも１つの抗原決定基または抗原エピトープを含有する。
【0097】
代替的な実施形態では、抗原は、それ自体核酸であるか、または抗原提示細胞の核内への輸送後に、ＭＨＣ分子に提示されるタンパク質生成抗原に翻訳される核酸によってコードされる。
【0098】
核酸は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドであり得る。核酸はまた、脂質、炭水化物、タンパク質またはペプチドとの複合体の構成要素であり得る。
【0099】
本発明による「ペプチド」は、好ましくはペプチド結合によって連結された任意の種類の任意の数のアミノ酸、好ましくは天然に存在するアミノ酸から構成される。特に、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも９個、少なくとも１２個または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ペプチドは、１００アミノ酸の長さを超えず、より好ましくは、５０アミノ酸の長さを超えない。さらにより好ましくは、それは２５アミノ酸以下である。最も好ましい実施形態では、ペプチドは、８～２０アミノ酸の長さを有する。ペプチドはまた、翻訳後修飾、例えばリン酸化、グリコシル化、脂質化（ミリストイル化またはパルミトイル化など）、シトルリン化、（リジンの）アセチル化、（プロリンまたはリジンの）ヒドロキシル化を示すことができる。
【0100】
抗原決定基としても知られている本発明による「エピトープ」は、免疫系によって、具体的には抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞によって認識される抗原の一部である。Ｔ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面に提示され、そこでＭＨＣ分子に結合する。ヒトでは、プロフェッショナル抗原提示細胞はＭＨＣクラスＩＩペプチドを提示するように特殊化されているが、ほとんどの有核体細胞はＭＨＣクラスＩペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは、典型的には８～１１アミノ酸長のペプチドであるが、ＭＨＣクラスＩＩ分子はより長いペプチド、１３～１７アミノ酸長を提示し、非古典的ＭＨＣ分子も糖脂質などの非ペプチドエピトープを提示する。
【0101】
本発明のより好ましい実施形態では、薬学的に許容され得る化合物は、少なくとも１つの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む化合物である。
【0102】
ＰＡＭＰは、いわゆるパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識され、微生物病原体の主要なセンサとしての機能を有し、それらに対する免疫応答を開始する。ＰＲＲは、細胞質ゾル内および細胞外で、血流、リンパ液および間質液中に存在する分泌形態で、細胞膜およびエンドソーム膜上の膜結合コンテクストなどの細胞内区画に関連する異なる位置に見出すことができる。
【0103】
ＰＲＲの４つの主要なサブファミリー、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）－ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）含有受容体（ＮＲＬ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）またはＲＩＧ－Ｉ様ヘリカーゼ（ＲＬＨ）およびＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）が存在する。更なるＰＲＲは補体系内にある。
【0104】
本発明によれば、ＴＬＲによって認識されるＰＡＭＰが好ましい。ＴＬＲは、細胞膜上、エンドサイトーシス小胞または他の細胞内オルガネラの膜上および細胞質ゾルＴＬＲ上に発現される膜結合ＴＬＲに分類することができる。ＴＬＲ４は、原形質膜および細胞内区画などの異なる細胞位置で経路を引き起こすことができるので、ＴＬＲの中でユニークな役割を有している。ＴＬＲは、「ＰＡＭＰ」（病原体関連分子パターン）と呼ばれることが多い微生物上の独特な構造を認識する。ＴＬＲへのリガンド結合は、炎症および免疫に関与する因子の産生を誘導する細胞内シグナル伝達経路のカスケードを引き起こす。
【0105】
表１は、本発明に従って適切なＰＡＭＰとしてのＴＬＲアゴニストを示す。
表１：ＴＬＲアゴニストおよびそれらのＰＡＭＰ
表１：ＴＬＲアゴニストおよびそれらのＰＡＭＰ
【表1】
【0106】
本発明によるより好ましいＰＡＭＰは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９アゴニストの群から選択され、最も好ましくはＴＬＲ３およびＴＬＲ９の群から選択される。
【0107】
特に好ましい実施形態は、表面上にリンカー化合物Ｌを有するＳｉＯ２ナノ粒子を含む本発明による組成物であって、リンカー化合物Ｌは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、吸着結合によりリンカー化合物Ｌにコンジュゲートされている１つもしくはそれを超えるＰＡＭＰとを含み、ＰＡＭＰはポリ（Ｕ）またはＣｐＧ ＯＤＮから選択されるものである。
【0108】
好ましいＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ３アゴニストならびにＲＩＧ－Ｉアゴニスト）、ポリＩ：ポリＣ１２Ｕ（ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ３アゴニスト、商品名Ａｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）、ＩＮＮ：リンタトリモド）、ＮＡＢ２（核酸バンド２、酵母から単離され、パターン認識受容体ＴＬＲ３およびＭＤＡ－５のアゴニストとして同定されたｄｓＲＮＡ）の群から選択される。
【0109】
好ましいＴＬＲ４アゴニストは、ＭＰＬ－Ａ（モノホスホリル脂質Ａ、例えば、特定の形態のアルミニウム塩上に吸着されたＭＰＬ－ＡからなるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ５９５もしくはＡＳ０４由来）またはＬＰＳ（リポ多糖、例えば大腸菌０５５：Ｂ５由来）から選択される。また好ましいＴＬＲ４アゴニストは、合成ＴＬＲ－４アゴニストアジュバントであるＬＰＳ模倣物である。ＴＬＲ４リガンド機能を模倣するペプチド配列の例としては、例えば、ＡＰＰＨＡＬＳおよびＱＥＩＮＳＳＹ（Ａ．Ｓｈａｎｍｕｇａｍら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏｌ．７，Ｉｓｓｕｅ ２；ｅ３０８３９）が挙げられる。そのようなペプチド配列を有効成分ポリペプチドの配列に導入することにより、ポリペプチドはアジュバント機能を有し得る。
【0110】
別の好ましいＰＲＲアゴニストは、マウスにおけるポリＵ（ｓｓＲＮＡ、ＴＬＲ８アゴニスト（ヒト）およびＴＬＲ７アゴニストである。
【0111】
本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容され得る化合物は、ヌクレオチド化合物、特にｄｓＲＮＡ構造を含むＴＬＲ７アゴニストを含むオリゴヌクレオチドアゴニスト（国際公開第２０１０／１０５８１９号、国際公開第２００６／０６３２５２号）、国際公開第２００７／０３１３１９号に記載されているものを含む短いｓｓＲＮＡ ＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニスト、先に記載されたような免疫賦活性ＣｐＧジヌクレオチドなどのＴＬＲ９アゴニスト（国際公開第２００１／０２２９９０号）、特にＣｐＧジヌクレオチドＯＤＮ ２００６（Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒｉｅｇ，２０００，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１６４ ９４４－９５２）である。
【0112】
好ましいＴＬＲ７アゴニストは、Ｇ：Ｕ塩基対に加えて４～８個のＧ：Ｃ塩基対によって形成される二本鎖構造の中央のＧ：Ｕ塩基対を特徴とする。適切なＴＬＲ７アゴニストの例は、ヌクレオチド配列５’－ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ－Ｓ’（配列番号１）から本質的になるオリゴヌクレオチド剤であって、好ましくはこの配列の５’末端から取られたもの、例えば、５’－ＧＵＣＣ－３’（配列番号２）、５’－ＧＵＣＣＵ－３’（配列番号３）、５’－ＧＵＣＣＵＵ－Ｓ’（配列番号４）、５’－ＧＵＣＣＵＵＣ－３’（配列番号５）、または５’－ＧＵＣＣＵＵＣＡ－Ｓ’（配列番号６）である（国際公開第２００６／０６３２５２号）。
【0113】
より好ましいＴＬＲ７アゴニストは、国際公開第２０１０／１０５８１９号に記載されており、ＲＮＡポリ／オリゴヌクレオチドは、Ｇ：Ｕ塩基対、好ましくはＧ：ＵおよびＧ：Ｃ塩基対ならびにＡ：Ｕ塩基対に加えて、４～８個のＧ：Ｃ塩基対によって形成される二本鎖構造の中心にあるＧ：Ｕゆらぎ塩基対を特徴とする。好ましいポリ／オリゴヌクレオチドは、以下の一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）によって定義される構造を有し、カセットを含有する２つの別個のＲＮＡ鎖を定義する：
５’ＸｎＧ／ＵＶｍ ３’（ＩＩ）、５’ｏＷｍＵ／ＧＹｎ ３’（ＩＩＩ）、
式中、Ｇ／ＵおよびＵ／Ｇは、ゆらぎ塩基対が形成するように選択され、
２＜ｎ≦１２、２＜ｍ≦１２、２≦ｏ＜１２であり、
Ｘは、Ｙの対応する塩基とワトソン・クリック塩基対を形成する任意の塩基を定義し、Ｖは、ＲＮＡステム構造中のＷの対応する塩基とワトソン・クリック塩基対を形成する任意の塩基を定義し、Ｎはループ中の任意の塩基である。
５’ＸｎＧ／ＵＶｍ ３’（ＩＩ）、５’ｏＷｍＵ／ＧＹｎ ３’（ＩＩＩ）、
式中、Ｇ／ＵおよびＵ／Ｇは、ゆらぎ塩基対が形成するように選択され、
２＜ｎ≦１２、２＜ｍ≦１２、２≦ｏ＜１２であり、
Ｘは、Ｙの対応する塩基とワトソン・クリック塩基対を形成する任意の塩基を定義し、Ｖは、ＲＮＡステム構造中のＷの対応する塩基とワトソン・クリック塩基対を形成する任意の塩基を定義し、Ｎはループ中の任意の塩基である。
【0114】
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のこれらの別々のＲＮＡ鎖の全長は、好ましくは５塩基～４５塩基である。
【0115】
少なくとも１つのステムアンドループ構造を有する最も好ましいポリ／オリゴヌクレオチドは、以下の一般式（Ｉｌ）および（ＩＩＩ）によって定義される構造を有し、カセットを含有する２つの別個のＲＮＡ鎖を定義する：
５’ＸｎＧ／ＵＶｍ ３’（ＩＩ）、５’ｏＷｍＵ／ＧＹｎ ３’（ＩＩＩ）、
式中、Ｇ／ＵおよびＵ／Ｇは、ゆらぎ塩基対が形成するように選択され、
２≦ｎ≦１２、２≦ｍ≦１２、２≦ｏ≦１２であり、
式中、Ｘは、Ｙにおいて対応するＧおよびＣ塩基とワトソン・クリック塩基対を形成するＧｓまたはＣｓを表し、Ｖは、Ｗにおいて対応する塩基とワトソン・クリック塩基対を形成するＧｓまたはＣｓを表す。
５’ＸｎＧ／ＵＶｍ ３’（ＩＩ）、５’ｏＷｍＵ／ＧＹｎ ３’（ＩＩＩ）、
式中、Ｇ／ＵおよびＵ／Ｇは、ゆらぎ塩基対が形成するように選択され、
２≦ｎ≦１２、２≦ｍ≦１２、２≦ｏ≦１２であり、
式中、Ｘは、Ｙにおいて対応するＧおよびＣ塩基とワトソン・クリック塩基対を形成するＧｓまたはＣｓを表し、Ｖは、Ｗにおいて対応する塩基とワトソン・クリック塩基対を形成するＧｓまたはＣｓを表す。
【0116】
塩基対カセットの反復（すなわち、二本鎖構造の複数のＧ・Ｕ塩基対）は活性を有するであろう。
【0117】
これらの別個のＲＮＡ鎖の好ましい全長は、５塩基～４５塩基である。
【0118】
特定の実施形態では、一本鎖ポリ／オリゴヌクレオチドは、２つの部分、５’部分および３’’部分を含有し、好ましくはこれらからなり、２つの部分の一方は、ｎ個のＵを含有し、好ましくはこれらからなり、他方の部分は、ｐ個のＧおよびｑ個のＡを含有し、好ましくはこれらからなり、式中、ｎ、ｐおよびｑは０より大きい整数であり、ｐ＋ｑ＝ｍであり、ｍは最大２５の整数であり、好ましくは１１に等しいまたはそれを超えて２１未満またはそれに等しい整数であり、ｎはｍより大きい。一実施形態では、ｎは１００未満またはそれに等しい。別の実施形態では、ｎは１００より大きく、好ましくは１０００より大きく、より好ましくは３０００より大きく、最も好ましくは３０００～５０００程度である。特定の実施形態では、ｎは、本発明のポリ／オリゴヌクレオチド調製物において異なる分子において異なっていてもよい。好ましい実施形態では、ｐは１に等しく、Ｇは、ＧおよびＡを含むかまたはＧおよびＡからなる部分の中心にある。
【0119】
少なくとも１つのステムアンドループ構造を有する一本鎖ポリ／オリゴヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：
Ｃ２ＵＣ２Ｇｎ（式中、ｎは４またはそれより大きい整数、
好ましくは８～９より大きい整数である）：
Ｃ３ＵＣ２Ｇｎ（式中、ｎは６より大きい整数である）；
Ｃ２ＵＣ３Ｇｎ（式中、ｎは６より大きい整数である）；
Ｃ３ＵＣ３Ｇｎ（式中、ｎは７より大きい整数である）；
Ｃ４ＵＣ３Ｇｎ（式中、ｎは８より大きい整数である）；
Ｃ３ＵＣ４Ｇｎ（式中、ｎは８より大きい整数である）；
Ｃ４ＵＣ４Ｇｎ（式中、ｎは９より大きい整数である）；
ＧｎＣ２ＵＣ２（式中、ｎは５より大きい整数である）；
ＧｎＣ３ＵＣ２（式中、ｎは６より大きい整数である）；
ＧｎＣ２ＵＣ３（式中、ｎは６より大きい整数である）；
ＧｎＣ３ＵＣ３（式中、ｎは７より大きい整数である）；
ＧｎＣ４ＵＣ３（式中、ｎは８より大きい整数である）；
ＧｎＣ３ＵＣ４（式中、ｎは８より大きい整数である）；
ＧｎＣ４ＵＣ４（式中、ｎは９より大きい整数である）；
Ａ５ＧＡｇＵｎ７（式中、ｎは１１より大きい整数である）；
Ａ６ＧＡＵｎ（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
Ａ５ＧＡ６Ｕｎ（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
Ａ６ＧＡ６Ｕｎ（式中、ｎは１３より大きい整数である）；
Ａ７ＧＡ６Ｕｎ（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
Ａ６ＧＡ７Ｕｎ（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
Ａ７ＧＡ７Ｕｎ（式中、ｎは１５より大きい整数である）；
Ａ８ＧＡ７Ｕｎ（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
Ａ７ＧＡ８Ｕｎ（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
Ａ８ＧＡ８Ｕｎ（式中、ｎは１７より大きい整数である）；
Ａ９ＧＡ８Ｕｎ（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
Ａ８ＧＡ９Ｕｎ（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
Ａ９ＧＡ９Ｕｎ（式中、ｎは１９より大きい整数である）；
Ａ１０ＧＡ９Ｕｎ（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
Ａ９ＧＡ１０Ｕｎ（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
Ａ１０ＧＡ１０Ｕｎ（式中、ｎは２１より大きい整数である）；
Ａ５ＧＡ１０ＧＡ４Ｕｎ（式中、ｎは２１より大きい整数である）；
ＵｎＡ５ＧＡ５（式中、ｎは１１より大きい整数である）；
ＵｎＡ６ＧＡ５（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
ＵｎＡ５ＧＡ６（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
ＵｎＡ６ＧＡ６（式中、ｎは１３より大きい整数である）；
ＵｎＡ７ＧＡ６（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
ＵｎＡ６ＧＡ７（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
ＵｎＡ７ＧＡ７（式中、ｎは１５より大きい整数である）；
ＵｎＡ８ＧＡ７（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
ＵｎＡ７ＧＡ８（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
ＵｎＡ８ＧＡ８（式中、ｎは１７より大きい整数である）；
ＵｎＡｇＧＡ８（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
ＵｎＡ８ＧＡ９（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
ＵｎＡ９ＧＡ９（式中、ｎは１９より大きい整数である）；
ＵｎＡ１０ＧＡ９（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
ＵｎＡ９ＧＡ１０（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
ＵｎＡ１０ＧＡ１０（式中、ｎは２１より大きい整数である）；
ＵｎＡ５ＧＡ１０ＧＡ４（式中、ｎは２１より大きい整数である）。
Ｃ２ＵＣ２Ｇｎ（式中、ｎは４またはそれより大きい整数、
好ましくは８～９より大きい整数である）：
Ｃ３ＵＣ２Ｇｎ（式中、ｎは６より大きい整数である）；
Ｃ２ＵＣ３Ｇｎ（式中、ｎは６より大きい整数である）；
Ｃ３ＵＣ３Ｇｎ（式中、ｎは７より大きい整数である）；
Ｃ４ＵＣ３Ｇｎ（式中、ｎは８より大きい整数である）；
Ｃ３ＵＣ４Ｇｎ（式中、ｎは８より大きい整数である）；
Ｃ４ＵＣ４Ｇｎ（式中、ｎは９より大きい整数である）；
ＧｎＣ２ＵＣ２（式中、ｎは５より大きい整数である）；
ＧｎＣ３ＵＣ２（式中、ｎは６より大きい整数である）；
ＧｎＣ２ＵＣ３（式中、ｎは６より大きい整数である）；
ＧｎＣ３ＵＣ３（式中、ｎは７より大きい整数である）；
ＧｎＣ４ＵＣ３（式中、ｎは８より大きい整数である）；
ＧｎＣ３ＵＣ４（式中、ｎは８より大きい整数である）；
ＧｎＣ４ＵＣ４（式中、ｎは９より大きい整数である）；
Ａ５ＧＡｇＵｎ７（式中、ｎは１１より大きい整数である）；
Ａ６ＧＡＵｎ（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
Ａ５ＧＡ６Ｕｎ（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
Ａ６ＧＡ６Ｕｎ（式中、ｎは１３より大きい整数である）；
Ａ７ＧＡ６Ｕｎ（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
Ａ６ＧＡ７Ｕｎ（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
Ａ７ＧＡ７Ｕｎ（式中、ｎは１５より大きい整数である）；
Ａ８ＧＡ７Ｕｎ（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
Ａ７ＧＡ８Ｕｎ（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
Ａ８ＧＡ８Ｕｎ（式中、ｎは１７より大きい整数である）；
Ａ９ＧＡ８Ｕｎ（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
Ａ８ＧＡ９Ｕｎ（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
Ａ９ＧＡ９Ｕｎ（式中、ｎは１９より大きい整数である）；
Ａ１０ＧＡ９Ｕｎ（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
Ａ９ＧＡ１０Ｕｎ（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
Ａ１０ＧＡ１０Ｕｎ（式中、ｎは２１より大きい整数である）；
Ａ５ＧＡ１０ＧＡ４Ｕｎ（式中、ｎは２１より大きい整数である）；
ＵｎＡ５ＧＡ５（式中、ｎは１１より大きい整数である）；
ＵｎＡ６ＧＡ５（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
ＵｎＡ５ＧＡ６（式中、ｎは１２より大きい整数である）；
ＵｎＡ６ＧＡ６（式中、ｎは１３より大きい整数である）；
ＵｎＡ７ＧＡ６（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
ＵｎＡ６ＧＡ７（式中、ｎは１４より大きい整数である）；
ＵｎＡ７ＧＡ７（式中、ｎは１５より大きい整数である）；
ＵｎＡ８ＧＡ７（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
ＵｎＡ７ＧＡ８（式中、ｎは１６より大きい整数である）；
ＵｎＡ８ＧＡ８（式中、ｎは１７より大きい整数である）；
ＵｎＡｇＧＡ８（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
ＵｎＡ８ＧＡ９（式中、ｎは１８より大きい整数である）；
ＵｎＡ９ＧＡ９（式中、ｎは１９より大きい整数である）；
ＵｎＡ１０ＧＡ９（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
ＵｎＡ９ＧＡ１０（式中、ｎは２０より大きい整数である）；
ＵｎＡ１０ＧＡ１０（式中、ｎは２１より大きい整数である）；
ＵｎＡ５ＧＡ１０ＧＡ４（式中、ｎは２１より大きい整数である）。
【0120】
好ましくは、上記の例において、ｎは１０００より大きく、より好ましくは３０００であり、さらにより好ましくは３０００～５０００程度である。
【0121】
ＴＬＲ７特異的リガンドには、一方の鎖または少なくとも１つの完全二本鎖部分を形成する鎖の一部がｎ個のＧを含み、好ましくはそれからなり、他方の鎖または同じ少なくとも１つの完全二本鎖部分を形成する鎖の一部がｐ個のＵおよびｑ個のＣを含み、好ましくはそれからなり、ｎは５に等しいまたはそれを超えて９未満またはそれに等しい整数であり、ｐはｎ未満またはそれに等しい整数であり、ｑは整数であり、ｐ＋ｑ＝ｎであるポリ／オリゴヌクレオチドが含まれる。
【0122】
本発明の更なる実施形態では、選択的ＴＬＲ８活性を示すＲＮＡポリ／オリゴヌクレオチドが提供され、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対中のＵヌクレオシドは、各側でＧ塩基に隣接している。選択的ＴＬＲ８活性を示すＲＮＡポリ／オリゴヌクレオチドは、一本鎖または部分的に二本鎖であり得る。好ましくは、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対の各側のＣヌクレオシドに隣接するＧ－Ｕゆらぎ塩基対中にＧヌクレオシドを有するＲＮＡポリ／オリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるヘアピン構造を形成し、式中、ｎは５～１００、好ましくは２０～１００である。前述のＲＮＡポリ／オリゴヌクレオチドは、高度に選択的なＴＬＲ８活性を示す。選択的ＴＬＲ８活性を示す前述のＲＮＡポリ／オリゴヌクレオチドは、好ましくは、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対の各側に少なくとも２つの隣接する塩基対を有する。本明細書で使用される「選択的ＴＬＲ８活性」という用語は、上で定義したＲＮＡポリ／オリゴヌクレオチドがＴＬＲ８活性を示すが、ＴＬＲ７活性を示さないことを意味する。
【0123】
好ましいＴＬＲ９アゴニストは、米国特許第６，４２９，１９９号、米国特許出願公開第２００７／００６５４６７号、国際公開第０１／２２９９０号、米国特許出願公開第２００３／０１００５２７号に記載されているように、ＣｐＧ ＯＤＮ（ＣｐＧリッチモチーフを有する非メチル化ＤＮＡ、ＴＬＲ９アゴニスト）から選択される。
【0124】
ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５およびＬＧＰ－２などのＲＮＡヘリカーゼは、ウイルスＲＮＡの検出に関与している。ＴＬＲとは対照的に、ＲＮＡヘリカーゼは細胞質ゾルであり、免疫細胞および非免疫細胞、例えば線維芽細胞および上皮細胞を含む広範囲の細胞型で発現される。したがって、免疫細胞だけでなく、１つまたはそれを超えるＲＮＡヘリカーゼを発現する非免疫細胞も、ウイルスＲＮＡを検出し、それに応答することができる。ＴＬＲヘリカーゼ系とＲＮＡヘリカーゼ系との両方が協働してウイルスＲＮＡを最適に検出する。
【0125】
本発明によれば、薬学的に許容され得る化合物は、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、例えば、欧州特許出願公開第１９２０７５５号または欧州特許出願公開第３５８１６５６号に記載されている遊離のキャップされていない５’リン酸を有するオリゴヌクレオチドである。本発明によるＲＩＧ－Ｉアゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）のサイズに応じてＲＩＧ－Ｉおよび／またはＭＤＡ－５によって認識される５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ、３ ｐ－ｈｐＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）／ＬｙｏＶｅｃ複合体；ＲＩＧ－Ｉによって間接的に認識されるポリ（ｄＡ：ｄＴ）／ＬｙｏＶｅｃ複合体の群から選択される。他のＲＩＧ－Ｉアゴニストは、国際公開第０９／１４１１４６号に記載されている平滑末端を有する５’三リン酸オリゴヌクレオチド、または米国特許出願公開第２０１２／０２８８４７６号に記載されている５’リン酸オリゴヌクレオチドに基づくＲＩＧ－Ｉアゴニストである。
【0126】
別の好ましいＲＩＧ－Ｉアゴニストは、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）（Ｂ－ＤＮＡの合成類似体であるｄｓＤＮＡ）である。ポリ（ｄＡ：ｄＴ）は、複数のＰＲＲによって認識される：ｃＧＡＳ、ＡＩＭ２、ＤＡＩ、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６およびＬＲＲＦＩＰ１を含む細胞質ゾルＤＮＡセンサ（ＣＤＳ）による感知は、Ｉ型インターフェロンの産生を引き起こす。細胞質ゾルＤＮＡセンサＡＩＭ２による感知は、インフラマソームの形成ならびにその後のＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の分泌を引き起こす。細胞質ゾルＲＮＡセンサＲＩＧ－Ｉによる間接的な感知は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる５’三リン酸部分（５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ）を有するｄｓＲＮＡへのポリ（ｄＡ：ｄＴ）の転写時に起こり得る。ＲＩＧ－Ｉによるこの間接的な感知は、Ｉ型インターフェロンの産生をもたらす。
【0127】
本発明によるＰＲＲアゴニストは、ＣＤＳリガンドおよびＳＴＩＮＧリガンドである。細胞質ゾルＤＮＡセンサ（ＣＤＳ）は、損傷した、誤って局在化した、または病原性のＤＮＡを検出し、典型的にはＴＢＫ １－ＩＲＦ３経路を介してＩ型ＩＦＮ産生を誘導する。環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、ＩＦＮ誘導性ＩＦＩ１６タンパク質、およびヘリカーゼＤＤＸ４１を含むいくつかのＣＤＳが同定されている。細胞質ゾルＤＮＡによるＩ型ＩＦＮの誘導は、小胞体膜タンパク質ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子）によって媒介される。
【0128】
本発明による適切なＣＤＳリガンドは、ｄｓＤＮＡ－ＥＣ、Ｇ３－ＹＳＤ、ＨＳＶ－６０ ＣＤＳアゴニスト、ＩＳＤ、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（Ａ １５１）、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）、ポリ（ｄＧ：ｄＣ）またはＶＡＣＶ－７０である。
【0129】
好ましいＣＤＳリガンドは、病原体由来のｄｓＤＮＡ（例えば、大腸菌Ｋ１２）、ＨＩＶ－１由来のｄｓＤＮＡ部分、ＨＳＶ－６０由来のｄｓＤＮＡ部分（単純ヘルペスウイルス）、ＩＳＤインターフェロン刺激ＤＮＡ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来）、ＶＡＣＶ－７０、ワクシニアウイルスＤＮＡに由来するウイルスＤＮＡモチーフを含有する７０ｂｐオリゴヌクレオチドである。
【0130】
別の好ましいＣＤＳリガンドは、ポリ（ｄＧ：ｄＣ）、ポリ（デオキシグアニル－デオキシシチジル）酸ナトリウム塩である。これは、ポリ（ｄＧ－ｄＣ）・ポリ（ｄＣ－ｄＧ）の反復合成二本鎖ＤＮＡ配列である。細胞内ポリ（ｄＧ：ｄＣ）は、ｃＧＡＳ、ＤＡＩ、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６およびＬＲＲＦＩＰ１などのいくつかの細胞質ゾルＤＮＡセンサ（ＣＤＳ）によって検出され、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を引き起こす。ＩＦＮのこの誘導は、小胞体タンパク質ＳＴＩＮＧによって媒介されるようである。さらに、ポリ（ｄＧ：ｄＣ）は、細胞質ゾルＤＮＡセンサＡＩＭ２（黒色腫２には存在しない）を活性化して、炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の分泌をもたらすインフラマソーム形成を引き起こす。
【0131】
細胞質ゾルＤＮＡセンサの刺激を達成するために、ポリ（ｄＧ：ｄＣ）を、例えばトランスフェクション剤を使用することによって細胞質に送達しなければならない。したがって、本発明によるナノ粒子は、トランスフェクション剤として役立ち得る。
【0132】
米国特許第８，８１５，５０３号またはＭＤＡ－５（メラノーマ分化抗原５）またはＮＡＢ２（核酸バンド２）に記載されている免疫刺激のためのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、酵母から単離されかつパターン認識受容体ＴＬＲ３およびＭＤＡ－５のアゴニストとして同定されたｄｓＲＮＡも適している。
【0133】
ＳＴＩＮＧはまた、細菌および哺乳動物の両方の環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の直接的なセンサであり、ＴＢＫ－１／ＩＲＦ－３およびＮＦ－κＢシグナル伝達経路を活性化して、堅牢なＩ型ＩＦＮおよび炎症促進性サイトカインを誘導する。
【0134】
本発明によるＳＴＩＮＧリガンドは、２’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰまたはｃ－ｄｉ－ＧＭＰである。
【0135】
好ましいＳＴＩＮＧアゴニストは、ＭＫ－１４５４（インターフェロン遺伝子タンパク質の刺激因子の合成環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）およびアゴニスト）、ポリ（ｄＧ：ｄＣ）、ＡＤＵ－Ｓ１００（インターフェロン遺伝子タンパク質の刺激因子の合成環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）およびアゴニスト）、膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）（潜在的な免疫調節活性および抗新生物活性を有する）、ＭＩＷ８１５（腫瘍内投与時に、ＳＴＩＮＧアゴニストＭＩＷ８１５がＳＴＩＮＧに結合し、ＳＴＩＮＧ媒介経路を刺激する）の群から選択される。
【0136】
本発明による組成物は、免疫賦活剤として使用され得る。本発明の免疫賦活剤は、好ましくは、薬学的に許容され得る化合物としてＴＬＲ３アゴニストを含む。本発明の更なる目的は、本発明による組成物を含む免疫賦活剤である。本発明の免疫賦活剤は、ヒトまたは動物に投与することができる。
【0137】
本発明の一実施形態では、本発明による組成物は、好ましくは免疫抑制事象の前に投与される。動物、好ましくはウシへの投与の場合、そのような免疫抑制事象は、例えば、輸送後または安定剤が変更されたときに引き起こされる動物のストレスまたは疲労の増加の結果であり得る。安定しない気候、準最適な供給量の飼料または水、および初乳の供給不足もまた、免疫抑制に影響を与える可能性がある。ヒトへの投与の場合、そのような免疫抑制事象は、例えば、外科手術である。
【0138】
したがって、本発明による組成物は、免疫系の弱化によってしばしば引き起こされるウシ伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ）またはウシ呼吸器病（ＢＲＤ）、好ましくはＢＲＤの予防および／または処置に使用される。
【0139】
本発明による組成物は、ヒトにおける周術期免疫刺激のために使用される。
【0140】
本発明の一実施形態では、本発明による組成物は、好ましくは手術前に患者に投与される。
【0141】
免疫賦活剤は、１つまたはそれを超えるアジュバントを含み、アジュバント免疫療法において使用される。当該技術分野で周知のように、アジュバントは、免疫応答を増強する薬剤である。アジュバントは当該技術分野で周知である（例えば、「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５を参照）。
【0142】
例示的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、スクアレン、スクアランおよびミョウバン（水酸化アルミニウム）が挙げられ、これらは当該技術分野で周知の材料であり、いくつかの供給元から市販されている。特定の実施形態では、アルミニウム塩またはカルシウム塩（例えば、水酸化物塩またはリン酸塩）をアジュバントとして使用することができる。ミョウバン（水酸化アルミニウム）は、多くの既存のワクチンに使用されている。
【0143】
本発明の特に好ましい実施形態では、ナノ粒子は、両方、すなわち病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、欠損感染性粒子（ＤＩＰ）および少なくとも１つの抗原からなる群から選択される化合物を含む。
【0144】
最も好ましいのは、ＰＡＭＰおよび抗原を含む化合物を含有する本発明によるナノ粒子である。
【0145】
非常に好ましい実施形態は、表面上にリンカー化合物Ｌを有するＳｉＯ２ナノ粒子を含む本発明による組成物であり、リンカー化合物Ｌは、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）と、少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基と、１つもしくはそれを超えるＰＡＭＰと、吸着結合によりリンカー化合物Ｌにコンジュゲートされている１つもしくはそれを超える抗原またはエピトープとを含み、抗原またはエピトープは、リンカーユニットＵおよび１つもしくはそれを超えるアミノ酸による親水性伸長部を含む。ＰＡＭＰは、好ましくは、ＴＬＲ３アゴニストまたはｄｓＲＮＡ構造を含むＴＬＲ７アゴニストを含むオリゴヌクレオチドアゴニストから選択される。
【0146】
開示される組成物および方法は、多種多様な抗原に適用可能である。特定の実施形態では、抗原は、タンパク質（組換えタンパク質を含む）、ポリペプチドまたはペプチド（合成ペプチドを含む）である。特定の実施形態では、抗原は、脂質または炭水化物（多糖）である。特定の実施形態では、抗原は、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）または組織である。
【0147】
特定の実施形態では、抗原は、以下からなる群から選択することができる：
（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；
（ｂ）感染性疾患に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；
（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；および
（ｄ）家畜またはペットにおいて免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド。
（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；
（ｂ）感染性疾患に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；
（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；および
（ｄ）家畜またはペットにおいて免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド。
【0148】
いくつかの実施形態では、抗原または抗原決定基は、感染性疾患の予防に有用なものである。そのような処置は、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ならびに他の哺乳動物種および非哺乳動物種を含む広範囲の宿主、好ましくはヒトに影響を及ぼす多種多様な感染性疾患を処置するのに有用であろう。したがって、組成物のために選択される抗原または抗原決定基は、医療技術者によく知られているものであろう。
【0149】
本発明による組成物と共に使用するための適切な抗原は、病原性細菌、真菌またはウイルス生物、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ウシヘルペスウイルス－１（ＢＨＶ－１）、パラインフルエンザ３型ウイルス（ＰＩ－３ Ｖ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、ｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉ、ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓに由来し得るが、これらに限定されない。
【0150】
感染性疾患の例としては、ウイルス感染性疾患、例えばＣＯＶＩＤ－１９、ウシ伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、ウシ呼吸器病（ＢＲＤ）、ＳＡＲＳおよびＨＰＶによって引き起こされる子宮頸癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【0151】
本明細書で提供される疾患または症状ずれかに関連する任意の抗原を、本明細書に記載される組成物および方法で使用することができる。これらには、癌、感染症もしくは感染性疾患または変性もしくは非自己免疫疾患に関連する抗原が含まれる。好ましいエピトープは、ヒトパピローマウイルス感染に関連するエピトープ（例えば、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（ＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９）、ＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹ（ＨＰＶ１６ Ｅ６５２－６１）、ＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（ＨＰＶ１６ Ｅ６２９－３８）、ＲＲＦＨＮＩＡＧＨＹＲ（ＨＰＶ１８ Ｅ６１２５－１３５）、ＫＡＴＬＱＤＩＶＬＨＬＥ（ＨＰＶ１８ Ｅ７５－１６）、ＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭ（ＨＰＶ １６ Ｅ７７３－８４）、ＬＥＤＬＬＭＧＴＬ（ＨＰＶ１６ Ｅ７７９－８７）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（ＨＰＶ１６ Ｅ７８２－９０）、癌抗原であるニューヨーク食道扁平上皮癌－１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）および腫瘍特異的抗原のクラスとしてのネオアンチゲンである。
【0152】
別の実施形態では、感染症または感染性疾患に関連する抗原は、本明細書で提供される感染因子のいずれかに関連する。
【0153】
一実施形態では、感染性因子は、パピローマウイルス科のウイルス、ＳＡＲＳファミリーのウイルスである。さらに別の実施形態では、感染因子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはヒトパピローマウイルスである。
【0154】
一実施形態では、本発明による組成物は、個別化された癌処置のためのワクチンとして使用される。
【0155】
本発明による組成物は、ＨＰＶの予防またはＨＰＶ陽性ヒトの処置またはＨＰＶ陽性腫瘍の処置のためのワクチンとして使用される。
【0156】
本発明の更なる目的は、本発明による組成物を含むワクチンを提供することである。
【0157】
本発明による組成物は、好ましくは安定な分散液である。
【0158】
ナノ粒子は、ナノ粒子が溶媒によって化学的に攻撃されず、物理的に修飾されず、逆もまた同様である限り、任意の所望の溶媒中に分散形態であり得、その結果、得られるナノ分散液は安定であり、特に薬学的および物理的に安定である。分散液は、ナノ粒子が単分散および非凝集形態であり、沈降傾向がなく、無菌濾過が可能であることを特に特徴とする。
【0159】
また、本発明の目的は、本発明によるナノ粒子を含む凍結乾燥物である。凍結乾燥物は、添加剤、例えば、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルデンプン、デキストランおよびフィコール）ならびに糖（例えば、トレハロース、ラクトース、スクロース、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノースおよびフルクトース）、ポリヒドロキシアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトールおよびイノシトール）、アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、プロリンおよびリジン）ならびにメチルアミン（例えば、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド、ベタインおよびサルコシン）を含み得る。本発明による凍結乾燥物は、ワクチン接種前に滅菌水で再懸濁することができる。
【0160】
本発明による医薬組成物は、特に感染性疾患、敗血症性ショック、腫瘍、癌、自己免疫疾患、アレルギーおよび慢性または急性炎症プロセスの結果として、患者生体の個々の部分の全体的な状態または状態の病原性変化を少なくとも一時的に示す患者の予防、治療、制御または後処置に使用することができる任意の組成物である。したがって、特に、本発明の意味における医薬組成物がワクチンおよび／または免疫療法薬であることが可能である。
【0161】
本発明による組成物は、固体または液体組成物の形態であり得る医薬組成物として製剤化され得る。そのような組成物は、一般に、何らかの種類の担体、例えばゼラチンもしくはアジュバントもしくは不活性希釈剤などの固体担体、または水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油もしくは合成油などの液体担体を含む。プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどの生理食塩水またはグリセロールまたはグリコールが含まれてもよい。
【0162】
本発明による組成物は、必要に応じて他の有効成分を含んでもよく、または薬学的に許容され得る医薬品添加剤、担体、緩衝剤、安定剤、等張剤、保存剤もしくは酸化防止剤、または当業者に周知の他の材料の１つもしくはそれを超えるものを含んでもよい。そのような材料は非毒性であるべきであり、薬学的に許容され得る化合物の有効性を妨げるべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば経口または非経口に依存し得る。
【0163】
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または罹患部位での注射のために、本発明による組成物は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容され得る水溶液の形態である。
【0164】
保存剤は、一般に、微生物の増殖を遅らせ、組成物の貯蔵寿命を延ばし、複数回使用の包装を可能にするために、本発明による組成物に含まれる。保存剤の例としては、フェノール、メタ－クレゾール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸およびそのエステル、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、１－チオグリセロールおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
【0165】
本発明のナノ粒子含有組成物は、経腸または非経口経路を含む任意の数の異なる経路によって患者に投与され得る。医薬組成物の非経口投与が好ましい。非経口投与には、以下の経路による投与が含まれる：静脈内、皮膚または皮下、経鼻、膣、直腸、筋肉内、眼内、経上皮、腹腔内、心臓内、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、経皮、経粘膜、ならびに吸入および局所（皮膚、眼、直腸、鼻、吸入およびエアロゾルを含む）、ならびに直腸全身経路。好ましい実施形態では、医薬組成物は局所（例えば、粘膜、皮膚）適用のためのものである。
【0166】
投与は、例えば注射によって、または送達ガンを使用してバリスティックに実施して、表皮の外層を通る経皮通過を促進する。次いで、ナノ粒子は、例えばリンパ系を通って移動するにつれて成熟する樹状細胞によって取り込まれ、エピトープペプチドおよび／またはエピトープペプチドが由来するもしくはエピトープペプチドが一部を形成する抗原に対する免疫応答およびワクチン接種の調節をもたらす。ナノ粒子はまた、エアロゾルで送達され得る。これは、ナノ粒子のサイズが小さいことによって可能になる。
【0167】
特に好ましいのは、皮内、皮下、筋肉内または静脈内注射である。投与は、例えば、いわゆるワクチン接種ガンを用いて、または注射器を用いて行うことができる。粘膜投与、特に粘膜ワクチン接種は、病原体が粘膜経路を介して体内に侵入した場合に有益であり得る。生体、好ましくはヒト患者によって吸入され、鼻および／または気管支粘膜によって取り込まれるエアロゾルとして物質を調製することも可能である。粘膜投与の他の可能な形態は、膣および直腸坐剤である。これらの投与形態は、費用対効果が高く（注射器および針のような消耗品がない）、安全であり（感染および操作ミスのリスクが非常に低く）、適用が容易であり、患者のコンプライアンスが高い（針恐怖がない）。また、粘膜免疫系（ＭＡＬＴ）に直接対処する。
【0168】
本発明の一実施形態では、本発明による組成物を含むワクチンは、粘膜投与に使用される。
【0169】
本発明のナノ粒子の例外的に小さいサイズは、標的分子または治療分子に結合されている場合であっても細胞によって取り込まれ得るので、細胞および組織への送達にとって大きな利点である。したがって、ナノ粒子はＡＰＣによって内在化され得、エピトープペプチドはクラスＩ ＭＨＣおよびクラスＩＩ ＭＨＣを介してプロセシングおよび提示される。
【0170】
本発明の特に好ましい実施形態
１．二酸化ケイ素および表面上の官能基を有する、薬学的に許容され得る化合物が負荷されたナノ粒子を含む組成物であって、
－官能基は、薬学的に許容され得る化合物の負電荷および正電荷の両方を担持および／または安定化することができ、
－組成物のゼータ電位は、少なくとも±１５ｍＶの値を有し、
－ナノ粒子は、１５０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍまたはそれ未満の粒径を有する、組成物。
１．二酸化ケイ素および表面上の官能基を有する、薬学的に許容され得る化合物が負荷されたナノ粒子を含む組成物であって、
－官能基は、薬学的に許容され得る化合物の負電荷および正電荷の両方を担持および／または安定化することができ、
－組成物のゼータ電位は、少なくとも±１５ｍＶの値を有し、
－ナノ粒子は、１５０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍまたはそれ未満の粒径を有する、組成物。
【0171】
２．ナノ粒子が、ｎｍ２単位のナノ粒子の表面に対する薬学的に許容され得る化合物の総数［分子／ｎｍ２］に関して、最大０．５、好ましくは０．０１～０．５、より好ましくは０．０３～０．４、最も好ましくは０．０５～０．３の表面負荷密度を有する、実施形態１に記載の組成物。
【0172】
３．組成物の多分散指数（ＰＤＩ）が、０～０．３２、好ましくは０．１～０．３、より好ましくは０．１～０．２、最も好ましくは０．１未満である、実施形態１または２に記載の組成物。
【0173】
４．組成物のｐＨ値が６．０～８．０である、実施形態１から３までのいずれかに記載の組成物。
【0174】
５．組成物のゼータ電位が、少なくとも±３０ｍＶの値を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0175】
６．ナノ粒子のＺ平均直径が、５ｎｍ以上１５０ｎｍ未満、好ましくは１５ｎｍ以上６０ｎｍ以下、より好ましくは２０ｎｍ以上５０ｎｍ以下、さらにより好ましくは２０ｎｍ～３０ｎｍの範囲にある、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0176】
７．負荷されたナノ粒子の正味電荷が、合計で０とは異なる、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0177】
８．官能基が、共有結合または吸着結合によってナノ粒子の表面に結合されたリンカーＬに連結されている、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0178】
９．リンカー化合物Ｌが、官能基として少なくとも１つのカルボキシル（－ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（－ＣＯＯ－）基を含む、実施形態８に記載の組成物。
【0179】
１０．リンカー化合物Ｌが、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）基を含む、実施形態８または９に記載の組成物。
【0180】
１１．リンカーＬが、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－グアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ））ＮＨ２）、－ＰＯ３Ｈ２、－ＰＯ２ＣＨ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＮＲ３
＋Ｘ－の群から選択される少なくとも１つの更なる官能基Ｌ’を含む、実施形態８から１０までのいずれかに記載の組成物。
【0181】
１２．リンカー化合物Ｌが、少なくとも式（Ｉ）の構造単位
＊－（－Ｏ）３Ｓｉ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｑ－Ｙ（Ｉ）
［式中、
Ｘは、互いに独立して、Ｈまたは負電荷であり、
Ｙは、互いに独立して、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、－ＮＨ２または－ＮＨ３ ＋であり、
ｎ、ｐおよびｑは、互いに独立して、０または１～２５の数であり、
＊－は、ナノ粒子との連結点である］
を含む、実施形態８から１１までのいずれかに記載の組成物。
＊－（－Ｏ）３Ｓｉ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＸ）－（ＣＨ２）ｑ－Ｙ（Ｉ）
［式中、
Ｘは、互いに独立して、Ｈまたは負電荷であり、
Ｙは、互いに独立して、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、－ＮＨ２または－ＮＨ３ ＋であり、
ｎ、ｐおよびｑは、互いに独立して、０または１～２５の数であり、
＊－は、ナノ粒子との連結点である］
を含む、実施形態８から１１までのいずれかに記載の組成物。
【0182】
１３．薬学的に許容され得る化合物が、吸着結合によってナノ粒子にコンジュゲートされている、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0183】
１４．薬学的に許容され得る化合物が、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖）、核酸またはペプチド抗原を含む群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0184】
１５．薬学的に許容され得る化合物が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、欠損感染性粒子（ＤＩＰ）またはエピトープを含む群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0185】
１６．ＰＡＭＰが少なくとも１つのリン酸基を含有する、実施形態１５に記載の組成物。
【0186】
１７．ＰＡＭＰがパターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストである、実施形態１５または１６に記載の組成物。
【0187】
１８．ＰＡＭＰが、ＴＬＲアゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）リガンド、メラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ－５）リガンド、細胞質ゾルＤＮＡセンサ（ＣＤＳ）リガンド、ＳＴＩＮＧリガンド（環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ））の群から選択される、実施形態１５から１７までのいずれかに記載の組成物。
【0188】
１９．ＰＡＭＰが、５’－三リン酸－ＲＮＡ、細胞質ゾルＤＮＡセンサ（ＣＤＳ）、２’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ジ－ＡＭＰ（ビス－（３’－５’）－環状二量体アデノシン一リン酸）、ｃ－ジ－ＧＭＰ（ビス－（３’－５’）－環状二量体グアノシン一リン酸、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの群から選択される、実施形態１５から１８までのいずれかに記載の組成物。
【0189】
２０．ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９アゴニストの群から選択される、実施形態１８に記載の組成物。
【0190】
２１．ＴＬＲアゴニストが、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ－Ａ）、ポリ（Ｕ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（非メチル化ＤＮＡ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（合成トリアシル化リポペプチド）である、実施形態２０に記載の組成物。
【0191】
２２．ペプチドが８～１００個のアミノ酸を含む、実施形態１４に記載の組成物。
【0192】
２３．ペプチドが、ＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープである、実施形態２２に記載の組成物。
【0193】
２４．ペプチドが、極性アミノ酸でＮ末端またはＣ末端に伸長されている、実施形態２２または２３に記載の組成物。
【0194】
２５．極性アミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、セリン、トレオニン、チロシンの群から選択される、実施形態２４に記載の組成物。
【0195】
２６．ペプチドが、酵素カテプシンＢにより切断可能なリンカーを有するＮ末端伸長部を含む、実施形態２２から２５までのいずれかに記載の組成物。
【0196】
２７．酵素により切断可能なリンカーが、カテプシンＢ感受性ジペプチドＶａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－ＬｙｓまたはＶａｌ－Ｌｙｓのうちの１つを含む、実施形態２６に記載の組成物。
【0197】
２８．スペーサが、酵素により切断可能なリンカーとペプチドとの間に配置されている、実施形態２６または２７に記載の組成物。
【0198】
２９．スペーサが自己犠牲スペーサである、実施形態２８に記載の組成物。
【0199】
３０．スペーサが、４－アミノベンジルアルコール、２－アミノベンジルアルコールまたは４－ヒドロキシベンジルアルコール、２－ヒドロキシベンジルアルコールの構造単位を含む、実施形態２８または２９に記載の組成物。
【0200】
３１．ナノ粒子が、別の材料との混合物であってもよい、少なくとも二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0201】
３２．ナノ粒子がＳｉＯ２からなる、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0202】
３３．組成物が安定な分散液である、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0203】
３４．組成物のｐＨ値が７．２～７．４である、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0204】
３５．組成物が等張性である、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0205】
３６．組成物が更なる薬学的に許容され得る添加剤を含有する、先行する実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0206】
３７．ワクチンとして使用するための、実施形態１に記載の組成物。
【0207】
３８．免疫賦活剤として使用するための、実施形態１に記載の組成物。
【0208】
３９．免疫系の活性化のためおよびアジュバントとして使用するための、実施形態３８に記載の組成物。
【0209】
４０．ウシ呼吸器病（ＢＲＤ）の予防および／または処置に使用するための、実施形態３８に記載の組成物。
【0210】
４１．ヒトにおける周術期免疫刺激のための、実施形態３８に記載の組成物。
【0211】
４２．個別化された癌処置のための、実施形態１に記載の組成物。
【0212】
４３．ＨＰＶの予防もしくはＨＰＶ陽性ヒトの処置またはＨＰＶ陽性腫瘍の処置のためのワクチンとして使用するための、実施形態３７に記載の組成物。
【0213】
４４．二酸化ケイ素および表面上の官能基を有し、１５０ｎｍ未満の粒径を有するナノ粒子であって、ナノ粒子に共有結合または吸着結合したリンカーＬを含み、リンカーＬが、官能基として少なくとも１つのグアニジノ基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２もしくは－ＮＨＣ（＝ＮＨ２
＋）ＮＨ２）またはアミノ基（－ＮＨ２もしくは－ＮＨ３
＋）基を含む、ナノ粒子。
【0214】
４５．実施形態４４に記載のナノ粒子を含む凍結乾燥物。
【0215】
４６．実施形態１に記載の組成物を含むワクチン。
【0216】
４７．実施形態１に記載の組成物を含む免疫賦活剤。
【実施例】
【0217】
実施例１
直径２５ｎｍの単分散二酸化ケイ素ナノ粒子の調製
５００ｍＬの無水エタノールを５００ｍＬのメスシリンダからスクリューキャップ付き１０００ｍＬのガラスびんに採取した。３５８ｍＬの滅菌ＤＩ水を加え、混合物を十分に振盪した。
直径２５ｎｍの単分散二酸化ケイ素ナノ粒子の調製
５００ｍＬの無水エタノールを５００ｍＬのメスシリンダからスクリューキャップ付き１０００ｍＬのガラスびんに採取した。３５８ｍＬの滅菌ＤＩ水を加え、混合物を十分に振盪した。
【0218】
６９．６ｍＬのオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）をびんに加えた。びんをしっかりと閉じ、十分に振盪した。１時間の待機時間の後、無色透明の混合物は室温（２２℃）になった。次いで、９．５ｍＬのアンモニア水（２５％）を素早く加えた。
【0219】
びんを手で１０秒間非常によく振盪し、室温で保存した。
【0220】
室温で２４時間後、より狭いサイズ分布を得るために、さらに３４．８ｍＬのＴＥＯＳを混合物に加えた（シード成長プロセス）。室温でさらに２４時間後、再び混合物に３４．８ｍＬを加えた（シード成長プロセスを続けた）。室温で２４時間後、５０μＬの反応混合物を一方向ＰＭＭＡキュベット（幅１０ｍＭ）に入れ、１．５ｍＬのＤＩ水（０．２μｍ濾過）で希釈した。キュベットを粒径測定のためにＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、英国）に入れた。
適用パラメータ：
測定角度：１７３°後方散乱（ＮＩＢＳデフォルト）
測定セル：ＤＴＳ１０７０（粒径およびゼータ電位に使用）
屈折率ＳｉＯ２：１．４６０
吸収：０．０１０
分散剤：水
屈折率：１．３３０
粘度：０．８８７２ｃＰ（＝サンプル粘度）
温度：２５℃
１０回を超える粒径測定の実行
結果：
Ｚ平均（体積基準）：２３．８６ｎｍ
ＰＤＩ：０．１０８
強度ピーク：２６．７７ｎｍ
ｐＨ：１１．０（新たに較正された複合電極）
適用パラメータ：
測定角度：１７３°後方散乱（ＮＩＢＳデフォルト）
測定セル：ＤＴＳ１０７０（粒径およびゼータ電位に使用）
屈折率ＳｉＯ２：１．４６０
吸収：０．０１０
分散剤：水
屈折率：１．３３０
粘度：０．８８７２ｃＰ（＝サンプル粘度）
温度：２５℃
１０回を超える粒径測定の実行
結果：
Ｚ平均（体積基準）：２３．８６ｎｍ
ＰＤＩ：０．１０８
強度ピーク：２６．７７ｎｍ
ｐＨ：１１．０（新たに較正された複合電極）
【0221】
ナノ粒子懸濁液を２リットルの丸底フラスコに移し、エタノールならびにアンモニアガスを、加熱式水浴を備えたロータリーエバポレーターによって除去した。４００ｍＬの滅菌ＤＩ水を少量ずつ加えた。体積を１９８．１５ｇに減少させた。
【0222】
懸濁液の固形分（純粋なナノ分散二酸化ケイ素）を２５０μＬの蒸発により三連で測定し、残渣を秤量した。
結果：
固形分：１６３．３ｍｇ／ｍＬ
ｐＨ：８．０（新たに較正された複合電極）
結果：
固形分：１６３．３ｍｇ／ｍＬ
ｐＨ：８．０（新たに較正された複合電極）
【0223】
７０．０ｍｇ／ｍＬの固形分を得るために、蒸留残渣を２６４．５ｍＬの滅菌ＤＩ水で希釈した。
実施例２：
アルギン酸化シリカナノ粒子（ＳｉＯ２－Ａｒｇ）を得るためのＬ－アルギニンによるナノ粒子の官能化
実施例２：
アルギン酸化シリカナノ粒子（ＳｉＯ２－Ａｒｇ）を得るためのＬ－アルギニンによるナノ粒子の官能化
【0224】
実施例１で得られた４６２．６５ｇのナノ粒子懸濁液４６２．６５ｇを５００ｍＬのガラスびんに入れた。磁気撹拌機を加え、びんを磁気撹拌機に置いた。１７．３５ｇのＬの（＋）－アルギニン（ＣＡＳ番号７４－７９－３、ＰａｎＲｅａｃ ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社、欧州薬局方・米国薬局方、製品コードＡ１３４５．０５００）をナノ粒子懸濁液に加えた。アルギニンが完全に溶解したら、１０．８のｐＨ値が得られ、次いで、５．３４ｍＬの３－（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＣＡＳ番号９３６４２－６８－３、Ｇｅｌｅｓｔ Ｃｏｒｐ．社、製品コード：ＳＩＴ８１９２．６）を室温でゆっくりと加えた。反応混合物は非常に混濁したが、約３０分以内にきれいになった。この時間中、２つの反応が同時に起こった：
【0225】
シランのエトキシ基は、高いｐＨ値のために加水分解された。生成されたシラノール基は、ナノ粒子上に沈殿し、ナノ粒子の上に表面コーティングを構築した。並行して、過剰のアルギニンのアミノ基は無水コハク酸基と反応し、アミド結合を形成する。
【0226】
環状無水物を開環することによって、アルギニンの消費および主にカルボン酸基の形成により、ｐＨ値は９．８に低下した。
【0227】
２４時間撹拌した後、懸濁液を１００ｋＤａの膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．社Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ、製品コードＭＡＰ １００Ｃ３８）を備えた２０ファルコンチューブに移した。ナノ粒子懸濁液を４，０００ｒｐｍ（使用した遠心分離機で＝２，７３７ｇ）で１０分間遠心分離して、開始体積より少なくとも５小さい体積にした。遠心分離後、ファルコンチューブ内の体積を滅菌ＤＩ水で元へ戻し、遠心分離を５回繰り返した。遠心分離ステップは、過剰なアルギニンおよび結合していない可能性のある反応生成物を除去するために必要である。
【0228】
遠心分離後、回収した上清の固形分を３連で測定した。方法は実施例１と同じであった。
結果：
収率：１７８．３ｇ
固形分：９７．１６ｍｇ／ｍＬ
結果：
収率：１７８．３ｇ
固形分：９７．１６ｍｇ／ｍＬ
【0229】
ナノ粒子懸濁液を１６８．１７ｍＬの滅菌ＤＩ水で希釈して、５０．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
実施例３
直径２５ｎｍのリン酸化シリカナノ粒子の合成
実施例３
直径２５ｎｍのリン酸化シリカナノ粒子の合成
【0230】
２００ｍＬの無水エタノールを２５０ｍＬのメスシリンダからスクリューキャップ付き５００ｍＬの耐圧ガラスびんに採取し、１４３．５ｍＬの滅菌ＤＩ水を加え、混合物を十分に振盪した。２７．８５ｍＬのオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）をびんに加えた。びんをしっかりと閉じ、十分に振盪した。
【0231】
１時間の待機時間の後、無色透明の混合物は室温（２２℃）になった。次いで、３．９５ｍＬのアンモニア水（２５％）を素早く加えた。びんを手で１０秒間非常によく振盪し、室温で保存した。室温で２４時間後、さらに１．５ｍＬの（ジエチルホスファトエチル）トリエトキシシラン（ＣＡＳ番号７５７－４４－８、Ｇｅｌｅｓｔ Ｃｏｒｐ．社、製品コードＳＩＤ３４１２．０）を室温で混合物に加えた。１０ｍＬのアンモニア水（２５％）も加え、反応混合物を８５℃の水浴に２４時間入れた。
【0232】
この温度で、２つの反応が並行して行われた：高いｐＨ値のために、シランのエトキシ基が加水分解された。シラノール基はシリカナノ粒子上に沈殿し、ナノ粒子の上に表面コーティングを構築した。並行して、しかしながらはるかに遅く、リン酸エステルが加水分解されて、アンモニアを対イオンとする対応する酸が得られた。５０μＬの反応混合物を一方向ＰＭＭＡキュベット（１０ｍＭ幅）に入れ、１．５ｍＬのＤＩ水（０．２μｍ濾過）で希釈した。キュベットを粒径測定のためにＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏに入れた。
結果：
Ｚ平均（体積基準）：２１．３ｎｍ
ＰＤＩ：０．１４４
強度ピーク：２７．７ｎｍ
結果：
Ｚ平均（体積基準）：２１．３ｎｍ
ＰＤＩ：０．１４４
強度ピーク：２７．７ｎｍ
【0233】
ナノ粒子懸濁液を５００ｍＬの丸底フラスコに移し、エタノールならびにアンモニアガスを、加熱式水浴を備えたロータリーエバポレーターによって除去した。２００ｍＬの滅菌ＤＩ水を少量ずつ加えた。体積を１２０ｍＬまで減少させた。この体積を、１００ｋＤａの膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．社Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ、製品コードＭＡＰ１００Ｃ３８）を備えた６本のファルコンチューブに入れた。ナノ粒子懸濁液を４，０００ｒｐｍ（使用した遠心分離機で＝２，７３７ｇ）で１０分間遠心分離して、開始体積より少なくとも８０小さい体積にした。遠心分離後、ファルコンチューブ内の体積を滅菌ＤＩ水で元へ戻し、遠心分離を５回繰り返した。遠心分離ステップは、過剰な結合していない可能性のある反応生成物を除去するために必要である。遠心分離後、回収した上清の固形分を３連で測定した。方法は実施例１と同じであった。
結果：
収率：８３．３ｇ
固形分：１０４．０ｍｇ／ｍＬ
結果：
収率：８３．３ｇ
固形分：１０４．０ｍｇ／ｍＬ
【0234】
ナノ粒子懸濁液を８６．６ｍＬの滅菌ＤＩ水で希釈して、５０．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
反応スキーム１：
実施例１＝ａ）および実施例２＝ｂ）
反応スキーム２：
実施例３
実施例４
ポリ（Ｉ：Ｃ）の吸着結合によるポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの調製
反応スキーム１：
実施例１＝ａ）および実施例２＝ｂ）
【化1】
実施例３
【化2】
ポリ（Ｉ：Ｃ）の吸着結合によるポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの調製
【0235】
２００ｍＬのエタノール、１４３．５ｍＬの滅菌脱イオン水および２７．８５ｍＬのオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）の混合物を調製した。３．７０ｍＬのアンモニア、２５％（水中ＮＨ３）を室温で加えた。反応混合物を１０秒間振盪することによって激しく混合し、撹拌せずに室温で２４時間放置した。翌日、別の部分である２７．８５ｍＬのオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を混合物に加えた。得られた混合物から５０μＬを取り出し、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）で動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。以下の結果が得られた：
Ｚ平均：２５．５３ｎｍ
平均：２０．３６ｎｍ
多分散指数（ＰＤＩ）：０．１３６
Ｚ平均：２５．５３ｎｍ
平均：２０．３６ｎｍ
多分散指数（ＰＤＩ）：０．１３６
【0236】
続いて、先に生成した１００ｍＬの二酸化ケイ素粒子の一部をロータリーエバポレーターで約３０ｍＬの体積に濃縮し、再び１００ｍＬまで充填した。これを３回繰り返し、反応溶液からエタノールおよびアンモニアを除去した。得られた懸濁液を滅菌脱イオン水で１００ｋＤａの膜上で５回洗浄した。最後の洗浄ステップの後、懸濁液の固形分を７．９％のＳｉＯ２で重量測定により測定し、計算された量の水を加えることによって懸濁液を固形分５．０％に調整した。
【0237】
実施例１で生成した１５ｍＬの二酸化ケイ素粒子（７５０ｍｇのＳｉＯ２）に、５００ｍｇのＬ－アルギニン（ＣＡＳ番号７４－７９－３；ａｂｃｒ ＧｍｂＨ社、ドイツ国）（＝２．８７ｍｍｏｌ）を加え、アルギニンを完全に溶解させながら撹拌した。透明な粒子懸濁液が得られ、この懸濁液に、室温で撹拌しながら１２７μＬの（３－トリエトキシシリルプロピル）コハク酸無水物基（ＣＡＳ番号：９３６４２－６８－３）（＝０．４５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。
【0238】
上記で得られた２．００ｍＬの「アルギニル化」シリカナノ粒子を、１ｍＬ当たり０．８３３ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度を有する３．００ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製（フランス国トゥールーズ在）ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＬＭＷ、サイズ０．２～１ｋｂ、ＣＡＳ番号３１８５２－２９－６）の低分子量溶液と混合した。ボルテックスミキサーで１５秒間完全に混合した後、１時間後に透明な懸濁液を２５０ｍｇのグルコースと混合した。配合物は、以下のものを含む：
１００ｍｇ 「アルギニル化」シリカナノ粒子、ＳｉＯ２－Ａｒｇ（ｃ＝２０ｍｇ／ｍＬ）
２．５ｍｇ ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＬＭＷ（ｃ＝０，５ｍｇ／ｍＬ）
２５０ｍｇ グルコース（ｃ＝５０ｍｇ／ｍＬ）（配合物の等張化のため）
１００ｍｇ 「アルギニル化」シリカナノ粒子、ＳｉＯ２－Ａｒｇ（ｃ＝２０ｍｇ／ｍＬ）
２．５ｍｇ ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＬＭＷ（ｃ＝０，５ｍｇ／ｍＬ）
２５０ｍｇ グルコース（ｃ＝５０ｍｇ／ｍＬ）（配合物の等張化のため）
【0239】
次いで、混合物を０．２μｍ滅菌フィルターを使用して３つの滅菌２．０ｍＬのＨＤＰＥバイアルに充填した。得られた懸濁液は澄んでおり完全に透明である。
【0240】
ポリ（Ｉ：Ｃ）負荷粒子は、滅菌フィルターを容易に通過する。２種類のフィルターを使用した：Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）膜（低タンパク質結合）０．２μｍ、カタログ番号ＰＮ４６０２およびＶＷＲ０．２μｍセルロースアセテート膜０．２μｍ、カタログ番号５１４－００６１。
【0241】
より多量のポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた後でも、懸濁液は澄んでおり完全に透明のままである。
実施例５
ＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子のペプチド負荷容量
実施例５
ＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子のペプチド負荷容量
【0242】
ペプチド負荷実験では、直径２５ｎｍ（Ｚ平均）、固形分２０ｍｇ／ｍＬおよびアルギニル化表面を有する１００μＬのシリカナノ粒子に、異なる量のモデルペプチドＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＳＩＩＮＦＥＫＬを負荷した。生理学的条件をシミュレートするために、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を加えて等張懸濁液（０．９％ＮａＣｌ）を得た。最大１０％のペプチドをナノ粒子に加えた。ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＳＩＩＮＦＥＫＬはｐＨ１０．２４の等電点を有し、４つの塩基性アミノ酸（リジン）および１つの酸性アミノ酸（グルタミン酸）によって決定されるカチオン特性を示す。
【0243】
５０μＬの対応する粒子－ペプチド－ＮａＣｌ混合物を１．５ｍＬの滅菌濾過脱イオン水で希釈し、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、英国）中で動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。各サンプル番号１～１０について、１００μＬのＳｉＯ２－Ａｒｇストック溶液を使用した。得られた結果を表２に示す。
表２：動的光散乱の結果
１保存溶液ＳｉＯ２－Ａｒｇ：２０ｍｇ／ｍＬのＳｉＯ２－Ａｒｇ
２ストック溶液ペプチド：４ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ）
３ストック溶液ＮａＣｌ：１００ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ
表２：動的光散乱の結果
【表2】
２ストック溶液ペプチド：４ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ）
３ストック溶液ＮａＣｌ：１００ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ
【0244】
【0245】
図５ａおよび図５ｂに示すように、最大５重量％このペプチドをナノ粒子に加えて、凝集または沈殿なしに安定な懸濁液を維持することができる。裸の粒子と比較して、直径はわずかに増加しており（＋５ｎｍ）、ＰＤＩは依然として非常に狭い粒径分布を示す。この光学透明懸濁液は、依然として滅菌フィルターを通過している。
【0246】
ペプチドを負荷した粒子は、滅菌フィルターを容易に通過する。２種類のフィルターを使用した：Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）膜（低タンパク質結合）０．２μｍ、カタログ番号ＰＮ４６０２およびＶＷＲ０．２μｍセルロースアセテート膜０．２μｍ、カタログ番号５１４－００６１。
【0247】
ペプチド負荷が増加すると、粒径が増加し、吸着ペプチドがシリカナノ粒子表面に結合することを示している。より高いペプチド濃度（上記の例では６％）では、ナノ懸濁液は崩壊しており、これは、濁りや凝集による測定可能な粒径の増加によって示される。これらの懸濁液は滅菌フィルターを通過せず、非経口投与には非常に好ましくない。
実施例６
ＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子のポリ（Ｉ：Ｃ）負荷容量
実施例６
ＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子のポリ（Ｉ：Ｃ）負荷容量
【0248】
負荷実験では、直径２５ｎｍ（Ｚ平均）、固形分２０ｍｇ／ｍＬおよびアルギニル化表面を有する５０μＬのシリカナノ粒子に、Ｇｉｂｃｏ（商標）によってＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーの水中の異なる量のポリ（Ｉ：Ｃ）溶液を負荷した。ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＬＭＷ）は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ Ｅｕｒｏｐｅ社（カタログ番号ｔｌｒｌ－ｐｉｃｗ）から入手した。生理学的条件をシミュレートするために、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を加えて等張懸濁液（０．９％ＮａＣｌ）を得た。最大８％のポリ（Ｉ：Ｃ）をナノ粒子に加えた。コロイドは安定したままであった：沈殿または濁りは観察されなかった。粒径および分布ならびにゼータ電位は、目視観察を裏付けるものである。
【0249】
ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ計算モデルに従って、以下の条件下で測定した：
測定温度：２５℃
平衡時間：３０秒
測定ごとに１０～１００回、サンプルごとに５回の測定（ゼータ電位＝５回の測定の平均値を行う。
表３：動的光散乱の結果
＊）２つのピーク：２７．３８ｎｍ（６７．８％）および３６２．６ｎｍ（３２．２％）
＊＊）２つのピーク：７．６９１ｎｍ（２２．９％）および１８．４ｎｍ（７７．１％）
測定温度：２５℃
平衡時間：３０秒
測定ごとに１０～１００回、サンプルごとに５回の測定（ゼータ電位＝５回の測定の平均値を行う。
表３：動的光散乱の結果
【表3】
＊＊）２つのピーク：７．６９１ｎｍ（２２．９％）および１８．４ｎｍ（７７．１％）
【0250】
６％ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷの負荷まで、吸着されたポリ（Ｉ：Ｃ）による粒径の増加のために、測定されたＺ平均値は増加する（図６ｂ）。また、低いＰＤＩ（＜０．１）は、滑らかな粒子負荷（図６ａ）を示す。８％の負荷では、２つのピーク（７．６９１ｎｍおよび１８．４ｎｍ）が現れ、より低い直径の値に向かう方向のピークの強いピーク広がりも起こり、ＰＤＩ値は悪化している（図７ｄ）。これらのデータは、粒子の「過負荷」を示す：結合していないポリ（Ｉ：Ｃ）は追加のピークを生成し、それぞれ測定ピークを広げる。
図７ａ：ナノ粒子を含まないポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ
図７ｂ：ポリ（Ｉ：Ｃ）を含まないＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子
図７ｃ：６重量％のポリ（Ｉ：Ｃ）を担持したＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子
図７ｄ：８重量％のポリ（Ｉ：Ｃ）を担持したＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子
実施例７
ペプチドおよびポリ（Ｉ：Ｃ）によるＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子の負荷
図７ａ：ナノ粒子を含まないポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ
図７ｂ：ポリ（Ｉ：Ｃ）を含まないＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子
図７ｃ：６重量％のポリ（Ｉ：Ｃ）を担持したＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子
図７ｄ：８重量％のポリ（Ｉ：Ｃ）を担持したＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子
実施例７
ペプチドおよびポリ（Ｉ：Ｃ）によるＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子の負荷
【0251】
ペプチドおよびポリ（Ｉ：Ｃ）負荷実験では、直径２５ｎｍ（Ｚ平均）、固形分２０ｍｇ／ｍＬおよびアルギニル化表面を有する１００μＬのシリカナノ粒子に、異なる量のモデルペプチドＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＳＩＩＮＦＥＫＬおよび各５０μｇのポリＩＣ（ＬＭＷ）（２．５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する２０μＬのポリ（Ｉ：Ｃ）ストック溶液）を負荷した。
【0252】
生理学的条件をシミュレートするために、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を加えて等張懸濁液（０．９％ＮａＣｌ）を得た。最大４％のペプチドをナノ粒子に加えた。コロイドは安定したままであった：沈殿または濁りは観察されなかった。粒径および分布ならびにゼータ電位は、目視観察を裏付けるものである。
表４：動的光散乱の結果
＊（ｐｅｐｔ．＝ペプチド）
実施例８
ｓｓＲＮＡ（ポリ（Ｕ））によるＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子の負荷
表４：動的光散乱の結果
【表4】
実施例８
ｓｓＲＮＡ（ポリ（Ｕ））によるＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子の負荷
【0253】
ｓｓＲＮＡ負荷実験では、直径２５ｎｍ（Ｚ平均）、固形分５０ｍｇ／ｍＬおよびアルギニル化表面（合計２０ｍｇの二酸化ケイ素）を有する４００μＬのシリカナノ粒子に、濃度１．０ｍｇ／ｍＬを有する５００μＬのポリ（Ｕ）溶液（合計０．５ｍｇのポリ（Ｕ））および濃度９０ｍｇ／ｍＬを有する１００μＬの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を加えて、等張懸濁液（０．９％ＮａＣｌ）を得た。この場合のシリカナノ粒子へのポリ（Ｕ）の負荷量は２．４４重量％である。５０μＬのこのサンプルをＤＬＳによって測定した。ポリ（Ｕ）は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製（フランス国トゥールーズ在）（カタログコード：ｔｌｒｌ－ｓｓｐｕ）から得た。
表５：動的光散乱の結果
実施例９
非メチル化ＤＮＡ（ＣｐＧ ＯＤＮ）によるＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子の負荷
表５：動的光散乱の結果
【表5】
非メチル化ＤＮＡ（ＣｐＧ ＯＤＮ）によるＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子の負荷
【0254】
ＤＮＡ負荷実験では、直径２５ｎｍ（Ｚ平均）、固形分５０ｍｇ／ｍＬおよびアルギニル化表面（合計２ｍｇの二酸化ケイ素）を有する４０μＬのシリカナノ粒子に、濃度１．０ｍｇ／ｍＬを有する５０μＬのＯＤＮ２３９５溶液（合計０．５ｍｇのＯＤＮ２３９５）および濃度９０ｍｇ／ｍＬを有する１０μＬの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加して、等張懸濁液（０．９％ ＮａＣｌ）を得た。この場合のシリカナノ粒子の担持量は２．４４重量％である。５０μＬのこのサンプルをＤＬＳによって測定した。
【0255】
ＯＤＮ２３９５は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社（フランス国）（カタログコード：ｔｌｒｌ－２３９５）から入手した。これは、構造：５’－ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃ：ｇｃｇｃｃｇ－３’（塩基はホスホロチオエート（ヌクレアーゼ耐性）であり、回文配列に下線が引かれている）を有する２２量体である。
表６：動的光散乱の結果
実施例１０
エピトープの溶解度向上の例
表６：動的光散乱の結果
【表6】
エピトープの溶解度向上の例
【0256】
酵素により切断されたリンカーのＮ末端部位に、極性アミノ酸の付加を使用して、ペプチド全体の溶解度を高めることができる。例えば、ＨＬＡ－Ａ：０２免疫原性ＨＰＶ １６ Ｅ７８２－９０エピトープＬＬＭＧＴＬＧＩＶは、極めて無極性であり、水への溶解度が非常に悪い。ヒトワクチンにおける使用は困難である。動物研究では、研究者らはそれをＤＭＳＯに溶解する。例えば皮下注射後の溶解性は疑わしい：希釈は大きなペプチド粒子の沈殿をもたらす可能性があり、これはリンパ節への輸送にとって非常に好ましくない。
本発明によれば、エピトープＬＬＭＧＴＬＧＩＶは、酵素により切断可能なリンカーＶａｌ－Ｃｉｔおよびカチオン性可溶化配列Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＬｙｓによってＮ末端部位で拡大され、
ＫＫＫＶ－Ｃｉｔ－ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ
が生じる。
本発明によれば、エピトープＬＬＭＧＴＬＧＩＶは、酵素により切断可能なリンカーＶａｌ－Ｃｉｔおよびカチオン性可溶化配列Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＬｙｓによってＮ末端部位で拡大され、
ＫＫＫＶ－Ｃｉｔ－ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ
が生じる。
【0257】
完全な合成を、自動化マイクロ波支援固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって１回の実行で行った。
【0258】
このペプチドは、水への溶解性に優れる。カテプシンＢによるエンドソームおよび／または細胞質ゾルの切断後、天然のＨＰＶ １６ Ｅ７８２－９０が放出される。また、残りのＫＫＫＶ－Ｃｉｔは、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩのいずれにも提示するには短すぎるために、免疫原性ではない。
実施例１１
初代ヒトマクロファージモデル（ＴＨＰ－１）におけるヒトＴＬＲ誘導サイトカイン
実施例１１
初代ヒトマクロファージモデル（ＴＨＰ－１）におけるヒトＴＬＲ誘導サイトカイン
【0259】
分化したＴＨＰ－１細胞をポリ（Ｉ：Ｃ）、ＳｉＯ２－Ａｒｇおよびポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇで刺激した後のサイトカインの産生を、Ｑｉａｇｅｎ社製のＭｕｌｔｉ－Ａｎａｌｙｔｅ ＥＬＩＳＡｒｒａｙを用いて行った。ナノ粒子直径は２２．１ｎｍ（Ｚ平均）、ＰＤＩは０．０８である。
【0260】
すべての実験は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ Ｅｕｒｏｐｅ社（フランス国トゥールーズ在）製の低分子量ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＬＭＷを用いて行った。
【0261】
サイトカインのスクリーニングにより、サイトカインの有意な産生が示された。
図８：７２時間の刺激後のサイトカイン発現（任意単位）対様々なタイプのサイトカイン
図８：７２時間の刺激後のサイトカイン発現（任意単位）対様々なタイプのサイトカイン
【0262】
ＴＮＦ－α、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）。ポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇによる７２時間の刺激後。ＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子では、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）の高いサイトカイン放出も認められた。
図９：９６時間の刺激後のサイトカイン発現（任意単位）対様々なタイプのサイトカイン
図９：９６時間の刺激後のサイトカイン発現（任意単位）対様々なタイプのサイトカイン
【0263】
９６時間の刺激後、サイトカインＩＬ１－β、ＩＬ１２、ＩＬ１７ Ａ、ＴＡＲＣ、ＩＦＮ－αの発現速度が増加し、ＳｉＯ２－Ａｒｇナノ粒子では、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）の高いサイトカイン放出も認められた。
【0264】
ＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）－ＬＭＷとＳｉＯ２－Ａｒｇとの組み合わせがサイトカイン放出を刺激できるかどうかを調べるために、分化したヒトマクロファージ様ＴＨＰ－１細胞を、ＳｉＯ２－Ａｒｇに吸着結合したポリ（Ｉ：Ｃ）－ＬＭＷ（ポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇ）または個々の化合物と共にインキュベートし、次いでサイトカイン特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に供した。ＴＨＰ－１細胞の上清を、いくつかの時点でインターロイキン８（ＩＬ－８）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）について分析した（図９）。ＩＬ－８およびＴＮＦ－αは、自然免疫系応答の重要なメディエーターであり、様々な免疫細胞の活性を調節する。これらの２つのサイトカインの放出は、免疫系の刺激が成功したことの証明である。
【0265】
図１０ａおよび図１０ｂ：分化したＴＨＰ－１細胞をポリ（Ｉ：Ｃ））［１２．５μｇ／ｍｌ］、ＳｉＯ２－Ａｒｇ［０．５ｍｇ／ｍＬ］または新規なアジュバント（ＳｉＯ２－Ａｒｇ［０．５ｍｇ／ｍＬ］に結合したポリ（Ｉ：Ｃ）［１２．５μｇ／ｍｌ］）で刺激した後の異なる時点でのサイトカイン放出。
【0266】
図１０ａ：ＩＬ－８放出の定量化を、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭＤｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、米国）を使用して行った。
【0267】
図１０ｂ：ＴＮＦ－α放出の定量化を、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭＤｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、米国）を使用して行った。
実施例１２
マウスのインフルエンザＡモデルにおける実験
実施例１２
マウスのインフルエンザＡモデルにおける実験
【0268】
ＴＬＲ３アゴニストの免疫刺激効力を決定するために、実施例６に従って調製した懸濁液を、インフルエンザＡウイルスＰＲ８／３４の５倍のＬＤ５０用量に対するその予防効果に関して、免疫刺激剤としての他の活性化合物と共にインビボ研究で試験した。
以下の活性化合物を試験した：
－ プラセボ：グルコース溶液（５％）
－ 遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ：低分子量ポリ（Ｉ：Ｃ）は、シチジン酸ポリ（Ｃ）ホモポリマーの鎖にアニールされたイノシン酸ポリ（Ｉ）ホモポリマーの短い鎖を含む。グルコース溶液（５％）中のポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷの平均サイズは０．２ｋｂ～１ｋｂ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、フランス国）である。
－ ＺｅｌＮａｔｅ（登録商標）：Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ（バイエルＡＧ社、ドイツ国）によるウシ呼吸器病（ＢＲＤ）の予防を補助するＦＤＡ承認の免疫賦活剤
－ 実施例６に従って調製したポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－アルギニル化
－ ５％グルコース溶液中で直径２５ｎｍの未修飾のシリコンナノ粒子
表７：各群が１０匹のマウスからなる、マウスにおける予防試験の概要
以下の活性化合物を試験した：
－ プラセボ：グルコース溶液（５％）
－ 遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ：低分子量ポリ（Ｉ：Ｃ）は、シチジン酸ポリ（Ｃ）ホモポリマーの鎖にアニールされたイノシン酸ポリ（Ｉ）ホモポリマーの短い鎖を含む。グルコース溶液（５％）中のポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷの平均サイズは０．２ｋｂ～１ｋｂ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、フランス国）である。
－ ＺｅｌＮａｔｅ（登録商標）：Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ（バイエルＡＧ社、ドイツ国）によるウシ呼吸器病（ＢＲＤ）の予防を補助するＦＤＡ承認の免疫賦活剤
－ 実施例６に従って調製したポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－アルギニル化
－ ５％グルコース溶液中で直径２５ｎｍの未修飾のシリコンナノ粒子
表７：各群が１０匹のマウスからなる、マウスにおける予防試験の概要
【表7】
【0269】
すべての場合において、注入量は１００μＬであった。
【0270】
１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスからなる各動物群（Ａ～Ｅ）を、インフルエンザＡウイルスの皮下投与の２４時間前に、それぞれの活性化合物またはプラセボで処置した。ウイルスを鼻腔内投与した。
【0271】
この研究では、動物の健康のための信頼性が高く容易に測定できるマーカーとして体重を使用した。病気の動物は食べる量が少なくなり、体重が非常に急速に減少する。倫理的理由から、研究は、終了基準として、ウイルス投与日の体重に基づいて２５％の体重減少を定義した。対照的に、より古い研究からの多くの刊行物において、「終了基準」は、ウイルス性疾患による動物の死である。
【0272】
この研究では、「アルギニル化」表面を有するシリカナノ粒子に吸着結合した、実施例６に従って調製したポリ（Ｉ：Ｃ）の製剤は、驚くほど強い免疫刺激効果を示し、Ｅ群の動物の統計的に有意に長い生存率および有意に少ない体重減少をもたらした。
【0273】
同じ濃度の有効成分を有するナノ粒子（Ｃ群）に結合していない遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）は、プラセボ群（Ａ群）と比較していかなる統計学的に有意な改善も示さない。未修飾シリカナノ粒子（群Ｄ）も統計的に有意な改善を示さなかった。
【0274】
上記の比較実験から、シリカナノ粒子に吸着的に結合したＴＬＲ３アゴニスト（群Ｅ）は、同じ濃度および同一の試験条件下で適用された遊離ＴＬＲ３アゴニスト（群Ｃ）よりも明らかに優れていることを示すことができた。免疫ブースターＺｅｌＮａｔｅ（登録商標）（群Ｂ）もまた、プラセボ群（群Ａ）と比較して、この研究で有意な改善を示さなかった。これは、有意な効果が観察されなかった群Ｄの未修飾シリカナノ粒子にも当てはまる（図１１ａおよび図１１ｂ）。
【0275】
図１２は臨床スコアを示す。データは、平均臨床スコア（最大スコア＝５）±ＳＥＭ（ｎ＝１０）として抗原負荷後の日数との関連で提示している。
実施例１３
腫瘍を含まないＡ２．ＤＲ１マウスにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９特異的ＣＤ８Ｔ細胞免疫応答の生成
実施例１３
腫瘍を含まないＡ２．ＤＲ１マウスにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９特異的ＣＤ８Ｔ細胞免疫応答の生成
【0276】
ヒトＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７由来のＨＬＡ－Ａ２結合エピトープの免疫原性は、遺伝子改変マウスにおいてのみ研究することができる。したがって、ＨＬＡヒト化Ａ２．ＤＲ１ ＢＬ６マウスを用いてインビボ研究を行った。Ａ２．ＤＲ１マウスは、ＨＬＡ－Ａ２＋／ＨＬＡ－ＤＲ１＋、Ｈ－２表現型を示すために多数の遺伝子改変を受け、ＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－ＤＲ１によって拘束される複数のエピトープに対する機能的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を組み立てることが示されていることから、非常に洗練されたマウスモデルである（Ｋｒｕｓｅ，Ｓ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＨＰＶ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ａ ＭＨＣ－ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ，Ｒｕｐｅｒｔｏ Ｃａｒｏｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２０１９，Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ；Ｋｒｕｓｅら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｉｎｉｍａｌ ＨＰＶ１６ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ＭＨＣ－ｈｕｍａｎｉｚｅｄ，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１９，Ｖｏｌ．８，１，ｐ．ｅ１５２４６９４）。
【0277】
様々な製剤の有効性を、毎週３回の皮下免疫化（０日目：プライム、７日目：ブースト、１４日目：ブースト、２１日目：脾臓サンプリング）後に高頻度のエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するそれらの能力のために調べた。
使用物質：
－ ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ：ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷの平均サイズは１．５～８ｋｂ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社（フランス国）
－ 実施例３のＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２
●ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの調製：
使用物質：
－ ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ：ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷの平均サイズは１．５～８ｋｂ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社（フランス国）
－ 実施例３のＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２
●ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの調製：
【0278】
２．７２ｍｇ（１．４８μｍｏｌ）のＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－Ｅ ７１１－１９を、滅菌条件下で５９２μＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水に溶解する。溶液をボルテックス下で５０ｍｇ／ｍＬのＳｉＯ２－Ａｒｇのストック溶液２．３７ｍＬ加える。２９６ｍｇの固体グルコースを加え、固体が完全に溶解するまで溶液を混合する。最後に、サンプルをボルテックスしながら、２．９６ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷを１．０ｍｇ／ｍＬのストック溶液として加える。ワクチンを０．４５μｍフィルターで濾過する。１．８ｍＬを各々３本の別々のバイアル（免疫ごとに１バイアル）に充填し、４℃で保存する。
【0279】
ＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９のＮ末端ペプチド伸長の影響（＝アミノ酸の１文字表記でＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）ならびにナノ粒子表面修飾の影響を調査した。ワクチン誘導性ＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を評価するために、エクスビボ再刺激脾細胞をＩＦＮ－γ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）とそれに続くフローサイトメトリーで評価した（図１３）。
図１３：
Ｙ軸：
ＨＰＶ－００１：ＲＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］
ＨＰＶ－００２：ＲＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］＠ＳｉＯ２－Ａｒｇ［２．２５ｍｇ］
ＨＰＶ－００３：ＲＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］＠ＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２［２．２５ｍｇ］
ＨＰＶ－００４：ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］＠ＳｉＯ２－Ａｒｇ［２．２５ｍｇ］
Ｘ軸：
脾臓ＩＦＮ－ｙ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞（％）
図１３：
Ｙ軸：
ＨＰＶ－００１：ＲＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］
ＨＰＶ－００２：ＲＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］＠ＳｉＯ２－Ａｒｇ［２．２５ｍｇ］
ＨＰＶ－００３：ＲＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］＠ＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２［２．２５ｍｇ］
ＨＰＶ－００４：ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－Ｅ７１１－１９［５０ｎｍｏｌ］＋ポリ（Ｉ：Ｃ）－ＨＭＷ［５０μｇ］＠ＳｉＯ２－Ａｒｇ［２．２５ｍｇ］
Ｘ軸：
脾臓ＩＦＮ－ｙ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞（％）
【0280】
ゴルジ装置－輸送阻害剤の存在下でのＥ７１１－１９による脾細胞のエクスビボ刺激後のＩＦＮ－γ陽性Ｅ７１１－１９特異的ＣＤ ８＋Ｔ細胞の頻度その後のＩＦＮ－γＩＣＳの後、ＩＦＮ－γ陽性Ｅ７１１－１９特異的Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって決定した。データを平均＋／－ＳＥＭとして表す。各点は１匹のマウスを表す。
【0281】
図１３に示すように、エピトープにコンジュゲートしたナノ粒子による３つの免疫化は、エピトープ注射と比較してより高い頻度で抗原特異的脾臓ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができた。さらに、ナノ粒子の２つの表面修飾（ＨＰＶ－００２対ＨＰＶ－００３）の直接比較により、エピトープをＳｉＯ２－Ａｒｇ（ＨＰＶ－００２）にコンジュゲートした場合により良好な性能が実証された。
【0282】
さらに、Ｎ末端ペプチド伸長（ＨＰＶ－００３対ＨＰＶ－００４）の影響を分析したところ、「ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－」修飾（ＨＰＶ－００４）は、エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い頻度をもたらした。
【0283】
この実験は、本発明によるＨＰＶ１６ワクチンが高頻度のエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する能力を首尾よく実証した。要約すると、ＳｉＯ２－Ａｒｇならびに「ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－」ペプチド伸長は、ＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２ナノ粒子および「ＲＷ－Ｃｉｔ－」ペプチド伸長よりも有益な特性を示している。したがって、両方の組み合わせを腫瘍研究における治療有効性のために使用した。
実施例１４
増殖の遅いＰＡＰ－Ａ２－ＨＰＶ１６腫瘍における治療効果
実施例１４
増殖の遅いＰＡＰ－Ａ２－ＨＰＶ１６腫瘍における治療効果
【0284】
最終研究目標は、前駆病変または確立された癌のいずれかと診断された患者に与えられる治療用抗ＨＰＶ１６ワクチンの開発である。したがって、治療ワクチン接種実験において腫瘍増殖の制御を誘導する新規ワクチンの能力を試験した。
増殖の遅いＰＡＰ－Ａ ２－ＨＰＶ１６腫瘍モデルにおける早期治療処置研究のための免疫スケジュール：
増殖の遅いＰＡＰ－Ａ ２－ＨＰＶ１６腫瘍モデルにおける早期治療処置研究のための免疫スケジュール：
【0285】
ＨＰＶ１６ Ｅ７由来のエピトープとコンジュゲートしたＳｉＯ２－Ａｒｇの治療有効性を評価するために、ＨＬＡヒト化Ａ２．ＤＲ１ ＢＬ６マウスにおけるＨＰＶ１６ Ｅ６＋／Ｅ７＋ＰＡＰ－Ａ２腫瘍モデルを使用した。１．５・１０６個のＰＡＰ－Ａ２細胞を皮下注射したが、これは２～３週間以内に大きな腫瘍をもたらすはずである。腫瘍接種後４日目から開始して、倫理的エンドポイント（腫瘍体積１０００ｍｍ３）に達するまで、腫瘍担持マウスを完全ワクチン（ＨＰＶ－００８）または対照としての個々の化合物で毎週（合計３回の免疫化、プライムブーストブースト）処置した。
【0286】
図１４は、遊離抗原ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＨＭＷ、高分子量）「遊離抗原＋ＴＬＲアゴニスト」または２３ｎｍの直径を有するアルギニル化シリカナノ粒子に両方とも吸着結合したＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＨＭＷ）のいずれかを受けたマウスの生存率を示す。
【0287】
図１４に示すように、両方ともアルギニル化シリカナノ粒子に吸着的に結合したＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＨＭＷ）による腫瘍担持マウスの処置は、９匹のマウスのうち５匹で完全な腫瘍退縮をもたらし、全生存率は５５％であった。対照的に、キャリア対照（遊離抗原＋ＴＬＲ３アゴニスト）マウスの９０％は、過剰な腫瘍増殖のために排除されなければならなかった。図１５ａおよび図１５ｂは、両方の群の個々の腫瘍増殖を示す。
【0288】
単一化合物およびエピトープとコンジュゲートしたＳｉＯ２－Ａｒｇを用いた治療的ワクチン接種からの結果をまとめると、ＫＫＫＷ－Ｃｉｔ－ＹＭＬＤＬＱＰＥＴワクチン接種とコンジュゲートした三重表面アルギニル化ナノ粒子を用いて最良の治療的抗腫瘍結果が達成されたと結論付けることができる。
実施例１５
交差提示実験
ＤＣ２．４細胞における細胞内プロセシング後のＯＶＡ２５７－２６４のＭＨＣ Ｉ交差提示
実施例１５
交差提示実験
ＤＣ２．４細胞における細胞内プロセシング後のＯＶＡ２５７－２６４のＭＨＣ Ｉ交差提示
【0289】
免疫原性エピトープに結合した酵素的切断（Ｗ－Ｃｉｔ）部位の機能性を実証するために、マウス樹状細胞（ＤＣ２．４細胞、不死化マウス樹状細胞）におけるモデル抗原ＯＶＡ２５７－２６４（＝アミノ酸の一文字表記でＳＩＩＮＦＥＫＬ）の交差提示に関する実験を行った。したがって、ナノ粒子を含むまたは含まない様々なＯＶＡ由来構築物とのインキュベーション後の主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）上のＳＩＩＮＦＥＫＬの発現を、ＭＨＣＩ上に提示された天然のエピトープの抗体（２５－Ｄ１．１６、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗体に結合したＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＨ－２Ｋｂ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．社、米国）特異的検出によって決定した。ＭＨＣ Ｉに結合していない遊離のＭＨＣ Ｉ結合エピトープまたはＭＨＣ Ｉ上の伸長エピトープは、ＭＨＣ Ｉに提示されるＳＩＩＮＦＥＫＬに対して高度に選択的である抗体によって認識されない。
【0290】
実験では、それぞれナノ粒子の有無で、全長タンパク質（ＯＶＡ＝オボアルブミン）、Ｎ末端およびＣ末端伸長エピトープ（ＯＶＡ２４７－２６４Ａ５Ｋ、いわゆる合成ロングペプチド（ＳＬＰ））、カテプシンＢ切断可能配列を有するＮ末端伸長エピトープ（例示的に示されるＲＷ－Ｃｉｔ－ＯＶＡ２５７－２６４）または天然のエピトープ（ＯＶＡ２５７－２６４）の５μＭ溶液と５・１０４個のＤＣ２．４細胞のインキュベーション後のＯＶＡ２５７－２６４提示有効性を比較した。平均直径２５ｎｍ（他の実験で使用したＳｉＯ２－Ａｒｇに匹敵するサイズ）の表面リン酸化シリカナノ粒子（ＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２）を担体として使用した。６時間のインキュベーション時間後、試験物質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって除去する。次のステップでは、細胞のＦｃ（フラグメント、結晶性）受容体への検出抗体の非特異的結合を遮断するために、細胞をＣＤ１６／ＣＤ３２抗体とインキュベートした。２５－Ｄ１．１６抗体とのインキュベーション後、交差提示ＯＶＡ ２５７－２６４の量をフローサイトメトリーによって定量化した。
【0291】
図１６：Ｈ２－Ｋｂ陽性細胞を、ＳｉＯ２－ＰＯ３Ｈ２の有無で、天然のもしくは伸長ＯＶＡ２５７－２６４エピトープまたは全長ＯＶＡタンパク質の５μＭ溶液と６時間インキュベートした後のＯＶＡ２５７－２６４ＭＨＣ Ｉ発現。２５－Ｄ１．１６検出抗体で標識した後、フローサイトメトリーによって定量化を行った。
【0292】
図１６に示すように、天然のエピトープおよび酵素切断部位を有する伸長エピトープのみがＭＨＣ上に有意な量で提示される。ナノ粒子にイオン結合したペプチドとのインキュベーションによって、提示されたエピトープの取り込み、ひいてはその量をわずかに増加させることができる。天然のエピトープは、必ずしも細胞内に内在化される必要はないが、ＭＨＣ分子上に外因的に負荷され得るので、Ｎ末端伸長エピトープは、天然配列を放出するために内在化されなければならない。細胞をＲＷ－Ｃｉｔ－ＯＶＡ２５７－２６４とインキュベートした後のＭＨＣ Ｉ上の天然のエピトープの検出は、酵素切断部位の機能性の証拠を裏付けるものである。
実施例１６
ヒト血清中の安定性測定
実施例１６
ヒト血清中の安定性測定
【0293】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞は、ＮＦ－ｋＢの活性化を監視することによってヒトＴＬＲ３によるヒトＴＬＲ３の刺激を測定するように設計されている。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞は、ｈＴＬＲ３遺伝子と、ＮＦ－ｋＢおよびＡＰ－１誘導性プロモーターの制御下に置かれた最適化分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子とをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションすることによって得た。ＴＬＲ３リガンドによる刺激は、ＳＥＡＰの産生を誘導するＮＦ－ｋＢおよびＡＰ－１を活性化する。ＳＥＡＰのレベルは、ＳＥＡＰのリアルタイム検出を可能にする細胞培養培地であるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出を用いて容易に決定することができる。ＳＥＡＰによる基質の加水分解は、肉眼で容易に検出することができるか、または９６ウェルプレートリーダー（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈｅｋ－ｂｌｕｅ－ｈｔｌｒ３を参照）で測定することができる紫／青色を生じる。
【0294】
ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇを３７℃で６０分間ヒト血清（ＨＳ）に曝露した。血清は５、１０および２０％の濃度で使用した。２０％の血清濃度は、末梢リンパの組成に非常によく対応する。
【0295】
ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇを別々にヒト血清に加えて、１ｍＬ当たり１μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度を得た。ポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの場合、ＳｉＯ２濃度は４０μｇ／ｍＬであった。この場合のＳｉＯ２－Ａｒｇにおけるポリ（Ｉ：Ｃ）ペイロードは約２．５％であった。ＨＳに曝露した後、２０μＬの培地を取り、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地中の１８０μＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞に加えた。この混合物を３７℃で１３時間インキュベートし、プレートを９６ウェルプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ社、型式：Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ）で分析した。
【0296】
結果を図１７に示す。
【0297】
２０％ヒト血清中の遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）の計算された半減期は、選択された条件下で２４．２分（６０分後の初期濃度の１８％）である。半減期計算：
ｔ１／２＝ｌｎ ２／（ｌｎ １００／ｌｎ １８）＊６０ ［分］
ｔ１／２＝ｌｎ ２／（ｌｎ １００／ｌｎ １８）＊６０ ［分］
【0298】
同じ条件下でのポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの半減期は、３９５分（６０分後の初期濃度の９０％）と計算される。
ｔ１／２＝ｌｎ ２／（ｌｎ １００／ｌｎ ９０）＊６０ ［分］
ｔ１／２＝ｌｎ ２／（ｌｎ １００／ｌｎ ９０）＊６０ ［分］
【0299】
したがって、ポリ（Ｉ：Ｃ）のアルギニル化シリカナノ粒子への結合は、半減期を１６倍増加させる（＝３９５／２４．２）。
実施例１７
ウシ血清中の安定性測定
実施例１７
ウシ血清中の安定性測定
【0300】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞は、ＮＦ－ｋＢの活性化を監視することによってヒトＴＬＲ３によるヒトＴＬＲ３の刺激を測定するように設計されている。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞は、ｈＴＬＲ３遺伝子と、ＮＦ－ｋＢおよびＡＰ－１誘導性プロモーターの制御下に置かれた最適化分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子とをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションすることによって得た。ＴＬＲ３リガンドによる刺激は、ＳＥＡＰの産生を誘導するＮＦ－ｋＢおよびＡＰ－１を活性化する。ＳＥＡＰのレベルは、ＳＥＡＰのリアルタイム検出を可能にする細胞培養培地であるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出を用いて容易に決定することができる。ＳＥＡＰによる基質の加水分解は、肉眼で容易に検出することができるか、または９６ウェルプレートリーダー（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）で測定することができる紫／青色を生じる。
【0301】
ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に３７℃で６０分間曝露した。血清は５、１０および２０％の濃度で使用した。２０％の血清濃度は、末梢リンパの組成に非常によく対応する。
【0302】
ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇを別々にウシ血清に加えて、１ｍＬ当たり１μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度を得た。ポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの場合、ＳｉＯ２濃度は４０μｇ／ｍＬであった。この場合のＳｉＯ２－Ａｒｇにおけるポリ（Ｉ：Ｃ）ペイロードは約２．５％であった。ＦＢＳに曝露した後、２０μＬの培地を取り、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地中の１８０μＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞に加えた。この混合物を３７℃で１３時間インキュベートし、プレートを９６ウェルプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ社、型式：Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ）で分析した。
結果は、図１８から確認することができた。
結果は、図１８から確認することができた。
【0303】
遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）は、より高い血清濃度で分解の明確な徴候を示すが、ポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇは、有意に高い安定性を示す。ポリ（Ｉ：Ｃ）＠ＳｉＯ２－Ａｒｇの半減期計算は、非常に低い崩壊速度のために役に立たない。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】