2023-524920 免疫調節導入遺伝子を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-14

(54)【発明の名称】免疫調節導入遺伝子を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20230607BHJP

   A61K 35/768 20150101ALI20230607BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230607BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230607BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230607BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20230607BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230607BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20230607BHJP

   C12N 15/20 20060101ALN20230607BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

A61K35/768

A61K35/15 Z

A61K45/00

A61P35/00

A61P35/04

C12N15/12

C12N15/24

C12N15/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022521641

(86)(22)【出願日】2020-10-09

(85)【翻訳文提出日】2022-06-08

(86)【国際出願番号】 US2020055083

(87)【国際公開番号】W WO2021072273

(87)【国際公開日】2021-04-15

(31)【優先権主張番号】62/913,658

(32)【優先日】2019-10-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508259467

【氏名又は名称】アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティ

(74)【復代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】マクファデン，ダグラス グラント

(72)【発明者】

【氏名】トーレス－ドミンゲス，リノ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィラ，ナンシー

(72)【発明者】

【氏名】ラフマーン，モハメド マスムズール

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA55

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB44

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA55

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

本開示は、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現する粘液腫ウイルス、ならびに対象における血液癌を阻害および／または治療する際のその使用を提供する。本開示はまた、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現する粘液腫ウイルスを有する白血球、ならびに対象における血液癌を阻害および／または治療するための白血球の使用を提供する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする導入遺伝子を含む操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）。

【請求項2】

前記１つ以上の免疫調節タンパク質が、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項3】

前記ＩＬ－１２がＩＬ－１２Ａである、請求項２に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項4】

前記ＩＬ－１２がＩＬ－１２Ｂである、請求項２に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項5】

前記免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－Ｌ１結合分子である、請求項２に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項6】

前記ＰＤ－Ｌ１結合分子が抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項7】

前記１つ以上の免疫調節タンパク質が、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激すること、核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）を活性化すること、またはインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）を活性化することができる、請求項１－６のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項8】

前記操作されたＭＹＸＶが、Ｍ００１Ｒ、Ｍ００２Ｒ、Ｍ００３．１Ｒ、Ｍ００３．２Ｒ、Ｍ００４．１Ｒ、Ｍ００４Ｒ、Ｍ００５Ｒ、Ｍ００６Ｒ、Ｍ００７Ｒ、Ｍ００８．１Ｒ、Ｍ００８Ｒ、Ｍ００９Ｌ、Ｍ０１３、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ０６３Ｌ、Ｍ１１Ｌ、Ｍ１２８Ｌ、Ｍ１３１Ｒ、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ１４１Ｒ、Ｍ１４８Ｒ、Ｍ１５１Ｒ、Ｍ１５２Ｒ、Ｍ１５３Ｒ、Ｍ１５４Ｌ、Ｍ１５６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、およびＳＯＤからなる群より選択される１つ以上の遺伝子における、またはそれに隣接する修飾を含む、請求項１－７のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項9】

前記操作されたＭＹＸＶが、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７またはＳＯＤにおける、またはそれに隣接する修飾を含む、請求項１－８のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ 。

【請求項10】

前記修飾が、欠失または挿入を含む、請求項８または請求項９に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項11】

前記導入遺伝子が、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、またはＳＯＤの一部を置き換える、請求項８－１０のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項12】

前記導入遺伝子が、ＭＹＸＶのゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に位置する、請求項８－１１のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項13】

導前記入遺伝子がＭ１３５Ｒの一部を置き換える、請求項８－１２のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項14】

前記操作されたＭＹＸＶがＭ１３５Ｒノックアウトである、請求項８－１３のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項15】

前記操作されたＭＹＸＶがＳＯＤノックアウトである、請求項８－１１のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項16】

レポーター遺伝子をさらに含む、請求項１－１５のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項17】

前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質、発光基質、または酵素をコードする、請求項１５に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項18】

ＬＣ３－ＩからＬＣ３－ＩＩへの変換アッセイによって決定されるように、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、感染細胞における自食作用を少なくとも５％増加させる、請求項１－１７のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項19】

インビトロフローサイトメトリーアッセイによって決定されるように、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、感染した癌細胞の殺傷を少なくとも５％増加させる、請求項１－１８のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項20】

インビトロフローサイトメトリーアッセイによって決定されるように、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、感染していない癌細胞の殺傷を少なくとも５％増加させる、請求項１－１９のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ。

【請求項21】

請求項１－２０のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項22】

全身投与用に製剤化されている、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

局所投与用に製剤化されている、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項24】

非経口投与用に製剤化されている、請求項２１－２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項25】

請求項１－２０のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶにエキソビボで曝露される複数の細胞を含む組成物であって、前記複数の細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。

【請求項26】

前記複数の細胞が単一の対象に由来する、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

請求項１－２０のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶまたは請求項２１－２４のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象における癌を阻害または治療する方法。

【請求項28】

請求項２５－２６のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象における癌を阻害または治療する方法。

【請求項29】

前記操作されたＭＹＸＶが、前記複数の細胞の少なくとも一部の表面にエキソビボで吸着される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記操作されたＭＹＸＶが、前記複数の細胞の表面への操作されたＭＹＸＶの結合を可能にする条件下で、前記操作されたＭＹＸＶに前記複数の細胞を曝露することによって吸着される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記操作されたＭＹＸＶが、前記複数の細胞の少なくとも一部に感染している、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記癌が固形腫瘍である、請求項２８－３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記癌が対象の第２の位置に転移している、請求項２８－３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記第２の位置が、前記対象の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記癌が、骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌、または黒色腫を含む、請求項２７－３４に記載のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記対象に追加の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項２７－３５に記載のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記追加の治療薬が、前記組成物を投与する前に前記対象に投与される、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記追加の治療薬が、前記組成物を投与した後で前記対象に投与される、請求項３６または請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記追加の治療薬が、前記組成物と共に対象に同時投与される、請求項３６－３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記対象がヒトである、請求項２７－３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象を選択する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記操作されたＭＹＸＶが、欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染することができる、請求項２７－４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞が癌細胞を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記複数の細胞が前記対象の組織から得られるか、または由来する、請求項２９－４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記複数の細胞が、前記対象に対して同種異系であるドナーに由来する、請求項２９－４３に記載のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記複数の細胞が、前記対象に対して、ＨＬＡ一致、ＨＬＡ不一致、ハプロタイプ一致、またはそれらの組み合わせであるドナーの組織から得られるか、または由来する、請求項２９－４３に記載のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

請求項１－２０のいずれか一項に記載の操作されたＭＹＸＶ、請求項２１－２４のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項２５－４６のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９１３，６５８号の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

技術分野
本開示は、粘液腫ウイルスおよび癌の治療、例えば、１つ以上の多重特異性免疫細胞エンゲージャーを発現する粘液腫ウイルスを用いる血液癌の治療のためのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

様々なタイプの癌を治療するために使用される現在の治療は、癌性細胞に毒を与えるかまたはこれを殺傷することによって機能する傾向がある。不運にも、癌細胞に毒性のある治療は、通常、健康な細胞にも毒性がある傾向がある。さらに、癌の効果的な治療はとらえどころのないままである。化学療法や放射線療法などの現在の主流の治療法は、治療ウィンドウ（例えば、有効性を達成するのに十分高いが、毒性を回避するのに十分低い濃度）が狭い可能性がある。これらのタイプの治療法は、様々なタイプの腫瘍、およびこれらの治療を投与できる限られたウィンドウに起因して、適用範囲が限られている鈍いツールと見なされる。

【発明の概要】

【0004】

本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする導入遺伝子を含む操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）である。

【0005】

いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫調節タンパク質は、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２はＩＬ－１２Ａである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ｂである。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１結合分子である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫調節タンパク質は、トール様受容体（ＴＬＲ）を刺激し、核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）を活性化し、またはインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）を活性化することができる。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、Ｍ００１Ｒ、Ｍ００２Ｒ、Ｍ００３．１Ｒ、Ｍ００３．２Ｒ、Ｍ００４．１Ｒ、Ｍ００４Ｒ、Ｍ００５Ｒ、Ｍ００６Ｒ、Ｍ００７Ｒ、Ｍ００８．１Ｒ、Ｍ００８Ｒ、Ｍ００９Ｌ、Ｍ０１３、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ０６３Ｌ、Ｍ１１Ｌ、Ｍ１２８Ｌ、Ｍ１３１Ｒ、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ１４１Ｒ、Ｍ１４８Ｒ、Ｍ１５１Ｒ、Ｍ１５２Ｒ、Ｍ１５３Ｒ、Ｍ１５４Ｌ、Ｍ１５６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、およびＳＯＤからなる群より選択される１つ以上の遺伝子においてまたはそれに隣接する修飾を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＭＹＸＶは、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７またはＳＯＤにおいてまたはそれに隣接する修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、またはＳＯＤの一部を置き換える。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＭＹＸＶのゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に位置する。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、Ｍ１３５Ｒの一部を置き換える。いくつかの実施形態では、操作されたＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒノックアウトである。いくつかの実施形態では、操作されたＭＹＸＶは、ＳＯＤノックアウトである。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、レポーター遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、発光基質または酵素をコードする。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、ＬＣ３－ＩからＬＣ３－ＩＩへの変換アッセイによって決定されるように、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、感染細胞における自食作用（オートファジー）を少なくとも５％増加させる。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、インビトロフローサイトメトリーアッセイによって決定されるように、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、感染した癌細胞の殺傷を少なくとも５％増加させる。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、インビトロフローサイトメトリーアッセイによって決定されるように、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、感染していない癌細胞の殺傷を少なくとも５％増加させる。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、操作されたＭＹＸＶおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、全身投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、複数の細胞は、エキソビボで操作されたＭＹＸＶに曝露され、ここで、複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、単一の対象に由来する。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶ、医薬組成物、または複数の細胞は、癌を治療する方法において、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、複数の細胞の少なくとも一部の表面上にエキソビボで吸着される。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、複数の細胞の表面への操作されたＭＹＸＶの結合を可能にする条件下で、操作されたＭＹＸＶに複数の細胞を曝露することによって吸着される。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、複数の細胞の少なくとも一部に感染している。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、対象の第２の場所に転移している。いくつかの実施形態では、第２の場所は、対象の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む。いくつかの実施形態では、癌は、骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌、または黒色腫を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療薬が対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物を投与する前に、追加の治療薬を対象に投与する。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物を投与した後に対象に投与される。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物と共に対象に同時投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有するか、または癌を有することが疑われる。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染することができる。いくつかの実施形態において、欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞は、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、対象の組織から得られるか、または由来する。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、対象に対して同種異系であるドナーからのものである。いくつかの実施形態において、複数の細胞は、対象に対してＨＬＡ適合、ＨＬＡ不適合、ハプロタイプ一致、またはそれらの組み合わせであるドナーの組織から得られるか、または誘導される。いくつかの実施形態では、操作されたＭＹＸＶ、医薬組成物、または組成物はキットの一部である。

【0006】

いくつかの実施形態は、１つ以上の免疫調節タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）に関する。

【0007】

いくつかの実施形態は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激するか、または核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）または（インターフェロン調節因子）ＩＲＦを活性化することができる１つ以上の免疫調節タンパク質を発現するように操作される粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）に関する。

【0008】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載の粘液腫ウイルスおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

【0009】

いくつかの実施形態は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、または免疫調節タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）によってエキソビボで処理されたそれらの組み合わせを含む組成物に関する。

【0010】

いくつかの実施形態は、免疫調節タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌を阻害または治療する方法に関する。

【0011】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌を阻害または治療する方法に関する。

【0012】

いくつかの実施形態は、粘液腫ウイルスまたは本明細書に記載の医薬組成物を含むキットに関する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

本開示の特定の実施形態の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られる。

【図1】免疫調節導入遺伝子を含む本開示の組換えＭＹＸＶを生成するために使用することができる組換えプラスミド設計の例示的な概略図を提供する。

【図2】ＳＴＩＮＧ導入遺伝子を含む本開示のＭＹＸＶを生成するために使用される組換えプラスミドの設計、および組換え後の改変されたＭＹＸＶゲノムを示す。

【図3A】候補ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧクローンまたは対照をスクリーニングすることから得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を介したＳＴＩＮＧの検出を示す。

【図3B】候補ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧクローンまたは対照に感染したＲＫ１３細胞からの溶解物のウエスタンブロットによるＳＴＩＮＧの検出を示す。

【図4】ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧの複製能力がＲＫ１３細胞における対照ウイルスと類似していたことを示している。

【図5A】図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃは、モック感染したか（図５Ａ）、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰに感染したか（図５Ｂ）、またはＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ－ＳＴＩＮＧに感染した（図５Ｃ）、ＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、およびＡ５４９細胞株から得られた顕微鏡画像である。

【図5B】図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃは、モック感染したか（図５Ａ）、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰに感染したか（図５Ｂ）、またはＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ－ＳＴＩＮＧに感染した（図５Ｃ）、ＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、およびＡ５４９細胞株から得られた顕微鏡画像である。

【図5C】図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃは、モック感染したか（図５Ａ）、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰに感染したか（図５Ｂ）、またはＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ－ＳＴＩＮＧに感染した（図５Ｃ）、ＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、およびＡ５４９細胞株から得られた顕微鏡画像である。

【図6】モック感染、ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧに感染した、またはＭＹＸＶ－ＧＦＰに感染したＡ５４９細胞からの溶解物のウエスタンブロットによって検出されたＬＣ３－ＩＩの存在を示す。

【図7A】図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、感染後２４時間および４８時間での本開示のＭＹＸＶによるＴＨＰ－１細胞の感染を示す。

【図7B】図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、感染後２４時間および４８時間での本開示のＭＹＸＶによるＴＨＰ－１細胞の感染を示す。

【図8A】図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ、感染後２４時間および４８時間での本開示のＭＹＸＶによるＵ２６６細胞の感染を示す。

【図8B】図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ、感染後２４時間および４８時間での本開示のＭＹＸＶによるＵ２６６細胞の感染を示す。

【図9】フローサイトメトリーによって評価された、本開示のＭＹＸＶによるＴＨＰ－１細胞の殺傷を実証する。

【図10】フローサイトメトリーによって評価された、本開示のＭＹＸＶによるＵ２６６細胞の殺傷を実証する。

【図11】フローサイトメトリーによって評価された、本開示のＭＹＸＶによる初代ヒト多発性骨髄腫細胞の殺傷を実証する。

【図12】骨髄生検中のＢＭ抽出の６時間後および２４時間後に分析された、同じ一次細胞サンプルから示されたＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ ４２０標識ＭＭ集団の喪失を示している。

【図13A】図１３Ａ－１３Ｃは、ＢＯＲ耐性ＶＫ１２５９８細胞株がＭＹＸＶに対して感受性であることを示す。図１３Ａは、ＭＹＸＶ（Ｖｅｎｕｓ＋）のＶＫ１２５９８細胞株への結合を示す。

【図13B】図１３Ａ－１３Ｃは、ＢＯＲ耐性ＶＫ１２５９８細胞株がＭＹＸＶに対して感受性であることを示す。図１３Ｂは、蛍光顕微鏡を介してＶＫ１２５９８細胞株の生産的感染を示す。

【図13C】図１３Ａ－１３Ｃは、ＢＯＲ耐性ＶＫ１２５９８細胞株がＭＹＸＶに対して感受性であることを示す。図１３Ｃは、フローサイトメトリーを介してＶＫ１２５９８細胞株の生産的感染を示す。

【図14A】図１４Ａおよび１４Ｂは、多剤耐性ＶＫ１２６５３細胞株のＭＹＸＶ結合および感染を示す。図１４Ａは、ＭＹＸＶ（Ｖｅｎｕｓ＋）のＶＫ１２６５３細胞株への結合を示す。

【図14B】図１４Ａおよび１４Ｂは、多剤耐性ＶＫ１２６５３細胞株のＭＹＸＶ結合および感染を示す。図１４Ｂは、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを介するＶＫ１２６５３細胞株の生産的感染を示す。

【図15A】図１５Ａ－１５Ｃは、自己移植レシピエントにおける既存の多発性骨髄腫癌を治療するための粘液腫ウイルスを用いるエキソビボ療法を示す。図１５Ａは、ＶＫ１２５９８細胞（上のパネル）と４つの実験コホート（下のパネル）を移植してから４週間後にマウスのＭスパイクを提供するウエスタンブロットを示す。ＭＭ細胞移植の４週間後のＭスパイクのレベル。

【図15B】図１５Ａ－１５Ｃは、自己移植レシピエントにおける既存の多発性骨髄腫癌を治療するための粘液腫ウイルスを用いるエキソビボ療法を示す。図１５Ｂは、低Ｍスパイク（０．１）を有する代表的なモック処置マウスにおけるＭＭ細胞（ＣＤ１３８＋Ｂ２２０－）のパーセンテージおよび高Ｍスパイク（０．６）を有する代表的な骨髄レシピエントマウスにおけるＭＭ細胞（ＣＤ１３８＋Ｂ２２０－）のパーセンテージを示す。

【図15C】図１５Ａ－１５Ｃは、自己移植レシピエントにおける既存の多発性骨髄腫癌を治療するための粘液腫ウイルスを用いるエキソビボ療法を示す。図１５Ｃは、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰを用いてエキソビボで処理された骨髄で処理されたマウスのＭスパイクを示す。移植後８日目、２９日目、および３７日目にＭスパイクバンドは検出されなかった。

【図16A】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－抗－ｍｕＰＤＬ１－ＧＦＰ、またはＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰを用いる感染２４時間後および４８時間でＧＦＰ陽性であったＴＨＰ－１細胞のパーセントを示す。

【図16B】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－抗－ｍｕＰＤＬ１－ＧＦＰ、またはＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰを用いる感染２４時間後および４８時間でＧＦＰ陽性であったＵ２６６細胞のパーセントを示す。

【図17A】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、およびＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰによって２４時間および４８時間で殺傷された感染ＴＨＰ－１細胞のパーセントを示す。

【図17B】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、およびＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰによって２４時間および４８時間で殺傷された非感染ＴＨＰ－１細胞のパーセントを示す。

【図18A】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰおよびＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰによって２４時間および４８時間で殺傷された感染Ｕ２６６細胞のパーセントを図示する。

【図18B】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰおよびＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰによって２４時間および４８時間で殺傷された非感染Ｕ２６６細胞のパーセントを図示する。

【図19】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－抗－ｍｕＰＤＬ１－ＧＦＰ、またはＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰに感染した培養物について、感染したＴＨＰ－１細胞に対する死滅したＴＨＰ－１細胞の比率を提供する。

【図20】ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－抗ｍｕＰＤＬ１－ＧＦＰ、またはＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰに感染した培養物について、感染したＵ２６６細胞に対する死滅したＵ２６６細胞の比率を提供する。

【図21】（ＧＦＰ陽性）ＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ、およびＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰに感染した初代ヒトＣＤ１３８＋多発性骨髄腫細胞のパーセントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本開示の態様は、免疫調節導入遺伝子を発現する腫瘍溶解性ウイルス組換え構築物、および血液癌などの癌を治療するためのそれらの使用に関する。腫瘍溶解性ウイルスは、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）であり得、本発明の構築物で使用される免疫調節導入遺伝子は、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、プログラムされたデスリガンド１（抗ＰＤＬ１）に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、またはそれらの組み合わせを含み得る。本明細書に記載のＭＹＸＶは、微小残存病変（ＭＲＤ）および薬剤耐性ＭＲＤを含む血液癌を治療するために使用できる。

【0015】

本明細書に記載のＭＹＸＶは、再発性多発性骨髄腫（ＭＭ）疾患などの血液癌を治療し、難治性および薬剤耐性のＭＲＤを完全に排除するためのより効果的な治療法であり得る。ＭＭは、溶解性骨病変、貧血、腎不全、高カルシウム血症を含む末端器官損傷を引き起こす悪性血漿細胞のクローン性増殖を特徴とし得る血液悪性腫瘍である（Ｈａｒｉ Ｐ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．２０１７；印刷中）。ＭＭの骨髄（ＢＭ）腫瘍微小環境は、悪性ＭＭ細胞の分化、移動、増殖、生存、および薬剤耐性をサポートおよび維持する重要な役割を果たす（Ｋａｗａｎｏ Ｙ，Ｍｏｓｃｈｅｔｔａ Ｍ，Ｍａｎｉｅｒ Ｓ，Ｇｌａｖｅｙ Ｓ，Ｇｏｅｒｇｕｅｎ ＧＴ，Ｒｏｃｃａｒｏ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１５；２６３（１））。移植適格患者のための自己幹細胞移植は、化学療法とともに、ＭＭの標準治療であり得る（Ｌａｎｄｇｒｅｎ Ｏ，Ｌｕ ＳＸ，ａｎｄ Ｈｕｌｔｃｒａｎｔｚ Ｍ．ＭＲＤ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｔｈｅ Ｍａｉｎ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｒｉｖｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｒｎ Ｔａｉｌｏｒｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１８；５５（１）：４４－５０；Ｈｏｙｏｓ Ｖ，ａｎｄ Ｉ．Ｂ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｅｒａ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖａｃｃｉｎｅｓ，ａｎｄ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（１３）：１６７９－８７）。しかし、これらの治療法の主なハードルは、治療抵抗性のＭＭ細胞の貯蔵庫として機能することができ、微小残存病変（ＭＲＤ）をもたらす腫瘍性クローンに起因する疾患の再発であり得る。

【0016】

転帰の改善にもかかわらず、ＭＭは依然としてほとんどの患者にとって不治であると見なされており、リスクの高い特徴を有する患者では低い生存率が観察される（Ｂｕｓｔｏｒｏｓ Ｍ，Ｍｏｕｈｉｅｄｄｉｎｅ ＴＨ，Ｄｅｔａｐｐｅ Ａ，ａｎｄ ＩＭ．Ｇ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ Ｅｄｕｃ Ｂｏｏｋ．２０１７；３７：５４８－６０）。ＭＹＸＶなどの腫瘍溶解性ウイルスは、形質転換された癌細胞に選択的に感染してこれを殺傷する能力、および宿主の免疫系を活性化するそれらの能力のために設計および／または選択できる哺乳動物ウイルスである。本明細書に記載のＭＹＸＶは、免疫調節導入遺伝子を利用し、宿主免疫系と組み合わせて働き、癌細胞を標的にすることができる。したがって、本明細書に記載の粘液腫ウイルスは、難治性および薬剤耐性の微小残存病変を軽減または排除するために役立つことができ、再発したＭＭ疾患を治療するためにより効果的であり得る。

【0017】

定義
特に断りのない限り、専門用語は従来の使用法に従って使用される。 分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）によって発行されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＲ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に記載されている。

【0018】

別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

【0019】

以下の用語および方法の説明は、本発明の化合物、組成物、および方法をよりよく説明し、本開示の実施において当業者を導くために提供される。また、本開示で使用される用語は、特定の実施形態および例を説明することのみを目的としており、限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。

【0020】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。

【0021】

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連するリストされた項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。

【0022】

本明細書で使用される場合、「１（つ）以上」または少なくとも１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上、任意の数までを意味し得る。

【0023】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含むこと」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含むこと」は、Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。「含む」および「含むこと」、「含み」、および「含んだ」などのこの用語のバリエーションは、本明細書で使用される場合、様々な付加的な構成要素または工程が共同して利用され得ることを意味する。

【0024】

「有効量」または「治療有効量」は、治療的および／または有益な効果であり得る所望の効果を生み出すのに十分である、本開示の化合物または組成物の量を指す。この例では、有効量は、対象の年齢、一般的な状態、治療される状態の重症度、投与される特定の薬剤、治療の期間、任意の同時治療の性質、使用される薬学的に許容される担体、および熟練作業者の知識と技能内にある同様の要因によって変動し得る。適切である場合、任意の個々の場合における有効量または治療有効量は、関連するテキストおよび文献を参照することによって、および／または実験によって決定することができる。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（最新版）を参照のこと）。

【0025】

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は交換可能に使用され、ヒトと非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、齧歯動物（例えば、マウス、ラットなど）などの哺乳動物、および非哺乳動物を含む。対象はヒトである可能性がある。対象はヒトの患者である可能性がある。いくつかの実施形態において、本開示の対象は、ヒトの対象である。

【0026】

本明細書で使用される「細胞」という用語は、単一の細胞ならびに複数の細胞または細胞の集団を含む。薬剤を細胞に投与または曝露することには、インビトロ、エキソビボ、およびインビボでの投与または曝露が含まれ得る。

【0027】

「それを必要とする対象」または「必要とする対象」は、血液癌などの癌を有することが知られているか、または有することが疑われる対象である。

【0028】

本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、悪性新生物、例えば、分化の喪失、成長速度の増加、周囲組織への浸潤を伴う特徴的な退形成を受け、転移することができる新生物を指す。

【0029】

残存癌は、癌を減少または根絶するために対象に与えられた何らかの型の治療の後に対象に残る癌である。転移性癌は、転移性癌が由来する元の（原発性）癌の起源の部位以外の、体内の１つ以上の部位、例えば、第２の部位にある癌である。局所再発は、元の癌と同じ部位（同じ組織内など）またはその近くでの癌の再発である。血液癌は、血液、骨髄、および／またはリンパ系に影響を与える癌である。

【0030】

血液癌の非限定的な例には、白血病、リンパ腫、および骨髄腫が含まれ、これには、例えば、以下が含まれる：多発性骨髄腫（ＭＭ）；活動性多発性骨髄腫；くすぶり型骨髄腫；形質細胞腫；骨の孤立性形質細胞腫；髄外形質細胞腫；軽鎖骨髄腫；非分泌性骨髄腫；免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）骨髄腫；免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）骨髄腫；免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）骨髄腫；免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）骨髄腫；免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）骨髄腫；高二倍体多発性骨髄腫；非高二倍体多発性骨髄腫；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；本態性血小板血症；真性赤血球増加症；原発性骨髄線維症；全身性肥満細胞症；慢性骨髄性白血病；慢性好中球性白血病；慢性好酸球性白血病；環状鉄芽球を伴う難治性貧血；多系統異形成を伴う難治性細胞減少症；過剰芽球１型を伴う難治性貧血；過剰芽球２型を伴う難治性貧血；孤立した欠失（ｄｅｌ）（５ｑ）を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；分類不可能なＭＤＳ；慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）；非定型慢性骨髄性白血病；若年性骨髄単球性白血病；骨髄増殖性／骨髄異形成症候群－分類不能；Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫；Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫／白血病；濾胞性リンパ腫；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫；Ｂ細胞前リンパ球性白血病；リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンストロームマクログロブリン血症；マントル細胞リンパ腫；辺縁帯リンパ腫；移植後リンパ増殖性疾患；ＨＩＶ関連リンパ腫；原発性滲出液リンパ腫；血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；重要性が不明な単クローン性免疫グロブリン血症；未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、細網内皮症、細網症、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、ワルデンストロームマクログロブリン血症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、形質細胞白血病、急性赤芽球血症および赤白血病、急性赤芽球性骨髄症、急性赤白血病、Ｈｅｉｌｍｅｙｅｒ－Ｓｃｈｏｅｎｅｒ病、急性巨核芽球性白血病、マスト細胞白血病、汎骨髄症、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症、リンパ肉腫細胞白血病、幹細胞白血病、不特定の細胞型の慢性白血病、不特定の細胞型の亜急性白血病、加速期慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性好塩基性白血病、急性好酸球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、侵攻性ＮＫ細胞白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性特発性骨髄線維症、Ｋａｈｌｅｒ病、骨髄腫症、孤立性骨髄腫、形質細胞白血病、血管中心性免疫増殖性病変、リンパ性肉芽腫症、血管免疫芽球性リンパ節腫脹症、Ｔ－ガンマリンパ増殖性疾患、ワルデンストロームマクログロブリン血症、アルファ重鎖疾患、ガンマ重鎖疾患、およびフランクリン病。いくつかの実施形態において、血液癌は多発性骨髄腫である。

【0031】

本明細書で使用される場合、「化学療法剤」という用語は、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療的有用性を有する任意の化学剤を指す。このような疾患には、腫瘍、新生物、および癌、ならびに乾癬などの過形成性増殖を特徴とする疾患が含まれ得る。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、抗新生物剤などの、癌の治療に使用される薬剤である。いくつかの実施形態において、化学療法剤は放射性化合物である。当業者は、使用する化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６ ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７ ｉｎ Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｋｅｒｙ．（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｋｎｏｂｆ，ａｎｄ Ｄｕｒｉｖａｇｅ （ｅｄｓ）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９３）。併用療法は、癌を治療するために複数の薬剤を投与することである。例えば、免疫調節導入遺伝子を発現する粘液腫ウイルスを投与することができ、１つ以上の化学療法剤を同時にまたは任意の順序で時間的に分離して投与することができる。

【0032】

本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患または状態に苦しむ患者に医薬組成物を投与することを指す。本明細書で使用される場合、癌などの「疾患を阻害または治療する」という用語は、疾患または状態の発症または進行を遅延または阻害することを指す。「治療」とは、疾患または病的状態が発症し始めた後、その兆候または症状を改善する治療的介入を指す。疾患または病的状態に関連する「改善すること」という用語は、いかなる治療の観察可能な有益な効果も指す。有益な効果は、例えば、感受性のある対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部もしくはすべての臨床症状の重症度の低下、転移などの疾患の進行の遅延、対象の全体的な健康もしくは幸福の改善、または特定の疾患に特有である当該技術分野でよく知られている他のパラメーターによって証明することができる。「予防的」治療は、例えば、転移性癌などの病状を発症するリスクを低減する目的で、疾患の兆候を示さないか、または初期の兆候のみを示す対象に投与される治療である。

【0033】

本明細書で使用される場合、本明細書に開示される治療用化合物と併せて有用な「薬学的に許容される担体」は、従来のものであり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）は、治療薬の薬剤送達に適した組成物および製剤を説明している。

【0034】

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセルの型）の場合、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどの少量の非毒性補助物質を含むことができる。

【0035】

本明細書で使用される場合、「医薬品」および「治療薬」という用語は、対象または細胞に適切に投与されたときに所望の治療的または予防的効果を誘導することができる化合物または組成物を指す。

【0036】

「複製コンピテント」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト血液細胞（例えば、血液癌細胞、または末梢血単核細胞）などの特定の宿主細胞内で感染および複製することができる粘液腫ウイルスなどのウイルスを指す。

【0037】

「免疫調節導入遺伝子」という用語は、ウイルスゲノムに導入することができ、免疫系の機能に影響を及ぼし得る、例えば、炎症、先天性または適応性免疫シグナル伝達、先天性または適応免疫細胞活性化（例えば、標的細胞の殺傷、サイトカイン、ケモカイン、または他の炎症性メディエーターの産生）、先天性または適応性免疫細胞ホーミング（例えば、走化性、血管外遊出、および／または部位での蓄積）、先天性または適応性免疫細胞増殖、先天性または適応性免疫細胞分化、抗体産生、抗癌免疫応答、あるいはそれらの組み合わせに影響を与える産物をコードする遺伝子配列を指す。免疫調節導入遺伝子の例には、ＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、およびＩＬ－１２が含まれるが含まれるが、これらに限定されない。

【0038】

粘液腫ウイルス
粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）は、その独特の生物学のために、多発性骨髄腫（ＭＭ）のような血液癌に対する治療用ウイルスとして潜在的によく適している。ＭＹＸＶは、ポックスウイルス科およびレポリポックスウイルス属のメンバーである（Ｃｈａｎ ＷＭ，Ｒａｈｍａｎ ＭＭ，ａｎｄ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ：ｔｈｅ ｐａｔｈ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３；３１（３９）：４２５２－８，Ｃｈａｎ ＷＭ，ａｎｄ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；１（１）：１１９－４１）。

【0039】

ＭＹＸＶは、様々なヒトおよびマウスの癌、例えば、原発性癌と確立された細胞株の両方を標的とすることができる新規の腫瘍溶解性ウイルスである（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＭＭ，ａｎｄ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ．Ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ：ａ ｎｅｗ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｗｅａｐｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｗａｒ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７；７（９）：１４１５－１１４２５；Ｗａｎｇ Ｇ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＪＷ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｍ，Ｗｅｒｄｅｎ ＳＪ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＪＢ，Ｇａｏ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｖｉｒａｌ ａｎｋｙｒｉｎ－ｒｅｐｅａｔ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６；１０３（１２）：４６４０－５；Ｂａｒｔｅｅ Ｅ，Ｃｈａｎ ＷＭ，Ｍｏｒｅｂ ＪＳ，Ｃｏｇｌｅ ＣＲ，ａｎｄ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｕｒｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｇｒａｆｔｓ ｕｓｉｎｇ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１２；１８（１０）：１５４０－５１；Ｃｈａｎ ＷＭ，Ｒａｈｍａｎ ＭＭ，ａｎｄ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ：ｔｈｅ ｐａｔｈ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３；３１（３９）：４２５２－８；Ｋｉｍ Ｍ，Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ ＧＪ，Ｒａｈｍａｎ ＭＭ，Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ＳＥ，Ｍｅａｃｈａｍ ＡＭ，Ｈｏｓａｋａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｌｅ ｓｐａｒｉｎｇ ｎｏｒｍａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００９；３２：２３１３－７；Ｖｉｌｌａ ＮＹ，Ｗａｓｓｅｒｆａｌｌ ＣＨ，Ｍｅａｃｈａｍ ＡＭ，Ｗｉｓｅ Ｅ，Ｃｈａｎ Ｗ，Ｗｉｎｇａｒｄ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｙｅｔ ｐｅｒｍｉｔｓ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２４）：３７７８－８８）

【0040】

本来は、ＭＹＸＶはウサギ特異的であり、一般に、免疫コンピテントなヒト、マウス、または他の家畜において感染または疾患を引き起こさない。しかし、発癌に関連する癌経路の変異の性質により、マウスとヒトの両方の癌細胞は、ＭＹＸＶを含む一部のウイルスによる感染に抵抗する能力が低下する可能性がある（例えば、損なわれた先天性免疫経路）（Ｃｈａｎ ＷＭ，ａｎｄ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；１（１）：１１９－４１，Ｓｙｐｕｌａ Ｊ，’Ｗａｎｇ Ｆ，Ｍａ Ｙ，Ｂｅｌｌ Ｊ，ａｎｄ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ．Ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４；８：１０３－１４）。

【0041】

本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、改変された（例えば、操作された）粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）である。ＭＹＸＶは、複製コンピテントであるポックスウイルスのＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ種に属する任意のウイルスであり得る。ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの野生型株である場合もあれば、ＭＹＸＶの遺伝子組み換え株である場合もある。いくつかの場合において、ＭＹＸＶはＬａｕｓａｎｎｅ株である。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは南米のＭＹＸＶ株であり、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓにおいて循環する。いくつかの場合において、ＭＹＸＶはＳｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂａｃｈｍａｎｉにおいて循環するカリフォルニアのＭＹＸＶ株である。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、６９１８であり、遺伝子Ｍ００９Ｌ、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ１３５Ｒ、およびＭ１４８Ｒ（２０１９年８月２７日にＧｅｎＢａｎｋによって提供されたような、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５５２５３０）の改変を含む弱毒化スペイン野外株である。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは６９１８ＶＰ６０－Ｔ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５５２５３１、これは、２０１９年８月２７日にＧｅｎＢａｎｋによって提供された参照により本明細書に組み込まれる）である。いくつかの場合において、ＭＹＸＶはＳＧ３３であり、これは、遺伝子Ｍ１５１Ｒ、Ｍ１５２Ｒ、Ｍ１５３Ｒ、Ｍ１５４Ｌ、Ｍ１５６Ｒ、Ｍ００８．１Ｒ、Ｍ００８Ｒ、Ｍ００７Ｒ、Ｍ００６Ｒ、Ｍ００５Ｒ、Ｍ００４．１Ｒ、Ｍ００４Ｒ、Ｍ００３．２Ｒ、Ｍ００３．１Ｒ、Ｍ００２Ｒ、およびＭ００１Ｒに影響を与えるゲノム欠失を含む株である（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）アクセッション番号１－１５９４）。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは標準実験室株（ＳＬＳ）と呼ばれる株である。

【0042】

いくつかの場合において、ＭＹＸＶゲノムは、Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｘｏｍａ Ｖｉｒｕｓ，」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６４：２９８－３１８（１９９９）に開示されている核酸配列に対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む、例えば、９５％から９８％の間、９５％から９９％の間の、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の核酸配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｘｏｍａ Ｖｉｒｕｓ，」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６４：２９８－３１８（１９９９）に開示された配列を含む。

【0043】

大きくて遺伝的に安定なポックスウイルスゲノムは、遺伝子操作、例えば、１つ以上の欠失および／または１つ以上の治療的（例えば、免疫調節）導入遺伝子の導入を伴うウイルスの生成を可能にする（Ｎａｙｅｒｏｓｓａｄａｔ Ｎ，Ｍａｅｄｅｈ Ｔ，ａｎｄ Ａｌｉ ＰＡ．Ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ａｄｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ．２０１２；１：２７）。

【0044】

本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）および改変された（例えば、操作された）ＭＹＸＶである。ＭＹＸＶは、複製コンピテントであるポックスウイルスのＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ種に属する任意のウイルスであり得る。ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの野生型株である場合もあれば、ＭＹＸＶの遺伝子組み換え株である場合もある。

【0045】

粘液腫ウイルスゲノムは、本明細書に開示され、および／または当業者に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている分子生物学技術を使用して、１つ以上の治療用導入遺伝子（例えば、ＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２などの免疫調節導入遺伝子）を発現するように改変することができる。当業者は、粘液腫ウイルスゲノムのどの部分を削除して、ウイルスが依然として生産的感染を可能にし、例えば、複製コンピテントウイルスを提供することができるかを決定することができる。例えば、削除できるウイルスゲノムの非必須領域は、公開されているウイルスゲノム配列を他のよく特徴付けられたウイルスのゲノムと比較することから推測できる（例えば、Ｃ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｓ．Ｈｏｔａ－Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｊ．－Ｘ．Ｃａｏ，Ｃ．Ｍａｃａｕｌａｙ，Ｄ．Ｗｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅｖａｎｓ，ａｎｄ Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２６４：２９８－３１８）を参照のこと）。

【0046】

いくつかの実施形態において、開示されるＭＹＸＶ組換え構築物は、多発性骨髄腫（ＭＭ）などの再発性／難治性の原発性ヒト血液悪性腫瘍を治療し、そして微小残存病変（ＭＲＤ）を標的とし、かつ低減または排除する腫瘍溶解性ウイルス候補である。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１つ以上の導入遺伝子を含む。

【0047】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、ＭＹＸＶゲノムにおける１つ以上の遺伝子改変、欠失、および／または破壊を含む。例えば、本開示のＭＹＸＶは、ゲノム内の１つ以上の遺伝子内、またはこれらの遺伝子に隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含むことができる。挿入、欠失または改変は、遺伝子ノックアウト（例えば、遺伝子によってコードされる産物の機能性をそれによって低下または排除する１つ以上のヌクレオチドの欠失、または遺伝子によってコードされる産物の発現および／または機能をそれによって破壊する１つ以上のヌクレオチドの挿入）を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、または改変は、遺伝子ノックアウトを含まない（例えば、配列は、２つの遺伝子の発現を破壊することなく、２つの遺伝子間の遺伝子間遺伝子座に挿入され得る）。改変は、例えば、本明細書に開示される遺伝子の一部を置き換える導入遺伝子であり得る。

【0048】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、宿主動物において疾患を引き起こすウイルスの能力に関連する１つ以上の遺伝子内またはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、宿主細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子内またはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、自然免疫応答を回避するウイルスの能力に関連する１つ以上の遺伝子内またはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、感染細胞における免疫シグナル伝達（例えば、サイトカイン受容体シグナル伝達）を調節する１つ以上の遺伝子内またはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、感染細胞における細胞死経路を調節する１つ以上の遺伝子（例えば、Ｍ０１１Ｌ遺伝子アクセッション番号ＧＱ３９８５３５などのアポトーシスを促進または阻害する産物をコードする遺伝子）内またはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、癌細胞におけるウイルス複製を調節する（例えば、癌細胞におけるウイルス複製の速度を増加または減少させる）１つ以上の遺伝子内またはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。

【0049】

いくつかの実施形態において、宿主動物において疾患を引き起こすウイルスの能力に関連し、宿主細胞向性に関連し、自然免疫応答を回避するウイルスの能力に関連し、感染細胞における免疫シグナル伝達を調整でき、感染細胞における細胞死経路を調節することができる、癌細胞におけるウイルス複製を調節することができ、またはそれらの組み合わせである、１つ以上の遺伝子は、Ｍ００１Ｒ、Ｍ００２Ｒ、Ｍ００３．１Ｒ、Ｍ００３．２Ｒ、Ｍ００４．１Ｒ、Ｍ００４Ｒ、Ｍ００５Ｒ、Ｍ００６Ｒ、Ｍ００７Ｒ、Ｍ００８．１Ｒ、Ｍ００８Ｒ、Ｍ００９Ｌ、Ｍ０１３、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ０６３Ｌ、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ１２８Ｌ、Ｍ１３１Ｒ、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ１４１Ｒ、Ｍ１４８Ｒ、Ｍ１５１Ｒ、Ｍ１５２Ｒ、Ｍ１５３Ｒ、Ｍ１５４Ｌ、Ｍ１５６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、およびＳＯＤのいずれか１つ以上を含む。

【0050】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、ＭＹＸＶ遺伝子の改変を含む。いくつかの場合において、改変は、ＭＹＸＶ遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を損なう欠失である。いくつかの場合において、改変は部分的な欠失である。例えば、部分的欠失は、ＭＹＸＶ遺伝子の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の欠失であり得る。いくつかの実施形態において、部分的欠失は、ＭＹＸＶ遺伝子の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、または最大で９５％の欠失であり得る。他の場合、改変は、ＭＹＸＶ遺伝子の完全な欠失である。いくつかの実施形態において、改変は、ＭＹＸＶ遺伝子を本開示の１つ以上の導入遺伝子（例えば、ＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２）で置き換えることである。

【0051】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、宿主細胞向性（例えば、ウサギ細胞向性）に関連する１つ以上の遺伝子内またはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、ウサギ細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子は、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの場合において、ウサギ細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子は、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、またはそれらの組み合わせを含む。

【0052】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の改変を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の部分的欠失または完全な欠失を含む。Ｍ１３５Ｒ遺伝子の欠失または破壊は、例えば、ＭＹＸＶが抗癌効果を示す（例えば、癌細胞に感染し、これを殺傷する）能力を損なうことなく、本開示のＭＹＸＶが宿主動物に疾患を引き起こす能力を弱めることができる。

【0053】

いくつかの場合において、改変は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を損なう欠失である。いくつかの場合において、改変は部分的欠失である（例えば、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の欠失、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大９５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の欠失）。他の場合、改変は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の完全な欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも３００の核酸の欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおけるＭ１３５Ｒの発現を駆動するプロモーター）を破壊する。いくつかの実施形態において、欠失は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１３５Ｒ転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１３５Ｒ遺伝子配列に導入する。

【0054】

いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の機能を損なうＭ１３５Ｒ遺伝子の改変（例えば、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の発現および／または機能を破壊する配列の挿入）を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２０００の核酸の挿入である。いくつかの実施形態において、挿入は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子配列のリーディングフレームを変更し、それにより、Ｍ１３５Ｒ転写物および／またはタンパク質の発現を破壊する。

【0055】

いくつかの場合において、変異は、置換、例えば、Ｍ１３５Ｒ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを弱める置換である。いくつかの実施形態において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０の核酸が置換される。いくつかの実施形態において、置換は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１３５Ｒ転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１３５Ｒ遺伝子配列に導入する。いくつかの実施形態において、置換は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１３５Ｒの発現を駆動するプロモーター）を破壊する。

【0056】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子および／またはタンパク質の活性レベルを、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１３５ＲをエンコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱める。

【0057】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１３５ＲをコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱める。

【0058】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１３５ＲをコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱められたＭ１３５Ｒタンパク質の活性レベルを有する。

【0059】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１３５ＲをコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱められたＭ１３５Ｒ遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを有する。

【0060】

いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１３５Ｒ遺伝子を置換し、例えば、Ｍ１３５Ｒ遺伝子を破壊し、これを本開示の１つ以上の導入遺伝子（例えば、ＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２）で置き換える。いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１３５Ｒ遺伝子の一部を置き換える（例えば、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の一部をＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦαで置き換える）。いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子は、Ｍ１３５－１３６遺伝子座に挿入される。ＭＹＸＶの場合、本明細書で使用される１３６は、ＭＹＸＶのＭ１３６遺伝子座を指すことができる。いくつかの実施形態において、Ｍ１３６とは、ＭＹＸＶのＭ１３６Ｒを指す。

【0061】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子の改変を含む。Ｍ１５３遺伝子産物はＥ３－ユビキチンリガーゼであり、これは、多様な細胞受容体およびタンパク質のダウンレギュレーション、例えば、ヒト細胞におけるＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４の分解に関与している可能性がある。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、弱められたＭ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルを有する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の弱められた活性および／または発現レベルは、免疫エピトープの提示、例えば、ウイルスおよび／または癌免疫ペプチドのＭＨＣ依存性提示を増強することができる。感染した癌細胞による免疫エピトープの提示の増強は、抗癌ＣＤ８＋Ｔ細胞応答などの抗癌Ｔ細胞応答を含むより強い免疫応答を誘発し得る。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の弱められた活性および／または発現レベルは、ＭＨＣ－１によるＭ１５３ＫＯウイルス感染腫瘍細胞からの直接抗原提示を増加させ、ＭＹＸＶによって媒介される免疫活性化を増強する。

【0062】

いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子の部分的欠失または完全な欠失を含む。いくつかの場合において、改変は、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を損なう欠失である。いくつかの場合において、改変は部分的欠失である（例えば、Ｍ１５３遺伝子の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の欠失、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大９５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の欠失）。いくつかの実施形態において、欠失は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも３００の核酸の欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。いくつかの実施形態において、欠失は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。

【0063】

他の場合において、改変は、Ｍ１５３遺伝子の完全な欠失である（例えば、Ｍ１５３遺伝子の全コード領域の欠失、Ｍ１５３遺伝子全体の欠失など）。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子の機能を損なうＭ１５３遺伝子の改変（例えば、Ｍ１５３遺伝子の発現および／または機能を破壊する配列の挿入）を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２０００の核酸の挿入である。いくつかの実施形態において、挿入は、Ｍ１５３遺伝子配列のリーディングフレームを変更し、それにより、Ｍ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を破壊する。

【0064】

いくつかの場合において、変異は、置換、例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを弱める置換である。いくつかの実施形態において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０の核酸が置換される。いくつかの実施形態において、置換は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。いくつかの実施形態において、置換は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。

【0065】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、Ｍ１５３遺伝子および／またはタンパク質の活性レベルを、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱める。

【0066】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、Ｍ１５３遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱める。

【0067】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱められたＭ１５３タンパク質の活性レベルを有する。

【0068】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％弱められたＭ１５３遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを有する。

【0069】

いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１５３遺伝子を置き換える（例えば、Ｍ１５３遺伝子を破壊し、またはそれを本開示の１つ以上の導入遺伝子（例えば、ＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２）で置き換える）。いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１５３遺伝子の一部を置き換える（例えば、Ｍ１５３遺伝子の一部を、ＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２で置き換える）。

【0070】

導入遺伝子
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、導入遺伝子を含む粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）組換え構築物である。

【0071】

癌と腫瘍の微小環境の状況では、さまざまな免疫調節因子が癌細胞と免疫系の間の相互作用に影響を与える可能性がある。
例えば、免疫調節因子は、悪性細胞と直接相互作用し、腫瘍微小環境への細胞傷害性リンパ球の浸潤に正または負の影響を及ぼし、癌細胞に対する免疫応答を媒介するサイトカインおよびケモカインの産生に正または負の影響を及ぼし、またはそれらの組み合わせである。１つ以上の免疫調節導入遺伝子をＭＹＸＶゲノムに導入して、例えば、癌をより効果的に治療または低減する免疫応答を促進することができる。

【0072】

例えば、いくつかの実施形態において、異なる形態の免疫調節および／または細胞死を調節する１つ以上のＭＹＸＶ内因性遺伝子が除去される。いくつかの実施形態において、１つ以上の治療的免疫調節導入遺伝子は、ウイルスゲノムに導入される（例えば、免疫原性を増加させるため、および／または癌細胞死の好ましい形態を誘導するために）。いくつかの実施形態において、１つ以上のＭＹＸＶ内因性遺伝子が除去され、１つ以上の免疫調節導入遺伝子がウイルスゲノムに導入される。

【0073】

いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、免疫調節導入遺伝子である。 いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、ＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、またはそれらの組み合わせを含む。

【0074】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、免疫シグナル伝達経路（例えば、パターン認識受容体の下流のシグナル伝達経路などの自然免疫シグナル伝達経路）に関与する免疫調節導入遺伝子を発現する組換えＭＹＸＶ構築物である。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）をコードする。抗腫瘍細胞応答の生成は、細胞応答を誘発する経路に関与するＳＴＩＮＧなどの導入遺伝子のＭＹＸＶベクターでのクローニングと発現から恩恵を受ける可能性がある。ＳＴＩＮＧ経路の活性化とそれに続くＩ型インターフェロンの分泌は、細胞性免疫応答の誘発と直接相関し得る。ＳＴＩＮＧは、腫瘍の自然免疫感知の重要な要素として提案されており、その活性化は抗腫瘍細胞応答に関連している。ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、抗癌適応免疫応答を促進することもできる。

【0075】

ＳＴＩＮＧ経路は、センサーサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）によって検出される細胞質ゾルＤＮＡの存在下で活性化され得る。ＤＮＡに結合すると、ｃＧＡＳはＳＴＩＮＧに結合して活性化するサイクリックＧＭＰ－ａｍｐ（ｃＧＡＭＰ）を生成し得る。ＳＴＩＮＧアゴニストの腫瘍内注射は、いくつかの癌マウスモデルにおいて強力な治療効果を示す。ＳＴＩＮＧ経路の活性化を、ＭＹＸＶなどの癌細胞に選択的に感染する腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせると、抗腫瘍活性の改善をもたらし得る。さらに、いくつかの場合において、ＳＴＩＮＧはオートファジーを誘発し得、これは細胞死の一因となり得る。

【0076】

表１は、ＳＴＩＮＧ配列の例を提供する。配列番号１はＤＮＡ配列を提供し、配列番号２はＳＴＩＮＧのアミノ酸配列を提供する。いくつかの場合において、ＳＴＩＮＧは改変されて、構成的に活性なＳＴＩＮＧ（例えば、ｃＧＡＭＰによる活性化を必要としないかまたは依存しないＳＴＩＮＧ）を生成できる。いくつかの実施形態において、本開示のＳＴＩＮＧは、ＳＴＩＮＧの構成的に活性なバリアントである。配列番号３はＤＮＡ配列を提供し、配列番号４は構成的に活性なＳＴＩＮＧのアミノ酸配列を提供する。

【0077】

【表1】

【0078】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号２または４に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＳＴＩＮＧをコードする。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号２または配列番号４であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＳＴＩＮＧをコードする。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号１または３に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＳＴＩＮＧをコードする。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号１または配列番号３であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＳＴＩＮＧをコードする。本開示のＭＹＸＶはヒトのＳＴＩＮＧをコードし得る。

【0079】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、融合関連小膜タンパク質（ＦＡＳＴ）などの合胞体形成を促進する免疫調節導入遺伝子を発現する組換えＭＹＸＶ構築物である。いくつかの場合において、ＦＡＳＴはＭＹＸＶ感染細胞の死を促進する。

【0080】

いくつかの場合において、本開示のＭＹＸＶは、ｐ１４ ＦＡＳＴを含むか、またはコードする。ｐ１４ ＦＡＳＴタンパク質は、爬虫類レオウイルス由来の小さな（１４ｋＤａ、３７５ｂｐ）融合性タンパク質である。いくつかの場合において、ｐ１４ ＦＡＳＴは、細胞間融合を促進する能力を通じて、宿主細胞間の横方向のウイルス拡散を促進することができます。 ｐ１４ＦＡＳＴアミノ酸配列の非限定的な例を表２に示す。

【0081】

【表2】

【0082】

いくつかの場合において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号５の配列を有するＦＡＳＴを含む（例えば、コードする）。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号５に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列の配列同一性を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＦＡＳＴをコードする。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号５であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＦＡＳＴをコードする。本開示のＦＡＳＴは、ヒトＦＡＳＴであり得る。

【0083】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする免疫調節導入遺伝子を発現する組換えＭＹＸＶ構築物である。いくつかの場合において、抗体はＰＤ－Ｌ１に対して拮抗的であり、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を妨害し、免疫活性化（例えば、抗腫瘍免疫応答の活性化）を可能にする。

【0084】

抗ＰＤＬ１抗体、その抗原結合フラグメント、またはその一部からのアミノ酸配列の非限定的な例を表３に提供する。

【0085】

【表3】

【0086】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号６－１３のいずれか１つ以上に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる抗ＰＤ－Ｌ１をコードする。いくつかの実施形態では、本開示のＭＹＸＶは、配列番号６－１３のいずれか１つ以上であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる抗ＰＤ－Ｌ１をコードする。いくつかの場合において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号６－１３のいずれか１つ以上である抗ＰＤ－Ｌ１配列（例えば、表３のＣＤＲおよび／または可変ドメインを含むｓｃＦｖ）を含むかまたはコードする。

【0087】

ＣＤＲおよび／またはその可変ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントの配列は、本明細書に開示されるアミノ酸または核酸配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７１％の相同性、少なくとも７２％の相同性、少なくとも７３％の相同性、少なくとも７４％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも７６％の相同性、少なくとも７７％の相同性、少なくとも７８％の相同性、少なくとも７９％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％相同性、少なくとも９８％の相同性、少なくとも９９％の相同性、少なくとも９９．１％の相同性、少なくとも９９．２％の相同性、少なくとも９９．３％の相同性、少なくとも９９．４％の相同性、少なくとも９９．５％の相同性、少なくとも９９．６％の相同性、少なくとも９９．７％の相同性、少なくとも９９．８％の相同性、少なくとも９９．９％の相同性、少なくとも９９．９１％の相同性、少なくとも９９．９２％の相同性、少なくとも９９．９３％の相同性、少なくとも９９．９４％の相同性、少なくとも９９．９５％の相同性、少なくとも９９．９６％の相同性、少なくとも９９．９７％の相同性、少なくとも９９．９８％の相同性、または少なくとも９９．９９％の相同性を有することができる。

【0088】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、免疫応答（例えば、抗癌免疫応答）をアップレギュレートすることができるサイトカインをコードする免疫調節導入遺伝子を発現する組換えＭＹＸＶ構築物である。いくつかの場合において、本開示のＭＹＸＶ構築物は、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）をコードする配列を含む。いくつかの場合において、本開示のＭＹＸＶ構築物は、ＩＬ－１２をコードする配列を含む。

【0089】

ＴＮＦα配列およびＩＬ－１２配列の非限定的な例を表４に提供する。

【0090】

【表4】

【0091】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号１４－１９のいずれか１つ以上に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるサイトカインをコードする。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号１４－１９のいずれか１つ以上であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるサイトカインをコードする。いくつかの場合において、本開示のＭＹＸＶは、配列番号１４－１９のいずれか１つ以上であるサイトカイン配列を含むかまたはコードする。

【0092】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、ＭＭを含む血液癌を標的とするためにこれらの免疫調節導入遺伝子の１つ以上で武装された組換えＭＹＸＶ構築物である。本開示において、免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、標準的な治療法に耐性のある難治性疾患を有する患者からの初代ヒトＭＭ細胞に選択的に感染し、そしてこれを殺傷することが示されている。さらに、これらのウイルス構築物は、ＭＭ細胞のアポトーシスおよび死を誘導することによってＭＭ細胞の生存率を損なう可能性があることが実証されている。特に、２種類のＭＭ細胞の殺傷を観察することができ、これらは、ウイルスに感染したＭＭ細胞の直接的な細胞毒性殺傷と、感染していないＭＭ細胞の「オフターゲット」殺傷である。理論に拘束されることを望まないが、感染していないＭＭ細胞の殺傷は、ＭＹＸＶ活性化免疫細胞、例えば、免疫調節導入遺伝子の産物によって活性化される免疫細胞によって媒介され得る。

【0093】

本開示の配列は、本明細書に開示されるアミノ酸配列または核酸配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７１％の相同性、少なくとも７２％の相同性、少なくとも７３％の相同性、少なくとも７４％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも７６％の相同性、少なくとも７７％の相同性、少なくとも７８％の相同性、少なくとも７９％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、少なくとも９９％の相同性、少なくとも９９．１％の相同性、少なくとも９９．２％相同性、少なくとも９９．３％の相同性、少なくとも９９．４％の相同性、少なくとも９９．５％の相同性、少なくとも９９．６％の相同性、少なくとも９９．７％の相同性、少なくとも９９．８％の相同性、少なくとも９９．９％の相同性、少なくとも９９．９１％の相同性、少なくとも９９．９２％の相同性、少なくとも９９．９３％の相同性、少なくとも９９．９４％の相同性、少なくとも９９．９５％の相同性、少なくとも９９．９６％の相同性、少なくとも９９．９７％の相同性、少なくとも９９．９８％の相同性、または少なくとも９９．９９％の相同性を有することができる。

【0094】

本開示の導入遺伝子は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体からの１つ以上の可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードすることができる。いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子（例えば、抗ＰＤＬ１）は、１つ以上の抗体に由来する１つ以上の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）は、ペプチドリンカーによって接続された抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含むことができる融合タンパク質である。例えば、導入遺伝子は、２つの標的の結合を可能にする２つのｓｃＦｖを含むことができる。

【0095】

抗原結合タンパク質は、抗体可変領域またはＣＤＲに基づいて操作することができる。抗体の可変（Ｖ）領域は、抗原結合を仲介し、抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。可変領域は、フレームワーク領域と呼ばれる比較的不変の配列、および異なる結合特異性の抗体間で配列がかなり異なる超可変領域を含む。超可変領域内には、主に抗体の結合特異性を決定するアミノ酸残基がある。これらの残基を含む配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている。抗体の１つの抗原結合部位は６つのＣＤＲを含み、３つは軽鎖の超可変領域にあり、３つは重鎖の超可変領域にある。軽鎖のＣＤＲはＬ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれ、重鎖のＣＤＲはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれる。ＣＤＲは、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と指定することもできる。抗原結合に対する各ＣＤＲの寄与は、抗体によって異なる。ＣＤＲの長さはさまざまであり得る。例えば、ＣＤＲの長さはしばしば５－１４残基であるが、０残基まで短く、または２５残基以上まで長いＣＤＲが存在する。ＣＤＲ配列を予測または指定するために、いくつかの方法、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ｐａｒａｔｏｍｅ、Ｍａｒｔｉｎ、およびＡＨｏの方法を使用できる。これらのＣＤＲ予測方法では、例えば、配列の挿入と欠失の番号が異なるため、異なる番号付けシステムを使用できる。

【0096】

抗原結合タンパク質またはそのフラグメントは、抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含むことができる。抗体フラグメントの非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂコンジュゲートの二量体および三量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、ならびに線状抗体が含まれる。ＦａｂおよびＦａｂ’は、ジスルフィド結合を介して軽鎖のＶＬおよびＣＬドメインに連結された重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むことができる抗原結合フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、ジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂまたはＦａｂ’を含むことができる。Ｆｖは、非共有結合性相互作用によって一緒に保持されたＶＨドメインとＶＬドメインを含む。ｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）は、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨドメインとＶＬドメインを含むことができる融合タンパク質である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインの配向と、リンカーの長さの操作を使用して、単量体、二量体（ダイアボディ）、三量体（トリアボディ）、または四量体（テトラボディ）であり得る、さまざまな形態の分子を作成できる。

【0097】

いくつかの実施形態において、本開示の導入遺伝子は、リンカー配列（例えば、導入遺伝子によってコードされるタンパク質の異なるドメイン間のリンカー配列）をコードすることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、抗体可変領域を結合して、ｓｃＦｖを形成するために使用される。いくつかの実施形態において、リンカーは、２つのｓｃＦｖを結合して、多重特異性構築物を形成するために使用される。リンカー配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸残基の長さであり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも１、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、または少なくとも１５アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、最大で５、最大で７、最大で９、最大で１１、最大で１５、最大で２０、最大で２５、または最大で５０アミノ酸の長さである。

【0098】

柔軟なリンカーは、グリシンおよびセリン残基のストレッチを含む配列を有することができる。グリシンおよびセリン残基のサイズが小さいことは、柔軟性を提供し、接続された機能ドメインの移動を可能にする。セリンまたはスレオニンの取り込みは、水分子と水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの安定性を維持し、それによってリンカーとタンパク質部分の間の好ましくない相互作用を減らすことができる。柔軟なリンカーにはまた、柔軟性を維持するためのスレオニンやアラニンなどの追加のアミノ酸や、溶解性を向上させるためのリジンやグルタミンなどの極性アミノ酸を含めることもできる。リジッドなリンカーは、例えば、アルファヘリックス構造を有することができる。アルファヘリックスリジッドリンカーは、タンパク質ドメイン間のスペーサーとして機能し得る。リンカーは、表５の配列のいずれか、またはその反復（例えば、配列番号２０－２９のいずれかの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の反復）を含むことができる。配列番号２０－２５は柔軟なリンカーを提供する。配列番号２６－２９はリジッドなリンカーを提供する。

【0099】

【表5】

【0100】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、１つ以上の追加の導入遺伝子（例えば、例えば、１つ以上のＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２に加えて、１つ以上の導入遺伝子）を含むことができる。

【0101】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、ＭＹＸＶによって感染された細胞における自食作用（オートファジー）を増加させることができる。自食作用は、例えば、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、または非感染細胞と比較して、免疫調節導入遺伝子を発現する操作されたＭＹＸＶによって増加させることができる。いくつかの実施形態において、自食作用は、ＬＣ３－ＩからＬＣ３－ＩＩへの変換アッセイで測定した場合に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍増加する。

【0102】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、感染した癌細胞の殺傷（例えば、「オンターゲット」の殺傷）を増加させることができる。感染した癌細胞の殺傷は、例えば、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、または感染していない癌細胞と比較して、免疫調節導入遺伝子を発現する操作されたＭＹＸＶによって増加させることができる。本開示のＭＹＸＶは、例えば、生／死染色アッセイによって決定されるように、感染した癌細胞の殺傷を、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍増加させることができる。ＭＹＸＶは、非癌細胞よりも癌細胞に優先的に感染し、優先的に殺傷することができる。

【0103】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、感染していない癌細胞の殺傷（例えば、「オフターゲット」殺傷）を増加させることができる。感染していない癌細胞の殺傷は、例えば、導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して、または感染していない癌細胞と比較して、免疫調節性導入遺伝子を発現する操作されたＭＹＸＶによって増加させることができる。本開示のＭＹＸＶは、例えば、生／死染色アッセイによって決定されるように、非感染癌細胞の殺傷を例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍増加させることができる。ＭＹＸＶは、非癌細胞よりも癌細胞に優先的に感染し、優先的に殺傷することができる。

【0104】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、１つの免疫調節導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、２つの免疫調節導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、３つの免疫調節導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、４つの免疫調節導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、５つの免疫調節導入遺伝子を含む。

【0105】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、１つ以上の非免疫調節性導入遺伝子を含み得る（例えば、１つ以上のＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２に加えて、１つ以上のレポーター導入遺伝子の非免疫調節性導入遺伝子）。

【0106】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、１つ以上のレポーター導入遺伝子（例えば、１つ以上のＳＴＩＮＧ、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ－１２に加えて１つ以上のレポーター導入遺伝子）を含むことができる。レポーター導入遺伝子（またはレポーター遺伝子）を使用して、ＭＹＸＶをインビトロ、エキソビボ、またはインビボでモニターまたは定量化できる。いくつかの実施形態において、レポーター導入遺伝子は、本開示のＭＹＸＶによって感染された細胞を同定するために使用され得る。例えば、本開示のＭＹＸＶは、蛍光導入遺伝子を発現することができ、感染細胞は、蛍光（例えば、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリー）を介して同定することができる。いくつかの実施形態において、レポーター導入遺伝子は、本開示のＭＹＸＶによって感染された細胞を定量するために使用され得る。例えば、本開示のＭＹＸＶは、蛍光導入遺伝子を発現することができ、感染細胞は、蛍光を介して定量することができる（例えば、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーを介する感染細胞の数または割合の定量）。いくつかの実施形態において、レポーター導入遺伝子は、本開示のＭＹＸＶによって感染された細胞におけるウイルス複製またはウイルス量を定量するために使用され得る。例えば、本開示のＭＹＸＶは、蛍光導入遺伝子を発現することができ、感染細胞は、蛍光を介して定量することができる（例えば、蛍光顕微鏡のフローサイトメトリーを介する細胞の平均蛍光強度の定量）。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、インビボでのウイルス負荷またはウイルス複製を定量するために使用され得るレポーター遺伝子を発現することができる（例えば、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用するイメージング）。

【0107】

本開示のレポーター導入遺伝子は、構成的に発現させることができる（例えば、構成的プロモーターの制御下で）。本開示のレポーター導入遺伝子は、条件付きで発現させることができる（例えば、条件付きプロモーター、例えば、複製サイクルの特定の段階でのみ活性であるか、またはより活性であるプロモーターの制御下で発現される）。

【0108】

レポーター導入遺伝子の非限定的な例には、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＴｄＴｏｍａｔｏ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、Ｖｅｒｄｅ蛍光タンパク質（ＶＦＰ）、ｋｉｎｄｌｉｎｇ蛍光タンパク質（ＫＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄなど）、ならびに発光に関与する酵素および基質（例えば、ルシフェリンおよび／またはルシフェラーゼ）が含まれる。

【0109】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、レポーター導入遺伝子を含まないか、またはコードしない（例えば、いかなる蛍光または発光タンパク質もコードしない）。

【0110】

１つ以上の免疫調節導入遺伝子の発現に加えて、本開示のＭＹＸＶは、ＭＹＸＶ治療の抗癌効果を増強することができる１つ以上の他の遺伝子を運ぶように改変され得る。このような遺伝子は、アポトーシスの誘発に関与するか、または感染細胞を免疫破壊の標的にすることに関与する遺伝子、例えば、インターフェロンに対する細胞の応答性を回復する遺伝子、または細菌の細胞表面抗原などの免疫応答を刺激する、細胞表面マーカーの発現をもたらす遺伝子であり得る。本開示のＭＹＸＶは、新生物または癌細胞の増殖および成長を遮断することに関与する１つ以上の遺伝子を発現するように改変することができ、それによって、癌細胞の分裂を防止または低減する。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、化学療法剤の合成に関与する遺伝子などの治療遺伝子を含むように改変され得る。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、特定の種の細胞におけるウイルス複製を増加させる導入遺伝子を含むことができる（例えば、ヒト癌細胞の殺傷および阻害の増加のためのヒト癌細胞における複製の増加）。

【0111】

治療の方法
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、本開示の粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を利用する対象における血液癌を治療する方法である。血液癌は、微小残存病変（ＭＲＤ）および／または薬剤耐性ＭＲＤを含む血液癌であり得る。

【0112】

以下の実施例に開示されるように、インビトロ研究は、標準的な治療に失敗した患者から難治性の原発性ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を有意に排除する本開示のＭＹＸＶ構築物の能力を実証した。ＭＹＸＶを使用して実施された研究では、ＭＹＸＶは、ヒトおよびマウスの多くのタイプの癌に対して向性を有する非常に特異的な抗癌剤であり得ることが示されている。

【0113】

本開示の治療は、多くの新規かつ有利な態様を含むことができる。例えば、これらのウイルス構築物は、各ウイルスに直接感染した薬剤耐性の初代ヒトＭＭ細胞（例えば、ＧＦＰ＋またはＴｄＴｏｍａｔｏ＋などのウイルスレポーター遺伝子を発現するＣＤ１３８＋細胞）を選択的に標的にして直接排除する、これまでのところ、唯一の腫瘍溶解ウイルスである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫調節性導入遺伝子を含む本開示のＭＹＸＶは、ウイルス感染細胞の直接殺傷によって血液癌細胞を排除することができるだけでなく、非感染癌細胞の「オフターゲット」殺傷を強化することによって（例えば、ウイルス活性化免疫細胞を介して）疾患を排除することもできる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子を含む本開示のＭＹＸＶは、他のウイルス（例えば、非武装ウイルスまたは免疫調節導入遺伝子を欠くウイルス）と比較して、非感染癌細胞の殺傷の増加を誘発することができる。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、感染していないＭＭ細胞（例えば、ＧＦＰ－またはＴｄＴｏｍｏｔｏ－などのウイルスレポーター遺伝子について陰性であるＣＤ１３８＋細胞）の増強された「オフターゲット」殺傷を示し得る。特定の理論に拘束されることを望まないが、感染していない細胞のウイルス増強殺傷は、ＭＹＸＶ活性化免疫細胞（例えば、本開示の導入遺伝子、他のウイルス成分、またはそれらの組み合わせによって活性化される免疫細胞）によって媒介され得る。

【0114】

血液悪性腫瘍（例えば、血液悪性腫瘍の難治性および／または微小残存病変（ＭＲＤ））を治療するためのＭＹＸＶの使用は、化学療法や幹細胞移植を含む現在の治療法、および他の候補腫瘍溶解性ウイルスを超えた、複数の利点を含み得る。ＭＹＸＶは、例えば、ウイルスがヒトの癌細胞に感染することを可能にするが、ウイルスが非癌性のヒト細胞に感染することを可能にしない、限定された向性を含む。ヒトの病原体から適応したほとんどのウイルスとは異なり、ＭＹＸＶはヒトに病気を引き起こさないため、このことは免疫システムが低下している患者にさえも安全にする。ヒト集団における既存の抗ＭＹＸＶ適応免疫の欠如は有利であり得、例えば、ヒト病原体から適応したウイルスのように迅速に除去されることなく、ウイルスが癌細胞に感染して殺傷することを可能にする。

【0115】

本明細書に開示されるエキソビボ治療アプローチにおいて、細胞（例えば、骨髄（ＢＭ）細胞および／または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））とのＭＹＸＶのインキュベーションは、高速であり得、例えば、エキソビボで１時間のウイルスインキュベーションのみを必要とし、その後、癌患者に細胞を再注入する。

【0116】

したがって、本開示の態様は、治療を必要とする対象における血液癌を阻害および／または治療するための方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、ヒト対象などの対象に、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を投与し、それによって必要としている対象の血液癌を治療および／または阻害する工程を含む。対象は哺乳動物であり得る。対象はヒトであり得る。

【0117】

いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶ－抗ＰＤ－Ｌ１を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶはＭＹＸＶ－ＦＡＳＴを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶ－ＴＮＦαを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶ－ＩＬ－１２を含む。

【0118】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、レポーター導入遺伝子（例えば、蛍光タンパク質または発光基質または酵素）を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を含み、さらにレポーター導入遺伝子を含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、ウイルスゲノム中の１つ以上の遺伝子における改変、挿入、欠失、または破壊を含む。例えば、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ００１Ｒ、Ｍ００２Ｒ、Ｍ００３．１Ｒ、Ｍ００３．２Ｒ、Ｍ００４．１Ｒ、Ｍ００４Ｒ、Ｍ００５Ｒ、Ｍ００６Ｒ、Ｍ００７Ｒ、Ｍ００８．１Ｒ、Ｍ００８Ｒ、Ｍ００９Ｌ、Ｍ０１３、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ０６３Ｌ、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ１２８Ｌ、Ｍ１３１Ｒ、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ１４１Ｒ、Ｍ１４８Ｒ、Ｍ１５１Ｒ、Ｍ１５２Ｒ、Ｍ１５３Ｒ、Ｍ１５４Ｌ、Ｍ１５６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、およびＳＯＤ遺伝子のいずれか１つ以上の中またはそれに隣接する改変、挿入、欠失、または破壊を含むことができる。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶにおけるウイルス遺伝子の欠失または破壊は、宿主動物に疾患を引き起こし、宿主細胞の向性を調節し、非癌細胞における自然免疫回避を減少させ、感染細胞における免疫シグナル伝達を調節し、感染細胞における細胞死経路を調節し、癌細胞におけるウイルス複製を増加させ、またはそれらの組み合わせであるウイルスの能力を低下させることができる。

【0120】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、宿主細胞向性（例えば、ウサギ細胞向性）に関連する１つ以上の遺伝子内のまたはそれに隣接する１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、ウサギ細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子は、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、Ｍ－Ｔ７、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの場合において、ウサギ細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子は、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、またはそれらの組み合わせを含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子における改変、挿入、欠失、または破壊を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の欠失または破壊を含む。Ｍ１３５Ｒ遺伝子の欠失または破壊は、例えば、ＭＹＸＶが抗癌効果を示す（例えば、癌細胞に感染しおよびこれを殺傷し、抗腫瘍免疫応答を誘発し、またはそれらの組み合わせである）能力を損なうことなく、本開示のＭＹＸＶが宿主動物において疾患を引き起こす能力を弱めることができる。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子における修飾、挿入、欠失、または破壊を含む。

【0122】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、ＳＯＤ遺伝子における修飾、挿入、欠失、または破壊を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＭＹＸＶは、ＳＯＤ遺伝子の欠失または破壊を含む。

【0123】

ＭＹＸＶは、欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞（例えば、ヒト細胞）に感染し得る。「欠損した生来の抗ウイルス応答」を有することは、本明細書で使用される場合、ウイルスに曝露されたとき、またはウイルスに侵入されたときに、１つ以上の抗ウイルス防御機構を誘導することに失敗する細胞を指し得る。例えば、欠損した生来の抗ウイルス応答は、ウイルス複製を阻害することの失敗、抗ウイルス性サイトカイン（例えば、インターフェロン）を産生することの失敗、抗ウイルス性サイトカインに応答することの失敗（例えば、インターフェロン応答経路を誘導すること）、アポトーシスの誘導の失敗、生来の免疫受容体（例えば、パターン認識受容体）を介した認識の誘発の失敗、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0124】

欠損した生来の抗ウイルス応答は、様々な要因、例えば、悪性形質転換、変異、感染、遺伝的欠陥、または環境ストレスによって引き起こされ得る。

【0125】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、遺伝的欠陥、環境ストレス、または感染症（例えば、異なる病原体による既存の感染症）によって引き起こされる欠損した生来の抗ウイルス応答を含む対象には投与されない。

【0126】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、悪性形質転換（例えば、癌）によって引き起こされる欠損した生来の抗ウイルス応答を含む対象に投与される。欠損した生来の抗ウイルス応答を含む細胞は、癌細胞、例えば、正常細胞、例えば、非癌細胞と比較して、ウイルスへの曝露またはウイルスによる感染の際に減少したかまたは欠陥のある生来の抗ウイルス応答を有する、癌細胞であり得る。これには、例えば、インターフェロン（例えば、Ｉ型インターフェロン）に反応しない癌細胞、および／またはアポトーシス応答もしくはアポトーシス経路の誘導の低下もしくは欠陥を有する癌細胞が含まれ得る。この方法のいくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染することができる。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物の癌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト癌細胞、例えば、ヒト血液癌細胞である。

【0127】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、癌を治療するために使用される。多発性骨髄腫について本明細書で提供される実施例は、拡張して考えると、他の血液癌に適用可能である。開示された方法に従って治療することができる癌の種類には、白血病、リンパ腫、および骨髄腫などの血液癌、例えば、以下が含まれるがこれらに限定されない：多発性骨髄腫（ＭＭ）；活動性多発性骨髄腫；くすぶり型骨髄腫；形質細胞腫；骨の孤立性形質細胞腫；髄外形質細胞腫；軽鎖骨髄腫；非分泌性骨髄腫；免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）骨髄腫；免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）骨髄腫；免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）骨髄腫；免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）骨髄腫；免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）骨髄腫；高二倍体多発性骨髄腫；非高二倍体多発性骨髄腫；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；本態性血小板血症；真性赤血球増加症；原発性骨髄線維症；全身性肥満細胞症；慢性骨髄性白血病；慢性好中球性白血病；慢性好酸球性白血病；環状鉄芽球を伴う難治性貧血；多系統異形成を伴う難治性細胞減少症；過剰芽球１型を伴う難治性貧血；過剰芽球２型を伴う難治性貧血；孤立した欠失（ｄｅｌ）（５ｑ）を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；分類不可能なＭＤＳ；慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）；非定型慢性骨髄性白血病；若年性骨髄単球性白血病；骨髄増殖性／骨髄異形成症候群－分類不能；Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫；Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫／白血病；濾胞性リンパ腫；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫；Ｂ細胞前リンパ球性白血病；リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンストロームマクログロブリン血症；マントル細胞リンパ腫；辺縁帯リンパ腫；移植後リンパ増殖性疾患；ＨＩＶ関連リンパ腫；原発性滲出液リンパ腫；血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；重要性が不明な単クローン性免疫グロブリン血症；未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、細網内皮症、細網症、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、ワルデンストロームマクログロブリン血症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、形質細胞白血病、急性赤芽球血症および赤白血病、急性赤芽球性骨髄症、急性赤白血病、Ｈｅｉｌｍｅｙｅｒ－Ｓｃｈｏｅｎｅｒ病、急性巨核芽球性白血病、マスト細胞白血病、汎骨髄症、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症、リンパ肉腫細胞白血病、幹細胞白血病、不特定の細胞型の慢性白血病、不特定の細胞型の亜急性白血病、加速期慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性好塩基性白血病、急性好酸球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、侵攻性ＮＫ細胞白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性特発性骨髄線維症、Ｋａｈｌｅｒ病、骨髄腫症、孤立性骨髄腫、形質細胞白血病、血管中心性免疫増殖性病変、リンパ性肉芽腫症、血管免疫芽球性リンパ節腫脹症、Ｔ－ガンマリンパ増殖性疾患、ワルデンストロームマクログロブリン血症、アルファ重鎖疾患、ガンマ重鎖疾患、およびフランクリン病。いくつかの実施形態において、血液癌は多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、癌は血液癌である。特定の実施形態では、癌は多発性骨髄腫を含む。

【0128】

本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、血液癌を治療する（例えば、血液癌の進行を阻害、軽減、安定化、低減、または遅延させる）方法である。いくつかの実施形態において、方法は、血液癌を治療するために必要とする対象に本開示のＭＹＸＶを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、血液癌を有するかまたは有することが疑われる、ヒト対象などの対象を選択する工程をさらに含む。

【0129】

本開示のＭＹＸＶは、血液癌を治療するための有効量で投与することができる。この量は、対象の癌細胞の数（例えば、対象の血液中の癌細胞の濃度）を減らすために十分であり得る。

【0130】

対象に投与される有効量は、ＭＹＸＶの薬力学的特性、投与様式、対象の年齢、健康および体重、病状の性質および程度、治療の頻度と同時治療の種類（ある場合）、ならびにウイルスの毒性および力価などの多くの要因に応じて変動し得る。

【0131】

ＭＹＸＶは、対象の臨床反応に依存して、必要に応じて調整され得る適切な量で最初に投与され得る。ウイルスの有効量は経験的に決定することができ、安全に投与できるＭＹＸＶの最大量と、望ましい結果を生み出すウイルスの最小量に依存する。

【0132】

ウイルスを全身投与するときに、疾患部位にウイルスを注射することによって達成されるのと同じ臨床効果を生み出すために、著しく大量のウイルスの投与が必要とされ得る。しかし、適切な用量レベルは、望ましい結果を達成する最小量であるべきである。

【0133】

投与されるウイルスの濃度は、投与されるＭＹＸＶの特定の株の毒性、および標的とされる細胞の性質に応じて変動する。一実施形態では、「感染単位」とも呼ばれる、約３×１０＾１０未満のフォーカス形成単位（「ｆｆｕ」）またはプラーク形成単位（「ｐｆｕ」）の用量が、ヒト対象に投与される。様々な実施形態において、約１０＾２から約１０＾９ ｆｆｕの間、約１０＾２から約１０＾７ ｆｆｕの間、約１０＾３から約１０＾６ ｆｆｕの間、または約１０＾４から約１０＾５ｆｆｕの間が、単回投与で投与され得る。

【0134】

いくつかの実施形態において、対象は、本開示のＭＹＸＶの特定の用量のフォーカス形成単位（ＦＦＵ）またはプラーク形成単位（ＰＦＵ）を投与される。

【0135】

いくつかの実施形態において、対象に投与されるＭＹＸＶの用量は、少なくとも１ｘ１０＾２、２ｘ１０＾２、３ｘ１０＾２、４ｘ１０＾２、５ｘ１０＾２、６ｘ１０＾２、７ｘ１０＾２、８ｘ１０＾２、９ｘ１０＾２、１ｘ１０＾３、２ｘ１０＾３、３ｘ１０＾３、４ｘ１０＾３、５ｘ１０＾３、６ｘ１０＾３、７ｘ１０＾３、８ｘ１０＾３、９ｘ１０＾３、１ｘ１０＾４、２ｘ１０＾４、３ｘ１０＾４、４ｘ１０＾４、５ｘ１０＾４、６ｘ１０＾４、７ｘ１０＾４、８ｘ１０＾４、９ｘ１０＾４、１ｘ１０＾５、２ｘ１０＾５、３ｘ１０＾５、４ｘ１０＾５、５ｘ１０＾５、６ｘ１０＾５、７ｘ１０＾５、８ｘ１０＾５、９ｘ１０＾５、１ｘ１０＾６、２ｘ１０＾６、３ｘ１０＾６、４ｘ１０＾６、５ｘ１０＾６、６ｘ１０＾６、７ｘ１０＾６、８ｘ１０＾６、９ｘ１０＾６、１ｘ１０＾７、２ｘ１０＾７、３ｘ１０＾７、４ｘ１０＾７、５ｘ１０＾７、６ｘ１０＾７、７ｘ１０＾７、８ｘ１０＾７、９ｘ１０＾７、１ｘ１０＾８、２ｘ１０＾８、３ｘ１０＾８、４ｘ１０＾８、５ｘ１０＾８、６ｘ１０＾８、７ｘ１０＾８、８ｘ１０＾８、９ｘ１０＾８、１ｘ１０＾９、２ｘ１０＾９、３ｘ１０＾９、４ｘ１０＾９、５ｘ１０＾９、６ｘ１０＾９、７ｘ１０＾９、８ｘ１０＾９、９ｘ１０＾９、１ｘ１０＾１０、２ｘ１０＾１０、３ｘ１０＾１０、４ｘ１０＾１０、５ｘ１０＾１０、６ｘ１０＾１０、７ｘ１０＾１０、８ｘ１０＾１０、９ｘ１０＾１０、１ｘ１０＾１１、２ｘ１０＾１１、３ｘ１０＾１１、４ｘ１０＾１１、５ｘ１０＾１１、６ｘ１０＾１１、７ｘ１０＾１１、８ｘ１０＾１１、９ｘ１０＾１１、１ｘ１０＾１２、２ｘ１０＾１２、３ｘ１０＾１２、４ｘ１０＾１２、５ｘ１０＾１２、６ｘ１０＾１２、７ｘ１０＾１２、８ｘ１０＾１２、９ｘ１０＾１２、１ｘ１０＾１３、２ｘ１０＾１３、３ｘ１０＾１３、４ｘ１０＾１３、５ｘ１０＾１３、６ｘ１０＾１３、７ｘ１０＾１３、８ｘ１０＾１３、９ｘ１０＾１３、１ｘ１０＾１４、２ｘ１０＾１４、３ｘ１０＾１４、４ｘ１０＾１４、５ｘ１０＾１４、６ｘ１０＾１４、７ｘ１０＾１４、８ｘ１０＾１４、９ｘ１０＾１４、１ｘ１０＾１５、２ｘ１０＾１５、３ｘ１０＾１５、４ｘ１０＾１５、５ｘ１０＾１５、６ｘ１０＾１５、７ｘ１０＾１５、８ｘ１０＾１５、９ｘ１０＾１５、１ｘ１０＾１６、２ｘ１０＾１６、３ｘ１０＾１６、４ｘ１０＾１６、５ｘ１０＾１６、６ｘ１０＾１６、７ｘ１０＾１６、８ｘ１０＾１６、９ｘ１０＾１６、１ｘ１０＾１７、２ｘ１０＾１７、３ｘ１０＾１７、４ｘ１０＾１７、５ｘ１０＾１７、６ｘ１０＾１７、７ｘ１０＾１７、８ｘ１０＾１７、９ｘ１０＾１７、１ｘ１０＾１８、２ｘ１０＾１８、３ｘ１０＾１８、４ｘ１０＾１８、５ｘ１０＾１８、６ｘ１０＾１８、７ｘ１０＾１８、８ｘ１０＾１８、９ｘ１０＾１８、１ｘ１０＾１９、２ｘ１０＾１９、３ｘ１０＾１９、４ｘ１０＾１９、５ｘ１０＾１９、６ｘ１０＾１９、７ｘ１０＾１９、８ｘ１０＾１９、９ｘ１０＾１９、１ｘ１０＾２０、２ｘ１０＾２０、３ｘ１０＾２０、４ｘ１０＾２０、５ｘ１０＾２０、６ｘ１０＾２０、７ｘ１０＾２０、８ｘ１０＾２０、または９ｘ１０＾２０ ＦＦＵまたはＰＦＵの本開示のＭＹＸＶである。

【0136】

いくつかの実施形態において、対象に投与されるＭＹＸＶの用量は、最大で１ｘ１０＾２、２ｘ１０＾２、３ｘ１０＾２、４ｘ１０＾２、５ｘ１０＾２、６ｘ１０＾２、７ｘ１０＾２、８ｘ１０＾２、９ｘ１０＾２、１ｘ１０＾３、２ｘ１０＾３、３ｘ１０＾３、４ｘ１０＾３、５ｘ１０＾３、６ｘ１０＾３、７ｘ１０＾３、８ｘ１０＾３、９ｘ１０＾３、１ｘ１０＾４、２ｘ１０＾４、３ｘ１０＾４、４ｘ１０＾４、５ｘ１０＾４、６ｘ１０＾４、７ｘ１０＾４、８ｘ１０＾４、９ｘ１０＾４、１ｘ１０＾５、２ｘ１０＾５、３ｘ１０＾５、４ｘ１０＾５、５ｘ１０＾５、６ｘ１０＾５、７ｘ１０＾５、８ｘ１０＾５、９ｘ１０＾５、１ｘ１０＾６、２ｘ１０＾６、３ｘ１０＾６、４ｘ１０＾６、５ｘ１０＾６、６ｘ１０＾６、７ｘ１０＾６、８ｘ１０＾６、９ｘ１０＾６、１ｘ１０＾７、２ｘ１０＾７、３ｘ１０＾７、４ｘ１０＾７、５ｘ１０＾７、６ｘ１０＾７、７ｘ１０＾７、８ｘ１０＾７、９ｘ１０＾７、１ｘ１０＾８、２ｘ１０＾８、３ｘ１０＾８、４ｘ１０＾８、５ｘ１０＾８、６ｘ１０＾８、７ｘ１０＾８、８ｘ１０＾８、９ｘ１０＾８、１ｘ１０＾９、２ｘ１０＾９、３ｘ１０＾９、４ｘ１０＾９、５ｘ１０＾９、６ｘ１０＾９、７ｘ１０＾９、８ｘ１０＾９、９ｘ１０＾９、１ｘ１０＾１０、２ｘ１０＾１０、３ｘ１０＾１０、４ｘ１０＾１０、５ｘ１０＾１０、６ｘ１０＾１０、７ｘ１０＾１０、８ｘ１０＾１０、９ｘ１０＾１０、１ｘ１０＾１１、２ｘ１０＾１１、３ｘ１０＾１１、４ｘ１０＾１１、５ｘ１０＾１１、６ｘ１０＾１１、７ｘ１０＾１１、８ｘ１０＾１１、９ｘ１０＾１１、１ｘ１０＾１２、２ｘ１０＾１２、３ｘ１０＾１２、４ｘ１０＾１２、５ｘ１０＾１２、６ｘ１０＾１２、７ｘ１０＾１２、８ｘ１０＾１２、９ｘ１０＾１２、１ｘ１０＾１３、２ｘ１０＾１３、３ｘ１０＾１３、４ｘ１０＾１３、５ｘ１０＾１３、６ｘ１０＾１３、７ｘ１０＾１３、８ｘ１０＾１３、９ｘ１０＾１３、１ｘ１０＾１４、２ｘ１０＾１４、３ｘ１０＾１４、４ｘ１０＾１４、５ｘ１０＾１４、６ｘ１０＾１４、７ｘ１０＾１４、８ｘ１０＾１４、９ｘ１０＾１４、１ｘ１０＾１５、２ｘ１０＾１５、３ｘ１０＾１５、４ｘ１０＾１５、５ｘ１０＾１５、６ｘ１０＾１５、７ｘ１０＾１５、８ｘ１０＾１５、９ｘ１０＾１５、１ｘ１０＾１６、２ｘ１０＾１６、３ｘ１０＾１６、４ｘ１０＾１６、５ｘ１０＾１６、６ｘ１０＾１６、７ｘ１０＾１６、８ｘ１０＾１６、９ｘ１０＾１６、１ｘ１０＾１７、２ｘ１０＾１７、３ｘ１０＾１７、４ｘ１０＾１７、５ｘ１０＾１７、６ｘ１０＾１７、７ｘ１０＾１７、８ｘ１０＾１７、９ｘ１０＾１７、１ｘ１０＾１８、２ｘ１０＾１８、３ｘ１０＾１８、４ｘ１０＾１８、５ｘ１０＾１８、６ｘ１０＾１８、７ｘ１０＾１８、８ｘ１０＾１８、９ｘ１０＾１８、１ｘ１０＾１９、２ｘ１０＾１９、３ｘ１０＾１９、４ｘ１０＾１９、５ｘ１０＾１９、６ｘ１０＾１９、７ｘ１０＾１９、８ｘ１０＾１９、９ｘ１０＾１９、１ｘ１０＾２０、２ｘ１０＾２０、３ｘ１０＾２０、４ｘ１０＾２０、５ｘ１０＾２０、６ｘ１０＾２０、７ｘ１０＾２０、８ｘ１０＾２０、または９ｘ１０＾２０ ＦＦＵまたはＰＦＵの本開示のＭＹＸＶである。

【0137】

いくつかの実施形態において、対象は、体重１キログラムあたりの本開示のＭＹＸＶの特定の用量のフォーカス形成単位（ＦＦＵ）またはプラーク形成単位（ＰＦＵ）を投与される。

【0138】

いくつかの実施形態において、対象に投与されるＭＹＸＶの用量は、対象の体重１キログラムあたり、少なくとも１ｘ１０＾２、２ｘ１０＾２、３ｘ１０＾２、４ｘ１０＾２、５ｘ１０＾２、６ｘ１０＾２、７ｘ１０＾２、８ｘ１０＾２、９ｘ１０＾２、１ｘ１０＾３、２ｘ１０＾３、３ｘ１０＾３、４ｘ１０＾３、５ｘ１０＾３、６ｘ１０＾３、７ｘ１０＾３、８ｘ１０＾３、９ｘ１０＾３、１ｘ１０＾４、２ｘ１０＾４、３ｘ１０＾４、４ｘ１０＾４、５ｘ１０＾４、６ｘ１０＾４、７ｘ１０＾４、８ｘ１０＾４、９ｘ１０＾４、１ｘ１０＾５、２ｘ１０＾５、３ｘ１０＾５、４ｘ１０＾５、５ｘ１０＾５、６ｘ１０＾５、７ｘ１０＾５、８ｘ１０＾５、９ｘ１０＾５、１ｘ１０＾６、２ｘ１０＾６、３ｘ１０＾６、４ｘ１０＾６、５ｘ１０＾６、６ｘ１０＾６、７ｘ１０＾６、８ｘ１０＾６、９ｘ１０＾６、１ｘ１０＾７、２ｘ１０＾７、３ｘ１０＾７、４ｘ１０＾７、５ｘ１０＾７、６ｘ１０＾７、７ｘ１０＾７、８ｘ１０＾７、９ｘ１０＾７、１ｘ１０＾８、２ｘ１０＾８、３ｘ１０＾８、４ｘ１０＾８、５ｘ１０＾８、６ｘ１０＾８、７ｘ１０＾８、８ｘ１０＾８、９ｘ１０＾８、１ｘ１０＾９、２ｘ１０＾９、３ｘ１０＾９、４ｘ１０＾９、５ｘ１０＾９、６ｘ１０＾９、７ｘ１０＾９、８ｘ１０＾９、９ｘ１０＾９、１ｘ１０＾１０、２ｘ１０＾１０、３ｘ１０＾１０、４ｘ１０＾１０、５ｘ１０＾１０、６ｘ１０＾１０、７ｘ１０＾１０、８ｘ１０＾１０、９ｘ１０＾１０、１ｘ１０＾１１、２ｘ１０＾１１、３ｘ１０＾１１、４ｘ１０＾１１、５ｘ１０＾１１、６ｘ１０＾１１、７ｘ１０＾１１、８ｘ１０＾１１、９ｘ１０＾１１、１ｘ１０＾１２、２ｘ１０＾１２、３ｘ１０＾１２、４ｘ１０＾１２、５ｘ１０＾１２、６ｘ１０＾１２、７ｘ１０＾１２、８ｘ１０＾１２、９ｘ１０＾１２、１ｘ１０＾１３、２ｘ１０＾１３、３ｘ１０＾１３、４ｘ１０＾１３、５ｘ１０＾１３、６ｘ１０＾１３、７ｘ１０＾１３、８ｘ１０＾１３、９ｘ１０＾１３、１ｘ１０＾１４、２ｘ１０＾１４、３ｘ１０＾１４、４ｘ１０＾１４、５ｘ１０＾１４、６ｘ１０＾１４、７ｘ１０＾１４、８ｘ１０＾１４、９ｘ１０＾１４、１ｘ１０＾１５、２ｘ１０＾１５、３ｘ１０＾１５、４ｘ１０＾１５、５ｘ１０＾１５、６ｘ１０＾１５、７ｘ１０＾１５、８ｘ１０＾１５、９ｘ１０＾１５、１ｘ１０＾１６、２ｘ１０＾１６、３ｘ１０＾１６、４ｘ１０＾１６、５ｘ１０＾１６、６ｘ１０＾１６、７ｘ１０＾１６、８ｘ１０＾１６、９ｘ１０＾１６、１ｘ１０＾１７、２ｘ１０＾１７、３ｘ１０＾１７、４ｘ１０＾１７、５ｘ１０＾１７、６ｘ１０＾１７、７ｘ１０＾１７、８ｘ１０＾１７、９ｘ１０＾１７、１ｘ１０＾１８、２ｘ１０＾１８、３ｘ１０＾１８、４ｘ１０＾１８、５ｘ１０＾１８、６ｘ１０＾１８、７ｘ１０＾１８、８ｘ１０＾１８、９ｘ１０＾１８、１ｘ１０＾１９、２ｘ１０＾１９、３ｘ１０＾１９、４ｘ１０＾１９、５ｘ１０＾１９、６ｘ１０＾１９、７ｘ１０＾１９、８ｘ１０＾１９、９ｘ１０＾１９、１ｘ１０＾２０、２ｘ１０＾２０、３ｘ１０＾２０、４ｘ１０＾２０、５ｘ１０＾２０、６ｘ１０＾２０、７ｘ１０＾２０、８ｘ１０＾２０、または９ｘ１０＾２０ ＦＦＵまたはＰＦＵの本開示のＭＹＸＶである。

【0139】

いくつかの実施形態において、対象に投与されるＭＹＸＶの用量は、対象の体重１キログラムあたり、最大で１ｘ１０＾２、２ｘ１０＾２、３ｘ１０＾２、４ｘ１０＾２、５ｘ１０＾２、６ｘ１０＾２、７ｘ１０＾２、８ｘ１０＾２、９ｘ１０＾２、１ｘ１０＾３、２ｘ１０＾３、３ｘ１０＾３、４ｘ１０＾３、５ｘ１０＾３、６ｘ１０＾３、７ｘ１０＾３、８ｘ１０＾３、９ｘ１０＾３、１ｘ１０＾４、２ｘ１０＾４、３ｘ１０＾４、４ｘ１０＾４、５ｘ１０＾４、６ｘ１０＾４、７ｘ１０＾４、８ｘ１０＾４、９ｘ１０＾４、１ｘ１０＾５、２ｘ１０＾５、３ｘ１０＾５、４ｘ１０＾５、５ｘ１０＾５、６ｘ１０＾５、７ｘ１０＾５、８ｘ１０＾５、９ｘ１０＾５、１ｘ１０＾６、２ｘ１０＾６、３ｘ１０＾６、４ｘ１０＾６、５ｘ１０＾６、６ｘ１０＾６、７ｘ１０＾６、８ｘ１０＾６、９ｘ１０＾６、１ｘ１０＾７、２ｘ１０＾７、３ｘ１０＾７、４ｘ１０＾７、５ｘ１０＾７、６ｘ１０＾７、７ｘ１０＾７、８ｘ１０＾７、９ｘ１０＾７、１ｘ１０＾８、２ｘ１０＾８、３ｘ１０＾８、４ｘ１０＾８、５ｘ１０＾８、６ｘ１０＾８、７ｘ１０＾８、８ｘ１０＾８、９ｘ１０＾８、１ｘ１０＾９、２ｘ１０＾９、３ｘ１０＾９、４ｘ１０＾９、５ｘ１０＾９、６ｘ１０＾９、７ｘ１０＾９、８ｘ１０＾９、９ｘ１０＾９、１ｘ１０＾１０、２ｘ１０＾１０、３ｘ１０＾１０、４ｘ１０＾１０、５ｘ１０＾１０、６ｘ１０＾１０、７ｘ１０＾１０、８ｘ１０＾１０、９ｘ１０＾１０、１ｘ１０＾１１、２ｘ１０＾１１、３ｘ１０＾１１、４ｘ１０＾１１、５ｘ１０＾１１、６ｘ１０＾１１、７ｘ１０＾１１、８ｘ１０＾１１、９ｘ１０＾１１、１ｘ１０＾１２、２ｘ１０＾１２、３ｘ１０＾１２、４ｘ１０＾１２、５ｘ１０＾１２、６ｘ１０＾１２、７ｘ１０＾１２、８ｘ１０＾１２、９ｘ１０＾１２、１ｘ１０＾１３、２ｘ１０＾１３、３ｘ１０＾１３、４ｘ１０＾１３、５ｘ１０＾１３、６ｘ１０＾１３、７ｘ１０＾１３、８ｘ１０＾１３、９ｘ１０＾１３、１ｘ１０＾１４、２ｘ１０＾１４、３ｘ１０＾１４、４ｘ１０＾１４、５ｘ１０＾１４、６ｘ１０＾１４、７ｘ１０＾１４、８ｘ１０＾１４、９ｘ１０＾１４、１ｘ１０＾１５、２ｘ１０＾１５、３ｘ１０＾１５、４ｘ１０＾１５、５ｘ１０＾１５、６ｘ１０＾１５、７ｘ１０＾１５、８ｘ１０＾１５、９ｘ１０＾１５、１ｘ１０＾１６、２ｘ１０＾１６、３ｘ１０＾１６、４ｘ１０＾１６、５ｘ１０＾１６、６ｘ１０＾１６、７ｘ１０＾１６、８ｘ１０＾１６、９ｘ１０＾１６、１ｘ１０＾１７、２ｘ１０＾１７、３ｘ１０＾１７、４ｘ１０＾１７、５ｘ１０＾１７、６ｘ１０＾１７、７ｘ１０＾１７、８ｘ１０＾１７、９ｘ１０＾１７、１ｘ１０＾１８、２ｘ１０＾１８、３ｘ１０＾１８、４ｘ１０＾１８、５ｘ１０＾１８、６ｘ１０＾１８、７ｘ１０＾１８、８ｘ１０＾１８、９ｘ１０＾１８、１ｘ１０＾１９、２ｘ１０＾１９、３ｘ１０＾１９、４ｘ１０＾１９、５ｘ１０＾１９、６ｘ１０＾１９、７ｘ１０＾１９、８ｘ１０＾１９、９ｘ１０＾１９、１ｘ１０＾２０、２ｘ１０＾２０、３ｘ１０＾２０、４ｘ１０＾２０、５ｘ１０＾２０、６ｘ１０＾２０、７ｘ１０＾２０、８ｘ１０＾２０、または９ｘ１０＾２０ ＦＦＵまたはＰＦＵの本開示のＭＹＸＶである。

【0140】

本開示のＭＹＸＶは、任意の所望の間隔で投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは１時間ごとに投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、４０、４４、または４８時間ごとに投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１日２回、１日１回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、５週間に１回、６週間に１回、８週間に１回、２か月に１回、１２週間に１回、３か月に１回、４か月に１回、６か月に１回、 年に１回、またはそれ以下の頻度で投与することができる。

【0141】

本開示のＭＹＸＶは、例えば、全身、経口、局所、非経口、静脈内注射、静脈内注入、腫瘍内注射、皮下注射、筋肉内注射、皮膚内注射、腹腔内注射、脳内注射、くも膜下注射、脊髄内注射、胸骨内注射、関節内注射、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、動脈内投与、髄腔内投与、吸入、病巣内投与、皮膚内投与、硬膜外投与、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜）を介した吸収、被膜内投与、被膜下投与、心臓内投与、経気管投与、皮下投与、くも膜下投与、被膜下投与、脊髄内投与、または胸骨内投与を含む様々な形態および経路によって、治療有効量で対象に投与することができる。

【0142】

いくつかの実施形態において、ウイルスは全身投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、疾患部位への注射によって投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスは経口投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスは非経口的に投与される。

【0143】

本開示のＭＹＸＶ（例えば、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現する）は、単独の治療として投与することができ、または１つ以上の他の治療法と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、化学療法、免疫療法、細胞療法、放射線療法、幹細胞移植（自己幹細胞移植など）、またはそれらの組み合わせと組み合わせて投与される。例えば、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、放射線療法または従来の化学療法薬の投与、および／または、自己幹細胞移植もしくは同種異系幹細胞移植（例えば、ＨＬＡ一致、ＨＬＡ不一致、またはハプロタイプ一致移植）などの幹細胞移植などの別の治療の前または後のいずれかに投与され得る。

【0144】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、免疫チェックポイントモジュレーターとの組み合わせであり得る。免疫チェックポイント阻害剤の例には、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈのアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒのアベルマブ、ＣｙｔｏｍＸ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＣＸ－０７２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＦＡＺ０５３、３Ｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ＡｌｐｈａｍａｂのＫＮ０３５、Ｅｌｉ ＬｉｌｌｙのＬＹ３３０００５４、またはＥＭＤ ＳｅｒｏｎｏのＭ７８２４（抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦｂｅｔａトラップ）などのＰＤ－Ｌ１阻害剤；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、およびｒＨＩｇＭ１２Ｂ７などのＰＤ－Ｌ２阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、Ｍｅｒｃｋのペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ＡｇｅｎｕｓのＡＧＥＮ ２０３４、ＢｅｉＧｅｎｅのＢＧＢ－Ａ３１７、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢｌ－７５４０９１、ＣＢＴ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＣＢＴ－５０１（ｇｅｎｏｌｉｍｚｕｍａｂ）、ＩｎｃｙｔｅのＩＮＣＳＨＲ１２１０、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔのＪＮＪ－６３７２３２８３、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＭＥＤＩ０６８０、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓのＭＧＡ ０１２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＰＤＲ００１、ＰｆｉｚｅｒのＰＦ－０６８０１５９１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＳａｎｏのＲＥＧＮ２８１０（ＳＡＲ４３９６８４）、またはＴＥＳＡＲＯのＴＳＲ－０４２などのＰＤ－１阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、ＭＤＸ－０１０、ＢＭＳ－７３４０１６、ＭＤＸ－１０１としても知られる）、Ｐｆｉｚｅｒのトレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６、チシリムマブ）、またはＡｇｅｎｕｓのＡＧＥＮ１８８４などのＣＴＬＡ－４阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＢＭＳ－９８６０１６、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＩＭＰ７０１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＬＡＧ５２５、またはＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＲＥＧＮ３７６７などのＬＡＧ３阻害剤；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓのエノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１）などのＢ７－Ｈ３阻害剤；Ｉｎｎａｔｅ ＰｈａｒｍａのＬｉｒｉｌｕｍａｂ（ＩＰＨ２１０１；ＢＭＳ－９８６０１５）などのＫＩＲ阻害剤；ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＰＦ－０５０８２５６６（抗－４－１ＢＢ、ＰＦ－２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ）、またはＸｍＡｂ－５５９２（Ｘｅｎｃｏｒ）などのＣＤ１３７阻害剤；およびバビツキシマブなどのＰＳ阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、例えば、ＴＩＭ３、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＣＤ２２６、ＣＤ２、またはＳＬＡＭに対して作用するか、またはこれらに特異的である、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ＲＮＡｉ分子、または小分子と組み合わされる。

【0145】

本開示のＭＹＸＶは、標準的な技術を使用して調製することができる。例えば、ウイルスは、培養ウサギ細胞、または不死化許容ヒトまたは霊長類細胞に、使用されるＭＹＸＶ株を感染させ、ウイルスが培養細胞内で複製し、これが、細胞表面を破壊しそれによってウイルス粒子を放出して採取するための標準的な方法によって放出できるように、感染を進行させることによって調製することができる。一旦採取されると、ウイルス力価は、例えば、ウサギ細胞のコンフルエントなローンに感染すること、およびプラークアッセイを実施することによって決定され得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１５：１７－３０を参照のこと）。

【0146】

ＭＹＸＶの細胞送達
本明細書でさらに開示されるのは、いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶが最初に細胞に吸着され、細胞が対象に投与される新規の送達戦略である。この方法は、ウイルスを保有する「キャリア」細胞を介して、本開示のＭＹＸＶを疾患部位に送達することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスのこの細胞支援送達は、腫瘍負荷を低減または排除し、そして対象の生存を増加させる能力を有する。

【0147】

キャリア細胞を介したＭＹＸＶの送達は、血液癌の新しい潜在的な治療レジメンを表す。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、複数の細胞（例えば、骨髄および／または末梢血からの白血球）に吸着され、そして白血球は、対象に注入される。癌を有するレシピエントへの白血球注入の前に、エキソビボで白血球をＭＹＸＶでプレロードすることは、多発性骨髄腫（ＭＭ）および本明細書に開示される他の任意の血液癌に利用することができる。いくつかの実施形態において、癌を有するレシピエントへの白血球注入の前に、エキソビボで白血球をＭＹＸＶでプレロードすることは、離れた腫瘍部位への白血球の局在化および浸潤に適した任意の癌を治療するのに効果的であり得る。

【0148】

いくつかの実施形態において、組み合わされた「白血球／ＭＹＸＶ」療法は、腫瘍床における癌細胞死の増加を引き起こし、抗腫瘍免疫原性を増強する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶ（例えば、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現するＭＹＸＶ）は、エキソビボでウイルスに事前に吸着または事前に感染した白血球の遊走を介して、微小残存病変（ＭＲＤ）を有する骨髄床などの癌部位に送達される。この全身送達法は、ウイルスが患者に注入される前に最初に白血球に送達されるため、「エキソビボウイルス療法」またはＥＶＶ（例えば、ＥＶ２）と呼ばれることもある。

【0149】

いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶの細胞媒介性送達は、感染した血液癌細胞の直接殺傷のレベルを増加させ、理論に拘束されるものではないが、宿主免疫系の活性化因子として作用し、これは、癌の長期的な退行をもたらし得る。これは、現在の治療法では困難であることが証明されている、骨および／またはリンパ節の血液癌の新しい治療法を提供することができる。

【0150】

したがって、特定の実施形態において、本開示の方法は、本開示の吸着されたＭＹＸＶ（例えば、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を含むＭＹＸＶ）を含む癌白血球を有する対象に投与し、それによって、対象の癌を治療および／または阻害する工程を含む。本開示のＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの複数の細胞の表面への結合を可能にする条件下で、複数の細胞をＭＹＸＶに曝露することによって吸着されることができる。

【0151】

いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、白血球（例えば、骨髄および／または末梢血からの白血球）に吸着され、そして白血球は、対象に注入される。白血球は骨髄由来であり得る（例えば、骨髄吸引液または骨髄生検から）。白血球は、血液（例えば、末梢血単核細胞）に由来し得る。いくつかの実施形態において、白血球は、対象、例えば、癌を有する対象から得られ、ＭＹＸＶで吸着され、そして対象に再注入される（例えば、自己細胞移植として）。いくつかの実施形態において、白血球は、対象の組織から得られる。いくつかの実施形態において、白血球は、１つ以上の同種異系ドナー（例えば、ＨＬＡ一致、ＨＬＡ不一致、またはハプロタイプ一致のドナー）から得られる。いくつかの実施形態において、白血球は、ＨＬＡ一致兄弟から得られる。

【0152】

白血球は、本開示のＭＹＸＶが吸着される前または後の、例えば、赤血球溶解、密度勾配遠心分離（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）、白血球アフェレーシス、抗体またはその誘導体を含む技術（例えば、蛍光活性化細胞選別または磁気活性化細胞選別を介したポジティブまたはネガティブ選択）、またはそれらの任意の組み合わせによって分類または精製することができる。いくつかの実施形態において、白血球は、本開示のＭＹＸＶが吸着される前または後に癌細胞を富化するために選別または精製される（例えば、癌に関連するマーカーを発現する細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞のＣＤ１３８）。いくつかの実施形態において、白血球は、本開示のＭＹＸＶが吸着される前または後に、非癌細胞を富化するために選別または精製される。いくつかの実施形態において、細胞は、本開示のＭＹＸＶが吸着される前または後に、１つ以上の細胞サブセット（例えば、単球、リンパ球、Ｂ細胞、血漿細胞、Ｔ細胞、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞、生来のリンパ系細胞、一般的な骨髄前駆細胞、一般的なリンパ系前駆細胞、骨髄芽細胞、単芽球、前単球、リンパ芽球、前リンパ球、血球芽細胞、巨核芽細胞、前巨核球、幹細胞、プロＢ細胞、プレＢ細胞、それらの前駆体、またはそれらの任意の組み合わせ））を富化するために選別または精製される。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、白血球に吸着され、そして白血球は、ＭＹＸＶを含む細胞について富化される（例えば、ＭＹＸＶが結合および／または内在化される）。

【0153】

白血球は、本開示のＭＹＸＶを吸着する前または後に保存することができる（例えば、凍結保存することができる）。いくつかの実施形態において、白血球は、凍結保存され得、そして後で対象への注入の前に解凍され得る。

【0154】

いくつかの実施形態において、この方法は、本開示のＭＹＸＶを白血球（例えば、末梢血単核細胞、骨髄細胞、またはそれらの精製／富化サブセット）の表面に吸着させる工程を含む。いくつかの実施形態において、粘液腫ウイルスを白血球の表面に吸着させる工程は、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞の表面へのＭＹＸＶの結合を可能にする条件下で、白血球をＭＹＸＶに曝露することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、本開示のＭＹＸＶで白血球を感染させる工程を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶで白血球を感染させる工程は、ＭＹＸＶを白血球の少なくとも一部に内在化することを可能にする条件下で、白血球をＭＹＸＶに曝露することを含む。白血球をＭＹＸＶに曝露することは、任意の適切な試薬または条件（例えば、滅菌細胞培養培地、培地補充物、ならびに、白血球の吸着および／または感染を可能にし、白血球の生存能力を維持するための適切なインキュベーション条件）を含み得る。

【0155】

ＭＹＸＶおよび白血球は、ウイルスが白血球に吸着することを可能にする任意の比率で互いに曝露され得る。いくつかの実施形態において、白血球の表面に白血球ウイルスを吸着させる工程は、約０．０００００１、０．００００１、０．０００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１ｘ１０＾４、１ｘ１０＾５、１ｘ１０＾６、１ｘ１０＾９、１ｘ１０＾１０、１ｘ１０＾１１、１ｘ１０＾１２、１ｘ１０＾１３、１ｘ１０＾１４、または１ｘ１０＾１５の白血球あたりのウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）で白血球をＭＹＸＶに曝露する工程を含む。

【0156】

いくつかの実施形態において、白血球の表面への白血球ウイルスの吸着は、少なくとも０．０００００１、少なくとも０．００００１、少なくとも０．０００１、少なくとも０．０００１、少なくとも０．００１、少なくとも０．０１、少なくとも０．０２、少なくとも０．０３、少なくとも０．０４、少なくとも０．０５、少なくとも０．０６、少なくとも０．０７、少なくとも０．０８、少なくとも０．０９、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１ｘ１０＾４、少なくとも１ｘ１０＾５、少なくとも１ｘ１０＾６、少なくとも１ｘ１０＾９、少なくとも１ｘ１０＾１０、少なくとも１ｘ１０＾１１、少なくとも１ｘ１０＾１２、少なくとも１ｘ１０＾１３、少なくとも１ｘ１０＾１４、または少なくとも１ｘ１０＾１５の白血球あたりのウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）で、白血球をＭＹＸＶに曝露することを含む。

【0157】

いくつかの実施形態において、白血球の表面に白血球ウイルスを吸着させる工程は、最大０．０００００１、最大０．００００１、最大０．０００１、最大０．０００１、最大０．００１、最大０．０１、最大０．０２、最大０．０３、最大０．０４、最大０．０５、最大０．０６、最大０．０７、最大０．０８、最大０．０９、最大０．１、最大０．２、最大最大０．３、最大０．４、最大０．５、最大０．６、最大０．７、最大０．８、最大０．９、最大１、最大１．１、最大１．２、最大１．３、最大１．４、最大１．５ 、最大１．６、最大１．７、最大１．８、最大１．９、最大２、最大３、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９、最大１０、最大１１、最大１２、最大１３、最大１４、最大１５、最大１６、最大１７、最大１８、最大１９、最大２０、最大２５、最大３０ 、最大３５、最大４０、最大４５、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１ ５０、最大２００、最大２５０、最大３００、最大４００、最大５００、最大６００、最大７００、最大８００、最大９００、最大１０００、最大２０００、最大３０００、最大４０００、最大５０００、最大６０００、最大７０００、最大８０００、最大９０００、最大１ｘ１０＾４、最大１ｘ１０＾５、最大１ｘ１０＾６、最大１ｘ１０＾９、最大１ｘ１０＾１０、最大１ｘ１０＾１１、最大１ｘ１０＾１２、最大１ｘ１０＾１３、最大１ｘ１０＾１４、または最大１ｘ１０＾１５の白血球あたりのウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）で、白血球をＭＹＸＶに曝露することを含む。

【0158】

いくつかの実施形態において、白血球の表面への粘液腫ウイルスの吸着は、白血球あたり、約、例えば、０．０００００１－１×１０＾１５、０．０００１－１ｘ１０＾６、０．００１－１ｘ１０＾４、０．００１－１０００、０．００１－１００、０．００１－１０、０．００１－１、０．００１－０．１、０．００１－０．０１、０．０１－１ｘ１０＾４、０．０１－１０００、０．０１－１００、０．０１－１０、０．０１－１、０．０１－０．１、０．１－１ｘ１０＾４、０．１－１０００、０．１－１００、０．１－１０、０．１－１、１－１ｘ１０＾４、１－１０００、１－１００、または１－１０のウイルスの間の感染多重度（ＭＯＩ）で、白血球をＭＹＸＶに曝露することを含む。

【0159】

いくつかの実施形態において、白血球の表面に粘液腫ウイルスを吸着する工程は、約０．１から１０の間の感染多重度（ＭＯＩ）で、白血球をＭＹＸＶに曝露することを含む。いくつかの実施形態において、白血球の表面に粘液腫ウイルスを吸着する工程は、約０．０１から１００の間の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＹＸＶに白血球を曝露することを含む。いくつかの実施形態において、白血球の表面に粘液腫ウイルスを吸着する工程は、約０．００１から１０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、白血球をＭＹＸＶに曝露することを含む。

【0160】

いくつかの実施形態において、白血球は、約５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、１１５分、１２０分、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間の期間、本開示のＭＹＸＶと接触または吸着される。

【0161】

いくつかの実施形態において、白血球は、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも３５分、少なくとも４０分、少なくとも４５分、少なくとも５０分、少なくとも５５分、少なくとも６０分、少なくとも６５分、少なくとも７０分、少なくとも７５分、少なくとも８０分、少なくとも８５分、少なくとも９０分、少なくとも９５分、少なくとも１００分、少なくとも１０５分、少なくとも１１０分、少なくとも１１５分、少なくとも１２０分、少なくとも２．５時間、少なくとも３時間、少なくとも３．５時間、少なくとも４時間、少なくとも４．５時間、少なくとも５時間、少なくとも５．５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間、少なくとも２４時間、またはそれ以上の期間、本開示のＭＹＸＶと接触または吸着される。

【0162】

いくつかの実施形態において、白血球は、最大で５分、最大で１０分、最大で１５分、最大で２０分、最大で２５分、最大で３０分、最大で３５分、最大で４０分、最大で４５分、最大で５０分、最大で５５分、最大で６０分、最大で６５分、最大で７０分、最大で７５分、最大で８０分、最大で８５分、最大で９０分、最大で９５分、最大で１００分、最大で１０５分、最大で１１０分、最大で１１５分、最大で１２０分、最大で２．５時間、最大で３時間、最大で３．５時間、最大で４時間、最大で４．５時間、最大で５時間、最大で５．５時間、最大で６時間、最大で７時間、最大で８時間、最大で９時間、最大で１０時間、最大で１１時間、最大で１２時間、最大で１３時間、最大で１４時間、最大で１５時間、最大で１６時間、最大で１８時間、最大で２０時間、最大で２２時間、最大で２４時間、またはそれ以下の期間、本開示のＭＹＸＶと接触または吸着される。

【0163】

いくつかの実施形態において、ＢＭまたはＰＢＭＣ細胞は、エキソビボで約１時間、ＭＹＸＶ構築物と接触または吸着される。

【0164】

追加のエキソビボ方法
本明細書に開示される場合、ＭＹＸＶは、欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞に選択的に感染することができ、細胞におけるそのような欠損の指標として使用することができる。したがって、対象から取り出された細胞は、本開示の方法を使用して、生来の抗ウイルス応答の欠損についてアッセイされ得る。そのような決定は、他の指標と組み合わせると、対象が特定の病状、例えば癌に苦しんでいる可能性があることを示し得る。細胞は、既知の生検方法を使用して、ヒト対象を含む対象から除去し得る。生検の方法は、検査する細胞の場所と種類に依存する。細胞を培養し、例えば、生ＭＹＸＶを培地に添加することによって、ＭＹＸＶに曝露することができる。感染多重度（ＭＯＩ）は、ＭＹＸＶへの曝露時に感染することが知られている陽性対照細胞培養を使用して、所定の細胞タイプ、密度、および培養技術のために適切なＭＯＩを決定するように変動し得る。

【0165】

培養細胞に添加されるＭＹＸＶの量は、細胞型、培養方法、およびウイルス株に応じて変動し得る。

【0166】

ＭＹＸＶによる培養細胞の感染力は、細胞死を引き起こすＭＹＸＶの能力を含む、当業者に知られている様々な方法によって決定され得る。これにはまた、ウイルス発現産物との酵素反応または化学反応を完了するために、細胞培養への試薬の添加も含み得る。ウイルス発現産物は、ＭＹＸＶゲノムに挿入されたレポーター遺伝子から発現し得る。

【0167】

一実施形態では、ＭＹＸＶは、感染状態の検出の容易さを高めるように改変し得る。例えば、ＭＹＸＶは、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、またはラジオイメージングによって容易に検出できるマーカーを発現するように遺伝子改変し得る。マーカーは、比色反応または放射性標識反応に関与し得る、発現された蛍光タンパク質または発現された酵素であり得る。いくつかの実施形態において、マーカーは、試験されている細胞の特定の機能を妨害または阻害する遺伝子産物であり得る。

【0168】

医薬組成物
本開示のＭＹＸＶまたは本開示のＭＹＸＶを含む細胞は、医薬組成物の成分として製剤化することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現する粘液腫ウイルス、および薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料、および様々な適合性のある担体を含み得る。

【0169】

医薬組成物は、追加の抗癌剤などの追加の治療剤を含み得る。一実施形態では、組成物は化学療法剤を含む。化学療法剤は、例えば、対象の癌細胞または腫瘍性細胞に対して効果を示し、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現するＭＹＸＶの腫瘍殺傷効果を阻害または減少させない実質的に任意の薬剤であり得る。例えば、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有剤またはサイトカインであり得るが、これらに限定されない。化学療法剤は、癌性または腫瘍性である特定の細胞型に対して有効であることが知られているものであり得る。

【0170】

薬学的に許容される希釈剤の割合および同一性は、例えば、選択された投与経路、生ウイルスとの適合性、および標準的な製薬慣行によって決定することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現するＭＹＸＶの生物学的特性を著しく損なうことのない成分で製剤化される。医薬組成物は、有効量の単数または複数の活性物質が薬学的に許容されるビヒクルと混合して組み合わされるように、対象への投与に適した薬学的に許容される組成物の調製のための既知の方法によって調製することができる。適切なビヒクルは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ １９９５）に記載されている。これに基づいて、組成物は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤とともに、ＭＹＸＶの溶液またはＭＹＸＶを含む細胞を含み得、適切なｐＨであり、および生理学的流体と等浸透圧である緩衝液に含まれ得る。

【0171】

医薬組成物は、本明細書に開示されるように、選択された投与経路に依存して様々な形態で対象に投与され得る。本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与され得る。非経口投与には、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻、肺内、髄腔内、腫瘍内、直腸および局所の投与様式が含まれる。非経口投与は、選択された期間にわたる継続的な注入（例えば、静脈内注入）によるものであり得る。

【0172】

医薬組成物は、例えば、不活性希釈剤または担体と共に経口投与され得るか、またはそれは、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の場合、１つ以上の免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶが賦形剤とともに取り込まれて、摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形で使用することができる。

【0173】

本開示のＭＹＸＶの溶液または本開示のＭＹＸＶを含む細胞は、生理学的に適切な緩衝液中で調製することができる。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための保存料を含むことができるが、それは生きているウイルスを不活化することはない。適切な製剤の選択および調製のための従来の手順および成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓおよび１９９９年に発行されたＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）に記載されている。使用される医薬組成物の用量は、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、サイズと体重を含む個々の対象のパラメーター、治療の期間、併用療法の性質（もしあれば）、投与の特定の経路、医療従事者の知識と専門知識の範囲内にある他の同様の要因に依存する。特定の実施形態において、治療用ウイルスは、室温での保存のために凍結乾燥され得る。

【0174】

キット
本開示の態様は、１つ以上の免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶ、およびそれらを含むキットに関する。ＢｉＫＥ、ＢｉＴＥおよび／またはＭｉＴＥなどの１つ以上の免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶ、またはＭＹＸＶを含む医薬組成物は、例えば、ＭＹＸＶの使用説明書を含むキットとしてパッケージすることができる。キットは、本明細書に開示される任意のＭＹＸＶを含み得、例えば、１つ以上の免疫調節性導入遺伝子、１つ以上のレポーター導入遺伝子、１つ以上の非免疫調節導入遺伝子、またはそれらの組み合わせを含むＭＹＸＶを含み得る。キットは、例えば、レシピエント対象への投与のための剤形にＭＹＸＶを製剤化するための、１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、賦形剤、またはビヒクルを含むことができる。

【0175】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶ（例えば、１つ以上の免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶ）、および本明細書に開示されるようなＭＹＸＶの細胞送達用材料を含むキットである。キットは、例えば、骨髄および／または末梢血からの白血球などの複数の細胞を含むことができる。白血球は、ＭＹＸＶおよび細胞のレシピエントとなる対象に対して、自己、同種異系、ハプロタイプ一致、ＨＬＡ一致、またはＨＬＡ不一致であり得る。いくつかの実施形態において、複数の細胞は、本開示のＭＹＸＶに事前に吸着されているか、または曝露されている。キットは、ＭＹＸＶを複数の細胞に吸着させるための、および／またはＭＹＸＶ吸着された細胞をレシピエントに投与するための説明書を含むことができる。キットは、例えば、ＭＹＸＶを複数の細胞に吸着させ、未結合のＭＹＸＶを除去し、ＭＹＸＶ吸着細胞をレシピエント対象への投与用の剤形に製剤化するため、またはそれらの任意の組み合わせのための、１つ以上の薬学的に許容される緩衝液、希釈剤、担体、賦形剤、またはビヒクルを含むことができる。

【0176】

いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＭＹＸＶおよび複数の細胞を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＭＹＸＶ、ならびに、ＭＹＸＶを複数の細胞に吸着させるための、および／またはＭＹＸＶ吸着細胞をレシピエントに投与するための説明書を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＭＹＸＶおよび２つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、賦形剤、またはビヒクルを含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＭＹＸＶ、複数の細胞、ならびに、ＭＹＸＶを複数の細胞に吸着させるための、および／またはＭＹＸＶ吸着細胞をレシピエントに投与するための説明書を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＭＹＸＶ、複数の細胞、および１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、賦形剤、またはビヒクルを含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＭＹＸＶ、ＭＹＸＶを複数の細胞に吸着させるための、および／またはＭＹＸＶ吸着細胞をレシピエントに投与するための説明書、ならびに１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、賦形剤、またはビヒクルを含む。いくつかの実施形態において、キットは、複数の細胞、ＭＹＸＶを複数の細胞に吸着させるための、および／またはＭＹＸＶが吸着された細胞をレシピエントに投与するための説明書、ならびに１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、賦形剤、またはビヒクルを含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＭＹＸＶ、複数の細胞、ＭＹＸＶを複数の細胞に吸着させるための、および／またはＭＹＸＶ吸着細胞をレシピエントに投与するための説明書、ならびに１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、賦形剤、またはビヒクルを含む。

【実施例】

【0177】

実施例１：免疫調節導入遺伝子を発現する組換えＭＹＸＶ構築物の設計および構築
この実施例は、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現する組換えＭＹＸＶ構築物の設計および構築を実証する。

【0178】

本開示の免疫調節導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列が生成され、例えば、商業的にまたはＰＣＲ増幅によって得られる。いくつかの場合において、コードされるタンパク質は、分泌を促進するためのシグナル配列を含むことができる。いくつかの場合において、タンパク質は、タンパク質の検出および／または精製のためのエピトープタグ（例えば、Ｖ５タグ）を含むことができる。

【0179】

導入遺伝子を粘液腫ウイルスゲノムに組み込むためのプラスミドが生成される。導入遺伝子は、ウイルス感染細胞でのみ発現できるポックスウイルス合成初期／後期プロモーター（ｓＥ／Ｌ）の下で発現させることができます。導入遺伝子に加えて、レポーター遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＴｄＴｏｍａｔｏも任意選択で含まれ、導入遺伝子を発現する組換えウイルスの迅速な選択および精製のために、ポックスウイルスプロモーターの下で発現され得る。ホタルルシフェラーゼ（Ｆ－Ｌｕｃ）などの追加のレポーター遺伝子により、例えば、生きている動物において、ウイルス複製のリアルタイムモニタリングが可能になる。導入遺伝子とレポーター遺伝子は、親の野生型ＭＹＸＶバックボーンを維持するためにオープンリーディングフレームの間に挿入できる（例えば、Ｍ１３５とＭ１３６のオープンリーディングフレームの間）。導入遺伝子は、遺伝子ノックアウトウイルスのバックグラウンドに挿入することもできます。例えば、導入遺伝子は、Ｍ１３５遺伝子の対応する欠失または破壊を伴ってＭ１３５遺伝子座に挿入されるか、または導入遺伝子は、Ｍ１３６遺伝子の対応する欠失または破壊を伴ってＭ１３６遺伝子座に挿入され得る。

【0180】

最終的な組換えプラスミドカセットは、（ｉ）導入遺伝子、（ｉｉ）任意選択のレポーター遺伝子、および（ｉｉｉ）相同組換えを促進するためにウイルスゲノム中の配列と一致するＤＮＡ配列を有する相同性アーム／組換えアームを含む。

【0181】

組換えプラスミドの構築は、細菌における組換えによる複数のＤＮＡ断片からの単一のプラスミドの構築を可能にするゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）技術（Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ Ｐｒｏ）によって行われる。最終的な組換えカセットを作成するために、異なる要素を含む複数のエントリークローンが生成される。エントリークローンは以下を含み得る：（ｉ）ウイルスゲノムの配列と一致するＤＮＡ配列を含む第１の相同性／組換えアーム、（ｉｉ）プロモーター（例えば、ポックスウイルス合成初期／後期プロモーター）、任意選択でシグナル配列、エピトープタグなどを有する本開示の免疫調節導入遺伝子、（ｉｉｉ）任意選択で、プロモーター（例えば、ポックスウイルス後期ｐ１１プロモーターの制御下にあるＧＦＰおよび／またはＴｄＴｏｍａｔｏ）を有する１つ以上のレポーター遺伝子、ならびに（ｉｖ）ウイルスゲノムの配列と一致するＤＮＡ配列を含む第２の相同性／組換えアーム。最終的な組換えプラスミドカセットを構築するために、すべての要素は、標準的なプロトコルを使用したＬＲ組換え反応によってＧａｔｅｗａｙデスティネーションベクターで組換えられる。

【0182】

組換えプラスミドの例を図１に提供する。２つの相同性アームは、収束する配列に整列させることができる（例えば、遺伝子間領域における組換えカセットの挿入のため）。いくつかの場合において、相同性アーム１はＭ１３５オープンリーディングフレームを含むことができ、相同性アーム２はＭ１３６オープンリーディングフレームを含むことができ、粘液腫ウイルスゲノムのＭ１３５とＭ１３６オープンリーディングフレームの間の導入遺伝子とレポーター遺伝子の挿入を容易にする。

【0183】

２つの相同性アームは、削除される配列をスキップするウイルスゲノム内の２つの別個の配列に整列することができる（例えば、ウイルスゲノムの遺伝子の全部または一部の欠失、および組換えカセットによる置換のため）。いくつかの場合において、相同性アーム１はＭ１３４オープンリーディングフレームまたはその一部を含むことができ、Ｍ１３５オープンリーディングフレームを何も含まないかまたは断片を含むことができ、相同性アーム２はＭ１３６オープンリーディングフレームまたはその一部を含むことができ、Ｍ１３５オープンリーディングフレームを何も含まないかまたは断片を含むことができ、これにより、Ｍ１３５オープンリーディングフレームの残りの部分を削除できる。いくつかの場合において、相同性アーム１は、ＳＯＤの上流にある配列を含むことができ、ＳＯＤオープンリーディングフレームを含まないかまたは断片を含むことができ、相同性アーム２は、ＳＯＤオープンリーディングフレームまたはその一部の下流である配列を含むことができ、そしてＳＯＤオープンリーディングフレームを何も含まないかまたは断片を含むことができ、これにより、ＳＯＤオープンリーディングフレームの残りの部分を削除することができる。

【0184】

プラスミド構築後、導入遺伝子および／またはレポーター遺伝子の発現は、プラスミドをＭＹＸＶに感染したＲＫ１３細胞にトランスフェクトした後、ウエスタンブロット分析によって試験することができる。

【0185】

導入遺伝子およびレポーター遺伝子を隣接配列と共にコードする最終的な組換えプラスミドを、野生型ＭＹＸＶ Ｌａｕｓａｎｎｅに感染したＲＫ１３細胞にトランスフェクトする。組換えウイルスは、レポーター遺伝子マーカーの発現に基づいて単離され、連続的に精製される。

【0186】

免疫調節導入遺伝子の発現は、ウエスタンブロット分析および機能アッセイによって再度確認される。ウイルスは、野生型ウイルスのバックグラウンドおよびノックアウトバックグラウンド（例えば、Ｍ１３５のノックアウトを伴う）上に免疫調節導入遺伝子を含むように生成される。

【0187】

この方法は、ＳＴＩＮＧ、ＴＮＦα、抗ＰＤＬ１、ＦＡＳＴ、および／またはＩＬ－１２などの、本開示の免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶを生成するために使用される。

【0188】

実施例２：ＳＴＩＮＧを発現する組換えＭＹＸＶの設計と構築
この実施例は、構成的に活性化されたＳＴＩＮＧの変異体を発現する組換えＭＹＸＶの設計および構築を実証する。ＳＴＩＮＧを利用した遺伝子のバージョンには、機能獲得型変異（Ｒ２８４Ｓ）があり、これは、単一の塩基対（８５２Ｇ／Ｔ）の置換によるものである。配列番号３の配列を含む、変異体ｃＤＮＡ ＳＴＩＮＧは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された。８５２Ｇ／Ｔ変異は、下線と太字で示される。

【0189】

【0190】

ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧは、野生型（ｗｔ）ＭＹＸＶ株 Ｌａｕｓｓａｎｅ（ＭＹＸＶ－Ｌａｕ）ゲノムのＭ１３５遺伝子座にＣ末端Ｖ５タグを有するＳＴＩＮＧ発現カセットを挿入することによって構築された。ＳＴＩＮＧの発現は、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター（Ｐ１１）の制御下にある。増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現カセットは、ＳＴＩＮＧのすぐ下流に挿入され、その発現は、ポックスウイルス合成初期／後期プロモーター（ｓＥ／Ｌ）によって駆動された。ＭＹＸＶ感染はＧＦＰ発現のライブイメージングによって監視できるため、ｅＧＦＰはインビトロおよびインビボでのＭＹＸＶ複製の蛍光マーカーとして機能し得る。

【0191】

ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧ－ＧＦＰ構築物を作製するために、組換えプラスミドが、Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して構築された。図２は、組換えプラスミドの設計と、組換え後のＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧ－ＧＦＰの改変ゲノムを図示する。

【0192】

上流および下流のハイブリダイズする配列をＰＣＲによって増幅し、適切なｐＤＯＮＲベクターを用いたＧａｔｅｗａｙＢＰ組換えによってエントリークローンを生成した。最終的な組換えプラスミドは、３つのエントリークローンをデスティネーションベクターと順次様式で再結合することによって構築した。ＳＴＩＮＧおよびｅＧＦＰ発現カセットは、ＲＫ１３細胞にＭＹＸＶ－Ｌａｕを感染させ、適切な組換えプラスミドをトランスフェクトすることにより、ＭＹＸＶゲノムに挿入された。組換えウイルスの純粋なストックを得るために、複数ラウンドの病巣（ｆｏｃｉ）精製を実施し、適切なプライマーセットを使用したＰＣＲによって特異性を確認した。

【0193】

【0194】

図３Ａは、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動によるＳＴＩＮＧの検出を図示する。図３Ａの候補１と２はＳＴＩＮＧに陽性である。候補３と対照はＳＴＩＮＧに対して陰性である。

【0195】

ＳＴＩＮＧタンパク質の発現は、ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧ－ＧＦＰに感染したＲＫ１３細胞からの溶解物のウエスタンブロットによって確認された。Ｖ５エピトープタグに特異的なマウスモノクローナル抗体を使用し、４３ｋＤａのバンドの検出を可能にした（図３Ｂ）。ＳＴＩＮＧは、ＲＫ１３細胞培養の３つからの溶解物で検出されたが、第４の培養および対照は陰性であった。

【0196】

ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧの複製能力は、５のＭＯＩで感染したＲＫ１３細胞における単一段階の増殖曲線を介して試験された。複製は、ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧと対照親ウイルスとの間で類似していた（図４）。

【0197】

実施例３：ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧは感染細胞に自食作用（オートファジー）を誘導する
親ウイルスからのＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧ－ＧＦＰの精製中に、この新しいウイルスが、ＲＫ１３感染細胞において、感染した細胞における、穴のような、または液胞のような構造が存在することを特徴とする、特定の表現型を促進することが予想外に観察された。

【0198】

精製されたＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧを使用して、ＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、およびＡ５４９細胞株を１０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。４８時間後、３つの細胞株すべてが穴様または液胞様構造を示した。図５Ａは、モック感染したＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、およびＡ５４９細胞の光学顕微鏡画像を提供する。図５Ｂは、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰに感染したＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、およびＡ５４９細胞の蛍光および光学顕微鏡画像を提供する。図５Ｃは、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＳＴＩＮＧ－ＧＦＰに感染したＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、およびＡ５４９細胞の蛍光および光学顕微鏡画像を提供する。

【0199】

観察された表現型の１つの可能な説明は、感染細胞における自食作用の誘導であり、これは、オートファゴソームの形成につながる可能性がある。自食作用がＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧ感染細胞で誘導されたかどうかを調べるために、Ａ５４９細胞をＭＹＸＶまたはＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧに感染させ、感染後４８時間から細胞溶解物に対してウエスタンブロットを行ってＬＣ３－ＩＩを検出した。自食作用の間、ＬＣ３－Ｉは、ＬＣ３が自食作用小胞と結合することを可能にするＡｔｇ７とＡｔｇ３を含むユビキチン様システムによる脂質化を通してＬＣ３－ＩＩに変換される。オートファゴソームにおけるＬＣ３の存在、およびＬＣ３のより低い移動形態であるＬＣ３－ＩＩへの変換は、自食作用の指標として使用されてきた。ウサギ抗ヒト－ＬＣ３ＢＡｂ（２７７５Ｓ）を使用してＬＣ３－ＩＩを検出した。参照遺伝子ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。ウイルスゲノムにおけるＳＴＩＮＧの存在は、ＭＯＩ依存的にＬＣ３－ＩＩをアップレギュレートするように見えた（図６）。驚くべきことに、ＭＹＸＶ－ＧＦＰはＬＣ３－ＩＩもある程度アップレギュレートし、感染細胞培養におけるある程度の自食作用誘導を示す（図６）。

【0200】

実施例４：ＭＹＸＶはインビトロでヒト血液癌細胞に感染して殺傷させる
本開示のＭＹＸＶに対するヒト血液癌細胞の感受性を評価するために、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株を組換えＭＹＸＶクローンに感染させた。ＡＭＬ細胞の例としてＴＨＰ－１細胞を使用した。ＭＭ細胞の例としてＵ２６６細胞を使用した。Ｕ２６６細胞は、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０で維持された。ＴＨＰ－１細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０で維持された。

【0201】

細胞をモック感染させるか、または０．１、１、または１０の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－抗ｍｕＰＤＬ１－ＧＦＰ、またはＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰに感染させた。細胞は、ウイルスを吸着させるために３７℃で１時間感染させ、感染後２４時間または４８時間（ｈｐｉ）までインキュベートした。

【0202】

感染は、蛍光顕微鏡法によって２４および４８ｈｐｉで評価された。画像は５倍の倍率で、３３８．００ミリ秒の露出、２．５のゲインで撮影された。図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ感染後２４時間および４８時間でのＴＨＰ－１細胞の感染を示す。図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ感染後２４時間および４８時間でのＵ２６６細胞の感染を実証する。

【0203】

感染率はまた、フローサイトメトリーによって定量化され、感染細胞の集団がＧＦＰ発現について評価された。図１６Ａは、感染後２４時間および４８時間でＧＦＰ陽性であったＴＨＰ－１細胞のパーセントを示す。図１６Ｂは、感染後２４時間および４８時間でＧＦＰ陽性であったＵ２６６細胞のパーセントを示す。

【0204】

細胞殺傷は、近ＩＲ生／死染色を使用するフローサイトメトリーによって、感染後２４時間および４８時間（ｈｐｉ）で評価された。図９はＴＨＰ－１細胞の殺傷を実証する。図１０は、Ｕ２６６細胞の殺傷を実証する。

【0205】

細胞殺傷は、ＧＦＰ＋細胞（感染細胞の直接殺傷または標的上殺傷のため）およびＧＦＰ陰性細胞（非感染細胞の間接殺傷または標的外殺傷のため）をゲーティングすることによってさらに特徴付けられた。図１７Ａは、２４時間および４８時間で殺傷された感染ＴＨＰ－１細胞の割合を図示する。図１７Ｂは、２４時間および４８時間で殺傷された非感染ＴＨＰ－１細胞の割合を図示する。図１８Ａは、２４時間および４８時間で殺傷された感染Ｕ２６６細胞のパーセントを図示する。図１８Ｂは、２４時間および４８時間で殺傷された非感染Ｕ２６６細胞のパーセントを図示する。図１９は、感染したＴＨＰ－１細胞に対する死滅したＴＨＰ－１細胞の比率を提供する。図２０は、感染したＵ２６６細胞に対する死滅したＵ２６６細胞の比率を提供する。

【0206】

これらのデータは、本開示の免疫調節導入遺伝子を発現するＭＹＸＶがヒト血液癌細胞に感染し、その中で複製し、そしてそれを殺傷することができ、いくつかの場合において、免疫調節導入遺伝子を欠くＭＹＸＶと比較して殺傷の増強を誘発できることを示す。例えば、ＭＹＸＶ－ＴＮＦαおよびＭＹＸＶ－ＦＡＳＴは、野生型ＭＹＸＶと比較して、ＴＨＰ－１（ヒトＡＭＬ）細胞の強化された殺傷を誘発し、ＭＹＸＶ－ＦＡＳＴはＵ２６６（ヒトＭＭ）細胞の強化された殺傷を誘発した。

【0207】

実施例５：免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、骨髄からの初代ヒト多発性骨髄腫細胞を殺傷する
この実施例は、ヒト患者からの骨髄（ＢＭ）サンプル中の多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を殺傷する本開示のＭＹＸＶを実証する。

【0208】

初代骨髄サンプルは、骨髄生検を介して多発性骨髄腫患者から得られ、単核細胞を単離するためにＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ勾配を使用する精製に供された。次に、単核細胞を条件ごとに３８０μＬの完全培地に再懸濁して２４ウェルプレートに入れた。

【0209】

次に、懸濁液中のこれらの一次細胞をモック処理するか（すなわち、ウイルスを添加しない）、またはＭＹＸＶ－ＷＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－抗ｍｕＰＤＬ１－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧ－ＧＦＰ、またはＭＹＸＶ－ＩＬ１２－ＧＦＰとインキュベートした。実験は、ＭＯＩ＝１０、１、および０．１を含むさまざまな感染多重度（ＭＯＩ）で実施した。細胞を３７℃で１時間インキュベートして、ウイルスを吸着を可能にした。１時間のインキュベーション後、１２０μＬの完全培地を各ウェルに添加し、プレートを３７℃でさらにインキュベートした。感染２４時間後に、細胞を近ＩＲ生／死で標識した。続いて、一次細胞を、条件ごとに１００μＬの染色バッファー中の１μＬのヒト抗ＣＤ１３８抗体で標識し、遮光して４℃で１５分間インキュベートした。次に、１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘを使用してすべてのサンプルを固定し、遮光して４℃で１５分間インキュベートした後、フローサイトメトリー分析のために２７０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。

【0210】

殺傷されたＭＭ細胞のパーセントは、フローサイトメトリーによって評価された。ＣＤ１３８は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞のマーカーとして使用された。図２１は、感染したＣＤ１３８＋細胞の割合を示す（ＧＦＰ陽性）。

【0211】

図１１は、免疫調節導入遺伝子を発現する本開示のＭＹＸＶによるＭＭ細胞の殺傷を示す。これらのデータは、免疫調節導入遺伝子を発現する本開示のＭＹＸＶが、原発性ヒト血液癌細胞に感染して殺傷させることができ、場合によっては、免疫調節導入遺伝子を発現しないＭＹＸＶと比較して増強された殺傷を誘発できることを示す。図１２は、骨髄生検中のＢＭ抽出の６時間後と２４時間後に分析された、同じ初代細胞サンプルから示されたＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ４２０標識ＭＭ細胞集団を示し、これらの細胞は６時間後には存在していたが、２４時間後に数が大幅に減少したことを示す。

【0212】

実施例６：免疫調節性導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、血液癌細胞の死滅を増強する
この実施例は、原発性ヒト血液癌細胞を殺傷する能力について、免疫調節性導入遺伝子を発現する本開示のＭＹＸＶを評価することを実証する。初代血液および骨髄サンプルは、血液癌の患者から入手される。サンプルは、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ勾配を使用する精製に供され、単核細胞が単離され、赤血球（ＲＢＣ）の大部分が除去される。

【0213】

次に、懸濁液中のこれらの初代細胞をモック処理するか（すなわち、ウイルスを添加しない）、または本開示のＭＹＸＶと共に３７℃で１時間インキュベートして、ウイルスを吸着させる。実験は、ＭＯＩ＝１０、１、および０．１を含むさまざまな感染多重度（ＭＯＩ）で実施される。この後、モック処理またはＭＹＸＶ処理した細胞を３７℃で一晩（約２４時間）インキュベートして、ウイルス感染が進行することを可能にする。

【0214】

ウイルス感染のパーセンテージならびに癌細胞の生存率、アポトーシス、および細胞死のパーセンテージは、フローサイトメトリーを使用して決定される。パーセンテージは、ウイルスに曝露された患者サンプル中の非感染癌細胞についても決定され、ウイルスに直接感染していないが（例えば、いかなるウイルス特異的蛍光タンパク質も発現していない）、免疫調節性導入遺伝子によって活性化される免疫細胞によって活性化される免疫細胞によって殺傷される、「オフターゲット」方式で殺傷され、細胞における癌細胞死の測定を可能にする。

【0215】

免疫調節性導入遺伝子（例えば、ＭＹＸＶ－ＳＯＤＫＯ－ＴＮＦα－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－抗ｍｕＰＤＬ１－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ｐ１４ＦＡＳＴ－ＧＦＰ、ＭＹＸＶ－ＳＴＩＮＧ－ＧＦＰ、またはＭＹＸＶ－ＩＬ１２－ＧＦＰ）を発現する本開示のＭＹＸＶは、生産的に癌細胞に感染する。場合によっては、免疫調節導入遺伝子を発現する本開示のＭＹＸＶは、それらが感染する癌細胞を直接殺傷し、免疫調節導入遺伝子を介して非感染癌細胞の殺傷を促進する。

【0216】

実施例７：多発性骨髄腫（ＭＭ）に対する粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を用いる腫瘍溶解性ウイルス療法（ＭＹＸＶ）：初代ヒトサンプルから癌細胞を排除するために適したＭＹＸＶ構築物の同定。
実験は、初代ヒト細胞サンプルから難治性癌細胞を排除するために適したＭＹＸＶ構築物および実験条件を同定するために実施される。骨髄または末梢血のサンプルは、血液癌（骨髄腫、白血病、またはリンパ腫）を有する対象から採取される。単核細胞が単離される（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを介して）。癌細胞を含む単核細胞のサンプルは、様々な条件下（例えば、ＭＯＩ、インキュベーション時間）の下で、本開示のＭＹＸＶ構築物（例えば、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現し、および／または１つ以上の欠失を含む）で処理され、癌細胞を殺傷するＭＹＸＶ構築物の能力は、本明細書に開示されるように（例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、および／または細胞毒性アッセイを介して）決定される。

【0217】

同定された構築物および／または実験条件は、対象を治療するために使用することができる。例えば、適切であると特定されたＭＹＸＶ構築物は、対象に直接投与することができ（例えば、注射または静脈内注入を介して）、またはＭＹＸＶに吸着した白血球を介して投与することができる。

【0218】

実施例８：粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）による腫瘍溶解性ウイルス療法
対象は、血液癌（例えば、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫）を有すると特定される。血液癌は、任意選択で、微小残存病変（ＭＲＤ）および／または薬剤耐性ＭＲＤを含む血液癌である可能性がある。

【0219】

必要に応じて、対象から採取されたサンプル（例えば、末梢血または骨髄サンプル）から癌細胞を殺傷する本開示のＭＹＸＶ構築物（例えば、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現する、および／または１つ以上の欠失を含む）を同定するために研究が行われる。

【0220】

ＭＹＸＶは、対象に投与される（例えば、注射または注入を介して投与される）。ＭＹＸＶは、対象の癌細胞に感染し、免疫調節導入タンパク質を発現し、癌細胞の殺傷と抗癌免疫応答の増強をもたらす。

【0221】

実施例９：ＭＹＸＶに吸着された白血球の自己移植を介した粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を用いる腫瘍溶解性ウイルス療法。
ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶに吸着された白血球の自己移植を介して、血液癌を有する対象に投与される。

【0222】

骨髄または末梢血サンプルは、血液癌（例えば、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫）を有する対象から得られ、単核細胞が（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅを介して）単離される。癌細胞は、非癌細胞から分離することができる（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介して）。本開示のＭＹＸＶは、白血球に吸着される（例えば、約０．１から１０のＭＯＩで約１時間吸着される）。ＭＹＸＶに吸着された白血球は、静脈内注入を介して対象に戻して投与される。ＭＹＸＶは、対象の癌細胞に感染し、癌細胞の殺傷と抗癌免疫応答をもたらす。

【0223】

実施例１０：ＭＹＸＶに吸着された白血球の同種異系移植を介した粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を用いる腫瘍溶解性ウイルス療法。
ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶに吸着された白血球の同種異系移植を介して、血液癌（例えば、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫）を有する対象に投与される。骨髄または末梢血サンプルは、ドナー（例えば、ＨＬＡ一致、ＨＬＡ不一致、ハプロタイプ一致、または兄弟ドナー、あるいはそれらの組み合わせ）から得られる。単核細胞が単離される（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを介して）。任意選択で、細胞は特定の白血球サブセットについて精製または濃縮される（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介して）。本開示のＭＹＸＶは、白血球に吸着される（例えば、約０．１から１０のＭＯＩで約１時間吸着される）。ＭＹＸＶに吸着された白血球は、静脈内注入を介して対象に戻して投与される。ＭＹＸＶは、対象の癌細胞に感染し、癌細胞の殺傷と抗癌免疫応答をもたらす。

【0224】

実施例１１：インビボで薬剤耐性の播種性ＭＭを標的および排除するための、微小残存病変（ＭＲＤ）のＶｋ＊ＭＹＣ免疫コンピテントマウスモデルにおける自己移植と組み合わせたエキソビボＭＹＸＶウイルス療法。
この実施例は、白血球の表面に吸着したＭＹＸＶを使用することによる血液癌を有する対象の治療を実証する。同様の実験または後続の実験は、１つ以上の免疫調節導入遺伝子を発現する本開示のＭＹＸＶを用いて実施することができる。

【0225】

２つのＣ５７ＢＬ／６由来のＶＫ＊ＭＹＣ細胞株をインビボ実験のために使用した：ボルテゾミブ耐性（ＢＯＲ耐性）であるＶＫ１２５９８、および多剤耐性株ＶＫ１２６５３。最初に、これら２つのＶＫ＊ＭＹＣ細胞株のＭＹＸＶ結合および感染に対する感受性を評価した。

【0226】

ＶＫ１２５９８およびＶＫ１２６５３へのＭＹＸＶ結合、インビトロ研究：結合実験のために、ＭＹＸＶ－Ｍ０９３Ｌ－Ｖｅｎｕｓウイルス（Ｍ０９３Ｌのアミノ末端にある蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの融合物を含む）を１０の感染多重度（ＭＯＩ）で使用した。簡単に説明すると、ＶＫ１２５９８またはＶＫ１２６５３のいずれかをＢＭ（または解凍したばかりのＢＭ）から新たに単離し、ＭＹＸＶ－Ｍ０９３Ｌ－Ｖｅｎｕｓと４℃で１時間インキュベートして、ウイルスを可能にした。未結合のウイルスは、ウイルス吸着細胞を２回洗浄することによって除去した。ビリオン結合のレベルは、フローサイトメトリーを使用して定量化した。ウイルス感染の分析のために、細胞をレポーターＭＹＸＶ－ＧＦＰ（Ｅ／Ｌ）／ＴｄＴｏｍａｔｏ（Ｌ）とＭＯＩ＝１０にて３７℃で１時間インキュベートし、ウイルスを吸着させた。ウイルス感染を可能にするために、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。ＭＹＸＶは両方の細胞株に効率的に結合した（図１３Ａおよび１４Ａ）。これに加えて、ＭＹＸＶは両方の細胞株に生産的に感染する（図１３Ｂ－Ｃおよび１４Ｂ）。

【0227】

ＶＫ１２５９８細胞株を使用するインビボ研究：最初のインビボ実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＶＫ１２５９８細胞（例えば、マウスあたり１×１０^６細胞）を事前に播種した。ＭＭ細胞移植の４週間後、マウスを出血させ、Ｍスパイクを測定した。Ｍ－スパイクのレベル（例えば、０、低＝０．１、中＝０．２、高＝０．６）に従ってマウスを分離した（図１５Ａ、上部パネル）。次に、マウスを次のように処理した：Ｃ５７ＢＬ／６ ＢＭ移植なし（コホートＩ）、Ｃ５７ＢＬ／６ ＢＭ細胞のみ（コホートＩＩ）、ＭＹＸＶ－Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰのみ（コホートＩＩＩ）、ＭＹＸＶ－でｅｘｖｉｖｏ処理したＣ５７ＢＬ／６ ＢＭ Ｍ１３５ＫＯ－ＧＦＰ（コホートＩＶ）（図１５Ａ、下のパネル）。図１５Ｂは、Ｍスパイクが低い（０．１）コホートＩの代表的なマウスのＭＭ（ＣＤ１３８＋ Ｂ２２０－）のパーセンテージと、Ｍ－スパイクが高い（０．６）コホートＩＩの代表的なマウスのＭＭ（ＣＤ１３８＋ Ｂ２２０－）のパーセンテージを示す。図１５Ｃは、コホートＩＶからの唯一の生存者のＭスパイクを示し、これは、ＭＭの完全な退行を示し、移植後８日目、２９日目、および３７日目にＭスパイクバンドは検出されなかった。これらのデータは、エキソビボにてＭＹＸＶで処理された骨髄の移植がＭＭの退行を誘発する可能性があることを示す。まとめると、これらのデータは、この最初の実験のコホート治療が疾患の進行の遅すぎることを示唆している可能性があり、代わりにウイルス療法はこのモデルのはるかに早い段階で開始するべきである（例えば、ＭＭ移植後４週間ではなくＭＭ移植後１週間未満）。ＭＭの退行は、この遅い介入時間でも発生し得るが、ウイルス療法を早期に開始すると（例えば、死亡またはエンドポイントにそれほど近くないマウスコホートで）、ウイルス技術の評価を改善できる可能性がある。

【0228】

追加の試験において、ＭＹＸＶは、他の治療法（ＳＭＡＣ模倣物ＬＣ１６１など）と組み合わせて試験される。ＶＫ１２５９８癌細胞が移植され、Ｍ－Ｓｐｉｋｅが１－４週間で定量化され、マウスがシクロホスファミドで処理されて、１か月続く可能性のある一過性の完全応答（ＣＲ）が誘導される。シクロホスファミドの１週間後または２週間後の」いずれかで、ウイルス療法が、シクロホスファミドによって開始された部分的退行を延長または完了することができるかどうかをテストするために、マウスにＢＭ＋ＭＹＸＶまたはＰＢＭＣ＋ＭＹＸＶ（例えば、本明細書に開示される免疫調節導入遺伝子を発現するＭＹＸＶ）を移植する。この設定では、この化学療法に機能的に抵抗する疾患によって定義されるＭＭ微小残存病変（ＭＲＤ）を排除するＭＹＸＶの能力が調べられる。単剤療法または併用療法のいずれかとして、多剤耐性ＶＫ１２６５３細胞株を排除するＭＹＸＶの能力も調べられる。

【0229】

実施形態
実施形態１．１つ以上の免疫調節タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）。

【0230】

実施形態２．免疫調節タンパク質がインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）である、実施形態１の粘液腫ウイルス。

【0231】

実施形態３．免疫調節タンパク質がインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）である、実施形態１の粘液腫ウイルス。

【0232】

実施形態４．免疫調節タンパク質がＩＬ－１２Ａである、実施形態１に記載の粘液腫ウイルス。

【0233】

実施形態５．免疫調節タンパク質がＩＬ－１２Ｂである、実施形態１に記載の粘液腫ウイルス。

【0234】

実施形態６．免疫調節タンパク質が融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）である、実施形態１の粘液腫ウイルス。

【0235】

実施形態７．免疫調節タンパク質が免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態１に記載の粘液腫ウイルス。

【0236】

実施形態８．免疫調節タンパク質が抗ＰＤＬ１である、実施形態１に記載の粘液腫ウイルス。

【0237】

実施形態９．免疫調節タンパク質が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質である、実施形態１に記載の粘液腫ウイルス。

【0238】

実施形態１０．免疫調節タンパク質が、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激すること、または核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）もしくはＩＲＦ（インターフェロン調節因子）を活性化することができる、実施形態１－９のいずれか１つに記載の粘液腫ウイルス。

【0239】

実施形態１１．粘液腫ウイルスが、Ｍ０１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、またはＭ－Ｔ７で、またはそれらに隣接する修飾を含む、実施形態１－１０のいずれか１つに記載の粘液腫ウイルス。

【0240】

実施形態１２．実施形態１－１１のいずれか１つの粘液腫ウイルス、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【0241】

実施形態１３．全身投与用に製剤化される、実施形態１２の医薬組成物。

【0242】

実施形態１４．局所投与用に製剤化される、実施形態１３の医薬組成物。

【0243】

実施形態１５．非経口投与用に製剤化される、実施形態１２－１４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0244】

実施形態１６．免疫調節タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）によってエキソビボで処理された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む組成物。

【0245】

実施形態１７．ＭＹＸＶが実施形態１－１１のいずれか１つの粘液腫ウイルスである、実施形態１６の組成物。

【0246】

実施形態１８．ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせが自己細胞を含む、実施形態１９－２１のいずれか１つに記載の組成物。

【0247】

実施形態１９．ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせが同種異系ドナーから得られる、実施形態１９－２１のいずれか１つに記載の組成物。

【0248】

実施形態２０．免疫調節タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を対象に投与することを含む、必要とする対象における癌を阻害または治療する方法。

【0249】

実施形態２１．ＭＹＸＶが実施形態１－１１のいずれか１つの粘液腫ウイルスである、実施形態２０の方法。

【0250】

実施形態２２．ＭＹＸＶが実施形態１－１１のいずれか１つの粘液腫ウイルスである、実施形態２０の方法。

【0251】

実施形態２３．ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせの表面にエキソビボで粘液腫ウイルスを吸着させることをさらに含む、実施形態２２の方法。

【0252】

実施形態２４．ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせの表面に粘液腫ウイルスを吸着させることは、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせの表面への粘液腫ウイルスの結合を可能にする条件下で、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせを粘液腫ウイルスに曝露することを含む、実施形態２３の方法。

【0253】

実施形態２５．癌が固形腫瘍である、実施形態２２－２４のいずれか１つに記載の方法。

【0254】

実施形態２６．癌が対象の第２の位置に転移している、実施形態２２－２５のいずれか１つに記載の方法。

【0255】

実施形態２７．第２の位置が、対象の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む、実施形態２６の方法。

【0256】

実施形態２８．癌が骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌、または黒色腫を含む、実施形態２２－２７のいずれか１つに記載の方法。

【0257】

実施形態２９．対象に追加の治療薬を投与することをさらに含む、実施形態２２－２８のいずれか１つに記載の方法。

【0258】

実施形態３０．ＭＹＸＶまたは組成物を投与する前に、追加の治療薬が対象に投与される、実施形態２９の方法。

【0259】

実施形態３１．ＭＹＸＶまたは組成物を投与した後、追加の治療薬が対象に投与される、実施形態２９または３０の方法。

【0260】

実施形態３２．追加の治療薬が、ＭＹＸＶまたは組成物との組み合わせとして対象に投与される、実施形態２９または３０の方法。

【0261】

実施形態３３．対象がヒトである、実施形態２２－３２のいずれか１つに記載の方法。

【0262】

実施形態３４．この方法は、癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象を選択することをさらに含む、実施形態３３に記載の方法。

【0263】

実施形態３５．粘液腫ウイルスが、欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染することができる、実施形態２２－３４のいずれか１つに記載の方法。

【0264】

実施形態３６．欠損した生来の抗ウイルス応答を有する細胞が癌細胞を含む、実施形態３５に記載の方法。

【0265】

実施形態３７．細胞が、免疫調節タンパク質を発現する粘液腫ウイルスに感染している、実施形態２２－３６のいずれか１つに記載の方法。

【0266】

実施形態３８．実施形態１－１１の粘液腫ウイルスまたは実施形態１２－１９の医薬組成物を含むキット。

【0267】

本開示は、特定の実施形態に重点を置いて説明されてきたが、特定の実施形態のバリエーションが使用され得ることは当業者には明らかであり、本開示は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施され得ることが意図される。本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して説明される特徴、特性、化合物、または例は、本発明の他の任意の態様、実施形態、または実施例に適用可能であると理解されるべきである。したがって、この開示には、以下の請求項によって定義される開示の精神および範囲に含まれるすべての改変が含まれる。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲と精神に含まれるすべてのものを本発明者らの発明として特許請求する。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21】

【国際調査報告】