▶ アクセラレイテッド・バイオサイエンシズ・コーポレーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-14
(54)【発明の名称】致死性多能性幹細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20230607BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230607BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20230607BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20230607BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230607BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20230607BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20230607BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230607BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N1/00 A
C12N1/00 G
C12N5/077
C12N5/074
C12N5/0783
C12N5/0793
C12N5/0735
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022567503
(86)(22)【出願日】2021-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-01-05
(86)【国際出願番号】 US2021030686
(87)【国際公開番号】W WO2021226112
(87)【国際公開日】2021-11-11
(31)【優先権主張番号】63/020,247
(32)【優先日】2020-05-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514149598
【氏名又は名称】アクセラレイテッド・バイオサイエンシズ・コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】リー，ジャウ－ナン
(72)【発明者】
【氏名】リー，ユータ
(72)【発明者】
【氏名】リー，トニー・トゥン－イーン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BB19
4B065BB20
4B065BB40
4B065BC11
4B065CA44
(57)【要約】
栄養膜幹細胞などの胚外幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで生産される致死性多能性幹細胞、その組成物、およびその使用が、本明細書において開示される。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生産された致死性多能性幹細胞を、１つまたは複数の誘導剤と共に培養して、細胞集団を生産する方法も、本明細書において開示される。また、本明細書において開示される細胞およびそれから分化した細胞を利用することによって障害または状態を処置する方法も、本明細書において開示される。
【選択図】図１０Ｂ
【選択図】図１０Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、ＭＰＳＣの培養開始から約９０日以内に少なくとも８９の集団倍加に達することができる、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）集団。
【請求項2】
ＭＰＳＣの培養開始から、約１２日以内に約２５～約３０の集団倍加、約３０日以内に約５０～約５５の集団倍加、および／または約６３日以内に約７５～約８０の集団倍加に達することができる、請求項１に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項3】
約２２～約２７時間で倍加することができる、請求項１または２に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項4】
約２５時間で倍加することができる、請求項３に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項5】
ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、病原体を含まない、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団。
【請求項6】
ＭＰＳＣが細菌を含まない、請求項１から５のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項7】
ＭＰＳＣがウイルスを含まない、請求項１から６のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項8】
ＭＰＳＣがサイトメガロウイルスを含まない、請求項１から７のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項9】
ＭＰＳＣが、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、水痘ウイルス（ＶＺＶ）、コリネバクテリウム、ハンタウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マイコプラズマ、トレポネマ、またはその任意の組合せである病原体を含まない、請求項１から８のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項10】
ＭＰＳＣが、肝炎ウイルスを含まず、肝炎ウイルスが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項11】
ＭＰＳＣが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含まず、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項12】
ＭＰＳＣが、ヒト免疫不全ウイルスを含まず、ヒト免疫不全ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ２）、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項13】
ＭＰＳＣが、ヒトパピローマウイルスを含まず、ヒトパピローマウイルスが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項14】
ＭＰＳＣが、単純ヘルペスウイルスを含まず、単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ２）、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項15】
ＭＰＳＣが、ヒトＴリンパ向性ウイルスを含まず、ヒトＴリンパ向性ウイルスが、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ１）、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ２）、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項16】
ＭＰＳＣが、コリネバクテリウムを含まず、コリネバクテリウムが、コリネバクテリウム・ボビス、コリネバクテリウム種（ＨＡＣ２）、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項17】
ＭＰＳＣが、ハンタウイルスを含まず、ハンタウイルスが、ハンターンハンタウイルス、ソウルハンタウイルス、シンノンブルハンタウイルス、またはその組合せを含む、請求項９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項18】
ｂ－ＨＣＧ、ＨＳＰ９０、ＣＤＸ２、ＦＧＦＲ１、ｐＡＫＴ、ｐＣＲＥＢ１、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、またはその任意の組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項19】
ＫＩＲ２ＤＬ４、Ｆｌｔ３Ｌ、ＮＫｐ４６、ＴＣＲ、ＩＬＴ－４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ９０／Ｔｈｙ－１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４１、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＣＤ１０７ａ、またはその任意の組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項20】
ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＣＬＸＬ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＶＥＧＦ、ＰＡＩ－１、ＩＬ－１０、またはその任意の組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する、請求項１から１９のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項21】
ＭＰＳＣの少なくとも一部が、Ｋｉ－６７、ＨＳＰ７０、ｐ５３、シンシチン、またはその組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現しない、請求項１から２０のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項22】
ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、またはその組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現する、請求項１から２１のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項23】
ＭＰＳＣの少なくとも一部が、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、またはその組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現しない、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項24】
９６％を超えるＭＰＳＣが、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、またはその組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現しない、請求項１から２３のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項25】
ＣＤ１６、ＣＤ５６、またはその組合せを発現する、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項26】
ＭＰＳＣの少なくとも一部が、ＣＤ３を発現しない、請求項１から２５のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項27】
９６％を超えるＭＰＳＣが、ＣＤ３を発現しない、請求項１から２６のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項28】
ＭＰＳＣの集団の少なくとも６５％が、ＨＬＡ－Ｇを発現する、請求項１から２７のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項29】
ＨＬＡ－Ｇが、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、ＨＬＡ－Ｇ７、またはその任意の組合せを含む、請求項２８に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項30】
ＨＬＡ－Ｇが、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡＧ－６、ＨＬＡ－Ｇ７、またはその任意の組合せを含む、請求項２８または２９に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項31】
ＨＬＡ－Ｇが、ＨＬＡＧ－６、ＨＬＡ－Ｇ７、またはその組合せを含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項32】
ＭＰＳＣの集団の１５％未満が、ＨＬＡ－Ｇ１を発現する、請求項１から３１のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項33】
少なくとも１０％が、単クローン性である、請求項１から３２のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項34】
約１３％～約１５％が単クローン性である、請求項２５に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項35】
少なくとも１ｘ１０６個のＭＰＳＣを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項36】
ＭＰＳＣが、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、安定な核型を有する、請求項１から３５のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項37】
ＭＰＳＣが、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、集団倍加に由来する染色体異常を示さない、請求項１から３６のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項38】
ＭＰＳＣが、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、凍結および解凍に由来する実質的な染色体異常を示さない、請求項１から３７のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団。
【請求項39】
致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、培養培地中に約１，０００～約５，０００細胞／ｃｍ２の密度でＭＰＳＣの継代培養物を播種するステップ、および細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項40】
致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、培養培地中に約１，０００～約５，０００細胞／ｃｍ２の密度でＭＰＳＣの継代培養物を播種するステップ、および細胞を培養するステップを含み、ＭＰＳＣの集団が、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現する、方法。
【請求項41】
培養培地が、動物成分を含まない、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項42】
培養培地が、血清を含まない、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
培養培地が、ウシ胎仔血清を含まない、請求項３８に記載の方法。
【請求項44】
ＭＰＳＣが、約３日間培養される、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
ＭＰＳＣが、約４日間培養される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
ＭＰＳＣの継代培養物が、約２，０００～約４，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
請求項３９から４６のいずれか一項に記載の方法によって生産される、細胞の集団。
【請求項48】
請求項１から３８のいずれか一項に記載のＭＰＳＣの集団と、１つまたは複数の誘導剤とを接触させるステップを含む、細胞を生産する方法。
【請求項49】
生産される細胞が、外胚葉細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
生産される細胞が、中胚葉細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項51】
生産される細胞が、内胚葉細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項52】
生産される細胞が、膵臓細胞または膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項53】
１つまたは複数の誘導剤が、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
１つまたは複数の誘導剤が、２－メルカプトエタノールおよびニコチンアミドをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
ＰＰＣが、β－ＨＣＧ、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
ＰＰＣが、β－ＨＣＧおよびＣＤＸ２；β－ＨＣＧおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＨＣＧ、ＣＤＸ２、およびＨＬＡ－Ｇを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
ＰＰＣが、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、またはその任意の組合せをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項58】
生産される細胞が、神経細胞（ＮＣＳ）または神経前駆細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項59】
１つまたは複数の誘導剤が、レチノイン酸を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
ＮＣＳ細胞が、ＲＡＲ－β、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項61】
ＮＣＳ細胞が、ＲＡＲ－βおよびＣＤＸ２；ＲＡＲ－βおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＲＡＲ－β、ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
ＮＣＳ細胞が、Ｎ－ＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、またはその任意の組合せをさらに含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項63】
生産される細胞が、肝細胞または肝前駆細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項64】
１つまたは複数の誘導剤が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ステロイド、およびサイトカインを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
生産される細胞がナチュラルキラー細胞であり、誘導剤がＦＧＦである、請求項４８に記載の方法。
【請求項66】
ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋、およびＣＤ３－である、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
ナチュラルキラー細胞がさらに、ＨＬＡ－Ｇ＋およびＣＤＸ２＋である、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
生産される細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、またはその任意の組合せを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項69】
生産される細胞が、脂肪細胞および軟骨細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
生産される細胞が、脂肪細胞および骨細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
生産される細胞が、軟骨細胞および骨細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項72】
生産される細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項73】
生産される細胞が、脂肪細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項74】
脂肪細胞が、レプチン、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、Ｕｃｐ１、ＣＩＤＥＡ、ＰＲＤＭ１６、Ｚｉｃ１、Ｌｈｘ８、Ｅｖａ１、Ｅｐｓｔｉ１、Ｃｄ１３７、Ｔｍｅｍ２６、Ｔｂｘ１、Ｃｉｔｅｄ１、Ｓｈｏｘ２、アミノ酸輸送因子ＡＳＣ－１、アミノ酸輸送因子ＰＡＴ２、プリン作動性受容体Ｐ２ＲＸ５、ＡＴＧＬ、ＣＡＶ１、ＦＡＢＰ４、ＣＯＸ４、ＬＭＮＢ１、またはその組合せを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項75】
脂肪細胞が、白色脂肪細胞を含む、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項76】
白色脂肪細胞が、レプチン、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、またはその組合せを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
脂肪細胞が、褐色脂肪細胞を含む、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項78】
褐色脂肪細胞が、Ｕｃｐ１、ＣＩＤＥＡ、ＰＲＤＭ１６、Ｚｉｃ１、Ｌｈｘ８、Ｅｖａ１、Ｅｐｓｔｉ１、またはその組合せを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
脂肪細胞が、ベージュ脂肪細胞を含む、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項80】
ベージュ脂肪細胞が、Ｃｄ１３７、Ｔｍｅｍ２６、Ｔｂｘ１、Ｃｉｔｅｄ１、Ｓｈｏｘ２、またはその組合せを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
脂肪細胞が、ベージュ脂肪細胞前駆体を含む、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項82】
ベージュ脂肪細胞前駆体が、ＣＤ１３７、ＴＭＥＭ２６、またはその組合せを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
生産される細胞が、軟骨細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項84】
軟骨細胞が、アネキシンＡ６、ＣＤ４４、ＣＤ１５１、ＩＴＭ２Ａ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＦｏｘＣ１、ＦｏｘＣ２、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＯＸ９、アグリカン、カテプシンＢ、ＣＨＡＤＬ、コンドロアドヘリン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＶ、ＣＲＴＡＣ１、ＤＳＰＧ３、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、マトリリン－１、マトリリン－３、マトリリン－４、ＭＩＡ、オトラプリン／ＯＴＯＲ、ＵＲＢ、またはその組合せを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
生産される細胞が、骨細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項86】
骨細胞が、前骨芽細胞、骨芽細胞、包埋骨芽細胞、類骨骨細胞、骨石灰化骨細胞、または成熟骨細胞を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
骨細胞が、ＲＵＮＸ２、ＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＥＰＥ、スクレロスチン、ＣａｐＧ、ＯＲＰ１５０、またはその組合せを含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項88】
骨細胞が前骨芽細胞を含み、前骨芽細胞がＲＵＮＸ２を含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項89】
骨細胞が前骨芽細胞を含み、前骨芽細胞がＲＵＮＸ２を含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項90】
骨細胞が骨芽細胞を含み、骨芽細胞がＲＵＮＸ２およびＯＣＮを含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項91】
骨細胞が包埋骨芽細胞を含み、包埋骨芽細胞がＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、およびＣａｐＧを含む、請求項ｖに記載の方法。
【請求項92】
骨細胞が類骨骨細胞または骨石灰化骨細胞を含み、類骨骨細胞または骨石灰化骨細胞が、ＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＥＰＥ、およびＣａｐＧを含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項93】
骨細胞が成熟骨細胞を含み、成熟骨細胞がＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＰＥＰ、スクレロスチン、ＣａｐＧ、およびＯＲＰ１５０を含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項94】
ＨＬＡ－Ｇを発現し、インドールアミン２－３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）分泌について陰性、キヌレニン分泌について陰性、およびインターロイキン２（ＩＬ－２）分泌について陽性のうちの１つまたは複数を含む表現型を含む、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団。
【請求項95】
インドールアミン２－３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）分泌について陰性、キヌレニン分泌について陰性、およびインターロイキン２（ＩＬ－２）分泌について陽性の表現型を含む、請求項９４に記載のＭＰＳＣの集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
[0001]本出願は、２０２０年５月５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２０，２４７号の利益を請求し、その出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0001]本出願は、２０２０年５月５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２０，２４７号の利益を請求し、その出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
[0002]現行の胚性幹細胞およびｉＰＳ細胞のある特定の欠点を克服するための代替手段として、様々な疾患または状態を処置するための新規幹細胞が必要である。
【0003】
参照による組込み
[0003]本明細書に記載の全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。本明細書の用語と、組み込まれる参考文献中の用語との間に矛盾が存在する場合、本明細書の用語が統制する。
[0003]本明細書に記載の全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。本明細書の用語と、組み込まれる参考文献中の用語との間に矛盾が存在する場合、本明細書の用語が統制する。
【発明の概要】
【0004】
[0004]発明の概要に提供される本発明の実施形態は、例示目的に過ぎず、本明細書において開示される選択的実施形態の概観を提供することを意味する。例示的かつ選択的である、発明の概要は、特許請求の範囲を制限せず、本明細書において開示される、または企図される本発明の実施形態の範囲全体を提供せず、本開示の範囲または特許請求される本発明の実施形態を制限または拘束すると解釈されるべきではない。
【0005】
[0005]多くの態様の一部では、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、ＭＰＳＣの培養開始から９０日以内に最大で少なくとも８９の集団倍加に達することができる、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が本明細書において開示される。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＭＰＳＣの培養開始から９０日以内に約８９～約１００の集団倍加に達することができる。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＭＰＳＣの培養開始から、約１２日以内に約２５～約３０の集団倍加、約３０日以内に約５０～約５５の集団倍加、および／または約６３日以内に約７５～約８０の集団倍加に達することができる。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、約２２～約２７時間、例えば、約２５時間で倍加することができる。一部の態様では、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、病原体を含まない、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が本明細書において開示される。
【0006】
[0006]一部の場合、本明細書において開示されるＭＰＳＣは、病原体を含まない。一部の例では、ＭＰＳＣは、細菌を含まない。一部の例では、ＭＰＳＣは、ウイルス、例えば、サイトメガロウイルスを含まない。一部の例では、ＭＰＳＣは、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、ＨＡｄＶ（ヒトアデノウイルス）、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、および／またはＣ型肝炎）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６（ヒトヘルペスウイルス６型）および／またはＨＨＶ８（ヒトヘルペスウイルス８型））、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ１（ヒト免疫不全ウイルス１型）、ＨＩＶ２（ヒト免疫不全ウイルス２型））、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８など）、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１（単純ヘルペス１型）、ＨＳＶ２（単純ヘルペス２型）など）、ヒトＴリンパ向性ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ１（ヒトＴリンパ向性ウイルス１型）、ＨＴＬＶ２（ヒトＴリンパ向性ウイルス２型）など）、ＶＺＶ（水痘ウイルス）、コリネバクテリウム・ボビス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、コリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）（ＨＡＣ２）、ハンタウイルス（例えば、ハンターン、ソウル、またはシンノンブル）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ならびにその任意の組合せからなる群から選択される病原体を含まない。
【0007】
[0007]一部の例では、本明細書において開示されるＭＰＳＣ、またはＭＰＳＣを含む集団は、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｂ－ＨＣＧ）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、尾型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、ｐＡＫＴ、ｐＣＲＥＢ１（ＣＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質１）、ヒトリンパ球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体４（ＫＩＲ２ＤＬ４）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＮＫｐ４６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、免疫グロブリン様転写物４（ＩＬＴ－４）、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ９０／Ｔｈｙ－１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４１、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、またはＣＤ１０７ａのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＩＬ－８、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、ＣＬＸＬ２、血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ－ＡＡ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プラスミノゲン活性化因子インヒビター１（ＰＡＩ－１）、またはＩＬ－１０のうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの少なくとも一部は、Ｋｉ－６７、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ｐ５３、またはシンシチンのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現しない。一部の例では、ＭＰＳＣの集団（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）は、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの少なくとも一部は、ＣＤ１９、ＣＤ４５、またはＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数のタンパク質を発現しない。一部の例では、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＭＰＳＣが、ＣＤ１９、ＣＤ４５、またはＨＬＡ－ＤＲのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現しない。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＣＤ１６またはＣＤ５６またはその組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの少なくとも一部は、ＣＤ３を発現しない。一部の例では、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＭＰＳＣが、ＣＤ３を発現しない。一部の例では、ＭＰＳＣの集団の少なくとも６５％または少なくとも７０％が、ＨＬＡ－Ｇを発現する。一部の例では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、もしくはＨＬＡ－Ｇ７、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ６、もしくはＨＬＡ－Ｇ７、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ６、もしくはＨＬＡ－Ｇ７、またはその組合せを含む。一部の例では、ＭＰＳＣの集団の１５％未満（例えば、１０％未満）が、ＨＬＡ－Ｇ１を発現する。
【0008】
[0008]一部の例では、本明細書において開示されるＭＰＳＣの集団の少なくとも１０％が、単クローン性である。一部の例では、ＭＰＳＣの集団の約１３％～約１５％が、単クローン性である。一部の例では、少なくとも約１ｘ１０６個のＭＰＳＣが、集団中に存在する。一部の例では、ＭＰＳＣは、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、安定な核型を有する。一部の例では、ＭＰＳＣは、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、集団倍加に由来する染色体異常を経験しない。一部の例では、ＭＰＳＣは、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、凍結および解凍に由来する実質的な染色体異常を経験しない。
【0009】
[0009]一部の場合、本開示は、本明細書において開示されるＭＰＳＣの集団を増殖させる方法であって、培養培地中に約１，０００～約５，０００細胞／ｃｍ２の密度でＭＰＳＣの継代培養物を播種するステップ、および細胞を培養するステップを含む、方法を提供する。
【0010】
[0010]一部の態様では、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、培養培地中に約１，０００～約５，０００細胞／ｃｍ２の密度でＭＰＳＣの継代培養物を播種するステップ、および細胞を培養するステップを含み、ＭＰＳＣの集団が、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現する、方法が本明細書において開示される。一部の例では、培養培地は、動物成分を含まない。一部の例では、培養培地は、血清、例えば、ウシ胎仔血清を含まない。一部の例では、細胞は、３日間培養される。一部の例では、細胞は、４日間培養される。一部の例では、ＭＰＳＣは、約２，０００～約４，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。
【0011】
[0011]一部の態様では、本明細書において開示されるＭＰＳＣの集団と、１つまたは複数の誘導剤とを接触させるステップを含む、細胞を生産する方法が本明細書において開示される。生産される細胞は、外胚葉細胞を含んでもよい。生産される細胞は、中胚葉細胞を含んでもよい。生産される細胞は、内胚葉細胞を含んでもよい。生産される細胞は、膵臓細胞または膵臓前駆細胞を含んでもよく、必要に応じて、誘導剤は、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を含み、２－メルカプトエタノールおよびニコチンアミドをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＰＰＣは、β－ＨＣＧ、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＰＰＣは、β－ＨＣＧおよびＣＤＸ２；β－ＨＣＧおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＨＣＧ、ＣＤＸ２、およびＨＬＡ－Ｇを含む。必要に応じて、一部の例では、ＰＰＣは、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、またはその任意の組合せをさらに含む。生産される細胞は、神経細胞または神経前駆細胞を含んでもよく、必要に応じて、誘導剤は、レチノイン酸を含む。一実施形態では、ＮＣＳ細胞は、レチノイン酸受容体ベータ（ＲＡＲ－β）、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＮＣＳ細胞は、ＲＡＲ－βおよびＣＤＸ２；ＲＡＲ－βおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＲＡＲ－β、ＣＤＸ２、およびＨＬＡ－Ｇを含む。必要に応じて、一部の例では、ＰＰＣは、Ｎ－ＣＡＤ、神経上皮幹細胞タンパク質（ＮＥＳＴＩＮ）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）ボックス２（ＳＯＸ２）、ペアードボックス６（ＰＡＸ６）、またはその任意の組合せをさらに含む。生産される細胞は、肝細胞または肝前駆細胞を含んでもよく、必要に応じて、誘導剤は、ＦＧＦ２などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、デキサメタゾンなどのステロイド、およびオンコスタチンＭなどのサイトカインを含み、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ４、および／または肝増殖因子をさらに含んでもよい。一部の例では、ＦＧＦは、ＦＧＦＲ１に結合し、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、またはＦＧＦ２３である。一部の例では、ステロイドは、糖質コルチコイドステロイド、例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、またはトリアムシノロンである。一部の例では、サイトカインは、インターロイキン６（ＩＬ－６）群のサイトカイン、例えば、オンコスタチンＭ、例えば、ヒトオンコスタチンＭ、ＩＬ－６、インターロイキン－１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）、およびカルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）である。生産される細胞は、ナチュラルキラー細胞を含んでもよく、誘導剤は、ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、またはＦＧＦ２３を含む。一実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋、およびＣＤ３－である。一部の例では、ナチュラルキラー細胞は、さらにＨＬＡ－Ｇ＋およびＣＤＸ２＋である。
【0012】
[0012]生産される細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、またはその任意の組合せを含んでもよい。一実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞および軟骨細胞を含む。別の実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞および骨細胞を含む。別の実施形態では、生産される細胞は、軟骨細胞および骨細胞を含む。別の実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞を含む。
【0013】
[0013]別の実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞を含む。脂肪細胞は、レプチン、ホメオボックスＣ８（ＨＯＸＣ８）、ホメオボックスＣ９（ＨＯＸＣ９）、脱共役タンパク質１（Ｕｃｐ１）、細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＰＲドメイン含有１６（ＰＲＤＭ１６）、Ｚｉｃファミリーメンバー１（Ｚｉｃ１）、ＬＩＭホメオボックス８（Ｌｈｘ８）、Ｅｖａ１、上皮間質相互作用１（Ｅｐｓｔｉ１）、Ｃｄ１３７、膜貫通タンパク質２６（Ｔｍｅｍ２６）、Ｔボックス転写因子１（Ｔｂｘ１）、Ｇｌｕ／Ａｓｐリッチカルボキシ末端ドメイン１を有するＣｂｐ／Ｐ３００相互作用トランス活性化因子（Ｃｉｔｅｄ１）、低身長ホメオボックス２（Ｓｈｏｘ２）、アミノ酸輸送因子ＡＳＣ－１、アミノ酸輸送因子ＰＡＴ２、プリン作動性受容体Ｐ２ＲＸ５、脂肪細胞トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）、カベオリン１（ＣＡＶ１）、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット４（ＣＯＸ４）、ラミンＢ１（ＬＭＮＢ１）、またはその組合せを含んでもよい。一例では、脂肪細胞は、白色脂肪細胞を含み、白色脂肪細胞は、レプチン、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、またはその組合せを含む。別の例では、脂肪細胞は、褐色脂肪細胞を含み、褐色脂肪細胞は、Ｕｃｐ１、ＣＩＤＥＡ、ＰＲＤＭ１６、Ｚｉｃ１、Ｌｈｘ８、Ｅｖａ１、Ｅｐｓｔｉ１、またはその組合せを含む。別の例では、脂肪細胞は、ベージュ脂肪細胞を含み、ベージュ脂肪細胞は、Ｃｄ１３７、Ｔｍｅｍ２６、Ｔｂｘ１、Ｃｉｔｅｄ１、Ｓｈｏｘ２、またはその組合せを含む。別の例では、脂肪細胞は、ベージュ脂肪細胞前駆体を含み、ベージュ脂肪細胞前駆体は、ＣＤ１３７、ＴＭＥＭ２６、またはその組合せを含む。
【0014】
[0014]別の実施形態では、生産される細胞は、軟骨細胞を含む。軟骨細胞は、アネキシンＡ６、ＣＤ４４、ＣＤ１５１、ＩＴＭ２Ａ、配列類似性を有するファミリーのメンバー２０－Ｂ（ＦＡＭ２０Ｂ）、フォークヘッドボックスＣ１（ＦｏｘＣ１）、ＦｏｘＣ２、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＯＸ９、アグリカン、カテプシンＢ、コンドロアドヘリン様（ＣＨＡＤＬ）、コンドロアドヘリン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＶ、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、デルマタン硫酸プロテオグリカン３（ＤＳＰＧ３）、インテグリン結合シアロタンパク質（ＩＢＳＰ）／シアロタンパク質ＩＩ、マトリリン－１、マトリリン－３、マトリリン－４、ＭＩＡ、オトラプリン／ＯＴＯＲ、ＵＲＢ、またはその組合せを含んでもよい。
【0015】
[0015]別の実施形態では、生産される細胞は、骨細胞を含む。骨細胞は、前骨芽細胞、骨芽細胞、包埋骨芽細胞、類骨骨芽細胞、骨石灰化骨細胞、または成熟骨細胞を含んでもよい。骨細胞は、ＲＵＮＸファミリー転写因子２（ＲＵＮＸ２）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、Ｅ１１、デンチンマトリックス酸性ホスホタンパク質１（ＤＭＰ１）、リン酸調節性エンドペプチダーゼホモログＸ連鎖（ＰＨＥ）Ｘ、マトリックス細胞外ホスホ糖タンパク質（ＭＥＰＥ）、スクレロスチン、キャッピングアクチンタンパク質、ゲルソリン様タンパク質（ＣａｐＧ）、ＯＲＰ１５０、またはその組合せを含んでもよい。一例では、骨細胞は、前骨芽細胞を含み、前骨芽細胞は、ＲＵＮＸ２を含む。別の例では、骨細胞は、前骨芽細胞を含み、前骨芽細胞は、ＲＵＮＸ２を含む。別の例では、骨細胞は、骨芽細胞を含み、骨芽細胞は、ＲＵＮＸ２およびＯＣＮを含む。別の例では、骨細胞は、包埋骨芽細胞を含み、包埋骨芽細胞は、ＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、およびＣａｐＧを含む。別の例では、骨細胞は、類骨骨細胞または骨石灰化骨細胞を含み、類骨骨細胞または骨石灰化骨細胞は、ＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＥＰＥ、およびＣａｐＧを含む。別の例では、骨細胞は、成熟骨細胞を含み、成熟骨細胞は、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＰＥＰ、スクレロスチン、ＣａｐＧ、およびＯＲＰ１５０を含む。
【0016】
[0016]別の態様では、ＨＬＡ－Ｇを発現し、インドールアミン２－３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）分泌について陰性、キヌレニン分泌について陰性、およびインターロイキン２（ＩＬ－２）分泌について陽性のうちの１つまたは複数を含む表現型を含む、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が本明細書において開示される。一例では、ＭＰＳＣの集団は、インドールアミン２－３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）分泌について陰性、キヌレニン分泌について陰性、およびインターロイキン２（ＩＬ－２）分泌について陽性の表現型を含む。
【0017】
[0017]そのような態様、実施形態、および／または例のいずれかにおいて、本発明者らは、幹細胞が免疫特権を有し、染色体的に安定であり（腫瘍形成性ではない）、病原体を含まず、多能性であることを証明した。本発明者らはまた、顕著な倍加時間および増殖特性と共に、その幹細胞の、プログラムされたナチュラルキラー（ＮＫ）、軟骨、骨、脂肪、ニューロン、膵臓、肝臓、およびセクレトーム細胞への効率的な分化も証明した。
【0018】
図面の簡単な説明
[0018]本発明の様々な態様は、特に、添付の特許請求の範囲と共に記載される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用する、例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
[0018]本発明の様々な態様は、特に、添付の特許請求の範囲と共に記載される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用する、例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図2-1】[0020]図２Ａ～２Ｄは、異なる集団倍加での４つの異なるＭＰＳＣ試料のＫＡＲＹＯＳＴＡＴ（商標）分析の全ゲノムビューを示す。図２Ａは、１６．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料である。図２Ｂは、４４．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料である。図２Ｃは、６２．６の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料である。図２Ｄは、７１．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料である。
【図5A】[0023]図５Ａ～５Ｄは、特定の分子バイオマーカーを発現することによるＭＰＳＣの特性評価を示す。ＭＰＳＣは、β－ｈＣＧ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＳＰ９０、およびＣＤＸ２などの分子バイオマーカーを発現する（図５Ａ）が、ｋｉ６７、シンシチン、ＨＳＰ７０、ｐ５３などの一部については陰性である（図５Ｂ）。（図５Ｃ）ＭＰＳＣは、ＦＡＣＳ分析により、アイソタイプ対照および非染色細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（左パネル）ならびに４Ｈ８４抗体により検出される表面および可溶性ＨＬＡ－Ｇ（右パネル）を発現する。（図５Ｄ）細胞表面および細胞内と比較した、細胞表面でのＭＰＳＣ中のＨＬＡ－Ｇアイソフォームの代表的なＦＡＣＳ分析。
【図6A】[0024]図６Ａ～６Ｇは、ＭＰＳＣ中での免疫細胞の分子バイオマーカーの発現を示す。イメージングまたはＦＡＣＳ分析により、ＭＰＳＣは、ＮＫ細胞（図６Ａ）、Ｔ細胞（図６Ｂ）、樹状細胞（図６Ｃおよび図６Ｄ）、マクロファージ（図６Ｅ）、および幹細胞前駆体（図６Ｆおよび図６Ｇ）の様々な分子バイオマーカーを発現する。特定のバイオマーカーが、イメージまたはプロット上に示される。
【図9B】[0029]図９Ｂは、対照および培地のみと比較した、２４、４８、および７２時間での３つの異なる濃度のキヌレニン分泌に対するＩＦＮ－γ刺激の効果の結果を示す。このデータは、対照と比較してキヌレニン分泌に対する効果がないことを示す「陰性」である。
【図10B】[0031]図１０Ｂは、対照および培地のみと比較した、２４、４８、および７２時間での３つの異なる濃度のＩＬ－２分泌に対するＩＦＮ－γ刺激の効果の結果を示す。このデータは、細胞が対照と比較してＩＬ－２分泌を増加させることを示す「陽性」である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
[0041]ｉｎ ｖｉｔｒｏで生産された新規で独特の致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）、その組成物、および様々な表現型の分化した細胞（例えば、膵臓、神経、肝臓、免疫調節、もしくはナチュラルキラー細胞表現型）の生成または障害（例えば、糖尿病、神経消失もしくは変性、肝疾患、がん、炎症、ウイルス感染、もしくは自己免疫疾患）の処置または状態（例えば、皮膚状態）の改善におけるその使用が、本明細書において開示される。ＭＰＳＣは、以前の栄養膜幹細胞とは異なるものであり、限定されるものではないが、速く、拡張性のある集団倍加；病原体を含まないプロファイルを示したこと；高い免疫特権を有し、移植に適すること；優れた染色体安定性を有すること、例えば、少なくとも７１の集団倍加まで安定な核型を保有すること；ならびにサイトカイン、ケモカイン、およびエキソソームに富むロバストなセクレトームを産生することなどの利点を有する。ＭＰＳＣは、胚性幹細胞とは異なるものであり、倫理的に調達および培養される。ＭＰＳＣは致死性（例えば、有限の増殖能力を有する）であるが、それらは、胚性幹細胞およびｉＰＳ細胞よりもはるかに速く集団倍加に達することができる。胎盤、臍帯、または骨髄に由来する細胞と違って、ＭＰＳＣは、多能性であり、人間を形成する３つの主な細胞群：外胚葉（皮膚、ニューロン、および神経系を生じさせる）、内胚葉（胃腸管および呼吸器、内分泌腺、肝臓または肝細胞様細胞、および膵臓または膵臓細胞を形成する）、ならびに中胚葉（骨（骨細胞）、脂肪、軟骨（軟骨細胞）、循環系の多く、筋肉、結合組織、免疫細胞などを形成する）に分化または成熟することができる。さらに、ＭＰＳＣは、免疫能力のあるラットの試験において示されるように、非腫瘍形成性であり、例えば、腫瘍または奇形腫を誘導しない。
【0021】
[0042]１つまたは複数の本発明の実施形態の詳細は、添付の図面、特許請求の範囲、および本明細書の説明に記載される。本明細書において開示され、企図される本発明の実施形態の他の特徴、目的、および利点は、明示的に除外されない限り、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
【0022】
[0043]別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、特許請求される主題が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。前記の一般的説明および以下の詳細な説明は、例示および説明に過ぎず、特許請求される任意の主題の限定ではないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、別途具体的に記述しない限り、複数形を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。本出願では、「または」の使用は、別途記述しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。
【0023】
[0044]本明細書で使用される場合、範囲および量は、特定の値または範囲に「約」を付けて表すことができ、例えば、参照される数値の±１５％を意味する。また、「約」は、正確な量も含み、例えば、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と、「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差の範囲内にあると予想される量を含む。
【0024】
[0045]本明細書で使用される場合、用語「処置すること」、「処置」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。一部の例では、個体（例えば、肝臓関連疾患または障害に罹患している、および／または遺伝的にその素因があることが疑われる個体）は、本明細書に記載の細胞の調製物を用いて予防的に処置され、そのような予防的処置は、肝臓関連疾患もしくは障害またはその兆候もしくは症状を完全に、または部分的に防止する。一部の例では、個体は、治療的に処置され（例えば、個体が肝臓関連疾患または障害に罹患している場合）、そのような治療的処置は、疾患もしくは障害の部分的もしくは完全な治癒を引き起こす、および／または疾患もしくは障害に起因する有害効果を逆転させる、および／または疾患もしくは障害を安定化させる、および／または疾患もしくは障害の進行を遅延させる、および／または疾患もしくは障害の退縮を引き起こす。
【0025】
[0046]処置を必要とする領域への本明細書において開示される細胞の投与（例えば、移植）は、例えば、限定されるものではないが、外科手術中の局部輸注により、注射により、カテーテルにより、または埋込み体により達成され、前記埋込み体は、シアラスティック（Ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、または繊維などの膜を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質のものである。
【0026】
[0047]哺乳動物中に組成物を「移植すること」は、当業界で確立された任意の方法によって哺乳動物の身体中に組成物を導入することを指す。導入される組成物は、「移植片」であり、哺乳動物は、「レシピエント」である。移植片およびレシピエントは、同系、同種異系または異種であってもよい。さらに、移植は、自家移植であってもよい。
【0027】
[0048]細胞または細胞集団に関連して使用される場合、用語「単離された」とは、細胞または細胞集団が由来し得る宿主生物から分離され、宿主生物中に存在しない細胞または細胞集団の状態を指す。一部の例では、単離された細胞は、同じ宿主生物から単離されるか、またはそれに由来する他の細胞と接触される。一部の例では、単離された細胞は、他の任意の細胞から精製および分離される。一部の例では、単離された細胞は、幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される。
【0028】
[0049]「有効量」は、意図される目的を達成するのに十分な治療剤の量である。障害を処置する、または改善するための組成物の有効量は、障害の症状を低減させる、または除去するのに十分な組成物の量である。
【0029】
[0050]本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成のみを目的とするものであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。
【0030】
細胞および組成物
[0051]多くの態様の一部では、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、ＭＰＳＣの培養開始から９０日以内に最大で少なくとも８９の集団倍加に達することができる、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が本明細書において開示される。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＭＰＳＣの培養開始から９０日以内に最大で少なくとも８９～１００の集団倍加に達することができる。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＭＰＳＣの培養開始から、約１２日以内に約２５～約３０の集団倍加、約３０日以内に約５０～約５５の集団倍加、および／または約６３日以内に約７５～約８０の集団倍加に達することができる。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、約２２～約２７時間、例えば、約２５時間で倍加することができる。一部の態様では、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、病原体を含まない、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が、本明細書において開示される。一部の例では、ＭＰＳＣは、ｐ５３、シンシチン、Ｋｉ６７、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、またはその任意の組合せの発現を欠く。一部の例では、ＭＰＳＣは、ヒト細胞である。一部の例では、ＭＰＳＣは、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿を起源とする、またはそれに由来する。
[0051]多くの態様の一部では、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、ＭＰＳＣの培養開始から９０日以内に最大で少なくとも８９の集団倍加に達することができる、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が本明細書において開示される。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＭＰＳＣの培養開始から９０日以内に最大で少なくとも８９～１００の集団倍加に達することができる。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＭＰＳＣの培養開始から、約１２日以内に約２５～約３０の集団倍加、約３０日以内に約５０～約５５の集団倍加、および／または約６３日以内に約７５～約８０の集団倍加に達することができる。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、約２２～約２７時間、例えば、約２５時間で倍加することができる。一部の態様では、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現し、病原体を含まない、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が、本明細書において開示される。一部の例では、ＭＰＳＣは、ｐ５３、シンシチン、Ｋｉ６７、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、またはその任意の組合せの発現を欠く。一部の例では、ＭＰＳＣは、ヒト細胞である。一部の例では、ＭＰＳＣは、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿を起源とする、またはそれに由来する。
【0031】
[0052]別の態様では、ＨＬＡ－Ｇを発現し、インドールアミン２－３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）分泌について陰性、キヌレニン分泌について陰性、およびインターロイキン２（ＩＬ－２）分泌について陽性のうちの１つまたは複数を含む表現型を含む、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団が本明細書において開示される。一例では、ＭＰＳＣの集団は、インドールアミン２－３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）分泌について陰性、キヌレニン分泌について陰性、およびインターロイキン２（ＩＬ－２）分泌について陽性の表現型を含む。この表現型は、当業者がＭＰＳＣについて予想したであろうものとは反対である。表面表現型マーカーによっては、細胞は間葉系幹細胞のように見えるが、それらは機能的には異なるように振る舞う。
【0032】
[0053]一部の場合、本明細書において開示されるＭＰＳＣは、病原体を含まない。一部の例では、ＭＰＳＣは、細菌を含まない。一部の例では、ＭＰＳＣは、ウイルス、例えば、サイトメガロウイルスを含まない。一部の例では、ＭＰＳＣは、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、ＨＡｄＶ（ヒトアデノウイルス）、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６（ヒトヘルペスウイルス６型）、ＨＨＶ８（ヒトヘルペスウイルス８型）など）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ１（ヒト免疫不全ウイルス１型）、ＨＩＶ２（ヒト免疫不全ウイルス２型））、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ；例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８など）、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１（単純ヘルペス１型）、ＨＳＶ２（単純ヘルペス２型））、ヒトＴリンパ向性ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ１（ヒトＴリンパ向性ウイルス１型）、ＨＴＬＶ２（ヒトＴリンパ向性ウイルス２型））、水痘ウイルス（ＶＺＶ）、コリネバクテリウム・ボビス、コリネバクテリウム種（ＨＡＣ２）、ハンタウイルス（例えば、ハンターン、ソウル、またはシンノンブル）、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、マイコプラズマ種、トレポネマ・パリダム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される病原体を含まない。
【0033】
[0054]一部の例では、本明細書において開示されるＭＰＳＣ、またはＭＰＳＣを含む集団は、ｂ－ＨＣＧ、ＨＳＰ９０、ＣＤＸ２、ＦＧＦＲ１、ｐＡＫＴ、ｐＣＲＥＢ１、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＫＩＲ２ＤＬ４、Ｆｌｔ３Ｌ、ＮＫｐ４６、ＴＣＲ、ＩＬＴ－４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ９０／Ｔｈｙ－１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４１、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、またはＣＤ１０７ａのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＣＬＸＬ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＶＥＧＦ、ＰＡＩ－１、またはＩＬ－１０のうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの少なくとも一部は、Ｋｉ－６７、ＨＳＰ７０、ｐ５３、またはシンシチンのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現しない。一部の例では、ＭＰＳＣの集団（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）は、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの少なくとも一部は、ＣＤ１９、ＣＤ４５、またはＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数のタンパク質を発現しない。一部の例では、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＭＰＳＣが、ＣＤ１９、ＣＤ４５、またはＨＬＡ－ＤＲのうちの１つまたは複数のタンパク質を発現しない。一部の例では、ＭＰＳＣの集団は、ＣＤ１６またはＣＤ５６またはその組合せのうちの１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する。一部の例では、ＭＰＳＣの少なくとも一部は、ＣＤ３を発現しない。一部の例では、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＭＰＳＣが、ＣＤ３を発現しない。一部の例では、ＭＰＳＣの集団の少なくとも６５％または少なくとも７０％が、ＨＬＡ－Ｇを発現する。一部の例では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、もしくはＨＬＡ－Ｇ７、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ６、もしくはＨＬＡ－Ｇ７、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ６、もしくはＨＬＡ－Ｇ７、またはその組合せを含む。一部の例では、ＭＰＳＣの集団の１５％未満（例えば、１０％未満）が、ＨＬＡ－Ｇ１を発現する。
【0034】
[0055]一部の例では、本明細書において開示されるＭＰＳＣの集団の少なくとも１０％が、単クローン性である。一部の例では、ＭＰＳＣの集団の約１３％～約１５％が、単クローン性である。一部の例では、少なくとも約１ｘ１０６個のＭＰＳＣが、集団中に存在する。一部の例では、ＭＰＳＣは、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、安定な核型を有する。一部の例では、ＭＰＳＣは、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、集団倍加に由来する染色体異常を経験しない。一部の例では、ＭＰＳＣは、アレイベースの全ゲノムアッセイによって測定した場合、凍結および解凍に由来する実質的な染色体異常を経験しない。
【0035】
[0056]一部の場合、本明細書に提供される細胞、例えば、ＭＰＳＣは、遺伝子改変される。一部の例では、細胞は、外因性遺伝子、例えば、導入遺伝子を発現するように遺伝子改変される。本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」およびその文法的等価物は、生物中に移入される遺伝子または遺伝物質を指してもよい。例えば、導入遺伝子は、生物中に導入される遺伝子を含有するＤＮＡのストレッチまたはセグメントであってもよい。導入遺伝子が生物中に移入される場合、その生物はその後、トランスジェニック生物と称される。導入遺伝子は、トランスジェニック生物中でＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、タンパク質）を産生するその能力を保持することができる。導入遺伝子は、異なる核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡから構成されていてもよい。導入遺伝子は、遺伝子操作されたＴ細胞受容体、例えば、ＴＣＲ導入遺伝子をコードしてもよい。導入遺伝子は、ＴＣＲ配列を含んでもよい。導入遺伝子は、がん遺伝子を含んでもよい。導入遺伝子は、免疫がん遺伝子を含んでもよい。導入遺伝子は、組換えアームを含んでもよい。導入遺伝子は、遺伝子操作された部位を含んでもよい。一部の例では、導入遺伝子は、がん遺伝子である。一部の例では、導入遺伝子は、免疫がん遺伝子である。一部の例では、導入遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子である。一部の例では、導入遺伝子は、タンパク質分解を直接または間接に促進するタンパク質をコードする。一部の例では、導入遺伝子は、腫瘍溶解性遺伝子である。一部の例では、導入遺伝子は、リンパ球が腫瘍細胞を標的化するのを補助することができる。一部の例では、導入遺伝子は、Ｔ細胞エンハンサー遺伝子である。一部の例では、導入遺伝子は、腫瘍溶解性ウイルス遺伝子である。一部の例では、導入遺伝子は、腫瘍細胞増殖を阻害する。一部の例では、導入遺伝子は、抗がん受容体である。一部の例では、導入遺伝子は、抗血管新生因子である。一部の例では、導入遺伝子は、細胞傷害性遺伝子である。例示的な導入遺伝子としては、限定されるものではないが、ＣＤ２８、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ、シグナル３、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＬＦＡ－３（ＣＤ５８）、ＨＬＡクラスＩ遺伝子、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、トランケート型ＣＤ１９、ＶＥＧＦ、カスパーゼ、ケモカイン、または上記のいずれかに対する抗体（例えば、単クローン性抗体）をコードする１つもしくは複数の遺伝子、またはその任意の組合せが挙げられる。一部の例では、導入遺伝子は、細胞または組織修復に関与するタンパク質（例えば、ＤＮＡ修復、免疫応答（例えば、インターフェロンおよびインターロイキン）、および構造タンパク質と関連するタンパク質）をコードする。一部の例では、導入遺伝子は、増殖因子受容体をコードする。一部の例では、本明細書において開示されるＭＰＳＣは、ＴＣＲ、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはその任意の組合せをコードする導入遺伝子を含む。一部の例では、本明細書に記載のＭＰＳＣは、がん遺伝子受容体をコードする導入遺伝子を含む。
【0036】
[0057]一部の場合、本明細書において開示される細胞を含む組成物は、ヒトを含む哺乳動物への静脈内投与のための医薬組成物として製剤化される。一部の場合、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性緩衝剤中の溶液である。必要に応じて、組成物は、注射部位での疼痛を改善するための局部麻酔剤も含む。組成物を輸注により投与しようとする場合、それを、滅菌医薬品等級の水または生理食塩水を含有する点滴ボトルを用いて分注することができる。組成物を注射により投与する場合、成分が投与前に混合されるように、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【0037】
[0058]一態様では、本明細書において開示される細胞を含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書において開示される。一部の例では、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。そのような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、およびその組合せが挙げられる。他の例では、コロイド分散系が使用される。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む、脂質ベース系が挙げられる。
【0038】
使用方法
[0059]一部の態様では、本明細書において開示されるＭＰＳＣの集団と、１つまたは複数の誘導剤とを接触させるステップを含む、細胞を生産する方法が本明細書において開示される。一部の例では、生産される細胞は、外胚葉細胞である。一部の例では、生産される細胞は、中胚葉細胞である。一部の例では、生産される細胞は、内胚葉細胞である。一部の例では、生産される細胞は、膵臓細胞または膵臓前駆細胞であり、必要に応じて、誘導剤は、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を含み、一部の例では、２－メルカプトエタノールおよびニコチンアミドをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＰＰＣは、β－ＨＣＧ、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＰＰＣは、β－ＨＣＧおよびＣＤＸ２；β－ＨＣＧおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＨＣＧ、ＣＤＸ２、およびＨＬＡ－Ｇを含む。必要に応じて、一部の例では、ＰＰＣは、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、またはその任意の組合せをさらに含む。一部の例では、生産される細胞は、神経細胞または神経前駆細胞であり、必要に応じて、誘導剤は、レチノイン酸を含む。一実施形態では、ＮＣＳ細胞は、ＲＡＲ－β、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＮＣＳ細胞は、ＲＡＲ－βおよびＣＤＸ２；ＲＡＲ－βおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＲＡＲ－β、ＣＤＸ２、およびＨＬＡ－Ｇを含む。必要に応じて、一部の例では、ＰＰＣは、Ｎ－ＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、またはその任意の組合せをさらに含む。一部の例では、生産される細胞は、肝細胞または肝前駆細胞であり、必要に応じて、誘導剤は、ＦＧＦ２などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、デキサメタゾンなどのステロイド、およびオンコスタチンＭなどのサイトカインを含み、一部の例では、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ４、および／または肝増殖因子をさらに含んでもよい。一部の例では、ＦＧＦは、ＦＧＦＲ１に結合し、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、またはＦＧＦ２３である。一部の例では、ステロイドは、糖質コルチコイドステロイド、例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、またはトリアムシノロンである。一部の例では、サイトカインは、インターロイキン６群のサイトカイン、例えば、オンコスタチンＭ、例えば、ヒトオンコスタチンＭ、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）、およびカルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）である。一部の例では、細胞は、ナチュラルキラー細胞であり、誘導剤は、ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、またはＦＧＦ２３を含む。一部の例では、ＭＰＳＣは、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞の３０日（または３～４週間）および４ステップの分化と比較して、１ステップのプロトコールを用いて１日で神経前駆細胞に分化することができる。一部の例では、ＭＰＳＣは、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞の、８～１５日および４～５ステップの分化と比較して、１ステップのプロトコールを用いて１日でインスリン産生膵臓前駆細胞に分化することができる。一部の例では、ＭＰＳＣは、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞の１２～２１日および３ステップの分化と比較して、２ステップのプロトコールを用いて６日で肝細胞様細胞に分化する。
[0059]一部の態様では、本明細書において開示されるＭＰＳＣの集団と、１つまたは複数の誘導剤とを接触させるステップを含む、細胞を生産する方法が本明細書において開示される。一部の例では、生産される細胞は、外胚葉細胞である。一部の例では、生産される細胞は、中胚葉細胞である。一部の例では、生産される細胞は、内胚葉細胞である。一部の例では、生産される細胞は、膵臓細胞または膵臓前駆細胞であり、必要に応じて、誘導剤は、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を含み、一部の例では、２－メルカプトエタノールおよびニコチンアミドをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＰＰＣは、β－ＨＣＧ、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＰＰＣは、β－ＨＣＧおよびＣＤＸ２；β－ＨＣＧおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＨＣＧ、ＣＤＸ２、およびＨＬＡ－Ｇを含む。必要に応じて、一部の例では、ＰＰＣは、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、またはその任意の組合せをさらに含む。一部の例では、生産される細胞は、神経細胞または神経前駆細胞であり、必要に応じて、誘導剤は、レチノイン酸を含む。一実施形態では、ＮＣＳ細胞は、ＲＡＲ－β、ＣＤＸ２、ＨＬＡ－Ｇ、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、ＮＣＳ細胞は、ＲＡＲ－βおよびＣＤＸ２；ＲＡＲ－βおよびＨＬＡ－Ｇ；ＣＤＸ２およびＨＬＡ－Ｇ；またはＲＡＲ－β、ＣＤＸ２、およびＨＬＡ－Ｇを含む。必要に応じて、一部の例では、ＰＰＣは、Ｎ－ＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、またはその任意の組合せをさらに含む。一部の例では、生産される細胞は、肝細胞または肝前駆細胞であり、必要に応じて、誘導剤は、ＦＧＦ２などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、デキサメタゾンなどのステロイド、およびオンコスタチンＭなどのサイトカインを含み、一部の例では、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ４、および／または肝増殖因子をさらに含んでもよい。一部の例では、ＦＧＦは、ＦＧＦＲ１に結合し、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、またはＦＧＦ２３である。一部の例では、ステロイドは、糖質コルチコイドステロイド、例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、またはトリアムシノロンである。一部の例では、サイトカインは、インターロイキン６群のサイトカイン、例えば、オンコスタチンＭ、例えば、ヒトオンコスタチンＭ、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）、およびカルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）である。一部の例では、細胞は、ナチュラルキラー細胞であり、誘導剤は、ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、またはＦＧＦ２３を含む。一部の例では、ＭＰＳＣは、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞の３０日（または３～４週間）および４ステップの分化と比較して、１ステップのプロトコールを用いて１日で神経前駆細胞に分化することができる。一部の例では、ＭＰＳＣは、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞の、８～１５日および４～５ステップの分化と比較して、１ステップのプロトコールを用いて１日でインスリン産生膵臓前駆細胞に分化することができる。一部の例では、ＭＰＳＣは、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞の１２～２１日および３ステップの分化と比較して、２ステップのプロトコールを用いて６日で肝細胞様細胞に分化する。
【0039】
[0060]一態様では、生産される細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、またはその任意の組合せを含む間葉系間質細胞を含む。一実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞および軟骨細胞を含む。別の実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞および骨細胞を含む。別の実施形態では、生産される細胞は、軟骨細胞および骨細胞を含む。別の実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞を含む。
【0040】
[0061]別の実施形態では、生産される細胞は、脂肪細胞を含む。脂肪細胞は、レプチン、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、Ｕｃｐ１、ＣＩＤＥＡ、ＰＲＤＭ１６、Ｚｉｃ１、Ｌｈｘ８、Ｅｖａ１、Ｅｐｓｔｉ１、Ｃｄ１３７、Ｔｍｅｍ２６、Ｔｂｘ１、Ｃｉｔｅｄ１、Ｓｈｏｘ２、アミノ酸輸送因子ＡＳＣ－１、アミノ酸輸送因子ＰＡＴ２、プリン作動性受容体Ｐ２ＲＸ５、ＡＴＧＬ、ＣＡＶ１、ＦＡＢＰ４、ＣＯＸ４、ＬＭＮＢ１、またはその組合せを含んでもよい。一例では、脂肪細胞は、白色脂肪細胞を含み、白色脂肪細胞は、レプチン、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、またはその組合せを含む。別の例では、脂肪細胞は、褐色脂肪細胞を含み、褐色脂肪細胞は、Ｕｃｐ１、ＣＩＤＥＡ、ＰＲＤＭ１６、Ｚｉｃ１、Ｌｈｘ８、Ｅｖａ１、Ｅｐｓｔｉ１、またはその組合せを含む。別の例では、脂肪細胞は、ベージュ脂肪細胞を含み、ベージュ脂肪細胞は、Ｃｄ１３７、Ｔｍｅｍ２６、Ｔｂｘ１、Ｃｉｔｅｄ１、Ｓｈｏｘ２、またはその組合せを含む。別の例では、脂肪細胞は、ベージュ脂肪細胞前駆体を含み、ベージュ脂肪細胞前駆体は、ＣＤ１３７、ＴＭＥＭ２６、またはその組合せを含む。
【0041】
[0062]別の実施形態では、生産される細胞は、軟骨細胞を含む。軟骨細胞は、アネキシンＡ６、ＣＤ４４、ＣＤ１５１、ＩＴＭ２Ａ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＦｏｘＣ１、ＦｏｘＣ２、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＯＸ９、アグリカン、カテプシンＢ、ＣＨＡＤＬ、コンドロアドヘリン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＶ、ＣＲＴＡＣ１、ＤＳＰＧ３、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、マトリリン－１、マトリリン－３、マトリリン－４、ＭＩＡ、オトラプリン／ＯＴＯＲ、ＵＲＢ、またはその組合せを含んでもよい。
【0042】
[0063]別の実施形態では、生産される細胞は、骨細胞を含む。骨細胞は、前骨芽細胞、骨芽細胞、包埋骨芽細胞、類骨骨芽細胞、骨石灰化骨細胞、または成熟骨細胞を含んでもよい。骨細胞は、ＲＵＮＸ２、ＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＥＰＥ、スクレロスチン、ＣａｐＧ、ＯＲＰ１５０、またはその組合せを含んでもよい。一例では、骨細胞は、前骨芽細胞を含み、前骨芽細胞は、ＲＵＮＸ２を含む。別の例では、骨細胞は、前骨芽細胞を含み、前骨芽細胞は、ＲＵＮＸ２を含む。別の例では、骨細胞は、骨芽細胞を含み、骨芽細胞は、ＲＵＮＸ２およびＯＣＮを含む。別の例では、骨細胞は、包埋骨芽細胞を含み、包埋骨芽細胞は、ＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、およびＣａｐＧを含む。別の例では、骨細胞は、類骨骨細胞または骨石灰化骨細胞を含み、類骨骨細胞または骨石灰化骨細胞は、ＯＣＮ、Ｅ１１、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＥＰＥ、およびＣａｐＧを含む。別の例では、骨細胞は、成熟骨細胞を含み、成熟骨細胞は、ＤＭＰ１、ＰＨＥＸ、ＭＰＥＰ、スクレロスチン、ＣａｐＧ、およびＯＲＰ１５０を含む。
【0043】
[0064]一部の場合、本明細書において開示される細胞は、静脈内的、皮下的、経皮的、吸入的、経口的、筋肉内的、または腫瘍内的に対象に投与される。一部の例では、対象は、哺乳動物である。一部の例では、対象は、霊長類である。一部の例では、対象は、ヒトである。
【0044】
[0065]一部の場合、抗原を担持する標的細胞を殺傷するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書において開示される細胞を投与するステップを含む方法が、本明細書において開示される。一部の例では、抗原を担持する標的細胞は、がん細胞である。一部の例では、がん細胞は、固形腫瘍細胞である。一部の例では、がん細胞は、血液がん細胞である。一部の例では、がん細胞は、膀胱がん細胞、骨肉腫細胞、脳腫瘍細胞、乳がん細胞、結腸直腸がん細胞、食道がん細胞、消化管がん細胞、肝臓がん細胞、肺がん細胞、鼻腔がん細胞、鼻咽頭がん細胞、口腔がん細胞、口腔咽頭がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、胃がん細胞、皮膚がん細胞、甲状腺がん細胞、またはその任意の組合せを含む。一部の場合、がん細胞は、造血悪性腫瘍を含むがん、頭頸部扁平上皮がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、肉腫、黒色腫、膀胱がん、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん（例えば、子宮頸部のがん腫）、結腸直腸がん、食道がん、消化管がん、肝臓がん、肺がん、鼻腔がん、鼻咽頭がん、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、皮膚がん、甲状腺がん、またはその任意の組合せに由来する。がんは、原発性がんを含む。あるいは、がんは、転移性がんを含む。一部の例では、抗原を担持する標的細胞は、病原体である。一部の例では、病原体は、ウイルス、細菌、原生動物、プリオン、真菌、またはその任意の組合せを含む。一部の例では、方法は、抗原を担持する標的細胞の集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％を殺傷する。一部の例では、方法は、抗原を担持する標的細胞の集団の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または１００％を殺傷する。
【0045】
[0066]一部の場合、炎症経路を下方調節するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書において開示される細胞を投与するステップを含む方法が、本明細書において開示される。一部の場合、方法は、移植片拒絶、感染、感染と関連する内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、多発性硬化症、強直性脊椎炎、皮膚筋炎、ブドウ膜炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病関節炎、髄膜脳炎、中枢および末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、膵炎、手術に由来する外傷、移植片対宿主疾患、心疾患、骨吸収、熱傷患者、心筋梗塞、パジェット病、骨粗鬆症、敗血症、肝もしくは肺線維症、歯周炎、または低塩酸症を含む疾患または状態を処置する。一部の例では、方法は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発筋炎、慢性活動性肝炎、混合結合組織疾患、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性アジソン病、白斑、グルテン感受性腸疾患、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー病、水疱性類天疱瘡、円板状ループス、潰瘍性大腸炎、デンスデポジット病、炎症性腸疾患、乾癬、またはその任意の組合せを含む自己免疫疾患を処置する。一部の例では、方法は、１型糖尿病を処置する。一部の例では、方法は、移植片拒絶を改善する。
【0046】
[0067]別の態様では、対象における状態を処置する方法であって、細胞を対象（例えば、対象の肝臓）に生着させるために有効な量の、本明細書に記載の細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において開示される。一部の例では、細胞は、薬学的に許容される担体中で投与される。一部の例では、薬学的に許容される担体は、生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、またはウシ胎仔血清を含む。一部の例では、細胞は、１ｍｌあたり約１ｘ１０６～約１００ｘ１０６個の細胞、１ｍｌあたり約１ｘ１０６～約２５０ｘ１０６個の細胞、約１ｘ１０６～約５００ｘ１０６個の細胞、または約１０ｘ１０６～約４０ｘ１０６個の細胞を含有する懸濁液中で投与される。一部の例では、細胞は、約１～５ｍｌ、１～１０ｍｌ、１～５０ｍｌ、１～１００ｍｌ、または１０～１５０ｍｌの体積で投与される。一部の例では、対象は、ヒトである。一部の例では、投与は、注射、例えば、静脈内注射を含む。一部の例では、注射は、肝静脈で投与される。一部の例では、注射は、肝動脈で投与される。一部の例では、状態は、肝臓関連疾患または障害、例えば、急性肝疾患である。一部の例では、状態は、肝不全である。一部の例では、肝臓関連疾患または障害は、アラジール症候群、アルファ１アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、良性肝臓腫瘍、胆管閉鎖症、肝硬変、肝臓の嚢胞性疾患、アルコール関連肝疾患および非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を含む脂肪肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（必要に応じて、急性妊娠脂肪肝、妊娠性肝内胆汁鬱滞症、妊娠高血圧腎症、またはＨＥＬＬＰ症候群（例えば、溶血、肝機能検査高値、血小板減少））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、１型糖原病、チロシン血症、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、またはその任意の組合せを含む。
【0047】
[0068]本明細書において開示される細胞の投与様式としては、限定されるものではないが、全身静脈内注入および意図される活動部位への直接注入（例えば、内視鏡逆行性注入）が挙げられる。調製物を、任意の都合のよい経路によって、例えば、輸注またはボーラス注入によって投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与することができる。一部の例では、投与は、全身性局部投与である。
【0048】
[0069]一部の態様では、本明細書において開示される細胞を対象に移植するための組成物および方法が、本明細書に提供される。一部の例では、対象は、細胞によって注入される（例えば、静脈内、筋肉内、経皮、内視鏡逆行性注入、または腹腔内）。一部の例では、対象は、移植前に免疫抑制剤で処置されない。一部の例では、方法は、患者を、免疫抑制剤、例えば、ＦＫ－５０６、シクロスポリン、または抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５キロダルトンアイソフォーム（ＧＡＤ６５）抗体で処置するステップをさらに含む。
【0049】
[0070]一部の例では、本明細書に記載の細胞は、細胞を特定の組織に標的化するのに好適な送達系によって標的部位（例えば、肝臓の欠陥部分）に送達される。例えば、細胞は、標的部位での細胞の徐放を可能にする送達ビヒクル中に封入される。送達ビヒクルを、それが特定の組織に特異的に標的化されるように改変することができる。標的化される送達系の表面を、様々な方法で改変することができる。リポソーム標的化送達系の場合、脂質基を、リポソームの脂質二重層中に含有させて、標的化リガンドを、リポソーム二重層との安定な会合中に維持することができる。
【0050】
[0071]本明細書に記載の細胞の投与を、必要に応じて、（１）注入される細胞の量を増加もしくは減少させること；（２）注入回数を変化させること；または（３）細胞の送達方法を変化させることによって、個体毎に調整することができる。
【0051】
検出方法
[0072]上記のバイオマーカーの発現または存在を決定するための方法は、当業界で周知であり、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウェスタンブロット、免疫沈降、磁気ビーズ選択、およびこれらの細胞表面マーカーのいずれかを発現する細胞の定量化によって測定することができる。バイオマーカーのＲＮＡ発現レベルを、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｑｔ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンブロット、または他の類似する技術を使用して測定することができる。
[0072]上記のバイオマーカーの発現または存在を決定するための方法は、当業界で周知であり、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウェスタンブロット、免疫沈降、磁気ビーズ選択、およびこれらの細胞表面マーカーのいずれかを発現する細胞の定量化によって測定することができる。バイオマーカーのＲＮＡ発現レベルを、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｑｔ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンブロット、または他の類似する技術を使用して測定することができる。
【0052】
[0073]「発現を検出すること」または「発現レベル」を検出することは、生体試料中のバイオマーカータンパク質または遺伝子の発現レベルまたは存在を決定することを意図する。かくして、「発現を検出すること」は、バイオマーカーが発現されない、検出可能に発現されない、低レベルで発現される、正常レベルで発現される、または過剰発現されると決定される場合の例を包含する。
【0053】
[0074]一部の例では、本明細書に記載のバイオマーカーの発現または存在は、例えば、免疫組織化学技術またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＲＴ－ＰＣＲなどの核酸に基づく技術を使用して、核酸レベルで決定される。一部の例では、１つまたは複数のバイオマーカーの発現または存在は、核酸増幅のための手段、核酸配列決定のための手段、核酸マイクロアレイ（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を利用する手段、または特異的に標識されたプローブを使用するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための手段によって実行される。
【0054】
[0075]一部の例では、バイオマーカーの発現または存在の決定は、ゲル電気泳動によって実行される。一部の例では、決定は、膜への移行および特異的プローブとのハイブリダイゼーションによって実行される。一部の例では、バイオマーカーの発現または存在の決定は、診断イメージング技術によって実行される。一部の例では、バイオマーカーの発現または存在の決定は、検出可能な固体基質によって実行される。一部の例では、検出可能な固体基質は、抗体で機能化された常磁性ナノ粒子である。
【0055】
[0076]一部の例では、バイオマーカーの発現または存在は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）レベルである。一部の例では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）レベルを検出する技術としては、限定されるものではないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイが挙げられる。
【0056】
[0077]ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡと、検出される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子（プローブ）とを接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、完全長ｃＤＮＡ、または少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、もしくは５００ヌクレオチド長であり、本明細書に記載のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどの、その一部を含む。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、バイオマーカーまたは他の目的の標的タンパク質が発現されることを示す。
【0057】
[0078]一部の例では、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上に流すこと、およびｍＲＮＡをゲルから膜、例えば、ニトロセルロースに移行させることによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。一部の例では、プローブを固体表面上に固定化し、例えば、遺伝子チップアレイにおいてｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者であれば、バイオマーカーまたは他の目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するのに使用するための公知のｍＲＮＡ検出法を容易に適合させることができる。
【0058】
[0079]試料中の目的のｍＲＮＡのレベルを決定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、自己持続性配列複製、転写増幅系、Ｑ－ベータレプリカーゼ、ローリングサークル複製または他の任意の核酸増幅法による核酸増幅のプロセス、次いで、当業者には周知の技術を使用する増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、そのような分子が、極めて少数で存在する場合には、核酸分子の検出のために特に有用である。一部の例では、バイオマーカー発現は、定量的蛍光Ｔ－ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）システム）によって評価される。
【0059】
[0080]目的のＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（例えば、ノーザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析において使用されるものなど）、またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズまたはファイバー（または結合している核酸を含む任意の固相支持体）を使用してモニタリングされる。発現の検出はまた、溶液中の核酸プローブを使用することも含む。
【0060】
[0081]一部の例では、１つまたは複数のバイオマーカーの発現または存在を決定するために、マイクロアレイが使用される。核酸マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時的測定のための１つの方法を提供する。それぞれのアレイは、固相支持体に結合した捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡを、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズさせた後、レーザー走査によって検出し、アレイ上の各プローブに関するハイブリダイゼーション強度を決定し、相対的遺伝子発現レベルを表す定量値に変換する。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡに関する遺伝子発現プロファイルを決定するために特に有用である。
【0061】
[0082]一部の例では、アレイは、実質的に任意の形状の表面またはさらには、多数の表面上で製造される。一部の例では、アレイは、平面アレイ表面である。一部の例では、アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどのファイバー、ガラスまたは他の任意の適切な基質上にペプチドまたは核酸を含む。一部の例では、アレイは、診断または包括的デバイスの他の操作を可能にする様式で包装される。
【0062】
[0083]一部の例では、本明細書に記載のバイオマーカーの発現または存在は、例えば、特異的バイオマーカータンパク質に対する抗体を使用して、タンパク質レベルで決定される。これらの抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、多重化技術、免疫沈降、または免疫組織化学技術などの種々の方法において使用される。一部の例では、バイオマーカーの検出は、ＥＬＩＳＡによって達成される。一部の例では、バイオマーカーの検出は、電気化学発光（ＥＣＬ）によって達成される。
【0063】
[0084]生体試料中のバイオマーカーを特異的に同定し、定量するための任意の手段が企図される。かくして、一部の例では、生体試料中の目的のバイオマーカータンパク質の発現レベルは、そのバイオマーカータンパク質またはその生物学的に活性なバリアントと特異的に相互作用することができる結合タンパク質によって検出される。一部の例では、標識された抗体、その結合部分、または他の結合パートナーが使用される。本明細書で使用される場合の単語「標識」とは、「標識された」抗体を生成するために抗体に直接または間接にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。一部の例では、標識は、それ自体で検出可能である（例えば、放射性アイソトープ標識もしくは蛍光標識）か、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学変化を触媒する。
【0064】
[0085]バイオマーカータンパク質の検出のための抗体は、元来、単クローン性もしくは多クローン性のいずれかであるか、または合成もしくは組換えにより生産される。複合体化したタンパク質の量、例えば、結合タンパク質、例えば、バイオマーカータンパク質に特異的に結合する抗体と会合したバイオマーカータンパク質の量は、当業者には公知の標準的なタンパク質検出法を使用して決定される。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコールの詳細な概説は、当業界におけるいくつかの教科書に見出される。
【0065】
[0086]抗体を標識するために使用されるマーカーの選択は、適用に応じて変化するであろう。しかしながら、マーカーの選択は、当業者には容易に決定可能である。これらの標識された抗体は、目的の任意のバイオマーカーまたはタンパク質の存在を検出するためにイムノアッセイならびに組織学的適用において使用される。標識された抗体は、多クローン性または単クローン性のいずれかである。さらに、目的のタンパク質を検出するのに使用するための抗体は、放射性原子、酵素、発色もしくは蛍光部分、または本明細書の他の箇所に記載される比色タグを用いて標識される。タグ付けする標識の選択も、所望の検出限界に依存するであろう。酵素アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）は、典型的には、酵素タグ付き複合体の酵素基質との相互作用によって形成される着色生成物の検出を可能にする。検出可能な標識として働く放射性核種としては、例えば、１－１３１、１－１２３、１－１２５、Ｙ－９０、Ｒｅ－１８８、Ａｔ－２１１、Ｃｕ－６７、Ｂｉ－２１２、およびＰｄ－１０９が挙げられる。検出可能な標識として働く酵素の例としては、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。発色部分としては、限定されるものではないが、フルオレセインおよびローダミンが挙げられる。抗体は、当業界で公知の方法によってこれらの標識にコンジュゲートされる。例えば、酵素および発色部分は、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのカップリング剤によって抗体にコンジュゲートされる。あるいは、コンジュゲーションは、リガンド－受容体対によって生じる。好適なリガンド－受容体対の例としては、限定されるものではないが、ビオチン－アビジンまたはビオチン－ストレプトアビジン、および抗体－抗原が挙げられる。
【0066】
[0087]一部の例では、生体試料内での１つまたは複数のバイオマーカーまたは他の目的のタンパク質の発現または存在は、ラジオイムノアッセイもしくは酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合的結合酵素結合イムノアッセイ、ドットブロット、ウェスタンブロット、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー、または当業界で公知の他のアッセイによって決定される。かくして、検出アッセイは、限定されるものではないが、イムノブロッティング、免疫拡散、免疫電気泳動、および免疫沈降などのステップを含む。
【0067】
細胞を取得する方法
[0088]一部の場合、胚外哺乳動物幹細胞（例えば、栄養膜幹細胞）は、本明細書において開示される致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）を作製するための供給源細胞であってもよい。一部の例では、哺乳動物幹細胞は、胚を阻害も破壊もしない様式で、羊水、羊膜、ホウォートンゼリー、絨毛膜絨毛、または子宮外妊娠から単離される。
[0088]一部の場合、胚外哺乳動物幹細胞（例えば、栄養膜幹細胞）は、本明細書において開示される致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）を作製するための供給源細胞であってもよい。一部の例では、哺乳動物幹細胞は、胚を阻害も破壊もしない様式で、羊水、羊膜、ホウォートンゼリー、絨毛膜絨毛、または子宮外妊娠から単離される。
【0068】
[0089]一部の例では、ＭＰＳＣは、抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、またはその任意の組合せを含まない培養培地中で取得される。一部の例では、哺乳動物幹細胞を取得するための培養培地は、レチノイン酸を含まない。一部の例では、哺乳動物幹細胞を取得および／または継代する培養培地は、メルカプトエタノール、ニコチンアミド、またはその組合せを含まない。一部の例では、哺乳動物幹細胞を取得および／または継代する培養培地は、デキサメタゾン、組換えヒトオンコスタチンＭ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ、またはその任意の組合せを含まない。一部の例では、哺乳動物幹細胞を取得および／または継代する培養培地は、ゼノフリーである、例えば、動物成分を含まない。一部の例では、哺乳動物幹細胞を取得および／または継代する培養培地は、ヒト由来成分および動物由来成分を含まない、例えば、既知組成培地である。一部の例では、哺乳動物幹細胞を取得および／または継代する培養培地は、血清を含まない。一部の例では、哺乳動物幹細胞を取得および／または継代する培養培地は、ウシ胎仔血清を含まない。
【0069】
[0090]一部の場合、本開示は、本明細書において開示されるＭＰＳＣの集団を増殖させる方法であって、培養培地中に約１，０００～約５，０００細胞／ｃｍ２の密度でＭＰＳＣの継代培養物を播種するステップ、および細胞を培養するステップを含む、方法を提供する。
【0070】
[0091]一部の態様では、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、培養培地中に約１，０００～約５，０００細胞／ｃｍ２の密度でＭＰＳＣの継代培養物を播種するステップ、および細胞を培養するステップを含み、ＭＰＳＣの集団が、ＨＬＡ－Ｇおよびインスリンを発現する、方法が本明細書において開示される。一部の例では、培養培地は、動物成分を含まない。一部の例では、培養培地は、血清、例えば、ウシ胎仔血清を含まない。一部の例では、細胞は、約３日間培養される。一部の例では、細胞は、約４日間培養される。一部の例では、ＭＰＳＣは、約２，０００～約４，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。
【0071】
[0092]一部の例では、哺乳動物幹細胞を、羊水穿刺生検または羊水から単離することができる。一例では、羊水穿刺は、妊娠中の胎児を取り囲む少量の羊水試料を取得するために使用される手順であってよい。一例では、羊水穿刺は、染色体異常のリスクが高い妊娠第１５週～２０週の間の女性、例えば、出産時に３５歳を超える女性、または染色体異常もしくは神経管欠損のリスクが高いことを示す異常な母体血清（血液）スクリーニング検査値を有していた女性に提示することができる。一例では、針、例えば、長く、薄い、中空の針を、腹部を通って子宮および羊膜嚢に超音波ガイドを用いて使用することができる。所定量の羊水、例えば、２８．３５ｇ（１オンス）を、注射筒中に引き出すことができる。
【0072】
[0093]一部の例では、本明細書における哺乳動物幹細胞を、例えば、体外受精（ＩＶＦ）などの生殖療法と併せた、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）中の割球生検から取得することができる。一例では、本明細書における細胞を、残りの胚盤胞が埋め込まれ、妊娠、後に、生児出生をもたらし、例えば、透明帯を胚盤胞から除去した後、胚盤胞を生検する、胚盤胞の生検のための方法によって生産することができる。
【0073】
[0094]一部の例では、本明細書における哺乳動物幹細胞を、出生前の絨毛採取（ＣＶＳ）から取得することができる。一例では、ＣＶＳは、染色体異常およびある特定の他の遺伝的問題に関して検査するために胎盤から組織試料を採取することを含む出生前検査であってもよい。一例では、ＣＶＳを、妊娠第１０週～１２週の間に実施することができる。一例では、ＣＶＳ手順は、経頸管的であり、例えば、カテーテルを、子宮頸部を通して胎盤中に挿入して、組織試料を取得する。一例では、ＣＶＳ手順は、経腹的であり、例えば、針を、腹部および子宮を通して胎盤中に挿入して、組織試料を取得する。
【0074】
[0095]一部の例では、本明細書における哺乳動物幹細胞を、妊娠初期の絨毛採取（例えば、妊娠期間の第８＋３～１２＋０週）または帝王切開出産に由来する満期胎盤から単離することができる。絨毛組織は、羊膜から分離し、細分し、および／または酵素消化することができる（例えば、約３ｍｌのＴＲＹＰＬＥ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅを用いて、例えば、約１５ｍｉｎ消化する）。続いて、細胞を遠心分離し（例えば、約１５０ｘｇ＋／－１０％で、例えば、約５ｍｉｎ）、計数し、および／または培地（例えば、ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔもしくはＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｉｔを含むα－ＭＥＭ）中に再播種することができる（例えば、１ｃｍ２あたり約１００個の細胞）。一例では、単離された細胞は、プラスチック接着性であってもよい。一例では、細胞を、約４～約８回の継代で使用することができる。
【0075】
[0096]一部の例では、絨毛膜絨毛を、子宮外妊娠した女性（例えば、妊娠期間：受精後、約５～約８週、約６～約８週、または約４～約８週）における未破裂着床前の胚の卵管から取得することができる。微量の絨毛組織を、好適な培地（例えば、無血清α－ＭＥＭ）中でよく細分し、顕微鏡下で同定した後、一定時間（例えば、約１５ｍｉｎ）にわたってトリプシン処理（例えば、約３ｍｌのＴＲＹＰＬＥ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅを用いる）し、培地（例えば、ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔまたはＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｉｔを含むα－ＭＥＭ）を添加して、反応を停止させることができる。接着細胞を取得し、好適な条件下で培養することができる（例えば、ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔまたはＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｉｔを含む条件化α－ＭＥＭ中、５％ＣＯ２中で３７℃にて）。
【0076】
キット／製品
[0097]本明細書に記載の１つまたは複数の方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製品が、本明細書において開示される。そのようなキットは、それぞれの容器が、本明細書に記載の方法において使用される別々の要素の１つを含む、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を受け取るように区画化された担体、パッケージ、または容器を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射筒、試験管などが挙げられる。一部の例では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
[0097]本明細書に記載の１つまたは複数の方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製品が、本明細書において開示される。そのようなキットは、それぞれの容器が、本明細書に記載の方法において使用される別々の要素の１つを含む、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を受け取るように区画化された担体、パッケージ、または容器を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射筒、試験管などが挙げられる。一部の例では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
【0077】
[0098]本明細書に提供される製品は、包装材料を含有する。薬学的包装材料の例としては、限定されるものではないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される製剤および意図される使用様式にとって好適な任意の包装材料が挙げられる。
【0078】
[0099]例えば、容器は、必要に応じて、本明細書において開示される組成物中の、細胞を含む。そのようなキットは、必要に応じて、本明細書に記載の方法におけるその使用に関する識別明細書またはラベルまたは指示書を含む。
【0079】
[00100]キットは、典型的には、内容物および／または使用説明書を列挙するラベル、ならびに使用説明書を含む添付文書を含む。典型的には、指示書のセットもまた含まれるであろう。
【0080】
[00101]一部の例では、ラベルは、容器上にあるか、または容器と結合している。一部の例では、ラベルは、ラベルを形成する文字、数字または他の符号が容器自体に取り付けられ、成型されるか、またはエッチングされている場合、容器上にある；ラベルは、それが例えば、添付文書として、容器をも保持するレセプタクルまたはキャリア内に存在する場合、容器と結合している。一部の例では、ラベルは、内容物が特定の治療適用のために使用されることを示すために使用される。ラベルはまた、本明細書に記載の方法などにおける、内容物の使用のための指示も示す。
【0081】
薬剤、組成物、およびその使用
[00102]本明細書に記載の方法によって生産される細胞を含む組成物（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物、医薬組成物など）および薬剤が、本明細書において開示される。必要に応じた薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））と共に所望の純度を有する組成物または薬剤を、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で調製することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と合わせたとき、成分に生物活性を保持させ、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例としては、限定されるものではないが、任意の標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々な型の湿潤剤などが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照されたい）。
[00102]本明細書に記載の方法によって生産される細胞を含む組成物（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物、医薬組成物など）および薬剤が、本明細書において開示される。必要に応じた薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））と共に所望の純度を有する組成物または薬剤を、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で調製することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と合わせたとき、成分に生物活性を保持させ、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例としては、限定されるものではないが、任意の標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々な型の湿潤剤などが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照されたい）。
【0082】
[00103]許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって無毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸など；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含んでもよい。
【0083】
[00104]ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養またはアッセイのための本明細書に記載の生産される細胞の使用が、本明細書に記載される。例えば、細胞は、免疫蛍光または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイにおける使用のためのものであってよい。一部の例では、生産される細胞は、神経幹細胞（ＮＣＳ）、膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）、外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞、肝細胞、または肝前駆細胞であってもよい。
【0084】
[00105]安全性および有効性について新規薬物を試験するための本明細書に記載の方法によって生産された神経幹細胞（ＮＳＣ）の使用が、本明細書に記載される。例えば、試験薬剤を、生産される細胞を含む培養物と接触させ、効果を決定することができる。試験薬剤が細胞に対して毒性である場合、培養物の増殖は減少し得る、および／または死滅し得る。試験薬剤が有効である場合、培養物の増殖は増加し得る。神経幹細胞の場合、試験薬剤は、運動ニューロンの産生を誘導してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで運動ニューロンを生産するための本明細書に記載の方法によって生産された神経幹細胞（ＮＳＣ）の使用が、本明細書に記載される。運動ニューロン疾患の処置のための薬剤の製造における本明細書に記載の方法によって生産された神経幹細胞（ＮＳＣ）の使用が、本明細書に記載される。脊髄損傷の処置のための薬剤の製造における本明細書に記載の方法によって生産された神経幹細胞（ＮＳＣ）の使用が、本明細書に記載される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで人工組織または臓器を生産するための本明細書に記載の方法によって生産された神経幹細胞（ＮＳＣ）の使用が、本明細書に記載される。
【0085】
[00106]安全性および有効性について新規薬物を試験するための本明細書に記載の方法によって生産された膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）の使用が、本明細書に記載される。例えば、試験薬剤を、生産される細胞を含む培養物と接触させ、効果を決定することができる。試験薬剤が細胞に対して毒性である場合、培養物の増殖は減少し得る、および／または死滅し得る。試験薬剤が有効である場合、培養物の増殖は増加し得る。ＰＰＣの場合、試験薬剤は、内分泌細胞および／または外分泌細胞の産生を誘導してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで内分泌細胞および／または外分泌細胞を生産するための本明細書に記載の方法によって生産されたＰＰＣの使用が、本明細書に記載される。膵外傷によって引き起こされる疾患または障害の処置のための薬剤の製造における本明細書に記載の方法によって生産されたＰＰＣの使用が、本明細書に記載される。膵外傷の処置のための薬剤の製造における本明細書に記載の方法によって生産されたＰＰＣの使用が、本明細書に記載される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで人工組織または臓器（例えば、膵臓）を生産するための本明細書に記載の方法によって生産されたＰＰＣの使用が、本明細書に記載される。
【実施例】
【0086】
[00107]本出願は、本出願の例示的実施形態として提供される、以下の非限定例を参照することによってより良く理解することができる。以下の実施例は、実施形態をより完全に例示するために提示されるものであるが、いかなる意味でも本出願の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0087】
実施例１：ＭＰＳＣは８９の集団倍加に達した
[00108]胚外幹細胞（例えば、栄養膜幹細胞）は、供給源細胞としてのヒトドナーに由来した。以下の表１に示されるように、いくつかの非限定的な培養培地を試験して、細胞を培養し、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）に増殖させた。
[00108]胚外幹細胞（例えば、栄養膜幹細胞）は、供給源細胞としてのヒトドナーに由来した。以下の表１に示されるように、いくつかの非限定的な培養培地を試験して、細胞を培養し、致死性多能性幹細胞（ＭＰＳＣ）に増殖させた。
【0088】
【表1】
【0089】
[00110]播種密度を１０，０００細胞／ｃｍ２から２，０００～４，０００細胞／ｃｍ２に低下させると、ＭＰＳＣの集団倍加数が改善された。３０００～５０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した細胞の３日の継代培養物は、同様の数のＰＤを生成する。４０００／３０００細胞／ｃｍ２で播種した細胞の交互の３日／４日の継代培養物は、より早い継代に関して４０００細胞／ｃｍ２での３日の継代培養と類似する数のＰＤを生成する。培養環境は、２１％Ｏ２／％ＣＯ２、または２％Ｏ２／５％ＣＯ２／９３％Ｎ２であってよい。
【0090】
[00111]９０日、すなわち、３日間の継代培養の３０回継代を超える増殖結果の一部を図１に示し、これは、９０日の時間枠での集団倍加（ＰＤ）によって測定されたＭＰＳＣの３日間の継代培養の増殖曲線を示す折れ線グラフである。ＭＰＳＣは、約１２日までに最大で２５ＰＤ、約３０日までに最大で５０ＰＤ、約６３日までに最大で７５ＰＤ、約９０日までに最大で８９ＰＤに達した。
【0091】
[00112]ＭＰＳＣは、ゼノフリー培地中で培養した場合、約２７時間の倍加時間で約７０～８０倍加する延長された集団倍加能力を有する。細胞が集団中で倍加するには、平均で約２７時間かかり、これを、式Ｔ＝ｔｄ／ｌｏｇ２［（２－ｙ）／（１－ｙ）］（式中、Ｔは細胞周期の持続期間であり、ｔｄは細胞数が２倍になるのにかかる平均時間であり、ｙはＧ０期にある細胞の割合である）を用いて算出することができる。
【0092】
[00113]この延長された倍加能力は、ＭＰＳＣを、産業規模での拡大のための理想的な細胞集団にし、ドナーまたは生物資源からの反復的単離の必要性を除去する。ＭＰＳＣの大きいバッチサイズ能力は、複数の細胞バンクと関連する生成物の変動性ならびに異なるドナーから同等の生成物を製造し、発売する費用を低減させることによって、治療剤の開発および製造を合理化し、診療所における幹細胞に基づく治療剤の実現を促進する、単一の起源から十分なＭＰＳＣを生成するであろう。
【0093】
実施例２：ＭＰＳＣは染色体異常を有しない
[00114]図２Ａ～２Ｄは、異なる集団倍加に由来する４つの異なるＭＰＳＣ試料のＫＡＲＹＯＳＴＡＴ（商標）の全ゲノムビューを示す。ＫＡＲＹＯＳＴＡＴ（商標）アッセイは、染色体異常のデジタル画像化を可能にすることができる。検出することができる構造異常のサイズは、染色体増加については約２Ｍｂ（メガベース）を超え、染色体消失については約１Ｍｂを超える。ゲノムＤＮＡを細胞から精製し、ゲノムＤＮＡをＫＡＲＹＯＴＡＴＥ（商標）のためにＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）に添加した。ＧＥＮＥＣＣＨＩＰ（登録商標）は、染色体のコピー数バリアントを決定することができる。図２Ａ～２Ｄは、１つの枠内に全ての体細胞染色体および性染色体を示す全ゲノムビューを示す。図２Ａは、１６．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料であり、図２Ｂは、４４．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料であり、図２Ｃは、６２．６の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料であり、図２Ｄは、７１．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣである。平滑シグナルプロット（右側のｙ軸）は、マイクロアレイ上のプローブのシグナル強度を描写するｌｏｇ２比の平滑化である。２の値は、正常なコピー数状態を表してもよい（ＣＮ＝２）。３の値は、染色体増加を表してもよい（ＣＮ＝３）。１の値は、染色体消失を表してもよい（ＣＮ＝１）。灰色のシグナルは、それぞれ個々の染色体プローブに関する生のシグナルを示すが、黒色のシグナルは、コピー数および異常（もしあれば）を同定するために使用される正規化されたプローブシグナルを表す。観察可能な染色体異常は、図２Ａ～Ｄにおいては見られなかった。ＭＰＳＣ細胞は、染色体異常を示さずに複数の集団倍加を経ることができる。例えば、単クローン集団を拡大した後、将来の使用のために凍結することができる。単クローンの凍結保存培養物から細胞を増殖させたら、それらを、実質的な染色体異常なしに拡大することができる。ＭＰＣＳの染色体安定性は、不死性と関連する遺伝子異常または突然変異を示すことが多いヒト胚性幹細胞およびｉＰＳＣを超える別の利点を提供する。
[00114]図２Ａ～２Ｄは、異なる集団倍加に由来する４つの異なるＭＰＳＣ試料のＫＡＲＹＯＳＴＡＴ（商標）の全ゲノムビューを示す。ＫＡＲＹＯＳＴＡＴ（商標）アッセイは、染色体異常のデジタル画像化を可能にすることができる。検出することができる構造異常のサイズは、染色体増加については約２Ｍｂ（メガベース）を超え、染色体消失については約１Ｍｂを超える。ゲノムＤＮＡを細胞から精製し、ゲノムＤＮＡをＫＡＲＹＯＴＡＴＥ（商標）のためにＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）に添加した。ＧＥＮＥＣＣＨＩＰ（登録商標）は、染色体のコピー数バリアントを決定することができる。図２Ａ～２Ｄは、１つの枠内に全ての体細胞染色体および性染色体を示す全ゲノムビューを示す。図２Ａは、１６．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料であり、図２Ｂは、４４．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料であり、図２Ｃは、６２．６の集団倍加に由来するＭＰＳＣ試料であり、図２Ｄは、７１．５の集団倍加に由来するＭＰＳＣである。平滑シグナルプロット（右側のｙ軸）は、マイクロアレイ上のプローブのシグナル強度を描写するｌｏｇ２比の平滑化である。２の値は、正常なコピー数状態を表してもよい（ＣＮ＝２）。３の値は、染色体増加を表してもよい（ＣＮ＝３）。１の値は、染色体消失を表してもよい（ＣＮ＝１）。灰色のシグナルは、それぞれ個々の染色体プローブに関する生のシグナルを示すが、黒色のシグナルは、コピー数および異常（もしあれば）を同定するために使用される正規化されたプローブシグナルを表す。観察可能な染色体異常は、図２Ａ～Ｄにおいては見られなかった。ＭＰＳＣ細胞は、染色体異常を示さずに複数の集団倍加を経ることができる。例えば、単クローン集団を拡大した後、将来の使用のために凍結することができる。単クローンの凍結保存培養物から細胞を増殖させたら、それらを、実質的な染色体異常なしに拡大することができる。ＭＰＣＳの染色体安定性は、不死性と関連する遺伝子異常または突然変異を示すことが多いヒト胚性幹細胞およびｉＰＳＣを超える別の利点を提供する。
【0094】
実施例３：特異的分子バイオマーカーを発現することによるＭＰＳＣの特性評価
[00115]ＭＰＳＣは、免疫特権マーカーであるＨＬＡ－Ｇを発現する。成人または出生後ヒト間葉系間質細胞と違って、本明細書におけるＭＰＳＣは、白血球上のＨＬＡ－Ｇ受容体に結合して、活性化Ｔ細胞におけるアポトーシスの誘発、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞の活性のモジュレーション、ならびにＴ細胞増殖の阻害を含む、いくつかの機構によって免疫機能を抑制する、胎盤にしかない主要組織適合複合体クラスＩ抗原であるヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）を発現する。図３を参照すると、この図面は、一次抗体４Ｈ８４で染色されたＭＰＳＣを示す。図３について、ＭＰＳＣを、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（登録商標）ＡＣＦ Ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｕｍ中での培養物から収集した。細胞を、フローサイトメトリー洗浄緩衝剤（塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを実質的に含まないＧｉｂｃｏ ＤＰＢＳ、約２％ウシ胎仔血清および約０．１％アジ化ナトリウム）中に再懸濁し、試料あたり約０．２５～０．５ｘ１０６個の細胞からフローサイトメトリー管中にアリコートし、細胞を遠心分離した。細胞を、室温で約１５ｍｉｎにわたって４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定した。一部の例では、固定後、細胞を、約５００μｌ（マイクロリットル）の冷Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理した後、細胞を氷上でインキュベートした。透過処理により、細胞内物質を染色することが可能となった。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー洗浄緩衝剤で洗浄し、遠心分離し、フローサイトメトリー染色緩衝剤（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁した。ＨＬＡ－Ｇ一次抗体（例えば、４Ｈ８４抗体）の希釈物を細胞に添加し、室温でインキュベートしたとき、一次抗体染色が起こった。細胞を、フローサイトメトリー洗浄緩衝剤で数回洗浄した。一次抗体が細胞に結合した後、二次抗体を添加した。二次抗体手順を暗室中で行った。二次抗体を、約１：２０００の希釈率でフローサイトメトリー染色緩衝剤中に添加した。細胞を、約１００μｌの希釈された二次抗体溶液中に再懸濁し、約３０分間インキュベートした。細胞を、フローサイトメトリー洗浄緩衝剤中で数回洗浄した。細胞を洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー染色緩衝剤中に再懸濁して、約０．５ｘ１０６個の細胞の濃度にした。細胞を再懸濁した後、細胞をフローサイトメトリーによって試料採取した。一次抗体ＭＥＭ－Ｇ／１１は、膜結合型であるＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームを認識することができる。一次抗体４Ｈ８４抗体は、ＨＬＡ－Ｇの７つのアイソフォームのアルファドメインを認識することができる。図３は、透過処理され、一次抗体ＨＬＡ－Ｇ ４Ｈ８４で染色されたＭＰＳＣを示す。染色は、ＭＰＳＣ中または上でのＨＬＡ－Ｇアイソフォームの存在を示す。染色は、１：５０の一次抗体希釈率で約７６％の細胞が、アイソタイプ対照と比較して陽性であったことを示す。図４は、一次抗体４Ｈ８４（下パネル）および一次アイソタイプ対照抗体マウスＩｇＧ１（上パネル）で染色した細胞を示す。細胞は、ＩｇＧ１抗体について限定された染色を示し、９９．６４％の事象が４Ｈ８４抗体で染色されたが、これは、この抗体がＭＰＳＣに特異的であることを示す。図３に示されるＭＰＳＣ中でのＨＬＡ－Ｇの発現により、細胞は免疫特権部位、例えば、胎児に対するアクセスを有することができる。
[00115]ＭＰＳＣは、免疫特権マーカーであるＨＬＡ－Ｇを発現する。成人または出生後ヒト間葉系間質細胞と違って、本明細書におけるＭＰＳＣは、白血球上のＨＬＡ－Ｇ受容体に結合して、活性化Ｔ細胞におけるアポトーシスの誘発、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞の活性のモジュレーション、ならびにＴ細胞増殖の阻害を含む、いくつかの機構によって免疫機能を抑制する、胎盤にしかない主要組織適合複合体クラスＩ抗原であるヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）を発現する。図３を参照すると、この図面は、一次抗体４Ｈ８４で染色されたＭＰＳＣを示す。図３について、ＭＰＳＣを、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（登録商標）ＡＣＦ Ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｕｍ中での培養物から収集した。細胞を、フローサイトメトリー洗浄緩衝剤（塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを実質的に含まないＧｉｂｃｏ ＤＰＢＳ、約２％ウシ胎仔血清および約０．１％アジ化ナトリウム）中に再懸濁し、試料あたり約０．２５～０．５ｘ１０６個の細胞からフローサイトメトリー管中にアリコートし、細胞を遠心分離した。細胞を、室温で約１５ｍｉｎにわたって４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定した。一部の例では、固定後、細胞を、約５００μｌ（マイクロリットル）の冷Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理した後、細胞を氷上でインキュベートした。透過処理により、細胞内物質を染色することが可能となった。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー洗浄緩衝剤で洗浄し、遠心分離し、フローサイトメトリー染色緩衝剤（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁した。ＨＬＡ－Ｇ一次抗体（例えば、４Ｈ８４抗体）の希釈物を細胞に添加し、室温でインキュベートしたとき、一次抗体染色が起こった。細胞を、フローサイトメトリー洗浄緩衝剤で数回洗浄した。一次抗体が細胞に結合した後、二次抗体を添加した。二次抗体手順を暗室中で行った。二次抗体を、約１：２０００の希釈率でフローサイトメトリー染色緩衝剤中に添加した。細胞を、約１００μｌの希釈された二次抗体溶液中に再懸濁し、約３０分間インキュベートした。細胞を、フローサイトメトリー洗浄緩衝剤中で数回洗浄した。細胞を洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー染色緩衝剤中に再懸濁して、約０．５ｘ１０６個の細胞の濃度にした。細胞を再懸濁した後、細胞をフローサイトメトリーによって試料採取した。一次抗体ＭＥＭ－Ｇ／１１は、膜結合型であるＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームを認識することができる。一次抗体４Ｈ８４抗体は、ＨＬＡ－Ｇの７つのアイソフォームのアルファドメインを認識することができる。図３は、透過処理され、一次抗体ＨＬＡ－Ｇ ４Ｈ８４で染色されたＭＰＳＣを示す。染色は、ＭＰＳＣ中または上でのＨＬＡ－Ｇアイソフォームの存在を示す。染色は、１：５０の一次抗体希釈率で約７６％の細胞が、アイソタイプ対照と比較して陽性であったことを示す。図４は、一次抗体４Ｈ８４（下パネル）および一次アイソタイプ対照抗体マウスＩｇＧ１（上パネル）で染色した細胞を示す。細胞は、ＩｇＧ１抗体について限定された染色を示し、９９．６４％の事象が４Ｈ８４抗体で染色されたが、これは、この抗体がＭＰＳＣに特異的であることを示す。図３に示されるＭＰＳＣ中でのＨＬＡ－Ｇの発現により、細胞は免疫特権部位、例えば、胎児に対するアクセスを有することができる。
【0095】
[00116]本明細書におけるＭＰＳＣは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、特徴的なマーカーを発現することによって、ヒトＭＳＣの表現型および形態を示した。以下の表２を参照されたい。
【0096】
【表2】
【0097】
[00118]本明細書におけるＭＰＳＣは、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の代替手段としての解決を提供することができる。ヒトＭＳＣは、免疫抑制効果を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで３系列の分化を示し、様々な適応症のために患者に安全に送達されており、自己免疫性肛門周囲瘻孔および移植片対宿主疾患などのニッチな適応症を処置するために認可されている。しかしながら、ＭＳＣに基づく療法の幅広い採用は、細胞老化に達する前の約３０～４０の倍加の集団倍加限界のため、大きいバッチのＭＳＣを製造することができないことによって阻害された。
【0098】
[00119]本明細書におけるＭＰＳＣは、ＦＡＣＳによって測定された場合、ナチュラルキラー細胞表現型を示した。以下の表３を参照されたい。
【0099】
【表3】
【0100】
[00121]ＭＰＳＣは、β－ｈＣＧ、ＨＬＡ－Ｇ、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、およびＣＤＸ２を含む様々な細胞バイオマーカーを免疫細胞化学的に発現した（図５Ａ）。しかしながら、ＭＰＳＣは、増殖マーカーＫｉ－６７、ＨＳＰ７０、腫瘍抑制因子ｐ５３、および細胞間融合タンパク質シンシチンを発現しなかった（図５Ｂ）が、これは、ＭＰＳＣがＴＥ分化栄養膜の第１の位置に立つという概念を支持するものである。具体的には、ＭＰＳＣは、様々な抗体を使用するフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によってＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃならびに表面および細胞内ＨＬＡ－Ｇを発現した（図５Ｃ；図５Ｄ）。しかしながら、それらはＨＬＡ－ＤＲを発現しなかった。
【0101】
[00122]図５Ｄは、ＭＰＳＣ中のＨＬＡ－Ｇアイソフォームの代表的なＦＡＣＳ画像である。Ａｂ ４Ｈ８４を使用することにより、７つ全部のアイソフォームは細胞表面でほとんど検出しなかったが（左上のカラム）、全部のＨＬＡ－Ｇの７つのアイソフォームの６８．７％が透過処理されたＭＰＳＣ中で検出した（左下のカラム）。Ａｂ ＭＥＭ－Ｇ／１１によって、ＨＬＡ－Ｇ Ｇ１は細胞表面でわずかに検出したが（中央上のカラム）、８．１％のＨＬＡ－Ｇ Ｇ１が検出した（中央上のカラム）。同様に、Ａｂ ＭＥＭ－Ｇ９によって、ＨＬＡ－Ｇ Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５は細胞表面で検出したが（右上のカラム）、ＨＬＡ－Ｇはいずれも検出しなかった。
【0102】
[00123]ヒトＭＰＳＣは免疫細胞結合バイオマーカーを示す。細胞を、免疫細胞化学分析およびＦＡＣＳ分析を用いて特性評価した。その結果、ＭＰＳＣは、ＮＫ細胞の分化抗原群（ＣＤ）５６、ＣＤ１６ｄｉｍ、阻害受容体ＫＩＲ２ＤＬ４、ＣＤ１１ｂ、活性化受容体ＮＫｐ４６、およびＣＤ１０（図６Ａ）；Ｔ細胞のＴＣＲ、ＣＤ４９ｆ、ＩＬＴ－４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ９０／Ｔｈｙ－１、ＣＤ４４、およびＣＤ１６６（図６Ｂ）；樹状細胞のＣＤ１９およびＣＤ１４１（図６Ｃおよび６Ｄ）；マクロファージのＣＤ１４（図６Ｅ）；造血幹細胞のＦｌｔ３Ｌ（図６Ｆ）およびＣＤ３４（図６Ｇ）；ならびにリンパ球のＣＤ３８（図６Ｇ）を含む、免疫細胞と結合した様々なバイオマーカーを発現することが示された。続いて、ＭＰＳＣ中でのこれらのバイオマーカーの発現を、ＮＫおよびＴ細胞バイオマーカーの類似するパターンを示す、８つの独立した細胞系を用いて分析したところ、（ＣＤ１６＋ＣＤ５６）＋細胞およびＣＤ１０７（＋）細胞がＭＰＳＣ中で最も高い発現を示した。ＦＡＣＳ分析によると、ＮＫ細胞およびＴ細胞のバイオマーカーは、ＭＰＳＣ中の多くの免疫細胞を占めるが、ＣＤ１０７（＋）ＣＤ（１６＋５６）（＋）細胞およびＣＤ８（＋）ＣＤ（１６＋５６）（＋）細胞が、ＭＰＳＣ中の多くの細胞集団を占めていた。
【0103】
実施例４：ＭＰＳＣの有意な部分は単クローン性である
[00124]ＭＰＳＣ単クローンを、ＭＰＳＣ培養物から取得した。ＭＰＳＣを、倒立顕微鏡上に置いて増殖させて、細胞型を記録した。古い培地を除去し、細胞を、滅菌ＰＢＳで洗浄した。ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）溶液を、ＭＰＳＣ培養物に添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で約６分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を分離した。培養培地を細胞に添加して、ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）反応を停止させた。細胞を収集し、細胞計数器を使用して、細胞数を算出した。約２００個の細胞を取り出し、遠心分離管に入れた。培地を補充し、マルチチャネルピペットを用いて、細胞を９６ウェルプレート中に分割した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２で増殖させ、約１４日間インキュベートした。このプロセス中、２～３日毎に培地を交換した。古い培地を洗浄し、ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）溶液を細胞に添加した。短いインキュベーションの後、培養培地を添加して、ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）反応を停止させ、細胞を６ウェルプレートに移動させて、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。細胞を１００ｍｍ皿中で継代培養し、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させるまで、培養培地を２～３日毎に交換した。培地を２～３日毎に交換した。単クローン細胞が８０～９５％の厚さに達したとき、それらを凍結した。ドナーの異所性組織から、細胞を、細胞と混合した野生型継代として拡大したか、またはそれらを単クローンに拡大した。単クローンを拡大して、複数用量を提供した。例えば、ドナーの異所性組織に由来する１００万個の細胞毎につき、約１２５，０００個の単クローンを培養することができる。それぞれの単クローンは、７ｘ１０２８個の細胞を有する可能性がある。用量あたり１億個の細胞で、それぞれの単クローンは、７ｘ１０２０の用量を作ることができる。収集されるそれぞれの異所性組織に由来する全可能性：１２５，０００ｘ７ｘ１０２０用量＝８．８ｘ１０２５用量。それぞれのＭＰＳＣ単クローンは、完全な製品サイクルを支援することができる。
[00124]ＭＰＳＣ単クローンを、ＭＰＳＣ培養物から取得した。ＭＰＳＣを、倒立顕微鏡上に置いて増殖させて、細胞型を記録した。古い培地を除去し、細胞を、滅菌ＰＢＳで洗浄した。ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）溶液を、ＭＰＳＣ培養物に添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で約６分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を分離した。培養培地を細胞に添加して、ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）反応を停止させた。細胞を収集し、細胞計数器を使用して、細胞数を算出した。約２００個の細胞を取り出し、遠心分離管に入れた。培地を補充し、マルチチャネルピペットを用いて、細胞を９６ウェルプレート中に分割した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２で増殖させ、約１４日間インキュベートした。このプロセス中、２～３日毎に培地を交換した。古い培地を洗浄し、ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）溶液を細胞に添加した。短いインキュベーションの後、培養培地を添加して、ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）反応を停止させ、細胞を６ウェルプレートに移動させて、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。細胞を１００ｍｍ皿中で継代培養し、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させるまで、培養培地を２～３日毎に交換した。培地を２～３日毎に交換した。単クローン細胞が８０～９５％の厚さに達したとき、それらを凍結した。ドナーの異所性組織から、細胞を、細胞と混合した野生型継代として拡大したか、またはそれらを単クローンに拡大した。単クローンを拡大して、複数用量を提供した。例えば、ドナーの異所性組織に由来する１００万個の細胞毎につき、約１２５，０００個の単クローンを培養することができる。それぞれの単クローンは、７ｘ１０２８個の細胞を有する可能性がある。用量あたり１億個の細胞で、それぞれの単クローンは、７ｘ１０２０の用量を作ることができる。収集されるそれぞれの異所性組織に由来する全可能性：１２５，０００ｘ７ｘ１０２０用量＝８．８ｘ１０２５用量。それぞれのＭＰＳＣ単クローンは、完全な製品サイクルを支援することができる。
【0104】
[00125]１Ｍの細胞の全てのバイアルが、潜在的には約１３０，０００個の単クローンをもたらすことができる。以下の表４を参照されたい。
【0105】
【表4】
【0106】
実施例５：ＭＰＣＳは病原体を含まない
[00127]供給源細胞が病原体に感染していたか、または病原体を含まなかったかに関係なく、本明細書で得られるヒトＭＰＣＳは、病原体を含まない。
ＭＰＳＣの９つの細胞系を試験した。ＰＣＲ評価を行って、コリネバクテリウム・ボビス、コリネバクテリウム種（ＨＡＣ２）、ＥＢＶ、ＨＡｄＶ、ハンターンハンタウイルス、ＨＣＭＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＨＶ６、ＨＨＶ８、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ＬＣＭＶ、マイコプラズマ種、ソウルハンタウイルス、シンノンブルハンタウイルス、トレポネマ・パリダム、ＶＺＶを検出した。全ての細胞系が、ｈ－ＩＭＰＡＣＴ Ｉパネルにおいて２５種全ての病原体について陰性であることがわかった。
[00127]供給源細胞が病原体に感染していたか、または病原体を含まなかったかに関係なく、本明細書で得られるヒトＭＰＣＳは、病原体を含まない。
ＭＰＳＣの９つの細胞系を試験した。ＰＣＲ評価を行って、コリネバクテリウム・ボビス、コリネバクテリウム種（ＨＡＣ２）、ＥＢＶ、ＨＡｄＶ、ハンターンハンタウイルス、ＨＣＭＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＨＶ６、ＨＨＶ８、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ＬＣＭＶ、マイコプラズマ種、ソウルハンタウイルス、シンノンブルハンタウイルス、トレポネマ・パリダム、ＶＺＶを検出した。全ての細胞系が、ｈ－ＩＭＰＡＣＴ Ｉパネルにおいて２５種全ての病原体について陰性であることがわかった。
【0107】
実施例６：ＨＬＡ－Ｇ ＦＡＣＳ染色の最適化（表面対細胞内）
[00128]ＭＰＳＣ野生型（ＷＴ）細胞系１（ＭＰＳＣ１）を、栄養培地＋細胞付着基質中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２で１２回継代した。固定および透過処理された細胞を、細胞表面および細胞内染色のために調製した。染色条件は、以下の表５の通りである。
[00128]ＭＰＳＣ野生型（ＷＴ）細胞系１（ＭＰＳＣ１）を、栄養培地＋細胞付着基質中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２で１２回継代した。固定および透過処理された細胞を、細胞表面および細胞内染色のために調製した。染色条件は、以下の表５の通りである。
【0108】
【表5】
【0109】
[00130]一次抗体ヒストグラムの結果を、１：２５、１：５０、１：１００、および１：２００の希釈率について以下の表６に示す。
【0110】
【表6】
【0111】
[00132]一次抗体ドットプロットの結果（Ａ－ＦＬ１対ＳＳＣ）を、１：２５、１：５０、１：１００、および１：２００の希釈率について以下の表７に示す。
【0112】
【表7】
【0113】
[00134]一次抗体ドットプロットの結果（ＦＬ１対ＦＬ２）を、１：２５、１：５０、１：１００、および１：２００の希釈率について以下の表８に示す。
【0114】
【表8】
【0115】
[00136]ＭＰＳＣ１を、栄養培地＋細胞付着基質中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２で７回継代した（１９．８の集団倍加）。固定および透過処理された細胞を、ＨＬＡ－Ｇ ４Ｈ８４抗体およびＨＬＡ－Ｇ ＭＥＭ－Ｇ／１１抗体を用いた細胞表面および細胞内染色のために調製した。表面染色後に固定された細胞を、ＨＬＡ－Ｇ ＭＥＭ－Ｇ／１１抗体を用いて分析した。結果を、以下の表９に示す。
【0116】
【表9】
【0117】
[00138]対照と比較した、ＦＬＡ－Ｇ ４Ｈ８６ドットプロットの結果（ＦＬ１対ＳＳＣ）と共に、ＭＰＳＣ１のＨＬＡ－Ｇ染色を、表１０に示す。
【0118】
【表10】
【0119】
実施例７：発生細胞バンクの生成およびその評価
[00140]４種の胚外幹細胞系（例えば、ヒト栄養膜幹細胞）を、供給源細胞として使用した：致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）、ＭＰＳＣ２、ＭＰＳＣ３、およびＭＰＳＣ４。栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で別々に細胞系を培養することによって、細胞バンクを開発した。細胞の継代培養物を、３０００～４０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３または４日間培養した。試験のエンドポイントは、１０ＰＤ、３５ＰＤ、５５ＰＤ、および７０ＰＤであった。その後、ＦＡＣＳ特性評価、ＭＰＳＣ／ＮＫマーカー、およびＨＬＡ－Ｇによって表現型を評価した。さらに、生産された細胞の機能を評価した。
[00140]４種の胚外幹細胞系（例えば、ヒト栄養膜幹細胞）を、供給源細胞として使用した：致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）、ＭＰＳＣ２、ＭＰＳＣ３、およびＭＰＳＣ４。栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で別々に細胞系を培養することによって、細胞バンクを開発した。細胞の継代培養物を、３０００～４０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３または４日間培養した。試験のエンドポイントは、１０ＰＤ、３５ＰＤ、５５ＰＤ、および７０ＰＤであった。その後、ＦＡＣＳ特性評価、ＭＰＳＣ／ＮＫマーカー、およびＨＬＡ－Ｇによって表現型を評価した。さらに、生産された細胞の機能を評価した。
【0120】
実施例８：ＭＰＳＣ／ＮＫの生産、表現型および機能に関する実験
致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）
[00141]致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ＋細胞付着基質）中で培養し、拡大した。２つの細胞バンク（ＣＢ）を凍結した：ＣＢ２：３１．３ＰＤおよびＣＤ３：５３．１ＰＤ。表現型および機能アッセイを行った。
致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）
[00141]致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ＋細胞付着基質）中で培養し、拡大した。２つの細胞バンク（ＣＢ）を凍結した：ＣＢ２：３１．３ＰＤおよびＣＤ３：５３．１ＰＤ。表現型および機能アッセイを行った。
【0121】
[00142]Ｃ１の特性評価は、以下の通りであった：ＭＰＳＣ１を、機能について評価した（３系列分化およびセクレトーム分析）。
【0122】
[00143]Ｃ２の特性評価は、以下の通りであった：ＭＰＳＣ１ Ｐ１３、４０．３ＰＤを、表現型決定について、および機能（３系列分化およびセクレトーム分析）について、ＭＳＣ／ＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇに関するＦＡＣＳによって評価した。
【0123】
致死性多能性幹細胞系２
[00144]致死性多能性幹細胞系２（ＭＰＳＣ２）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養し、拡大した。３つの細胞バンク（ＣＢ）を凍結した：ＣＢ１：８．１ＰＤ；ＣＢ２：２９．３ＰＤ；およびＣＢ３：４７．４ＰＤ。表現型および機能アッセイを行った。平均倍化時間（Ｐ４～Ｐ６）は、２６．９時間であった。
[00144]致死性多能性幹細胞系２（ＭＰＳＣ２）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養し、拡大した。３つの細胞バンク（ＣＢ）を凍結した：ＣＢ１：８．１ＰＤ；ＣＢ２：２９．３ＰＤ；およびＣＢ３：４７．４ＰＤ。表現型および機能アッセイを行った。平均倍化時間（Ｐ４～Ｐ６）は、２６．９時間であった。
【0124】
[00145]Ｃ１の特性評価は、以下の通りであった：ＭＰＳＣ２継代５（Ｐ５）、１１．２の継代倍加（ＰＤ）を、表現型決定について、および機能（３系列分化およびセクレトーム分析）について、ＭＳＣ／ＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇに関するＦＡＣＳによって評価した。
【0125】
[00146]Ｃ２の特性評価は、以下の通りであった：ＭＰＳＣ２ Ｐ１６、３６．９ＰＤを、表現型決定について、および機能（３系列分化およびセクレトーム分析）について、ＭＳＣ／ＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇに関するＦＡＣＳによって評価した。
【0126】
致死性多能性幹細胞系３
[00147]致死性多能性幹細胞系３（ＭＰＳＣ３）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養し、拡大した。３つの細胞バンク（ＣＢ）を凍結した：ＣＢ１：８．１ＰＤ；ＣＢ２：２５．５ＰＤ；およびＣＢ３：３７．３ＰＤ。表現型および機能アッセイを行った。平均倍化時間（Ｐ４～Ｐ６）は、３２．７時間であった。
[00147]致死性多能性幹細胞系３（ＭＰＳＣ３）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養し、拡大した。３つの細胞バンク（ＣＢ）を凍結した：ＣＢ１：８．１ＰＤ；ＣＢ２：２５．５ＰＤ；およびＣＢ３：３７．３ＰＤ。表現型および機能アッセイを行った。平均倍化時間（Ｐ４～Ｐ６）は、３２．７時間であった。
【0127】
[00148]Ｃ１の特性評価は、以下の通りであった：ＭＰＳＣ３継代５（Ｐ５）、１０．２の継代倍加（ＰＤ）を、表現型決定について、および機能（３系列分化およびセクレトーム分析）について、ＭＳＣ／ＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇに関するＦＡＣＳによって評価した。
【0128】
[00149]Ｃ２の特性評価は、以下の通りであった：ＭＰＳＣ３ Ｐ１８、３３．３ＰＤを、表現型決定について、および機能（３系列分化およびセクレトーム分析）について、ＭＰＳＣ／ＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇに関するＦＡＣＳによって評価した。
【0129】
致死性多能性幹細胞系４
[00150]致死性多能性幹細胞系（ＭＰＳＣ４）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養し、合計約６．５ＰＤにわたって拡大した。細胞を、凍結したか、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）／ナチュラルキラーＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇに関するＦＡＣＳ分析によって特性評価した。Ｐ４～Ｐ５の平均倍化時間は、約４３．７時間であった。
[00150]致死性多能性幹細胞系（ＭＰＳＣ４）を、供給源細胞として使用した。培養物を３０００／４０００細胞／ｃｍ２で播種し、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養し、合計約６．５ＰＤにわたって拡大した。細胞を、凍結したか、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）／ナチュラルキラーＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇに関するＦＡＣＳ分析によって特性評価した。Ｐ４～Ｐ５の平均倍化時間は、約４３．７時間であった。
【0130】
増殖曲線
[00151]４種のＭＰＳＣ細胞系の増殖曲線を、図７に示す。この実験のためのＭＰＳＣ１は、２回の凍結／解凍サイクルを受け、培養物中でのＰＤの最大数をおそらく減少させた。
[00151]４種のＭＰＳＣ細胞系の増殖曲線を、図７に示す。この実験のためのＭＰＳＣ１は、２回の凍結／解凍サイクルを受け、培養物中でのＰＤの最大数をおそらく減少させた。
【0131】
[00152]ＭＰＳＣ１、ＭＰＳＣ２、ＭＰＳＣ３、およびＭＰＳＣ４に関する細胞バンク（ＣＢ）１、２、３、および４の増殖曲線および収集の２回目の実験からの結果を得た。ＭＰＳＣ４の倍加は遅く、その細胞系のための実験は中止した。
【0132】
【表11】
【0133】
[00153]表現型の特性評価を、それぞれの細胞系について、以下の継代倍加（ＰＤ）時間で行った。
【0134】
【表12】
【0135】
[00154]ＭＰＳＣ／ＮＫマーカーおよびＨＬＡ－Ｇの細胞表面抗原発現を、ＦＡＣＳによって評価した。また、標準的な培養条件でのプラスチックへの接着ならびに骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞への多能性分化能力も評価した。
【0136】
【表13】
【0137】
[00155]Ｃ１およびＣ２についてのＭＰＳＣマーカー、ＨＬＡ－ＧのＦＡＣＳ特性評価は、以下の通りである。
【0138】
【表14】
【0139】
【表15】
【0140】
【表16】
【0141】
【表17】
【0142】
[00156]機能：３系列分化を、以下の分化プロトコールを使用して評価した：
【0143】
【表18】
【0144】
[00157]ＭＰＳＣ３は、脂肪細胞分化培地中で７週間後でも脂肪細胞への分化を示さなかった。対照的に、ＭＰＳＣ１およびＭＰＳＣ２は、それぞれ、５．５週および７週で脂肪細胞に分化する能力を示した。データは示さない。
【0145】
[00158]第３週で、ＭＰＳＣ１、ＭＰＳＣ２、およびＭＰＳＣ３ Ｃ１細胞は、対照と比較して、アリザリンレッド染色を使用すると、骨形成を示した。データは示さない。
【0146】
実施例９：低酸素により誘導される分化
[00159]胚外幹細胞系（例えば、ヒト栄養膜幹細胞）を、集密に達するまで（例えば、約３０００細胞／ｃｍ２～約９０００細胞／ｃｍ２、または約６０００細胞／ｃｍ２）、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で増殖させた。細胞を洗浄し、培地を補給物質なしに交換した。低酸素を、チャンバー中で誘導した（例えば、２％Ｏ２気体混合物中、約２４時間の培養）。培地を収集し、使用まで凍結した。３種全ての細胞系に由来する培地を、ＱＵＡＮＴＩＢＯＤＹ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｋｉｌｏｐｌｅｘ Ａｒｒａｙ（ＲＡＹＢＩＯＴＥＣＨ（商標）Ｌｉｆｅ，Ｉｎｃ．）を使用して試験して、１０００種のタンパク質を定量的に分析した。ＭＰＳＣ１およびＭＰＳＣ２に関する実験を繰り返した。簡単に述べると、試料をプロセッシングし、分析物濃度（ｐｇ／ｍＬ）を決定し、標準曲線と比較した。検出限界（ＬＯＤ）より下の試料の％、ＬＯＤより上であるが、ＬＯＤの３倍未満である試料の％、最良信頼区間にある試料の％、および最大値より上の試料の％として、データを決定した。
[00159]胚外幹細胞系（例えば、ヒト栄養膜幹細胞）を、集密に達するまで（例えば、約３０００細胞／ｃｍ２～約９０００細胞／ｃｍ２、または約６０００細胞／ｃｍ２）、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で増殖させた。細胞を洗浄し、培地を補給物質なしに交換した。低酸素を、チャンバー中で誘導した（例えば、２％Ｏ２気体混合物中、約２４時間の培養）。培地を収集し、使用まで凍結した。３種全ての細胞系に由来する培地を、ＱＵＡＮＴＩＢＯＤＹ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｋｉｌｏｐｌｅｘ Ａｒｒａｙ（ＲＡＹＢＩＯＴＥＣＨ（商標）Ｌｉｆｅ，Ｉｎｃ．）を使用して試験して、１０００種のタンパク質を定量的に分析した。ＭＰＳＣ１およびＭＰＳＣ２に関する実験を繰り返した。簡単に述べると、試料をプロセッシングし、分析物濃度（ｐｇ／ｍＬ）を決定し、標準曲線と比較した。検出限界（ＬＯＤ）より下の試料の％、ＬＯＤより上であるが、ＬＯＤの３倍未満である試料の％、最良信頼区間にある試料の％、および最大値より上の試料の％として、データを決定した。
【0147】
[00160]ＭＰＳＣの集団倍加および倍加時間は、以下の通りである。ＤＴ時間（ｈ）＊：完全な細胞回復を可能にするために解凍直後の最初の２回の継代を除く、解凍時の３回連続する継代にわたって算出された平均倍化時間。＊＊ＰＤ：対応する培養条件について培養物中で達成される集団倍加の最大数。
【0148】
【表19】
【0149】
[00161]ＭＰＳＣ陰性マーカーについてのＣ１細胞のＦＡＣＳ特性評価は、以下の通りである：
【0150】
【表20】
【0151】
[00162]ＭＰＳＣ陽性マーカーについてのＣ１細胞のＦＡＣＳ特性評価は、以下の通りである：
【0152】
【表21】
【0153】
[00163]ＮＫ陽性マーカーについてのＣ１細胞のＦＡＣＳ特性評価は、以下の通りである：
【0154】
【表22】
【0155】
[00164]膵臓前駆細胞および神経幹細胞へのＭＰＳＣの分化を決定した。試料を収集して、３つの異なる濃度および３つの異なる時点でＦＡＣＳ分析およびｍＲＮＡ分析を実施した。
【0156】
【表23】
【0157】
実施例１０：免疫抑制細胞の生成およびＩＤＯ分泌の評価
[00165]３種の胚外幹細胞系（例えば、ヒト栄養膜幹細胞）を、供給源細胞として使用した：致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）Ｐ５細胞、ＭＰＳＣ２ Ｐ８細胞、およびＭＰＳＣ３ Ｐ８細胞。細胞を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で別々に培養した。細胞の継代培養物を、約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、約３日間培養し、０ｎｇ／ｍＬ（対照）、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）で２４時間処理した。その後、細胞および上清を収集した。得られるＭＰＳＣの免疫抑制能力を、ＥＬＩＳＡによって評価した。
[00165]３種の胚外幹細胞系（例えば、ヒト栄養膜幹細胞）を、供給源細胞として使用した：致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）Ｐ５細胞、ＭＰＳＣ２ Ｐ８細胞、およびＭＰＳＣ３ Ｐ８細胞。細胞を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で別々に培養した。細胞の継代培養物を、約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、約３日間培養し、０ｎｇ／ｍＬ（対照）、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）で２４時間処理した。その後、細胞および上清を収集した。得られるＭＰＳＣの免疫抑制能力を、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【0158】
[00166]ＩＦＮ－γ刺激時のインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）分泌を評価した。図８Ａは、アッセイの標準曲線を示す。図８Ｂは、対照と比較した、ＩＤＯ分泌に対する種々の濃度のＩＦＮ－γ刺激での３種の細胞系の結果を示す。ＩＦＮ－γでプライミングしたＭＰＳＣは、ＩＤＯ分泌を統計的に増加させるとは認められなかった。
【0159】
実施例１１：免疫抑制細胞の生成およびキヌレニン分泌の評価
[00167]ヒト栄養膜幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）Ｐ５細胞を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養した。細胞の継代培養物を、約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、約３日間培養し、０ｎｇ／ｍＬ（対照）、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）で２４、４８、および７２時間処理した。その後、細胞および上清を収集した。
[00167]ヒト栄養膜幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）Ｐ５細胞を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養した。細胞の継代培養物を、約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、約３日間培養し、０ｎｇ／ｍＬ（対照）、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）で２４、４８、および７２時間処理した。その後、細胞および上清を収集した。
【0160】
[00168]ＩＦＮ－γ刺激時のキヌレニン分泌を評価した。図９Ａは、アッセイの標準曲線を示す。図９Ｂは、対照および培地のみと比較した、２４、４８、および７２時間の３つの異なる濃度でのキヌレニン分泌に対するＩＦＮ－γ刺激の効果の結果を示す。ＩＦＮ－γでプライミングしたＭＰＳＣは、キヌレニン分泌を統計的に増加させるとは認められなかった。
【0161】
実施例１２：免疫抑制細胞の生成およびＩＬ－２分泌の評価
[00169]致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）Ｐ５細胞を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（約１００，０００細胞／ｍＬ）を、１μｇ／ｍＬのＧＩＢＣＯ（登録商標）フィトヘマグルチニン、Ｍ型（ＰＨＡ－Ｍ）＋５０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で２４時間にわたって活性化した。
[00169]致死性多能性幹細胞系１（ＭＰＳＣ１）Ｐ５細胞を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質）中で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（約１００，０００細胞／ｍＬ）を、１μｇ／ｍＬのＧＩＢＣＯ（登録商標）フィトヘマグルチニン、Ｍ型（ＰＨＡ－Ｍ）＋５０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で２４時間にわたって活性化した。
【0162】
[00170]ＭＰＳＣ１細胞とＪｕｒｋａｔ細胞との同時培養物を確立させた。試料は、（１）ＭＰＳＣのみ、（２）ＭＰＳＣ１＋休止中のＪｕｒｋａｔ細胞、（３）ＭＰＳＣ１＋活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞、および（４）活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞のみであった。ＭＰＳＣを、約２０００～約３０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、約５０，０００～約５００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、２４または４８時間にわたって同時培養し、上清を収集した。ＩＬ－２の分泌を、ＥＬＩＳＡによって評価した。図１０Ａは、アッセイの標準曲線を示す。図１０Ｂは、２４および４８時間でのＩＬ－２分泌に対するＩＦＮ－γ刺激の効果の結果を示す。ＭＰＳＣ１と活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞との同時培養物が、最も高いＩＬ－２分泌を誘導した。用量依存的増加が観察された。図１０Ｃは、対照と比較した、２４時間の同時培養での約３０００細胞／ｃｍ２のＭＰＳＣ播種密度の効果を示す。用量依存的増加が観察された。図１０Ｄは、対照と比較した、２４時間の同時培養での約２０００細胞／ｃｍ２のＭＰＳＣ播種密度の効果を示す。用量依存的増加が観察された。図１０Ｅは、対照と比較した、４８時間の同時培養での約３０００細胞／ｃｍ２のＭＰＳＣ播種密度の効果を示す。用量依存的増加が観察された。図１０Ｆは、対照と比較した、４８時間の同時培養での約２０００細胞／ｃｍ２のＭＰＳＣ播種密度の効果を示す。用量依存的増加が観察された。ＭＰＳＣは、活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞により、ＩＬ－２分泌を、減少させるよりもむしろ、増加させた。試料のＦＡＣＳ表現型を決定し、２４および４８時間（ｈ）での結果を以下に提供する。
【0163】
【表24】
【0164】
実施例１３：膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）または神経幹細胞（ＮＳＣ）への幹細胞の分化
ＭＰＳＣ１
[00171]約１ｘ１０６個の細胞の幹細胞（例えば、ＭＰＳＣ１ Ｐ４）を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質、またはＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ）中で解凍した。次いで、Ｐ５で細胞を拡大させた：４０００細胞／ｃｍ２のＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質または４０００細胞／ｃｍ２のＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ。ＰＰＣまたはＮＳＣ分化は、Ｐ６で始まった。培養および分化条件は以下の通りである：
ＭＰＳＣ１
[00171]約１ｘ１０６個の細胞の幹細胞（例えば、ＭＰＳＣ１ Ｐ４）を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質、またはＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ）中で解凍した。次いで、Ｐ５で細胞を拡大させた：４０００細胞／ｃｍ２のＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質または４０００細胞／ｃｍ２のＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ。ＰＰＣまたはＮＳＣ分化は、Ｐ６で始まった。培養および分化条件は以下の通りである：
【0165】
【表25】
【0166】
[00172]細胞を、微小担体への接着および懸濁拡大について評価した。拡大は、１００ｍＬのバイオリアクター中で行った。
【0167】
ＭＰＳＣ２
[00173]約１ｘ１０６個の細胞の幹細胞（例えば、ＭＰＳＣ２ Ｐ４）を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質、またはＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ）中で解凍した。次いで、Ｐ５で細胞を拡大させた：５０００細胞／ｃｍ２のＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質または５０００細胞／ｃｍ２のＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ。ＰＰＣまたはＮＳＣ分化は、Ｐ６で始まった。培養および分化条件は以下の通りである：
[00173]約１ｘ１０６個の細胞の幹細胞（例えば、ＭＰＳＣ２ Ｐ４）を、栄養培地（例えば、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質、またはＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ）中で解凍した。次いで、Ｐ５で細胞を拡大させた：５０００細胞／ｃｍ２のＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋細胞付着基質または５０００細胞／ｃｍ２のＭＥＭ－アルファ＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ。ＰＰＣまたはＮＳＣ分化は、Ｐ６で始まった。培養および分化条件は以下の通りである：
【0168】
【表26】
【0169】
分化実験設定
【0170】
【表27】
【0171】
神経幹細胞のＦＡＣＳ特性評価
ＭＰＳＣ１培養条件１：神経幹細胞マーカー
ＭＰＳＣ１培養条件１：神経幹細胞マーカー
【0172】
【表28】
【0173】
【表29】
【0174】
ＭＰＳＣ１培養条件２：神経幹細胞マーカー
【0175】
【表30】
【0176】
【表31】
【0177】
ＭＰＳＣ２培養条件１：神経幹細胞マーカー
【0178】
【表32】
【0179】
【表33】
【0180】
ＭＰＳＣ２培養条件２：神経幹細胞マーカー
【0181】
【表34】
【0182】
【表35】
【0183】
[00174]生産される細胞のＮＣＳマーカーは、ＮＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、またはその任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む。一例では、ＮＣＳ細胞は、Ｎ－ＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、およびＰＡＸ６のうちの１つを含む。一例では、ＮＣＳ細胞は、ＮＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、およびＰＡＸ６のうちの２つ（例えば、ＮＣＡＤおよびＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＤおよびＳＯＸ２、ＮＣＡＤおよびＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮおよびＳＯＸ２、ＮＥＳＴＩＮおよびＰＡＸ６、またはＳＯＸ２およびＰＡＸ６）を含む。一例では、ＮＣＳ細胞は、ＮＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、およびＰＡＸ６のうちの３つ（例えば、ＣＡＤ／ＮＥＳＴＩＮ／ＳＯＸ２、ＣＡＤ／ＮＥＳＴＩＮ／ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ／ＳＯＸ２／ＰＡＸ６）を含む。一例では、ＮＣＳ細胞は、ＮＣＡＤ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ２、およびＰＡＸ６の全部を含む。
【0184】
ＭＰＳＣ１培養条件１：膵臓前駆細胞マーカー
【0185】
【表36】
【0186】
【表37】
【0187】
ＭＰＳＣ１培養条件２：膵臓前駆細胞マーカー
【0188】
【表38】
【0189】
[00175]太字は、ＦＢＦ処置後に一貫して増加または減少したマーカーを示す。
【0190】
【表39】
【0191】
ＭＰＳＣ２培養条件１：膵臓前駆細胞マーカー
【0192】
【表40】
【0193】
【表41】
【0194】
ＭＰＳＣ２培養条件２：膵臓前駆細胞マーカー
【0195】
【表42】
【0196】
【表43】
【0197】
[00176]生産される細胞のＰＰＣマーカーは、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＳＯＣ９、またはその任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む。一例では、ＰＰＣ細胞は、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、およびＳＯＣのうちの１つを含む。別の例では、ＰＰＣ細胞は、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、およびＳＯＣのうちの２つを含む。例えば、ＰＰＣは、ＰＤＸ１およびＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１およびＳＯＣ、またはＦＯＸＡ２およびＳＯＣを含んでもよい。別の例では、ＰＰＣ細胞は、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、およびＳＯＣの全部を含む。
【0198】
実施例１４：ＭＰＳＣ製造のスケールアップ
【0199】
【表44】
【0200】
[00177]ＭＰＳＣ１細胞（約１００００細胞／ｃｍ２）を、振とう器上、微小担体と共に培養した。（１）ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）、（２）ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋ＢＳＡ、（３）ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）＋ＰＬＵ、または（４）Ｒｏｏｓｔｅｒ培地中で３日間拡大した後、細胞を、トリパンブルー色素排除試験および生細胞／死細胞イメージングによって分析した。
【0201】
【0202】
実施例１５：バイオリアクター中でのＭＰＳＣの拡大
[00179]ＭＰＳＣ（約４，６００細胞／ｃｍ２）を、微小担体と共に、２５ｒｐｍで約７日間にわたって１００ｍＬのＰＢＳバイオリアクター中のＲｏｏｓｔｅｒ ＭＸＣ ＸＦ培地中で培養した。細胞計数および生存能力を決定した。細胞マーカーのＦＡＣＳ特性評価を、接着対懸濁培養を比較して行った。
[00179]ＭＰＳＣ（約４，６００細胞／ｃｍ２）を、微小担体と共に、２５ｒｐｍで約７日間にわたって１００ｍＬのＰＢＳバイオリアクター中のＲｏｏｓｔｅｒ ＭＸＣ ＸＦ培地中で培養した。細胞計数および生存能力を決定した。細胞マーカーのＦＡＣＳ特性評価を、接着対懸濁培養を比較して行った。
【0203】
[00180]図１２Ａは、異なる日数の培養での細胞計数を示すグラフである。ΔＤ２－Ｄ６＝４４，０００，０００細胞である。図１２Ｂは、培養中の生細胞の％を示すグラフである。図１２Ｃは、接着対懸濁培養を比較する集団倍加を示すグラフである。ΔＤ２－Ｄ６＝４．９ＰＤである。接着培養は懸濁培養よりも最初は速く倍加したが、時間と共に、懸濁培養がより速い速度の集団倍加を達成した。
【0204】
[00181]接着および懸濁細胞培養のためのＭＰＳＣおよびＮＫマーカーは、以下に示される通りである。
【0205】
【表45】
【0206】
【表46】
【0207】
【表47】
【0208】
【表48】
【0209】
さらなる最適化
【0210】
【表49】
【0211】
知見のまとめ
[00182]増殖曲線分析は、異なるＭＰＳＣ系間で異なる増殖特性を示す：ＭＰＳＣ４＜ＭＰＳＣ３＜ＭＰＳＣ２＜ＭＰＳＣ１。ＭＳＣ／ＮＫマーカーのＦＡＣＳ特性評価は、ＭＰＳＣ４細胞系について異種細胞集団を示す；ＭＰＳＣ２、ＭＰＳＣ３、およびＭＰＳＣ１細胞系は同種であり、コアＭＳＣマーカーを発現する。ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）およびＭＥＭ－α＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ培地を使用するＰＰＣおよびＮＳＣへの短期分化は、培地依存的マーカー発現を示す；ＭＰＳＣ１とＭＰＳＣ２細胞系は両方とも、分化後にＰＰＣ、ＮＳＣ、およびＭＰＳＣマーカーの組合せを発現する。活性化されたＴ細胞のような細胞系（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）との同時培養において、ＭＰＳＣは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中で活性化ＩＬ－２分泌を刺激することができた。
[00182]増殖曲線分析は、異なるＭＰＳＣ系間で異なる増殖特性を示す：ＭＰＳＣ４＜ＭＰＳＣ３＜ＭＰＳＣ２＜ＭＰＳＣ１。ＭＳＣ／ＮＫマーカーのＦＡＣＳ特性評価は、ＭＰＳＣ４細胞系について異種細胞集団を示す；ＭＰＳＣ２、ＭＰＳＣ３、およびＭＰＳＣ１細胞系は同種であり、コアＭＳＣマーカーを発現する。ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）およびＭＥＭ－α＋ＳＴＥＭＵＬＡＴＥ培地を使用するＰＰＣおよびＮＳＣへの短期分化は、培地依存的マーカー発現を示す；ＭＰＳＣ１とＭＰＳＣ２細胞系は両方とも、分化後にＰＰＣ、ＮＳＣ、およびＭＰＳＣマーカーの組合せを発現する。活性化されたＴ細胞のような細胞系（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）との同時培養において、ＭＰＳＣは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中で活性化ＩＬ－２分泌を刺激することができた。
【0212】
[00183]一部の実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、そのような実施形態は、ほんの一例として提供されるものである。いくつかの変更、変化、および置換を、本発明から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替手段を、本発明の実施において使用することができることが理解されるべきである。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【国際調査報告】