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特表2023-525050キメラインフルエンザワクチン

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-14

(54)【発明の名称】キメラインフルエンザワクチン

(51)【国際特許分類】

C12N 15/44 20060101AFI20230607BHJP

C07K 14/11 20060101ALI20230607BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20230607BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20230607BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20230607BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20230607BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20230607BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20230607BHJP

C12N 15/62 20060101ALI20230607BHJP

A61K 39/145 20060101ALI20230607BHJP

A61P 31/16 20060101ALI20230607BHJP

【ＦＩ】

C12N15/44

C07K14/11 ZNA

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/62 Z

A61K39/145

A61P31/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022567535

(86)(22)【出願日】2021-05-07

(85)【翻訳文提出日】2022-12-23

(86)【国際出願番号】 US2021031406

(87)【国際公開番号】W WO2021226533

(87)【国際公開日】2021-11-11

(31)【優先権主張番号】63/022,328

(32)【優先日】2020-05-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】596118493

【氏名又は名称】アカデミアシニカ

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡＳＩＮＩＣＡ

【住所又は居所原語表記】１２８Ｓｅｃ２，ＡｃａｄｅｍｉａＲｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ１１５２９ＴＷ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウォン，チー－ヒューイ

(72)【発明者】

【氏名】リャオ，シン－ユー

(72)【発明者】

【氏名】ワン，シー－チー

(72)【発明者】

【氏名】コ，イー－アン

(72)【発明者】

【氏名】リン，クオ－イー

(72)【発明者】

【氏名】マー，チェー

(72)【発明者】

【氏名】チェン，チン－ジェン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C085AA03

4C085AA04

4C085BA55

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）の球状頭部ドメイン共通配列に対し少なくとも６０％の相同性を各々有する１つ以上の球状頭部ドメイン配列と融合した、Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）及び／又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）のステムドメイン共通配列に対し少なくとも６０％の相同性を各々有する１つ以上のステムドメイン配列を含む、キメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドに、関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）の球状頭部ドメイン共通配列に対し少なくとも６０％の相同性を各々有する１つ以上の球状頭部ドメイン配列と融合した、Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）及び／又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）のステムドメイン共通配列に対し少なくとも６０％の相同性を各々有する１つ以上のステムドメイン配列を含む、キメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。

【請求項2】

前記ＨＡが、インフルエンザＡＨＡ、インフルエンザＢＨＡ又はインフルエンザＣＨＡである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記相同性が、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記ステムドメイン配列が、Ｈ１ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１ＨＡのＣ末端ステムセグメント；Ｈ１ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１＋Ｈ５ＨＡ配列のＣ末端ステムセグメント；又はＨ５ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１＋Ｈ５ＨＡ配列のＣ末端ステムセグメントである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

Ｈ１ＨＡの前記ステムドメイン共通配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項6】

Ｈ５ＨＡの前記球状頭部ドメイン共通配列が、配列番号３、配列番号７又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項7】

配列番号４、配列番号８又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項8】

ＨＡにおける１つ以上のグリコシル化部位が、モノグリコシル化され、このモノグリコシル化ＨＡが、各グリコシル化部位においてＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のみを有する、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記キメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、免疫原として使用される、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチド及びアジュバントを含む、免疫原性組成物。

【請求項11】

前記アジュバントが、糖脂質アジュバントである、請求項１０に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

有効量の請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド又は請求項１０に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象をインフルエンザウイルスに対して免疫化するか又はインフルエンザウイルス疾患を予防する方法。

【請求項13】

ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を惹起する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７株及びサブタイプに対するより高い抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、より良い中和活性及びより強い交差防御活性を有するステム特異的抗体を誘導する、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

より多くのＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びＣＤ８^＋記憶Ｔ細胞産生によりワクチン効力を増大する、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

請求項１～９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列及び任意選択的にシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、組換えポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記シグナルペプチドが、配列番号１３又は配列番号１４の配列を含む、請求項１６に記載の組換えポリヌクレオチド。

【請求項18】

請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項19】

請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６３／０２２．３２８号（２０２０年５月８日出願）に対する優先権を主張し、この出願は、本明細書中でその全体が全ての目的のために参考として組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、本明細書にその全体が組み込まれる配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年５月６日に作成され、Ｇ４５９０－０８６００ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられており、２８キロバイトの大きさである。

【0003】

発明の分野
本開示は、キメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド、それを含む免疫原性／ワクチン組成物及びその使用に関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
インフルエンザワクチン製造の従来の方法は、特定病原体除去（ＳＰＦ）胚形成雌ニワトリ卵においてウイルスを培養することであり、このプロセスは、多くの場合、大量生産のために６か月超を要する。しかし、いくつかのワクチンウイルス株は、卵の中では増殖が不十分であり、また、ニワトリ卵に対するアレルギーを有する人々は、安全性への懸念を抱く。ウイルスの細胞培養に基づく新規なアプローチが、卵ベースの方法に置き換わるべく開発されている。しかし、細胞培養方法は、未だ、危険なウイルスを産生する潜在的な危険性を有する。これらの問題を克服するために、代替の戦略の探求は、組換えＨＡベースのワクチンがインフルエンザウイルス感染に対する中和抗体を誘導し得ることを実証した。しかし、特定のインフルエンザウイルスサブタイプによって誘導された抗体は、通常、他のインフルエンザサブタイプを効果的に中和することができなかった。さらに、このワクチンは、このウイルスの絶え間ない突然変異ゆえに、毎年更新されなければならない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、広範囲のインフルエンザウイルス株に対する普遍的なワクチンを開発する需要が、未だに存在する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の要旨
一態様において、本開示は、Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）の球状頭部（ｇｌｏｂｕｌａｒｈｅａｄ）ドメイン共通配列に対し少なくとも６０％の相同性を各々有する１つ以上の球状頭部ドメイン配列と融合した、Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）及び／又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）のステムドメイン共通配列に対し少なくとも６０％の相同性を各々有する１つ以上のステムドメイン配列を含む、キメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを、提供する。

【0007】

いくつかの実施形態において、上記ＨＡは、インフルエンザＡＨＡ、インフルエンザＢＨＡ又はインフルエンザＣＨＡである。

【0008】

いくつかの実施形態において、上記相同性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。

【0009】

いくつかの実施形態において、上記ステムドメイン配列は、Ｈ１ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１ＨＡのＣ末端ステムセグメント；Ｈ１ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１＋Ｈ５ＨＡ配列のＣ末端ステムセグメント；又はＨ５ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１＋Ｈ５ＨＡ配列のＣ末端ステムセグメントである。

【0010】

いくつかの実施形態において、Ｈ１ＨＡ及び／又はＨ５ＨＡの上記ステムドメイン共通配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、Ｈ１ＨＡ又はＨ５ＨＡの上記球状頭部ドメイン共通配列は、配列番号３、配列番号７又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0012】

一実施形態において、上記キメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、配列番号４、配列番号８又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＨＡにおける１つ以上のグリコシル化部位は、モノグリコシル化される。さらなる実施形態において、このモノグリコシル化ＨＡは、各グリコシル化部位においてＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のみを有する。

【0014】

一実施形態において、上記キメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、免疫原として使用される。

【0015】

別の態様において、本開示は、キメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチド及びアジュバントを含む免疫原性組成物を、提供する。一実施形態において、このアジュバントは、糖脂質アジュバントである。

【0016】

別の態様において、本開示は、本開示のポリペプチドをコードする核酸配列及び任意選択的にシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドを、提供する。いくつかの実施形態において、このシグナルペプチドは、配列番号１３又は配列番号１４の配列を含む。

【0017】

別の態様において、本開示は、本開示の組換えポリヌクレオチドを含むベクターを、提供する。本開示のベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。

【0018】

別の態様において、本開示は、有効量の、本開示のキメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド又は免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象をインフルエンザウイルスに対して免疫化する方法を、提供する。

【0019】

別の態様において、本開示は、有効量の、本開示のキメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド又は免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防する方法を、提供する。

【0020】

一実施形態において、本明細書中で記載される方法は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を惹起する。

【0021】

一実施形態において、本明細書中で記載される方法は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７株及びサブタイプに対するより高い抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、より良い中和活性及びより強い交差防御活性を有するステム特異的抗体を誘導する。

【0022】

一実施形態において、本明細書中で記載される方法は、より多くのＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞産生により、ワクチン効力を増大する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1-1】図１（Ａ）～（Ｃ）。共通Ｈ５球状頭部及び共通Ｈ１ステム（ｃＨＡ）を有するキメラＨ５／１構築物ならびにｃＨＡ_ｍｇ免疫原によるワクチン接種によって惹起された広範に交差防御的なステム特異的抗体。（Ａ）ｓｗａｐＨ１／５（Ｈ１球状頭部及びＨ１＋Ｈ５［ＨＡ２］ステム）、ｓｗａｐＨ５／１（Ｈ５球状頭部及びＨ５＋Ｈ１［ＨＡ２］ステム）ならびにキメラＨ５／１（ｃＨＡ：Ｈ５球状頭部及びＨ１ステム）の構築物。（Ｂ）Ｈ１Ｎ１Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９及びＨ５Ｎ１Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４ウイルスに対する中和活性。（Ｃ）ＰＢＳ（対照）、ＨＡ＋Ａｌｕ、又はＨＡ＋Ｃ３４でワクチン接種したマウスにおいて２日間にわたってＨＡ（黒色バー）又はＰＢＳ（白色バー）対照で刺激した脾細胞におけるグランザイムＢ（ＧｒｚＢ）産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリー分析によって評価した。

【図1-2】図１（Ｄ）～（Ｉ）。共通Ｈ５球状頭部及び共通Ｈ１ステム（ｃＨＡ）を有するキメラＨ５／１構築物ならびにｃＨＡ_ｍｇ免疫原によるワクチン接種によって惹起された広範に交差防御的なステム特異的抗体。（Ｄ～Ｉ）Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇ対Ｃ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇでワクチン接種したマウスからの抗体力価を、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９Ｈ１Ｎ１ＨＡタンパク質（Ｄ）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７Ｈ１Ｎ１ＨＡタンパク質（Ｅ）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７Ｈ３Ｎ２ＨＡタンパク質（Ｆ）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４Ｈ５Ｎ１ＨＡタンパク質（Ｇ）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３Ｈ７Ｎ９ＨＡタンパク質（Ｈ）及びＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｂｒｉｓ／０７）ステムＨＡ（ｎｏ．４９００）タンパク質（Ｉ）をコーティング抗原として用いたＥＬＩＳＡによって、４２日目に測定した。陰性対照（免疫前血清）によって発生する吸光度よりも２．５倍高い吸光度を発生するエンドポイント抗体力価を、抗血清の最終希釈物として定義する。データを、スチューデントｔ検定及びＰｒｉｓｍからの双方向ＡＮＯＶＡを用いて調べた；相違を、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１にて、統計学的に有意とみなした。データは、平均±ＳＥＭを表す。

【図2-1】図２（Ａ）～（Ｂ）。ｃＨＡワクチン接種マウス由来の抗血清の、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２又はＨ５Ｎ１のＨＡ及びサブタイプを発現する標的細胞に対するＡＤＣＣレポーターアッセイ。水酸化アルミニウムもしくはＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇ又はｃＨＡ_ｍｇタンパク質によって免疫化したマウスから収集した抗血清を、（Ａ）Ｈ１Ｎ１ウイルス、（Ｂ）Ｈ５Ｎ１ウイルス、によって感染したＭＤＣＫ細胞と共に３０分間にわたってインキュベートした。その後、ＡＤＣＣレポーターアッセイを、マウスＦｃγＲＩＩＩを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を用いて行い、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。値は、平均±ＳＥＭ、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。Ｐ値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより二方向ＡＮＯＶＡを用いて計算した。

【図2-2】図２（Ｃ）。ｃＨＡワクチン接種マウス由来の抗血清の、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２又はＨ５Ｎ１のＨＡ及びサブタイプを発現する標的細胞に対するＡＤＣＣレポーターアッセイ。水酸化アルミニウムもしくはＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇ又はｃＨＡ_ｍｇタンパク質によって免疫化したマウスから収集した抗血清を、（Ｃ）Ｈ３Ｎ２ウイルスによって感染したＭＤＣＫ細胞と共に３０分間にわたってインキュベートした。その後、ＡＤＣＣレポーターアッセイを、マウスＦｃγＲＩＩＩを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を用いて行い、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。値は、平均±ＳＥＭ、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。Ｐ値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより二方向ＡＮＯＶＡを用いて計算した。

【図3-1】図３（Ａ）～（Ｃ）。アジュバントＣ３４を伴うｃＨＡ_ｍｇにより、より多くのＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞が応答し、そして広範な中和抗体が惹起されて、より広範な交差防御が得られた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アジュバントＡｌ（ＯＨ）_３又はＣ３４を伴うｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇによって免疫化した；免疫化マウスの脾臓由来の細胞を、３回の免疫化後に得、そしてＩＦＮ－γ（Ａ）、ＩＬ－４（Ｂ）及びＧｚＢ（Ｃ）分泌細胞を、特異的ペプチドを用いるＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。スポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を、平均±ＳＥＭで表す。

【図3-2】図３（Ｄ）～（Ｅ）。アジュバントＣ３４を伴うｃＨＡ_ｍｇにより、より多くのＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞が応答し、そして広範な中和抗体が惹起されて、より広範な交差防御が得られた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アジュバントＡｌ（ＯＨ）_３又はＣ３４を伴うｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇによって免疫化した。ｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇワクチン接種マウス由来の抗血清の中和活性を、（Ｄ）Ｈ１Ｎ１ウイルス及び（Ｅ）Ｈ５Ｎ１ウイルスに対してアッセイした。データを、平均±ＳＥＭで表す。結果を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアにて、スチューデントｔ検定及び双方向ＡＮＯＶＡを用いて計算した；有意な相違を、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１として記した。

【図4-1】図４（Ａ）～（Ｃ）。Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスの致死用量でチャレンジされたマウスにおける交差防御的な効力。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３回用量の、アジュバントＡｌ（ＯＨ）_３又はＣ３４を伴うｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇにより、２週間間隔で免疫化した。免疫化マウスを、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ａ）、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９（Ｂ）、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｃ）によりチャレンジし、そして効力を、感染後１４日間にわたって生存率を記録することによって評価した。＊＊Ｐ＜０．０１。生存率における有意な相違を、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって分析した。

【図4-2】図４（Ｄ）～（Ｆ）。Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスの致死用量でチャレンジされたマウスにおける交差防御的な効力。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３回用量の、アジュバントＡｌ（ＯＨ）_３又はＣ３４を伴うｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇにより、２週間間隔で免疫化した。免疫化マウスを、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／０３／２００６（Ｄ）、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４／ＮＩＢＲＧ１４（Ｅ）、又はＨ５Ｎ１Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５／ＮＩＢＲＧ２３（Ｆ）によりチャレンジし、そして効力を、感染後１４日間にわたって生存率を記録することによって評価した。＊＊Ｐ＜０．０１。生存率における有意な相違を、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって分析した。

【図5-1】図５（Ａ）～（Ｄ）。キメラＨＡタンパク質の設計及び調製。（Ａ）設計されたインフルエンザＨＡ配列を、共通Ｈ１Ｎ１配列及び共通Ｈ５Ｎ１配列ｐＣＨＡ５－ＩＩを用いて構築し、キメラＨＡを作製した。球状頭部ドメインは、Ｃ５２とＣ２７７との間の残基（Ｈ３番号付け）のアミノ酸配列からなる。ステム領域は、ＨＡ１及びＨＡ２サブユニットの部分からなる。タンパク質構造を、タンパク質データバンクＩＤコード２ＩＢＸ（ＶＮ１１９４Ｈ５ＨＡ）及び３ＬＺＧ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）からダウンロードした。最終画像を、ＰｙＭｏｌによって作成した。共通ＨＡの構造は公開されたことがないので、鳥インフルエンザＨ５（Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）の頭部ドメイン及びパンデミックＨ１Ｎ１（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）のステム領域の画像を、キメラＨＡ構築物のために用いる。（Ｂ～Ｄ）キメラＨＡタンパク質の精製及びゲル濾過クロマトグラフィー分析。（Ｂ）精製ＨＡタンパク質を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析した。Ｍ：分子量マーカー。左：ｃＨＡ_ｆｇ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から直接精製された完全グリコシル化ｃＨＡ；（Ｃ）ｃＨＡ_ｍｇ、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞から精製され、エンドグリコシダーゼＨによって消化されたモノグリコシル化ｃＨＡ（Ｄ）精製した分泌型ＨＡタンパク質のゲル濾過分析。クロマトグラフィーによって示される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の完全グリコシル化ｃＨＡ及び三量体として存在するモノグリコシル化ｃＨＡ（２００ｋＤａを超える）。この図は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって発現されたｃＨＡタンパク質を較正標準（破線）と重ねた、重ね合わせ溶出プロファイルを表す。

【図5-2】図５（Ｅ）。キメラＨＡタンパク質の設計及び調製。（Ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定された、ｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇのグリコシル化部位における主なグリカンに印をつけた模式図。一般的なグリカン記号にしたがった。

【図6-1】図６（Ａ）。分泌型ＨＡの構築物及び精製。（Ａ）ＨＡの外部ドメインをコードする配列を、発現ベクターｐｃＤＮＡ内に調製し、そしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトさせた。タンパク質を、安定化／三量体化シグナル、ｆｏｌｄｏｎ、及び精製のためのＣ末端（Ｈｉｓ）_６タグを含むように操作した。

【図6-2】図６（Ｂ）。分泌型ＨＡの構築物及び精製。（Ｂ）精製ＨＡタンパク質を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析した。Ｍ：分子量マーカー。レーン１：Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＨＡタンパク質；レーン２：Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）ＨＡタンパク質；レーン３：Ｈ３Ｎ２（Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７）ＨＡタンパク質；レーン４：Ｈ５Ｎ１（Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）ＨＡタンパク質；レーン５：Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３）ＨＡタンパク質。

【図7-1】図７（Ａ）～（Ｂ）。ｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇでワクチン接種したマウス由来の抗血清のＨＡ結合活性。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝１０）を、２週間間隔でＡｌ（ＯＨ）_３もしくはＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇ又はｃＨＡ_ｍｇによって免疫化した。Ａｌ（ＯＨ）_３アジュバントを有するｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇ対Ｃ３４アジュバントを有するｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇでワクチン接種したマウスからの抗体力価を、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９Ｈ１Ｎ１ＨＡタンパク質（Ａ）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７Ｈ１Ｎ１ＨＡタンパク質（Ｂ）をコーティング抗原として用いたＥＬＩＳＡによって、２８日目に測定した。エンドポイント抗体力価を、陰性対照（免疫前血清）によって発生する吸光度（ＯＤ）より２．５倍高い吸光度を発生する血清の最高希釈として定義した。データを、Ｐｒｉｓｍからの双方向ＡＮＯＶＡを用いて調べた；相違を、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１にて統計学的に有意とみなした。データは、平均±ＳＥＭを表す。

【図7-2】図７（Ｃ）～（Ｆ）。ｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇでワクチン接種したマウス由来の抗血清のＨＡ結合活性。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝１０）を、２週間間隔でＡｌ（ＯＨ）_３もしくはＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇ又はｃＨＡ_ｍｇによって免疫化した。Ａｌ（ＯＨ）_３アジュバントを有するｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇ対Ｃ３４アジュバントを有するｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇでワクチン接種したマウスからの抗体力価を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７Ｈ３Ｎ２ＨＡタンパク質（Ｃ）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４Ｈ５Ｎ１ＨＡタンパク質（Ｄ）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３Ｈ７Ｎ９ＨＡタンパク質（Ｅ）及びＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｂｒｉｓ／０７）ステムＨＡ（＃４９００）タンパク質（Ｆ）をコーティング抗原として用いたＥＬＩＳＡによって、２８日目に測定した。エンドポイント抗体力価を、陰性対照（免疫前血清）によって発生する吸光度（ＯＤ）より２．５倍高い吸光度を発生する血清の最高希釈として定義した。データを、Ｐｒｉｓｍからの双方向ＡＮＯＶＡを用いて調べた；相違を、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１にて統計学的に有意とみなした。データは、平均±ＳＥＭを表す。

【図8】図８（Ａ）及び（Ｂ）。ストーク反応性抗体（Ｆ１０ＩｇＧ）の組換えＨ１、Ｈ５及びｃＨＡに対する結合。（Ａ）精製Ｆ１０を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析した。Ｍ：分子量マーカー。レーン１：Ｆ１０抗体。（Ｂ）Ｆ１０ＩｇＧと種々のＨＡとの結合親和性を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ｘ軸は、種々のＨＡタンパク質の濃度を示し、そしてｙ軸は、ＯＤ４０５ｎｍにおける吸光値を示す。

【図9】図９（Ａ）～（Ｄ）。Ｃ３４の抗体力価に対する用量依存性効果。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝１０）に、２週間間隔で、０．５μｇ、２μｇ又は１０μｇのＣ３４をアジュバントとした２０μｇｃＨＡを注射した。マウス血清を、第２回目（Ｄ２８）及び第３回目（Ｄ４２）の免疫化の２週間後に、収集した。抗体力価を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ａ及びＣ）ならびにＨ５Ｎ１Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｂ及びＤ）のＨＡタンパク質を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。抗体力価のＰ値を、Ｐｒｉｓｍからの双方向ＡＮＯＶＡを用いて計算した；相違を、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１にて、統計学的に有意とみなした。データは、平均±ＳＥＭを表す。

【図10】図１０（Ａ）～（Ｃ）。Ｃ３４の抗原特異的サイトカイン分泌細胞に対する用量依存性効果。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝５）に、２週間間隔で、０．５、２及び１０μｇの３つの異なる用量のＣ３４をアジュバントとした２０μｇの精製ｃＨＡを注射した。ｃＨＡ免疫化マウスの脾細胞を、第２回目（Ｄ２８）及び第３回目（Ｄ４２）の免疫化の２週間後に、得た。（Ａ）ＩＦＮ－γ及び（Ｂ）ＩＬ４分泌細胞を、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析によって評価した。（Ｃ）脾細胞におけるグランザイムＢ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を、特異的ペプチドを用いるＥｌｉｓｐｏｔ分析によって決定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｐ値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより、二方向ＡＮＯＶＡを用いて計算した。

【図11-1】図１１（Ａ）～（Ｃ）。Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスを致死用量でチャレンジしたｃＨＡ_ｆｇ又はｃＨＡ_ｍｇワクチン接種マウスの体重。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ａ）、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９（Ｂ）、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｃ）ウイルスによってチャレンジした免疫化マウスの体重変化を、感染後１４日間にわたってモニタリングした。体重変化を、平均±ＳＥＭで表す。

【図11-2】図１１（Ｄ）～（Ｆ）。Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスを致死用量でチャレンジしたｃＨＡ_ｆｇ又はｃＨＡ_ｍｇワクチン接種マウスの体重。Ｈ１Ｎ１Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／０３／２００６（Ｄ）、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｅ）又はＨ５Ｎ１Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５（Ｆ）ウイルスによってチャレンジした免疫化マウスの体重変化を、感染後１４日間にわたってモニタリングした。体重変化を、平均±ＳＥＭで表す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

発明の詳細な説明
本発明の実施は、別段に示さない限り、当業者の技術範囲内である分子生物学、微小生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、文献によって完全に例示される。例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，ＶｏｌｕｍｅｓＩａｎｄＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．，１９８５）；ＣｕｌｔｕｒｅＯｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅｔｒｅａｔｉｓｅ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓｅｄｓ．，１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ａｎｄ１５５（Ｗｕｅｔａｌ．ｅｄｓ．），ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒａｎｄＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ｂｙＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８８）；及びＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）を参照されたい。

【0025】

定義
明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかでない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「キメラ膜貫通受容体」は、複数のキメラ膜貫通受容体を含む。

【0026】

本明細書中で使用される場合、用語「ヘマグルチニン」及び「ＨＡ」は、当業者に公知の任意のヘマグルチニンをいう。特定の実施形態において、ヘマグルチニンは、インフルエンザヘマグルチニン、例えば、インフルエンザＡヘマグルチニン、インフルエンザＢヘマグルチニン、又はインフルエンザＣヘマグルチニンである。代表的なヘマグルチニンは、シグナルペプチド、ステムドメイン、球状頭部ドメイン、管腔ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、当業者に公知のドメインを含む。

【0027】

本明細書中で使用される場合、用語「ステムドメインポリペプチド」、「ＨＡステムドメイン」、「インフルエンザウイルスヘマグルチニンステムドメインポリペプチド」及び「ＨＡストークドメイン」は、インフルエンザヘマグルチニンのＡステムステムドメインを作り上げる１つ以上のポリペプチド鎖を含むか、又はそれからなるポリペプチドをいう。ドメインポリペプチドは、１本のポリペプチド鎖であっても、２本のポリペプチド鎖であっても、又はもっと多くのポリペプチド鎖であってもよい。

【0028】

本明細書中で使用される場合、用語「インフルエンザウイルスヘマグルチニン頭部ドメインポリペプチド」、「インフルエンザウイルスヘマグルチニン頭部ドメイン」、「ＨＡ球状頭部ドメイン」、及び「ＨＡ頭部ドメイン」は、インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドの球状頭部ドメインをいう。

【0029】

本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、免疫応答を惹起することができる、任意の物質として定義される。

【0030】

本明細書中で使用される場合、用語「免疫原性」は、免疫原、抗原、又はワクチンの、免疫応答を刺激する能力をいう。

【0031】

本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体又はＴ細胞受容体の抗原結合部位と接触する、抗原分子の部分として定義される。

【0032】

本明細書中で使用される場合、用語「ワクチン」は、疾患の原因となる生物全体（殺傷済又は弱体化済）又はそのような生物の構成部分、例えばタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、又はそれらの任意の組み合わせからなり、その生物が引き起こす疾患に対する免疫を付与する、抗原を含む調製物をいう。ワクチン調製物は、天然であっても、合成であっても、又は組換えＤＮＡ技術によって得られてもよい。

【0033】

本明細書中で使用される場合、用語「抗原特異的」は、特定の抗原、又は抗原の断片を供給し、特異的な細胞増殖をもたらす、細胞集団の特性をいう。

【0034】

「有効量」は、所望の治療効果又は予防効果を達成するために必要な期間にわたる投薬量で、有効な量をいう。

【0035】

本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個人の疾患状態、年齢、性別及び体重などの要因、ならびにその個体において所望の応答を惹起するその物質／分子の能力にしたがって、変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、その物質／分子の任意の毒性効果又は有害効果をしのぐ量でもある。「予防有効量」は、所望の予防効果を達成するために必要な期間にわたる投薬量で、有効な量をいう。必ずしもというわけではないが、代表的に、予防用量は疾患にかかる前、又は疾患のより初期の段階で、対象において使用されるがゆえに、予防有効量は治療有効量より少なくなる。

【0036】

鳥インフルエンザＨ５（ｐＣＨＡ５－ＩＩ）の共通ＤＮＡ配列を、マウスにおける投与のためのワクチンとして使用し、結果は、種々のＨ５サブタイプに対する広範な保護を有することを示した（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔａｌ．ＢｒｏａｄｌｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａｔｉｏｎａｌｔｅｒｓｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｓｕｇａｒ－ｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０８，３５１０－３５１５（２０１１））。本開示は、最も一般的な鳥インフルエンザＨ５及びヒトインフルエンザＨ１配列に基づく種々のキメラワクチンの設計及び評価を報告する。これらの構築物の中で、球状頭部としての共通Ｈ５及びステムとしての共通Ｈ１を有するキメラＨＡ（ｃＨＡ）ワクチンは最良であり、そして強いＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を惹起することが、示された。興味深いことに、各グリコシル化部位にＧｌｃＮＡｃのみを有するモノグリコシル化ｃＨＡ（ｃＨＡｍｇ）ワクチンは、より高い抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７株ならびにサブタイプに対するより良い中和活性及びより強い交差防御活性を有する、より多くのステム特異的抗体を誘導した。さらに、クラススイッチのために設計した、糖脂質アジュバントと組み合わせたｃＨＡｍｇワクチンは、さらにワクチン効力を増大し、より多くのＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びＣＤ８^＋記憶Ｔ細胞産生を伴った。

【0037】

キメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド
本開示は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を惹起するための免疫原又はワクチンとして使用される、キメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを、提供する。したがって、キメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防し得る。

【0038】

本開示のキメラインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドは、Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）の球状頭部共通配列と少なくとも６０％の相同性をそれぞれ有する１つ以上の球状頭部ドメイン配列と融合した、Ｈ１サブタイプＨＡ（Ｈ１ＨＡ）及び／又はＨ５サブタイプＨＡ（Ｈ５ＨＡ）のステムドメイン共通配列と少なくとも６０％の相同性をそれぞれ有する１つ以上のステムドメイン配列を、含む。

【0039】

本明細書中で使用される場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば核酸分子（例えばＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体にわたる関連性をいう。適合する残基のアラインメントによって決定された類似性または同一性の閾値レベルを共有するポリマー分子（例えば核酸分子（例えばＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）及び／又はポリペプチド分子）は、相同であると呼ばれる。相同性は、分子間の関係性をいう定性的用語であり、定量的な類似性又は同一性に基づき得る。類似性及び同一性は、２つの比較される配列の間で適合する配列の程度を規定する、定量的用語である。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、その配列が、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるか又は類似する場合に、互いに「相同」であるとみなされる。

【0040】

いくつかの実施形態において、本開示にしたがうポリペプチドは、Ｈ１ＨＡ又はＨ５ＨＡの既知のヒト及び鳥インフルエンザウイルス株にわたる共通配列に対し少なくとも６０％の相同性を有する１つ以上の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、相同性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。いくつかの実施形態において、ステムドメイン配列は、Ｈ１ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１ＨＡのＣ末端ステムセグメント；Ｈ１ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１＋Ｈ５ＨＡ配列のＣ末端ステムセグメント；又はＨ５ＨＡのＮ末端ステムセグメントもしくはＨ１＋Ｈ５ＨＡ配列のＣ末端ステムセグメントである。

【0041】

いくつかの実施形態において、Ｈ１ＨＡ及び／又はＨ５ＨＡのステムドメイン共通配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0042】

配列番号１（Ｈ１ステム）
DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKL

【0043】

配列番号２（Ｈ１ステム）
NTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQ

【0044】

配列番号５（Ｈ１ステム）
DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKL

【0045】

配列番号６（Ｈ１＋Ｈ５ステム）
NTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGV

【0046】

配列番号９（Ｈ５ステム）
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL

【0047】

配列番号１０（Ｈ５＋Ｈ１ステム）
NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKR
GLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGV

【0048】

一実施形態において、Ｈ１ＨＡ又はＨ５ＨＡの球状頭部ドメイン共通配列は、配列番号３、配列番号７又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0049】

配列番号３（Ｈ５球状頭部）
CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC

【0050】

配列番号７（Ｈ１球状頭部）
CKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDC

【0051】

配列番号１１（Ｈ５球状頭部）
CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC

【0052】

一実施形態において、キメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、配列番号４、配列番号８又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0053】

配列番号４（キメラＨ５／１）
DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQ

【0054】

配列番号８（ＳｗａｐＨ１／５）
DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGV

【0055】

配列番号１２（ＳｗａｐＨ５／１）
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGV

【0056】

いくつかの実施形態において、免疫原性を増大させるために、ＨＡ上の１つ以上のグリコシル化部位が、モノグリコシル化される。好ましくは、モノグリコシル化ＨＡは、各グリコシル化部位に、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のみを有する。

【0057】

キメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、任意の好適な方法によって生成され得る。そのような方法の多くは、当業者に公知である。例えば、タンパク質は、化学合成されてもよく、又は組換えＤＮＡ技術（例えば、細菌細胞において、細胞培養物（哺乳動物細胞、酵母細胞又は昆虫細胞）において、植物もしくは植物細胞において、又は無細胞原核生物もしくは真核生物ベースの発現系によって、他のインビトロ系によって、など）を用いて産生されてもよい。したがって、本開示は、本開示のポリペプチドをコードする核酸配列及び任意選択的にシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドを、提供する。本開示は、本開示の組換えポリヌクレオチドを含むベクターを、提供する。本開示のポリペプチドの実施形態は、本明細書中で記載される。一実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１３（ＭＥＫＩＶＬＬＬＡＩＶＳＬＶＫＳ）又は配列番号１４（ＭＫＡＩＬＶＶＬＬＹＴＦＡＴＡＮＡ）の配列を含む。本開示のベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。

【0058】

免疫原性組成物
免疫原性組成物は、好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体及び／又はアジュバントを含む。一実施形態において、アジュバントは、糖脂質アジュバントである。アジュバントの例としては、Ａｌ（ＯＨ）_３、ＡｌＰＯ_４、Ｃ３４、スクアレン及びＱＳ２１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0059】

本開示のキメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて、調合されるか又は投与され得る。免疫原性／ワクチン組成物は、無菌であっても、パイロジェン・フリーであっても、又は無菌かつパイロジェン・フリーの両方であってもよい。医薬品、例えばワクチン組成物の調合及び／又は製造における一般的考慮は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ２１ｓｔｅｄ．，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（本明細書中でその全体が参考として組み込まれる）において見出され得る。

【0060】

免疫原性組成物は、投薬調合物に適合する様式で、かつ治療的に有効な、保護的なそして免疫原性である量で、投与される。投与される量は、例えば、抗体を合成する、及び必要である場合に細胞媒介性免疫応答を発生する、個人の免疫系の受容能を含めて、治療される対象に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、臨床医の判断にゆだねられる。しかし、好適な投薬量範囲は、当業者によって容易に決定される。初回投与及びブースター用量のための好適なレジメンもまた変動するが、初回投与及びそれに続くその後の投与が、含まれ得る。ワクチンの投薬量もまた、投与の経路に依存し得、そして宿主の大きさにしたがって変わり得る。

【0061】

本明細書中で記載されるワクチン組成物の調合物は、薬理学分野で公知の方法又はこれから開発される任意の方法によって、調製され得る。一般に、このような調製方法としては、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の副成分と一緒にする工程を含み、及び次いで、必要な場合及び／又は望ましい場合、製品を所望の単回用量単位又は多回用量単位に分割するか、成形するか、及び／又は包装することを含む。

【0062】

用途
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を提示し得ることは、しばらく前から知られていた。近年の研究は、ヒトにおけるＣＴＬ応答が、多数のエピトープに向けられ得ることを、示している。

【0063】

本明細書中で、ヒト及び他の哺乳動物におけるインフルエンザウイルス疾患の予防の方法が、提供される。また、対象においてインフルエンザウイルスに対して免疫応答を惹起する方法も、提供される。この方法は、有効量の、本開示のキメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチド又は免疫原性組成物／ワクチンを、対象に投与することによって、対象においてインフルエンザウイルス株（例えば、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７株ならびにサブタイプ）に対する免疫応答特異的を、誘導することを含む。好ましくは、この方法は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を惹起する。より好ましくは、この方法は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７株ならびにサブタイプに対し、より高い抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、より良い中和活性及びより強い交差防御活性を有する、ステム特異的抗体を誘導する。この方法はまた、ワクチン効力を増大し、より多くのＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞産生を伴う。

【0064】

対象における抗体力価は、ワクチン接種後に増大する。例示的な態様において、本開示の免疫組成物又はワクチンは、インフルエンザからの予防的保護を提示するために使用される。インフルエンザからの予防的保護は、本開示のワクチン又は組み合わせワクチンの投与後に達成され得る。ワクチン（組み合わせワクチンを含む）は、１回、２回、３回、４回又はそれ以上の回数で投与され得るが、１回のワクチン投与で充分である可能性が高い（任意選択的に、後に１回のブースターを行う）。したがって、投薬は、調整される必要がある場合がある。

【0065】

予防効果用量は、臨床的に許容できるレベルでインフルエンザウイルスに対して保護する、治療有効用量である。いくつかの実施形態において、治療有効用量は、ワクチンについての包装挿入物に列挙される用量である。

【0066】

本開示のキメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチド又は免疫原性組成物／ワクチンは、治療有効な結果をもたらす任意の経路で投与され得る。これらとしては、限定されないが、皮内、筋肉内及び／又は皮下投与が挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示のキメラインフルエンザウイルスＨＡポリペプチド又は免疫原性組成物／ワクチンは、当該分野で公知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内又は皮内投与され得る。

【0067】

本発明は、以下の記載に示されるか又は図面に図示される構成要素の構成及び配置の詳細にその用途を限定しない。本発明は、他の実施形態及び種々の方法での実践もしくは実施が可能である。

【実施例】

【0068】

方法
ワクチン及びプラスミド構築。２００９年初頭～２０１３年に入手可能であったＨ１Ｎ１ウイルス由来の全部で１０２の完全長ＨＡ配列を、ＮＣＢＩデータベースからダウンロードし、そしてＢｉｏＥｄｉｔプログラムからのＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムによって並べた。各位置において最も保存的なアミノ酸を選択して、共通Ｈ１配列を作成した。共通ヘマグルチニンＨ５（ｐＣＨＡ５－ＩＩ）配列を、以前の記載の通りに作製した。共通ヘマグルチニンＨ５（ｐＣＨＡ５－ＩＩ）及び共通Ｈ１のヌクレオチド配列を、ｐｃＤＮＡ発現ベクター内にクローニングし、そして得られたプラスミドを、ｓｗａｐ及びキメラＨＡ構築のためのテンプレートとして使用した。ＳｗａｐＨ１／５は、ＨＡ１（配列番号８のアミノ酸１～３２７）であるＨ１及びＨＡ２（配列番号８のアミノ酸３２８～５０３）であるＨ５から構成され、球状頭部であるＨ１及びＨ１＋Ｈ５（ＨＡ２）ステムを生じる。ＳｗａｐＨ５／１は、ＨＡ１（配列番号１２のアミノ酸１～３３０）であるＨ５及びＨＡ２（配列番号１２のアミノ酸３３１～５０６）であるＨ１から構成され、球状頭部であるＨ５及びＨ５＋Ｈ１（ＨＡ２）ステムを生じる。キメラＨ５／１構築物については、球状頭部ドメインは、配列番号４のＣ４２～Ｃ２７４の間の残基（Ｈ３番号付け）のアミノ酸配列から構成され、そしてステム領域は、ＨＡ１及びＨＡ２サブユニット（配列番号４のアミノ酸１～４１及び配列番号４の２７５～５１１）の部分からなる。膜貫通ドメインを、バクテリオファージＴ４ｆｉｂｒｉｔｉｎｆｏｌｄｏｎ三量体化配列、トロンビン切断部位及びＨＡのＣ末端の（Ｈｉｓ）_６－タグからのさらなる残基と置き換えた。共通ＨＡの両ＤＮＡ配列を、ヒトに好ましいコドンを用いて発現のために最適化し、そして種々の領域をＰＣＲによって増幅して、その後、発現のためにｐｃＤＮＡベクター内にクローニングした。その上さらに、インフルエンザウイルス季節性Ｈ１Ｎ１Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、パンデミックＨ１Ｎ１Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、Ｈ７Ｎ９Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３及び鳥インフルエンザＨ５Ｎ１Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４由来のＨＡ遺伝子をも最適化し、合成し、そしてｐｃＤＮＡ発現ベクター内にクローニングした。配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認し、そしてタンパク質発現及び精製のために高品質で調製した。

【0069】

発現細胞からの組換え分泌型ＨＡの発現。ヒト上皮性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３Ｓ細胞を、慣用的に１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。一過性形質転換のために、２９３Ｔ又は２９３Ｓ細胞を、１０ｃｍ皿（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）内に播種し、そして全ての手順を、製造業者のプロトコールにしたがって実施した。簡潔にいうと、８０％コンフルーエンシーの２９３Ｔ又は２９３Ｓ細胞を、ＭｉｒｕｓＴｒａｎｓＩＴ^（Ｒ）－ＬＴ１（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）トランスフェクション試薬で、３：１の比の試薬対プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。ＴｒａｎｓＩＴ^（Ｒ）－ＬＴ１試薬を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈し、混合物を、５～２０分間にわたって室温でインキュベートした。この溶液に、プラスミドＤＮＡを加え、そして完全に混合した後、１５～３０分間のインキュベーションを行った。トランスフェクションの前に、細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充した新鮮なＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地で置換した。ＴｒａｎｓＩＴ^（Ｒ）－ＬＴ１試薬／ＤＮＡ複合物を、細胞に加え、そして４８時間にわたって３７℃にてインキュベートした。ヘマグルチニンの発現を、抗（ｈｉｓ）_６抗体（Ｑｉａｇｅｎ）又は特異的抗ヘマグルチニン抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化二次抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いたイムノブロットによって確認した。

【0070】

組換え分泌型ヘマグルチニンの精製。ヒト２９３Ｔ細胞における発現のために、目的の遺伝子を担うｐｃＤＮＡを、高品質で調製し、そしてＭｉｒｕｓＴｒａｎｓＩＴ^（Ｒ）－ＬＴ１（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いて細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培地を収集し、そして１，０００×ｇにて１０分間にわたる遠心分離によって、細胞を清澄化した。上清を、Ｎｉ－ＮＴＡ（ニッケル－ニトリロ三酢酸）アフィニティーカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。上清を、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０及び３００ｍＭＮａＣｌ中で事前に平衡化したＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム上にロードした。未結合タンパク質を、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０及び３００ｍＭＮａＣｌ（緩衝液Ａ）中２５～５０ｍＭのイミダゾール勾配で洗浄した。次いで、ＨＡタンパク質を、緩衝液Ａ中１００～３００ｍＭイミダゾール勾配で溶出した。精製ＨＡタンパク質を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＵｎｉｔ（ＭＷ３０Ｋカットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＰＢＳ、ｐＨ７．４中に濃縮した。純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてモニタリングし、そしてタンパク質を、抗（ｈｉｓ）_６抗体（Ｑｉａｇｅｎ）又は特異的抗ヘマグルチニン抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いたウエスタンブロットを用いて確認した。最後に、ＨＡタンパク質の三量体形態を、サイズ排除カラム、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによって得た。

【0071】

モノグリコシル化ＨＡタンパク質の調製。Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩに欠損のあるＨＥＫ２９３Ｓ細胞を、高マンノースグリカン^３１を有するＨＡを産生するために使用した。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞由来の精製ＨＡタンパク質を、ＥｎｄｏＨ（ＮＥＢ）で２０℃にて一晩処理し、モノグリコシル化ＨＡ_ｍｇを生成した。タンパク質対ＥｎｄｏＨの比は、ＨＡについて３対１（ｗ／ｖ）であった。次いで、ＥｎｄｏＨ及びモノグリコシル化ＨＡタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって分離した。ＨＡ_ｍｇタンパク質を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＵｎｉｔ（ＭＷ３０Ｋカットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＰＢＳ、ｐＨ７．４中に濃縮し、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した。

【0072】

ＨＡタンパク質に対するＮ連結グリコシル化の同定。１０マイクログラムのタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で泳動させ、ゲル消化に備えた。所望のタンパク質バンドを、鋭利なメスで切り出し、１ｍｍ片のさいの目にし、そして１．３ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。５００μｌの５０％ＡＣＮ（アセトニトリル）中２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで３分間にわたって２回洗浄した後、ＳｐｅｅｄＶａｃエバポレーター（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてゲル片を乾燥させた。乾燥サンプルを、１００μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の添加により、３７℃にて１時間にわたって還元し、その後、１０，０００ｇにて１分間遠心分離した。この溶液を除去し、そしてゲルサンプルを、１００μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中１００ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）の添加によってアルキル化工程に進め、そして暗所で室温にて１時間にわたってインキュベートした。５００μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中５０％アセトニトリル及び５００μｌの１００％アセトニトリルでの洗浄後、サンプルを、１０，０００ｇにて１分間にわたって遠心分離し、そして上清を完全に除去した。ゲルサンプルを、ＳｐｅｅｄＶａｃエバポレーターで乾燥させ、そして２００μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中に再溶解した。次いで、ゲルサンプルを、０．５μｇトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）及び１μｇキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で一晩処理した。一晩の消化の後、サンプルに１００μｌの５％ＴＦＡ中５０％アセトニトリルを加えた。サンプルを１０秒間にわたって超音波処理し、次いで、１０秒間にわたって停止した。このプロセスを、１０回繰り返した。ペプチド混合物を含む上清を、サンプルチューブから除去し、そして新しいチューブに移した。この手順を、２回繰り返した。合わせた上清を、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機中で乾燥させ、そしてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために処理した。

【0073】

内毒素測定。内毒素レベルを、Ｐｉｅｒｃｅ^（Ｒ）ＬＡＬＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃＥｎｄｏｔｏｘｉｎＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。タンパク質サンプルを、１０倍、２０倍、１００倍及び１０００倍希釈し、他方で、内毒素標準を、１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１５及び０ｎｇ／ｍｌで調製した。マイクロプレートをヒーティングブロック内で１０分間にわたり３７℃にて平衡化した後、タンパク質サンプル又は標準を、ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｅＬａｓａｔｅ（ＬＡＬ）Ｐｙｒｏｃｈｒｏｍｅ試薬（最終容量１００μｌ）（１：１）と、内毒素非含有ウェル内で３７℃にて１０分間にわたって混合した。１００μｌの基質溶液を各ウェルに加え、そしてプレートを、３７℃にて６分間にわたってインキュベートした。反応を、５０μｌの停止試薬（２５％酢酸）の添加により停止した。ウェルの吸光度を、４０５ｎｍにてＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。標準曲線を、吸光度対対応する標準の濃度をプロットすることによって得た。標準曲線を、サンプルの内毒素濃度を決定するために使用した。全ての精製タンパク質の内毒素値は、０．５ｎｇ／ｍｌ未満であった。

【0074】

マウスワクチン接種。アジュバントＣ３４を、記載のように化学合成し、ＤＭＳＯ中に溶解した。雌６～８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝１０）を、ＰＢＳ中の、５０μｇの水酸化アルミニウム（ミョウバン；Ｓｉｇｍａ）又は２μｇのＣ３４と混合した２０μｇの精製キメラＨＡ_ｆｇ又はＨＡ_ｍｇタンパク質（ｐＨ７．４）により、筋肉内で免疫化した。対照マウスには、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した。３回のワクチン接種を、２週間間隔で行った。血液を、第２回目及び第３回目の免疫化の１４日間後に収集した。血液を、３７℃で３０分間にわたってインキュベートし、そして１，２０００ｒｐｍにて１０分間にわたって遠心分離して、血清を収集した。ワクチン接種マウスから収集した血清中のＨＡ特異的抗体を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び中和アッセイによって評価した。

【0075】

ＥＬＩＳＡによるＨＡ特異的抗体の決定。ＨＡ特異的抗体力価を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、Ｈ７Ｎ９Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３及びＨ５Ｎ１Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４ＨＡタンパク質を基質として用いるＥＬＩＳＡによって検出した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．８）中に５μｇ／ｍｌの濃度で希釈した１ウェルあたり１００μｌのタンパク質でコーティングし、そしてプラスチックシーラーで４℃にて一晩カバーした。プレートをＴＢＳＴ（１３７ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ－ｂａｓｅ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中１％ＢＳＡで３７℃にて１時間にわたってブロックした後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、プレートを、２倍連続希釈の２００μｌのマウス血清と共に、３７℃にて２時間にわたってインキュベートした。血清を除去しそしてプレートを６回洗浄した後、ＨＡ特異的ＩｇＧを、２００μｌの二次ＨＲＰ標識抗マウス抗体（１：８０００）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてモニタリングした。３７℃にて１時間のインキュベーション後、このプレートを、ＴＢＳＴで６回洗浄し、そして１００μｌのＳｕｐｅｒＡｑｕａｂｌｕｅＥＬＩＳＡ基質（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で１分間にわたり現像した。反応を、１００μｌの０．６２５Ｍシュウ酸の添加により停止した。ウェルの吸光度を、４０５ｎｍにてＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。陰性対照（免疫前血清）によって発生した吸光度（ＯＤ）よりも２．５倍高い吸光度を発生したエンドポイント抗体力価を、最も高い希釈の血清として定義した。バックグラウンドエンドポイント抗体力価を、１：５０未満とした。

【0076】

骨髄由来樹状細胞の回収。ＧＭ－ＣＳＦ培養骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、以前の記載のように調製した。簡潔にいうと、骨髄単細胞浮遊物を、ＲＢＣ溶解に供し、赤血球（ＲＢＣ）を除去した。残った細胞を、１０ｍｌの２０ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ－ＣＳＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１０％ＦＢＳ（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ）、５０μＭ２－ＭＥ、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を、各シャーレ内でプレート培養し、２×１０^６細胞／シャーレの最終細胞密度を達成した。培養物に、３日目に２０ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ－ＣＳＦを補充した１０ｍｌの新鮮な培養培地を加えることによって再度満たし、６日目には２分の１容量の上述の完全培養培地によってリフレッシュした。８日目に、ゆっくりとピペッティングすることによって非接着細胞を集めることにより、未成熟ＢＭＤＣを回収し、そして１０^６／ｍｌの密度で再度プレート培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイのために、未成熟ＢＭＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びキメラＨＡタンパク質（１００μＬ中０．１ｍｇ／ウェル）と４８時間にわたって共培養した。グランザイムＢ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、洗浄後のフローサイトメトリー分析によって決定した。

【0077】

酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、抗マウスＩＦＮ－γ、ＩＬ－４（ＭａｂｔｅｃｈＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）又はグランザイムＢ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者の指示にしたがってコーティングした。プレートを、４回洗浄し、そして３０分間にわたり１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０と共にインキュベートした。キメラ免疫化マウス由来のＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びグランザイムＢ分泌細胞の検出のために、脾細胞を収集し、そして１ウェルあたり５×１０^５で３７℃にて５％ＣＯ_２中で２４時間にわたって、再刺激のために、ＨＡ由来の特異的ペプチドと共に培養した。細胞を取り出し、そしてビオチン化抗マウスＩＦＮ－γ、ＩＬ－４（ＭａｂｔｅｃｈＡＢ）又はグランザイムＢ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）特異的抗体と共にインキュベートした。プレートを５回洗浄した後、ストレプトアビジン－ＡＬＰ結合体を添加し、そして即時使用可能ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質を用いて現像した。乾燥後、生じたスポットの数を、ＩｍｍｕｎｅＳｐｏｔＲｅａｄｅｒ（ＣｅｌｌｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ．）によって分析した。データを、３連のウェルから得た。

【0078】

中和アッセイ。１００ＴＣＩＤ_５０のウイルスを含む培養物上清を、等容量の２倍連続希釈した血清と混合し、そして３７℃にて１時間にわたってインキュベートした。次いで、この混合物を、９６ウェルプレートの各ウェル内のＭＤＣＫ細胞に添加し、そして３７℃にて３日間にわたってインキュベートした。この細胞に、３０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ＡＴＰ存在の定量を基にして生存細胞の数を決定した。血清の中和活性を、細胞がウイルス誘導による死から有意に保護された最大希釈倍率として決定した。

【0079】

マイクロ中和アッセイ。ウイルスを１００ＴＣＩＤ_５０で含む感染培地（０．３％ＢＳＡ、２μｇ／ｍｌＴＰＣＫ－トリプシンで補充したＤＭＥＭ）を、等容量の２倍連続希釈の血清と混合し、３７℃にて１時間にわたってインキュベートした。次いで、この混合物を、９６ウェルプレートの各ウェル内のＭＤＣＫ細胞（１ウェルあたり１．５×１０^４細胞）に添加し、そして３７℃にて１６～２０時間にわたってインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、アセトン／メタノール溶液（容量／容量１：１）中で固定し、そして５％スキムミルクでブロックした。１時間の３７℃でのインキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄し、そしてウイルス力価を、１００μｌのインフルエンザＡＮＰ（１：２５００）に対するｍＡｂを用いることによってモニタリングした。３７℃にて１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄し、そして１００μｌの二次ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（１：５０００）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を加えた。３７℃にて１時間のインキュベーション後、ウェルを再びＰＢＳＴで６回洗浄し、そして５０μｌの１ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ）によって１分間にわたって現像させた。反応を、５０μｌの１ＭＨ_２ＳＯ_４の添加によって停止した。ウェルの吸光度を、４５０ｎｍにて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。

【0080】

抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性レポーターアッセイ。９６ウェル平底プレートの各ウェル内のＭＤＣＫ細胞（１ウェルあたり１×１０^４細胞）を、３７℃にて２４時間にわたってインキュベートした。翌日、１×１０^４ＭＤＣＫ細胞に、インフルエンザウイルスを、１の感染（ＭＯＩ）多重度で２４時間にわたって感染させた。次いで、培地を、４％ＬｏｗＩｇＧ血清を補充したＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地１６４０で置き換え、その後、連続希釈のキメラＨＡタンパク質ワクチン接種マウス由来抗血清を加え、３７℃にて３０分間にわたってインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞発現マウスＦｃγＲＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、４％ｌｏｗＩｇＧＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に浮遊させ、そして１：５の標的細胞：エフェクター細胞比を、感染ＭＤＣＫ細胞に加えた。３７℃にて６時間にわたるインキュベーション後、アッセイプレートを、３７℃インキュベーターから取り出し、そして１５分間にわたり周囲温度にて平衡化した後に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^ＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１：１の比で加えた。発光を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーにおいて測定した。

【0081】

ウイルスチャレンジ実験。２週間間隔での３回のワクチン接種の２週間後、免疫化マウスを、Ｈ１Ｎ１Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／０３／２００６ならびにリアソータントなＨ５Ｎ１ウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４／ＮＩＢＲＧ１４及びＨ５Ｎ１Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５／ＮＩＢＲＧ２３の１０ＬＤ_５０（５０％のマウスの死をもたらすウイルス用量）により、鼻腔内チャレンジした。感染後、マウスを、１４日間にわたって毎日観察し、そして生存及び体重を記録した。体重の百分率を、毎日の体重をチャレンジ前の体重と比較することによって１群あたり動物各個体について計算し、そして初期重量の２５％を超えて体重減少したマウスを屠殺し、死亡として評点した。マウス研究は、ＡｃａｄｅｍｉａＳｉｎｉｃａの施設内動物管理使用委員会によって承認されている。全ての動物実験を、バイオセイフティーレベル－３拡張条件下で実施した。

【0082】

組換えＦ１０抗体の発現及び精製。Ｆ１０抗体をコードするプラスミドを、無血清馴化ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｆ細胞内にポリエチレンイミンを用いてトランスフェクトし、そしてオービタルシェーカープラットフォーム上で１３５ｒｐｍにて回転する１２５ｍｌ無菌エルレンマイヤーフラスコ内のＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。上清を、トランスフェクションの７２時間後に収集し、そして細胞を、１，０００×ｇでの１０分間にわたる遠心分離によって清澄化した。上清を、５カラム容量（ＣＶ）のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）洗浄緩衝液（ｐＨ７．０）及びその後５ＣＶの洗浄緩衝液において事前に平衡化した、プロテイン－Ａカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。Ｆ１０抗体を、０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出し、そして画分を、０．５ｍＬ１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ９．０を中和のために含むチューブ内に収集した。精製を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いることによってモニタリングした。

【0083】

統計学的分析。免疫応答の評価のために使用した動物実験を、少なくとも３回繰り返し（１群あたりｎ＝５）、そしてウイルスチャレンジ研究を、少なくとも２回（１群あたりｎ＝１０）行った。統計学的分析のために、各マウスの応答を、個々のデータ点として計数した。動物研究から得られたデータを、Ｐｒｉｓｍからの双方向ＡＮＯＶＡを用いて調べた；データを、平均±ＳＥＭとして表し、そして相違は、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１において有意であるとみなした。

【0084】

実施例１モノグリコシル化キメラＨＡの調製及び性質決定。
普遍的なワクチンを設計するため、本発明者らは、まず、インフルエンザＡウイルス群１（Ｈ１及びＨ５は主要なサブタイプであるが、他方で、Ｈ２、Ｈ６、及びＨ９は少数のサブタイプである）に対する広範な保護を有するワクチンを得ることを目的とした。したがって、２００９年初頭～２０１３年に入手可能であったＨ１Ｎ１ウイルス由来のＨＡ配列を使用して、共通Ｈ１配列を作成した。次いで、共通Ｈ５及び共通Ｈ１を、ワクチン設計のためのテンプレートとして使用した。インフルエンザウイルス複製において、ＨＡ前駆体（ＨＡ０）は、２つのサブユニット、ＨＡ１及びＨＡ２に、タンパク質分解的に開裂する；ＨＡ１サブユニットは、５－Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）結合部位を担い、そしてＨＡ２サブユニットは、宿主細胞膜とのウイルス融合を担う（図５Ａ）。他方で、ＨＡは、３次元（３Ｄ）構造に基づいて２つの構造的ドメインである球状頭部及びステムに分けられ得る。ステム領域は、ＨＡ２ドメイン、Ｎ末端３６～５０残基及びＨＡ１ドメインのＣ末端の短い鎖を含む。したがって、本発明者らは、ワクチンを、Ｈ１及びＨ５からのドメインの種々の組み合わせに基づき設計した。本発明者らは、まず、比較のために、ｓｗａｐＨ１／５（Ｈ１球状頭部及び［Ｈ１＋Ｈ５（ＨＡ２）ステム］、ｓｗａｐＨ５／１（Ｈ５球状頭部及び［Ｈ５＋Ｈ１（ＨＡ２）ステム］、ならびにキメラＨ５／１（Ｈ５球状頭部及びＨ１ステム）を作製した（図１Ａ及び図５Ａ）。この結果は、共通Ｈ１Ｎ１及びｓｗａｐＨ１／５による免疫化が、交差防御的な活性を誘導せず、しかしｓｗａｐＨ５／１及びキメラＨ５／１は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスに対する交差中和活性を惹起したことを示した（図１Ｂ）。本発明者らは、次に、この交差防御がＣＤ８^＋Ｔ細胞応答によるものであるか否かを調べ、そして、グランザイムＢがキメラＨ５／１－免疫化マウスにおいてより多く分泌されていることを見出した。このことは、キメラＨ５／１ワクチンは、ｓｗａｐＨ５／１ワクチンと比較して、より強いＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を誘導することを示唆する。

【0085】

実施例２キメラＨ５／１（ｃＨＡ）の免疫応答に対するグリコシル化の効果
異なるグリコシル化状態を有するキメラＨ５／１（ｃＨＡ）ワクチンの免疫原性を調べるため、モノグリコシル化ｃＨＡ（ｃＨＡ_ｍｇ）及び完全グリコシル化ｃＨＡ（ｃＨＡ_ｆｇ）ワクチンを比較した（図５）。Ｅｎｄｏ－Ｈは、高マンノースについて特異的であるが、複合型グリカンについて特異的ではない。Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩが欠損しており、高マンノース型Ｎ－グリカンを有する糖タンパク質を産生する、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞において発現されるＨＡ糖タンパク質を、Ｅｎｄｏ－Ｈで処理して、Ｎ－グリカンを１つのＧｌｃＮＡｃ残基に切断させた。ｃＨＡ_ｍｇを産生するために、ｃＨＡを、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３Ｓ）から産生させ、そして精製した高マンノースグリカンを有するｃＨＡを、Ｅｎｄｏ－Ｈで処理して、Ｎ－グリカンの外側部分を取り除き、各グリコシル化部位のアスパラギン残基に結合したＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を１つのみ有するＨＡを生成した。Ｅｎｄｏ－Ｈ処理の後、混合物をゲル濾過し、Ｅｎｄｏ－Ｈを三量体ｃＨＡ_ｍｇから分離した。濃縮後、ｃＨＡ_ｍｇタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）及び液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析に供して、純度及びグリカン組成（図５Ｃ）を確認した。インフルエンザＨＡは、ウイルス表面上で三量体として存在するので、ゲル濾過を実施し、ｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇが三量体として存在すること（２００ｋＤａを超える）を確認した（図５Ｄ）。本発明者らは、また、比較のために、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）由来の別の完全グリコシル化ｃＨＡ_ｆｇを作製した（図５Ｂ）。この細胞培養物は、約６ｍｇ／Ｌの収量のｃＨＡ_ｆｇをもたらした。

【0086】

組換えｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇのＮ連結グリコシル化部位及びグリカンプロファイルを、７つのグリコシル化部位（Ｎ２８、Ｎ４０、Ｎ１７１、Ｎ１８２、Ｎ２９２、Ｎ３０３、及びＮ４９７）を示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した；ｃＨＡ_ｆｇのＮ－グリカンは、ほぼ複合型であり、ｃＨＡ_ｍｇは、約９９％がＮ－グリコシル化部位の各々においてＧｌｃＮＡｃのみを有する単一の糖型として得られ得る（図５Ｅ及び表１）。

【0087】

【表1】

【0088】

実施例３完全グリコシル化キメラＨ５／１（ｃＨＡ_ｆｇ）及びモノグリコシル化キメラＨ５／１（ｃＨＡ_ｍｇ）によって免疫化したマウスからの抗血清の交差反応性
ｃＨＡ構築物によって惹起される抗体の結合活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａｌ（ＯＨ）_３又はＣ３４（α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）のアナログである）をアジュバントとした２０μｇのｃＨＡｆｇ又はｃＨＡｍｇタンパク質によって筋肉内で免疫化した。このマウスを、０、２、及び４週間目に免疫化し、そしてＨＡに誘導された血清を、２８日目及び４２日目に得、そして種々の組換えＨＡ（図６）を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。２回の免疫化後の抗血清の最大希釈と比較し、３回の免疫化は、ＨＡ特異的抗体のより高い力価を有する抗血清を実際に産生した（図１Ｄ～Ｉ及び図７）。そしてｃＨＡ_ｍｇによるワクチン接種は、ｃＨＡ_ｆｇと比較してより良い抗体応答を誘導した（図１Ｄ、Ｅ、及びＧ）。さらに、ｃＨＡ_ｍｇからの抗血清は、Ｈ３及びＨ７ＨＡタンパク質に対してわずかに優れた結合を示し（図１Ｆ及びＨ）、Ａｌ（ＯＨ）_３アジュバントとＣ３４アジュバントとの間に有意な相違は観察されなかった。これらのデータは、ｃＨＡワクチンが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１ならびにＨ７Ｎ９株由来のＨＡを認識する交差反応性抗体を惹起し得たことを示す。

【0089】

Ｆ１０は、インフルエンザウイルスの種々のサブタイプの間で非常に保存されているＨＡのステム領域を標的することが知られる、広範に中和するＩｇＧ抗体である。Ｆ１０の組換えＨ１、Ｈ５、及びｃＨＡに対する結合を比較するため、Ｆ１０の種々のＨＡに対する結合アビディティを測定した。その結果は、Ｆ１０が、Ｈ１、Ｈ５及びｃＨＡタンパク質に結合し得たことを示した（図８）。Ｆ１０様抗体がｃＨＡワクチン接種によって惹起されるかを調べるため、ｃＨＡによって誘導された血清のＨＡステム番号４９００に対する結合を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。この結果は、ｃＨＡ_ｍｇワクチンが、ｃＨＡ_ｆｇよりも高いステム特異的抗体力価を誘導し得ることを示し（図１Ｉ及び図７Ｆ）、そしてより良い結果が、Ｃ３４をアジュバントに伴うｃＨＡワクチンによって観察された（図１Ｉ）。これは、より多くのステム特異的抗体を誘導した。

【0090】

実施例４ｃＨＡ_ｍｇ及びアジュバントＣ３４によるマウスのワクチン接種は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５ウイルス及びそのサブタイプに対する強いＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞応答、抗体依存性エフェクター機能ならびに中和活性を惹起する
抗体媒介型中和と比べて、Ｆｃ媒介型エフェクター機能もまた、インフルエンザ感染に対する保護において重要な役割を果たす。したがって、本発明者らは、抗体がＦｃ受容体媒介型免疫応答を誘導するか否かを試験した。マウスに適合したＡＤＣＣアッセイを、ＦｃγＲＩＩＩを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を用いて実施し、ｃＨＡｆｇ及びｃＨＡｍｇによって免疫化したマウス由来の血清のＡＤＣＣ活性を評価した（図２）。予想したとおり、ｃＨＡ_ｆｇ又はｃＨＡ_ｍｇをワクチン接種したマウス由来の血清は、Ｈ５Ｎ１ＮＩＢＲＧ１４（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）、ＮＩＢＲＧ２３（Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５）、ＲＧ５（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５）、又はＲＧ２（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５）ウイルスに対して比較に値するレベルのＡＤＣＣ活性を誘導した。興味深いことに、より良いＡＤＣＣ活性が、Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとしたｃＨＡ_ｍｇ群において観察され（図２Ｂ）、そして類似の結果が、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／３／２００６、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（図２Ａ）、Ｈ３Ｎ２Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５及びＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１ウイルスに対する実験において観察された（図２Ｃ）。

【0091】

ｃＨＡ免疫化マウスにおける抗原特異的サイトカイン分泌細胞の役割を評価するために、脾細胞を、２回及び３回の免疫化後に収集し、そしてＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、及びグランザイムＢ（ＧｚＢ）分泌細胞を、刺激のためにＨＡ由来の特異的ペプチドを用いた酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって評価した。図３に示されるように、Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇ及びｃＨＡ_ｍｇワクチンは、類似のレベルのサイトカイン分泌細胞を産生した。しかし、より多くのＣＤ４^＋／ＩＦＮ－γ^＋Ｔｈ１細胞（図３Ａ）、ＣＤ４^＋／ＩＬ－４^＋Ｔｈ２（図３Ｂ）及びＣＤ８^＋ＧｚＢ分泌型細胞（図３Ｃ）が、Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとしたよりもＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｍｇワクチン接種において惹起された。これらの結果は、Ｃ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｍｇが、ｃＨＡ_ｆｇと比較してより多くのＣＤ４^＋Ｔヘルパー応答及びより強いＣＤ８^＋細胞傷害性効果を刺激することを確認した。

【0092】

抗体力価及び細胞媒介型免疫に対するＣ３４の用量依存性を評価するために、マウスを、０．５、２及び１０μｇの３つの異なる用量のＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇによって、筋肉内で免疫化した。結果は、２回又は３回の免疫化後に、２μｇのＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇが、０．５及び１０μｇのＣ３４によるよりも高い力価を誘導化したことを示した（図９）。さらに、３回の免疫化後に、２μｇのＣ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｆｇワクチンは、０．５及び１０μｇのＣ３４よりも多くのＩＦＮ－γを誘導し（図１０Ａ）、ならびに２及び１０μｇのＣ３４は、０．５μｇのＣ３４よりも多くのＩＬ－４を誘導した（図１０Ｂ）。他方で、ｃＨＡ_ｆｇワクチンが０．５、２、又は１０μｇのＣ３４をアジュバントとした場合に、２回及び３回の免疫化後、ＣＤ８^＋ＧｚＢ分泌細胞における増大に関して、相違はなかった（図１０Ｃ）。これらの観察に基づき、２μｇのＣ３４を、実験を通じて使用した。

【0093】

ｃＨＡによって誘導された抗血清の中和活性を、さらに調べた。ｃＨＡ_ｍｇワクチン接種からの抗血清は、同種のウイルスＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（図３Ｄ）及び異種のウイルスＨ５Ｎ１ＮＩＢＲＧ１４（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）、ＮＩＢＲＧ２３（Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５）、ＲＧ５（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５）又はＲＧ２（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５）に対して、より良い中和活性を有することを示した（図３Ｅ）。さらに、ｃＨＡ_ｍｇでワクチン接種したマウス由来の抗血清は、異種のウイルスＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９及びＡ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／３／２００６に対して有意な中和活性を示す（図３Ｄ）。ｃＨＡ免疫化マウス由来の抗血清は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスの感染を明らかにブロック可能であり、そしてｃＨＡ_ｍｇの中和活性は、一般に、ｃＨＡ_ｆｇよりも高く、特に、異種のウイルスに対して高い。

【0094】

実施例５チャレンジ研究において、ｃＨＡ_ｍｇ／Ｃ３４によるマウスのワクチン接種は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ならびにそのサブタイプに対する交差防御を提供する
ｃＨＡ_ｍｇワクチン接種が種々のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスに対して広範に交差防御的な免疫を提供するか否かを評価するために、ワクチン接種マウスを、致死用量の多数のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスによって鼻腔内接種によりチャレンジし、そしてワクチン保護の効力を、生存率及び体重変化を記録することにより、１４日間にわたって評価した（図４及び図１１）。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ウイルスでチャレンジしたマウスについて、全てのｃＨＡワクチンは、１００％の保護を提供した（図４Ａ）、さらに、Ｃ３４をアジュバントとして用いるｃＨＡ_ｍｇによって免疫化したマウスは、ｃＨＡ_ｆｇと比較して最小量の体重減少を示した（図１１Ａ）。Ｃ３４をアジュバントとして用いるｃＨＡ_ｆｇによって免疫化したマウスは、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９チャレンジに対し、３０％の保護しか得なかった；しかし、Ｃ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｍｇワクチンは、交差株Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９ウイルスに対して９０％の保護を提供し、そして類似の結果が、Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとして用いるｃＨＡワクチン接種において観察された（図４Ｂ）。交差株Ａ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスによってチャレンジしたマウスについて、Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとして用いるｃＨＡによって免疫化した全てのマウスが生存した；しかし、Ｃ３４をアジュバントとして用いるｃＨＡ_ｆｇによって免疫化したマウスは、８０％の保護しか得なかった（図４Ｃ）。Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／０３／２００６による致死量チャレンジもまた、実施した。Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとして用いるｃＨＡによって免疫化した全てのマウスが、より低い保護を示した；しかし、Ｃ３４をアジュバントとして用いるｃＨＡ_ｍｇによって免疫化したマウスは、交差株Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／０３／２００６ウイルスに対してより良い保護を示した（図４Ｄ）。Ｈ５Ｎ１ＮＩＢＲＧ１４（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）及びＮＩＢＲＧ２３（Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５）によってチャレンジしたマウスについて、全ての免疫化マウスが生存した（図４Ｅ及びＦ）。生存チャレンジ後の体重変化をも、評価した（図１１）。データは、ｃＨＡが、種々のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスに対する有意な保護免疫を惹起することにおいて有効であり、そしてｃＨＡ_ｍｇが、ｃＨＡ_ｆｇと比較してより広い交差防御能力を提供することを、示した。

【0095】

インフルエンザウイルスの多数の株及びサブタイプに対して保護を提供するための、普遍的インフルエンザワクチンの開発に、現在関心が寄せられており、そして普遍的ワクチン開発のために使用されるエピトープは、２４の非グリコシル化アミノ酸、核タンパク質ＮＰを含むＭ２の非常に保存的な外部ドメイン及びＨＡ－ステム領域を標的するか又はウイルス侵入をブロックして広範に中和抗体のより高い力価を誘導することが示されている種々のＨＡ構築物を、含む。例えば、再編成したステムサブユニットを有する可溶性三量体ＨＡ（ミニ－ＨＡ）ワクチンが、異種及び異なるサブタイプのウイルスによる致死量チャレンジからマウスを完全に保護することが示され、そしてＤＮＡプライムプロテインブーストによるキメラＨＡワクチン接種ならびに同じステム領域及び多様な外来性頭部ドメインへの曝露が、広範に保護的なステム特異的抗体を惹起することが、示されている。しかし、この結果は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が、交差防御活性においてカギとなる役割を果たさなかったことを示した。ＤＮＡワクチンは有望であるが、未だ開発の初期段階にある。本研究において、球状頭部の共通Ｈ５及びステム領域の共通Ｈ１を発現するｃＨＡ構築物が、鳥ウイルスからヒトへと伝染するインフルエンザウイルスの実際の状況を模倣するように設計されている。完全グリコシル化ｃＨＡ_ｆｇ及びモノグリコシル化ｃＨＡ_ｍｇの両方を比較のために調製し、そしてその結果は、ｃＨＡ_ｍｇワクチンが、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を介して（図３Ａ～Ｃ）、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７サブタイプに対する交差反応性抗体のより高い力価を惹起したことを示した（図１Ｄ～Ｈ）。

【0096】

ＨＡのグリコシル化が、タンパク質折り畳み及び安定性、その生物学的活性における調節（中和抗体由来の抗原性部位が免疫原性を低減されることから守ることを含む）において重要な役割を果たすことが、示された。さらに、超グリコシル化ＨＡが、超可変頭部ドメインにおける抗原性部位をマスクするように発展し、それによって、免疫応答が保存的ステム領域に再度向けられた。本発明者らの結果において、ｃＨＡ_ｍｇ抗血清の中和活性は、ｃＨＡ_ｆｇによって誘導された抗血清よりも著しく優れており、特に、異種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ／０３／２００６、及びＡ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９に対して優れていた（図３Ｄ）。ｃＨＡ_ｍｇワクチンのより広範な中和活性は、おそらく、以前に報告されているように多くの抗体バリアントの誘導によるものであろう。ＩｇＧは、マウスに存在する優勢な抗体であり、ＡＤＣＣを誘導する免疫細胞上のＦｃγＲＩＩＩ受容体に対する高いアビディティを有するＨＡ特異的抗体の主要なサブタイプである。本発明者らは、ｃＨＡ_ｍｇによる免疫化が、より高いＡＤＣＣを誘導し、そしてより良い保護活性を有するステム特異的抗体をより多く誘導することを示した（図１Ｉ及び２）。このことは、ＡＤＣＣがインビボでのインフルエンザ保護のために必要であることを示す研究と一致する。水酸化アルミニウム（ミョウバン）は、Ｔｈ２応答を刺激することが公知であり、ＦＤＡによってワクチンアジュバントとしての使用が認可されている；しかし、その作用様式は、充分に研究されていない。糖脂質Ｃ３４は、樹状細胞におけるＣＤ１ｄに対するリガンドでありかつＣＤ１ｄによって提示されており、不変のナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞上の受容体と相互作用し、ｉＮＫＴ細胞を刺激し、アジュバント効果を有するＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）及びクラススイッチ活性を有するＴｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ－４）を産生させる。本発明者らの結果において、ＩＦＮ－γ（Ｔｈ１サイトカイン）、ＩＬ－４（Ｔｈ２サイトカイン）分泌性細胞及びグランザイムＢ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数は、Ａｌ（ＯＨ）_３をアジュバントとするよりも、Ｃ３４をアジュバントとしたｃＨＡ_ｍｇによる免疫化によって、有意に増加した（図３Ａ～Ｃ）。

【0097】

まとめると、広範囲保護的な免疫応答を有する次世代のインフルエンザワクチンの開発に、現在関心が寄せられており、普遍的ワクチンの開発に手が届きそうないくつかの有望な結果が報告されている。この目的に向かう努力において、本発明者らは、本研究において、共通Ｈ５頭部及び共通Ｈ１ステムを有するモノグリコシル化ｃＨＡワクチンが、異種インフルエンザウイルス（中和研究においてＨ１、Ｈ３、Ｈ５、及びＨ７ウイルスならびにサブタイプを含み、チャレンジ研究においてＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、及びサブタイプを含む）に対し、広範な保護活性を示す有効なインフルエンザワクチンであることの原理証明を、首尾よく実証した。インフルエンザＡウイルスの異なる株及びサブタイプに対する広範に保護的なワクチンの開発におけるこの成功により、本発明者らは、本研究において開発した戦略を、インフルエンザＡ及びＢウイルスに対するより広い普遍的ワクチンを設計するために使用することを志す。

【図1-1】