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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-14
(54)【発明の名称】抗ＣＤ２５抗体、その抗原結合断片及びその医薬用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230607BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230607BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230607BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230607BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230607BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230607BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230607BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230607BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230607BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230607BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230607BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230607BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230607BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12N1/19
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K48/00
A61P37/04
A61P35/00
A61P43/00 105
G01N33/574 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022567574
(86)(22)【出願日】2021-05-14
(85)【翻訳文提出日】2022-11-07
(86)【国際出願番号】 CN2021093791
(87)【国際公開番号】W WO2021228218
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】202010408502.3
(32)【優先日】2020-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516174219
【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】520392096
【氏名又は名称】上海盛迪医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＨＥＮＧＤＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１２８８ Ｈａｉｋｅ Ｒｏａｄ， Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｔｏｗｎ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２１０， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】陳 思萌
(72)【発明者】
【氏名】張 偉
(72)【発明者】
【氏名】姜 福偉
(72)【発明者】
【氏名】廖 成
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AA77X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC411
4C084ZC412
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB42
4C085BB43
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗ＣＤ２５抗体、その抗原結合断片及びその医薬用途を提供する。具体的には、抗ＣＤ２５抗体及びその抗腫瘍薬を調製する用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、１）前記ＶＨは、配列番号１７におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
２）前記ＶＨは配列番号１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
３）前記ＶＨは配列番号３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
４）前記ＶＨは配列番号５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
５）前記ＶＨは配列番号７におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号８におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
６）前記ＶＨは配列番号９におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１０におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
７）前記ＶＨは配列番号１１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
８）前記ＶＨは配列番号１３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、或いは
９）前記ＶＨは配列番号１５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
前記ＣＤＲはＫａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムによって定義され、好ましくは、前記ＣＤＲはＫａｂａｔ番号付けシステムによって定義される、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
ＶＨとＶＬを含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、１）前記ＶＨはそれぞれ配列番号４５、４６、４７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬはそれぞれ配列番号４８、４９、５０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
２）前記ＶＨはそれぞれ配列番号２７、２８、２９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬはそれぞれ配列番号３０、３１、３２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
３）前記ＶＨはそれぞれ配列番号３３、３４、３５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬはそれぞれ配列番号３６、３７、３８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、或いは
４）前記ＶＨはそれぞれ配列番号３９、４０、４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬはそれぞれ配列番号４２、４３、４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記抗ＣＤ２５抗体はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、好ましくは、前記抗ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である、
請求項１～２の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
１）前記ＶＨはＩＧＨＶ１－４６＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、且つ前記ＶＬはＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、２）前記ＶＨはＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ２、ＩＧＨＶ１－６９＊０２から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１＿１４から選ばれるＦＲ４を含み、且つ前記ＶＬはＩＧＫＶ３－１１＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＫＶ５－２＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＫＶ６－２１＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ４＊０１＿１２から選ばれるＦＲ４を含み、
３）前記ＶＨはＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＨＶ４－３１＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＨＶ１－３＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、且つ前記ＶＬはＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ２＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、或いは
４）前記ＶＨはＩＧＨＶ３－２３＊０４から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、ＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、且つ前記ＶＬはＩＧＫＶ２－２８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含む、
請求項１～２の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
前記ＶＨは配列番号２５で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号２６で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記ＶＨは配列番号５９で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号６０で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号１で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号２で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号３で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号４で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号５で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号６で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号７で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号８で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号９で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号１０で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号１１で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号１２で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号１３で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号１４で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号１５で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号１６で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号１７で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号１８で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記ＶＨは配列番号１９で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号２０で示され、
前記ＶＨは配列番号２１で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号２２で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、或いは
前記ＶＨは配列番号２３で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記ＶＬは配列番号２４で示され、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有する、
請求項１～４の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗原結合断片はｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗ＣＤ２５抗体はＩｇＧ抗体であり、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４であり、好ましくは、前記抗ＣＤ２５抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合能力を向上させ、及び／又はＦｃγＲＩＩｂとの結合能力を低減するために、Ｆｃ領域において脱フコシル化部位を有し、
より好ましくは、前記脱フコシル化部位は２９７位である、
請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項8】
重鎖と軽鎖を含み、１）前記重鎖は配列番号５１で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記軽鎖は配列番号５２で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
２）前記重鎖は配列番号５３で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記軽鎖は配列番号５４で示され、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有し、
３）前記重鎖は配列番号５５で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記軽鎖は配列番号５６で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
４）前記重鎖は配列番号５７で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記軽鎖は配列番号５８で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、或いは
５）前記重鎖は配列番号６１で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記軽鎖は配列番号６２で示され、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有する、
請求項１～７の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項9】
前記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は以下の特徴のうちの少なくとも１つを有し、即ち、（ａ）ヒトＣＤ２５と結合するＫＤ値が１×１０－７Ｍ未満であり、
（ｂ）ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制しないか又は基本的に抑制せず、
（ｃ）腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇを消耗し、Ｔｅｆｆの機能に影響を与えないか又は基本的に影響を与えず、
（ｄ）１よりも高い活性化抑制率（Ａ／Ｉ）でＦｃγ受容体と結合し、
（ｅ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及び／又はＦｃγＲＩＩｂとの結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩａと結合し、好ましくは、ＦｃγＲＩＩｂとの結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩａと結合し、
（ｆ）腫瘍の成長を抑制し、及び
（ｇ）強化されたＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ反応を誘発し、好ましくは、増加されたＡＤＣＣ反応を誘発する、
請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項10】
請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片と競合してヒトＣＤ２５と結合し、或いは競合して同じヒトＣＤ２５エピトープと結合し、又はそれと結合する、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片。
【請求項11】
請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項12】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は細菌、酵母又は哺乳動物細胞であり、
より好ましくは、前記宿主細胞は大腸菌、ピキア酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト胎児腎臓２９３細胞である、
宿主細胞。
【請求項14】
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、請求項１３に記載の宿主細胞に請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を発現することと、
前記宿主細胞から前記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を単離することと、
を含む、方法。
【請求項15】
請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片と、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターと、
を含む、医薬組成物。
【請求項16】
請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、請求項１１に記載のポリヌクレオチドと請求項１５に記載の医薬組成物から選ばれる何れか一項又はそれらの任意の組み合わせの、がんを治療するための薬剤又は医薬組成物の調製における用途。
【請求項17】
がんに罹患した対象を治療する方法であって、対象に治療有効量の請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の医薬組成物又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含む、
方法。
【請求項18】
対象の腫瘍内部又は腫瘍浸潤性のＴｒｅｇ細胞数を低減し、及び／又はその活性を抑制する方法であって、対象に治療有効量の請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の医薬組成物又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含む、
方法。
【請求項19】
対象の腫瘍内部のＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇの割合を増加する方法であって、対象に治療有効量の請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の医薬組成物又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含む、
方法。
【請求項20】
対象の体内での腫瘍細胞に対するＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを強化させる方法であって、対象に治療有効量の請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の医薬組成物又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含む、
方法。
【請求項21】
前記対象はがん又は腫瘍に罹患しており、好ましくは、前記がん又は腫瘍は扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、肝細胞がん（ＨＣＣ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）がん、腎がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎がん、前列腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形性膠芽細胞腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がんと頭頸部がんから選ばれる、
請求項１６の用途と請求項１７～２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項22】
体内又は体外でＣＤ２５を検出する方法であって、請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片、及び／又は請求項１１に記載のポリヌクレオチドを使用することを含み、
好ましくは、ＣＤ２５が存在する場合、前記抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片、ポリヌクレオチドと前記ＣＤ２５との間の相互作用を検出する、
方法。
【請求項23】
ＣＤ２５を検出するための試薬キットであって、請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片及び／又は請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、
試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２０年５月１４日に提出された中国特許出願（出願番号２０２０１０４０８５０２．３）の優先権を主張する。上記中国特許出願の全文は、本願に援用されている。
【0002】
本開示は、生物医薬分野、特にがん免疫治療分野に属し、がん（例えば、固形腫瘍）を治療する方法を含み、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
腫瘍免疫療法は、腫瘍治療分野においてよく注目されている課題であり、現在、主に、腫瘍内部のＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞を向上させたり、腫瘍内部の抑制型免疫細胞の数と活性を抑制すること、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髓由来の抑制性細胞ＭＤＳＣや腫瘍関連マクロファージ細胞を抑制することにより達成される。腫瘍内部のＴｒｅｇ細胞の低減又は除去による治療対策は、既に臨床的に検証された。
【0004】
ＣＤ２５は、２７２個のアミノ酸からなるＩ型膜タンパク質であり、そのＴ細胞での発現がＴＣＲシグナルによって調節されるので、よくＴ細胞が活性化された印とされている。ＩＬ－２は、免疫活性化作用を有し、腫瘍を治療する免疫調節剤であり、細胞表面のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を介して作用を果たす。ＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２Ｒα（即ち、ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（即ち、ＣＤ１２２）とＩＬ－２Ｒγ（即ち、ＣＤ１３２）という３つのサブユニットを含む。３つのサブユニットは、３つのサブユニットＩＬ－２Ｒα／β／γの全てを含む高結合力受容体、ＩＬ－２Ｒβ／γを含む中等結合力受容体と、ＩＬ－２Ｒαである低結合力受容体という３つの受容体形態を形成することができる。ＩＬ－２Ｒα（即ち、ＣＤ２５）は、単独でＩＬ－２との親和性が比較的低く（Ｋｄが１０－８ Ｍ）、且つ細胞内シグナルを伝達しない。ＩＬ－２ＲβとＩＬ－２Ｒγは、ＩＬ－２による下流シグナル伝達経路の活性化に必要なもので、ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγと同時に結合する場合、２つの受容体サブユニットはヘテロ二量体を形成する。ＩＬ－２Ｒα（即ち、ＣＤ２５）は、ＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγと合わせて高親和性の受容体（Ｋｄが１０－１１ Ｍ）を形成する場合、下流ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ及びＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化することで、Ｔ細胞、ＮＫ細胞などのリンパ球の増殖と活性を促進することができる。
【0005】
一部の既存の抗ＣＤ２５抗体は、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害又は抑制し、例えば、ＷＯ２００４／０４５５１２、ＷＯ２００６／１０８６７０、ＷＯ１９９３／０１１２３８、ＷＯ１９９０／００７８６１及びＷＯ２０１７／１７４３３１が参照される。バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）及びダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ、ＤＡＣ）は、何れもＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制するＩｇＧ１型抗ヒトＣＤ２５抗体であり、ＣＤ２５によってＩＬ－２の免疫活性化機能を仲介するもので、何れもエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の活性化を低減するために開発された。バシリキシマブは、現在、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）への適用が承認されているキメラ抗ＣＤ２５抗体であるが、ダクリズマブは、多発性硬化症の治療への適用が承認されているヒト化抗ＣＤ２５抗体である。
【0006】
ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇにおける発現存在度が他の免疫細胞よりもはるかに高いため、ＣＤ２５はＴｒｅｇの特異的マーカーとして抗体の開発に用いられてもよく、抗体仲介性の細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び抗体仲介性の細胞食作用（ＡＤＣＰ）によって腫瘍内部のＴｒｅｇ細胞を除去し、Ｔｒｅｇによる腫瘍内部Ｔ細胞への抑制を解消することで、抗腫瘍免疫を促進する。しかし、ＣＤ２５は、ＩＬ－２によるエフェクターＴ細胞の活性化も同時に仲介しており、ＣＤ２５抗体によりＩＬ－２シグナル伝達経路が抑制されると、Ｔｅｆｆが抑制され、その抗腫瘍活性が拮抗されてしまう。幾つかの文献によると、抗ＣＤ２５は単独で、又は組み合わせてがん又はＴｒｅｇの消耗に関連する用途に用いられる（ＷＯ ２００４／０７４４３７、ＷＯ ２００６／１０８６７０、ＷＯ ２００６／０５０１７２、ＷＯ ２０１１／０７７２４５、ＷＯ ２０１６／０２１７２０、ＷＯ ２００４／０４５５１２）ため、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を許容する抗ＣＤ２５抗体が必要となる。臨床前に開発されたＣＤ２５抗体は、７Ｄ４（ラット抗マウスＣＤ２５、例えば、Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ、１９８３ Ｓｅｐ、８０（１８）：５６９４－８、Ｏｎｉｚｕｋａ Ｓ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９ Ｊｕｌ １、５９（１３）：３１２８－３３を参照）、７Ｇ７Ｂ６（抗ヒトＣＤ２５、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００９ Ｊｕｎ、２４（３）： ３０３－３０９を参照）、及びＰＣ６１（ラット抗マウスＣＤ２５、例えば、Ｙｕｌｉｕｓ Ｙ Ｓｅｔｉａｄｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｍａｒ、４０（３）：７８０－６を参照）を含み、マウスがんモデルで試験する時に、ＰＣ６１は、そのＣＤ２５とＩＬ２の結合への抑制作用のため、抗腫瘍活性を示せないが、７Ｄ４は、ＩＬ２のＣＤ２５への結合に影響を与えないため、ＰＣ６１よりも優れた抗腫瘍活性を示している。更に、ＷＯ２０１９／１７５２１６には、ロシュ社及びＴＵＳＫ社により共同開発されたＣＤ２５を標的とする抗体ＲＧ６２９２が提供されており、その固形腫瘍における安全性と薬効を検出するために、既に臨床第Ｉ相に入った。ＷＯ２０１８１６７１０４にも、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合に影響を与えない抗ＣＤ２５抗体が提供されている。
【0007】
腫瘍抑制効果がより優れ、安全性がより高く、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制せず、ＡＤＣＣとＡＤＣＰ効果によりＴｒｅｇを除去すると共に、Ｔｅｆｆ活性への抑制を回避することができる抗ＣＤ２５抗体の開発は、依然としてこの分野において必要なことである。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、抗ＣＤ２５抗体、その抗原結合断片、及びそれらをコードする核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、がん（特に固形腫瘍）を治療するための方法と製薬用途を提供する。
【0009】
抗ＣＤ２５抗体、その抗原結合断片
本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、
１）上記ＶＨは配列番号１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
２）上記ＶＨは配列番号３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
３）上記ＶＨは配列番号５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
４）上記ＶＨは配列番号７におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号８におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
５）上記ＶＨは配列番号９におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１０におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
６）上記ＶＨは配列番号１１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
７）上記ＶＨは配列番号１３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
８）上記ＶＨは配列番号１５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
９）上記ＶＨは配列番号１７におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１８におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１０）上記ＶＨは配列番号１９におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２０におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１１）上記ＶＨは配列番号２１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１２）上記ＶＨは配列番号２３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１３）上記ＶＨは配列番号２５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、或いは
１４）上記ＶＨは配列番号５９におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６０におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、
１）上記ＶＨは配列番号１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
２）上記ＶＨは配列番号３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
３）上記ＶＨは配列番号５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
４）上記ＶＨは配列番号７におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号８におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
５）上記ＶＨは配列番号９におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１０におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
６）上記ＶＨは配列番号１１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
７）上記ＶＨは配列番号１３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
８）上記ＶＨは配列番号１５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
９）上記ＶＨは配列番号１７におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１８におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１０）上記ＶＨは配列番号１９におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２０におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１１）上記ＶＨは配列番号２１におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２２におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１２）上記ＶＨは配列番号２３におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２４におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
１３）上記ＶＨは配列番号２５におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２６におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、或いは
１４）上記ＶＨは配列番号５９におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６０におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0010】
上記ＣＤＲはＫａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムによって定義され、幾つかの具体的な実施形態において、ＣＤＲはＫａｂａｔ番号付けシステムによって定義される。
【0011】
幾つかの実施形態において、１）、２）、３）、５）又は６）で示されるＶＨとＶＬを含む抗体又はその抗原結合断片は、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害又は部分的に阻害し、他の幾つかの実施形態において、４）、７）、８）、９）、１０）、１１）、１２）又は１３）で示されるＶＨとＶＬを含む抗体又はその抗原結合断片は、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害せず、抑制せず、又はほぼ阻害せず、抑制しない。
【0012】
幾つかの実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、
上記ＶＨは配列番号２７、３３、３９又は４５から選ばれるＨＣＤＲ１、及び／又は配列番号２８、３４、４０又は４６から選ばれるＨＣＤＲ２、及び／又は配列番号２９、３５、４１又は４７から選ばれるＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号３０、３６、４２又は４８から選ばれるＬＣＤＲ１、及び／又は配列番号３１、３７、４３又は４９から選ばれるＬＣＤＲ２、及び／又は配列番号３２、３８、４４又は５０から選ばれるＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
上記ＶＨは配列番号２７、３３、３９又は４５から選ばれるＨＣＤＲ１、及び／又は配列番号２８、３４、４０又は４６から選ばれるＨＣＤＲ２、及び／又は配列番号２９、３５、４１又は４７から選ばれるＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号３０、３６、４２又は４８から選ばれるＬＣＤＲ１、及び／又は配列番号３１、３７、４３又は４９から選ばれるＬＣＤＲ２、及び／又は配列番号３２、３８、４４又は５０から選ばれるＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0013】
幾つかの実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、
ｉ）上記ＶＨは、配列番号２７で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号２８で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号２９で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号３０で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号３１で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号３２で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）上記ＶＨは、配列番号３３で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号３４で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号３５で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号３６で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号３７で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号３８で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含み、
ｉｉｉ）上記ＶＨは、配列番号３９で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号４０で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号４１で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号４２で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号４３で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号４４で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含み、或いは
ｉｖ）上記ＶＨは、配列番号４５で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号４６で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号４７で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号４８で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号４９で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号５０で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
ｉ）上記ＶＨは、配列番号２７で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号２８で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号２９で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号３０で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号３１で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号３２で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）上記ＶＨは、配列番号３３で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号３４で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号３５で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号３６で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号３７で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号３８で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含み、
ｉｉｉ）上記ＶＨは、配列番号３９で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号４０で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号４１で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号４２で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号４３で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号４４で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含み、或いは
ｉｖ）上記ＶＨは、配列番号４５で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号４６で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号４７で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、及び／又は上記ＶＬは、配列番号４８で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号４９で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号５０で示され、又はそれと多くとも３個、２個又は１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0014】
幾つかの具体的な実施形態において、上記のアミノ酸変異を有する抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片及び親抗体又は抗原結合断片は、相同又は基本的に相同のヒトＣＤ２５と結合する親和性及び／又は機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、抗腫瘍活性）を有する。
【0015】
幾つかの実施形態において、本開示の上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は、１０－７Ｍ以下の解離平衡定数でヒトＣＤ２５と結合する。幾つかの実施形態において、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ又は１０－１１Ｍ以下の解離平衡定数でヒトＣＤ２５と結合する。
【0016】
幾つかの実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号２７、２８と２９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３０、３１と３２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３３、３４と３５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３６、３７と３８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３９、４０と４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４２、４３と４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、或いは
上記ＶＨはそれぞれ配列番号４５、４６と４７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４８、４９と５０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
上記ＶＨはそれぞれ配列番号２７、２８と２９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３０、３１と３２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３３、３４と３５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３６、３７と３８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３９、４０と４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４２、４３と４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、或いは
上記ＶＨはそれぞれ配列番号４５、４６と４７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４８、４９と５０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む、
抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0017】
幾つかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はＶＨとＶＬを含み、そのうち、
上記ＶＨは配列番号１で示され、上記ＶＬは配列番号２で示され、
上記ＶＨは配列番号３で示され、上記ＶＬは配列番号４で示され、
上記ＶＨは配列番号５で示され、上記ＶＬは配列番号６で示され、
上記ＶＨは配列番号７で示され、上記ＶＬは配列番号８で示され、
上記ＶＨは配列番号９で示され、上記ＶＬは配列番号１０で示され、
上記ＶＨは配列番号１１で示され、上記ＶＬは配列番号１２で示され、
上記ＶＨは配列番号１３で示され、上記ＶＬは配列番号１４で示され、
上記ＶＨは配列番号１５で示され、上記ＶＬは配列番号１６で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号１７で示され、上記ＶＬは配列番号１８で示され、前記抗体はマウス抗体又はその断片である。
上記ＶＨは配列番号１で示され、上記ＶＬは配列番号２で示され、
上記ＶＨは配列番号３で示され、上記ＶＬは配列番号４で示され、
上記ＶＨは配列番号５で示され、上記ＶＬは配列番号６で示され、
上記ＶＨは配列番号７で示され、上記ＶＬは配列番号８で示され、
上記ＶＨは配列番号９で示され、上記ＶＬは配列番号１０で示され、
上記ＶＨは配列番号１１で示され、上記ＶＬは配列番号１２で示され、
上記ＶＨは配列番号１３で示され、上記ＶＬは配列番号１４で示され、
上記ＶＨは配列番号１５で示され、上記ＶＬは配列番号１６で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号１７で示され、上記ＶＬは配列番号１８で示され、前記抗体はマウス抗体又はその断片である。
【0018】
幾つかの具体的な実施形態において、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片のＶＨ及び／又はＶＬとそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片変異体を提供する。
【0019】
幾つかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はその断片であり、例えば、ヒト化抗体又はその断片である。
【0020】
幾つかの実施形態において、マウス抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片によりキメラ抗体を調製し、ヒト化した後、復帰変異を行う。ここで、ＵＳ２００３００４０６０６及びＵＳ７４９４６４７におけるヒト化の方法が全文に組み込まれている。
【0021】
幾つかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はＶＨとＶＬを含み、そのうち、
上記ＶＨはＩＧＨＶ１－４６＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ２、ＩＧＨＶ１－６９＊０２から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１＿１４から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ３－１１＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＫＶ５－２＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＫＶ６－２１＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ４＊０１＿１２から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＨＶ４－３１＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＨＶ１－３＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ２＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、或いは
上記ＶＨはＩＧＨＶ３－２３＊０４から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ２－２８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含む。
上記ＶＨはＩＧＨＶ１－４６＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ２、ＩＧＨＶ１－６９＊０２から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１＿１４から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ３－１１＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＫＶ５－２＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＫＶ６－２１＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ４＊０１＿１２から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＨＶ４－３１＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＨＶ１－３＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ２＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、或いは
上記ＶＨはＩＧＨＶ３－２３＊０４から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはＩＧＫＶ２－２８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含む。
【0022】
幾つかの具体的な実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はＶＨ及び／又はＶＬを含み、そのうち、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号２７、２８と２９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ１－４６＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３０、３１と３２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３３、３４と３５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ２、ＩＧＨＶ１－６９＊０２から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１＿１４から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３６、３７と３８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ３－１１＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＫＶ５－２＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＫＶ６－２１＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ４＊０１＿１２から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３９、４０と４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＨＶ４－３１＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＨＶ１－３＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４２、４３と４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ２＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、或いは
上記ＶＨはそれぞれ配列番号４５、４６と４７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ３－２３＊０４から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４８、４９と５０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ２－２８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含む。上記ＦＲを復帰変異することで、抗体活性を維持することができる。
上記ＶＨはそれぞれ配列番号２７、２８と２９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ１－４６＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３０、３１と３２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３３、３４と３５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ２、ＩＧＨＶ１－６９＊０２から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１＿１４から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号３６、３７と３８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ３－１１＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＫＶ５－２＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＫＶ６－２１＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ４＊０１＿１２から選ばれるＦＲ４を含み、
上記ＶＨはそれぞれ配列番号３９、４０と４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ１－１８＊０１から選ばれるＦＲ１、ＩＧＨＶ４－３１＊０１から選ばれるＦＲ２、ＩＧＨＶ１－３＊０１から選ばれるＦＲ３、及びｈＩＧＨＪ６＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４２、４３と４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ４－１＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びｈＩＧＫＪ２＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、或いは
上記ＶＨはそれぞれ配列番号４５、４６と４７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＩＧＨＶ３－２３＊０４から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＨＪ１＊０１から選ばれるＦＲ４を含み、上記ＶＬはそれぞれ配列番号４８、４９と５０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、ＩＧＫＶ２－２８＊０１から選ばれるＦＲ１～ＦＲ３、及びＩＧＫＪ４＊０１から選ばれるＦＲ４を含む。上記ＦＲを復帰変異することで、抗体活性を維持することができる。
【0023】
幾つかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はＶＨ及び／又はＶＬを含み、そのうち、
上記ＶＨは配列番号１９で示され、上記ＶＬは配列番号２０で示され、
上記ＶＨは配列番号２１で示され、上記ＶＬは配列番号２２で示され、
上記ＶＨは配列番号２３で示され、上記ＶＬは配列番号２４で示され、
上記ＶＨは配列番号２５で示され、上記ＶＬは配列番号２６で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号５９で示され、上記ＶＬは配列番号６０で示され、上記抗体はヒト化抗体又はその断片である。
上記ＶＨは配列番号１９で示され、上記ＶＬは配列番号２０で示され、
上記ＶＨは配列番号２１で示され、上記ＶＬは配列番号２２で示され、
上記ＶＨは配列番号２３で示され、上記ＶＬは配列番号２４で示され、
上記ＶＨは配列番号２５で示され、上記ＶＬは配列番号２６で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号５９で示され、上記ＶＬは配列番号６０で示され、上記抗体はヒト化抗体又はその断片である。
【0024】
幾つかの具体的な実施形態において、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片のＶＨ及び／又はＶＬとそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片変異体を提供する。
【0025】
幾つかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は、抗体の重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４の重鎖定常領域及びその一般的な変異体を更に含み、上記抗体の軽鎖定常領域はヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその一般的な変異体から選ばれ、また例えば、マウスＩｇＧ２ａなど、マウスのＩｇＧである。
【0026】
幾つかの実施形態において、上記抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量化のＶ領域（二重抗体）、ジスルフィド結合安定化のＶ領域（ｄｓＦｖ）とその他のＣＤＲを含むペプチドの抗原結合断片から選ばれる。
【0027】
幾つかの実施形態において、上記何れか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片と競合してヒトＣＤ２５と結合し、又は競合して同じエピトープと結合する、単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を更に提供する。
【0028】
幾つかの実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、
上記ＶＨは配列番号１で示され、上記ＶＬは配列番号２で示され、
上記ＶＨは配列番号３で示され、上記ＶＬは配列番号４で示され、
上記ＶＨは配列番号５で示され、上記ＶＬは配列番号６で示され、
上記ＶＨは配列番号９で示され、上記ＶＬは配列番号１０で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号１１で示され、上記ＶＬは配列番号１２で示され、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害又は部分的に阻害する、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。
上記ＶＨは配列番号１で示され、上記ＶＬは配列番号２で示され、
上記ＶＨは配列番号３で示され、上記ＶＬは配列番号４で示され、
上記ＶＨは配列番号５で示され、上記ＶＬは配列番号６で示され、
上記ＶＨは配列番号９で示され、上記ＶＬは配列番号１０で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号１１で示され、上記ＶＬは配列番号１２で示され、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害又は部分的に阻害する、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0029】
他の幾つかの実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片であって、
上記ＶＨは配列番号７で示され、上記ＶＬは配列番号８で示され、
上記ＶＨは配列番号１３で示され、上記ＶＬは配列番号１４で示され、
上記ＶＨは配列番号１５で示され、上記ＶＬは配列番号１６で示され、
上記ＶＨは配列番号１７で示され、上記ＶＬは配列番号１８で示され、
上記ＶＨは配列番号１９で示され、上記ＶＬは配列番号２０で示され、
上記ＶＨは配列番号２１で示され、上記ＶＬは配列番号２２で示され、
上記ＶＨは配列番号２３で示され、上記ＶＬは配列番号２４で示され、
上記ＶＨは配列番号２５で示され、上記ＶＬは配列番号２６で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号５９で示され、上記ＶＬは配列番号６０で示され、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害せず、抑制せず、ほぼ阻害せず、抑制せず、又は低い程度で阻害し、抑制する、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。例えば、抗体が存在しない場合のＩＬ－２シグナル伝達と比べ、上記抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、約５０％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％未満のＩＬ－２シグナル伝達、例えば、約２５％未満のＩＬ－２シグナル伝達を阻害する。
上記ＶＨは配列番号７で示され、上記ＶＬは配列番号８で示され、
上記ＶＨは配列番号１３で示され、上記ＶＬは配列番号１４で示され、
上記ＶＨは配列番号１５で示され、上記ＶＬは配列番号１６で示され、
上記ＶＨは配列番号１７で示され、上記ＶＬは配列番号１８で示され、
上記ＶＨは配列番号１９で示され、上記ＶＬは配列番号２０で示され、
上記ＶＨは配列番号２１で示され、上記ＶＬは配列番号２２で示され、
上記ＶＨは配列番号２３で示され、上記ＶＬは配列番号２４で示され、
上記ＶＨは配列番号２５で示され、上記ＶＬは配列番号２６で示され、或いは
上記ＶＨは配列番号５９で示され、上記ＶＬは配列番号６０で示され、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害せず、抑制せず、ほぼ阻害せず、抑制せず、又は低い程度で阻害し、抑制する、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。例えば、抗体が存在しない場合のＩＬ－２シグナル伝達と比べ、上記抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、約５０％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％未満のＩＬ－２シグナル伝達、例えば、約２５％未満のＩＬ－２シグナル伝達を阻害する。
【0030】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片のＶＨ及び／又はＶＬと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片変異体を提供する。
【0031】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域ＶＨ及び／又はＶＬと比べ、それぞれ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸変化を含むＶＨ及び／又はＶＬを含む、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片変異体を提供する。上記アミノ酸変化は、可変領域中のアミノ酸残基の保存的置換であってもよい。幾つかの実施形態において、上記のアミノ酸変化を含む抗体又は抗原結合断片は、親抗体又は抗原結合断片と相同又は基本的に相同のヒトＣＤ２５と結合する親和性及び／又は機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、抗腫瘍活性）を有する。
【0032】
幾つかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は重鎖及び／又は軽鎖を含み、そのうち、
上記重鎖は配列番号５１で示され、上記軽鎖は配列番号５２で示され、
上記重鎖は配列番号５３で示され、上記軽鎖は配列番号５４で示され、
上記重鎖は配列番号５５で示され、上記軽鎖は配列番号５６で示され、
上記重鎖は配列番号５７で示され、上記軽鎖は配列番号５８で示され、或いは
上記重鎖は配列番号６１で示され、上記軽鎖は配列番号６２で示される。
上記重鎖は配列番号５１で示され、上記軽鎖は配列番号５２で示され、
上記重鎖は配列番号５３で示され、上記軽鎖は配列番号５４で示され、
上記重鎖は配列番号５５で示され、上記軽鎖は配列番号５６で示され、
上記重鎖は配列番号５７で示され、上記軽鎖は配列番号５８で示され、或いは
上記重鎖は配列番号６１で示され、上記軽鎖は配列番号６２で示される。
【0033】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び／又は軽鎖とそれぞれ少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する重鎖及び／又は軽鎖を含む、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0034】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はＩｇＧ１型であり、Ｆｃ領域は脱フコシル化部位を有し、強化されたＦｃγＲＩＩＩａ結合能力を持つ。上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はＴｒｅｇ細胞へのＡＤＣＣ作用を増加し、その抗腫瘍活性を強化することができる。
【0035】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片はＩｇＧ１型であり、Ｆｃ領域は脱フコシル化部位（例えば、Ａ３３０Ｉ変異）を有し、低減されたＦｃγＲＩＩｂ結合能力を持つ。上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は、ＦｃγＲＩＩｂ受容体により仲介されるＡＤＣＣ／ＡＤＣＰへの抑制性シグナルを低減することで、Ｔｒｅｇ細胞へのＡＤＣＣ作用を強化し、その抗腫瘍活性を強化することができる。
【0036】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有し、即ち、
（ａ）ヒトＣＤ２５と結合するＫＤ値が１×１０－７Ｍ未満であり、
（ｂ）ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制せず（又は基本的に抑制せず）、
（ｃ）腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇを消耗し、Ｔｅｆｆの機能に影響を与えず（又は基本的に影響を与えず）、
（ｄ）１よりも高い活性化抑制率（Ａ／Ｉ）でＦｃγ受容体と結合し、
（ｅ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及び／又はＦｃγＲＩＩｂとの結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩａと結合し、ＦｃγＲＩＩｂとの結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩａと結合し、
（ｆ）多種の腫瘍の成長を抑制する。
（ａ）ヒトＣＤ２５と結合するＫＤ値が１×１０－７Ｍ未満であり、
（ｂ）ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制せず（又は基本的に抑制せず）、
（ｃ）腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇを消耗し、Ｔｅｆｆの機能に影響を与えず（又は基本的に影響を与えず）、
（ｄ）１よりも高い活性化抑制率（Ａ／Ｉ）でＦｃγ受容体と結合し、
（ｅ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及び／又はＦｃγＲＩＩｂとの結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩａと結合し、ＦｃγＲＩＩｂとの結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩａと結合し、
（ｆ）多種の腫瘍の成長を抑制する。
【0037】
本開示に係るＣＤ２５のタンパク質との結合又は抗ＣＤ２５抗体のＣＤ２５との結合のＫＤ値は１×１０－７Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、又は１×１０－１０Ｍ未満であってもよい。
【0038】
本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍成長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％を抑制することができる。
【0039】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、高い親和性でＦｃγＲと結合し、例えば、高い親和性で活性化受容体と結合する。幾つかの具体的な実施形態において、本開示に係る抗体は、高い親和性でＦｃγＲＩ及び／又はＦｃγＲＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡと結合する。具体的な実施形態において、抗体は、少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体と約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ未満の解離定数で結合する。
【0040】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片はＩｇＧ１抗体であり、少なくとも１つのＦｃ活性化受容体と結合することができる。例えば、当該抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩＩｂから選ばれる１つ又は複数の受容体と結合することができる。幾つかの具体的な実施形態において、本開示に係る抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡと結合することができる。幾つかの実施形態において、本開示に係る抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＡと何れかのＦｃγＲＩと結合することができる。一態様において、抗体は、高い親和性でこれらの受容体と結合し、例えば、約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ未満の解離定数で結合することができる。
【0041】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、低い親和性で抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂと結合する。一態様において、抗体は、約１０－７Ｍよりも高い、約１０－６Ｍよりも高い又は約１０－５Ｍよりも高い解離定数でＦｃγＲＩＩｂと結合する。
【0042】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ１サブクラス由来であり、好ましくはＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する。他の幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体は、ＩｇＧ２サブクラス由来である。
【0043】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、５０％未満のＣＤ２５によるＩＬ－２シグナル伝達を抑制又は阻害する。例えば、抗体が存在しない場合のＩＬ－２シグナル伝達と比べ、抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合断片は、約４０％、３５％、３０％未満、好ましくは、約２５％未満のＩＬ－２シグナル伝達を抑制又は阻害する。
【0044】
ポリヌクレオチド及びベクター
本開示は、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離したポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
本開示は、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離したポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
【0045】
本開示は、上記のようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供し、発現ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、ウィルスベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージであってもよい。
【0046】
宿主細胞
本開示は、上記のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それは、真核細胞や、原核細胞であってもよい。
本開示は、上記のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それは、真核細胞や、原核細胞であってもよい。
【0047】
幾つかの実施形態において、上記宿主細胞は、細菌、酵母菌、哺乳動物細胞である。幾つかの具体的な実施形態において、上記宿主細胞は、大腸菌、ピキア酵母、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞である。
【0048】
調製方法
本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を調製するための方法であって、上記のような宿主細胞において当該抗体又はその抗原結合断片を発現し、且つ当該宿主細胞から当該抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む方法を提供する。
本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を調製するための方法であって、上記のような宿主細胞において当該抗体又はその抗原結合断片を発現し、且つ当該宿主細胞から当該抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む方法を提供する。
【0049】
選択的に、精製工程を含んでもよく、例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製し、非特異的に結合した成分を洗い流し、更にＰＨ勾配法により、結合した抗体を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出して収集する。選択的に、通常の方法によりろ過して濃縮する。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、－７０℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。
【0050】
抗体及び抗原結合断片の製造・精製方法は、従来技術でよく知られており、且つ、例えば冷泉港の抗体実験技術マニュアル（５～８章及び１５章）で見出すことができる。例えば、ヒトＦｃＲｎ又はその断片をマウスに免疫することができ、得られた抗体は復元、精製されることができると共に、通常の方法によりアミノ酸シークエンシングを行うことができる。抗原結合断片は、同じく通常の方法により調製することができる。
【0051】
本開示に係る工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製と精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローニングして発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションすることができる。哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現することによって安定的なクローンが得られる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を製造する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製して収集することができる。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。
【0052】
組成物
本開示は、治療有効量の上記のような抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈又はベクターを含む医薬組成物などの組成物を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、上記医薬組成物の単位用量には、０．０１～９９ ｗｔ％の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含んでもよく、或いは、医薬組成物の単位用量における抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片の含有量は０．１～２０００ ｍｇであり、幾つかの具体的な実施形態では１～１０００ ｍｇである。
本開示は、治療有効量の上記のような抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈又はベクターを含む医薬組成物などの組成物を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、上記医薬組成物の単位用量には、０．０１～９９ ｗｔ％の抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含んでもよく、或いは、医薬組成物の単位用量における抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片の含有量は０．１～２０００ ｍｇであり、幾つかの具体的な実施形態では１～１０００ ｍｇである。
【0053】
治療方法及び製薬用途
本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、コードポリヌクレオチドのうちの何れか一項又はそれらの任意の組み合わせ、疾患を診断、治療、予防するための方法及び薬剤、医薬組成物を調製する用途（例えば、増殖性病状（例えば、がん又は腫瘍）の治療や予防又は関連病状の進行の遅延を提供する。
本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、コードポリヌクレオチドのうちの何れか一項又はそれらの任意の組み合わせ、疾患を診断、治療、予防するための方法及び薬剤、医薬組成物を調製する用途（例えば、増殖性病状（例えば、がん又は腫瘍）の治療や予防又は関連病状の進行の遅延を提供する。
【0054】
幾つかの実施形態において、対象の病状を予防、治療又は緩和する方法であって、上記対象に本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及び／又はコードポリヌクレオチドを投与することを含む方法を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、上記対象の病状は増殖性疾患、例えば、腫瘍又はがんである。幾つかの実施形態において、上記対象は、形成された腫瘍、例えば、固形腫瘍に罹患している。
【0055】
幾つかの実施形態において、対象の腫瘍内部又は腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの細胞数を減少する方法を提供し、幾つかの実施形態において、対象の腫瘍内部又は腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの細胞活性を除去又は抑制する方法を提供し、何れも、上記対象に本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及び／又はコードポリヌクレオチドを投与することを含む。
【0056】
幾つかの実施形態において、対象の腫瘍内部Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇの割合を増加する方法であって、上記対象に本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及び／又はコードポリヌクレオチドを投与することを含む方法を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、腫瘍中のエフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞の割合（Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ）は、５、１０、１５、２０、４０又は８０を超えるように増加する。
【0057】
幾つかの実施形態において、対象の体内での腫瘍細胞に対するＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを強化する方法であって、上記対象に本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及び／又はコードポリヌクレオチドを投与することを含む方法を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、対象の体内での腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ効果は強化されている。幾つかのさらなる具体的な実施形態において、対象の体内での腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ効果は強化されている。
【0058】
幾つかの実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片、上記抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及び／又はコードポリヌクレオチドの、対象の病状を予防、治療又は緩和する薬剤を調製するための製薬用途、対象の腫瘍内部又は腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの細胞数を減少する薬剤を調製するための製薬用途、対象の腫瘍内部又は腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの細胞活性を除去又は抑制する薬剤を調製するための製薬用途、対象の腫瘍内部のＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇの割合を増加する薬剤を調製するための製薬用途、対象の体内での腫瘍細胞に対するＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを強化する薬剤を調製するための製薬用途を提供する。
【0059】
幾つかの具体的な実施形態において、上記対象の病状は、増殖性病状（例えば、がん又は腫瘍）であり、又は増殖性病状（例えば、がん又は腫瘍）に罹患している。上記腫瘍はがん、リンパ腫、白血病、芽細胞腫と肉腫を含むが、これらに限定されない。このようながんの更に具体的な実例は、扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、肝細胞がん（ＨＣＣ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）がん、腎がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎がん、前列腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形性膠芽細胞腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がんと頭頸部がんを含む。
【0060】
幾つかの具体的な実施形態において、上記がん又は腫瘍は固形腫瘍であってもよく、肉腫（組織（例えば、海綿質骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、造血細胞又は線維性結合組織）中の間葉由来の形質転換細胞によるがんを含む）、がん（上皮細胞による腫瘍を含む）、中皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫などを含むが、これらに限定されない。固形腫瘍に関わるがんは、脳がん、肺がん、胃がん、十二指腸がん、食管がん、乳がん、結腸・直腸がん、腎がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、黒色腫、口腔がん、肉腫、眼がん、甲状腺がん、尿道がん、膣がん、頸部がん、リンパ腫などを含むが、これらに限定されない。
【0061】
幾つかの具体的な実施形態において、上記がんは、ＣＤ２５を発現した腫瘍に関わり、ホジキンリンパ腫などのリンパ腫と、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などのリンパ球性白血病を含むが、これらに限定されない。
【0062】
検出用途
本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片の検出用途を提供する。
本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片の検出用途を提供する。
【0063】
本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を含む、ＣＤ２５を検出する試薬を提供する。本開示は、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片を使用することを含む、体内(in vivo)又は体外(in vitro)でＣＤ２５を検出するための方法、システム又は装置を更に提供する。
【0064】
幾つかの実施形態において、体外検出方法、システム又は装置は、例えば、（１）試料を抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片に接触させることと、（２）抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片と試料の間で形成された複合体を検出することと、及び／又は（３）参照試料（例えば、対照試料）を抗体に接触させることと、（４）参照試料と比較することにより、抗体と試料の間の複合体形成程度を決定することと、を含み得る。例えば、対照試料又は対象におけるものと比べ、試料又は対象における複合体形成の変化（例えば、統計学的に有意な変化）は、試料にＣＤ２５が存在することを示す。
【0065】
幾つかの実施形態において、検出のために、本開示に係るＣＤ２５結合タンパク質又は抗ＣＤ２５抗体は、蛍光団及び発色団で標識することができる。
【0066】
幾つかの実施形態において、試薬キットを更に提供し、上記試薬キットは、ＣＤ２５と結合するタンパク質又は抗ＣＤ２５抗体を含み、診断マニュアルを更に含んでもよい。試薬キットは、少なくとも１つの付加的な試薬、例えば、マーカーや付加的な診断剤を更に含んでもよい。体内での使用に対して、抗体は、医薬組成物として調製することができる。
【0067】
本開示の実施例により提供される抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は、高い特異性、高い親和性、低い免疫原性という特徴がある。また、本開示に係る抗体は、Ｔｒｅｇを抑制し、Ｔｅｆｆに影響を与えず、対象の体内でのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強化し、腫瘍の発生と進行を抑制する良好な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図2】ＦＡＣＳによる、ヒトＣＤ２５タンパク質を安定的に発現した細胞株２Ｆ８の測定であり、ここで、白いピークはＣＤ２５陽性ピーク、灰色のピークは対照ピーク、一次抗体はヒトＩｇＧ１陰性対照抗体である。
【図3A-3C】ＦＡＣＳによる抗体機能の測定と検出である。図３Ａは、ＦＡＣＳにより抗体ＤＡＣ、７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６とＣＨＯ－Ｋ１細胞の結合を測定した結果であり、図３Ｂは、ＦＡＣＳにより抗体ＤＡＣ、７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６と、ヒトＣＤ２５タンパク質を安定的に発現したＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ２５細胞との結合を測定した結果であり、図３Ｃは、ＦＡＣＳにより抗体ＤＡＣ、７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６とＳｕ－ＤＨＬ－１の結合を測定した結果であり、ここで、マウスＩｇＧ又はヒトＩｇＧアイソタイプを陰性対照として使用する。
【図4A-4C】ＥＬＩＳＡによる抗体とＣＤ２５の結合の測定と検出である。図４Ａは７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６と組換えヒトＣＤ２５タンパク質との結合結果、図４Ｂは７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６と組換えサルＣＤ２５タンパク質との結合結果、図４Ｃは７Ｄ４と組換えマウスＣＤ２５タンパク質との結合結果であり、使用される陰性対照はマウスＩｇＧとヒトＩｇＧである。
【図5A-5C】ＦＡＣＳによるキメラ型抗ＣＤ２５抗体とＳＵ－ＤＨＬ－１細胞の結合の検出である。図５ＡはｃＡｂ００１、ｃＡｂ００２、ｃＡｂ００４、ｃＡｂ００６の検出結果、図５ＢはｃＡｂ０２８、ｃＡｂ０２９、ｃＡｂ０３７の検出結果、図５ＣはｃＡｂ０４２、ｃＡｂ０４６の検出結果であり、使用される陽性対照はＴａｂ０６とＤＡＣ、陰性対照はヒトＩｇＧ（即ち、ｈＩｇＧ）である。
【図6A-6G】ＦＡＣＳによるキメラ型抗ＣＤ２５抗体とＴｒｅｇ細胞、活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞におけるＣＤ２５抗原との結合の検出である。図６ＡはｃＡｂ００６の結果、図６ＢはｃＡｂ０３７の結果、図６ＣはｃＡｂ０４２の結果、図６ＤはｃＡｂ０４６の結果、図６Ｅは陽性対照７Ｇ７Ｂ６の結果、図６Ｆは陽性対照ＤＡＣの結果、図６Ｇは陽性対照Ｔａｂ０６の結果である。
【図7A-7B】ＦＡＣＳによる、ＩＬ－２と受容体ＣＤ２５の結合能力へのキメラ型抗ＣＤ２５抗体の影響の検出である。図７ＡはｃＡｂ００１、ｃＡｂ００２、ｃＡｂ０２８、ｃＡｂ０２９の検出結果図、図７ＢはｃＡｂ００６、ｃＡｂ０３７、ｃＡｂ０４２、ｃＡｂ０４６の検出結果図であり、使用されるＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害する抗ＣＤ２５抗体対照はＤＡＣ、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体対照はＴａｂ０６、陰性対照はヒトＩｇＧ（即ち、ｈＩｇＧ－１）である。
【図8】ＦＡＣＳによるヒト化抗ＣＤ２５抗体とＳＵ－ＤＨＬ－１細胞の結合の検出である。
【図9】ＦＡＣＳによる、ヒト末梢血Ｔリンパ球ｐＳｔａｔ５シグナル伝達経路へのヒト化抗ＣＤ２５抗体の影響の検出である。
【図10】ＡＤＣＣレポーター遺伝子の細胞における蛍光活性を検出することにより、ヒト化抗ＣＤ２５抗体により仲介されたＳＵ－ＤＨＬ－１細胞へのＡＤＣＣ作用を検出することである。
【発明を実施するための形態】
【0069】
発明の詳細
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書の他所で別途明確に定義されていない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を有する。
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書の他所で別途明確に定義されていない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を有する。
【0070】
本開示に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
【0071】
「ＣＤ２５」又は「ＣＤ２５タンパク質」又は「ＣＤ２５ポリペプチド」は、本明細書に記載の既知又は野生型のＣＤ２５、及び任意の天然に存在するスプライス変異体、アミノ酸変異体又はアイソフォームを含む（これらに限定されない）任意のこのようなタンパク質又はその変異体、結合体又は断片を任意選択的に含んでもよい。完全なヒトＣＤ２５配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１５８９で見出すことができ、その２２～２４０番目のアミノ酸が成熟したヒトＣＤ２５の細胞外領域に対応する。
【0072】
「ＣＤ２５と結合する」とは、ヒト由来可能であるＣＤ２５又はそのエピトープと相互作用できることを意味する。「抗原結合部位」とは、本開示の抗体又は抗原結合断片により認識される、抗原上の不連続の３次元空間部位を指す。
【0073】
「抗体」とは、２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合で連結してなるテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指す。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序が異なるので、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは、５種類、或いは免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに分けることができ、その対応する重鎖がそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。５種類のＩｇのそれぞれは、何れもκ鎖又はλ鎖を有してもよい。抗体重鎖及び軽鎖は、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸の配列の変化が大きく、可変領域（Ｖ領域）となり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域（Ｃ領域）となる。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、４つの配列が比較的に保存的な骨格領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と、４つのＦＲ領域とからなり、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。幾つかの実施例において、本開示の抗体は、ＣＤ２５に特異的に又は基本的に特異的に結合する。
【0074】
「ＣＤ２５と結合する抗体」とは、ＩＬ－２受容体のＣＤ２５サブユニットと結合可能な抗体である。当該サブユニットは、ＩＬ－２受容体のαサブユニットとも呼ばれる。このような抗体は、本明細書において「抗ＣＤ２５抗体」とも呼ばれる。
【0075】
本開示に係る抗体又は抗原結合断片のＶＬ領域とＶＨ領域のＣＤＲアミノ酸残基は、数と位置において既知のＫａｂａｔ番号付けシステムに合致する。ＫａｂａｔにおけるＥＵ番号は、一般的に定常ドメイン及び／又はＦｃドメインにも使用される。
【0076】
「ＣＤＲ」の決定又は定義については、抗体の構造を解明し、及び／又は抗体－リガンド複合体の構造を解明することによってＣＤＲの明確な描写及び抗体の結合部位を含む残基の同定を達成することができる。これは、例えばＸ線結晶学などの当業者に既知の様々な技術の何れか１つによって実現することができる。種々の分析方法は、ＣＤＲの同定に使用することができ、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム、ＡｂＭ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム、接触定義、立体配座定義を含むが、これらに限定されない。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、抗体における残基に番号を付けるための基準であり、一般的にＣＤＲ領域の同定に使用される（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：２１４－８を参照する）。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムと類似するが、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、ある構造ループ領域の位置を考慮に入れた。（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１－１７、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７－８３を参照する）。ＡｂＭ番号付けシステムは、抗体構造をモデル化したＯｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕＬａｒ Ｇｒｏｕｐにより生産されたコンピュータプログラム一式を使用する（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９、ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６：９２６８－９２７２；「ＡｂＭＴＭ、Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕＬａｒ Ｌｔｄを参照する）。ＡｂＭ番号付けシステムは、知識データベース及びａｂ ｉｎｉｔｉｏ法の組み合わせを用いて、基本配列から抗体の三次構造をモデル化する（Ｓａｍｕｄｒａｌａ ｅｔ ａｌ．、１９９９、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．、３：１９４－１９８における「Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」に記載されたものを参照する）。接触定義は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づくものである（例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：７３２－４５を参照する）。立体配座定義において、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー寄与をする残基として同定することができる（例えば、Ｍａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６－１１６６を参照する）。なお、他のＣＤＲ境界定義は、上記方法の１つに厳格に従うとは限らないが、特定の残基又は残基群が抗原結合に顕著に影響しないという予測又は実験結果によって、それらは短縮又は延長可能であるとはいえ、依然としてＫａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書に使用されるように、ＣＤＲは、この分野で既知の任意の方法（方法の組み合わせを含む）によって定義されたＣＤＲを指すことができる。本明細書に使用される方法は、これらの方法の何れか１つによって定義されたＣＤＲを用いることができる。本開示の実施例では、ｋａｂａｔ番号付け規則によってＣＤＲを定義しているが、当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張された、ＡｂＭ、ＩＭＧＴ、接触及び／又は立体配座定義の何れか１つによってＣＤＲを改めて定義してもよいと理解可能である。
【0077】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、幾つかの種類の細胞Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）と相互作用して下流エフェクター機序を刺激と調節する。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）とＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）という５種類の活性化受容体、及び１種類の抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）がある。ＩｇＧ抗体と免疫系のコミュニケーションはＦｃγＲにより制御と仲介され、ＦｃγＲは抗体により感知・収集された情報を免疫系に伝達することで、特に生物療法の背景下で、自然・適応免疫系間の関連を提供する（Ｈａｙｅｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．、２０１６．ＪＩｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ ９：２０９－２１９）。ＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲとの結合能力が相違しており、このような相違結合によって、それらの一連の機能的反応を引き起こす能力が決定される。例えば、ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａは抗体依存性細胞仲介性の細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）活性化に関与する主な受容体であり、ＩｇＧ１のＩｇＧ３との密接は、当該受容体に対する最も高い親和性を示し、それらのＡＤＣＣを効果的に誘導する能力を反映し、ＩｇＧ２は当該受容体に弱く結合するが、ヒトＩｇＧ２アイソタイプを持つ抗ＣＤ２５抗体もＴｒｅｇを効果的に消耗することができると発見された。
【0078】
「制御性Ｔ細胞」、「Ｔｒｅｇ」又は「Ｔｒｅｇ細胞」とは、自己免疫、アレルギー反応と感染を専門的に制御するＣＤ４＋Ｔリンパ球系譜である。通常、それらはＴ細胞群の活性を調節するが、ある自然免疫系細胞種に影響を与えることもできる。バイオマーカーであるＣＤ４、ＣＤ２５とＦｏｘｐ３の発現により、Ｔｒｅｇを同定することができる。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、通常、末梢のＣＤ４＋Ｔリンパ球の約５～１０％を占める。しかし、腫瘍微小環境（即ち、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞）において、それらは全ＣＤ４＋Ｔリンパ球群の２０～３０％を占めることができる。活性化したヒトＴｒｅｇ細胞は、パーフォリン又はグランザイムＢ依存性経路によって標的細胞、例えばＴｅｆｆとＡＰＣ（抗原提示細胞）を直接殺すことができ、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４＋）Ｔｒｅｇ細胞は、ＡＰＣによってインドールアミン２、３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現を誘導し、それで更にトリプトファンを減少することでＴ細胞の活性化を抑制し、Ｔｒｅｇ細胞は、体内でインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）と形質転換成長因子（ＴＧＦβ）を放出することができるので、ＭＨＣ分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６とＩＬ－１２の発現を抑制することでＴ細胞の活性化が直接抑制されると共にＡＰＣ機能が抑制される。Ｔｒｅｇ細胞は更に、高レベルのＣＴＬＡ４を発現することにより免疫を抑制することができ、ＣＴＬＡ４は、抗原提出細胞におけるＣＤ８０及びＣＤ８６と結合してエフェクターＴ細胞の正確な活性化を阻止することができる。
【0079】
本明細書の「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄細胞又はリンパ球様細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞と、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とを含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ細胞、単核細胞、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞と好塩基球を含む。
【0080】
本明細書の「抑制しない」、「阻害しない」、「非阻害性」、「非ＩＬ－２阻害性」、「阻害なし」とそのような表現（抗ＣＤ２５抗体の存在下でＩＬ－２とＣＤ２５の結合を阻害せず、又は抑制せず、例えば、「ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制しない」について）は、その中の抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５によるＩＬ－２のシグナル伝達を阻害せず、又は抑制せず、特にＣＤ２５を発現した細胞中のインターロイキン－２シグナル伝達を抑制しないことを含む。つまり、抗体が存在しない場合のＩＬ－２シグナル伝達と比べ、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体は、５０％未満のＣＤ２５によるＩＬ－２シグナル伝達を抑制する。好ましくは、抗体が存在しない場合のＩＬ－２シグナル伝達と比べ、抗ＣＤ２５抗体は、約４０％、３５％、３０％未満、好ましくは約２５％未満のＩＬ－２シグナル伝達を抑制する。
【0081】
「抗体依存性細胞仲介性の細胞傷害作用」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現した非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球とマクロファージ細胞）が標的細胞に結合された抗体を認識することで標的細胞の溶解を発生させる、細胞仲介性の反応を指す。「抗体依存性細胞仲介性の食作用」（ＡＤＣＰ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現した食細胞（例えば、マクロファージ細胞）が標的細胞に結合された抗体を認識することで標的細胞への食作用を発生させる、細胞仲介性の反応を指す。「補体依存性細胞傷害作用」（ＣＤＣ）は、補体の存在下で、抗原発現細胞への抗体溶解を指す。ＣＤＣ、ＡＤＣＣとＡＤＣＰは、本分野において既知で使用可能な測定方法（Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９５、６５２－６）により測定することができ、抗体の定常領域は、補体と仲介性細胞依存性細胞の傷害作用と食作用に対する抗体の固定能力で重要である。従って、抗体によるＡＤＣＣ、ＡＤＣＰの仲介が必要か否かによって抗体のアイソタイプを選択することができる。
【0082】
ＡＤＣＣは、抗体グリカンからフコース部分を除去する方法により、例えば、ＹＢ２／０細胞系において抗体を産生することにより、又はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に特定の変異を導入することにより、増加することができる（例えば、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ １０３、２００５－２０１０、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ２５Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９、６１８１－６）。ＡＤＣＰも、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に特定の変異を導入することにより増加することができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＭｏｌＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７、２５１７－２７）。
【0083】
「マウス抗体」は、本開示において、当該分野の知識と技術により調製されたヒトＣＤ２５又はそのエピトープに対するモノクローナル抗体である。調製時にＣＤ２５抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を持つ抗体を発現したハイブリドーマを分離する。本開示の一具体的な実施形態において、上記マウス抗ヒトＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ、λ鎖若しくはその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、又は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４若しくはその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよい。
【0084】
「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、マウス抗体により誘発される免疫応答反応を低減することができる。キメラ抗体を作成するには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成し、そしてマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、更に、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように連結した後、ヒトベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体分子を発現する。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域から選ばれてもよく、好ましくはヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、又はアミノ酸変異した後にＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性の細胞仲介性の細胞傷害作用）毒性のないＩｇＧ１を使用する。
【0085】
「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワークに移植して産生された抗体を指す。キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことにより誘導された強い免疫応答反応を克服することができる。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、上記ヒト抗体可変領域に対して最も少ない逆変異を行うことにより、活性を維持することができる。本開示に係る抗体は、親和性の成熟したヒト化抗体であってもよく、親和性の成熟した抗体の親配列（全ての配列を含む）のＣＤＲは、少なくとも８０％が相同で、例えば、９０％相同である。親和性の成熟した抗体は、１つ又は複数のＣＤＲに１つ又は複数の改変されたアミノ酸を有する抗体であり、これにより、抗体は、改変されたアミノ酸を有しない親抗体と比べてＣＤ２５に対する親和性が改善される。
【0086】
「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の可変と定常領域を有する抗体を含む。本開示に係るヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列でコードされていないアミノ酸残基（例えば、体外のランダム又は部位特異的な変異誘発、又は体内の体細胞変異により導入された変異）を含むことができる。しかし、「ヒト抗体」は、別種の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系から誘導されたＣＤＲ配列をヒト骨格配列に移植した抗体（即ち、「ヒト化抗体」）を含まない。
【0087】
「抗原結合断片」は、単鎖抗体（即ち、全長重鎖と軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、２価又は３価又は４価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ及び上記の何れか１つのエピトープ結合断片を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６、Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９－２１７を参照する）。これらの抗体断片を産生・調製する方法は、この分野において公知のものである（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５－１８１を参照する）。Ｆａｂ－Ｆｖ形態は、ＷＯ２００９／０４０５６２に初めて開示され、そのジスルフィド結合の安定化形態であるＦａｂ－ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２に初めて開示された。本開示に係る抗原結合断片は、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０とＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片を更に含む。多価抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性のものを含んでもよく、又は単一特異性のものであってもよく（例えば、ＷＯ９２／２２５８３とＷＯ０５／１１３６０５参照）、後者の一例としては、ＷＯ９２／２２５８３に記載されたＴｒｉ－Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。幾つかの具体的な実施形態において、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体は、二重、多重特異性抗体をカバーする。
【0088】
「エピトープ」とは、抗原における免疫グロブリン又は抗体と特異的に結合する部位である。エピトープは、隣接するアミノ酸から、又はタンパク質の三次折畳により並列して隣接しないアミノ酸から形成されてもよい。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは、通常、変性溶媒に暴露された後に保持されるが、三次折畳により形成されたエピトープは通常、変性溶媒で処理された後に無くなる。エピトープは、通常、特別な空間配座で、少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む。所定の抗体により結合するエピトープを決定する方法は、この分野でよく知られているもので、免疫ブロット法と免疫沈降検出分析などを含む。エピトープの空間配座の決定方法は、この分野における技術と本明細書に記載の技術、例えば、Ｘ線結晶分析法と２次元核磁気共鳴などを含む。
【0089】
「特異的結合」、「選択的結合」とは、抗体と所定の抗原におけるエピトープとの結合を指す。通常、組換えヒトＣＤ２５又はそのエピトープを分析物として使用すると共に抗体をリガンドとして使用し、機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定する場合、抗体は、約１０－７ Ｍ未満又はそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原又はそのエピトープと結合し、且つ所定の抗原又はそのエピトープに対する結合親和性が、所定の抗原（又はそのエピトープ）又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡなど）に対する結合親和性の少なくとも２倍である。「抗原を認識する抗体」は、本明細書において「特異的に結合する抗体」と互換可能に使用されてもよい。
【0090】
「結合親和性」とは、見掛け会合定数又はＫａである。Ｋａは解離定数（Ｋｄ）の逆数である。例えば、結合タンパク質は、特定の標的分子に対して少なくとも１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０と１０－１１ Ｍの結合親和性を有してもよい。第２標的に対して、リガンドと第１標的との結合より高い親和結合は、第２標的と結合するＫａ（又は、それ以下の数値のＫｄ）よりも高い第１標的と結合するＫａ（又は、Ｋｄの数値）で示すことができる。このような場合に、第２標的（例えば、第２立体配座又はその類似体の同じタンパク質、或いは第２タンパク質）に対して、結合タンパク質は、第１標的に特異性（例えば、第１立体配座又はその類似体のタンパク質）を有する。結合親和性の差異（例えば、特異性又はその他に対する比較）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、５０、７０、８０、１００、５００、１０００又は１０５倍である。
【0091】
「保存的置換」は、元のアミノ酸残基と類似の特性を有する別のアミノ酸残基に置換されることを指す。例えば、リジン、アルギニンとヒスチジンは、塩基性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有し、また、アスパラギン酸とグルタミン酸は、酸性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有する。更に、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインとトリプトファンは、電荷をもたない極性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有し、また、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニンとメチオニンは、非極性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有する。更に、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンとヒスチジンは、芳香族側鎖を持つことにおいて類似の特性を有する。従って、上記のような類似の特性を示す群におけるアミノ酸残基が置換される場合にも、それは特性の特定の変化を示さないことが当業者に明らかである。
【0092】
「配列相同性」又は「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列類似性である。２つの比較される配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットに占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンに占められる場合、上記分子が当該位置で相同である。２つの配列間の相同性百分率は、２つの配列の共有するマッチング又は相同位置数を比較される位置数で割って１００％をかける関数である。例えば、配列が最適にアラインメントされる場合、２つの配列の１０個の位置に６個がマッチングし、又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般的には、２つの配列をアラインメントすることで最大の相同性百分率を得た場合に比較する。
【0093】
「交差反応」は、本開示の抗体の異なる種由来のＣＤ２５との結合能力を指す。例えば、ヒトＣＤ２５に結合する本開示の抗体は、別の種のＣＤ２５に結合することもできる。交差反応性は、結合測定（例えばＳＰＲ及びＥＬＩＳＡ）において精製抗原との特異的反応性、又はＣＤ２５を生理学的に発現した細胞との結合又は機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を決定する方法は、本明細書に記載されるような標準的な結合測定、例えば、表面プラズモン共鳴分析や、フローサイトメトリーを含む。
【0094】
「抑制」又は「阻害」は交換可能に使用されてもよく、部分的と完全な抑制／阻害の両方をカバーする。ＣＤ２５に対する抑制／阻害は、抑制や阻害のない場合にＣＤ２５の結合が発生される時に活性が現れる正常なレベル又は種類を低減又は変更することが好ましい。抑制と阻害は、抗ＣＤ２５抗体と接触した場合、抗ＣＤ２５抗体と接触していないＣＤ２５に比べて、任意の測定可能なＣＤ２５結合親和性が低減されることを含むことも意図する。
【0095】
「成長の抑制」（例えば、細胞について）は、細胞成長の何れの測定可能な低下も含むことを意図する。
【0096】
抗体及び抗原結合断片の製造・精製方法は、従来技術でよく知られており、且つ、例えば冷泉港の抗体実験技術マニュアル（５～８章及び１５章）で見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ２５又はその断片をマウスに免疫することができ、得られた抗体は復元、精製されることができると共に、通常の方法によりアミノ酸シークエンシングを行うことができる。抗原結合断片は、同じく通常の方法により調製することができる。発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒト由来のＣＤＲ領域に１つ又は複数のヒトＦＲ領域を追加したものである。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のホームページであるｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから取得可能であり、又は免疫グロブリン雑誌、２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得ることができる。
【0097】
本開示に係る抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、異種、同種異系、同系又はその修飾された形態であってもよく、そのうち、モノクローナル抗体は、特に複数の実施例に適用される。一般的に、本開示に係る抗体は組換え抗体である。本明細書に使用される「組換え」は、例えば細胞又は核酸、タンパク質又はベクターなどの製品を広義に指し、上記細胞、核酸、タンパク質又はベクターが既にヘテロ核酸又はタンパク質を導入したり、天然の核酸又はタンパク質を改変したりすることで修飾され、又は上記細胞がこのように修飾された細胞に由来することを表す。例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）細胞形態に存在しない遺伝子を発現するか、又は元々異常に発現され、低く発現され又は完全に発現されていない天然遺伝子を発現する。
【0098】
「モノクローナル抗体」又は「単クローン抗体」は、単一のクローン細胞株から得られた抗体を指し、上記の細胞株は真核の、原核の又はファージのクローン細胞株に限定されない。モノクローナル抗体又は抗原結合断片は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えば、ＣＤＲ－グラフト）、又は他の従来技術により組換えて得ることができる。
【0099】
本開示に係る抗体又は抗原結合断片は、従来の方法により調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローニングして発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションすることができる。哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現することによって安定的なクローンが得られる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を製造する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製して収集することができる。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、－７０℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。
【0100】
当業者に知られている従来の技術により、同じエピトープに対する結合から抗体を競合的にスクリーニングすることができる。例えば、競合及び交差競合研究を行うことにより、互いに競合したり、交差競合したりして抗原と結合する抗体を得ることができる。それらの交差競合によって同じエピトープと結合する抗体を得るハイスループット方法は、国際特許公開ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。従って、当業者に知られている通常の技術により、本開示に係る抗体分子と競合してＣＤ２５における同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合断片を得ることができる。ここで、ＷＯ２０１８１６７１０４における抗体の競合的結合を検出する方法が全文に組み込まれている。
【0101】
「与える」、「投与」及び「処理」は動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物と、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官や生物流体との接触を意味する。「与える」、「投与」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬と細胞との接触、及び試薬と流体との接触を含み、そのうち、上記流体は細胞と接触する。「与える」、「投与」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。
【0102】
「治療」は、対象に内用又は外用の治療剤、例えば、本開示の何れか１つの抗体又はその抗原結合断片、又はその複合体を含む組成物を投与することを意味し、上記対象は、１つ又は複数の疾患又はその症状を患っており、患っている恐れがあり、又は患う傾向がある者であるが、上記治療剤は、これらの症状に対して治療作用を有することが知られている。通常、このような症状の退行を誘導することによるにせよ、臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこのような症状を抑制することによるにせよ、治療される対象又は集団に、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を投与する。任意の具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、対象の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の対象に必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。当該症状の重症度や進行状況を評価するために医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる何れの臨床的検出方法によっても、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、ある対象における目標疾患症状の緩和において無効であり得るが、この分野で知られている何れかの統計学的検定方法、例えば、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定によると、それは、統計学的に有意な数の対象において目標疾患症状を軽減できることが確認された。
【0103】
本明細書に使用される「がんの治療」という用語は下記のことを含む：（ａ）がんを抑制し、即ち、その進行を阻止することであって、がんの進行を阻害又は遅延すること、がんの転移を阻害又は遅延することを含むが、これらに限定されず、及び／又は（ｂ）がんを緩和し、即ち、がんの消退を引き起こすことであって、上記がんに関連する１つ又は複数の症状を軽減又は緩和すること、転移されたがんを軽減又は緩和すること、及び／又は腫瘍を縮小又は除去することを含むが、これらに限定されない。
【0104】
本明細書の「予防」は、がんの症状の発症を遅延又は予防することを指す。予防は、絶対的なこと（それで疾患が発生されない）であり、又はある個体若しくは限られた時間だけにおいて有効である可能性がある。
【0105】
「有効量」は、医学病状の症状又は病状の改善又は予防に十分な量を含む。有効量は、更に、診断の許容又は促進に十分な量を指す。特定の対象又は獣医学的対象に使用される有効量は、例えば、治療すべき病状、対象の全体的体調、投与の方法や経路と用量、及び副作用の重症度といった要因によって変化することができる。有効量は、顕著な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与計画であってもよい。
【0106】
「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は、互換可能に使用されてもよく、このような名称は何れもそれらの子孫を含む。また、意図する又は意図しない変異のために、あらゆる子孫は、ＤＮＡ含有量で精確に同じであることがあり得ないと理解すべきである。最初の形質転換細胞からスクリーニングされたものと同様の機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。
【0107】
「任意選択的」又は「任意選択的に」とは、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、必ずしもそうとは限らないことを意味し、当該表現には当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意選択的に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしもその必要がないことを意味する。
【0108】
「医薬組成物」とは、１種又は複数種の本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片又はその生理学的に／薬学的に許容される塩又はプロドラッグと他の化学成分の混合物と、生理学的に／薬学的に許容されるベクター及び賦形剤などの他の成分と、を含むことを意味する。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与して更に生物活性を発揮するためのものである。
【0109】
「腫瘍」は、腫瘍に罹患していると診断され、又は罹患している可能性のある対象に適用され、がんは、任意の大きさの悪性又は潜在的に悪性の新生物や組織瘤腫を指し、原発性腫瘍と二次性新生物を含む。「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」及び「癌」は、本明細書において互換可能に使用されてもよく、相対的な異常を示し、制御されない及び／又は自己成長している腫瘍と腫瘍細胞を指すため、それらは、細胞増殖が明らかに制御できなくなることを特徴とする異常成長表現型を示している。通常、検出又は治療するための細胞は、前がん（例えば、良性）、悪性、転移前、転移と非転移細胞を含む。「固形腫瘍」は、組織の異常成長又は瘤腫であり、通常、嚢胞又は液体領域を含まず、特に白血病や非固形リンパ腫を除いた腫瘍及び／又は転移である（どこにあってもよい）。固形腫瘍は良性でも悪性でもよい。様々な固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類及び／又はそれらの存在する組織又は器官で命名される。固形腫瘍の実例は、肉腫（組織、例えば、海綿質骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、造血細胞又は線維性結合組織中の間葉に由来する形質転換細胞によるがんを含む）、がん（上皮細胞による腫瘍を含む）、黒色腫、リンパ腫、中皮腫、神経芽細胞腫と網膜芽細胞腫を含むが、これらに限定されない。
【0110】
具体的な説明のない限り、本明細書に使用される「１種」（ａ）及び「１つ」（ａｎ）という冠詞は、１個以上（即ち、少なくとも１個／種）の上記冠詞の文法的対象を指す。例えば、「１種の要素」とは、１個以上の要素である。
【実施例】
【0111】
以下、実施例と合わせて更に説明するが、これらの実施例は、本開示の範囲を限定するものではない。
【0112】
実施例又は試験例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に通常の条件、或いは原料又は商品メーカーにより推奨された条件に従う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル、冷泉港実験室、及び現代分子生物学方法、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｇｒｅｅｎｅ出版協会、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹが参照される。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販の一般的な試薬である。
【0113】
実施例１．組換えＣＤ２５タンパク質の活性の検出
組換えヒトＣＤ２５－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグタンパク質をヒトＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿０００４０８．１）のＣ末端に融合したものである。組換えヒトＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質（北京義翹神州から購入）は、複数群のアミノ酸タグをヒトＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿０００４０８．１）Ｍｅｔ１－Ｃｙｓ２１３のＣ末端に融合したものである。組換えサルＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質（北京義翹神州から購入）は、ＨｉｓタグをサルＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿００１２７０６３３．１）Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２１３のＣ末端に融合したものである。組換えマウスＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質（北京義翹神州から購入）は、ＨｉｓタグをマウスＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿０３２３９３．３）Ｍｅｔ１－Ｌｙｓ２３６のＣ末端に融合したものである。抗ＣＤ２５抗体ＤＡＣ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ、ダクリズマブ）により、購入された組換えタンパク質に対して活性検証などの一連の品質管理検出を行った。
組換えヒトＣＤ２５－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグタンパク質をヒトＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿０００４０８．１）のＣ末端に融合したものである。組換えヒトＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質（北京義翹神州から購入）は、複数群のアミノ酸タグをヒトＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿０００４０８．１）Ｍｅｔ１－Ｃｙｓ２１３のＣ末端に融合したものである。組換えサルＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質（北京義翹神州から購入）は、ＨｉｓタグをサルＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿００１２７０６３３．１）Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２１３のＣ末端に融合したものである。組換えマウスＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質（北京義翹神州から購入）は、ＨｉｓタグをマウスＣＤ２５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号：ＮＰ＿０３２３９３．３）Ｍｅｔ１－Ｌｙｓ２３６のＣ末端に融合したものである。抗ＣＤ２５抗体ＤＡＣ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ、ダクリズマブ）により、購入された組換えタンパク質に対して活性検証などの一連の品質管理検出を行った。
【0114】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着実験）により組換えタンパク質の活性を検証した。具体的に、ＰＢＳで組換えヒトＣＤ２５－Ｆｃ融合タンパク質、ヒトＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質、サルＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質、マウスＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質をそれぞれ１ μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェル１００ μＬでＥＬＩＳＡマイクロプレートに入れ、４℃で一晩インキュベートし、ＥＬＩＳＡブロッキング液（１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有、ｐＨ７．４のＰＢＳリン酸塩緩衝液）を加え、３７℃で２時間ブロッキングした後、勾配希釈された検出抗体ＤＡＣと７Ｄ４（抗マウスＣＤ２５抗体）を順に加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄液でプレートを２～３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識（ＨＲＰ）の二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄液でプレートを２～３回洗浄した。ＴＭＢ基質をそれぞれのウェルに１００ μＬ加え、室温で１５分間インキュベートした後、それぞれのウェルに５０ μＬの停止液（２ Ｍ ＨＣｌ）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ）でＯＤ４５０ ｎｍ値を読み取り、その結果は図１Ａと１Ｂに示される通りである。
【0115】
その結果、２種の組換えヒトＣＤ２５タンパク質、組換えサルＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質は何れもＤＡＣと結合可能であり、且つ検出シグナルが検出抗体の濃度によって変化され、組換えマウスＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質はＤＡＣと結合することができないが、７Ｄ４と結合可能であることが示されており、上記組換えＣＤ２５タンパク質は何れも活性を持つことが証明される。
【0116】
実施例２．組換えヒトＣＤ２５タンパク質を発現した安定細胞株の作製
組換えヒトＣＤ２５タンパク質をコードするプラスミドでＣＨＯ－Ｋ１細胞をトランスフェクションした後、スクリーニングにより組換えヒトＣＤ２５タンパク質を安定的に発現した細胞株を得た。ヒトＣＤ２５をコードするヌクレオチド配列は、クローニングされてｐＣＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に連結されてプラスミドを調製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でＣＨＯ－Ｋ１細胞系（何れもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクションし、Ｇ４１８を含むＣＤ－ＣＨＯ培地で２週間選択的に培養し、有限希釈法により９６ウェル培養プレートにおいてサブクローニングし、３７℃で５％のＣＯ２（ｖ／ｖ）を含むインキュベーターに入れて培養し、２週間後に一部のモノクローナルウェルを２４ウェルプレート内に増幅してから、６ウェルプレートに増幅して培養した。増幅されたクローンに対してフロー分析法により検出とスクリーニングを行った。図２の結果から、スクリーニングされた細胞株２Ｆ８は、ヒトＣＤ２５タンパク質を安定的に発現することができることを示している。
組換えヒトＣＤ２５タンパク質をコードするプラスミドでＣＨＯ－Ｋ１細胞をトランスフェクションした後、スクリーニングにより組換えヒトＣＤ２５タンパク質を安定的に発現した細胞株を得た。ヒトＣＤ２５をコードするヌクレオチド配列は、クローニングされてｐＣＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に連結されてプラスミドを調製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でＣＨＯ－Ｋ１細胞系（何れもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクションし、Ｇ４１８を含むＣＤ－ＣＨＯ培地で２週間選択的に培養し、有限希釈法により９６ウェル培養プレートにおいてサブクローニングし、３７℃で５％のＣＯ２（ｖ／ｖ）を含むインキュベーターに入れて培養し、２週間後に一部のモノクローナルウェルを２４ウェルプレート内に増幅してから、６ウェルプレートに増幅して培養した。増幅されたクローンに対してフロー分析法により検出とスクリーニングを行った。図２の結果から、スクリーニングされた細胞株２Ｆ８は、ヒトＣＤ２５タンパク質を安定的に発現することができることを示している。
【0117】
実施例３．検出抗体に対する機能検証
ＤＡＣ、７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６、７Ｄ４は何れも抗ＣＤ２５抗体である。ＤＡＣの配列はＵＳ５５３０１０１においてリストされており、当該特許は参照により本開示に組み込まれている。７Ｇ７Ｂ６は、放射性核種にＣＤ２５を発現したリンパ腫を狙わせる標的部分として提案された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２４（３）、３０３－３０９）。Ｔａｂ０６は、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制しない抗ＣＤ２５抗体であり、配列がＷＯ２０１８１６７１０４においてリストされている（当該特許の配列２７と２９）、当該特許は参照により本開示に組み込まれている。７Ｄ４はラットＩｇＭ抗マウスＣＤ２５抗体であり、ＰＣ６１の存在下又はＰＣ６１による治療後又は類似の結合特性を持つ抗体の存在下で、７Ｄ４は既にＣＤ２５陽性細胞の検出に広く適用されている（Ｍａｌｅｋ、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８０、ｐｐ．５６９４－５６９８、Ｏｎｉｚｕｋａ Ｓ ｅｔ ａｌ．、１９９９．Ｃａｎｃ Ｒｅｓ．５９、３１２８－３１３３）。
ＤＡＣ、７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６、７Ｄ４は何れも抗ＣＤ２５抗体である。ＤＡＣの配列はＵＳ５５３０１０１においてリストされており、当該特許は参照により本開示に組み込まれている。７Ｇ７Ｂ６は、放射性核種にＣＤ２５を発現したリンパ腫を狙わせる標的部分として提案された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２４（３）、３０３－３０９）。Ｔａｂ０６は、ＩＬ－２とＣＤ２５の結合を抑制しない抗ＣＤ２５抗体であり、配列がＷＯ２０１８１６７１０４においてリストされている（当該特許の配列２７と２９）、当該特許は参照により本開示に組み込まれている。７Ｄ４はラットＩｇＭ抗マウスＣＤ２５抗体であり、ＰＣ６１の存在下又はＰＣ６１による治療後又は類似の結合特性を持つ抗体の存在下で、７Ｄ４は既にＣＤ２５陽性細胞の検出に広く適用されている（Ｍａｌｅｋ、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８０、ｐｐ．５６９４－５６９８、Ｏｎｉｚｕｋａ Ｓ ｅｔ ａｌ．、１９９９．Ｃａｎｃ Ｒｅｓ．５９、３１２８－３１３３）。
【0118】
ＦＡＣＳにより検出抗体ＤＡＣ、７Ｇ７Ｂ６、Ｔａｂ０６、７Ｄ４に対して機能検証を行った。具体的に、対数増殖期のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、及びヒトＣＤ２５を安定的に発現したＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ２５細胞）を遠心分離で収集し、ＰＢＳで洗浄した後、２００ ｇで５分間遠心分離した。２×１０５個の細胞数を含む培養液１００ μＬをプレートに播種し、４００ ｇで５分間遠心分離した後に検出抗体（１００ ｎＭ、勾配希釈）を加え、そのうち、対照群抗体はヒトＩｇＧアイソタイプである。氷上で１ ｈインキュベートし、ＰＢＳにより不要の抗体を洗い流し、４００ ｇで５分間遠心分離した。二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ヒト（Ｆｃ）抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入、製品番号Ａ１１０１３）を加えて氷浴で１時間染色し、ＰＢＳにより不要の抗体を洗い流し、４００ ｇで５分間遠心分離した。それぞれのウェルに２００ μＬのフロー検出液を加えた後、マシンにかけて検出した。
【0119】
図３Ａ～３Ｃに示されるように、Ｓｕ－ＤＨＬ－１細胞及びヒトＣＤ２５を安定的に発現したＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ２５細胞）（即ち、モノクローナル２Ｆ８）との結合実験において、ＤＡＣのシグナルは最も強く、Ｔａｂ０６はその次、７Ｇ７Ｂ６のシグナルは最も弱く、３つの抗体は何れも、Ｓｕ－ＤＨＬ－１細胞及びヒトＣＤ２５を安定的に発現したＣＨＯ－Ｋ１細胞と結合可能であるが、何れもＣＨＯ－Ｋ１細胞とは結合しない。
【0120】
７Ｇ７Ｂ６及びＴａｂ０６に対してＥＬＩＳＡにより機能検証を行った。具体的に、ＰＢＳで組換えヒトＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質、組換えサルＣＤ２５－Ｈｉｓタンパク質及び組換えマウスＣＤ２５－ｈｉｓタンパク質を１ μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェル１００ μＬでＥＬＩＳＡマイクロプレートに入れ、４℃で一晩インキュベートし、ＥＬＩＳＡブロッキング液（１％のＢＳＡ含有、ｐＨ７．４のＰＢＳリン酸緩衝液）を加え、３７℃で２時間ブロッキングした後、順に勾配希釈された検出抗体をそれぞれ加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄液でプレートを２～３回し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識（ＨＲＰ）の二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄液でプレートを２～３回洗浄した。それぞれのウェルにＴＭＢ基質１００ μＬを加え、室温で１５分間インキュベートした後、それぞれのウェルに５０ μＬの停止液（２ ＭのＨＣｌ）を加え、ＯＤ４５０ ｎｍ値を読み取った。
【0121】
図４Ａ～４Ｃに示されるように、７Ｇ７Ｂ６及びＴａｂ０６は、それぞれヒトＣＤ２５タンパク質及びサルＣＤ２５タンパク質と結合可能であることで、７Ｇ７Ｂ６及びＴａｂ０６はヒトサル交差反応活性を持つことが示され、７Ｄ４は、マウスＣＤ２５タンパク質と結合可能であることで、７Ｄ４はマウスＣＤ２５タンパク質との結合活性を持つことが示される。
【0122】
実施例４．組換えＣＤ２５タンパク質のマウスへの免疫によるマウス抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の取得
組換えヒトＣＤ２５－Ｆｃを免疫原として６～８週齢のＢａｌｂ／ｃとＳＪＬ／Ｊマウスに免疫し、組換えヒトＣＤ２５－Ｈｉｓを免疫原としてＳＪＬ／Ｊマウスに免疫した。初回の免疫用量は、１匹のマウスあたり５０ μｇである。初回免疫後の２週間に、追加免疫を行い、免疫用量は、１匹のマウスあたり２５ μｇである。その後、３週間おきに１回追加免疫した。
組換えヒトＣＤ２５－Ｆｃを免疫原として６～８週齢のＢａｌｂ／ｃとＳＪＬ／Ｊマウスに免疫し、組換えヒトＣＤ２５－Ｈｉｓを免疫原としてＳＪＬ／Ｊマウスに免疫した。初回の免疫用量は、１匹のマウスあたり５０ μｇである。初回免疫後の２週間に、追加免疫を行い、免疫用量は、１匹のマウスあたり２５ μｇである。その後、３週間おきに１回追加免疫した。
【0123】
毎回の追加免疫後の１週間に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりマウス血清中の抗体活性を検出した。１ μｇ／ｍＬの組換えヒトＣＤ２５－Ｈｉｓでプレートを被覆し、４℃で一晩置き、１％のＢＳＡ含有のＰＢＳＴ緩衝液により１時間ブロッキングし、プレートを３回洗浄した。ブロッキング緩衝液において１：１００を始めとして、マウスの血清を１０倍勾配希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、プレートを３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰの二次抗体と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、それぞれのウェルに１００ μＬのＴＭＢ基質を加え、１５分間後に２ ＭのＨＣｌで反応を中止した。マイクロプレートリーダーにより４５０ ｎｍでの吸光度を読み取った。免疫原である組換えヒトＣＤ２５－Ｆｃで免疫されたマウス血清は、免疫原への結合度が異なり、血清の最高希釈倍数が１：１０５である場合にも、抗原抗体反応を示すことができる。
【0124】
最終回の免疫で１００ μｇの組換えヒトＣＤ２５－Ｆｃと組換えヒトＣＤ２５－Ｈｉｓを腹腔内注射し、５日間後にマウスを殺した後、脾臓を取り、粉砕して脾細胞を収集した。最終濃度が１％（ｗ／ｗ）のＮＨ４ＯＨを加えて脾細胞中に混在する赤血球を溶解し、脾細胞懸濁液を得て、１０００回転数で遠心分離して細胞を３回洗浄した。生細胞数５：１の比率でマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０を混合し、高効率電気融合方法により細胞融合を行った。２０％のウシ胎児血清、１×ＨＡＴ（ｗ／ｗ）含有のＤＭＥＭ培地により融合された細胞を９６ウェル細胞培養プレートに希釈し、１ウェル２００ μＬで合計１×１０５個の細胞を、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２の３７℃インキュベーターに置いた。１４日間後、ＥＬＩＳＡで融合された細胞をスクリーニングし、ＯＤ４５０ ｎｍ＞１．０の陽性クローンを２４ウェル細胞プレートに増幅し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２条件下で、１０％（ｗ／ｗ）のＨＴウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で拡大培養を続けた。３日間後、２４ウェル細胞プレート培養液を取って遠心分離して上清を収集し、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳにより組換えヒトＣＤ２５タンパク質とＣＤ２５陽性細胞への結合活性を確定した。２ラウンドの単クローン化を行い、且つ上記ＥＬＩＳＡ検出方法とフロー検出方法により優れたモノクローナル株をスクリーニングした。抗体のシークエンシングされたアミノ酸配列は表１に示されており、下線部は相補性決定領域ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ番号付けシステムで）である。
【0125】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0126】
実施例５．組換えキメラ型抗ＣＤ２５抗体の調製及びヒト化プロセス
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体の定常領域を置換することにより、組換えキメラ型抗体が得られ、そしてマウスモノクローナル抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト重、軽鎖定常領域（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１、ｋａｐｐａ）をコードするタンパク質配列を含むｐＴＴ５ベクターにクローニングした後、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションし、つまり、得られたキメラ抗体の重鎖、軽鎖可変領域がそれぞれマウス抗体の重鎖、軽鎖可変領域と同様である。ヒト化抗体は、相同モデル化によりマウスモノクローナル抗体の構造を予測した後、マウス抗ＣＤＲを適当なヒトＧｅｒｍＬｉｎｅフレームワークに嵌合し（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．２０１４、１０（４）：１８０－１８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１９、１９０４：２１３－２３０）、そして抗体－抗原結合に影響を与え得る部位で復帰変異を導入し、最後にヒト化モノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト重、軽鎖定常領域（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１、ｋａｐｐａ）をコードするタンパク質配列を含むｐＴＴ５ベクターにクローニングした後、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。５日間後、遠心分離して細胞を除去し、細胞培養液を収集してろ過した。ｐＨを７．０に調整した後、取得された細胞培養液の上清液をタンパク質Ａカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ）にかけ、グリシンにより結合した抗体を溶離し、１ ＭのＴｒｉｓで溶離液を中和した。
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体の定常領域を置換することにより、組換えキメラ型抗体が得られ、そしてマウスモノクローナル抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト重、軽鎖定常領域（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１、ｋａｐｐａ）をコードするタンパク質配列を含むｐＴＴ５ベクターにクローニングした後、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションし、つまり、得られたキメラ抗体の重鎖、軽鎖可変領域がそれぞれマウス抗体の重鎖、軽鎖可変領域と同様である。ヒト化抗体は、相同モデル化によりマウスモノクローナル抗体の構造を予測した後、マウス抗ＣＤＲを適当なヒトＧｅｒｍＬｉｎｅフレームワークに嵌合し（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．２０１４、１０（４）：１８０－１８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１９、１９０４：２１３－２３０）、そして抗体－抗原結合に影響を与え得る部位で復帰変異を導入し、最後にヒト化モノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト重、軽鎖定常領域（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１、ｋａｐｐａ）をコードするタンパク質配列を含むｐＴＴ５ベクターにクローニングした後、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。５日間後、遠心分離して細胞を除去し、細胞培養液を収集してろ過した。ｐＨを７．０に調整した後、取得された細胞培養液の上清液をタンパク質Ａカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ）にかけ、グリシンにより結合した抗体を溶離し、１ ＭのＴｒｉｓで溶離液を中和した。
【0127】
抗体可変領域フレームワークの選択は表２に示され、抗体可変領域配列は表３に示され、重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１￥ＨＣＤＲ２￥ＨＣＤＲ３）と軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１￥ＬＣＤＲ２￥ＬＣＤＲ３）は表４に示され、抗体アミノ酸配列全長は表５に示されている。ここで、ＰＲ００６はｃＡｂ００６のヒト化の抗体、ＰＲ０７１はｃＡｂ０３７のヒト化抗体、ＰＲ０３１はｃＡｂ０４２のヒト化抗体、ＰＲ０５８、ＰＲ１５７はｃＡｂ０４６のヒト化抗体である。
【0128】
【表2】
【0129】
【表3-1】
【表3-2】
【0130】
【表4-1】
【表4-2】
【0131】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【0132】
実施例６．キメラ型抗ＣＤ２５抗体のヒト（ｈｕｍａｎ）とカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ２５タンパク質への親和性の検出
ＥＬＩＳＡ方法によりキメラ型抗ＣＤ２５抗体のＣＤ２５組換えタンパク質との結合活性を検出した。１ ｇ／ｍＬのヒトＣＤ２５－Ｈｉｓ／サルＣＤ２５－Ｈｉｓ濃度で、１ウェル５０ μＬで９６ウェルプレートを被覆した。洗浄液で未結合抗原を洗い流した（洗浄液：１×ＰＢＳＴ）。洗浄後、１×ＰＢＳＴで調製された１％のＢＳＡブロッキング液により３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄液でプレートを３回洗浄した後、異なる希釈濃度の検出待ちのキメラ抗体を加え、３７℃でインキュベーターで１時間インキュベートした。洗浄液でプレートを３回洗浄した後、１：５０００で希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体１００ μＬを加え、３７℃でインキュベーターで０．５時間インキュベートしてプレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液であるＡ液及びＢ液を取って１：１の割合で混合した後、発色させた。１５分間を経て１ Ｍの塩酸で発色反応を中止し、４５０ ｎｍの蛍光値を検出した。その結果、検出されるキメラ型抗ＣＤ２５抗体は、何れもヒト及びサルのＣＤ２５タンパク質と結合可能であることが示され、ＥＬＩＳＡにより検出された半有効濃度（ＥＣ５０）は表６と表７に示されている。
ＥＬＩＳＡ方法によりキメラ型抗ＣＤ２５抗体のＣＤ２５組換えタンパク質との結合活性を検出した。１ ｇ／ｍＬのヒトＣＤ２５－Ｈｉｓ／サルＣＤ２５－Ｈｉｓ濃度で、１ウェル５０ μＬで９６ウェルプレートを被覆した。洗浄液で未結合抗原を洗い流した（洗浄液：１×ＰＢＳＴ）。洗浄後、１×ＰＢＳＴで調製された１％のＢＳＡブロッキング液により３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄液でプレートを３回洗浄した後、異なる希釈濃度の検出待ちのキメラ抗体を加え、３７℃でインキュベーターで１時間インキュベートした。洗浄液でプレートを３回洗浄した後、１：５０００で希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体１００ μＬを加え、３７℃でインキュベーターで０．５時間インキュベートしてプレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液であるＡ液及びＢ液を取って１：１の割合で混合した後、発色させた。１５分間を経て１ Ｍの塩酸で発色反応を中止し、４５０ ｎｍの蛍光値を検出した。その結果、検出されるキメラ型抗ＣＤ２５抗体は、何れもヒト及びサルのＣＤ２５タンパク質と結合可能であることが示され、ＥＬＩＳＡにより検出された半有効濃度（ＥＣ５０）は表６と表７に示されている。
【0133】
【表6】
【0134】
【表7】
【0135】
実施例７．キメラ型抗ＣＤ２５抗体のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞との結合
リンパ腫細胞系ＳＵ－ＤＨＬ－１がＣＤ２５を高発現しているため、フローサイトメトリーによりキメラ型抗ＣＤ２５抗体のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞との結合を検出した。対数増殖期のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞を選択し、細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した後に遠心分離した。それぞれのウェルに１００ μＬの２×１０５個の細胞をプレートに播種し、４００ ｇで５分間遠心分離した。様々な濃度の検出待ちの抗体を加え、氷上で１ ｈインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、４００ ｇで５ ｍｉｎ遠心分離した。蛍光基を持つヤギ抗ヒト二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を加え、氷浴で１ ｈ染色し、ＰＢＳで洗浄した後にマシンにかけて検出した。図５Ａ～５Ｃに示されるように、検出される本開示に係るキメラ型抗ＣＤ２５抗体は、何れもＳＵ－ＤＨＬ－１細胞と結合可能である。表８は結合のＥＣ５０値である。
リンパ腫細胞系ＳＵ－ＤＨＬ－１がＣＤ２５を高発現しているため、フローサイトメトリーによりキメラ型抗ＣＤ２５抗体のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞との結合を検出した。対数増殖期のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞を選択し、細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した後に遠心分離した。それぞれのウェルに１００ μＬの２×１０５個の細胞をプレートに播種し、４００ ｇで５分間遠心分離した。様々な濃度の検出待ちの抗体を加え、氷上で１ ｈインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、４００ ｇで５ ｍｉｎ遠心分離した。蛍光基を持つヤギ抗ヒト二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を加え、氷浴で１ ｈ染色し、ＰＢＳで洗浄した後にマシンにかけて検出した。図５Ａ～５Ｃに示されるように、検出される本開示に係るキメラ型抗ＣＤ２５抗体は、何れもＳＵ－ＤＨＬ－１細胞と結合可能である。表８は結合のＥＣ５０値である。
【0136】
【表8】
【0137】
実施例８．キメラ型抗ＣＤ２５抗体のＴｒｅｇ細胞／活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞との結合
ＣＤ２５は、活性化されたＴｒｅｇにおいても、活性化されたエフェクターＴ細胞においても発現されるため、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体の、Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋とＣＤ８＋エフェクターＴ細胞に発現されるＣＤ２５に対する結合に差異があるか否かを検出するために、以下、ＦＡＣＳの方法により抗体のＴｒｅｇ及び活性化されたエフェクターＴ細胞への結合能力を比較した。
ＣＤ２５は、活性化されたＴｒｅｇにおいても、活性化されたエフェクターＴ細胞においても発現されるため、本開示に係る抗ＣＤ２５抗体の、Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋とＣＤ８＋エフェクターＴ細胞に発現されるＣＤ２５に対する結合に差異があるか否かを検出するために、以下、ＦＡＣＳの方法により抗体のＴｒｅｇ及び活性化されたエフェクターＴ細胞への結合能力を比較した。
【0138】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取り、磁気ビーズ法で天然ＣＤ４＋細胞を分離抽出し、Ｔｒｅｇを誘導する培地（（ＡＩＭ Ｖ＋１０％のＦＢＳ＋ｈｕｍａｎ ＩＬ－２（４００ Ｕ／ｍＬ）＋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ （０．１ ｇ／ｍＬ）又はＴＧＦβ （２０ ｎｇ／ｍＬ）＋ａｔＲＡ（２００ ｎＭ））を加えると共に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆された磁気ビーズを加えた。培養中に細胞密度を２×１０６／ｍＬに維持し、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で培養した。７日間培養した後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(商標) ＲｅｇｕＬａｔｏｒｙ ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１３６３Ｄ）により細胞を分離して活性化型のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を得て、ＦＯＸＰ３陽性率が９０％よりも大きいＴｒｅｇ細胞を得た。
【0139】
新鮮なＰＢＭＣにおいて、それぞれＣＤ４＋細胞ネガティブスクリーニング濃縮キット細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞スクリーニングキットにより濃縮し、分離して純度が９０％よりも大きい高純度のＣＤ４＋とＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を得た。また、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆された磁気ビーズを加えて細胞を活性化と増幅した。３日間後、ＣＤ２５を高発現したエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞及びエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を得た。
【0140】
体外で誘導されたＴｒｅｇ細胞及び体外で活性化されたＣＤ４＋とＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をそれぞれ様々な希釈濃度の検出待ちの抗体に入れて氷上で１ ｈインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。更に、ヤギ抗ヒト抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を加えて氷浴で１ ｈ染色し、ＰＢＳで洗浄し、それぞれのウェルに２００ μＬのフロー検出液を入れて同じ条件下で同時にマシンにかけて検出した。
【0141】
その結果、図６Ａ～６Ｇに示されるように、何れの検出されたキメラ抗体も、Ｔｒｅｇ細胞、活性化されたＣＤ４＋とＣＤ８＋エフェクターＴ細胞におけるＣＤ２５抗原と結合可能である。しかし、結合度から言えば、Ｔｒｅｇとの結合力はＣＤ４＋Ｔ細胞との結合よりはるかに大きく、且つＣＤ４＋Ｔ細胞との結合はＣＤ８＋Ｔ細胞との結合よりやや大きい。
【0142】
実施例９．キメラ型抗ＣＤ２５抗体によるＩＬ－２と受容体の結合能力への影響
対数増殖期のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞と２００ ｎＭのＩＬ－２－ｂｉｏｔｉｎ及び様々な濃度の検出待ちのキメラ型抗ＣＤ２５抗体を収集し、４℃で１ ｈインキュベートした後、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（１：１０００）を加えて４℃で１ ｈインキュベートし、ＰＢＳで不要の二次抗体を除去し、ＦＡＣＳで蛍光細胞を検出した。抗体がＩＬ－２とＣＤ２５の結合に影響を与えると、蛍光強度は弱くなる。
対数増殖期のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞と２００ ｎＭのＩＬ－２－ｂｉｏｔｉｎ及び様々な濃度の検出待ちのキメラ型抗ＣＤ２５抗体を収集し、４℃で１ ｈインキュベートした後、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（１：１０００）を加えて４℃で１ ｈインキュベートし、ＰＢＳで不要の二次抗体を除去し、ＦＡＣＳで蛍光細胞を検出した。抗体がＩＬ－２とＣＤ２５の結合に影響を与えると、蛍光強度は弱くなる。
【0143】
下記の式で抑制率を算出した：
抑制率％＝１００×（抗体が加えられていない時の最大結合蛍光強度－抗体結合後の蛍光強度）／抗体が加えられていない時の結合強度。
抑制率％＝１００×（抗体が加えられていない時の最大結合蛍光強度－抗体結合後の蛍光強度）／抗体が加えられていない時の結合強度。
【0144】
その結果、図７Ａ～７Ｂに示されるように、ＤＡＣ、ｃＡｂ００１、ｃＡｂ００２、ｃＡｂ０２８、ｃＡｂ０２９はＩＬ－２とＳＵ－ＤＨＬ－１の結合を異なる程度で抑制していることで、上記のキメラ型抗体によりＩＬ－２シグナル伝達経路が抑制されることが示唆されるのに対し、ｃＡｂ００６、ｃＡｂ０３７、ｃＡｂ０４２、ｃＡｂ０４６はＴａｂ００６と同様にＩＬ－２とＳＵ－ＤＨＬ－１の結合を抑制しないことで、上記のキメラ型抗体は非拮抗型抗体に属することが示唆される。
【0145】
実施例１０．ヒト化抗ＣＤ２５抗体のＳＵＤＨ－Ｌ１の細胞との結合
実施例７のフローサイトメトリー方法によりキメラ型抗ＣＤ２５抗体のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞との結合を検出した。図８は、本開示に係るヒト化抗ＣＤ２５抗体ＲＰ００６、ＰＲ０３１、ＰＲ０５８及びＰＲ０７１が何れも良好なＳＵ－ＤＨＬ－１結合活性を持つことを示している。
実施例７のフローサイトメトリー方法によりキメラ型抗ＣＤ２５抗体のＳＵ－ＤＨＬ－１細胞との結合を検出した。図８は、本開示に係るヒト化抗ＣＤ２５抗体ＲＰ００６、ＰＲ０３１、ＰＲ０５８及びＰＲ０７１が何れも良好なＳＵ－ＤＨＬ－１結合活性を持つことを示している。
【0146】
実施例１１．ヒト化抗ＣＤ２５抗体のヒト末梢血Ｔリンパ球ｐＳｔａｔ５シグナル伝達経路への影響
ＣＤ２５は、ＩＬ－２サイトカイン受容体のα鎖として、β及びγ鎖と合わせて高親和性の受容体を形成した後、ＩＬ－２と結合してから、下流ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴとＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化するので、ＩＬ－２によるＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ－５のリン酸化のアップレギュレーションに対するキメラ型抗体の作用を更に検出した。
ＣＤ２５は、ＩＬ－２サイトカイン受容体のα鎖として、β及びγ鎖と合わせて高親和性の受容体を形成した後、ＩＬ－２と結合してから、下流ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴとＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化するので、ＩＬ－２によるＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ－５のリン酸化のアップレギュレーションに対するキメラ型抗体の作用を更に検出した。
【0147】
凍結保存されたＰＢＭＣを蘇生し、ヒト化抗ＣＤ２５抗体とＰＢＭＣを共にインキュベートした（３７℃で、５％のＣＯ２）。３０分間後、それぞれ１００ Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を加えて１０分間誘導した。活性化されたＰＢＭＣを固定し、それぞれのウェルに２００ μＬの染色液（２％のＦＢＳ含有のＰＢＳ）を入れて５ μＬのＶ４５０マウス抗ヒトＣＤ３標識Ｔ細胞を加え、未結合の抗体を洗い流した後、３００ μＬの予冷膜透過剤Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩを加え、ボルテックスで均一に混合し、３０分間氷浴した。更に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標) ６４７マウス抗Ｓｔａｔ５で６０分間染色した。不要の抗体を除去し、フローサイトメーターにより検出した。
【0148】
図９に示されるように、ＤＡＣは、ＩＬ－２により誘導されたＣＤ３細胞内のＳｔａｔ５のリン酸化を明らかに抑制可能であるが、Ｔａｂ０６は、ＩＬ－２により誘導されたＳｔａｔ５のリン酸化を抑制することができない。ＰＲ００６は３００ ｎＭと１００ ｎＭでＳｔａｔ５のリン酸化を弱く抑制することができるが、ＰＲ０３１、ＰＲ０５８、ＰＲ０７１はＩＬ－２仲介性のＳｔａｔ５のリン酸化を抑制しない。
【0149】
実施例１２．ヒト化抗ＣＤ２５抗体により仲介されるＳＵ－ＤＨＬ－１細胞へのＡＤＣＣ作用
抗体仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は抗体治療の重要な機能の一つであり、ＡＤＣＣの活性によりＣＤ２５を高発現したＴｒｅｇ細胞を傷害して腫瘍免疫を活性化する作用を達成することが求められており、以下、本開示に係るヒト化抗ＣＤ２５抗体仲介性ＡＤＣＣの活性を検出した。
抗体仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は抗体治療の重要な機能の一つであり、ＡＤＣＣの活性によりＣＤ２５を高発現したＴｒｅｇ細胞を傷害して腫瘍免疫を活性化する作用を達成することが求められており、以下、本開示に係るヒト化抗ＣＤ２５抗体仲介性ＡＤＣＣの活性を検出した。
【0150】
ＡＤＣＣレポーター遺伝子細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧ７０１０ ＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ）を使用してＳＵ－ＤＨＬ－１細胞と１：１の割合で混合し、様々な濃度の抗体を加えて６時間インキュベートした後、細胞蛍光活性を検出し、図１０及び表９から、ＰＲ００６、ＰＲ０３１、ＰＲ０５８及びＰＲ０７１は何れも良好なＡＤＣＣ活性を持ち、そのうち、ＰＲ０５８、ＰＲ０７１の活性は抗体６８６よりも明らかに強いことが分かる。
【0151】
抗体６８６配列は、ＵＳ２０１９０２８４２８７Ａの配列５、配列９を参照する。
【0152】
【表9】
【0153】
実施例１３．ヒト化抗ＣＤ２５抗体により仲介されたｈＣＤ２５マウスのＭＣ３８移植腫瘍モデルに対する抗腫瘍活性
Ｂ－ｈＩＬ２ＲＡヒト化マウスのＭＣ３８結腸がんマウスモデルにおいてヒト化抗ＣＤ２５抗体の抗腫瘍活性を評価した。上記ＰＲ０５８、６８６の可変領域をマウスＩｇＧ２ａに連結してＰＲ０５８ ｍＩｇＧ２ａ、６８６ ｍＩｇＧ２ａ抗体を構築し、動物実験に用いた。
Ｂ－ｈＩＬ２ＲＡヒト化マウスのＭＣ３８結腸がんマウスモデルにおいてヒト化抗ＣＤ２５抗体の抗腫瘍活性を評価した。上記ＰＲ０５８、６８６の可変領域をマウスＩｇＧ２ａに連結してＰＲ０５８ ｍＩｇＧ２ａ、６８６ ｍＩｇＧ２ａ抗体を構築し、動物実験に用いた。
【0154】
ＰＢＳで再懸濁されたＭＣ３８結腸がん細胞を５×１０５個／０．１ ｍＬの濃度、０．１ ｍＬ／匹の体積でＢ－ｈＩＬ２ＲＡヒト化マウスの右側皮下に接種した。平均腫瘍体積が約１１３ ｍｍ３に達する場合、個体の腫瘍体積が適当なマウス４８匹を選択してランダムに群分けして、１群あたり８匹で、それぞれＧ１アイソタイプｍＩｇＧ２ａ（３ ｍｇ／ｋｇ）対照群、Ｇ２ ＰＲ０５８ ｍＩｇＧ２ａ（３ ｍｇ／ｋｇ）群、Ｇ３ ６８６ ｍＩｇＧ２ａ（３ ｍｇ／ｋｇ）群である合計６群であった。あらゆる群の投与経路は何れも腹腔内注射であり、１週１回投与し、３回連続投与し、最終回投与後の７日に実験を終了させた。腫瘍体積及び体重を週２回計測し、マウスの体重及び腫瘍体積を記録した。実験終了時に、動物を安楽死させ、腫瘍を剥ぎ取って秤量し、写真を撮り、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出した。
【0155】
研究の結果として、図１１Ａに示されるように、ＰＲ０５８は３ ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、ＭＣ３８皮下移植腫瘍の成長に対して最も優れた抑制作用を有し、６８６よりも優れている。図１１Ｂは、実験動物の投与期間における活動と摂食状態が良好で、実験動物の体重が何れもある程度向上していることを示し、被験薬は実験動物に顕著な毒性作用を果たせず、安全性が良いことが明らかになる。図１２Ａ、図１２Ｂの腫瘍内リンパ球の分析結果に示されるように、ＰＲ０５８は、Ｔｒｅｇの傷害及びＣＤ３数のアップレギュレーションをより強く仲介することができる。ここで、＊はｐ＜０．０５で、ｍＩｇＧ２ａ群と比べて統計学的に差異があることを示し、＊＊はｐ＜０．０１で、ｍＩｇＧ２ａ群と比べて統計学的に有意な差異があることを示し、＊＊＊はｐ＜０．００１で、ｍＩｇＧ２ａ群と比べて統計学的に極めて有意な差異があることを示し、ｎｓは、ｍＩｇＧ２ａ群と比べて統計学的に差異がないことを示す。
【0156】
以上、本開示の具体的な実施形態を説明したが、当業者であれば、これらは例示的な説明に過ぎず、本発明の原理及び主旨から逸脱しない限り、これらの実施形態に種々の変更や修正を行うことができると理解すべきである。従って、本開示の請求範囲は、添付される特許請求の範囲によって限定される。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【配列表】
【国際調査報告】