▶ ゴーダーヴァリ バイオリファイナリーズ リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-14
(54)【発明の名称】ウイルス感染の治療のための化合物の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/36 20060101AFI20230607BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230607BHJP
A61K 31/365 20060101ALI20230607BHJP
A61K 31/4025 20060101ALI20230607BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20230607BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20230607BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20230607BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230607BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230607BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230607BHJP
【ＦＩ】
A61K31/36
A61P43/00 111
A61K31/365
A61K31/4025
A61K31/4709
A61K31/496
A61K31/5377
A61P31/12
A61P31/16
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568620
(86)(22)【出願日】2021-05-10
(85)【翻訳文提出日】2023-01-05
(86)【国際出願番号】 IN2021050451
(87)【国際公開番号】W WO2021229602
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】202021019866
(32)【優先日】2020-05-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511190694
【氏名又は名称】ゴーダーヴァリ バイオリファイナリーズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アタヴァレ マイティリ
(72)【発明者】
【氏名】ガヴァデ サンディップ
(72)【発明者】
【氏名】カーカル プラシャント
(72)【発明者】
【氏名】スリヴァスタヴァ サンギータ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA13
4C086BA17
4C086BC05
4C086BC28
4C086BC50
4C086BC73
4C086GA02
4C086GA07
4C086GA09
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086NA15
4C086ZB33
4C086ZC20
(57)【要約】
本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｉの化合物の使用、および式Ｉの化合物を用いたウイルス感染の治療方法に関する。
【化１】
【選択図】なし
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｉの化合物の使用。【化1】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５等の－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のＯ等のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ１１およびＲ１２は、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化2】
【化3】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【請求項2】
前記化合物が下記式ＩＩで表される、請求項１に記載の化合物の使用。【化4】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は－Ｈおよび－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒは置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化5】
【化6】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【請求項3】
前記化合物が式ＩＩＩで表される、請求項１に記載の化合物の使用。【化7】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のＯ等のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化8】
【化9】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【請求項4】
前記化合物が下記式の化合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物の使用。【化10】
【化11】
【化12】
【請求項5】
細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｅの化合物の使用。【化13】
【請求項6】
前記化合物がプロドラッグ、代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物またはその多形体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項7】
細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害によってウイルスを阻害するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害のための、請求項７に記載の化合物の使用。
【請求項9】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害のための、式Ｉの化合物の使用。
【請求項10】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害のための、式Ｅの化合物の使用。
【請求項11】
細胞を請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物の少なくとも１種を細胞と接触させることを含む、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害方法。
【請求項12】
請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物の少なくとも１種をウイルス感染細胞と接触させることを含む、ウイルスの阻害方法。
【請求項13】
前記ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項１２に記載の阻害方法。
【請求項14】
前記化合物が式Ｅの化合物である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の阻害方法。
【請求項15】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスを阻害するために、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物の少なくとも１種を投与することを含む、ウイルス感染の治療方法。
【請求項16】
請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物をＶ－ＡＴＰアーゼ阻害活性を有する少なくとも１種の追加化合物と組み合わせる、請求項１５に記載の治療方法。
【請求項17】
前記化合物が式Ｅの化合物である、請求項１５または１６に記載の治療方法。
【請求項18】
ウイルス感染の治療のために細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性を阻害する医薬の製造のための、式Ｉの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための化合物の使用、特にウイルス感染の治療のための、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルス等のウイルスのＶ－ＡＴＰアーゼ活性に対する阻害剤としての使用に関連する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスおよびＣＯＶＩＤ－１９疾病は、文化、人口統計学、技術および宗教の違いに関係なく、全世界的な大混乱を招いた。
【0003】
ＣＯＶＩＤ－１９の治療法の開発においては、計算的および実験的なドラッグ－リパーパシング（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ）あるいは第二用途の実証といった論理的な解決策が有用である。現存する薬物は出発点を提供し、臨床開発に要する期間を大幅に短縮し得る。ウイルスの侵入から始まり、成熟ウイルス粒子の放出までのウイルス生活環の種々の事象を標的とするリパーパシング作戦が文献にはあふれている。ＣＯＶＩＤ－１９の可能性のある治療選択肢としてのヒドロキシクロロキン、クロロキンおよび他の抗ウイルス薬の使用は、このアプローチの有する可能性の証拠となる。
【0004】
約束されたこのような標的の１つは、バフィロマイシン等のＶ－ＡＴＰアーゼ阻害剤の抗ウイルス効能から推測される、液胞性ＡＴＰアーゼ（Ｖ－ＡＴＰアーゼ）である。Ｖ－ＡＴＰアーゼは、宿主細胞へのウイルス侵入を遮断する約束された標的として提案されたものである。Ｖ－ＡＴＰアーゼは、全ての真核細胞の内膜系、即ち、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体等に位置する、偏在性プロトンポンプである。インフルエンザウイルス、フラビウイルス、ワクシニアウイルス、ボルナウイルス、ラブドウイルスおよびコロナウイルスは、Ｖ－ＡＴＰアーゼ仲介エンドソーム酸性化を宿主細胞への侵入のための重要な細胞プロセスとして利用する。
【0005】
Ｖ－ＡＴＰアーゼは宿主タンパク質であるため、Ｖ－ＡＴＰアーゼ阻害剤は、薬剤耐性の発達に対して感受性の低い、ウイルス侵入の潜在的な介入となり得る。
【0006】
数種のＶ－ＡＴＰアーゼ阻害剤、例えば、（初めに発見され、最も注目すべき例である）バフィロマイシンについて、それらの抗ウイルス能が検証された。それらの強力な抗ウイルス効能にもかかわらず、毒性が臨床応用における主たる障害となった。加えて、Ｖ－ＡＴＰアーゼ阻害剤の貧水溶性が薬物送達療法における課題となった。
【0007】
コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、におけるＶ－ＡＴＰアーゼの重要な役割およびその阻害剤のＣＯＶＩＤ－１９と戦うための用途に鑑みると、コロナウイルス感染症を標的とする潜在的な療法として、強力で有効なＶ－ＡＴＰアーゼ阻害剤の開発が必要である。
【発明の概要】
【0008】
一実施形態において、本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｉの化合物の使用に関する。
式中、
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５等の－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のＯ等のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ１１およびＲ１２は、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、および下記式から選ばれる。
式中、Ｒ１３はＨまたはアルキルであり、
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【化1】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５等の－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のＯ等のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ１１およびＲ１２は、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化2】
【化3】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【0009】
他の実施形態において、本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｅの化合物の使用に関する。
【化4】
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ＥＬＩＳＡアッセイの略図を示す。
【図2】３１．２５ｐｇ／ｍｌ～２０００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲内のＶ－ＡＴＰアーゼの標準曲線を示す。
【図3】レミデシビルの用量反応曲線を示す。
【図4】本発明の式Ｅの化合物の用量反応曲線を示す。
【図5】ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する式Ｅの化合物の投与の効果を示し、図５Ａは、曝露日から感染の４日後までのハムスターの体重変化のパーセンテージを表し、図５Ｂは、炎症および間質性肺炎を示す安楽死させた動物から摘出した肺全体の画像を示し、図５Ｃは、脾腫の症状を示す脾臓の画像を示す。
【図6】ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する式Ｅの化合物の投与の抗ウイルスおよび免疫調節効果を示し、図６Ａは、感染から４日後の種々の群における相対肺ウイルス負荷量を示す棒グラフであり、図６Ｂは、種々の実験群における脾臓のサイトカインの相対ｍＲＮＡ発現量を示す棒グラフである。各棒は平均＋ＳＥＭを表す。
【図7】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺の病理に対する式Ｅの化合物の投与の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｉの化合物の使用に関する。
式中、
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５等の－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のＯ等のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ１１およびＲ１２は、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、および下記式から選ばれる。
式中、Ｒ１３はＨまたはアルキルであり、
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｉの化合物の使用に関する。
【化5】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５等の－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のＯ等のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ１１およびＲ１２は、ラクトン等の置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化6】
【化7】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【0012】
一実施形態において、式Ｉ中のａおよびｂは対応する位置の二重結合の有無を示す。例えば、Ｅが－Ｎであり、且つＲ３が存在する場合、対応する位置の二重結合は不在である、あるいはＥが－Ｎであり、且つＲ３が不在の場合、対応する位置の二重結合は存在する。
【0013】
一実施形態において、本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式ＩＩの化合物の使用に関する。
【化8】
【0014】
一実施形態において、本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式ＩＩＩの化合物の使用に関する。
置換基は上記式Ｉについて定義した通りである。
【化9】
【0015】
一実施形態において、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための表１に示した化合物の使用に関する。これら化合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはインフルエンザの感染に対する治療において抗ウイルス薬として機能する。
【0016】
【表1-1】
【0017】
【表1-2】
【0018】
【表1-3】
【0019】
【表1-4】
【0020】
【表1-5】
【0021】
【表1-6】
【0022】
他の実施形態において、本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための式Ｅの化合物の使用に関する。式Ｅの化合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはインフルエンザの感染に対する治療に効果的である。
【化10】
【0023】
式Ｅの化合物の分子量は約４５０であり、分配係数（ｌｏｇＰ）値は４に近い。この化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、酢酸エチルなどの溶媒に可溶性である。
【0024】
式Ｉ～ＩＩＩおよび式Ａ～Ｕの化合物は、それらのプロドラッグ、代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物または多形体も使用され得る。
【0025】
式Ｉ～ＩＩＩおよび式Ａ～Ｕの化合物の用途は、ウイルスの阻害である。ウイルスに感染した細胞内のＶ－ＡＴＰアーゼ活性が阻害される。細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害がウイルスを阻害すると考えられる。
【0026】
式Ｉ～ＩＩＩおよび式Ａ～Ｕの化合物の用途は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルス等のウイルスの阻害である。
【0027】
式Ｅの化合物の用途は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害である。
【0028】
さらに本発明は、細胞を式Ｉ～ＩＩＩおよび式Ａ～Ｕの化合物の少なくとも１種と接触させることを含む、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害方法式に関する。
【0029】
さらに本発明は、式Ｉ～ＩＩＩおよび式Ａ～Ｕの化合物の少なくとも１種をウイルス感染細胞と接触させることを含む、ウイルスの阻害方法、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害方法に関する。
【0030】
細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害方法は、細胞またはウイルス感染細胞を式Ｅの化合物と接触させることを含む。
【0031】
さらに本発明は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性を阻害するために、治療有効量の式Ｉ～ＩＩＩおよび式Ａ～Ｕの化合物の少なくとも１種を投与する、ウイルス感染の治療方法に関する。この治療方法は、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの感染の治療用である。
【0032】
一実施形態において、治療方法は、治療有効量の式Ｉ～ＩＩＩおよび式Ａ～Ｕの化合物を、Ｖ－ＡＴＰアーゼ阻害活性を有する少なくとも１種の追加化合物と組み合わせて投与することを含む。
【0033】
他の実施形態において、治療方法は、化合物の１つとして式Ｅの化合物を投与することを含む。
【0034】
本発明の化合物は細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害に非常に効果的である。当該化合物は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ研究およびｉｎ－ｖｉｖｏ研究の両方において、正常ヒトリンパ球に対して殺細胞効果を示すことなく、優れた抗ウイルス効果を発揮した。この結果は、ウイルス感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する治療において、化合物を効果的かつ安全に使用できることを意味する。
【0035】
一実施形態において、本発明に包含される化合物は、細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはインフルエンザの感染などのウイルス感染を治療する医薬の製造に用いられる。
【0036】
本発明の範囲に含まれるいくつかの具体的な化合物をここに開示する。開示された化合物は本発明の範囲を減縮するものではないことを理解されたい。
【実施例】
【0037】
本発明の化合物は公知の方法によって製造される。化合物の製造方法は、ここで援用される国際公開第２０１８１９３４７６号および国際公開第２０２０１２９０８２号に開示されている。
【0038】
実施例１
細胞におけるＶ－ＡＴＰアーゼ阻害活性の決定
液胞性ＡＴＰアーゼ（Ｖ－ＡＴＰアーゼ）は、細胞の細胞内ｐＨおよび細胞外ｐＨの制御を担うプロトンポンプである。Ｖ－ＡＴＰアーゼの構造は、全真核細胞の間で高度に保存されており、種間で様々な機能に関与する。Ｖ－ＡＴＰアーゼはエンドソームおよびリソソームの酸性化について最も広く知られており、特異性細胞の管腔酸性化においても重要である。
細胞におけるＶ－ＡＴＰアーゼ阻害活性の決定
液胞性ＡＴＰアーゼ（Ｖ－ＡＴＰアーゼ）は、細胞の細胞内ｐＨおよび細胞外ｐＨの制御を担うプロトンポンプである。Ｖ－ＡＴＰアーゼの構造は、全真核細胞の間で高度に保存されており、種間で様々な機能に関与する。Ｖ－ＡＴＰアーゼはエンドソームおよびリソソームの酸性化について最も広く知られており、特異性細胞の管腔酸性化においても重要である。
【0039】
抗ウイルス治療において標的とされ得る宿主因子の中でＶ－ＡＴＰアーゼは、ウイルスの宿主細胞への侵入に介入するための約束された標的である。インフルエンザウイルス、フラビウイルス、ワクシニアウイルス、ボルナウイルス、ラブドウイルスおよびコロナウイルスといったウイルス脅威に対して、Ｖ－ＡＴＰアーゼ仲介エンドソーム酸性化は、汎用性が高く、薬剤耐性変異に対する感受性の低い新たな抗ウイルス療法への道を開くかもしれない。
【0040】
本発明の化合物のＶ－ＡＴＰアーゼ阻害効果を決定するために、ヒトＶ型プロトンＡＴＰアーゼＥＬＩＳＡキット（Ｍｙ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社カタログ番号：ＭＢＳ９１１８６２）を用いてＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【0041】
方法：
１００万個のＭＤＡＭＢ２３１（Ｖ－ＡＴＰアーゼに富んだ細胞株）を６０ｍｍのプレートに播種し、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２中に置いた。細胞を濃度１００ｎＭ（０．１μＭ）／１０，０００細胞の試験化合物（式Ａ～Ｕ）で処理し、４８時間インキュベートした。インキュベーション後に上澄みを廃棄し、細胞をＤ．Ｐ．Ｂ．Ｓ．（ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄し、回収して、－８０℃で４８時間保存した。細胞を融解し、ボルテックスに付し、７分間均一化し、続いて３０００Ｒ．Ｐ．Ｍ．で３分間の遠心分離に付した。上清をＶ－ＡＴＰアーゼアッセイのために回収した。
１００万個のＭＤＡＭＢ２３１（Ｖ－ＡＴＰアーゼに富んだ細胞株）を６０ｍｍのプレートに播種し、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２中に置いた。細胞を濃度１００ｎＭ（０．１μＭ）／１０，０００細胞の試験化合物（式Ａ～Ｕ）で処理し、４８時間インキュベートした。インキュベーション後に上澄みを廃棄し、細胞をＤ．Ｐ．Ｂ．Ｓ．（ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄し、回収して、－８０℃で４８時間保存した。細胞を融解し、ボルテックスに付し、７分間均一化し、続いて３０００Ｒ．Ｐ．Ｍ．で３分間の遠心分離に付した。上清をＶ－ＡＴＰアーゼアッセイのために回収した。
【0042】
用いたアッセイは、図１に示した定量的サンドウイッチ酵素免疫アッセイ技術を使用した。
【0043】
標準およびサンプルをウェルにピペットで加えた。Ｖ－ＡＴＰアーゼ特異的抗体をマイクロプレートにプレコートした。標準／サンプル中に存在するいかなるＶ－ＡＴＰアーゼも固定化抗体と結合するであろう。インキュベーション期間後には、洗浄によっていかなる未結合の物質をも除去し、Ｖ－ＡＴＰアーゼ特異的ビオチン結合抗体をウェルに添加し、プレートを３７°Ｃおよび５％のＣＯ２中で再度インキュベートした。洗浄後、アビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をウェルに添加した。未結合のアビジン－酵素試薬を除去するための洗浄に続き、基質溶液をウェルに添加し、初期工程で結合させたＶ－ＡＴＰアーゼの量に比例する量の発色が生じた。発色を停止し、光学密度を４５０ｎｍで分光光学的に測定した。Ｖ－ＡＴＰアーゼの濃度は、標準試料を用いて得た回帰式に光学密度を代入することで計算した。Ｖ－ＡＴＰアーゼのパーセント（％）減少は、得られたＶ－ＡＴＰアーゼの量を未処理試料から引いた値／未処理試料中のＶ－ＡＴＰアーゼ濃度×１００によって計算した。
【0044】
結果
３１．２５ｐｇ／ｍｌから２０００ｐｇ／ｍｌの範囲内のＶ－ＡＴＰアーゼ濃度の標準曲線を図２に示したようにプロットしたところ、プロットは良好な直線性（Ｒ２＝０．９５４）を示した。
３１．２５ｐｇ／ｍｌから２０００ｐｇ／ｍｌの範囲内のＶ－ＡＴＰアーゼ濃度の標準曲線を図２に示したようにプロットしたところ、プロットは良好な直線性（Ｒ２＝０．９５４）を示した。
【0045】
表２は、本発明の化合物のＶ－ＡＴＰアーゼアッセイの結果を示す。
【0046】
【表2】
【0047】
結論
結果は、式Ａ～Ｕの化合物が細胞内のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の減少をもたらしたことを示した。
結果は、式Ａ～Ｕの化合物が細胞内のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の減少をもたらしたことを示した。
【0048】
実施例２
正常細胞における本発明の化合物の毒性研究
脱線維血の分画遠心によって得られたヒト末梢血リンパ球に対して毒性研究を実施した。その毒性を決定するために、本発明の化合物のＭＴＴアッセイを実施した。ＭＴＴアッセイは単純且つ高感度のアッセイであり、細胞の代謝減少活性を測定する。本アッセイは次のように実施した。
正常細胞における本発明の化合物の毒性研究
脱線維血の分画遠心によって得られたヒト末梢血リンパ球に対して毒性研究を実施した。その毒性を決定するために、本発明の化合物のＭＴＴアッセイを実施した。ＭＴＴアッセイは単純且つ高感度のアッセイであり、細胞の代謝減少活性を測定する。本アッセイは次のように実施した。
【0049】
必要な容量の細胞懸濁液を、細胞播種効率ごとに作製した。２００μｌの作製した細胞懸濁液を標識された９６穴プレートに添加し、プレートを３７°Ｃおよび５％のＣＯ２のインキュベーターに１８～２４時間静置した。その後、２μｌのそれぞれの希釈化合物を添加し、プレートを３７°Ｃおよび５％のＣＯ２のインキュベーターに４８時間静置した。プレートから懸濁液を吸い出し、１００μｌの作業用ＭＴＴ溶液（１×完全培地中の５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ原液から調製した０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ）を添加した。プレートを３７°Ｃおよび５％のＣＯ２のインキュベーターで４時間インキュベートした。プレートを遠心分離に付し、上清を除去し、２００μｌのＤＭＳＯを添加し、穏やかに撹拌し、３７°Ｃおよび５％のＣＯ２のインキュベーターに１０分間静置した。５７０ｎｍの吸光度を読み取り、パーセント生存率および化合物のＩＣ５０値を回帰分析で計算した。
【0050】
表３は、本発明の化合物について実施したＭＴＴアッセイの結果を示す。
【0051】
【表3】
【0052】
結論
上記結果から、１００μＭまでの式Ｂ～Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、Ｐ、Ｕの化合物は、正常ヒトリンパ球に対していかなる毒性も発揮しなかった。これは、正常末梢血リンパ球に対して本発明の化合物がいかなる毒性も発揮しなかったことを意味する。
上記結果から、１００μＭまでの式Ｂ～Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、Ｐ、Ｕの化合物は、正常ヒトリンパ球に対していかなる毒性も発揮しなかった。これは、正常末梢血リンパ球に対して本発明の化合物がいかなる毒性も発揮しなかったことを意味する。
【0053】
他の完全性研究
種々の臨床前ＧＬＰ（優良試験所基準）研究および非ＧＬＰ研究を式Ｅの化合物で実施した。この研究には、ラットおよびイヌに対する７日間および２８日間の研究、ラット、マウスおよびイヌにおける急性毒性が含まれた。呼吸機能、神経系および心血管系、細菌変異、代謝、ＣａＣｏ２透過性、タンパク質結合およびチトクローム効果に対する式Ｅの化合物の効果も研究した。これらの研究は、式Ｅの化合物が非毒性、非変異原性、非染色体異常誘発性であり、且つ呼吸器系、神経系および心血管系に何ら影響しないことを示した。さらに、式Ｅの化合物は、ラット、マウスおよびイヌにおいて、２０００ｍｇ／ｋｇというより高い用量でもいかなる毒性作用または副作用を示さなかった。この結果は、式Ｅの化合物は投与しても安全であることを示す。
種々の臨床前ＧＬＰ（優良試験所基準）研究および非ＧＬＰ研究を式Ｅの化合物で実施した。この研究には、ラットおよびイヌに対する７日間および２８日間の研究、ラット、マウスおよびイヌにおける急性毒性が含まれた。呼吸機能、神経系および心血管系、細菌変異、代謝、ＣａＣｏ２透過性、タンパク質結合およびチトクローム効果に対する式Ｅの化合物の効果も研究した。これらの研究は、式Ｅの化合物が非毒性、非変異原性、非染色体異常誘発性であり、且つ呼吸器系、神経系および心血管系に何ら影響しないことを示した。さらに、式Ｅの化合物は、ラット、マウスおよびイヌにおいて、２０００ｍｇ／ｋｇというより高い用量でもいかなる毒性作用または副作用を示さなかった。この結果は、式Ｅの化合物は投与しても安全であることを示す。
【0054】
実施例３
本発明の化合物のｉｎ－ｖｉｔｒｏ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性
ニュートラルレッド（細胞変性効果／毒性アッセイ）
本発明の化合物のｉｎ－ｖｉｔｒｏ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性
ニュートラルレッド（細胞変性効果／毒性アッセイ）
【0055】
方法：
ウイルス誘導性細胞変性効果の減少（初期ＣＰＥアッセイ）
Ｖｅｒｏ７６細胞のコンフルエントまたはほぼコンフルエントな培養Ｔ細胞単層を、試験の前日に、９６穴の使い捨てマイクロプレート内に作製した。細胞を５％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＭＥＭ（イーグルの最小必須培地）で維持した。抗ウイルスアッセイには同じ培地を使用したが、ＦＢＳを２％に下げ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加した。化合物をＤＭＳＯ、生理食塩水、または希釈液に溶解した。低溶解率の化合物はボルテックス、加熱および超音波処理に付し、これでも溶液にならなかったときは、コロイド状の懸濁液として試験した。試験化合物を４段階のｌｏｇ１０濃度、通常は０．１、１．０、１０および１００μｇ／ｍｌまたはμＭとして調製した。不十分な量の化合物が供給され得たときには、低濃度を使用した。各希釈当たり５つのマイクロウェル、即ち、感染した培養細胞に３つと、未感染毒性培養細胞に２つ用いた。実験の対照は、プレートごとに、感染し未処理（ウイルス対照）の６つのマイクロウェルと、未処理で未感染（細胞対照）の６つのマイクロウェルからなる。試験化合物に用いたのと同じ方法を用いて、陽性対照として公知の活性薬剤を平衡して試験した。各試験の実行時に陽性対照も試験した。
ウイルス誘導性細胞変性効果の減少（初期ＣＰＥアッセイ）
Ｖｅｒｏ７６細胞のコンフルエントまたはほぼコンフルエントな培養Ｔ細胞単層を、試験の前日に、９６穴の使い捨てマイクロプレート内に作製した。細胞を５％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＭＥＭ（イーグルの最小必須培地）で維持した。抗ウイルスアッセイには同じ培地を使用したが、ＦＢＳを２％に下げ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加した。化合物をＤＭＳＯ、生理食塩水、または希釈液に溶解した。低溶解率の化合物はボルテックス、加熱および超音波処理に付し、これでも溶液にならなかったときは、コロイド状の懸濁液として試験した。試験化合物を４段階のｌｏｇ１０濃度、通常は０．１、１．０、１０および１００μｇ／ｍｌまたはμＭとして調製した。不十分な量の化合物が供給され得たときには、低濃度を使用した。各希釈当たり５つのマイクロウェル、即ち、感染した培養細胞に３つと、未感染毒性培養細胞に２つ用いた。実験の対照は、プレートごとに、感染し未処理（ウイルス対照）の６つのマイクロウェルと、未処理で未感染（細胞対照）の６つのマイクロウェルからなる。試験化合物に用いたのと同じ方法を用いて、陽性対照として公知の活性薬剤を平衡して試験した。各試験の実行時に陽性対照も試験した。
【0056】
細胞から培養培地を除去し、２×濃度の試験化合物を０．１ｍｌ容量でウェルに加えた。通常、０．１ｍｌ容量中に上限が６０ＣＣＩＤ５０（５０％培養細胞感染用量）のウイルスをウイルス感染用のウェルに添加した。ウイルス無しの培地を毒性対照ウェルおよび細胞対照ウェルに加えた。ウイルス対照ウェル中に明確なＣＰＥ（ほとんどのウイルス株について＞８０％のＣＰＥ）が観察されるまで、プレートを３７°Ｃおよび５％のＣＯ２中でインキュベートした。その後、プレートを、３７°Ｃおよび５％のＣＯ２のインキュベーター内で、０．０１１％のニュートラルレッドで約２時間染色した。完全な吸引によりニュートラルレッド培地を除去し、細胞を１×のリン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）で濯いで残存染色剤を除去してもよい。ＰＢＳを完全に除去し、組み込まれたニュートラルレッドを５０％のソレンセンのクエン酸緩衝液／５０％のエタノールで少なくとも３０分間溶出した。ニュートラルレッド染色剤は生細胞に浸透するため、赤色が濃いほど、ウェル内に存在する生細胞数が大きい。各ウェルの染色剤含有量は、５４０ｎｍの波長の分光光度計で定量した。各セットのウェルの染色剤含有量を、マイクロソフト・エクセルのコンピューターベースのスプレッドシートによって未処理対照ウェル中に存在する染色剤のパーセンテージに変換し、ウイルス対象に基づき正規化した。５０％有効濃度（ＥＣ５０、ウイルス阻害性）および５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０、細胞阻害性）を回帰分析により計算した。ＣＣ５０をＥＣ５０で割った商が選択指数（ＳＩ）値となる。
【0057】
表３は、ニュートラルレッド（細胞変性効果／毒性アッセイ）の結果を示す。
【0058】
【表4】
【0059】
ニュートラルレッドアッセイにおいて、式Ｅの化合物のＥＣ５０、ＣＣ５０およびＳＩ５０値はそれぞれ０．３５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌおよび７．１であった。これらの値は、化合物、特に式Ｅの化合物がウイルス複製を阻害することを示す。
【0060】
結論
式Ｅの化合物がＥＣ５０として０．３５およびＳＩ５０として７．１を示し、式Ｆの化合物がＥＣ５０として２．９およびＳＩ５０として１１を示すことから、これらは良好な抗ウイルス活性を有すると考えられる。
式Ｅの化合物がＥＣ５０として０．３５およびＳＩ５０として７．１を示し、式Ｆの化合物がＥＣ５０として２．９およびＳＩ５０として１１を示すことから、これらは良好な抗ウイルス活性を有すると考えられる。
【0061】
実施例４
式Ｅの化合物のｉｎ－ｖｉｔｒｏの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性（アッセイ方法： ＩＣ５０の推定）
式Ｅの化合物のｉｎ－ｖｉｔｒｏの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性（アッセイ方法： ＩＣ５０の推定）
【0062】
方法：
アッセイは、９６穴プレートの形式で、サンプル当たり３つのウェルを用いて実施した。１×１０４のＶｅｒｏＥ６細胞を各ウェルに播種し、単層を形成するために３７°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、細胞を７つの濃度の試験物質（ＴＳ）と共にインキュベートした。レミデシビルについては、次の濃度を使用した：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭおよび０．０１μＭ。式Ｅの化合物については、１０μＭの原溶液をＤＭＳＯで段階希釈（２倍希釈）した。各希釈から２マイクロリットルをスクリーニングアッセイに用いた。式Ｅの化合物の７つの濃度は１０μｇ、３μｇ、１μｇ、０．３μｇ、０．１μｇ、０．０３μｇおよび０．０１μｇであった。対照細胞は、０．５％のＤＭＳＯのみとインキュベートした。ＭＯＩを０．０１としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を細胞に感染させた。４８時間後、１００μｌの培養上清からウイルスＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲに（２組ずつ）付して、ＮおよびＥ遺伝子配列のＣｔ値を求めた。ウイルス複製の阻害は、対照と比較した、ＴＳ処理細胞におけるＣｔ値の倍率変化に基づき決定した。ＩＣ５０値は、表４に示すように、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ ＩＣ５０計算器を用いて決定した。
アッセイは、９６穴プレートの形式で、サンプル当たり３つのウェルを用いて実施した。１×１０４のＶｅｒｏＥ６細胞を各ウェルに播種し、単層を形成するために３７°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、細胞を７つの濃度の試験物質（ＴＳ）と共にインキュベートした。レミデシビルについては、次の濃度を使用した：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭおよび０．０１μＭ。式Ｅの化合物については、１０μＭの原溶液をＤＭＳＯで段階希釈（２倍希釈）した。各希釈から２マイクロリットルをスクリーニングアッセイに用いた。式Ｅの化合物の７つの濃度は１０μｇ、３μｇ、１μｇ、０．３μｇ、０．１μｇ、０．０３μｇおよび０．０１μｇであった。対照細胞は、０．５％のＤＭＳＯのみとインキュベートした。ＭＯＩを０．０１としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を細胞に感染させた。４８時間後、１００μｌの培養上清からウイルスＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲに（２組ずつ）付して、ＮおよびＥ遺伝子配列のＣｔ値を求めた。ウイルス複製の阻害は、対照と比較した、ＴＳ処理細胞におけるＣｔ値の倍率変化に基づき決定した。ＩＣ５０値は、表４に示すように、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ ＩＣ５０計算器を用いて決定した。
【0063】
【表5】
【0064】
【0065】
結論
結果は、式Ｅの化合物がｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて優れた抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性（ＩＣ５０＜１０μＭ）を発揮したことを示す。
結果は、式Ｅの化合物がｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて優れた抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性（ＩＣ５０＜１０μＭ）を発揮したことを示す。
【0066】
実施例５
式Ｅの化合物のｉｎ－ｖｉｔｒｏの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性
アッセイ方法： 細胞毒性
式Ｅの化合物のｉｎ－ｖｉｔｒｏの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性
アッセイ方法： 細胞毒性
【0067】
方法
アッセイは、９６穴プレートの形式で、サンプル当たり３つのウェルを用いて実施した。１×１０４のＶｅｒｏＥ６細胞を各ウェルに播種し、単層を形成するために３７°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、細胞を指定濃度の試験物質（ＴＳ）と共にインキュベートし、最終ＤＭＳＯ濃度を０．５％とした。対照細胞は、０．５％のＤＭＳＯのみとインキュベートした。２４時間および４８時間後に、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２およびＳｙｔｏｘ ｏｒａｎｇｅ染色剤で染色した。倍率１０で、ウェル面積の９０％を占める１６枚の画像を各ウェルについてＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ顕微共焦点（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で撮影した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核酸染色剤は、一般的な、細胞の永久核対比染色剤（ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）であり、二本鎖ＤＮＡに結合すると青い蛍光を放出する。全ての生細胞および死細胞を染色する。Ｓｙｔｏｘ ｏｒａｎｇｅ染色剤は、異形膜を有する細胞内の核酸を染色する。この染色剤は細胞死の指標である。初めにソフトウェアがＨｏｅｃｈｓｔ画像中の総細胞数を計数する。Ｓｙｔｏｘ画像においては、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞の中から、いくつの細胞がＳｙｔｏｘ陽性であるかを計数する。
アッセイは、９６穴プレートの形式で、サンプル当たり３つのウェルを用いて実施した。１×１０４のＶｅｒｏＥ６細胞を各ウェルに播種し、単層を形成するために３７°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、細胞を指定濃度の試験物質（ＴＳ）と共にインキュベートし、最終ＤＭＳＯ濃度を０．５％とした。対照細胞は、０．５％のＤＭＳＯのみとインキュベートした。２４時間および４８時間後に、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２およびＳｙｔｏｘ ｏｒａｎｇｅ染色剤で染色した。倍率１０で、ウェル面積の９０％を占める１６枚の画像を各ウェルについてＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ顕微共焦点（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で撮影した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核酸染色剤は、一般的な、細胞の永久核対比染色剤（ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）であり、二本鎖ＤＮＡに結合すると青い蛍光を放出する。全ての生細胞および死細胞を染色する。Ｓｙｔｏｘ ｏｒａｎｇｅ染色剤は、異形膜を有する細胞内の核酸を染色する。この染色剤は細胞死の指標である。初めにソフトウェアがＨｏｅｃｈｓｔ画像中の総細胞数を計数する。Ｓｙｔｏｘ画像においては、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞の中から、いくつの細胞がＳｙｔｏｘ陽性であるかを計数する。
【0068】
抗ウイルススクリーニング
方法：
アッセイは、９６穴プレートの形式で、サンプル当たり３つのウェルを用いて実施した。１×１０４のＶｅｒｏＥ６細胞を各ウェルに播種し、単層を形成するために３７°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、細胞を指定濃度の試験物質（ＴＳ）と共にインキュベートし、最終ＤＭＳＯ濃度を０．５％とした。対照細胞は、０．５％のＤＭＳＯのみとインキュベートした。ＭＯＩを０．０１としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を細胞に感染させた。２４時間および４８時間後、１００μｌの培養上清からウイルスＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲに（２組ずつ）付して、ＮおよびＥ遺伝子配列のＣｔ値を求めた。ウイルス複製の阻害は、対照と比較した、ＴＳ処理細胞におけるＣｔ値の倍率変化に基づき決定した。レミデシビルをウイルス阻害の陽性対照として使用した。
方法：
アッセイは、９６穴プレートの形式で、サンプル当たり３つのウェルを用いて実施した。１×１０４のＶｅｒｏＥ６細胞を各ウェルに播種し、単層を形成するために３７°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、細胞を指定濃度の試験物質（ＴＳ）と共にインキュベートし、最終ＤＭＳＯ濃度を０．５％とした。対照細胞は、０．５％のＤＭＳＯのみとインキュベートした。ＭＯＩを０．０１としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を細胞に感染させた。２４時間および４８時間後、１００μｌの培養上清からウイルスＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲに（２組ずつ）付して、ＮおよびＥ遺伝子配列のＣｔ値を求めた。ウイルス複製の阻害は、対照と比較した、ＴＳ処理細胞におけるＣｔ値の倍率変化に基づき決定した。レミデシビルをウイルス阻害の陽性対照として使用した。
【0069】
結果
表５は、式Ｅの化合物の細胞毒性および抗ウイルス活性の結果を示す。
表５は、式Ｅの化合物の細胞毒性および抗ウイルス活性の結果を示す。
【0070】
【表6】
【0071】
上記結果から、式Ｅの化合物はレミデシビルと比べて、２４時間後にわずかではあるが高い細胞生存率を示すことがわかる。ウイルス感染から２４時間後および４８時間後の式Ｅの化合物によるウイルス複製阻害のパーセントは、レミデシビルと同等であった。
【0072】
結論
レミデシビルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して効果的であることから、式Ｅの化合物もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの阻害に効果的であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染の治療に効果的に使用することができる。
レミデシビルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して効果的であることから、式Ｅの化合物もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの阻害に効果的であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染の治療に効果的に使用することができる。
【0073】
実施例６
式Ｅの化合物の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性のＩｎ－Ｖｉｖｏ研究
Ｉｎ－ｖｉｖｏ研究を、下記の方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたゴールデンハムスターで実施した。
式Ｅの化合物の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性のＩｎ－Ｖｉｖｏ研究
Ｉｎ－ｖｉｖｏ研究を、下記の方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたゴールデンハムスターで実施した。
【0074】
方法論
動物：６～８週齢の雄のゴールデンハムスターをＣＤＲＩ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より入手し、ＴＨＳＴＩ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の小動物飼育施設（ＳＡＦ）に移動し、曝露研究の前に７日間検疫を行った。前処理レジメンの際に、動物を小動物飼育施設（ＳＡＦ）で飼育し、その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露研究のために動物バイオセーフティレベル－３（ＡＢＳＬ－３）の研究施設に移した。動物を明暗サイクル下、標準ペレット飼料を与え、自由に水が飲める環境で１２時間未満維持した。免疫接種、ブースター用量および動物曝露を含む全ての実験プロトコルが研究所の倫理委員会ＩＡＥＣ（ＩＡＥＣ／ＴＨＳＴＩ／１１８）、ＩＢＳおよびＲＣＧＭの承認を得ていた。ウイルス培養および力価測定： ４．５ｇ／ＬのＤ－グルコース、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン－ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２％のＦＢＳを含むダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の完全培地で培養したＶｅｒｏＥ６細胞系でＳＡＲＳ関連コロナウイルス２、単離ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ウイルスを増殖させ、力価を測定した。ＡＢＳＬ３内のＴＨＳＴＩ ＩＤＲＦ施設において、研究所のバイオセーフティ基準に従い、ウイルスのストックをプラーク化により精製した。
動物：６～８週齢の雄のゴールデンハムスターをＣＤＲＩ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より入手し、ＴＨＳＴＩ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の小動物飼育施設（ＳＡＦ）に移動し、曝露研究の前に７日間検疫を行った。前処理レジメンの際に、動物を小動物飼育施設（ＳＡＦ）で飼育し、その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露研究のために動物バイオセーフティレベル－３（ＡＢＳＬ－３）の研究施設に移した。動物を明暗サイクル下、標準ペレット飼料を与え、自由に水が飲める環境で１２時間未満維持した。免疫接種、ブースター用量および動物曝露を含む全ての実験プロトコルが研究所の倫理委員会ＩＡＥＣ（ＩＡＥＣ／ＴＨＳＴＩ／１１８）、ＩＢＳおよびＲＣＧＭの承認を得ていた。ウイルス培養および力価測定： ４．５ｇ／ＬのＤ－グルコース、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン－ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２％のＦＢＳを含むダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の完全培地で培養したＶｅｒｏＥ６細胞系でＳＡＲＳ関連コロナウイルス２、単離ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ウイルスを増殖させ、力価を測定した。ＡＢＳＬ３内のＴＨＳＴＩ ＩＤＲＦ施設において、研究所のバイオセーフティ基準に従い、ウイルスのストックをプラーク化により精製した。
【0075】
ウイルス培養および力価測定
４．５ｇ／ＬのＤ－グルコース、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン－ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２％のＦＢＳを含むダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）完全培地で培養したＶｅｒｏＥ６細胞系でＳＡＲＳ関連コロナウイルス２、単離ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ウイルスを増殖させ、力価を測定した。ＡＢＳＬ３内のＴＨＳＴＩ ＩＤＲＦ施設において、研究所のバイオセーフティ基準に従い、ウイルスのストックをプラーク化により精製した。
４．５ｇ／ＬのＤ－グルコース、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン－ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２％のＦＢＳを含むダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）完全培地で培養したＶｅｒｏＥ６細胞系でＳＡＲＳ関連コロナウイルス２、単離ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ウイルスを増殖させ、力価を測定した。ＡＢＳＬ３内のＴＨＳＴＩ ＩＤＲＦ施設において、研究所のバイオセーフティ基準に従い、ウイルスのストックをプラーク化により精製した。
【0076】
ゴールデンハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染および投薬
３３匹の雄のゴールデンハムスターを乱数的に異なるグループ（ｎ＝５）に分け、１）曝露対照（ｎ＝５）、２）レミデシビル対照（ｎ＝５）および未曝露対照（ｎ＝３）を個別のケージで飼育した。前処理群（δＩＩＩ／ｐ４００）は、４００ｍｐｋの式Ｅの化合物（薬剤）の投与を経口経管栄養（ｏｒａｌｇａｖａｇｉｎｇ）によって曝露２日目から開始した。残りの３群であるδＩ／２００、δＩＩ／８００、δＩＶ／４００は、それぞれ２００、８００および４００ｍｐｋの式Ｅの化合物をそれぞれ曝露後に経口経管栄養によって毎日、終点まで投与された。未曝露対照以外のすべての動物を、ＡＢＳＬ３施設内で、ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射による麻酔下で、カテーテルを介した各鼻腔に５０μｌの経鼻投与によって１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に暴露した（Chan et al., 2020、Rizvi et. al., 2021、Sia et al., 2020）。未曝露対照群はモックＰＢＳの経鼻投与を受けた。ウイルス培養および動物感染の取り扱いを伴う全ての実験プロトコルが、ＲＣＧＭ、施設バイオセーフティおよびＩＡＥＣ動物倫理委員会（ＲＣＧＭ，ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ＩＡＥＣ ａｎｉｍａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けていた。
３３匹の雄のゴールデンハムスターを乱数的に異なるグループ（ｎ＝５）に分け、１）曝露対照（ｎ＝５）、２）レミデシビル対照（ｎ＝５）および未曝露対照（ｎ＝３）を個別のケージで飼育した。前処理群（δＩＩＩ／ｐ４００）は、４００ｍｐｋの式Ｅの化合物（薬剤）の投与を経口経管栄養（ｏｒａｌｇａｖａｇｉｎｇ）によって曝露２日目から開始した。残りの３群であるδＩ／２００、δＩＩ／８００、δＩＶ／４００は、それぞれ２００、８００および４００ｍｐｋの式Ｅの化合物をそれぞれ曝露後に経口経管栄養によって毎日、終点まで投与された。未曝露対照以外のすべての動物を、ＡＢＳＬ３施設内で、ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射による麻酔下で、カテーテルを介した各鼻腔に５０μｌの経鼻投与によって１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に暴露した（Chan et al., 2020、Rizvi et. al., 2021、Sia et al., 2020）。未曝露対照群はモックＰＢＳの経鼻投与を受けた。ウイルス培養および動物感染の取り扱いを伴う全ての実験プロトコルが、ＲＣＧＭ、施設バイオセーフティおよびＩＡＥＣ動物倫理委員会（ＲＣＧＭ，ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ＩＡＥＣ ａｎｉｍａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けていた。
【0077】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の大規模臨床パラメーター
ＡＢＳＬ３において、感染から４日後に、全ての感染動物を安楽死させた。体重の変化、動物の活動を曝露後毎日観察した。安楽死後に、動物の肺および脾臓を切除し、総形態学的変化を見るために画像化した。右肺の下葉を１０％の中性ホルマリン溶液で固定し、組織学的分析に用いた。ウイルス負荷量の概算のために、肺の完全な左肺葉を２ｍｌのトリゾール溶液中で均質化した。脾臓は２ｍｌのトリゾール溶液中で均質化した。トリゾール中の組織サンプルは、さらに使用するまで、直ちに－８０℃で保存した。動物の血液を心臓に直接穿刺することで引き出し、血清を単離し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。
ＡＢＳＬ３において、感染から４日後に、全ての感染動物を安楽死させた。体重の変化、動物の活動を曝露後毎日観察した。安楽死後に、動物の肺および脾臓を切除し、総形態学的変化を見るために画像化した。右肺の下葉を１０％の中性ホルマリン溶液で固定し、組織学的分析に用いた。ウイルス負荷量の概算のために、肺の完全な左肺葉を２ｍｌのトリゾール溶液中で均質化した。脾臓は２ｍｌのトリゾール溶液中で均質化した。トリゾール中の組織サンプルは、さらに使用するまで、直ちに－８０℃で保存した。動物の血液を心臓に直接穿刺することで引き出し、血清を単離し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。
【0078】
結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの大規模臨床パラメーターに対する式Ｅの化合物の経口投与の効果
ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露に対する（投与計画に従う）式Ｅの化合物の防御効率を理解するために、異なる量の式Ｅの化合物を投与された感染群、即ち、δＩ／２００、δＩＩ／８００、δＩＩＩ／ｐ４００、δＩＶ／４００、について、ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連する大規模臨床パラメーターを、実験対照である未感染（ＵＩ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（Ｉ）、ＳＣのレミデシビルを投与されたハムスター（Ｒ）と比較して評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの大規模臨床パラメーターに対する式Ｅの化合物の経口投与の効果
ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露に対する（投与計画に従う）式Ｅの化合物の防御効率を理解するために、異なる量の式Ｅの化合物を投与された感染群、即ち、δＩ／２００、δＩＩ／８００、δＩＩＩ／ｐ４００、δＩＶ／４００、について、ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連する大規模臨床パラメーターを、実験対照である未感染（ＵＩ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（Ｉ）、ＳＣのレミデシビルを投与されたハムスター（Ｒ）と比較して評価した。
【0079】
図５Ａに示したように、結果は、δＩＩＩ／ｐ４００を投与されたゴールデンハムスターが体重減少に対して最も高い防御を示し、感染後に痩せることはなかった。さらに、δＩ／２００群は、体重減少について２番目に望ましい結果を示したものの、残りの２群は、感染対象と比べて最小の防御を示し、感染後に緩やかな体重減少を示した。
【0080】
上記と同様に、曝露４日後に安楽死させた動物から単離した肺は、δＩＩＩ／ｐ４００群で間質性肺炎および炎症の領域が有意に少なく、δＩＩ／８００群がそれに続き、これら２つの群において感染群と比べてＳＡＲＳ－ＣｏＶ２関連肺損傷が少ない可能性が示された（図５Ｂ）。ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２関連病理の別の臨床パラメーターである脾腫も、感染対照群と比べて有意な縮小をδＩＩＩ／ｐ４００群で示したが、他の薬剤群では、脾臓サイズの減少は無いまたは少量であった（図５Ｃ）。
【0081】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターに対する式Ｅの化合物の抗ウイルス性能および免疫調節性能
相対ウイルス負荷に対する式Ｅの化合物の抗ウイルス効率を理解するために、ハムスターから切り出した肺のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＮ２遺伝子の定量を実施した。
相対ウイルス負荷に対する式Ｅの化合物の抗ウイルス効率を理解するために、ハムスターから切り出した肺のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＮ２遺伝子の定量を実施した。
【0082】
図６Ａの結果は、δＩ／２００群、δＩＩ／８００群およびδＩＩＩ／ｐ４００群における、相対肺ウイルス負荷量の有意な減少を示した。最も大きなウイルス負荷量の減少が、感染対照群と比べてウイルス負荷量に５倍の減少を示したδＩＩＩ／ｐ４００で見られたが、一方、δＩ／２００およびδＩＩ／８００等の他の群は、ウイルス負荷量の約２～２．５倍の減少を示した。興味深いことに、δＩＶ／４００群ではウイルス負荷量の減少はなく、この群では肺ウイルス負荷に不均質性も認められた。
【0083】
式Ｅの化合物による免疫調節能について理解するために、種々の群の脾臓細胞サンプルにおけるＨＧＰＲＴ内因性対照に対するＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ１７Ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイリングを実施した。データは、全群にわたるＩＬ４の劇的な阻害と、δＩ／２００およびδＩＩＩ／ｐ４００におけるＩＬ１７Ａ発現阻害とを示した（図６Ｂ）。興味深いことに、δＩ／２００は全群間で最も高いＩＮＦγの誘導を示した。
【0084】
式Ｅの化合物で処置したハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染関連肺疾患の組織学的研究
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の際の肺疾患に対する式Ｅの化合物の投与の効果を理解するために、感染後４日目に単離された肺サンプルの詳細な組織学的分析を実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の際の肺疾患に対する式Ｅの化合物の投与の効果を理解するために、感染後４日目に単離された肺サンプルの詳細な組織学的分析を実施した。
【0085】
肺疾患の組織学的評価は式Ｅの化合物を投与したハムスターのＨ＆Ｅ染色で実施し、対照群と比較した。図７は、Ｈ＆Ｅ染色した肺の４０倍の組織学的画像であり、間質性肺炎（青い矢印）、炎症（黒い矢印）、肺損傷（赤い矢印）、肺胞上皮細胞（緑の矢印）の領域、ならびにそれぞれに対応する病理スコア、および肺サンプルの総合的疾患スコアを示す。
【0086】
全ての薬剤処理群のＨ＆Ｅ染色肺サンプルが、間質性肺炎、肺胞上皮損傷および肺炎症スコアの良好な減少を示した。δＩＩＩ／ｐ４００群が研究した組織学的パラメーターおよび総合的疾患スコアについて最も高い防御を示した。興味深いことに、感染対象と比べて、δＩＶ／４００薬剤群に見られたのは、僅かな保護または保護無しであった。
【0087】
結論
ゴールデンハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露研究は、試験した４種の投与計画の内、４００ｍｐｋの式Ｅの化合物による前処理がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して最も高い総合防御効率を示し、レミデシビルと比べて、肺ウイルス負荷量および間質性肺炎の減少をもたらした。さらに肺病理の減少および病原性ＩＬ４およびＩＬ１７Ａ免疫応答の抑制を発揮した。
ゴールデンハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露研究は、試験した４種の投与計画の内、４００ｍｐｋの式Ｅの化合物による前処理がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して最も高い総合防御効率を示し、レミデシビルと比べて、肺ウイルス負荷量および間質性肺炎の減少をもたらした。さらに肺病理の減少および病原性ＩＬ４およびＩＬ１７Ａ免疫応答の抑制を発揮した。
【0088】
上記試験は、式Ｉの化合物が細胞内のＶ－ＡＴＰアーゼの減少に効果的であることから、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスの阻害によってウイルス感染の治療を支援したことを示す。式Ｉの化合物、特に式Ｅの化合物は、毒性を生じることなくウイルス感染を治療する抗ウイルス薬として非常に効果的であった。
【0089】
本発明の上記説明は、本発明を説明することを目的とし、限定することを意図しない。開示された実施期待に本発明の精神および実態を導入した変更を当業者は想到し得るため、本発明は、本願開示の範囲内の全てを含むと理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための、式Ｉの化合物を活性成分として含む医薬。【化1】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ１１およびＲ１２ は、置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化2】
【化3】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【請求項2】
前記化合物が下記式ＩＩで表される、請求項１に記載の医薬。【化4】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ１およびＲ２は－Ｈおよび－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ１およびＲ２は結合して、置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒは置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化5】
【化6】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【請求項3】
前記化合物が式ＩＩＩで表される、請求項１に記載の医薬。【化7】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ７およびＲ８は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ７およびＲ８は結合して、１以上のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化8】
【化9】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ２基との結合を表す。）
【請求項4】
前記化合物が下記式で表される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬。【化10】
【化11】
【化12】
【請求項5】
細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害のための、式Ｅの化合物を含む医薬。【化13】
【請求項6】
前記化合物がプロドラッグ、代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物またはその多形体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項7】
細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性の阻害によってウイルスを阻害するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害のための、請求項７に記載の医薬。
【請求項9】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害のための、式Ｉの化合物を活性成分として含む医薬。【化14】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ １ およびＲ ２ は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ １ およびＲ ２ は結合して、置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ およびＲ ６ はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ ７ およびＲ ８ は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ ７ およびＲ ８ は結合して、１以上のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ １１ およびＲ １２ はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ １１ およびＲ １２ は、置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化15】
【化16】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ ２ 基との結合を表す。）
【請求項10】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスの阻害のための、式Ｅの化合物を活性成分として含む医薬。【化17】
【請求項11】
ウイルス感染の治療のために細胞のＶ－ＡＴＰアーゼ活性を阻害する医薬の製造のための、式Ｉの化合物の使用。【化18】
ＥはＣおよびＮから選ばれ、
ＱはＯまたは－ＮＨであり、
ｎは０～６であり、
Ｒ １ およびＲ ２ は、－Ｈ、および－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルから選ばれる、あるいはＲ １ およびＲ ２ は結合して、置換または未置換の５員環または６員環を形成し、
Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ およびＲ ６ はそれぞれ独立に－Ｈ、－ＯＨ、およびアルコキシから選ばれ、
Ｒ ７ およびＲ ８ は－Ｈ、－ＯＨ、アルコキシ、－Ｘから選ばれ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒであり得る、あるいはＲ ７ およびＲ ８ は結合して、１以上のヘテロ原子を含む５員環を形成し、
ａおよびｂは、対応する位置の二重結合の有無を示し、
Ｒ １１ およびＲ １２ はそれぞれ独立に－Ｈから選ばれる、あるいはＲ １１ およびＲ １２ は、置換または未置換の５員環または６員環、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルであり得、
Ｒは、置換または未置換の下記フェニル環から選ばれる。
【化19】
【化20】
＊は、Ｑまたは－ＣＨ ２ 基との結合を表す。）
【国際調査報告】