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特表2023-525139内因性受容体の検出のためのプローブとして有用な蛍光発生性ダイマー化合物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-14
(54)【発明の名称】内因性受容体の検出のためのプローブとして有用な蛍光発生性ダイマー化合物
(51)【国際特許分類】
C09B 23/08 20060101AFI20230607BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230607BHJP
C09K 11/06 20060101ALI20230607BHJP
C07K 7/64 20060101ALN20230607BHJP
【ＦＩ】
C09B23/08 CSP
A61K49/00
C09K11/06
C07K7/64 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568894
(86)(22)【出願日】2021-05-12
(85)【翻訳文提出日】2023-01-10
(86)【国際出願番号】 EP2021062626
(87)【国際公開番号】W WO2021228939
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】20305479.6
(32)【優先日】2020-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509228260
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
(71)【出願人】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ジュリー・カルペンコ
(72)【発明者】
【氏名】アンドレイ・クリムチェンコ
(72)【発明者】
【氏名】ドミニク・ボネ
(72)【発明者】
【氏名】マイユール・コロ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085HH11
4C085KA27
4C085KB82
4C085LL20
4H045AA10
4H045BA14
4H045BA51
4H045EA20
4H045FA33
(57)【要約】
本開示は、内因性受容体、特にGタンパク質共役受容体の検出のためのプローブとして有用な新規蛍光発生性ダイマー化合物に関する。本発明は、そのような化合物を含む組成物及びキット並びに生体分子を本発明の化合物と接触させる工程を含む生体分子を標識する方法を提供する。化合物は、以下の式(1):D-L-D(1)により表される、2つのシアニン部分(D)を有する蛍光発生性ダイマーであり、(D)は以下の式(I)又は(I')により表され;(式(I)又は(I'))、式中(A)は以下の式を有する:式(A)、(B)は以下の式を有する:式(B)、破線は存在するか、又は存在せず、存在する場合、それらは単結合又は二重炭素結合を表す。Lは、3つの先端を呈し、2から40、好ましくは2から30個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の炭化水素基であり、前記リンカーLの2つの先端は、式(I)又は(I')の両シアニン部分に、両R1を経て共有結合しており、第3の先端は、飽和又は不飽和炭化水素基の残りであり、反応性基を含むか、又はリガンドに結合している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(D)が以下の式(I)又は(I')により表される以下の式(1):D-L-D(1)により表される、2つのシアニン部分(D)を有する蛍光発生性ダイマーである化合物;【化1】
(A)は以下の式を有し:
【化2】
【化3】
R2は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される官能基により置換されている(C2～C10)アルキル基;式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコールを含むか、又はそれからなり(nは1から40の整数であり、R'は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される少なくとも1つの官能基を任意に含むC1～C12のアルキル基である);
R3は、
- 水素原子、
- ハロゲン原子、好ましくはフッ素、
- (C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、(C1～C5)アルキル-NR''R'''(R''及びR'''は、独立に、H又は(C1～C5)アルキルである)、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、及び(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択される基(前記基は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、アリール(C1～C5)アルキル、-CONR11R12、若しくは-R13COOHから選択される1若しくは2つの置換基により置換されており、
R11及びR12は、独立に、水素、(C1～C20)アルキル、場合により1つ若しくは複数のハロゲン原子、好ましくはF、若しくはヒドロキシ基により置換されているジ(C1～C5)アルキルアミノ(C1～C5)アルキル、式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコール(nは1から40の整数であり、R'はC1～C12のアルキル基である)であるか、或いは代わりに、R11及びR12は、それらが結合している窒素と共に、場合により(C1～C4)アルキルにより置換されている複素環(ピペラジン等)を表し、
R13は、(C1～C10)アルキルであり、
1つの置換基は、本明細書に定義される1つ若しくは2つの置換基により任意に置換されていてもよい)、又は
- 式-E-R10の基(Eは、-O-、-S-、-NR''-(R''は、H又は(C1～C4)アルキルである)、及び-CH2-から選択され; R10は、(C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、(C1～C5)アルキル-NR''R'''(R''及びR'''は、独立に、H又は(C1～C5)アルキルである)、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択され、R10は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、アリール(C1～C5)アルキル、-CONR11R12、若しくは-R13COOHから選択される1から3つの置換基により置換されており;
R11及びR12は、独立に、水素、(C1～C20)アルキル、場合により1つ若しくは複数のハロゲン原子若しくはヒドロキシ基により置換されているジ(C1～C5)アルキルアミノ(C1～C5)アルキルであるか、或いは代わりに、R11及びR12は、それらが結合している窒素と共に、場合により(C1～C4)アルキルにより置換されている複素環(ピペラジン等)を表し、
R13は(C1～C10)アルキルであり、
1つの置換基は、本明細書に定義される1つ若しくは2つの置換基により任意に置換されていてもよい)
を表し、
R4は、存在する場合、
- 水素原子、
- (C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、若しくは(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択される基(前記基は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、若しくは-R13COOHから選択される1つ若しくは2つの置換基により置換されており、R13は(C1～C20)アルキルである)、又は
- 式-E-R10の基(Eは、-O-、-S-、-NH-、-CH2-から選択され; R10は、(C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択され、R10は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、若しくは-R13COOHから選択される1から3つの置換基により置換されており、R13は(C1～C10)アルキルである)
を表し;
R1は、式(1)中のLの先端に結合している飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、
Lは、3つの先端を呈し、2から40個、好ましくは2から30個の炭素原子を含む飽和又は不飽和炭化水素基であり、ここで、前記リンカーLの2つの先端は、式(I)又は(I')の両シアニン部分に、両R1を経て共有結合しており、第3の先端は飽和又は不飽和炭化水素基の残りであり、反応性基を含むか、又はリガンドに結合しており;
炭化水素鎖又は基(すなわち、独立にR1又はL)は、1つ若しくはいくつかのヘテロ原子により、1つ若しくはいくつかの結合基により、又は1つ若しくはいくつかの炭素環若しくは複素環により任意に分断され、炭化水素鎖(独立にR1又はL)は、C1～C3アルキル基、ハロゲン、好ましくはF、-OH、-OMe、及び-CF3から選択される1つ又はいくつかの基により更に置換されていてもよく;
反応性基は少なくとも1つのヘテロ原子を含み、別の反応性基への共有結合を形成して、それにより結合基を形成することが可能であり;且つ
Xは負電荷を有するアニオンである)。
【請求項2】
R1が、3から6個の炭素原子の飽和炭化水素鎖、好ましくは3から6個の炭素原子のアルキル基である、請求項1に記載の化合物。
【請求項3】
リンカーLが、1つ又は複数のエチレンオキシ基(すなわち; oが、1から5、好ましくは1又は2である(CH2CH2O)o)、エチレン基(すなわちrが、1から5、好ましくは1又は2である(CH2CH2)r)により分断され、好ましくは、-O-、-NH-、-C(=O)-、-C(=O)NH-、-OC(=O)-、-(C=O)O-、-NHC(=O)-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)NH-、-NHC(=O)O-、及び-OC(=O)NH-からなる群から選択される1つ又は複数の結合基により分断されている炭化水素基である、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項4】
(D)が、以下の式(I)又は(I')により表され:【化4】
【請求項5】
(D)が、以下の式(I)により表され:【化5】
【請求項6】
式(A)が下記の通りである:【化6】
【請求項7】
式(B)が下記の通りである:【化7】
【請求項8】
アジド基又は歪みアルキンスキャホールドを、反応性基としてL先端中に有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項9】
炭化水素基Lが、飽和又は不飽和炭化水素基の残りであり、リガンドに連結している、好ましくはリガンドに共有結合しているその第3の先端を有し、より好ましくは前記リガンドが分子標的の合成ケミカルリガンド又は基質である、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項10】
リガンドがGタンパク質共役受容体(GPCR)のリガンドであり、より具体的には、リガンドがカルベトシンである、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項11】
下記から選択される式を有し:【化8A】
【化8B】
【化8C】
【化9】
TFA-が、負電荷を有する任意の他のアニオンにより置換されていてもよい、請求項1から10のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項12】
請求項1から11のいずれか一項に記載の式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物;及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項13】
前記化合物が、請求項11に記載される式(2)又は(3)のものである、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項14】
分子標的を標識する方法であって、分子標的を、請求項1から11のいずれか一項に記載の式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物と接触させる工程を含む方法。
【請求項15】
式(1)の化合物が、請求項9又は10に記載のリガンドを含む、標識の方法。
【請求項16】
容器及び請求項1から11のいずれか一項に記載の少なくとも1種の式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、内因性受容体、特にGタンパク質共役受容体の検出のためのプローブとして有用な新規蛍光発生性ダイマー化合物に関する。本発明は、そのような化合物を含む組成物及びキット並びに生体分子を本発明の化合物と接触させる工程を含む生体分子を標識する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
蛍光プローブは、生細胞中のGタンパク質共役受容体(GPCR)を研究する際に使用できるが、動物全体の受容体画像化へのそれらの応用はまだ始まったばかりである。
【0003】
Gタンパク質共役受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜貫通型受容体の最大のファミリーである。GPCRは、健康及び疾患における事実上全ての側面のヒト生理機能に関与している。GPCRが、市場に出ている現在の薬の30%超の分子標的であることは驚くべきことではない。GPCRファミリーの各メンバーは、その生理学的及び生理病理学的役割を果たすために決定的である独特な組織依存性発現及び局在化パターンを有する。そのため、GPCR発現のレベルを疾患に相関づけるために、それらの空間的分布を、細胞レベルで、また生命体レベルでも評価することが重要である。
【0004】
生物全体の分子画像化技法に関して、蛍光系造影剤は非電離放射線を放ち、放射性同位元素系プローブと比べて、より長い貯蔵寿命を有する。更に、有機色素の蛍光特性は、化学修飾により幅広く調節できる。生きたマウス中の遺伝子導入GPCRの画像化に着目した報告はわずかであった。例えば、Maらは、遠赤色素-リガンドコンジュゲートを使用して異種移植片モデル中のα1-AR受容体を画像化した(Z. Ma、Y. Lin、Y. Cheng、W. Wu、R. Cai、S. Chen、B. Shi、B. Han、X. Shi、Y. Zhouら、J. Med. Chem. 2016、59、2151～2162頁)。ごく最近、Alcobiaらは、BRETによる受容体-リガンド結合の検出を可能にする生物発光レポーターNanoLucに融合したβ2-アドレナリン受容体を使用した(D. C. Alcobia、A. I. Ziegler、A. Kondrashov、E. Comeo、S. Mistry、B. Kellam、A. Chang、J. Woolard、S. J. Hill、E. K. Sloan、iScience 2018、6、280～288頁)。しかし、主に、多くの内因性GPCRの低い発現レベル及び適切な蛍光プローブの欠如のために、マウスにおいて内因性GPCRの蛍光画像化の例は報告されていない。
【0005】
理想的には、内因性GPCRのインビボ画像化のための蛍光プローブは以下の要件を満たさなければならない: 1)その標的への高い親和性及び選択性; 2)組織中の光散乱を最小限にし、組織浸透を増大させるための近赤外(NIR)領域における吸収及び発光; 3)高いシグナル対ノイズ比を確実にする、標的受容体に結合した後にその蛍光を「発現」する蛍光発生特性。蛍光発生色素は、種々の分析物のノイズのない検出及び画像化に首尾よく使用されてきており、生細胞中のリガンド-GPCR結合の検出のために開発されてきた(I. A. Karpenko、R. Kreder、C. Valencia、P. Villa、C. Mendre、B. Mouillac、Y. Mely、M. Hibert、D. Bonnet、A. S. Klymchenko、ChemBioChem 2014、15、359～363頁; I. A. Karpenko、A. S. Klymchenko、S. Gioria、R. Kreder、I. Shulov、P. Villa、Y. Mely、M. Hibert、D. Bonnet、Chem. Commun. 2015、51、2960～2963頁)。最近、高いシグナル対ノイズ比で非洗浄(no-wash)条件における生細胞中のGPCRの可視化を可能にする、環境感受性フォールディング(environment-sensitive folding)を有する蛍光発生性スクアラインダイマーのコンセプトが報告された(I. A. Karpenko、M. Collot、L. Richert、C. Valencia、P. Villa、Y. Mely、M. Hibert、D. Bonnet、A. S. Klymchenko、J. Am. Chem. Soc. 2015、137、405～412頁)。水性媒体中で、H-凝集体タイプのダイマーの形成は、プローブの完全な蛍光消光をもたらした。対照的に、受容体に結合すると、フルオロフォアは生体膜の疎水性環境に曝され、それによりダイマーが解離し、蛍光が回復した。スクアラインダイマーは生細胞中の受容体標識の強力なツールであるが、それは、インビボ画像化のために最適ではない遠赤領域における吸収及び発光を示す。
【0006】
内因性GPCRであるオキシトシン受容体OTRは、社会認識、愛着、共感、信頼等の複雑な社会的行動の調節に関与していると知られており、自閉症スペクトラム障害の治療のための潜在的な治療標的として提案されている。マウスにおいて、OTRは、妊娠中に子宮内に、並びに妊娠後期及び授乳中に乳腺内に高度に発現されている。しかし、この受容体及びGPCRの直接インビボ光学画像化は、一般的に、今までのところ困難な問題のままである。
【0007】
本明細書において、環境感受性フォールディングを有する最初の近赤外(NIR)発光蛍光発生性ダイマーの設計及び合成が開示される。シアニン色素を含むそのようなNIRプローブは、生きたマウス中でオキシトシン受容体(OTR)等の内因性GPCRのノイズのない検出を初めて可能にする前例のない輝度を示した。シアニンπシステムの平面性は、水溶液中での凝集をもたらし、この現象は、しばしば、そのような色素を使用する欠点として考えられる。本明細書において、水性媒体中の非蛍光性H-凝集体の形成のために、近赤外蛍光発生性ダイマーは、無極性環境中で強い蛍光発現(turn-on)反応(140倍まで)並びに並外れた輝度: 56%量子収量及び≒444000M-1cm-1吸光係数を示す。オキシトシン受容体のリガンドにグラフトされると、それは、生きているマウス中で天然に発現される受容体の、ノイズがなく標的特異的な、前例のない画像化を可能にする。
【0008】
OTRのNIR蛍光発生性ダイマープローブの設計における主要な要素は、フルオロフォアの選択である。NIRウィンドウ(700～950nm)における操作に加え、フルオロフォアは、明るく、光安定性であり、充分に水溶性でなくてはならない。このために、色素の親油性が補正されるのを可能にし、非特異的相互作用の回避を可能にする、ポリエチレングリコール鎖により修飾されたシアニン誘導体ダイマーである独自の化合物が本明細書に提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Z. Ma、Y. Lin、Y. Cheng、W. Wu、R. Cai、S. Chen、B. Shi、B. Han、X. Shi、Y. Zhouら、J. Med. Chem. 2016、59、2151～2162頁
【非特許文献2】D. C. Alcobia、A. I. Ziegler、A. Kondrashov、E. Comeo、S. Mistry、B. Kellam、A. Chang、J. Woolard、S. J. Hill、E. K. Sloan、iScience 2018、6、280～288頁
【非特許文献3】I. A. Karpenko、R. Kreder、C. Valencia、P. Villa、C. Mendre、B. Mouillac、Y. Mely、M. Hibert、D. Bonnet、A. S. Klymchenko、ChemBioChem 2014、15、359～363頁
【非特許文献4】I. A. Karpenko、A. S. Klymchenko、S. Gioria、R. Kreder、I. Shulov、P. Villa、Y. Mely、M. Hibert、D. Bonnet、Chem. Commun. 2015、51、2960～2963頁
【非特許文献5】I. A. Karpenko、M. Collot、L. Richert、C. Valencia、P. Villa、Y. Mely、M. Hibert、D. Bonnet、A. S. Klymchenko、J. Am. Chem. Soc. 2015、137、405～412頁
【非特許文献6】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第22版; Allenら編、The Pharmaceutical Press、2012
【非特許文献7】Handbook of Pharmaceutical Excipients、第7版; Roweら編、The Pharmaceutical Press、2012
【非特許文献8】Handbook of Pharmaceutical Additives、第3版; Ash及びAsh編; Gower Publishing Company: 2007
【非特許文献9】Pharmaceutical Preformulation and Formulation、第2版; Gibson編; CRC Press LLC: Boca Raton、Fla.、2009
【非特許文献10】J. Org. Chem. 2007、72、23A～24A頁
【非特許文献11】IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (Biochem. 1972、11、942～944頁)
【非特許文献12】Modified-Release Drug Delivery Technology、第2版; Rathboneら編; Marcel Dekker, Inc.: New York、N.Y.、2008
【非特許文献13】A. Soriano、R. Ventura、A. Molero、R. Hoen、V. Casado、A. Cortes、F. Fanelli、F. Albericio、C. Lluis、R. Francoら編、J. Med. Chem. 2009、52、5590～5602頁
【非特許文献14】D. Bonnet、S. Riche、S. Loison、R. Dagher、M. Frantz、L. Boudier、R. Rahmeh、B. Mouillac、J. Haiech、M. Hibert、Chem. - Eur. J. 2008、14、6247～6254頁
【非特許文献15】K. Kiyose、K. Hanaoka、D. Oushiki、T. Nakamura、M. Kajimura、M. Suematsu、H. Nishimatsu、T. Yamane、T. Terai、Y. Hirataら編、J. Am. Chem. Soc. 2010、132、15846～15848頁
【非特許文献16】A. Alessi、M. Salvalaggio、G. Ruzzon、J. Lumin. 2013、134、385～389頁
【非特許文献17】I. Texierら、J. Biomed. Opt. 2009、14、054005
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
このように、本開示は、哺乳動物における、より詳細には生きている哺乳動物における内因性GPCRの検出のためのプローブとして使用できる新規蛍光発生性ダイマー化合物を提供する。本発明は、そのような化合物を含む組成物及びキット並びに分子標的を本発明の化合物と接触する工程を含む、分子標的を標識する方法を提供する。
【0011】
本発明のこれら及び他の目的及び実施形態は、本発明の詳細な説明の後でより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】非洗浄条件下でのOTR-GFPフュージョンを発現している、生きているHEK 293細胞上のdCy5.5-PEG-CBT及びmCy5.5-PEG-CBTの共焦点顕微鏡法試験。細胞は、画像化の前にリガンドと共に5分間室温でインキュベートされた;
【図2】画像化の30分前に、7.5nmolのdCy5.5-PEG-CBT(A及びC)、7.5nmolのdCy5.5-PEG-CBT及び450nmolのCBT(B)、又は7.5nmolのmCy5.5-PEG-CBT(D)を静脈内注射された授乳中(A、B、D)又はナイーブ(C)マウスのインビボ画像。少なくとも3回の生物学的反復実験の代表的画像。
【発明を実施するための形態】
【0013】
他に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により通常理解される同じ意味を有する。
【0014】
冠詞「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、その冠詞の文法的な対象の1つ又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すように本明細書で使用される。例としては、「要素(an element)」は、1つの要素又は2つ以上の要素を意味する。
【0015】
量、継続期間等の測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」、「前後」、又は「およそ」は、明示された値の±20%又は±10%、より好ましくは±5%、更により好ましくは±1%、更により好ましくは±0.1%の変動を包含することを意味し、その理由は、そのような変動が、開示される方法又は組成物を実施するために適切であるからである。
【0016】
範囲:本開示全体で、本発明の種々の態様は、範囲フォーマットで提示できる。範囲フォーマットでの記載が、簡便及び簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能性がある部分範囲の全て並びにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、1から6等の範囲の記載は、1から3、1から4、1から5、2から4、2から6、3から6等の部分範囲並びにその範囲内の個別の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6を具体的に開示したと考えられるべきである。これは、範囲の広さに関わらず当てはまる。
【0017】
本発明によると、用語「含む(comprise(s))」又は「含む(comprising)」(並びに他の同等な用語、例えば、「含む(containing)」及び「含む(including)」)は、「非限定的」であり、具体的に述べられた特徴の全て並びにあらゆる任意選択の、追加の、及び不特定の特徴が含まれるように一般的に解釈できる。特定の実施形態によると、それは、特記されない限り、明示された特徴並びに特許請求される発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないあらゆる任意選択の、追加の、及び不特定の特徴が含まれる句「から基本的になる(consisting essentially of)」、又は明示された特徴のみが含まれる句「からなる(consisting of)」としても解釈できる。
【0018】
用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「生理的に許容される担体」、又は「生理的に許容される賦形剤」は、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、溶媒、又はカプセル化材料等の薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを指す。一実施形態において、各成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト及び動物の組織又は器官と接触して使用するために好適であり、妥当なベネフィット/リスク比に釣り合うという意味で「薬学的に許容される」ものである。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第22版; Allenら編; The Pharmaceutical Press、2012; Handbook of Pharmaceutical Excipients、第7版; Roweら編; The Pharmaceutical Press: 2012; Handbook of Pharmaceutical Additives、第3版; Ash及びAsh編; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation、第2版; Gibson編; CRC Press LLC: Boca Raton、Fla.、2009を参照されたい。
【0019】
用語「溶媒和物」は、溶質、例えば、本明細書に提供される化合物の1つ又は複数の分子及び化学量論量又は非化学量論量で存在する、溶媒の1つ又は複数の分子により形成される錯体又は凝集体を指す。好適な溶媒としては、水、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、及び酢酸があるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、溶媒は薬学的に許容されるものである。一実施形態において、錯体又は凝集体は結晶形である。別の実施形態において、錯体又は凝集体は非結晶形である。溶媒が水である場合、溶媒和物は水和物である。水和物の例としては、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、四水和物、及び五水和物があるが、これらに限定されない。
【0020】
用語「対象」は、霊長類(例えば、ヒト)、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウスを含むがこれらに限定されない動物を指す。用語「対象」及び「患者」は、例えば、ヒト対象等の哺乳動物対象、一実施形態においてヒトに関連して、本明細書において互換的に使用される。好ましくは、対象は、年齢又は性別にかかわらず、ヒト患者である。新生児、幼児、子供も同様に含まれる。
【0021】
本明細書で使用される通り、あらゆる保護基、アミノ酸、及び他の化合物の略語は、別途示されない限り、J. Org. Chem. 2007、72、23A～24A頁に見られる略語又はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (Biochem. 1972、11、942～944頁)により確立された略語を含む、それらの通常の用法又は認められた略語と一致する。
【0022】
本発明の化合物
本発明は、(D)が以下の式(I)又は(I')により表される以下の式(1): D-L-D (1)により表される、2つのシアニン部分(D)を有する蛍光発生性ダイマーである化合物に関する;
本発明は、(D)が以下の式(I)又は(I')により表される以下の式(1): D-L-D (1)により表される、2つのシアニン部分(D)を有する蛍光発生性ダイマーである化合物に関する;
【0023】
【化1】
【0024】
(式中:
(A)は以下の式を有し:
(A)は以下の式を有し:
【0025】
【化2】
【0026】
(B)は以下の式を有し:
【0027】
【化3】
【0028】
式中、破線は、存在するか又は存在せず、存在する場合、それらは単結合又は二重結合を表し;
R2は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される官能基により置換されている(C2～C10)アルキル基;式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコールを含むか、又はそれからなり(nは1から40の整数であり、R'は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される少なくとも1つの官能基を任意に含むC1～C12のアルキル基である);
R3は、
- 水素原子、
- ハロゲン原子、好ましくはフッ素(F)、
- (C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、(C1～C5)アルキル-NR''R'''(R''及びR'''は、独立に、H又は(C1～C5)アルキルである)、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、及び(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択される基(前記基は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、アリール(C1～C5)アルキル、-CONR11R12、若しくは-R13COOHから選択される1若しくは2つの置換基により置換されており、
R11及びR12は、独立に、水素、(C1～C20)アルキル、場合により1つ若しくは複数のハロゲン原子、好ましくはF、若しくはヒドロキシ基により置換されているジ(C1～C5)アルキルアミノ(C1～C5)アルキル、式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコール(nは1から40の整数であり、R'はC1～C12のアルキル基である)であるか、或いは代わりに、R11及びR12は、それらが結合している窒素と共に、場合により(C1～C4)アルキルにより置換されている複素環(ピペラジン等)を表し、
R13は、(C1～C10)アルキルであり、
1つの置換基は、本明細書に定義される1つ若しくは2つの置換基により任意に置換されていてもよい)、又は
- 式-E-R10の基(Eは、-O-、-S-、-NR''-(R''は、H又は(C1～C4)アルキルである)、及び-CH2-から選択され; R10は、(C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、(C1～C5)アルキル-NR''R'''(R''及びR'''は、独立に、H又は(C1～C5)アルキルである)、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択され、R10は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、アリール(C1～C5)アルキル、-CONR11R12、若しくは-R13COOHから選択される1つから3つの置換基により置換されており;
R11及びR12は、独立に、水素、(C1～C20)アルキル、場合により1つ若しくは複数のハロゲン原子若しくはヒドロキシ基により置換されているジ(C1～C5)アルキルアミノ(C1～C5)アルキルであるか、或いは代わりに、R11及びR12は、それらが結合している窒素と共に、場合により(C1～C4)アルキルにより置換されている複素環(ピペラジン等)を表し、
R13は(C1～C10)アルキルであり、
1つの置換基は、本明細書に定義される1つ若しくは2つの置換基により任意に置換されていてもよい)
を表し、
R4は、存在する場合、
- 水素原子、
- (C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、若しくは(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択される基(前記基は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、若しくは-R13COOHから選択される1つ若しくは2つの置換基により置換されており、R13は(C1～C20)アルキルである)、又は
- 式-E-R10の基(Eは、-O-、-S-、-NH-、-CH2-から選択され; R10は、(C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択され、R10は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、若しくは-R13COOHから選択される1つから3つの置換基により置換されており、R13は(C1～C10)アルキルである)
を表し;
R1は、式(1)中のLの先端に結合している飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、
Lは、3つの先端を呈し、2から40個、好ましくは2から30個の炭素原子を含む飽和又は不飽和炭化水素基であり、ここで、前記リンカーLの2つの先端は、式(I)又は(I')の両シアニン部分に、両R1を経て共有結合しており、第3の先端は飽和又は不飽和炭化水素基の残りであり、反応性基を含むか、又はリガンドに結合しており;
炭化水素鎖又は基(すなわち、独立にR1又はL)は、1つ若しくはいくつかのヘテロ原子により、1つ若しくはいくつかの結合基により、又は1つ若しくはいくつかの炭素環若しくは複素環により任意に分断され、炭化水素鎖(独立にR1又はL)は、C1～C3アルキル基、ハロゲン、好ましくはF、-OH、-OMe、及び-CF3から選択される1つ又はいくつかの基により更に置換されていてもよく;
反応性基は少なくとも1つのヘテロ原子を含み、別の反応性基への共有結合を形成して、それにより結合基を形成することが可能であり;且つ
Xは負電荷を有するアニオンである)。
R2は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される官能基により置換されている(C2～C10)アルキル基;式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコールを含むか、又はそれからなり(nは1から40の整数であり、R'は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される少なくとも1つの官能基を任意に含むC1～C12のアルキル基である);
R3は、
- 水素原子、
- ハロゲン原子、好ましくはフッ素(F)、
- (C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、(C1～C5)アルキル-NR''R'''(R''及びR'''は、独立に、H又は(C1～C5)アルキルである)、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、及び(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択される基(前記基は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、アリール(C1～C5)アルキル、-CONR11R12、若しくは-R13COOHから選択される1若しくは2つの置換基により置換されており、
R11及びR12は、独立に、水素、(C1～C20)アルキル、場合により1つ若しくは複数のハロゲン原子、好ましくはF、若しくはヒドロキシ基により置換されているジ(C1～C5)アルキルアミノ(C1～C5)アルキル、式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコール(nは1から40の整数であり、R'はC1～C12のアルキル基である)であるか、或いは代わりに、R11及びR12は、それらが結合している窒素と共に、場合により(C1～C4)アルキルにより置換されている複素環(ピペラジン等)を表し、
R13は、(C1～C10)アルキルであり、
1つの置換基は、本明細書に定義される1つ若しくは2つの置換基により任意に置換されていてもよい)、又は
- 式-E-R10の基(Eは、-O-、-S-、-NR''-(R''は、H又は(C1～C4)アルキルである)、及び-CH2-から選択され; R10は、(C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、(C1～C5)アルキル-NR''R'''(R''及びR'''は、独立に、H又は(C1～C5)アルキルである)、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択され、R10は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、アリール(C1～C5)アルキル、-CONR11R12、若しくは-R13COOHから選択される1つから3つの置換基により置換されており;
R11及びR12は、独立に、水素、(C1～C20)アルキル、場合により1つ若しくは複数のハロゲン原子若しくはヒドロキシ基により置換されているジ(C1～C5)アルキルアミノ(C1～C5)アルキルであるか、或いは代わりに、R11及びR12は、それらが結合している窒素と共に、場合により(C1～C4)アルキルにより置換されている複素環(ピペラジン等)を表し、
R13は(C1～C10)アルキルであり、
1つの置換基は、本明細書に定義される1つ若しくは2つの置換基により任意に置換されていてもよい)
を表し、
R4は、存在する場合、
- 水素原子、
- (C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、若しくは(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択される基(前記基は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、若しくは-R13COOHから選択される1つ若しくは2つの置換基により置換されており、R13は(C1～C20)アルキルである)、又は
- 式-E-R10の基(Eは、-O-、-S-、-NH-、-CH2-から選択され; R10は、(C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、(C1～C20)アルキルヘテロアリールから選択され、R10は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、若しくは-R13COOHから選択される1つから3つの置換基により置換されており、R13は(C1～C10)アルキルである)
を表し;
R1は、式(1)中のLの先端に結合している飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、
Lは、3つの先端を呈し、2から40個、好ましくは2から30個の炭素原子を含む飽和又は不飽和炭化水素基であり、ここで、前記リンカーLの2つの先端は、式(I)又は(I')の両シアニン部分に、両R1を経て共有結合しており、第3の先端は飽和又は不飽和炭化水素基の残りであり、反応性基を含むか、又はリガンドに結合しており;
炭化水素鎖又は基(すなわち、独立にR1又はL)は、1つ若しくはいくつかのヘテロ原子により、1つ若しくはいくつかの結合基により、又は1つ若しくはいくつかの炭素環若しくは複素環により任意に分断され、炭化水素鎖(独立にR1又はL)は、C1～C3アルキル基、ハロゲン、好ましくはF、-OH、-OMe、及び-CF3から選択される1つ又はいくつかの基により更に置換されていてもよく;
反応性基は少なくとも1つのヘテロ原子を含み、別の反応性基への共有結合を形成して、それにより結合基を形成することが可能であり;且つ
Xは負電荷を有するアニオンである)。
【0029】
好ましくは、結合基は、-O-、C(=O)-OC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)O-、-S-、-SS-、-SC(O)-、-OC(S)-、-NR21-、-NR21C(O)-、-C(O)NR21-、-NR21C(S)-、-C(S)NR21-、-OC(O)S-、-OC(S)O-、-SC(O)O-、-OC(S)S-、-SC(O)S-、-SC(S)O-、-SC(S)S-、-OC(O)NR21-、-OC(S)NR21-、-NR21C(S)O-、-NR21C(O)S-、-NR21C(O)NR22-、-NR21C(S)NR22-、-SC(O)S-、-SC(S)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-O(CR21R22)O-、-C(O)O(CR21R22)O-、-OC(O)O(CR21R22)O-、-P(O)(R21)-、-P(O)(OR21)-、-P(O)(R21)O-、-OP(O)(OR21)-、-OP(O)(R21)O-、-NR21P(O)(R22)-、-NR21P(O)(OR22)-、-NR21P(O)(R22)O-、-OP(O)(OR21)-、及び-OP(O)(R21)O-から選択され、式中、R21及びR22は、独立に、H又はCH3、好ましくはHである。
【0030】
本明細書において、用語「アルキル」は、単独又は組合せで、示された数の炭素原子を有する分岐又は非分岐飽和炭化水素基を指す。本明細書で使用される通り、x及びyがそれぞれ異なる正の整数である用語「(Cx～Cy)アルキル」は、xからyの数の炭素原子を有するアルキル基を意味する。例えば、本明細書で使用される用語「(C1～C20)アルキル」、「(C1～C10)アルキル」、「(C8～C20)アルキル」、「(C12～C18)アルキル」は、それぞれ、1から20個の炭素原子、1から10個の炭素原子、8から20個の炭素原子、又は12から18個の炭素原子を有するアルキル基を指す。
【0031】
アルキルの例は、メチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、sec-ブチル、iso-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、3-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルペンチル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシル、n-ウンデシル、n-ドデシル、n-トリデシル、n-テトラデシル、n-ペンタデシル、n-ヘキサデシル、n-ヘプタデシル、n-オクタデシル、n-ノナデシル、n-イコシルであり得るが、これらに限定されない。
【0032】
用語「ヘテロ(C1～C10)アルキル」、「ヘテロ(C1～C20)アルキル」、及び「ヘテロ(C8～C20)アルキル」は、それぞれ、1個又は複数の炭素原子が、酸素、窒素、リン、又は硫黄に置き換えられた、上記で定義された(C1～C10)アルキル基、(C1～C20)アルキル基、又は(C8～C20)アルキル基を指す。ヘテロアルキルの例は、アルキルオキシ(メトキシ、エトキシ等)、アルキルメルカプト(メチルメルカプト、エチルメルカプト等)、又はアルキルオキシエチル(メトキシエチル等)等であり得る。
【0033】
用語「シクロアルキル」は、少なくとも3個の炭素原子で構成された環式飽和炭素系環を指す。用語「シクロ(3～20)アルキル」、「シクロ(3～10)アルキル」、又は「シクロ(8～20)アルキル」は、それぞれ、3から20個の炭素原子、3から10個の炭素原子、又は8から20個の炭素原子で構成されたシクロアルキルを指す。
【0034】
シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロテトラデシル、シクロヘキサデシル、シクロヘプタデシル、シクロオクタデシル、シクロノナデシル、シクロイコシルがあるが、これらに限定されない。
【0035】
本明細書で使用される用語「アルケニル」は、単独又は組合せで、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有する、示された数の炭素原子の分岐又は非分岐炭化水素基を指す。用語「(C2～C20)アルケニル」、「(C2～C10)アルケニル」、又は「(C8～C20)アルケニル」は、それぞれ、2から20個の原子のアルケニル基、2から10個の炭素原子のアルケニル基、又は8から20個の炭素原子のアルケニル基を表す。
【0036】
アルケニル基の例は、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、イソブテニル、1-ペンテニル、1-ヘキセニル、1-ヘプテニル、1-オクテニル、1-ノネニル、2-ノネニル、1-デセニル、1-ウンデセニル、1-ドデセニル、1-トリデセニル、1-テトラデセニル、1-ペンタデセニル、1-ヘキサデセニル、1-ヘプタデセニル、1-オクタデセニル、1-ノナデセニル、1-エイコセニル、1,3-ブタジエニル、1,4-ペンタジエニルである。
【0037】
用語「シクロアルケニル」は、少なくとも3個の炭素原子で構成され、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む環式不飽和炭素系環を指す。用語「シクロ(3～20)アルケニル」、「シクロ(3～10)アルケニル」及び「シクロ(8～20)アルケニル」は、それぞれ、3～20個の炭素原子を有するシクロアルケニル、3～10個の炭素原子を有するシクロアルケニル、又は8～20個の炭素原子を有するシクロアルケニルを表す。
【0038】
シクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル等があるが、これらに限定されない。
【0039】
本明細書で使用される用語「ヘテロシクロアルケニル」は、少なくとも2個の炭素原子及び酸素、窒素、リン、又は硫黄から選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含む複素環不飽和炭素系環を指す。用語「ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル」、「ヘテロシクロ(C2～C10)アルケニル」、及び「ヘテロシクロ(C8～C20)アルケニル」は、それぞれ、2～20個の炭素原子を有する、2～10個の炭素原子を有する、又は8～20個の炭素原子を有するヘテロシクロアルケニルを指す。
【0040】
本明細書で使用される用語「アルキニル」は、単独又は組合せで、2個の炭素原子の間に少なくとも三重結合を含む、示された数の原子の分岐又は非分岐炭化水素基を意味する。用語「(C2～C20)アルキニル」、「(C2～C10)アルキニル」、又は「(C8～C20)アルキニルは、それぞれ、2から20個の炭素原子、2から10個の炭素原子、又は8から20個の炭素原子を有するアルキニル基を示す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニル等がある。
【0041】
単独又は別の基の一部として本明細書で利用される用語「アリール」は、6から10個の炭素を環部分に含む単環式及び二環式芳香族基を指す。アリールの例としてはフェニル及びナフチルがある。
【0042】
用語「(C1～C20)アルキルアリール」及び「(C1～C10)アルキルアリール」は、それぞれ、(C1～C20)アルキル基又は(C1～C10)アルキル基により置換された、定義された通りのアリール基を指す。
【0043】
用語「ヘテロアリール」は、1個又は複数の炭素原子が、酸素、窒素、又は硫黄に置き換えられたアリール基、例えば、4-ピリジル、2-イミダゾリル、3-ピラゾリル、及びイソキノリニル基を指す。
【0044】
用語「アリール(C1～C10)アルキル」又は「アリール(C1～C5)アルキル」は、ベンジル又はフェネチル等、アリールにより置換された、上記で定義された(C1～C10)アルキル又は(C1～C5)アルキルを指す。
【0045】
用語「(C1～C20)アルキルヘテロアリール」及び「(C1～C10)アルキルヘテロアリール」は、それぞれ、(C1～C20)アルキル基又は(C1～C10)アルキル基により置換された、上記で定義されたヘテロアリール基を意味する。
【0046】
用語「炭素環式基」又は「炭素環」は、芳香族又は非芳香族炭化水素単環又は多環(縮合、架橋、又はスピロ環を含む)を指す。好都合には、炭素環は、環中に3から15個、特に5から10個の炭素原子を含む。
【0047】
用語「複素環基」又は「複素環」は、1個又は複数の炭素原子が1個又は複数の酸素、窒素、リン、又は硫黄原子に置き換えられた炭素環式基を指す。それは、より具体的には、1個又は複数の、好都合には1から4個、より好都合には1又は2個の炭素原子が、それぞれ、窒素、酸素、及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子に置き換えられた芳香族又は非芳香族炭化水素単環又は多環(縮合、架橋、又はスピロ環を含む)を指す。好都合には、複素環は、環中に5から15個、特に5から10個の原子を含む。
【0048】
複素環基は、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル等であり得る。複素環基の例としては、フリル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピリジル、キノリル、ピリミジニルがある。
【0049】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を意味する。
【0050】
本発明によると、式(1)の化合物は、このように、Lにより(両D部分のR1を経て)連結された、本明細書に詳述される式(D)の2つの部分を呈する。各D部分は、異なっていても、好ましくは同一でもあり得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、R1は、1から20個、好ましくは2から10個の炭素原子を含む飽和炭化水素鎖である。特定の実施形態によると、R1は、3から6個の炭素原子の飽和炭化水素鎖、好ましくは3から6個の炭素原子のアルキル基(xが、3、4、5、又は6である式-(CH2)x-等)である。
【0052】
いくつかの実施形態において、Lは、3つの先端を呈し、2から40個、好ましくは2から30個の炭素原子を含む飽和炭化水素鎖であって、前記リンカーLの2つの先端は、両R1に共有結合しており、第3の先端は飽和炭化水素基の分岐部分であり、反応性基を含むか、又はリガンドに結合する。Lの炭化水素鎖は、窒素及び酸素原子等の1つ若しくはいくつかのヘテロ原子により、アミド基(-CONH-)等上記で定義されたヘテロ原子を含む結合基により、又は1つ若しくはいくつかの炭素環若しくは複素環により、任意に分断されており、炭化水素鎖は、C1～C3アルキル基、F、Cl、又はBr等のハロゲン、-OH、-OMe、及び-CF3から選択される1つ又はいくつかの基により置換されていることも、そうでないこともある。
【0053】
いくつかの実施形態において、リンカーLは、1つ又は複数のエチレンオキシ基(すなわち; oが、1から5、好ましくは1又は2である(CH2CH2O)o)、エチレン基(すなわちrが、1から5、好ましくは1又は2である(CH2CH2)r)により分断され、好ましくは-O-、-NH-、-C(=O)-、-C(=O)NH-、-OC(=O)-、-(C=O)O-、-NHC(=O)-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)NH-、-NHC(=O)O-、及び-OC(=O)NH-からなる群から選択され、又はより好ましくは-NHC(=O)-若しくは-C(=O)NH-である1つ又は複数の結合基(上記で定義された通り)により分断された炭化水素基である。
【0054】
好ましい実施形態によると、第3の先端は、炭化水素基の分岐部分であり、クリック反応又は生体共役反応で反応することが可能な反応性基を含む。
【0055】
Xは負電荷を有するアニオンである。Xは、有機又は無機対イオンであり得る。一実施形態によると、Xは、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、アシル化アミノ酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、L-アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ホウ酸、(+)-ショウノウ酸、カンファースルホン酸、(+)-(15)-カンファー-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、D-グルコン酸、D-グルクロン酸、L-グルタミン酸、a-オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、(-)-L-リンゴ酸、マロン酸、(±)-DL-マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、過塩素酸、リン酸、L-ピログルタミン酸、糖酸、サリチル酸、4-アミノ-サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、(+)-L-酒石酸、チオシアン酸、p-トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸、及び吉草酸のアニオンである。
【0056】
別の実施形態において、Xは、フルオリド(F-)、クロリド(Cl-)、ブロミド(Br-)、ヨージド(I-)、アセテート(CH3CO2-)、トリフルオロアセテート(CF3CO2-) (TFAと称される)、ホスフェート(PO4H2-、PO4H2-、又はPO43-)、又はサルフェート(HSO4-又はSO42-)である。
【0057】
更に別の実施形態において、Xは、クロリド又はトリフルオロアセテートである。
【0058】
特定の実施形態において、R2は、式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコールであり、式中、nは1から40の整数であり、特にnは5から15であり、特にn=6から10、特にn=8、且つR'は、C1～C12、特にC1～C8のアルキル基、より具体的にはCH3である。
【0059】
別の特定の実施形態において、R2は、式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコールであり、式中、nは1から40の整数であり、特にnは5から15であり、特にn=6から10、特にn=8、且つR'は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される少なくとも1つの官能基を含むC1～C12のアルキル基である。
【0060】
別の特定の実施形態において、R2は、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される少なくとも1つの官能基により置換されている(C2～C10)アルキル基である。より具体的な実施形態によると、前記官能基は、アルキル基にその先端で結合している。
【0061】
別の実施形態によると、本発明の化合物は、破線が式(I)又は(I')中に存在し、好ましくは単結合を表す式(1)のものである。より特定の実施形態によると、R4は水素原子である。
【0062】
特定の実施形態において、式(I)及び(I')は下記の通りである:
【0063】
【化4】
【0064】
。
【0065】
別の実施形態によると、本発明の化合物は、破線が式(I)又は(I')中に存在しない(したがって、R4が存在しない)式(1)のものである。
【0066】
この好ましい実施形態によると、(D)は、以下の式(I)又は(I')により表され:
【0067】
【化5】
【0068】
式中、A、B及びR3は、好ましい実施形態を含む上記に定義された通りである。好ましくは、R3はHである。
【0069】
より好ましい実施形態によると、(D)は以下の式(I)により表され:
【0070】
【化6】
【0071】
式中、A、B及びR3は、好ましい実施形態を含む上記に定義された通りである。好ましくは、R3はHである。
【0072】
好ましい実施形態によると、式(A)は下記の通りである:
【0073】
【化7】
【0074】
好ましい実施形態によると、式(B)は下記の通りである:
【0075】
【化8】
【0076】
好ましい実施形態によると、化合物は、AがA1であり、BがB1であり、より好ましくは(D)が以下の式(I)により表される式(1)のものである:
【0077】
【化9】
【0078】
一実施形態によると、R4は、存在する場合、水素、(C1～C20)アルキル、シクロ(C3～C20)アルキル、(C2～C20)アルケニル、(C2～C20)アルキニル、複素環基、シクロ(C3～C20)アルケニル、ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ(C1～C20)アルキル、(C1～C20)アルキルアリール、及び(C1～C20)アルキルヘテロアリールからなる群から選択され、前記基は、非置換又は(C1～C5)アルキル、アリール、若しくは-R13COOHから選択される1つ若しくは2つの置換基により置換されており、R13は(C1～C20)アルキルである;好ましくは、R4は、存在する場合、水素、非置換(C1～C20)アルキル、非置換シクロ(C3～C20)アルキル、非置換(C2～C20)アルケニル、非置換(C2～C20)アルキニル、非置換複素環基、非置換シクロ(C3～C20)アルケニル、非置換ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロ(C1～C20)アルキル、非置換(C1～C20)アルキルアリール、及び非置換(C1～C20)アルキルヘテロアリールからなる群から選択される。
【0079】
一実施形態によると、R3は、水素、非置換(C1～C20)アルキル、非置換シクロ(C3～C20)アルキル、非置換(C2～C20)アルケニル、非置換(C2～C20)アルキニル、非置換複素環基、非置換シクロ(C3～C20)アルケニル、非置換ヘテロシクロ(C2～C20)アルケニル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロ(C1～C20)アルキル、非置換(C1～C20)アルキルアリール、又は非置換(C1～C20)アルキルヘテロアリールからなる群から選択される。
【0080】
別の実施形態によると、R3は、下記からなる群から選択される基であり得:
【0081】
【化10】
【0082】
式中、R31は、非存在、O、S又はNR"であり、R32は、-CH2-又は-O-であり、R33は式-(CH2CH2O)n-R'により表されるポリエチレングリコール;又は式-(CH2CH2(CH3)O)n-R'により表されるポリプロピレングリコール(nは1から40の整数であり、R'はC1～C12のアルキル基である)である。
【0083】
特定の実施形態によると、化合物は、(D)が、下記の通りである式(I)又は(I')により表される式(1)のものであり:
【0084】
【化11】
【0085】
式中、X及びR3は、詳述される具体的な実施形態を含む本明細書に定義される通りであり、nは0～8であり、Yは、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される官能基である。
【0086】
別の特定の実施形態によると、化合物は、(D)が、下記の通りである式(I')により表される式(1)のものであり:
【0087】
【化12】
【0088】
式中、X及びR3は、詳述される具体的な実施形態を含む本明細書に定義される通りであり、nは0～8であり、Yは、-COOH、-SO3H、及びOHからなる群から選択される官能基である。
【0089】
別の特定の実施形態によると、化合物は、(D)が以下の式(I')により表される式(1)のものであり:
【0090】
【化13】
【0091】
式中、X及びR3は、詳述される具体的な実施形態を含む本明細書に定義される通りであり、nは、0～8、好ましくは5、6、又は7である。
【0092】
特定の実施形態によると、R3(及びR4、存在する場合)は水素原子である。
【0093】
特定の実施形態によると、本発明の化合物は、リンカーLを経て、より具体的には上記で定義されたLの第3の先端で、化合物に連結したリガンドを含む。好ましくは、それに結合する前に、本発明の化合物及びリガンドは、それぞれ、クリック反応又は生体共役反応により共に反応することが可能な反応性基を有する。
【0094】
具体的には、クリック反応は、銅触媒によるアジド-アルキン双極子環化付加(CuAAC)、歪み促進型アルキン-アジド環化付加(SPAAC)、テトラジンと歪みアルキン又はアルケン(strained alkyne or alkene)とのディールス・アルダー反応、テトラジン-イソニトリル環化付加、マレイミド-システイン環化付加等のチオール-アルケンクリック反応、及びシドノン-アルキン環化付加からなる群から選択され得て、好ましくは歪み促進型アルキン-アジド環化付加(SPAAC)である。
【0095】
いくつかの態様において、クリック反応は、「生体直交型」又は「生体適合性」であり得て、これは、クリック反応に関与する試薬が、複数の生物学的実体の存在下で、互いに選択的且つ迅速に反応し得ることを意味する。いくつかの実施形態において、クリック反応は、生細胞を含む培地中で、細胞過程との干渉なしに実施され得る。
【0096】
したがって、本発明の化合物は、反応性基としてアジド基を有し得て、リガンドの反応性基は、アルキン基又は歪みアルキンスキャホールド(strained alkyne scaffold)を有し得て、逆も同様である。好ましくは、歪みアルキニル基は、アザジベンゾシクロオクチン(ADIBO、DIBAC、又はDBCO)又はテトラメトキシジベンゾシクロオクチン(TMDIBO)等のシクロオクチンスキャホールドから選択される。銅フリー反応にしばしば使用される他の適切な歪みアルキンとしては、シクロオクチン(OCT)、アリールレスシクロオクチン(ALO)、モノフルオロシクロオクチン(MOFO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)、ジメトキシアザシクロオクチン(DIMAC)、ビアリールアザシクロオクチノン(BARAC)、ビシクロノニン(BCN)、テトラメチルチエピニウム(TMTI、TMTH)、ジフルオロベンゾシクロオクチン(DIFBO)、オキサ-ジベンゾシクロオクチン(ODIBO)、カルボキシメチルモノベンゾシクロオクチン(COMBO)、又はベンゾシクロノニンがある。
【0097】
リガンドは、分子標的に特異的に結合することが可能で、蛍光発生性ダイマー(すなわち本発明の化合物)と、共有結合又は非共有結合の相互作用により、直接又は結合媒介により相互作用することが可能である少なくとも1つの結合ドメインを含むあらゆる化合物である。リガンドの例としては、抗体、抗体の断片又は誘導体、アプタマー、シュピーゲルマー、ペプチドアプタマー、分子標的のケミカルリガンド(アゴニスト及びアンタゴニスト)又は基質、分子標的をハイブリダイズすることが可能な核酸があるが、これらに限定されない。リガンドは、特定の実施形態によると、分子標的の合成ケミカルリガンド又は基質である。
【0098】
したがって、式(1)の化合物は、飽和若しくは不飽和炭化水素基の残りであり、反応性基を含むか、又は飽和若しくは不飽和炭化水素基の残りであり、リガンドに連結している、好ましくはリガンドに共有結合している第3の先端を有する炭化水素基Lを含む。
【0099】
本明細書で使用される通り、用語「分子標的」は、回収され、検出され、且つ/又は定量化されるべきあらゆる種類の分子を指す。分子標的は、生体分子、すなわち生体中に存在する分子であり得て、生体分子の例としては、核酸、例えば、DNA又はRNA分子、抗体、酵素又は成長因子等のタンパク質、脂肪酸、糖脂質、ステロール、又はグリセロ脂質等の脂質、ビタミン、ホルモン、神経伝達物質、及び炭水化物、例えば、モノ-、オリゴ-及び多糖があるが、これらに限定されない。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用され、最低限の長さに限定されない。タンパク質は、リン酸化、アセチル化、アミド化、メチル化、グリコシル化、又は脂質付加等のあらゆる翻訳後修飾を含み得る。本明細書で使用される通り、用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドのいずれかで、あらゆる長さのポリマー性形態のヌクレオチドを指す。好ましくは、分子標的は、タンパク質又は核酸である。より好ましくは、分子標的はタンパク質であり、より詳細にはGPCR等の膜受容体である。
【0100】
特定の実施形態によると、リガンドは、GPCRのリガンドであり、より具体的には、リガンドは、カルベトシン(CBT)、オキシトシン受容体(OTR)のペプチドリガンドであり、GPCRはOTRである。
【0101】
更に別の実施形態において、本発明の化合物は、下記から選択される式を有する:
【0102】
【化14A】
【0103】
【化14B】
【0104】
。
【0105】
式(2)及び(3)の前記化合物は、それぞれ、dCY5.5-PEG及びdCY5.5-PEG-CBTとも称される。対イオンXを表すTFA-は、上記で定義された任意の他のアニオンにより置換されていてもよい。
【0106】
別の特定の実施形態によると、本発明の化合物は、下記から選択される式を有し:
【0107】
【化15】
【0108】
式中、nは、0又は1であり(それぞれ化合物4及び5);
【0109】
【化16】
【0110】
式中、nは、0又は1である(それぞれ、化合物6及び7)。
【0111】
対イオンXを表すTFAは、上記で定義された任意の他のアニオンにより置換されていてもよい。
【0112】
調製の方法
本明細書に提供される化合物は、当業者に公知である任意の方法により、調製、単離、又は得ることができる。特定の実施形態において、且つ例としては、本発明の化合物は、以下の実施例に詳述される通り調製できる。
本明細書に提供される化合物は、当業者に公知である任意の方法により、調製、単離、又は得ることができる。特定の実施形態において、且つ例としては、本発明の化合物は、以下の実施例に詳述される通り調製できる。
【0113】
本明細書に提供される化合物の合成に使用される出発物質は、市販されているか、又は容易に調製できる。
【0114】
本明細書に提供される医薬組成物は、リポソーム-、再封赤血球-、及び抗体-系送達系を含む、治療される対象の体の特定の組織、受容体、又は他の部分を標的化するようにも製剤できる。
【0115】
医薬組成物
一実施形態において、本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物;及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
一実施形態において、本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物;及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【0116】
本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物を含む医薬組成物は、経口、非経口、及び外用投与のための種々の剤形で製剤できる。医薬組成物は、遅延-、延長-、長期-、持続-、パルス-、制御-、加速-、速放-、標的化-、プログラム-放出、及び胃内滞留剤形を含む、改変された放出剤形としても製剤できる。これらの剤形は、当業者に公知である従来の方法及び技法に従って調製できる(Remington: The Science and Practice of Pharmacy、上記; Modified-Release Drug Delivery Technology、第2版; Rathboneら編; Marcel Dekker、Inc.: New York、N.Y.、2008を参照されたい)。
【0117】
一実施形態において、医薬組成物は、本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物を含む経口投与のための剤形で提供される。
【0118】
別の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物を含む非経口投与のための剤形で提供される。
【0119】
更に別の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物を含む外用投与のための剤形で提供される。
【0120】
使用方法
一実施形態において、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで分子標的を標識する方法であって、分子標的を、本明細書に開示される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物と接触させる工程を含む方法が本明細書に提供される。好ましい実施形態によると、式(1)の化合物は上記で定義されたリガンドを含む。
一実施形態において、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで分子標的を標識する方法であって、分子標的を、本明細書に開示される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物と接触させる工程を含む方法が本明細書に提供される。好ましい実施形態によると、式(1)の化合物は上記で定義されたリガンドを含む。
【0121】
このように標識された分子標的は、生物学的画像化、薬理学的試験、又は臨床診断に好適である。
【0122】
一実施形態において、接触工程は、約5から約9又は約6から約8の範囲のpHで実施される。別の実施形態において、接触工程は、約6、約6.2、約6.4、約6.6、約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、又は約8のpHで実施される。
【0123】
一実施形態において、接触工程は、約0から約50℃、約10から約40℃、約20から40℃、又は約30から約40℃の範囲の温度で実施される。別の実施形態において、接触工程は、約35から約40℃の範囲の温度で実施される。
【0124】
一実施形態において、接触工程は水溶液で実施される。
【0125】
一実施形態において、接触工程は生理的条件下で実施される。
【0126】
一実施形態において、分子標的は、アミノ酸系化合物である生体分子である。別の実施形態において、生体分子はタンパク質である。別の実施形態において、生体分子は、膜受容体である。更に別の実施形態において、生体分子は、OTR等の内因性GPCRである。
【0127】
アミノ酸系化合物は、本明細書に開示される組成物又は化合物に、アミン、アミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基を経て結合し得る。
【0128】
このように標識された分子標的は、生体イメージング、薬物送達、臨床診断、法医学、インビトロ、エクスビボ診断法、及びインビボ診断法に好適である。非限定的な用途としては、薬物送達、免疫療法、画像化造影媒体又は造影剤、フローサイトメトリー、細胞選別、顕微鏡法、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織染色、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降法、マイクロアレイ、近赤外画像化等がある。
【0129】
このように標識された生体分子は、生体イメージング、臨床診断、薬物送達、法医学、又はインビトロ診断法に好適である。非限定的な用途としては、増幅(ポリメラーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、鎖置換、ループ介在等温増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応、核酸配列ベース増幅、多重置換増幅、ヘリカーゼ依存増幅、分枝増幅等)、リアルタイム増幅、シーケンシング(サンガー、リアルタイム、イオン半導体、合成、ライゲーション、ナノポア等)、検出プローブ、蛍光性インサイチュハイブリダイゼーション、アンチセンス技術、マイクロアレイ等がある。
【0130】
分子標的は、任意の試料、典型的には対象の生体試料、例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液の試料等の流体又は対象若しくはその一部の組織由来の試料に含まれ得るか、又はそれら由来であり得る。そのような試料の例としては、血液、血漿、唾液、尿、及び精液試料等の流体、並びに生検材料、器官、組織、又は細胞試料がある。それは、対象の全身又はその一部分も含み得る(インビボ標識)。試料は、本発明の化合物と接触される前に処理され得る。
【0131】
キット
一実施形態において、容器及び少なくとも1種の本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物を含むキットが本明細書に提供される。式(1)の化合物は、上記で定義された通り、リガンド又は反応性基を含み得る。
一実施形態において、容器及び少なくとも1種の本明細書に提供される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物を含むキットが本明細書に提供される。式(1)の化合物は、上記で定義された通り、リガンド又は反応性基を含み得る。
【0132】
特定の実施形態によると、キットは、2、3、4、5、6、10種までの異なる式(1)の化合物を含む、1種又は数種の(2、3、4、5、6、10種までの)異なる式(1)の化合物を含み得る。
【0133】
キットは、式(1)の化合物のリンカーLの反応性基と、クリック反応又は生体共役反応により反応することが可能な反応性基を有するリガンド(上記で定義された)を更に含み得る。
【0134】
本明細書に提供されるキットは、本明細書に提供される化合物を投与するために使用される装置を更に含み得る。そのような装置の例としては、シリンジ、針なし注射器、点滴バッグ、パッチ、及び吸入器があるが、これらに限定されない。
【0135】
本明細書に提供されるキットは、1種又は複数の本明細書に提供される化合物を投与するために使用され得る薬学的に許容されるビヒクルを更に含み得る。例えば、本明細書に提供される化合物が、非経口投与のために復元されなければならない固体形態で提供される場合、キットは、化合物が溶解されて非経口投与に好適な滅菌溶液を形成できる好適なビヒクルの密閉された容器を含み得る。
【0136】
別の実施形態において、診断法又は研究使用のためのキットが本明細書に提供される。これらのキットには、任意に、本明細書に開示される化合物、例えば、式(1)の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくは水和物により標識される分子標的が含まれる。
【0137】
以下の実施例は、限定のためではなく説明のために与えられる。
【実施例】
【0138】
(実施例1)
化学合成
一般情報
試薬は、商業的供給源から得て、更に精製せずに使用した。Fmoc-NH-PEG3-COOHは、A. Soriano、R. Ventura、A. Molero、R. Hoen、V. Casado、A. Cortes、F. Fanelli、F. Albericio、C. Lluis、R. Francoら、J. Med. Chem. 2009、52、5590～5602頁中の記載されたプロトコルに従って得た。
化学合成
一般情報
試薬は、商業的供給源から得て、更に精製せずに使用した。Fmoc-NH-PEG3-COOHは、A. Soriano、R. Ventura、A. Molero、R. Hoen、V. Casado、A. Cortes、F. Fanelli、F. Albericio、C. Lluis、R. Francoら、J. Med. Chem. 2009、52、5590～5602頁中の記載されたプロトコルに従って得た。
【0139】
固相反応は、オービタル撹拌機振盪装置を使用して、ポリエチレンフリット及びポリプロピレンキャップを備えたポリプロピレンチューブ中で実施した。Fmoc-保護リンクアミドAM樹脂(ローディング0.7mmol/g)は、Iris Biotech社から購入した。SPOrT樹脂は、既報の通り調製した(D. Bonnet、S. Riche、S. Loison、R. Dagher、M. Frantz、L. Boudier、R. Rahmeh、B. Mouillac、J. Haiech、M. Hibert、Chem. - Eur. J. 2008、14、6247～6254頁)。カップリング及びFmoc切断の完了は、カイザーテスト及びTNBSテストによりモニターした。
【0140】
分析逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を、C18 Sunfireカラム(5μm、4.6mm×150mm)で、溶媒A(H2O中0.1% TFA、v/v)中の溶媒B(MeCN中0.1% TFA、v/v)の直線勾配(20分で5%から95%、1mL.分-1の流量)を使用して実施した。検出は、220及び254nmに設定した。セミ分取RP-HPLCクロマトグラフィーを、SunFire C18カラム(5μm、19×150mm)で、溶媒A(H2O中0.1% TFA、v/v)中の溶媒B(MeCN中0.1% TFA、v/v)の勾配及び20ml.分-1の流量を使用して実施した。高分解能質量スペクトル(HRMS)を、Zorbax SB C18カラム(1.8μm、2.1×50mm)を備えたAgilent Technology 6520 Accurare-Mass Q.Tof LC/MS装置で、エレクトロスプレーイオン化(ESI)及び飛行時間分析計(TOF)を使用して得た。1H及び13C NMRスペクトルは、Bruker Advance分光計(1Hスペクトルでは400MHz及び13Cでは126MHz)で、25℃で記録した。ケミカルシフトは、残留溶媒に対する百万分率(ppm)で報告し、カップリング定数(J)はヘルツ(Hz)で報告する。シグナルは、s(シングレット)、d(ダブレット)、t(トリプレット)、q(カルテット)、m(マルチプレット)、br s(ブロードシングレット)及びbr d(ブロードダブレット)として記載する。
【0141】
固相合成-スキーム1
Lys(N3)-CBT
Lys(N3)-CBT
【0142】
【化17】
【0143】
合成を、FmocリンクアミドAM樹脂(0.21mmol、ローディング0.7mmol/g、300mg)で実施した。Fmoc保護基の切断を、DMF中20%ピペリジン(5mL; 15分間2回)で実施した。Fmoc-保護アミノ酸を、DMF(5mL)中で、45分間、HBTU(3.8当量)及びHOBt(4当量)を活性化剤としてのDIEA(12当量)と共に使用してカップリングしたが、例外として、Fmoc-Cys(Mmt)-OH(5当量)の導入は、HATU(4.9当量)をテトラメチルピペリジン(10当量)と共に使用して、DMF(5mL)中で45分間実施した。4-ブロモ酪酸(5当量)は、DIC(5当量)及びHOBt(5当量)を使用して、DMF(5mL)中で24時間導入した。システインMmt保護基を除去するために、ペプチドを、TFA/TIS/DCM1/5/94 (v/v/v; 12mL; 2分間7回)で処理した。Mmtの除去は、分析RP-HPLCによりモニターした。分子内環化を、MeOH/THF 1/4 (v/v、5mL)中1.4M NH3中で、4時間室温で実施した。3時間室温でのTFA/H2O/TIS 95/2.5/5.5 (v/v/v; 15mL)処理によりペプチドを樹脂から切断した。濾液を、120mLの冷Et2Oに滴加し、5分間3000rpmで、4℃で遠心分離した。溶媒を除去し、固体を、冷Et2Oにより1回洗浄し、次いで5分間3000rpmで4℃での遠心分離及びデカンテーションにより除去した。粗製のペプチドを乾燥させ、溶媒A中の溶媒Bの直線勾配(30分で10%から60%)を使用してセミ分取RP-HPLCにより精製すると、Lys(N3)-CBT(60mg、28%)が白色の固体として与えられた。TR=11.04分(>95%純度[220.8nm]); HRMS(ESI) C45H68N14NaO12S([M+Na]+)の計算値: 1051.4760;実測値: 1051.4776。
【0144】
ダイマー性PEG鎖1
【0145】
【化18】
【0146】
合成を、SPOrT樹脂(0.12mmol、ローディング0.6mmol/g、200mg)で実施した。Fmoc保護基の切断を、DMF中20%ピペリジン(2mL; 20分間2回)中で実施した。Fmoc-NH-PEG3-COOH(2当量)を、DMF(2mL)中で、45分間、HBTU(1.9当量)及びHOBt(2当量)を活性化剤としてのDIEA(6当量)と共に使用して導入した。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(4当量)は、DMF(2mL)中で45分間、HBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)及びDIEA(12当量)を使用して導入した。3時間室温でのTFA/H2O/TIS 95/2.5/2.5(v/v/v)処理により、ダイマー性鎖を樹脂から切断した。濾液を冷Et2Oにより沈殿させ、5分間3000rpmで、4℃で遠心分離し、溶媒をデカンテーションにより除去した。残渣を冷Et2Oにより洗浄し、更に1回遠心分離し、溶媒をデカンテーションにより除去した。粗製のペプチドを乾燥させ、溶媒A中の溶媒Bの直線勾配(40分で0%から30%)を使用してセミ分取RP-HPLCにより精製すると、ダイマー性PEG鎖1(20mg、23%)が茶色の油として得られた。TR=5.51分(>95%純度[220.8nm]); MS (ESI): C52H96N12O18 ([M+2H]2+/2)の計算値588.35;実測値588.35。
【0147】
モノマー性PEG鎖3
【0148】
【化19】
【0149】
モノマー性鎖は、SPOrT樹脂(0.060mmol、ローディング0.6mmol/g、100mg)で合成した。Fmoc保護基の切断を、DMF中20%ピペリジン(0.5mL; 20分間2回)中で実施した。Fmoc-NH-PEG3-COOH(2当量)を、DMF(0.5mL)中で45分間、HBTU(1.9当量)及びHOBt(2当量)を活性化剤としてのDIEA(6当量)と共に使用して導入した。3時間室温でのTFA/H2O/TIS 95/2.5/2.5(v/v/v)処理により、モノマー性鎖を樹脂から切断した。濾液を冷Et2Oにより沈殿させ、5分間3000rpmで、4℃で遠心分離し、溶媒をデカンテーションにより除去した。残渣を冷Et2Oにより洗浄し、更に1回遠心分離し、溶媒をデカンテーションにより除去した。粗製のペプチドを乾燥させ、溶媒A中の溶媒Bの直線勾配(40分で0%から30%)を使用してセミ分取RP-HPLCにより精製すると、モノマー性PEG鎖3(13.3mg、24%)が茶色の油として得られた。TR=5.48分(>95%純度[220.8nm]); MS (ESI): C36H66N8O13 ([M+2H]2+/2)の計算値409.24;実測値409.24。
【0150】
液相合成-スキーム2
【0151】
【化20】
【0152】
25-クロロ-2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサペンタコサン4
【0153】
【化21】
【0154】
オクタエチレングリコールモノメチルエーテル(3.58g、9.32mmol)をDCM(20mL)及びピリジン(1.5mL)に溶解させた。この溶液に塩化チオニル(1mL)を加え、溶液を40℃で一晩撹拌した。生成物をDCMで抽出し、有機相をHCl(1M)で洗浄し、次いで、NaHCO3の飽和溶液で中和してから、無水MgSO4で乾燥させた。溶液を濾過し、蒸発させると、3.10gの帯黄色の油を与えた(収率=83%)。TLCは、生成物が純粋であることを示した(Rf=0.74、DCM/MeOH、9/1)。生成物を更に精製せずに次の工程に使用した。
【0155】
1,1,2-トリメチル-3-(2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサペンタコサン-25-イル)-1H-ベンゾ[e]インドール-3-イウムヨージド5
【0156】
【化22】
【0157】
4(3.00g、7.46mmol)のI(20mL)溶液に、トリメチル-1H-ベンゾ[e]インドール(2.00、9.57mmol、1.3当量)を加え、それに続いてヨウ化ナトリウム(5.00、33.55mmol、4.5当量)を加えた。溶液を120℃で一晩撹拌した。濃いナイトブルーの溶液を蒸発させ、生成物をDCMで抽出し、有機相を水で3回洗浄してから、無水MgSO4で乾燥させた。溶液を濾過し、蒸発させ、生成物を最低限のアセトンに可溶化させ、エーテルに注いだ。TLCにより生成物が純粋であることが示されるまで、沈殿工程を繰り返した。Rf=0.37(DCM/MeOH、96/4)。2.17gの5が青色の油として得られた(収率=41%)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.10-8.01 (m, 4H, H Ar), 7.73 (t, J = 7.6 Hz, 1H, H Ar), 7.65 (t, J = 7.6 Hz, 1H, H Ar), 5.13 (t, J = 4.9 Hz, 2H, CH2N+), 4.10 (t, J = 4.9 Hz, 2H, CH2 PEG), 3.64-3.53 (m, 22H, CH2 PEG), 3.46 (m, 6H, CH2 PEG), 3.36 (s, 3H, Ome PEG), 3.14 (s, 3H, CH3 インドレニン), 1.86 (s, 6H, 3 CH3). 13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 197.7 (CN+), 138.2 (C Ar), 136.7 (C Ar), 133.6 (C Ar), 131.3 (C Ar), 130.0 (C Ar), 128.4 (C Ar), 127.7 (C Ar), 127.4 (C Ar), 122.7 (C Ar), 113.2 (C Ar), 71.9, 70.5, 70.5, 70.5, 70.5, 70.4, 70.4, 70.3, 70.2, 70.2, 67.3, 58.9, 55.9, 50.5, 30.9, 22.5, 16.5. HRMS (ESI+)、C32H50NO8
+ [M+]の計算値576.3531、実測値576.3524。
【0158】
1,1-ジメチル-3-(2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサペンタコサン-25-イル)-2-((1E, 3E)-4-(N-フェニルアセトアミド)ブタ-1,3-ジエン-1-イル)-1H-ベンゾ[e]インドール-3-イウムヨージド6
【0159】
【化23】
【0160】
5(1.00g、1.42mmol)及びマロンアルデヒドジアニリド塩酸塩(0.40g、1.55mmol、1.1当量)の無水酢酸(10mL)溶液に、1mLの塩化アシルを加えた。溶液を100℃で撹拌してから蒸発させた。粗製物を、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー(DCM/MeOH、9/1)により精製すると、1.00gの6が、黒みがかったシロップとして得られた(収率=80%)。Rf=0.62(DCM/MeOH、9/1)。生成物を更に特性決定せずに次の工程に用いた。
【0161】
2-((1E,3E,5E)-5-(3-(5-カルボキシペンチル)-1,1-ジメチル-1,3-ジヒドロ-2H-ベンゾ[e]インドール-2-イリデン)ペンタ-1,3-ジエン-1-イル)-1,1-ジメチル-3-(2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサペンタコサン-25-イル)-1H-ベンゾ[e]インドール-3-イウムヨージド2
【0162】
【化24】
【0163】
6(1.00g、1.14mmol)及びC6-Indo(K. Kiyose、K. Hanaoka、D. Oushiki、T. Nakamura、M. Kajimura、M. Suematsu、H. Nishimatsu、T. Yamane、T. Terai、Y. Hirataら、J. Am. Chem. Soc. 2010、132、15846～15848頁)(500mg、1.23mmol、1.1当量)をピリジン(15mL)に溶解させ、溶液を60℃で1時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物をDCMで抽出し、有機相をHCl(1M)で洗浄してから、無水MgSO4で乾燥させた。溶液を濾過し、粗製物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー(DCM/MeOH、99/1から85/15)で精製すると、490mgの2が濃紺のシロップとして得られた(収率=40%)。Rf=0.57(DCM/MeOH、9/1)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.42-8.33 (m, 2H, H Ar), 8.19-8.17 (m, 2H, H Ar), 7.95-7.89 (m, 4H, H Ar), 7.60 (dd, J = 9.9, 5.4 Hz, 2H, H Ar), 7.48 (dt, J = 16.8, 8.4 Hz, 3H, H Ar), 7.39-7.37 (m, 1H, H Ar), 6.96-6.90 (m, 1H, H Ar), 6.55-6.52 (m, 1H, H Ar), 6.33 (d, J = 13.6 Hz, 1H, H Ar), 4.51-4.48 (m, 2H, CH2), 4.20-4.16 (m, 2H, CH2), 4.01-3.99 (m, 2H, CH2), 3.65-3.51 (m, 32H, CH2 PEG), 3.37 (s, 3H, Ome PEG), 2.45-2.42 (m, 2H, CH2), 2.10 (s, 12H, 4 CH3), 1.92-1.87 (m, 2H, CH2), 1.78-1.74 (m, 2H, CH2), 1.62-1.58 (m, 2H, CH2). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3): δ 174.8 (CN), 174.1 (CN), 152.8 (CO), 140.0 (C Ar), 139.2 (C Ar), 134.0 (C Ar), 133.7 (C Ar), 131.7 (C Ar), 131.7 (C Ar), 130.5 (C Ar), 130.1 (C Ar), 129.9 (C Ar), 129.9 (C Ar), 128.2 (C Ar), 128.0 (C Ar), 127.7 (C Ar), 127.5 (C Ar), 126.5 (C Ar), 126.5 (C Ar), 125.0 (C Ar), 124.9 (C Ar), 122.3 (C Ar), 111.5 (C Ar), 110.4 (C Ar), 104.0 (C Ar), 103.2 (C Ar), 71.7, 71.0, 70.4, 70.3, 70.3, 70.3, 70.3, 70.3, 70.3, 70.2, 68.3, 59.0, 51.2, 51.2, 51.2, 45.0, 45.0, 45.0, 44.3, 33.9, 27.8 (2 CH3), 27.8 (2 CH3), 27.1 (CH2), 26.2 (CH2), 24.3 (CH2), 24.3 (CH2), 24.3 (CH2). HRMS (ESI) C56H75N2O10 ([M-I-]+)の計算値: 935.5422; 実測値: 935.5393。
【0164】
dCy5.5-PEG(化合物(2)、本発明による、リガンドなし)
【0165】
【化25】
【0166】
ペグ化されたシアニン2(1.9当量、13mg、0.012mmol)及びダイマー性PEG鎖1(1当量、9mg、0.006mmol)を262μLの乾燥DMFに可溶化させた。PyBOP(2当量、6.66mg、0.012mmol)及びDIEA(6当量、6.36μL、0.0385mmol)を混合物に加えた。反応混合物を1時間室温で撹拌した。粗生成物を、溶媒A中の溶媒Bの直線勾配(30分で15%から60%)を使用してセミ分取RP-HPLCにより精製すると、dCy5.5-PEG(16mg、77%)が青色の固体として得られた。TR=14.71分(>95%純度[220.8nm]); MS (ESI): C164H241N16O36 ([M+H]3+/3)の計算値1003.58;実測値1003.58。
【0167】
mCy5.5-PEG(本発明によるものではない)
【0168】
【化26】
【0169】
ペグ化されたシアニン2(1.2当量、9.59mg、0.009mmol)及びモノマー性PEG鎖3(1当量、7mg、0.008mmol)を308μLの乾燥DMFに可溶化させた。PyBOP(1.2当量、4.7mg、0.009mmol)及びDIEA(6当量、7.46μL、0.045mmol)を加え、反応混合物を1時間室温で撹拌した。粗生成物を、溶媒A中の溶媒Bの直線勾配(30分で15%から60%)を使用してセミ分取RP-HPLCにより精製すると、所望の生成物(8.1mg、58%)が青色の固体として得られた。TR=13.15分(>95%純度[220.8nm]); MS (ESI): C92H138N10O22 ([M+H]2+/2)の計算値867.50;実測値867.50。
【0170】
dCy5.5-PEG-CBT(化合物(3)、本発明による、リガンドあり: CBT)
【0171】
【化27】
【0172】
CuSO4(1当量、2.04μmol、20.4μLの0.1M水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム(1.2当量、2.44μmol、24.4μLの0.1M水溶液)、及びTBTA(1.2当量、2.44μmol、24.4μLの0.1M DMF溶液)を、20分の間、室温で、70μLの水/DMF 2/8(v/v)の総体積中で事前活性化した。Lys(N3)-CBT(1.2当量、2.44μmol、2.52mg)及びdCy5.5-PEG(1当量、2.04μmol、6.6mg)を混合物に加え、それに続いて700μLの水/DMF 2/8(v/v)を加えた。反応混合物を3時間37℃で撹拌した。粗生成物を、溶媒A中の溶媒Bの直線勾配(30分で20%から70%)を使用してセミ分取RP-HPLCにより精製すると、所望の生成物(3.5mg、40%)が青色の固体として得られた。TR=14.2分(>95%純度[220.8nm]); HRMS (ESI) C209H309N30O48S ([M+H]3+/3)の計算値: 1346,4127;実測値: 1346.4097。
【0173】
mCy5.5-PEG-CBT(本発明によるものでない)
【0174】
【化28】
【0175】
CuSO4(1当量、3.25μmol、32.5μLの0.1M水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム(1.2当量、3.9μmol、39μLの0.1M水溶液)、及びTBTA(1.2当量、3.9μmol、39μLの0.1M DMF溶液)を、20分の間、室温で、100μLの水/DMF 2/8(v/v)の総体積中で事前活性化した。Lys(N3)-CBT(1.2当量、3.9μmol、4.01mg)及びmCy5.5-PEG(1当量、3.25μmol、6mg)を混合物に加え、それに続いて1100μLの水/DMF 2/8(v/v)を加えた。反応混合物を3時間37℃で撹拌した。粗生成物を、溶媒A中の溶媒Bの直線勾配(40分で20%から70%)を使用してセミ分取RP-HPLCにより精製すると、所望の生成物(4.1mg、44%)が青色の固体として得られた。TR=12.8分(>95%純度[220.8nm]); HRMS (ESI) C137H207N24O34S ([M+2H]3+/3)の計算値: 921,4978;実測値: 921.4959。
【0176】
本発明の化合物(2)及び(3)は、化合物(4)、(5)、(6)及び(7)に関して以下で詳述する通り溶液中で調製もできる。
【0177】
吸収及び蛍光分光法
一般的情報
吸収スペクトルをCary 4000分光光度計(Varian社)で記録し、蛍光スペクトルをFluoromax 3(Jobin Yvon, Horiba社)分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルを、630nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを、機器効果に関して補正した。蛍光量子収量(QY)を、EtOH中のローダミン800を基準として(QY=25%)使用して測定した。
一般的情報
吸収スペクトルをCary 4000分光光度計(Varian社)で記録し、蛍光スペクトルをFluoromax 3(Jobin Yvon, Horiba社)分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルを、630nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを、機器効果に関して補正した。蛍光量子収量(QY)を、EtOH中のローダミン800を基準として(QY=25%)使用して測定した。
【0178】
NIRシアニンの二量体化から生じた蛍光発生性を特性決定するために、ダイマーdCy5.5-PEG及びモノマーmCy5.5-PEGの吸収及び蛍光特性を、異なる極性の溶媒中で評価した。ダイマーとモノマーは両方とも有機溶媒中で高蛍光性であり、蛍光量子収量(QY)は26から59%の範囲であり(Table1(表1))蛍光極大はおよそ710nmに位置する。しかし、水中で蛍光性である(QY=22%)モノマーmCy5.5-PEGとは対照的に、ダイマーdCy5.5-PEGの水性媒体中の蛍光はほとんどなかった(QY=0.4%)。
【0179】
【表1】
【0180】
分子内ダイマーの形成を確認するために、2つの色素の吸収スペクトルを比較した。モノマーは、水及びMeOH中で類似の吸収スペクトルを呈し、吸収極大はおよそ680nmであった。MeOH中のダイマーの吸収スペクトルは、682nmに極大を有するモノマーのものに同一であったが、その水中の吸収スペクトルは629nmでの青色シフトした極大(blue-shifted maximum)及び長波長ショルダーを呈した。この新たなバンドはH-凝集体タイプの非蛍光性分子内ダイマーに帰属することができ、それは、水性媒体中で非常に有利である。実際に、dCy5.5-PEG内の分子内H-凝集体は、MeOHの水への添加と同時に迅速に消失し、それは吸収極大の682nmへのシフト及び蛍光の回復をもたらした。その結果、dCy5.5-PEGは、優れた蛍光発生性を呈し、水中の140倍の有機溶媒中のQYとなった。比較すると、モノマーmCy5.5-PEGは、水と有機溶媒の間のわずか2.7倍未満のQYの差を特徴とする。開放状態である(MeOH中)dCy5.5-PEGの吸収スペクトルは、シアニン2のものと同じであり、ダイマーの吸光係数は、モノマーのおよそ2倍であるはずである。シアニン2の吸光係数を測定するとMeOH中で222000M-1cm-1であったが、これにより、ダイマーdCy5.5-PEGの吸光係数の推定が可能である:222000M-1cm-1×2=444000M-1cm-1。次いで、その強いQY(DMF中56%)を考えると、dCy5.5-PEGは、現在までに報告された最も明るい蛍光発生性NIR色素の1つであるようである。
【0181】
蛍光共焦点顕微鏡法
細胞株、培養条件、及び処理
GFP-融合オキシトシン受容体(GFP-OTR)を発現するHEK293細胞及び野生型HEK293細胞を、10%の熱非働化ウシ胎児血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、及びGFP-OTR細胞のための50μg/mLのハイグロマイシンBを有するイーグル最小必須培地(MEM、Invitrogen 21090)中で、37℃で、加湿された5% CO2雰囲気中で培養した。週に2回培養物の一部の除去及び新鮮な培地との交換により、70～80%細胞コンフルエンスを維持した。共焦点顕微鏡法試験のために、細胞を、35mm ibiTreat Ibidi Polymer Coverslip上に、100000細胞/Ibidiの密度で、顕微鏡法の24時間前に播種した。
細胞株、培養条件、及び処理
GFP-融合オキシトシン受容体(GFP-OTR)を発現するHEK293細胞及び野生型HEK293細胞を、10%の熱非働化ウシ胎児血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、及びGFP-OTR細胞のための50μg/mLのハイグロマイシンBを有するイーグル最小必須培地(MEM、Invitrogen 21090)中で、37℃で、加湿された5% CO2雰囲気中で培養した。週に2回培養物の一部の除去及び新鮮な培地との交換により、70～80%細胞コンフルエンスを維持した。共焦点顕微鏡法試験のために、細胞を、35mm ibiTreat Ibidi Polymer Coverslip上に、100000細胞/Ibidiの密度で、顕微鏡法の24時間前に播種した。
【0182】
共焦点顕微鏡法実験
細胞を、ハンクス平衡塩溶液(HBSS、フェノールレッドなし)で穏やかにすすぐことにより2回洗浄し、次いで、HBSS(1mL)中10nMの蛍光性リガンドの溶液を加え、細胞を5分間室温でインキュベートした。競合実験のために、10nMの蛍光性リガンドと2μMのカルベトシンの混合物を使用した。蛍光共焦点顕微鏡法実験を、HXC PL APO 63x/1.40 OIL CS対物レンズを有するLeica TCS SPE-II顕微鏡で実施した。GFP励起を、488nm 10mWレーザーで実施し、Cy5.5の励起を635nm 18mWレーザーで実施した。画像処理を、ImageJ(Wayne Rasband、National Institute of Mental Health、Bethesda)を使用して進めた。
細胞を、ハンクス平衡塩溶液(HBSS、フェノールレッドなし)で穏やかにすすぐことにより2回洗浄し、次いで、HBSS(1mL)中10nMの蛍光性リガンドの溶液を加え、細胞を5分間室温でインキュベートした。競合実験のために、10nMの蛍光性リガンドと2μMのカルベトシンの混合物を使用した。蛍光共焦点顕微鏡法実験を、HXC PL APO 63x/1.40 OIL CS対物レンズを有するLeica TCS SPE-II顕微鏡で実施した。GFP励起を、488nm 10mWレーザーで実施し、Cy5.5の励起を635nm 18mWレーザーで実施した。画像処理を、ImageJ(Wayne Rasband、National Institute of Mental Health、Bethesda)を使用して進めた。
【0183】
結果
図1に示される通り、dCy5.5-PEG-CBTのわずか10nM溶液の添加は、細胞膜でのOTRを明らかにした。大過剰の非標識CBTリガンドの存在下で実施した競合実験は、蛍光膜染色を示さず、dCy5.5-PEG-CBTと細胞膜との非特異的な相互作用がないこと及びOTRへのその特異的結合を示している。蛍光発生色素を生物学的感知に使用する利点を強調するために、OTR画像化を、500nM濃度の蛍光発生性dCy5.5-PEG-CBT又は非蛍光発生性mCy5.5-PEG-CBTのいずれかの存在下で、非洗浄条件で実施した。それにより、過剰の非結合非蛍光発生性mCy5.5-PEG-CBTは水溶液中で高蛍光性であり、強いバックグラウンドを生じた(図3)。非常に対照的に、dCy5.5-PEG-CBTによる画像のバックグラウンドは全く暗いままであり、これは恐らくは、溶解状態でダイマー性プローブが非蛍光性H-凝集体の形態で存在していたからである。
図1に示される通り、dCy5.5-PEG-CBTのわずか10nM溶液の添加は、細胞膜でのOTRを明らかにした。大過剰の非標識CBTリガンドの存在下で実施した競合実験は、蛍光膜染色を示さず、dCy5.5-PEG-CBTと細胞膜との非特異的な相互作用がないこと及びOTRへのその特異的結合を示している。蛍光発生色素を生物学的感知に使用する利点を強調するために、OTR画像化を、500nM濃度の蛍光発生性dCy5.5-PEG-CBT又は非蛍光発生性mCy5.5-PEG-CBTのいずれかの存在下で、非洗浄条件で実施した。それにより、過剰の非結合非蛍光発生性mCy5.5-PEG-CBTは水溶液中で高蛍光性であり、強いバックグラウンドを生じた(図3)。非常に対照的に、dCy5.5-PEG-CBTによる画像のバックグラウンドは全く暗いままであり、これは恐らくは、溶解状態でダイマー性プローブが非蛍光性H-凝集体の形態で存在していたからである。
【0184】
小動物蛍光画像化
動物
12週齢の妊娠中の雌のSwissマウスをJanvier Laboratories社(France)から購入した。動物を、相対湿度(50±10%)及び12時間明/暗サイクルの制御された環境条件下で(20±2℃)、トウヒ木材チップ(Safe社、villeAugy、France)製で巣材を補った床敷きを有する個別換気ケージ(GM500、Techniplast社)中で維持した。飼料(オートクレーブ飼料、D04、Safe社、France)及び水道水は自由に利用可能であった。動物実験は、the French ministry of agriculture及びthe Ethics local committee for animal experimentation of the Strasbourg University(CREMEAS)の認可の下に、認可番号#11974-2017103010101372で実施した。
動物
12週齢の妊娠中の雌のSwissマウスをJanvier Laboratories社(France)から購入した。動物を、相対湿度(50±10%)及び12時間明/暗サイクルの制御された環境条件下で(20±2℃)、トウヒ木材チップ(Safe社、villeAugy、France)製で巣材を補った床敷きを有する個別換気ケージ(GM500、Techniplast社)中で維持した。飼料(オートクレーブ飼料、D04、Safe社、France)及び水道水は自由に利用可能であった。動物実験は、the French ministry of agriculture及びthe Ethics local committee for animal experimentation of the Strasbourg University(CREMEAS)の認可の下に、認可番号#11974-2017103010101372で実施した。
【0185】
インビボ蛍光生体内分布試験
動物蛍光画像化を、ルミノグラフ(NightOwl、Berthold Technologies社)を使用して実施した。出産の11日後の授乳中のマウスに、腹腔内麻酔をかけた(ケタミン150mg/kg、キシラジン10mg/kg)。非蛍光性カルベトシン(0.9% NaCl中450nmolを含む100μL)有り又は無しの蛍光性化合物(0.9% NaCl中7.5nmolを含む100μL)を静脈内に(尾静脈)投与した。マウスをルミノグラフ内に配置し(プローブの静脈内投与の30分後)、仰向けに置いた。ハロゲンランプ(75W、340～750nm)を使用してマウスを画像化し、色素の発光を、630/700nmフィルターを使用して記録した。実験を3匹のマウスに繰り返した。
動物蛍光画像化を、ルミノグラフ(NightOwl、Berthold Technologies社)を使用して実施した。出産の11日後の授乳中のマウスに、腹腔内麻酔をかけた(ケタミン150mg/kg、キシラジン10mg/kg)。非蛍光性カルベトシン(0.9% NaCl中450nmolを含む100μL)有り又は無しの蛍光性化合物(0.9% NaCl中7.5nmolを含む100μL)を静脈内に(尾静脈)投与した。マウスをルミノグラフ内に配置し(プローブの静脈内投与の30分後)、仰向けに置いた。ハロゲンランプ(75W、340～750nm)を使用してマウスを画像化し、色素の発光を、630/700nmフィルターを使用して記録した。実験を3匹のマウスに繰り返した。
【0186】
結果
図2Aに示される通り、乳腺中の強い蛍光が検出され、標的外シグナルは実質的にごくわずかであるが、肝臓は例外であり、その器官は注射された色素を蓄積すると予測された。OTRの特異的標識を表すために、dCy5.5-PEG-CBTを、60倍過剰の非蛍光性CBTの存在下で注射した(図2B)。その場合、マウスの肝臓のみが蛍光性であり、乳腺は標識されないままであった。乳腺標識の非存在は、腺領域にオキシトシンGPCRを過剰発現するとは予測されていないナイーブマウスにも観察された(図2C)。最後に、モノマー性プローブmCy5.5-PEG-CBTの投与は、強い標的外蛍光をもたらした。これは、等しい強度スケールを使用して画像中に(図2D)見ることができる(最大値は最小値の20倍である)。
図2Aに示される通り、乳腺中の強い蛍光が検出され、標的外シグナルは実質的にごくわずかであるが、肝臓は例外であり、その器官は注射された色素を蓄積すると予測された。OTRの特異的標識を表すために、dCy5.5-PEG-CBTを、60倍過剰の非蛍光性CBTの存在下で注射した(図2B)。その場合、マウスの肝臓のみが蛍光性であり、乳腺は標識されないままであった。乳腺標識の非存在は、腺領域にオキシトシンGPCRを過剰発現するとは予測されていないナイーブマウスにも観察された(図2C)。最後に、モノマー性プローブmCy5.5-PEG-CBTの投与は、強い標的外蛍光をもたらした。これは、等しい強度スケールを使用して画像中に(図2D)見ることができる(最大値は最小値の20倍である)。
【0187】
これらの結果は、インビボ画像化のシグナル対ノイズ比を増加させるために本発明の蛍光発生性ダイマープローブを使用する利点を強調する。
【0188】
結論としては、環境感受性フォールディングを呈する蛍光発生性ダイマーコンセプトは、明るい蛍光発生性NIRプローブが、生きているマウス中の内因性OTRの、特異的で、ノイズのない、前例のない画像化をもたらすことを可能にする。これらの結果は、生きている動物中のGPCRの非侵襲性で非電離の蛍光カートグラフィー(cartography)の魅力的な見通しを広げる。
【0189】
(実施例2)
化学合成
4種の化合物を以下に詳述するように調製した:化合物4及び5(Cy5.5ダイマー、式は以下に詳述する通りである)並びに以下の式を有する化合物A及びB(DY647ダイマー):
化学合成
4種の化合物を以下に詳述するように調製した:化合物4及び5(Cy5.5ダイマー、式は以下に詳述する通りである)並びに以下の式を有する化合物A及びB(DY647ダイマー):
【0190】
【化29】
【0191】
(式中、nは0(化合物A)及び1(化合物B)である)。
【0192】
化合物A及びBは、シアニン誘導体を持たないので本発明の範囲内ではない(DY647ダイマー、比較例)。
【0193】
【化30】
【0194】
スキーム3 溶解状態のダイマー性鎖の合成
【0195】
3,14-ジオキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4,13-ジアザヘプタデカン-17-オイック酸(8)
【0196】
【化31】
【0197】
5(1当量、1.19g、1.17mL、8mmol)のACN(120mL)溶液に、6(1当量、801mg、8mmol)のACN(60mL)溶液を1.3時間にわたり滴加した。混合物を、25℃で21時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。得られた残渣を2:1 v/v DCM/MeOH(120mL)に溶解させた。氷冷水温度の得られた混合物にTEA(2当量、1.62g、2.22mL、16mmol)を加え、7(1.3当量、1.77g、1.48mL、10.4mmol)を滴加した。混合物を25℃で5時間撹拌した。減圧下でエバポレーションの後、飽和NaHCO3水溶液(20mL)を加え、水層をEtOAc(3×15mL)で洗浄した。濃HCl水溶液によりpHを1に調整した。有機層をEtOAc(3×15mL)で抽出し、水で洗浄し(10mL)、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮すると、無色のゲルを与えた(2.04g、67%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.85 (s, 1H), 7.39 - 7.26 (m, 5H), 6.93 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.13 (s, 1H), 5.08 (s, 1H), 3.63 - 3.55 (m, 4H), 3.57 - 3.47 (m, 4H), 3.46 - 3.34 (m, 4H), 2.70 - 2.57 (m, 2H), 2.45 (dt, J = 13.0, 6.0 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 175.54, 172.54, 156.71, 136.55, 128.65, 128.32, 128.24, 70.27, 70.17, 70.10, 69.69, 40.88, 39.50, 31.00, 30.01.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.85 (s, 1H), 7.39 - 7.26 (m, 5H), 6.93 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.13 (s, 1H), 5.08 (s, 1H), 3.63 - 3.55 (m, 4H), 3.57 - 3.47 (m, 4H), 3.46 - 3.34 (m, 4H), 2.70 - 2.57 (m, 2H), 2.45 (dt, J = 13.0, 6.0 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 175.54, 172.54, 156.71, 136.55, 128.65, 128.32, 128.24, 70.27, 70.17, 70.10, 69.69, 40.88, 39.50, 31.00, 30.01.
【0198】
tert-ブチル3,14-ジオキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4,13-ジアザヘプタデカン-17-オエート(9)
【0199】
【化32】
【0200】
8(1当量、680mg、1.78mmol)のDCM(2.34mL)溶液に、tert-ブタノール(2当量、263mg、0.338mL、3.56mmol)、DMAP(0.2当量、43.4mg、0.356mmol)、及びDCC(1.1当量、403mg、1.96mmol)を加えた。混合物を25℃で20時間撹拌した。真空下でエバポレーションの後、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中10～55% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、凍結乾燥後に無色の油を与えた(208mg、27%)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.44 - 7.23 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 3.64 - 3.57 (m, 4H), 3.53 (dt, J = 9.0, 5.5 Hz, 4H), 3.38 - 3.32 (m, 4H), 2.50 (td, J = 6.5, 1.5 Hz, 2H), 2.42 (td, J = 6.5, 1.5 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 174.53, 173.61, 158.86, 138.37, 129.46, 128.98, 128.83, 81.67, 71.28, 70.95, 70.58, 67.43, 41.70, 40.37, 31.68, 31.57, 28.33. HRMS (ESI): C22H34N2O7Na+ [M + Na]+の計算値: 461.2264、実測値461.2272。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.44 - 7.23 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 3.64 - 3.57 (m, 4H), 3.53 (dt, J = 9.0, 5.5 Hz, 4H), 3.38 - 3.32 (m, 4H), 2.50 (td, J = 6.5, 1.5 Hz, 2H), 2.42 (td, J = 6.5, 1.5 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 174.53, 173.61, 158.86, 138.37, 129.46, 128.98, 128.83, 81.67, 71.28, 70.95, 70.58, 67.43, 41.70, 40.37, 31.68, 31.57, 28.33. HRMS (ESI): C22H34N2O7Na+ [M + Na]+の計算値: 461.2264、実測値461.2272。
【0201】
tert-ブチル4-((2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチル)アミノ)-4-オキソブタノエート(10)
【0202】
【化33】
【0203】
9(1当量、173mg、0.395mmol)の無水MeOH(2mL)溶液に、Pd/C(4.54%、19.1mg、0.018mmol)を加えた。混合物をH2(1気圧)下で、25℃で2.5時間撹拌した。混合物を疎水性PTFEシリンジフィルター(細孔:0.22μM、直径:13mm)に通して濾過し、MeOHですすいだ。MeOHを真空下で蒸発させると、無色の油を与えた(126mg、定量的)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.67 - 3.59 (m, 6H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.38 - 3.35 (m, 2H), 2.98 - 2.92 (m, 2H), 2.55 - 2.48 (m, 2H), 2.48 - 2.41 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 174.59, 173.63, 81.69, 71.33, 71.29, 70.78, 70.61, 41.39, 40.31, 31.67, 31.57, 28.32. HRMS (ESI): C14H29N2O5 + [M + H]+の計算値: 305.2076、実測値305.2084。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.67 - 3.59 (m, 6H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.38 - 3.35 (m, 2H), 2.98 - 2.92 (m, 2H), 2.55 - 2.48 (m, 2H), 2.48 - 2.41 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 174.59, 173.63, 81.69, 71.33, 71.29, 70.78, 70.61, 41.39, 40.31, 31.67, 31.57, 28.32. HRMS (ESI): C14H29N2O5 + [M + H]+の計算値: 305.2076、実測値305.2084。
【0204】
tert-ブチル3,14,17,28-テトラオキソ-1-フェニル-2,7,10,21,24-ペンタオキサ-4,13,18,27-テトラアザヘントリアコンタン-31-オエート(11)
【0205】
【化34】
【0206】
10(1当量、64.6mg、0.212mmol)に、8(1当量、81.2mg、0.212mmol)の無水DMF(2.46mL)溶液、PYBOP(1.5当量、165mg、0.318mmol)、及びTEA(5当量、107mg、0.148mL、1.06mmol)を加えた。混合物を25℃で2時間撹拌した。AcOH(4.1当量、50.0μL、0.873mmol)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中の10～65% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、凍結乾燥の後に、無色の油を与えた(37.6mg、26%)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.43 - 7.23 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 3.64 - 3.56 (m, 8H), 3.56 - 3.50 (m, 8H), 3.39 - 3.33 (m, 6H), 3.33 - 3.31 (m, 2H), 2.54 - 2.41 (m, 8H), 1.44 (s, 9H). BRMS (ESI): C32H53N4O11 + [M + H]+の計算値: 669.3711、実測値669.3704。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.43 - 7.23 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 3.64 - 3.56 (m, 8H), 3.56 - 3.50 (m, 8H), 3.39 - 3.33 (m, 6H), 3.33 - 3.31 (m, 2H), 2.54 - 2.41 (m, 8H), 1.44 (s, 9H). BRMS (ESI): C32H53N4O11 + [M + H]+の計算値: 669.3711、実測値669.3704。
【0207】
tert-ブチル1-アミノ-10,13,24-トリオキソ-3,6,17,20-テトラオキサ-9,14,23-トリアザヘプタコサン-27-オエート(12)
【0208】
【化35】
【0209】
11(1当量、35mg、52.3μmol)の無水MeOH(1mL)溶液に、Pd/C(4.54%、2.53mg、2.38μmol)を加えた。混合物をH2(1気圧)下25℃で18時間撹拌した。混合物を疎水性PTFEシリンジフィルター(細孔:0.22μM、直径:13mm)に通して濾過し、MeOHですすいだ。MeOHを真空下で蒸発させると、無色のゲルを与えた(28.7mg、定量的)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.67 - 3.61 (m, 10H), 3.55 (td, J = 5.6, 1.6 Hz, 6H), 3.38 - 3.34 (m, 6H), 3.03 - 2.95 (m, 2H), 2.54 - 2.42 (m, 8H), 1.44 (s, 9H).
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.67 - 3.61 (m, 10H), 3.55 (td, J = 5.6, 1.6 Hz, 6H), 3.38 - 3.34 (m, 6H), 3.03 - 2.95 (m, 2H), 2.54 - 2.42 (m, 8H), 1.44 (s, 9H).
【0210】
tert-ブチルL-リジネート塩酸塩(14)
【0211】
【化36】
【0212】
13(1当量、120mg、322μmol)の無水MeOH(2.5mL)溶液に、Pd/C(3.57%、12.2mg、11.5μmol)を加えた。混合物をH2(1気圧)下25℃で18.5時間撹拌した。混合物をセライトに通して濾過し、MeOHですすいだ。MeOHを真空下で蒸発させると、薄黄色の固体を与えた(80.9mg、定量的)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.39 (dd, J = 7.0, 5.6 Hz, 1H), 2.93 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 - 1.58
(m, 5H), 1.53 - 1.49 (m, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.48 - 1.31 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 175.01, 82.70, 55.23, 40.55, 34.53, 28.45, 28.29, 23.46.
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.39 (dd, J = 7.0, 5.6 Hz, 1H), 2.93 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 - 1.58
(m, 5H), 1.53 - 1.49 (m, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.48 - 1.31 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 175.01, 82.70, 55.23, 40.55, 34.53, 28.45, 28.29, 23.46.
【0213】
tert-ブチル(S)-23-(3,14-ジオキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4,13-ジアザヘプタデカン-17-アミド)-3,14,17-トリオキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4,13,18-トリアザテトラコサン-24-オエート(15)
【0214】
【化37】
【0215】
14(1当量、50.0mg、0.209mmol)に、8(3当量、240mg、0.628mmol)の無水DCM(5.7mL)溶液、TEA(3当量、63.6mg、0.0873mL、0.628mmol)、EDCI(3当量、120mg、0.628mmol)及びHOBt.H2O(0.3当量、9.62mg、0.063mmol)を加えた。混合物を25℃で6.5時間撹拌した。DCM(30mL)を加え、有機層を水(20mL)、飽和NaHCO3水溶液(20mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物を、DCM中5～10% v/v MeOHにより溶出してシリカゲルカラムで精製すると、真空下でエバポレーションの後に、橙色の油を与えた(152mg、78%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 10H), 6.81 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.82 - 5.44 (m, 3H), 5.07 (s, 4H), 4.46 - 4.31 (m, 1H), 3.60 - 3.52 (m, 12H), 3.49 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.42 - 3.33 (m, 8H), 3.30 - 3.17 (m, 1H), 3.15 - 3.04 (m, 1H), 2.62 - 2.39 (m, 8H), 1.81 - 1.68 (m, 1H), 1.66 - 1.53 (m, 1H), 1.50 - 1.44 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.34 - 1.25 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.70, 172.60, 172.37, 172.27, 171.58, 156.64, 136.70, 128.59, 128.18, 81.87, 70.31, 70.09, 69.78, 66.71, 52.51, 40.97, 39.39, 38.76, 31.74, 31.67, 31.59, 31.43, 31.40, 30.99, 28.08, 22.03.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 10H), 6.81 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.82 - 5.44 (m, 3H), 5.07 (s, 4H), 4.46 - 4.31 (m, 1H), 3.60 - 3.52 (m, 12H), 3.49 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.42 - 3.33 (m, 8H), 3.30 - 3.17 (m, 1H), 3.15 - 3.04 (m, 1H), 2.62 - 2.39 (m, 8H), 1.81 - 1.68 (m, 1H), 1.66 - 1.53 (m, 1H), 1.50 - 1.44 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.34 - 1.25 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.70, 172.60, 172.37, 172.27, 171.58, 156.64, 136.70, 128.59, 128.18, 81.87, 70.31, 70.09, 69.78, 66.71, 52.51, 40.97, 39.39, 38.76, 31.74, 31.67, 31.59, 31.43, 31.40, 30.99, 28.08, 22.03.
【0216】
(S)-23-(3,14-ジオキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4,13-ジアザヘプタデカン-17-アミド)-3,14,17-トリオキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4,13,18-トリアザテトラコサン-24-オイック酸(16)
【0217】
【化38】
【0218】
15(1当量、34.1mg、0.037mmol)のDCM(1mL)溶液に、TFA(244当量、666μL、8.966mmol)を加えた。混合物を25℃で6.5時間撹拌した。真空下でエバポレーションの後、H2O(200μL)を加えると、凍結乾燥の後に、薄黄色の油を与えた(33.5mg、定量的)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.40 - 7.23 (m, 10H), 5.07 (s, 4H), 4.40 - 4.31 (m, 1H), 3.63 - 3.49 (m, 16H), 3.37 - 3.31 (m, 8H), 3.16 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.60 - 2.38 (m, 8H), 1.90 - 1.77 (m, 1H), 1.76 - 1.63 (m, 1H), 1.57 - 1.46 (m, 2H), 1.45 - 1.34 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 175.50, 174.78, 158.93, 138.32, 129.46, 128.97, 128.78, 71.24, 71.07, 70.66, 67.43, 53.56, 41.67, 40.32, 40.02, 32.35, 32.19, 32.05, 29.83, 24.12.
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.40 - 7.23 (m, 10H), 5.07 (s, 4H), 4.40 - 4.31 (m, 1H), 3.63 - 3.49 (m, 16H), 3.37 - 3.31 (m, 8H), 3.16 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.60 - 2.38 (m, 8H), 1.90 - 1.77 (m, 1H), 1.76 - 1.63 (m, 1H), 1.57 - 1.46 (m, 2H), 1.45 - 1.34 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 175.50, 174.78, 158.93, 138.32, 129.46, 128.97, 128.78, 71.24, 71.07, 70.66, 67.43, 53.56, 41.67, 40.32, 40.02, 32.35, 32.19, 32.05, 29.83, 24.12.
【0219】
tert-ブチル(S)-9-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3,10,21,24,35-ペンタオキソ-1-フェニル-2,14,17,28,31-ペンタオキサ-4,11,20,25,34-ペンタアザオクタトリアコンタン-38-オエート(18)
【0220】
【化39】
【0221】
17(1当量、10.9mg、0.026mmol)の無水DMF(152μL)溶液に、12(1当量、14mg、0.026mmol)の無水DMF(152μL)溶液、PYBOP(1.5当量、20.4mg、0.039mmol)、及びTEA(5当量、13.2mg、18.2μL、0.131mmol)を加えた。混合物を25℃で4.5時間撹拌した。AcOH(5当量、7.5μL、0.131mmol)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中の10～70% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に無色の油を与えた(15.7mg、64%)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.38 - 7.25 (m, 10H), 5.08 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 4.12 - 3.98 (m, 1H), 3.62 - 3.49 (m, 16H), 3.41 - 3.32 (m, 8H), 3.10 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.54 - 2.40 (m, 8H), 1.82 - 1.58 (m, 2H), 1.54 - 1.46 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.41 - 1.30 (m, 2H). BRMS (ESI): C46H71N6O14 + [M + H]+の計算値: 931.5028、実測値931.5047。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.38 - 7.25 (m, 10H), 5.08 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 4.12 - 3.98 (m, 1H), 3.62 - 3.49 (m, 16H), 3.41 - 3.32 (m, 8H), 3.10 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.54 - 2.40 (m, 8H), 1.82 - 1.58 (m, 2H), 1.54 - 1.46 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.41 - 1.30 (m, 2H). BRMS (ESI): C46H71N6O14 + [M + H]+の計算値: 931.5028、実測値931.5047。
【0222】
tert-ブチル(S)-23-(3,14-ジオキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4,13-ジアザヘプタデカン-17-アミド)-3,14,17,24,35,38,49-ヘプタオキソ-1-フェニル-2,7,10,28,31,42,45-ヘプタオキサ-4,13,18,25,34,39,48-ヘプタアザドペンタコンタン-52-オエート(19)
【0223】
【化40】
【0224】
16(0.978当量、22.4mg、0.026mmol)の無水DMF(152μL)溶液に、12(1当量、14.0mg、0.026mmol)の無水DMF(152μL)溶液、PYBOP(1.5当量、20.4mg、0.039mmol)、及びTEA(5当量、13.2mg、18.2μL、0.131mmol)を加えた。混合物を25℃で4.5時間撹拌した。AcOH(5当量、7.5μL、0.131mmol)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中の10～70% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に無色の油を与えた(13.1mg、37%)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.39 - 7.26 (m, 10H), 5.07 (s, 4H), 4.26 (dd, J = 9.2, 4.8 Hz, 1H), 3.63 - 3.57 (m, 16H), 3.57 - 3.49 (m, 16H), 3.40 - 3.31 (m, 16H), 3.15 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.55 - 2.39 (m, 16H), 1.88 - 1.76 (m, 1H), 1.69 - 1.58 (m, 1H), 1.56 - 1.46 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.41 - 1.32 (m, 2H). BRMS (ESI): C66H108N10O22 2+ [M + 2H]2+/2の計算値: 696.3820、実測値696.3862。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.39 - 7.26 (m, 10H), 5.07 (s, 4H), 4.26 (dd, J = 9.2, 4.8 Hz, 1H), 3.63 - 3.57 (m, 16H), 3.57 - 3.49 (m, 16H), 3.40 - 3.31 (m, 16H), 3.15 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.55 - 2.39 (m, 16H), 1.88 - 1.76 (m, 1H), 1.69 - 1.58 (m, 1H), 1.56 - 1.46 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.41 - 1.32 (m, 2H). BRMS (ESI): C66H108N10O22 2+ [M + 2H]2+/2の計算値: 696.3820、実測値696.3862。
【0225】
tert-ブチル(S)-30,34-ジアミノ-4,15,18,29-テトラオキソ-8,11,22,25-テトラオキサ-5,14,19,28-テトラアザテトラトリアコンタノエート(20)
【0226】
【化41】
【0227】
18(1当量、15.7mg、16.9μmol)の無水MeOH(1mL)溶液に、Pd/C(16.2%、2.9mg、2.73μmol)を加えた。混合物をH2(1気圧)下25℃で3時間撹拌した。混合物を疎水性PTFEシリンジフィルター(細孔:0.22μM、直径:13mm)に通して濾過し、MeOHですすいだ。MeOHを真空下で蒸発させると、無色のゲルを与えた(11.5mg、定量的)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.65 - 3.51 (m, 16H), 3.46 - 3.35 (m, 8H), 2.88 - 2.80 (m, 2H), 2.56 - 2.41 (m, 8H), 1.75 - 1.51 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.43 - 1.32 (m, 2H). BRMS (ESI): C30H59N6O10 + [M + H]+の計算値: 663.4292、実測値663.4307。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 3.65 - 3.51 (m, 16H), 3.46 - 3.35 (m, 8H), 2.88 - 2.80 (m, 2H), 2.56 - 2.41 (m, 8H), 1.75 - 1.51 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.43 - 1.32 (m, 2H). BRMS (ESI): C30H59N6O10 + [M + H]+の計算値: 663.4292、実測値663.4307。
【0228】
tert-ブチル(S)-1-アミノ-19-(4-((2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチル)アミノ)-4-オキソブタンアミド)-10,13,20,31,34,45-ヘキサオキソ-3,6,24,27,38,41-ヘキサオキサ-9,14,21,30,35,44-ヘキサアザオクタテトラコンタン-48-オエート(21)
【0229】
【化42】
【0230】
19(1当量、13.1mg、9.41μmol)の無水MeOH(1mL)溶液に、Pd/C(84.8%、8.5mg、7.99μmol)を加えた。混合物をH2(1気圧)下25℃で4時間撹拌した。混合物を疎水性PTFEシリンジフィルター(細孔:0.22μM、直径:13mm)に通して濾過し、MeOHですすいだ。MeOHを真空下で蒸発させると、無色のゲルを与えた(10.5mg、99%)。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.25 (dd, J = 9.2, 5.0 Hz, 1H), 3.68 - 3.59 (m, 20H), 3.58 - 3.51 (m, 12H), 3.39 - 3.35 (m, 12H), 3.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.06 - 3.00 (m, 4H), 2.55 - 2.42 (m, 16H), 1.89 - 1.76 (m, 1H), 1.70 - 1.59 (m, 1H), 1.56 - 1.46 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.43 - 1.34 (m, 2H). BRMS (ESI): C50H96N10O18 2+ [M + 2H]2+/2の計算値: 562.3452、実測値562.3481。
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.25 (dd, J = 9.2, 5.0 Hz, 1H), 3.68 - 3.59 (m, 20H), 3.58 - 3.51 (m, 12H), 3.39 - 3.35 (m, 12H), 3.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.06 - 3.00 (m, 4H), 2.55 - 2.42 (m, 16H), 1.89 - 1.76 (m, 1H), 1.70 - 1.59 (m, 1H), 1.56 - 1.46 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.43 - 1.34 (m, 2H). BRMS (ESI): C50H96N10O18 2+ [M + 2H]2+/2の計算値: 562.3452、実測値562.3481。
【0231】
【化43】
【0232】
スキーム4 Cy5.5及びDY647ダイマーの合成
【0233】
【化44】
【0234】
20(1当量、0.2mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、22(1.9当量、0.7mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液、PYBOP(2当量、0.3mg、0.65μmol)、及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で3時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中の30～95% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.6mg、67%)。
HRMS (ESI): C142H204N10O28 2+ [M]2+/2の計算値: 1248.7423、実測値1249.2413。
HRMS (ESI): C142H204N10O28 2+ [M]2+/2の計算値: 1248.7423、実測値1249.2413。
【0235】
【化45】
【0236】
21(1当量、0.4mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、22(1.9当量、0.7mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液、PYBOP(2当量、0.3mg、0.65μmol)、及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で3時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中の30～95% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.5mg、48%)。
HRMS (ESI): C162H240N14O36 2+ [M]2+/2の計算値: 1478.8690、実測値1479.3667。
HRMS (ESI): C162H240N14O36 2+ [M]2+/2の計算値: 1478.8690、実測値1479.3667。
【0237】
【化46】
【0238】
20(1当量、0.2mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、23(1.9当量、0.5mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で4.5時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中10～75% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.4mg、61%)。
HRMS (ESI): C98H140N10O26S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 1000.4412、実測値1000.4409。
HRMS (ESI): C98H140N10O26S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 1000.4412、実測値1000.4409。
【0239】
【化47】
【0240】
21(1当量、0.4mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、23(1.9当量、0.5mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で4.5時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中10～75% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.5mg、62%)。
HRMS (ESI): C118H176N14O34S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 1230.5678、実測値1230.5693。
HRMS (ESI): C118H176N14O34S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 1230.5678、実測値1230.5693。
【0241】
吸収及び蛍光分光法
一般的情報
Cy5.5ダイマー
吸収スペクトルをShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルをHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルは、630nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)を、EtOH中のローダミン800を基準として(QY=25%)使用して測定した。[ref] 蛍光発現を、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref A. Alessi、M. Salvalaggio、G. Ruzzon、J. Lumin. 2013、134、385～389頁。
一般的情報
Cy5.5ダイマー
吸収スペクトルをShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルをHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルは、630nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)を、EtOH中のローダミン800を基準として(QY=25%)使用して測定した。[ref] 蛍光発現を、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref A. Alessi、M. Salvalaggio、G. Ruzzon、J. Lumin. 2013、134、385～389頁。
【0242】
DY647ダイマー
吸収スペクトルはShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルはHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルは、600nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)は、MeOH中のDIDを基準として(QY=33%)使用して測定した。[ref] 蛍光発現を、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref I. Texierら、J. Biomed. Opt. 2009、14、054005.
吸収スペクトルはShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルはHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルは、600nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)は、MeOH中のDIDを基準として(QY=33%)使用して測定した。[ref] 蛍光発現を、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref I. Texierら、J. Biomed. Opt. 2009、14、054005.
【0243】
【表2】
【0244】
【表3】
【0245】
結論:
1)Cy5.5フルオロフォアのDy647(負電荷を帯びたフルオロフォア)による置換は、蛍光発現有効性を厳しく減少させる。
2)フルオロフォア部分とリジン部分の間のPEG部分の存在により、より良好な蛍光発現反応を得ることが可能である(Table3(表3)-化合物4及び5)。
1)Cy5.5フルオロフォアのDy647(負電荷を帯びたフルオロフォア)による置換は、蛍光発現有効性を厳しく減少させる。
2)フルオロフォア部分とリジン部分の間のPEG部分の存在により、より良好な蛍光発現反応を得ることが可能である(Table3(表3)-化合物4及び5)。
【0246】
(実施例3)
化合物6及び7並びに比較化合物C及びDは以下の式を有する:
化合物6及び7並びに比較化合物C及びDは以下の式を有する:
【0247】
【化48】
【0248】
(式中、nは0であり(化合物6)、nは1である(化合物7));及び
【0249】
【化49】
【0250】
(式中、nは0であり(化合物C)、nは1である(化合物D))。
【0251】
化学合成
【0252】
【化50】
【0253】
スキーム5 溶解状態のダイマー性鎖の合成。
【0254】
tert-ブチル(S)-9-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3,10-ジオキソ-1-フェニル-2,14,17,20,23-ペンタオキサ-4,11-ジアザヘキサコサン-26-オエート(11)
【0255】
【化51】
【0256】
10(1当量、500.0mg、1.56mmol.)及び9(1当量、644.7mg、1.56mmol.)の無水DMF(15.6mL)溶液に、PYBOP(1.5当量、1.21g、2.33mmol.)を加え、それに続いてDIPEA(5当量、1.00g、1.29mL、7.78mmol.)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。粗製物を蒸発乾固させ、シリカゲル(EtOAc)で精製した:収率90%(1.00g、1.39mmol)。
Rf : 0.15(EtOAc), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 1.32 1.39 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.46 - 1.54 (m, 2H), 1.60 - 1.69 (m, 1H), 1.78 - 1.86 (m, 1H), 2.47 (t, J=6.5, 2H), 3.16 (q, J=6.7, 2H), 3.39 - 3.46 (m, 2H), 3.51 - 3.53 (m, 2H), 3.55 - 3.64 (m, 12H), 3.67 (t, J=6.6, 2H), 4.14 (q, J=7.3, 1H), 5.05 - 5.08 (m, 5H), 5.68 (d, J=8.1, 1H), 6.74 (d, J=5.4, 1H), 7.26 - 7.41 (m, 10H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 22.4, 28.2, 29.5, 32.5, 36.3, 39.4, 40.5, 54.9, 66.7, 66.9, 67.0, 69.7, 70.3, 70.4, 70.5, 70.6, 70.6, 80.7, 128.1, 128.2, 128.2, 128.2, 128.6, 128.6, 136.4, 136.8, 156.3, 156.7, 171.0, 171.8. HRMS (ESI): C37H56N3O11 + [M + H]+の計算値: 718,3909、実測値718.3917。
Rf : 0.15(EtOAc), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 1.32 1.39 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.46 - 1.54 (m, 2H), 1.60 - 1.69 (m, 1H), 1.78 - 1.86 (m, 1H), 2.47 (t, J=6.5, 2H), 3.16 (q, J=6.7, 2H), 3.39 - 3.46 (m, 2H), 3.51 - 3.53 (m, 2H), 3.55 - 3.64 (m, 12H), 3.67 (t, J=6.6, 2H), 4.14 (q, J=7.3, 1H), 5.05 - 5.08 (m, 5H), 5.68 (d, J=8.1, 1H), 6.74 (d, J=5.4, 1H), 7.26 - 7.41 (m, 10H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 22.4, 28.2, 29.5, 32.5, 36.3, 39.4, 40.5, 54.9, 66.7, 66.9, 67.0, 69.7, 70.3, 70.4, 70.5, 70.6, 70.6, 80.7, 128.1, 128.2, 128.2, 128.2, 128.6, 128.6, 136.4, 136.8, 156.3, 156.7, 171.0, 171.8. HRMS (ESI): C37H56N3O11 + [M + H]+の計算値: 718,3909、実測値718.3917。
【0257】
tert-ブチル(S)-18,22-ジアミノ-17-オキソ-4,7,10,13-テトラオキサ-16-アザドコサノエート(12)
【0258】
【化52】
【0259】
11(1当量、1.00g、1.39mmol)の脱気したMeOH(20mL)溶液に、Pd(OH)2(100.0mg)を加えた。懸濁液をH2雰囲気下で一晩撹拌した。粗製物をセライトで濾過し、蒸発乾固させると、標記化合物が作られた:収率99%(621.0mg、1.38mmol)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 1.44 (s, 14H), 1.78 - 1.86 (m, 5H), 2.51 (t, J=6.5, 2H), 2.74 (tq, J=12.7, 6.6, 2H), 3.37 (dd, J=7.6, 5.8, 2H), 3.50 - 3.67 (m, 14H), 3.72 (t, J=6.5, 2H), 7.80 (s, 1H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 23.1, 28.2, 32.3, 35.1, 36.4, 38.9, 41.8, 55.2, 67.1, 70.0, 70.3, 70.4, 70.6, 70.7, 76.8, 77.2, 77.5, 80.7, 171.1, 175.6. HRMS (ESI): C21H44N3O7 + [M + H]+の計算値: 450.3174、実測値450.3191。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 1.44 (s, 14H), 1.78 - 1.86 (m, 5H), 2.51 (t, J=6.5, 2H), 2.74 (tq, J=12.7, 6.6, 2H), 3.37 (dd, J=7.6, 5.8, 2H), 3.50 - 3.67 (m, 14H), 3.72 (t, J=6.5, 2H), 7.80 (s, 1H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 23.1, 28.2, 32.3, 35.1, 36.4, 38.9, 41.8, 55.2, 67.1, 70.0, 70.3, 70.4, 70.6, 70.7, 76.8, 77.2, 77.5, 80.7, 171.1, 175.6. HRMS (ESI): C21H44N3O7 + [M + H]+の計算値: 450.3174、実測値450.3191。
【0260】
tert-ブチル1-[2,6-ビス({3-[2-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)エトキシ]プロパンアミド})ヘキサンアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-オエート(14)
【0261】
【化53】
【0262】
12(1当量、300.0mg、0.67mmol.)及び13(2.1当量、436.3mg、1.40mmol.)の無水DMF(6.7mL)溶液に、PYBOP(3当量、1.04g、2.00mmol.)を加え、それに続いてDIPEA(10当量、862.4mg、1.10mL、6.67mmol.)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。粗製物を蒸発乾固させ、逆相:H2O/CH3CNで精製すると、標記化合物を単離した:収率:71%(489.0mg、0.47mmol)。
Rf : 0.45(DCM/MeOH : 9/1), 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 1.31 - 1.41 (m, 2H), 1.45 - 1.53 (s + m, 11H), 1.58 - 1.67 (m, 1H), 1.74 - 1.83 (m, 1H), 2.41 (t, J=6.2, 2H), 2.45 - 2.50 (m, 4H), 3.15 (t, J=6.9, 2H), 3.27 - 3.31 (m, 3H), 3.33 - 3.37 (m, 3H), 3.50 - 3.54 (m, 6H), 3.57 - 3.63 (m, 20H), 3.67 - 3.74 (m, 6H), 4.31 (dd, J=8.9, 5.3, 1H), 5.07 (大きなs, 4H), 7.08 - 7.58 (m, 10H). 13C NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ 24.2, 28.4, 30.0, 32.9, 37.2, 37.5, 37.7, 40.1, 40.4, 41.7, 54.6, 67.4, 67.9, 68.2, 68.3, 70.5, 70.9, 71.0, 71.2, 71.2, 71.3, 71.3, 71.3, 71.4, 71.5, 71.6, 71.6, 81.7, 128.8, 128.9, 129.0, 129.5, 138.4, 158.9, 172.8, 173.8, 173.9, 174.3. HRMS (ESI): C51H82N5O17 + [M + H]+の計算値: 1036.5718、実測値1036.5700。
Rf : 0.45(DCM/MeOH : 9/1), 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 1.31 - 1.41 (m, 2H), 1.45 - 1.53 (s + m, 11H), 1.58 - 1.67 (m, 1H), 1.74 - 1.83 (m, 1H), 2.41 (t, J=6.2, 2H), 2.45 - 2.50 (m, 4H), 3.15 (t, J=6.9, 2H), 3.27 - 3.31 (m, 3H), 3.33 - 3.37 (m, 3H), 3.50 - 3.54 (m, 6H), 3.57 - 3.63 (m, 20H), 3.67 - 3.74 (m, 6H), 4.31 (dd, J=8.9, 5.3, 1H), 5.07 (大きなs, 4H), 7.08 - 7.58 (m, 10H). 13C NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ 24.2, 28.4, 30.0, 32.9, 37.2, 37.5, 37.7, 40.1, 40.4, 41.7, 54.6, 67.4, 67.9, 68.2, 68.3, 70.5, 70.9, 71.0, 71.2, 71.2, 71.3, 71.3, 71.3, 71.4, 71.5, 71.6, 71.6, 81.7, 128.8, 128.9, 129.0, 129.5, 138.4, 158.9, 172.8, 173.8, 173.9, 174.3. HRMS (ESI): C51H82N5O17 + [M + H]+の計算値: 1036.5718、実測値1036.5700。
【0263】
tert-ブチル1-[2,6-ビス({3-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパンアミド})ヘキサンアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-オエート(15)
【0264】
【化54】
【0265】
14(1当量、480.0mg、0.46mmol.)の脱気したMeOH(10mL)溶液にPd(OH)2(48.0mg)を加えた。懸濁液をH2雰囲気下で一晩撹拌した。粗製物をセライトで濾過し、蒸発乾固させると標記化合物が作られた:収率100%(355.0mg、0.46mmol)。
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 1.23 - 1.33 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.40 - 1.47 (m, 2H), 1.53 - 1.61 (m, 1H), 1.66 - 1.74 (m, 1H), 2.34 - 2.51 (m, 6H), 3.01 - 3.10 (m, 6H), 3.27 - 3.30 (m, 2H), 3.44 - 3.47 (m, 2H), 3.49 - 3.72 (m, 30H), 4.20 (dd, J=8.6, 5.5, 1H). 13C NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ 24.2, 28.4, 30.0, 32.9, 37.2, 37.2, 37.5, 40.1, 40.3, 40.7, 40.8, 54.8, 67.9, 67.9, 68.1, 68.3, 70.6, 71.2, 71.3, 71.3, 71.3, 71.4, 71.5, 81.8, 173.7, 173.9, 173.9, 174.5. HRMS (ESI) : C35H70N5O13 + [M + H]+の計算値: 768.4965、実測値768.4972。
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 1.23 - 1.33 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.40 - 1.47 (m, 2H), 1.53 - 1.61 (m, 1H), 1.66 - 1.74 (m, 1H), 2.34 - 2.51 (m, 6H), 3.01 - 3.10 (m, 6H), 3.27 - 3.30 (m, 2H), 3.44 - 3.47 (m, 2H), 3.49 - 3.72 (m, 30H), 4.20 (dd, J=8.6, 5.5, 1H). 13C NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ 24.2, 28.4, 30.0, 32.9, 37.2, 37.2, 37.5, 40.1, 40.3, 40.7, 40.8, 54.8, 67.9, 67.9, 68.1, 68.3, 70.6, 71.2, 71.3, 71.3, 71.3, 71.4, 71.5, 81.8, 173.7, 173.9, 173.9, 174.5. HRMS (ESI) : C35H70N5O13 + [M + H]+の計算値: 768.4965、実測値768.4972。
【0266】
【化55】
【0267】
スキーム6 Cy5.5ダイマー(化合物6及び7)及びDY647ダイマー(化合物C及びD)の合成。
【0268】
【化56】
【0269】
12(1当量、0.1mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、16(1.9当量、0.7mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液、PYBOP(2当量、0.3mg、0.65μmol)、及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で3時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中の30～95% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.5mg、61%)。
HRMS (ESI): C133H189N7O25 2+ [M]2+の計算値: 2284.3733、実測値2284.3803。
HRMS (ESI): C133H189N7O25 2+ [M]2+の計算値: 2284.3733、実測値2284.3803。
【0270】
【化57】
【0271】
15(1当量、0.3mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、16(1.9当量、0.7mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液、PYBOP(2当量、0.3mg、0.65μmol)、及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で3時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中の30～95% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.6mg、65%)。
HRMS (ESI): C147H215N9O31 2+ [M]2+の計算値: 2602.5524、実測値2602.5580。
HRMS (ESI): C147H215N9O31 2+ [M]2+の計算値: 2602.5524、実測値2602.5580。
【0272】
【化58】
【0273】
12(1当量、0.1mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、17(1.9当量、0.5mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で4.5時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中10～75% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.4mg、69%)。
HRMS (ESI): C89H125N7O23S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 893.8855、実測値893.8863。
HRMS (ESI): C89H125N7O23S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 893.8855、実測値893.8863。
【0274】
【化59】
【0275】
15(1当量、0.3mg、0.33μmol)の無水DMF(50μL)溶液に、17(1.9当量、0.5mg、0.62μmol)の無水DMF(50μL)溶液及びDIPEA(4当量、0.2μL、1.31μmol)を加えた。混合物を25℃で4.5時間撹拌した。H2O(100μL)を加え、粗生成物を、H2O(0.1% v/v TFA)中10～75% v/v ACN(0.1% v/v TFA)の直線勾配を使用して逆相セミ分取HPLCにより精製すると、凍結乾燥後に青色の固体を与えた(0.3mg、44%)。
HRMS (ESI): C103H151N9O29S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 1052.9750、実測値1052.9744。
HRMS (ESI): C103H151N9O29S4 2+ [M+4H]2+/2の計算値: 1052.9750、実測値1052.9744。
【0276】
吸収及び蛍光分光法
一般的情報
Cy5.5ダイマー
吸収スペクトルをShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルをHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルを、630nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)は、EtOH中のローダミン800を基準として(QY=25%)使用して測定した。[ref] 蛍光発現は、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref A. Alessi、M. Salvalaggio、G. Ruzzon、J. Lumin. 2013、134、385～389頁。
一般的情報
Cy5.5ダイマー
吸収スペクトルをShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルをHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルを、630nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)は、EtOH中のローダミン800を基準として(QY=25%)使用して測定した。[ref] 蛍光発現は、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref A. Alessi、M. Salvalaggio、G. Ruzzon、J. Lumin. 2013、134、385～389頁。
【0277】
DY647ダイマー
吸収スペクトルをShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルをHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルは、600nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)は、MeOH中のDIDを基準として使用して(QY=33%)測定した。[ref] 蛍光発現は、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref I. Texierら、J. Biomed. Opt. 2009、14、054005。
吸収スペクトルをShimadzu UV-2700i分光光度計で記録し、蛍光スペクトルをHoriba Fluoromax 4分光蛍光光度計で記録した。蛍光発光スペクトルは、600nm励起波長で、20℃で系統的に記録した。全蛍光スペクトルを機器効果に対して補正した。蛍光量子収量(QY)は、MeOH中のDIDを基準として使用して(QY=33%)測定した。[ref] 蛍光発現は、EtOH中の化合物のQYの水中のQYに対する比として計算した。
Ref I. Texierら、J. Biomed. Opt. 2009、14、054005。
【0278】
【表4】
【0279】
【表5】
【0280】
結論:
1)結果は、フルオロフォア部分とリジン部分の間のPEG部分がより良好な蛍光発現応答を得るために必要ではないことを示す。蛍光発現応答は、PEGリンカー無しでもより良好である(それぞれ化合物6及び7で106対64)。
2)Cy5.5フルオロフォアのDy647(負電荷を帯びたフルオロフォア)による置換は、蛍光発現有効性を厳しく減少させる。
1)結果は、フルオロフォア部分とリジン部分の間のPEG部分がより良好な蛍光発現応答を得るために必要ではないことを示す。蛍光発現応答は、PEGリンカー無しでもより良好である(それぞれ化合物6及び7で106対64)。
2)Cy5.5フルオロフォアのDy647(負電荷を帯びたフルオロフォア)による置換は、蛍光発現有効性を厳しく減少させる。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】