特表 2023-525180 Ｎ‐アシル化ヒスチジンジペプチド抗がん剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-15

(54)【発明の名称】Ｎ‐アシル化ヒスチジンジペプチド抗がん剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 5/062 20060101AFI20230608BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20230608BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230608BHJP

   A61P 15/14 20060101ALI20230608BHJP

【ＦＩ】

C07K5/062

A61K38/05

A61P35/00

A61P15/14

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022523136

(86)(22)【出願日】2020-10-15

(85)【翻訳文提出日】2022-06-14

(86)【国際出願番号】 US2020055707

(87)【国際公開番号】W WO2021076710

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/916,001

(32)【優先日】2019-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】ブルーノ，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】スナイダー，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】スライファ―，テリー

(72)【発明者】

【氏名】リ－プック－タン，ジェニファー

(72)【発明者】

【氏名】グ アーバン，ジジュアン

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA14

4C084BA23

4C084NA14

4C084ZA81

4C084ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA11

4H045EA28

(57)【要約】

式（Ｉ）のＮ‐アシル化ヒスチジンジペプチドが開示される。該化合物は乳がんの治療に有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式

【化1】

（式中、
Ｒ^１はＨ又は（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルであり、
Ｒ^２は（Ｃ_１‐Ｃ_１０）ヒドロカルビルであり、
Ｒ^３は（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルであり、
Ｒ^４は、（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビル；ハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アシル、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルコキシ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）ハロアルコキシ、アミノ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、及び（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルチオの１以上で置換された（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビル；（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）オキサアルキル；（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）チアアルキル、及び（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）アザアルキル、から選択される）
で表される、化合物。

【請求項2】

Ｒ^１はＨである、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｒ^２はエチルであり、かつＲ^３はメチルである、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

Ｒ^２及びＲ^３はいずれもメチルである、請求項１に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ^４は（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）脂肪族炭化水素である、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ^４は直鎖の（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）アルキルである、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ^１はＨであり、かつＲ^４は（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）アルキルである、請求項４に記載の化合物。

【請求項8】

Ｎ‐［Ｎ‐（１‐オキソヘキサデシル）‐Ｌ‐ヒスチジル］‐Ｌ‐バリン、
Ｎ‐［Ｎ‐（１‐オキソヘキサデシル）‐Ｌ‐ヒスチジル］‐Ｌ‐イソロイシン、
Ｎ‐［Ｎ‐（１‐オキソヘキサデシル）‐Ｌ‐ヒスチジル］‐Ｌ‐バリンエチルエステル、
Ｎ‐［Ｎ‐（１‐オキソヘキサデシル）‐Ｄ‐ヒスチジル］‐Ｄ‐バリン、又は
Ｎ‐［Ｎ‐（１‐オキソヘキサデシル）‐Ｄ‐ヒスチジル］‐Ｄ‐バリンエチルエステル
を含む、請求項１に記載の化合物。

【請求項9】

薬学的に許容可能な担体と、請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物又は前記化合物のうち任意の２以上の組み合わせとを含む、医薬組成物。

【請求項10】

治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の、請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物若しくは前記化合物のうち任意の２以上の組み合わせ、又は請求項９に記載の医薬組成物を、投与することを含む、乳がんの治療方法。

【請求項11】

乳がんの治療に使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物又は前記化合物のうち任意の２以上の組み合わせ。

【請求項12】

乳がんの治療用医薬の製造における、請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物又は前記化合物のうち任意の２以上の組み合わせの使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，００１号に基づく優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６２／９１６，００１号の全内容は参照により本出願に組み込まれる。

【0002】

［連邦政府資金による研究］
本発明は、米国国立衛生研究所との契約ＧＭ０６２４８０及びＨＧ００７７３５の下に政府の支援を得て行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

【0003】

［分野］
本開示は、がん、特に乳がんの治療に有用なＮ‐アシル化ヒスチジンジペプチド及びその誘導体に関する。

【0004】

［背景］
乳がんは、生存率は高いものの、女性が罹患する未だ最も一般的ながんである。米国内だけでも、２０１９年には２７１，２７０人の新たな乳がん患者が生じたと推定され、また同年にこの疾患で４２，２６０人が死亡したと推定されている。乳がんの治療は、腫瘍の病期、大きさ、及び患者の選択などの要因に応じて様々である。大多数の治療には放射線療法を伴う乳房温存手術又は乳房切除術が必要であるが、早期の（ステージＩ及びＩＩの）がんのおよそ３５％では治療に薬物療法（標的療法及び／又は非標的療法）が含まれることになる。ステージＩＩＩ及びＩＶの乳がんでは、少なくとも５８％が薬物療法と手術及び／又は放射線療法とを組み合わせて治療される。効能がより大きい、及び／又は毒性がより低い、乳がんを治療するための小分子治療法が必要とされている。

【0005】

［概要］
１つの態様では、本開示は式Ｉ

【化1】

の化合物に関し、上記式中、
Ｒ^１はＨ又は（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルであり、
Ｒ^２は（Ｃ_１‐Ｃ_１０）ヒドロカルビルであり、
Ｒ^３は（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルであり、
Ｒ^４は、（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビル、（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビルが、ハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アシル、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルコキシ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）ハロアルコキシ、アミノ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、及び（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルチオのうち１以上で置換された置換体、（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）オキサアルキル、（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）チアアルキル並びに（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）アザアルキル、から選択される。

【0006】

別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能な担体及び式Ｉの化合物を含んでいる医薬組成物に関する。

【0007】

別の態様では、本開示は、治療を必要とする哺乳動物に対して治療上有効な量の式Ｉの化合物を投与することを含む、乳がんを治療する方法に関する。

【0008】

別の態様では、本開示は、乳がんの治療に使用するための式Ｉの化合物に関する。

【0009】

別の態様では、本開示は、乳がんの治療のための医薬の製造における式Ｉの化合物の使用に関する。

【0010】

本開示の上記及びその他の特徴、態様、及び利点は、以降の詳細な説明を添付図面と併せて読めば一層よく理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を用いたＭＢＣ０１７の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７を、表示した濃度でトリプルネガティブのヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔは、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングして図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得るために使用した。データは正確なＩＣ５０値を計算するには不十分であった。

【0012】

【図2】ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を用いたＭＢＣ０１７１の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７１を、表示した濃度でトリプルネガティブのヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0013】

【図3】ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を用いたＭＢＣ０１７２の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７２を、表示の濃度でトリプルネガティブのヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0014】

【図4】ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を用いたＭＢＣ０１７４の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７４を、表示の濃度でトリプルネガティブのヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0015】

【図5】ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でトリプルネガティブのヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0016】

【図6】ＭＥＧＭ培地においてｈＴＥＲＴ‐ＨＭＥ１細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、成長因子豊富なＭＥＧＭ培地において表示の濃度で健康なヒト乳房上皮細胞ｈＴＥＲＴ‐ＨＭＥ１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0017】

【図7】ＭＥＧＭ培地においてＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、成長因子豊富なＭＥＧＭ培地において表示の濃度でトリプルネガティブのヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0018】

【図8】ＭＣＦ７細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でエストロゲン受容体陽性のヒト乳がん細胞ＭＣＦ７とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0019】

【図9】ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でトリプルネガティブのヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0020】

【図10】ＺＲ‐７５‐３０細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でヒト乳がん細胞ＺＲ‐７５‐３０とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0021】

【図11】Ｋ‐５６２細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度で非付着性細胞株であるヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ‐５６２とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0022】

【図12】ＨＥＰＧ２細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でヒト肝臓癌細胞ＨＥＰＧ２とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0023】

【図13】Ａ５４９細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でヒト肺がん細胞Ａ５４９とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0024】

【図14】ＯＶＣＡＲ‐３細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でヒト卵巣がん細胞ＯＶＣＡＲ‐３とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0025】

【図15】ＳＫ‐Ｎ‐ＳＨ細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でヒト神経芽腫細胞ＳＫ‐Ｎ‐ＳＨとともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0026】

【図16】４Ｔ１細胞を用いたＭＢＣ０１７９の用量反応曲線。化合物ＭＢＣ０１７９を、表示の濃度でトリプルネガティブのマウス乳がん細胞４Ｔ１とともに３７℃で３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ蛍光式細胞生存性アッセイを行った。正規化されて百分率で表わされた細胞生存性データを、３つの生物学的レプリケートから平均値化し、各平均データポイント（白抜きの正方形）について標準誤差をエラーバーで示した。化合物の濃度は、単位をμＭとしてＸ軸上に対数目盛りで表わされている。データは、Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載されるようなＤｒＦｉｔと呼ばれるフリーソフトウェアを使用して分析した。ＤｒＦｉｔを使用して、プロットしたデータポイントをヒル式（赤色の曲線）にフィッティングし、図中に示すＩＣ５０値（μＭ）を得た。

【0027】

【図17】ＭＢＣ０１７９を用いた４Ｔ１マウス乳がん肺転移の検討。化合物ＭＢＣ０１７９（７％（ｗ／ｖ）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ ＥＬ／１０％（ｖ／ｖ）エタノール／９０％（ｖ／ｖ）生理食塩水のビヒクルに含めたもの）又はビヒクル単独を、ネズミ科動物乳がん細胞株４Ｔ１由来の乳房腫瘍を担持している移植後１週間のＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢）に、１群を６匹として３群に、静脈内投与した。ビヒクル（青色の棒）、１０ｍｇ／ｋｇのＭＢＣ０１７９（赤色の棒）又は１５ｍｇ／ｋｇのＭＢＣ０１７９（緑色の棒）を週に２回として４週間投薬した後、マウスをＩＡＣＵＣのガイドラインに従って人道的に安楽死させ、４Ｔ１の肺転移の度合いを知るために４Ｔ１クローン原性アッセイ（colonogenic assay）用に肺を切除した。コロニー計数値をプロットし、平均値化して標準誤差を計算した（エラーバー）。統計的有意差について両側ｔ検定を実施し、ビヒクル群及び１５ｍｇ／ｋｇのＭＢＣ０１７９治療群を比較した。ｐ値を図中に示す。加えて、ビヒクル群と１５ｍｇ／ｋｇのＭＢＣ０１７９治療群との間の肺由来４Ｔ１コロニーの減少率を、各群の平均コロニー計数値に基づいて、ビヒクル群に対して相対値化するかたちで計算して図中に示す。

【0028】

［詳細な説明］
本明細書中に記載された化合物は腫瘍の成長を阻害する。本明細書中に記載された方法に有用な化合物は、式Ｉ

【化2】

に属している。

【0029】

上記化合物において、Ｒ^１はＨ又は（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルであってよい。いくつかの実施形態では、Ｒ^１は水素であり、いくつかの実施形態では、Ｒ^１はメチル又はエチルである。

【0030】

Ｒ^２は（Ｃ_１‐Ｃ_１０）ヒドロカルビルであり、かつＲ^３は（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^２はエチルであり、Ｒ^３はメチルである。他の実施形態では、Ｒ^２及びＲ^３はいずれもメチルである。

【0031】

Ｒ^４は、（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビル、（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビルが、ハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アシル、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルコキシ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）ハロアルコキシ、アミノ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、及び（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルチオのうち１以上で置換された置換体、（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）オキサアルキル、（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）チアアルキル並びに（Ｃ_１０‐Ｃ_２０）アザアルキル、から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ^４は（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）脂肪族炭化水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ^４はフッ素化（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）脂肪族炭化水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ^４は直鎖（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^１はＨであり、かつＲ^４は（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）アルキルである。

【0032】

開示される化合物は、Ｒ^１がアルキルであるときは塩基性であり、Ｒ^１が水素であるときは両性である。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、無機酸及び無機塩基並びに有機酸及び有機塩基などの、薬学的に許容可能な無毒な酸又は塩基から調製された塩を指す。本開示の化合物が塩基性である場合、塩は薬学的に許容可能な無毒な酸から調製可能である。本発明の化合物に適した薬学的に許容可能な酸付加塩には、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸（ベシル酸）、安息香酸、ホウ酸、ラク酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、炭酸、クエン酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、エチレンジアミン四酢酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフチレンスルホン酸、硝酸、オレイン酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、ピバル酸、ポリガラクツロン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、テオクラティック（teoclatic）、ｐ‐トルエンスルホン酸などの付加塩が挙げられる。Ｒ^１がアルキルではない場合、内錯塩に加えて、本発明の化合物に適した薬学的に許容可能な塩基付加塩には、限定するものではないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から作られた金属塩、又は、リジン、アルギニン、Ｎ，Ｎ’‐ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ‐メチルグルカミン）及びプロカインから作られた有機塩が挙げられる。さらなる薬学的に許容可能な塩には、適切であれば、無毒なアンモニウムカチオン並びにカルボン酸、スルホン酸及びホスホン酸アニオンが１～２０個の炭素原子を有するアルキルに結合したものが挙げられる。医薬製剤の調製のために、かつ治療方法に使用するためには薬学的に許容可能な対イオンが好ましいことになるが、他のアニオンも合成中間体としては十分に許容可能である。よってアニオンは、そのような塩が中間体であるときは、薬学的に不適当であってもよい。

【0033】

本明細書全体を通じて、用語及び置換基の定義は保持される。

【0034】

炭化水素とは、水素及び炭素のみを含有する骨格を指す。炭化水素には、アルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール及びこれらの組み合わせが含まれる。例としては、フェニル、ベンジル、フェネチル、シクロヘキシルメチル、カンフォリル、９‐ヘキサデセニル、６‐オクタデセニル、９‐オクタデセニル、９‐エイコセニル、及び１３‐ドコセニルが挙げられる。

【0035】

アルコキシ又はアルコキシルは、直鎖、分岐鎖、環式の構造及びこれらの組み合わせである１～６個の炭素原子の基であって酸素を介して親構造に結合したものを指す。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシなどが挙げられる。

【0036】

オキサアルキルとは、１以上の炭素（及びそこに結合した水素）が酸素に置き換えられたアルキル残基を指す。例としては、３，６，９‐トリオキサデシルなどが挙げられる。オキサアルキルという用語は、該用語が当分野で理解されているような意味である［参照：アメリカ化学会が発行している「Naming and Indexing of Chemical Substances for Chemical Abstracts」の¶１９６、ただし¶１２７（ａ）の制約を受けない］、すなわち、該用語は酸素が単結合によって隣接原子に結合している（エーテル結合を形成している）化合物を指しており、カルボニル基に見られるような二重結合した酸素は指していない。同様に、チアアルキル及びアザアルキルは、１以上の炭素がそれぞれ硫黄又は窒素に置き換えられたアルキル残基を指す。

【0037】

アシルは、直鎖、分岐鎖、環式の構造の、飽和、不飽和及び芳香族、並びにこれらの組み合わせである１、２、３、４、及び５個の炭素原子の基であって、カルボニル官能基によって親構造に結合したものを指す。例としては、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、プロピオニル、イソブチリルなどが挙げられる。

【0038】

アリール及びヘテロアリールとは、５員若しくは６員の、Ｏ、Ｎ、若しくはＳから選択された０～３個のヘテロ原子を含有する芳香環若しくはヘテロ芳香環；二環式の９員若しくは１０員の、Ｏ、Ｎ若しくはＳから選択された０～３個のヘテロ原子を含有する芳香環系若しくはヘテロ芳香環系；又は、三環式の１３員若しくは１４員の、Ｏ、Ｎ、若しくはＳから選択された０～３個のヘテロ原子を含有する芳香環系若しくはヘテロ芳香環系、を意味する。

【0039】

本明細書中に使用されるように、「場合により置換された」という用語は、「非置換の又は置換された」と互換的に使用可能である。「置換された」という用語は、指定された基（group）の中の１以上の水素原子を指定された基（radical）に置き換えることを指す。例えば、置換された（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビルとは、（Ｃ_１４‐Ｃ_２０）ヒドロカルビル残基であって１以上のＨ原子がハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アシル、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルコキシ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）ハロアルコキシ、アミノ、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルアミノ、又は（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキルチオで置き換えられたものを指す。そのような置換されたヒドロカルビル残基の一例は、リシノレイル（すなわち１２‐ヒドロキシ‐９‐オクタデセニル）となろう。ほとんどの「場合により置換された」残基において、１、２又は３個の水素原子が指定された基（radical）に置き換えられているが、フッ化炭化水素残基の場合、４個以上の水素原子がフッ素に置き換えられていることがあり、実際に、全ての置換可能な水素原子がフッ素に置き換えられる、例えばパーフルオロプロピルも考えられる。

【0040】

本明細書中に記載される化合物は少なくとも２個の不斉中心を有し、よって絶対立体化学の面から（Ｒ）‐又は（Ｓ）‐と定義することができるエナンチオマー、ジアステレオマー、及びその他の立体異性体を生じる。本開示は、そのような可能な異性体、並びにそのラセミ体及び光学的に純粋な異性体を全て含むように意図されている。（Ｓ，Ｓ）ジアステレオマーのジペプチド、すなわち２個のＬ‐アミノ酸を含んでいるジペプチドが好ましい。光学活性な（Ｒ）‐及び（Ｓ）‐異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を使用して調製されてもよいし、従来の技法を使用して分離されてもよい。本明細書中に記載された化合物がオレフィン性二重結合又は他の幾何学的不斉中心を有する場合、かつ別段の定めがない限り、該化合物がＥ及びＺ両方の幾何異性体を備えることが意図される。同様に、互変異性体も全て含まれるように意図されている。

【0041】

いくつかの例において、式Ｉの化合物の一部分がアミノ酸から成っていてもよい。アミノ酸は、当業者が従来Ｄ‐異性体及びＬ‐異性体と称してきた異なる立体異性体として存在することができる。アミノ酸のＬ‐異性体は、生細胞によって生産されてタンパク質に組み込まれる異性体である。部分的に１個又は２個のアミノ酸を含んでいる式Ｉのいくつかの化合物では、アミノ酸成分が各々独立に、又は両方のアミノ酸成分が、全部又は大部分（９０％（ｗ／ｖ）超）をＬ‐異性体として存在してもよいし、全部又は大部分をＤ‐異性体として存在してもよい。他の例では、アミノ酸成分が各々独立に、又は両方のアミノ酸成分が、おおむね等しい比率のＬ‐及びＤ‐アイソフォームで存在してもよい。いくつかの例では、一方のアイソフォームは大部分がＬ‐体又はＤ‐体であり、他方は両アイソフォームの混合物として存在する。他の例では、両方のアミノ酸成分がＤ‐体又はＬ‐体であり、他の例では一方がＤ‐体で他方がＬ‐体であってもよい。化合物の特定の作用機構又は有効性の程度若しくは持続期間に限定されるものではないが、天然に存在する細胞内のポリペプチドは主にＬ型構造を備えたアミノ酸で構成されているのに対し、本明細書中に開示されるようにＤ‐体のアミノ酸成分を１又は複数備えている式Ｉの化合物は、Ｄ‐体ではないアミノ酸成分を有する化合物よりもペプチダーゼの作用に対して抵抗力があり、かつしたがって細胞又は生物体への投与時に持続的かつ増強された生理学的効能を示す可能性がある。

【0042】

本明細書中で使用されるように、かつ当業者には理解されるであろうように、「化合物」と言う場合、さらに限定されることが明らかでないかぎり、その化合物の塩を含むように意図される。特定の実施形態では、「式Ｉの化合物」という用語は薬学的に許容可能な塩を指す。

【0043】

本開示の化合物が放射性同位体で標識された形態で存在することができる、すなわち該化合物が、自然界に通常見られる原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有している１以上の原子を含んでいてもよい、ということは認識されるであろう。別例として、単一構造の複数の分子が、自然界に見出される同位体存在比とは異なる同位体存在比で存在する少なくとも１つの原子を備えていてもよい。水素、炭素、リン、フッ素、塩素及びヨウ素の放射性同位体には、例えば、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３６Ｃｌ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ及び^１３３Ｉが挙げられる。これらの放射性同位元素及び／又は他の原子の他の放射性同位体を含んでいる化合物は、本開示の範囲内にある。^３Ｈ、^１４Ｃ及びヨウ素放射性同位体を含んでいる化合物は、調製のしやすさ及び可検出性から特に好ましい。同位体^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ及び^１８Ｆを含有する化合物は、陽電子放射断層撮影法によく適している。本開示の式Ｉ及びＩＩの放射性同位体標識化合物は概して、当業者に良く知られた方法で調製可能である。便利なことに、そのような放射性同位体標識化合物は、放射性同位体で標識されていない試薬の代わりに入手容易な放射性同位体標識試薬を用いることにより、実施例及びスキームに開示された手順を実行して調製することができる。

【0044】

本開示には様々な形態の実施形態が可能であるが、本開示の好ましい実施形態について示す。しかし、当然のことであるが、この開示内容は、本開示の原理の例示と見なされるべきであり、本開示を例証された実施形態に限定するようには意図されていない。

【0045】

さらなる組成物の態様では、本開示は、薬学的に許容可能な担体及び式Ｉの化合物に関する。そのような医薬組成物は、他の抗腫瘍剤及び賦形剤を追加として含んでもよい。該医薬組成物はがんの治療用であって界面活性剤又は錯体を形成するためではないので、一般に銅のような錯化する金属を含まないことになろう。好ましい担体は、水性であって水と不混和性の溶媒を含まないものであろう。担体は、調合物の他の成分と共存可能でありかつ該調合物の被投与者に対して有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。組成物は、経口、局所又は非経口投与向けに調合することができる。例えば、組成物は、静脈内、動脈内、皮下、及び直接ＣＮＳに、すなわち髄腔内又は脳室内のいずれかに、投与することができる。

【0046】

調合物には、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内及び関節内など）、直腸内及び局所（経皮、口腔内、舌下及び眼内など）の投与に適した調合物が挙げられる。化合物は経口又は注射（静脈内又は皮下）によって投与されることが好ましい。患者に投与される化合物の正確な量は担当医師の責任となる。しかしながら、使用される用量は、患者の年齢及び性別、治療されるその病気、並びにその重症度などの多くの要因に応じて様々となろう。同様に、投与経路は身体状態及びその重症度に応じて変化してよい。調合物は、便利なように投薬単位形態で提供可能であり、薬学の分野で良く知られた方法のうち任意の方法で調製可能である。一般に、調合物は、活性成分を液体担体又は微粉固体担体又は両方とともに均一かつ徹底的に合わせ、次いで必要ならばその生成物を成形して所望の調合物とすることにより、調製される。

【0047】

経口投与に適した本開示の調合物は、所定量の活性成分を各々含有しているカプセル剤、カシェ剤若しくは錠剤のような個別の構成単位として；散剤若しくは顆粒剤として；水性の液体若しくは非水性の液体に含めた溶液若しくは懸濁液として；又は、水中油型の乳濁液若しくは油中水型の乳濁液として、提供可能である。活性成分が、巨丸剤、舐剤又はパスタ剤として提供されてもよい。

【0048】

錠剤は、場合により１以上の副成分とともに、圧縮又は型入れ成形（molding）によって作製することができる。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒のような流動性を有する形態の活性成分を、場合により結合剤、潤滑剤、不活性の希釈剤、潤滑性、表面活性剤又は分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することにより調製することができる。湿製錠剤は、湿らせた粉末状の化合物と不活性の液体希釈剤との混合物を適切な機械で型入れ成形することにより作製することができる。錠剤は、場合によりコーティングや割線が施されてもよく、錠剤中の活性成分を持続放出、遅延放出又は制御放出するように調合されてもよい。

【0049】

非経口投与のための調合物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び調合物を対象の被投与者の血液と等張にする溶質を含有することのできる水性及び非水性の無菌の注射用液が挙げられる。非経口投与のための調合物にはさらに、懸濁化剤及び増粘剤を含有することのできる水性及び非水性の無菌の懸濁液も挙げられる。該調合物は、単位用量又は複数回用量の容器、例えば密封したアンプル及びバイアルに入れて提供されてもよいし、使用直前に無菌の液体担体、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などを添加するだけでよいフリーズドライの（凍結乾燥された）状態で保管されてもよい。即席の注射溶液及び懸濁液が、既述した種類の無菌の散剤、顆粒剤及び錠剤から調製されてもよい。好ましい単位投薬調合物は、有効用量の、又は有効用量の何分の１かの妥当な量の、活性成分を含有しているものである。

【0050】

当然のことであるが、具体的に上述された成分に加えて、本開示の調合物は、当の調合物の種類に関する分野において慣例的な他の作用物質を含むことが可能であり、例えば経口投与に適した調合物は香料を含んでもよい。

【0051】

本明細書中で使用されるように、「治療」若しくは「治療すること」、又は「緩和すること」若しくは「好転させること」という用語は、有益な結果又は所望の結果、例えば限定するものではないが治療上の有益性及び／又は予防上の有益性を、獲得するための手法について言及している。治療上の有益性とは、治療対象の根本的疾患の好転を意味する。さらに、治療上の有益性は、根本的疾患に関連した生理学的症状のうち１以上を好転させて、患者がその根本的疾患を依然として患っているとしても患者に改善が観察されるようになることで、達成される。他の例では、式Ｉの化合物は、治療以外の目的で動物若しくはヒト対象者に、又は試料（細胞培養物若しくは他のｉｎ ｖｉｔｒｏの系など）に、投与されてもよい。別の例には、乳がんの治療に使用するための式Ｉの化合物が挙げられる。さらに別の例には、乳がんの治療のための医薬の製造における式Ｉの化合物の使用が挙げられる。いくつかの例では、式Ｉの１つの化合物、又は式Ｉの２以上の化合物の任意の組み合わせが、治療のためか否かは別として、投与されてもよい。

【0052】

該化合物は当分野で良く知られた方法により合成することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３０８６４６号明細書の段落［０１７９］以降に記載された合成でアラニンの代わりにヒスチジンを用いることができる。同様に、式Ｉの他の化合物を、‐ＣＨＲ^２Ｒ^３側鎖を有する他のアミノ酸を利用して合成することができる。

【0053】

試験が行われた式Ｉの化合物のいくつかの例としては、表１において以下のように同定されたものが挙げられる。すなわち表１では、正式な化学名は、試験した各分子について、対応する化合物ＩＤ及びペプチド名ＩＤとともに各行に示されている。各化合物の試験に用いた細胞株及びその結果得られたＩＣ５０値（μＭ）は図面番号の隣に示されており、図面番号はＩＣ５０値を計算するために使用された用量反応データを示している。細胞株の列には、全ての細胞がＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ培地（括弧内に示す）において、かつ明細書本文に記載されたようにして試験されたことが示されている。しかしながら一部の例では、ｈＴＥＲＴ‐ＨＭＥ１細胞及びＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を用いたＭＢＣ０１７９ペプチドの比較について、成長因子豊富なＭＥＧＭ培地中でのインキュベーションによる差を最小限にし、かつ厳密な比較を容易にするために、ＭＥＧＭ培地が使用された。ＭＢＣ０１７の場合、この化合物は細胞生存性を低減したがＩＣ５０の正確な計算を可能にするには不十分であり、計算せず（ＮＣ）と示されている。

【0054】

【表1】

【0055】

≪アッセイ及び試験結果≫

【0056】

市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存性試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ）を使用して、複数のがん細胞株及び健康な組織由来の細胞株に対するいくつかの化合物（１～５）の抗がん有効性を測定した。細胞株については表２に概説する。すなわち表２では、全ての細胞株、並びに各細胞株の起源及び特性についての情報は、ＡＴＣＣ（www.atcc.org）から入手した。慣用名及びＡＴＣＣの製品ＩＤは第１（左端）の列に示されている。左から、第２列及び第３列には各細胞株が単離された生物及び組織が記載されている。第４列及び第５列には、各細胞株の細胞種及び病態（例えば、正常か癌腫か）が示されている。第６列には、各細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存性アッセイを使用してどの化合物を試験したかがまとめられている。ペプチド名ＩＤは、番号１～５の各化合物について括弧内に示されている。

【0057】

【表2】

【0058】

Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ試薬（プロメガ社（Promega, Inc.）から入手可能）は、代謝活性を有する細胞によって変換されて検出可能な蛍光生成物レゾルフィンとなる化合物、レサズリンを含有している緩衝液である。したがって、レゾルフィン生成物の蛍光強度は生細胞の数の相応な尺度としての役割を果たして、細胞毒性薬又は細胞静止薬の添加に反応したがん細胞株又は他の細胞株における細胞生存性の変化をモニタリングすることを可能にする。様々なヒト乳房組織由来の細胞株が、乳がんに対する潜在的治療法の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで検討するために広く使用されている。ヒト乳がん細胞株は、ホルモン受容体の状態すなわちエストロゲン、プロゲステロン及びヒト上皮成長因子について陽性か陰性かに基づいて、グループ分けすることができる。健康なヒト乳房組織由来の細胞株ｈＴＥＲＴ‐ＨＭＥ１は、健康なヒト乳房組織に対する治療薬の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定するために使用することができる。加えて、高転移性かつ悪性度の高いネズミ科動物（マウス）乳がん細胞株４Ｔ１は、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて抗がん治療法の転移抑制の有効性を体系的に調査するために、マウスの乳房脂肪体から肺への乳がん転移のモニタリングに広く使用されてきた。肺への転移は、好都合なことに、十分確立されたクローン原性アッセイにより数値化することができる。乳がん以外の様々ながんを代表する他のヒト組織由来のモデル細胞株を、抗がん治療化合物の潜在力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価するために利用することもできる。これらには、Ｋ‐５６２（慢性骨髄性白血病）、ＨＥＰＧ２（肝細胞癌）、ＯＶＣＡＲ‐３（卵巣腺癌）、ＳＫ‐Ｎ‐ＳＨ（神経芽腫）及びＡ５４９（肺癌）が挙げられる。いくつかの化合物を、ヒト及びネズミ科動物の両方を起源とする一連のがん細胞株、並びに１種類の健康なヒト乳腺細胞株に対して、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ生存性アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した（表１、図１～１６）。マウス４Ｔ１の転移についての検討は、１種類の化合物ＭＢＣ０１７９の転移抑制の潜在力を測定するために実施した（図１７）。

【0059】

≪試薬及び機器≫

【0060】

ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、メチレンブルー、１００×抗生物質／抗真菌剤溶液、コラゲナーゼ（タイプＩＶ）、ＤＮＡｓｅＩ及び６‐チオグアニンは、ミリポア‐シグマ（Millipore-Sigma）から入手可能であった。ペプチド（化合物１～５、表１）は、バイオ・ベーシック社（Bio Basic, Inc.）（カナダ、オンタリオ州）により上述のようにして合成された。ペプチドはＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭとした後に希釈して適切な培地に含めた。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ試薬（プロメガ社）は製造業者の指示に従って使用した。レゾルフィンの蛍光は、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）蛍光プレートリーダ（パーキンエルマー（PerkinElmer））を用いて５６０ｎｍの励起波長及び５８３ｎｍの蛍光波長で計測した。

【0061】

≪細胞株及び培養≫

【0062】

全ての細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手した（www.atcc.org、詳細は表２を参照）。培地及び培地添加物は、サーモフィッシャー・サイエンティフィック（ThermoFisher Scientific）から入手可能であった。別段の定めのないかぎり、細胞は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）の抗生物質／抗真菌剤溶液（１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．０２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ）を添加した培地で単層培養した。ｈＴＥＲＴ‐ＨＭＥ１（及び１件の実験に関してはＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１）細胞は、ＭＥＧＭ（乳腺上皮細胞増殖培地）（ロンザ（Lonza））に１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）の抗生物質／抗真菌剤溶液を添加した培地で培養した。４Ｔ１及びＯＶＣＡＲ‐３細胞は、ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所）１６４０培地に１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）の抗生物質／抗真菌剤溶液を添加した培地で培養した。非接着性の細胞株であるＫ‐５６２細胞は、ＤＭＥＭに１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）の抗生物質／抗真菌剤溶液を添加した培地で、浮遊状態で培養及びアッセイを行った。細胞を、９６ウェルの平底の細胞培養用透明底プレート（１ウェルにつき培地１００μｌ）に細胞４０００個／ウェルとして播種し、３７℃で２４時間増殖を継続させてから薬物又はビヒクルとともにインキュベーションした。

【0063】

≪生存性アッセイ≫

【0064】

播種（第０日）の後に２４時間増殖させてから、同じ組成の培地にビヒクルを加えたもの（１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）又は１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯとしてペプチド（薬物）を様々な濃度（図及び図の凡例に示すとおり）で添加したものに培地交換した。薬物又はビヒクルとのインキュベーションを、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅアッセイの前に３７℃で７２時間継続させた。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ試薬を各ウェルに１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、プレートを３７℃で２時間インキュベーションしてから蛍光を計測した。すべての実験データは３つの生物学的レプリケートから得た結果であり、各々３回繰り返して実施されたもの（３つの技術的レプリケート）である。ベースラインのレゾルフィンの蛍光（細胞を含まない培地）の平均値を、ビヒクル又は薬物が細胞とともに入っている各ウェルから差し引いた。補正された蛍光信号を次に、ビヒクルで処理されたウェルに対して正規化し、正規化した細胞生存性（％）として表現した。データをプロットし、ＤｒＦｉｔソフトウェア（Nature Scientific Reports, 2015, 記事番号14701に記載）を使用してヒル式にカーブフィッティングしてＩＣ_５０値を計算し、３つの生物学的レプリケート全ての平均値及び標準誤差を書き込んだ（図１～１６）。

【0065】

≪４Ｔ１マウス乳がんの転移についての検討≫

【0066】

８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群ｎ＝６として３群、ビヒクル群と２つの薬物治療群）に対し、２５００００個の４Ｔ１細胞を第４鼠径部乳房脂肪体に移植した。細胞移植の１週間後、担体（通常生理食塩水中に７％（ｗ／ｖ）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ及び１０％エタノール）に含めた用量１０ｍｇ／ｋｇ（治療群、群２）及び１５ｍｇ／ｋｇ（治療群、群３）のＭＢＣ０１７９、又は担体のみ（対照群、群１）を週２回静脈内投与した。週に３回、全ての動物について体重を測定して腫瘍をノギスで計測した。移植の５週間後、ＩＡＣＵＣのガイドラインに従って、全ての動物を過量の二酸化炭素への曝露により人道的に安楽死させ、クローン原性アッセイのために肺を切除した。マウスの両肺を取り出してダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ブイダブリューアール（VWR））で洗浄し、鋏で切って小片とし、広口径のピペットによるピペット操作を繰り返すことでさらに細かくして、４ｍｇ／ｍＬのタイプＩＶコラゲナーゼ及び２．５Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩを含有する５ｍＬのＤＰＢＳの中で撹拌しながら３７℃で２時間消化した。試料を４０μｍのセルストレーナでろ過して１０００ｒｐｍで５分間遠心し、１０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、再度遠心し、最後に１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）の抗生物質／抗真菌剤溶液及び６０μＭの６‐チオグアニンを添加した５ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁した（４Ｔ１細胞は６‐チオグアニンに対して抵抗性であるため、６‐チオグアニンを含めることで確実に４Ｔ１のコロニーのみが計数される）。処理された１組の肺（１匹の動物に由来するもの）各々につき、濃縮された細胞５ｍｌを６ウェル細胞培養プレートの第１のウェルへと移し、次に残りの５ウェル各々を用いて１／１０系列希釈して、１ウェルあたり５ｍｌの、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）の抗生物質／抗真菌剤溶液及び６０μＭの６‐チオグアニンが添加されたＤＭＥＭに、含まれるようにした。プレートを３７℃で２週間インキュベーションした後に培地を除去し、５ｍｌのＤＰＢＳで各ウェルを２回洗浄した。次に１ｍｌのメタノールを添加して室温で２０分間置くことにより細胞を固定した。メタノールを取り除き、細胞を１ｍｌのメチレンブルー染色液（０．０３％（ｗ／ｖ）水溶液）とともに１０分間インキュベーションした。次いでプレートを水中に浸すことによりバックグラウンドのメチレンブルーを取り除いて青色染色された４Ｔ１コロニーが見えるようにし、その後該コロニーを計数した。各ウェルのもとの希釈倍率を考慮して、肺１組あたりの４Ｔ１コロニーの総数を計算した。次に上記の計算値を、各治療群又は対照群の全ての被験動物について平均し、計算した標準誤差及び値をプロットした（図１７）。最後に、対照群と治療群との間の変化の統計的有意差を、両側ｔ検定を使用して評価した。

【0067】

≪結果≫

【0068】

表１（及び図１）にまとめたように、Ｎ‐［Ｎ‐（１‐オキソヘキサデシル）‐Ｌ‐ヒスチジル］‐Ｌ‐バリン（１）すなわちＭＢＣ０１７は、３日間のインキュベーション後に、生存可能なトリプルネガティブ（クローディン低発現型）のヒト乳がん細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の割合をビヒクルと比較して用量依存的に低減させた。１２５μＭのＭＢＣ０１７でほぼ４０％の生存性低下が観察されたが、この低下はＩＣ_５０値を正確に計算するには不十分であった。ＭＢＣ０１７の誘導体、すなわちＭＢＣ０１７１、ＭＢＣ０１７２、ＭＢＣ０１７４及びＭＢＣ０１７９もＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞に対する抗がん有効性を示し、それぞれ６７３０μＭ、１３．１μＭ、６２．１μＭ及び１４．７μＭのＩＣ_５０値を達成した（表１、図２～５）。成長因子を添加したＭＥＧＭ培地で正常に増殖させた正常なヒト乳房上皮細胞株ｈＴＥＲＴ‐ＨＭＥ１について化合物ＭＢＣ０１７９を用いて試験した結果、同じ培地中でＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞とともにインキュベーションしたＭＢＣ０１７９のＩＣ_５０（８．８８μＭ、表１、図７）と比較して顕著に高いＩＣ_５０（２７０μＭ、表１、図６）が得られた。このデータは、ＭＢＣ０１７９が正常な乳房上皮と比較して乳房上皮がん細胞の増殖を選択的に阻害することを示している。ＭＢＣ０１７９についてはさらに、その他のヒト乳がん細胞株、すなわちＭＣＦ７（ＥＲ^＋、ルミナールサブタイプ）、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８（トリプルネガティブ、基底サブタイプ）、及びＺＲ‐７５‐３０（ＥＲ＋ＨＥＲ２＋、ルミナールサブタイプ）に対して試験を行ったところ、細胞生存性の用量依存的な低下がみられ、それぞれ３５５μＭ（図８）、１５．７μＭ（図９）及び９．７μＭ（図１０）のＩＣ_５０値が得られた。これらのデータは、ＭＢＣ０１７９が広範囲の乳がん分子サブタイプに対して有効となりうることを強く示唆している。加えて、ＭＢＣ０１７９について、いくつかのヒトのがんのモデル細胞株を用いて細胞生存性の低減についてアッセイしたが、慢性骨髄性白血病に相当する細胞株（Ｋ５６２、図１１、ＩＣ_５０＝６．１１μＭ）、肝臓がんに相当する細胞株（ＨＥＰＧ２、図１２、ＩＣ_５０＝２４．９μＭ）、肺がんに相当する細胞株（Ａ５４９、図１３、ＩＣ_５０＝１０．５μＭ）、卵巣がんに相当する細胞株（ＯＶＣＡＲ‐３、図１４、ＩＣ_５０＝９．２２μＭ）及び神経芽腫に相当する細胞株（ＳＫＮ‐ＳＨ、図１５、ＩＣ_５０＝３５μＭ）であった。これらのデータは幅広い抗がん有効性を実証しており、ＭＢＣ０１７９ががんの種類を選ばない可能性を示唆している。最終的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物ＭＢＣ０１７９の有効性の評価は、高転移性のトリプルネガティブなマウス乳がん細胞株４Ｔ１を用いた用量依存的な生存性実験を最後に実施して、４Ｔ１のｉｎ ｖｉｖｏでのマウス乳がん転移の検討を実行する前に、転移抑制の潜在力を予備的に示した。図１６の用量反応データは、該薬物が有効であろうことを強く示しており（ＩＣ_５０＝２５．５μＭ）、したがってｉｎ ｖｉｖｏでの検討が開始された（結果は下記に述べる）。

【0069】

４Ｔ１乳がん細胞は主としてマウスの乳房脂肪体から肺へと転移するが、４Ｔ１細胞は６‐チオグアニンに対して抵抗性であることから、４Ｔ１の肺転移を計測するためのクローン原性アッセイ（colonogenic assay）が広く採用されてきた。データは３つの検討群（ビヒクル処理群、１０ｍｇ／ｋｇ ＭＢＣ０１７９治療群、及び１５ｍｇ／ｋｇ ＭＢＣ０１７９治療群）から収集したが、各群は６匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウスから成り、マウスには週２回投薬した。各群の平均の４Ｔ１コロニー数をプロットし（図１７）、統計的に有意な肺転移の低減（ｐ＝０．０３、両側ｔ検定）が、ビヒクル群と１５ｍｇ／ｋｇ ＭＢＣ０１７９治療群との間で観察された。加えて、これら２群の間の肺転移の低減率は７４．４％であった（図１７）。全体として、肺転移において用量依存的な低減がみられ、ＭＢＣ０１７９がｉｎ ｖｉｖｏで乳がんの転移を予防することができたこと、及びヒトにおいて同様の治療上の有益性を有しうることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【国際調査報告】