特表2023-525226抗ＩＬ１３Ｒα２抗体、その抗原結合フラグメントおよび使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-15
(54)【発明の名称】抗ＩＬ１３Ｒα２抗体、その抗原結合フラグメントおよび使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230608BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20230608BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230608BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230608BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230608BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230608BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230608BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230608BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230608BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230608BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230608BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230608BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230608BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230608BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230608BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230608BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230608BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230608BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/30 ZNA
C12P21/08
C07K19/00
C07K14/725
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12Q1/04
A61K39/395 U
A61P35/00
A61K38/16
A61K48/00
A61K47/68
A61K35/17
A61K35/15
G01N33/53 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563449
(86)(22)【出願日】2021-05-05
(85)【翻訳文提出日】2022-10-18
(86)【国際出願番号】 SE2021050419
(87)【国際公開番号】W WO2021230792
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】2050572-3
(32)【優先日】2020-05-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522408647
【氏名又は名称】エリセラ セラピューティクス アクチエボラグ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ユー，ディ
(72)【発明者】
【氏名】サレン，ティナ
(72)【発明者】
【氏名】エッサンド，マグナス
(72)【発明者】
【氏名】ペルソン ロソルム，ヘレナ
(72)【発明者】
【氏名】ホフストロム，カミラ
(72)【発明者】
【氏名】アンダーソン，ヤスミン
(72)【発明者】
【氏名】アストルガ ウェルス，ジュアン
(72)【発明者】
【氏名】ルース，アネッテ
(72)【発明者】
【氏名】パロウ，ヴェンデラ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA14
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QQ96
4B063QR48
4B063QS05
4B063QS10
4B063QS33
4B063QS38
4B063QX01
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4B064AG27
4B064CA10
4B064CA20
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4B064DA14
4B065AA26X
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4B065CA25
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4B065CA46
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA53
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C085AA14
4C085BB17
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA70
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＩＬ１３Ｒα２に結合できる抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。抗体およびその抗原結合フラグメントは特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築およびＩＬ１３Ｒα２発現癌疾患の治療のためのＣＡＲに基づく免疫療法において有用である。
【選択図】図１６Ｃ
【選択図】図１６Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）に結合できる、抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６８～７５の第１のβ鎖、前記第１のβ鎖の後のループ、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１０１～１０９の第２のβ鎖、前記第２のβ鎖の前のループ、およびＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１２４～１２８の第３のβ鎖を含むＩＬ１３Ｒα２のβシート領域内のエピトープに対する特異性を有する、抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
ＩＬ１３Ｒα２中の、アミノ酸番号６７～８１、すなわち、ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ（配列番号４４）、アミノ酸番号９６～１０６、すなわち、ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ（配列番号４５）、およびアミノ酸番号１２３～１２８、すなわち、ＷＡＥＴＴＹ（配列番号４６）からなる群より選択される、少なくとも１つのペプチド、好ましくは少なくとも２つのペプチド、およびより好ましくは全ての３つのペプチドを含むエピトープに対する特異性を有する、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
アミノ酸配列ＹＳＰＦＹ（配列番号３）を含む、好ましくはアミノ酸配列ＹＳＰＦＹＭ（配列番号９）を含む、およびより好ましくはアミノ酸配列ＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹ（配列番号１０）を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
アミノ酸配列ＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）を含む、好ましくはアミノ酸配列ＱＱＧＹＳＦＰＰＴ（配列番号１１）を含む、好ましくはその配列からなる可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、請求項１～３のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
アミノ酸配列ＳＧＳＹ（配列番号１）を含む、好ましくはアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＳＹ（配列番号１０５）を含む、好ましくはその配列からなる可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を含む、請求項１～４のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
延長されたＶＨドメインＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳ（配列番号６）を含む、好ましくはその配列からなる、請求項５に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
アミノ酸配列ＹＧＳＧＧＹ（配列番号２）を含む、好ましくはアミノ酸配列ＩＹＧＳＧＧＹＴ（配列番号７）を含む、好ましくはその配列からなる可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含む、請求項１～６のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
延長されたＶＨドメインＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹ（配列番号８）を含む、好ましくはその配列からなる、請求項７に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１２）を含む、好ましくはその配列からなる可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を含む、請求項１～８のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
アミノ酸配列ＡＡＳを含む、好ましくはその配列からなる可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含む、請求項１～９のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）を含む、好ましくはその配列からなる可変重鎖（ＶＨ）ドメイン；およびアミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）を含む、好ましくはその配列からなる可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン
を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項12】
インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）に結合できる抗体、またはその抗原結合フラグメントであって：アミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含み、好ましくはその配列からなる可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）であって、各Ｘｎ、ｎ＝１～４、は、Ｇ、Ａ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
アミノ酸配列ＩＢ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｂ６Ｔを含み、好ましくはその配列からなるＶＨドメインＣＤＲ２であって、各Ｂｍ、ｍ＝１～６、は、Ｇ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される、ＶＨドメインＣＤＲ２；
アミノ酸配列ＡＲ－ＺＨ－Ｚ１ＤＹを含む、好ましくはその配列からなるＶＨドメインＣＤＲ３であって、Ｚ１は、Ｆ、Ｍ、ＩおよびＬからなる群より選択され、ＺＨは、ＶＶＲＳＴＹＧＹ（配列番号１５）、ＹＧＨＹＡＹＧＳＹ（配列番号１６）、ＹＳＳＳＧＷＹＹＧＦ（配列番号１７）、ＴＰＹＳＡＹ（配列番号１８）、ＲＹＲＳＨＲＰＧＬＳ（配列番号１９）、ＦＨＰＲＹＧＹ（配列番号２０）、ＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹ（配列番号２１）、ＹＹＨＹＤＹＧＹＹＹ（配列番号２２）、ＹＳＰＦＹ（配列番号３）、ＲＮＹＷＥＨＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＨＨＹＧＹＹＰＰＧＳＶＹＹ（配列番号２５）、およびＶＥＹＴＹＹＧＳＥＧＳＰＶ（配列番号２６）からなる群より選択されるアミノ酸配列である、ＶＨドメインＣＤＲ３；
アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１２）を含む、好ましくはその配列からなる可変軽鎖（ＶＬ）ドメインＣＤＲ１；
アミノ酸配列ＡＡＳを含む、好ましくはその配列からなるＶＬドメインＣＤＲ２；および
アミノ酸配列ＱＱ－ＺＬ－Ｔを含む、好ましくはその配列からなるＶＬドメインＣＤＲ３であって、ＺＬは、ＴＹＹＳＰＨ（配列番号２８）、ＤＹＹＬＦ（配列番号２９）、ＳＹＳＴＰＹ（配列番号３０）、ＦＹＳＹＰＬ（配列番号３１）、ＡＦＳＰＳ（配列番号３２）、ＳＹＤＴＬＬ（配列番号３３）、ＡＬＳＳＬＰ（配列番号３４）、ＦＳＴＲＬＳ（配列番号３５）、ＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）、ＳＴＹＰＦ（配列番号３７）、ＹＧＳＮＰＬ（配列番号３８）、およびＲＹＮＧＬＦ（配列番号３９）からなる群より選択されるアミノ酸配列である、ＶＬドメインＣＤＲ３、
を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項13】
アミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＭＸ５を含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨ ＣＤＲ１を含み、各Ｘｎ、ｎ＝１～５、は、Ｇ、Ａ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される、請求項１２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項14】
Ｘ５が、ＳまたはＧである、請求項１３に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項15】
アミノ酸配列ＪＩＢ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｂ６ＴＹを含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨ ＣＤＲ２を含み、各Ｂｍ、ｍ＝１～６、は、Ｇ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択されかつＪは、Ａ、Ｙ、ＧおよびＳからなる群より選択される、請求項１２～１４のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項16】
Ｘ１が、ＳまたはＹであり；Ｘ２が、ＳまたはＧであり；
Ｘ３が、ＳまたはＹであり；
Ｘ４が、Ａ、ＹまたはＧである、
請求項１２～１５のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項17】
Ｂ１が、ＳまたはＹであり；Ｂ２が、Ｇであり；
Ｂ３が、Ｓ、ＧまたはＹであり；
Ｂ４が、Ｇであり；
Ｂ５が、ＳまたはＧであり；および
Ｂ６が、ＳまたはＹである、
請求項１２～１６のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項18】
ＺＨ－Ｚ１が、ＹＧＨＹＡＹＧＳＹＦ（配列番号４０）、ＴＰＹＳＡＹＩ（配列番号４１）、ＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹＬ（配列番号４２）、およびＹＳＰＦＹＭ（配列番号９）からなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項１２～１７のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項19】
ＺＬが、ＤＹＹＬＦ（配列番号２９）、ＦＹＳＹＰＬ（配列番号３１）、ＡＬＳＳＬＰ（配列番号３４）、およびＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）からなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項１２～１８のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項20】
配列番号１０１のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨドメインＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、ＡＡＳアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号７６のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ３；または配列番号１０２のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨドメインＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、ＡＡＳアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号７８のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ３；または
配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨドメインＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、ＡＡＳアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号８１のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ３；または
配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨドメインＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、ＡＡＳアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含む、好ましくはその配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含む、請求項１２～１９のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項21】
アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）を含む、好ましくはその配列からなるＶＨドメイン；およびアミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）を含む、好ましくはその配列からなるＶＬドメイン；または
アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＧＨＹＡＹＧＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８６）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメイン；および
アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＤＹＹＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号８７）を含む、好ましくはその配列からなるＶＬドメイン；または
アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＧＳＹＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＧＹＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＰＹＳＡＹＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８８）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメイン；および
アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＹＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号８９）を含む、好ましくはその配列からなるＶＬドメイン；または
アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＧＧＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９０）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメイン；および
アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＬＳＳＬＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号９１）を含む、好ましくはその配列からなるＶＬドメイン；または
アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメイン；および
アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）を含む、好ましくはその配列からなるＶＬドメイン、
を含む、請求項１２～２０のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項22】
前記抗原結合フラグメントが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１～２１のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項23】
薬物としての使用のための請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項24】
神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項25】
請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む抗原認識ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項26】
前記膜貫通ドメインが、表面抗原分類２８（ＣＤ２８）の膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ８αの膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ２７の膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ１３７の膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ１３４の膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ３εの膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ３ζの膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ３γの膜貫通ドメインの全て、または一部、ＣＤ３δの膜貫通ドメインの全て、または一部、ＴＣＲαの膜貫通ドメインの全て、または一部、およびＴＣＲβの膜貫通ドメインの全て、または一部からなる群より選択され、好ましくは前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全て、または一部およびＣＤ８αの膜貫通ドメインの全て、または一部からなる群より選択される、請求項２５に記載のＣＡＲ。
【請求項27】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、表面抗原分類３のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、および／またはＭｙｄ８８からなる群より選択され、好ましくは前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζおよび／またはＣＤ１３７からなる群より選択される、請求項２５または２６に記載のＣＡＲ。
【請求項28】
薬物としての使用のための請求項２５～２７のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項29】
神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項２５～２７のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項30】
請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む抗原認識ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体。
【請求項31】
薬物としての使用のための請求項３０に記載のＴＣＲ複合体。
【請求項32】
神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項３０に記載のＴＣＲ複合体。
【請求項33】
請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント；および
エフェクター分子であって、検出可能標識、細胞毒素、金属、別の抗体またはその抗原結合フラグメント、核酸配列、および脂質二重層ドッキング部分からなる群より好ましくは選択される、エフェクター分子、
を含むコンジュゲート。
【請求項34】
前記エフェクター分子が、細胞毒素である、薬物としての使用のための請求項３３に記載のコンジュゲート。
【請求項35】
前記エフェクター分子が、細胞毒素である、神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項３３に記載のコンジュゲート。
【請求項36】
請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント、請求項２５～２７のいずれかに記載のＣＡＲおよび／または請求項３０に記載のＴＣＲ複合体をコードする核酸分子。
【請求項37】
薬物としての使用のための請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項38】
神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項39】
請求項３６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項40】
薬物としての使用のための請求項３９に記載のベクター。
【請求項41】
神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項３９に記載のベクター。
【請求項42】
請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント、請求項２５～２７のいずれかに記載のＣＡＲ、請求項３０に記載のＴＣＲ複合体、請求項３６に記載の核酸および／または請求項３９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項43】
細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球、およびマクロファージからなる群より選択される、好ましくはＴ細胞である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項44】
薬物としての使用のための請求項４２または４３に記載の細胞。
【請求項45】
神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項４２または４３に記載の細胞。
【請求項46】
請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント、請求項２５～２７のいずれかに記載のＣＡＲ、請求項３０に記載のＴＣＲ複合体、請求項３３に記載のコンジュゲート、請求項３６に記載の核酸分子、請求項３９に記載のベクターおよび／または請求項４２または４３に記載の細胞、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項47】
薬物としての使用のための請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項48】
神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される疾患の治療またはその発症を遅延することにおける使用のための請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項49】
請求項１～２２のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントと生体試料を接触させること；および前記生体試料の少なくとも１つの細胞に結合された、前記抗体、またはその抗原結合フラグメントの量を測定すること、それによりＩＬ１３Ｒα２陽性細胞として前記少なくとも１つの細胞を特定すること、
を含む、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）陽性細胞を特定する方法。
【請求項50】
インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）のエピトープであって、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６８～７５の第１のβ鎖、第１のβ鎖の後のループ、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１０１～１０９の第２のβ鎖、第２のβ鎖の前のループ、およびＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１２４～１２８の第３のβ鎖を含むＩＬ１３Ｒα２のβシート領域内にある、エピトープ。
【請求項51】
ＩＬ１３Ｒα２中の、アミノ酸番号６７～８１、すなわち、ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ（配列番号４４）、アミノ酸番号９６～１０６、すなわち、ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ（配列番号４５）、およびアミノ酸番号１２３～１２８、すなわち、ＷＡＥＴＴＹ（配列番号４６）からなる群より選択される、少なくとも１つのペプチド、好ましくは少なくとも２つのペプチド、およびより好ましくは全ての３つのペプチドを含む、請求項５０に記載のエピトープ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本実施形態は一般に、抗ＩＬ１３Ｒα２抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに特に、癌治療でのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫療法は、癌治療を激変させた。しかし、高悪性度型脳癌である神経膠芽腫は、免疫療法のブレークスルーからまだ利益を得ておらず、この疾患は致死性のままである。癌細胞の表面上で発現される抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにエクスビボで改変された、患者由来のＴ細胞の養子移入は、現在集中的に研究されている免疫療法の一形態である。人工の膜貫通型ＣＡＲ分子は、細胞外の抗原結合部分、通常は抗体由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃｆｖ）、ヒンジ領域、膜貫通ドメインならびにＴ細胞受容体複合体（ＣＤ３ζ）由来であり、および１種または複数のＴ細胞共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ由来である細胞内シグナル伝達ドメインからなる。従って、ＣＡＲ Ｔ細胞治療は、抗体の特異性と、Ｔリンパ球の殺傷効力を組み合わせる。ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、難治性Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に極めて効果的であり、米国および欧州の両方で急性リンパ性白血病および非ホジキンリンパ腫への適用が認可されている。固形腫瘍を標的にするＣＡＲ Ｔ細胞は、まだ認可されていない。ＣＡＲ ＮＫおよびＣＡＲ マクロファージと命名されたＣＡＲ分子を用いてＮＫ細胞およびマクロファージを改変する考え方もまた、探求されてきた。
【0003】
表面抗原分類２１３Ａ２（ＣＤ２１３Ａ２）としても知られる、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ１３Ｒα２）は、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）を結合する膜タンパク質である。ＩＬ１３Ｒα２は、ＩＬ１３Ｒα１（ＣＤ２１３Ａ１）と密接に関係し、これは、インターロイキン－４受容体アルファ（ＩＬ４Ｒα）、ＩＬ－１３およびＩＬ－４受容体により共有されるサブユニット、と受容体複合体を形成する。ＩＬ－１３がＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα受容体複合体に結合すると、ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ６の活性をもたらすシグナル伝達プロセスが開始される。明らかな対照をなして、ＩＬ１３Ｒα２は、モノマーとして高い親和性でＩＬ－１３を結合し、有効な細胞質ドメインを欠き、そのためシグナルメディエーターとして機能しないようである。ＩＬ１３Ｒα２は、精巣および脳下垂体での多少の発現を除き、健全ヒト細胞および組織中ではわずかに発現される。しかし、ＩＬ１３Ｒα２は、神経膠芽腫を含む、これを癌治療の標的にする種々の癌中で選択的に過剰発現されることが明らかになった。
【0004】
ＩＬ１３Ｒα２に対するＣＡＲ Ｔ細胞は、神経膠芽腫の患者について、小さい臨床試験で評価された（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５，２１：４０６２－４０７２）。１人の患者では、治療は、ＩＬ１３Ｒα２陰性腫瘍クローンが成長して元に戻るまで、一定期間にわたり持続的退行をもたらした（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１６，３７５：２５６１－２５６９）。
【0005】
米国特許第９，９１４，９０９号は、ＩＬ１３Ｒα２に結合するＩＬ－１３またはそのバリアント、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を開示する。ＣＡＲ Ｔ細胞は、神経膠芽腫の治療に有用であると言われている。
【0006】
米国特許第９，８６８，７８８号は、ヒトＩＬ１３Ｒα２の細胞外部分およびイヌＩＬ１３Ｒα２と少なくとも９０％の配列同一性を有する細胞外の部分をまたぐ線形エピトープに特異的に結合する抗体を開示する。化学療法剤に結合された抗体は、神経膠芽腫の治療に有用であると言われている。
【0007】
米国特許第１０，３０８，７１９号は、ＩＬ１３Ｒα２およびこの抗体フラグメントを含むＣＡＲ構築物に結合する抗体、およびそのフラグメント、ならびに神経膠芽腫の治療でのそれらの使用を開示する。抗体は、ＩＬ－１３とＩＬ１３Ｒα２との間の相互作用を抑制する。ＩＬ１３Ｒα２のＮ結合型グリコシル化は、ＩＬ１３Ｒα２に対する抗体の相互作用に寄与する。
【0008】
Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００８，７（６）：１５７９－１５８７、は、抗ＩＬ１３Ｒα２（ｓｃＦｖ）－ＰＥ３８免疫毒素を得るために、ヒトｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーと緑膿菌外毒素（ＰＥ）から得られる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）のＩＬ１３Ｒα２に対する融合体を開示する。しかし、得られる免疫毒素は、ＩＬ－１３とＰＥの間の融合体の形態（ＩＬ－１３－ＰＥ３８）で以前に開発された免疫毒素に比べて、より高い抗腫瘍作用を媒介しなかった。これは、標的抗原に対する免疫毒素のｓｃＦｖ部分の低い親和性のためであった。
ＩＬ１３Ｒα２の過剰発現を特徴とする神経膠芽腫および他の癌の治療における改善の必要性がまだ存在する。
ＩＬ１３Ｒα２の過剰発現を特徴とする神経膠芽腫および他の癌の治療における改善の必要性がまだ存在する。
【発明の概要】
【0009】
抗ＩＬ１３Ｒα２抗体およびその抗原結合フラグメントを提供することが、一般的な目的である。
ＣＡＲ系免疫療法で有用なこのような抗ＩＬ１３Ｒα２抗体およびその抗原結合フラグメントを提供することが、特定の目的である。
このおよび他の目的は、本明細書で開示の実施形態により実現される。
本発明は、独立請求項で定められる。本発明のさらなる実施形態は、従属請求項で定められる。
ＣＡＲ系免疫療法で有用なこのような抗ＩＬ１３Ｒα２抗体およびその抗原結合フラグメントを提供することが、特定の目的である。
このおよび他の目的は、本明細書で開示の実施形態により実現される。
本発明は、独立請求項で定められる。本発明のさらなる実施形態は、従属請求項で定められる。
【0010】
実施形態の態様は、ＩＬ１３Ｒα２に結合できる抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６８～７５の第１のβ鎖、第１のβ鎖の後のループ、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１０１～１０９の第２のβ鎖、第２のβ鎖の前のループ、およびＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１２４～１２８の第３のβ鎖を含むＩＬ１３Ｒα２のβシート領域内のエピトープに対して特異性を有する。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６８～７５の第１のβ鎖、第１のβ鎖の後のループ、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１０１～１０９の第２のβ鎖、第２のβ鎖の前のループ、およびＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１２４～１２８の第３のβ鎖を含むＩＬ１３Ｒα２のβシート領域内のエピトープに対して特異性を有する。
【0011】
別の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を含み、各Ｘｎ、ｎ＝１～４、は、Ｇ、Ａ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される。抗体、またはその抗原結合フラグメントはまた、アミノ酸配列ＩＢ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｂ６Ｔを含むＶＨドメインＣＤＲ２を含み、各Ｂｍ、ｍ＝１～６、は、Ｇ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＡＲ－ＺＨ－Ｚ１ＤＹを含むＶＨドメインＣＤＲ３をさらに含み、Ｚ１は、Ｆ、Ｍ、ＩおよびＬからなる群より選択され、ＺＨは、ＶＶＲＳＴＹＧＹ（配列番号１５）、ＹＧＨＹＡＹＧＳＹ（配列番号１６）、ＹＳＳＳＧＷＹＹＧＦ（配列番号１７）、ＴＰＹＳＡＹ（配列番号１８）、ＲＹＲＳＨＲＰＧＬＳ（配列番号１９）、ＦＨＰＲＹＧＹ（配列番号２０）、ＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹ（配列番号２１）、ＹＹＨＹＤＹＧＹＹＹ（配列番号２２）、ＹＳＰＦＹ（配列番号３）、ＲＮＹＷＥＨＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＨＨＹＧＹＹＰＰＧＳＶＹＹ（配列番号２５）、およびＶＥＹＴＹＹＧＳＥＧＳＰＶ（配列番号２６）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１２）を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインＣＤＲ１ならびにアミノ酸配列ＡＡＳを含むＶＬドメインＣＤＲ２をさらに含む。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＱＱ－ＺＬ－Ｔを含むＶＬドメインＣＤＲ３をさらに含み、ＺＬは、ＴＹＹＳＰＨ（配列番号２８）、ＤＹＹＬＦ（配列番号２９）、ＳＹＳＴＰＹ（配列番号３０）、ＦＹＳＹＰＬ（配列番号３１）、ＡＦＳＰＳ（配列番号３２）、ＳＹＤＴＬＬ（配列番号３３）、ＡＬＳＳＬＰ（配列番号３４）、ＦＳＴＲＬＳ（配列番号３５）、ＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）、ＳＴＹＰＦ（配列番号３７）、ＹＧＳＮＰＬ（配列番号３８）、およびＲＹＮＧＬＦ（配列番号３９）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。
【0012】
本発明はまた、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメント、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗原認識ドメインを含むＣＡＲ；本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む抗原認識ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体；ならびに本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントおよびエフェクター分子を含むコンジュゲートに関する。
【0013】
本発明はさらに、ＩＬ１３Ｒα２のエピトープに関する。エピトープは、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６８～７５の第１のβ鎖、第１のβ鎖の後のループ、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１０１～１０９の第２のβ鎖、第２のβ鎖の前のループ、およびＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１２４～１２８の第３のβ鎖を含むＩＬ１３Ｒα２のβシート領域内にある。
【0014】
さらなる態様はまた、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体をコードする核酸分子；核酸分子を含むベクター；本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、核酸および／またはベクターを含む細胞；ならびに、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、コンジュゲート、核酸分子、ベクターおよび／または細胞、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【0015】
本発明はまた、薬物としての使用のための、特にＩＬ１３Ｒα２発現癌疾患を治療するまたは発症を遅らせることにおける使用のための、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、コンジュゲート、核酸分子、ベクター、細胞、および／または医薬組成物に関する。
【0016】
本発明はまた、ＩＬ１３Ｒα２陽性細胞を特定する方法にも関する。方法は、生体試料を本発明に従って、抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させること、および生体試料の少なくとも１つの細胞に結合された抗体、またはその抗原結合フラグメントの量を測定し、それによりＩＬ１３Ｒα２陽性細胞として少なくとも１つの細胞を特定することを含む。
【0017】
実施形態の抗体、およびその抗原結合フラグメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）フォーマットに変換される場合もまた、Ｌ１３Ｒα２上のエピトープに特異的に結合し、かつＩＬ１３Ｒα２に対する高度に特異的で強力な結合を保持する。実施形態の抗体の抗原結合フラグメントに基づくＣＡＲ構築物は、ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法で使用される場合、高い細胞傷害能力を示し、それによりＩＬ１３Ｒα２発現癌の治療で使用できる。
そのさらなる目的および利点と一緒に、いくつかの実施形態は、添付図面とともに、以下の説明を参照することにより最も良く理解され得る。
そのさらなる目的および利点と一緒に、いくつかの実施形態は、添付図面とともに、以下の説明を参照することにより最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）結果を示す。１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖ（Ｂ９ ｓｃＦｖ）およびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（４７ ｓｃＦｖ）の細菌上清を、３種の異なる濃度（２、２０および２００倍希釈）でＥＬＩＳＡにより、ヒトＩＬ１３Ｒα２および無関係タンパク質（ストレプトアビジン）への結合に関しスクリーニングした。２つのコロニー（クローン＿１およびクローン＿２）を、２つのｓｃＦｖのそれぞれについて評価した。ストレプトアビジン特異的ｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１を、参照として含めた。結合を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ抗体により検出し、吸光度値を、４５０ｎｍで測定した（ｙ軸）。報告値は、２回の平均である。また、ブランク値（ｓｃＦｖなしで、培地のみを添加したものから得たシグナル）を、差し引いた。
【図2】均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結果を示す。１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖ（Ｘ－ＭＥ１０７－Ｂ９）およびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（Ｘ－ＭＥ１０７－４７）の細菌上清を、ＨＴＲＦによりＩＬ１３Ｒα２への結合に関してスクリーニングした。無関係のｓｃＦｖを、無関係のタンパク質に結合することが予測される陰性対照として含めた。結合シグナル（６６５ｎｍ）およびバックグラウンド／ノイズシグナル（６１５ｎｍ）を、測定し、シグナルの比率であるＲ値を、各試料について計算した（ｙ軸）。報告値は、２回の平均である。また、ブランク値（ｓｃＦｖなしで、培地のみを添加したものから得たシグナル）を、差し引いた。
【図3-1】４４種の精製Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖのゲル電気泳動法を示す。
【図3-2】４４種の精製Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖのゲル電気泳動法を示す。
【図4】ＥＬＩＳＡ結果を示す。ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（中空バー）、ヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ（黒色バー）、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ（濃い灰色バー）、ヒトＩＬ１３Ｒα１－Ｆｃ（上方向斜縞模様バー）、無関係のタンパク質（中実ドットバー）、およびストレプトアビジン（薄灰色バー）に対する４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン、参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよびＧ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖの４５０ｎｍでの吸光度（ｙ軸）として測定した結合シグナル。
【図5】細胞株へのｓｃＦｖ結合の結果を示す。選択されたｓｃＦｖを、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧ（高レベルのｈＩＬ１３Ｒα２を内因性に発現）、またはヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９（陰性対照として）のいずれかとインキュベートした。細胞を、抗ＦＬＡＧ－ＰＥ抗体でさらに染色し、フローサイトメトリーで分析した。細胞へのｓｃＦｖの結合は、平均蛍光強度（ＭＦＩ、ｙ軸）として示される。
【図6-1】ＩＬ－１３が存在するおよび存在しない場合のＩＬ１３Ｒα２へ結合する１２種のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。また、ストレプトアビジンｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１（陰性対照、ストレプトアビジンに結合すると予測される）のセンサーグラムを含む。精製クローン４７ ｓｃＦｖの活性は、検出されなかった。
【図6-2】ＩＬ－１３が存在するおよび存在しない場合のＩＬ１３Ｒα２へ結合する１２種のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。また、ストレプトアビジンｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１（陰性対照、ストレプトアビジンに結合すると予測される）のセンサーグラムを含む。精製クローン４７ ｓｃＦｖの活性は、検出されなかった。
【図6-3】ＩＬ－１３が存在するおよび存在しない場合のＩＬ１３Ｒα２へ結合する１２種のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。また、ストレプトアビジンｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１（陰性対照、ストレプトアビジンに結合すると予測される）のセンサーグラムを含む。精製クローン４７ ｓｃＦｖの活性は、検出されなかった。
【図6-4】ＩＬ－１３が存在するおよび存在しない場合のＩＬ１３Ｒα２へ結合する１２種のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。また、ストレプトアビジンｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１（陰性対照、ストレプトアビジンに結合すると予測される）のセンサーグラムを含む。精製クローン４７ ｓｃＦｖの活性は、検出されなかった。
【図6-5】ＩＬ－１３が存在するおよび存在しない場合のＩＬ１３Ｒα２へ結合する１２種のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。また、ストレプトアビジンｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１（陰性対照、ストレプトアビジンに結合すると予測される）のセンサーグラムを含む。精製クローン４７ ｓｃＦｖの活性は、検出されなかった。
【図6-6】ＩＬ－１３が存在するおよび存在しない場合のＩＬ１３Ｒα２へ結合する１２種のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。また、ストレプトアビジンｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１（陰性対照、ストレプトアビジンに結合すると予測される）のセンサーグラムを含む。精製クローン４７ ｓｃＦｖの活性は、検出されなかった。
【図6-7】ＩＬ－１３が存在するおよび存在しない場合のＩＬ１３Ｒα２へ結合する１２種のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。また、ストレプトアビジンｓｃＦｖ Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１（陰性対照、ストレプトアビジンに結合すると予測される）のセンサーグラムを含む。精製クローン４７ ｓｃＦｖの活性は、検出されなかった。
【図7-1】エピトープビニング実験のセンサーグラムを示す。１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１固定化表面に注入し、かつ１０倍モル過剰（１００ｎＭ）のヒトＩＬ－１３、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５またはＷ－ＭＥ１０７－１１７とプレインキュベートした。対照試料として、１０倍モル過剰のＢＩ－８ ｓｃＦｖ（陰性対照）またはクローン４７ ｍＩｇＧ１（陽性対照）とプレインキュベートした１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉも評価した。
【図7-2】エピトープビニング実験のセンサーグラムを示す。１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１固定化表面に注入し、かつ１０倍モル過剰（１００ｎＭ）のヒトＩＬ－１３、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５またはＷ－ＭＥ１０７－１１７とプレインキュベートした。対照試料として、１０倍モル過剰のＢＩ－８ ｓｃＦｖ（陰性対照）またはクローン４７ ｍＩｇＧ１（陽性対照）とプレインキュベートした１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉも評価した。
【図8】ＩＬ１３αＲ２に対するＷ－ＭＥ１０７－１１７のＨＤＸ－ＭＳマッピングからの残差プロットを示し、出力図形は、異なる時点を示し、縦線は、ペプチド当りの差異を合計を示す。区画領域中の２つの縦線の間の測定値は、統計的に有意でない（抗原単独間の差異またはｓｃＦｖの存在下での差異は、９５％の信頼水準で反復分散を超えなかった）。
【図9】ＥＬＩＳＡ結果を示す。結合シグナル、４５０ｎｍでの吸光度（ｙ軸）を、ペプチドおよびｈＩＬ１３Ｒα２抗原（ｘ軸）に対しプロットした。Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖ（黒色バー）およびＷ－ＭＥ１０７－７５（灰色バー）の結合は、ｈＩＬ１３Ｒα２に対して唯一検出された。
【図10】ＩＬ－１３（黒色）との複合体中のＩＬ１３Ｒα２（薄灰色、残基３１～３２８）の構造（ＰＤＢコード３ＬＢ６）を示し、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７のエピトープを強調している。ＨＤＸ－ＭＳにより決定されるエピトープ配列は、濃い灰色に着色され、受容体のドメイン１上に位置している。左パネルは、模式図的表現による構造を示し、β鎖は矢印で、およびヘリックスはスパイラルとして表現される。エピトープ配列は、２つのβシート（鎖４、３、６、７）の１つの上に認められ、鎖３、６、７中、および鎖３と４の間および鎖５と６の間のループ領域中の残基を含み、両ループは、ドメイン２に面する。右パネルは、表面表現による構造を示し、ＩＬ－１３は取り除かれ、エピトープ領域がリガンドと相互作用しないことを強調している。ＩＬ－１３結合部位は、黒色円として表される。
【図11】レンチウィルス構築物の略図を示す。ＥＦ１αプロモーターを利用して、選択ｓｃＦｖおよび細胞内Ｔ細胞活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を駆動する。Ｔ２Ａ自己切断ペプチドを用いて、ＣＡＲ構築物および検出のために使用された、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を分離する。
【図12】ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞殺傷結果を示す。ルシフェラーゼ発現Ｕ－８７ＭＧ細胞（ＩＬ１３Ｒα２を発現）またはＭｅｌ５２６細胞（ＩＬ１３Ｒα２を発現していない）を、異なるＣＡＲ Ｔ細胞構築物と共に、０：１～２５：１の範囲の標的に対するエフェクター比率で２４時間共培養した。標的細胞の生存率を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した。共培養物中の標的細胞の相対生存率（ｙ軸）を、未治療対照（腫瘍細胞のみ）と比較して測定した。アッセイを、生物学的および実験的な反復により実施した。値は、平均±ＳＥＭとして示される。
【図13】標的認識時の異なるＣＡＲ Ｔ細胞構築物の増殖を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞を、青紫色素で染色し、４日間Ｕ－８７ＭＧと共培養した。ロバスタチンとの共培養は、非複製対照としての役割をする。標的認識時に複製されたＣＡＲ Ｔ細胞は、細胞分裂の数（０、１、２、３および４またはそれを超える分裂）に従って分類された。図は、分裂中のＣＤ３＋ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。パーセンテージは、各分裂ピーク内の総ＣＤ３＋ＧＦＰ＋集団の％を測定することにより評価された。代表的データを示す。
【図14A】ＨＤＸ－ＭＳにより明らかになったＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５のエピトープ配列を強調する図である。（Ａ）ＩＬ－１３（黒色）との複合体でのＩＬ１３Ｒα２（薄灰色）の構造（ＰＤＢコード３ＬＢ６）は、図１０の視野に比べて１８０度回転されている。エピトープ配列は、番号を付した残基境界と共に濃い灰色に着色され、ドメイン２で始まる１つの配列を除いて、全て、受容体のドメイン３上に位置している。構造は、模式的表現で示される。（Ｂ～Ｅ）は、ＩＬ１３Ｒα２を表面表現で示し、結合データと共にＨＤＸ－ＭＳデータに基づき、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５で予測されるエピトープの差異を強調する。エピトープ領域は、濃い灰色で着色される。ＩＬ－１３（黒色）は、明確にするために、模式的表現のままである。（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７の予測結合領域を示す。（Ｄ）では、Ｗ－ＭＥ１０７－７５の結合領域が、濃い灰色で示される。Ｗ－ＭＥ１０７－７５は、多くの実験でＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７とは異なる挙動を示し、従って異なる結合部位を有すると予測される。エピトープは、受容体の極めてＣ末端部分、残基３２９～３３７を含む。これらの残基は、報告された構造中では見えないが、図では点線として含まれる。それらは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５結合中では重要であると推定される。理由は、それらがマウスＩＬ１３Ｒα２中では非保存であるからである。（Ｅ）ここでは、タンパク質構造は、１８０度回転されており、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７ではエピトープの一部であるがＷ－ＭＥ１０７－７５ではエピトープの一部でない、ペプチド２２８～２４５の始まりは、濃い灰色として見られる。
【図14B】ＨＤＸ－ＭＳにより明らかになったＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５のエピトープ配列を強調する図である。（Ａ）ＩＬ－１３（黒色）との複合体でのＩＬ１３Ｒα２（薄灰色）の構造（ＰＤＢコード３ＬＢ６）は、図１０の視野に比べて１８０度回転されている。エピトープ配列は、番号を付した残基境界と共に濃い灰色に着色され、ドメイン２で始まる１つの配列を除いて、全て、受容体のドメイン３上に位置している。構造は、模式的表現で示される。（Ｂ～Ｅ）は、ＩＬ１３Ｒα２を表面表現で示し、結合データと共にＨＤＸ－ＭＳデータに基づき、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５で予測されるエピトープの差異を強調する。エピトープ領域は、濃い灰色で着色される。ＩＬ－１３（黒色）は、明確にするために、模式的表現のままである。（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７の予測結合領域を示す。（Ｄ）では、Ｗ－ＭＥ１０７－７５の結合領域が、濃い灰色で示される。Ｗ－ＭＥ１０７－７５は、多くの実験でＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７とは異なる挙動を示し、従って異なる結合部位を有すると予測される。エピトープは、受容体の極めてＣ末端部分、残基３２９～３３７を含む。これらの残基は、報告された構造中では見えないが、図では点線として含まれる。それらは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５結合中では重要であると推定される。理由は、それらがマウスＩＬ１３Ｒα２中では非保存であるからである。（Ｅ）ここでは、タンパク質構造は、１８０度回転されており、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７ではエピトープの一部であるがＷ－ＭＥ１０７－７５ではエピトープの一部でない、ペプチド２２８～２４５の始まりは、濃い灰色として見られる。
【図14C】ＨＤＸ－ＭＳにより明らかになったＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５のエピトープ配列を強調する図である。（Ａ）ＩＬ－１３（黒色）との複合体でのＩＬ１３Ｒα２（薄灰色）の構造（ＰＤＢコード３ＬＢ６）は、図１０の視野に比べて１８０度回転されている。エピトープ配列は、番号を付した残基境界と共に濃い灰色に着色され、ドメイン２で始まる１つの配列を除いて、全て、受容体のドメイン３上に位置している。構造は、模式的表現で示される。（Ｂ～Ｅ）は、ＩＬ１３Ｒα２を表面表現で示し、結合データと共にＨＤＸ－ＭＳデータに基づき、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５で予測されるエピトープの差異を強調する。エピトープ領域は、濃い灰色で着色される。ＩＬ－１３（黒色）は、明確にするために、模式的表現のままである。（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７の予測結合領域を示す。（Ｄ）では、Ｗ－ＭＥ１０７－７５の結合領域が、濃い灰色で示される。Ｗ－ＭＥ１０７－７５は、多くの実験でＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７とは異なる挙動を示し、従って異なる結合部位を有すると予測される。エピトープは、受容体の極めてＣ末端部分、残基３２９～３３７を含む。これらの残基は、報告された構造中では見えないが、図では点線として含まれる。それらは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５結合中では重要であると推定される。理由は、それらがマウスＩＬ１３Ｒα２中では非保存であるからである。（Ｅ）ここでは、タンパク質構造は、１８０度回転されており、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７ではエピトープの一部であるがＷ－ＭＥ１０７－７５ではエピトープの一部でない、ペプチド２２８～２４５の始まりは、濃い灰色として見られる。
【図14D】ＨＤＸ－ＭＳにより明らかになったＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５のエピトープ配列を強調する図である。（Ａ）ＩＬ－１３（黒色）との複合体でのＩＬ１３Ｒα２（薄灰色）の構造（ＰＤＢコード３ＬＢ６）は、図１０の視野に比べて１８０度回転されている。エピトープ配列は、番号を付した残基境界と共に濃い灰色に着色され、ドメイン２で始まる１つの配列を除いて、全て、受容体のドメイン３上に位置している。構造は、模式的表現で示される。（Ｂ～Ｅ）は、ＩＬ１３Ｒα２を表面表現で示し、結合データと共にＨＤＸ－ＭＳデータに基づき、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５で予測されるエピトープの差異を強調する。エピトープ領域は、濃い灰色で着色される。ＩＬ－１３（黒色）は、明確にするために、模式的表現のままである。（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７の予測結合領域を示す。（Ｄ）では、Ｗ－ＭＥ１０７－７５の結合領域が、濃い灰色で示される。Ｗ－ＭＥ１０７－７５は、多くの実験でＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７とは異なる挙動を示し、従って異なる結合部位を有すると予測される。エピトープは、受容体の極めてＣ末端部分、残基３２９～３３７を含む。これらの残基は、報告された構造中では見えないが、図では点線として含まれる。それらは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５結合中では重要であると推定される。理由は、それらがマウスＩＬ１３Ｒα２中では非保存であるからである。（Ｅ）ここでは、タンパク質構造は、１８０度回転されており、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７ではエピトープの一部であるがＷ－ＭＥ１０７－７５ではエピトープの一部でない、ペプチド２２８～２４５の始まりは、濃い灰色として見られる。
【図14E】ＨＤＸ－ＭＳにより明らかになったＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５のエピトープ配列を強調する図である。（Ａ）ＩＬ－１３（黒色）との複合体でのＩＬ１３Ｒα２（薄灰色）の構造（ＰＤＢコード３ＬＢ６）は、図１０の視野に比べて１８０度回転されている。エピトープ配列は、番号を付した残基境界と共に濃い灰色に着色され、ドメイン２で始まる１つの配列を除いて、全て、受容体のドメイン３上に位置している。構造は、模式的表現で示される。（Ｂ～Ｅ）は、ＩＬ１３Ｒα２を表面表現で示し、結合データと共にＨＤＸ－ＭＳデータに基づき、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５で予測されるエピトープの差異を強調する。エピトープ領域は、濃い灰色で着色される。ＩＬ－１３（黒色）は、明確にするために、模式的表現のままである。（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７の予測結合領域を示す。（Ｄ）では、Ｗ－ＭＥ１０７－７５の結合領域が、濃い灰色で示される。Ｗ－ＭＥ１０７－７５は、多くの実験でＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７とは異なる挙動を示し、従って異なる結合部位を有すると予測される。エピトープは、受容体の極めてＣ末端部分、残基３２９～３３７を含む。これらの残基は、報告された構造中では見えないが、図では点線として含まれる。それらは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５結合中では重要であると推定される。理由は、それらがマウスＩＬ１３Ｒα２中では非保存であるからである。（Ｅ）ここでは、タンパク質構造は、１８０度回転されており、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７ではエピトープの一部であるがＷ－ＭＥ１０７－７５ではエピトープの一部でない、ペプチド２２８～２４５の始まりは、濃い灰色として見られる。
【図15A】改変ＣＡＲ Ｔ細胞のプロファイリングおよびキャラクタリゼーションを示す。（Ａ）は、非刺激対照（モック）ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞の培地中へのＩＦＮγ分泌を示す。
【図15B】改変ＣＡＲ Ｔ細胞のプロファイリングおよびキャラクタリゼーションを示す。（Ｂ）は、Ｕ８７ＵＵまたはＵ３４３ＭＧ腫瘍細胞と共培養した対照（モック）ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞の培地中へのＩＦＮγ分泌を示す。
【図15C】改変ＣＡＲ Ｔ細胞のプロファイリングおよびキャラクタリゼーションを示す。（Ｃ）は、経時的な、対照（モック）ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞中のＣＡＲ発現を示す。
【図15D】改変ＣＡＲ Ｔ細胞のプロファイリングおよびキャラクタリゼーションを示す。（Ｄ）腫瘍細胞刺激の存在または非存在下での対照（モック）ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞、およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞上の表面活性化マーカー（ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ６９およびＣＤ２５）を示す。
【図16A】改変ＣＡＲ Ｔ細胞が、インビボで神経膠芽腫腫瘍増殖を調節することを示す。（Ａ）実験手順の概略図。
【図16B】改変ＣＡＲ Ｔ細胞が、インビボで神経膠芽腫腫瘍増殖を調節することを示す。（Ｂ）は、対照（モック）ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞について腫瘍移植後の様々な日数での腫瘍増殖を示す。
【図16C】改変ＣＡＲ Ｔ細胞が、インビボで神経膠芽腫腫瘍増殖を調節することを示す。（Ｃ）は、対照（モック）ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞について腫瘍移植後の様々な日数でのマウスの生存パーセントを示す。
【図17A】ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）がＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現に影響を与えることを示す。（Ａ）各構築物でのヒトジャーカット細胞上のＣＡＲ発現。（ｎｓ：統計的有意性なし；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図17B】ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）がＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現に影響を与えることを示す。（Ｂ）各構築物における形質導入細胞およびＣＡＲ表面染色シグナルの指標としてのＧＦＰシグナルを示す代表的プロット。
【図18A】改変ＣＡＲ Ｔ細胞の基底レベル活性化は、細胞内シグナル伝達ドメインが取り除かれると、減少することを示す。（Ａ）ＣＡＲまたはデコイＣＡＲ（細胞内シグナル伝達ドメインを含まないＣＡＲ分子、ｄＣＡＲと命名される）を発現するために使用されるレンチウィルス構築物の概略図。
【図18B】改変ＣＡＲ Ｔ細胞の基底レベル活性化は、細胞内シグナル伝達ドメインが取り除かれると、減少することを示す。（Ｂ）概略図は、細胞膜上のＣＡＲ分子およびデコイＣＡＲ分子を示す。
【図18C】改変ＣＡＲ Ｔ細胞の基底レベル活性化は、細胞内シグナル伝達ドメインが取り除かれると、減少することを示す。（Ｃ）刺激なしで、形質導入の７日後の異なるＣＡＲ－Ｔ細胞構築物からのＩＦＮγ分泌。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本実施形態は一般に、抗ＩＬ１３Ｒα２抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに特に、癌治療でのその使用に関する。
本実施形態は、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ１３Ｒα２）に対し特異性を有する抗体、およびその抗原結合フラグメントに関する。実施形態の抗体および抗原結合フラグメントは特に、ＩＬ１３Ｒα２の発現および提示を特徴とする癌疾患を含む種々の疾患のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＡＲ系免疫療法での使用に特に好適である。
本実施形態は、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ１３Ｒα２）に対し特異性を有する抗体、およびその抗原結合フラグメントに関する。実施形態の抗体および抗原結合フラグメントは特に、ＩＬ１３Ｒα２の発現および提示を特徴とする癌疾患を含む種々の疾患のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＡＲ系免疫療法での使用に特に好適である。
【0020】
ＩＬ１３Ｒα２に対する抗体ＣＡＲ構築物は、背景技術セクションで引用された文献で例示されるように、当技術分野において既知である。しかし、先行技術の解決策は、癌治療でのそれらの使用を制限する種々の欠点を有する。例えば、モノクローナル抗ＩＬ１３Ｒα２抗体１Ｅ１０Ｂ９（米国特許第９，８６８，７８８号；Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＩＬ－１３ＲＡ２ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｃａｎｉｎｅ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３，８（１０）：ｅ７７７１９）は、実施例セクションで示されるように、ＩｇＧ抗体から単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）フォーマットへ変換されるとヒトＩＬ１３Ｒα２に特異的に結合するその能力を失う。抗体フォーマット間での交替時の抗原結合の消失は、ＩｇＧからｓｃＦｖへ移行する場合は特に、珍しいことではない。抗原結合部位の構造に影響を与える変更されたタンパク質折り畳みは、これを最もうまく説明できる。従って、先行技術のモノクローナル抗ＩＬ１３Ｒα２抗体１Ｅ１０Ｂ９は、ＩｇＧ型で使用され得るが、ｓｃＦｖフォーマットへの変換には好適でなく、そのためＣＡＲ系免疫療法での使用に適さない。
【0021】
モノクローナル抗ＩＬ１３Ｒα２抗体ｍＡｂ４７（米国特許第１０，３０８，７１９号；Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｄｉｒｅｃｔｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｏ ＩＬ１３Ｒα２－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５，５：１８１３３）は、ｓｃＦｖフォーマットへの変換時にヒトＩＬ１３Ｒα２への結合の保持を示した。しかし、ＣＡＲ系免疫療法での本発明のｓｃＦｖを用いた比較例では、ｍＡｂ４７ ｓｃＦｖに基づいて生成されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ごくわずかな標的細胞殺傷を示したに過ぎないが、一方、本実施形態により生成されたＣＡＲ Ｔ細胞は、低いエフェクター：標的細胞比ですでに、十分な細胞傷害能力を示した。従って、実施形態による抗体の抗原結合フラグメントは、ＣＡＲ系免疫療法で使用する場合、抗体ｍＡｂ４７の抗原結合フラグメントより優れている。さらに、抗体ｍＡｂ４７は、受容体ＩＬ１３Ｒα２への結合時に、リガンドインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）と競合するが、一方、実施形態のいくつかの抗体、およびその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２への結合についてＩＬ－１３と競合しない。
【0022】
本明細書では、本明細書で記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域中の全てのアミノ酸は従って、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１：５５－７７）に準拠して番号が付され、特定される。
【0023】
ヒトＩＬ１３Ｒα２タンパク質配列中のアミノ酸番号は、受入番号ＮＰ＿０００６３１および２０２１年４月２６日付けバージョンＮＰ＿０００６３１．１のＮＣＢＩ参照配列ならびに本明細書で下に提示された配列（配列番号１０７）に従う。
ＭＡＦＶＣＬＡＩＧＣ ＬＹＴＦＬＩＳＴＴＦ ＧＣＴＳＳＳＤＴＥＩ ＫＶＮＰＰＱＤＦＥＩ ＶＤＰＧＹＬＧＹＬＹ ＬＱＷＱＰＰＬＳＬＤ ＨＦＫＥＣＴＶＥＹＥ ＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴ ＷＫＴＩＩＴＫＮＬＨ ＹＫＤＧＦＤＬＮＫＧ ＩＥＡＫＩＨＴＬＬＰ ＷＱＣＴＮＧＳＥＶＱ ＳＳＷＡＥＴＴＹＷＩ ＳＰＱＧＩＰＥＴＫＶ ＱＤＭＤＣＶＹＹＮＷ ＱＹＬＬＣＳＷＫＰＧ ＩＧＶＬＬＤＴＮＹＮ ＬＦＹＷＹＥＧＬＤＨ ＡＬＱＣＶＤＹＩＫＡ ＤＧＱＮＩＧＣＲＦＰ ＹＬＥＡＳＤＹＫＤＦ ＹＩＣＶＮＧＳＳＥＮ ＫＰＩＲＳＳＹＦＴＦ ＱＬＱＮＩＶＫＰＬＰ ＰＶＹＬＴＦＴＲＥＳ ＳＣＥＩＫＬＫＷＳＩ ＰＬＧＰＩＰＡＲＣＦ ＤＹＥＩＥＩＲＥＤＤ ＴＴＬＶＴＡＴＶＥＮ ＥＴＹＴＬＫＴＴＮＥ ＴＲＱＬＣＦＶＶＲＳ ＫＶＮＩＹＣＳＤＤＧ ＩＷＳＥＷＳＤＫＱＣ ＷＥＧＥＤＬＳＫＫＴ ＬＬＲＦＷＬＰＦＧＦ ＩＬＩＬＶＩＦＶＴＧ ＬＬＬＲＫＰＮＴＹＰ ＫＭＩＰＥＦＦＣＤＴ
ＭＡＦＶＣＬＡＩＧＣ ＬＹＴＦＬＩＳＴＴＦ ＧＣＴＳＳＳＤＴＥＩ ＫＶＮＰＰＱＤＦＥＩ ＶＤＰＧＹＬＧＹＬＹ ＬＱＷＱＰＰＬＳＬＤ ＨＦＫＥＣＴＶＥＹＥ ＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴ ＷＫＴＩＩＴＫＮＬＨ ＹＫＤＧＦＤＬＮＫＧ ＩＥＡＫＩＨＴＬＬＰ ＷＱＣＴＮＧＳＥＶＱ ＳＳＷＡＥＴＴＹＷＩ ＳＰＱＧＩＰＥＴＫＶ ＱＤＭＤＣＶＹＹＮＷ ＱＹＬＬＣＳＷＫＰＧ ＩＧＶＬＬＤＴＮＹＮ ＬＦＹＷＹＥＧＬＤＨ ＡＬＱＣＶＤＹＩＫＡ ＤＧＱＮＩＧＣＲＦＰ ＹＬＥＡＳＤＹＫＤＦ ＹＩＣＶＮＧＳＳＥＮ ＫＰＩＲＳＳＹＦＴＦ ＱＬＱＮＩＶＫＰＬＰ ＰＶＹＬＴＦＴＲＥＳ ＳＣＥＩＫＬＫＷＳＩ ＰＬＧＰＩＰＡＲＣＦ ＤＹＥＩＥＩＲＥＤＤ ＴＴＬＶＴＡＴＶＥＮ ＥＴＹＴＬＫＴＴＮＥ ＴＲＱＬＣＦＶＶＲＳ ＫＶＮＩＹＣＳＤＤＧ ＩＷＳＥＷＳＤＫＱＣ ＷＥＧＥＤＬＳＫＫＴ ＬＬＲＦＷＬＰＦＧＦ ＩＬＩＬＶＩＦＶＴＧ ＬＬＬＲＫＰＮＴＹＰ ＫＭＩＰＥＦＦＣＤＴ
【0024】
抗体、またはその抗原結合フラグメントの特異性は、および／または結合力に基づいて決定できる。親和性は、抗原と、抗体、またはその抗原結合フラグメントとの解離のための平衡定数、（ＫＤ）により表され、抗原決定基、すなわち、エピトープと、抗体、またはその抗原結合フラグメント上の抗原結合との間の結合強度の尺度である。 ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と、抗体、またはその抗原結合フラグメントとの間の結合強度が強い。あるいは、親和性はまた、１／ＫＤである、親和性定数（ＫＡ）として表すこともできる。当業者には自明であるように、親和性は、目的の特異的抗原に応じて、それ自体既知である方法によって決定できる。
【0025】
結合力は、抗体、またはその抗原結合フラグメントと、関連抗原の間の結合力の尺度である。結合力は、抗原決定基と、抗体、またはその抗原結合フラグメント上のその抗原結合部位との親和性、および抗体、またはその抗原結合フラグメント上に存在する関連結合部位数、の両方に関連する。
【0026】
典型的には、抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０－５～１０－１２モル／リットル（Ｍ）以下、および好ましくは１０－７～１０－１２Ｍ以下およびより好ましくは１０－８～１０－１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）で、すなわち、１０５～１０１２Ｍ－１以上、および好ましくは１０７～１０１２Ｍ－１以上およびより好ましくは１０８～１０１２Ｍ－１の親和性定数（ＫＡ）でそれらの抗原に結合する。
通常、１０－４Ｍより大きいいずれかのＫＤ値（または１０４Ｍ－１より小さいいずれかのＫＡ値）は、非特異的結合を示すと見なされる。
通常、１０－４Ｍより大きいいずれかのＫＤ値（または１０４Ｍ－１より小さいいずれかのＫＡ値）は、非特異的結合を示すと見なされる。
【0027】
好ましくは、実施形態の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満の親和性でＩＬ１３Ｒα２に結合する。
抗体、またはその抗原結合フラグメントの抗原または抗原決定基に対する特異的結合は、それ自体既知の任意の好適な方法で決定でき、例えば、スキャチャード解析および／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイ；ルミネックス（登録商標）マルチプレックスアッセイおよびそれ自体当該技術分野において既知の種々のこれらの変種を含む。
抗体、またはその抗原結合フラグメントの抗原または抗原決定基に対する特異的結合は、それ自体既知の任意の好適な方法で決定でき、例えば、スキャチャード解析および／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイ；ルミネックス（登録商標）マルチプレックスアッセイおよびそれ自体当該技術分野において既知の種々のこれらの変種を含む。
【0028】
本発明者らは、ＩＬ１３Ｒα２中で新規エピトープまたは抗原決定基領域を見出し、これは、抗体およびその抗原結合フラグメントによる標的に極めて好適である。特に、この新規エピトープを標的化する抗体およびその抗原結合フラグメントは、ＣＡＲ系免疫療法において有用である。このエピトープは、図１０に示すように、ＩＬ１３Ｒα２のドメイン１中の第２のおよび最大βシートに対応する。これは、受容体のＮ末端部分であり、ドメイン１は、相互上の２つのβシートで折り畳まれたβサンドイッチからなる。エピトープは、最大βシート中の４鎖の３鎖中に位置し、ＩＬ１３Ｒα２に対しＩＬ－１３の結合部位から離れた領域中に存在する。図１０を参照されたい。
【0029】
このβシート中のエピトープに特異的に結合する抗体、およびその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２に対し高い特異性を有し、ＩＬ１３Ｒα１への結合を示さなかった。抗原結合フラグメントは、ＣＡＲ Ｔ細胞系免疫療法で、ＩＬ１３Ｒα２を発現する癌細胞に対し、優れた細胞傷害能力を示した。
【0030】
実施形態の態様は従って、ＩＬ１３Ｒα２に結合できる抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６８～７５の第１のβ鎖、第１のβ鎖の後のループ、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１０１～１０９の第２のβ鎖、第２のβ鎖の前のループ、およびＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１２４～１２８の第３のβ鎖を含むＩＬ１３Ｒα２のβシート領域またはドメイン内のエピトープに対して特異性を有する。
【0031】
ＩＬ１３Ｒα２のアミノ酸配列は、配列番号１０７で示される。アミノ酸番号６８～７５は、アミノ酸配列ＥＹＥＬＫＹＲＮ（配列番号１０８）に対応し、アミノ酸番号１０１～１０９は、アミノ酸配列ＩＥＡＫＩＨＴＬＬ（配列番号１０９）に対応し、およびアミノ酸番号１２４～１２８は、アミノ酸配列ＡＥＴＴＹ（配列番号１１０）に対応する。
【0032】
図１０は、エピトープを形成する、３、６および７と番号を付けた３つのβ鎖のまわりにハッチングを施した楕円を有する、ドメイン１の最大のβシートを示す。β鎖６および７は、アルファヘリックスおよび屈曲部を含むループ領域で相互接続される。β鎖３および６は、２つの折り返し部および２つのβ鎖（番号４および５、β鎖４は、鎖３、６、７と共に最大βシートに属し、およびβ鎖５は、ドメイン１の第１のより小さいβシートに属する）を含むアミノ酸配列で相互接続される。
【0033】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６７～８１、アミノ酸番号９６～１０６およびアミノ酸番号１２３～１２８からなる群より選択される、エピトープ領域とも称される、少なくとも１つのペプチドを含むエピトープに対する特異性を有する。
ある実施形態では、第１のペプチドまたはエピトープ領域（ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ、配列番号４４）は、ＩＬ１３Ｒα２中のβ鎖３およびβ鎖３の後の折り返し部に実質的に対応する。第２のペプチドまたはエピトープ領域（ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ、配列番号４５）は、β鎖６およびその前のループのショートストレッチに実質的に対応し、一方、第３のペプチドまたはエピトープ領域（ＷＡＥＴＴＹ、配列番号４６）は、β鎖７に実質的に対応する。
ある実施形態では、第１のペプチドまたはエピトープ領域（ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ、配列番号４４）は、ＩＬ１３Ｒα２中のβ鎖３およびβ鎖３の後の折り返し部に実質的に対応する。第２のペプチドまたはエピトープ領域（ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ、配列番号４５）は、β鎖６およびその前のループのショートストレッチに実質的に対応し、一方、第３のペプチドまたはエピトープ領域（ＷＡＥＴＴＹ、配列番号４６）は、β鎖７に実質的に対応する。
【0034】
抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２のβシート領域中のこれらの３つのペプチドまたはエピトープ領域の少なくとも１つに対する特異性を有する。従って、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、第１のペプチドまたはエピトープ（ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ、配列番号４４）に対する特異性を有し、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、第２のペプチドまたはエピトープ領域（ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ、配列番号４５）に対する特異性を有し、または抗体、またはその抗原結合フラグメントは、第３のペプチドまたはエピトープ領域（ＷＡＥＴＴＹ、配列番号４６）に対する特異性を有する。
【0035】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２のβシート領域中のこれらの３つのペプチドまたはエピトープ領域の少なくとも２つに対する特異性を有する。従って、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、第１のペプチドまたはエピトープ（ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ、配列番号４４）および第２のペプチドまたはエピトープ領域（ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ、配列番号４５）に対する特異性を有し、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、第１のペプチドまたはエピトープ領域（ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ、配列番号４４）および第３のペプチドまたはエピトープ領域（ＷＡＥＴＴＹ、配列番号４６）に対する特異性を有し、または抗体、またはその抗原結合フラグメントは、第２のペプチドまたはエピトープ領域（ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ、配列番号４５）および第３のペプチドまたはエピトープ領域（ＷＡＥＴＴＹ、配列番号４６）に対する特異性を有する。
【0036】
好ましい実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２のβシート領域中のこれらの３つのペプチドまたはエピトープ領域の全てに対する、すなわち、第１のペプチドまたはエピトープ領域（ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ、配列番号４４）、第２のペプチドまたはエピトープ領域（ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ、配列番号４５）および第３のペプチドまたはエピトープ領域（ＷＡＥＴＴＹ、配列番号４６）に対する特異性を有する。
【0037】
本発明はまた、ＩＬ１３Ｒα２のエピトープに関する。このエピトープは、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６８～７５の第１のβ鎖、第１のβ鎖の後のループ、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１０１～１０９の第２のβ鎖、第２のβ鎖の前のループ、およびＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号１２４～１２８の第３のβ鎖を含むＩＬ１３Ｒα２のβシート領域内にある。
【0038】
ある実施形態では、エピトープは、ＩＬ１３Ｒα２中のアミノ酸番号６７～８１、すなわち、ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ（配列番号４４）、アミノ酸番号９６～１０６、すなわち、ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ（配列番号４５）、およびアミノ酸番号１２３～１２８、すなわち、ＷＡＥＴＴＹ（配列番号４６）からなる群より選択される、少なくとも１つのペプチド、好ましくは少なくとも２つのペプチド、およびより好ましくは３つ全てのペプチドを含む。
【0039】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＹＳＰＦＹ（配列番号３）を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＹＳＰＦＹＭ（配列番号９）を含むＶＨドメインＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹ（配列番号１０）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＱＱＧＹＳＦＰＰＴ（配列番号１１）を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＧＳＹ（配列番号１）を含むＶＨドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＳＹ（配列番号１０６）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＧＳＹＭＳ（配列番号５）を含み、好ましくはアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳ（配列番号６）を含み、好ましくはそれからなる延長ＶＨドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＹＧＳＧＧＹ（配列番号２）を含むＶＨドメインＣＤＲ２を含む。
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＩＹＧＳＧＧＹＴ（配列番号７）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ２を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹ（配列番号８）を含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨドメインＣＤＲ２を含む。
本明細書で使用される場合、延長ＣＤＲは、ＩＭＧＴ命名法に従って定義されたＣＤＲのアミノ酸を越える少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列に関する。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１２）を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＡＡＳを含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ２を含む。
抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの上記の実施形態のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインＣＤＲ領域、好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの、およびさらにより好ましくは少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは全てのＣＤＲ領域を含み得る。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＹＳＰＦＹＭ（配列番号９）を含むＶＨドメインＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹ（配列番号１０）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＱＱＧＹＳＦＰＰＴ（配列番号１１）を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＧＳＹ（配列番号１）を含むＶＨドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＳＹ（配列番号１０６）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＧＳＹＭＳ（配列番号５）を含み、好ましくはアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳ（配列番号６）を含み、好ましくはそれからなる延長ＶＨドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＹＧＳＧＧＹ（配列番号２）を含むＶＨドメインＣＤＲ２を含む。
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＩＹＧＳＧＧＹＴ（配列番号７）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ２を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹ（配列番号８）を含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨドメインＣＤＲ２を含む。
本明細書で使用される場合、延長ＣＤＲは、ＩＭＧＴ命名法に従って定義されたＣＤＲのアミノ酸を越える少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列に関する。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１２）を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ１を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＡＡＳを含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ２を含む。
抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの上記の実施形態のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインＣＤＲ領域、好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの、およびさらにより好ましくは少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは全てのＣＤＲ領域を含み得る。
【0040】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも２つの上記のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインＣＤＲ領域を含む。このような実施形態は、上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１およびＶＨドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１およびＶＨドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ１を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＨドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ１を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ１を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；および上で定義されるＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント、を含む。
【0041】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも３つの上記のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインＣＤＲ領域を含む。このような実施形態は、上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＨドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ１を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ１を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；このような実施形態は、上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ１を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；および上で定義されるＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント、を含む。
【0042】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも４つの上記のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインＣＤＲ領域を含む。このような実施形態は、上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ１を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；および上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント、を含む。
【0043】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも５つの上記のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインＣＤＲ領域を含む。このような実施形態は、上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ２を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント；および上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメント、を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、６つ全ての上記のＶＨドメインおよびＶＬドメインＣＤＲ領域を含む。このような実施形態は、上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、６つ全ての上記のＶＨドメインおよびＶＬドメインＣＤＲ領域を含む。このような実施形態は、上で定義されるＶＨドメインＣＤＲ１、ＶＨドメインＣＤＲ２、ＶＨドメインＣＤＲ３、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＶＬドメインＣＤＲ２およびＶＬドメインＣＤＲ３を含む抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。
【0044】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインを含む。
【0045】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインを含む。
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインおよび配列番号１４のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインを含む。
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインおよび配列番号１４のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインを含む。
【0046】
実施形態の特に好ましい抗体は、本明細書でＭＥ１０７－１１７またはＷ－ＭＥ１０７－１１７と表記され、対応するその抗原結合フラグメントは、ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖまたはＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖと表記される。この抗体およびその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２のβシート領域（図１０）中のエピトープに特異的に結合し、上述のＶＨおよびＶＬドメインＣＤＲ領域を含む。
【0047】
実施形態の別の態様は、ＩＬ１３Ｒα２に結合できる抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ１を含み、各Ｘｎ、ｎ＝１～４、は、Ｇ、Ａ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される。抗体、またはその抗原結合フラグメントはまた、アミノ酸配列ＩＢ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｂ６Ｔを含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ２を含み、各Ｂｍ、ｍ＝１～６、は、Ｇ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＡＲ－ＺＨ－Ｚ１ＤＹを含む、好ましくはそれからなるＶＨドメインＣＤＲ３をさらに含み、Ｚ１は、Ｆ、Ｍ、ＩおよびＬからなる群より選択され、ＺＨは、ＶＶＲＳＴＹＧＹ（配列番号１５）、ＹＧＨＹＡＹＧＳＹ（配列番号１６）、ＹＳＳＳＧＷＹＹＧＦ（配列番号１７）、ＴＰＹＳＡＹ（配列番号１８）、ＲＹＲＳＨＲＰＧＬＳ（配列番号１９）、ＦＨＰＲＹＧＹ（配列番号２０）、ＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹ（配列番号２１）、ＹＹＨＹＤＹＧＹＹＹ（配列番号２２）、ＹＳＰＦＹ（配列番号３）、ＲＮＹＷＥＨＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＨＨＹＧＹＹＰＰＧＳＶＹＹ（配列番号２５）、およびＶＥＹＴＹＹＧＳＥＧＳＰＶ（配列番号２６）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１２）を含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ１を含む。抗体、またはその抗原結合フラグメントはまた、アミノ酸配列ＡＡＳを含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱ－ＺＬ－Ｔを含む、好ましくはそれからなるＶＬドメインＣＤＲ３を含み、ＺＬは、ＴＹＹＳＰＨ（配列番号２８）、ＤＹＹＬＦ（配列番号２９）、ＳＹＳＴＰＹ（配列番号３０）、ＦＹＳＹＰＬ（配列番号３１）、ＡＦＳＰＳ（配列番号３２）、ＳＹＤＴＬＬ（配列番号３３）、ＡＬＳＳＬＰ（配列番号３４）、ＦＳＴＲＬＳ（配列番号３５）、ＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）、ＳＴＹＰＦ（配列番号３７）、ＹＧＳＮＰＬ（配列番号３８）、およびＲＹＮＧＬＦ（配列番号３９）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＭＸ５を含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨ ＣＤＲ１を含む。この実施形態では、各Ｘｎ、ｎ＝１～５、は、Ｇ、Ａ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される。
ある実施形態では、Ｘ５は、ＳまたはＧである。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＪＩＢ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｂ６ＴＹを含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨ ＣＤＲ２を含む。この実施形態では、各Ｂｍ、ｍ＝１～６、は、Ｇ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択され、Ｊは、Ａ、Ｙ，ＧおよびＳからなる群より選択される。
ある実施形態では、Ｊは、Ａ、ＹおよびＳからなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｘ１は、ＳまたはＹであり、Ｘ２は、ＳまたはＧであり、Ｘ３は、ＳまたはＹであり、Ｘ４は、Ａ、ＹまたはＧである。
ある実施形態では、Ｂ１は、ＳまたはＹであり、Ｂ２は、Ｇであり、Ｂ３は、Ｓ、ＧまたはＹであり、Ｂ４は、Ｇであり、Ｂ５は、ＳまたはＧであり、Ｂ６は、ＳまたはＹである。
ある実施形態では、ＺＨ－Ｚ１は、ＹＧＨＹＡＹＧＳＹＦ（配列番号４０）、ＴＰＹＳＡＹＩ（配列番号４１）、ＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹＬ（配列番号４２）、およびＹＳＰＦＹＭ（配列番号９）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。
ある実施形態では、ＺＬは、ＤＹＹＬＦ（配列番号２９）、ＦＹＳＹＰＬ（配列番号３１）、ＡＬＳＳＬＰ（配列番号３４）、およびＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＭＸ５を含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨ ＣＤＲ１を含む。この実施形態では、各Ｘｎ、ｎ＝１～５、は、Ｇ、Ａ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択される。
ある実施形態では、Ｘ５は、ＳまたはＧである。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＪＩＢ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｂ６ＴＹを含む、好ましくはそれからなる延長ＶＨ ＣＤＲ２を含む。この実施形態では、各Ｂｍ、ｍ＝１～６、は、Ｇ、ＳおよびＹからなる群より独立に選択され、Ｊは、Ａ、Ｙ，ＧおよびＳからなる群より選択される。
ある実施形態では、Ｊは、Ａ、ＹおよびＳからなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｘ１は、ＳまたはＹであり、Ｘ２は、ＳまたはＧであり、Ｘ３は、ＳまたはＹであり、Ｘ４は、Ａ、ＹまたはＧである。
ある実施形態では、Ｂ１は、ＳまたはＹであり、Ｂ２は、Ｇであり、Ｂ３は、Ｓ、ＧまたはＹであり、Ｂ４は、Ｇであり、Ｂ５は、ＳまたはＧであり、Ｂ６は、ＳまたはＹである。
ある実施形態では、ＺＨ－Ｚ１は、ＹＧＨＹＡＹＧＳＹＦ（配列番号４０）、ＴＰＹＳＡＹＩ（配列番号４１）、ＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹＬ（配列番号４２）、およびＹＳＰＦＹＭ（配列番号９）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。
ある実施形態では、ＺＬは、ＤＹＹＬＦ（配列番号２９）、ＦＹＳＹＰＬ（配列番号３１）、ＡＬＳＳＬＰ（配列番号３４）、およびＧＹＳＦＰＰ（配列番号４）からなる群より選択されるアミノ酸配列である。
【0048】
現時点で好ましい抗原結合フラグメントの実施形態は、本明細書で、Ｗ－ＭＥ１０７－７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－１６、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－６７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７、Ｗ－ＭＥ１０７－１２８、Ｗ－ＭＥ１０７－１５０およびＷ－ＭＥ１０７－１５６と称される。従って、好ましい抗体は、これらの抗原結合フラグメントに対応するＣＤＲ領域ならびにＶＨおよびＶＬドメインを有する。表１はＶＨドメインＣＤＲ１、表２はＶＨドメイン延長ＣＤＲ１、表３はＶＨドメインＣＤＲ２を示し、表４はＶＨドメイン延長ＣＤＲ２を示す。表５はＶＨドメインＣＤＲ３、表６はＶＬドメインＣＤＲ３を示す。Ｗ－ＭＥ１０７－７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－１６、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－６７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７、Ｗ－ＭＥ１０７－１２８、Ｗ－ＭＥ１０７－１５０およびＷ－ＭＥ１０７－１５６の全ては、共通のＶＬドメインＣＤＲ１のＱＳＩＳＳＹ（配列番号１２）および共通のＶＬドメインＣＤＲ２のＡＡＳを有する。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【0049】
実施形態の特に好ましい抗原結合フラグメントは、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５およびＷ－ＭＥ１０７－１１７であり、特に好ましい抗体は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５およびＷ－ＭＥ１０７－１１７のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ領域を有する抗体である。
【0050】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５に示す、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１０のＶＨ ＣＤＲ領域を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１０のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１０のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0051】
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５に示す、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１０のＶＨ ＣＤＲ領域、および共通のＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１０のＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。
【0052】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５に示す、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－２７のＶＨ ＣＤＲ領域を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－２７のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－２７のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0053】
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５で特定される、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－２７のＶＨ ＣＤＲ領域、および共通のＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－２７のＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。
【0054】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５で特定される、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－７５のＶＨ ＣＤＲ領域を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－７５のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－７５のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0055】
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５で特定される、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－７５のＶＨ ＣＤＲ領域、および共通のＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－７５のＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。
【0056】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５で特定される、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１１７のＶＨ ＣＤＲ領域を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１１７のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、共通ＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１１７のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0057】
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１、３および５で特定される、好ましくは表２、４および５で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１１７のＶＨ ＣＤＲ領域、および共通のＶＬドメインＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域と一緒に表６で特定されるクローンＷ－ＭＥ１０７－１１７のＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。
【0058】
Ｗ－ＭＥ１０７－１０は、（配列番号８６）：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＧＨＹＡＹＧＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
のＶＨドメインおよび（配列番号８７）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＤＹＹＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
のＶＨドメインおよび（配列番号８７）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＤＹＹＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
【0059】
Ｗ－ＭＥ１０７－２７は、（配列番号８８）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＧＳＹＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＧＹＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＰＹＳＡＹＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
のＶＨドメインおよび（配列番号８９）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＹＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＧＳＹＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＧＹＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＰＹＳＡＹＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
のＶＨドメインおよび（配列番号８９）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＹＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
【0060】
Ｗ－ＭＥ１０７－７５は、（配列番号９０）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＧＧＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
のＶＨドメインおよび（配列番号９１）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＬＳＳＬＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＧＧＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＹＳＨＹＧＡＨＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
のＶＨドメインおよび（配列番号９１）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＬＳＳＬＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
【0061】
Ｗ－ＭＥ１０７－１１７は、（配列番号１３）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
のＶＨドメインおよび（配列番号１４）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＳＰＦＹＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
のＶＨドメインおよび（配列番号１４）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫのＶＬドメインを含む。
【0062】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントのＶＨドメインは、リンカーを介してＶＬドメインに融合される。抗体、およびその抗原結合フラグメント中のＶＨおよびＶＬドメインを相互接続する種々のこのようなリンカーは、実施形態により使用され得る。特定の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸グリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）を含み得る、例えばこれらからなり得る。このようなペプチドリンカーの非限定的例は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７）を含む、好ましくはこれからなる。
【0063】
当業者は、アミノ酸の欠失または付加を含む、１つ、２つ、３つ、４つまたはさらに多くのアミノ酸配列中のアミノ酸残基の置換などの軽度の変化が、抗体またはその抗原結合フラグメントのＩＬ１３Ｒα２に結合すその能力などの機能特性に影響を与えることなく発生し得ることを理解するであろう。変化は、重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列中、ＣＤＲ領域の外側、すなわちフレームワーク領域のアミノ酸配列中、またはＣＤＲのアミノ酸配列中およびＣＤＲ領域の外側のアミノ酸配列の両方中に存在し得る。従って、いくつかの実施形態はまた、本明細書で提示するまたは配列表中のアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、およびより好ましくは少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントも包含する。
【0064】
本明細書で使用される場合、配列同一性は、ペプチドまたはタンパク質配列などの、２つのアミノ酸配列間の配列類似性を指す。類似性は、配列間の構造的および／または機能的関連性を決定するための配列アラインメントにより決定される。アミノ酸配列間の配列同一性は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＵＳＡから、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ経由で入手できるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌを用いて、デフォルトパラメーター設定（タンパク質アラインメントの場合、Ｇａｐ ｃｏｓｔｓ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１）を使用して、配列のアラインメントを比較することにより決定できる。本明細書で言及される配列比較およびパーセンテージの特定は、このソフトウエアを用いて決定された。例えば、あるアミノ酸配列に対する配列同一性のレベルを比較する場合、これは、好ましくは、アミノ酸配列の全長に対して実施されるべきである、すなわち、高い全体同一性評価を生ずる高い同一性オーバーラップの短い領域を回避するために、グローバルアライメント法が使用される。例えば、５つのアミノ酸を有する短いポリペプチドフラグメントは、全体のアミノ酸配列内の５つのアミノ酸領域と１００％同一配列を有し得るが、これは、フラグメントが、アミノ酸配列中の位置と同等の他の位置で同一のアミノ酸をまた有する、より長い配列の一部を形成しない限り１００％のアミノ酸同一性を与えない。比較される配列における同等位置が同一のアミノ酸で占められる場合、分子は、その位置で同一である。同一性のパーセンテージとしてのアラインメントの点数化は、比較される配列により共有される位置での同一アミノ酸の数の関数である。配列を比較する場合、最適アラインメントは、配列中の可能な挿入および欠失を考慮するために、１種または複数の配列中に導入されるギャップを必要とする場合がある。
【0065】
ある実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。
ある実施形態では、抗体は、遺伝子操作された抗体、例えば、単鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、または多重特異性抗体である。ある実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、１つの種由来の定常ドメインおよび第２の種由来の可変ドメインを含む抗体を指す。
ある実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、ヒト化は、元の起源の抗体より真のヒト抗体により高い類似性の構造および免疫学的機能を有するように改変される非ヒト起源由来の少なくとも１つのＣＤＲ領域を有する抗体を指す。ヒト化抗体の例は、ヒト抗体にグラフト化された非ヒト抗体由来のＣＤＲ領域を有する抗体である。ヒト化は、追加でまたは代わりに、非ヒトアミノ酸配列をヒト配列により似させるための選択アミノ酸置換を含む。
ある実施形態では、抗体は、遺伝子操作された抗体、例えば、単鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、または多重特異性抗体である。ある実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、１つの種由来の定常ドメインおよび第２の種由来の可変ドメインを含む抗体を指す。
ある実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、ヒト化は、元の起源の抗体より真のヒト抗体により高い類似性の構造および免疫学的機能を有するように改変される非ヒト起源由来の少なくとも１つのＣＤＲ領域を有する抗体を指す。ヒト化抗体の例は、ヒト抗体にグラフト化された非ヒト抗体由来のＣＤＲ領域を有する抗体である。ヒト化は、追加でまたは代わりに、非ヒトアミノ酸配列をヒト配列により似させるための選択アミノ酸置換を含む。
【0066】
好適な抗体作製方法は、当技術分野において既知である。例えば、標準ハイブリドーマ法は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、およびＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載されている。
【0067】
モノクローナル抗体は、培養物中の連続継代性細胞株により抗体分子の産生を可能にするいずれかの技術により調製され得る。これらは、限定されないが、最初にＮａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２，１９８３；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０：２０２６－２０３０，１９８３）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．，ｐｐ ７７－９６，（１９８５））を含む。
ポリクローナル抗体は、ＩＬ１３Ｒα２抗原を含む免疫原で動物を免疫化し、その免疫された動物から抗血清を収集することにより調製され得る。限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマを含む広範囲の動物種が、抗血清の産生に使用できる。
ポリクローナル抗体は、ＩＬ１３Ｒα２抗原を含む免疫原で動物を免疫化し、その免疫された動物から抗血清を収集することにより調製され得る。限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマを含む広範囲の動物種が、抗血清の産生に使用できる。
【0068】
あるいは、抗体、およびその抗原結合フラグメントは、本明細書で記載のファージディスプレイ選択を用いて選択的に産生され得る。
本明細書で使用される場合、抗体の抗原結合フラグメントは、単鎖抗体、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、ｄｉ－ｓｃＦｖフラグメントおよびＣＤＲ領域からなる群から選択できる。現時点で好ましい抗原結合フラグメントの実施形態は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
本明細書で使用される場合、抗体の抗原結合フラグメントは、単鎖抗体、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、ｄｉ－ｓｃＦｖフラグメントおよびＣＤＲ領域からなる群から選択できる。現時点で好ましい抗原結合フラグメントの実施形態は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【0069】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１３Ｒα２に、好ましくはヒトＩＬ１３Ｒα２に特異的に結合する。ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、追加でまたは代わりに、非ヒトＩＬ１３Ｒα２に特異的に結合する。このような非ヒトＩＬ１３Ｒα２の非限定的例は、イヌのＩＬ１３Ｒα２、ネコＩＬ１３Ｒα２、ウシＩＬ１３Ｒα２、ウマＩＬ１３Ｒα２、ヒツジＩＬ１３Ｒα２、ラットＩＬ１３Ｒα２および／またはマウスＩＬ１３Ｒα２を含む。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１３Ｒα１に結合しない。
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１３Ｒα１に結合しない。
【0070】
実施形態のある態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。ＣＡＲは、実施形態による抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抗原認識ドメインを含む。ＣＡＲはまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一般に、ＣＡＲは、外部ドメイン、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインを含む。ＣＡＲの外部ドメインは、ｓｃＦｖであってよい、抗原認識領域を含む。外部ドメインはまた、シグナルタグまたはＣＡＲを小胞体中へ誘導するペプチドを含み得る。
一般に、ＣＡＲは、外部ドメイン、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインを含む。ＣＡＲの外部ドメインは、ｓｃＦｖであってよい、抗原認識領域を含む。外部ドメインはまた、シグナルタグまたはＣＡＲを小胞体中へ誘導するペプチドを含み得る。
【0071】
膜貫通ドメインは、細胞膜を横切るＣＡＲの部分である。一般に、膜貫通ドメインは、任意の膜貫通型タンパク質から誘導できる。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含む。ＣＡＲ中に含まれ得る膜貫通ドメインの非限定的例は、表面抗原分類２８（ＣＤ２８）の膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ８αの膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ２７の膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）の膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）の膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ３εの膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ３ζの膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ３γの膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＣＤ３δの膜貫通ドメインの全てまたは一部、ＴＣＲαの膜貫通ドメインの全てまたは一部、およびＴＣＲβの膜貫通ドメインの全てまたは一部、好ましくは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全てまたは一部またはＣＤ８αの膜貫通ドメインの全てまたは一部を含む。
【0072】
ＣＡＲのエンドドメインは、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ中に含まれ得るこのようなシグナル伝達ドメインの非限定的例は、ＣＤ３のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはＭｙｄ８８、好ましくはＣＤ３ζおよび／またはＣＤ１３７を含む。
ある実施形態では、ＣＡＲは、抗原認識ドメインと膜貫通ドメインとを相互連結するヒンジドメインまたはスペーサーを含む。
ある実施形態では、ＣＡＲは、抗原認識ドメインと膜貫通ドメインとを相互連結するヒンジドメインまたはスペーサーを含む。
【0073】
実施形態の関連態様は、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む抗原認識ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を規定する。
ＴＣＲは、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子に結合されるペプチドとして抗原のフラグメントの認識に関与する、Ｔ細胞の表面上で見出される分子である。ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣとかみ合うと、Ｔ細胞は、シグナル伝達、すなわち、関連酵素、共受容体、分化アダプター分子、および活性化または放出される転写因子により媒介される一連の生化学的イベントを介して活性化される。ＴＣＲ複合体は通常、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖と結合されるＴＣＲ分子である。これらの鎖は、ＴＣＲおよびζ鎖（ゼータ鎖）と結合して、Ｔ細胞中で活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は一緒に、ＴＣＲ複合体を構成する。
使用可能なＴＣＲの非限定的例は、ＣＭＶｐｐ６５ ＴＣＲおよびＴＡＲＰ ＴＣＲを含む。
ＴＣＲは、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子に結合されるペプチドとして抗原のフラグメントの認識に関与する、Ｔ細胞の表面上で見出される分子である。ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣとかみ合うと、Ｔ細胞は、シグナル伝達、すなわち、関連酵素、共受容体、分化アダプター分子、および活性化または放出される転写因子により媒介される一連の生化学的イベントを介して活性化される。ＴＣＲ複合体は通常、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖と結合されるＴＣＲ分子である。これらの鎖は、ＴＣＲおよびζ鎖（ゼータ鎖）と結合して、Ｔ細胞中で活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は一緒に、ＴＣＲ複合体を構成する。
使用可能なＴＣＲの非限定的例は、ＣＭＶｐｐ６５ ＴＣＲおよびＴＡＲＰ ＴＣＲを含む。
【0074】
実施形態の別の態様は、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメントおよびエフェクター分子を含むコンジュゲートに関する。
実施形態のコンジュゲートは、標的化ドメインまたは分子およびエフェクタードメインまたは分子として、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞を含むＩＬ１３Ｒα２発現細胞にコンジュゲートを向ける。
実施形態のコンジュゲートは、標的化ドメインまたは分子およびエフェクタードメインまたは分子として、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞を含むＩＬ１３Ｒα２発現細胞にコンジュゲートを向ける。
【0075】
実施形態の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、種々のいわゆるエフェクタードメインまたは分子と接続して使用され得る。ある実施形態では、エフェクター分子は、検出可能標識、細胞毒素、金属、別の抗体、またはその抗原結合フラグメント、核酸配列、および脂質二重層ドッキング部分（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｄｏｃｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）からなる群より選択される。
【0076】
ある実施形態では、エフェクタードメインは、検出および診断目的のために使用され得る。このような場合、エフェクタードメインは、放射標識、蛍光標識、化学発光標識などの、検出可能な標識である。コンジュゲートはその後、例えば対象の身体中で、ＩＬ１３Ｒα２発現細胞などのＩＬ１３Ｒα２の診断およびイメージングのために使用できる。特定の検出可能な標識に応じて種々の画像化手法、例えば、Ｘ線イメージング、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、または単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）をその後、使用し得る。
【0077】
検出可能な標識の使用の代わりに、実施形態の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、抗体、またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つのアミノ酸残基中の水素または炭素などの元素を、その同位体、例えば、水素の代わりに重水素および１２Ｃの代わりに１３Ｃで置換することにより検出され得る。
【0078】
常磁性金属および放射性同位元素を含む金属も、イメージング目的のためにエフェクタードメインとして使用できる。
細胞毒素、または細胞傷害薬は、コンジュゲートが抗体、またはその抗原結合フラグメントを使用して細胞を標的化すると、細胞傷害性を発現しＩＬ１３Ｒα２発現細胞を死滅させるためのエフェクタードメインとして使用できる。細胞毒素の典型的な例は、化学療法剤である。限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および細胞傷害性抗生物質を含む任意の化学療法剤を、実施形態に従って使用できる。
別の実施形態では、エフェクタードメインは、アポトーシスタグであり、これは、ＩＬ１３Ｒα２を発現しかつコンジュゲートにより標的化される細胞によりアポトーシスの誘導をもたらす。このようなアポトーシスタグの例は、ＴＲＡＩＬタンパク質である。
さらに別の実施形態では、エフェクタードメインは、Ｔ細胞またはＢ細胞エピトープ、またはＴ細胞またはＢ細胞エピトープをコードする核酸配列であり、これは、エピトープに対するＴ細胞またはＢ細胞免疫の特異的誘導を引き起こす。
エフェクタードメインは、別の抗体、またはその抗原結合フラグメントであってよい。例えば、エフェクタードメインは、ＩｇＧまたは他の免疫グロブリンのＦｃドメインであり得る。Ｆｃドメインを次に使用して、プロテインＡアフィニティカラムを介する精製を可能にする。追加で、または代わりに、Ｆｃドメインは、コンジュゲートのインビボ半減期を改善し得る。さらに、Ｆｃ領域は、コンジュゲートのダイマー化／多量体化を可能にする。
細胞毒素、または細胞傷害薬は、コンジュゲートが抗体、またはその抗原結合フラグメントを使用して細胞を標的化すると、細胞傷害性を発現しＩＬ１３Ｒα２発現細胞を死滅させるためのエフェクタードメインとして使用できる。細胞毒素の典型的な例は、化学療法剤である。限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および細胞傷害性抗生物質を含む任意の化学療法剤を、実施形態に従って使用できる。
別の実施形態では、エフェクタードメインは、アポトーシスタグであり、これは、ＩＬ１３Ｒα２を発現しかつコンジュゲートにより標的化される細胞によりアポトーシスの誘導をもたらす。このようなアポトーシスタグの例は、ＴＲＡＩＬタンパク質である。
さらに別の実施形態では、エフェクタードメインは、Ｔ細胞またはＢ細胞エピトープ、またはＴ細胞またはＢ細胞エピトープをコードする核酸配列であり、これは、エピトープに対するＴ細胞またはＢ細胞免疫の特異的誘導を引き起こす。
エフェクタードメインは、別の抗体、またはその抗原結合フラグメントであってよい。例えば、エフェクタードメインは、ＩｇＧまたは他の免疫グロブリンのＦｃドメインであり得る。Ｆｃドメインを次に使用して、プロテインＡアフィニティカラムを介する精製を可能にする。追加で、または代わりに、Ｆｃドメインは、コンジュゲートのインビボ半減期を改善し得る。さらに、Ｆｃ領域は、コンジュゲートのダイマー化／多量体化を可能にする。
【0079】
実施形態のさらなる態様は、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体をコードする核酸分子を含む。核酸分子は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および核酸配列を含み、ＤＮＡまたはＲＮＡの高分子を通常意味し、これは、一本鎖または二本鎖であってよく、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含んでよく、およびこれは、天然の、非天然のまたは改変されたヌクレオチド間結合、例えば、非改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で認められるリン酸ジエステルではなく、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合を含んでもよい。核酸分子はまた、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）も含む。
【0080】
核酸分子はまた、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメント以外の分子もコードし得る。このような別の分子の例は、ヘリコバクター・ピロリ（ＨＰ）好中球有効活性化タンパク質（ＮＡＰ）であり、ＨＰ－ＮＡＰは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌感染症において病原性因子として作用するドデカマータンパク質である。それは、１２のモノマーサブユニットから作製され、各サブユニットは、４つのアルファヘリックスからなる。ＨＰ－ＮＡＰの表面は、強く正に帯電し、ヒト白血球（ＷＢＣ）（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅとも表記される）と相互作用する能力およびこれを活性化する能力を有する。
【0081】
実施形態の別の態様は、実施形態による核酸分子を含むベクターに関する。
ベクターは、好ましくは発現ベクター、すなわち、発現ベクターを含む、宿主Ｔ細胞などの、宿主細胞中で転写されるおよび翻訳されるなど、発現され得るコード配列を含む少なくとも１種の核酸分子を含むベクターである。発現ベクターは、ある実施形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、プラスミド、エピソームプラスミドおよびウィルスベクターから選択される。
ある実施形態では、ベクターは、ウィルスベクターである。特定の実施形態では、ウィルスベクターは、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウィルスベクター、セムリキ森林ウィルス、ポリオウィルスおよびハイブリッドベクターからなる群から選択される。
ベクターは、好ましくは発現ベクター、すなわち、発現ベクターを含む、宿主Ｔ細胞などの、宿主細胞中で転写されるおよび翻訳されるなど、発現され得るコード配列を含む少なくとも１種の核酸分子を含むベクターである。発現ベクターは、ある実施形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、プラスミド、エピソームプラスミドおよびウィルスベクターから選択される。
ある実施形態では、ベクターは、ウィルスベクターである。特定の実施形態では、ウィルスベクターは、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウィルスベクター、セムリキ森林ウィルス、ポリオウィルスおよびハイブリッドベクターからなる群から選択される。
【0082】
レンチウィルスは、レトロウィルスのサブクラスである。それらは、非分裂細胞のゲノム中へ組み込むそれらの能力のために、遺伝子送達媒体（ベクター）として適合される。それは、他のレトロウィルスは分裂細胞にのみ感染できるので、レンチウィルス固有の特徴である。ＲＮＡの形態のウィルスのゲノムは、ウィルスがＴ細胞などの細胞に侵入したときに逆転写されて、ＤＮＡを産生し、これはその後、ウィルスインテグラーゼ酵素により、ゲノム中の位置に挿入される。ベクター（ここではプロウィルスと呼ばれる）は、ゲノムに留まり、細胞が分裂するとき、細胞の子孫に伝えられる。安全性の理由から、レンチウィルスベクターは通常、それらの複製に必要とされる遺伝子を決して含まない。レンチウィルスを作製するために、いくつかのプラスミドが、いわゆるパッケージング細胞株、通常はＨＥＫ２９３、に遺伝子導入される。一般にパッケージングプラスミドと呼ばれる、１つまたは複数のプラスミドは、ビリオンタンパク質、例えば、カプシドおよび逆転写酵素などをコードする。別のプラスミドは、ベクターによって送達される遺伝物質を含有する。それは転写されて、一本鎖のＲＮＡウィルスゲノムを産生し、かつΨ（プシー）配列の存在によりマークが付けられる。この配列を使って、ビリオン中にゲノムをパッケージする。
【0083】
レトロウィルスは、現在の遺伝子治療手法の中心的役割をになうものの１つである。モロニーマウス白血病ウィルスなどの組換えレトロウィルスは、宿主ゲノム中に安定に組み込む能力を有する。それらは宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含む。レトロウィルスベクターは、複製能力があるまたは複製欠損のいずれかであり得る。複製欠損ベクターは、最もよくある選択肢である。理由は、ウィルスが、追加のラウンドのビリオン複製およびパッケージングのために必要な、他の遺伝子で置換された、または欠失された遺伝子のためのコード領域を有しているためである。これらのウィルスは、Ｔ細胞に感染およびそれらのウィルス負荷量を送達できるが、その後、細胞溶解および細胞死に繋がる典型的溶菌経路を継続できない。ベクターがレンチウィルスまたはレトロウィルスベクターの場合には、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体およびＨＰ－ＮＡＰおよび／または免疫学的に同等のＨＰ－ＮＡＰフラグメントをコードする核酸配列は好ましくは、ＲＮＡ配列である。
【0084】
本明細書で使用される場合、アデノウィルスベクターは、アデノウィルスベクターおよびアデノウィルス由来ウィルスベクターを含む。
アデノウィルスＤＮＡは、ゲノム中に組み込まれず、細胞分裂中に複製されない。アデノ由来ウィルスベクターは、アデノウィルスベースであるが、種々の改変、例えば、複製タンパク質、すなわち調節タンパク質、表面タンパク質などをコードするヌクレオチド配列に関連する改変が行われている。
アデノウィルスＤＮＡは、ゲノム中に組み込まれず、細胞分裂中に複製されない。アデノ由来ウィルスベクターは、アデノウィルスベースであるが、種々の改変、例えば、複製タンパク質、すなわち調節タンパク質、表面タンパク質などをコードするヌクレオチド配列に関連する改変が行われている。
【0085】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよびいくらかの霊長類種に感染する小さいウィルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染でき、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。さらに、ＡＡＶはほとんど、エピソームとしてそのまま存在し、長く安定な発現を行う。ＡＡＶは、一本鎖のＤＮＡをパッケージングし、第２の鎖合成のプロセスを必要とするが、自己相補的アデノ随伴ウィルス（ｓｃＡＡＶ）は、両鎖をパッケージし、これは一緒にアニールして二重鎖ＤＮＡを形成する。第２の鎖合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは、細胞中での急速発現を可能にする。ベクターがアデノウィルスベクターである場合、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体およびＨＰ－ＮＡＰおよび／または免疫学的に同等のＨＰ－ＮＡＰフラグメントをコードする核酸配列は好ましくは、ＤＮＡ配列である。
【0086】
セムリキ森林ウィルスは、９つのタンパク質をコードする約１３，０００個の塩基対のゲノムを有するプラス鎖ＲＮＡウィルスである。ゲノムの５’側３分の２はＲＮＡ合成に関する４つの非構造タンパク質をコードし、構造タンパク質が３’側３分の１にコードされる。構造タンパク質のうち、Ｃタンパク質は、宿主細胞由来の脂質二重層により覆われた二十面体カプシドを構成する。ウィルスの最外表面は、外殻を形成する、相互接続三量体中に配置された糖タンパク質Ｅ１およびＥ２ヘテロダイマーによりほぼ完全に覆われている。三量体は、ヌクレオキャプシドと結合するＥ２細胞質ドメインにより膜中に固定される。その広範な宿主範囲および効率的複製のために、それはベクターとしても開発された。
【0087】
ハイブリッドベクターは、２種以上のベクターの性質を有するように遺伝子操作されるベクターウィルスである。例えば、ハイブリッドベクターは、アデノウィルスとレンチウィルスの組み合わせであり得る。
【0088】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体をコードする核酸分子は、プロモーターの転写制御下にある。ある実施形態では、プロモーターは、ヒトＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＣＡＧプロモーターからなる群から、好ましくはＥＦ１αプロモーターから選択される。
ある実施形態では、ベクターは、ＥＦ１αプロモーターなどのプロモーターの転写制御下でＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体をコードする核酸分子を含む。ベクターはまた、好ましくは分泌のためのシグナルペプチドを有し、かつ誘導性ＮＦＡＴ－ＩＬ－２プロモーターなどの誘導性プロモーターの転写制御下で、ＨＰ－ＮＡＰをコードする核酸分子を含む。
実施形態のさらなる態様は、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、核酸分子および／またはベクターを含む細胞に関する。
核酸またはベクターは、次に、細胞中で転写されて、抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体を細胞中で産生できる。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球、およびマクロファージからなる群より選択される。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
ある実施形態では、ベクターは、ＥＦ１αプロモーターなどのプロモーターの転写制御下でＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体をコードする核酸分子を含む。ベクターはまた、好ましくは分泌のためのシグナルペプチドを有し、かつ誘導性ＮＦＡＴ－ＩＬ－２プロモーターなどの誘導性プロモーターの転写制御下で、ＨＰ－ＮＡＰをコードする核酸分子を含む。
実施形態のさらなる態様は、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、核酸分子および／またはベクターを含む細胞に関する。
核酸またはベクターは、次に、細胞中で転写されて、抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ複合体を細胞中で産生できる。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球、およびマクロファージからなる群より選択される。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
【0089】
実施形態はまた、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、細胞、コンジュゲート、核酸、および／またはベクター、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【0090】
薬学的に許容可能な担体は、医薬組成物の他の成分と適合性がある、薬学的に許容可能な担体、ビークルおよび／または賦形剤またはこれらの組み合わせを含む。このような薬学的に許容可能な担体の非限定的例は、生理食塩水または緩衝化注射溶液などの注射溶液を含む。
【0091】
実施形態はまた、エフェクター分子が、薬物として使用するための実施形態による細胞毒素、核酸分子、ベクター、細胞および／または医薬組成物である、抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、コンジュゲートに関する。
特定の実施形態では、エフェクター分子が、実施形態による細胞毒素、核酸分子、ベクター、細胞および／または医薬組成物である、抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、コンジュゲートは、癌細胞上のＩＬ１３Ｒα２の発現を特徴とする癌疾患、すなわち、ＩＬ１３Ｒα２発現癌疾患の治療または発症の遅延化において使用できる。
特定の実施形態では、エフェクター分子が、実施形態による細胞毒素、核酸分子、ベクター、細胞および／または医薬組成物である、抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、コンジュゲートは、癌細胞上のＩＬ１３Ｒα２の発現を特徴とする癌疾患、すなわち、ＩＬ１３Ｒα２発現癌疾患の治療または発症の遅延化において使用できる。
【0092】
いくつかの実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２発現癌疾患は、神経膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、尿路上皮癌、メラノーマおよびカポジ肉腫からなる群より選択される。
【0093】
さらなる実施形態は、患者のＩＬ１３Ｒα２発現癌を治療、低減および／または予防する方法に関する。方法は、有効量の抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、ＴＣＲ複合体、コンジュゲートを患者に投与することを含み、エフェクター分子は、実施形態による細胞毒素、核酸分子、ベクター、細胞および／または医薬組成物である。
【0094】
本明細書で使用される場合、有効量は、望ましい結果を得るのに必要な投与および時間のための有効な量を示す。例えば、腫瘍増殖を抑制することにおいて、有効量は、細胞の投与なしで得られる応答に比べて、例えば、寛解、腫瘍負荷量の低減を誘導し、および／または腫瘍伝播または増殖を防止する量である。有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別および／または体重などの因子に応じて変化し得る。本明細書で使用される治療すること、または治療は、当技術分野において十分に理解されており、臨床結果を含む、有益な、または所望の結果を得るための手法を意味する。有益な、または所望の臨床結果としては、１つまたは複数の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の縮減、疾患の状態の安定化、すなわち悪化を防ぐ、疾患のまん延の防止、疾患進行の遅延または減速化、疾患状態の改善または緩和、疾患の再発の縮減、および寛解を挙げ得る。治療すること、または治療はまた、治療を受けていない場合の予測生存期間に比べて、生存期間の延長も含み得る。
【0095】
本明細書で使用される場合、防止または予防は、当該技術分野において十分に理解されており、疾患の発生を遷延または遅延させ得ことを含む、疾患または状態を発症するリスクを低減するまたは防止する手法を意味する。例えば、遺伝的または遺伝的素因によるなどの疾患を発症し易い患者は、疾患の発症を防止する、そのリスクを低減する、それを遅延化するおよび／または緩徐化するための実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメント、細胞、コンジュゲートおよび／または医薬組成物の投与についての恩恵を受け得る。
【0096】
患者は好ましくは、ヒトである。しかし、実施形態は、獣医学用途、すなわち、例えば、霊長類、サル、類人猿、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、マウス、ラットおよびモルモットを含む非ヒト哺乳動物などの、非ヒト患者にも適用し得る。実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメント、細胞、コンジュゲートおよび／または医薬組成物は、種々の経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内または腫瘍内投与により患者に投与され得る。
【0097】
本発明はまた、ＩＬ１３Ｒα２陽性細胞を特定する方法にも関する。方法は、生体試料を、実施形態による抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させること、および生体試料の少なくとも１つの細胞に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントの量を測定すること、それにより少なくとも１つの細胞をＩＬ１３Ｒα２陽性細胞として特定することを含む。
【0098】
ある実施形態では、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、同位体を含むか、または前に本明細書で記載のように、ビオチン－アビジンまたはビオチン－ストレプトアビジン結合を使用するなどの、検出可能な標識に融合されるまたは結合される。
あるいは、ＩＬ１３Ｒα２陽性細胞は、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出され得る。
あるいは、ＩＬ１３Ｒα２陽性細胞は、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出され得る。
【0099】
実施例
本明細書の実施例は、癌の治療のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞療法における使用のためのＩＬ１３Ｒα２を標的とするヒト単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の開発を記載する。
本明細書の実施例は、癌の治療のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞療法における使用のためのＩＬ１３Ｒα２を標的とするヒト単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の開発を記載する。
【0100】
実施例１－ｓｃＦｖへの１Ｅ１０Ｂ９およびｍＡｂ４７ ＩｇＧの変換およびＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦによる結合キャラクタリゼーション
文献調査は、２つの既存のモノクローナル抗ＩＬ１３Ｒα２、すなわち、１Ｅ１０Ｂ９（米国特許第９，８６８，７８８号；Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＩＬ－１３ＲＡ２ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｃａｎｉｎｅ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３，８（１０）：ｅ７７７１９）およびｍＡｂクローン４７（ｍＡｂ４７）（米国特許第１０，３０８，７１９号；Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｄｉｒｅｃｔｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｏ ＩＬ１３Ｒα２－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５，５：１８１３３）を明らかにした。これらは両方とも、ハイブリドーマ技術により生成されたマウス抗体である。１Ｅ１０Ｂ９の場合、ヒトとイヌの配列との間で１００％の相同性を有する、ＩＬ１３Ｒα２の細胞外ドメインの一部をコードするペプチドフラグメントが、合成され、免疫原として使用された。得られた抗体１Ｅ１０Ｂ９は、従って、受容体のヒトおよびイヌ両方の相同分子種を結合する。ｍＡｂ４７は、免疫原として受容体の完全細胞外領域（ＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ）を用いることにより得られた。ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する報告された親和性は、ＫＤ＝１．４ｎＭであり、ヒトＩＬ１３Ｒα１またはマウスＩＬ１３Ｒα２には結合しないことが認められた（Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７）。また、この抗体は、ＩＬ１３Ｒα２への結合に関して、ＩＬ－１３と競合する。
文献調査は、２つの既存のモノクローナル抗ＩＬ１３Ｒα２、すなわち、１Ｅ１０Ｂ９（米国特許第９，８６８，７８８号；Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＩＬ－１３ＲＡ２ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｃａｎｉｎｅ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３，８（１０）：ｅ７７７１９）およびｍＡｂクローン４７（ｍＡｂ４７）（米国特許第１０，３０８，７１９号；Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｄｉｒｅｃｔｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｏ ＩＬ１３Ｒα２－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５，５：１８１３３）を明らかにした。これらは両方とも、ハイブリドーマ技術により生成されたマウス抗体である。１Ｅ１０Ｂ９の場合、ヒトとイヌの配列との間で１００％の相同性を有する、ＩＬ１３Ｒα２の細胞外ドメインの一部をコードするペプチドフラグメントが、合成され、免疫原として使用された。得られた抗体１Ｅ１０Ｂ９は、従って、受容体のヒトおよびイヌ両方の相同分子種を結合する。ｍＡｂ４７は、免疫原として受容体の完全細胞外領域（ＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ）を用いることにより得られた。ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する報告された親和性は、ＫＤ＝１．４ｎＭであり、ヒトＩＬ１３Ｒα１またはマウスＩＬ１３Ｒα２には結合しないことが認められた（Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７）。また、この抗体は、ＩＬ１３Ｒα２への結合に関して、ＩＬ－１３と競合する。
【0101】
１Ｅ１０Ｂ９およびｍＡｂ４７のｓｃＦｖタンパク質をコードする遺伝子が、合成され、タンパク質が、細菌中で発現され、ＥＬＩＳＡおよび均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によりヒトＩＬ１３Ｒα２への結合について試験された。これらのアッセイの結果は、ｍＡｂ４７ ｓｃＦｖのみがその完全長の親ＩｇＧ対応物の結合能力を保持することを示した。
【0102】
材料と方法
遺伝子合成
１Ｅ１０Ｂ９およびｍＡｂ４７の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの配列は、それぞれ、米国特許第９，８６８，７８８号および同第１０，３０８，７１９号から得た。１Ｅ１０Ｂ９のＶＨの最初の７つのアミノ酸は、特許に含まれていなかった。完全なＶＨ遺伝子を生成するために、最も相同なマウスＶＨ遺伝子の最初の７つのアミノ酸を、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ）での検索に基づいて含めた。グリシン－セリンリンカー（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）を介してＶＬにＶＨを融合することにより、対応するｓｃＦｖ構築物１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖ（Ｘ－ＭＥ１０７－Ｂ９とも呼ばれる）（配列番号９２）およびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（Ｘ－ＭＥ１０７－４７とも呼ばれる）（配列番号９３）をコードする遺伝子を、形成した。
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖ（ＶＨ＋リンカー＋ＶＬ＋３ｘＦＬＡＧ＋Ｈｉｓｘ６）（配列番号９２）
ｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（ＶＨ＋リンカー＋ＶＬ＋３ｘＦＬＡＧ＋Ｈｉｓｘ６）（配列番号９３）
遺伝子合成
１Ｅ１０Ｂ９およびｍＡｂ４７の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの配列は、それぞれ、米国特許第９，８６８，７８８号および同第１０，３０８，７１９号から得た。１Ｅ１０Ｂ９のＶＨの最初の７つのアミノ酸は、特許に含まれていなかった。完全なＶＨ遺伝子を生成するために、最も相同なマウスＶＨ遺伝子の最初の７つのアミノ酸を、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ）での検索に基づいて含めた。グリシン－セリンリンカー（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）を介してＶＬにＶＨを融合することにより、対応するｓｃＦｖ構築物１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖ（Ｘ－ＭＥ１０７－Ｂ９とも呼ばれる）（配列番号９２）およびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（Ｘ－ＭＥ１０７－４７とも呼ばれる）（配列番号９３）をコードする遺伝子を、形成した。
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖ（ＶＨ＋リンカー＋ＶＬ＋３ｘＦＬＡＧ＋Ｈｉｓｘ６）（配列番号９２）
【化1】
【化2】
【0103】
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖおよびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖの合成およびサブクローニングを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）により実施した。これらのコドン最適化を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現に基づいて実施した。合成後、ｓｃＦｖ遺伝子を、制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＨＡＴ－６ベクター（ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）中に挿入した。ｐＨＡＴ－６ベクターは、Ｃ末端にトリプルＦＬＡＧタグおよびヘキサヒスチジン（Ｈｉｓｘ６）タグを有する分泌されるｓｃＦｖをもたらす。
【0104】
ベクターを、Ｔｏｐ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、目的の配列を,
塩基配列決定（ＧＡＴＣ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。
塩基配列決定（ＧＡＴＣ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。
【0105】
タンパク質発現
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖおよびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖのｓｃＦｖ当り２つのコロニーの小規模発現を、９６ディープウェルプレートで実施した。
一晩のインキュベーション後、細菌を、遠心沈降し、上清を、ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦの両方による機能評価に使用した。
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖおよびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖのｓｃＦｖ当り２つのコロニーの小規模発現を、９６ディープウェルプレートで実施した。
一晩のインキュベーション後、細菌を、遠心沈降し、上清を、ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦの両方による機能評価に使用した。
【0106】
ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１参照）、および陰性対照タンパク質ストレプトアビジンを、３８４－ＥＬＩＳＡウェルプレートに、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを４℃で一晩コートした。
ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１参照）、および陰性対照タンパク質ストレプトアビジンを、３８４－ＥＬＩＳＡウェルプレートに、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを４℃で一晩コートした。
【0107】
プレートを、ミリＱ水で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充したリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中で２時間ブロックした。細菌上清中に存在するトリプルＦＬＡＧタグ付きｓｃＦｖ １Ｅ１０Ｂ９およびｍＡｂ４７を、ブロッキング緩衝液中で１：２、１：２０および１：２００に希釈し、結合させた。ストレプトアビジン特異的アッセイ対照ｓｃＦｖ（Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１）も含めた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いて１－ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。全ての試料を、二重にアッセイした。
【0108】
均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）
１Ｅ１０Ｂ９、ｍＡｂ４７および陽性アッセイ対照ｓｃＦｖを、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ）中で１：５に希釈し、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよび無関係のタンパク質（両方ともアッセイ緩衝液中で２００ｎＭに希釈）に結合させた。結合の検出を、ドナー分子テルビウム標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１１ＦＧ２ＴＬ）および受容体分子ストレプトアビジン標識ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１０ＳＡＸＬ）により可能にした。プレートを、暗所下、室温で２時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により６１５ｎｍ（バックグラウンド／ノイズシグナル）および６６５ｎｍ（結合シグナル）で分析した。全ての試料を、二重にアッセイした。
１Ｅ１０Ｂ９、ｍＡｂ４７および陽性アッセイ対照ｓｃＦｖを、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ）中で１：５に希釈し、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよび無関係のタンパク質（両方ともアッセイ緩衝液中で２００ｎＭに希釈）に結合させた。結合の検出を、ドナー分子テルビウム標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１１ＦＧ２ＴＬ）および受容体分子ストレプトアビジン標識ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１０ＳＡＸＬ）により可能にした。プレートを、暗所下、室温で２時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により６１５ｎｍ（バックグラウンド／ノイズシグナル）および６６５ｎｍ（結合シグナル）で分析した。全ての試料を、二重にアッセイした。
【0109】
結果
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖおよびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖをコードする４μｇのベクターを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得た。これらのＤＮＡ塩基配列決定法は、正しい配列を確認した。小規模発現を実施し、これらの小セットの抗原に対する結合を、ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦを用いて分析した。
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖおよびｍＡｂ４７ ｓｃＦｖをコードする４μｇのベクターを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得た。これらのＤＮＡ塩基配列決定法は、正しい配列を確認した。小規模発現を実施し、これらの小セットの抗原に対する結合を、ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦを用いて分析した。
【0110】
これらの分析の結果は、ｍＡｂ４７ ｓｃＦｖがヒトＩＬ１３Ｒα２を認識することを示した（図１および２）。１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖは、ＥＬＩＳＡでもＨＴＲＦでも、含まれる抗原のいずれかに対する検出可能なシグナルを生じなかった。
【0111】
結論
マウスＩｇＧ抗体１Ｅ１０Ｂ９およびｍＡｂ４７に特異的なＩＬ１３Ｒα２のＶＨおよびＶＬをコードするｓｃＦｖ遺伝子は、うまく合成され、ｐＨＡＴ６中に挿入され、タンパク質が発現され、ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦにより結合について分析された。
マウスＩｇＧ抗体１Ｅ１０Ｂ９およびｍＡｂ４７に特異的なＩＬ１３Ｒα２のＶＨおよびＶＬをコードするｓｃＦｖ遺伝子は、うまく合成され、ｐＨＡＴ６中に挿入され、タンパク質が発現され、ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦにより結合について分析された。
【0112】
ｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する保持された結合を示し、陰性対照タンパク質に対する結合は、検出されなかった。
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖは、しかし、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合を示さなかった。これは、その完全長ＩｇＧ対応物について報告されたこと（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｄｉｒｅｃｔｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｏ ＩＬ１３Ｒα２－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５，５：１８１３３）とは対照的である。抗体フォーマット間での交替時の抗原結合の消失は、ＩｇＧからｓｃＦｖへ移行する場合は特に、珍しいことではない。抗原結合部位の構造に影響を与える変更されたタンパク質折り畳みは、これを最もうまく説明できる。
１Ｅ１０Ｂ９ ｓｃＦｖは、しかし、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合を示さなかった。これは、その完全長ＩｇＧ対応物について報告されたこと（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｄｉｒｅｃｔｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｏ ＩＬ１３Ｒα２－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５，５：１８１３３）とは対照的である。抗体フォーマット間での交替時の抗原結合の消失は、ＩｇＧからｓｃＦｖへ移行する場合は特に、珍しいことではない。抗原結合部位の構造に影響を与える変更されたタンパク質折り畳みは、これを最もうまく説明できる。
【0113】
実施例２－ファージライブラリーを用いるヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２に対するファージディスプレイ選択
ファージディスプレイ選択を実施して、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２に特異的なｓｃＦｖフラグメントの単離を可能にした。ｓｃＦｖを、２つの異なるヒトファージライブラリー（ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１および２）から選択した。ＥＬＩＳＡによる合計９２０個のクローンの一次選別は、６７３個の陽性クローンをもたらし、これらは塩基配列決定に送られた。これらのうちの３０４個は、ユニークな配列であることがわかった。
ファージディスプレイ選択を実施して、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２に特異的なｓｃＦｖフラグメントの単離を可能にした。ｓｃＦｖを、２つの異なるヒトファージライブラリー（ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１および２）から選択した。ＥＬＩＳＡによる合計９２０個のクローンの一次選別は、６７３個の陽性クローンをもたらし、これらは塩基配列決定に送られた。これらのうちの３０４個は、ユニークな配列であることがわかった。
【0114】
材料と方法
抗原
ファージディスプレイ選択用の抗原として使用されるヒトおよびマウスバージョンのＩＬ１３Ｒα２を、表７に記載する。
抗原
ファージディスプレイ選択用の抗原として使用されるヒトおよびマウスバージョンのＩＬ１３Ｒα２を、表７に記載する。
【表7】
【0115】
ファージディスプレイ選択
バイオパニングを、２種のヒト合成ｓｃＦｖファージライブラリー、ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１およびＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ２（ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を採用し、４選択ラウンドの濃縮を使用して実施した。ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１および２は、以前に報告されたもの（Ｓａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２０１６）２９：４２７－４３７）に設計および構成が似ている、未感作ヒト合成ｓｃＦｖライブラリーである。手短に説明すると、ヒト生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２３およびＩＧＫＶ１－３９を、ライブラリー骨格として使用し、クンケル変異誘発を用いて、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の４つ中に多様性、すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３、を導入した。ビオチン化試料（ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ）に対しては、選択を、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１１２０６Ｄ）を用いて実施した。同様にして、タンパク質Ｇ結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１０００４Ｄ）を用いて、Ｆｃ融合ｍＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを捕捉した。２つのトラックで、異種間反応性ｓｃＦｖを優先的に選択するために、抗原を、異なるラウンドでヒトとマウスＩＬ１３Ｒα２との間で交替させた。さらに、別の２つのトラックでは、ヒトＩＬ－１３（Ｐｒｏｓｐｅｃ ＃ｃｙｔ－４４６）を、選択緩衝液に含めた。淘汰圧を、徐々に抗原量を減らすことにより、および異なるラウンド間の洗浄の回数と強さを増加させることにより高めた。抗原結合ファージの溶出を、トリプシン－アプロチニン手法を用いて実施した。ファージ標的タンパク質インキュベーションステップを除く全体選択プロセスを、自動化し、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ ｒｏｂｏｔで実施した。異なるパラメーターの組み合わせは、６つの異なる選択トラックの全体を包含するスキームを生じた。
バイオパニングを、２種のヒト合成ｓｃＦｖファージライブラリー、ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１およびＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ２（ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を採用し、４選択ラウンドの濃縮を使用して実施した。ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１および２は、以前に報告されたもの（Ｓａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２０１６）２９：４２７－４３７）に設計および構成が似ている、未感作ヒト合成ｓｃＦｖライブラリーである。手短に説明すると、ヒト生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２３およびＩＧＫＶ１－３９を、ライブラリー骨格として使用し、クンケル変異誘発を用いて、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の４つ中に多様性、すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３、を導入した。ビオチン化試料（ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ）に対しては、選択を、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１１２０６Ｄ）を用いて実施した。同様にして、タンパク質Ｇ結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１０００４Ｄ）を用いて、Ｆｃ融合ｍＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを捕捉した。２つのトラックで、異種間反応性ｓｃＦｖを優先的に選択するために、抗原を、異なるラウンドでヒトとマウスＩＬ１３Ｒα２との間で交替させた。さらに、別の２つのトラックでは、ヒトＩＬ－１３（Ｐｒｏｓｐｅｃ ＃ｃｙｔ－４４６）を、選択緩衝液に含めた。淘汰圧を、徐々に抗原量を減らすことにより、および異なるラウンド間の洗浄の回数と強さを増加させることにより高めた。抗原結合ファージの溶出を、トリプシン－アプロチニン手法を用いて実施した。ファージ標的タンパク質インキュベーションステップを除く全体選択プロセスを、自動化し、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ ｒｏｂｏｔで実施した。異なるパラメーターの組み合わせは、６つの異なる選択トラックの全体を包含するスキームを生じた。
【0116】
ｓｃＦｖの再クローニングおよび発現
可溶性ｓｃＦｖを産生させるために、各選択トラックの第３および第４のラウンドからファージミドＤＮＡを単離した。
プール中で、ｓｃＦｖフラグメントをコードする遺伝子を、制限酵素消化し、スクリーニングベクターｐＨＡＴ－６中にサブクローニングし、Ｃ末端でのトリプルＦＬＡＧタグおよびヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグと共にｓｃＦｖの分泌のためのシグナルをもたらした。構築物をその後、ＴＯＰ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。単一コロニーを、採取し、培養し、９６ウェルフォーマットでの可溶性ｓｃＦｖ発現をＩＰＴＧ誘導した。合計で、細菌上清中に存在する９２０個のｓｃＦｖクローンを、一次ＥＬＩＳＡ選別のために調製した。
可溶性ｓｃＦｖを産生させるために、各選択トラックの第３および第４のラウンドからファージミドＤＮＡを単離した。
プール中で、ｓｃＦｖフラグメントをコードする遺伝子を、制限酵素消化し、スクリーニングベクターｐＨＡＴ－６中にサブクローニングし、Ｃ末端でのトリプルＦＬＡＧタグおよびヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグと共にｓｃＦｖの分泌のためのシグナルをもたらした。構築物をその後、ＴＯＰ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。単一コロニーを、採取し、培養し、９６ウェルフォーマットでの可溶性ｓｃＦｖ発現をＩＰＴＧ誘導した。合計で、細菌上清中に存在する９２０個のｓｃＦｖクローンを、一次ＥＬＩＳＡ選別のために調製した。
【0117】
ＥＬＩＳＡ選別
マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを、３８４ＥＬＩＳＡウェルプレートにＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを用いて、４℃で一晩直接コートし、一方、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、ストレプトアビジンを介して、同様にＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを用いて、４℃で一晩間接的にコートした。２つの陰性対照タンパク質、ストレプトアビジンおよびＢＳＡもまた、コートした。
マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを、３８４ＥＬＩＳＡウェルプレートにＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを用いて、４℃で一晩直接コートし、一方、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、ストレプトアビジンを介して、同様にＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを用いて、４℃で一晩間接的にコートした。２つの陰性対照タンパク質、ストレプトアビジンおよびＢＳＡもまた、コートした。
【0118】
細菌上清中に存在するＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンを、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）で補充したＰＢＳ）で１：３に希釈し、コートしたタンパク質に結合させた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いて、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。全ての試料を、二重にアッセイした。また、２つの参照ｓｃＦｖのｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよびＧ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖを、含めた。
【0119】
ＤＮＡ塩基配列決定法
ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示す６７３個の陽性ｓｃＦｖクローンを、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ塩基配列決定法のために、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に送った。
ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示す６７３個の陽性ｓｃＦｖクローンを、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ塩基配列決定法のために、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に送った。
【0120】
結果
合計６つの選択トラックを、ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１および２を使用して、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２に対し並行して実施した。選択ｓｃＦｖクローンの再クローニング後に、９２個のクローン（コロニー）を、選択ラウンド３および４から採取し、合計９２０個の選択クローンを得た。
合計６つの選択トラックを、ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１および２を使用して、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２に対し並行して実施した。選択ｓｃＦｖクローンの再クローニング後に、９２個のクローン（コロニー）を、選択ラウンド３および４から採取し、合計９２０個の選択クローンを得た。
【0121】
ＥＬＩＳＡ選別は、別個の結合特性を有する６７３個の潜在的ヒットを特定した。ヒットの大部分は、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する結合のみを示し、残りのヒットは、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方に対する結合を示した。
６７３個のヒットのＤＮＡ塩基配列決定法は、３０４個のユニークな配列のＷ－ＭＥ１０７クローンを特定した。
６７３個のヒットのＤＮＡ塩基配列決定法は、３０４個のユニークな配列のＷ－ＭＥ１０７クローンを特定した。
【0122】
結論
ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２に結合するｓｃＦｖクローンは、ファージディスプレイ選択によりうまく単離された。９２０クローンの初期ＥＬＩＳＡ選別および６７３個の陽性ヒットのＤＮＡ塩基配列決定法後に、合計３０４個のユニークな配列のｓｃＦｖクローンが、特定された。クローンの大部分は、ヒトＩＬ１３Ｒα２にのみ結合したが、１セットは、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方への結合を示した。
ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２に結合するｓｃＦｖクローンは、ファージディスプレイ選択によりうまく単離された。９２０クローンの初期ＥＬＩＳＡ選別および６７３個の陽性ヒットのＤＮＡ塩基配列決定法後に、合計３０４個のユニークな配列のｓｃＦｖクローンが、特定された。クローンの大部分は、ヒトＩＬ１３Ｒα２にのみ結合したが、１セットは、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方への結合を示した。
【0123】
実施例３－ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦによる３０４個の配列ユニークなｓｃＦｖクローンの二次選別
３０４個の配列ユニークなｓｃＦｖクローンのさらなる順位付けを促進するために、二次ＥＬＩＳＡ選別および均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）選別を、全ての配列ユニーククローンに対し実施した。
これらの分析は、初期ＥＬＩＳＡ選別（実施例２）の結果を確証し、結合特異性に基づき、２つの主要クローン群を特定した。１つの群は、ヒトＩＬ１３Ｒα２にのみ結合し、一方で他の群は、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方に結合するクローンを含んだ。
生成されたＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦデータを用いて、クローンの数をさらに低減し、１６０個のｓｃＦｖのリストを生成した。これらの１６０個のクローンは、２つの主要基準に基づいて選択された：１）マウスおよびヒトＩＬ１３Ｒα２の両方に対する高いシグナルを示すこと（異種間反応性）または２）ヒトＩＬ１３Ｒα２に対し高いシグナルを示し、無関係標的に対する低いバックグラウンドシグナルを示すこと。
３０４個の配列ユニークなｓｃＦｖクローンのさらなる順位付けを促進するために、二次ＥＬＩＳＡ選別および均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）選別を、全ての配列ユニーククローンに対し実施した。
これらの分析は、初期ＥＬＩＳＡ選別（実施例２）の結果を確証し、結合特異性に基づき、２つの主要クローン群を特定した。１つの群は、ヒトＩＬ１３Ｒα２にのみ結合し、一方で他の群は、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方に結合するクローンを含んだ。
生成されたＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦデータを用いて、クローンの数をさらに低減し、１６０個のｓｃＦｖのリストを生成した。これらの１６０個のクローンは、２つの主要基準に基づいて選択された：１）マウスおよびヒトＩＬ１３Ｒα２の両方に対する高いシグナルを示すこと（異種間反応性）または２）ヒトＩＬ１３Ｒα２に対し高いシグナルを示し、無関係標的に対する低いバックグラウンドシグナルを示すこと。
【0124】
材料と方法
ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉは、３８４ＥＬＩＳＡウェルプレートにストレプトアビジンを介して間接的にコートされ、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃおよび陰性対照タンパク質ストレプトアビジンおよび無関係のタンパク質は、ウェルに直接コートされた。この実施例で使用したＩＬ１３Ｒα２タンパク質の詳細は、表７に記載される。
プレートを４℃で一晩コート後、プレートを、ミリＱ水で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充したＰＢＳ）中で２時間ブロックした。細菌上清中に存在するトリプルＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンを、ブロッキング緩衝液中で１：１０に希釈し、結合させた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いて、１－ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで分析した。
全ての試料を、二重にアッセイした。また、２つの陽性対照のｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよびＧ－ｓｔｒｅｐ－１を、含めた。
ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉは、３８４ＥＬＩＳＡウェルプレートにストレプトアビジンを介して間接的にコートされ、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃおよび陰性対照タンパク質ストレプトアビジンおよび無関係のタンパク質は、ウェルに直接コートされた。この実施例で使用したＩＬ１３Ｒα２タンパク質の詳細は、表７に記載される。
プレートを４℃で一晩コート後、プレートを、ミリＱ水で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充したＰＢＳ）中で２時間ブロックした。細菌上清中に存在するトリプルＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンを、ブロッキング緩衝液中で１：１０に希釈し、結合させた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いて、１－ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで分析した。
全ての試料を、二重にアッセイした。また、２つの陽性対照のｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよびＧ－ｓｔｒｅｐ－１を、含めた。
【0125】
ＨＴＲＦ
Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン、ならびに参照のｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよびＧ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖを、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡで補充したＰＢＳ）中で１：５に希釈し、アッセイ緩衝液中で２００ｎＭに希釈されたｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉまたは無関係の抗原に結合させた。結合の検出を、ドナー分子テルビウム標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１１ＦＧ２ＴＬ）および受容体分子ストレプトアビジン標識ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１０ＳＡＸＬ）により可能にした。プレートを、暗所下にて室温で２時間インキュベートした後、６１５ｎｍ（バックグラウンド／ノイズシグナル）および６６５ｎｍ（結合シグナル）にてＥｎｖｉｓｉｏｎ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で分析した。６６５ｎｍの値を、６１５ｎｍの値で除算して、各試料のＲ値を得た。
全ての試料を、二重にアッセイした。
Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン、ならびに参照のｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよびＧ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖを、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡで補充したＰＢＳ）中で１：５に希釈し、アッセイ緩衝液中で２００ｎＭに希釈されたｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉまたは無関係の抗原に結合させた。結合の検出を、ドナー分子テルビウム標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１１ＦＧ２ＴＬ）および受容体分子ストレプトアビジン標識ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６１０ＳＡＸＬ）により可能にした。プレートを、暗所下にて室温で２時間インキュベートした後、６１５ｎｍ（バックグラウンド／ノイズシグナル）および６６５ｎｍ（結合シグナル）にてＥｎｖｉｓｉｏｎ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で分析した。６６５ｎｍの値を、６１５ｎｍの値で除算して、各試料のＲ値を得た。
全ての試料を、二重にアッセイした。
【0126】
結果
ＥＬＩＳＡ
ｓｃＦｖクローンは、結合特異性に基づいて２つの主要群に分割され得る。ｓｃＦｖの大部分を含む、第１の群は、ヒトＩＬ１３Ｒα２にのみ結合し、一方で第２の群に属するクローンは、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方に結合した。参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合のみを示した。
ＨＴＲＦ
３０４個のｓｃＦｖクローンもまた、ＦＲＥＴベース均質溶液アッセイでヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に関して分析された。このアッセイでもまた、遙かに多数のクローンが、ヒトＩＬ１３Ｒα２への明らかな結合を示し、このアッセイに含まれた陰性対照に対しては有意な結合を示さなかった。意外にも、ｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、極めて低い結合シグナルを示した。
ＥＬＩＳＡ
ｓｃＦｖクローンは、結合特異性に基づいて２つの主要群に分割され得る。ｓｃＦｖの大部分を含む、第１の群は、ヒトＩＬ１３Ｒα２にのみ結合し、一方で第２の群に属するクローンは、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方に結合した。参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合のみを示した。
ＨＴＲＦ
３０４個のｓｃＦｖクローンもまた、ＦＲＥＴベース均質溶液アッセイでヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に関して分析された。このアッセイでもまた、遙かに多数のクローンが、ヒトＩＬ１３Ｒα２への明らかな結合を示し、このアッセイに含まれた陰性対照に対しては有意な結合を示さなかった。意外にも、ｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、極めて低い結合シグナルを示した。
【0127】
結論
ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦ選別は、ファージディスプレイ選択により単離された３０４個の配列ユニークなｓｃＦｖクローンに対しうまく実施された。実施例４の同じ試料に対し行われたルミネックスアッセイからの結果と合わせて、この結果に基づき、１６０個のクローンが、ＳＰＲによるさらなるスクリーニングのために選択された。これらの１６０個のクローンは、それらの結合特性に基づいて２つのサブセットに分割され得る；ｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２のみに結合するクローン、およびｉｉ）ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方に結合するクローン。
ＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦ選別は、ファージディスプレイ選択により単離された３０４個の配列ユニークなｓｃＦｖクローンに対しうまく実施された。実施例４の同じ試料に対し行われたルミネックスアッセイからの結果と合わせて、この結果に基づき、１６０個のクローンが、ＳＰＲによるさらなるスクリーニングのために選択された。これらの１６０個のクローンは、それらの結合特性に基づいて２つのサブセットに分割され得る；ｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２のみに結合するクローン、およびｉｉ）ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２の両方に結合するクローン。
【0128】
実施例４－ルミネックスによる３０４個のｓｃＦｖクローンの結合特異性評価
この実施例では、全ての３０４個のユニークなｓｃＦｖクローン、ならびに参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、ルミネックスベース手法で特異性についてさらに評価した。
この分析は、３０４個の８個のクローンがいくつかの無関係のタンパク質に対し非特異的結合を示したことを、示した。残りの２９６個のクローン、ならびに参照クローンｍＡｂ４７は、それらの目的の抗原、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する特異的な結合を示した。
この実施例では、全ての３０４個のユニークなｓｃＦｖクローン、ならびに参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、ルミネックスベース手法で特異性についてさらに評価した。
この分析は、３０４個の８個のクローンがいくつかの無関係のタンパク質に対し非特異的結合を示したことを、示した。残りの２９６個のクローン、ならびに参照クローンｍＡｂ４７は、それらの目的の抗原、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する特異的な結合を示した。
【0129】
この実施例４で示されたルミネックス（登録商標）データと一緒に、実施例３の同じ試料で生成されたＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦデータを用いて、クローンの数をさらに低減し、１６０個のｓｃＦｖのリストを生成した。ルミネックス（登録商標）での良好な性能に加えて、これらの１６０個のクローンは、２つの主要基準に基づいて選択された：１）マウスおよびヒトＩＬ１３Ｒα２の両方に対する高いシグナルを示すこと（異種間反応性）または２）ヒトＩＬ１３Ｒα２に対し高いシグナルを示し、無関係標的に対する低いバックグラウンドシグナルを示すこと。
【0130】
材料と方法
ビオチン化ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよび３１個のビオチン化無関係タンパク質を個別に、特異的ニュートラアビジン結合ルミネックスビードＩＤにコンジュゲートした。結合後、全てのビードＩＤを、混合し、アッセイ緩衝液（３％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０（登録商標）および１０μｇ／ｍｌのニュートラアビジンを補充したＰＢＳ）で１：１０に希釈した、細菌上清中に存在するｓｃＦｖクローンとインキュベートした。３１個の無関係タンパク質のそれぞれについて、少なくとも１個の陽性対照ｓｃＦｖを含めた。クローンの特定のタンパク質結合ビードへの結合を、Ｒ－ＰＥ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｐｒｏｚｙｍｅ ＃ＰＪ３１５）抗体により可能にし、続いて、ＦｌｅｘＭＡＰ ３Ｄ測定器で分析した。
全ての試料を二重にアッセイし、中央値強度蛍光（ＭＦＩ）に対応する、得られた結合シグナルの平均値を、各ビードＩＤに対する各クローンについて計算した。
ビオチン化ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよび３１個のビオチン化無関係タンパク質を個別に、特異的ニュートラアビジン結合ルミネックスビードＩＤにコンジュゲートした。結合後、全てのビードＩＤを、混合し、アッセイ緩衝液（３％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０（登録商標）および１０μｇ／ｍｌのニュートラアビジンを補充したＰＢＳ）で１：１０に希釈した、細菌上清中に存在するｓｃＦｖクローンとインキュベートした。３１個の無関係タンパク質のそれぞれについて、少なくとも１個の陽性対照ｓｃＦｖを含めた。クローンの特定のタンパク質結合ビードへの結合を、Ｒ－ＰＥ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｐｒｏｚｙｍｅ ＃ＰＪ３１５）抗体により可能にし、続いて、ＦｌｅｘＭＡＰ ３Ｄ測定器で分析した。
全ての試料を二重にアッセイし、中央値強度蛍光（ＭＦＩ）に対応する、得られた結合シグナルの平均値を、各ビードＩＤに対する各クローンについて計算した。
【0131】
結果
３０４個のｓｃＦｖクローンのうち２９６個の選別物は、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する特異的結合を示した。８個のクローンはしかし、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に加えて、いくつかの無関係タンパク質への結合を示した。
注目すべきことに、３１個の無関係タンパク質のそれぞれについて、少なくとも１個の陽性対照ｓｃＦｖが、アッセイされた。これらの全ては、予測通りそれらの同族抗原と特異的に相互作用した。これは、全ての抗原がそれらのそれぞれのビーズに機能的に結合されたことを保証する。
３０４個のｓｃＦｖクローンのうち２９６個の選別物は、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する特異的結合を示した。８個のクローンはしかし、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に加えて、いくつかの無関係タンパク質への結合を示した。
注目すべきことに、３１個の無関係タンパク質のそれぞれについて、少なくとも１個の陽性対照ｓｃＦｖが、アッセイされた。これらの全ては、予測通りそれらの同族抗原と特異的に相互作用した。これは、全ての抗原がそれらのそれぞれのビーズに機能的に結合されたことを保証する。
【0132】
結論
３２プレックスルミネックス（登録商標）ベースアッセイは、ファージディスプレイ選択により単離された３０４個の配列ユニークなｓｃＦｖクローンに対しうまく実施された。８個のｓｃＦｖのみが、アッセイに含まれた無関係のタンパク質に対し非特異的結合を示した。残りの２９６個のクローン、および参照クローンｍＡｂ４７は、それらの目的の抗原のヒトＩＬ１３Ｒα２に対する特異的結合を示し、３１個の無関係のタンパク質のいずれに対しても有意な結合を示さなかった。
３２プレックスルミネックス（登録商標）ベースアッセイは、ファージディスプレイ選択により単離された３０４個の配列ユニークなｓｃＦｖクローンに対しうまく実施された。８個のｓｃＦｖのみが、アッセイに含まれた無関係のタンパク質に対し非特異的結合を示した。残りの２９６個のクローン、および参照クローンｍＡｂ４７は、それらの目的の抗原のヒトＩＬ１３Ｒα２に対する特異的結合を示し、３１個の無関係のタンパク質のいずれに対しても有意な結合を示さなかった。
【0133】
実施例５－ＳＰＲによる１６０個の配列ユニークなｓｃＦｖの動力学的選別
実施例４からの１６０個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン、ならびに参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、異なるクローンの効率的順位付けを可能にする動力学的選別ベース手法で表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により、さらなるキャラクタリゼーションのために選択した。
実施例４からの１６０個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン、ならびに参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、異なるクローンの効率的順位付けを可能にする動力学的選別ベース手法で表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により、さらなるキャラクタリゼーションのために選択した。
【0134】
材料と方法
動力学的選別を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００測定器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。捕捉リガンドとして機能する、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ１８０４）を、製造業者の推奨条件に従い、ＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４つ全ての表面上に固定した。
動力学的選別を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００測定器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。捕捉リガンドとして機能する、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ１８０４）を、製造業者の推奨条件に従い、ＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４つ全ての表面上に固定した。
【0135】
細菌上清中に存在する１６０個のＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７クローンを、注入し、チップ表面上に捕捉し、続いて、５０ｎＭでｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ｈＩＬ１３Ｒα２－ＦｃまたはｍＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを、注入した。この試験で使用したＩＬ１３Ｒα２タンパク質の詳細は、表８に記載される。表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．２で再生された。全ての実験は、ランニング緩衝液（０．０５％ツイーン２０（登録商標）で補充したＨＢＳ、ｐＨ７．５）中、２５℃で実施された。
【0136】
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体が固定されている表面の、参照表面の応答曲線を差し引くことにより、全てのｓｃＦｖクローンについて応答曲線センサーグラムを得た。データを、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１ソフトウェアを用いて分析した。
【表8】
【0137】
結果
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体をＣＭ５ Ｓチップの４つ全ての面上に固定し、類似のＲＵレベルの捕捉ｓｃＦｖクローンを得た。５０ｎＭでのＩＬ１３Ｒα２注入後、各表面は、低ｐＨ酸溶液を用いてうまく再生された。
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体をＣＭ５ Ｓチップの４つ全ての面上に固定し、類似のＲＵレベルの捕捉ｓｃＦｖクローンを得た。５０ｎＭでのＩＬ１３Ｒα２注入後、各表面は、低ｐＨ酸溶液を用いてうまく再生された。
【0138】
データの分析を、センサーグラムの目視検査（示さず）により実施した。クローンは、結合特性；（ｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよびヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃの両方、ならびにマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに結合するｓｃＦｖクローン；（ｉｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２バリアントの両方に結合するが、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃには測定可能な結合を示さないｓｃＦｖクローン；（ｉｉｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉのみに結合するが、ヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃには結合しないｓｃＦｖ、そのうちの少数は、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対する結合も示す、に基づいて３つの群に分割され得ることが、センサーグラムから明らかであった。
【0139】
１６０個のｓｃＦｖの４４個の結合パターンを、表９に記載する。このセットは、ヒト受容体への結合に基づいて最も有望と考えられた。より具体的には、高い結合応答および好ましい遅い乖離速度（ｓｌｏｗ ｏｆｆ－ｒａｔｅ）が、考慮された。加えて、異種間反応性を示すクローンが、含められた。
【表9】
【0140】
結論
動力学的選別は、異なる結合特性；（ｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよびＦｃ融合ヒトＩＬ１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ）の両方、ならびにマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに結合するクローン、（ｉｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２バリアントの両方に結合するが、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃには測定可能な結合を示さないクローン、および（ｉｉｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉのみに結合するが、ヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃには測定可能な結合を示さないクローン、を示すクローンを生じ、そのうちのいくつかは、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対する結合も示す。生成されたデータは、異なるクローンの効率的順位付け、およびクローンの数の１６０から４４へのさらなる低減を可能にした。
動力学的選別は、異なる結合特性；（ｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよびＦｃ融合ヒトＩＬ１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ）の両方、ならびにマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに結合するクローン、（ｉｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２バリアントの両方に結合するが、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃには測定可能な結合を示さないクローン、および（ｉｉｉ）ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉのみに結合するが、ヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃには測定可能な結合を示さないクローン、を示すクローンを生じ、そのうちのいくつかは、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対する結合も示す。生成されたデータは、異なるクローンの効率的順位付け、およびクローンの数の１６０から４４へのさらなる低減を可能にした。
【0141】
実施例６－４４個のｓｃＦｖクローンの小規模タンパク質精製およびＥＬＩＳＡ分析
４４個のクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、小規模タンパク質産生および精製のために、例３～５に示された結果に基づいて選択した。
４４個のクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、小規模タンパク質産生および精製のために、例３～５に示された結果に基づいて選択した。
【0142】
タンパク質精製を、プロテインＡまたはニッケル結合磁気ビーズを用いて、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ測定器により９６ウェルフォーマットで実施した。全ての４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンは、十分な純度で、および十分なタンパク質濃度で精製可能であった。参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、しかし、発現不十分であり、それにより低い純度および濃度を示した。
ＥＬＩＳＡで分析した場合、ほとんどの精製されたクローンは、それらの予測される抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示した。
ＥＬＩＳＡで分析した場合、ほとんどの精製されたクローンは、それらの予測される抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示した。
【0143】
材料と方法
産生および精製
４４＋１個のｓｃＦｖクローンのそれぞれを、１５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ培養物中で産生した。３０℃で１８時間のタンパク質産生後、細胞を、Ｂ－ＰＥＲ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃７８２４８）により溶解し、Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンと参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖの清澄化された細菌性溶解物を、プロテインＡ－結合磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃８８８４６）またはＭａｇｎｅＨｉｓ Ｎｉ粒子磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ８５４８）とそれぞれ混合して、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ機器での精製を可能にした。溶出されたｓｃＦｖクローンの緩衝液を、Ｚｅｂａ ９６ウェルスピン脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃８９８０７）を用いて、ＰＢＳに交換した。
産生および精製
４４＋１個のｓｃＦｖクローンのそれぞれを、１５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ培養物中で産生した。３０℃で１８時間のタンパク質産生後、細胞を、Ｂ－ＰＥＲ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃７８２４８）により溶解し、Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンと参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖの清澄化された細菌性溶解物を、プロテインＡ－結合磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃８８８４６）またはＭａｇｎｅＨｉｓ Ｎｉ粒子磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ８５４８）とそれぞれ混合して、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ機器での精製を可能にした。溶出されたｓｃＦｖクローンの緩衝液を、Ｚｅｂａ ９６ウェルスピン脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃８９８０７）を用いて、ＰＢＳに交換した。
【0144】
精製されたｓｃＦｖクローンを、純度および健全性を測定するために還元条件下でゲル電気泳動法により分析し、タンパク質濃度を、製造業者推奨条件に従って標準ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃２３２２７）により測定した。
【0145】
ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度で、３８４－ＥＬＩＳＡウェルプレートに３７℃で４５分間コートした。この実施例で使用したＩＬ１３Ｒα２タンパク質の詳細は、表８に記載される。３つの陰性対照タンパク質（ストレプトアビジン、ＢＳＡおよび無関係のタンパク質）もまた、コートした。ＦＬＡＧタグ付きｓｃＦｖを、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充したＰＢＳ）中で１μｇ／ｍｌに希釈し、コートしたタンパク質に結合させた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いてＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよび陽性アッセイ対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖ（ストレプトアビジンに特異的）を含む、全ての試料を、二重にアッセイした。
ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度で、３８４－ＥＬＩＳＡウェルプレートに３７℃で４５分間コートした。この実施例で使用したＩＬ１３Ｒα２タンパク質の詳細は、表８に記載される。３つの陰性対照タンパク質（ストレプトアビジン、ＢＳＡおよび無関係のタンパク質）もまた、コートした。ＦＬＡＧタグ付きｓｃＦｖを、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充したＰＢＳ）中で１μｇ／ｍｌに希釈し、コートしたタンパク質に結合させた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いてＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよび陽性アッセイ対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖ（ストレプトアビジンに特異的）を含む、全ての試料を、二重にアッセイした。
【0146】
結果
産生および精製
４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、十分な試料純度、すなわち、ｓｃＦｖ予測分子量（約３０ｋＤａ）に相関する１つの主要バンドおよび、存在しないか、またはほんのわずかの弱いＥ．ｃｏｌｉ由来タンパク質バンドを示した（図３）。
参照クローンｍＡｂ４７は、しかし、低い試料純度を示し、複数のＥ．ｃｏｌｉ由来タンパク質バンドを有した。また、その予測分子量に対応するタンパク質バンドは、ゲル上の全ての他のバンドに比べてかなり弱く、このクローンの低い試料濃度を示した。
精製されたｓｃＦｖ試料のタンパク質濃度は、標準ＢＣＡアッセイにより測定された。全ての４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンは、０．１～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の十分なタンパク質濃度で精製された。
産生および精製
４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、十分な試料純度、すなわち、ｓｃＦｖ予測分子量（約３０ｋＤａ）に相関する１つの主要バンドおよび、存在しないか、またはほんのわずかの弱いＥ．ｃｏｌｉ由来タンパク質バンドを示した（図３）。
参照クローンｍＡｂ４７は、しかし、低い試料純度を示し、複数のＥ．ｃｏｌｉ由来タンパク質バンドを有した。また、その予測分子量に対応するタンパク質バンドは、ゲル上の全ての他のバンドに比べてかなり弱く、このクローンの低い試料濃度を示した。
精製されたｓｃＦｖ試料のタンパク質濃度は、標準ＢＣＡアッセイにより測定された。全ての４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンは、０．１～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の十分なタンパク質濃度で精製された。
【0147】
ＥＬＩＳＡ
精製されたＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンのほとんどは、それらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示し、コートした陰性対照タンパク質に対しては、非結合または極めて低い結合を示した。しかし、低または非抗原結合を示すいくつかのクローンが存在した。
精製されたＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンのほとんどは、それらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示し、コートした陰性対照タンパク質に対しては、非結合または極めて低い結合を示した。しかし、低または非抗原結合を示すいくつかのクローンが存在した。
【0148】
結論
４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７は、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ機器で小規模で精製された。参照クローンｍＡｂ４７を除く、全てのｓｃＦｖクローンは、十分な試料純度および十分なタンパク質濃度を示した。
ＥＬＩＳＡベース手法でアッセイした場合、クローンの大部分は、それらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示した。しかし、いくつかのクローンは、予測通りには機能せず、低い結合または非抗原結合を有した。
４４個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７は、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ機器で小規模で精製された。参照クローンｍＡｂ４７を除く、全てのｓｃＦｖクローンは、十分な試料純度および十分なタンパク質濃度を示した。
ＥＬＩＳＡベース手法でアッセイした場合、クローンの大部分は、それらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示した。しかし、いくつかのクローンは、予測通りには機能せず、低い結合または非抗原結合を有した。
【0149】
実施例７－ＥＬＩＳＡによる４４個のｓｃＦｖクローンのヒトＩＬ１３Ｒα１に対する結合の調査
実施例６で小規模タンパク質精製のための選択された４４個のクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡベース手法を用いてヒトＩＬ１３Ｒα１への結合について試験した。
結果は、全てのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンがそれらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示し、ヒトＩＬ１３Ｒα１に対しては有意な結合がなかったことを、示した。同じ結果はが、参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖについても得られた。
実施例６で小規模タンパク質精製のための選択された４４個のクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡベース手法を用いてヒトＩＬ１３Ｒα１への結合について試験した。
結果は、全てのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンがそれらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示し、ヒトＩＬ１３Ｒα１に対しては有意な結合がなかったことを、示した。同じ結果はが、参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖについても得られた。
【0150】
材料と方法
コーティングタンパク質ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１）、ｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃７１４７－ＩＲ）、ｍＩｌ１３Ｒα２－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃５３９－ＩＲ）およびｈＩＬ１３Ｒα１－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃１４６－ＩＲ）を、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈し、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートに直接コートした。２つの陰性対照タンパク質、ストレプトアビジンおよび無関係のタンパク質もまた、コートした。４℃で一晩コーティングタンパク質とのプレートのインキュベーション後に、プレートを、ミリＱ水で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充したＰＢＳ）中で２時間ブロックした。細菌上清中に存在するトリプルＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンを、ブロッキング緩衝液中で１：１０に希釈し、結合させた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いて、１－ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで分析した。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよび陽性ＥＬＩＳＡ対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖ（ストレプトアビジンに特異的）を含む、全ての試料を、二重にアッセイした。
コーティングタンパク質ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１）、ｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃７１４７－ＩＲ）、ｍＩｌ１３Ｒα２－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃５３９－ＩＲ）およびｈＩＬ１３Ｒα１－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃１４６－ＩＲ）を、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈し、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートに直接コートした。２つの陰性対照タンパク質、ストレプトアビジンおよび無関係のタンパク質もまた、コートした。４℃で一晩コーティングタンパク質とのプレートのインキュベーション後に、プレートを、ミリＱ水で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充したＰＢＳ）中で２時間ブロックした。細菌上清中に存在するトリプルＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンを、ブロッキング緩衝液中で１：１０に希釈し、結合させた。結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にし、続いて、１－ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とインキュベーションした。比色分析シグナル発生を、１Ｍの硫酸を添加することにより停止し、プレートを、４５０ｎｍで分析した。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖおよび陽性ＥＬＩＳＡ対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖ（ストレプトアビジンに特異的）を含む、全ての試料を、二重にアッセイした。
【0151】
結果
全てのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンは、以前に報告されたように（実施例３および実施例５）、それらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示した（図４）。ヒトＩＬ１３Ｒα１に対して、または陰性対照タンパク質に対して、有意な結合は、いずれのクローンの場合も、検出できなかった。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対してのみ結合を示し、マウスＩＬ１３Ｒα２またはヒトＩＬ１３Ｒα１へは結合を示さず、および陽性アッセイ対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖは、ストレプトアビジンコートウェルに結合した。
全てのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンは、以前に報告されたように（実施例３および実施例５）、それらの目的の抗原、ヒトおよび／またはマウスＩＬ１３Ｒα２への結合を示した（図４）。ヒトＩＬ１３Ｒα１に対して、または陰性対照タンパク質に対して、有意な結合は、いずれのクローンの場合も、検出できなかった。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対してのみ結合を示し、マウスＩＬ１３Ｒα２またはヒトＩＬ１３Ｒα１へは結合を示さず、および陽性アッセイ対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖは、ストレプトアビジンコートウェルに結合した。
【0152】
結論
ヒトＩＬ１３Ｒα１に対する有意な結合は、細菌上清からアッセイされた場合、４４個のいずれのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンでも、または参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖでも、検出できなかった（図４）。
動力学的選別結果（実施例５）とは対照的に、ここでの全てのクローンは、ａｖｉタグ付きおよびＦｃ融合の両方のヒトＩＬ１３Ｒα２タンパク質への結合を示した。対照的に、実施例５では、４４個のクローンの１２個は、Ｆｃ融合バリアントへの測定可能な結合を示さなかった。この矛盾は、２つの方法の感度の差異により説明できる可能性が高いが、実験構成の差異による可能性もある。この実施例では、受容体は、表面に付着され、一方で実施例５および９では、受容体は溶液中にある。受容体のタグまたは融合タンパク質の差異は、どのように抗原が挙動するか、および異なるエピトープが２つの実験構成中でどのように異なって提示されるかに関して大きな影響を与え得る。
マウスＩＬ１３Ｒα２への結合は、以前のＳＰＲデータ（実施例５）とうまく相関する、すなわち、親和性選別で標的に対し測定可能な結合を示さないｓｃＦｖはまた、この実験構成では、「非バインダー」と見なされる。
いくつかのｓｃＦｖは、全ての分析されたタンパク質（Ｗ－ＭＥ１０７－９７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０１、Ｗ－ＭＥ１０７－１２９、Ｗ－ＭＥ１０７－１３０、Ｗ－ＭＥ１０７－１３７、Ｗ－ＭＥ１０７－１４１、Ｗ－ＭＥ１０７－１５１、Ｗ－ＭＥ１０７－１５７で代表される）に対して低いシグナルを示した（図４）。
ヒトＩＬ１３Ｒα１に対する有意な結合は、細菌上清からアッセイされた場合、４４個のいずれのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンでも、または参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖでも、検出できなかった（図４）。
動力学的選別結果（実施例５）とは対照的に、ここでの全てのクローンは、ａｖｉタグ付きおよびＦｃ融合の両方のヒトＩＬ１３Ｒα２タンパク質への結合を示した。対照的に、実施例５では、４４個のクローンの１２個は、Ｆｃ融合バリアントへの測定可能な結合を示さなかった。この矛盾は、２つの方法の感度の差異により説明できる可能性が高いが、実験構成の差異による可能性もある。この実施例では、受容体は、表面に付着され、一方で実施例５および９では、受容体は溶液中にある。受容体のタグまたは融合タンパク質の差異は、どのように抗原が挙動するか、および異なるエピトープが２つの実験構成中でどのように異なって提示されるかに関して大きな影響を与え得る。
マウスＩＬ１３Ｒα２への結合は、以前のＳＰＲデータ（実施例５）とうまく相関する、すなわち、親和性選別で標的に対し測定可能な結合を示さないｓｃＦｖはまた、この実験構成では、「非バインダー」と見なされる。
いくつかのｓｃＦｖは、全ての分析されたタンパク質（Ｗ－ＭＥ１０７－９７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０１、Ｗ－ＭＥ１０７－１２９、Ｗ－ＭＥ１０７－１３０、Ｗ－ＭＥ１０７－１３７、Ｗ－ＭＥ１０７－１４１、Ｗ－ＭＥ１０７－１５１、Ｗ－ＭＥ１０７－１５７で代表される）に対して低いシグナルを示した（図４）。
【0153】
実施例８－細胞結合
選択ｓｃＦｖのＩＬ１３Ｒα２発現細胞への結合を評価して、標的細胞の表面上の受容体に対する結合も確認した。
選択ｓｃＦｖのＩＬ１３Ｒα２発現細胞への結合を評価して、標的細胞の表面上の受容体に対する結合も確認した。
【0154】
材料と方法
ＩＬ１３Ｒα２発現細胞に対するｓｃＦｖ結合を、１００ｎｇの精製ｓｃＦｖ（実施例６）をヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧ（確認済みＩＬ１３Ｒα２発現を有するオリジナルＵｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙクローン、ＰＭＩＤ：２７５８２０６１）またはヒト非小細胞肺癌細胞（Ａ５４９）の１ｘ１０５個の細胞と室温（ＲＴ）（約２０～２５℃）で２０分間インキュベートすることにより評価した。ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧは、高レベルのヒトＩＬ１３Ｒα２（ｈＩＬ１３Ｒα２）を内因性に発現し、一方、ヒト非小細胞肺癌細胞は、ｈＩＬ１３Ｒα２を発現しない。
洗浄（１ｘＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、３ｍＭのＥＤＴＡ）後、ＦＬＡＧタグを、室温で２０分間ＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いて染色した。読み取りを、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を用いて実施した。
ＩＬ１３Ｒα２発現細胞に対するｓｃＦｖ結合を、１００ｎｇの精製ｓｃＦｖ（実施例６）をヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧ（確認済みＩＬ１３Ｒα２発現を有するオリジナルＵｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙクローン、ＰＭＩＤ：２７５８２０６１）またはヒト非小細胞肺癌細胞（Ａ５４９）の１ｘ１０５個の細胞と室温（ＲＴ）（約２０～２５℃）で２０分間インキュベートすることにより評価した。ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧは、高レベルのヒトＩＬ１３Ｒα２（ｈＩＬ１３Ｒα２）を内因性に発現し、一方、ヒト非小細胞肺癌細胞は、ｈＩＬ１３Ｒα２を発現しない。
洗浄（１ｘＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、３ｍＭのＥＤＴＡ）後、ＦＬＡＧタグを、室温で２０分間ＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いて染色した。読み取りを、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を用いて実施した。
【0155】
結果
選択ｓｃＦｖをＩＬ１３Ｒα２発現細胞とインキュベートして、標的細胞の表面上の受容体に対する結合も確認した。全てのｓｃＦｖは、高レベルのｈＩＬ１３Ｒα２を内因性に発現するヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧに特異的に結合し得るが、陰性対照のヒト非小細胞肺癌細胞（Ａ５４９）には結合しなかった（図５）。
選択ｓｃＦｖをＩＬ１３Ｒα２発現細胞とインキュベートして、標的細胞の表面上の受容体に対する結合も確認した。全てのｓｃＦｖは、高レベルのｈＩＬ１３Ｒα２を内因性に発現するヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧに特異的に結合し得るが、陰性対照のヒト非小細胞肺癌細胞（Ａ５４９）には結合しなかった（図５）。
【0156】
結論
フローサイトメトリーは、選択Ｗ－ＭＥ１０７クローンの細胞結合能力をうまく評価し、選択Ｗ－ＭＥ１０７クローンは、標的細胞株に対し異なる結合力を示した。オフターゲット、すなわち、非神経膠腫への結合は、この結合アッセイでは観察されなかった。
フローサイトメトリーは、選択Ｗ－ＭＥ１０７クローンの細胞結合能力をうまく評価し、選択Ｗ－ＭＥ１０７クローンは、標的細胞株に対し異なる結合力を示した。オフターゲット、すなわち、非神経膠腫への結合は、この結合アッセイでは観察されなかった。
【0157】
実施例９－１１個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンに対するＳＰＲによる単一サイクル動力学
単一サイクル動力学的手法を用いた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）分析を、実施例５、７および８の結果に基づいて選択された１１個の最も有望なＷ－ＭＥ１０７クローン、および参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖに対して実施して、それぞれ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対するそれらの動力学的パラメーターを決定した。
得られたデータの解析は、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２に両方に対する低ナノモル範囲のＫＤ値を示す最高親和性結合クローンを示した。
単一サイクル動力学的手法を用いた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）分析を、実施例５、７および８の結果に基づいて選択された１１個の最も有望なＷ－ＭＥ１０７クローン、および参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖに対して実施して、それぞれ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対するそれらの動力学的パラメーターを決定した。
得られたデータの解析は、ヒトおよびマウスＩＬ１３Ｒα２に両方に対する低ナノモル範囲のＫＤ値を示す最高親和性結合クローンを示した。
【0158】
材料と方法
捕捉リガンドとして機能する、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ１８０４）を、製造業者の推奨条件に従い、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００測定器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４つ全ての表面上に固定した。
プロテインＡ精製ＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７クローンを、それぞれ注入し、クローン間の応答単位（ＲＵ）が等しくなるように、チップ表面上に捕捉した。参照クローンｍＡｂ４７は、しかし、タンパク質精製があまりに低い収率であったので（実施例６）細菌上清から非精製で捕捉された。
３倍希釈系列の１．２～１００ｎＭの間の５種の濃度範囲からなる、それぞれヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを、ランニング緩衝液（０．０５％のツイーン２０（登録商標）を補充したＨＢＳ、ｐＨ７．５）中で調製し、順次チップ上に注入した。解離段階（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）の後、チップ表面を、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１で再生した。
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体が固定されている表面の、参照表面の応答曲線を差し引くことにより、全てのｓｃＦｖクローンの応答曲線センサーグラムを得た。データを、ＢＩＡｅｖａｌバージョン３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて解析し、動力学的パラメーターを、１：１ラングミュア結合モデルを仮定して計算した。
捕捉リガンドとして機能する、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ１８０４）を、製造業者の推奨条件に従い、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００測定器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４つ全ての表面上に固定した。
プロテインＡ精製ＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７クローンを、それぞれ注入し、クローン間の応答単位（ＲＵ）が等しくなるように、チップ表面上に捕捉した。参照クローンｍＡｂ４７は、しかし、タンパク質精製があまりに低い収率であったので（実施例６）細菌上清から非精製で捕捉された。
３倍希釈系列の１．２～１００ｎＭの間の５種の濃度範囲からなる、それぞれヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃを、ランニング緩衝液（０．０５％のツイーン２０（登録商標）を補充したＨＢＳ、ｐＨ７．５）中で調製し、順次チップ上に注入した。解離段階（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）の後、チップ表面を、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１で再生した。
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体が固定されている表面の、参照表面の応答曲線を差し引くことにより、全てのｓｃＦｖクローンの応答曲線センサーグラムを得た。データを、ＢＩＡｅｖａｌバージョン３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて解析し、動力学的パラメーターを、１：１ラングミュア結合モデルを仮定して計算した。
【0159】
結果
データは、全てのＷ－ＭＥ１０７クローンがヒトｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉに対し、低ナノモル～ナノモル範囲の親和性を示し、最高の親和性クローンは、３．１ｎＭのＫＤ値を有するＷ－ＭＥ１０７－２７であったこと、を示した（表１０）。
４つのクローン（Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７、Ｗ－ＭＥ１０７－１２８およびＷ－ＭＥ１０７－１５６）以外の全ては、マウスバージョンの受容体にも結合した。これは、実施例５で示したデータとよく相関した。
意外にも、全ての分析されたクローンは、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉへの結合を明確に示したが、約半分のみが、Ｆｃ融合ヒト構築物（ｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ）への結合を示した。これは、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉに対して高い応答を示した（＞５０ＲＵ）がＦｃ融合ヒト構築物に対してはほとんど何の応答も示さなかった、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１４３およびＷ－ＭＥ１０７－１５０により実証された。これは、動力学的選別分析（実施例５）中にも確認された。
データは、全てのＷ－ＭＥ１０７クローンがヒトｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉに対し、低ナノモル～ナノモル範囲の親和性を示し、最高の親和性クローンは、３．１ｎＭのＫＤ値を有するＷ－ＭＥ１０７－２７であったこと、を示した（表１０）。
４つのクローン（Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７、Ｗ－ＭＥ１０７－１２８およびＷ－ＭＥ１０７－１５６）以外の全ては、マウスバージョンの受容体にも結合した。これは、実施例５で示したデータとよく相関した。
意外にも、全ての分析されたクローンは、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉへの結合を明確に示したが、約半分のみが、Ｆｃ融合ヒト構築物（ｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ）への結合を示した。これは、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉに対して高い応答を示した（＞５０ＲＵ）がＦｃ融合ヒト構築物に対してはほとんど何の応答も示さなかった、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１４３およびＷ－ＭＥ１０７－１５０により実証された。これは、動力学的選別分析（実施例５）中にも確認された。
【0160】
ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉへの参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（細菌上清中に存在する）の結合親和性、ＫＤ（Ｍ）は、１．１ｎＭと特定された。
全てのｓｃＦｖ試料は、細菌上清中に存在するクローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを除いて精製試料として存在する。「－－」として報告された値は、結合パラメーターが決定できなかったことを示す。「＊＊」として報告された値は、低結合応答（ＲＵ）のために不確定データであることを示す。
【表10】
【0161】
結論
１１個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７に対する単一サイクル反応速度手法は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００機器でうまく実施された。ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃのそれぞれについて各クローンの得られた動力学的パラメーターは、動力学的選別分析（実施例５）の間に得られた推定親和性とよく相関した。最高の親和性結合クローン、Ｗ－ＭＥ１０７－２７は、３．１ｎＭのＫＤ値を有した。Ｗ－ＭＥ１０７－２７はまた、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対しても最高の親和性（ＫＤ＝２．４ｎＭ）を示したクローンであった。
１１個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７に対する単一サイクル反応速度手法は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００機器でうまく実施された。ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ、ヒトＩＬ１３Ｒα２－ＦｃおよびマウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃのそれぞれについて各クローンの得られた動力学的パラメーターは、動力学的選別分析（実施例５）の間に得られた推定親和性とよく相関した。最高の親和性結合クローン、Ｗ－ＭＥ１０７－２７は、３．１ｎＭのＫＤ値を有した。Ｗ－ＭＥ１０７－２７はまた、マウスＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対しても最高の親和性（ＫＤ＝２．４ｎＭ）を示したクローンであった。
【0162】
意外にも、この実施例では、いくつかのクローンはｈＬ１３Ｒα２－ａｖｉへの良好な結合を示したが、ｈＩＬ１３Ｒ２α２－Ｆｃに対してはそうではなかった（Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１４３およびＷ－ＭＥ１０７－１５０）。これは、これらのタンパク質構築物中に含まれたアミノ酸はほとんど同一であるという事実にもかかわらずである（表８）。しかし、異なるエピトープは、２つの構築物では異なって提示される可能性がある。例えば、Ｆｃ融合により起こるダイマー化は、いくつかのエピトープの立体障害を引き起こす可能性がある。
【0163】
実施例１０－ナノＤＳＦによる１１個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンのＴｍ測定
１１個の精製Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンを、安定性を評価するためにＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８機器でのナノＤＳＦによる融解温度、Ｔｍ（℃）測定に供した。
１１個の精製Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンを、安定性を評価するためにＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８機器でのナノＤＳＦによる融解温度、Ｔｍ（℃）測定に供した。
【0164】
材料と方法
ナノＤＳＦ技術は、タンパク質が熱変性を受けている間にそのタンパク質の固有蛍光を測定し、それにより天然の条件下でタンパク質のアンフォールディングの特性を明らかにする。
プロテインＡ精製Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン（実施例６）を、ＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、「高感度」キャピラリー（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ ＃ＰＲ－Ｃ００６）に毛管力によりロードし、次にこれをＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８機器に取り付けた。融解温度傾斜部を、２０℃～９５℃、１℃／分加熱に設定した。
トリプトファン排出を、３３０ｎｍおよび３５０ｎｍで測定し、計算された比率を温度に対してプロットして、各クローンの融解曲線を得て、これからＴｍ値を、ソフトウェアＰＲ．ＴｈｅｒｍｏＣｏｎｔｒｏｌ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｉｎｃ）を用いて推定した。
ナノＤＳＦ技術は、タンパク質が熱変性を受けている間にそのタンパク質の固有蛍光を測定し、それにより天然の条件下でタンパク質のアンフォールディングの特性を明らかにする。
プロテインＡ精製Ｗ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン（実施例６）を、ＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、「高感度」キャピラリー（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ ＃ＰＲ－Ｃ００６）に毛管力によりロードし、次にこれをＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８機器に取り付けた。融解温度傾斜部を、２０℃～９５℃、１℃／分加熱に設定した。
トリプトファン排出を、３３０ｎｍおよび３５０ｎｍで測定し、計算された比率を温度に対してプロットして、各クローンの融解曲線を得て、これからＴｍ値を、ソフトウェアＰＲ．ＴｈｅｒｍｏＣｏｎｔｒｏｌ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｉｎｃ）を用いて推定した。
【0165】
結果
融解温度を、ナノＤＳＦにより決定した。表１１は、１１個のｓｃＦｖクローンのそれぞれのＴｍ値（変曲点）を示す。
融解温度を、ナノＤＳＦにより決定した。表１１は、１１個のｓｃＦｖクローンのそれぞれのＴｍ値（変曲点）を示す。
【表11】
【0166】
結論
融解温度、Ｔｍ（℃）を、１１個全てのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンについて決定できた。Ｔｍ値は、予測範囲内にあり、それぞれ５５℃と５７℃の幾分低いＴｍ値を示したＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１４３を除き全てのクローンで、約６０℃＜Ｔｍ＜７０℃であった。
また、全てのクローンは、２つの融解イベントを示したＷ－ＭＥ１０７－７を除き１個のみの融解イベントを示した。これはおそらく、トリプトファン含有混入物またはＷ－ＭＥ１０７－７の不均一混合物（存在するフォールドおよびミスフォールド集団）に起因する可能性がある。
決定されたＴｍ値は、タンパク質安定性測定値として使用でき、得られたデータは、この分析に含まれた他のｓｃＦｖクローンに比べて、クローンＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１４３では、より低い安定性を示す。
融解温度、Ｔｍ（℃）を、１１個全てのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンについて決定できた。Ｔｍ値は、予測範囲内にあり、それぞれ５５℃と５７℃の幾分低いＴｍ値を示したＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１４３を除き全てのクローンで、約６０℃＜Ｔｍ＜７０℃であった。
また、全てのクローンは、２つの融解イベントを示したＷ－ＭＥ１０７－７を除き１個のみの融解イベントを示した。これはおそらく、トリプトファン含有混入物またはＷ－ＭＥ１０７－７の不均一混合物（存在するフォールドおよびミスフォールド集団）に起因する可能性がある。
決定されたＴｍ値は、タンパク質安定性測定値として使用でき、得られたデータは、この分析に含まれた他のｓｃＦｖクローンに比べて、クローンＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１４３では、より低い安定性を示す。
【0167】
実施例１１－ＳＰＲによるＩＬ１３Ｒα２へのＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖの結合のＩＬ１３阻害の解析
１２個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、ＳＰＲに基づく手法を用いて受容体への結合についてＩＬ１３と競合するそれらの能力について解析した。
各Ｗ－ＭＥ１０７クローンを、ＳＰＲチップ表面に固定された抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体上に捕捉し、ＩＬ１３α２受容体それ自体に、ならびにＩＬ－１３とプレインキュベートされたＩＬ１３Ｒα２に結合させた。
１２個のクローンのうちの７個、Ｗ－ＭＥ１０７－７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－６７、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１５０が、受容体への結合に関してＩＬ－１３競合を示したことが見出された。ここで、いくつかのクローンは、存在するＩＬ－１３との結合のほぼ完全な喪失を示し、いくつかのクローンは、受容体への結合の部分的喪失のみを示した。陰性対照タンパク質とプレインキュベートされたＩＬ１３Ｒα２へのクローンの結合は、受容体結合を遮断できなかった。これらの知見は、これら７個のクローンが、受容体上のＩＬ－１３のリガンド結合部位と重なり合う、またはそれに極めて接近して、結合エピトープを有することを示す。
１２個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンおよび参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖを、ＳＰＲに基づく手法を用いて受容体への結合についてＩＬ１３と競合するそれらの能力について解析した。
各Ｗ－ＭＥ１０７クローンを、ＳＰＲチップ表面に固定された抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体上に捕捉し、ＩＬ１３α２受容体それ自体に、ならびにＩＬ－１３とプレインキュベートされたＩＬ１３Ｒα２に結合させた。
１２個のクローンのうちの７個、Ｗ－ＭＥ１０７－７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－６７、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２、Ｗ－ＭＥ１０７－１５０が、受容体への結合に関してＩＬ－１３競合を示したことが見出された。ここで、いくつかのクローンは、存在するＩＬ－１３との結合のほぼ完全な喪失を示し、いくつかのクローンは、受容体への結合の部分的喪失のみを示した。陰性対照タンパク質とプレインキュベートされたＩＬ１３Ｒα２へのクローンの結合は、受容体結合を遮断できなかった。これらの知見は、これら７個のクローンが、受容体上のＩＬ－１３のリガンド結合部位と重なり合う、またはそれに極めて接近して、結合エピトープを有することを示す。
【0168】
ＩＬ－１３の存在により影響を受けなかった５個のクローン、すなわち、Ｗ－ＭＥ１０７－１６、Ｗ－ＭＥ１０７－７５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７、Ｗ－ＭＥ１０７－１２８、およびＷ－ＭＥ１０７－１５６は、ＩＬ１３Ｒα２のＩＬ－１３結合部位とは異なるエピトープに結合した。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、この実験では、結合活性を示さず、そのため、データを取得できなかった。しかし、文献では、この抗体がＩＬ１３Ｒα２への結合に関しＩＬ－１３と競合することが報告されている（Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７）。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖは、この実験では、結合活性を示さず、そのため、データを取得できなかった。しかし、文献では、この抗体がＩＬ１３Ｒα２への結合に関しＩＬ－１３と競合することが報告されている（Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７）。
【0169】
材料と方法
捕捉リガンドとして機能する、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ１８０４）を、製造業者の推奨条件に従い、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＥＣＤ／ＮＨＳ化学によりＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４つ全ての表面上に固定した。
１２個のプロテインＡ精製ＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７クローン（実施例６）、陽性参照クローンｍＡｂ４７および陰性対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖ（ストレプトアビジンに特異的）を、注入し、チップ表面上に捕捉し、続いて１００ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１）、１００ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ＋２００ｎＭのＩＬ１３（Ｐｒｏｓｐｅｃ ＃ｃｙｔ－４４６）、１００ｎＭのＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ＋２００ｎＭのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ＳＡ４７６２）または２００ｎＭのストレプトアビジンを注入した。表面を、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１で再生した。全ての実験は、０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充されたＨＢＳ、ｐＨ７．５中、２５℃で実施された。
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体が固定されている表面の、参照表面の応答曲線を減算することにより、全てのｓｃＦｖクローンの応答曲線センサーグラムを得た。
捕捉リガンドとして機能する、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ１８０４）を、製造業者の推奨条件に従い、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＥＣＤ／ＮＨＳ化学によりＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４つ全ての表面上に固定した。
１２個のプロテインＡ精製ＦＬＡＧタグ付きＷ－ＭＥ１０７クローン（実施例６）、陽性参照クローンｍＡｂ４７および陰性対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖ（ストレプトアビジンに特異的）を、注入し、チップ表面上に捕捉し、続いて１００ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１）、１００ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ＋２００ｎＭのＩＬ１３（Ｐｒｏｓｐｅｃ ＃ｃｙｔ－４４６）、１００ｎＭのＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ＋２００ｎＭのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ＳＡ４７６２）または２００ｎＭのストレプトアビジンを注入した。表面を、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１で再生した。全ての実験は、０．０５％ツイーン２０（登録商標）を補充されたＨＢＳ、ｐＨ７．５中、２５℃で実施された。
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体が固定されている表面の、参照表面の応答曲線を減算することにより、全てのｓｃＦｖクローンの応答曲線センサーグラムを得た。
【0170】
結果
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体は、ＣＭ５シリーズＳチップの４つ全ての面上にうまく固定された。ｓｃＦｖクローン捕捉および抗原注入後に、チップ表面は、低ｐＨによりうまく再生された。
全ての１２個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンは、ｈＩＬ１３Ｒα２に対して、ならびに陰性対照ストレプトアビジンとプレインキュベートされたｈＩＬ１３Ｒα２に対して結合を示した。また、いずれのクローンも、ストレプトアビジン単独に対する結合を示さなかった。
クローンを、ＩＬ－１３とプレインキュベートされたｈＩＬ１３Ｒα２に対する結合に関して試験した場合、５個のクローン（Ｗ－ＭＥ１０７－１６、Ｗ－ＭＥ１０７－７５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７、Ｗ－ＭＥ１０７－１２８、およびＷ－ＭＥ１０７－１５６）のみが、受容体リガンド複合体に対する保持された結合を示した。残りの７個のクローン（Ｗ－ＭＥ１０７－７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－６７、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２およびＷ－ＭＥ１０７－１５０）について、結合は、ＩＬ－１３の存在によりほとんど完全に遮断され、これは、応答単位（ＲＵ）の減少により示された（図６）。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖの結合活性は、認められなかった。予想通り、陰性対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖは、ストレプトアビジンとプレインキュベートされたｈＩＬ１３Ｒα２、ならびにストレプトアビジン単独に対する結合のみを示した。
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体は、ＣＭ５シリーズＳチップの４つ全ての面上にうまく固定された。ｓｃＦｖクローン捕捉および抗原注入後に、チップ表面は、低ｐＨによりうまく再生された。
全ての１２個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンは、ｈＩＬ１３Ｒα２に対して、ならびに陰性対照ストレプトアビジンとプレインキュベートされたｈＩＬ１３Ｒα２に対して結合を示した。また、いずれのクローンも、ストレプトアビジン単独に対する結合を示さなかった。
クローンを、ＩＬ－１３とプレインキュベートされたｈＩＬ１３Ｒα２に対する結合に関して試験した場合、５個のクローン（Ｗ－ＭＥ１０７－１６、Ｗ－ＭＥ１０７－７５、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７、Ｗ－ＭＥ１０７－１２８、およびＷ－ＭＥ１０７－１５６）のみが、受容体リガンド複合体に対する保持された結合を示した。残りの７個のクローン（Ｗ－ＭＥ１０７－７、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－５５、Ｗ－ＭＥ１０７－６７、Ｗ－ＭＥ１０７－１１２およびＷ－ＭＥ１０７－１５０）について、結合は、ＩＬ－１３の存在によりほとんど完全に遮断され、これは、応答単位（ＲＵ）の減少により示された（図６）。
参照クローンｍＡｂ４７ ｓｃＦｖの結合活性は、認められなかった。予想通り、陰性対照Ｇ－ｓｔｒｅｐ－１ ｓｃＦｖは、ストレプトアビジンとプレインキュベートされたｈＩＬ１３Ｒα２、ならびにストレプトアビジン単独に対する結合のみを示した。
【0171】
結論
結果は、１２個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンのうちの７個が、ＩＬ－１３が存在する場合ｈＩＬ１３Ｒα２受容体を結合できなかったことを示した。これらの結果は、これらのクローンが、受容体上のＩＬ－１３のリガンド結合部位と重なり合う、または極めて接近して、結合エピトープを有したことを示す。残りの５個のクローンは、ＩＬ－１３が受容体に結合された場合にも、ｈＩＬ１３Ｒα２に結合できた。
ＩＬ－１３と結合の競合を示す全てのクローンはまた、以前に実施した動力学的測定でＦｃ融合ヒトＩＬ１３Ｒα２構築物（ｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ ＃７１４７－ＩＲ）への検出可能な結合が全くないこと、または極めてわずかな結合を示した（実施例５および実施例９）。
結果は、１２個のＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローンのうちの７個が、ＩＬ－１３が存在する場合ｈＩＬ１３Ｒα２受容体を結合できなかったことを示した。これらの結果は、これらのクローンが、受容体上のＩＬ－１３のリガンド結合部位と重なり合う、または極めて接近して、結合エピトープを有したことを示す。残りの５個のクローンは、ＩＬ－１３が受容体に結合された場合にも、ｈＩＬ１３Ｒα２に結合できた。
ＩＬ－１３と結合の競合を示す全てのクローンはまた、以前に実施した動力学的測定でＦｃ融合ヒトＩＬ１３Ｒα２構築物（ｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ ＃７１４７－ＩＲ）への検出可能な結合が全くないこと、または極めてわずかな結合を示した（実施例５および実施例９）。
【0172】
実施例１２－クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１を用いるエピトープビニング実験
完全長抗体クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１を、購入し、ＳＰＲベースのエピトープビニング手法で解析した。また、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対するその反応速度定数を、測定した。
クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１は、以下の範囲でヒトＩＬ１３Ｒα２に対し、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））として定義される親和性、ＫＤ＝０．９ｎＭを示した。
さらに、エピトープビニングデータは、クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１が、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に関し、ＩＬ－１３、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖと競合または干渉したことを示した。これは、それらが全て、受容体上で、重なり合うエピトープ、または近接したエピトープを有することを示した。データはまた、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖがヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に関し、クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１と干渉しなかったことを示し、従ってそれらが離れた非オーバーラップエピトープを有することを示す。
完全長抗体クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１を、購入し、ＳＰＲベースのエピトープビニング手法で解析した。また、ヒトＩＬ１３Ｒα２に対するその反応速度定数を、測定した。
クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１は、以下の範囲でヒトＩＬ１３Ｒα２に対し、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））として定義される親和性、ＫＤ＝０．９ｎＭを示した。
さらに、エピトープビニングデータは、クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１が、ヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に関し、ＩＬ－１３、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖと競合または干渉したことを示した。これは、それらが全て、受容体上で、重なり合うエピトープ、または近接したエピトープを有することを示した。データはまた、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖがヒトＩＬ１３Ｒα２への結合に関し、クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１と干渉しなかったことを示し、従ってそれらが離れた非オーバーラップエピトープを有することを示す。
【0173】
材料と方法
単一サイクル動力学、ＳＣＫ
参照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃ＮＥＵＴ－１１９０ＱＣ）を、１０ｎＭのＮａＡｃ ｐＨ４．０中の５０μｇ／ｍｌに希釈し、製造業者推奨条件に従いＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用してＣＭ５シリーズＳチップ上に固定した。ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉの５種の濃度からなる、５０ｎＭから０．２ｎＭの範囲の４倍希釈系列を、チップ表面上に順次注入した。
結合センサーグラムを、ブランク参照表面センサーグラム（リガンド固定なし）で減算し、１：１ラングミュア結合モデルに当てはめて、動力学的パラメーター、Ｋａ（Ｍ－１ｓ－１）、Ｋｄ（ｓ－１）およびＫＤ（Ｍ）を取得した。
単一サイクル動力学、ＳＣＫ
参照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃ＮＥＵＴ－１１９０ＱＣ）を、１０ｎＭのＮａＡｃ ｐＨ４．０中の５０μｇ／ｍｌに希釈し、製造業者推奨条件に従いＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用してＣＭ５シリーズＳチップ上に固定した。ヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉの５種の濃度からなる、５０ｎＭから０．２ｎＭの範囲の４倍希釈系列を、チップ表面上に順次注入した。
結合センサーグラムを、ブランク参照表面センサーグラム（リガンド固定なし）で減算し、１：１ラングミュア結合モデルに当てはめて、動力学的パラメーター、Ｋａ（Ｍ－１ｓ－１）、Ｋｄ（ｓ－１）およびＫＤ（Ｍ）を取得した。
【0174】
エピトープビニング
１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、単独でまたは１０倍モル過剰（１００ｎＭ）のヒトＩＬ－１３（Ｐｒｏｓｐｅｃ ＃ｃｙｔ－４４６）またはＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５またはＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖクローンとプレインキュベートして、固定化されたクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１表面に、注入した。対照試料として、１０倍モル過剰のＢＩ－８ ｓｃＦｖ（陰性対照）またはクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１（陽性対照）とプレインキュベートされた１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉも、評価した。結合段階（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）後に、チップ表面を、１０ｎＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．１を用いて再生した。結合センサーグラムを、ブランク参照表面センサーグラム（固定された抗体なし）で減算し、各試料の結合レベル、応答単位（ＲＵ）を取得可能できた。
１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、単独でまたは１０倍モル過剰（１００ｎＭ）のヒトＩＬ－１３（Ｐｒｏｓｐｅｃ ＃ｃｙｔ－４４６）またはＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５またはＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖクローンとプレインキュベートして、固定化されたクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１表面に、注入した。対照試料として、１０倍モル過剰のＢＩ－８ ｓｃＦｖ（陰性対照）またはクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１（陽性対照）とプレインキュベートされた１０ｎＭのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉも、評価した。結合段階（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）後に、チップ表面を、１０ｎＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．１を用いて再生した。結合センサーグラムを、ブランク参照表面センサーグラム（固定された抗体なし）で減算し、各試料の結合レベル、応答単位（ＲＵ）を取得可能できた。
【0175】
結果
クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１は、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用してＣＭ５シリーズＳチップ上にうまく固定され、１０ｎＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．１で再生後、活性が維持された。
ｈＩＬ１３Ｒα２に対するクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１の親和性は、ナノモル以下の範囲で、０．９ｎＭのＫＤ値であると特定された。観察された結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）は、それぞれ、５．９ｘ１０５Ｍ－１ｓ－１および５．４ｘ１０－４ｓ－１であると特定された。
エピトープビニングは、ｈＩＬ１３Ｒα２が１０倍のモル過剰のヒトＩＬ－１３、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖまたは陽性対照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１とそれぞれプレインキュベートされ、続いてクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１固定化表面上に注入された場合、観察される結合応答（ＲＵ、ｙ軸）は、ｈＩＬ１３Ｒα２単独の注入に比べて減少したことを示した（図７）。これは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖ、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖおよび陰性対照ＢＩ－８ ｓｃＦｖについては観察されず、これらの場合には、結合応答は、ｈＩＬ１３Ｒα２単独の注入とほとんど同じであった（図７）。
クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１は、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用してＣＭ５シリーズＳチップ上にうまく固定され、１０ｎＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．１で再生後、活性が維持された。
ｈＩＬ１３Ｒα２に対するクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１の親和性は、ナノモル以下の範囲で、０．９ｎＭのＫＤ値であると特定された。観察された結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）は、それぞれ、５．９ｘ１０５Ｍ－１ｓ－１および５．４ｘ１０－４ｓ－１であると特定された。
エピトープビニングは、ｈＩＬ１３Ｒα２が１０倍のモル過剰のヒトＩＬ－１３、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖまたは陽性対照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１とそれぞれプレインキュベートされ、続いてクローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１固定化表面上に注入された場合、観察される結合応答（ＲＵ、ｙ軸）は、ｈＩＬ１３Ｒα２単独の注入に比べて減少したことを示した（図７）。これは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖ、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖおよび陰性対照ＢＩ－８ ｓｃＦｖについては観察されず、これらの場合には、結合応答は、ｈＩＬ１３Ｒα２単独の注入とほとんど同じであった（図７）。
【0176】
結論
ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する参照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１の親和性は、ナノモル以下の範囲であると特定された（０．９ｎＭのＫＤ値）。
エピトープビニング結果は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７、ならびにヒトＩＬ－１３は、ｈＩＬ１３Ｒα２受容体への結合に関し、参照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１と競合したことを示した。
エピトープビニング分析からの結果は、以前に実施したＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン（実施例１１）に対するＳＰＲ分析とよく相関した。この実施例は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖは、ｈＩＬ１３Ｒα２への結合に関しヒトＩＬ－１３と競合し、一方でＷ－ＭＥ１０７－７５およびＷ－ＭＥ１０７－１１７は、競合しなかったことを示した。
ヒトＩＬ１３Ｒα２に対する参照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１の親和性は、ナノモル以下の範囲であると特定された（０．９ｎＭのＫＤ値）。
エピトープビニング結果は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７、ならびにヒトＩＬ－１３は、ｈＩＬ１３Ｒα２受容体への結合に関し、参照クローンｍＡｂ４７ ｍＩｇＧ１と競合したことを示した。
エピトープビニング分析からの結果は、以前に実施したＷ－ＭＥ１０７ ｓｃＦｖクローン（実施例１１）に対するＳＰＲ分析とよく相関した。この実施例は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖは、ｈＩＬ１３Ｒα２への結合に関しヒトＩＬ－１３と競合し、一方でＷ－ＭＥ１０７－７５およびＷ－ＭＥ１０７－１１７は、競合しなかったことを示した。
【0177】
まとめると、実施例１１および１２の結果は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７、ならびに参照クローンｍＡｂ４７は、ヒトＩＬ１３α２受容体上のヒトＩＬ－１３結合部位に結合されるか、または極めて接近しており、一方でＷ－ＭＥ１０７－７５およびＷ－ＭＥ１０７－１１７は、そうではなかったことを示した。ＩＬ－１３およびクローンｍＡｂ４７の重なり合うエピトープはまた、Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７により示唆されている。この文献では、彼らは、プレートベース競合アッセイを用いて、この抗体によるヒト可溶性ＩＬ－１３とｈＩＬ１３Ｒα２の間の相互作用の顕著な阻害を示した。
【0178】
実施例１３－ＨＤＸ－ＭＳによるエピトープマッピング実験
タンパク質が重水（Ｄ２Ｏ）を含む緩衝液中に溶解されると、ヘテロ原子（例えば、－ＯＨ、－ＮＨ、－ＳＨ）に付着されたそれらの水素は、重水素により置換される。水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）では、重水素取り込みの速度は、ペプチド主鎖アミド基（－ＮＨＣＯ－）の分子内水素結合の程度と相関する。既に水素結合に関与している主鎖アミド－ＮＨ水素、例えば、αヘリックスまたはβシートに位置する－ＮＨＣＯ－水素は、それらの水素を受容体と共有するために利用できるそれらのＮＨ水素よりもよりゆっくり交換する。従って、無秩序な領域中に位置する主鎖アミドＨは、βシートまたはαヘリックスに関与するそれらの水素よりも速く交換する。
タンパク質が重水（Ｄ２Ｏ）を含む緩衝液中に溶解されると、ヘテロ原子（例えば、－ＯＨ、－ＮＨ、－ＳＨ）に付着されたそれらの水素は、重水素により置換される。水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）では、重水素取り込みの速度は、ペプチド主鎖アミド基（－ＮＨＣＯ－）の分子内水素結合の程度と相関する。既に水素結合に関与している主鎖アミド－ＮＨ水素、例えば、αヘリックスまたはβシートに位置する－ＮＨＣＯ－水素は、それらの水素を受容体と共有するために利用できるそれらのＮＨ水素よりもよりゆっくり交換する。従って、無秩序な領域中に位置する主鎖アミドＨは、βシートまたはαヘリックスに関与するそれらの水素よりも速く交換する。
【0179】
いまでは、リガンドのタンパク質標的への結合は、水素結合中に局所的変化、例えば、構造安定化または不安定化、をもたらすので、この技術を用いて、タンパク質複合体の結合界面を特定できる。大抵の水素の場合、Ｈ／Ｄ交換は、短寿命であり、ポリペプチド鎖が水含有溶液と接触すると直ちに、－ＯＤ、－ＳＤとして取り込まれた重水素は、水素により再度置換される。この減少は、「逆交換」と呼ばれ、それは、アミノ酸残基の側鎖に位置するヘテロ原子に結合された重水素では非常に速い。幸いにも、酸性条件（ｐＨ約２．３）および０℃近くの温度下では、ペプチド主鎖アミド基（－ＮＤＣＯ－）での逆交換は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）による分析に適合する時間枠まで遅くなる。このようにして、各Ｄ原子はＨ原子より１質量単位重くなるので、組み込みの程度は、ＭＳによりモニターできる。さらに、重水素ラベル表示が酵素タンパク質分解とさらに組み合わされる場合には、タンパク質内の異なる領域の重水素化プロファイルを、モニターできる。
【0180】
材料と方法
対照試料（ＩＬ１３Ｒα２単独）を、３μＬのヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１参照）（１．６ｍｇ／ｍＬ）を２４μＬの重水素化ＰＢＳと混合することにより調製した。抗原／ｓｃＦｖ複合体を、以下のように調製した：４０μＬのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（１．６ｍｇ／ｍＬ）を、３４．５μＬのＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖ（１．４６ｍｇ／ｍＬ）、７４μＬのＷ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖ（０．６８ｍｇ／ｍＬ）、５７．２μＬのＷ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖ（０．８８ｍｇ／ｍＬ）および１２２．８μＬのＷ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖ（０．４１ｍｇ／ｍＬ）と、各ｓｃＦｖに対し３０ｋＤａの平均分子量を用いて、１：１抗原／ｓｃＦｖモル比で混合した。複合体を、１０ｋＤａタンパク質濃縮機Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬを用いて初期の４０μＬに濃縮した。標識反応を、３μＬの抗原／ｓｃＦｖ複合体と２４μＬの重水素化ＰＢＳとを４分間、１０分間および６０分間混合することにより、実施した（二重で実施したＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５の４分インキュベーション以外は、三重で実施）。インキュベーション後に、反応を、６Ｍの尿素、１００ｍＭのＴＣＥＰおよび０．５％のＴＦＡを含む２５μＬの溶液を加えて、ｐＨを約２．３、温度を約４℃に下げることによりクエンチした。
対照試料（ＩＬ１３Ｒα２単独）を、３μＬのヒトＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（実施例Ａ１参照）（１．６ｍｇ／ｍＬ）を２４μＬの重水素化ＰＢＳと混合することにより調製した。抗原／ｓｃＦｖ複合体を、以下のように調製した：４０μＬのｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ（１．６ｍｇ／ｍＬ）を、３４．５μＬのＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖ（１．４６ｍｇ／ｍＬ）、７４μＬのＷ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖ（０．６８ｍｇ／ｍＬ）、５７．２μＬのＷ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖ（０．８８ｍｇ／ｍＬ）および１２２．８μＬのＷ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖ（０．４１ｍｇ／ｍＬ）と、各ｓｃＦｖに対し３０ｋＤａの平均分子量を用いて、１：１抗原／ｓｃＦｖモル比で混合した。複合体を、１０ｋＤａタンパク質濃縮機Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬを用いて初期の４０μＬに濃縮した。標識反応を、３μＬの抗原／ｓｃＦｖ複合体と２４μＬの重水素化ＰＢＳとを４分間、１０分間および６０分間混合することにより、実施した（二重で実施したＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５の４分インキュベーション以外は、三重で実施）。インキュベーション後に、反応を、６Ｍの尿素、１００ｍＭのＴＣＥＰおよび０．５％のＴＦＡを含む２５μＬの溶液を加えて、ｐＨを約２．３、温度を約４℃に下げることによりクエンチした。
【0181】
試料を、自動化ＨＤＸ－ＭＳシステム（ＣＴＣ ＰＡＬ／Ｂｉｏｍｏｔｉｆ ＨＤＸ）で分析した。このシステムで試料は２℃で自動的に標識、クエンチ、消化、洗浄および単離された。試料を、固定化ペプシンカラム（２．１ｘ３０ｍｍ）を用いて６０μＬ／分で２分間消化し、続いて２ｍｍＩＤｘ１０ｍｍ長さのＣ－１８プレカラム（ＡＣＥ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）を用い、０．１％ギ酸を４００μｌ／分で１分間使用して、オンライン脱塩ステップを実施した。消化性ペプチドを次に、６０μＬ／分で操作される２ｍｍＩ．Ｄｘ５０ｍｍ長さのＨＡＬＯ Ｃ１８／１．８μｍ分析カラムを用いて、０．１％ギ酸中のＡＣＮの１８分の８～５５％直線勾配により分離した。ｍ／ｚ４００で１２０，０００の分解能で動作するＬＴＱ Ｅｌｉｔｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全ての実験を実施した。
全てのＨＤＸ－ＭＳデータを、１０ｐｐｍのプリカーサー質量許容誤差、０．０５Ｄａ ＭＳ／ＭＳ質量誤差を用いて、専用データベースでペプチド特定に使用されたＨＤＥｘａｍｉｎｅｒバージョン２．５．１．Ｍａｓｃｏｔにより処理した。
全てのＨＤＸ－ＭＳデータを、１０ｐｐｍのプリカーサー質量許容誤差、０．０５Ｄａ ＭＳ／ＭＳ質量誤差を用いて、専用データベースでペプチド特定に使用されたＨＤＥｘａｍｉｎｅｒバージョン２．５．１．Ｍａｓｃｏｔにより処理した。
【0182】
結果
本ＨＤＸ－ＭＳ実験では、ＩＬ１３Ｒα２は、２種の異なる実験条件下で、重水素化緩衝液を用いて重水素で標識された。１セットの実験はＩＬ１３Ｒα２単独を使用し、もう一方では、ＩＬ１３Ｒα２は、等モル濃度のＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの存在下で標識された。標識後に、反応が停止され、タンパク質は、タンパク分解性酵素により消化された。その後のステップでは、消化ＩＬ１３Ｒα２由来の各重水素化ペプチドの個別の質量が、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により測定された。これらの実験条件下で、ＩＬ１３Ｒα２単独と、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの存在下でのＩＬ１３Ｒα２との間の重水素取り込みの差異は、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの結合に起因する重水素取り込みの変化のみに帰属され得る。現在では、抗体が抗原／抗体境界（エピトープ）で重水素取り込みの減少をもたらすことは、当該技術分野において周知であるので、これらの２つの実験条件の間の重水素取り込みの差異が特定され、エピトープの位置を決定するために、ＩＬ－１３を含むＩＬ１３Ｒα２の３次元（３Ｄ）構造中にマッピングされた（ＰＤＢ ３ＬＢ６，Ｌｕｐａｒｄｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０１０）１８：３３２－３４２）。ＩＬ１３Ｒα２単独と、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの存在下でのＩＬ１３Ｒα２との間の統計的有意差（スチューデントのｔ検定、実験状態当り３回の反復実験、および９９％信頼区間、ｐ＜０．０１）を有するＩＬ１３Ｒα２由来のペプチドが、特定され、それらが１５～２０オングストロームの間の領域にクラスター化され、ｓｃＦｖの正確な結合を可能にする十分な溶媒露出を示す場合、そのエピトープに属するとされた。
本ＨＤＸ－ＭＳ実験では、ＩＬ１３Ｒα２は、２種の異なる実験条件下で、重水素化緩衝液を用いて重水素で標識された。１セットの実験はＩＬ１３Ｒα２単独を使用し、もう一方では、ＩＬ１３Ｒα２は、等モル濃度のＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの存在下で標識された。標識後に、反応が停止され、タンパク質は、タンパク分解性酵素により消化された。その後のステップでは、消化ＩＬ１３Ｒα２由来の各重水素化ペプチドの個別の質量が、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により測定された。これらの実験条件下で、ＩＬ１３Ｒα２単独と、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの存在下でのＩＬ１３Ｒα２との間の重水素取り込みの差異は、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの結合に起因する重水素取り込みの変化のみに帰属され得る。現在では、抗体が抗原／抗体境界（エピトープ）で重水素取り込みの減少をもたらすことは、当該技術分野において周知であるので、これらの２つの実験条件の間の重水素取り込みの差異が特定され、エピトープの位置を決定するために、ＩＬ－１３を含むＩＬ１３Ｒα２の３次元（３Ｄ）構造中にマッピングされた（ＰＤＢ ３ＬＢ６，Ｌｕｐａｒｄｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０１０）１８：３３２－３４２）。ＩＬ１３Ｒα２単独と、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの存在下でのＩＬ１３Ｒα２との間の統計的有意差（スチューデントのｔ検定、実験状態当り３回の反復実験、および９９％信頼区間、ｐ＜０．０１）を有するＩＬ１３Ｒα２由来のペプチドが、特定され、それらが１５～２０オングストロームの間の領域にクラスター化され、ｓｃＦｖの正確な結合を可能にする十分な溶媒露出を示す場合、そのエピトープに属するとされた。
【0183】
次のペプチドが、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖに対するエピトープとして特定された：位置６７～８１に対応するアミノ酸配列ＶＥＹＥＬＫＹＲＮＩＧＳＥＴＷ（配列番号４４）、位置９６～１０６に対応するアミノ酸配列ＤＬＮＫＧＩＥＡＫＩＨ（配列番号４５）；および位置１２３～１２８に対応するアミノ酸配列ＷＡＥＴＴＹ（配列番号４６）（図８および表１２と１３）。これらの３つの配列は、ＩＬ１３Ｒα２のドメイン１にマップされ、このベータサンドイッチドメインの第２のβシートの一部である。エピトープ領域は、さらに具体的には、隣接するβ鎖３、６および７、β鎖３の後のループおよびβ鎖６の前のループからなる（図１０）。これらのループの両方は、受容体のドメイン２の方を指している。エピトープ領域は、連続表面領域を形成し、これは、抗原／抗体境界で典型的に認められるものと一致した。βシートから突き出ているアミノ酸は、主に大きなアミノ酸（Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＧｌｕ）であり、抗体への潜在的な水素結合のためのいくつかの荷電基を提供した。これらの残基は、報告された構造中で明確な電子密度を有し、相互にスタッキング相互作用を形成すると見なされた。エピトープ領域は、ドメイン１の側面上にあり、これは、ＩＬ－１３とは相互作用しなかった。
【表12】
【表13】
【0184】
クローンＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５にマップされたペプチドは、異なる組み合わせで重なり合い、ドメイン２で開まった１つのペプチドを除いて、全てドメイン３に位置した。ペプチドは、図１４で全てハイライト表示され、開始および終了アミノ酸は、数字でマークされる（図１４Ａ）。Ｗ－ＭＥ１０７－１０のＨＤＸ－ＭＳは、次の２つのペプチドを与えた：アミノ酸番号２２８～２４５に対応するＦＴＦＱＬＱＮＩＶＫＰＬＰＰＶＹＬＴ（配列番号４３）およびアミノ酸番号２５３～２７１に対応するＥＩＫＬＫＷＳＩＰＬＧＰＩＰＡＲＣＦＤ（配列番号３６）。Ｗ－ＭＥ１０７－２７についての結果は、アミノ酸番号３２３～３３７に対応する追加のペプチドＳＥＷＳＤＫＱＣＷＧＬＮＤＩＦ（配列番号２３）を有する同じ２つのペプチドを与え、残基３３２～３３７は、組換えタンパク質の親和性タグ由来である。Ｗ－ＭＥ１０７－７５にマップされたエピトープは、上記と同じアミノ酸番号２５３～２７１および３２３～３３７を有する２つのペプチドからなった。
【0185】
これらの３つの異なるペプチドの３次元構造へのマッピングは、それらが全て、ＩＬ１３Ｒα２のＣ末端領域に向かってクラスター形成することを示した。クローンＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７の両方は、ペプチド２２８～２４５を有した。このペプチドはドメイン２で始まり、ドメイン３まで続いた。ペプチドの先頭に近接して、Ｇｌｎ２３１、Ｇｌｎ２３３およびＡｓｎ２３４は、どの残基も構造中で相互作用するようには見えないが、ＩＬ－１３の結合部位に極めて接近していた（図１４Ｅ）。ＩＬ１３Ｒα２の構造の解析は、ｓｃＦｖがこれらの残基と相互作用し同時に前述の他のペプチドと交互作用することは困難と思われることを示す。ＩＬ１３Ｒα２の立体構造変化は、ＨＤＸ－ＭＳ結果におけるこれらの残基の含有を説明し得る。
【0186】
クローンＷ－ＭＥ１０７－７５は、そのエピトープ中にペプチド２２８～２４５を欠き、ＩＬ－１３との結合に関し競合しないことが明らかになったが、一方、他の２つのクローンは、競合した。ペプチド２５３～２７１は、２２８～２４５に隣接し、かつＩＬ－１３結合部位側に位置し、リガンドへの結合を形成するＡｒｇ２６８を有する。全ての３つのクローンは、エピトープマッピングにおいて、このペプチドを共有した。しかし、Ｗ－ＭＥ１０７－７５の異なる結合プロファイルのために、このｓｃＦｖはＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７と同じ方式でペプチド２５３～２７１と結合するようには見えないが、むしろ、ペプチド２５３～２７１の先頭でより多く結合すると思われる（図１４Ｄ）。
【0187】
ペプチド３２３～３３７は、まさに受容体のＣ末端部分であり、２２８～２４５の反対側に位置する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）で報告された構造は、残基３２９で終わり、Ｃ末端分がどこへ続くかを述べることはできない。これは、この構造のフレキシブルな領域である可能性が高い。異なるｓｃＦｖがどのようにマウスＩＬ１３Ｒα２に結合したかについての実施例５および９からのデータを考察し、次いで保存された残基が構造中のどこに位置するかを調査することは、なぜＷ－ＭＥ１０７－７５がＷ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７とは異なるかに対するさらに多くの考えをもたらした。ドメインの先端に沿って延び、残基２３７～２４１、２６３～２６９および３２３～３２６からなる、マウスおよびヒトＩＬ１３Ｒα２中の保存残基のバンドが存在する。Ｗ－ＭＥ１０７－２７は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０のようにこの領域に結合すると考えられるが、ペプチド３２３～３２６との相互作用を欠く（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。他方、Ｗ－ＭＥ１０７－７５は、この保存領域にそれほど結合しなかったが、むしろ、アミノ酸残基２５３～２６６およびまさにＣ末端残基３３２～３３７に結合する。これは、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７に比べて、ドメイン３からさらに下方の領域を意味する。
【0188】
さらに、ＨＤＸ－ＭＳエピトープマッピング試験からの結果は、実施例１２のデータおよび実施例５および９のｓｃＦｖに対する結合および非結合データを有するマウスおよびヒトの配列アラインメントの分析とよく相関した。クローンＷ－ＭＥ１０７－１１７は、受容体の１つの領域にマップし、これは、ＩＬ－１３結合部位から離れている。クローンＷ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５は全て、ｈＩＬ１３Ｒα２上の類似の領域にマップされたが、Ｗ－ＭＥ１０７－１０およびＷ－ＭＥ１０７－２７は、共通の１つのペプチドを有し、これは、Ｗ－ＭＥ１０７－７５では欠けていた。このペプチドは、ＩＬ－１３リガンドの結合部位と重なり合う小さい領域を有した。これらの３つのｓｃＦｖがどのようにマウス受容体に結合するか、および保存残基がどこに位置しているかの差異はまた、異なるエピトープをさらに特定するのを支援し得る。
【0189】
実施例１４－ペプチドアレイを用いるｓｃＦｖのエピトープマッピング
Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖクローンのヒトＩＬ１３Ｒα２に対するエピトープマッピングは、４つのクローンに対するエピトープとして受容体の２つの異なる部分を示した（実施例１３）。Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１１７－７５は、ドメイン３上の、類似の、または重なり合う領域を結合するように見え、一方でＷ－ＭＥ１０７－１１７は、ドメイン１上の異なるエピトープに結合した。クローンＷ－ＭＥ１０７－１１７のＨＤＸ－ＭＳマッピングの初期の結果は、ドメイン１の両側にわたり広がるいくつかの異なるペプチドを生じた。エピトープを絞り込むために、ＩＬ１３Ｒα２上にａａ（アミノ酸）３９～１０２を包含する１ａａのシフトを有する１５ａａの長いペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡベース手法でアッセイした。
アレイに含まれた６０個のペプチドのいずれかへのＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの結合は検出できなかった。結合は、完全細胞外ドメインを包含するタンパク質に対してのみ検出できた。これは、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖが、ＩＬ１３Ｒα２受容体中で、直鎖ペプチドエピトープではなく立体構造エピトープを有したことが示された、実施例１３での知見を補強した。
Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７、Ｗ－ＭＥ１０７－７５およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖクローンのヒトＩＬ１３Ｒα２に対するエピトープマッピングは、４つのクローンに対するエピトープとして受容体の２つの異なる部分を示した（実施例１３）。Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１１７－７５は、ドメイン３上の、類似の、または重なり合う領域を結合するように見え、一方でＷ－ＭＥ１０７－１１７は、ドメイン１上の異なるエピトープに結合した。クローンＷ－ＭＥ１０７－１１７のＨＤＸ－ＭＳマッピングの初期の結果は、ドメイン１の両側にわたり広がるいくつかの異なるペプチドを生じた。エピトープを絞り込むために、ＩＬ１３Ｒα２上にａａ（アミノ酸）３９～１０２を包含する１ａａのシフトを有する１５ａａの長いペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡベース手法でアッセイした。
アレイに含まれた６０個のペプチドのいずれかへのＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの結合は検出できなかった。結合は、完全細胞外ドメインを包含するタンパク質に対してのみ検出できた。これは、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖが、ＩＬ１３Ｒα２受容体中で、直鎖ペプチドエピトープではなく立体構造エピトープを有したことが示された、実施例１３での知見を補強した。
【0190】
材料と方法
ＩＬ１３Ｒα２の一続きの７４個のａａ、ａａ３９～１０２に相当する、６０個のＮ末端ビオチン化ペプチドを、注文し、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。到着時に、ペプチドを、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に無菌ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中で溶解した。
３８４ＥＬＩＳＡウェルプレートを、４℃で一晩１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンおよびＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃでコートした。ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０（登録商標）で補充したＰＢＳ）中でのプレートの洗浄およびブロッキング後に、ブロッキング緩衝液中でそれぞれ０．２５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌに希釈された、ビオチン化ペプチドおよびビオチン化バージョンのＩＬ１３Ｒα２ ＥＣＤ、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、３０分間結合させた。精製されたＷ－ＭＥ１０７－１１７およびＷ－ＭＥ１０７－７５を、ブロッキング緩衝液中で１μｇ／ｍｌに希釈し、１時間結合させた。
結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にした。結合シグナル発生を、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）の添加により開始し、１Ｍの硫酸の添加により終了した。プレートを、４５０ｎｍで分析した。
各試料を二重でアッセイし、これから平均吸光度値を、ブランクウェル値を減算した後に取得した。
ＩＬ１３Ｒα２の一続きの７４個のａａ、ａａ３９～１０２に相当する、６０個のＮ末端ビオチン化ペプチドを、注文し、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。到着時に、ペプチドを、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に無菌ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中で溶解した。
３８４ＥＬＩＳＡウェルプレートを、４℃で一晩１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンおよびＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃでコートした。ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０（登録商標）で補充したＰＢＳ）中でのプレートの洗浄およびブロッキング後に、ブロッキング緩衝液中でそれぞれ０．２５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌに希釈された、ビオチン化ペプチドおよびビオチン化バージョンのＩＬ１３Ｒα２ ＥＣＤ、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉを、３０分間結合させた。精製されたＷ－ＭＥ１０７－１１７およびＷ－ＭＥ１０７－７５を、ブロッキング緩衝液中で１μｇ／ｍｌに希釈し、１時間結合させた。
結合の検出を、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）により可能にした。結合シグナル発生を、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）の添加により開始し、１Ｍの硫酸の添加により終了した。プレートを、４５０ｎｍで分析した。
各試料を二重でアッセイし、これから平均吸光度値を、ブランクウェル値を減算した後に取得した。
【0191】
結果
アレイに含まれたペプチドのいずれかへのＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの結合は、検出できなかった。結合は、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよびｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対してのみ検出された（図９）。予測通り、ペプチドアレイ内に現れないエピトープを有するＷ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖは、ＩＬ１３Ｒα２のＥＣＤドメインに対してのみ結合を示した。実験を、１０倍高い濃度のペプチドを用いて反復し同じ結果を得た。
アレイに含まれたペプチドのいずれかへのＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖの結合は、検出できなかった。結合は、ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉおよびｈＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃに対してのみ検出された（図９）。予測通り、ペプチドアレイ内に現れないエピトープを有するＷ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖは、ＩＬ１３Ｒα２のＥＣＤドメインに対してのみ結合を示した。実験を、１０倍高い濃度のペプチドを用いて反復し同じ結果を得た。
【0192】
結論
Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖのエピトープマッピング試験は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖクローンのエピトープが見つかったＩＬ１３Ｒα２の反対側上に位置するエピトープを示した。図１０に示す構造は、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７が、ベータシート（βシート）ドメインに折り畳まれるループ領域により連結された３つのベータ鎖（β鎖）から構成されるＩＬ１３Ｒα２の一部を結合することを示す。エピトープ中に含まれるβシートおよび２つのループは、リガンドＩＬ－１３を結合するＩＬ１３Ｒα２の部分には存在しない。従って、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７は、リガンド結合と干渉しない。ペプチドアレイへの結合の非存在は、実施例１２から得られた結果と共に、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７が立体構造エピトープを有することを明らかにした実施例１３の結果を補強する。
Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖのエピトープマッピング試験は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０、Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖクローンのエピトープが見つかったＩＬ１３Ｒα２の反対側上に位置するエピトープを示した。図１０に示す構造は、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７が、ベータシート（βシート）ドメインに折り畳まれるループ領域により連結された３つのベータ鎖（β鎖）から構成されるＩＬ１３Ｒα２の一部を結合することを示す。エピトープ中に含まれるβシートおよび２つのループは、リガンドＩＬ－１３を結合するＩＬ１３Ｒα２の部分には存在しない。従って、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７は、リガンド結合と干渉しない。ペプチドアレイへの結合の非存在は、実施例１２から得られた結果と共に、Ｗ－ＭＥ１０７－１１７が立体構造エピトープを有することを明らかにした実施例１３の結果を補強する。
【0193】
実施例１５－レンチウィルス構築およびＴ細胞改変
この実施例は、選択ｓｃＦｖに基づきキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を構築し、標的細胞殺傷アッセイでＣＡＲ Ｔ細胞を試験した。
この実施例は、選択ｓｃＦｖに基づきキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を構築し、標的細胞殺傷アッセイでＣＡＲ Ｔ細胞を試験した。
【0194】
材料と方法
Ｔ細胞の形質導入のためのウィルスベクター構築
選択ｓｃＦｖを、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）由来の共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ由来の刺激ドメインを含む第二世代ＣＡＲ構築物中に組み込んだ。ＣＡＲカセットを、伸長因子－１α（ＥＦ１α）プロモーターの制御下で、第三世代自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウィルスベクター（ＳＢＩ，Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）中に挿入した（図１１）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、ＣＡＲカセットの後に組み込み、自己切断Ｔ２Ａ配列により分離した。全ての組換え配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。ウィルス粒子の産生を、構築されたＣＡＲレンチウィルスプラスミドおよび対応するヘルパープラスミドを用いて２９３Ｔ細胞の一時的遺伝子導入により行った。ウィルス粒子含有上清を、採取し、超遠心分離し、その後実験に使用した。
Ｔ細胞の形質導入のためのウィルスベクター構築
選択ｓｃＦｖを、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）由来の共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ由来の刺激ドメインを含む第二世代ＣＡＲ構築物中に組み込んだ。ＣＡＲカセットを、伸長因子－１α（ＥＦ１α）プロモーターの制御下で、第三世代自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウィルスベクター（ＳＢＩ，Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）中に挿入した（図１１）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、ＣＡＲカセットの後に組み込み、自己切断Ｔ２Ａ配列により分離した。全ての組換え配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。ウィルス粒子の産生を、構築されたＣＡＲレンチウィルスプラスミドおよび対応するヘルパープラスミドを用いて２９３Ｔ細胞の一時的遺伝子導入により行った。ウィルス粒子含有上清を、採取し、超遠心分離し、その後実験に使用した。
【0195】
Ｔ細胞改変
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、２ｘ１０６個の細胞／ｍｌの濃度で３日間にわたりＯＫＴ－３（５０ｎｇ／ｍｌ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ，Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて活性化した。活性化後、Ｔ細胞（２ｘ１０６個の細胞）を、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＩＬ－２（１００ＩＵ）と共に３０μｌの濃縮レンチウィルス中に再懸濁し、３７℃で４時間インキュベートした。Ｔ細胞を、翌日に類似の方法で形質導入し、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の最終濃度で培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔ、１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。７日後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現に基づく選別により濃縮した（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。選別細胞を、製造業者のプロトコルに従いｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）を用いて増殖させた。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、２ｘ１０６個の細胞／ｍｌの濃度で３日間にわたりＯＫＴ－３（５０ｎｇ／ｍｌ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ，Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて活性化した。活性化後、Ｔ細胞（２ｘ１０６個の細胞）を、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＩＬ－２（１００ＩＵ）と共に３０μｌの濃縮レンチウィルス中に再懸濁し、３７℃で４時間インキュベートした。Ｔ細胞を、翌日に類似の方法で形質導入し、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の最終濃度で培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔ、１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。７日後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現に基づく選別により濃縮した（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。選別細胞を、製造業者のプロトコルに従いｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）を用いて増殖させた。
【0196】
死滅アッセイ
天然でｈＩＬ１３Ｒα２を発現している、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧ、およびｈＩＬ１３Ｒα２を発現していないメラノーマ細胞株Ｍｅｌ５２６を最初に、ルシフェラーゼシグナルを細胞生存率の読み出しシグナルとして使用するために、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウィルスプラスミドを用いて改変し、ＣＡＲ Ｔ細胞に曝露した。これらの標的細胞を２４時間、０、０．２、１、５または２５ＣＡＲ Ｔ細胞：１標的細胞のエフェクター（ＣＡＲ Ｔ細胞）：標的（腫瘍細胞）細胞比率でＣＡＲ改変Ｔ細胞と共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞および陰性対照（ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞）を、この実施例で使用した。ホタルルシフェラーゼ活性を、標的細胞生存率の測定値として使用し、ＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。
天然でｈＩＬ１３Ｒα２を発現している、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ－８７ＭＧ、およびｈＩＬ１３Ｒα２を発現していないメラノーマ細胞株Ｍｅｌ５２６を最初に、ルシフェラーゼシグナルを細胞生存率の読み出しシグナルとして使用するために、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウィルスプラスミドを用いて改変し、ＣＡＲ Ｔ細胞に曝露した。これらの標的細胞を２４時間、０、０．２、１、５または２５ＣＡＲ Ｔ細胞：１標的細胞のエフェクター（ＣＡＲ Ｔ細胞）：標的（腫瘍細胞）細胞比率でＣＡＲ改変Ｔ細胞と共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞および陰性対照（ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞）を、この実施例で使用した。ホタルルシフェラーゼ活性を、標的細胞生存率の測定値として使用し、ＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。
【0197】
結果
全ての試験したＣＡＲ Ｔ細胞構築物は、ｈＩＬ１３Ｒα２発現神経膠芽腫細胞（Ｕ－８７ＭＧ）を特異的に死滅させたが、抗原陰性メラノーマ細胞（Ｍｅｌ５２６）を死滅させなかった（図１２）。陰性対照（ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞）は、どの癌細胞株もＣＤ１９を発現しないことから予測されるように、どの癌細胞株も死滅させなかった。
Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖにそれぞれ基づく、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、低いエフェクター：標的細胞比率で既に十分な細胞傷害能力を示した。他方では、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－５５ ｓｃＦｖに基づくＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ Ｔ細胞は、より高いエフェクター：標的比率でのみ死滅を示した（図１２）。以前に報告されたｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７：３０２１５－３０２２７，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１６，２４（２）：３５４－３６３）に基づき産生された、基準Ｘ－ＭＥ１０７－４７（ｍＡｂ４７）ＣＡＲ Ｔ細胞は、ごくわずかな標的細胞の死滅を示した。
全ての試験したＣＡＲ Ｔ細胞構築物は、ｈＩＬ１３Ｒα２発現神経膠芽腫細胞（Ｕ－８７ＭＧ）を特異的に死滅させたが、抗原陰性メラノーマ細胞（Ｍｅｌ５２６）を死滅させなかった（図１２）。陰性対照（ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞）は、どの癌細胞株もＣＤ１９を発現しないことから予測されるように、どの癌細胞株も死滅させなかった。
Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ｓｃＦｖ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ｓｃＦｖにそれぞれ基づく、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、低いエフェクター：標的細胞比率で既に十分な細胞傷害能力を示した。他方では、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ｓｃＦｖおよびＷ－ＭＥ１０７－５５ ｓｃＦｖに基づくＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ Ｔ細胞は、より高いエフェクター：標的比率でのみ死滅を示した（図１２）。以前に報告されたｍＡｂ４７ ｓｃＦｖ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２，２８７：３０２１５－３０２２７，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１６，２４（２）：３５４－３６３）に基づき産生された、基準Ｘ－ＭＥ１０７－４７（ｍＡｂ４７）ＣＡＲ Ｔ細胞は、ごくわずかな標的細胞の死滅を示した。
【0198】
実施例１６－増殖アッセイ
この実施例は、標的細胞と共培養した場合の種々のＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能力を調査した。
この実施例は、標的細胞と共培養した場合の種々のＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能力を調査した。
【0199】
材料と方法
産生されたＣＡＲ Ｔ細胞を、抗原陽性標的細胞の遭遇時の細胞増殖を追跡するために、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｌａｂｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔ細胞を、非刺激のまま残すか、または標的Ｕ－８７ＭＧ細胞（１：１比率）と共培養した。培養物を、未処理のまま残すか、または１０μＭのロバスタチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、対照としてＴ細胞増殖を防ぐために）で４日間処理した後、フローサイトメトリーにより分析した（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ヒストグラムで認められる青紫色素の希釈（ピークパターン）を、細胞増殖と見なした。
産生されたＣＡＲ Ｔ細胞を、抗原陽性標的細胞の遭遇時の細胞増殖を追跡するために、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｌａｂｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔ細胞を、非刺激のまま残すか、または標的Ｕ－８７ＭＧ細胞（１：１比率）と共培養した。培養物を、未処理のまま残すか、または１０μＭのロバスタチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、対照としてＴ細胞増殖を防ぐために）で４日間処理した後、フローサイトメトリーにより分析した（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ヒストグラムで認められる青紫色素の希釈（ピークパターン）を、細胞増殖と見なした。
【0200】
結果
約半分のＷ－ＭＥ１０７－５５およびＷ－ＭＥ１０７－２７が、腫瘍細胞との共培養時に分裂した。印象的なことに、ほとんどのＷ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞と出会うと、２回またはそれを超えて分裂した（図１３）。参照ｍＡｂ４７（Ｘ－ＭＥ１０７－４７）ＣＡＲ Ｔ細胞もまた、標的腫瘍細胞と共培養時に増殖したが、ｍＡｂ４７ ＣＡＲ Ｔ細胞の半分のみが２回またはそれを超えて分裂した事実を考慮すると、増殖は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも少なかった。予測通り、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｕ－８７ＭＧ細胞との培養では増殖しなかった。まとめると、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞認識時に、高い増殖能力を示した。結果は、参照ｍＡｂ４７ ＣＡＲ Ｔ細胞と異なり、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞と効率的に相互作用でき、それにより高い増殖能力を実現できることを示している。
約半分のＷ－ＭＥ１０７－５５およびＷ－ＭＥ１０７－２７が、腫瘍細胞との共培養時に分裂した。印象的なことに、ほとんどのＷ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞と出会うと、２回またはそれを超えて分裂した（図１３）。参照ｍＡｂ４７（Ｘ－ＭＥ１０７－４７）ＣＡＲ Ｔ細胞もまた、標的腫瘍細胞と共培養時に増殖したが、ｍＡｂ４７ ＣＡＲ Ｔ細胞の半分のみが２回またはそれを超えて分裂した事実を考慮すると、増殖は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも少なかった。予測通り、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｕ－８７ＭＧ細胞との培養では増殖しなかった。まとめると、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞認識時に、高い増殖能力を示した。結果は、参照ｍＡｂ４７ ＣＡＲ Ｔ細胞と異なり、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞と効率的に相互作用でき、それにより高い増殖能力を実現できることを示している。
【0201】
実施例１７－ＣＡＲ Ｔ細胞のプロファイリングおよびキャラクタリゼーション
この実施例は、サイトカイン放出プロファイル、表面マーカー発現およびＣＡＲ発現状態によりＣＡＲ Ｔ細胞を調査し、特徴付けた。
この実施例は、サイトカイン放出プロファイル、表面マーカー発現およびＣＡＲ発現状態によりＣＡＲ Ｔ細胞を調査し、特徴付けた。
【0202】
材料と方法
ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例１５に記載のようにレンチウィルス構築物を用いて改変した。細胞を、分析までＩＬ－２（２５ＩＵ／ｍＬ）を補充した細胞培地中で培養するか、または分析前に、刺激物質として３人のドナーのＰＢＭＣを使用して急速増殖プロトコルで増殖させた。
ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例１５に記載のようにレンチウィルス構築物を用いて改変した。細胞を、分析までＩＬ－２（２５ＩＵ／ｍＬ）を補充した細胞培地中で培養するか、または分析前に、刺激物質として３人のドナーのＰＢＭＣを使用して急速増殖プロトコルで増殖させた。
【0203】
非刺激ＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し、標準細胞培地中で培養した（実施例１５）。レンチウィルス形質導入後７日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞（２００μＬの培地中の２ｘ１０５個の細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートに播種し、追加して１日培養した後、上清を、採取した。細胞培養上清中へＣＡＲ Ｔ細胞により分泌されたＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）により定量化した。
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し、標準細胞培地中で培養した（実施例１５）。レンチウィルス形質導入後７日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞（２００μＬの培地中の２ｘ１０５個の細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートに播種し、追加して１日培養した後、上清を、採取した。細胞培養上清中へＣＡＲ Ｔ細胞により分泌されたＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）により定量化した。
【0204】
腫瘍刺激ＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し（実施例１５）、急速増殖プロトコルを用いて増殖させた。増殖後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＩＬ－２（２５ＩＵ／ｍＬ）を補充した細胞培地中で３日間静置し、ＣＡＲ Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中に種々の比率のＵ８７ＵＵまたはＵ３４３ＭＧ腫瘍細胞と共に播種し、さらに２日間培養した後、上清を、採取した。細胞培養上清中へ分泌されたＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）により定量化した。
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し（実施例１５）、急速増殖プロトコルを用いて増殖させた。増殖後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＩＬ－２（２５ＩＵ／ｍＬ）を補充した細胞培地中で３日間静置し、ＣＡＲ Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中に種々の比率のＵ８７ＵＵまたはＵ３４３ＭＧ腫瘍細胞と共に播種し、さらに２日間培養した後、上清を、採取した。細胞培養上清中へ分泌されたＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）により定量化した。
【0205】
細胞表面上のＣＡＲ発現レベル
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し、標準細胞培地中で培養した（実施例１５）。レンチウィルス形質導入後の３、６および１２日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ３、ＣＡＲについて染色し（抗ヒトＩｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて）、フローサイトメトリーで分析した。経時的ＣＡＲ発現レベルを、ヒストグラムとして各ＣＡＲ Ｔ細胞について示した。
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し、標準細胞培地中で培養した（実施例１５）。レンチウィルス形質導入後の３、６および１２日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ３、ＣＡＲについて染色し（抗ヒトＩｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて）、フローサイトメトリーで分析した。経時的ＣＡＲ発現レベルを、ヒストグラムとして各ＣＡＲ Ｔ細胞について示した。
【0206】
腫瘍刺激の前および後のＣＡＲ Ｔ細胞表面活性化マーカー発現
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し（実施例１５）、急速増殖プロトコルを用いて増殖させた。改変ＣＡＲ Ｔ細胞を、アッセイ前に３日間ＩＬ－２（２５ＩＵ／ｍＬ）を補充した細胞培地中で静置した。静置したＣＡＲ Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中に直接播種し、単独で培養し、分析した；またはＵ８７ＵＵ腫瘍細胞と１日間共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、フローサイトメトリーで分析する前にＰＤ１、Ｔｉｍ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＣＤ３について染色した。データを、ＣＡＲ Ｔ細胞中の特異的マーカー陽性細胞のパーセンテージとして示した（ＣＤ３陽性およびＧＦＰ陽性細胞としてゲートを設定）。
モック（対照として）、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウィルスベクターを用いて改変し（実施例１５）、急速増殖プロトコルを用いて増殖させた。改変ＣＡＲ Ｔ細胞を、アッセイ前に３日間ＩＬ－２（２５ＩＵ／ｍＬ）を補充した細胞培地中で静置した。静置したＣＡＲ Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中に直接播種し、単独で培養し、分析した；またはＵ８７ＵＵ腫瘍細胞と１日間共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、フローサイトメトリーで分析する前にＰＤ１、Ｔｉｍ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＣＤ３について染色した。データを、ＣＡＲ Ｔ細胞中の特異的マーカー陽性細胞のパーセンテージとして示した（ＣＤ３陽性およびＧＦＰ陽性細胞としてゲートを設定）。
【0207】
結果
定常状態では、レンチウィルスベクターでＴ細胞形質導入の直後に、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、多量のＩＦＮγを分泌し、一方でＷ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、モックＣＡＲ Ｔ細胞対照と比べて、比較的少量のＩＦＮγを分泌した（図１５Ａ）。他方では、改変ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍細胞と共培養された場合、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、用量依存的により多量のＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）を発現し、一方、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞刺激に応答してＩＦＮγをほとんど分泌しなかった（図１５Ｂ）。
表面ＣＡＲ発現レベルを経時的に分析して、我々は、全てのＣＡＲ Ｔ細胞が、レンチウィルス形質導入後に細胞表面上で発現されたＣＡＲ分子を有することを観察した。しかし、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲの発現は、時間と共に減少し、一方でＷ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲは、細胞表面上に最初から類似のレベルを保持した（図１５Ｃ）。
腫瘍細胞刺激の存在下および非存在下で改変ＣＡＲ Ｔ細胞上の表面活性化マーカーを調査することにより、我々は、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞がすでに、腫瘍細胞刺激なしで発現されたより高いレベルのこれらの活性化マーカーを有し、追加の腫瘍刺激は、マーカー発現レベルに影響を与えなかったことに気付いた。他方では、これらのマーカーは、非刺激Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞では低いレベルのままであり、一方で腫瘍細胞刺激時にそれらの発現は劇的に増大した（図１５Ｄ）。
まとめると、これらの結果は、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的依存性ではない基底レベル活性化を有し、かつこの基底レベル活性化は、標的腫瘍細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞のより低い応答性に繋がることを示した。
定常状態では、レンチウィルスベクターでＴ細胞形質導入の直後に、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、多量のＩＦＮγを分泌し、一方でＷ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、モックＣＡＲ Ｔ細胞対照と比べて、比較的少量のＩＦＮγを分泌した（図１５Ａ）。他方では、改変ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍細胞と共培養された場合、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、用量依存的により多量のＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）を発現し、一方、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞刺激に応答してＩＦＮγをほとんど分泌しなかった（図１５Ｂ）。
表面ＣＡＲ発現レベルを経時的に分析して、我々は、全てのＣＡＲ Ｔ細胞が、レンチウィルス形質導入後に細胞表面上で発現されたＣＡＲ分子を有することを観察した。しかし、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲの発現は、時間と共に減少し、一方でＷ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲは、細胞表面上に最初から類似のレベルを保持した（図１５Ｃ）。
腫瘍細胞刺激の存在下および非存在下で改変ＣＡＲ Ｔ細胞上の表面活性化マーカーを調査することにより、我々は、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞がすでに、腫瘍細胞刺激なしで発現されたより高いレベルのこれらの活性化マーカーを有し、追加の腫瘍刺激は、マーカー発現レベルに影響を与えなかったことに気付いた。他方では、これらのマーカーは、非刺激Ｗ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞では低いレベルのままであり、一方で腫瘍細胞刺激時にそれらの発現は劇的に増大した（図１５Ｄ）。
まとめると、これらの結果は、Ｗ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的依存性ではない基底レベル活性化を有し、かつこの基底レベル活性化は、標的腫瘍細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞のより低い応答性に繋がることを示した。
【0208】
実施例１８－ＣＡＲ Ｔ細胞は神経膠芽腫腫瘍増殖をインビボで調節する
この実施例は、動物モデルでの神経膠芽腫腫瘍増殖の調節における種々のＣＡＲ Ｔ細胞の効力を調査した。以前のデータはＷ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞が非特異的標的非依存性基底レベル活性化を有することを示唆したので、我々は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞の抑制効力を解析した。
この実施例は、動物モデルでの神経膠芽腫腫瘍増殖の調節における種々のＣＡＲ Ｔ細胞の効力を調査した。以前のデータはＷ－ＭＥ１０７－５５ ＣＡＲ、およびＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞が非特異的標的非依存性基底レベル活性化を有することを示唆したので、我々は、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞の抑制効力を解析した。
【0209】
材料と方法
ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例１５に記載のようにレンチウィルス構築物を用いて改変した。以前のデータは、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ細胞が増殖においてより良好であり、より低い基底レベル活性化を有することを示したので、我々は、これらのＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで評価した。ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ３４３ＭＧ－Ｌｕｃ（５μＬ中の１ｘ１０５個の細胞）を、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変し、ヌードマウスの頭蓋内に移植した。注入を、ハミルトンシリンジおよび定位注入フレームを用いて、ブレグマから１ｍｍ前方および１．５ｍｍ右および２．７ｍｍの深さで実施した。腫瘍移植後の７日目に、マウスを、同じ位置で頭蓋内投与されたモックＴ細胞（対照として）または種々のＣＡＲ Ｔ細胞（２百万細胞）により治療した。マウスを、ＩＶＩＳシステム（ＮｉｇｈｔＯＷＬ）を使って、ルシフェラーゼシグナルのイメージングにより追跡し、現地で承認された動物倫理許可に厳格に従い重度症状の発生時に安楽死させた。実験手順概略図を、図１６Ａに示す。ルシフェラーゼシグナル（平均＋ＳＥＭ）を、腫瘍増殖の指標として、および各治療群におけるマウスの生存をカプランマイヤー曲線として示し、ゲーハン－ブレスロウ－ウィルコクソン（Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定を使用して比較した。
ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例１５に記載のようにレンチウィルス構築物を用いて改変した。以前のデータは、Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ細胞が増殖においてより良好であり、より低い基底レベル活性化を有することを示したので、我々は、これらのＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで評価した。ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ３４３ＭＧ－Ｌｕｃ（５μＬ中の１ｘ１０５個の細胞）を、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変し、ヌードマウスの頭蓋内に移植した。注入を、ハミルトンシリンジおよび定位注入フレームを用いて、ブレグマから１ｍｍ前方および１．５ｍｍ右および２．７ｍｍの深さで実施した。腫瘍移植後の７日目に、マウスを、同じ位置で頭蓋内投与されたモックＴ細胞（対照として）または種々のＣＡＲ Ｔ細胞（２百万細胞）により治療した。マウスを、ＩＶＩＳシステム（ＮｉｇｈｔＯＷＬ）を使って、ルシフェラーゼシグナルのイメージングにより追跡し、現地で承認された動物倫理許可に厳格に従い重度症状の発生時に安楽死させた。実験手順概略図を、図１６Ａに示す。ルシフェラーゼシグナル（平均＋ＳＥＭ）を、腫瘍増殖の指標として、および各治療群におけるマウスの生存をカプランマイヤー曲線として示し、ゲーハン－ブレスロウ－ウィルコクソン（Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定を使用して比較した。
【0210】
結果
試験した全ての３つのＣＡＲ Ｔ細胞（Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ Ｔ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ ＴおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ）は、モックＴ細胞治療群に比べて、治療群でのより低いルシフェラーゼシグナルにより示されるように、腫瘍増殖を調節できた（図１６Ｂ）。加えて、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ Ｔ細胞治療およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞治療の両方は、現在のアッセイ条件でマウス生存の有意な改善を示した（図１６Ｃ）。
試験した全ての３つのＣＡＲ Ｔ細胞（Ｗ－ＭＥ１０７－１０ ＣＡＲ Ｔ、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ ＴおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ）は、モックＴ細胞治療群に比べて、治療群でのより低いルシフェラーゼシグナルにより示されるように、腫瘍増殖を調節できた（図１６Ｂ）。加えて、Ｗ－ＭＥ１０７－７５ ＣＡＲ Ｔ細胞治療およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞治療の両方は、現在のアッセイ条件でマウス生存の有意な改善を示した（図１６Ｃ）。
【0211】
実施例１９－ＣＤＲは差次的にＣＡＲ発現および機能に影響する
この実施例は、ＣＤＲ領域中のアミノ酸をアラニンで置換することにより、異なる構築物間のＣＡＲ発現レベル差異の機序を調査した。以前のデータはＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１１７がＣＡＲ表面発現の最大の差異を有することを示唆したので、我々は、これらの２つのクローンおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７とは異なった、Ｗ－ＭＥ１０７－２７中の置換アミノ酸を調査した。
この実施例は、ＣＤＲ領域中のアミノ酸をアラニンで置換することにより、異なる構築物間のＣＡＲ発現レベル差異の機序を調査した。以前のデータはＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１１７がＣＡＲ表面発現の最大の差異を有することを示唆したので、我々は、これらの２つのクローンおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７とは異なった、Ｗ－ＭＥ１０７－２７中の置換アミノ酸を調査した。
【0212】
材料と方法
ウィルス構築およびＴ細胞改変
アミノ酸置換を有するＤＮＡ構築物（詳細は表１４）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文し、レンチウィルスベクター中にサブクローニングした。レンチウィルス構築を、実施例１５に記載した。ヒトジャーカットＴ細胞株を、レンチウィルス構築物で改変した。改変細胞を、細胞培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔ、１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で、ウィルス形質導入の４日後でのフローサイトメトリーによる分析まで、培養した。
ウィルス構築およびＴ細胞改変
アミノ酸置換を有するＤＮＡ構築物（詳細は表１４）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文し、レンチウィルスベクター中にサブクローニングした。レンチウィルス構築を、実施例１５に記載した。ヒトジャーカットＴ細胞株を、レンチウィルス構築物で改変した。改変細胞を、細胞培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔ、１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で、ウィルス形質導入の４日後でのフローサイトメトリーによる分析まで、培養した。
【表14】
【0213】
ＣＡＲ発現分析
改変細胞を、ＣＡＲについて染色し（抗ヒトＩｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて）、フローサイトメトリーで分析した。ＧＦＰ陽性細胞からのＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージを、ゲートし、提示した。
改変細胞を、ＣＡＲについて染色し（抗ヒトＩｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて）、フローサイトメトリーで分析した。ＧＦＰ陽性細胞からのＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージを、ゲートし、提示した。
【0214】
結果
Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ２、Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ４、Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ５は、ＧＦＰ陽性形質導入Ｔ細胞からの有意により高いＣＡＲ発現を示した。Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ１、Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ３は、Ｗ－ＭＥ１０７－２７と類似のレベルのＣＡＲ発現を示した（図１７Ａ、１７Ｂ）。これらの結果は、重鎖中のＣＤＲ２および軽鎖中のＣＤＲ３が、ＣＡＲ表面発現に影響することにおいて最も関与したことを示す。
Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ２、Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ４、Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ５は、ＧＦＰ陽性形質導入Ｔ細胞からの有意により高いＣＡＲ発現を示した。Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ１、Ｗ－ＭＥ１０７－２７－Ａｌａ３は、Ｗ－ＭＥ１０７－２７と類似のレベルのＣＡＲ発現を示した（図１７Ａ、１７Ｂ）。これらの結果は、重鎖中のＣＤＲ２および軽鎖中のＣＤＲ３が、ＣＡＲ表面発現に影響することにおいて最も関与したことを示す。
【0215】
実施例２０－基底レベル活性化は、細胞内シグナル伝達ドメインと関連する
この実施例は、ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインを除去する（デコイＣＡＲ）ことにより、改変ＣＡＲ Ｔ細胞の基底レベル活性化の機序を調査した。以前のデータはＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１１７がＣＡＲ表面発現の最大の差異を有することを示唆したので、我々は、これらの２つのクローンを調査する。
この実施例は、ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインを除去する（デコイＣＡＲ）ことにより、改変ＣＡＲ Ｔ細胞の基底レベル活性化の機序を調査した。以前のデータはＷ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１１７がＣＡＲ表面発現の最大の差異を有することを示唆したので、我々は、これらの２つのクローンを調査する。
【0216】
材料と方法
ウィルス構築およびＴ細胞改変
デコイＣＡＲを有するＤＮＡ構築物を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文し、レンチウィルスベクター中にサブクローニングし（図１８Ａ）、これは、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ｄＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ｄＣＡＲを生成した。レンチウィルス構築を、実施例１５に記載した。ヒトＴ細胞を、レンチウィルス構築物で改変した。
ウィルス構築およびＴ細胞改変
デコイＣＡＲを有するＤＮＡ構築物を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文し、レンチウィルスベクター中にサブクローニングし（図１８Ａ）、これは、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ｄＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ｄＣＡＲを生成した。レンチウィルス構築を、実施例１５に記載した。ヒトＴ細胞を、レンチウィルス構築物で改変した。
【0217】
ＩＦＮγ分泌
改変細胞を、ウィルス形質導入後の７日間にわたり２５ＩＵのＩＬ－２／ｍＬを供給した細胞培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔ、１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養した。改変細胞（２ｘ１０５個の細胞／ウェル）を次に、さらなるサイトカイン補充なしに、９６ウェルプレート中の２００μＬの細胞培地中に播種した。細胞培養上清を、２４時間後に採取し、上清中のＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）により測定した。
改変細胞を、ウィルス形質導入後の７日間にわたり２５ＩＵのＩＬ－２／ｍＬを供給した細胞培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔ、１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養した。改変細胞（２ｘ１０５個の細胞／ウェル）を次に、さらなるサイトカイン補充なしに、９６ウェルプレート中の２００μＬの細胞培地中に播種した。細胞培養上清を、２４時間後に採取し、上清中のＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）により測定した。
【0218】
結果
Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方は、定常状態でＩＦＮγを分泌し、一方でＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、有意により高い量のＩＦＮγを分泌した（図１８Ｃ）。細胞内シグナル伝達ドメインが除去された場合、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ｄＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ｄＣＡＲは両方とも、それらの対応物に比べて、有意に少ないＩＦＮγ分泌を示した（図１８Ｃ）。モックＴ細胞は、ＩＦＮγを分泌しなかった（図１８Ｃ）。これらの結果は、改変ＣＡＲ Ｔ細胞の基底レベル活性化は、その細胞内シグナル伝達ドメインと関連することを示す。
Ｗ－ＭＥ１０７－２７およびＷ－ＭＥ１０７－１１７ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方は、定常状態でＩＦＮγを分泌し、一方でＷ－ＭＥ１０７－２７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、有意により高い量のＩＦＮγを分泌した（図１８Ｃ）。細胞内シグナル伝達ドメインが除去された場合、Ｗ－ＭＥ１０７－２７ｄＣＡＲおよびＷ－ＭＥ１０７－１１７ｄＣＡＲは両方とも、それらの対応物に比べて、有意に少ないＩＦＮγ分泌を示した（図１８Ｃ）。モックＴ細胞は、ＩＦＮγを分泌しなかった（図１８Ｃ）。これらの結果は、改変ＣＡＲ Ｔ細胞の基底レベル活性化は、その細胞内シグナル伝達ドメインと関連することを示す。
【0219】
実施例Ａ１－組換えヒトＩＬ１３Ｒα２（ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉ）の調製
ビオチン化ｈＩＬ１３Ｒα２を、クローン化し、単離した。
材料と方法
ビオチン化ｈＩＬ１３Ｒα２を、クローン化し、単離した。
材料と方法
【0220】
材料
ＭｕｌｔｉＢａｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ，Ｇｅｎｅｖａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮａＮ
ＳａｌＩ，Ｇ｜ＴＣＧＡＣ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０６４４
ＸｈｏＩ，Ｃ｜ＴＣＧＡＧ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０６９４
ＫｐｎＩ，ＧＧＴＡＣ｜Ｃ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０５２４
ＰｓｔＩ，ＣＴＧＣＡ｜Ｇ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０６１５
Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋ１４２２
Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＮＥＢ，Ｍ０２９８
ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋ０５０３
ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋ２１０００２
ＬＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｌ７０２５
ＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｓｉｇｍａ，Ｌ０３０２２
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｍａｃｈ１ Ｔ１ Ｐｈａｇｅ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ８６２００３
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＰＩＲ１ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１０１０１０
Ｓｐｅｃｔａｍｙｃｉｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｓ４０１４
ゲンタマイシン、Ｓｉｇｍａ，Ｇ１３９７
ＩＰＴＧ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１５５２９０１９
ＢｌｕｏＧａｌ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１５５１９０２８
テトラサイクリン、Ｂｉｏｌｉｎｅ，８７０３０
ＤＨ１０ＥｍＢａｃｙコンピテント細胞（ｍｕｌｔｉｂａｃ ｋｉｔから調製）
Ｓｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３６７６３．
１７ＡＥＡＭＯＰ＿ＭＥ１０７ｈ＿ｐＭＡ－Ｔ，Ｇｅｎｅ Ａｒｔ
１７ＡＥＡＭＰＰ＿ＢｉｒＡ＿ｐＭＡ－Ｔ，Ｇｅｎｅ Ａｒｔ
ｐＦａｓｔＢａｃ順方向、ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＣ ＡＴＡ ＣＣＧ ＴＣＣ ＣＡ
ｐＡＣＥＢａｃ１ 逆方向（ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ），ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＴＧ ＴＧＡ ＴＧＣ ＴＡＴ ＴＧＣ
ｐＩＤＳ 順方向、ＣＧＡ ＴＡＣ ＴＡＧ ＴＡＴ ＡＣＧ ＧＡＣ Ｃ
ｐＩＤＳ 逆方向、ＣＣＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＴＧＴ Ｃ
ヘペス、ＶＷＲ，４４１４８７Ｍ
グリセロール、ＶＷＲ，４４４４８５Ｂ
ツイーン８０（登録商標）（Ｓｕｒｆａｃｔ－Ａｍｐｓ ８０），Ｐｉｅｒｃｅ，００２８３２８
イミダゾール、Ｍｅｒｃｋ，１．０４７１６．０２５０
ＮａＣｌ，ＶＷＲ，２７８００．３６０
ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－３７１２－０５
ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８－９８９３－３５
Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬＣ５８００
ＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００５
ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００７
ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳランニング緩衝液２０Ｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００２０２
ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ １．０ ｍｍ １０－ｗｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０３２１ＢＯＸ
ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ １．０ ｍｍ １５－ｗｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０３２３ＢＯＸ
Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １０Ｋ ５－２０ ｍｌ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，８８５２７
Ａｎｔｉ－６Ｘヒスチジンタグ抗体、Ａｂｃａｍ，ａｂ１８１８４
Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１８５６２０９
ＭｕｌｔｉＢａｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ，Ｇｅｎｅｖａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮａＮ
ＳａｌＩ，Ｇ｜ＴＣＧＡＣ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０６４４
ＸｈｏＩ，Ｃ｜ＴＣＧＡＧ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０６９４
ＫｐｎＩ，ＧＧＴＡＣ｜Ｃ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０５２４
ＰｓｔＩ，ＣＴＧＣＡ｜Ｇ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＤ０６１５
Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋ１４２２
Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＮＥＢ，Ｍ０２９８
ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋ０５０３
ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋ２１０００２
ＬＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｌ７０２５
ＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｓｉｇｍａ，Ｌ０３０２２
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｍａｃｈ１ Ｔ１ Ｐｈａｇｅ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ８６２００３
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＰＩＲ１ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１０１０１０
Ｓｐｅｃｔａｍｙｃｉｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｓ４０１４
ゲンタマイシン、Ｓｉｇｍａ，Ｇ１３９７
ＩＰＴＧ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１５５２９０１９
ＢｌｕｏＧａｌ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１５５１９０２８
テトラサイクリン、Ｂｉｏｌｉｎｅ，８７０３０
ＤＨ１０ＥｍＢａｃｙコンピテント細胞（ｍｕｌｔｉｂａｃ ｋｉｔから調製）
Ｓｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３６７６３．
１７ＡＥＡＭＯＰ＿ＭＥ１０７ｈ＿ｐＭＡ－Ｔ，Ｇｅｎｅ Ａｒｔ
１７ＡＥＡＭＰＰ＿ＢｉｒＡ＿ｐＭＡ－Ｔ，Ｇｅｎｅ Ａｒｔ
ｐＦａｓｔＢａｃ順方向、ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＣ ＡＴＡ ＣＣＧ ＴＣＣ ＣＡ
ｐＡＣＥＢａｃ１ 逆方向（ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ），ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＴＧ ＴＧＡ ＴＧＣ ＴＡＴ ＴＧＣ
ｐＩＤＳ 順方向、ＣＧＡ ＴＡＣ ＴＡＧ ＴＡＴ ＡＣＧ ＧＡＣ Ｃ
ｐＩＤＳ 逆方向、ＣＣＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＴＧＴ Ｃ
ヘペス、ＶＷＲ，４４１４８７Ｍ
グリセロール、ＶＷＲ，４４４４８５Ｂ
ツイーン８０（登録商標）（Ｓｕｒｆａｃｔ－Ａｍｐｓ ８０），Ｐｉｅｒｃｅ，００２８３２８
イミダゾール、Ｍｅｒｃｋ，１．０４７１６．０２５０
ＮａＣｌ，ＶＷＲ，２７８００．３６０
ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－３７１２－０５
ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８－９８９３－３５
Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬＣ５８００
ＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００５
ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００７
ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳランニング緩衝液２０Ｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００２０２
ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ １．０ ｍｍ １０－ｗｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０３２１ＢＯＸ
ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ １．０ ｍｍ １５－ｗｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０３２３ＢＯＸ
Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １０Ｋ ５－２０ ｍｌ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，８８５２７
Ａｎｔｉ－６Ｘヒスチジンタグ抗体、Ａｂｃａｍ，ａｂ１８１８４
Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１８５６２０９
【0221】
ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉのクローニング
ヒトＩＬ１３Ｒα２のＥＣＤドメイン（ユニプロットＱ１４６２７ ａａ２９～３３１）を、バキュロウィルス／Ｓｆ９システム中でＢｉｒＡと共発現させて、ビオチン化受容体を産生した。遺伝子構築物中で、天然のシグナルペプチド（ａａ１～２８）を、培地中へのタンパク質の分泌のために、ｇｐ６７バキュロウィルスシグナルペプチドに交換した。Ａｖｉタグを、ＢｉｒＡによる標的化ビオチン化を促進するために、受容体に対しＣ末端に組み込み、続いて精製のためにＨｉｓ６タグを組み込んだ。これは、Ｔｒｐ３３１の後に付加されるＣ末端アミノ酸配列ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１１）を与えた。構築物は、クローニング部位ＳａｌＩとＸｈｏＩに挟まれ、ヨトウガのためにコドン最適化された。同様に、大腸菌ＢｉｒＡリガーゼ遺伝子は、ＸｈｏＩとＫｐｎＩに挟まれ、コドン最適化された。遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒに注文した（ベクター１７ＡＥＡＭＯＰ＿ＭＥ１０７ｈ＿ｐＭＡ－Ｔおよびベクター１７ＡＥＡＭＰＰ＿ＢｉｒＡ＿ｐＭＡ－Ｔ）。
ドナーベクターｐＩＤＳ中の受容体ベクターｐＡＣＥＢａｃ１およびＢｉｒＡ中のｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉのｍｕｌｔｉｂａｃ構築物を、製造業者のプロトコルに従って作製した。ベクター配列を、ＧＡＴＣでの塩基配列決定により確認した。２つのベクターを、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えにより融合し、ｈＩＬ１３Ｒα２－ＡＶＩｈｉｓ／ＢｉｒＡ構築物を形成した。この構築物を、バクミド中への遺伝子転位のため、ＤＨ１０ＥｍｂａｃＹに形質転換した。陽性クローンの選択を、これらの細胞の青／白スクリーニングにより実施した。最終的に、バクミドを、単離し、遺伝子の組み込みについてＰＣＲにより分析した。
ヒトＩＬ１３Ｒα２のＥＣＤドメイン（ユニプロットＱ１４６２７ ａａ２９～３３１）を、バキュロウィルス／Ｓｆ９システム中でＢｉｒＡと共発現させて、ビオチン化受容体を産生した。遺伝子構築物中で、天然のシグナルペプチド（ａａ１～２８）を、培地中へのタンパク質の分泌のために、ｇｐ６７バキュロウィルスシグナルペプチドに交換した。Ａｖｉタグを、ＢｉｒＡによる標的化ビオチン化を促進するために、受容体に対しＣ末端に組み込み、続いて精製のためにＨｉｓ６タグを組み込んだ。これは、Ｔｒｐ３３１の後に付加されるＣ末端アミノ酸配列ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１１）を与えた。構築物は、クローニング部位ＳａｌＩとＸｈｏＩに挟まれ、ヨトウガのためにコドン最適化された。同様に、大腸菌ＢｉｒＡリガーゼ遺伝子は、ＸｈｏＩとＫｐｎＩに挟まれ、コドン最適化された。遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒに注文した（ベクター１７ＡＥＡＭＯＰ＿ＭＥ１０７ｈ＿ｐＭＡ－Ｔおよびベクター１７ＡＥＡＭＰＰ＿ＢｉｒＡ＿ｐＭＡ－Ｔ）。
ドナーベクターｐＩＤＳ中の受容体ベクターｐＡＣＥＢａｃ１およびＢｉｒＡ中のｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉのｍｕｌｔｉｂａｃ構築物を、製造業者のプロトコルに従って作製した。ベクター配列を、ＧＡＴＣでの塩基配列決定により確認した。２つのベクターを、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えにより融合し、ｈＩＬ１３Ｒα２－ＡＶＩｈｉｓ／ＢｉｒＡ構築物を形成した。この構築物を、バクミド中への遺伝子転位のため、ＤＨ１０ＥｍｂａｃＹに形質転換した。陽性クローンの選択を、これらの細胞の青／白スクリーニングにより実施した。最終的に、バクミドを、単離し、遺伝子の組み込みについてＰＣＲにより分析した。
【0222】
ｈＩＬ１３Ｒα２－ａｖｉの発現およびキャラクタリゼーション
バクミドを、Ｓｆ９細胞に遺伝子導入して、バキュロウィルスを産生した。ヒトＩＬ１３Ｒα２を、４８時間の間２．３Ｌの遺伝子導入Ｓｆ９培養液中で発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｅｌカラム上に捕捉することにより、培地から採取した。カラムを、緩衝液Ａ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、９ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロールおよび１０μＭのツイーン８０（登録商標））で平衡化した。カラムを緩衝液Ａで洗浄後、タンパク質を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、９ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール、１０μＭのツイーン８０（登録商標）および３００ｍＭのイミダゾール）で溶出した。
バクミドを、Ｓｆ９細胞に遺伝子導入して、バキュロウィルスを産生した。ヒトＩＬ１３Ｒα２を、４８時間の間２．３Ｌの遺伝子導入Ｓｆ９培養液中で発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｅｌカラム上に捕捉することにより、培地から採取した。カラムを、緩衝液Ａ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、９ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロールおよび１０μＭのツイーン８０（登録商標））で平衡化した。カラムを緩衝液Ａで洗浄後、タンパク質を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、９ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール、１０μＭのツイーン８０（登録商標）および３００ｍＭのイミダゾール）で溶出した。
【0223】
分割量を含むタンパク質をプールし濃縮した後、試料を、５０ｍＭのヘペスｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよび１０μＭのツイーン８０（登録商標）を用いて、スーパーデックス２００ １６／６０カラムで最終精製した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによる最も純粋なタンパク質画分を、選択し、プールし濃縮した。精製されたｈＩＬ１３Ｒα２受容体を、ＳＤＳゲルで泳動して、純度およびサイズを決定した。クローンｍＡｂ４７単鎖対照への結合を、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより確認した。受容体をまた、ＭＳ分析のために、Ｘｉａｏｆａｎｇ Ｃａｏ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに送付した。試料を、３回実験したが、配列の一部のみがカバーされた。我々は、タンパク質のＩＤが正しかったと結論できた。
【0224】
上述の実施形態は、本発明のいくつかの例示的実施例として理解されたい。種々の修正、組み合わせおよび変更が本発明の範囲または趣旨から逸脱することなくその実施形態に対しなされ得ることは、当業者には明らかであろう。特に、技術的に可能な場合には、異なる実施形態での異なる部分の解決策を、他の構成で組み合わせることができる。しかし、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図6-6】
【図6-7】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】