(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-15
(54)【発明の名称】生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物
(51)【国際特許分類】
A61L 27/60 20060101AFI20230608BHJP
【ＦＩ】
A61L27/60
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022564277
(86)(22)【出願日】2021-05-13
(85)【翻訳文提出日】2022-10-21
(86)【国際出願番号】 US2021032315
(87)【国際公開番号】W WO2021231775
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】63/024,258
(32)【優先日】2020-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507295048
【氏名又は名称】ストラタテック コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100107489
【弁理士】
【氏名又は名称】大塩 竹志
(72)【発明者】
【氏名】アレン－ホフマン， ビー． リン
(72)【発明者】
【氏名】カマー， アレン アール．
(72)【発明者】
【氏名】グラッツ， ケネス アール．
(72)【発明者】
【氏名】スティグリッツ， バリー エム．
【テーマコード（参考）】
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C081AB19
4C081BA12
4C081BB08
4C081CD121
4C081CD34
4C081DA01
4C081DC01
(57)【要約】
本開示は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物を対象とする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、前記真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、前記マトリックスが、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、を含み、
前記上皮層の前記底面が、前記真皮等価層の前記上面に、前記層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
前記皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重（「破壊荷重」）及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、前記完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において前記皮膚構築物と同じ点で破壊し、前記真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
前記ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
【請求項2】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の１０％未満低下する、請求項１に記載の皮膚構築物。
【請求項3】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の５％未満低下する、請求項２に記載の皮膚構築物。
【請求項4】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の１％未満低下する、請求項２に記載の皮膚構築物。
【請求項5】
前記真皮等価層が、約１４～１６ｍｍの変位及び約０．１～約０．５Ｎの荷重で破壊する、請求項１～４のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項6】
前記皮膚構築物が、組織学によって測定される場合、約１００μｍ～約２５０μｍ、又は約１２０μｍ～約２００μｍの厚さを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項7】
前記完全に階層化された上皮層が、組織学によって測定される場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有し、かつ／又は前記真皮等価層が、約２０μｍ～約８０μｍの厚さを有する、請求項６に記載の皮膚構築物。
【請求項8】
前記上皮層の前記ケラチノサイトが、単一のヒトドナー由来であり、かつ／又は前記真皮等価層の前記真皮線維芽細胞が、任意選択的に前記ケラチノサイトの前記ヒトドナーとは異なる単一のヒトドナー由来である、請求項１～７のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項9】
前記ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であるか、又は前記真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、請求項８に記載の皮膚構築物。
【請求項10】
前記ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であり、前記真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、請求項８に記載の皮膚構築物。
【請求項11】
前記皮膚構築物が、約４０ｃｍ２～約１００ｃｍ２の表面積を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項12】
前記皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲンを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項13】
前記皮膚構築物が、少なくとも５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、請求項１２に記載の皮膚構築物。
【請求項14】
前記皮膚構築物が、少なくとも５．５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン又は少なくとも少なくとも５．８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、請求項１２に記載の皮膚構築物。
【請求項15】
前記ヒトＩ型コラーゲンの約９８％以上が、前記皮膚構築物の細胞によって産生される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項16】
前記ヒトＩ型コラーゲンの約１００％が、前記皮膚構築物の細胞によって産生される、請求項１５に記載の皮膚構築物。
【請求項17】
前記皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、前記マウスＩ型コラーゲンが、前記皮膚構築物中の総コラーゲンの９０重量％以下である、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項18】
前記皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、前記マウス１型コラーゲンが、前記皮膚構築物中の総コラーゲン型の約６０重量％～約９０重量％である、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項19】
前記皮膚構築物が、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～約０．４５ｍｇ、又は表面積１ｃｍ２当たり約０．２９ｍｇ～約０．３９ｍｇの総コラーゲン含有量を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項20】
生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、前記上皮層の前記底面が、前記真皮等価層の前記上面に、前記層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
前記真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、前記マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含み、
前記皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、前記完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において前記皮膚構築物と同じ点で破壊し、前記真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
前記ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
【請求項21】
前記上皮層の前記ケラチノサイトが、単一のヒトドナー由来であり、かつ／又は前記真皮等価層の前記真皮線維芽細胞が、任意選択的に前記ケラチノサイトの前記ヒトドナーとは異なる単一のヒトドナー由来である、請求項２０に記載の皮膚構築物。
【請求項22】
前記ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であるか、又は前記真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、請求項２１に記載の皮膚構築物。
【請求項23】
前記ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であり、前記真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、請求項２１に記載の皮膚構築物。
【請求項24】
生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、前記上皮層の前記底面が、前記真皮等価層の前記上面に、前記層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
前記真皮等価層が、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、前記マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含み、
前記皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、前記完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において前記皮膚構築物と同じ点で破壊し、前記真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
前記ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
【請求項25】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の１０％未満低下する、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項26】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の５％未満低下する、請求項２５に記載の皮膚構築物。
【請求項27】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の１％未満低下する、請求項２５に記載の皮膚構築物。
【請求項28】
前記真皮等価層が、約１４～１６ｍｍの変位及び約０．１～約０．５Ｎの荷重で破壊する、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項29】
前記皮膚構築物が、組織学によって測定される場合、約１００μｍ～約２５０μｍ、又は約１２０μｍ～約２００μｍの厚さを有する、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項30】
前記完全に階層化された上皮層が、組織学によって測定される場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有し、かつ／又は前記真皮等価層が、約２０μｍ～約８０μｍの厚さを有する、請求項２９に記載の生物工学によって作られた皮膚構築物。
【請求項31】
前記皮膚構築物が、表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン、又は表面積１ｃｍ２当たり少なくとも少なくとも０．０５８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項32】
前記ヒトＩ型コラーゲンの約９８％以上が、前記皮膚構築物の細胞によって産生される、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項33】
前記ヒトＩ型コラーゲンの約１００％が、前記皮膚構築物の細胞によって産生される、請求項３２に記載の皮膚構築物。
【請求項34】
前記総コラーゲン含有量が、表面積１ｃｍ２当たり約０．２９ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．３９ｍｇである、請求項２０～３３のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項35】
前記皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、前記マウスＩ型コラーゲンが、前記皮膚構築物中の総コラーゲンの９０重量％以下である、請求項２０～３４のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項36】
前記皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、前記マウス１型コラーゲンが、前記皮膚構築物中の総コラーゲン型の約６０重量％～約９０重量％である、請求項２０～３４のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項37】
前記皮膚構築物が、約４０ｃｍ２～約１００ｃｍ２の表面積を有する、請求項２０～３６のいずれか一項に記載の生物工学によって作られた皮膚構築物。
【請求項38】
生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、前記上皮層の前記底面が、前記真皮等価層の前記上面に、前記層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
前記真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、前記マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含む、皮膚構築物。
【請求項39】
前記上皮層の前記ケラチノサイトが、単一のヒトドナー由来であり、かつ／又は前記真皮等価層の前記真皮線維芽細胞が、任意選択的に前記ケラチノサイトの前記ヒトドナーとは異なる単一のヒトドナー由来である、請求項３８に記載の皮膚構築物。
【請求項40】
前記ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であるか、又は前記真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、請求項３９に記載の皮膚構築物。
【請求項41】
前記ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であり、前記真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、請求項３９に記載の皮膚構築物。
【請求項42】
生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、前記上皮層の前記底面が、前記真皮等価層の前記上面に、前記層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
前記真皮等価層が、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、前記マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含む、皮膚構築物。
【請求項43】
前記皮膚構築物が、表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン又は表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項44】
前記ヒトＩ型コラーゲンの約９８％以上が、前記皮膚構築物の細胞によって産生される、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項45】
前記ヒトＩ型コラーゲンの約１００％が、前記皮膚構築物の細胞によって産生される、請求項４４に記載の皮膚構築物。
【請求項46】
前記皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、前記マウスＩ型コラーゲンが、前記皮膚構築物中の総コラーゲンの９０重量％以下である、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項47】
前記皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、前記マウス１型コラーゲンが、前記皮膚構築物中の総コラーゲン型の約６０重量％～約９０重量％である、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項48】
前記皮膚構築物が、組織学によって測定される場合、約１００μｍ～約２５０μｍ、又は約１２０μｍ～約２００μｍの厚さを有する、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項49】
前記完全に階層化された上皮層が、組織学によって測定される場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有し、かつ／又は前記真皮等価層が、約２０μｍ～約８０μｍの厚さを有する、請求項４８に記載の皮膚構築物。
【請求項50】
前記皮膚構築物が、約４０ｃｍ２～約１００ｃｍ２の表面積を有する、請求項３８～４９のいずれか一項に記載の生物工学によって作られた皮膚構築物。
【請求項51】
前記皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、前記完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において前記皮膚構築物と同じ点で破壊し、前記真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、前記ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、請求項３８～５０のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項52】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の１０％未満低下する、請求項５１に記載の皮膚構築物。
【請求項53】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の５％未満低下する、請求項５２に記載の皮膚構築物。
【請求項54】
前記真皮等価層が破壊するとき、前記荷重が、前記破壊荷重の１％未満低下する、請求項５３に記載の皮膚構築物。
【請求項55】
前記真皮等価層が、約１４～１６ｍｍの変位及び約０．１～約０．５Ｎの荷重で破壊する、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項56】
前記皮膚構築物が凍結保存される、先行請求項のいずれか一項に記載の皮膚構築物。
【請求項57】
前記皮膚構築物が、解凍後に、ｂＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、ＰｌＧＦ、ＳＤＦ－１α、ＴＧＦ－β１、及びＶＥＧＦ－Ａから選択される複数のタンパク質を分泌する、請求項５６に記載の皮膚構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／０２４，２５８号に対する優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／０２４，２５８号に対する優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物を対象とする。
【背景技術】
【0003】
創傷治癒に対する可能性のある解決策は、多くの場合、皮膚代替物を含む。創傷を閉じ、保護するのに役立つように、これらの代替製品が使用され得る。しかしながら、多くの場合、代替製品は、特に引張強度等の代替物の物理的特性に関して、多くの望ましいものを残す。したがって、当該技術分野では、代替物の耐久性を促進し、創傷に顕著な利益をもたらす物理的特徴を有する代替製品への必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示の一態様は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、上面及び底面を有する真皮等価層であって、真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含む、真皮等価層と、を含む、皮膚構築物を包含する。マトリックスは、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着される。皮膚構築物のドッグボーン型試料は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重（「破壊荷重」）及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、ドッグボーン型試料は、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する。
【0005】
本開示の別の態様は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着される、真皮等価層と、を含む、皮膚構築物を包含する。真皮等価層は、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。皮膚構築物は、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する。皮膚構築物のドッグボーン型試料は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊する。完全に階層化された上皮層は、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊する。ドッグボーン型試料は、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する。
【0006】
本開示の更に別の態様は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着される、真皮等価層と、を含む、皮膚構築物を包含する。真皮等価層は、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。皮膚構築物は、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する。皮膚構築物のドッグボーン型試料は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊する。ドッグボーン型試料は、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する。
【0007】
本開示のなお別の態様は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着される、真皮等価層と、を含む、皮膚構築物を包含する。
【0008】
真皮等価層は、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。皮膚構築物は、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する。
【0009】
本開示のいくつかの態様は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着される、真皮等価層と、を含む、皮膚構築物を包含する。真皮等価層は、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。皮膚構築物は、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する。
【0010】
本開示の他の態様は、生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、上面及び底面を有する真皮等価層であって、真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含む、真皮等価層と、を含む、皮膚構築物を包含する。マトリックスは、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。皮膚構築物は、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する。皮膚構築物のドッグボーン型試料は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重（「破壊荷重」）及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、ドッグボーン型試料は、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する。
【0011】
上の態様の各々は、本開示の追加の態様及び繰り返しと共に、本明細書に詳述される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
本開示の生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物は、完全に階層化された上皮層と、真皮等価層とを包含する。本開示の皮膚構築物は、器官型ヒト皮膚等価物として使用され得る。したがって、皮膚構築物は、内側の真皮様の層と、外側の上皮様の層の両方を有する天然ヒト皮膚を模倣するように設計された、生物工学によって作られた（非天然の）二重層組織である。例えば、器官型培養による皮膚構築物の産生により、インタクトなヒト皮膚に匹敵するバリア機能を示す、完全に階層化されたヒトケラチノサイトの十分に発達した上皮層を産生する。
【0014】
皮膚代替物の生存能力のある細胞（例えば、線維芽細胞、ＮＩＫＳ細胞等）は、代謝的に活性であり、あるスペクトルの成長因子、走化因子、サイトカイン、炎症性メディエーター、酵素、及び宿主防御ペプチドを分泌し、これらは、皮膚構築物が創傷に適用された後に、創傷床を調整し、組織再生を促進し、修復し、感染を低減し得る。例示的な実施形態において、皮膚構築物は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（商標登録）（商標）である。別の例示的な実施形態において、皮膚構築物は、ＥｘｐｒｅｓｓＧｒａｆｔ（商標）である。
【0015】
いくつかの実施形態において、皮膚構築物は、組織学によって測定される場合、約１００μｍ～約２５０μｍ、又は約１２０μｍ～約２００μｍの厚さを有する。例えば、皮膚構築物は、組織学によって測定される場合、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０μｍの厚さを有し得る。
【0016】
一般的に言えば、本開示の皮膚構築物は、利用される培養プレートのみによって制限される、任意の所望の寸法及び表面積を含み得る。特定の実施形態において、本開示の皮膚構築物は、約２０ｃｍ２～約２５０ｃｍ２の表面積を有する。いくつかの実施形態において、本開示の皮膚構築物は、約２０ｃｍ２～約８０ｃｍ２、約８０ｃｍ２～約１４０ｃｍ２、約１４０ｃｍ２～約２００ｃｍ２、又は約２００ｃｍ２～約２５０ｃｍ２の表面積を有する。ある特定の実施形態において、本開示の皮膚構築物は、約９０ｃｍ２～約１１０ｃｍ２の表面積を有する。一実施形態において、本開示の皮膚構築物は、約１００ｃｍ２の表面積を有する。
【0017】
本開示の皮膚構築物は、任意選択的にメッシュされていてもよい。いくつかの実施形態において、皮膚構築物は、約１：１以上（例えば、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１等）のメッシュ比を有する。いくつかの実施形態において、皮膚構築物は、メッシュされていない。
【0018】
皮膚構築物の各層は、本発明の皮膚構成物の他の規定する特徴と共に、以下に詳述される。
【0019】
（ａ）完全に階層化された上皮層
本開示の皮膚構築物は、上皮様である完全に階層化された上皮層を含む。完全に階層化された上皮層は、上面及び底面を有し、ヒトケラチノサイトを含む。
本開示の皮膚構築物は、上皮様である完全に階層化された上皮層を含む。完全に階層化された上皮層は、上面及び底面を有し、ヒトケラチノサイトを含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、完全に階層化された上皮層は、ＮＩＫＳ細胞を含む。ＮＩＫＳ（商標登録）細胞は、ＡＴＣＣに寄託され（ＣＲＬ－１２１９１）、米国特許第５，９８９，８３７号及び米国特許第６，９６４，８６９号に更に詳細に記載され、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0021】
完全に階層化された上皮層は、種々の外因性核酸を発現するように操作されたＮＩＫＳ（商標登録）細胞を包含し得る。ＶＥＧＦタンパク質（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ等）をコードする外因性遺伝子、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ－１Ａ等）をコードする外因性遺伝子、アンジオポエチン（例えば、ＡＮＧＰＴ１等）をコードする外因性遺伝子、カテリシジンペプチド又はその切断産物（例えば、ｈＣＡＰ－１８等）をコードする外因性遺伝子、ベータ－ディフェンシン（例えば、ｈＢＤ－３等）をコードする外因性遺伝子、ケラチノサイト成長因子（例えば、ＫＧＦ－２等）をコードする外因性遺伝子、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（例えば、ＴＩＭＰ－１等）をコードする外因性遺伝子、外因性ＩＬ－１２遺伝子、並びに他の抗菌剤、成長因子、転写因子、インターロイキン及び細胞外マトリックスタンパク質をコードする外因性核酸配列を発現するように操作されたＮＩＫＳ（登録商標）細胞が明示的に企図される。非限定的な例として、例えば、これらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７４９８１６７号、同第７９１５０４２号、同第７８０７１４８号、同第７９８８９５９号、同第８８０８６８５号、同第７６７４２９１号、同第８０９２５３１号、同第８７９０６３６号、同第９５２６７４８号、同第９２１６２０２号、及び同９１６３０７６号、並びにＵＳ２０１９／００３０１３０を参照されたい。所望のタンパク質をコードする外因性核酸を発現するように操作されたＮＩＫＳ細胞を含む皮膚構築物は、外因性核酸を含有しないＮＩＫＳ細胞を含む皮膚構築物よりも多くの量の（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％等多くの）そのタンパク質を産生する。
【0022】
いくつかの実施形態において、完全に階層化された上皮層は、組織学によって測定される場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有する。例えば、完全に階層化された上皮層は、組織学によって測定される場合、約７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、又は１２０μｍの厚さを有し得る。
【0023】
（ｂ）真皮等価層
本開示の皮膚構築物は、真皮様である真皮等価層を含む。真皮等価層は、上面及び底面を有し、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含む。
本開示の皮膚構築物は、真皮様である真皮等価層を含む。真皮等価層は、上面及び底面を有し、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、真皮等価層は、組織学によって測定される場合、約２０μｍ～約８０μｍの厚さを有する。例えば、真皮等価層は、組織学によって測定される場合、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０μｍの厚さを有し得る。
【0025】
ｉ．ヒト真皮線維芽細胞
本開示の皮膚構築物は、ヒト真皮線維芽細胞を含む真皮等価層を包含する。例示的な実施形態において、ヒト真皮線維芽細胞は、初代の正常なヒト真皮線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、ヒト真皮線維芽細胞は、不死化される。
本開示の皮膚構築物は、ヒト真皮線維芽細胞を含む真皮等価層を包含する。例示的な実施形態において、ヒト真皮線維芽細胞は、初代の正常なヒト真皮線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、ヒト真皮線維芽細胞は、不死化される。
【0026】
ｉｉ．マトリックス
本開示の皮膚構築物は、マトリックスを含む真皮等価層を包含する。真皮等価層のマトリックスは、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、真皮等価層のマトリックスは、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。
本開示の皮膚構築物は、マトリックスを含む真皮等価層を包含する。真皮等価層のマトリックスは、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、真皮等価層のマトリックスは、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。
【0027】
真皮等価物中に存在するコラーゲンとしては、Ｉ型マウスコラーゲンが挙げられ得る。代替的に、真皮等価物中に存在する唯一のコラーゲンは、皮膚代替物（例えば、ヒト真皮線維芽細胞）の細胞によって産生され得る。マトリックスは、その中に含まれる細胞によって産生される追加の生体分子を更に含み得る。例示的な実施形態において、皮層は、線維芽細胞によって産生され、組織化されたマトリックス（例えば、細胞外マトリックス）内に埋め込まれた正常なヒト真皮線維芽細胞で構成される。この実施形態のいくつかの繰り返しにおいて、真皮等価層中に非ヒトコラーゲンは存在しない。この実施形態の他の繰り返しにおいて、真皮等価層には最大約８５％の非ヒトコラーゲンが存在する。特定の繰り返しにおいて、非ヒトコラーゲンは、マウスコラーゲンである。別の例示的な実施形態において、真皮等価層は、精製されたマウスＩ型コラーゲンを含有するゲル化コラーゲンマトリックスに埋め込まれた正常なヒト真皮線維芽細胞で構成される。疑問を避けるために、この実施形態において、マウスＩ型コラーゲンは、皮層にその一次構造を与えるようにゲル化されているが、その中に埋め込まれた正常なヒト真皮線維芽細胞は、マトリックスに対してコラーゲン（及び他の生体分子）を産生し、それに寄与し得る。
【0028】
ｉｉｉ．細胞の組み合わせ
上の実施形態のいずれかの皮膚構築物は、単一のヒトドナー由来の上皮層のケラチノサイト、又は単一のヒトドナー由来の真皮等価層の真皮線維芽細胞を含み得る。代替的に、上の実施形態のいずれかの皮膚構築物は、単一のヒトドナー由来の上皮層のケラチノサイト、及び単一のヒトドナー由来の真皮等価層の真皮線維芽細胞を含み得る。任意選択的に、真皮線維芽細胞のドナーは、ケラチノサイトのヒトドナーとは異なっていてもよい。
上の実施形態のいずれかの皮膚構築物は、単一のヒトドナー由来の上皮層のケラチノサイト、又は単一のヒトドナー由来の真皮等価層の真皮線維芽細胞を含み得る。代替的に、上の実施形態のいずれかの皮膚構築物は、単一のヒトドナー由来の上皮層のケラチノサイト、及び単一のヒトドナー由来の真皮等価層の真皮線維芽細胞を含み得る。任意選択的に、真皮線維芽細胞のドナーは、ケラチノサイトのヒトドナーとは異なっていてもよい。
【0029】
いくつかの実施形態において、本開示の皮膚構築物は、ＮＩＫＳ細胞であるケラチノサイト、又は正常なヒト真皮線維芽細胞である真皮線維芽細胞を含み得る。他の実施形態において、本開示の皮膚構築物は、ＮＩＫＳ細胞であるケラチノサイト、及び正常なヒト真皮線維芽細胞である真皮線維芽細胞を含み得る。
【0030】
（ｃ）接着
本開示の皮膚構築物は、上で詳述したように、上皮層及び真皮等価層の２つの層を含む。全ての場合において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも８５％を覆うように接着される。ある特定の実施形態において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％より多くを覆うように接着される。いくつかの実施形態において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％より多くを覆うように接着される。特定の実施形態において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％、９９％、又は９９％より多くを覆うように接着される。
本開示の皮膚構築物は、上で詳述したように、上皮層及び真皮等価層の２つの層を含む。全ての場合において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも８５％を覆うように接着される。ある特定の実施形態において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％より多くを覆うように接着される。いくつかの実施形態において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％より多くを覆うように接着される。特定の実施形態において、上皮層の底面は、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％、９９％、又は９９％より多くを覆うように接着される。
【0031】
本明細書で使用される場合、「接着される」とは、製造中に生じる層間の自然な相互作用を指し、いかなる種類の人工接着剤又は接着剤を指すものではない。
【0032】
（ｄ）コラーゲン
本開示の皮膚構築物は、以下の実施例に詳述されるプロトコルを使用して測定される場合、皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．２０ｍｇ～皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．５０ｍｇの総コラーゲン含有量を有する。いくつかの実施形態において、皮膚構築物は、皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量を有し得る。例えば、皮膚構築物は、皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、又は０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量を有し得る。特定の実施形態において、皮膚構築物は、皮膚構築物表面積の約０．２５～約０．３０、約０．３０～約０．３５、約０．３５～約０．４０、又は約０．４０～約０．４５ｃｍ２の総コラーゲン含有量を有し得る。
本開示の皮膚構築物は、以下の実施例に詳述されるプロトコルを使用して測定される場合、皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．２０ｍｇ～皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．５０ｍｇの総コラーゲン含有量を有する。いくつかの実施形態において、皮膚構築物は、皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量を有し得る。例えば、皮膚構築物は、皮膚構築物表面積１ｃｍ２当たり約０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、又は０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量を有し得る。特定の実施形態において、皮膚構築物は、皮膚構築物表面積の約０．２５～約０．３０、約０．３０～約０．３５、約０．３５～約０．４０、又は約０．４０～約０．４５ｃｍ２の総コラーゲン含有量を有し得る。
【0033】
特定の実施形態において、本開示の皮膚構築物は、ヒト１型コラーゲンを含む。例えば、本開示の皮膚構築物は、以下の実施例に詳述されるプロトコルを使用して測定される場合、表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有し得る。いくつかの実施形態において、皮膚構築物は、１００ｃｍ２当たり少なくとも５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する。例えば、皮膚構築物は、１００ｃｍ２当たり少なくとも５．５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン、又は少なくとも少なくとも５．８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有し得る。
【0034】
代替的な実施形態において、本発明の皮膚構築物は、表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン、又は表面積１ｃｍ２当たり少なくとも少なくとも０．０５８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有し得る。
【0035】
ヒト１型コラーゲンを含む本開示の皮膚構築物を包含する上の実施形態の各々において、ヒトＩ型コラーゲンの約９５％以上は、皮膚構築物の細胞によって産生される。例えば、ヒトＩ型コラーゲンの約９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％は、皮膚構築物の細胞によって産生され得る。特定の実施形態において、ヒトＩ型コラーゲンの約１００％は、皮膚構築物の細胞によって産生される。
【0036】
本開示の皮膚構築物は、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含んでいてもよく、マウスＩ型コラーゲンは、皮膚構築物中の総コラーゲンの９０重量％以下である。例えば、いくつかの実施形態において、マウス１型コラーゲンは、皮膚構築物中の総コラーゲン型の約６０重量％～約９０重量％である。
【0037】
好ましい実施形態において、本開示の皮膚構築物は、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する。
【0038】
ある特定の実施形態において、本開示の皮膚構築物は、最大約８８％のマウスコラーゲンを含み得る。例えば、本開示の皮膚構築物は、最大約８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、又は５０％のマウスコラーゲンを含み得る。この段落に記載の実施形態の各々において、非マウスコラーゲンは、ヒトコラーゲンである。
【0039】
特定の実施形態において、本開示の皮膚構築物は、約１０質量％～約２５質量％のヒトコラーゲンを含み得る。これらの実施形態において、ヒトコラーゲンは、正常なヒト真皮線維芽細胞に由来する。例えば、本開示の皮膚構築物は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５質量％のヒトコラーゲンを含み得る。ある特定の実施形態において、本開示の皮膚構築物は、約１５～約２０質量％のヒトコラーゲンを含み得る。
【0040】
（ｅ）破壊荷重
本発明の皮膚構築物は、約０．５～約１．０Ｎの破壊荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位を有する。本明細書で使用される場合、「破壊荷重」は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで皮膚構築物の試料を引っ張るのに必要な力を指し、試料は、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、対称形のドッグボーン様の形状である。例えば、図２の適切な試料の図を参照されたい。
本発明の皮膚構築物は、約０．５～約１．０Ｎの破壊荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位を有する。本明細書で使用される場合、「破壊荷重」は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで皮膚構築物の試料を引っ張るのに必要な力を指し、試料は、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、対称形のドッグボーン様の形状である。例えば、図２の適切な試料の図を参照されたい。
【0041】
いくつかの実施形態において、本発明の皮膚構築物は、約０．５Ｎ、０．６Ｎ、０．７Ｎ、０．８Ｎ、０．９Ｎ、又は１．０Ｎの破壊荷重、及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位を有する。ある特定の実施形態において、本発明の皮膚構築物は、約０．５～約１．０Ｎの破壊荷重、及び約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５ｍｍの変位を有する。
【0042】
本開示の皮膚構築物は、皮膚構築物の真皮等価層がまず破壊し、その後に、完全に階層化された上皮層が破壊するという、二段階で破壊する。例えば、いくつかの実施形態において、真皮等価層は、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊する。ある特定の実施形態において、真皮等価層は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８ｍｍの変位で破壊する。いくつかの実施形態において、真皮等価層は、約１４～１６ｍｍの変位及び約０．１～約０．５Ｎの破壊荷重で破壊する。
【0043】
ある特定の実施形態において、真皮等価層が破壊するとき、荷重は、破壊荷重の１０％未満低下する。例えば、真皮等価層が破壊するとき、荷重は、破壊荷重の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満低下し得る。一実施形態において、真皮等価層が破壊するとき、荷重は、破壊荷重の１％未満低下する。
【0044】
（ｆ）製造
皮膚構築物を製造するための好適な製造プロセスは、当該技術分野において以前に記載されている。例えば、これらの開示が各々、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７４９８１６７号、同第７９１５０４２号、同第７８０７１４８号、同第７９８８９５９号、同第８８０８６８５号、同第７６７４２９１号、同第８０９２５３１号、同第８７９０６３６号、同第９５２６７４８号、同第９２１６２０２号、同第９１６３０７６号、同第１００９１９８３号、及びＵＳ２０１９／００３０１３０を参照されたい。
皮膚構築物を製造するための好適な製造プロセスは、当該技術分野において以前に記載されている。例えば、これらの開示が各々、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７４９８１６７号、同第７９１５０４２号、同第７８０７１４８号、同第７９８８９５９号、同第８８０８６８５号、同第７６７４２９１号、同第８０９２５３１号、同第８７９０６３６号、同第９５２６７４８号、同第９２１６２０２号、同第９１６３０７６号、同第１００９１９８３号、及びＵＳ２０１９／００３０１３０を参照されたい。
【0045】
本開示の皮膚構築物は、凍結保存されてもよい。凍結保存方法は、当該技術分野において既知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，０９１，９８３号を参照されたい。
【0046】
本開示の皮膚構築物が凍結保存後に解凍された後、皮膚構築物は、ｂＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、ＰｌＧＦ、ＳＤＦ－１α、ＴＧＦ－β１、及びＶＥＧＦ－Ａから選択される複数のタンパク質を分泌し得る。
【実施例】
【0047】
以下の実施例は、本発明の様々な繰り返しを例示する。当業者は、以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施において良好に機能するために本発明者らによって発見された技術を表すことを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示され、依然として同様又は類似の結果を得る特定の実施形態に変更が行われ得ることを理解すべきである。したがって、添付の図面に記載されるか、又は示される全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではない。
【0048】
緒言
製造プロセスを確定した後、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織内の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子の発現を調査するために、研究を行った。新生真皮等価物（ＤＥ）は、インプットマウスＩ型コラーゲン及び正常なヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）からなる、製剤化ステップで定義された組成を有するが、成熟ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）のＥＣＭ組成物を調査して、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織製造の器官型段階中のＤＥ組成の変化を評価した。実施された研究は、ＮＩＫＳケラチノサイト及びＮＨＤＦからヒトＥＣＭ分子を入念に作り上げることによって、ＤＥが、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造プロセス中に顕著な変化を受けることを示している。
製造プロセスを確定した後、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織内の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子の発現を調査するために、研究を行った。新生真皮等価物（ＤＥ）は、インプットマウスＩ型コラーゲン及び正常なヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）からなる、製剤化ステップで定義された組成を有するが、成熟ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）のＥＣＭ組成物を調査して、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織製造の器官型段階中のＤＥ組成の変化を評価した。実施された研究は、ＮＩＫＳケラチノサイト及びＮＨＤＦからヒトＥＣＭ分子を入念に作り上げることによって、ＤＥが、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造プロセス中に顕著な変化を受けることを示している。
【0049】
ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の製造プロセスは、３つの連続した細胞及び組織培養プロセスを包含する。製造プロセスの第Ｉ段階において、ＮＩＫＳケラチノサイトは、単層細胞培養で増殖する。第Ｉ段階のＮＩＫＳケラチノサイト培養と同時に、ＮＨＤＦは、単層培養で増殖し、精製されたＩ型コラーゲン及び培養培地と合わせられ、ゲル化して、細胞化真皮等価物（ＤＥ）を形成する。第ＩＩ段階において、ＮＩＫＳケラチノサイトを、ＤＥの表面に播種し、浸漬条件下で２日間培養し、ＤＥ表面の完全な上皮化を促進する。次いで、第ＩＩＩ段階において、組織を、空気－液体界面へと押し上げ、制御された低湿度環境で１８日間維持し、組織成熟を促進する。皮膚等価物は、一般に、米国特許第７，６７４，２９１号、同第７，８０７，１４８号、同第７，９１５，０４２号、同第７，９８８，９５９号、及び同第８，０９２，５３１号に記載されるように調製され、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0050】
ＥＬＩＳＡ研究の結果に基づいて、１つの１００ｃｍ２のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織中で合成されたヒトＩ型コラーゲンの総量は、凍結保存直前の名目上の製剤原料段階で、組織当たり５．８ｍｇであると推定される。ヒドロキシプロリン含有量の定量化により、各成熟した１００ｃｍ２のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織において、２９．６～３８．６ｍｇの総コラーゲン含有量を示す。このことは、コラーゲンの１５～２０質量％が、ＮＨＤＦ由来のヒトコラーゲンであり、コラーゲンの残りの８０～８５質量％が、マウス由来であることを示す。５１．５ｍｇのマウスコラーゲンのインプット質量に基づき、インプットマウスコラーゲンのおよそ３７～５４％が、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造プロセス中に失われ得ると決定されている。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）中に残存するマウスコラーゲンにもかかわらず、ここに提示されるデータは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造プロセス全体で、ＮＨＤＦに埋め込まれたマウスＩ型コラーゲンを使用して製剤化される新生ＤＥが、ヒト皮膚の主要な構造的及び機能的ＥＣＭ要素の多くの産生及び組み立てによって形質転換されることを示唆している。本明細書のデータは、外因性マウスコラーゲンゲルが、インプットＮＨＤＦ及びＮＩＫＳ細胞のための初期の生理学的基質を提供するが、組織の最終的な機械的特性に実質的に寄与しないことを示す。ＥＣＭの改変及び再編成は、全体的なＤＥ構造の変化と並行して起こり、これはゆるく編成された厚さ２．３ｍｍ（体積２３ｍＬ）のヒドロゲルとして始まり、成熟組織において、より圧縮された厚さ１００μｍ（体積１ｍＬ）未満の層に移行する。
【0051】
重要なことに、ＮＩＫＳケラチノサイト及びＮＨＤＦは両方とも、インテグリン受容体及びディスコイジンドメイン受容体を介してコラーゲンに結合すると考えられる。この結合は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の発達中にケラチノサイト及び線維芽細胞内で生物学的応答を誘発し、最終的な１００ｃｍ２の皮膚構築物の固有の引張特徴を生じさせる。インプットマウスＩ型コラーゲン出発物質は、細胞成熟、及びＮＩＫＳケラチノサイトとＮＨＤＦとの間のパラクリンシグナル伝達を可能にする生物学的に関連する環境を提供する。コラーゲンは、インプットＮＩＫＳケラチノサイト及びＮＨＤＦの初期細胞接着、タンパク質分泌、増殖、及び分化を促進する。器官型培養環境は、他のコラーゲン、接着タンパク質、プロテオグリカン、並びにマトリックス結合酵素及び成長因子を含む構造的に編成されたＥＣＭの形成及び維持を促進する。Ｉ型コラーゲンは、発達しつつあるＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織内の細胞活性の機能的調節因子としての役割も果たすことが予想される。
【0052】
本明細書にまとめられている研究は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造中のヒトＥＣＭの合成及び蓄積を追跡するために、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織製造中の様々な時間点でのＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の薄い断面上での間接的な免疫蛍光（ＩＩＦ）、並びに製造プロセス中のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織成長チャンバから採取した馴化培地のＥＬＩＳＡの使用を用いた。この分析は、新生ＤＥ中の初期コラーゲンマトリックスが、ＮＩＫＳケラチノサイト及びＮＨＤＦによるヒトＥＣＭ成分の産生及び編成によって広範囲に改変されることを示す。
【0053】
研究を実施して、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織製造プロセスの器官型段階全体で、ＥＣＭ分子の分泌を特性決定した。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織は、真皮ＥＣＭの主な構造成分を表す、線維状Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを合成することが示された。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織成熟全体にわたるＩＩＦによる抗原特異的染色の増加は、ヒトコラーゲンの新合成を示す。ヒトＩ型コラーゲンの合成は、Ｉ型コラーゲンの生合成処理と関連する特異的な代謝産物であるＩ型コラーゲンＣプロペプチド（ＣＩＣＰ）の検出によって更に確認された。追加のデータは、ヒトコラーゲンが、両方ともコラーゲン構造の組み立てをインビボで導くように機能するＶＩ型コラーゲン及びデコリンの蓄積を含め、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）の細胞成分によって堆積され、編成されることを示す。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）は、コラーゲンＩＶ及びラミニン３３２（ラミニン５）の適切な空間分布によって示されるように、基底膜帯及び真皮－上皮接合部を編成することを示した。新しく注がれたＤＥ中にこれらのＥＣＭ分子が存在しないことは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）の細胞成分が、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）成熟プロセス中に、皮膚組織の構造的機能及びシグナル伝達機能において中心的な役割を有するヒトＥＣＭ成分を含むように、新生ＤＥを形質変換することを示す。
【0054】
実施例１－間接免疫蛍光（ＩＩＦ）
ＩＩＦを使用して、様々な製造段階としての新鮮な新生細胞化ＤＥの凍結切片中、及び発達しつつある組織中のＥＣＭタンパク質を検出した。新生ＤＥ内のＮＨＤＦが希少であることに起因して、ＤＡＰＩ核対比染色を使用して蛍光イメージングによって、核染色を可視化することはできなかった。これに代えて、マウスＩ型コラーゲンに対する一次抗体である、新しく注がれたＤＥ中の一次ＥＣＭ成分を使用した。この様式での対比染色は、ＤＥの完全性の検証を可能にした。
ＩＩＦを使用して、様々な製造段階としての新鮮な新生細胞化ＤＥの凍結切片中、及び発達しつつある組織中のＥＣＭタンパク質を検出した。新生ＤＥ内のＮＨＤＦが希少であることに起因して、ＤＡＰＩ核対比染色を使用して蛍光イメージングによって、核染色を可視化することはできなかった。これに代えて、マウスＩ型コラーゲンに対する一次抗体である、新しく注がれたＤＥ中の一次ＥＣＭ成分を使用した。この様式での対比染色は、ＤＥの完全性の検証を可能にした。
【0055】
Ｉ型コラーゲン
Ｉ型コラーゲンは、皮膚ＥＣＭの主要な構造成分を構成する原線維形成コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンの検出に使用される抗体は、ヒト及びウシのＩ型コラーゲンに対して指向し、抗体特異性を増加させるために、他のヒトコラーゲン型、血清タンパク質、及び非コラーゲン性ＥＣＭタンパク質に対して高度に交差吸着された。この抗体の調製は、マウスＩ型コラーゲンと交差反応させるために、製造業者によって注目される。したがって、この試薬の使用は、発達しつつある組織内でのマウスコラーゲンとヒトコラーゲンとを区別することは期待されなかった。Ｉ型コラーゲンの拡散染色は、新しく注がれた新生ＤＥ中で存在し、このことは、マウスＩ型コラーゲン出発物質との交差反応性を確認するものである。プロセス１８日目までに、新生ＤＥ全体にわたるコラーゲンＩ型の拡散染色に加えて、新生ＤＥ全体にわたって濃縮された点状染色も明らかにみられ、多くは組織断面内で捕捉されたＮＨＤＦからの核に隣接していた。
Ｉ型コラーゲンは、皮膚ＥＣＭの主要な構造成分を構成する原線維形成コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンの検出に使用される抗体は、ヒト及びウシのＩ型コラーゲンに対して指向し、抗体特異性を増加させるために、他のヒトコラーゲン型、血清タンパク質、及び非コラーゲン性ＥＣＭタンパク質に対して高度に交差吸着された。この抗体の調製は、マウスＩ型コラーゲンと交差反応させるために、製造業者によって注目される。したがって、この試薬の使用は、発達しつつある組織内でのマウスコラーゲンとヒトコラーゲンとを区別することは期待されなかった。Ｉ型コラーゲンの拡散染色は、新しく注がれた新生ＤＥ中で存在し、このことは、マウスＩ型コラーゲン出発物質との交差反応性を確認するものである。プロセス１８日目までに、新生ＤＥ全体にわたるコラーゲンＩ型の拡散染色に加えて、新生ＤＥ全体にわたって濃縮された点状染色も明らかにみられ、多くは組織断面内で捕捉されたＮＨＤＦからの核に隣接していた。
【0056】
プロセス３３日目（凍結保存直前の名目上の製剤原料を表す）までに、Ｉ型コラーゲンの発現が、線維状分布において、ＤＥ全体でみられた。解凍直後のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）薬物製品において、Ｉ型コラーゲンの局在化は、真皮等価物全体で均一であるようにみえ、これはおそらく、凍結保存溶液のグリセロール成分によるコラーゲンＥＣＭの可逆的解離から生じるエピトープ脱マスキングの機能である（Ｙｅｈ，２０１３）。組織成熟中の染色パターンの変化は、新生細胞化マウスコラーゲンゲル化ＤＥの染色からのシフトと一致しており、ＮＨＤＦによって新しく合成されたヒトＩ型コラーゲンの点状染色、その後のＩ型コラーゲンからの原線維への編成を示している。使用されるＩ型抗体は、ヒトコラーゲンとマウスコラーゲンとを区別することはできないが、ＩＩＩ型コラーゲン及びデコリンとのＩ型コラーゲン染色の共局在化（以下を参照）は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織製造中のヒトＩ型コラーゲン生合成を強く裏付けている。
【0057】
ＩＩＩ型コラーゲン
ＩＩＩ型コラーゲンは、弾性組織の主要な線維状コラーゲンの１つであり、Ｉ型コラーゲンを豊富に含む組織と共局在化することがわかっており、これは両コラーゲン型を含有する異型コラーゲン原線維の組み立てに起因する（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。このタンパク質の検出に使用される抗体調製物は、ヒトＩＩＩ型コラーゲンに対して上昇し、ＩＩＩ型コラーゲン上の立体構造決定因子と反応することが報告されている。この抗体調製物は、これらのタンパク質に対する交差反応性を排除するために、ヒトコラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型に対して交差吸着した。抗体調製物は、マウスＩＩＩ型コラーゲンと交差反応することが報告されている。しかしながら、新しく注がれたＤＥにおいて、ＩＩＩ型コラーゲンシグナルは検出されず、このことは、マウスＩＩＩ型コラーゲンが、新生細胞化ＤＥの製剤に使用されるコラーゲン出発物質の重要な成分ではないことを示唆している。プロセス１８日目までに、Ｉ型コラーゲンの場合に指摘されたように、しばしばＮＨＤＦ核と関連するＤＥ全体にわたって点状染色が存在していた。この局在化は、ＮＨＤＦによるＩＩＩ型コラーゲンの合成及び分泌と一致している。染色強度は、組織成熟全体で増加した。このことは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織成熟中のヒトＩＩＩ型コラーゲンの合成及び堆積を確認するものである。
ＩＩＩ型コラーゲンは、弾性組織の主要な線維状コラーゲンの１つであり、Ｉ型コラーゲンを豊富に含む組織と共局在化することがわかっており、これは両コラーゲン型を含有する異型コラーゲン原線維の組み立てに起因する（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。このタンパク質の検出に使用される抗体調製物は、ヒトＩＩＩ型コラーゲンに対して上昇し、ＩＩＩ型コラーゲン上の立体構造決定因子と反応することが報告されている。この抗体調製物は、これらのタンパク質に対する交差反応性を排除するために、ヒトコラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型に対して交差吸着した。抗体調製物は、マウスＩＩＩ型コラーゲンと交差反応することが報告されている。しかしながら、新しく注がれたＤＥにおいて、ＩＩＩ型コラーゲンシグナルは検出されず、このことは、マウスＩＩＩ型コラーゲンが、新生細胞化ＤＥの製剤に使用されるコラーゲン出発物質の重要な成分ではないことを示唆している。プロセス１８日目までに、Ｉ型コラーゲンの場合に指摘されたように、しばしばＮＨＤＦ核と関連するＤＥ全体にわたって点状染色が存在していた。この局在化は、ＮＨＤＦによるＩＩＩ型コラーゲンの合成及び分泌と一致している。染色強度は、組織成熟全体で増加した。このことは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織成熟中のヒトＩＩＩ型コラーゲンの合成及び堆積を確認するものである。
【0058】
ＶＩ型コラーゲン
ＶＩ型コラーゲンは、天然ヒト皮膚のＥＣＭ内に糸状の網を含む非線維状コラーゲンであり、線維状コラーゲンであるＩ型及びＩＩＩ型、ＩＶ型コラーゲン、並びにデコリンを含む種々の構造ＥＣＭ成分と機能的相互作用を有する。ＶＩ型コラーゲンは、創傷治癒と関連する成長因子及び酵素のための場所として、並びに真皮マトリックスの組み立て及び組成の調節因子として作用する（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。ＶＩ型コラーゲンは、ＥＣＭの形成中に主要な間質コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型の堆積に先行することも示されている（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。ヒトＶＩ型コラーゲンの検出に使用される抗体調製物は、天然のＶＩ型コラーゲン上の立体構造決定因子と反応し、マウスＶＩ型コラーゲンを認識せず、ヒトコラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、又はＶ型と交差反応しない。ＶＩ型コラーゲンは、新しく注がれた新生ＤＥにおいて、検出することができなかった。プロセス１８日目までに、真皮区画に点状染色が位置しており、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの発現を反映している。プロセス３３日までに、ＶＩ型コラーゲンは、ＤＥ全体で検出され、このことは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の細胞成分によるヒトコラーゲンＶＩ型生合成を確認するものである。
ＶＩ型コラーゲンは、天然ヒト皮膚のＥＣＭ内に糸状の網を含む非線維状コラーゲンであり、線維状コラーゲンであるＩ型及びＩＩＩ型、ＩＶ型コラーゲン、並びにデコリンを含む種々の構造ＥＣＭ成分と機能的相互作用を有する。ＶＩ型コラーゲンは、創傷治癒と関連する成長因子及び酵素のための場所として、並びに真皮マトリックスの組み立て及び組成の調節因子として作用する（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。ＶＩ型コラーゲンは、ＥＣＭの形成中に主要な間質コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型の堆積に先行することも示されている（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。ヒトＶＩ型コラーゲンの検出に使用される抗体調製物は、天然のＶＩ型コラーゲン上の立体構造決定因子と反応し、マウスＶＩ型コラーゲンを認識せず、ヒトコラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、又はＶ型と交差反応しない。ＶＩ型コラーゲンは、新しく注がれた新生ＤＥにおいて、検出することができなかった。プロセス１８日目までに、真皮区画に点状染色が位置しており、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの発現を反映している。プロセス３３日までに、ＶＩ型コラーゲンは、ＤＥ全体で検出され、このことは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の細胞成分によるヒトコラーゲンＶＩ型生合成を確認するものである。
【0059】
デコリン
デコリンは、Ｉ型コラーゲン原線維の組み立てと関連する真皮硫酸プロテオグリカンであり、インビトロ及びインビボの両方で新たに合成されたＩ型コラーゲンを視覚化するために使用されてきた（Ｏｏｓｔｅｎｄｏｒｐ，２０１６）。抗体調製物は、ヒトデコリンコアタンパク質の組換え断片に対して上昇し、潜在的なマウス交差反応性を有するヒトデコリンを検出することが報告されている。
デコリンは、Ｉ型コラーゲン原線維の組み立てと関連する真皮硫酸プロテオグリカンであり、インビトロ及びインビボの両方で新たに合成されたＩ型コラーゲンを視覚化するために使用されてきた（Ｏｏｓｔｅｎｄｏｒｐ，２０１６）。抗体調製物は、ヒトデコリンコアタンパク質の組換え断片に対して上昇し、潜在的なマウス交差反応性を有するヒトデコリンを検出することが報告されている。
【0060】
デコリンは、新しく注がれた新生ＤＥにおいて、検出することができなかったが、成熟したＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織としての真皮区画において蓄積しており、このことは、製造中のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の細胞成分によるヒトデコリンの合成を確認するものである。
【0061】
ＩＶ型コラーゲン
ＩＶ型コラーゲン（図６）は、基底膜帯内の真皮－上皮接合部の主要な構造成分である（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。この研究で用いられる抗体調製物は、精製されたヒトＩＶ型コラーゲンに対して上昇し、マウスＩＶ型コラーゲンとの交差反応性は、製造業者によって評価されなかった。ＩＶ型コラーゲンは、新生ＤＥにおいて、又はＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）成熟の初期の器官型段階中に、検出されなかった。ＩＶ型コラーゲンの発現は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織製造のプロセス３３日目に、また、凍結保存された最終製品において、真皮区画と上皮区画との間の接合部で検出可能であり、このことは、ＩＶ型コラーゲンが、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の細胞成分によって適切に合成され、編成されることを確認するものである。
ＩＶ型コラーゲン（図６）は、基底膜帯内の真皮－上皮接合部の主要な構造成分である（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。この研究で用いられる抗体調製物は、精製されたヒトＩＶ型コラーゲンに対して上昇し、マウスＩＶ型コラーゲンとの交差反応性は、製造業者によって評価されなかった。ＩＶ型コラーゲンは、新生ＤＥにおいて、又はＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）成熟の初期の器官型段階中に、検出されなかった。ＩＶ型コラーゲンの発現は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織製造のプロセス３３日目に、また、凍結保存された最終製品において、真皮区画と上皮区画との間の接合部で検出可能であり、このことは、ＩＶ型コラーゲンが、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の細胞成分によって適切に合成され、編成されることを確認するものである。
【0062】
ラミニン３３２（ラミニン５）
ラミニン５は、皮膚の基底膜帯にみられ、その下にある真皮に対する上皮の接着に寄与する固定フィラメントと関連している（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。この研究で利用される抗体調製物は、ラミニンのヒトγ２鎖の組換え断片に対して上昇した。この抗体調製物は、他のラミニンアイソフォームと反応しないが、マウスラミニン５に対する交差反応性は、製造業者によって評価されなかった。ラミニン５は、新しく注がれた新生ＤＥにおいて、検出することができなかった。しかしながら、プロセス１８日目までに、真皮－上皮接合部で点状染色が明らかであった。プロセス２６日目までに、真皮－上皮接合部で連続的な染色が検出された。この染色は、組織の成熟全体にわたって残っており、プロセス３３日目までに、真皮区画全体にわたる拡散染色を含むように増殖した。これらの観察は、ヒトラミニン５が、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の細胞成分によって合成され、堆積されることを示す。プロセス３３日目に、及び解凍後の標本において、この抗体調製物は、このポリカーボネート膜に非特異的に結合し、膜自体と関連するシグナルを引き起こすことが示された。
ラミニン５は、皮膚の基底膜帯にみられ、その下にある真皮に対する上皮の接着に寄与する固定フィラメントと関連している（Ｎｙｓｔｒｏｍ，２０１９）。この研究で利用される抗体調製物は、ラミニンのヒトγ２鎖の組換え断片に対して上昇した。この抗体調製物は、他のラミニンアイソフォームと反応しないが、マウスラミニン５に対する交差反応性は、製造業者によって評価されなかった。ラミニン５は、新しく注がれた新生ＤＥにおいて、検出することができなかった。しかしながら、プロセス１８日目までに、真皮－上皮接合部で点状染色が明らかであった。プロセス２６日目までに、真皮－上皮接合部で連続的な染色が検出された。この染色は、組織の成熟全体にわたって残っており、プロセス３３日目までに、真皮区画全体にわたる拡散染色を含むように増殖した。これらの観察は、ヒトラミニン５が、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の細胞成分によって合成され、堆積されることを示す。プロセス３３日目に、及び解凍後の標本において、この抗体調製物は、このポリカーボネート膜に非特異的に結合し、膜自体と関連するシグナルを引き起こすことが示された。
【0063】
実施例２－ＥＬＩＳＡ分析によるヒトコラーゲンインプロセス及び最終薬物製品における定量化
ヒトＩ型コラーゲンの合成は、１型コラーゲンのヒト架橋Ｃテロペプチド（ＣＩＣＰ）に特異的なＥＬＩＳＡを用いて、独立して確認された。ＤＥ製剤に使用されるインプットマウスＩ型コラーゲンは、ＣＩＣＰを含有しない成熟コラーゲンからなる。新たに合成されたＩ型コラーゲンは、線維状コラーゲン構造に重合する能力を有さないプロコラーゲンとして細胞内で産生される。分泌すると、プロコラーゲンは、特異的な細胞外プロテアーゼによってトロポコラーゲンに変換され、Ｎ末端及びＣ末端プロペプチドの両方を放出し、線維状コラーゲン構造の重合を可能にする。放出されたＣＩＣＰは、Ｉ型コラーゲン生合成のマーカーであり（Ｐａｒｆｉｔｔ，１９８７）、コラーゲン生合成の最小速度を得るために、定量化することができる。
ヒトＩ型コラーゲンの合成は、１型コラーゲンのヒト架橋Ｃテロペプチド（ＣＩＣＰ）に特異的なＥＬＩＳＡを用いて、独立して確認された。ＤＥ製剤に使用されるインプットマウスＩ型コラーゲンは、ＣＩＣＰを含有しない成熟コラーゲンからなる。新たに合成されたＩ型コラーゲンは、線維状コラーゲン構造に重合する能力を有さないプロコラーゲンとして細胞内で産生される。分泌すると、プロコラーゲンは、特異的な細胞外プロテアーゼによってトロポコラーゲンに変換され、Ｎ末端及びＣ末端プロペプチドの両方を放出し、線維状コラーゲン構造の重合を可能にする。放出されたＣＩＣＰは、Ｉ型コラーゲン生合成のマーカーであり（Ｐａｒｆｉｔｔ，１９８７）、コラーゲン生合成の最小速度を得るために、定量化することができる。
【0064】
ヒトＣＩＣＰを、ＮＩＫＳ播種の直前に、また、凍結保存ステップまでの各々の培地交換時に、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（商標登録）組織から集めた馴化培地において定量化した。試料を、ヒト特異的ＣＩＣＰ ＥＬＩＳＡを使用して、ＣＩＣＰ参照標準曲線に対して試験し、比較した。結果を、［ｍ／（ｖ＊ｔ）］、すなわち、１日（ｔ）当たりの培地の単位体積（ｖ）当たりの質量（ｍ）として表した。ヒトＩ型コラーゲンの合成の最小速度を、１：１モル比のＩ型ＣＩＣＰ三量体及びトロポコラーゲンＩ三量体に基づいて測定された値から外挿した。
【0065】
ヒトＩ型コラーゲンのＥＬＩＳＡの結果及び定量的推定値を、表１に示す。総分泌ＣＩＣＰは、各プロセスステップで平均ＣＩＣＰ含有量に総培地体積を掛け算することによって決定した。ＣＩＣＰ分泌速度は、総分泌ＣＩＣＰを、組織面積及び培地交換間の培養間隔によって割り算することによって得られた。Ｉ型コラーゲン合成の最小推定値は、ＣＩＣＰ三量体と成熟トロポコラーゲン三量体との間の１：１化学量論に基づいて、ＣＩＣＰ及び成熟トロポコラーゲン三量体の予測分子量を計算し、ＣＩＣＰ分泌速度に、ＣＩＣＰに対するトロポコラーゲンの質量比を掛け算することによって得られた。累積ヒトＩ型コラーゲンは、最小コラーゲン合成速度を、各プロセスステップについての総組織面積及び培養間隔を掛け算し、得られた値を合計することによって得られた。
【表1】
【0066】
Ｉ型コラーゲン合成は、真皮等価物上にＮＩＫＳケラチノサイトを播種する前に、低レベルで検出可能であった。初期の器官型段階（ＮＩＫＳ播種及びプロセス１５日目）中に、ＮＩＫＳケラチノサイトは、増殖し、新生ＤＥの表面上に広がる。空気－液体界面が、プロセス１５日目に開始すると、ＮＩＫＳとＮＨＤＦとの間のパラクリンシグナル伝達は、ＣＩＣＰ産生の顕著な増加を引き起こすと予想され、コラーゲン合成のピークレベルは、プロセス２６日目の前に集めた馴化培地においてみられるレベル上昇から推測することができる。このデータは、最小でおよそ５．８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンが、合成され、薬物製品の成熟ＤＥ内の成熟タンパク質として組み込まれることを裏付けている。
【0067】
実施例３－ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（商標登録）皮膚組織における総コラーゲンの定量化
上述のＣＩＣＰデータは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造プロセス中にヒトＩ型コラーゲンのインビトロ生合成を示し、組織当たり少なくとも５．８ｍｇである、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織において産生されるヒトＩ型コラーゲンの推定量が提供された。哺乳動物コラーゲンの固有のアミノ酸組成を利用することによって、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織において総コラーゲン含有量を定量化するために、追加の研究を行った。マウス及びヒトのＩ型コラーゲンは両方とも、コラーゲンの組み立てに適合するアミノ酸構造を作成するために、１２～１４質量％のヒドロキシプロリンで構成されている（Ｓｔｏｉｌｏｖ，２０１８）。
上述のＣＩＣＰデータは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造プロセス中にヒトＩ型コラーゲンのインビトロ生合成を示し、組織当たり少なくとも５．８ｍｇである、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織において産生されるヒトＩ型コラーゲンの推定量が提供された。哺乳動物コラーゲンの固有のアミノ酸組成を利用することによって、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織において総コラーゲン含有量を定量化するために、追加の研究を行った。マウス及びヒトのＩ型コラーゲンは両方とも、コラーゲンの組み立てに適合するアミノ酸構造を作成するために、１２～１４質量％のヒドロキシプロリンで構成されている（Ｓｔｏｉｌｏｖ，２０１８）。
【0068】
この研究は、総ヒドロキシプロリンの測定のための比色アッセイキットを利用し、次いで、これを使用して、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織において総コラーゲンを定量化した。次いで、残留マウスコラーゲンを、ＣＩＣＰ ＥＬＩＳＡから得られた推定ヒトコラーゲン成分を測定された総コラーゲンから引き算することによって推定した。ヒトコラーゲンの推定生合成から、最終産物における総コラーゲンと比較して、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織におけるマウスＩ型コラーゲン及びヒトＩ型コラーゲンの相対的寄与を近似することが可能であった。
【0069】
試料に対し、アルカリ加水分解を行い、その後に中和した。実験試料及びコラーゲン参照試料を、９６ウェルマイクロプレートのウェルに移した。ヒドロキシプロリン含有量を、ヒドロキシプロリンアッセイキット（過塩素酸塩を含まない）（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を使用して測定した。試料ウェル当たり０～１μｇの範囲のヒドロキシプロリンの標準曲線を生成するために、ヒドロキシプロリン標準溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルマイクロウェルプレートに３ッ組で適用した。加水分解物及び標準物質を乾燥するまで蒸発させ、クロラミンＴで酸化し、ＤＭＡＢを含有する現像溶液（Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬）と反応させた。吸光度測定を５６０ｎｍで行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアパッケージｖ．７．０．２を使用して、ヒドロキシプロリン含有量を決定した。
【0070】
ヒドロキシプロリンアッセイの実現可能性は、最初に、このアッセイが、マウスコラーゲン及びヒトコラーゲンの両方からなる試料において総コラーゲンを定量化する能力を評価することによって検証された。マウスＩ型コラーゲンの試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、これを１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した精製ヒト線維芽細胞由来Ｉ型コラーゲンの量を増やしつつ、混合した（表２）。この方法が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンの両方について同等の読みを提供することを検証するために、試料を、参照標準として使用した。
【表2】
【0071】
測定された滴定試料のまとめを表３に提供する。様々なレベルのマウス及びヒトのＩ型コラーゲンを含有する参照試料間で、参照試料におけるラットコラーゲン％に対する総コラーゲンの散布図から誘導される傾向線の平坦な傾きによって示されるように（－０．０００４）、総コラーゲン含有量の明らかな差はなかった。このデータは、Ｉ型コラーゲンにおけるヒドロキシプロリン含有量が、マウスコラーゲンとヒトコラーゲンとの間で一致していることを確認する。
【表3】
【0072】
ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の３つのロットの各々からの２つの凍結保存組織を、総コラーゲン含有量について評価した。組織は、市販の８０組織ロットスケールでのＳｔｒａｔａｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．，５３５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ製造施設で製造した（ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）ロットＦＰ０００１－０００００８８５９６及びＦＰ０００１－０００００８８５９７）か、又は単一製造ロット（Ｃｏｒｎｉｎｇ）からのマウスコラーゲンを使用し、２０組織ロットスケールでの５１０ Ｃｈａｒｍａｎｙ ＤｒｉｖｅでのＰｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社において製造された（ロットＳＧ－Ｃ１００－１０２４１９－６７）。組織を周囲温度で解凍し、３５～３９℃まで加温された１５ｍＬのＳｔｒａｔａｔｅｃｈ Ｈｏｌｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを含有する保持皿に移した。組織を周囲の室温で少なくとも１５分間保持して、凍結保存剤溶液の除去を可能にした。組織の試料を採取し、均質化し、ヒドロキシプロリン含有量の分析を行った。評価対象の組織及び試験試料のまとめを表４に提供する。
【表4】
【0073】
表５は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）試験試料からの結果をまとめたものである。１３．５質量％のヒドロキシプロリンの報告値に基づき、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織におけるコラーゲン含有量は、組織当たり２９．６～３８．６ｍｇと推定された（平均値３２．９ｍｇ、ｎ＝６組織）。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織最終製品中に存在するＣＩＣＰ ＥＬＩＳＡによる、組織当たり５．８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンの推定値に基づき、コラーゲンの１５～２０質量％が、ＮＨＤＦに由来し、コラーゲンの残りの８０．４～８５．０質量％が、マウス起源のものである。５１．５ｍｇのマウスコラーゲンのインプット質量に基づき、インプットマウスコラーゲンのおよそ３７～５４％が、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）製造プロセス中に失われ得ることを暗示している。
【表5】
【0074】
実施例４－ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）の機械的特性に対するコラーゲン成分の寄与
重要なことに、外因性マウスコラーゲンゲルは、インプットＮＨＤＦ及びＮＩＫＳ細胞のための初期の生理学的基質を提供するが、組織の最終的な機械的特性に実質的に寄与しない。組織の機械的特性を、単軸引張試験によって評価した。標準的なドッグボーン型引張標本（ゲージ幅４ｍｍ、ゲージ長さ２５ｍｍ）を、ステンレス鋼ダイ及び手動トグルプレスを使用して、組織から切断した。Ｍｉｔｕｔｏｙｏデジタル厚さゲージを使用して、厚さ測定を行った。標本を、Ｉｎｓｉｇｈｔ １ Ｂｉｏｎｉｘテンシオメーター（ＭＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）で、ＤＰＢＳにより連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った。Ｔｅｓｔｗｏｒｋｓ ４ソフトウェアを使用して取得した荷重及び変位データから、破壊時のピーク荷重を決定した。
重要なことに、外因性マウスコラーゲンゲルは、インプットＮＨＤＦ及びＮＩＫＳ細胞のための初期の生理学的基質を提供するが、組織の最終的な機械的特性に実質的に寄与しない。組織の機械的特性を、単軸引張試験によって評価した。標準的なドッグボーン型引張標本（ゲージ幅４ｍｍ、ゲージ長さ２５ｍｍ）を、ステンレス鋼ダイ及び手動トグルプレスを使用して、組織から切断した。Ｍｉｔｕｔｏｙｏデジタル厚さゲージを使用して、厚さ測定を行った。標本を、Ｉｎｓｉｇｈｔ １ Ｂｉｏｎｉｘテンシオメーター（ＭＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）で、ＤＰＢＳにより連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った。Ｔｅｓｔｗｏｒｋｓ ４ソフトウェアを使用して取得した荷重及び変位データから、破壊時のピーク荷重を決定した。
【0075】
試験中の引張標本の目視観察により、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織が、引張中に２つの別個の段階で破壊し、ＤＥが最初に破壊し、次いで、上皮層がより高い荷重及び変位で破壊すると、試料が破壊することを確認した。図１は、代表的な荷重変位曲線を示し、ＤＥ破壊点が矢印によって示されている。
【0076】
荷重変位曲線のプロファイルは、全体的な組織引張特性に対するＤＥ層の寄与が最小限であることを示す。ＤＥが、組織に対して顕著な機械強度をもたらす場合、荷重変位曲線において、わずかな平坦部ではなく、破壊する点での荷重の顕著な低下が存在するであろう。１２個のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）試料からのＤＥ破壊と関連する荷重の低下は、比較可能性試験の一部として評価され、わずか６ｍＮの平均低下、又は組織の全体的な破壊荷重のおよそ１％を引き起こした。破壊の前後に、荷重変位曲線の傾きにも有意差が存在し、その代わりに、曲線は、ＤＥ破壊の前後の両方で同様の傾きを有し、このことは、試料伸長に対する抵抗性が、ほぼ上皮層のみから生じていることを示唆している。
【0077】
列挙される実施形態
実施形態１．生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、
ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、を含み、
上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重（「破壊荷重」）及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
実施形態１．生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、
ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、を含み、
上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重（「破壊荷重」）及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
【0078】
実施形態２．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の１０％未満低下する、実施形態１の皮膚構築物。
【0079】
実施形態３．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の５％未満低下する、実施形態２の皮膚構築物。
【0080】
実施形態４．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の１％未満低下する、実施形態２の皮膚構築物。
【0081】
実施形態５．真皮等価層が、約１４～１６ｍｍの変位及び約０．１～約０．５Ｎの荷重で破壊する、実施形態１～４のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0082】
実施形態６．皮膚構築物が、組織学によって測定される場合、約１００μｍ～約２５０μｍ、又は約１２０μｍ～約２００μｍの厚さを有する、実施形態１～５のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0083】
実施形態７．完全に階層化された上皮層が、組織学によって測定される場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有し、かつ／又は真皮等価層が、約２０μｍ～約８０μｍの厚さを有する、実施形態６の皮膚構築物。
【0084】
実施形態８．上皮層のケラチノサイトが、単一のヒトドナー由来であり、かつ／又は真皮等価層の真皮線維芽細胞が、任意選択的にケラチノサイトのヒトドナーとは異なる単一のヒトドナー由来である、実施形態１～７のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0085】
実施形態９．ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であるか、又は真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、実施形態８の皮膚構築物。
【0086】
実施形態１０．ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であり、真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、実施形態８の皮膚構築物。
【0087】
実施形態１１．皮膚構築物が、約４０ｃｍ２～約１００ｃｍ２の表面積を有する、先行実施形態のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0088】
実施形態１２．皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲンを含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0089】
実施形態１３．皮膚構築物が、少なくとも５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、実施形態１２の皮膚構築物。
【0090】
実施形態１４．皮膚構築物が、少なくとも５．５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン又は少なくとも少なくとも５．８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、実施形態１２の皮膚構築物。
【0091】
実施形態１５．ヒトＩ型コラーゲンの約９８％以上が、皮膚構築物の細胞によって産生される、実施形態１２～１４のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0092】
実施形態１６．ヒトＩ型コラーゲンの約１００％が、皮膚構築物の細胞によって産生される、実施形態１５の皮膚構築物。
【0093】
実施形態１７．皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、マウスＩ型コラーゲンが、皮膚構築物中の総コラーゲンの９０重量％以下である、実施形態１２～１６のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0094】
実施形態１８．皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、マウス１型コラーゲンが、皮膚構築物中の総コラーゲン型の約６０重量％～約９０重量％である、実施形態１２～１７のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0095】
実施形態１９．皮膚構築物が、表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～約０．４５ｍｇ、又は表面積１ｃｍ２当たり約０．２９ｍｇ～約０．３９ｍｇの総コラーゲン含有量を有する、先行実施形態のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0096】
実施形態２０．生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、
ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含み、
皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含み、
皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
【0097】
実施形態２１．上皮層のケラチノサイトが、単一のヒトドナー由来であり、かつ／又は真皮等価層の真皮線維芽細胞が、任意選択的にケラチノサイトのヒトドナーとは異なる単一のヒトドナー由来である、実施形態２０の皮膚構築物。
【0098】
実施形態２２．ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であるか、又は真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、実施形態２１の皮膚構築物。
【0099】
実施形態２３．ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であり、真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、実施形態２１の皮膚構築物。
【0100】
実施形態２４．生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、
ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含み、
皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含み、
皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、皮膚構築物。
【0101】
実施形態２５．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の１０％未満低下する、実施形態２０～２４のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0102】
実施形態２６．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の５％未満低下する、実施形態２５の皮膚構築物。
【0103】
実施形態２７．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の１％未満低下する、実施形態２５の皮膚構築物。
【0104】
実施形態２８．真皮等価層が、約１４～１６ｍｍの変位及び約０．１～約０．５Ｎの荷重で破壊する、実施形態２０～２７のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0105】
実施形態２９．皮膚構築物が、組織学によって測定される場合、約１００μｍ～約２５０μｍ、又は約１２０μｍ～約２００μｍの厚さを有する、実施形態２０～２８のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0106】
実施形態３０．完全に階層化された上皮層が、組織学によって測定される場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有し、かつ／又は真皮等価層が、約２０μｍ～約８０μｍの厚さを有する、実施形態２９の生物工学によって作られた皮膚構築物。
【0107】
実施形態３１．皮膚構築物が、表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン、又は表面積１ｃｍ２当たり少なくとも少なくとも０．０５８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、実施形態２０～３０のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0108】
実施形態３２．ヒトＩ型コラーゲンの約９８％以上が、皮膚構築物の細胞によって産生される、実施形態２０～３１のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0109】
実施形態３３．ヒトＩ型コラーゲンの約１００％が、皮膚構築物の細胞によって産生される、実施形態３２の皮膚構築物。
【0110】
実施形態３４．総コラーゲン含有量が、表面積１ｃｍ２当たり約０．２９ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．３９ｍｇである、実施形態２０～３３のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0111】
実施形態３５．皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、マウスＩ型コラーゲンが、皮膚構築物中の総コラーゲンの９０重量％以下である、実施形態２０～３４のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0112】
実施形態３６．皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、マウス１型コラーゲンが、皮膚構築物中の総コラーゲン型の約６０重量％～約９０重量％である、実施形態２０～３４のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0113】
実施形態３７．皮膚構築物が、約４０ｃｍ２～約１００ｃｍ２の表面積を有する、実施形態２０～３６のうちのいずれか１つの生物工学によって作られた皮膚構築物。
【0114】
実施形態３８．生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、
ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含む、皮膚構築物。
ヒトケラチノサイトを含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内にヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含む、皮膚構築物。
【0115】
実施形態３９．上皮層のケラチノサイトが、単一のヒトドナー由来であり、かつ／又は真皮等価層の真皮線維芽細胞が、任意選択的にケラチノサイトのヒトドナーとは異なる単一のヒトドナー由来である、実施形態３８の皮膚構築物。
【0116】
実施形態４０．ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であるか、又は真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、実施形態３９の皮膚構築物。
【0117】
実施形態４１．ケラチノサイトが、ＮＩＫＳ細胞であり、真皮線維芽細胞が、正常なヒト真皮線維芽細胞である、実施形態３９の皮膚構築物。
【0118】
実施形態４２．生存能力のある生物工学によって作られた皮膚構築物であって、
ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含む、皮膚構築物。
ＮＩＫＳ細胞を含む、上面及び底面を有する完全に階層化された上皮層と、
上面及び底面を有する真皮等価層であって、上皮層の底面が、真皮等価層の上面に、層のうちの１つの少なくとも９８％を覆うように接着され、
真皮等価層が、マトリックス内に正常なヒト真皮線維芽細胞を含み、マトリックスが、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、及びヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む、真皮等価層と、
表面積１ｃｍ２当たり約０．２５ｍｇ～表面積１ｃｍ２当たり約０．４５ｍｇの総コラーゲン含有量、及び表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ｍｇのヒトＩ型コラーゲンと、を含む、皮膚構築物。
【0119】
実施形態４３．皮膚構築物が、表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５５ｍｇのヒトＩ型コラーゲン又は表面積１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５８ｍｇのヒトＩ型コラーゲンを有する、実施形態３８～４２のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0120】
実施形態４４．ヒトＩ型コラーゲンの約９８％以上が、皮膚構築物の細胞によって産生される、実施形態３８～４３のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0121】
実施形態４５．ヒトＩ型コラーゲンの約１００％が、皮膚構築物の細胞によって産生される、実施形態４４の皮膚構築物。
【0122】
実施形態４６．皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、マウスＩ型コラーゲンが、皮膚構築物中の総コラーゲンの９０重量％以下である、実施形態３８～４６のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0123】
実施形態４７．皮膚構築物が、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み、マウス１型コラーゲンが、皮膚構築物中の総コラーゲン型の約６０重量％～約９０重量％である、実施形態３８～４６のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0124】
実施形態４８．皮膚構築物が、組織学によって測定される場合、約１００μｍ～約２５０μｍ、又は約１２０μｍ～約２００μｍの厚さを有する、実施形態３８～４７のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0125】
実施形態４９．完全に階層化された上皮層が、組織学によって測定される場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有し、かつ／又は真皮等価層が、約２０μｍ～約８０μｍの厚さを有する、実施形態４８の皮膚構築物。
【0126】
実施形態５０．皮膚構築物が、約４０ｃｍ２～約１００ｃｍ２の表面積を有する、実施形態３８～４９のうちのいずれか１つの生物工学によって作られた皮膚構築物。
【0127】
実施形態５１．皮膚構築物のドッグボーン型試料が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を使用して連続的に水和させつつ１分当たり１００％の一定の歪み速度での単軸引張において破壊するまで引っ張った場合に、約０．５～約１．０Ｎの荷重及び約３０ｍｍ～約４５ｍｍの変位で破壊し、完全に階層化された上皮層が、荷重変位曲線において皮膚構築物と同じ点で破壊し、真皮等価層が、約１２～１８ｍｍ又は約１４～１６ｍｍの変位で破壊し、
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、実施形態３８～５０のいずれか１つの皮膚構築物。
ドッグボーン型試料が、厚さゲージによって測定される場合、４ｍｍのゲージ幅及び２５ｍｍのゲージ長さを有する、実施形態３８～５０のいずれか１つの皮膚構築物。
【0128】
実施形態５２．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の１０％未満低下する、実施形態５１の皮膚構築物。
【0129】
実施形態５３．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の５％未満低下する、実施形態５２の皮膚構築物。
【0130】
実施形態５４．真皮等価層が破壊するとき、荷重が、破壊荷重の１％未満低下する、実施形態５３の皮膚構築物。
【0131】
実施形態５５．真皮等価層が、約１４～１６ｍｍの変位及び約０．１～約０．５Ｎの荷重で破壊する、実施形態５１～５４のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0132】
実施形態５６．皮膚構築物が凍結保存される、先行実施形態のうちのいずれか１つの皮膚構築物。
【0133】
実施形態５７．皮膚構築物が、解凍後に、ｂＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、ＰｌＧＦ、ＳＤＦ－１α、ＴＧＦ－β１、及びＶＥＧＦ－Ａから選択される複数のタンパク質を分泌する、実施形態５６の皮膚構築物。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】