特表 2023-525489 ウイルス感染症を有する対象の死亡率リスクの決定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-16

(54)【発明の名称】ウイルス感染症を有する対象の死亡率リスクの決定

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20230609BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20230609BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230609BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALI20230609BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230609BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20230609BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230609BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z ZNA

C12Q1/6844 Z

C12Q1/02

C12Q1/6888 Z

G01N33/53 M

G01N33/569 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565618

(86)(22)【出願日】2021-04-29

(85)【翻訳文提出日】2022-12-19

(86)【国際出願番号】 US2021029847

(87)【国際公開番号】W WO2021222537

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/017,570

(32)【優先日】2020-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521107080

【氏名又は名称】インフラマティックス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｘ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】スウィーニー，ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】ブトゥロヴィク，リュボミル

(72)【発明者】

【氏名】ミディック，ウロス

(72)【発明者】

【氏名】ヘ，ユドン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ10

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

(57)【要約】

ウイルス感染症を有する対象の３０日死亡率リスクを決定し、そのような対象の効果的なトリアージ戦略を決定するためのシステム、方法、組成物、装置、及びキットが提供される。本開示の方法及び組成物は、ウイルス死亡率トレーニングデータへの機械学習ワークフローの適用から同定されたバイオマーカーを含む。前記バイオマーカーは、前記対象の３０日生存の可能性を決定するために使用できるスコアの計算を可能にする。
【選択図】図１３Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

救急治療室又は他の臨床施設においてウイルス感染症の診断を有する対象に緊急医療を施す方法であって、
（ｉ）前記対象から得られた生体試料を受け取ること、
（ｉｉ）前記生体試料中のバイオマーカーであるＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３の発現レベルを検出すること、並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で検出された前記バイオマーカーの発現レベルに基づいてリスクスコアを決定し、前記スコアは、指定された期間にわたる前記対象の死亡率又はＩＣＵケアの必要性のリスクに相当すること、を含む方法。

【請求項2】

（ｉｖ）前記リスクスコアに基づいて、前記対象に緊急医療を施すこと又は前記救急治療室若しくは他の臨床施設から前記対象を退院させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記指定された期間が３０日である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

工程（ｉｉ）において前記生体試料中のＨＬＡ－ＤＰＢ１バイオマーカーの発現レベルを検出することをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記スコアを、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率のリスクの１又は複数の個別のレベルに対応する１又は複数の閾値と比較することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記スコアを、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の（ｉ）低、（ｉｉ）中間、及び（ｉｉｉ）高リスクを定義する２つの閾値と比較することにより、リスクの各レベル（ｉ～ｉｉｉ）に対応する３つのリスクカテゴリーの１つに前記対象を分類できる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記リスクスコアが、前記対象について決定された１又は複数の臨床パラメータにも基づいている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記１又は複数の臨床パラメータが、年齢又は臨床リスクスコアを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記臨床リスクスコアが、順次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記バイオマーカーの発現が、ｑＲＴ－ＰＣＲ又は等温増幅を使用して検出される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記等温増幅が、ｑＲＴ－ＬＡＭＰである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記バイオマーカーの発現が、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒを使用して検出される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記生体試料が、血液試料である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記診断が、前記対象から採取された生体試料中のウイルス抗原又はウイルス核酸の検出に基づく、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記診断が、前記対象から採取された生体試料におけるウイルス感染症に関連する宿主バイオマーカーの発現レベルの検出に基づく、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記バイオマーカーの発現レベルが、前記ウイルス感染症の診断から２４時間以内に検出される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

３０日にわたる死亡率又はＩＣＵケアの必要性の低リスクを決定するための前記閾値が、０．１５未満の尤度比に相当する、請求項６～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の中間リスクを決定するための前記閾値が、０．１５～５の尤度比に相当する、請求項６～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記リスクスコアに基づいて、前記救急治療室又は他の臨床施設から前記対象を退院させることをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記対象が、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の（ｉ）低リスクを有すると分類されている、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記緊急医療が、臓器支持療法を実施すること、治療剤を投与すること、前記対象をＩＣＵへ入院させること、又は血液製剤を投与することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記対象が、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の（ｉｉ）中間リスク又は（ｉｉｉ）高リスクを有すると分類されている、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記対象が、３０日死亡率の（ｉｉｉ）高リスクを有すると分類されている、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記臓器支持療法が、人工呼吸器、ペースメーカー、除細動器、透析若しくは腎代替療法機器、又は肺動脈カテーテル、動脈血圧カテーテル、及び中心静脈圧カテーテルからなる群から選択される侵襲的モニターのいずれか１又は複数を前記対象に接続することを含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記治療剤が、免疫調節剤、抗ウイルス剤、凝固調節剤、昇圧剤、又は鎮静剤を含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ウイルス感染症が、インフルエンザ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ウイルス感染症が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

ウイルス感染症を有する対象の５つ以上のバイオマーカーの発現レベルを検出するための検査キットであって、前記キットが、前記５つ以上のバイオマーカーの発現レベルを特異的に検出するための試薬を含み、並びに前記バイオマーカーが、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３を含む、検査キット。

【請求項29】

前記バイオマーカーが、ＨＬＡ－ＤＰＢ１をさらに含む、請求項２８に記載の検査キット。

【請求項30】

マイクロアレイを含む、請求項２８又は２９に記載の検査キット。

【請求項31】

前記キットが、ＴＧＦＢＩにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＤＥＦＡ４にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＬＹ８６にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＫ３にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の検査キット。

【請求項32】

ＨＬＡ－ＤＰＢ１にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項３１に記載の検査キット。

【請求項33】

ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＬＡＭＰ、又はＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析を実行するための１又は複数の試薬をさらに含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の検査キット。

【請求項34】

前記ウイルス感染症が、インフルエンザ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の検査キット。

【請求項35】

前記対象の前記バイオマーカーの発現レベルに基づいて死亡率スコアを計算するための指示をさらに含み、前記スコアが、指定された期間における前記対象の死亡率リスクに相当する、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の検査キット。

【請求項36】

前記死亡率スコアが、前記対象について確立された１又は複数の臨床パラメータにも基づいている、請求項３５に記載の検査キット。

【請求項37】

前記１又は複数の臨床パラメータが、年齢又は臨床リスクスコアを含む、請求項３６に記載の検査キット。

【請求項38】

前記臨床リスクスコアが、ＳＯＦＡスコアである、請求項３７に記載の検査キット。

【請求項39】

前記指定された期間が３０日である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の検査キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０２０年４月２９日に出願された米国特許仮出願番号第６３／０１７，５７０号に対する優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

ＣＯＶＩＤ－１９の原因物質であるＳＡＲＳ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の出現及びその急速なパンデミックの広がりにより、これまでに５，４００万人を超える症例及び１００万人を超える死亡という世界的な健康危機が引き起こされている（１）。ＣＯＶＩＤ－１９はあらゆる臨床表現型を示し、ほとんどの患者は軽度～中等度の症状を示し、２０％は典型的には１週間以内に重度又は重篤な疾患に進行する（２～６）。重症例は、人工呼吸器を必要とする急性呼吸不全を特徴とすることが多く、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に進行して死亡する場合がある（７）。ＡＲＤＳの重症度及び発症は、加齢及び基礎となる医学的状態に関連している（３）。

【0003】

今までのところ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の診断法の開発が急速に進歩しているにもかかわらず、臨床データからバイオマーカー及び免疫病理学的所見に至るまでの既存の予後マーカーでは、どの患者が重症化する可能性があるかを特定できないことが証明されている（８）。リスク層別化（重症度分類）が不充分であることは、最前線の医療従事者が、隔離して自宅で回復させても安全な患者と、注意深いモニタリングが必要な患者とを判断できない可能性があることを意味している。免疫状態をモニタリングしながら重症度を早期に特定することも、コルチコステロイド、静注免疫グロブリン、又は選択的サイトカイン遮断などの治療の選択に重要であることも証明される可能性がある（９～１１）。

【0004】

ウイルス因子ではなく、好中球増加、リンパ球数、ＣＤ３及びＣＤ４Ｔ細胞数、インターロイキン－６及び－８、乳酸脱水素酵素、Ｄダイマー、ＡＳＴ、プレアルブミン、クレアチニン、グルコース、低密度リポタンパク質、血清フェリチン、並びにプロトロンビン時間を含む多くの検査値が重症疾患及びＡＲＤＳのリスクを高めることに関連している（３、１２、１３）。機械学習（ＭＬ）を介して複数の弱いマーカーを組み合わせると、試験の識別及び臨床的有用性が高まる可能性がある一方、これまでのＭＬの適用は、深刻なオーバーフィッティング（過学習）及び臨床導入の欠如に至っている（１４）。このようなモデルの失敗は、トレーニングにおける臨床的不均一性の欠如と、タスクにとって理想的ではない可能性がある既存の臨床検査を使用する変数選択の実用的な性質との両方から生じる。さらに、検査マーカーの多くは、それらが異常になるまでに患者がすでに重病であるため、重症度の指標としては遅い。

【0005】

全血トランスクリプトームに代表される宿主免疫応答は、感染症の存在、種類、及び重症度を診断することが繰り返し示されている（１５～１９）。複数の独立したデータセットにわたる臨床的、生物学的、及び技術的な不均一性を活用することにより、本発明者らは以前に、細菌感染症（１５～１７）とは異なり、無症候性感染症を識別することができる、呼吸器ウイルス感染症（１６）に対する保存された宿主応答を特定した。ウイルス感染症に対するこの保存された宿主応答は、転帰の重症度と強く関連している（２０）。本発明者らはまた、感染性疾患に対する保存された宿主免疫応答が、感染症患者の３０日死亡率リスクの正確な予後マーカーになり得ることも実証した（１８）。最も重要なことは、生物学的、臨床的、及び技術的な不均一性を説明することで、より一般化可能なロバストな宿主応答に基づいたターゲット・プラットフォームで迅速に翻訳可能なシグネチャを特定できることを実証したことである（１９）。

【0006】

現在のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックや将来のウイルスパンデミックにおいて、又は季節性インフルエンザの発生時に、最も必要とする人だけのために病院のリソースを保つために、トリアージ（例えば、救急部門）で患者のリスク層別化に対する重要なニーズがある。しかしながら、Ｃ反応性タンパク質及びプロカルシトニンなどの現在のバイオマーカーは、効果的なトリアージのための適切なリスク層別化を行わない。したがって、ウイルス感染症患者のリスク、例えば３０日死亡率リスクを迅速かつ正確に決定できる新しいバイオマーカーのニーズがある。本開示は、このニーズを満たし、他の利点も提供する。

【発明の概要】

【0007】

一態様では、本開示は、救急治療室又は他の臨床施設においてウイルス感染症の診断を有する対象に緊急医療を施す方法であって、（ｉ）前記対象から得られた生体試料を受け取ること、（ｉｉ）前記生体試料中のバイオマーカーであるＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３の発現レベルを検出すること、並びに（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で検出された前記バイオマーカーの発現レベルに基づいてリスクスコアを決定し、前記スコアは、指定された期間にわたる前記対象の死亡率又はＩＣＵケアの必要性のリスクに相当すること、を含む方法を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態では、前記方法は、（ｉｖ）前記リスクスコアに基づいて、前記対象に緊急医療を施すこと又は前記救急治療室若しくは他の臨床施設から前記対象を退院させることをさらに含む。前記方法のいくつかの実施形態では、前記指定された期間が３０日である。いくつかの実施形態では、前記方法は、工程（ｉｉ）において前記生体試料中のＨＬＡ－ＤＰＢ１バイオマーカーの発現レベルを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記スコアを、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率のリスクの１又は複数の個別のレベルに対応する１又は複数の閾値と比較する。いくつかの実施形態では、前記スコアを、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の（ｉ）低、（ｉｉ）中間、及び（ｉｉｉ）高リスクに対応する２つの閾値と比較することにより、リスクの各レベル（ｉ～ｉｉｉ）に対応する３つのリスクカテゴリーの１つに前記対象を分類できる。

【0009】

いくつかの実施形態では、前記リスクスコアが、前記対象について決定された１又は複数の臨床パラメータにも基づいている。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の臨床パラメータが、年齢又は臨床リスクスコアを含む。いくつかの実施形態では、前記臨床リスクスコアが、順次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアである。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の発現が、ｑＲＴ－ＰＣＲ又は等温増幅を使用して検出される。いくつかの実施形態では、前記等温増幅法が、ｑＲＴ－ＬＡＭＰである。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の発現が、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒを使用して検出される。いくつかの実施形態では、前記生体試料が、血液試料である。いくつかの実施形態では、前記診断が、前記対象から採取された生体試料中のウイルス抗原又はウイルス核酸の検出に基づく。いくつかの実施形態では、前記診断が、前記対象から採取された生体試料におけるウイルス感染症に関連するバイオマーカーの発現レベルの検出に基づく。いくつかの実施形態では、前記バイオマーカーの発現レベルが、ウイルス感染症の診断から２４時間以内に検出される。

【0010】

いくつかの実施形態では、３０日にわたる死亡率又はＩＣＵケアの必要性の低リスクを決定するための閾値が、０．１５未満の尤度比に相当する。いくつかの実施形態では、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の中間リスクを決定するための閾値が、０．１５～５の尤度比に相当する。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記リスクスコアに基づいて、前記救急治療室又は他の臨床施設から前記対象を退院させることをさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、前記対象が、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の（ｉ）低リスクを有すると分類されている。いくつかの実施形態では、前記緊急医療が、臓器支持療法を実施すること、治療剤を投与すること、前記対象をＩＣＵへ入院させること、又は血液製剤を投与することを含む。いくつかのそのような実施形態では、前記対象が、３０日にわたるＩＣＵケアの必要性又は死亡率の（ｉｉ）中間リスク又は（ｉｉｉ）高リスクを有すると分類されている。いくつかの実施形態では、前記臓器支持療法が、人工呼吸器、ペースメーカー、除細動器、透析若しくは腎代替療法機器、又は肺動脈カテーテル、動脈血圧カテーテル、及び中心静脈圧カテーテルからなる群から選択される侵襲的モニターのいずれか１又は複数を前記対象に接続することを含む。いくつかの実施形態では、前記治療剤が、免疫調節剤、抗ウイルス剤、凝固調節剤、昇圧剤、又は鎮静剤を含む。いくつかの実施形態では、前記ウイルス感染症が、インフルエンザ又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症である。

【0012】

別の態様では、本開示は、ウイルス感染症を有する対象の５つ以上のバイオマーカーの発現レベルを検出するための検査キットであって、前記キットが、前記５つ以上のバイオマーカーの発現レベルを特異的に検出するための試薬を含み、並びに前記バイオマーカーが、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３を含む、検査キットを提供する。いくつかの実施形態では、前記バイオマーカーが、ＨＬＡ－ＤＰＢ１をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記バイオマーカーが、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、ＨＫ３、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記キットが、マイクロアレイを含む。いくつかの実施形態では、前記キットが、ＴＧＦＢＩにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＤＥＦＡ４にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＬＹ８６にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＫ３にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キットが、ＨＬＡ－ＤＰＢ１にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記検査キットが、ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＬＡＭＰ、又はＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析を実行するための１又は複数の試薬、デバイス、容器、又は器具をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ウイルス感染症が、インフルエンザ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である。いくつかの実施形態では、前記検査キットが、前記対象の前記バイオマーカーの発現レベルに基づいて死亡率スコアを計算するための指示をさらに含み、前記スコアが、指定された期間における前記対象の死亡率リスクに相当する。いくつかの実施形態では、前記指定された期間が３０日である。いくつかの実施形態では、前記死亡率スコアが、さらに前記対象について確立された１又は複数の臨床パラメータに基づいている。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の臨床パラメータが、年齢又は臨床リスクスコアを含む。いくつかの実施形態では、前記臨床リスクスコアが、ＳＯＦＡスコアである。

【0014】

以下の詳細な説明及び添付の図面を参照して、本開示の実施形態の性質及び利点をよりよく理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、選択された１５個の遺伝子のうちの２遺伝子の組み合わせの２つの例であり、（大きい）三角形は非生存症例及び（小さい）四角形は生存症例である。

【図2】図２Ａ～図２Ｄは、選択された１５個の遺伝子のそれぞれ（図２Ａ）、選択された１５個の遺伝子の２遺伝子対（図２Ｂ）、１、２、及び最大１５のランク付けされた上位１５個の遺伝子からなる予測因子（図２Ｃ）、並びに１３，９０２個の遺伝子のそれぞれ（図２Ｄ）を使用して得られたＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）のヒストグラム。

【図3】図３Ａは、ロジスティック回帰モデルの選択。各点は、ロジスティック回帰ハイパーパラメータと決定閾値（すなわち、スコアが閾値を超えると３０日死亡率が予測され、スコアが閾値を下回ると３０日生存率が予測される閾値）とによって定義されるモデルに対応する。検索空間全体（１００個のハイパーパラメータ構成）が示されている。図３Ｂは、最適なモデルのＲＯＣプロット。プロットは、リーブワンスタディアウト交差検証（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｓｔｕｄｙ－ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ－ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（ＬＯＳＯＣＶ））分割からプールされた確率を使用して構築されている。

【図4】図４は、ＨｏｓｔＤｘ（商標）ウイルス重症度が、低リスク患者の入院を除外し、入院が必要な高リスク患者を特定するために使用され得ることを示す。本研究では、患者のわずか１０％が「中等度」／不確定バンドに分類され、この事は本試験が約９０％の症例で、ＣＯＶＩＤ－１９でＣ反応性タンパク質又はプロカルシトニンが示したよりもはるかに有用であることを意味することに注意。

【図5】図５は、年齢調整した多変量モデル。この図は、年齢調整しても、遺伝子スコアが依然として死亡率と有意に関連していることを実証する。すなわち、前記スコアは、患者の年齢に関係なく（補正された場合でも）、死亡率の予測因子となる。

【図6】図６は、アテネのＣＯＶＩＤ－１９コホートから入手可能な試料及び臨床データを使用して、４１人の患者の３０日転帰に対してプロットした５－ｍＲＮＡリスクスコア（「ｖｉｒａｌ＿ｓｅｖｅｒｉｔｙ」）。非重症患者は、ＩＣＵや人工呼吸器を必要としなかった。スコアは、９６％の感度及び７５％の特異度を示し、非重症患者を重症患者及び死亡患者から分離した。

【図7】図７は、単一遺伝子ＡＵＣの分布。ＡＵＣは、６２人の患者の重症群対非重症群を予測するために計算した。以下を示す：検出された１５，７８８個の遺伝子のそれぞれを使用したＡＵＣ分布（上段、灰色）、絶対効果サイズ＞１．３及びＰ値＜０．００５によって定義される１５０個の下方制御（青色）された遺伝子又は３２９個の上方制御（サンゴ色）された遺伝子のそれぞれを使用したＡＵＣ、高発現かつロバストなパフォーマンスに対してさらに選択された３５個の遺伝子の個々のＡＵＣ（緑色）、及び３５個のバイオマーカー遺伝子からの全ての２遺伝子の組み合わせのＡＵＣ（紫色）。

【図8】図８は、頻度に基づくバイオマーカーの選択。上位４６位の遺伝子のそれぞれが、６２個のリーブワンアウト（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（ＬＯＯ））遺伝子選択から存在する回数。選択された３５個のマーカー遺伝子は、６２のＬＯＯのうち少なくとも６０で示され、３３個は６２のＬＯＯ全てで示された。

【図9】図９Ａ及び図９Ｂは、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者対非重症ＣＯＶＩＤ－１９患者を区別するための集計されたＧＭスコアのパフォーマンス。幾何平均スコアは、差次的に上方（ｎ＝２２）発現及び下方（ｎ＝１３）発現された遺伝子の正規化された発現の幾何平均に基づいている。図９Ａは、非重症患者（橙色）及び重症患者（青色）の幾何平均スコアのボックスプロット。図９Ｂは、幾何平均スコアのＲＯＣ。

【図10】図１０Ａ及び図１０Ｂは、研究フロー。図１０Ａは、トレーニング及び試験のための臨床データフロー。図１０Ｂは、６－ｍＲＮＡウイルス重症度分類子の開発及び検証に使用した機械学習ワークフロー。ＬＯＳＯ＝リーブワンスタディアウト（Ｌｅａｖｅ－Ｏｎｅ－Ｓｔｕｄｙ－Ｏｕｔ）。ＣＶ＝交差検証。ＡＵＲＯＣ＝ＲＯＣ曲線下面積。

【図11】図１１Ａ～図１１Ｄは、６－ｍＲＮＡ分類子のトレーニングデータ。図１１Ａは、ｔ－ＳＮＥを使用した低次元での２１の研究にわたる７０５個の試料の可視化。図１１Ｂは、ロジスティック回帰モデルの選択。各ドットは、ロジスティック回帰ハイパーパラメータと決定閾値の組み合わせによって定義されたモデルに対応している。検索空間全体（１００個のハイパーパラメータ構成）が示されている。図１１Ｃは、最適なモデルのＲＯＣプロット。プロットは、交差検証分割からプールされた確率を使用して構築されている。図１１Ｄは、死亡率の転帰に応じたロジスティック回帰モデルで使用した６個の遺伝子の発現。

【図12】図１２Ａ～図１２Ｄは、独立した後ろ向き非ＣＯＶＩＤ－１９コホートにおける６－ｍＲＮＡ分類子の検証。図１２Ａは、ｔ－ＳＮＥを使用した試料の可視化。図１２Ｂは、臨床的に関連する部分群を有する患者のロジスティック回帰モデルで使用した６個の遺伝子の発現。図１２Ｃは、６－ｍＲＮＡ分類子が、ＣＯＶＩＤ－１９の非重症患者及び重症患者、並びに死亡した患者を正確に区別することを示す。図１２Ｄは、部分群のＲＯＣプロット。

【図13】図１３Ａ～図１３Ｄは、ＣＯＶＩＤ－１９コホートにおける６－ｍＲＮＡ分類子の検証。図１３Ａは、ｔ－ＳＮＥを使用した予測的検証コホートの９７個の試料の可視化。図１３Ｂは、重症及び非重症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症患者のロジスティック回帰モデルで使用した６個の遺伝子の発現。図１３Ｃは、６－ｍＲＮＡ分類子が、ＣＯＶＩＤ－１９の非重症患者及び重症患者、並びに死亡した患者を正確に区別することを示す。図１３Ｄは、非重症ＣＯＶＩＤ－１９対重症又は死亡のＲＯＣプロット（健康な対照からの試料は含まれず）。

【図14】図１４は、最適なロジスティック回帰モデルのプールされたトレーニングセットの交差検証６－ｍＲＮＡスコアの分布。青色＝生存者、赤色＝非生存者

【図15】図１５は、迅速なｑＲＴ－ＬＡＭＰのパネル及びＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）の絶対的基準を使用した６－ｍＲＮＡ分類子スコアの相関関係は、臨床試料全体（ｎ＝６１）で優れた一致（ピアソンＲ＝０．９５）を示すことを示す。

【図16】図１６は、本開示の一実施形態に係る測定システム１６０を示す。

【図17】図１７は、本開示の実施形態に係るシステム及び方法で使用可能な例示的なコンピューターシステムのブロック図を示す。

【0016】

用語
本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の指定のない限り、それらに帰する意味を有する。

【0017】

本明細書で使用される「１（つ）（ａ）」、「１（つ）（ａｎ）」、又は「前記（ｔｈｅ）」という用語は、１つの要素を伴う態様を含むだけでなく、２つ以上の要素を伴う態様も含む。例えば、単数形「１（つ）（ａ）」、「１（つ）（ａｎ）」、及び「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「前記薬剤」への言及は、当業者に公知の１又は複数の薬剤への言及を含むなどである。

【0018】

本明細書で使用される「約」及び「およそ」という用語は、概して、測定の性質又は精度を考慮して、測定された量の誤差の許容程度を意味するものとする。典型的には、誤差の程度の例は、所与の値又は値の範囲内の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。「約Ｘ」への言及は、少なくともＸ、０．８Ｘ、０．８１Ｘ、０．８２Ｘ、０．８３Ｘ、０．８４Ｘ、０．８５Ｘ、０．８６Ｘ、０．８７Ｘ、０．８８Ｘ、０．８９Ｘ、０．９Ｘ、０．９１Ｘ、０．９２Ｘ、０．９３Ｘ、０．９４Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、１．０５Ｘ、１．０６Ｘ、１．０７Ｘ、１．０８Ｘ、１．０９Ｘ、１．１Ｘ、１．１１Ｘ、１．１２Ｘ、１．１３Ｘ、１．１４Ｘ、１．１５Ｘ、１．１６Ｘ、１．１７Ｘ、１．１８Ｘ、１．１９Ｘ、及び１．２Ｘの値を具体的に示している。したがって、「約Ｘ」は、例えば「０．９８Ｘ」のクレーム限定（ｃｌａｉｍ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を教示し、書面による説明の裏付けを提供することを意図している。

【0019】

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、オリゴヌクレオチド、鋳型ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、バイオマーカー遺伝子の増幅された部分配列、又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）で構成される任意のポリヌクレオチド、又はプリン若しくはピリミジン塩基か一本鎖若しくは二本鎖形態の修飾されたプリン若しくはピリミジン塩基のＮ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１又は複数の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。「核酸」、「ＤＮＡ」、「ポリヌクレオチド」、及び同様の用語には、核酸類似体も含まれる。ポリヌクレオチドは、必ずしも既存の又は天然の配列に物理的に由来する必要はなく、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はそれらの組み合わせを含む任意の方法で生成することができる。

【0020】

本明細書で使用される「プライマー」は、天然に存在するか合成的に生成されたかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が、すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合剤の存在下で、適切な温度及び緩衝液で誘導される条件下に置かれた際に合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。このような条件には、適温での適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子であるか、ｐＨ、イオン強度などに影響を与える置換基を含む）中の、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸並びにＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素などの重合誘導剤の存在が含まれる。プライマーは、好ましくは、本明細書に記載のＴａｑＭａｎリアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲなどの増幅における最大効率のために一本鎖である。本明細書のプライマーは、増幅される各特定配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択され、所与のプライマーセットは、対応するバイオマーカー遺伝子の部分配列を増幅するために一緒に作用する。

【0021】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを指す。これには、コード領域の前後の領域（リーダー及びトレーラー）、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる。

【0022】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＣＯＶＩＤ－１９と呼ばれる感染性疾患を引き起こすコロナウイルスを指す。本発明の方法は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＭＮ９０８９４７、ＬＣ７５７９９５、及びＬＣ５２８２３２又は別のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの全部若しくは一部のヌクレオチド配列を含む、又はそれらと実質的に同一の（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上同一の）ヌクレオチド配列を含むウイルスによる感染によるものを含む、任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を含む任意のウイルス感染症を有する任意の対象の３０日死亡率リスク（集中治療室（ＩＣＵ）への入院、二次感染、又は７、１４、６０日などの他の時点での死亡など、他の転帰のリスク）を決定するために使用できる。これらの方法は、症状の有無に関わらず、任意の方法によって検出された感染症を有する対象で実施され得る。

【0023】

本明細書で使用される場合、「バイオマーカー遺伝子」又は「バイオマーカー」とは、その発現が、例えばインフルエンザ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する対象において、３、７、１４、２８、３０、６０、又は９０日でのウイルス感染症を有する対象における死亡率又は他の転帰、例えば、生存又は非生存、ＩＣＵ入院、二次感染などと相関する遺伝子を指す。各遺伝子の発現レベルは、全ての患者の死亡率と相関する必要はなく、むしろ人口レベルで相関関係が存在することで、発現レベルは、ウイルス感染症及び公知の３０日死亡率を有する個人の全体集団内で充分に相関しており、本明細書の別の場所に記載されているように、多くの方法のいずれかで他のバイオマーカー遺伝子の発現レベルと組み合わせることができ、バイオマーカー又は死亡率スコアを計算するために使用できる。関連する機器又はアッセイシステムからの直接読み出し値又は線形若しくは非線形変換、再スケーリング、正規化、Ｚスコア、共通参照値に対する比率、若しくは当業者に公知の他の手段の形態を含むがこれらに限定されない方法を使用して決定された値を含む個々のバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルに使用される値は、多くの方法のいずれかで決定できる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの読み出し値は、参照又は対照、例えばバイオマーカーと同時に発現が測定されるハウスキーピング遺伝子の読み出し値と比較される。例えば、参照遺伝子に対するバイオマーカーの比又は対数比を決定することができる。本発明の方法の目的のための好ましいバイオマーカー遺伝子には、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３、又はＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、ＨＫ３、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１が挙げられるが、例えば、本明細書に記載の機械学習法を使用して識別される他のバイオマーカーなど、他のバイオマーカーも同様に使用することができる。

【0024】

互いに交換可能に使用可能な「バイオマーカースコア」、「死亡率スコア」、又は「リスクスコア」という用語は、ウイルス感染症を有する対象の死亡率（又はその他の転帰）の確率の決定を可能にする値であって、前記対象における複数のバイオマーカー遺伝子、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上の個々のバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルから計算される値を指す。いくつかの実施形態では、リスクスコアは、数式、指定された相互接続を使用した一連の数式、最適化されたハイパーパラメータを使用した機械学習アルゴリズム、又は別のパラメータに基づく方法を適用することによって決定され、それによって、バイオマーカー遺伝子の測定された発現値を使用して、例えば重み付き若しくは重み無しの算術平均若しくは幾何平均、線形回帰、ロジスティック回帰、ニューラルネット、又は当技術分野で公知の任意の他の方法を含む、単一の「リスク」スコアを生成することができる特定の実施形態では、「リスクスコア」は、本明細書の別の場所でより詳細に説明されるように、スコアが問題の転帰に対する所与の閾値を超えるか、又は閾値を超えないかによって、対象の３０日死亡率リスク（又はＩＣＵケアの必要性）を決定するために使用される。前記リスクスコア（又は本明細書に記載されるように、異なる数式、アルゴリズムなどを使用して得られる異なるリスクスコア）を使用して、対象における感染関連リスクの他の側面、例えば入院期間、ＩＣＵケアの必要性、前記対象の再入院率などを決定できる。前記リスクスコアはまた、年齢、併存疾患状態、又はｑＳＯＦＡ、ＳＯＦＡ、ＡＰＡＣＨＥなどのリスクスコア、又は当技術分野で公知の他のものなど１又は複数の臨床パラメータの単独又は組み合わせと組み合わせて死亡率又はその他の転帰のリスクを決定する際のスコアのパフォーマンスを改善することができる。

【0025】

「相互に関連付ける（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ）」という用語は、概して、ある確率変数と別の確率変数との関係を決定することを指す。様々な実施形態では、所与のバイオマーカーレベル又はスコアを状態又は転帰（例えば、３０日での生存又は非生存）の存在又は非存在と関連付けることは、同じ転帰の対象における少なくとも１つのバイオマーカーの存在、非存在、又は量を決定することを含む。特定の実施形態では、バイオマーカーレベル、非存在、又は存在のセットは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して、特定の転帰に関連付けられる。

【0026】

「保存的に修飾されたバリアント」は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コード（暗号）の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵであるコドンは全てアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、前記コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を説明する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に内在する。

【0027】

当業者は、コード配列内の単一のアミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を変更、付加、又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失、又は付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であり、この変更により、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的に修飾されたバリアントは、多型バリアント、種間ホモログ、及び対立遺伝子に加えて、これらを除外するものではない。場合によっては、保守的に修飾されたバリアントは、安定性、集合、又は活性が増加し得る。

【0028】

本明細書で使用される用語「同一」又はパーセント「同一性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列を説明する文脈において、同じである２つ以上の配列又は指定された部分配列を指す。「実質的に同一」な２つの配列は、配列比較アルゴリズムを使用するか、特定の領域が指定されていない手動のアライメントと目視検査とによって、比較ウィンドウ又は測定された指定領域で最大の一致が得られるように比較及び整列された場合、少なくとも６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。ポリヌクレオチド配列に関して、この定義は、試験配列の相補体も指す。同一性は、長さが少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上のヌクレオチドである領域にわたって存在し得る。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、核酸配列の全長にわたって決定される。

【0029】

配列比較では、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、別のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。核酸とタンパク質との配列比較には、ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを、例えば、デフォルトパラメータと共に使用できる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びアメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））のウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本開示は、ウイルス感染症を有する対象における３０日（又は他の期間）死亡率リスク又は重篤な疾患のリスクを推定するための、並びに例えば、救急治療室環境に存在するそのような対象の効果的なトリアージ戦略を決定するための方法及び組成物を提供する。本発明の方法及び組成物は、ウイルス死亡率トレーニングデータ、すなわち、公知のウイルス感染症及び公知の３０日転帰（生存又は非生存）を有する患者からの発現データへの機械学習ワークフローの適用から同定されたバイオマーカーを含む。これらのデータを使用して、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はインフルエンザ感染であるウイルス感染症と診断された対象の３０日生存（又は集中治療の必要性）の尤度を決定するために使用できるスコアの計算を可能にするバイオマーカーが特定された。

【0031】

Ｉ．対象
本発明の方法及び組成物を使用して、ウイルス感染症を有する対象のリスクスコア（例えば、３０日死亡率又は集中治療室（ＩＣＵ）ケアの必要性スコア）を決定することができる。様々な実施形態では、前記対象は、成人、小児、又は青年であり得る。前記対象は、男性であっても女性であってもよい。

【0032】

前記対象は、ウイルス感染、例えば、インフルエンザ又はＳＡＲ－ＣｏＶ－２の診断を受けている。前記診断は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲによるウイルスゲノム配列の検出によって、又は、例えば、ＥＬＩＳＡによるウイルスに対する抗体の検出によって直接行うことができる。いくつかの実施形態では、前記診断は、例えば、対象の症状及び／又はウイルスへの公知の暴露の臨床的評価によって、間接的に行われる。いくつかの実施形態では、診断は、例えば、その全体の開示が参照により本明細書に援用されるＳｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，８（３４６）：３４６ｒａ９１及び国際公開（ＷＯ）第２０１７／２１４０６１号に記載されるようにウイルス感染症に関連するバイオマーカーを評価することによって行われる。

【0033】

特定の実施形態では、前記対象は、救急治療の状況、例えば、救急治療室、緊急医療施設、病院、又は診断が行われ得る任意の他の臨床環境に存在する。しかしながら、臨床環境は、患者が物理的に病院又は臨床施設にいることを必ずしも示しているわけではない。例えば、患者は家にいるかもしれないが、例えば、医療専門家との遠隔相談、在宅検査キットの使用、又は地域若しくはドライブアップ（ｄｒｉｖｅ－ｕｐ）検査施設を通じて診断を受けている可能性がある。本明細書に記載の方法の結果は、対象のケアのための最適な次の工程又は行動計画の決定を可能にし得る。例えば、対象が３０日死亡率のリスクが低いという決定は、救急治療室に在室している対象については、例えば、モニタリングのために帰宅するか、別の非救急病棟へ移るために、病室又は救急治療室から退院することができることを示し得る。本明細書の別の場所でより詳細に説明するように、３０日死亡率のリスクが高い対象は、例えば、ＩＣＵに送られる、及び／又はその後の治療オプションのいずれかを適用され得る。ＩＣＵへの入院又は本明細書に記載のいずれかの治療の実施を含む、中間又は高リスクスコアを考慮して取られた一連の行動は、本開示の目的では「緊急医療」と見なされる。

【0034】

本発明の方法は、死亡率リスクに関する以前の研究よりもウイルス感染症に関してより具体的なアプローチを提供する（例えば、米国特許第１０，３４４，３３２号及びＳｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．１５（９）：６９４を参照）。この初期の研究は、宿主応答が、段落［０３０］で説明されているような結果をオールカマー（ａｌｌ－ｃｏｍｅｒ）で正確に予測できることを示した。しかしながら、基礎となる宿主免疫応答は、生理学的傷害によって、例えば、細菌感染、ウイルス感染、及び非感染性炎症の間で異なる。本発明者らの以前のリスクスコアは、ａｌｌ－ｃｏｍｅｒリスクスコアとして設計されていたが、本開示は、ウイルス感染症の患者のみに使用するために特別に設計されたリスクスコアを提供し、そのため、これらの患者のリスク層別化を改善し、場合によっては、より少ないバイオマーカーの使用を可能にする。

【0035】

本発明の方法は、例えば以下の任意のウイルスによる３０日死亡率リスクを決定するために使用できる。インフルエンザ、コロナウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ハンタウイルス、ロタウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、愛知ウイルス、αパピローマウイルス、αウイルス、αコロナウイルス、αトルクウイルス、アレナウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バンナウイルス、バーマ森林ウイルス、βコロナウイルス、ブニヤムウェラ（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ）ウイルス、ブニヤウイルス・ラクロス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ）、ブニヤウイルス・スノーシューヘア（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ ｓｎｏｗｓｈｏｅ ｈａｒｅ）、カーディオウイルス、セルコピテシン（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ）ヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、コサウイルス、コサウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴサイトメガロウイルス、出血熱ウイルス、δウイルス、δレトロウイルス、デングウイルス、ディペンドウイルス、ドーリ（Ｄｈｏｒｉ）ウイルス、ダグベ（Ｄｕｇｂｅ）ウイルス、ドウベンハーゲ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ）ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バー（ＥＢ）ウイルス、エリスロウイルス、欧州コウモリリッサウイルス、フラビウイルス、ＧＢウイルス／Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタンウイルス、ハンタウイルス、ヘニパウイルス、ヘンドラウイルス、ヘニパウイルス、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＥ型肝炎、又はδウイルス、ヘパトウイルス、ヘパシウイルス、ヘペウイルス、馬痘ウイルス、アストロウイルス、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、コブウイルス、リッサウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザ、パルボウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、スプマレトロウイルス、Ｔリンパ球向性ウイルス、トロウイルス、イスファハンウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンアレナウイルス、ＫＩポリマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、レンチウイルス、ローズデールウイルス、ルーピング病ウイルス、リンパクリプトウイルス、リンパ性脈絡膜髄膜炎ウイルス、リッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、マスタデノウイルス、ママストロウイルス、マヤロウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、モルシポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、ムンプスウイルス、ムパピローマウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ナイロウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、オルフウイルス、オロプーシェウイルス、オルソブニヤウイルス、オルソヘパドナウイルス、オルソニューモウイルス、オルソポックスウイルス、ヘパシウイルス、オルソポックスウイルス、ペギウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、ポリオーマウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、レスピロウイルス、ラディノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロサウイルス、ロゼオロウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、ルブラウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスＡ、サシチョウバエ熱シシリアンウイルス、サポウイルス、サッポロウイルス、セドルナウイルス（ｓｅａｄｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、セムリキフォレストウイルス、ソウルウイルス、シミアンフォーミーウイルス、シミアンウイルス、シンプレックスウイルス、シンドビスウイルス、サウサンプトンウイルス、スプマウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、トゴトウイルス、ダニ媒介性ポワッサンウイルス、トルクテノウイルス、トロウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、バリセロウイルス、天然痘ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ベシキュロウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、西ナイルウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバ様病ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルスなど。特定の実施形態では、前記対象は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はインフルエンザを有する。前記対象は、パンデミック（広域流行性）、エピデミック（流行性）、季節性、又は単独の感染インシデントの際に感染し得る。特定の実施形態では、エピデミック又はパンデミックの文脈で、すなわち、医療資源が限られており、救急医療の文脈で存在する対象の迅速なトリアージが重要である場合に、感染が検出される。

【0036】

ＩＩ．生体試料
患者のバイオマーカーの状態を評価するために、対象から生体試料を得る。例えば、血液試料はフレボトミスト（ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｉｓｔ）（採血有資格者）によって採取され、ｍＲＮＡを収集して保存することができる。いくつかの実施形態では、血液試料は、試料内の血液細胞からのＲＮＡを即座に安定化できる溶液で事前に満たされたチューブに直接収集される。適切なチューブの１つは、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｔｕｂｅ（ＱＩＡＧＥＮ社、ＢＤカタログ７６２１６５）であるが、ＲＮＡを保存可能な任意のチューブを使用できる。Ｋ２－ＥＤＴＡチューブなどの非ＲＮＡ保存チューブを使用することもできるが、静脈穿刺後一定時間内（例えば、１５、３０、６０、又は１２０分以内）に検査、冷蔵保存、又はその両方とする必要がある。特定の細胞で発現が乏しいバイオマーカーポリヌクレオチドは、正規化技術を使用して濃縮することができる（Ｂｏｎａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：７９１－８０６）。特定の実施形態では、試料は、ウイルス感染の最初の診断から２４時間以内に採取される。

【0037】

典型的には、生体試料は、全血、軟膜、血漿、血清、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣＳ）、Ｔ細胞、並びにリンパ球、多形核白血球、好中球、単球、網状赤血球、好塩基球、バンド細胞、後骨髄球、体腔細胞、血球、好酸球、巨核球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、又はそのような細胞の画分（例えば、核酸又はタンパク質画分）として挙げられる、成熟、未成熟、又は発生中の白血球などの血液細胞を含む。本発明の方法の目的のために使用され得る他の生体試料は、とりわけ、唾液、尿、汗、鼻スワブ、鼻咽頭スワブ、直腸スワブ、腹水、腹膜液、滑液、羊水、脳脊髄液、及び組織生検を含む。生体試料は、従来の技術、例えば、血液試料用の静脈穿刺又は固形組織試料用外科的技術によって対象から得ることができる。

【0038】

ＩＩＩ．バイオマーカーの選択
ウイルス感染症と診断された対象の３０日死亡率リスクは、バイオマーカーの発現レベルに基づいてスコア（例えば、「バイオマーカースコア」又は「死亡率スコア」）を計算することによって決定される。いくつかの実施形態では、前記スコアの計算には、５つのバイオマーカーのパネルが使用される。特定の実施形態では、バイオマーカー遺伝子は、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３である。いくつかの実施形態では、前記スコアの計算には、６つのバイオマーカーのパネルが使用される。特定の実施形態では、バイオマーカー遺伝子は、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、ＨＫ３、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１である。ＴＧＦＢＩは、形質転換増殖因子β誘導を指す（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ７０４５を参照、その全開示は参照により本明細書に援用される）。ＤＥＦＡ４は、デフェンシンα４を指す（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１６６９を参照、その全開示は参照により本明細書に援用される）。ＬＹ８６は、リンパ球抗原８６を指す（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ９４５０を参照、その全開示は参照により本明細書に援用される）。ＢＡＴＦは、塩基性ロイシンジッパーＡＴＦ様転写因子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１０５３８を参照、その全開示は参照により本明細書に援用される）を指し、ＨＫ３は、ヘキソキナーゼ３（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３１０１を参照、その全開示は参照により本明細書に援用される）を指し、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１は、主要組織適合複合体クラスＩＩ ＤＰβ１（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３１１５を参照、その全開示は参照により本明細書に援用される）を指す。

【0039】

しかしながら、例えば、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３、又はＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、ＨＫ３、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の代わりに、又はそれらに加えて、他のバイオマーカーを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される他のバイオマーカーには、ＴＤＲＤ１、ＰＯＬＥ、ＭＹＯＭ１、ＰＤＺＤ４、ＨＨＬＡ３、ＰＤＥ４Ｂ、ＨＳＰＡ１４、ＰＲＤＭ２、ＴＳＰＡＮ１３、ＧＡＢ４、ＲＰＬ４、ＥＧＬＮ１、ＴＲＩＭ６７、ＡＡＣＳ、及びＳＴ８ＳＩＡ３が含まれるが、これに限定されない。本発明の方法で、任意の数のバイオマーカーを評価でき、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のバイオマーカーである。使用できる他のバイオマーカーには、例えば、それぞれの全開示が参照により本明細書に援用される、Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．１１，Ａｒｔ．１１７７、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．９（１）：６９４、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７（２８７）：２８７ｒａ７１、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．８（３４６）：３４６ｒａ９１、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．４６（６）：９１５－９２５、並びに特許公報の国際公開（ＷＯ）第２０１６／１４５４２６号、国際公開（ＷＯ）第２０１７／２１４０６１号、国際公開（ＷＯ）第２０１９／１６８２２号、及び国際公開（ＷＯ）第２０１８／００４８０６号に開示されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、表１に記載されている遺伝子の任意の１又は複数を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、表５に記載されている遺伝子の任意の１又は複数を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、表３に記載されている遺伝子対の任意の１又は複数を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、表６に記載されている遺伝子対の任意の１又は複数を含む。

【0040】

本発明の方法で使用されるバイオマーカーは、その発現レベルがウイルス感染症、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はインフルエンザを有する対象における３０日死亡率（又は他の）転帰と相関する遺伝子に対応する。個々のバイオマーカーの発現レベルは、同じウイルス感染症の生存者又は非生存者におけるレベルと比較して上昇又は低下し得ることが理解される。重要なことは、バイオマーカーの発現レベルは、生存又は非生存に対して正相関又は逆相関であり、全体のスコア、例えば、リスクスコア、バイオマーカースコア、又は死亡率スコアの決定を可能にするため、対象の３０日死亡率リスク、例えば、低い、中間の、又は高い３０日死亡率リスクを決定するために使用できることである。

【0041】

追加のバイオマーカーは、本明細書の別の場所で、例えば、実施例でより詳細に説明されるように、標準的な分析方法又は測定基準を使用して、例えば、ウイルス感染症と診断され、３０日転帰（すなわち、３０日生存又は非生存）が判明している対象から採取した試料のデータを分析することにより、評価及び特定できる。特定の方法では、トレーニングデータのウイルス感染症の種類には対象のウイルス感染症の種類が含まれるが、これは必須ではない。適切な方法又は測定基準には、ピアソン相関、ケンドール順位相関、スピアマン順位相関、ｔ検定、その他のノンパラメトリック尺度、非生存群のオーバーサンプリング、生存群のアンダーサンプリング、並びに線形回帰、非線形回帰、ランダムフォレスト及びその他のツリー・ベースの手法、人工ニューラルネットワークなどを含むその他の手法が挙げられる。特定の実施形態では、特徴選択は、ランキング測定基準として遺伝子発現と転帰との間のピアソン相関の絶対値を用いた単変量ランキングを使用する。いくつかの実施形態では、特徴（遺伝子）は、トレーニングの精度に合わせて最適化された貪欲法による順方向検索によって選択される。いくつかの実施形態では、特徴（遺伝子）は、受信者動作特性曲線下面積に合わせて最適化された貪欲法による順方向検索によって選択される。

【0042】

特定の実施形態では、例えば別個の検証セットを使用して、又は交差検証を使用して、機械学習ワークフローがトレーニングデータに適用される。例えば、ハイパーパラメータチューニングは、感染性疾患診断のモデル最適化に有効であることが公知のパラメータなど、パラメータの検索空間で使用され得る。使用できる分類子の例としては、線形カーネルを使用するサポートベクターマシン、ロジスティック回帰、及び線形活性化関数を使用する多層パーセプトロンなどの線形分類子が挙げられる。特徴選択は、候補バイオマーカーの遺伝子発現データを独立変数として使用し、公知の転帰を従属変数として使用して実行され得る。各モデルの感度及び偽陽性率並びにハイパーパラメータ検索中に評価される決定閾値に基づくプロットと、最適なモデルのプールされた交差検証確率に基づくＲＯＣ様プロットとを使用して、様々なモデルを評価できる。（例えば、Ｒａｍｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｒｉｓｋ－Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅａｒｌｙ－Ｓｔａｇｅ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｖｏｌ．１３，１－９，２０１８，Ｆｉｇ．２Ａを参照）。任意の数の様々な交差検証（ＣＶ）のバリアントを使用できる。各分割（ｆｏｌｄ）が複数のスタディ（ｓｔｕｄｙ）を含み、各スタディが正確に１つのＣＶ分割に割り当てられる、５分割（５－ｆｏｌｄ）ランダムＣＶや５分割グループ化ＣＶ、並びに各スタディが１つのＣＶ分割を形成するリーブワンスタディアウト（ＬＯＳＯ）法などである。いくつかの実施形態では、最終モデルに含まれる遺伝子の数は、例えば、５又は６に制限して、迅速な分子アッセイへの翻訳を容易にすることができる。例えば、発現レベルが最も高い遺伝子を選択することにより、遺伝子の数を減らすことができる。

【0043】

ＩＶ．バイオマーカー発現の検出
以下で詳細に説明するように、本明細書に記載のバイオマーカー遺伝子発現レベルに対応するデータセットを使用して、統計的機械学習アルゴリズムの適用に基づいて診断ルール若しくはモデル又は予測ルール若しくはモデルを作成し、死亡率リスクスコアを生成する。このようなアルゴリズムは、バイオマーカープロファイルと転帰との間の関係、例えば３０日の生存率及び非生存率（トレーニングデータと称される場合もある）を使用する。前記データを、対象の状態、例えば３０日での死亡率リスクを予測するために使用される関係を推測するために使用する。

【0044】

バイオマーカーの発現レベルは、多くの方法のいずれかで評価することができる。特定の実施形態では、バイオマーカーの発現レベルは、バイオマーカーのポリヌクレオチドレベルを測定することによって決定される。例えば、血液又はその他の生体試料が収集され保存されると、ＲＮＡは、使用するバイオマーカー遺伝子及び任意の対照遺伝子、例えば、バイオマーカーの参照値として使用されるハウスキーピング遺伝子の発現レベルのその後の定量化のためにＲＮＡを保存できる限り、任意の方法を使用して抽出できる。ＲＮＡは、例えば、保存された血球から手動で、又は市販のＲＮＡ抽出キットを備えたＱＩＡｃｕｂｅ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社）などのロボット装置を使用して抽出することができる。いくつかの実施形態では、例えば、等温増幅法では、ＲＮＡ抽出は行われない。そのような方法では、発現レベルは、例えば、血液細胞の溶解、次いで、例えば、逆転写及びｍＲＮＡの増幅によって直接決定することができる。

【0045】

いくつかの実施形態では、参照核酸はハウスキーピング遺伝子又は対応するｍＲＮＡ転写物などのその産物である。いくつかの実施形態では、参照核酸には、プレｍＲＮＡ分子、５’キャップｍＲＮＡ分子、３’アデニル化ｍＲＮＡ分子、又は成熟ｍＲＮＡ分子であるｍＲＮＡ転写物が含まれる。特定の実施形態では、参照核酸は、試験試料の供給源でもある哺乳動物宿主から得られた成熟ｍＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ハウスキーピング遺伝子又はその産物は、宿主の細胞によって比較的一定の速度で発現され、ハウスキーピング遺伝子の発現率は、他の宿主遺伝子又はその遺伝子産物の発現に対する基準点として使用できる。適切なハウスキーピング遺伝子は、当技術分野で周知であり、例えば、ＧＡＰＤＨ、ユビキチン、１８Ｓ（１８Ｓ ｒＲＮＡ、例えば、ＨＧＮＣ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）番号４４２７８～４４２８１及び３７６５７）、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ Ｂｅｔａ、例えば、ＨＧＮＣ番号１３２））、ＫＰＮＡ６（カリオフェリンサブユニットα６、例えば、ＨＧＮＣ番号６３９９）、又はＲＲＥＢ１（ｒａｓ応答性エレメント結合タンパク質１、例えば、ＨＧＮＣ番号１０４４９）を含み得る。

【0046】

いくつかの実施形態では、参照核酸は、ヒトハウスキーピング遺伝子である。本発明の方法での使用に適した例示的なヒトハウスキーピング遺伝子には、ＫＰＮＡ６、ＲＲＥＢ１、ＹＷＨＡＢ、染色体１オープンリーディングフレーム４３（Ｃ１ｏｒｆ４３）、荷電多胞体タンパク質２Ａ（ＣＨＭＰ２Ａ）、ＥＲ膜タンパク質複合体サブユニット７（ＥＭＣ７）、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、プロテアソームサブユニットβ型２（ＰＳＭＢ２）、プロテアソームサブユニットβ型４（ＰＳＭＢ４）、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢ７Ａ）、受容体アクセサリータンパク質５（ＲＥＥＰ５）、小核リボ核タンパク質Ｄ３（ＳＮＲＰＤ３）、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）、及び液胞タンパク質ソーティング２９ホモログ（ＶＰＳ２９）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｗｗｗ／ｔａｕ／ａｃ／ｉｌ～ｅｌｉｅｉｓ／ＨＫＧ／で提供されている任意のハウスキーピング遺伝子を使用できる（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｌｅｖａｎｏｎ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．（２０１３），１０：５６９－７４を参照）。

【0047】

バイオマーカー遺伝子の転写物のレベル、又はそれらの互いに対するレベル、及び／又はハウスキーピング遺伝子などの参照遺伝子に対するそれらのレベルは、生体試料に存在するｍＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドの量から決定することができる。ポリヌクレオチドは、様々な方法で検出及び定量化でき、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（例えば、ｎＣｏｕｎｔｅｒ解析）、マイクロアレイ解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、等温増幅法、例えば、ｑＲＴ－ＬＡＭＰ、内部ＤＮＡ検出スイッチ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡフィンガープリンティング、リガーゼ連鎖反応、Ｑｂｅｔａレプリカーゼ、鎖置換増幅、転写に基づく増幅システム、ヌクレアーゼ保護（ＳＩヌクレアーゼ又はＲＮＡｓｅ保護アッセイ）、配列決定法、並びにその全体が参照により本明細書に援用される国際公開（ＷＯ）第８８／１０３１５号及び第８９／０６７００号並びに国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号及び第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号に開示される方法、及びＭａｃＭａｎプローブ、フリップ（ｆｌｉｐ）プローブ、及びＴａｑＭａｎプローブを使用する方法（例えば、Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｏｌ Ｄｉａｇ．１６：６，ｐｐ ６２７－６３８を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｄｒａｇｈｉｃｉ，Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ／ＣＲＣ，２００３、Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００４、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｅｄｗａｒｄｓ，ａｎｄ Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｄｓ．，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００９、Ｂｕｓｔｉｎ，Ａ－Ｚ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＩＵＬ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．５），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌｉｎｅ，２００４、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４－４８７、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１１－１８、及びＳｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００８を参照。

【0048】

いくつかの実施形態では、バイオマーカー遺伝子発現は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒなどの遺伝子発現パネルを使用して検出され、これにより、増幅又はｃＤＮＡ変換を必要とせずにバイオマーカー遺伝子発現の定量化が可能になる。そのような方法では、対象からの血液試料又は他の生体試料から得られたＲＮＡは、プローブ、例えば、各バイオマーカー及び制御配列の標識レポータープローブ及び捕捉プローブに溶液中でハイブリダイズする。次いで、標的ＲＮＡプローブ複合体を精製し、固体支持体に固定した後、各々特定のマーカーの定量化を可能にする特定の蛍光シグネチャを有するマーカー特異的プローブを用いて定量化する。そのような用途のためのそのような方法並びにプローブ、例えば捕捉プローブ及びレポータープローブの生成は、当技術分野で公知であり、例えば、ウェブサイト（ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ）に記載されている。

【0049】

ｑＲＴ－ＰＣＲ又はｑＲＴ－ＬＡＭＰなどの増幅に基づく方法では、プライマーは様々な方法で得ることができる。例えば、プライマーは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｂｉｏｌｙｔｉｃ Ｌａｂ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ社、Ｓｉｅｒｒａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などによって販売されているオリゴ合成機を使用して実験室で合成することができる。あるいは、任意の配列及び／又は修飾を備えたプライマー及びプローブは、多数のサプライヤー、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｂｉｏｌｙｔｉｃ Ｌａｂ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ社、ＩＤＴ社、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｔｃｈ社、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社などから容易に注文できる。

【0050】

Ｏｌｉｇｏバージョン５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）など、当技術分野で周知のコンピュータープログラムが、必要な特異度及び最適な増幅特性を有するプライマーの設計に有用である。ＰＣＲ法は当技術分野で周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。

【0051】

いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、バイオマーカーのレベルを測定するために使用される。マイクロアレイ解析の利点は、各バイオマーカーの発現を同時に測定できることと、特定の疾患又は状態（例えば、インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）の診断的発現プロファイルを提供するようにマイクロアレイを特別に設計できることである。マイクロアレイは、ポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、次いでそのようなプローブを固体支持体又は表面に固定することによって調製される。例えば、マイクロアレイは、それぞれ本明細書に記載のバイオマーカーの１つを表す結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位又は「プローブ」の規則配列を有する支持体又は表面を含み得る。マイクロアレイは、アドレス可能なアレイであることが好ましく、位置的にアドレス可能なアレイであることがより好ましい。より具体的には、アレイの各プローブは、好ましくは、固体支持体上の既知の所定の位置に配置され、各プローブの同一性（すなわち、配列）がアレイ中（すなわち、支持体又は表面上）の位置から決定され得る。各プローブは、好ましくは単一部位で固体支持体に共有結合される。マイクロアレイを調製するための条件、ハイブリダイゼーション条件、及び結合したプローブの検出のための条件は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、Ｓｈａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：６３９－６４５、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：６３９－６４５（１９９６）、及びＦｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６８１－１６８４（１９９６）を参照）。

【0052】

上記のように、特定のポリヌクレオチド分子が特異的にハイブリダイズする「プローブ」は、相補的なポリヌクレオチド配列を含む。前記マイクロアレイのプローブは、典型的には、例えば、長さが１，０００ヌクレオチド以下、又は１０～１，０００ヌクレオチド、又は１０～２００、１０～３０、１０～４０、２０～５０、４０～８０、５０～１５０、若しくは８０～１２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。前記プローブは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡとＲＮＡとのコポリマー配列を含み得る。前記プローブのポリヌクレオチド配列はまた、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ類似体、誘導体、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、前記プローブは、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格（例えば、ホスホロチオエート）で修飾され得る。前記プローブのポリヌクレオチド配列は、合成オリゴヌクレオチド配列などの合成ヌクレオチド配列であり得る。プローブ配列は、インビボで酵素的に、インビトロで酵素的に（例えばＰＣＲによって）、又はインビトロで非酵素的に合成され得る。

【0053】

プローブは、好ましくは、結合エネルギー、塩基組成、配列複雑性、クロスハイブリダイゼーション結合エネルギー、及び二次構造を考慮に入れるアルゴリズムを使用して選択される。Ｆｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．（国際公開（ＷＯ）第０１／０５９３５号、２００１年１月２５日公開）及びＨｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３４２－７（２００１）を参照。アレイは、陽性対照プローブ、例えば標的ポリヌクレオチド分子中の配列に相補的でハイブリダイズ可能であることが公知のプローブ、及び陰性対照プローブ、例えば標的ポリヌクレオチド分子中の配列に相補的ではなくハイブリダイズ可能でないことが公知のプローブの両方を含む。さらに、本発明の方法は、本明細書の他の場所でより詳細に説明するように、バイオマーカー自体、並びにハウスキーピング遺伝子などの内部制御配列の両方に対するプローブを含む。

【0054】

一実施形態では、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＤＥＦＡ４ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＬＹ８６ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＫ３ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。一実施形態では、本開示は、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＤＥＦＡ４ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＬＹ８６ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＨＫ３ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、表１又は表５に列挙されたバイオマーカーのいずれかにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、表３又は表６に列挙されたバイオマーカー対のいずれかにハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する。

【0055】

いくつかの実施形態では、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、バイオマーカーの発現プロファイルを決定するために使用される（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開番号第２００５／００４８５４２Ａ１号を参照）。ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１の工程は、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写と、その後のＰＣＲ反応における指数関数的増幅である。最も一般的に使用される２つの逆転写酵素は、アビロ（ａｖｉｌｏ）骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）及びモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＬＶ－ＲＴ）である。逆転写工程は、典型的には、状況や発現プロファイリングの目的に応じて、特定のプライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングされる。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、米国カリフォルニア州）を製造元の指示に従って使用して逆転写することができる。得られたｃＤＮＡは、その後のＰＣＲ反応の鋳型として使用できる。

【0056】

いくつかの実施形態では、ＰＣＲでは、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’－５’校正（プルーフリーディング）エンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲは典型的には、Ｔａｑ又はＴｔｈポリメラーゼの５’－ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用できる。このような方法では、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成し、３番目のオリゴヌクレオチド又はプローブを設計して、２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出する。プローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長不可であり、レポーター蛍光色素及び消光剤蛍光色素で標識されている。レポーター色素からのレーザー誘起発光は、プローブ上に２つの色素が近接して配置されている場合、消光色素によって消光される。増幅反応中、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は鋳型依存的にプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアの消光効果を有さない。新たに合成された分子ごとに１分子のレポーター色素が遊離し、消光されていないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈の基礎となる。

【0057】

ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国カリフォルニア州フォスターシティ）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、マンハイム、ドイツ）などの市販の機器を使用して行うことができる。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼ手順は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出システムなどのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置で実行される。前記システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ、及びコンピューターで構成されている。前記システムには、前記機器を実行し、データを分析するためのソフトウェアが含まれている。５’－ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はＣｔ、すなわち閾値サイクルとして表される。蛍光値はサイクルごとに記録され、増幅反応のその時点までに増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であると最初に記録された時点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。

【0058】

エラーと試料間変動の影響とを最小限に抑えるために、ＲＴ－ＰＣＲは通常、内部標準を使用して実行される。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定のレベルで発現され、実験的処理の影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために使用され得るＲＮＡには、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド－３－リン酸－デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びベータ－アクチンのｍＲＮＡが挙げられる。

【0059】

特定の実施形態では、バイオマーカー遺伝子発現は、等温増幅を使用して決定される。等温増幅は、一定の単一増幅温度（例えば、約３０℃～約９５℃）を用いて標的核酸を増幅するプロセスである。標準的なＰＣＲとは異なり、等温増幅反応には、アニールされたオリゴヌクレオチドの変性、ハイブリダイゼーション、及び伸長の複数サイクルが含まれず、増幅された標的核酸分子（すなわち、アンプリコン）の集団が形成される。当技術分野で公知の様々なタイプの等温適用があり、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、及びヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

特定の実施形態では、等温増幅は、標的核酸が一定温度で増幅され、標的核酸の増幅速度が蛍光、濁度、又は同様の手段（例えば、ＮＥＡＲ又はＬＡＭＰ）によってモニタリングされるリアルタイム定量的等温増幅である。場合によっては、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）が生体試料から分離され、逆転写によってｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして使用される。ｃＤＮＡ分子は、増幅された標的核酸の産生を検出及び定量できるように、等温増幅条件下で増幅される。

【0061】

特定の実施形態では、等温増幅はループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）である。ＬＡＭＰは選択性を提供し、ポリメラーゼと標的核酸の固有の配列を認識する特別に設計されたプライマーのセットとを使用する（例えば、Ｎｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，２：４－１０、Ｓｃｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ａｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，８：２７５０－２７５５、及びＳｃｈｏｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，９：ｅａａｌ３６９３を参照）。ＰＣＲとは異なり、標的核酸は、複数の内部プライマー及び外部プライマーと、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、一定温度（例えば、６０℃～６５℃）で増幅される。場合によっては、標的核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖の一部に相補的な核酸配列を含む内部プライマー対がＬＡＭＰを開始する。内部プライマーによる鎖置換合成に続いて、外部プライマー対によってプライミングされた鎖置換合成により、一本鎖アンプリコンが放出され得る。一本鎖アンプリコンは、標的核酸の他端にハイブリダイズしてステムループ核酸構造を生成する第２の内部プライマー及び第２の外部プライマーによってプライミングされるさらなる合成のためのテンプレートとして機能し得る。その後のＬＡＭＰサイクリングでは、１つの内部プライマーが産物のループにハイブリダイズし、置換及び標的核酸合成を開始し、元のステムループ産物と、２倍の長さのステムを有する新しいステムループ産物を生成する。さらに、アンプリコンループ構造の３’末端は、自己鋳型鎖合成の開始部位として機能し、追加のループ構造を形成して後続の自己鋳型増幅ラウンドをプライミングするヘアピン様アンプリコンを生成する。増幅は、標的核酸の多数のコピーの蓄積を伴って継続する。ＬＡＭＰプロセスの最終産物は、同一鎖内の標的核酸配列の交互に反転した反復間のアニーリングによって形成された複数のループを有する、カリフラワー様構造の標的核酸の連結された反復を有するステムループ核酸である。

【0062】

いくつかの実施形態では、等温増幅アッセイは、標的核酸を定量化するためのデジタル逆転写ループ媒介等温増幅（ｄＲＴ－ＬＡＭＰ）反応を含む（例えば、Ｋｈｏｒｏｓｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：２ ｅ１０を参照）。通常、ＬＡＭＰアッセイは、増幅反応中に検出可能なシグナル（例えば、蛍光）を生成する。いくつかの実施形態では、蛍光を検出して定量化できる。蛍光を検出及び定量化するための任意の適切な方法を使用することができる。場合によっては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏなどの装置を使用して、等温増幅アッセイからの蛍光を検出及び定量化できる。

【0063】

定量的リアルタイム等温増幅によって試験試料中の標的核酸の増幅を検出するための任意の適切な方法を使用して、本発明の方法を実施することができる。いくつかの実施形態では、試験試料中の標的核酸の定量的リアルタイム等温増幅は、標的核酸の等温増幅中に組み込まれたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に結合した１又は複数の異なる（固有の）蛍光標識（例えば、５－ＦＡＭ（５２２ｎｍ）、ＲＯＸ（６０８ｎｍ）、ＦＩＴＣ（５１８ｎｍ）、及びナイルレッド（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ）（６２８ｎｍ））を検出することによって決定される。別の実施形態では、試験試料中の標的核酸の定量的リアルタイム等温増幅は、標的核酸の等温増幅中に組み込まれたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に結合した単一のフルオロフォア種（例えば、ＲＯＸ（６０８ｎｍ））の検出によって決定することができる。いくつかの実施形態では、使用される各フルオロフォア種は、任意の他のフルオロフォア種とは異なる蛍光シグナルを放出するため、アッセイに存在する他のフルオロフォア種の中から各フルオロフォアを容易に検出できる。

【0064】

いくつかの実施形態では、定量的リアルタイム等温増幅によって試験試料中の標的核酸の増幅を検出する方法は、ＳＹＴＯ色素（ＳＹＴＯ９又はＳＹＴＯ８２）などのインターカレーター蛍光色素を使用することを含み得る。いくつかの実施形態では、定量的リアルタイム等温増幅により試験試料中の標的核酸の増幅を検出する方法は、非標識プライマーを使用して前記試験試料中の標的核酸を等温増幅し、標識プローブ（例えば、フルオロフォアを有する）を使用して前記試験試料中の標的核酸の等温増幅を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、非標識プライマーは、試験試料に存在する標的核酸を等温的に増幅するために使用され、５’末端に５－ＦＡＭ色素標識を有し、３’末端にマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）と非蛍光クエンチャーとを有するプローブを使用して、標的核酸の等温増幅を検出する（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）。

【0065】

いくつかの実施形態では、試験試料中の標的核酸の増幅を検出することは、ワンステップ又はツーステップ定量的リアルタイム等温増幅アッセイを用いて行われる。ワンステップ定量的リアルタイム等温増幅アッセイでは、逆転写を定量的等温増幅と組み合わせて、単一の定量的リアルタイム等温増幅アッセイを形成する。ワンステップアッセイにより、実際の操作回数が減り、試験試料を処理するための合計時間が短縮される。ツーステップアッセイは、逆転写が行われる第１工程と、それに続く定量的等温増幅が行われる第２工程とを含む。ワンステップ又はツーステップアッセイのどちらを行うべきかを決定することは、当業者の技術常識の範囲内である。

【0066】

いくつかの実施形態では、増幅及び／又は検出は、図１６に示されるように、統合された測定システムを使用して全体的又は部分的に実行され、これは、本明細書の別の場所で説明されているコンピューターシステムも含み得る（例えば、図１７を参照）。

【0067】

いくつかの実施形態では、リスク又はバイオマーカーのスコアは、試験した各バイオマーカーのＴｔ（閾値までの時間）値に基づいて計算される。これは、例えば、標的核酸（例えば、バイオマーカー）及び参照核酸（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の等温増幅又は他の増幅についての標準曲線を確立することによって達成され得る。標準曲線は、複数の既知の入力濃度で定量化されたキャリブレーター試料を使用して、リアルタイムの等温増幅アッセイを実行することによって取得できる。適切な方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号（ＷＯ）第２０２０／０６１２１７号に提供されており、その全開示は参照により本明細書に援用される。

【0068】

例えば、いくつかの実施形態では、標準曲線を生成するために、定量化された物質の連続希釈を行うことによって定量化されたキャリブレーター試料が得られる。例えば、鋳型は、例えば、約１０^９コピー／μＬ～約１０^２コピー／μＬの範囲内の濃度をカバーする鋳型を生成する１０倍濃度間隔で緩衝液中で段階希釈される。各キャリブレーター試料の正確な濃度は、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。

【0069】

標準曲線を得るために、標的核酸のそれぞれの濃度を有するそれぞれのキャリブレーター試料の既知量（例えば、１／μＬ）を用いて、各アリコートについてリアルタイム増幅アッセイを実施する。それぞれのキャリブレーター試料のリアルタイム増幅アッセイでは、標的核酸のインターカレーター蛍光色素（例えば、ｄｓＤＮＡ色素）又は蛍光標識によって放出される蛍光の強度が、時間関数として測定される。例えば、リアルタイム定量的増幅アッセイにおいて時間関数として蛍光強度のプロットを作成することができる。破線は、所定の閾値強度を表すために使用することができ、増幅が開始された時点からの経過時間が閾値までの時間Ｔｔである。それぞれの閾値までの時間値は、それぞれの蛍光曲線から時間関数として決定することができる。したがって、閾値までの時間値Ｔｔ_ｎ、Ｔｔ_ｎ＋１、Ｔｔ_ｎ＋２などは、異なるキャリブレーター―試料について得られる。

【0070】

指数関数的増幅の場合、閾値までの時間は、開始コピー数（鋳型存在量とも称される）の対数（例えば、１０を底とする対数）に直線的に比例する。データ点の散布図は、蛍光曲線から生成できる。各データ点は、データ対［Ｌｏｇ_１０（ＣｏｐｙＮｕｍｂｅｒ）， Ｔｔ］を表す（「ＣｏｐｙＮｕｍｂｅｒ」は、増幅アッセイにおける核酸の開始コピー数を指すことに注意）。いくつかの実施形態では、データ点はほぼ直線上にある。次いで、プロット内のデータ点に対して線形回帰が実行され、全偏差が最小でデータ点に最もよく適合する直線が得られる。線形回帰の結果は、下記式で表される直線になる。

ｍは直線の傾きであり、ｂはｙ切片である。傾きｍは、標的核酸の等温増幅の効率を表す。ｂは、鋳型のコピー数がゼロに近似する時の閾値までの時間を表す。式（１）で表される直線を標準曲線と称する。

【0071】

いくつかの実施形態では、等温増幅アッセイの複製（例えば、三つ組）は、データの信頼性を高めるために、各試料に対して実行してもよい。複製された閾値までの時間の値を平均化し、標準偏差を計算できる。

【0072】

所定の等温増幅アッセイの標準曲線が確立されると、その標準曲線を使用して、下記式を用いて、標的核酸の未知の開始コピー数の増幅アッセイの将来の実行のために、閾値までの時間値を開始コピー数に変換できる。

【0073】

通常、低いコピー数又は非常に高いコピー数のデータ点は、直線から外れる場合がある。データ点が直線で表され得るコピー数の範囲は、標準曲線のダイナミックレンジと称される。閾値までの時間と標準曲線によって表されるコピー数の対数との間の線形関係は、ダイナミックレンジ内でのみ有効である。

【0074】

標的核酸及び参照核酸の増幅効率が所定の等温増幅アッセイで異なる場合、標的核酸及び参照核酸の標準曲線を別々に得る必要がある場合がある。したがって、２セットのリアルタイム等温増幅アッセイを行ってもよく、一方のセットは標的核酸の標準曲線を確立するためのものであり、他方のセットは参照核酸の標準曲線を確立するためのものである。複数の標的核酸が考慮される場合（例えば、本明細書に記載の５つのバイオマーカーのパネルの場合）、各標的核酸の標準曲線を得てもよい。

【0075】

いくつかの実施形態では、標準曲線は、試験試料を得る前に生成される。すなわち、標準曲線は、試験試料の定量的等温増幅を使用してオンボードで生成されるわけではない。このような標準曲線は、オフボード標準曲線と称される場合がある。オフボード標準曲線は、相対存在量の値を推定するために使用され得る。例えば、未知の入力濃度の標的核酸の試験試料について、試験試料の第１のアリコートに対して第１のリアルタイム増幅アッセイを実施して、標的核酸に関する第１の閾値までの時間値を得る。次いで、第２のリアルタイム等温増幅アッセイを、試験試料の第２のアリコートに対して実施して、参照核酸に関する第２の閾値までの時間値を得る。第１のアリコート及び第２のアリコートは、実質的に同量の試験試料を含む。次いで、第１の閾値までの時間は、標的核酸の標準曲線を使用して、標的核酸の開始コピー数に変換され得る。同様に、第２の閾値までの時間は、参照核酸の標準曲線を使用して、参照核酸の開始コピー数に変換され得る。次いで、標的核酸の開始コピー数を参照核酸の開始コピー数に対して正規化し、相対量の値を得る。

【0076】

標的核酸及び参照核酸の増幅効率は、既知の値とほぼ同じである場合、相対存在量は、標準曲線を使用せずに、閾値までの時間から直接得られ得る。

【0077】

Ｖ．バイオマーカースコアの計算
死亡率リスク、例えば、３０日死亡率リスクを決定するために、モデル（例えば、最大のＡＵＣを提供するハイパーパラメータ構成を備えたモデル）を対象からのバイオマーカー発現データに適用して、死亡の可能性を示すスコア、例えば、３０日時点又は別の時点での死亡率、ＩＣＵ入院リスクなどのスコア、例えば、「リスクスコア」、「バイオマーカースコア」、「死亡率スコア」、「３０日死亡率スコア」、又は「ＨｏｓｔＤｘ（商標）ウイルス重症度スコア」を決定する。このスコアを使用して、例えば、対象をいくつかのビン、例えば、死亡率リスクが「低」、「中間」又は「不確定」、及び「高」の３つのビンのいずれかに分類することができる（例えば、図４を参照）。特定の実施形態では、このモデルは、ロジスティック回帰及び選択されたバイオマーカー遺伝子、例えば、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ及びＨＫ３、又はＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、ＨＫ３、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１を使用して、スコアを計算する。前記モデルを使用して決定された３０日死亡率は、本明細書の他の場所でより詳細に説明されているように、対象の最適な治療を決定するために使用される。

【0078】

例えば、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子と比較して、遺伝子レベルの合計、積、又は商を、それらの絶対レベル又はそれらの相対レベルに関して取得すること、又はそれらの値を、少なくとも測定された遺伝子レベル、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上のバイオマーカー遺伝子の測定レベルを解釈可能なスコアに組み込む線形若しくは非線形アルゴリズムに入力することによって、リスク又はバイオマーカースコアを計算できる。特定の実施形態において、前記スコアは、５つのバイオマーカーのパネルについて得られた発現データに基づいて計算される。特定の実施形態において、前記スコアは、６つのバイオマーカーのパネルについて得られた発現データに基づいて計算される。

【0079】

半定量的方法では、閾値又はカットオフ値が適切に決定され、場合により所定の値である。特定の実施形態では、閾値は固定されているという意味では、例えば、以前のアッセイの経験及び／又は所与の転帰（単数又は複数）を有する対象の集団、例えば、３０日生存又は非生存の転帰を有する５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はそれ以上の人数の被験者の集団に基づいて事前に決定されている。あるいは、所定の値は、特定の値がアッセイ間で変化する場合でも、又はアッセイの実行ごとに決定され得る場合でも、閾値に到達する方法が事前に決定又は固定されていることを示してもよい。

【0080】

本明細書に記載の統計分析について、例えば、スコアの計算又は患者の特定の死亡率リスクの確率若しくは尤度の計算に含まれるバイオマーカーの選択のために、並びに特定のリスク若しくはバイオマーカースコアを考慮して行われる診断又は治療評価のために、各個人が患っている１又は複数の状態に関する臨床データなど、他の関連情報も考慮され得る。これには、年齢、人種、性別などの人口統計情報、状態の存在、非存在、程度、段階、重症度、又は進行に関する情報、ＳＯＦＡ、ｑＳＯＦＡ、又はＡＰＡＣＨＥなどの臨床リスクスコア、表現型特性の詳細、遺伝的な又は遺伝的に調節された情報、アミノ酸又はヌクレオチド関連のゲノミクス情報などの表現型情報、イメージング、生化学的、及び血液学的アッセイを含むその他の試験の結果、その他の生理学的スコアなどが含まれ得る。

【0081】

上記のように、個々のバイオマーカー遺伝子の存在量の値は、数式又は機械学習又は他のアルゴリズムを使用して組み合わせることができ、対象の３０日死亡率リスクを予測できる死亡率スコアなどの単一の診断スコアを生成できる。これらの実施形態では、生成されたスコアは、任意の個々の遺伝子レベル単独よりも高い予測力を有する（例えば、３０日での生存又は非生存の識別のためのより大きな受信者動作特性曲線下面積を有する）。

【0082】

いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーを単一の診断スコアに統合するためのアルゴリズムのタイプには、幾何平均の差、算術平均の差、和の差、単純和などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、診断スコアは、複数のバイオマーカーの相対的存在量の値に基づいて、回帰モデル、ツリー・ベースの機械学習モデル、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデル、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）モデルなどの機械学習モデルを用いて推定されてもよい。

【0083】

バイオマーカーデータは、３０日以内の対象の死亡率リスクを評価するために、テスト発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間で観察されたバイオマーカーレベルの差異の統計的有意性を決定するために、様々な方法によって分析することもできる。特定の実施形態では、患者データは、１又は複数の方法で分析され、多変量線形判別分析（ＬＤＡ）、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析、主成分分析（ＰＣＡ）、アンサンブルデータマイニング法、マイクロアレイ有意性分析（ＳＡＭ）、細胞特異的マイクロアレイ有意性分析（ｃｓＳＡＭ）、密度正規化イベントのスパニングツリー進行分析（ＳＰＡＤＥ）、及び多次元タンパク質同定技術（ＭＵＤＰＩＴ）による分析が挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｈｉｌｂｅ（２００９）Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ／ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；ＭｃＬａｃｈｌａｎ（２００４）Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｚｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：５６１－５７７；Ｐｅｐｅ（２００３）Ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｏｘｆｏｒｄ、Ｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１：３９４０－３９４１、Ｔｕｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：５１１６－５１２１、Ｏｚａ（２００６）Ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ，ＮＡＳＡ Ａｍｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｏｆｆｅｔｔ Ｆｉｅｌｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ、Ｅｎｇｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍ．４２（２）：２８７－２９５、Ｚｈａｎｇ（２００７）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：２３０、Ｓｈｅｎ－Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８４：１４４－１３０、Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１０）：８８６－８９１、Ｒｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１１１１（２）：１６６－１７４，Ｊｏｌｌｉｆｆｅ Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ，２００２）、及びＫｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｖｉｓ Ｃｏｍｐｕｔ Ｇｒａｐｈ １０：４５９－４７０を参照。）

【0084】

３０日死亡率又は可能性を決定するために、全てのバイオマーカーが特定の対象の対照レベルに比べて上昇又は低下している必要はない。例えば、特定のバイオマーカーレベルの場合、異なる確率カテゴリーに分類される個人間に重複がある可能性がある。しかしながら、アッセイに含まれる全てのバイオマーカー遺伝子の合計レベルがスコアを生じさせるものであり、スコアが閾値、例えば、ウイルス感染症及び生存者転帰を有する少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、又はそれ以上の患者由来の閾値及び／又はウイルス感染症及び非生存者転帰を有する１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、又はそれ以上の対照者の閾値を超えた場合、それにより対象の３０日死亡率リスクに関する決定が可能になる。例えば、３０日での死亡率リスクが低いと判断する場合には、閾値は、ウイルス感染症及び３０日生存転帰を有する少なくとも１００人の個人並びにウイルス感染症及び非生存転帰を有する１００人の患者の集団全体での閾値となり得、３０日で生存している対象の少なくとも９０％が閾値を超えている。任意のアッセイでは、複数の閾値が存在する場合があり、例えば、死亡率リスクが高いことを示す一方向のしきい値と、死亡率リスクが低いことを示す他方向の閾値であることを理解されたい。

【0085】

本明細書で使用される場合、所与の転帰に関する「確率（可能性）」及び「リスク」という用語は、所与の数学的モデルに基づいて、特定のスコアを有する対象が実際にその状態（例えば、３０日非生存）を有するという条件付き確率を指す。例えば、確率又はリスクの増加は、相対的又は絶対的なものであり得、質的又は量的に表すことができる。例えば、リスクの増加は、以前の集団研究に基づいて、単に対象のスコアを決定し、対象を「リスクの増加」カテゴリーに分類することで表現できる。あるいは、試験対象の増加したリスクの数値表現は、バイオマーカー又はリスクスコアの分析に基づいて決定することができる。

【0086】

いくつかの実施形態では、尤度は、バイオマーカー又は死亡率スコアのレベルを、１又は複数の事前に選択されたレベル又は閾値レベルと比較することによって評価される。３０日死亡率のリスク、又は入院期間、ＩＣＵケアの必要性、人工呼吸器の必要性、再入院率などのケアの１又は複数の側面のリスクを予測する許容可能な能力を提供する閾値を選択できる。説明に役立つ例では、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、第１の集団が第１の状態（例えば、３０日での非生存）を有し、第２の集団が、第２の状態（例えば、３０日での非生存）を有する、２つの集団におけるバイオマーカー又はリスクスコアの値をプロットすることによって計算される。

【0087】

任意の特定のバイオマーカーについて、疾患を有する対象と有さない対象とにおけるバイオマーカーレベルの分布は重複する可能性が高く、バイオマーカー又はリスクスコアにも一部の重複が存在し得る。このような条件下では、試験で第１の状態と第２の状態とを１００％の精度で完全に区別することはできず、オーバーラップ領域は、試験で第１の状態と第２の状態とを区別できない場所を示している。閾値が選択され、その値を超えると（又は指定された状態若しくは予後によってバイオマーカー若しくはリスクスコアがどのように変化するかに応じて、その値を下回ると）、試験では「陽性」と見なされ、それを下回ると試験では「陰性」と見なされる。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）はＣ統計量を提供する。これは、認識された測定値が状態の正確な同定を可能にする確率の尺度である（例えば、Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３：２９－３６（１９８２）を参照）。

【0088】

いくつかの実施形態では、陽性尤度比、陰性尤度比、オッズ比、及び／又はＡＵＣ若しくは受信者動作特性（ＲＯＣ）値は、死亡率リスクを予測する方法の能力の尺度として使用される。本明細書で使用する場合、「尤度比」という用語は、所与の試験結果が目的の状態又は転帰を有する対象で観察される確率を、目的の状態又は転帰を有さない患者で同じ結果が観察される確率で割ったものである。したがって、陽性尤度比は、特定の状態又は転帰を有する対象で観察される陽性結果の確率を、特定の状態又は転帰を有さない対象で陽性結果が得られる確率で割ったものである。陰性尤度比は、特定の状態又は転帰を有さない対象の陰性結果の確率を、特定の状態又は転帰を有する対象の陰性結果の確率で割ったものである。

【0089】

「オッズ比」という用語は、本明細書で使用される場合、１つの群（例えば、３０日生存者群）で発生するイベントのオッズと、別の群（例えば、３０日非生存者群）で発生するイベントのオッズとの比率、又はその比率のデータに基づく推定値を指す。「曲線下面積」又は「ＡＵＣ」という用語は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積を指し、どちらも当技術分野で周知である。ＡＵＣ測定値は、完全な決定閾値範囲全体における分類子の精度を評価するのに有用である。ＡＵＣが大きい分類子は、２つ以上の目的の群間で未知のものを正しく分類する（例えば、３０日での死亡率リスクが低い、中間、又は高い）能力が高くなる。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えば、生存者又は非生存者）を区別する又は見分ける際に、特定の特徴（例えば、本明細書に記載のバイオマーカー発現レベル又はバイオマーカースコアのいずれか、及び／又は追加の生物医学情報の任意の項目）のパフォーマンスをプロットするのに有用である。典型的には、集団全体（例えば、症例及び対照）の特徴データは、単一の特徴の値に基づいて昇順に並べ替えられる。次いで、その特徴の各値について、データの真陽性率と偽陽性率とが計算される。感度は、その特徴の値を超える症例の数をカウントし、症例の総数で割ることによって決定される。特異度は、その特徴の値を下回る対照の数をカウントし、対照の総数で割ることによって決定される。

【0090】

これは、対照と比較して症例で特徴が上昇するシナリオを指すが、対照と比較して症例で特徴が低いシナリオにも適用される（このようなシナリオでは、その特徴の値を下回る試料がカウントされることになる）。ＲＯＣ曲線は、単一の特徴に対しても他の単一の出力に対しても生成され得る。例えば、２つ以上の特徴の組み合わせを数学的に組み合わせて（例えば、加算、減算、乗算など）、単一の値を生成し、この単一の値をＲＯＣ曲線にプロットできる。さらに、組み合わせが単一の出力値を導出する複数の特徴の任意の組み合わせを、ＲＯＣ曲線にプロットできる。これらの特徴の組み合わせは、試験を構成し得る。ＲＯＣ曲線は、試験の１－異度に対する試験の感度のプロットであり、感度は従来縦軸に表示され、１－異度は従来横軸に表示される。したがって、「ＡＵＣのＲＯＣ値」は、分類子がランダムに選択された正のインスタンスを、ランダムに選択された負のインスタンスよりも高くランク付けする確率に等しくなる。

【0091】

いくつかの実施形態では、少なくとも２個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上）のバイオマーカー遺伝子を選択して、第１の状態又は転帰を有する対象と、第２の状態又は転帰を有する対象とを、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の精度で、又は少なくとも約０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５のＣ統計量で見分ける。

【0092】

陽性尤度比の場合、１の値は、「状態」群及び「対照」群の両方の対象で陽性結果が出る可能性が等しいことを示し（例えば、３０日での非生存者及び生存者）、１より大きい値は、前記状態群（例えば、非生存者）で陽性結果が得られる可能性がより高いことを示し、１より小さい値は、前記対照群（例えば、生存者）で陽性結果が得られる可能性がより高いことを示す。この文脈において、「状態」は、１つの特性を有する群（例えば、３０日での非生存）、「対照」は、同じ特性を欠く群（例えば、３０日での生存）を指すことを意味する。陰性尤度比の場合、１の値は、「状態」群及び「対照」群の両方の対象で陰性結果が出る可能性が等しいことを示し、１より大きい値は、前記状態群で陰性結果が得られる可能性がより高いことを示し、１より小さい値は、前記対照群で陰性結果が得られる可能性がより高いことを示す。

【0093】

特定の実施形態では、バイオマーカー又はリスクスコアは、ウイルス感染症及び３０生存転帰を有する対象又はウイルス感染症及び３０日非生存転帰を有する対象におけるバイオマーカーの測定レベルに基づいて計算され、３０日死亡率又はＩＣＵケアの必要性について、高リスクビンに対応する尤度比は、１．５、２、２．５、３、３．５、４、又はそれ以上となるか、低リスクビンに対応する尤度比は、０．１５、０．１０、０．０５、又はそれ以下となる。

【0094】

オッズ比の場合、１の値は、「状態」群及び「対照」群の両方の対象で陽性結果が出る可能性が等しいことを示し、１より大きい値は、前記状態群で陽性結果が得られる可能性がより高いことを示し、１より小さい値は、前記対照群で陽性結果が得られる可能性がより高いことを示す。ＡＵＣのＲＯＣ値の場合、これはＲＯＣ曲線の数値積分によって計算される。この値の範囲は、０．５～１．０である。０．５の値は、分類子（例えば、バイオマーカーレベル）が、症例及び対照（例えば、非生存者及び生存者）を区別できないことを示すが、１．０は完全な診断精度を示す。特定の実施形態では、バイオマーカー遺伝子レベル及び／又はバイオマーカースコアは、少なくとも約１．５以上若しくは約０．６７以下、少なくとも約２以上若しくは約０．５以下、少なくとも約５以上若しくは約０．２以下、少なくとも約１０以上若しくは約０．１以下、又は少なくとも約２０以上若しくは約０．０５以下の陽性尤度比又は陰性尤度比を示すように選択される。

【0095】

特定の実施形態では、バイオマーカー遺伝子レベル及び／又はバイオマーカースコアは、少なくとも約２以上若しくは約０．５以下、少なくとも約３以上若しくは約０．３３以下、少なくとも約４以上若しくは約０．２５以下、少なくとも約５以上若しくは約０．２以下、又は少なくとも約１０以上若しくは約０．１以下のオッズ比を示すように選択される。特定の実施形態では、バイオマーカー遺伝子レベル及び／又はバイオマーカースコアは、０．５より大きい、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは０．７、さらにより好ましくは少なくとも０．８、さらにより好ましくは少なくとも０．９、最も好ましくは少なくとも０．９５のＡＵＣのＲＯＣ値を示すように選択される。

【0096】

場合によっては、いわゆる「三分位値」、「四分位値」、又は「五分位値」分析で複数の閾値を決定できる。これらの方法では、「罹患」群及び「対照」群（又は「高リスク」及び「低リスク」）群は、まとめて単一の集団と見なされ、３、４、又は５（又はそれ以上）の個体数が等しい「ビン」に分割される。これらの「ビン」の２つの間の境界は、「閾値」と見なすことができる。リスク（例えば、特定の診断又は予後）は、被験者がどの「ビン」に分類されるかに基づいて割り当てることができる。特定の実施形態では、被験者は、本発明の方法を使用して得られたリスクスコアに基づいて、３０日死亡率のリスク又はＩＣＵケアを必要とするリスクを参照して、３つのビン、すなわち「低」、「中間」、又は「高」のうちの１つに割り当てられる。例えば、対象は、３０日での推定死亡確率に従って、低尤度（ビン１）、中間尤度（ビン２）、及び高尤度（ビン３）の３つのビンに分類できる。これらのビンは、例えば、尤度比がビン１で＜０．１５、ビン２で０．１５～５、ビン３で＞５となるように定義される。

【0097】

「尤度を評価する（こと）」及び「尤度を決定する（こと）」という語句は、本明細書で使用される場合、当業者が患者における状態（例えば、３０日での生存又は非生存）の存在又は非存在を予測できる方法を指す。当業者は、この語句がその範囲内に、患者に状態が存在するか非存在である確率の増加を含むことを理解するであろう。すなわち、状態が対象において存在するか非存在である可能性が高いということである。例えば、特定の状態にあると識別された個人が実際にその状態にある確率は、「陽性適中率（陽性予測値）」又は「ＰＰＶ」として表すことができる。陽性適中率は、真陽性の数を真陽性及び偽陽性の合計で割った値として計算できる。ＰＰＶは、本明細書に記載の予測方法の特性、並びに分析された集団における状態の有病率によって決定される。統計的アルゴリズムは、状態の有病率を有する母集団における陽性適中率が７０％～９９％の範囲内にあり、例えば少なくとも７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得るように選択することができる。

【0098】

他の例では、特定の状態又は転帰を有さないと識別された個人が実際にはその状態を有さない確率は、「陰性適中率（陰性予測値）」又は「ＮＰＶ」として表すことができる。陰性適中率は、真陰性の数を真陰性及び偽陰性の合計で割った値として計算できる。陰性適中率は、診断若しくは予後の方法、システム、又はコードの特性、並びに分析対象集団における疾患の有病率によって決定される。統計的方法及びモデルは、状態の有病率を有する母集団における陰性適中率が約７０％～約９９％の範囲内にあり、例えば少なくとも約７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得るように選択することができる。

【0099】

いくつかの実施形態では、対象は、特定の状態又は転帰を有するか有さない有意確率を有すると判断される。「有意確率」とは、対象が、特定の状態又は転帰を有するか有さない妥当な確率（０．６、０．７、０．８、０．９、又はそれ以上）を有することを意味する。

【0100】

いくつかの実施形態では、バイオマーカースコアは、ＳＯＦＡ、ｑＳＯＦＡ、又はＡＰＡＣＨＥなどの１又は複数の臨床リスクスコアと組み合わされる。例えば、数式を使用して、（ｉ）個々の遺伝子発現値又は遺伝子発現値を使用する分類子からの出力のいずれかを、（ｉｉ）臨床リスクスコアと組み合わせて、（ｉｉｉ）臨床医にとって有用な新しいスコアを生成する。

【0101】

ＶＩ．治療の決定
本明細書に記載の方法を使用して、３０日死亡率又はＩＣＵケアの必要性の相対リスクに従って、ウイルス感染症を有する対象を分類することができる。特定の実施形態では、対象は、高リスク、低リスク、又は中間リスクを有するものとして分類される。高リスクの３０日死亡率における対象は、直ちに集中治療を受ける必要がある。例えば、本明細書に記載の方法により、高リスクの３０日死亡率を有すると特定された患者は、治療のために直ちにＩＣＵに送られ得るが、低リスクの３０日死亡率を有すると特定された患者は、救急治療室環境から退院としてもよく、例えば、自己隔離及びさらなるモニタリングのために退院したり、通常の病棟で治療したりすることができる。患者及び臨床医の双方が、死亡率リスクのより良い推定から利益を得ることができる。これにより、患者の優先傾向及び救命措置に関する選択についてタイムリーな議論が可能になる。患者のより良い分子表現型解析は、１）薬物及び介入のための患者選択、及び２）対象死亡率の観察対期待比の評価の両方において、臨床試験の改善も可能にする。３つのリスククラス（「低」、「中間」又は「不確定」、及び「高」）の要約、並びに各クラスの例示的な治療又はトリアージの決定を図４に示す。本明細書で使用される場合、「緊急医療」は、ウイルス感染症の何らかの側面又は症状を緩和、排除、進行を遅らせる、又は何らかの方法で改善するために、救急治療室又は緊急医療における対象の治療に関して実施される任意の行動を含み、治療剤の投与、臓器支持療法の実施、及びＩＣＵへの入院が挙げられるが、これらに限定されない。

【0102】

高リスクの３０日以内の死亡率を有すると特定された患者のＩＣＵ治療には、身体機能の継続的なモニタリングと、正常な身体機能を回復するための生命維持装置及び／又は投薬の提供が含まれる場合がある。ＩＣＵ治療は、例えば、呼吸を補助する人工呼吸器、身体機能をモニタリングするための機器（例えば、心拍数と脈拍数、肺への気流、血圧及び血流、中心静脈圧、血液中の酸素量、並びに体温）、ペースメーカー、除細動器、透析機器、静脈ライン、栄養チューブ、吸引ポンプ、ドレーン、及び／又はカテーテルを使用すること、及び／又は生命を脅かす状態（例えば、敗血症、重度の外傷、又は火傷）を治療するための様々な薬剤の投与を含み得る。ＩＣＵ治療は、疼痛を軽減するための１又は複数の鎮痛薬、及び／又は睡眠を誘発するか不安を軽減するための鎮静薬、及び／又は医学的に昏睡を誘発するためのバルビツール酸塩（例えば、ペントバルビタール又はチオペンタール）の投与をさらに含み得る。

【0103】

特定の実施形態では、ウイルス感染症と診断された重症患者に、広域スペクトル抗ウイルス剤などの抗ウイルス剤、抗ウイルスワクチン、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）（Ｒｅｌｅｎｚａ（商標）（リレンザ））及びオセルタミビル（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）（タミフル）））、ヌクレオシド類似体（例えば、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）（ＡＺＴ）、及びラミブジン（Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ））、アンチセンス抗ウイルス剤（例えば、ホスホロチオエートアンチセンス抗ウイルス剤（例えば、サイトメガロウイルス網膜炎に対するホミビルセン（Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ））、モルホリノアンチセンス抗ウイルス剤）、ウイルスアンコーティングの阻害剤（例えば、インフルエンザに対するアマンタジン（Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）及び、リマンタジン（Ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ライノウイルスに対するプレコナリル（Ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ））、ウイルス侵入の阻害剤（例えば、ＨＩＶに対するフゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ））、ウイルス集合阻害剤（例えば、リファンピシン）、又は免疫系を刺激する抗ウイルス剤（例えば、インターフェロン類）の治療有効量をさらに投与する。抗ウイルス剤の例としては、アバカビル（Ａｂａｃａｖｉｒ）、アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アデホビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）、アマンタジン（Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）、アンプレナビル（Ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、アンプリジェン（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）、アルビドール（Ａｒｂｉｄｏｌ）、アタザナビル（Ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、アトリプラ（Ａｔｒｉｐｌａ）（固定用量薬）、バラビル（Ｂａｌａｖｉｒ）、シドフォビル（Ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、コンビビル（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ）（固定用量薬）、ドルテグラビル（Ｄｏｌｕｔｅｇｒａｖｉｒ）、ダルナビル（Ｄａｒｕｎａｖｉｒ）、デラビルジン（Ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）、ジダノシン（Ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、ドコサノール（Ｄｏｃｏｓａｎｏｌ）、エドクスジン（Ｅｄｏｘｕｄｉｎｅ）、エファビレンツ（Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、エムトリシタビン（Ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）、エンフビルチド（Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、エンテカビル（Ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、エコリエベル（Ｅｃｏｌｉｅｖｅｒ）、ファムシクロビル（Ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）、固定用量薬の組み合わせ（抗レトロウイルス薬）、ホミビルセン（Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、ホスアンプレナビル（Ｆｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、ホスカルネット（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）、ホスホネット（Ｆｏｓｆｏｎｅｔ）、融合阻害剤、ガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、イバシタビン（Ｉｂａｃｉｔａｂｉｎｅ）、イムノビル（Ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン（Ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、インジナビル（Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、イノシン（Ｉｎｏｓｉｎｅ）、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、インターフェロン、ラミブジン（Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、ロピナビル（Ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）、ロビリド（Ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、マラビロク（Ｍａｒａｖｉｒｏｃ）、モロキシジン（Ｍｏｒｏｘｙｄｉｎｅ）、メチサゾン（Ｍｅｔｈｉｓａｚｏｎｅ）、ネルフィナビル（Ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、ネビラピン（Ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、ネクサビル（Ｎｅｘａｖｉｒ）、ニタゾキサニド（Ｎｉｔａｚｏｘａｎｉｄｅ）、ヌクレオシド類似体、ノビル（Ｎｏｖｉｒ）、オセルタミビル（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）（タミフル））、ペグインターフェロンα－２ａ、ペンシクロビル（Ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ペラミビル（Ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）、プレコナリル（Ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル（Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ）、逆転写酵素阻害剤、リバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、リマンタジン（Ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）、リトナビル（Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、ピラミジン（Ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル（Ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、ソホスブビル（Ｓｏｆｏｓｂｕｖｉｒ）、スタブジン（Ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、相乗的増強剤（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｒ）（抗レトロウイルス薬）、テラプレビル（Ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ）、テノホビル（Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）、テノホビルジソプロキシル（Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ）、チプラナビル（Ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）、トリフルリジン（Ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トリジビル（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、トロマンタジン（Ｔｒｏｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ツルバダ（Ｔｒｕｖａｄａ）、バラシクロビル（Ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｖａｌｔｒｅｘ（バルトレックス））、バルガンシクロビル（Ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ビクリビロク（Ｖｉｃｒｉｖｉｒｏｃ）、ビダラビン（Ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、ビラミジン（Ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン（Ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）（Ｒｅｌｅｎｚａ（商標）（リレンザ））、及びジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）が挙げられる。投与され得る他の薬剤には、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、レムデシビル（Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ）、アジスロマイシン（Ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、及びスタチンが挙げられる。

【0104】

いくつかの実施形態では、ウイルス感染症と診断された重症患者に、アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）、アベチムス（Ａｂｅｔｉｍｕｓ）、アブリルマブ（Ａｂｒｉｌｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、アレファセプト（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）、アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）、アンデカリキシマブ（Ａｎｄｅｃａｌｉｘｉｍａｂ）、アニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）、抗リンパ球グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン、葉酸拮抗薬、アポリズマブ（Ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、アプレミラスト（Ａｐｒｅｍｉｌａｓｔ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、アザチオプリン（Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベラタセプト（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルティリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、ブレセルマブ（Ｂｌｅｓｅｌｕｍａｂ）、ブリシビモド（Ｂｌｉｓｉｂｉｍｏｄ）、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、クロロキン、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、コルチコステロイド、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、エルデルマブ（Ｅｌｄｅｌｕｍａｂ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エマパルマブ（Ｅｍａｐａｌｕｍａｂ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フレチクマブ（Ｆｌｅｔｉｋｕｍａｂ）、フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲボキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）、ギルべツマブ（Ｇｉｌｖｅｔｍａｂ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、グセルクマブ（Ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、グスペリムス（Ｇｕｓｐｅｒｉｍｕｓ）、ヒドロキシクロロキン、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、免疫グロブリンＥ、イネビリズマブ（Ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラムパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、ラナデルマブ（Ｌａｎａｄｅｌｕｍａｂ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レフルノミド（Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、レマルソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レナリドミド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、レンジルマブ（Ｌｅｎｚｉｌｕｍａｂ）、ラルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レトリズマブ（Ｌｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ルリズマブペゴル（Ｌｕｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、ムロモナブ－ＣＤ３（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３）、ミコフェノール酸、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オヅリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オレクルマブ（Ｏｌｅｃｌｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パムレブルマブ（Ｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、ＰＤＥ４阻害剤、ペグスネルセプト（Ｐｅｇｓｕｎｅｒｃｅｐｔ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペキセリズマブ（Ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピメクロリムス（Ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、プロザリズマブ（Ｐｌｏｚａｌｉｚｕｍａｂ）、ポマリドミド（Ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリン合成阻害剤、ピリミジン合成阻害剤、キリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リダホロリムス（Ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、リロナセプト（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シプリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スルファサラジン（Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、タリズマブ（Ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトックス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、テムシロリムス（Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、テリフルノミド（Ｔｅｒｉｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、テゼペルマブ（Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂ）、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トファシチニブ（Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ウロクプルマブ（Ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、ウミロリムス（Ｕｍｉｒｏｌｉｍｕｓ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボバリリズマブ（Ｖｏｂａｒｉｌｉｚｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゾリモマブアリトックス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、ゾタロリムス（Ｚｏｔａｒｏｌｉｍｕｓ）などの自然免疫又は適応免疫モジュレーター又はｒｈ－インターフェロン－ガンマなどの組換えヒトサイトカインの治療有効量をさらに投与する。

【0105】

いくつかの実施形態では、ウイルス感染症と診断された重症患者に、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＴＲＥＭ－１、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ，又はＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｂ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｍ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０Ａ、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５８Ａ、ＣＤ１５８Ｂ１、ＣＤ１５８Ｂ２、ＣＤ１５８Ｃ、ＣＤ１５８Ｄ、ＣＤ１５８Ｅ１、ＣＤ１５８Ｅ２、ＣＤ１５８Ｆ１、ＣＤ１５８Ｆ２、ＣＤ１５８Ｇ、ＣＤ１５８Ｈ、ＣＤ１５８Ｉ、ＣＤ１５８Ｊ、ＣＤ１５８Ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１８７、ＣＤ１８８、ＣＤ１８９、ＣＤ１９０、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤｗ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１１、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３７、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５０、ＣＤ２５１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５５、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２５９、ＣＤ２６０、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８５、ＣＤ２８６、ＣＤ２８７、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９１、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００Ａ、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１０、ＣＤ３１１、ＣＤ３１２、ＣＤ３１３、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２３、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３０、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、若しくはＣＤ３７１を含む分化のヒトクラスターのいずれかの遮断修飾剤又はシグナル伝達修飾剤の治療有効量をさらに投与する。

【0106】

いくつかの実施形態では、ウイルス感染症と診断された重症患者に、アルブミン、抗血友病グロブリン、ＡＨＦ Ａ、Ｃ１阻害剤、Ｃａ＋＋、ＣＤ６３、クリスマス因子、ＡＨＦ Ｂ、内皮細胞増殖因子、上皮増殖因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブリン安定化因子、ラキ‐ローランド（Ｌａｋｉ－Ｌｏｒａｎｄ）因子、フィブリナーゼ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＧＭＰ３３、ハーゲマン（Ｈａｇｅｍａｎ）因子、高分子量キニノーゲン、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、インターロイキン－１Ｂ、マルチメリン、Ｐ－セレクチン、血漿トロンボプラスチン前駆物質、ＡＨＦ Ｃ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、血小板因子、血小板由来増殖因子、プレカリクレイン、プロアクセルリン、プロコンバーチン、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｍ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、スチュアート・プロワー（Ｓｔｕａｒｔ－Ｐｒｏｗｅｒ）因子、ＴＦ、トロンボプラスチン、トロンボスポンジン、組織因子経路阻害剤、トランスフォーミング増殖因子β、血管内皮増殖因子、ビトロネクチン、フォン・ヴィレブランド因子、α２－アンチプラスミン、２－マクログロブリン、β－トロンボグロブリン、又は凝固若しくは血小板活性化カスケードの他のメンバーを標的とするものなど、凝固カスケード又は血小板活性化を変更する１又は複数の薬剤の治療有効量をさらに投与する。

【0107】

ＶＩＩ．キット及びシステム
Ａ．キット
一態様では、本明細書に記載のバイオマーカーを検出するために使用することができる、対象における死亡率の予後診断のためのキットが提供される。例えば、前記キットを使用して、本明細書に記載のバイオマーカーのうちの任意の１又は複数を検出することができ、これらは、ウイルス感染症を有する対象の３０日生存者及び３０日非生存者からの試料において差次的に発現される。前記キットは、バイオマーカーの検出のための１又は複数の薬剤、ウイルス感染症が疑われるヒト対象から分離された生体試料を保持するための容器、及び前記生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの存在又は量を検出するために、前記生体試料又は前記生体試料の一部と前記薬剤を反応させるための印刷された説明書を含み得る。前記薬剤は別々の容器に包装されていてもよい。前記キットは、ＰＣＲ、等温増幅、イムノアッセイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、又はマイクロアレイ分析を実行するための１又は複数の対照の参照試料及び試薬、例えば、３０日生存又は非生存の転帰を有する対象からの参照試料をさらに含み得る。前記キットはまた、本明細書の装置のいずれかを実行するための１又は複数のデバイス又は器具、例えば、９６ウェルプレート、マイクロ流体カートリッジ、単一ウェルマルチプレックスアッセイなどを含んでいてもよい。

【0108】

特定の実施形態では、前記キットは、目的の少なくとも５個又は６個のバイオマーカーのレベルを測定するための薬剤を含む。例えば、前記キットは、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＤＥＦＡ４ポリヌクレオチド、ＬＹ８６ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、及びＨＫ３ポリヌクレオチドを含むパネルのバイオマーカーを検出するための薬剤、例えば、プライマー及び／又はプローブを含み得る。いくつかの実施形態では、前記パネルは、ＨＬＡ－ＤＰＢ１をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記パネルは、表１又は表５に記載されているバイオマーカーのいずれか１又は複数を含む。いくつかの実施形態では、前記パネルは、表３又は表６に記載されているバイオマーカーの任意の１又は複数のペアを含む。

【0109】

特定の実施形態では、前記キットは、複数のバイオマーカーポリヌクレオチドの分析のためのマイクロアレイ又は他の固体支持体を含む。前記キットに含まれる例示的なマイクロアレイ又は他の支持体は、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＤＥＦＡ４ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＬＹ８６ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＫ３ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、ＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記マイクロアレイ又は他の支持体は、表１及び表５に列挙されるバイオマーカー、又は表３及び表６に列挙されるバイオマーカー対を含む、本明細書に記載の方法を使用して検出されるバイオマーカーのそれぞれに対するオリゴヌクレオチドを含む。

【0110】

前記キットは、前記キットに含まれる組成物用の１又は複数の容器を含み得る。組成物は、液体形態であってもよく、又は凍結乾燥されてもよい。前記組成物に適した容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、及び試験管が含まれる。容器は、ガラスやプラスチックなど、様々な素材から形成され得る。前記キットはまた、ウイルス感染症を診断又は評価する方法についての説明書を含む添付文書を含み得る。

【0111】

Ｂ．バイオマーカーの発現を検出及び記録するための測定システム
一態様では、測定システムが提供される。そのようなシステムは、例えば、試料中のバイオマーカー遺伝子発現の検出、及び検出から得られたデータの記録を可能にする。次いで、格納されたデータを本明細書の他の場所で説明したように分析して、対象のウイルス感染状態を決定することができる。そのようなシステムは、論理システム（検出器からのデータを取得、変換、分析、又は別の方法で処理するためのコンピューター又は他のシステム又はデバイスなど）にデータを送信できるアッセイシステム（例えば、アッセイデバイス及び検出器を含む）を含み得る。前記論理システムは、前記アッセイシステムなどのシステム全体の要素を制御すること、記憶装置又は外部メモリにデータ又は他の情報を送信すること、及び／又は治療装置にコマンドを発行することを含む、複数の機能のうちの任意の１又は複数を有し得る。

【0112】

例示的な測定システムを図１６に示す。図示のシステムは、アッセイ装置１６１０内に無細胞ＤＮＡ分子などの試料１６０５を含み、試料７０５に対してアッセイ１６０８を実行することができる。例えば、試料１６０５をアッセイ１６０８の試薬と接触させて、物理的特性１６１５のシグナルを提供することができる。アッセイ装置の例は、アッセイのプローブ及び／又はプライマーを含むフローセル、又は（アッセイを含む液滴とともに）液滴が移動するチューブであり得る。前記試料からの物理的特性１６１５（例えば、蛍光強度、電圧、又は電流）は、検出器１６２０によって検出される。検出器１６２０は、データシグナルを構成するデータ点を取得するために、一定間隔で（例えば、定期的な間隔で）測定を行うことができる。一実施形態では、アナログ・デジタル変換器は、前記検出器からのアナログシグナルをデジタル形式に複数回変換する。アッセイ装置１６１０及び検出器１６２０は、アッセイシステム、例えば、本明細書に記載の実施形態に従ってバイオマーカー遺伝子発現を測定する増幅及び検出システムを形成することができる。データシグナル１６２５は、検出器１６２０から論理システム１６３０に送られる。一例として、データシグナル１６２５を使用して、選択されたバイオマーカーの発現レベルを決定することができる。データシグナル１６２５は、同時に実行される様々な測定、例えば、試料１６０５の異なる分子に対する異なる色の蛍光色素又は異なる電気シグナルを含み得るため、データシグナル１６２５は、複数のシグナルに対応し得る。データシグナル１６２５は、ローカルメモリ１６３５、外部メモリ１６４０、又は記憶装置１６４５に格納され得る。システム１６００はまた、対象に治療を提供することができる治療装置１６６０を含んでいてもよい。治療装置１６６０は、治療を決定する及び／又は治療を行うために使用することができる。このような治療の例には、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、及び幹細胞移植が含まれ得る。論理システム１６３０は、例えば、本明細書に記載の方法の結果を提供するために、治療装置１６６０に接続されていてもよい。治療装置は、撮像デバイスなどの他のデバイスからの入力及びユーザー入力（例えば、ロボットシステムに対する制御など、治療を制御するため）を受信してもよい。

【0113】

本明細書に記載の方法のある態様は、工程を実行するように構成され得る１又は複数のプロセッサを含むコンピューターシステムで全体的又は部分的に実行されてもよい。したがって、実施形態は、本明細書に記載の方法の工程を実行するように構成されたコンピューターシステムを対象とし、場合によっては、それぞれの工程又は工程群を実行する異なるコンポーネントを伴う。本開示のコンピューターシステムは、上述の測定システムの一部であってもよいし、任意の測定システムから独立していてもよい。いくつかの実施形態では、本開示は、入力されたバイオマーカー発現（及び所望により他の）データに基づいてウイルススコアを計算し、対象の３０日死亡率リスクを決定するコンピューターシステムを提供する。

【0114】

例示的なコンピューターシステムを図１７に示す。いずれのコンピューターシステムも、任意の適切な数のサブシステムを利用することができる。いくつかの実施形態では、コンピューターシステムは単一のコンピューター装置を含み、サブシステムはコンピューター装置のコンポーネントであり得る。他の実施形態では、コンピューターシステムは、それぞれがサブシステムであり、内部コンポーネントを有する複数のコンピューター装置を含み得る。コンピューターシステムには、デスクトップコンピューター及びラップトップコンピューター、タブレット、携帯電話、並びにその他のモバイルデバイスが含まれ得る。図１７に示されるサブシステムは、システムバス１７５を介して相互接続される。プリンタ１７４、キーボード１７８、記憶装置１７９、ディスプレイアダプタ１８２に結合されたモニター１７６（例えば、ＬＥＤなどのディスプレイスクリーン）などの追加のサブシステム、及びその他が示されている。入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ１７１に結合する周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート１７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などの当技術分野で公知の任意の数の手段によってコンピューターシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート１７７又は外部インターフェース１８１（例えばイーサネット、Ｗｉ－Ｆｉなど）を使用して、コンピューターシステム１８０をインターネット、マウス入力デバイス、又はスキャナなどの広域ネットワークに接続することができる。システムバス１７５を介した相互接続により、中央処理装置１７３は、各サブシステムと通信し、システムメモリ１７２又は記憶装置１７９（例えば、ハードドライブなどの固定ディスク又は光ディスク）からの複数の指示の実行並びにブシステム間の情報交換を制御することができる。前記システムメモリ１７２及び／又は前記記憶装置１７９は、コンピューター可読媒体を具現化し得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計などのデータ収集装置１８５である。本明細書で言及されるデータのいずれも、あるコンポーネントから別のコンポーネントに出力することができ、またユーザーに出力することができる。コンピューターシステムは、複数の同じコンポーネント又はサブシステムを含むことができ、例えば、外部インターフェース１８１によって、内部インターフェースによって、又は１つのコンポーネントから別のコンポーネントに接続及び取り外し可能な記憶装置を介して一緒に接続される。いくつかの実施形態では、コンピューターシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワークを介して通信できる。このような場合、１台のコンピューターをクライアントと見なし、別のコンピューターをサーバーと見なすことができ、それぞれが同じコンピューターシステムの一部となり得る。クライアント及びサーバーにはそれぞれ、複数のシステム、サブシステム、又はコンポーネントを含めることができる。

【0115】

一態様では、本開示は、ウイルス感染症を有する患者の３０日死亡率リスクを決定するためのコンピューター実施方法を提供する。前記コンピューターは、例えば、患者からの生体試料中の１又は複数のバイオマーカーのレベルの値を含む入力された患者データを受け取ること、１又は複数のバイオマーカーのレベルを分析し、所望によりそれらをそれぞれの参照値、例えば、正規化のためのハウスキーピング参照遺伝子と比較すること、前記バイオマーカーのレベルに基づいて前記患者の３０日死亡率スコアを計算し、前記スコアを１又は複数の閾値と比較して、前記患者をリスクカテゴリーに割り当てること、並びに前記患者の死亡率リスクに関する情報を表示すること、を含む工程を実施する。特定の実施形態では、前記入力された患者データは、患者からの生体試料中の複数のバイオマーカーのレベルの値を含む。一実施形態では、前記入力された患者データは、ポリヌクレオチドであるＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３のレベルの値を含む。一実施形態では、前記入力された患者データは、ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、ＨＫ３、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１のレベルの値を含む。

【0116】

さらなる態様では、説明したように、コンピューターで実施される方法を実行するための診断システムが提供される。診断システムは、プロセッサ、記憶コンポーネント（すなわち、メモリ）、表示コンポーネント、及び汎用コンピューターに典型的に存在する他のコンポーネントを含むコンピューターを含み得る。前記記憶コンポーネントは、前記プロセッサによって実行され得る指示及び前記プロセッサによって検索、操作、又は記憶され得るデータを含む、前記プロセッサによってアクセス可能な情報を格納する。

【0117】

前記記憶コンポーネントには、前記対象の死亡率リスクを決定するための指示が含まれている。例えば、前記記憶コンポーネントは、本明細書に記載されるように、バイオマーカー発現レベルに基づいて対象の死亡率の遺伝子スコアを計算するための指示を含む。また、前記記憶コンポーネントは、多変量線形判別分析（ＬＤＡ）、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析、主成分分析（ＰＣＡ）、アンサンブルデータマイニング法、細胞特異的マイクロアレイ有意性分析（ｃｓＳＡＭ）、又は多次元タンパク質同定技術（ＭＵＤＰＩＴ）による分析を実施するための指示をさらに含み得る。前記コンピュータープロセッサは、前記記憶コンポーネントに結合され、患者データを受け取り、１又は複数のアルゴリズムに従って患者データを分析するために、前記記憶コンポーネントに格納された前記指示を実行するように構成される。表示コンポーネントは、前記患者の診断及び／又は予後（例えば、死亡率リスク）に関する情報を表示する。前記記憶コンポーネントは、ハードドライブ、メモリカード、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュドライブ、書き込み可能メモリ、及び読み取り専用メモリなど、プロセッサによってアクセス可能な情報を格納できる任意のタイプのものであり得る。

【0118】

前記指示は、前記プロセッサによって直接（マシンコードなど）又は間接的に（スクリプトなど）実行される指示の任意のセットであり得る。その点で、「指示」、「工程」、及び「プログラム」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。前記指示は、前記プロセッサによる直接処理用のオブジェクトコード形式で格納することも、オンデマンドで解釈されるか事前にコンパイルされるスクリプト又は独立したソースコードモジュールのコレクションを含む任意の他のコンピューター言語で格納することもできる。

【0119】

データは、指示に従って前記プロセッサによって検索、保存、又は変更される場合がある。例えば、前記診断システムは特定のデータ構造に限定されないが、前記データは、複数の異なるフィールド及びレコードを有するテーブル、ＸＭＬ文書、又はフラットファイルとしてリレーショナルデータベース内のコンピューターレジスタに格納され得る。前記データは、バイナリ値、ＡＳＣＩＩ、又はユニコード（Ｕｎｉｃｏｄｅ）などのコンピューター可読形式でフォーマットすることもできるが、これらに限定されない。さらに、前記データは、数値、説明テキスト、専用のコード、ポインタ、他のメモリ（他のネットワークの場所を含む）に格納されたデータへの参照、又は関連する情報を計算する関数によって使用される情報など、関連する情報を識別するのに充分な情報を含み得る。特定の実施形態では、前記プロセッサ及び前記記憶コンポーネントは、同じ物理的ハウジング内に格納されていても格納されていなくてもよい複数のプロセッサ及び記憶コンポーネントを含み得る。例えば、指示及びデータの一部は取り外し可能なＣＤ－ＲＯＭに格納され、その他は読み取り専用のコンピューターチップに格納される。前記指示及びデータの一部又は全ては、プロセッサから物理的に離れた場所に格納されていても、プロセッサからアクセス可能であり得る。同様に、前記プロセッサは、並列に動作してもよく、しなくてもよいプロセッサの集合を実際に含む場合がある。一態様では、コンピューターは、１又は複数のクライアントコンピューターと通信するサーバーである。各クライアントコンピューターは、プロセッサ、記憶コンポーネント、及び指示を使用して、サーバーと同様に構成され得る。クライアントコンピューターは、フルサイズのパーソナルコンピューターを含む場合があるが、前記システム及び方法の多くの側面は、インターネットなどのネットワークを介してサーバーと無線でデータを交換可能なモバイルデバイスに関連して使用される場合に特に有利である。

【0120】

ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、請求された開示を説明するために提示されるが、限定するものではない。

【0121】

Ａ．実施例１．２７個のコホートデータのゲノム規模での解析。
宿主応答におけるウイルスの重症度に対するシグネチャ遺伝子同定の実現可能性を評価するために、８５６人のウイルス感染患者のゲノム規模での遺伝子発現データを調べた。上位１５個の遺伝子を選択し、それらの２遺伝子対を、非生存症例と生存症例とを区別するために評価した。

【0122】

１．データセット
細菌感染症及びウイルス感染症と健康な対照（ＩＭＸ１１）とを含む４２の研究からの５，２１７人の患者の血液遺伝子発現データのコレクションを使用した。このゲノム規模でのｍＲＮＡプロファイルには１３，９０２個の遺伝子が含まれており、複数のプラットフォームで充分にテストされたＣＯＣＯＮＵＴ法を使用して相互正規化した。２７のコホートから８５６人の患者の全てのウイルス症例を選択した。これらの８５６人の患者のうち、６９１人は２８日又は３０日以内の生存、４人は２８日又は３０日以内の非生存、１６１人は不明として注釈を付している。このウイルス重症度分析は、４つの非生存例（陽性）と６９１の生存例（陰性）との間の２群比較のために実行した。

【0123】

２．方法
目的の遺伝子を選択するために、２群を対比するためのいくつかの測定基準を非生存症例対生存症例に適用した。測定基準には、ピアソン相関、ケンドール順位相関、スピアマン順位相関、ｔ検定、及びその他のノンパラメトリック尺度が含まれる。２群間の極端に不均衡な症例数（４対６９１）を考慮すると、非生存群のオーバーサンプリングも生存群のアンダーサンプリングも確実に適用することはできない。各試験で推定した有意性は、分析的に多重度補正又は順列のいずれかを使用して、主に遺伝子をランク付けし、少数の非生存症例によって大幅に制限された統計的検出力を考慮してカットオフ値を提案する目的で使用した。

【0124】

３．結果
大まかな有意性推定に基づいて、各測定基準から上位の遺伝子の結果を調べた。様々な測定基準の上位遺伝子が非常に重複しており、使用されている様々な測定基準間である程度一致した結果を示していることが判明した。したがって、発見的（ヒューリスティクス）に２つの方法のみから上位１０個の遺伝子を選択することにした。数値に基づく試験カテゴリーを表すピアソン相関及びランクに基づく試験カテゴリーを表すケンドール相関により、合計１５個の遺伝子が得られる。

【0125】

ウイルスの重症度の予測に関してこれら１５個の遺伝子のパフォーマンスを確認するために、全ての患者のこれら１５個の遺伝子のそれぞれからの遺伝子発現測定値を予測因子として使用し、表１に示すＡＵＲＯＣ値を計算した（０．８９８～０．９９４）。

【0126】

次に、各対の幾何平均を予測スコアとして使用して、これらの１５遺伝子から２遺伝子組み合わせをそれぞれ評価し、それらのＡＵＲＯＣ（０．９４０～０．９９８）を計算した。そのような１０５個の遺伝子対の２つの例を図１に示す。全１０５対からの全ＡＵＲＯＣの分布を図２Ｂに示す。２遺伝子対のそれぞれのＡＵＲＯＣを表３に示す。

【0127】

また、表１のランク付け順序に基づいて、１つの遺伝子から始まり、最大１５個の遺伝子を再帰的に追加する一連のモデルの予測スコアとして幾何平均を使用してＡＵＲＯＣを計算した。結果を表２に示す（０．９２０～０．９９７）。

【0128】

要約すると、図２Ａ～図２Ｄは、データ中の１３，９０２個の遺伝子のそれぞれがＡＵＲＯＣを計算するために使用される分布（図２Ｄ）と比較して、上記の３つのシナリオ（図２Ａ～図２Ｃ）についてのＡＵＲＯＣのヒストグラムを示す。１５個の選択された遺伝子と１３，９０２個の調べた遺伝子の完全な補完とを含む３つのシナリオ間のＡＵＲＯＣ分布の違いは、１５個の遺伝子を組み合わせて使用する場合を含め、ウイルスの重症度を予測する方法の有効性を強調している。

【0129】

４．検討
利用可能な遺伝子発現データにより、ウイルスの重症度に関連する上位の遺伝子を特定することができた。少ない死亡症例数による制限のため、交差検証の使用やデータセットのトレーニング及び検証セットへの分割などの厳密な戦略を使用することはできなかった。

【0130】

Ｂ．実施例２．急性感染症に関連する２９個の遺伝子の中からのウイルス死亡率マーカーの同定。
１．データ
以前に、公的情報源及び内部研究から、判定された感染状態及び死亡率情報を含む正規化された遺伝子発現データのマルチプラットフォームデータベースをコンパイルした。データには、以前の研究で急性感染症に関連することが判明した２９個の遺伝子の遺伝子発現が含まれていた（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，２０２０ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．１１，Ａｒｔ．１１７７）。

【0131】

ウイルス死亡率予測因子を開発するために、ウイルス感染症と診断され、既知の日数（２８日又は３０日）での死亡状態を有する成人患者に焦点を当てた。ここで、２８又は３０は交換可能で、３０日死亡率と称される場合もある。しかしながら、入手可能なデータでは、ロバストなモデル開発には症例数の割合が低すぎた。この状況を緩和するために、以前に検証された高性能の細菌／ウイルス／非感染分類子の高度なバリアント（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を適用し、３クラス分類子でウイルス感染症の確率が０．５を超える全ての試料を保持した。これにより、ウイルスデータセットのサイズが増加し、７０５個の２９次元試料のトレーニングセットが得られ、死亡率は３．３％（２３試料）であった。このデータを、機械学習ワークフローへの入力として使用した。

【0132】

２．分析
社内機械学習ワークフローをウイルス死亡率トレーニングデータに適用した。データサイズにより、別の検証セットを確保することができなかったが、代わりに、前記ワークフローでは交差検証を使用した。交差検証分割は単一の研究からの試料を含むのに対し、リーブワンスタディアウト（ＬＯＳＯ）アプローチが最もロバストな結果を生み出すことが判明した。感染性疾患診断ドメインのモデル最適化に有効であることが以前に判明したパラメータの検索空間に、ハイパーパラメータチューニングを適用した。検索空間のサイズは、迅速なターンアラウンドのために、そして過剰適合を制限するために１００に固定した。オーバーフィッティングを制限するために、線形分類子のみを調べた：線形カーネルを使用するサポートベクターマシン、ロジスティック回帰、及び線形活性化関数を使用する多層パーセプトロン。

【0133】

ＰＣＲプラットフォームへの転送を容易にするために、５個の遺伝子を標的にして、特徴（遺伝子）選択を適用した。特徴選択は、ランキング測定基準として遺伝子発現と転帰との間のピアソン相関の絶対値を用いた単変量ランキングを使用した。ランキングは、バイアスを最小限に抑えるために交差検証ループ内で実施した。５個の遺伝子の最終的なリストは、交差検証分割間の平均遺伝子ランキングに基づいていた。

【0134】

検証セットがない場合、独立したデータで勝者分類子の受信者動作特性プロットを生成する実際に実行可能な方法はない。代わりに、交差検証に基づいて２つの関連するプロットを生成した。１）各モデルの感度及び偽陽性率とハイパーパラメータ検索中に評価された決定閾値、並びに２）最適なモデルのプールされた交差検証確率に基づくＲＯＣ様プロット。

【0135】

年齢は３０日死亡率の重要な予測因子であり、死亡率の予測因子が年齢に依存しないかどうかを評価することから、予測因子及び年齢を独立変数として、結果を従属変数として、多変量一般化線形二項モデルを当てはめる。

【0136】

３．結果
最適なモデル（ＡＵＲＯＣ０．８９）では、ロジスティック回帰及び以下の遺伝子を使用した：ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、及びＨＫ３。モデル選択ドットプロットを図３Ａに示す。ＡＵＣが最大のハイパーパラメータ構成を選択した。対応するＲＯＣを図３Ｂに示す。年齢は３０日死亡率の重要な予測因子であり、死亡率の予測因子が年齢に依存しないかどうかを評価することから、予測因子及び年齢を独立変数として、多変量一般化線形二項モデルを当てはめる。５遺伝子スコアは有意（Ｐ＜１×１０^－６）であったが、年齢は有意ではなかった（Ｐ＝０．４）。

【0137】

選択したモデルのパフォーマンスをさらに特徴付けるために、３０日での推定死亡確率を３つのビンに分割した：低尤度（ビン１）、中間（又は不確定）尤度（ビン２）、及び高尤度（ビン３）。これらのビンは尤度比がビン１で＜０．１５及びビン３で＞５となるように定義される。最も低いビンは、ＬＲ－０．１、感度９１％（推定ＮＰＶ９９．７％）である。最も高いビンはＬＲ＋５、特異度８９％である。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の場合のプロカルシトニンのオッズ比（ＯＲ）５と比較して、上下のビンの診断オッズ比（ＤＯＲ）は約５０である。よって、ＨｏｓｔＤｘ（商標）ウイルス重症度は、最もリスクの低い群の約７７％の患者の入院を除外すると同時に、入院が最も必要な１３％の患者を特定するために使用され得る（図４）。分割に基づく勝者モデルの交差検証パフォーマンスを表４に示す。

【0138】

表４は、最適モデルの交差検証パフォーマンスの推定値を示す。ＬＲ＝尤度比。率（フラクション）：対応するビンに割り当てられた試料の割合（％）低リスクビンの特異度：低リスクビンに割り当てられた陽性試料の割合（％）。高リスクビンの感度： 高リスクビンに割り当てられた陰性試料の割合（％）。Ｓｅｎｓ＠Ｓｐｅｃ９０：特異度＞９０％である最適モデルの感度。Ｓｐｅｃ＠Ｓｅｎｓ９０：感度＞９０％である最適モデルの特異度。

【0139】

図５は、ウイルス死亡率予測因子を年齢で調整した結果を含む。結果は、予測因子が年齢に関係なく強力な予後情報を含むことを示している。

【0140】

Ｃ．実施例３．５－ｍＲＮＡスコアの検証
５－ｍＲＮＡスコアの前向き検証は、ギリシャのアテネにある１つの病院で行われた。患者は、救急部門でＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２陽性であった場合、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の診断で病院に移送され、挿管された場合に登録された。臨床データは、ＩＣＵケア及び／又は人工呼吸器の必要性、死亡、及びその他の標準的な転帰を含め、３０日で記録された。登録時にＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡチューブに血液を採取し、冷凍してＩｎｆｌａｍｍａｔｉｘ社に発送した。ＲＮＡを抽出し、カスタムコードセットを使用してＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ装置で実行した。正規化後に５遺伝子スコアを計算し、３０日転帰と比較した（図６）。

【0141】

Ｄ．実施例４．リスク層別化のためのＣＯＶＤ－１９患者の全血中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する重篤な反応に関連するバイオマーカーの同定
１．要約
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされたパンデミックに対応して、ゲノム規模での遺伝子発現を使用して、３９非重症例及び２４重症例で構成される６２人のＣＯＶＩＤ－１９患者の血液中の宿主応答を研究した。重症度に関連する３５個の遺伝子を特定し、重症度の予測におけるそれらのパフォーマンスを特徴付けた。一連の遺伝子は、臨床現場でのＣＯＶＩＤ－１９患者のリスク層別化のための予後検査でバイオマーカーとして利用できる。

【0142】

２．データセット
入院後２４時間以内にＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２による市中下気道感染症で前向きに登録された６２人のＣＯＶＩＤ－１９患者のＲＮＡ－Ｓｅｑ（ＲＮＡシーケンス）から収集された全血遺伝子発現データを使用した。コホートには、非重症群（ｎ＝３９）及び重症疾患群（ｎ＝２３、うち６人が死亡）が含まれていた。

【0143】

３．方法
データは、充分に確立されたオープンソースツール（ＦＡＳＴＱＣ、ＳＴＡＲ）を使用して、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｘ社の内部パイプラインで処理した。次いで、統計パッケージＤＥＳｅｑ２を使用して、データを正規化し、差次的に発現する遺伝子をランク付けした。ＤＥＳｅｑ２ は、ＲＮＡ配列決定データから差次的に発現された遺伝子を特定するために特別に設計された、最も一般的に使用されるソフトウェアパッケージの１つである。簡潔には、データの正規化を実行して配列決定及びＲＮＡ組成のバイアスを考慮し、次に各比較群の各遺伝子の分散を推定し、これを使用して負の二項分布に適合させる。遺伝子発現差の有意性は、ワルド（Ｗａｌｄ）検定統計量を使用して評価する。また、遺伝子の数をさらに限定するための基準として、標準化された効果サイズ（ヘッジ（Ｈｅｄｇｅ）のｇ）を使用した。ヘッジのｇは、分散を考慮しているため、効果の大きさのロバストな推定値であり、中程度のサイズのコホートでも効果のロバストな推定値が得られる。

【0144】

４．結果
差次的発現は、倍数変化（ＦＣ）、効果サイズ（ＥＳ）、及びベンジャミーニ＝ホッホベルク（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）補正Ｐ値（Ｐ値調整）の複数の閾値の選択肢で評価した。ＦＣ＞１．５及びＰ値調整＜０．０５で、高い不均一性でも８０％の検出力に相当する閾値で、１，８６５個の差次的に発現する遺伝子を特定した。この数は、アプリケーション開発には実用的ではないため、最も適切なシグナルに焦点を当てるために、Ｐ値調整＜０．００５及び｜ＥＳ｜＞１．３（２のＦＣに相当）でよりストリンジェントなカットオフを使用することを選択した。これらの閾値で、４７９個の遺伝子を特定した。重症患者対非重症患者では、３２９個が上方制御され、１５０個が下方制御された。バックグラウンドパフォーマンスレベルを確立するために、最初に、測定された全ての遺伝子について、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）の遺伝子ごとの曲線下面積（ＡＵＣ）を推定した（図７Ａ、ＡＵＣは０．３６～０．８７の範囲内で、中央値は０．６４）。選択した４７９個の遺伝子のＡＵＣは０．７８～０．９３の範囲内で、中央値は０．８４であった（図７Ｂ、図７Ｃ）。

【0145】

次いで、３２９個の上方制御された遺伝子と１５０個の下方制御された遺伝子の上位１０％の最も高度に発現された遺伝子を別々に選択し、３２個の上方制御された遺伝子及び１５個の下方制御された遺伝子、合計４７個の遺伝子が得られた。より高い発現の遺伝子は、多くの場合、本発明者らのアッセイでよりロバストなパフォーマンスであるためである。さらに、６２個のリーブワンアウト（ＬＯＯ）遺伝子選択から６０回以上存在する遺伝子のみを保持することにより、前記リストを３５個に絞り込んだ（図８）。特に、これらの遺伝子は、データの中で最もロバストな選択を表しており、３５個の遺伝子のうち３３個が、可能な６２個のリーブワンアウト選択の全てにおいて存在している。

【0146】

図７Ｄに示すこれらの３５個の遺伝子についての個々のＡＵＣは、０．８２～０．８９の範囲内であり、中央値は０．８４である（表５も参照）。また、３５個の遺伝子のうちの２個の遺伝子の５９５個の組み合わせ全てのパフォーマンスを評価し、それらのＡＵＣを図７Ｅ及び表６に示す。３５個の同定されたバイオマーカー遺伝子の幾何平均差スコア（過剰発現－過少発現）は、最も高いＡＵＣであった（０．９１、図８）。

【0147】

５．検討
ＣＯＶＩＤ－１９は急速に進化するパンデミックである。本発明者らは、知る限りでは、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度が多様なかなりの数の患者からの全血のＲＮＡ－ｓｅｑ遺伝子発現を報告した最初のグループである。これらの６２個の試料により、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度を予測するために使用できる可能性のある遺伝子のコアセットを特定することができ、タイムリーに患者をより迅速かつ正確にトリアージできるようになった。

【0148】

Ｅ．実施例５．非ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染症を有する患者を用いてトレーニングされた６－ｍＲＮＡ宿主応答全血分類子は、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度を正確に予測する
１．序論
急性ウイルス感染症の患者には、血液の宿主免疫応答に基づくｍＲＮＡ予後シグネチャが共有されているという以前の結果に基づいて、ウイルス感染症患者の転帰を予測するための、倹約的かつ臨床的に翻訳可能な遺伝子シグネチャを特定できるという仮説を立てた。２１の独立したデータセットを急性ウイルス感染症患者からの７０５の末梢血トランスクリプトームプロファイルと統合することにより、この仮説をテストし、これらの複数のウイルスデータセットにわたる死亡率予測のための６－ｍＲＮＡ宿主応答に基づくシグネチャを特定した。次に、様々なウイルス感染症（非ＣＯＶＩＤ）の患者の１，４１７の血液トランスクリプトームプロファイルの２１の独立した後ろ向きコホートで、ロックされたモデルを検証した。次に、ＣＯＶＩＤ－１９患者の独立した前向きに収集されたコホートで６－ｍＲＮＡモデルを検証したところ、非ＣＯＶＩＤデータを使用して完全にトレーニングされているにもかかわらず、転帰を予測する能力を示した。本発明者らの結果は、急性ウイルス感染症の転帰に関連する保存された宿主応答があることを示唆している。そして、ＣＯＶＩＤ－１９及びその他の急性ウイルス感染症の患者の管理の改善を支援するために、迅速な分子検査（ＣｏＶｅｒｉｔｙ（商標））にさらに開発されている６－ｍＲＮＡ宿主応答シグネチャの迅速な等温バージョンの有効性を示した。

【0149】

２．材料及び方法
データ収集、キュレーション、及び試料のラベル付け
死亡率データが存在する典型的な急性感染症の研究について、公開リポジトリ（ＮＣＢＩ ＧＥＯ及びＥＢＩ ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ）を検索した。小児の完全に非ウイルスのデータセットを削除した後、２８日又は３０日死亡率情報のいずれかを有する１，８６１人の成人患者からの試料で構成される１７のマイクロアレイ又はＲＮＡｓｅｑ末梢血急性感染症研究を特定した（図１０及び表７）。前述のように、これらのデータセットを処理して共正規化した（１９）。

【0150】

公開されている試料における臨床的に判定されたウイルス感染症及び既知の死亡転帰を有する症例数は、ロバストなモデリングには過少であった。したがって、トレーニング試料の数を増やすために、以前に開発された遺伝子発現に基づく細菌／ウイルス分類子を使用してウイルス感染状態を割り当てた。分類子の精度は臨床判定の精度に近くなる。具体的には、「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｘ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ－Ｖｉｒａｌ Ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ ２」（ＩＭＸ－ＢＶＮ－２）と呼ばれる細菌感染対ウイルス感染の診断に、以前に説明したニューラルネットワークに基づく分類子の更新バージョンを利用した（１８）。この方法は、多くの偽陽性を導入することなく、ウイルス感染症による死亡率試料の数を増やすというアイデアである。全ての試料について、ＩＭＸ－ＢＶＮ－２を適用して細菌又はウイルス感染症の確率を割り当て、ＩＭＸ－ＢＶＮ－２によるウイルス確率が０．５以上の試料を保持した。このウイルス感染症の評価をコンピューター支援判定と称する。１，８６１個の試料のうち、ウイルス感染症のＩＭＸ－ＢＶＮ－２確率＞０．５である３１１個の試料が見つかり、試料中９人の患者が３０日以内の死亡であった。

【0151】

この公開されているマイクロアレイ／ＲＮＡｓｅｑデータに加えて、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒを使用してプロファイリングされた４つの独立したコホート（１９）から３９４個の試料を含めた。その中１４人の患者が死亡していた（表７）。したがって、全体として、ウイルス感染症及び短期死亡転帰のコンピューター支援判定を受けた患者からの２１の独立した研究にわたる７０５個の血液試料を含めた。重要なことに、これらの患者は全員、２０１９年１１月より前に登録されていたため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していなかった。

【0152】

分類子開発のための変数の選択
いくつかの生物学的及び実用的な理由から、分類子を開発するために２９個のｍＲＮＡを事前に選択した。生物学的には、２９個のｍＲＮＡは、重症患者の３０日死亡率を予測するための１１遺伝子セットと、ウイルス対細菌又は非感染性炎症を識別できる繰り返し検証された１８遺伝子セットで構成されている（１７～１９）。したがって、一般化可能なウイルスの重症度シグネチャが可能である場合、適切な（及び事前に精査された）変数がこの場合ある可能性が高いと仮定した。入力変数を制限することで、トレーニングデータへのオーバーフィッティングのリスクも低下させた。実用的な観点からは、まず、これら２９個の遺伝子を３０分未満で測定するための診療現場での（Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ）診断プラットフォームを開発している。これら２９個の遺伝子のサブセットを使用して開発された分類子により、既存のプラットフォームで迅速な診療現場での検査（簡易迅速検査）を開発できるようになる。次に、トレーニングに含まれる２１のコホートのうち４つは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒを使用してこれら２９個の遺伝子をプロファイリングしたＩｎｆｌａｍｍａｔｉｘ社の研究であり、したがって、これらの研究では、これが利用可能な唯一のｍＲＮＡ発現データであった。

【0153】

機械学習を用いた分類子の開発
交差検証（ＣＶ）を使用して７０５個のウイルス試料を分析し、機械学習分類子のランク付けと選択を行った。交差検証の３つのバリアントを調査した：（１）５分割ランダムＣＶ、（２）各分割が複数のスタディを含み、各スタディが正確に１つのＣＶ分割に割り当てられる、５分割グループ付きＣＶ、及び（３）各スタディがＣＶ分割を形成する、リーブワンスタディアウト（ＬＯＳＯ）法。非ランダムＣＶバリアントを含めたのは、特定のデータセットについて、リーブワンスタディアウト交差検証がトレーニング中のオーバーフィッティングを減らし、よりロバストな分類子を生成する可能性があることを最近実証したからである（１９）。ハイパーパラメータ検索空間は、機械学習のベストプラクティス及び感染症診断におけるモデルの最適化における以前の結果に基づいている（２１）。迅速なターンアラウンド及びオーバーフィッティングの低減のために、線形分類子（線形カーネル、ロジスティック回帰、及び線形活性化関数を使用する多層パーセプトロンをサポートするベクターマシン）のみを調査し、検索するハイパーパラメータ構成の数を分類子あたり１０００に制限した。そして、迅速な分子アッセイへの翻訳のための倹約的シグネチャを確保するために、最終モデルの遺伝子数を６に制限した。６個の遺伝子を選択するために、順方向選択及び単変量特徴ランキングを適用した。遺伝子選択プロセスでオーバーフィッティングを回避するためのベストプラクティスに従った（２２、２３）。

【0154】

各ハイパーパラメータ構成に対して交差検証を実施した。各分割内で、遺伝子のピアソン相関の絶対値及びクラスラベル（生存／死亡）を並べ替えた。次に、上位６個の遺伝子を使用して分類子をトレーニングし、それを除外された分割に適用した。前記分割からの予測確率がプールされ、プールされた交差検証確率に対する受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）が、分類モデルをランク付けするための測定基準として使用された。遺伝子の最終ランキングは、ＣＶ分割全体の平均ランキングを使用して決定した。最高ランクのモデルハイパーパラメータが選択され、６個の遺伝子の最終リストが確立されると、トレーニングセット全体及び「ロックされた」ハイパーパラメータを使用して最終モデルがトレーニングされた。対応するモデルの重みはロックされ、最終的な分類子は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の独立した前向きコホートと、ＣＯＶＩＤ－１９を伴わないウイルス感染症患者の独立した後ろ向きコホートとで試験された。

【0155】

後ろ向き非ＣＯＶＩＤ－１９患者コホート
全血又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する３４の独立したコホートの以前に説明したデータベースから試料のサブセットを選択した（２０）。このデータベースから、６遺伝子シグネチャを特定するための分析で使用した全ての試料を削除し、２１の独立したコホート全体で１，４１７個の試料を残した（表１１）。これらのデータセットの試料は、実際の患者集団で観察された生物学的及び臨床的不均一性を表しており、無症候性から致命的なウイルス感染まで幅広い年齢範囲（１２ヶ月未満～７３歳）にわたる重症度の１６の異なるウイルスに感染した健康対照及び患者が含まれた（図９Ａ及び表１１）特に、試料は、患者及びウイルスの多様な遺伝的背景を表す１０か国に登録された患者からのものであった。そして、これらのデータセットは様々な製造元のマイクロアレイを使用してプロファイリングされたため、分析に技術的な不均一性を含めた。

【0156】

生データがＧＥＯデータベースから入手可能である場合、標準的な方法を使用して全てのマイクロアレイデータセットを再正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイのミスマッチプローブを使用して、ＧＣロバストマルチアレイ平均（ｇｃＲＭＡ）をアレイに適用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＧＥ、及びその他の商用アレイの分位正規化に続いて、正規指数バックグラウンド補正を使用した。カスタムアレイを再正規化せず、研究著者によって公開されているように前処理されたデータを使用した。統合分析を容易にするために、各データセットのマイクロアレイプローブをＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ（識別子）にマッピングした。プローブが複数の遺伝子と一致した場合、そのプローブの発現データを拡張して、遺伝子ごとに１つのレコードを追加した。複数のプローブがデータセット内の同じ遺伝子にマッピングされた場合、固定効果モデルを適用した。データセット内で、様々な種類のマイクロアレイでアッセイされたコホートは、独立したものとして扱った。

【0157】

後ろ向き非ＣＯＶＩＤ－１９患者試料の標準化された重症度割り当て
前述のように、１，４１７個の試料のそれぞれに標準化された重症度を使用した（２０）。簡潔には、各データセットについて、原著で定義されている試料表現型を使用した。以下のように、原著の各データセットのコホートの説明に基づいて、各試料に重症度カテゴリーを手動で割り当てた：（１）健康対照：症候性で感染していない健康な個人（２）無症候性又は回復期：イルスに対して検査で陽性を示した無熱性かつ無症候性の個人、又はウイルス感染症から完全に回復し、症状が完全に解消された個人、（３）軽症：来患者として管理された又は救急部門（ＥＤ）から退院したウイルス感染症の症状のある個人、（４）中等症：般病棟に入院し、酸素吸入を必要としなかったウイルス感染症の症状のある個人、（５）重症：原著者によって「重症」と記載された、ウイルス感染症の症状のある個人、酸素吸入のある一般病棟に入院した、又は人工呼吸器や強心薬のサポートを必要とせずに集中治療室（ＩＣＵ）に入院した患者、（６）重篤：ＣＵで人工呼吸器を使用していた、又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症性ショック、又は多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）と診断されたウイルス感染症の症状のある個人、並びに（７）致死：ＩＣＵで死亡したウイルス感染症患者。

【0158】

試料レベルの重症度データを提供しなかったデータセット（ＧＳＥ１０１７０２、ＧＳＥ３８９００、ＧＳＥ１０３８４２、ＧＳＥ６６０９９、ＧＳＥ７７０８７）については、次のように重症度カテゴリーを割り当てた。以下のいずれかの場合に、データセット内の全ての試料を「中等症」に分類した：（１）患者の７０％超が、救急部門（ＥＤ）から退院するのではなく、一般病棟に入院した、（２）一般病棟に入院した患者の２０％未満が酸素吸入を必要とした、又は（３）患者は一般病棟に入院し、原著者によって「軽症」又は「中等症」に分類された。データセット内の全ての試料を「重症」と分類したのは、２０％を超える患者が、（１）一般病棟に入院し、原著者によって「重症」と分類された場合、（２）酸素吸入が必要な場合、又は（３）人工呼吸器なしでＩＣＵへの入院を必要とした場合であった。

【0159】

前向きＣＯＶＩＤ－１９患者コホート
この研究は、２０２０年３月～４月に、ギリシャのアテネにあるＡＴＴＩＫＯＮ 大学総合病院（ＡＴＴＩＫＯＮ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で実施された（２０１９年２月２６日に倫理委員会が承認）。参加者は、呼吸器分泌物中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の分子検出及び下気道への関与の放射線学的エビデンスを伴う、本人又は同意できない患者の場合は１親等近親者によって提供された書面によるインフォームドコンセントを有する成人であった。ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブは、入院から最初の２４時間以内に、その他の標準的な検査パラメータと共に採取された。データ収集には、人口統計情報、臨床スコア（ＳＯＦＡ、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）、検査結果、入院期間、及び臨床転帰が含まれる。患者は３０日間毎日経過観察された。重症疾患は、呼吸不全（ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２比が１５０未満で人工呼吸器が必要）又は死亡と定義された。ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ試料は、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｘ社に送られ、前述のように、ＲＮＡが抽出されＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒを用いて処理された（１９）。６－ｍＲＮＡスコアは、分類子の重みをロックした後に計算した。

【0160】

健康対照
商用ベンダー（ＢｉｏＩＶＴ社）を通じて健康対照から５つの全血試料を取得した。各個人は無熱性であり、口頭でスクリーニングして、試料収集前の３日以内に感染の徴候や症状がないことを確認した。また、口頭でスクリーニングして、現在抗生物質治療を受けていないこと、及び試料収集前の３日以内に抗生物質を服用していないことを確認した。さらに、全ての試料は、分子又は抗体に基づく検査により、ＨＩＶ、西ナイル熱、Ｂ型肝炎、及びＣ型肝炎に対して陰性であることが示された。試料をＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブに採取し、製造元のプロトコルに従って処理した。試料を、－８０℃で保存及び輸送した。

【0161】

迅速等温アッセイ
本発明者らの目標は、迅速なアッセイを作製し、等温反応が従来のｑＰＣＲよりもはるかに高速に実行されることである。したがって、ＬＡＭＰアッセイを、エキソンジャンクションに渡るように設計し、これらの設計基準を満たす少なくとも３つのコア（ＦＩＰ／ＢＩＰ／Ｆ３／Ｂ３）ソリューションを各マーカーについて特定し、ｃＤＮＡの増幅及びｇＤＮＡの排除の成功について評価した。利用可能な場合は、完全なプライマーセットを生成するための最適なコアソリューションのループプライマー（ＬＦ／ＬＢ）を続いて特定した。ソリューションは、ｃＤＮＡ及びＲＮＡの効率的な増幅、ｇＤＮＡに対する選択性、並びに単一の均一な融解ピークの存在に基づいてダウンセレクションした。最終的なプライマーセットを、表１２として添付している。

【0162】

健康、細菌、又はウイルスを含む複数の感染クラスの患者からの６１の血液試料の分析検証パネルを設計した。細菌又はウイルス感染症の患者からの試料のサブセットは、敗血症に進行した感染症の患者からのものであった。全血試料は、採取時に宿主ｍＲＮＡ発現プロファイルの完全性が維持されるＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ安定化バキュテナーで採取された。全ＲＮＡは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡｄｖａｎｃｅ Ｂｌｏｏｄキット及びプロトコルの修正版を使用して、安定化された各血液試料の１．５ｍＬアリコートから抽出された。ＲＮＡを５５℃で５分間熱処理し、定量前に急速冷却した。全ＲＮＡ材料は、三つ組で５個のマーカーを測定するＬＡＭＰ反応全体に均等に分配した。ＬＡＭＰアッセイは、Ｏｐｔｉｇｅｎｅ Ｌｔｄ社が推奨するプロトコルの修正バージョンを使用して行い、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実行した。

【0163】

統計分析
分析は、Ｒバージョン３及びＰｙｔｈｏｎバージョン３．６で実行した。受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）は、有病率に依存したり、特定のカットオフポイントを選択したりすることなく、診断試験の品質の一般的な尺度を提供するため、モデル評価の主要な測定基準として選択された。

【0164】

全ての検証データセット分析では、ロックされた６－ｍＲＮＡロジスティック回帰出力、すなわち、予測確率を使用する。追加マーカーのＡＵＲＯＣ（表９）は、各マーカーの利用可能なデータから計算される。他のマーカーを予測変数として伴う６－ｍＲＮＡ予測確率を含むロジスティック回帰モデルでは、モデルの収束を確実にするために値に条件付き多重代入を使用した。ＡＵＲＯＣは、検証データの乏しいキャリブレーションを検出できない場合があるため（対象のランキングが保持される可能性があるため）、トレーニングデータから選択されたカットオフが、再キャリブレーションの前であっても、検証データで良好な感度及び特異度を維持することも実証した。試料サイズが比較的小さいため、可能な場合は正規性の仮定なしで群間比較を行った（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）の順位和又はマン・ホイットニーのＵ検定）。連続変数については、中央値及び四分位範囲が与えられる。

【0165】

３．結果
最初に、コンピューター支援判定及び利用可能な結果データに基づいて、ウイルス感染症（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外）の７０５人の患者を対象とした２１の研究（２４～３９）を特定した（方法、図１０、及び表７を参照）。これらの研究には、４社の製造元（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ａｇｉｌｅｎｔ社、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ社）のｍＲＮＡプロファイリングプラットフォームを使用して１４か国からのウイルス感染症由来の血液試料をプロファイリングしたため、臨床的、生物学的、及び技術的不均一性の広いスペクトルが含まれていた。各データセット内で、死亡した患者数は非常に少なく（１つの研究を除く全ての研究で２人以下）、充分な試料サイズを有する単一のコホートに依存するバイオマーカー発見の従来のアプローチは効果的ではなかったことを意味する。しかしながら、これらの７０５人の患者全体では充分な症例（試料採取から３０日以内に２３人の死亡）であった。独立したデータセットを統合し、不均一性を活用するための以前に説明したアプローチにより、プールされたデータセット全体で学習することができた（１９、４０、４１）。ｔ－確率的近隣埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）を使用した研究全体に存在する全ての遺伝子を使用した７０５の共正規化試料の可視化は、死亡した患者からの試料と生存した患者からの試料との間に明確な分離がないことを示した（図１１Ａ）。

【0166】

６－ｍＲＮＡロジスティック回帰に基づくモデルは、複数の後ろ向き研究でウイルス患者の死亡率を正確に予測する
分析で採用された線形機械学習アルゴリズム全体で、ロジスティック回帰を使用したモデルは、死亡したウイルス感染症患者を特定するための平均ＡＵＲＯＣが最も高かった。さらに、ロジスティック回帰モデル内では、ランダム交差検証を使用してトレーニングされたモデルは、交差検証の他のバリアントを使用してトレーニングされたモデルよりも正確であった。そして、ＣＶを使用してトレーニングされた様々な６－ｍＲＮＡロジスティック回帰に基づくモデル内で、ＡＵＲＯＣが最も高いモデルは以下の６個の遺伝子を使用した：ＴＧＦＢＩ、ＤＥＦＡ４、ＬＹ８６、ＢＡＴＦ、ＨＫ３、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１。ＡＵＲＯＣは０．８９６であった（９５％ＣＩ：０．８４４～０．９４９）（図１１Ｂ、図１１Ｃ、及び図１４）。６個の遺伝子のそれぞれは、生存したウイルス感染症患者と生存しなかった患者との間で有意に差次的に発現され、死亡した患者では、そのうち３個の遺伝子（ＤＥＦＡ４、ＢＡＴＦ、ＨＫ３）がより高く、３個の遺伝子（ＴＧＦＢＩ、ＬＹ８６、ＨＬＡ－ＤＰＢ１）がより低かった（図１１Ｄ）。交差検証に基づいて、６－ｍＲＮＡロジスティック回帰モデルは、生存した患者から死亡したウイルス感染症患者を区別するために、９１％の感度及び６８％の特異度を示した。６－ｍＲＮＡ分類子と称されるこのモデルを、複数の独立した後ろ向きコホート及び前向きコホートでの検証にそのまま使用した。

【0167】

６－ｍＲＮＡ分類子は、ウイルス感染症患者の年齢に依存しない死亡率の予測因子である
年齢は、呼吸器ウイルス感染症患者の３０日死亡率の重要な予測因子として公知である。トレーニングデータの年齢に関する６－ｍＲＮＡ分類子の新しい予後情報の付加価値を評価するために、年齢及びプールされた交差検証６－ｍＲＮＡ分類子確率を独立変数としてバイナリロジスティック回帰モデルに適合させる。６－ｍＲＮＡスコアは３０日死亡率の増加と有意に関連していたが（Ｐ＜０．００１）、年齢はそうではなかった（Ｐ＝０．０６）。

【0168】

複数の独立した後ろ向きコホートにおける６－ｍＲＮＡ分類子の検証
ロックされた６－ｍＲＮＡ分類子を、１０か国のウイルス感染症患者（健康対照：６６３人、非重症：６７４人、重症：７１人、致死：７人）からの２１の独立したコホートにわたる血液試料の１，４１７のトランスクリプトームプロファイルに適用した（表１１）。６個の遺伝子の発現を使用した１，４１７個の試料の視覚化により、重症転帰を有する患者がより近くに集まっていることが示された（図１２Ａ）。６個の遺伝子のうち、過剰発現遺伝子（ＨＫ３、ＤＥＦＡ４、ＢＡＴＦ）はウイルス感染症の重症度と正の相関があり、過小発現遺伝子（ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＬＹ８６、ＴＧＦＢＩ）は重症度と負の相関があった（図１２Ｂ）。重要なことに、６－ｍＲＮＡ分類子スコアは重症度と正の相関があり、重症又は致死的ウイルス感染症患者では、非重症ウイルス感染症患者又は健康対照よりも有意に高かった（図１２Ｃ）。そして、６－ｍＲＮＡ分類子スコアは、重症ウイルス感染症患者を、非重症ウイルス感染症患者（ＡＵＲＯＣ＝０．９１、９５％ＣＩ：０．８８１～０．９３８）及び健康対照者（ＡＵＲＯＣ＝０．９９８、９５％ＣＩ：０．９９４～１）から区別した（図１２Ｄ）。

【0169】

本発明者らは、ＲＯＣ曲線をプロットして、臨床的に目的とする以下のサブグループにおける６－ｍＲＮＡ分類子の識別能力を評価した：健康対照、非重症例、重症及び致死転帰（図１２Ｄ）。ＣＯＶＩＤ－１９などの一部のウイルス感染症は無症候性である可能性があるため、健康対照が提示される（但し、非重症ウイルス感染症は含めない）。全てのペアワイズ比較は、独立したデータに対する分類子のロバストなパフォーマンスを示し、０．８６（非重症対健康）～１（重症対健康）のＡＵＲＯＣ点推定値を達成した。

【0170】

独立したコホートにおける６－ｍＲＮＡ ロジスティック回帰モデルの前向き検証
ギリシャのアテネで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による肺炎の成人患者９７人を前向きに登録した。非重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患の患者は４７人であったが、５０人は重症ＣＯＶＩＤ－１９であり、そのうち１６人が死亡した（表８）。興味深いことに、６つのｍＲＮＡの発現を使用した低次元でのこれらの試料の視覚化（分類子なし）では、重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患の患者を非重症疾患患者から区別できなかった（図１３Ａ）。非重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患患者における６つのｍＲＮＡの発現を重症疾患患者と比較すると、それぞれの発現はトレーニングデータと同じ方向に統計的に有意に変化した（Ｐ＜０．０５）（図１３Ｂ）。

【0171】

ロックされた６－ｍＲＮＡ分類子を９７人のＣＯＶＩＤ－１９患者及び５人の健康対照に適用した。驚くべきことに、この分類子は、健康対照、非重症ＣＯＶＩＤ－１９の患者、並びに重症ＣＯＶＩＤ－１９及び死亡の患者を区別した（図１３Ｃ）。特に、このモデルは重症呼吸不全患者と非重症患者とを、ＡＵＲＯＣが０．８９で区別した（９５％ＣＩ：０．８２～０．９５、図１３Ｄ）。

【0172】

また、ロジスティック回帰モデルに重症度の他の予測因子（年齢、ＳＯＦＡスコア、ＣＲＰ、ＰＣＴ、乳酸、及び性別）を含めることにより、６－ｍＲＮＡスコアがＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度の独立した予測因子であるかどうかを評価した。予想したように、試料サイズが小さく、マーカー間の相関関係があるため、ＳＯＦＡ以外のマーカーは重症呼吸不全の統計的に有意な予測因子ではなかった（表１３）。

【0173】

臨床応用の場合、ＡＵＲＯＣはマーカーパフォーマンスのより適切な指標である。そのために、ＡＵＲＯＣを使用して６－ｍＲＮＡスコアを重症度の他の臨床パラメータと比較した（表９）。６－ｍＲＮＡスコアは、ＳＯＦＡを除いて、重症呼吸不全及び死亡の最も正確な予測因子であった。ＡＵＲＯＣの信頼区間が重複しているのは、本研究が統計的に有意な差を検出するようになっていないためである。６－ｍＲＮＡスコアが臨床医のベッドサイドでの重症度評価にどのように追加されるかを評価する代わりに、重症呼吸不全の予測について、分類子とＳＯＦＡスコアとの組み合わせがＳＯＦＡ単独よりも改善するかどうかを評価した。２つのスコアを合わせたＡＵＲＯＣは０．９５であった。継続的な純再分類改善度（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｎｅｔ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、ｃＮＲＩ）は、０．４３［９５％ＣＩ：０．０４～０．８１、Ｐ＝０．０３］であった。まとめると、これらの結果は、標準的なリスク予測因子に６－ｍＲＮＡスコアを追加すると、臨床リスク予測が改善される可能性があることを示唆しているが、決定的な結論には、追加の独立したデータでの検証が必要である。

【0174】

臨床報告への翻訳
有用性及び採用を改善するには、直感的で実用的な試験レポートでリスク予測スコアを臨床医に提示する必要がある。そのために、６－ｍＲＮＡスコアを３つのバンドで離散化した：重症転帰の低リスク、中間リスク、及び高リスク。各バンドのパフォーマンス特性を表１０に示す。この表は、２つのバージョンの決定閾値を使用した後ろ向きデータ（健康対照を除く）に対する試験のパフォーマンスを示している：トレーニングデータで最適化された閾値（表１０Ａ）及び後ろ向き試験セットを使用して最適化された閾値（表１０Ｂ）。転帰は重症感染症であった。表１０Ｃ及び表１０Ｄは、重症呼吸不全を転帰として使用した、ＣＯＶＩＤ－１９データの対応する結果を示している。

【0175】

迅速なアッセイへの変換
リスク予測スコアは、臨床ワークフローに適合するのに充分な速さである必要がある。そこで、迅速な６－ｍＲＮＡ試験の概念実証としてＬＡＭＰアッセイを開発した。さらに、健康対照及び様々な重症度の急性感染症からの６１の臨床試料全体で、ＬＡＭＰ ６－ｍＲＮＡスコアと参照ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）６－ｍＲＮＡスコアが非常に高い相関関係にあることを示した（ｒ＝０．９５、図１５）。これらの結果は、さらに最適化することで、６－ｍＲＮＡモデルを臨床アッセイに翻訳して３０分未満で実行できることを実証する。

【0176】

４．検討
２００９年以来４回目のウイルスパンデミックである進行中のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックによる深刻な経済的及び社会的コストは、誰が自宅で隔離して安全に回復できるか、誰が綿密にモニタリングする必要があるかについて、患者を層別化するのに役立つ予後試験の緊急の必要性を強調している。ここでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していないウイルス感染患者からの２１の不均一性研究にわたる７０５の末梢血トランスクリプトームプロファイルを統合した。これらの研究全体でかなりの生物学的、臨床的、及び技術的な不均一性があるにもかかわらず、重症ウイルス感染症患者をそうでない患者から区別する６－ｍＲＮＡ宿主応答シグネチャを特定した。この６－ｍＲＮＡモデルの一般化可能性は、まず後ろ向きにプロファイリングされた１，４１７試料の２１の独立した不均一コホートのセットで、次にギリシャのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者の独立した前向きに収集されたコホートで実証された。各検証分析で、６－ｍＲＮＡ分類子は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２を含む感染ウイルスに関係なく、重症転帰を有する患者を、非重症転帰を有する患者から正確に区別した。重要なことに、各分析全体で、６－ｍＲＮＡ分類子はＡＵＲＯＣよって測定された同様の精度を有し、生物学的、臨床的、及び技術的不均一性に対する一般化可能性及びロバストネスを実証している。この研究は、トランスクリプトーム全体の変化の説明ではなく、臨床ツールの開発に焦点を当てていたが、ウイルス感染症全体でのシグネチャの適用可能性は、重症転帰に関連する宿主因子がウイルス感染全体で保存されていることをさらに実証しており、これは最近の大規模分析と一致している（２０）。

【0177】

多くのリスク層別化スコア及びバイオマーカーが存在するが、ウイルス感染症に特化したものはほとんどない。ＣＯＶＩＤ－１９用に特別に設計された最近のモデルのほとんどは、同じ均一なコホートでトレーニング及び検証されており、他のウイルス感染症で試験されていないため、他のウイルスへの一般化可能性は不明である（１４）。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの新しいウイルスが出現すると、その有用性は大幅に制限される。但し、ウイルス感染症に対する宿主応答は保存されており、他の急性症状に対する宿主応答とは異なることを本発明者らは繰り返し実証してきた（１５～２０）。

【0178】

ここでは、以前の結果に基づいて、ウイルス感染症患者で特別にトレーニングされた６－ｍＲＮＡ分類子を開発し、他の既存のバイオマーカーよりも優れたリスク層別化を行った。さらに、ＣＯＶＩＤ－１９のリスク層別化における臨床使用が承認された唯一のアッセイ（血中のＩＬ－６を測定）は、ここで提案した６－ｍＲＮＡモデルを大幅に下回っている。とは言え、重症呼吸不全の予測に関する既存のバイオマーカー（表９）に対するわずかな改善には、統計的有意性を確認するためにより大きなコホートが必要である。６－ｍＲＮＡスコアは名目上ＳＯＦＡよりも悪いが、ＳＯＦＡは計算に２４時間要する一方、６－ｍＲＮＡスコアは３０分で実施でき、トリアージテストとしての有用性を実証している。ＳＯＦＡと組み合わせた相乗効果（正の再分類改善度（ｎｅｔ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、ＮＲＩ））は、６－ｍＲＮＡスコアが臨床ゲシュタルト（ｇｅｓｔａｌｔ）と組み合わせて実践を改善できることも示唆している。６－ｍＲＮＡスコアは、急速な等温定量的ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイとして実践するために削減されており、さらなる開発によりクリニックで実施することが実用的である可能性があることを示唆している。

【0179】

本研究における本発明者らの目標は、根底にある生物学的メカニズムを調べることではなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックにおける予後検査の差し迫ったニーズに対処し、将来のパンデミックへの備えを改善することであった。しかしながら、ｉｍｍｕｎｏＳｔａｔｅｓデータベース（ｍｅｔａｓｉｇｎａｔｕｒｅ．ｋｈａｔｒｉｌａｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）（４２）を使用して、６個の遺伝子のうち５個（ＨＫ３、ＤＥＦＡ４、ＴＧＦＢＩ、ＬＹ８６、ＨＬＡ－ＤＰＢ１）が、単球、骨髄樹状細胞、及び顆粒球を含む骨髄性細胞で高度に発現されていることを見出した。これは、骨髄細胞がウイルス感染に対する保存された宿主応答の主要な供給源であることを実証する最近の結果と一致している（２０）。さらに、本発明者らは以前に、ＤＥＦＡ４が、重症感染症に進行したデングウイルス感染症患者（４３）、及び敗血症患者で死亡率リスクが高い患者（１８）で過剰発現していることを見出した。ＨＬＡ－ＤＰＢ１は、ＨＬＡクラスＩＩβ鎖パラログに属し、細胞外タンパク質由来のペプチドを提示することにより、免疫系で中心的な役割を果たす。クラスＩＩ分子は、抗原提示細胞（Ｂ リンパ球、樹状細胞、マクロファージ）で発現される。重症転帰を伴う患者におけるＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現低下は、抗原提示の機能不全を示唆しており、さらに検討する必要がある。同様に、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）患者と比較して、敗血症患者ではＢＡＴＦが有意に過剰発現し、ＴＧＦＢＩが有意に過少発現している（１５）。そして、末梢血でのＴＧＦＢＩ及びＬＹ８６の低発現は、敗血症患者の死亡率リスクの増加と関連している（１８）。これらの結果は、細菌感染又はウイルス感染に関係なく、感染症の重症転帰に関連する共通の根本的な宿主免疫応答がある可能性があることをさらに示唆している。不均一なデータセット全体にわたる重症感染症患者におけるこれらの遺伝子の一貫した差次的発現は、宿主応答の調節不全を利用して高リスク群と低リスク群とにおける患者を層別化できるという本発明者らの仮説をさらに支持する．

【0180】

本発明者らの研究にはいくつかの制限がある。第一に、本発明者らの研究では、６－ｍＲＮＡシグネチャの発見のために大量の不均一性を含む後ろ向きデータを使用しており、このような不均一性は、分類子の開発において未知の交絡因子を隠す可能性がある。但し、生物学的、臨床的、及び技術的不均一性の提示に成功したことで、診療現場での臨床解釈に適した、一般化可能な予後バイオマーカーの倹約的なセットを特定する推測的な可能性も高まった。第二に、差し迫ったニーズに対する実際的な考慮事項により、事前に選択されたｍＲＮＡのパネルに焦点を当てた。トランスクリプトームデータ全体を使用した同様の分析により、臨床データは少なくなるが、追加のシグネチャが見つかる可能性がある。第三に、線形モデルのみを考慮した。非線形関係を説明するより複雑なモデルは、より正確である可能性があるが、オーバーフィッティングする可能性もある。第四に、これら全てのタイプのパンデミック観察研究に共通する制限は、症状の発症からの時間の影響に関する理解の欠如である。そして、重症転帰に進行するリスクが高い患者をそうでない患者から区別する際の６－ｍＲＮＡモデルの精度をさらに確認するには、さらに大規模な前向きコホートが必要である。

【0181】

全体として、本発明者らの結果は、一旦迅速なアッセイに翻訳され、より大きな前向きコホートで検証されると、この６－ｍＲＮＡ予後スコアが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はインフルエンザなどの他のウイルス感染症の診断後に患者をトリアージするのに役立つ臨床ツールとして使用できることを示している。トリアージの改善により、リソースをより効果的に割り当てながら、罹患率及び死亡率を減らすことができる。重症ウイルス感染症を発症するリスクが高い患者、すなわち、綿密な観察及び抗ウイルス療法から最も恩恵を受けるウイルス感染症患者群を特定することにより、本発明の６－ｍＲＮＡシグネチャは、新たな抗ウイルス療法の評価を目的とした臨床試験における患者の選択及び場合によってはエンドポイント測定の指針にもなり得る。これは、現在のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの状況では特に重要であるが、将来のパンデミックや季節性インフルエンザでも役立つ。

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４２． Ｆ．Ｖａｌｌａｎｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｃｒｏｓｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄａｔａｓｅｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌ－ｍｉｘｔｕｒｅ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｂｉａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９，１－８（２０１８）．
４３． Ｍ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａ ２０－Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｏ Ｓｅｖｅｒｅ Ｄｅｎｇｕｅ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２６，１１０４－１１１１．ｅ１１０４（２０１９）．
４４． Ｌ．Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３，３９７－４０６（２０１４）．

【0182】

特定の実施形態の特定の詳細は、本開示の実施形態の精神及び範囲から逸脱することなく、任意の適切な方法で組み合わせることができる。しかしながら、本開示の他の実施形態は、個々の態様のそれぞれ、又はこれらの個々の態様の特定の組み合わせに関する特定の実施形態を対象とすることができる。

【0183】

本開示の例示的な実施形態の上記の説明は、例示及び説明の目的で提示されたものである。網羅的であること、又は開示を記述された詳細な形式に限定することは意図されておらず、上記の教示に照らして多くの修正及び変形が可能である。

【0184】

「１（つ）（ａ）」、「１（つ）（ａｎ）」、又は「前記（ｔｈｅ）」の引用は、特に反対の指示がない限り、「１又は複数」を意味することを意図している。「又は」の使用は、特に反対の指示がない限り、「排他的又は」ではなく、「包括的又は」を意味することを意図している。「第１」の構成要素への言及は、必ずしも第２の構成要素が提供されることを必要としない。さらに、「第１（の）」又は「第２（の）」構成要素への言及は、明示的に述べられていない限り、言及された構成要素を特定の位置に限定しない。「基づく（ｂａｓｅｄ ｏｎ）」という用語は、「少なくとも部分的に基づく」を意味することを意図している。

【0185】

本明細書で言及される全ての特許、特許出願、刊行物、及び説明は、全ての目的のために参照によりその全体が援用される。いずれも先行技術であると認められない。本出願と本明細書で提供される参考文献との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先するものとする。

【0186】

置換基の群が本明細書で開示される場合、それらの群の全ての個々の要素、並びに置換基を使用して形成され得る全ての部分群及びクラスが別々に開示されることが理解される。マーカッシュ群又は他の群が本明細書で使用される場合、群の全ての個々の要素、並びに群の可能な全ての組み合わせ及び部分的組み合わせが、開示に個別に含まれることが意図される。本明細書で使用される「及び／又は」は、「及び／又は」で区切られたリスト内の項目の１つ、全て、又は任意の組み合わせがリストに含まれることを意味する。例えば、「１、２、及び／又は３」は、「『１』、又は『２』、又は『３』『１及び２』、又は『１及び３』、又は『２及び３』、又は『１、２、及び３』」と等しい。本明細書で範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、又は組成範囲が示されている場合は常に、全ての中間範囲及び部分的範囲、並びに与えられた範囲に含まれる全ての個々の値は、開示に含まれることが意図されている。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【国際調査報告】