▶ モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-16
(54)【発明の名称】新規アンキリンリピート結合タンパク質とその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230609BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230609BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230609BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230609BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230609BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230609BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230609BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230609BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230609BHJP
A61K 38/55 20060101ALI20230609BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230609BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230609BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20230609BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/47
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12P21/02 A
A61P31/14
A61K48/00
A61K38/55
A61P43/00 111
A61K47/64
A61K39/395 P
A61K39/395 S
A61K39/395 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022567265
(86)(22)【出願日】2021-05-06
(85)【翻訳文提出日】2022-12-12
(86)【国際出願番号】 IB2021000320
(87)【国際公開番号】W WO2021224686
(87)【国際公開日】2021-11-11
(31)【優先権主張番号】63/145,192
(32)【優先日】2021-02-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/020,882
(32)【優先日】2020-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/069,174
(32)【優先日】2020-08-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/057,477
(32)【優先日】2020-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/021,024
(32)【優先日】2020-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515146556
【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】アムステュツ パトリック
(72)【発明者】
【氏名】カラブロ ヴァーレリー ペリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァルザー マルセル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA03
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA94
4C076CC29
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE59M
4C076FF31
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA03
4C084BA41
4C084CA53
4C084DC40
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZC201
4C085AA13
4C085AA14
4C085BA71
4C085BB22
4C085CC31
4C085DD62
4C085GG02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045EA20
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、コロナウイルススパイクタンパク質に対する結合特異性を有する１つ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質または核酸を含む医薬組成物、及びコロナウイルス疾患、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の治療におけるそのようなタンパク質、核酸または医薬組成物の使用に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質。
【請求項2】
前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項3】
前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項4】
第２のアンキリンリピートドメインをさらに含む請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質。
【請求項5】
前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項6】
前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、請求項４に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項7】
第３のアンキリンリピートドメインをさらに含む請求項４～６のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質。
【請求項8】
前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項9】
前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、請求項７に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項10】
前記第１、第２、及び第３のアンキリンリピートドメインが、以下のようなアミノ酸配列を含み、Ｎ末端からＣ末端に向かって配置される、請求項７に記載の組換え結合タンパク質：（ｉ）配列番号６、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号４、２、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４、６、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号６、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号７、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号８、４、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号３、６、及び７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号４、１、及び８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号３、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号９、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号９、６、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号３、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１０、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１１、９、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号５、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１、２、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号３、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号６、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号７、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号８、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号６、１０、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号３、１０、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号５、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号９、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号９、６、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号５、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｘ）配列番号６、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘ）配列番号１０、９、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉ）配列番号１１、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号３、７６、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
または（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３、８５、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項11】
前記結合タンパク質がポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、配列番号６８、６９、７９、及び８９～９１からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７～１０のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項12】
前記結合タンパク質がコロナウイルススパイクタンパク質に結合する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項13】
前記スパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項１２に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項14】
前記第１、第２、及び／または第３のアンキリンリピートドメインが、約１００ｎＭ以下の解離定数（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する、請求項１２または１３に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項15】
少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリンリピートドメインが、約１００ｎＭ以下の解離定数（ＫD）でコロナウイルススパイクタンパク質に結合する、前記組換え結合タンパク質。
【請求項16】
少なくとも１つの血清アルブミン結合ドメインをさらに含む、いずれかの先行請求項に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項17】
前記血清アルブミン結合ドメインが、配列番号４７～４９からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項18】
ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質。
【請求項19】
前記ポリペプチドが配列番号３１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項20】
前記ポリペプチドが配列番号３９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項21】
前記ポリペプチドが配列番号７５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項22】
前記ポリペプチドが配列番号８４と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項23】
前記ポリペプチドが配列番号８７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項24】
前記ポリペプチドが配列番号８８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項25】
前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項26】
前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項27】
ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号３１、配列番号３９、配列番号７５、配列番号８４、配列番号８７、または配列番号８８のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質。
【請求項28】
前記結合タンパク質がコロナウイルススパイクタンパク質に結合する、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項29】
前記スパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項２８に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項30】
前記結合タンパク質が、約１００ｎＭ以下の解離定数（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する、請求項２８または２９に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項31】
前記結合タンパク質が、コロナウイルスによる細胞の感染を阻害することができる、請求項１～３０のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項32】
前記結合タンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を阻害することができる、請求項１～３０のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項33】
請求項１～３２のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項34】
前記核酸が、配列番号７０または配列番号７０と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項35】
前記核酸が、配列番号７１または配列番号７１と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項36】
前記核酸が、配列番号７２または配列番号７２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項37】
前記核酸が、配列番号７３または配列番号７３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項38】
前記核酸が、配列番号７４または配列番号７４と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項39】
前記核酸が、配列番号８０または配列番号８０と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項40】
前記核酸が、配列番号８１または配列番号８１と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項41】
前記核酸が、配列番号８２または配列番号８２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項42】
前記核酸が、配列番号８３または配列番号８３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項43】
前記核酸が、配列番号７８または配列番号７８と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項44】
前記核酸が、配列番号８６または配列番号８６と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項45】
前記核酸が、配列番号９２または配列番号９２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項46】
前記核酸が、配列番号９３または配列番号９３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項47】
前記核酸が、配列番号９４または配列番号９４と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項48】
前記核酸が、配列番号９５または配列番号９５と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、請求項３３に記載の核酸。
【請求項49】
請求項３３～４８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項50】
請求項４９に記載の宿主細胞を、前記組換え結合タンパク質が発現する条件下で培養することを含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質を作製する方法。
【請求項51】
請求項１～３２のいずれか１項に記載の組換え結合タンパク質または請求項３３～４８のいずれか１項に記載の核酸と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項52】
対象におけるコロナウイルス感染症を治療する方法であって、前記方法が、請求項１～３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの結合タンパク質の有効量、または請求項３３～４８のいずれか１項に記載の核酸の有効量、または請求項５１に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項53】
対象におけるコロナウイルス感染症を予防する方法であって、前記方法が、請求項１～３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの結合タンパク質の有効量、または請求項３３～４８のいずれか１項に記載の核酸の有効量、または請求項５１に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項54】
対象におけるコロナウイルス感染症を検出する方法であって、前記方法が、ａ）対象から試料を得ることと；
ｂ）前記試料を、請求項１～３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることと；
（ｃ）コロナウイルス感染症の存在を検出することと、を含む、前記方法。
【請求項55】
前記コロナウイルス感染症がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記対象がヒトである、請求項５２～５５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コロナウイルススパイクタンパク質に対する結合特異性を有する１つ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質または核酸を含む医薬組成物、及びコロナウイルス疾患、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の治療におけるそのようなタンパク質、核酸または医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
２８～３２ｋｂのプラス鎖ＲＮＡゲノムを有するＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅは、最大のエンベロープ型ＲＮＡウイルスである。コロナウイルスは、多くのさまざまな哺乳類や鳥類の種に感染する。それらは、呼吸器系、肝臓系、胃腸系、及び神経系のさまざまな急性疾患及び慢性疾患の原因となっている。風邪は、軽度のコロナウイルス感染症の例である。２００３年のＳＡＲＳの大流行と２０１２年のＭＥＲＳの大流行は、どちらもコロナウイルスによって引き起こされた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶとも呼ばれる）は、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルス系統である。
【0003】
コロナウイルスには、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質、及びヌクレオキャプシドタンパク質として知られる４つの構造タンパク質がある。スパイクタンパク質は、細胞侵入に関与するウイルス膜タンパク質である。
【0004】
コロナウイルスは、密にグリコシル化されたスパイクタンパク質を利用して、宿主細胞に侵入する。スパイクタンパク質は３つのサブユニットで構成され、ウイルス膜を宿主細胞膜と融合させるために実質的な構造再編成を受ける準安定融合前立体配座で存在する三量体クラスＩ融合タンパク質である。このプロセスは、Ｓ１サブユニットが宿主細胞受容体に結合するときに誘起される。受容体結合は融合前三量体を不安定化し、Ｓ１サブユニットの脱落とＳ２サブユニットの安定した融合後の立体配座への移行をもたらす。宿主細胞受容体に係合するために、Ｓ１の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、受容体結合の決定基を一時的に隠したり露出したりするヒンジのような立体配座の動きを起こす。これらの２つの状態は、「ダウン」立体配座と「アップ」立体配座と呼ばれ、ダウンは受容体にアクセスできない状態に対応し、アップは受容体にアクセスできる状態に対応し、安定性が低いと考えられている。スパイクタンパク質が「アップ」立体配座になると、宿主細胞のアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体への結合が起こり、ウイルスが細胞内に入ることができる。スパイクタンパク質の「アップ」立体配座への「活性化」は、フューリンまたはＴＭＰＲＳＳ２などの酵素によって実行され得る。これらの酵素は、スパイクタンパク質を開くことによって作用でき、ヌクレオキャプシドタンパク質をウイルスキャプシドから細胞内に移動させ、感染をもたらす。
【0005】
細胞がコロナウイルスに感染すると、免疫系（または治療剤）は非感染細胞に損傷を与えることなく、ウイルス感染細胞のみを標的にしなければならないため、治療オプションはより困難になる。スパイクタンパク質の不可欠な機能のため、それは抗体を介した中和の標的を表す。したがって、コロナウイルス療法の１つのアプローチは、スパイクタンパク質を中和することによって細胞へのウイルスの結合を阻害し、細胞の感染を防ぐことである。
【0006】
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、遺伝子操作されたアンキリンリピートタンパク質であり、抗体模倣タンパク質のように機能し、典型的には、高い特異性と高い親和性の標的結合を示す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、設計された１つ以上のアンキリンリピートリピートドメインを含む。設計されたアンキリンリピートドメインは、天然のアンキリンリピートタンパク質に由来し、設計されたそれぞれのアンキリンリピートドメインは典型的には、高い特異性と親和性で標的タンパク質に結合する。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、高い特異性、安定性、有効性、及び親和性により、ならびに単一特異性、二重特異性、または多重特異性タンパク質を生成するためのフォーマットの柔軟性により、さまざまな臨床応用のための魅力的な治療剤である。例えば、ＷＯ２０１１／１３５０６７は、がん及び加齢性黄斑変性症などの眼疾患を含む他の病理学的状態の治療に使用するためのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質について記載している。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧが所有する登録商標である。
【0007】
本発明の根底にある技術的問題は、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合特異性を有する１つ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含む新規組換え結合タンパク質を同定することである。そのような組換え結合タンパク質は、コロナウイルスの細胞への結合を阻害するため、及び細胞のウイルス感染を防ぐために有用であり得る。そのような組換え結合タンパク質及びそのようなタンパク質を含む医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるコロナウイルス疾患などのコロナウイルス疾患を予防、治療、または診断する方法に、及び／またはコロナウイルス、好ましくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法にさらに有用であり得る。
【発明の概要】
【0008】
本明細書に提供される開示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図されている。
【0009】
１． 第１の実施形態では、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0010】
１ａ． 実施形態１ａでは、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0011】
１ｂ． 実施形態１ｂでは、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0012】
２． 第２の実施形態では、本発明は、前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0013】
２ａ． 実施形態２ａでは、本発明は、前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１ａに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0014】
２ｂ． 実施形態２ｂでは、本発明は、前記第１のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１ｂに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0015】
３． 第３の実施形態では、本発明は、前記第１のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、実施形態１に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0016】
３ａ． 実施形態３ａでは、本発明は、前記第１のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１からなる群から選択される、実施形態１ａに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0017】
３ｂ． 実施形態３ｂでは、本発明は、前記第１のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択される、実施形態１ｂに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0018】
４． 第４の実施形態では、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインをさらに含む実施形態１～３のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0019】
４ａ． 実施形態４ａでは、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインをさらに含む実施形態１ａ、２ａ、または３ａのいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0020】
４ｂ． 実施形態４ｂでは、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインをさらに含む実施形態１ｂ、２ｂ、または３ｂのいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0021】
５． 第５の実施形態では、本発明は、前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0022】
５ａ． 実施形態５ａでは、本発明は、前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４ａに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0023】
５ｂ． 実施形態５ｂでは、本発明は、前記第２のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４ｂに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0024】
６． 第６の実施形態では、本発明は、前記第２のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、実施形態４に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0025】
６ａ． 実施形態６ａでは、本発明は、前記第２のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１からなる群から選択される、実施形態４ａに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0026】
６ｂ． 実施形態６ｂでは、本発明は、前記第２のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択される、実施形態４ｂに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0027】
７． 第７の実施形態では、本発明は、第３のアンキリンリピートドメインをさらに含む実施形態４～６のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0028】
７ａ． 実施形態７ａでは、本発明は、第３のアンキリンリピートドメインをさらに含む実施形態４ａ、５ａ、または６ａのいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0029】
７ｂ． 実施形態７ｂでは、本発明は、第３のアンキリンリピートドメインをさらに含む実施形態４ｂ、５ｂ、または６ｂのいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0030】
８． 第８の実施形態では、本発明は、前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0031】
８ａ． 実施形態８ａでは、本発明は、前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７ａに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0032】
８ｂ． 実施形態８ｂでは、本発明は、前記第３のアンキリンリピートドメインが、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７ｂに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0033】
９． 第９の実施形態では、本発明は、前記第３のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、実施形態７に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0034】
９ａ． 実施形態９ａでは、本発明は、前記第３のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１からなる群から選択される、実施形態７ａに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0035】
９ｂ． 実施形態９ｂでは、本発明は、前記第３のアンキリンリピートドメインが配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択される、実施形態７ｂに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0036】
１０． 第１０の実施形態では、本発明は、前記第１、第２、及び第３のアンキリンリピートドメインが、以下のようなアミノ酸配列を含み、Ｎ末端からＣ末端に向かって配置される、実施形態７、７ａまたは７ｂに記載の組換え結合タンパク質に関する：
（ｉ）配列番号６、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号４、２、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４、６、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号６、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号７、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号８、４、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号３、６、及び７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号４、１、及び８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号３、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号９、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号９、６、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号３、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１０、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１１、９、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号５、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１、２、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号３、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号６、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号７、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号８、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号６、１０、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号３、１０、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号５、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号９、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号９、６、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号５、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｘ）配列番号６、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘ）配列番号１０、９、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉ）配列番号１１、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号３、７６、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３、８５、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
（ｉ）配列番号６、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号４、２、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４、６、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号６、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号７、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号８、４、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号３、６、及び７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号４、１、及び８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号３、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号９、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号９、６、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号３、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１０、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１１、９、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号５、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１、２、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号３、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号６、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号７、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号８、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号６、１０、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号３、１０、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号５、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号９、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号９、６、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号５、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｘ）配列番号６、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘ）配列番号１０、９、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉ）配列番号１１、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号３、７６、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３、８５、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【0037】
１０ａ． 実施形態１０ａでは、本発明は、実施形態１０（ｘｘ）に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0038】
１０ｂ． 実施形態１０ｂでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号６８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0039】
１０ｃ． 実施形態１０ｃでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号６８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0040】
１０ｄ． 実施形態１０ｄでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号６８のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0041】
１０ｅ． 実施形態１０ｅでは、本発明は、実施形態１０（ｘｘｖｉｉｉ）に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0042】
１０ｆ． 実施形態１０ｆでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号６９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0043】
１０ｇ． 実施形態１０ｇでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号６９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0044】
１０ｈ． 実施形態１０ｈでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号６９のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0045】
１０ｉ． 実施形態１０ｉでは、本発明は、実施形態１０（ｘｘｘｉｉ）に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0046】
１０ｊ． 実施形態１０ｊでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号７９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0047】
１０ｋ． 実施形態１０ｋでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号７９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0048】
１０ｌ． 実施形態１０ｌでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0049】
１０ｍ． 実施形態１０ｍでは、本発明は、実施形態１０（ｘｘｘｉｉ）に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0050】
１０ｎ． 実施形態１０ｎでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８９～９１からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0051】
１０ｏ． 実施形態１０ｏでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８９～９１からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0052】
１０ｐ． 実施形態１０ｐでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８９～９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0053】
１１． 第１１の実施形態では、本発明は、前記結合タンパク質がコロナウイルススパイクタンパク質に結合する、実施形態１～１０ｐのいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0054】
１２． 第１２の実施形態では、本発明は、前記スパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、実施形態１１に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0055】
１３． 第１３の実施形態では、本発明は、前記第１、第２、及び／または第３のアンキリンリピートドメインが、約１００ｎＭ以下の解離定数（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する、実施形態１１及び１２のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0056】
１４． 第１４の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリンリピートドメインが、約１００ｎＭ以下の解離定数（ＫD）でコロナウイルススパイクタンパク質に結合する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0057】
１５． 第１５の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの血清アルブミン結合ドメインをさらに含む、いずれかの先行実施形態に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0058】
１６． 第１６の実施形態では、本発明は、前記血清アルブミン結合ドメインが、配列番号４７～４９からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0059】
１６ａ． 実施形態１６ａでは、本発明は、前記組換え結合タンパク質が、少なくとも約３０時間、好ましくは少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４５時間のマウスにおける終末相半減期を有する、実施形態１５及び１６のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0060】
１７． 第１７の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0061】
１７ａ． 実施形態１７ａでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0062】
１７ｂ． 実施形態１７ｂでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0063】
１７ｃ． 実施形態１７ｃでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号７５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0064】
１７ｄ． 実施形態１７ｄでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８４と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0065】
１７ｅ． 実施形態１７ｅでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0066】
１７ｆ． 実施形態１７ｆでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0067】
１７ｇ． 実施形態１７ｇでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0068】
１７ｈ． 実施形態１７ｈでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、及び７５からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0069】
１８． 第１８の実施形態では、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１７に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0070】
１８ａ． 実施形態１８ａでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0071】
１８ｂ． 実施形態１８ｂでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0072】
１８ｃ． 実施形態１８ｃでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号７５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0073】
１８ｄ． 実施形態１８ｄでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８４と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0074】
１８ｅ． 実施形態１８ｅでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0075】
１８ｆ． 実施形態１８ｆでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0076】
１８ｇ． 実施形態１８ｇでは、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１７ｇに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0077】
１８ｈ． 実施形態１８ｈでは、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、及び７５からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１７ｈに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0078】
１９． 第１９の実施形態では、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態１７に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0079】
１９ａ． 実施形態１９ａでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３１のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0080】
１９ｂ． 実施形態１９ｂでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３９のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0081】
１９ｃ． 実施形態１９ｃでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号７５のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0082】
１９ｄ． 実施形態１９ｄでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８４のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0083】
１９ｅ． 実施形態１９ｅでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８７のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0084】
１９ｆ． 実施形態１９ｆでは、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８８のアミノ酸配列を有する、前記組換え結合タンパク質に関する。
【0085】
１９ｇ． 実施形態１９ｇでは、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態１７ｇに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0086】
１９ｈ． 実施形態１９ｈでは、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態１７ｈに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0087】
２０． 第２０の実施形態では、本発明は、前記結合タンパク質がコロナウイルススパイクタンパク質に結合する、実施形態１７～１９ｈのいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0088】
２１． 第２１の実施形態では、本発明は、前記スパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、実施形態２０に記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0089】
２２． 第２２の実施形態では、本発明は、前記結合タンパク質が、約１００ｎＭ以下の解離定数（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する、実施形態２０及び２１のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0090】
２３． 第２３の実施形態では、本発明は、前記結合タンパク質が、コロナウイルスによる細胞の感染を阻害することができる、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0091】
２４． 第２４の実施形態では、本発明は、前記結合タンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を阻害することができる、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質に関する。
【0092】
２５． 第２５の実施形態では、本発明は、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0093】
２５ａ． 実施形態２５ａでは、本発明は、前記核酸が、配列番号７０または配列番号７０と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0094】
２５ｂ． 実施形態２５ｂでは、本発明は、前記核酸が、配列番号７１または配列番号７１と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0095】
２５ｃ． 実施形態２５ｃでは、本発明は、前記核酸が、配列番号７２または配列番号７２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0096】
２５ｄ． 実施形態２５ｄでは、本発明は、前記核酸が、配列番号７３または配列番号７３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0097】
２５ｅ． 実施形態２５ｅでは、本発明は、前記核酸が、配列番号７４または配列番号７４と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0098】
２５ｆ． 実施形態２５ｆでは、本発明は、前記核酸が、配列番号８０または配列番号８０と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0099】
２５ｇ． 実施形態２５ｇでは、本発明は、前記核酸が、配列番号８１または配列番号８１と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0100】
２５ｈ． 実施形態２５ｈでは、本発明は、前記核酸が、配列番号８２または配列番号８２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0101】
２５ｉ． 実施形態２５ｉでは、本発明は、前記核酸が、配列番号８３または配列番号８３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0102】
２５ｊ． 実施形態２５ｊでは、本発明は、前記核酸が、配列番号７８または配列番号７８と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0103】
２５ｋ． 実施形態２５ｋでは、本発明は、前記核酸が、配列番号８６または配列番号８６と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0104】
２５ｌ． 実施形態２５ｌでは、本発明は、前記核酸が、配列番号９２または配列番号９２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0105】
２５ｍ． 実施形態２５ｍでは、本発明は、前記核酸が、配列番号９３または配列番号９３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0106】
２５ｎ． 実施形態２５ｎでは、本発明は、前記核酸が、配列番号９４または配列番号９４と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0107】
２５ｏ． 実施形態２５ｏでは、本発明は、前記核酸が、配列番号９５または配列番号９５と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0108】
２６． 第２６の実施形態では、本発明は、実施形態２５～２５ｏのいずれか１つに記載の核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【0109】
２７． 第２７の実施形態では、本発明は、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質を作製する方法であって、前記組換え結合タンパク質が発現する条件下で実施形態２６の宿主細胞を培養することを含む、方法に関する。
【0110】
２８． 第２８の実施形態では、本発明は、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の結合タンパク質または実施形態２５～２５ｏのいずれか１つに記載の核酸と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
【0111】
２９． 第２９の実施形態では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質の有効量、または実施形態２５～２５ｏのいずれか１つに記載の核酸の有効量、または実施形態２８に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記方法に関する。
【0112】
２９ａ． 実施形態２９ａでは、本発明は、前記方法が治療的治療方法である、実施形態２９に記載の治療する方法に関する。
【0113】
２９ｂ． 実施形態２９ｂでは、本発明は、前記方法が予防的治療方法である、実施形態２９に記載の治療する方法に関する。
【0114】
２９ｃ． 実施形態２９ｃでは、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を予防する方法であって、前記方法が、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質の有効量、または実施形態２５～２５ｏのいずれか１つに記載の核酸の有効量、または実施形態２８に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記方法に関する。
【0115】
２９ｄ． 実施形態２９ｄでは、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を診断する方法で使用するための、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質、または実施形態２５～２５ｏのいずれか１つに記載の核酸、または実施形態２８に記載の医薬組成物に関する。
【0116】
２９ｅ． 実施形態２９ｅでは、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を診断する方法であって、対象からの試料をインビトロまたはエクスビボで、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質と接触させるステップを含む、前記方法に関する。
【0117】
２９ｆ． 実施形態２９ｆでは、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を検出する方法であって、前記方法は、
（ａ）対象から試料を得ることと；
（ｂ）前記試料を、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることと；
（ｃ）コロナウイルス感染症の存在を検出することと、を含む、前記方法に関する。
（ａ）対象から試料を得ることと；
（ｂ）前記試料を、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることと；
（ｃ）コロナウイルス感染症の存在を検出することと、を含む、前記方法に関する。
【0118】
２９ｇ． 実施形態２９ｇでは、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を治療または予防する方法で使用するための、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質、または実施形態２５～２５ｏのいずれか１つに記載の核酸、または実施形態２８に記載の医薬組成物に関する。
【0119】
３０． 第３０の実施形態では、本発明は、前記コロナウイルス感染症がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる、実施形態２９～２９ｇのいずれか１つに記載の方法に関する。
【0120】
３１． 第３１の実施形態では、本発明は、前記対象がヒトである、実施形態２９、２９ａ、２９ｂ、２９ｃ、２９ｅ、２９ｆ、２９ｇ、及び３０のいずれか１つに記載の方法、または実施形態２９ｄに記載の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0121】
【図1】２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質プロトマーは、さまざまなアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）の提案された結合部位を示している。
【図2】ダウン立体配座の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質プロトマー。
【図3】ｈＡＣＥ２結合部位が上昇していることを示す、アップ立体配座の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質プロトマー。ｈＡＣＥ２は、スパイクタンパク質のアップ立体配座に結合するが、ダウン立体配座には結合しないと考えられている。
【図4】ｈＡＣＥ２結合部位の位置、Ｓ１／Ｓ２切断部位、及びＳ２’切断部位を示す２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質プロトマー。分子成熟の間、スパイクタンパク質は三量体化し、Ｓ１／Ｓ２部位で切断された。それは非共有複合体として膜に提示されれる。膜融合には、スパイクタンパク質の受容体結合とタンパク質分解処理の協調作用が必要である。立体配座遷移のための最初のエネルギー障壁が必要である。理論に拘束されることは望まないが、このエネルギー障壁は、（ｉ）ｈＡＣＥ２受容体に結合することと、（ｉｉ）Ｓ２’部位でのタンパク質分解を開始することと、によって克服される。宿主細胞表面でのＡＣＥ２との相互作用は、Ｓ２’部位の切断を引き起こすと考えられている。この切断は、広範な不可逆的な構造変化を介して膜融合のためにタンパク質を活性化することが提案されている。
【図5】スパイクタンパク質に結合する単一のアンキリンリピートドメインを含むさまざまな組換え結合タンパク質（モノドメイン及びモノパラトピックのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質）の１００ｎＭでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルス阻害。バーが短いほど、ウイルス阻害が強いことを示す。
【図6】スパイクタンパク質に結合する単一のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質（モノドメイン及びモノパラトピックのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質）の代表的なＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）トレース。
【図7】スパイクタンパク質に結合する３つのアンキリンリピートドメインを含むさまざまな組換え結合タンパク質（マルチドメイン及びマルチパラトピックのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質）の１００ｎＭでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルス阻害。バーが短いほど、ウイルス阻害が強いことを示す。
【図8】スパイクタンパク質に結合する３つのアンキリンリピートドメインを含むさまざまな組換え結合タンパク質（マルチドメイン及びマルチパラトピックのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質）の１ｎＭでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルス阻害。バーが短いほど、ウイルス阻害が強いことを示す。
【図9a】スパイクタンパク質に結合する単一のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）トレース。４つまたは５つの濃度のＳＰＲフィッティング曲線は、これらのモノドメイン、モノパラトピックＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質の高い結合親和性（例えば、２桁のｐＭ範囲）を裏付けている。
【図9b】スパイクタンパク質に結合する単一のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）トレース。４つまたは５つの濃度のＳＰＲフィッティング曲線は、これらのモノドメイン、モノパラトピックＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質の高い結合親和性（例えば、２桁のｐＭ範囲）を裏付けている。
【図9c】スパイクタンパク質に結合する単一のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）トレース。４つまたは５つの濃度のＳＰＲフィッティング曲線は、これらのモノドメイン、モノパラトピックＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質の高い結合親和性（例えば、２桁のｐＭ範囲）を裏付けている。上のパネルは配列番号９を表し、下のパネルは配列番号１０を表す。
【図10】ＧＦＰ標識されたＶＳＶ偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染したＧＦＰ陽性のＶｅｒｏ Ｅ０６細胞を示す蛍光顕微鏡画像。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物ＡＬＥ０４３（配列番号２５）及びｖＳ０７＿Ｍ１０１Ｅ０４では、ウェル１（濃度１００ｎＭ）とウェル６（濃度３．１２５ｎＭ）に感染細胞は見られないが、アイソタイプ陰性対照（ｈｉｓタグ付きＭＰ０２５０）についてのウェル１及び６において、Ｖｅｒｏ Ｅ０６細胞の視認できるＧＦＰ標識されたＶＳＶ偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染がある。ウェル１２のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質濃度が低い場合（０．０４９ｎＭ）、感染したＶｅｒｏ Ｅ０６細胞（ＧＦＰ陽性）がすべての構築物で見られる。
【図11】マルチドメインＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質によるＶＳＶ偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和。試験された構築物（ＡＬＥ０３０、ＡＬＥ０３１など）の名称は、図に示されている。
【図12】マルチドメインＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質によるＶＳＶ偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ウイルスの中和。試験された構築物（ＡＬＥ０３０、ＡＬＥ０３３など）の名称は、図に示されている。
【図13】縁の周りの境界ゾーン、及び０．００６４～１００ｎｍまでのそれぞれの希釈値についての三重のウェル、及び対照ウェルを含む、実施例４で使用される試験プレートのマップ。
【図14a】実施例４から得られた試験プレートの写真。
【図14b】実施例４から得られた試験プレートの写真。
【図14c】実施例４から得られた試験プレートの写真。
【図14d】実施例４から得られた試験プレートの写真。
【図14e】実施例４から得られた試験プレートの写真。
【図14f】実施例４から得られた試験プレートの写真。
【図15a】ＡＬＥ０３３の特性評価（表５、試料３を参照されたい）。コロナウイルススパイクタンパク質への高親和性結合を示すＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）トレースである。経時的に標的結合の喪失は観察されなかった。
【図15b】ＡＬＥ０３３の特性評価（表５、試料３を参照されたい）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイル（モル質量対時間）を示している。凝集体やオリゴマーは観察されなかった。ＣＤ（円偏光二色性）スペクトル（提供なし）では、８５℃までアンフォールディングは検出されなかった。
【図16】ＡＬＥ０３０のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）トレース（表５、試料１を参照されたい）。
【図17】ＡＬＥ０３８のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）トレース（表５、試料７を参照されたい）。
【図18a】実施例５から得られた試験プレートの写真。
【図18b】実施例５から得られた試験プレートの写真。
【図18c】実施例５から得られた試験プレートの写真。
【図18d】実施例５から得られた試験プレートの写真。
【図19】ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した細胞防御。実施例７を参照されたい。
【図20】バイオレットクリスタル染色後に得られた試験プレートの写真。実施例８を参照されたい。
【図21a】ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した細胞防御。実施例８を参照されたい。
【図21b】ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した細胞防御。実施例８を参照されたい。
【図21c】ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した細胞防御。実施例８を参照されたい。
【図22a】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク外部ドメイン（灰色）に結合したＡＬＥ０４９（黄色：ＨＳＡ結合ドメイン；シアン、青、マゼンタ：ＲＢＤ結合ドメイン）の分子モデル。
【図22b】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク外部ドメイン（灰色）に結合したＡＬＥ０５８（黄色：ＨＳＡ結合ドメイン、青：ＲＢＤ結合ドメイン、緑：Ｓ１－ＮＴＤ結合ドメイン、赤：Ｓ２結合ドメイン）の分子モデル。
【図23】多重特異性結合タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ０５８によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスの中和。実施例８を参照されたい。
【図24】実施例９で使用したＥＬＩＳＡ法。
【図25】ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９の平均血清濃度データ。実施例９を参照されたい。
【図26a】予防的シリアンゴールドハムスターモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療におけるＡＬＥ０４９の有効性。実施例１０を参照されたい。
【図26b】予防的シリアンゴールドハムスターモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療におけるＡＬＥ０４９の有効性。実施例１０を参照されたい。
【図26c】予防的シリアンゴールドハムスターモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療におけるＡＬＥ０４９の有効性。実施例１０を参照されたい。
【図26d】予防的シリアンゴールドハムスターモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療におけるＡＬＥ０４９の有効性。実施例１０を参照されたい。
【図26e】予防的シリアンゴールドハムスターモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療におけるＡＬＥ０４９の有効性。実施例１０を参照されたい。
【図27】４日目に撮影したハムスターの肺組織の代表的な組織病理学顕微鏡写真。左側のパネル：１６００μｇのＡＬＥ０４９で処置した動物の健康なハムスターの肺組織（群１）。右側のパネル：プラセボ注射を受けた動物の疾患の肺組織（群４）。
【図28】実施例１１及び１２で評価されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異の構造可視化。Ａ）完全な三量体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の表現。偽ウイルス中和アッセイで分析されたすべての残基が青い球体として視覚化されている。ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９に組み込まれている個々のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメインの結合領域は、青（ＲＢＤ）、緑（ＮＴＤ）、及び赤（Ｓ２）で着色されている。Ｂ）英国Ｂ．１．１．７（ｄｅｌ６９－７０、ｄｅｌ１４５、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ）で最初に同定されたバリアントを表す単量体スパイクタンパク質構造。Ｃ）南アフリカＢ．１．３５１（Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖ）で最初に同定されたバリアントを表す単量体スパイクタンパク質構造。ＰＤＢファイル６ｘｃｎは、ＰｙＭｏｌバージョン２．１．１（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）で図を生成するために使用された。すべての変異を視覚化するために、ループ５１８～５２０、６７６～６８９、８１１～８１３、及びｃｒｙｏ－ＥＭ構造で欠落しているＮＴＤドメインの領域は、ＮＴＤドメインのテンプレートとしてのＰＤＢファイル６ｚｇｅを使用してＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアに含まれるＭＯＤＥＬＬＥＲでモデル化された（ＢＩＯＶＩＡ，Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ，ＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２０２１）。
【図29】（Ａ）ノックアウト実験用に生成されたＡＬＥ１０９構築物の視覚的表示。それぞれのノックアウト（ｋｏ）構築物について、示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメインが非結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメインに置き換えられた。ＨＳＡ：ＨＳＡ結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメイン、ＲＢＤ：ＲＢＤ結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメイン、ＮＴＤ：ＮＴＤ結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメイン、Ｓ２：Ｓ２結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメイン。実施例１１を参照されたい。（Ｂ）野生型スパイクタンパク質を発現するＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスに対するＡＬＥ１０９及びｋ．ｏ．構築物の中和プロファイル。（Ｃ）上のパネル：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１００ｐｆｕ）を介した細胞変性効果に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の防御効果。描かれているのは、ＡＬＥ１０９またはｋ．ｏ．構築物によって付与される細胞防御のパーセンテージである。細胞防御は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを使用する細胞生存率アッセイで細胞内ＡＴＰレベルを測定することにより、３日間のインキュベーション後に決定された。下のパネル：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製の阻害は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって定量化され、ＡＬＥ１０９またはｋ．ｏ．構築物の量を増やしながら１００ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞の上清に存在するウイルスゲノム等価物のパーセンテージとして表される。（Ｄ）分析された構築物のＩＣ50／ＥＣ50値と効力ランキング。
【図30】実施例１２の手順の概略図。
【図31】実施例１２で観察された細胞変性効果を示す表。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質Ｒ１ｂは、この図ではＲＢＤ－２と呼ばれている。
【図32】マルチドメインＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合タンパク質によるＶＳＶ偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ウイルスの中和。試験された構築物（ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５８など）の名称は、図に示されている。
【図33】１ｍｇ／ｋｇ投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡＬＥ０５８の平均血清濃度－時間プロファイル。
【図34】１ｍｇ／ｋｇ投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡＬＥ１０９、ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３の平均血清濃度－時間プロファイル。
【図35】概略研究の概要。体重と体温を毎日測定し、スワブ、血液、及び組織をそれぞれの群について３匹の動物から採取し、それぞれ３日目と５日目に安楽死させた。
【図36】０日目から５日目までの時間経過における５つの研究群すべての体重測定値の平均とＳＥＭ。
【図37a】３匹の動物の３日目の肺ホモジネートの生ウイルス滴定によるウイルス定量化。
【図37b】３匹の動物の５日目の肺ホモジネートの生ウイルス滴定によるウイルス定量化。
【図37c】３匹の動物の３日目の肺におけるゲノムコピーのｑＰＣＲ測定によるウイルス定量化。
【図37d】３匹の動物の５日目の肺におけるゲノムコピーのｑＰＣＲ測定によるウイルス定量化。
【図38a】炎症の徴候の４つのカテゴリにグループ化された平均組織病理学的スコアの合計。
【図38b】影響を受けた血管の４つのカテゴリにグループ化された平均組織病理学的スコアの合計。
【図38c】肺胞の４つのカテゴリにグループ化された平均組織病理学的スコアの合計。
【図38d】気管支の４つのカテゴリにグループ化された平均組織病理学的スコアの合計。
【発明を実施するための形態】
【0122】
概要
本明細書に開示されるのは、コロナウイルススパイクタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合特異性を有する１つ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質である。結合タンパク質をコードする核酸、結合タンパク質または核酸を含む医薬組成物、及び結合タンパク質、核酸、または医薬組成物を使用する方法も開示される。
本明細書に開示されるのは、コロナウイルススパイクタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合特異性を有する１つ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質である。結合タンパク質をコードする核酸、結合タンパク質または核酸を含む医薬組成物、及び結合タンパク質、核酸、または医薬組成物を使用する方法も開示される。
【0123】
本発明による組換え結合タンパク質は、１つ以上の結合部位でコロナウイルススパイクタンパク質に結合し、それによってウイルスを中和する。これらの結合部位を図１に示す。一実施形態では、組換え結合タンパク質はスパイクタンパク質上の３つの部位に結合する。
【0124】
理論に縛られることは望まないが、本発明の設計されたアンキリンリピートタンパク質は、（ｉ）受容体結合を阻害することにより；（ｉｉ）スパイクタンパク質の立体配座の変化のアロステリック阻害を提供することにより；及び／または（ｉｉｉ）スパイクタンパク質の活性化に必要なプロテアーゼ部位をブロックすることにより作用すると考えられる。図１に示すように、設計されたアンキリンリピートリピートドメイン１（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１）は、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体結合をブロックすることによって作用すると理解されている。設計されたアンキリンリピートリピートドメイン１及び２（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１及び２）は、スパイクタンパク質の立体配座の変化を防ぎ、スパイクタンパク質を効果的に閉じた配置に固定することによって作用するとさらに理解されている。設計されたアンキリンリピートリピートドメイン３（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）３）は、立体配座の変化をさらに阻害し、プロテアーゼ結合をブロックすると理解されている。これらの設計されたアンキリンリピートドメインは個々のタンパク質としてスパイクタンパク質に結合でき、及び／またはそれを阻害できる。マルチドメイン、多重特異性タンパク質によるマルチエピトープ標的化は、スパイクタンパク質のさらに強力な中和を提供し、エスケープ変異の可能性を最小限に抑えると考えられている。
【0125】
記載されている設計されたアンキリンリピートタンパク質のさらなる利点は、Ｆｃ媒介マクロファージまたは補体活性化の欠如による急性肺炎症（ＡＬＩ）の発生率を低下させ得ることである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１９ ４（４）：ｅ１２３１５８に記載されるように）。設計されたアンキリンリピートタンパク質は、モノクローナル抗体ではアクセスできないエピトープにも対応し得る。
【0126】
記載された設計されたアンキリンリピートタンパク質のさらなる利点は、免疫原性が低く、オフターゲット効果がないことである。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）候補は、迅速、低コストかつ高収率の製造、及び４℃で最大数年の貯蔵寿命を含む、有利な開発特性も示す。
【0127】
定義
本明細書で特に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
本明細書で特に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
【0128】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別の記載がない限り、制限のない用語と解釈されるべきである。本発明の態様が特徴を「含む」と記載されている場合、実施形態はまた、その特徴「からなる」または「本質的にからなる」と考えられる。本明細書で提供される任意の及びすべての例、または例示的な用語（例えば、「～など」）の使用は、単に本開示をよりよく示すことを意図しており、別の請求がない限り、本開示の範囲の限定を提示するものではない。本明細書中のいかなる文言も、本開示の実施に不可欠なものとして、非請求の要素を示すとして解釈されるべきではない。実施例以外で、または別段の指示がある場合を除いて、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数字は、すべての場合において、関連する技術分野の当業者によって解釈される「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の記載がない限り、所与の数値の±１０％に相当する。
【0129】
本明細書における値の範囲の言及は、本明細書中に別の指示がない限り、範囲及びそれぞれの端点に含まれるのそれぞれの個別の値を個々に参照する簡略方法として機能することを意図しており、それぞれの個別の値及び端点は本明細書に個別に言及されているかのように、本明細書に組み入れられる。
【0130】
「核酸」または「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかのリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であり得るポリヌクレオチド分子を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡの改変型及び人工型を含む。核酸分子は、単離された形態で存在するか、または組換え核酸分子またはベクターに含まれ得る。
【0131】
本発明の文脈において、「タンパク質」という用語は、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／または複数のポリペプチド鎖間で二次、三次、及び／または四次の構造を形成することによって、定義された三次元配置を有するか、または獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、例えば２つのポリペプチド間のジスルフィド結合によって、非共有結合または共有結合で連結され得る。二次構造及び／または三次構造を形成することにより、定義された三次元配置を個別に持つ、または獲得できるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【0132】
組換えタンパク質、組換えポリペプチドなどで使用される場合、「組換え」という用語は、前記タンパク質またはポリペプチドが当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば、遺伝子合成によって産生される）は、細菌発現プラスミド（例えば、ｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、または植物発現プラスミド、またはインビトロ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドが適切な細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に挿入される場合、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされるポリペプチド（複数可）を産生することができる。それに対応して産生されたポリペプチドまたはタンパク質は、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質と呼ばれる。
【0133】
本発明の文脈において、「結合タンパク質」という用語は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の結合ドメインを含み得る。好ましくは、前記結合タンパク質は組換え結合タンパク質である。より好ましくは、本発明の結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に対する結合特異性を有するアンキリンリピートドメインを含む。
【0134】
「標的」という用語は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、炭水化物、もしくはそのような個々の分子の任意の部分を含む任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子、またはそのような分子の２つ以上の複合体、または全細胞もしくは組織試料、または任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は、天然または非天然のポリペプチドまたはタンパク質、あるいは化学修飾、例えば、天然または非天然のリン酸化、アセチル化、またはメチル化を含むポリペプチドまたはタンパク質である。
【0135】
本発明の文脈において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して連結された複数の、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子を指す。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結された８個を超えるアミノ酸からなる。「ポリペプチド」という用語には、システインのＳ－Ｓ架橋によって一緒に連結された複数のアミノ酸の鎖も含まれる。ポリペプチドは当業者に周知である。
【0136】
特許出願ＷＯ２００２／０２０５６５及びＦｏｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６）には、リピートタンパク質の特徴とリピートドメインの特徴、技術、及び応用に関する一般的な説明が含まれている。「リピートタンパク質」という用語は、１つ以上のリピートドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、リピートタンパク質は、１、２、３、４、５または６個のリピートドメインを含む。さらに、前記リピートタンパク質は、追加の非リピートタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ及び／またはペプチドリンカーを含み得る。リピートドメインは結合ドメインであり得る。
【0137】
「リピートドメイン」という用語は、構造単位として２つ以上の連続するリピートモジュールを含むタンパク質ドメインを指し、前記リピートモジュールは構造的相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、リピートドメインはＮ末端及び／またはＣ末端のキャッピングモジュールも含む。明確にするために、キャッピングモジュールはリピートモジュールであり得る。そのようなリピートドメイン、リピートモジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、ならびに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリンリピートドメイン（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３，２００３；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）；ＷＯ２００２／０２０５６５；ＷＯ２０１２／０６９６５５）、ロイシンリッチリピートドメイン（ＷＯ２００２／０２０５６５）、テトラトリコペプチドリピートドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７－５０８，２００３）、及びアルマジロリピートドメイン（ＷＯ２００９／０４０３３８）の例から当業者によく知られている。そのようなリピートドメインは、反復したアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なり、反復したアミノ酸配列ごとに個々のドメインを形成できることは当業者にさらによく知られている（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）。
【0138】
「アンキリンリピートドメイン」という用語は、構造単位として２つ以上の連続するアンキリンリピートモジュールを含むタンパク質ドメインを指し、前記アンキリンリピートモジュールは構造的相同性及び配列相同性を有する。
【0139】
設計されたリピートタンパク質、設計されたリピートドメインなどで使用される場合、「設計された」という用語は、そのようなリピートタンパク質及びリピートドメインがそれぞれ人工であり、天然には存在しないという性質を指す。本発明の結合タンパク質は設計されたリピートタンパク質であり、それらは少なくとも１つの設計されたリピートドメインを含む。好ましくは、設計されたリピートドメインは、設計されたアンキリンリピートドメインである。
【0140】
「標的相互作用残基」という用語は、標的との直接相互作用に寄与するリピートモジュールのアミノ酸残基を指す。
【0141】
「フレームワーク残基」または「フレームワーク位置」という用語は、フォールディングトポロジーに寄与する、すなわち前記リピートモジュールのフォールディングに寄与する、または隣接モジュールとの相互作用に寄与するリピートモジュールのアミノ酸残基を指す。そのような寄与は、リピートモジュール内の他の残基との相互作用、またはα－ヘリックスまたはβ－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、または線形ポリペプチドまたはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与である可能性があり得る。そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、物理化学的方法、例えばＸ線結晶学、ＮＭＲ及び／またはＣＤ分光法によって、または構造生物学及び／またはバイオインフォマティクスの専門家によく知られている既知及び関連する構造情報との比較によって得られた構造データの分析によって同定することができる。
【0142】
「リピートモジュール」という用語は、もともと天然に存在するリピートタンパク質のリピート単位に由来する、設計されたリピートドメインの反復するアミノ酸配列及び構造単位を指す。リピートドメインに含まれるそれぞれのリピートモジュールは、天然に存在するリピートタンパク質のファミリーまたはサブファミリー、好ましくはアンキリンリピートタンパク質のファミリーの１つ以上のリピート単位に由来する。さらに、リピートドメインに含まれるそれぞれのリピートモジュールは、例えば実施例１に記載のように、標的上で選択されたリピートドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同リピートモジュールから推定される「リピート配列モチーフ」を含み得る。
【0143】
したがって、「アンキリンリピートモジュール」という用語は、天然に存在するアンキリンリピートタンパク質のリピート単位に元々由来するリピートモジュールを指す。アンキリンリピートタンパク質は、当業者に周知である。
【0144】
リピートモジュールは、標的特異的リピートドメインを選択する目的でライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を含む位置（「非ランダム化位置」または「固定位置」は、本明細書では交換可能に使用される）、及び標的特異的リピートドメインを選択する目的でライブラリー内でランダム化されているアミノ酸残基を含む位置（「ランダム化された位置」）を含み得る。ランダム化されていない位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化されている」とは、システイン以外のアミノ酸、またはグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、リピートモジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許容されたことを意味し、例えば、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許容された、または２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許容されたことを意味する。
【0145】
「リピート配列モチーフ」という用語は、１つ以上のリピートモジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、前記リピートモジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有するリピートドメインに由来する。そのようなリピート配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。前記フレームワーク残基の位置は、リピートモジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、前記標的相互作用残基の位置は、リピートモジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。リピート配列モチーフは、ランダム化されていない位置とランダム化されている位置を含む。
【0146】
「リピート単位」という用語は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、ここで、前記「リピート単位」は複数のコピーで見られ、タンパク質のフォールディングを決定するすべての前記モチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。このようなリピート単位の例としては、ロイシンリッチリピート単位、アンキリンリピートリピート単位、アルマジロリピート単位、テトラトリコペプチドリピート単位、ＨＥＡＴリピート単位、及びロイシンリッチバリアントリピート単位が挙げられる。
【0147】
「アンキリンリピートドメイン」という用語は、天然に存在するアンキリンリピートタンパク質のリピート単位に元々由来する、少なくとも１つのアンキリンリピートモチーフを含むドメインを指す。一般に、アンキリンリピートモチーフは、ループによって分離された２つのアルファヘリックスを形成する約３３残基を含む。アンキリンリピートタンパク質は、当該技術分野で知られている。例えば、すべてが参照によりその全体が組み込まれる、国際特許公開番号ＷＯ２００２／０２０５６５、ＷＯ２０１０／０６０７４８、ＷＯ２０１１／１３５０６７、ＷＯ２０１２／０６９６５４、ＷＯ２０１２／０６９６５５、ＷＯ２０１４／００１４４２、ＷＯ２０１４／１９１５７４、ＷＯ２０１４／０８３２０８、ＷＯ２０１６／１５６５９６、及びＷＯ２０１８／０５４９７１を参照されたい。アンキリンリピートドメインは、任意選択で、適切なキャッピングモジュールをさらに含む。
【0148】
アンキリンリピートドメインは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインを用いて、本開示に従ってより大きなアンキリンリピートタンパク質にモジュール式に組み立てることができる（例えば、Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６，２００３、ＷＯ２０１２／０６９６５５、ＷＯ２００２／０２０５６５を参照されたい）。
【0149】
アンキリンリピートドメインは、代替的な標的（例えば、細胞または物質）と結合するよりも、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／またはより大きな親和性で特定の標的（例えば、細胞または物質）と反応または結合する場合、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書では交換可能に使用される）。例えば、コロナウイルスのスパイクタンパク質に特異的に結合するアンキリンリピートドメインは、他の非コロナウイルススパイクタンパク質に結合するよりも、より大きな親和性、結合力、より容易に、及び／またはより長い持続時間でコロナウイルススパイクタンパク質に結合するアンキリンリピートドメインである。この定義を読むことにより、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合するアンキリンリピートドメインが、第２の標的に特異的または優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。そのため、「特異的結合」は必ずしも排他的結合を（含めることはできれるが）必要とするわけではない。一般に、指定されたアッセイ条件下で、アンキリンリピートドメインは特定の標的分子に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分には有意な量で結合しない。
【0150】
目的の分子に特異的に結合するアンキリンリピートドメインを選択または特徴付けるために、さまざまなアッセイ形式を使用することができる。例えば、標的と特異的に反応するアンキリンリピートドメインを同定するために使用できる多くのアッセイの中で、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）及びウエスタンブロット分析などがある。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より典型的には、バックグラウンドの１０倍を超えるものであろう。さらに具体的には、アンキリンリピートドメインは、平衡解離定数（ＫD）値が１μＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、または１ｐＭ超である場合、標的に「特異的に結合する」と言われる。
【0151】
ＫD値は、しばしば結合親和性と呼ばれる。結合親和性は、１つの結合パートナーの接触残基（複数可）とその結合パートナーの接触残基（複数可）との間の非共有相互作用の合計の強度を測定する。特に明記しない限り、本明細書中で使用される場合、「結合親和性」とは、結合ペアまたは結合パートナーのメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。１つの結合パートナーに対して２つの結合ドメインを含む結合タンパク質の場合、結合親和性は、結合タンパク質と結合パートナーの間の１：２の相互作用を反映する結尾久親和性を指し得る。
【0152】
結合親和性の種々の測定方法が当該技術分野で知られており、これらのいずれも、本発明において使用することができる。例えば、本明細書で例示されるように、結合親和性は、ＫD値として表すことができ、これは、特定のアンキリンリピートドメインとその結合標的の解離速度を指す。ＫDは、「オフ速度（Ｋoff）」とも呼ばれる解離速度の会合速度または「オン速度（Ｋon）」に対する比率である。したがって、ＫDは、Ｋoff／Ｋonに等しく、モル濃度（Ｍ）で表され、ＫDが小さいほど結合の親和性が強い。
【0153】
ＫD値は、任意の適切な方法を使用して決定することができる。ＫDを測定するための１つの例示的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１５ Ｍａｙ ５；１５（５）：１０４８１－５１０を参照されたい）。ＫD値は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用するＳＰＲによって測定することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ速度論的分析は、表面上に固定化された分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）を有するチップからの抗原の結合及び解離を分析することを含む。タンパク質のＫDを決定する別の方法は、バイオレイヤー干渉法を使用することによるものである（例えば、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４；（８４）：５１３８３を参照されたい）。ＫD値は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）テクノロジー（Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ ｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定できる。代替的に、または付加的に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイも使用することができる。２つの結合パートナー間の結合親和性を評価するのに適した任意の方法が本明細書に包含される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が特に好ましい。最も好ましくは、ＫD値はＰＢＳ中でＳＰＲによって決定される。
【0154】
「ＰＢＳ」という用語は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、及び２．７ｍＭのＫＣｌを含み、ｐＨ７．４を有するリン酸緩衝水溶液を意味する。
【0155】
「治療する」という用語及びそれに関連する言葉は、必ずしも１００％または完全な治癒を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識するさまざまな程度の治療が存在する。この点で、本明細書に記載のコロナウイルス感染を治療する方法は、任意の量または任意のレベルの治療を提供することができる。さらに、本開示の方法によって提供される治療は、１つ以上の状態または症状の治療（すなわち、軽減）を含むことができる。例示的な態様では、方法は、対象の生存を増加させることによって治療する。「治療」という用語には、予防的（予防的）治療も含まれる。
【0156】
所与の疾患または状態における治療応答は、その疾患または状態に固有の標準化された応答基準によって決定することができる。治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善という有益な効果を経験し得る。
【0157】
コロナウイルススパイクタンパク質を標的とする組換え結合タンパク質
コロナウイルススパイクタンパク質に対する結合特異性を有する、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質が、本明細書に記載される。好ましい実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質に対する結合特異性を有する２つ、３つ、またはそれ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含むそのような組換え結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質上の２つ、３つ、またはそれ以上の異なるエピトープを標的とする。
コロナウイルススパイクタンパク質に対する結合特異性を有する、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質が、本明細書に記載される。好ましい実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質に対する結合特異性を有する２つ、３つ、またはそれ以上の設計されたアンキリンリピートドメインを含むそのような組換え結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質上の２つ、３つ、またはそれ以上の異なるエピトープを標的とする。
【0158】
設計されたアンキリンリピートモチーフまたはモジュールを含む、記載された組換え結合タンパク質またはその結合ドメインは、本明細書ではＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質とも呼ばれる。Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．１０（２）：１５３－９（２００７）；及びＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）を参照されたい。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、標的タンパク質に対する高い特異性と高い結合親和性を有する抗体模倣体とみなすことができれる。一般に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメイン、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上のアンキリンリピートドメインを含む。
【0159】
本明細書に記載のアンキリンリピートドメインは、一般に、構造を提供するコア骨格、及び標的に結合する標的結合残基を含む。構造コアには保存されたアミノ酸残基が含まれ、標的結合表面には標的に応じて異なるアミノ酸残基が含まれる。
【0160】
国際特許公開第ＷＯ２００２／０２０５６５、及びＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）は、標的に特異的に結合するタンパク質の選択／スクリーニングに使用できるアンキリンリピートタンパク質のライブラリーを記載する。そのようなライブラリーを作成する方法も提供される。
【0161】
複数のアンキリンリピートドメインを（共有結合または非共有結合のいずれかを介して）連結して、二重特異性または多重特異性分子を形成することができる。そのような分子の１つを図１に示す。ここでは、３つの個別のコロナウイルススパイクタンパク質結合ドメインが結合して、多重特異性分子を形成している。リンカーは、３つの結合ドメインを結ぶ破線で示されている。
【0162】
コロナウイルススパイクタンパク質
上記のように、コロナウイルススパイクタンパク質は魅力的な治療標的である。コロナウイルススパイクタンパク質を中和することで、哺乳動物細胞の感染を防ぎ、コロナウイルス疾患が対象に定着するのを防ぐことができる。本発明による組換え結合タンパク質は、哺乳動物コロナウイルスに特異的である。好ましくは、設計されたアンキリンリピートタンパク質は、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、サル、またはヒト起源のコロナウイルスに特異的である。より好ましくは、設計されたアンキリンリピートタンパク質は、ヒト起源のコロナウイルスに特異的である。コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が最も好ましい。本明細書で使用される場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語には、野生型ウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの初期に感染したヒトで見つかったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）とその変異型またはバリアントとの両方が含まれる。一実施形態では、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語には、野生型及び特定のバリアントＢ．１．１．７（いわゆる「英国バリアント」）、及びＢ．１．３５１（いわゆる「南アフリカバリアント」）が含まれる。
上記のように、コロナウイルススパイクタンパク質は魅力的な治療標的である。コロナウイルススパイクタンパク質を中和することで、哺乳動物細胞の感染を防ぎ、コロナウイルス疾患が対象に定着するのを防ぐことができる。本発明による組換え結合タンパク質は、哺乳動物コロナウイルスに特異的である。好ましくは、設計されたアンキリンリピートタンパク質は、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、サル、またはヒト起源のコロナウイルスに特異的である。より好ましくは、設計されたアンキリンリピートタンパク質は、ヒト起源のコロナウイルスに特異的である。コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が最も好ましい。本明細書で使用される場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語には、野生型ウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの初期に感染したヒトで見つかったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）とその変異型またはバリアントとの両方が含まれる。一実施形態では、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語には、野生型及び特定のバリアントＢ．１．１．７（いわゆる「英国バリアント」）、及びＢ．１．３５１（いわゆる「南アフリカバリアント」）が含まれる。
【0163】
本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合するアンキリンリピートドメインを含む。一実施形態では、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する２つ、３つ、またはそれ以上のアンキリンリピートドメインを含む。一実施形態では、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合する１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアンキリンリピートドメインを含む。
【0164】
コロナウイルススパイクタンパク質に関する本開示で目的の標的ドメインには、受容体結合ドメイン（ＲＢＤドメイン）、Ｓ１ ＮＴＤドメイン、及びＳ２ドメインが含まれるが、これらに限定されない。これらのドメインは当該技術分野で知られている（例えばＷｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７，１２６０－１２６３（２０２０）を参照されたい）。
【0165】
コロナウイルススパイクタンパク質に結合する本発明によるアンキリンリピートドメインを表１に提供する。
【0166】
【表1】
【0167】
したがって、一実施形態では、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。
【0168】
一実施形態では、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。
【0169】
一実施形態では、本発明は、第１のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１のアンキリンリピートドメインが、表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、組換え結合タンパク質に関する。
【0170】
表１に列挙されるアンキリンリピートドメインは、二重特異性または多重特異性の分子を提供するために任意の方法で組み合わせることができる。第１、第２、及び第３のアンキリンリピートドメインは、同一の配列を有し得る。第１、第２、及び第３のアンキリンリピートドメインは、異なる配列を有し得る。
【0171】
したがって、一実施形態では、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。
【0172】
一実施形態では、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。
【0173】
一実施形態では、本発明は、第２のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第２のアンキリンリピートドメインが、表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、組換え結合タンパク質に関する。
【0174】
一実施形態では、本発明は、上で定義されるような、第３のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。
【0175】
一実施形態では、本発明は、上で定義されるような、第３のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、上で定義されるような、第３のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１、７６、及び７７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、上で定義されるような、第３のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、上記の表１に示される、配列番号１～１１からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。
【0176】
一実施形態では、本発明は、上で定義されるような、第３のアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第３のアンキリンリピートドメインが、表１に示される、配列番号１～１１、７６、７７、及び８５からなる群から選択される、組換え結合タンパク質に関する。
【0177】
本発明はさらに、以下のようなアミノ酸配列を有し、Ｎ末端からＣ末端に向かって配置される、第１、第２、及び第３のアンキリンリピートドメインの特定の組み合わせに関する：
（ｉ）配列番号６、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号４、２、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４、６、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号６、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号７、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号８、４、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号３、６、及び７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号４、１、及び８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号３、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号９、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号９、６、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号３、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１０、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１１、９、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号５、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１、２、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号３、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号６、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号７、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号８、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号６、１０、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号３、１０、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号５、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号９、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号９、６、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号５、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｘ）配列番号６、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘ）配列番号１０、９、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉ）配列番号１１、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号３、７６、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３、８５、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
（ｉ）配列番号６、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号４、２、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４、６、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号６、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号７、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号８、４、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号３、６、及び７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号４、１、及び８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号３、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号９、３、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号９、６、及び１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号３、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１０、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１１、９、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号５、１、及び３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１、２、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号３、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号６、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号７、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号８、５、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号６、１０、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号３、１０、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号５、６、及び９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号９、３、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号９、６、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号５、９、及び１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｉｘ）配列番号６、９、及び１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘ）配列番号１０、９、及び５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉ）配列番号１１、９、及び６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号３、７６、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３、８５、及び７７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【0178】
一実施形態では、本発明は、上に挙げた実施形態（ｘｘ）による組換え結合タンパク質に関する。さらなる実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号６８と、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号６８のアミノ酸配列を有する。
【0179】
一実施形態では、本発明は、上に挙げた実施形態（ｘｘｖｉｉｉ）による組換え結合タンパク質に関する。さらなる実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号６９と、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号６９のアミノ酸配列を有する。
【0180】
一実施形態では、本発明は、上に挙げた（ｘｘｘｉｉ）による組換え結合タンパク質に関する。さらなる実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号７９と、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を有する。
【0181】
一実施形態では、本発明は、上に挙げた（ｘｘｘｉｉｉ）による組換え結合タンパク質に関する。さらなる実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号８９～９１からなる群から選択される配列と、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号８９～９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0182】
別の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。別の実施形態では、スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。
【0183】
別の実施形態では、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む本発明の組換え結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でコロナウイルススパイクタンパク質に結合する。別の実施形態では、スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。
【0184】
別の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、第１、第２、及び／または第３のアンキリンリピートドメインを含み、前記第１、第２、及び／または第３のアンキリンリピートドメインは、約１００ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でコロナウイルススパイクタンパク質に結合する。別の実施形態では、スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。
【0185】
例示的な実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約９００ｐＭ以下、約８００ｐＭ以下、約７００ｐＭ以下、約６００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２５ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１５ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下のＫD値でコロナウイルススパイクタンパク質、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合する。例示的な一実施形態では、組換え結合タンパク質は、約１０ｎＭ以下のＫD値でコロナウイルススパイクタンパク質、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合する。別の例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、約１ｎＭ以下のＫD値でコロナウイルススパイクタンパク質、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合する。
【0186】
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質は、ヒトコロナウイルススパイクタンパク質である。特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質は、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。
【0187】
特定の実施形態では、組換え結合タンパク質は、少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合ドメインをさらに含み得る。実施形態では、少なくとも１つのヒト血清アルブミンドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方に位置し得る。
【0188】
特定の実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号４７～４９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号４７と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0189】
さらなる実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約３０時間、好ましくは少なくとも約３５時間、より好ましくは少なくとも約４０時間、より好ましくは少なくとも約４５時間の終末相半減期を有する。前記終末相半減期は、好ましくは、実施例９に記載されるように、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて決定される。
【0190】
アンキリンリピートドメインの特に好ましい組み合わせを表２に挙げる。ここで、Ｈはヒト血清アルブミンを表し、Ｒ３ｂ、Ｒ２ａなどは上記の表１で定義した通りである：
【表2】
【0191】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。
【0192】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号１２～４２、及び７５からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号１２～４２からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。
【0193】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号１２～４２、７５、８４、８７、及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。
【0194】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組換え結合タンパク質であって、コロナウイルスによる細胞の感染を阻害することができる、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組換え結合タンパク質であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を阻害することができる、組換え結合タンパク質に関する。
【0195】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号３１と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号３１のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約１０ｐＭ未満、または約１ｐＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４５時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約４０時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、５０℃を超える、６０℃を超える、７０℃を超える、または８０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、アミノ酸配列、結合親和性、終末相半減期、熱安定性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス阻害のＩＣ50、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害のＩＣ50に関して、このパラグラフに挙げた特性から選択される２、３、４、５、または６つの特性の組み合わせを有する。例示的な一実施形態では、本発明はポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記結合タンパク質が約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合し、前記結合タンパク質が、マウスにおいて少なくとも約４０時間の終末相半減期を有し、前記結合タンパク質が、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示し、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害し、及び／または、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する、組換え結合タンパク質に関する。
【0196】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号３９と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号３９のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約１０ｐＭ未満、または約１ｐＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４５時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約２０時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、５０℃を超える、６０℃を超える、７０℃を超える、または８０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、アミノ酸配列、結合親和性、終末相半減期、熱安定性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス阻害のＩＣ50、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害のＩＣ50に関して、このパラグラフに挙げた特性から選択される２、３、４、５、または６つの特性の組み合わせを有する。一実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号３９と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記結合タンパク質が約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合し、前記結合タンパク質が、マウスにおいて少なくとも約２０時間の終末相半減期を有し、前記結合タンパク質が、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示し、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害し、及び／または、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する、組換え結合タンパク質に関する。
【0197】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号７５と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号７５のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約１０ｐＭ未満、または約１ｐＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４５時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約３０時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、５０℃を超える、６０℃を超える、７０℃を超える、または８０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、アミノ酸配列、結合親和性、終末相半減期、熱安定性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス阻害のＩＣ50、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害のＩＣ50に関して、このパラグラフに挙げた特性から選択される２、３、４、５、または６つの特性の組み合わせを有する。一実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号７５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記結合タンパク質が約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合し、前記結合タンパク質が、マウスにおいて少なくとも約３０時間の終末相半減期を有し、前記結合タンパク質が、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示し、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害し、及び／または、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する、組換え結合タンパク質に関する。
【0198】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号８４と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号８４のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約１０ｐＭ未満、または約１ｐＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４５時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約４０時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、５０℃を超える、６０℃を超える、７０℃を超える、または８０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、アミノ酸配列、結合親和性、終末相半減期、熱安定性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス阻害のＩＣ50、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害のＩＣ50に関して、このパラグラフに挙げた特性から選択される２、３、４、５、または６つの特性の組み合わせを有する。一実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８４と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記結合タンパク質が約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合し、前記結合タンパク質が、マウスにおいて少なくとも約４０時間の終末相半減期を有し、前記結合タンパク質が、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示し、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害し、及び／または、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する、組換え結合タンパク質に関する。
【0199】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号８７と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号８７のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約１０ｐＭ未満、または約１ｐＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４５時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約３５時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、５０℃を超える、６０℃を超える、７０℃を超える、または８０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、アミノ酸配列、結合親和性、終末相半減期、熱安定性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス阻害のＩＣ50、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害のＩＣ50に関して、このパラグラフに挙げた特性から選択される２、３、４、５、または６つの特性の組み合わせを有する。一実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記結合タンパク質が約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合し、前記結合タンパク質が、マウスにおいて少なくとも約３５時間の終末相半減期を有し、前記結合タンパク質が、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示し、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害し、及び／または、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する、組換え結合タンパク質に関する。
【0200】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、配列番号８８と、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、組換え結合タンパク質に関する。別の実施形態では、組換え結合タンパク質はポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号８８のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約１０ｐＭ未満、または約１ｐＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４５時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、マウスにおいて少なくとも約４０時間の終末相半減期を有する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）で前記コロナウイルススパイクタンパク質に結合する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、５０℃を超える、６０℃を超える、７０℃を超える、または８０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示す。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する。一実施形態では、前記結合タンパク質は、アミノ酸配列、結合親和性、終末相半減期、熱安定性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス阻害のＩＣ50、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害のＩＣ50に関して、このパラグラフに挙げた特性から選択される２、３、４、５、または６つの特性の組み合わせを有する。一実施形態では、本発明は、ポリペプチドを含む組換え結合タンパク質であって、前記ポリペプチドが配列番号８８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記結合タンパク質が約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合し、前記結合タンパク質が、マウスにおいて少なくとも約４０時間の終末相半減期を有し、前記結合タンパク質が、６０℃を超えるＴｍで高い熱安定性を示し、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスのウイルス侵入を阻害し、及び／または、前記結合タンパク質が、１ｎＭ以下のＩＣ50値で、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を阻害する、組換え結合タンパク質に関する。
【0201】
半減期延長部分
「半減期延長部分」は、半減期延長部分のない同じタンパク質と比較して、本明細書に記載の組換え結合タンパク質のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
「半減期延長部分」は、半減期延長部分のない同じタンパク質と比較して、本明細書に記載の組換え結合タンパク質のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【0202】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、本明細書で「血清アルブミン結合ドメイン」とも呼ばれる、血清アルブミン（好ましくはヒト血清アルブミンなど）に特異的に結合するアンキリンリピートドメインを含む。本明細書に記載の組換え結合タンパク質はまた、１つを超える血清アルブミン結合ドメイン、例えば、２つ、または３つ、またはそれ以上の血清アルブミン結合ドメインを含み得る。したがって、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、第１及び第２の血清アルブミン結合ドメイン、または第１、第２、及び第３の血清アルブミン結合ドメインを含み得る。以下に提供される実施形態は、そのような第１の血清アルブミン結合ドメイン、第２の血清アルブミン結合ドメイン、及び／または第３の血清アルブミン結合ドメインを記載する。
【0203】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号４７～４９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、血清アルブミン結合ドメインを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号４７～４９のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号４７と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号４７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0204】
いくつかの実施形態では、２つ以上の血清アルブミン結合ドメインが好ましい。いくつかの実施形態では、２つの血清アルブミン結合ドメインがＮ末端に位置する。例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）血清アルブミンに特異的に結合するアンキリンリピートドメイン；（ｉｉ）血清アルブミンに特異的に結合するアンキリンリピートドメイン；及び（ｉｉｉ）コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する１つ以上のアンキリンリピートドメインを含む。特定の実施形態では、Ｎ末端血清アルブミン結合ドメイン（本明細書では血清アルブミン結合ドメイン１とも呼ばれる）は、配列番号４７と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２の血清アルブミン結合ドメイン（本明細書では血清アルブミン結合ドメイン２とも呼ばれる）は、配列番号４７と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0205】
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンドメインはＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプ：ＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＥ（ε）、またはＩｇＡ（α）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプまたはサブタイプ：ＩｇＧ1（γ１）、ＩｇＧ2（γ２）、ＩｇＧ3（γ３）、ＩｇＧ4（γ４）、ＩｇＡ1（α１）、ＩｇＡ2（α２）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ1のＦｃドメインである。
【0206】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの中断されていない天然配列（すなわち、野生型配列）を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、改変された生物学的活性をもたらすバリアントＦｃドメインを含む。例えば、エフェクター活性を低減または排除するために（例えば、国際特許公開第ＷＯ２００５／０６３８１５）、及び／または組換え結合タンパク質の産生中の均一性を高めるために、少なくとも１つの点変異または欠失をＦｃドメインに導入することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ1のＦｃドメインであり、以下のエフェクターヌル置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ（Ｅｕナンバリング）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣ末端位置（すなわち、ＥｕナンバリングによるＫ４４７）に位置するリジンを含まない。リジンが存在しないと、組換え結合タンパク質の産生中の均一性が高まり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｃ末端位置（Ｋ４４７、Ｅｕナンバリング）に位置するリジンを含む。
【0207】
アンキリンリピートドメイン
いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリンリピートドメインにおいて、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換（複数可）は、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列を含むタンパク質のＫD値と比較して、１０００倍を超えて、１００倍を超えて、または１０倍を超えてＫD値を変化させない。特定の実施形態では、置換は、表３による保存的置換である。特定の実施形態では、置換は、アンキリンリピートドメインの構造コア残基の外側、例えばアルファヘリックスを接続するベータループにおいて行われる。
いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリンリピートドメインにおいて、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列と比較して１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換（複数可）は、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５の配列を含むタンパク質のＫD値と比較して、１０００倍を超えて、１００倍を超えて、または１０倍を超えてＫD値を変化させない。特定の実施形態では、置換は、表３による保存的置換である。特定の実施形態では、置換は、アンキリンリピートドメインの構造コア残基の外側、例えばアルファヘリックスを接続するベータループにおいて行われる。
【0208】
【表3】
【0209】
特定の実施形態では、置換は、アンキリンリピートドメインの構造コア残基内で行われる。例えば、アンキリンドメインはコンセンサス配列：ＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘｌＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡｘ（配列番号５０）（式中、「ｘ」は任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、もしくはプロリンではない）を示す）；またはＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡＡｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡｘ（配列番号５１）、（式中、「ｘ」は任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、もしくはプロリンではない）を表し、「ｚ」はアスパラギン、ヒスチジン、もしくはチロシンからなる群から選択される）を含む。一実施形態では、置換は、「ｘ」と指定された残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」で示される残基の外側で行われる。
【0210】
さらに、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリンリピートドメインの最後から２番目の位置は、「Ａ」もしくは「Ｌ」であり得、及び／または最後の位置は「Ａ」もしくは「Ｎ」であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、それぞれのアンキリンリピートドメインは、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、任意選択で最後から２番目の位置のＡがＬで置換されている、及び／または最後の位置のＡはＮで置換されている、アミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、それぞれのスパイクタンパク質結合ドメインは、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５のいずれか１つと９０％同一であり、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されている、及び／または最後の位置のＡがＮで置換されている、アミノ酸配列を含む。さらに、本発明の結合タンパク質に含まれるいずれかのアンキリンリピートドメインの配列は、任意選択でそのＮ末端にＧ、Ｓ、またはＧＳを含み得る（下記参照）。
【0211】
さらに、本発明の組換え結合タンパク質に含まれるそれぞれのアンキリンリピートドメインは、任意選択で、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、または「ＧＳ」配列を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、それぞれのアンキリンリピートドメインは、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、かつそのＮ末端にＧＳをさらに含む（例えば、配列番号１～１１、４７、７６、７７、及び８５にあるように）か、またはＧＳの代わりにＧまたはＳのみを含む、アミノ酸配列を含む。
【0212】
特定の実施形態では、組換え結合タンパク質とその標的（スパイクタンパク質または血清アルブミン）との間の親和性は、ＫDの単位として記載される。例示的な実施形態では、ＫDは、約１０-1Ｍ以下、約１０-2Ｍ以下、約１０-3Ｍ以下、約１０-4Ｍ以下、約１０-5Ｍ以下、約１０-6Ｍ以下、約１０-7Ｍ以下、約１０-8Ｍ以下、約１０-9Ｍ以下、約１０-10Ｍ以下、約１０-11Ｍ以下、約１０-12Ｍ以下、約１０-13Ｍ以下、約１０-14Ｍ以下、約１０-5Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-13Ｍ、または約１０-10Ｍ～約１０-13Ｍである。
【0213】
例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、約９００ｎＭ以下、約８００ｎＭ以下、約７００ｎＭ以下、約６００ｎＭ以下、約５００ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約９００ｐＭ以下、約８００ｐＭ以下、約７００ｐＭ以下、約６００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下のＫD値でスパイクタンパク質または血清アルブミンに結合する。例示的な一実施形態では、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下のＫD値でスパイクタンパク質または血清アルブミンに結合する。別の例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、１０ｎＭ以下のＫD値でスパイクタンパク質または血清アルブミンに結合する。
【0214】
リンカー
本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、リンカーを含み得る。「リンカー」は、２つの別個の実体（例えば、図１に示すＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１とＤＡＲＰｉｎ２（登録商標））を互いに結合する分子または分子群であり、２つの実体の間に間隔と柔軟性を提供して、それぞれの標的に結合できる立体配座を達成できる。タンパク質リンカーが特に好ましく、それらは、当該技術分野で周知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、組換え結合タンパク質のコンポーネントとして発現させることができる。
本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、リンカーを含み得る。「リンカー」は、２つの別個の実体（例えば、図１に示すＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１とＤＡＲＰｉｎ２（登録商標））を互いに結合する分子または分子群であり、２つの実体の間に間隔と柔軟性を提供して、それぞれの標的に結合できる立体配座を達成できる。タンパク質リンカーが特に好ましく、それらは、当該技術分野で周知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、組換え結合タンパク質のコンポーネントとして発現させることができる。
【0215】
アンキリンリピートドメインは、例えば、ジスルフィド結合、ポリペプチド結合、または架橋剤によって共有結合的に、または非共有結合的に、連結され、ヘテロ二量体タンパク質を生成することができる。組換え結合タンパク質は、コロナウイルススパイク結合ドメインと任意選択の半減期延長部分との間にリンカーを含むことができる。
【0216】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、ペプチジルリンカーである。いくつかの実施形態では、プチジルリンカーは、約１～５０のアミノ酸残基を含む。例示的なリンカーとしては、例えば、グリシンリッチペプチド；グリシン及びセリンを含むペプチド；配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］n（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）を有するペプチド；または配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］n（配列番号５４）（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）を有するペプチドが挙げられる。グリシンリッチペプチドリンカーは、残基の少なくとも２５％がグリシンであるペプチドリンカーを含む。グリシンリッチペプチドリンカーは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２２（２）：１５３－１６７）。
【0217】
いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、プロリン－トレオニンリッチリンカーである。例示的な実施形態では、リンカーは、配列番号５２のプロリン－トレオニンリッチペプチドリンカーである。別の例示的な実施形態では、リンカーは、配列番号５３のプロリン－トレオニンリッチペプチドリンカーである。
【0218】
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。より長いプロリン－トレオニンリッチペプチドリンカーの例は、配列番号８４及び８８に見られる。
【0219】
Ｎ末端及びＣ末端のキャッピング配列
本明細書に開示される組換え結合タンパク質のアンキリンリピートドメインは、Ｎ末端またはＣ末端のキャッピング配列を含み得る。キャッピング配列とは、アンキリンリピート配列モチーフ（複数可）のＮ末端またはＣ末端に融合された追加のポリペプチド配列を指し、前記キャッピング配列は、アンキリンリピート配列モチーフ（複数可）と緊密な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、側面のアンキリンリピートドメインの疎水性コアが溶媒に露出するのを防ぐキャップを提供する。
本明細書に開示される組換え結合タンパク質のアンキリンリピートドメインは、Ｎ末端またはＣ末端のキャッピング配列を含み得る。キャッピング配列とは、アンキリンリピート配列モチーフ（複数可）のＮ末端またはＣ末端に融合された追加のポリペプチド配列を指し、前記キャッピング配列は、アンキリンリピート配列モチーフ（複数可）と緊密な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、側面のアンキリンリピートドメインの疎水性コアが溶媒に露出するのを防ぐキャップを提供する。
【0220】
Ｎ－及び／またはＣ末端のキャッピング配列は、リピート単位に隣接する天然に存在するリピートタンパク質に見出されるキャッピング単位または他の構造単位に由来し得る。キャッピング配列の例は、国際特許公開番号ＷＯ２００２／０２０５６５とＷＯ２０１２／０６９６５５、米国特許公開番号ＵＳ２０１３／０２９６２２１におおいて、及びＩｎｔｅｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４によって記載されている。Ｎ末端アンキリンリピートキャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピングリピート）の例は、配列番号５５～５７であり、アンキリンリピートＣ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピングリピート）の例は、配列番号５８を含む。
【0221】
核酸及び方法
一実施形態では、本発明は、本明細書で定義される組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
一実施形態では、本発明は、本明細書で定義される組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0222】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号７０または配列番号７０と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0223】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号７１または配列番号７１と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0224】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号７２または配列番号７２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0225】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号７３または配列番号７３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0226】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号７４または配列番号７４と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0227】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号８０または配列番号８０と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0228】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号８１または配列番号８１と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0229】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号８２または配列番号８２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0230】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号８３または配列番号８３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0231】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号７８または配列番号７８と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0232】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号８６または配列番号８６と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0233】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号９２または配列番号９２と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0234】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号９３または配列番号９３と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0235】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号９４または配列番号９４と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0236】
一実施形態では、本発明は、前記核酸が、配列番号９５または配列番号９５と同じアミノ酸配列をコードするそのバリアントを含むか、またはそれらからなる、先行実施形態の１つに記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0237】
本発明はさらに、前記核酸分子を含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
【0238】
本発明はさらに、前記核酸分子または前記ベクターを含む宿主細胞に関する。
【0239】
一実施形態では、本発明は、本明細書で定義される組換え結合タンパク質を作製する方法であって、前記組換え結合タンパク質が発現する条件下で本明細書で定義される宿主細胞を培養することを含む、方法に関する。
【0240】
組成物、使用、及び治療方法
本明細書に記載の組換え結合タンパク質を使用して、コロナウイルスに感染した対象を治療することができる。一実施形態では、対象はコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している。
本明細書に記載の組換え結合タンパク質を使用して、コロナウイルスに感染した対象を治療することができる。一実施形態では、対象はコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している。
【0241】
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書で定義される結合タンパク質または核酸と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
【0242】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含んでもよい。標準的な薬学的担体としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水または水／油のエマルションなどのエマルション、及びさまざまな種類の湿潤剤が挙げられる。
【0243】
医薬組成物は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアゾール噴射剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固剤、抗菌防腐剤、酸化防止剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、皮膚軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、フィルム形成剤、風味増強剤、香料、フローエンハンサー、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜接着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、トローチ剤基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶剤、安定剤、座薬基剤、界面活性剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、増粘剤、吸水剤、水混和性共溶媒、水軟化剤、または湿潤剤を含む、任意の薬学的に許容される成分を含むことができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）を参照されたい。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）を参照されたい。
【0244】
医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、例えば、約４もしくは約５と約８．０との間、または約４．５と約７．５との間、または約５．０と約７．５との間であり得る。例示的な実施形態では、医薬組成物のｐＨは５．５から７．５の間である。
【0245】
別の実施形態では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を治療する方法であって、前記方法が、本明細書で定義されるいずれか１つに記載の少なくとも１つの結合タンパク質の有効量、または本明細書で定義される核酸の有効量、または本明細書で定義される医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法に関する。対象は、治療方法が投与された場合、重症度の異なるコロナウイルス感染症に関連する症状のいずれかを示している可能性がある。
【0246】
いくつかの実施形態では、治療方法の単回投与で十分であり得る。他の実施形態では、反復投与が必要な場合がある。対象の年齢及び一般的な健康状態、対象のコロナウイルス感染の状態、ならびにコロナウイルス感染に関連する症状の重症度など、さまざまな因子が投与の回数と頻度に影響を及ぼす。
【0247】
いくつかの実施形態では、この方法は、予防方法、すなわち対象におけるコロナウイルス感染を予防する方法である。そのような方法では、本明細書で定義される少なくとも１つの結合タンパク質の有効量、または本明細書で定義される核酸の有効量、または本明細書で定義される医薬組成物の有効量が対象に投与される。典型的には、予防方法が投与された場合、対象はコロナウイルス感染症に関連する症状を示さない。
【0248】
いくつかの実施形態では、予防方法の単回投与で十分であり得る。他の実施形態では、反復投与が必要な場合がある。対象の年齢及び一般的な健康状態、ならびに対象のコロナウイルスへの曝露のリスクなど、さまざまな因子が投与の回数と頻度に影響を及ぼす。
【0249】
特定の実施形態では、コロナウイルス感染はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【0250】
本明細書に記載の結合タンパク質は、非経口、経鼻、経口、肺、局所、膣、または直腸の投与などの任意の適切な投与経路を介して対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、非経口投与に適した製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の等張無菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液が挙げられる。追加の詳細については、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６））を参照されたい。
【0251】
本明細書に記載の結合タンパク質は、鎮痛剤などの別の治療剤と組み合わせて使用することができる。それぞれの治療剤は、同時に（例えば、同じ医薬で、または同時に）、同時に（すなわち、別々の医薬で、任意の順序で次々に投与される）、または任意の順序で逐次的に投与することができる。併用療法における治療剤が異なる剤形である場合（例えば、ある薬剤が錠剤またはカプセルであり、別の薬剤が無菌液体である場合）、及び／または、それらが異なる投与スケジュールで投与される場合、例えば、少なくとも１日１回投与される鎮痛薬と、週に１回または２週間に１回など、より少ない頻度で投与される生物療法薬との場合、逐次投与は有用であり得る。
【0252】
検出または診断の方法
一実施形態では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を診断する方法で使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つの結合タンパク質に関する。
一実施形態では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を診断する方法で使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つの結合タンパク質に関する。
【0253】
一実施形態では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を診断する方法であって、対象からの試料をインビトロまたはエクスビボで、本明細書に記載の少なくとも１つの結合タンパク質と接触させるステップを含む、前記方法に関する。
【0254】
一実施形態では、本発明は、対象におけるコロナウイルスを検出する方法であって、前記方法は、
ａ）対象から試料を得ることと；
ｂ）前記試料を、本明細書に記載の少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることと；
（ｃ）コロナウイルスの存在を検出することと、を含む、方法に関する。
ａ）対象から試料を得ることと；
ｂ）前記試料を、本明細書に記載の少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることと；
（ｃ）コロナウイルスの存在を検出することと、を含む、方法に関する。
【0255】
前記方法及び使用において、試料は、血液、脳脊髄液、血漿、または尿などの体液から得ることができる。試料はまた、粘液から（鼻腔、口腔咽頭、もしくは膣スワブなどを介して）得てもよく、または固形組織試料（例えば、生検から）であってもよい。
【0256】
試料は、これらの方法のいずれかで使用する前に保存できる。例えば、試料は、前記方法で使用する前に、適切な期間、極低温凍結に供することができる。
【0257】
前記方法及び使用において、対象は、重症度の異なるコロナウイルス感染に関連する症状を示している可能性がある。代替的に、対象は無症候性であり得る。この方法及び使用は、死因を調査するために、生きていない対象から得られた試料に対しても実施することもできる。
【実施例】
【0258】
以下に開示する出発物質及び試薬は当業者に知られており、市販されており、及び／または周知の技術を用いて調製することができる。
【0259】
物質
化学薬品はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得た。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）またはＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）から得た。誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ発現株、例えばＥ．ｃｏｌｉＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）またはＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）をクローニング及びタンパク質産生に使用した。
化学薬品はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得た。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）またはＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）から得た。誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ発現株、例えばＥ．ｃｏｌｉＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）またはＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）をクローニング及びタンパク質産生に使用した。
【0260】
分子生物学
別段の記載がない限り、既知のプロトコール（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照された）に従って方法を実施する。
別段の記載がない限り、既知のプロトコール（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照された）に従って方法を実施する。
【0261】
細胞及びウイルス
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ）から購入したＶｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１５８６（商標））を、１０％のＦＢＳ及び補充成分（２ｍＭのＬ－グルタミン、非必須アミノ酸及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及びＨＥＰＥＳ、すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手）を含む細胞培養培地ＤＭＥＭ（ＦＧ０４４５）中で、３７℃、ＣＯ2なしで継代した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ／ＩＤＦ０３７２／２０２０）を、２％ＦＢＳ及び補充成分（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ）を含むＭＥＭ中のＶｅｒｏ Ｅ６細胞内で３７℃で増殖させた。ウイルスは、実験期間中、密閉ホイル（Ｂｉｏｒａｄ，ｍｉｃｒｏｓｅａｌ Ｂ－ｆｉｌｍ，ＭＳＢ １００１）で覆われた通気口のないフラスコ、２４ウェルまたは９６ウェルプレートでＣＯ2なしで培養した。
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ）から購入したＶｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１５８６（商標））を、１０％のＦＢＳ及び補充成分（２ｍＭのＬ－グルタミン、非必須アミノ酸及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及びＨＥＰＥＳ、すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手）を含む細胞培養培地ＤＭＥＭ（ＦＧ０４４５）中で、３７℃、ＣＯ2なしで継代した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ／ＩＤＦ０３７２／２０２０）を、２％ＦＢＳ及び補充成分（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ）を含むＭＥＭ中のＶｅｒｏ Ｅ６細胞内で３７℃で増殖させた。ウイルスは、実験期間中、密閉ホイル（Ｂｉｏｒａｄ，ｍｉｃｒｏｓｅａｌ Ｂ－ｆｉｌｍ，ＭＳＢ １００１）で覆われた通気口のないフラスコ、２４ウェルまたは９６ウェルプレートでＣＯ2なしで培養した。
【0262】
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリー
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３（示した場所）；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所）に記載されている。そのような方法により、ランダム化されたアンキリンリピートモジュール及び／またはランダム化されたキャッピングモジュールを有する設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを構築できる。例えば、そのようなライブラリーは、固定されたＮ末端キャッピングモジュールまたはランダム化されたＮ末端キャッピングモジュール、１つ以上のランダム化リピートモジュール、及び固定されたＣ末端キャッピングモジュールまたはランダム化されたＣ末端キャッピングモジュールに基づいて適宜組み立てることができる。好ましくは、そのようなライブラリーは、リピートまたはキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）、及びＰのいずれも有しないように組み立てられる。
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３（示した場所）；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所）に記載されている。そのような方法により、ランダム化されたアンキリンリピートモジュール及び／またはランダム化されたキャッピングモジュールを有する設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを構築できる。例えば、そのようなライブラリーは、固定されたＮ末端キャッピングモジュールまたはランダム化されたＮ末端キャッピングモジュール、１つ以上のランダム化リピートモジュール、及び固定されたＣ末端キャッピングモジュールまたはランダム化されたＣ末端キャッピングモジュールに基づいて適宜組み立てることができる。好ましくは、そのようなライブラリーは、リピートまたはキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）、及びＰのいずれも有しないように組み立てられる。
【0263】
さらに、そのようなライブラリー中のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含み得る。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体の補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリーまたはデノボ生成ペプチドライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとしてヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリンリピートドメインの構造を使用して設計できる（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ，Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）。１０個のアミノ酸が２つのアンキリンリピートの境界近くに存在するベータターンに挿入されるこのアンキリンリピートドメインと同様に、アンキリンリピートタンパク質ライブラリーは、アンキリンリピートドメインの１つ以上のベータターンに挿入された可変長（例えば１～２０個のアミノ酸）のランダム化されたループ（固定された位置及びランダム化された位置で）を含み得る。
【0264】
アンキリンリピートタンパク質ライブラリーの任意のそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ、またはＲＥＬＬＫＡモチーフを有し（例えば、配列番号５５の２１位から２６位までに存在する）、アンキリンリピートタンパク質ライブラリーの任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＫＬＮ、ＫＬＡ、またはＫＡＡモチーフを有する（例えば、配列番号５８の最後の３アミノ酸に存在する）。
【0265】
そのようなアンキリンリピートタンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリンリピートドメインの既知の構造によって導かれ得る。プロテインデータバンク（ＰＤＢ）固有のアクセッションまたは識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別されるこのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。
【0266】
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーなどの設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーの例が記載されている（米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３（示した場所）；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所））。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端キャッピングモジュールとＣ末端キャッピングモジュールの間に存在するランダム化されたリピートモジュールの数を表す。
【0267】
リピート単位とモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所）に基き、アンキリンリピートモジュールとアンキリンリピート単位の境界が１アミノ酸位置だけシフトされているという変更を有する。例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所）のアンキリンリピートモジュールの１位は、本開示のアンキリンリピートモジュールの２位に対応し、その結果、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所）のアンキリンリピートモジュールの３３位は、本開示の次のアンキリンリピートモジュールの位置１に対応する。
【0268】
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合特異性を有するアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質の選択
概要
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＲＢＤドメイン；Ｓ１ ＮＴＤドメイン；Ｓ２ドメイン）の異なるドメインに対する結合特異性を有する複数のアンキリンリピートドメインは、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所）によって記載されたものと同様の方法で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから特定の条件と追加の選択解除ステップで選択された。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質標的ドメインに対する選択されたクローンの結合と特異性は、Ｅ．ｃｏｌｉ粗抽出物均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって評価され、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的結合タンパク質が成功裏に選択されたことを示している。例えば、配列番号１～１１のアンキリンリピートドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合特異性を有するアンキリンリピートドメインを含む選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
概要
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＲＢＤドメイン；Ｓ１ ＮＴＤドメイン；Ｓ２ドメイン）の異なるドメインに対する結合特異性を有する複数のアンキリンリピートドメインは、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所）によって記載されたものと同様の方法で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから特定の条件と追加の選択解除ステップで選択された。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質標的ドメインに対する選択されたクローンの結合と特異性は、Ｅ．ｃｏｌｉ粗抽出物均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって評価され、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的結合タンパク質が成功裏に選択されたことを示している。例えば、配列番号１～１１のアンキリンリピートドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合特異性を有するアンキリンリピートドメインを含む選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
【0269】
標的及び選択材料としてのスパイクタンパク質ドメイン
スパイクタンパク質ドメインは、標的及び選択材料として使用された。選択に使用されたタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメイン（ＳＡＲＳ２－Ｓｅｃｔｏ－ｄ７２－ＧＣＮ４－Ｓｔｒｅｐｔａｇ）、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｓタンパク質（Ｓ１＋Ｓ２ ＥＣＴ、Ｈｉｓ－ｔａｇ；Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ４０５８９－Ｖ０８Ｂ１）、Ｂｉｏ－ＣＯＶＩＤ－１９＿Ｓ１タンパク質＿Ｈｉｓ＿Ａｖｉｔａｇ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＳＡＲＳ２－Ｓ１－Ｆｌａｇ－３Ｓｔｒｅｐｔａｇ、ＣＯＶＩＤ－１９＿Ｓ＿タンパク質＿ＲＢＤ＿Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＳＡＲＳ２－Ｓ１Ｂ－２Ｓｔｒｅｐｔａｇから構成された。そのような標的タンパク質は、配列番号４３～４５及び５９～６７のポリペプチドから選択された。標準的な方法を用いてタンパク質をビオチン化した。
スパイクタンパク質ドメインは、標的及び選択材料として使用された。選択に使用されたタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメイン（ＳＡＲＳ２－Ｓｅｃｔｏ－ｄ７２－ＧＣＮ４－Ｓｔｒｅｐｔａｇ）、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｓタンパク質（Ｓ１＋Ｓ２ ＥＣＴ、Ｈｉｓ－ｔａｇ；Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ４０５８９－Ｖ０８Ｂ１）、Ｂｉｏ－ＣＯＶＩＤ－１９＿Ｓ１タンパク質＿Ｈｉｓ＿Ａｖｉｔａｇ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＳＡＲＳ２－Ｓ１－Ｆｌａｇ－３Ｓｔｒｅｐｔａｇ、ＣＯＶＩＤ－１９＿Ｓ＿タンパク質＿ＲＢＤ＿Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＳＡＲＳ２－Ｓ１Ｂ－２Ｓｔｒｅｐｔａｇから構成された。そのような標的タンパク質は、配列番号４３～４５及び５９～６７のポリペプチドから選択された。標準的な方法を用いてタンパク質をビオチン化した。
【0270】
リボソームディスプレイによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的アンキリンリピートタンパク質の選択
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリー（Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質断片に対するリボソームディスプレイ選択で使用された（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２，５７５－５８２（２００４）；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２６９－２７９（２００７）；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，１４１３０－１４１３５（１９９８）を参照されたい）。
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリー（Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質断片に対するリボソームディスプレイ選択で使用された（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２，５７５－５８２（２００４）；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２６９－２７９（２００７）；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，１４１３０－１４１３５（１９９８）を参照されたい）。
【0271】
標的及びライブラリーごとに４回の選択ラウンドを実行した。４ラウンドの選択では、ラウンド１からラウンド４への選択圧を増加させるために、標的濃度の減少と洗浄ストリンジェンシーの増加を使用する、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用したＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（示した場所））。それぞれの選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数を連続的に減らし、結合剤の濃縮による収量を調整した。次いで、得られた１２個のプールを結合剤スクリーニングに供した。
【0272】
選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＲＢＤ、Ｓ２、及びＳ１－ＮＴＤドメインに特異的に結合する。
【0273】
溶液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＲＢＤ、Ｓ２、及びＳ１－ＮＴＤドメインに特異的に結合する個別に選択されたアンキリンリピートタンパク質は、標準プロトコールを使用して、アンキリンリピートタンパク質発現タンパク質発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞の粗抽出物を使用する均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって同定された。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリンリピートタンパク質クローンをｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ寒天（１％ブドウ糖と５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを、１６５μｌの増殖培地（１％ブドウ糖と５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ）を含む９６ウェルプレートにつついて入れ（それぞれのクローンを単一のウェルに入れる）、３７℃で一晩、８００ｒｐｍで振盪しつつインキュベートした。新鮮な９６ディープウェルプレートに、８．５μｌの一晩培養物とともに、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１５０μｌの新鮮なＬＢ培地を接種した。３７℃、８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベーションした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、６時間続けた。細胞をプレートの遠心分離によって回収し、上清を廃棄し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８．５μｌのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁し、室温で１時間振盪しながら（６００ ｒｐｍ）インキュベートした。次いで、１６０μｌのＰＢＳを添加し、遠心分離（３２２０ｇで１５分間）によって細胞破片を除去した。
【0274】
溶解したそれぞれのクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中の１：２００希釈として、２０ｎＭ（最終濃度）のビオチン化スパイクタンパク質ドメイン、１：４００（最終濃度）の抗６Ｈｉｓ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴアクセプターコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）と一緒に、３８４ウェルプレートのウェルに適用し、４℃で１２０分間インキュベートした。ＨＴＲＦはＴｅｃａｎ Ｍ１０００で、励起波長３４０ｎｍ、バックグラウンド蛍光検出用の６２０±１０ｎｍ発光フィルター、及び特異的結合の蛍光シグナル検出用の６６５±１０ｎｍ発光フィルターを使用して読み取られた。
【0275】
スパイクタンパク質への特異的結合を評価するために、それぞれの溶解クローンの抽出物をビオチン化スパイクタンパク質ドメインへの結合について試験した。
【0276】
結合タンパク質のさらなる分析及び選択
合計９０９の結合剤と阻害剤が特定された。結合プロファイルに基づいて、３６０の候補が選択され、９６ウェル形式で発現され、ＤＮＡ配列決定と並行して均一になるまで精製された。候補は、サイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ熱安定性評価（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，２２１２－２２２１，（２００７）を参照されたい）、ＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）標的親和性評価、ＥＬＩＳＡ、ｈＡＣＥ２－競合ＨＴＲＦ実験、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルス阻害アッセイによって生物物理学的に特性評価された。これらのデータに基づいて、ＲＢＤ、Ｓ１－ＮＴＤ、またはＳ２ドメインに結合する１１の候補（配列番号１～１１）をさらなる分析のために選択した。この分析には、マルチドメイン形式の３１の組み合わせ（配列番号１２～４２）も含まれており、新しい作用機序を探索し、阻害効力、エピトープ及び標的の多様性、配列の多様性、及び／または生物物理学的特性を決定した。マルチドメイン構築物は、以前に記載されたようにギブソンアセンブリを使用して調製された（Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ９，１２６２－１２６９，（２０１７）を参照されたい）。本発明の結合タンパク質は、精製または検出を容易にするためにそれらのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号４６）を付けて発現させ、以下に記載する実験でこのＨｉｓタグ付き形態で試験した。
合計９０９の結合剤と阻害剤が特定された。結合プロファイルに基づいて、３６０の候補が選択され、９６ウェル形式で発現され、ＤＮＡ配列決定と並行して均一になるまで精製された。候補は、サイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ熱安定性評価（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，２２１２－２２２１，（２００７）を参照されたい）、ＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）標的親和性評価、ＥＬＩＳＡ、ｈＡＣＥ２－競合ＨＴＲＦ実験、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルス阻害アッセイによって生物物理学的に特性評価された。これらのデータに基づいて、ＲＢＤ、Ｓ１－ＮＴＤ、またはＳ２ドメインに結合する１１の候補（配列番号１～１１）をさらなる分析のために選択した。この分析には、マルチドメイン形式の３１の組み合わせ（配列番号１２～４２）も含まれており、新しい作用機序を探索し、阻害効力、エピトープ及び標的の多様性、配列の多様性、及び／または生物物理学的特性を決定した。マルチドメイン構築物は、以前に記載されたようにギブソンアセンブリを使用して調製された（Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ９，１２６２－１２６９，（２０１７）を参照されたい）。本発明の結合タンパク質は、精製または検出を容易にするためにそれらのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号４６）を付けて発現させ、以下に記載する実験でこのＨｉｓタグ付き形態で試験した。
【0277】
追加の結合タンパク質の操作
最初に同定された結合タンパク質のさらなる開発では、標的タンパク質に対する、改善された親和性、及び／または標的タンパク質からの低下したオフ速度、またはマウスにおける改善されたなどの改善された薬物動態特性などの特性を有する結合タンパク質が種々の方法を使用して生成された。１つのアプローチでは、最初に同定された結合タンパク質（「親」結合タンパク質）が、親和性成熟のための適切な出発点として選択された。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリンリピートドメインのそれぞれのランダム化された位置の飽和変異導入を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列は、競合ＨＴＲＦによって低いオフ速度についてスクリーニングされた。それによって同定された有益な変異は、タンパク質工学によって結合タンパク質に組み合わされた。親和性が成熟し、操作された結合タンパク質の結合特性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検証された。別のアプローチでは、アンキリンリピートドメインのＮ末端及び／またはＣ末端のキャッピングモジュールの特定のアミノ酸残基は、アンキリンリピートドメイン及びアンキリンリピートドメインを構成するタンパク質の、延長された終末相半減期を含む改善された薬物動態特性を達成するために変更された。そのような改変されたアミノ酸残基は、大部分が表面に露出した残基であった（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０８５８５５を参照されたい）。
最初に同定された結合タンパク質のさらなる開発では、標的タンパク質に対する、改善された親和性、及び／または標的タンパク質からの低下したオフ速度、またはマウスにおける改善されたなどの改善された薬物動態特性などの特性を有する結合タンパク質が種々の方法を使用して生成された。１つのアプローチでは、最初に同定された結合タンパク質（「親」結合タンパク質）が、親和性成熟のための適切な出発点として選択された。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリンリピートドメインのそれぞれのランダム化された位置の飽和変異導入を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列は、競合ＨＴＲＦによって低いオフ速度についてスクリーニングされた。それによって同定された有益な変異は、タンパク質工学によって結合タンパク質に組み合わされた。親和性が成熟し、操作された結合タンパク質の結合特性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検証された。別のアプローチでは、アンキリンリピートドメインのＮ末端及び／またはＣ末端のキャッピングモジュールの特定のアミノ酸残基は、アンキリンリピートドメイン及びアンキリンリピートドメインを構成するタンパク質の、延長された終末相半減期を含む改善された薬物動態特性を達成するために変更された。そのような改変されたアミノ酸残基は、大部分が表面に露出した残基であった（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０８５８５５を参照されたい）。
【0278】
一例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１－ＮＴＤドメインに対する結合特異性を有するアンキリンリピートドメイン、すなわちｖＳ０７＿０８Ｆ１０ｖ２７（配列番号７６）及びｖＳ０７＿０８Ｆ１０ｖ４７（配列番号８５）は、疎水性を低下させるため及び／またはその標的への結合親和性を増加させるため、及び／またはその標的からのオフ速度減少するために、アンキリンリピートリピートドメインｖＳ０７＿０８Ｆ１０（配列番号９）に多数の変異を導入することによって生成された。疎水性の減少（例えば、Ｎ末端及びＣ末端キャッピングモジュールの残基を改変することによる）は、ＳＥＣによって検出される多量体化の量を減少させ、粘度を低下させ、及び／またはマウスにおける薬物動態特性を改善した。いくつかの変異した残基は、「親」結合タンパク質に対する単一部位変異導入アプローチを使用する親和性成熟プロセスで特定され、これにより、潜在的な結合残基は、縮重プライマーを使用するＰＣＲによって２０アミノ酸すべてにランダム化された。個々のバリアントは、競合ＨＴＲＦスクリーニングを使用して改善されたオフ速度について試験された。いくつかの個々の変異は、ＨＴＲＦシグナルを少なくとも２倍から３倍増加させた。例として、ｖＳ０７＿０８Ｆ１０ｖ４７（配列番号８５）には、以下が含まれる：
ＩＲ１＿Ｖ１１Ｔ：第１の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで２～３倍高いシグナルに基づいて、１１位のバリンがトレオニンに変異された；
ＩＲ２＿Ｓ３Ｋ：第２の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．５～２倍高いシグナルに基づいて、３位のセリンがリジンに変異された；
ＩＲ２＿Ｉ４Ｖ：第２の内部リピートモジュールでは、親タンパク質と比較してオフ速度の改善及びタンパク質の多量体化の減少を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．５～２倍高いシグナルに基づいて、４位のイソロイシンがバリンに変異された；
ＩＲ２＿Ｒ１４Ｑ：第２の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで３倍を超える高いシグナルに基づいて、位置１４のアルギニンがグルタミンに変異された；
ＩＲ２＿Ｖ１５Ｓ：第２の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．５～２倍高いシグナルに基づいて、１５位のバリンがセリンに変異された；
Ｃ＿Ｗ３Ｖ：Ｃ末端キャッピングモジュールでは、親タンパク質と比較してオフ速度の改善及びタンパク質の多量体化の減少を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．２～１．５倍高いシグナルに基づいて、３位のトリプトファンがバリンに変異された；
Ｃ＿Ｉ４Ｖ：Ｃ末端キャッピングモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで２～３倍高いシグナルに基づいて、４位のイソロイシンがバリンに変異された；
Ｃ＿Ｉ６Ｖ：Ｃ末端キャッピングモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで２～３倍高いシグナルに基づいて、６位のイソロイシンがバリンに変異された。
ＩＲ１＿Ｖ１１Ｔ：第１の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで２～３倍高いシグナルに基づいて、１１位のバリンがトレオニンに変異された；
ＩＲ２＿Ｓ３Ｋ：第２の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．５～２倍高いシグナルに基づいて、３位のセリンがリジンに変異された；
ＩＲ２＿Ｉ４Ｖ：第２の内部リピートモジュールでは、親タンパク質と比較してオフ速度の改善及びタンパク質の多量体化の減少を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．５～２倍高いシグナルに基づいて、４位のイソロイシンがバリンに変異された；
ＩＲ２＿Ｒ１４Ｑ：第２の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで３倍を超える高いシグナルに基づいて、位置１４のアルギニンがグルタミンに変異された；
ＩＲ２＿Ｖ１５Ｓ：第２の内部リピートモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．５～２倍高いシグナルに基づいて、１５位のバリンがセリンに変異された；
Ｃ＿Ｗ３Ｖ：Ｃ末端キャッピングモジュールでは、親タンパク質と比較してオフ速度の改善及びタンパク質の多量体化の減少を示すＨＴＲＦ競合アッセイで１．２～１．５倍高いシグナルに基づいて、３位のトリプトファンがバリンに変異された；
Ｃ＿Ｉ４Ｖ：Ｃ末端キャッピングモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで２～３倍高いシグナルに基づいて、４位のイソロイシンがバリンに変異された；
Ｃ＿Ｉ６Ｖ：Ｃ末端キャッピングモジュールでは、オフ速度の改善を示すＨＴＲＦ競合アッセイで２～３倍高いシグナルに基づいて、６位のイソロイシンがバリンに変異された。
【0279】
別の例では、改善された特性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２ドメインに対する結合特異性を有するアンキリンリピートドメイン、すなわち配列番号７７のアンキリンリピートドメインは、アンキリンリピートドメインｖＳ０７＿１４Ｇ０３（配列番号１０）に多数の変異を導入することによって生成された。
【0280】
配列番号７６、７７、及び８５などの操作された結合タンパク質は、配列番号１～１１について上記したのと同様に生物物理学的に特性評価された。さらに、そのような操作された結合ドメイン（例えば、配列番号７５、８４、８７、及び８８）の１つ以上を含むマルチドメイン形式の組み合わせが生成され、配列番号１２～４２についての上記と同様に、新しい作用機序を探索し、阻害効力、エピトープ及び標的の多様性、配列の多様性、及び／または生物物理学的特性を決定した。
【0281】
実施例２：ＳＰＲ結合アッセイ
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する本発明の結合タンパク質の結合親和性を決定した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する本発明の結合タンパク質の結合親和性を決定した。
【0282】
すべてのＳＰＲデータは、実行緩衝液としてＰＢＳ－Ｔ（０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を使用するＢｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置を使用して生成された。新しいニュートラアビジンセンサーチップ（ＮＬＣ）は、Ｂｉｏ－Ｒａｄのマニュアルに従って空気初期化及び調整された。
【0283】
モノドメインＤＡＲＰｉｎタンパク質：社内で化学的にビオチン化（リジン経由）されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号 ４０５８９－Ｖ０８Ｂ１、ロットＭＦ１４ＭＡ０７０１）を約３４００ＲＵ（３０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｌ／分、３００秒）まで捕捉した。２回の緩衝液注入（１００ｕｌ／分、６０秒）に続いて２回の１２．５ｍＭのＮａＯＨの再生ステップ（１００ｕｌ／分、１８秒）が、最初の注射の前に適用された。モノドメインＤＡＲＰｉｎタンパク質を、会合のために１００ｕｌ／分で１８０秒間、（５０／１６．７／５．６／１．９／０．６ｎＭ（または、配列番号９及び１０については１６．７／５．６／１．９／０．６ｎＭ）で）注入し、３６００秒間（１００ｕｌ／分で）、解離を記録した。リガンドは、１２．５ｍＭのＮａＯＨパルスで再生された（１００ｕｌ／分、１８秒）。データは、空の表面と緩衝液注入に対して二重に参照され、１：１ラングミュアモデルに従ってフィッティングされた。
【0284】
マルチドメインＤＡＲＰｉｎタンパク質：社内で化学的にビオチン化（リジン経由）されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）Ｓタンパク質ＲＢＤ（からログＳＰＤ－Ｃ５２５５、ロットＢＶ３５３９ｂ－２０３ＦＦ１－２０３Ｋ）を、約１０００ＲＵ（７７５ｎｇ／ｍｌ、３０ｕｌ／分、３００秒）まで捕捉した。２回の緩衝液注入（１００ｕｌ／分、６０秒）に続いて２回の１２．５ｍＭのＮａＯＨの再生ステップ（１００ｕｌ／分、１８秒）が、最初の注射の前に適用された。会合のために、それぞれのマルチドメインＤＡＲＰｉｎ構築物（例えば、ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０３０、ＡＬＥ０３８、ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５８を含む）の２５ｎＭの単一濃度を、会合のために１００ｕｌ／分で１８０ 秒間注入し、解離が３６０００秒間（１００ｕｌ／分）記録された。データは、空の表面と緩衝液注入に対して二重に参照された。結合力の増加により、測定時間中に有意な解離を記録することはできなかった。
【0285】
ＳＰＲアッセイの例示的な結果は、図６、９ａ～ｃ、１５ａ、１６、及び１７、ならびに表４に示されている。実施例４も参照されたい。
【0286】
配列番号１～１１によるアンキリンリピートドメインは、ＳＰＲを使用して、特定のコロナウイルススパイクタンパク質ドメインへの結合親和性について試験された（示されない限り、マルチトレース）。さらに、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、熱安定性測定（Ｔｍ）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス中和アッセイなど、本明細書の実施例に記載の方法を使用して、他の生物物理学的及び機能的特性も試験した。
【0287】
結果は、以下の図９ａ～ｃならびに表４ａ及び４ｂに示す。
【0288】
【表4】
【表5】
【0289】
配列番号１～８は、標的物質としてｂｉｏ－ＲＢＤ Ｆｃ Ａｃｒｏ（配列番号４５）及びｂｉｏ－Ｓ１ Ａｃｒｏ（配列番号４３）を使用して、表４ａに示されるのと同様の親和性で、スパイクタンパク質のＲＢＤドメインまたはＳ１ドメインに結合することがＳＰＲによって示された。配列番号９は、標的物質としてｂｉｏ－Ｓ１ Ａｃｒｏ（配列番号４３）を使用して、２．０Ｅ－０８ＭのＫD（シングルトレース）でスパイクタンパク質のＳ１ドメインに結合することが示された。配列番号９及び配列番号１０は、標的物質としてＳ ｅｃｔｏ Ｕ（配列番号６１）を使用して、それぞれ１．２Ｅ－０９ Ｍ及び７．９Ｅ－１０ＭのＫDでスパイクタンパク質の外部ドメインに結合することが示された（図９ｃ参照）。配列番号７６は、配列番号９で観察されたのとほぼ同じＫDでスパイクタンパク質のＳ１ドメインまたは外部ドメインに結合することが示されたが、配列番号８５は、配列番号９または配列番号７６よりもさらに高い結合親和性（すなわち、より低いＫD）でスパイクタンパク質のＳ１ドメインまたは外部ドメインに結合することが見出された。配列番号１０、１１、及び７７は、例えばＨＴＲＦアッセイによって、スパイクタンパク質のＳ２ドメインに結合することが示された。表４ｂは、配列番号３、５、６、９、及び１０のそれぞれが、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて単量体であったことを示している。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスに対して試験した場合、高い熱安定性（＞８５℃）及びナノモル範囲のＩＣ50値（例えば、２ｎＭ未満）が配列番号のいくつかについて示されている。
【0290】
マルチドメインＤＡＲＰｉｎタンパク質については、結合力の増加により、測定時間中に有意な解離を記録できなかった（例えば、図１５ａ、１６、及び１７を参照されたい）。マルチドメインタンパク質（例えば、ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ０５８のものを含む）の見かけの親和性は、ＳＰＲの限界を超えており、サブｐＭの標的親和性を示している（データ示さず）。
【0291】
実施例３：機能スクリーニング
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスアッセイを使用するモノドメイン及びマルチドメインのタンパク質の機能スクリーニングについて記載する。このアッセイの結果を図５～８に示す。
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスアッセイを使用するモノドメイン及びマルチドメインのタンパク質の機能スクリーニングについて記載する。このアッセイの結果を図５～８に示す。
【0292】
感染阻害は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）偽ウイルスアッセイ（ｐｓＶＳＶ）を使用して評価された。このアッセイでは、ＶＳＶの糖タンパク質が、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）でタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の武漢バリアントに置き換えられていた。１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの候補の添加後の感染の阻害は、ＥＧＦＰ及びＬＵＣの活性の単純な定量化によって測定された（Ｔｏｒｒｉａｎｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５３１，５７－６８（２０１９）を参照されたい）。
【0293】
図５及び７は、それぞれ、スパイクタンパク質の単一の部位（モノドメインＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）と、スパイクタンパク質の３つの部位（マルチドメインＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）に結合する種々の組換え結合タンパク質の１００ｎＭでの偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス阻害を示す。バーが短いほど、ウイルス阻害が強いことを示す。図８は、図７を繰り返するが、１ｎＭにおけるものである。図６ は、モノドメイン組換え結合タンパク質の代表的なＳＰＲトレースを示す。このデータは、出願人がサブナノモルの抗ウイルス活性を有するマルチドメインＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の構造を迅速に確立できたことを示している。組換え結合タンパク質のさらなる合理的な設計は、効力をさらに増大させた。
【0294】
実施例 ４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス（ＰｓＶ ｎＣｏＶ）を使用する中和アッセイ
細胞
Ｖｅｒｏ Ｅ６、９ Ｃｏｓｔａｒ ３６１０、透明底、白色プレートに播種した。
細胞
Ｖｅｒｏ Ｅ６、９ Ｃｏｓｔａｒ ３６１０、透明底、白色プレートに播種した。
【0295】
疑ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＰｓＶ ｎＣｏＶ）
２０００ＩＵ／ウェル （２５μＬ）
８０’０００ＩＵ／ｍＬ＝８×１０4ＩＵ／ｍＬ
４０００ＩＵ／ウェルにより、１．６×１０5ＩＵ／ｍＬとなった。
２０００ＩＵ／ウェル （２５μＬ）
８０’０００ＩＵ／ｍＬ＝８×１０4ＩＵ／ｍＬ
４０００ＩＵ／ウェルにより、１．６×１０5ＩＵ／ｍＬとなった。
【0296】
プレートあたり１００×３５μＬ。４ｍＬのウイルス×８プレート＝３２ｍＬを調製。
【0297】
約１×１０6ＩＵ／ｍＬでＣ１５を得た。
【0298】
２６ｍＬの培地２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）に６ｍｌのストック。全部で３２ｍＬ
【表6】
【0299】
ヒト血清アルブミン
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の３．０ｍＭのストック溶液を使用して、ＨＳＡの１０μＭの溶液を調製した。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の３．０ｍＭのストック溶液を使用して、ＨＳＡの１０μＭの溶液を調製した。
【0300】
この溶液の培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、及び２０μＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）を含んでいた。
【0301】
試料希釈
２倍希釈液を調製した。それぞれの希釈液を１体積（ＰｓＶ ｎＣｏＶ）と混合した。
２倍希釈液を調製した。それぞれの希釈液を１体積（ＰｓＶ ｎＣｏＶ）と混合した。
【0302】
試料１～１４：２０μＭでストック
１００ｎＭで３００μＬ（四重、４×７０μＬ）を調製した。
１００ｎＭで３００μＬ（四重、４×７０μＬ）を調製した。
【0303】
希釈１：／１／１０：
ストック２０μＭの１５μＬ＋１３５μＬのＰＢＳを取った、最終濃度２μＭ
希釈２：１／２０：
希釈１の１５μＬ＋２８５μＬの２０μＭのＨＳＡと２％ＦＣＳを含むデミリューＤＭＥＭをとった。
ストック２０μＭの１５μＬ＋１３５μＬのＰＢＳを取った、最終濃度２μＭ
希釈２：１／２０：
希釈１の１５μＬ＋２８５μＬの２０μＭのＨＳＡと２％ＦＣＳを含むデミリューＤＭＥＭをとった。
【0304】
最終濃度１００ｎＭ
陰性対照：
希釈１陰性対照。
陰性対照：
希釈１陰性対照。
【0305】
希釈１：／１／１６．５：
ストック１６７μＭの１０μＬ＋１５７μＬのＰＢＳを取った、最終濃度１０μＭ
希釈２：１／１０：
ストック１０μＭの１５μＬ＋１３５μＬのＰＢＳを取った、最終濃度１μＭ
希釈３：／１／１０：
希釈２の３０μＬ＋２７０μＬの２０μＭのＨＳＡと２％ＦＣＳを含むデミリューＤＭＥＭをとった。
ストック１６７μＭの１０μＬ＋１５７μＬのＰＢＳを取った、最終濃度１０μＭ
希釈２：１／１０：
ストック１０μＭの１５μＬ＋１３５μＬのＰＢＳを取った、最終濃度１μＭ
希釈３：／１／１０：
希釈２の３０μＬ＋２７０μＬの２０μＭのＨＳＡと２％ＦＣＳを含むデミリューＤＭＥＭをとった。
【0306】
陽性対照：
１００ｎＭで３００μＬ（四重、４×７０μＬ）を調製した。
１００ｎＭで３００μＬ（四重、４×７０μＬ）を調製した。
【0307】
希釈１：／１／１０：
ストック１０μＭの１５μＬ＋１３５μＬのＰＢＳを取った、最終濃度１μＭ
希釈２：１／１０：
希釈１の３０μＬ＋２７０μＬの２０μＭのＨＳＡと２％ＦＣＳを含むデミリューＤＭＥＭをとった。最終濃度１００ｎＭ
ストック１０μＭの１５μＬ＋１３５μＬのＰＢＳを取った、最終濃度１μＭ
希釈２：１／１０：
希釈１の３０μＬ＋２７０μＬの２０μＭのＨＳＡと２％ＦＣＳを含むデミリューＤＭＥＭをとった。最終濃度１００ｎＭ
【0308】
準備
・ Ｖ底プレートに
・ 試料の最初の１／１０希釈を調製した。必要体積４×７０μｌ＝２８０μｌ。２％ＦＣＳ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む３００μｌの培地を調製した
・ 四重の試料に７０μｌを分注した
・ Ｖ底プレートで２倍希釈を実施した
・ Ｖ底プレートに
・ 試料の最初の１／１０希釈を調製した。必要体積４×７０μｌ＝２８０μｌ。２％ＦＣＳ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む３００μｌの培地を調製した
・ 四重の試料に７０μｌを分注した
・ Ｖ底プレートで２倍希釈を実施した
【0309】
方法及び結果
３７℃で１時間インキュベーションする前に、１体積（３５μｌ）のＰｓＶ ｎＣＯＶをそれぞれのウェルに添加した。次いで、細胞を５０μｌ／ウェルで感染させ、再び３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、接種物を除去し、１５０μｌの培地２％ＦＣＳを添加し、３７℃で１６時間の最終インキュベーションをした。最終インキュベーション期間の後、アッセイを停止し、倒立蛍光顕微鏡を使用して、感染した細胞（ＥＧＦＰ＋）を適切な希釈でカウントした。細胞の固定は必要なかった。次いでルシフェラーゼアッセイを行った。細胞培地の一部を除去し（１５０μｌから１００μｌ）、５０μｌのＧｌｏｗ（ＰＲＯＭＥＧＡ）をそれぞれのウェルに加えた。結果は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ（登録商標）ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１照度計を約１秒間使用して読み取った。ソフトウェアＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用してデータを分析し、結果を表６に示す。
３７℃で１時間インキュベーションする前に、１体積（３５μｌ）のＰｓＶ ｎＣＯＶをそれぞれのウェルに添加した。次いで、細胞を５０μｌ／ウェルで感染させ、再び３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、接種物を除去し、１５０μｌの培地２％ＦＣＳを添加し、３７℃で１６時間の最終インキュベーションをした。最終インキュベーション期間の後、アッセイを停止し、倒立蛍光顕微鏡を使用して、感染した細胞（ＥＧＦＰ＋）を適切な希釈でカウントした。細胞の固定は必要なかった。次いでルシフェラーゼアッセイを行った。細胞培地の一部を除去し（１５０μｌから１００μｌ）、５０μｌのＧｌｏｗ（ＰＲＯＭＥＧＡ）をそれぞれのウェルに加えた。結果は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ（登録商標）ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１照度計を約１秒間使用して読み取った。ソフトウェアＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用してデータを分析し、結果を表６に示す。
【0310】
【表7】
【0311】
試料１～１４は、１．５ｎＭ未満のＩＣ50、ほとんどの場合０．７ｎＭ未満を示し、疑似ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な阻害剤であることが判明した。試料２及び１１は特に強力であり、ＩＣ50は０．１ｎＭ未満であった。図５は、ＧＦＰ標識されたＶＳＶ偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染したＧＦＰ陽性のＶｅｒｏ Ｅ０６細胞を示す蛍光顕微鏡画像を示す。図５のＡＬＥ０４３は、上記の表６の試料番号１２に対応する。ＡＣＯ２６８とｖＳ０７＿Ｍ１０１Ｅ０４は、それぞれ陰性対照と陽性対照である。
【0312】
図１１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスの中和を示している。
【0313】
図１２は、試料１（ＡＬＥ０３０）、４（ＡＬＥ０３３）、９（ＡＬＥ０３８）、１３（ＡＬＥ０４２）、及び１４（ＡＬＥ０４３）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスの中和を示している。陽性対照も含まれている（ｖＳ０７＿Ｍ１０１Ｅ０４）。
【0314】
図１１及び１２では、候補の滴定は、５０ｎＭ～５０ｐＭ（２ 倍希釈）であった。１０μＭのＨＳＡの存在は、アッセイに影響を及ぼさないようであった（ＨＳＡ結合剤を含まない対照Ｍ１０１Ｅ０４を参照されたい）。結果は、半減期が延長されたマルチドメイン構築物がＰｓＶ ｎＣｏＶの強力な阻害剤であり、ＩＣ50値が約１００ｐＭであることを示している。
【0315】
実施例５：ウイルス中和活性；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の微量滴定アッセイ（オープンセルシステム）
この実施例では、試料はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ウイルス試料（すなわち、偽ウイルスではない）に対して試験された。以下の表８に示す化合物の試料は、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、及び０．００６４ｎＭの希釈で調製した。
この実施例では、試料はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ウイルス試料（すなわち、偽ウイルスではない）に対して試験された。以下の表８に示す化合物の試料は、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、及び０．００６４ｎＭの希釈で調製した。
【0316】
【表8】
【0317】
以下の対照試料も調製した：
・ 抗体陽性血清（患者由来）：１：１００、１：５００、１：２５００、１：６２５、…
・ 抗体陰性血清：１：１００、１：５００、１：２５００、１：６２５、…
・ 陰性対照ＤＡＲＰｉｎタンパク質：ＡＣＯ２６８、ＨＳＡ結合ＤＡＲＰｉｎタンパク質
・ ＡＣＥ２
・ ウイルス逆滴定
培地：ＭＥＭ、２％ＦＣＳ、Ｌ－Ｇｌｕｔ、ＮＥＡＡ、Ｎｅｏ、Ｐｅｎ Ａｄｄ：１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）希釈ストック１：３００
・ 抗体陽性血清（患者由来）：１：１００、１：５００、１：２５００、１：６２５、…
・ 抗体陰性血清：１：１００、１：５００、１：２５００、１：６２５、…
・ 陰性対照ＤＡＲＰｉｎタンパク質：ＡＣＯ２６８、ＨＳＡ結合ＤＡＲＰｉｎタンパク質
・ ＡＣＥ２
・ ウイルス逆滴定
培地：ＭＥＭ、２％ＦＣＳ、Ｌ－Ｇｌｕｔ、ＮＥＡＡ、Ｎｅｏ、Ｐｅｎ Ａｄｄ：１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）希釈ストック１：３００
【0318】
アッセイの前日に、試験する化合物２つにつき、コンフルエントなＶｅｒｏＥ６細胞（オープンシステム）を含む９６ウェルプレートを調製した。すべての試験は三重で実行された。図１３は、縁の周りの境界ゾーン、及び０．００６４～１００ｎｍまでのそれぞれの希釈値についての三重のウェル、及び対照ウェルを含む試験プレートのマップを示している。
【0319】
試料を、２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含む１ｍｌの培地中で１００ｎＭに希釈した。２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含む１００μｌの培地は、行４～１１のすべてのウェルに加えられた。１００μｌの希釈した試験化合物または対照（１００ｎＭ）を、行２に加え、１２５μｌを行３に加えた。行３から開始して行１０まで、上の列の２５μｌを下の列と混合することによって（毎回、液体をピペットで上下に５回移動させてウェルを完全に混合した）１：５に段階希釈した。
【0320】
ＭＥＭ、２％ＦＣＳ、１０μＭのＨＳＡ中で１０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌでプレートあたり６ｍｌのウイルス懸濁液を調製した（ＴＣＩＤ５０は５０％の組織培養感染量である）。１００μｌのウイルス懸濁液（１００ＴＣＩＤ５０）を行３～１０のそれぞれのウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＶｅｒｏＥ６細胞を含む９６ウェルプレートから培地を除去した。２００μｌの試験化合物／ウイルス混合物を細胞を含む９６ウェルプレートに移し、プレートを３７℃で３日間インキュベートした。次いで、ＣＰＥを顕微鏡及びクリスタルバイオレット染色によって決定した。
【0321】
実施例４の結果を図１４ａ～１４ｆに示す。青色の細胞は１００％の活性を示す。無色の細胞は活動がないことを示す。明確に示されるように、３２ｐＭまで細胞のほぼ完全な防御があり、本発明の組換え結合タンパク質がコロナウイルススパイクタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の非常に強力な阻害剤であることを示している。
【0322】
実施例６：ウイルス中和活性；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の微量滴定アッセイ（オープンセルシステム）
この実施例では、アンキリンリピート結合ドメインをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して試験した。以下の表９に示すアンキリンリピート結合ドメインの試料を、２００ｎＭ、１００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ、及び０．２ｎＭの希釈で調製した。
この実施例では、アンキリンリピート結合ドメインをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して試験した。以下の表９に示すアンキリンリピート結合ドメインの試料を、２００ｎＭ、１００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ、及び０．２ｎＭの希釈で調製した。
【0323】
【表9】
【0324】
以下の対照試料も調製した：
・ ＡＣＥ２ １００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ
・ ウイルス逆滴定
使用された材料：ビオチン化ヒトＡＣＥ－２ Ｆｃ、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＣ２－Ｈ８２Ｆ９）
培地：ＭＥＭ、２％ＦＣＳ、Ｌ－Ｇｌｕｔ、ＮＥＡＡ、Ｎｅｏ、Ｐｅｎ Ａｄｄ：１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）希釈ストック１：３００
・ ＡＣＥ２ １００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ
・ ウイルス逆滴定
使用された材料：ビオチン化ヒトＡＣＥ－２ Ｆｃ、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＣ２－Ｈ８２Ｆ９）
培地：ＭＥＭ、２％ＦＣＳ、Ｌ－Ｇｌｕｔ、ＮＥＡＡ、Ｎｅｏ、Ｐｅｎ Ａｄｄ：１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）希釈ストック１：３００
【0325】
アッセイの前日に、試験する化合物２つにつき、コンフルエントなＶｅｒｏＥ６細胞（オープンシステム）を含む９６ウェルプレートを調製した。すべての試験は四重で実行された。図１３のように、それぞれの９６ウェルプレートは、境界ゾーン、次いで、２００ｎｍ～０．２ｎＭの異なる濃度のウェルの行が含まれていた。
【0326】
試料を、２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含む１ｍｌの培地中で２００ｎＭに希釈した。２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含む１００μｌの培地をすべてのウェルに加えた。ＡＣＥ２対照ウェルは、示された濃度のＡＣＥ２を使用して類似の方法で調製された。
【0327】
ＭＥＭ、２％ＦＣＳ、１０μＭのＨＳＡ中で１０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌでプレートあたり１０ｍｌのウイルス懸濁液を調製した。１００μｌのウイルス懸濁液（１００ＴＣＩＤ５０）を、プレートの端のウェル（すなわち境界ウェル）を除いて、それぞれのウェルに添加した。プレートを密封して３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＶｅｒｏＥ６細胞を含む９６ウェルプレートから培地を除去した。２００μｌの試験化合物／ウイルス混合物を細胞を含む９６ウェルプレートに移し、プレートを密封し、３７℃で２～３日間インキュベートした。次いで、ＣＰＥを顕微鏡またはメチルブルー染色によって決定した。
【0328】
実施例５の結果を図１８ａ～１８ｄに示す。青色の細胞は１００％の活性を示す。無色の細胞は活動がないことを示す。明確に示されるように、２０ｎＭまで、またはそれ以下でさえ、細胞の完全な、またはほぼ完全な防御があり、本発明の組換え結合タンパク質がコロナウイルススパイクタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の非常に強力な阻害剤であることを示している。具体的には、完全な防御が、ｖＳ０７＿１２Ｃ０６について２ｎＭまで、ｖＳ０７＿２９Ｂ１０及びｖＳ０７＿２３Ｅ０４について２０ｎＭまで、ｖＳ０７＿１９Ｇ１０について１００ｎＭまで（２０ｎＭでほぼ完全な防御）で観察された。ｖＳ０７＿１４Ｇ０３について、部分的な防御が、２～２００ｎＭで観察された。
【0329】
実施例７：ウイルス中和活性；低濃度範囲でのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の滴定
生きているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を阻害する本発明の組換え結合タンパク質の能力をさらに調査するために、ｉ）ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）及びｉｉ）クリスタルバイオレット染色によってＶｅｒｏ Ｅ０６細胞の細胞生存率を測定する２つの異なるアッセイを実施した。試験した試料を表１０に示し、結果を図１９に示す。
生きているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を阻害する本発明の組換え結合タンパク質の能力をさらに調査するために、ｉ）ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）及びｉｉ）クリスタルバイオレット染色によってＶｅｒｏ Ｅ０６細胞の細胞生存率を測定する２つの異なるアッセイを実施した。試験した試料を表１０に示し、結果を図１９に示す。
【0330】
【表10】
【0331】
すべての試料は２０μＭストックで提供され、最初に１０μＭのＨＳＡを含む２％ＦＣＳ培地中で８００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、６．２５ｐＭ、及び３．１２５ｐＭに希釈され、次いでウイルス懸濁液で１：２にさらに希釈された。
【0332】
調製
・ 試験の前日に、２つの化合物あたり８０％コンフルエントなＶｅｒｏＥ６細胞（オープンシステム）を含む９６ウェルプレートを準備した（化合物は三重で試験される）。
・ 試験の前日に、２つの化合物あたり８０％コンフルエントなＶｅｒｏＥ６細胞（オープンシステム）を含む９６ウェルプレートを準備した（化合物は三重で試験される）。
【0333】
・ 化合物を、２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含む、１ｍｌのＭＥＭ培地で８００ｐＭに希釈した。
【0334】
・ すべての化合物は、２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含む、１００μｌのＭＥＭ培地で１００μｌの希釈化合物を混合することにより１：２で段階希釈された。
【0335】
・ 試験での境界効果を避けるために、境界ウェルはフリー（細胞と培地のみ）に保たれた。
【0336】
・ 細胞に対する化合物の非特異的効果を特定するために、化合物と細胞のみを含む対照行が予見された（対照；行２）
・ ３行目～９行目まで、化合物は、２００ｐＭから３．１２５ｐＭまで１：２に段階的に希釈された。
・ ３行目～９行目まで、化合物は、２００ｐＭから３．１２５ｐＭまで１：２に段階的に希釈された。
【0337】
・ 行１０及び１１において、２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含むＭＥＭ培地をウイルス対照及び細胞対照用に追加した。
【0338】
試験手順
プレートのレイアウトは、図１３に示したレイアウトと同様であったが、化合物濃度は上記のとおりである。
プレートのレイアウトは、図１３に示したレイアウトと同様であったが、化合物濃度は上記のとおりである。
【0339】
・ ２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含むＭＥＭ培地中の１０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ／ＩＤＦ０３７２／２０２０）を含むウイルス懸濁液（プレートあたり１０ｍｌ）
・ １００μｌのウイルス懸濁液（１００ＴＣＩＤ５０）を行３～１０のそれぞれのウェルに加え、他のすべてのウェルには培地を加えた。
・ １００μｌのウイルス懸濁液（１００ＴＣＩＤ５０）を行３～１０のそれぞれのウェルに加え、他のすべてのウェルには培地を加えた。
【0340】
・ プレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【0341】
・ ８０％コンフルエントのＶｅｒｏＥ６細胞培地を含む９６ウェルプレートから培地を除去し、２００μｌの試験化合物／ウイルス混合物を細胞を含む９６ウェルプレートに加えた。
【0342】
・ 培養物を３７℃で３日間インキュベートした
・ ｑＰＣＲによるウイルスゲノムコピーの分析について：１００μｌの上清を４００μｌのＡＶＬ緩衝液＋４００μｌの１００％ＥｔＯＨで不活性化－＞不活性化された上清はＢＳＬ３ラボから流出した
・ 細胞生存率を決定するために：１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質を調製し、製造業者のプロトコールに従って添加し、プレートを２分間振盪し、蛍光赤色をＧｌｏＭａｘ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。
・ ｑＰＣＲによるウイルスゲノムコピーの分析について：１００μｌの上清を４００μｌのＡＶＬ緩衝液＋４００μｌの１００％ＥｔＯＨで不活性化－＞不活性化された上清はＢＳＬ３ラボから流出した
・ 細胞生存率を決定するために：１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質を調製し、製造業者のプロトコールに従って添加し、プレートを２分間振盪し、蛍光赤色をＧｌｏＭａｘ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。
【0343】
結果
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光生存率アッセイによる試験の結果を図１９に示す。ＶＫ：ウイルス対照；ＺＫ：細胞対照。Ｖｅｒｏ Ｅ０６細胞の完全な防御は、約２５ｐＭの試験化合物で観察された。ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４２、及びＡＬＥ０４８では、細胞の完全な防御が２５ｐＭまで観察された。ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５３、及びＡＬＥ０５８に対する防御は幾分効果が低かったが、細胞の少なくとも部分的な防御は、これらの化合物についても２５ｐＭで観察された。結論として、本発明のマルチドメイン結合タンパク質は、ピコモル濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を阻害することができる。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光生存率アッセイによる試験の結果を図１９に示す。ＶＫ：ウイルス対照；ＺＫ：細胞対照。Ｖｅｒｏ Ｅ０６細胞の完全な防御は、約２５ｐＭの試験化合物で観察された。ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４２、及びＡＬＥ０４８では、細胞の完全な防御が２５ｐＭまで観察された。ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５３、及びＡＬＥ０５８に対する防御は幾分効果が低かったが、細胞の少なくとも部分的な防御は、これらの化合物についても２５ｐＭで観察された。結論として、本発明のマルチドメイン結合タンパク質は、ピコモル濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を阻害することができる。
【0344】
実施例８：配列番号３１（ＡＬＥ０４９）または配列番号３９（ＡＬＥ０５８）を含む多重特異性結合タンパク質のさらなる特性評価
配列番号３１または配列番号３９のアミノ酸配列を含む多重特異性結合タンパク質のさらなる特性評価には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（結果：分解なしの完全に無傷のサイズ；データ示さず）、質量分析（結果：予想される分子量；データ示さず）、静的光散乱組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー、円偏光二色性、保存安定性（結果：６０℃で１週間安定；データ示さず）、血清安定性（結果：血清中 ３７℃で１週間安定；データ示さず）、表面プラズモン共鳴、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルス阻害アッセイ、生ウイルス阻害アッセイ、マウス薬物動態分析（実施例９を参照されたい）、及びハムスター有効性モデル（実施例１０を参照されたい）が含まれていた。
配列番号３１または配列番号３９のアミノ酸配列を含む多重特異性結合タンパク質のさらなる特性評価には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（結果：分解なしの完全に無傷のサイズ；データ示さず）、質量分析（結果：予想される分子量；データ示さず）、静的光散乱組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー、円偏光二色性、保存安定性（結果：６０℃で１週間安定；データ示さず）、血清安定性（結果：血清中 ３７℃で１週間安定；データ示さず）、表面プラズモン共鳴、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルス阻害アッセイ、生ウイルス阻害アッセイ、マウス薬物動態分析（実施例９を参照されたい）、及びハムスター有効性モデル（実施例１０を参照されたい）が含まれていた。
【0345】
実験方法と結果
円偏光二色性
円偏光二色性測定は、キュベットに挿入されたモニターセンサーを備えた１ｃｍの光路長のキュベット（Ｈｅｌｌｍａ）を使用して、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１５で実行された。２２２ｎｍでのＭＲＥは、２０℃から９０℃までの温度勾配（加熱及び冷却）で追跡された。１９０～２５０ｎｍのスペクトルは、２０℃での可変温度測定の前後に取得された。タンパク質はＰＢＳで０．２５μＭで測定された。
円偏光二色性
円偏光二色性測定は、キュベットに挿入されたモニターセンサーを備えた１ｃｍの光路長のキュベット（Ｈｅｌｌｍａ）を使用して、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１５で実行された。２２２ｎｍでのＭＲＥは、２０℃から９０℃までの温度勾配（加熱及び冷却）で追跡された。１９０～２５０ｎｍのスペクトルは、２０℃での可変温度測定の前後に取得された。タンパク質はＰＢＳで０．２５μＭで測定された。
【0346】
表面プラズモン共鳴親和性決定
ＳＰＲアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する多重特異性結合タンパク質の結合親和性を決定するために使用された。ＳＰＲ実験は、実施例２に記載のように行った。
ＳＰＲアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する多重特異性結合タンパク質の結合親和性を決定するために使用された。ＳＰＲ実験は、実施例２に記載のように行った。
【0347】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスアッセイ
結合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスアッセイで阻害効力について評価された。このアッセイは、例えば実施例３及び４に詳細に記載されているように実施した。
結合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽型ウイルスアッセイで阻害効力について評価された。このアッセイは、例えば実施例３及び４に詳細に記載されているように実施した。
【0348】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスアッセイ
結合タンパク質は、実施例５に記載されるのと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスアッセイにおいて阻害効力について評価された。簡潔に述べると、結合タンパク質は、以下に記載されるように、以下の培地：ＭＥＭ、２％ ＦＣＳ、Ｌ－Ｇｌｕｔ、ＮＥＡＡ、Ｎｅｏ、Ｐｅｎ、１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を添加（希釈ストック１：３００）を使用して、９６ウェルプレート中で、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、及び０．００６４ｎＭの希釈で調製された。すべての試験は三重で実行された。アッセイの前日に、試験する化合物２つにつき、コンフルエントなＶｅｒｏＥ６細胞（オープンシステム）を含む９６ウェルプレートを調製した。試験プレートは、図１３に示すのと同様に、縁の周りの境界ゾーン、及び０．００３２ｎＭ～５０ｎｍまでのそれぞれの最終希釈値についての三重のウェル、及び対照ウェルを含んで設計された。試料を、２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含む１ｍｌの培地中で１００ｎＭに希釈した。２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含む１００μｌの培地は、行４～１１のすべてのウェルに加えられた。１００μｌの希釈した試験化合物または対照（１００ｎＭ）を、行２に加え、１２５μｌを行３に加えた。行３から開始して行１０まで、上の列の２５μｌを下の列と混合することによって（毎回、液体をピペットで上下に５回移動させてウェルを完全に混合した）１：５で段階希釈した。１プレートあたり６ｍｌのウイルス懸濁液をＭＥＭ、２％ＦＣＳ、１０μＭのＨＳＡ中１’０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌで調製した。レーン３～１０のそれぞれのウェルに１００μｌのウイルス懸濁液（１００ＴＣＩＤ５０）を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＶｅｒｏＥ６細胞を含む９６ウェルプレートから培地を除去した。２００μｌの試験化合物／ウイルス混合物を細胞を含む９６ウェルプレートに移し、プレートを３７℃で３日間インキュベートした。次いで、細胞変性効果を、顕微鏡及びクリスタルバイオレット染色によって決定した。ここで、青色の細胞は１００％の活性を示し、無色の細胞は活性がないことを示す（図２０を参照されたい）。代替的に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；図２１ａ～ｃを参照されたい）を使用した。後者については、１’０００、１０’０００、または１００’０００ＴＣＩＤ５０が使用された。
結合タンパク質は、実施例５に記載されるのと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスアッセイにおいて阻害効力について評価された。簡潔に述べると、結合タンパク質は、以下に記載されるように、以下の培地：ＭＥＭ、２％ ＦＣＳ、Ｌ－Ｇｌｕｔ、ＮＥＡＡ、Ｎｅｏ、Ｐｅｎ、１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を添加（希釈ストック１：３００）を使用して、９６ウェルプレート中で、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、及び０．００６４ｎＭの希釈で調製された。すべての試験は三重で実行された。アッセイの前日に、試験する化合物２つにつき、コンフルエントなＶｅｒｏＥ６細胞（オープンシステム）を含む９６ウェルプレートを調製した。試験プレートは、図１３に示すのと同様に、縁の周りの境界ゾーン、及び０．００３２ｎＭ～５０ｎｍまでのそれぞれの最終希釈値についての三重のウェル、及び対照ウェルを含んで設計された。試料を、２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び１０μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含む１ｍｌの培地中で１００ｎＭに希釈した。２％ＦＣＳ及び１０μＭのＨＳＡを含む１００μｌの培地は、行４～１１のすべてのウェルに加えられた。１００μｌの希釈した試験化合物または対照（１００ｎＭ）を、行２に加え、１２５μｌを行３に加えた。行３から開始して行１０まで、上の列の２５μｌを下の列と混合することによって（毎回、液体をピペットで上下に５回移動させてウェルを完全に混合した）１：５で段階希釈した。１プレートあたり６ｍｌのウイルス懸濁液をＭＥＭ、２％ＦＣＳ、１０μＭのＨＳＡ中１’０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌで調製した。レーン３～１０のそれぞれのウェルに１００μｌのウイルス懸濁液（１００ＴＣＩＤ５０）を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＶｅｒｏＥ６細胞を含む９６ウェルプレートから培地を除去した。２００μｌの試験化合物／ウイルス混合物を細胞を含む９６ウェルプレートに移し、プレートを３７℃で３日間インキュベートした。次いで、細胞変性効果を、顕微鏡及びクリスタルバイオレット染色によって決定した。ここで、青色の細胞は１００％の活性を示し、無色の細胞は活性がないことを示す（図２０を参照されたい）。代替的に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；図２１ａ～ｃを参照されたい）を使用した。後者については、１’０００、１０’０００、または１００’０００ＴＣＩＤ５０が使用された。
【0349】
図２０に明確に示されるように、ＡＬＥ０４９とＡＬＥ０５８の両方について０．０８ｎＭまで細胞の完全またはほぼ完全な防御があり、本発明の組み換え結合タンパク質がコロナウイルススパイクタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及びコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染の非常に強力な阻害剤であることを示している。対応する結果を図２１ａ～ｃに示すが、これもＡＬＥ０４９とＡＬＥ０５８の両方に対する強力な阻害を実証している。これらのアッセイで効率的な阻害を達成するために必要な組換え結合タンパク質の正確な濃度は、使用したウイルス負荷に依存していた。ＡＬＥ０４９とＡＬＥ０５８の両方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な阻害がピコモル範囲で観察され、ＡＬＥ０４９では５０ｐＭまで低下した。ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ０５８のＩＣ50値を以下の表１１に示す。これらのウイルス阻害値は、これまでに報告された最も強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害を表している。
【0350】
薬物候補の分子モデル
ＡＬＥ０４９の分子モデル（図２２Ａ）は、極低温電子顕微鏡データ（データ示さず）に基づいて構築された。最初のステップでは、結合ドメインのモデル構造番号２が生成された。コンセンサス設計のアンキリンリピートドメインＰＤＢ：２ｘｅｅがテンプレートとして使用された。変異は固定バックボーンを有するＲｏｓｅｔｔａＲｅｍｏｄｅｌで導入され、構造はＲｏｓｅｔｔａＲｅｌａｘで洗練された。半径０．３ÅのＲｏｓｅｔｔａＣｌｕｓｔｅｒを使用して４０の精密な構造をクラスター化し、最大クラスターからの最低エネルギーモデルを最終モデルとして使用した。次いでこのモデルは、ドメイン番号２のスパイクタンパク質とドメイン番号２の複雑な構造から生成された観察された電子密度へのフィッティングに使用され、ドメイン番号２ＲＢＤの三量体の座標を含むＰＤＢファイルが生成された。この三量体モデルは、図２２Ａに示すように、スパイク外部ドメインに結合したＡＬＥ０４９の概念モデリングの入力構造として使用された。同様に、ＡＬＥ０５８の分子モデルも構築された（図２２Ｂ）。ＡＬＥ０５８のこのモデルは、極低温電子顕微鏡データと、Ｓ２結合ドメインの概略構造予測に基づいている。
ＡＬＥ０４９の分子モデル（図２２Ａ）は、極低温電子顕微鏡データ（データ示さず）に基づいて構築された。最初のステップでは、結合ドメインのモデル構造番号２が生成された。コンセンサス設計のアンキリンリピートドメインＰＤＢ：２ｘｅｅがテンプレートとして使用された。変異は固定バックボーンを有するＲｏｓｅｔｔａＲｅｍｏｄｅｌで導入され、構造はＲｏｓｅｔｔａＲｅｌａｘで洗練された。半径０．３ÅのＲｏｓｅｔｔａＣｌｕｓｔｅｒを使用して４０の精密な構造をクラスター化し、最大クラスターからの最低エネルギーモデルを最終モデルとして使用した。次いでこのモデルは、ドメイン番号２のスパイクタンパク質とドメイン番号２の複雑な構造から生成された観察された電子密度へのフィッティングに使用され、ドメイン番号２ＲＢＤの三量体の座標を含むＰＤＢファイルが生成された。この三量体モデルは、図２２Ａに示すように、スパイク外部ドメインに結合したＡＬＥ０４９の概念モデリングの入力構造として使用された。同様に、ＡＬＥ０５８の分子モデルも構築された（図２２Ｂ）。ＡＬＥ０５８のこのモデルは、極低温電子顕微鏡データと、Ｓ２結合ドメインの概略構造予測に基づいている。
【0351】
配列番号３１（ＡＬＥ０４９）または配列番号３９（ＡＬＥ０５８）のアミノ酸配列を含む多重特異性結合タンパク質はそれぞれ、２つの臨床的に検証された全身半減期延長のための血清アルブミン結合ドメインにＣ末端で融合された３つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合剤の組み合わせを含む。得られた５ドメインタンパク質を発現、精製し、生物物理学的特性、標的親和性、及びウイルス阻害に関して詳細に特性評価した。多重特異性結合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質において高レベルで可溶性形態で発現された。精製されたタンパク質は単量体であり、高い熱安定性（Ｔｍ＞８８℃）、及び円偏光二色性によって評価される可逆的なアンフォールディング、及び６０℃での加速保存安定性アッセイにおける高い安定性（データ示さず）である。それらの見かけの親和性はＳＰＲの限界を超えており、サブｐＭの標的親和性を示している（データ示さず）。ｐｓＶＳＶアッセイでは、多重特異性結合タンパク質は、３ｐＭ～１３８ｐＭまたは０．２４ｎｇ／ｍｌ～１１．０４ｎｇ／ｍｌの範囲のＩＣ50値でウイルス侵入を阻害した（表１１、図２３を参照されたい）。ｐｓＶＳＶアッセイの結果は、生ウイルスアッセイ結果とよく相関し、感染阻害は２５ｐＭ～１００ｐＭまたは２ｎｇ／ｍｌ～８ｎｇ／ｍｌの濃度で観察された（表１１、図２１ａ～ｃを参照されたい）。
【0352】
【表11】
【0353】
図２３は、スパイクタンパク質のＲＢＤドメインの存在下で試験された本発明の組換え結合タンパク質によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルスの中和をさらに示す。図２３は、ＲＢＤドメインが、３つのＲＢＤ結合ドメインを含むＡＬＥ０４９と強力に競合するが、１つのＲＢＤ結合ドメイン、１つのＳ１－ＮＴＤ結合ドメイン、及び１つのＳ２結合ドメインを含むＡＬＥ０５８とは競合しないことを示している。ＡＬＥ０４９は、単離されたＲＢＤドメインと競合すると効力を失ったが、ＡＬＥ０５８における単一のＲＢＤ結合剤の競合は、ＡＬＥ０５８の効力に大きな影響を及ぼさなかった。理論に拘束されることを望むわけではないが、このデータは、ＡＬＥ０４９とＡＬＥ０５８が異なる作用機序によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害することを確認しているようである。ＡＬＥ０４９はＲＢＤ／ＡＣＥ－２相互作用の中和に強く依存しているようであるが、ＡＬＥ０５８は、マルチモード結合と、ＲＢＤ／ＡＣＥ－２相互作用の中和を超えて、分子のＳ１－ＮＴＤ－Ｓ２アームの独立した中和効力も利用する多様な作用機序と、を示しているようである。したがって、図２３に示したデータに基づくと、ＡＬＥ０４９とＡＬＥ０５８は異なる作用機序を持っているように見え、図２２に示した２つの分子の分子モデルと一致している。
【0354】
本発明の結合タンパク質で観察されるような高い効力は、感染開始時の非常に低いウイルス力価が想定されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療及び予防における使用の鍵となる。重要なことに、最も豊富なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２血清型のいくつかのスパイクタンパク質バリアントは、多重特異性結合タンパク質によって高い効力でブロックされ（表１２を参照）、ウイルスエスケープに対する堅牢性と現在のパンデミックにおける予防的治療での使用の可能性を示し、将来のパンデミックの可能性をも示している。マウス実験では、試験した最高用量（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）まで有害事象は観察されなかった。
【0355】
【表12】
【0356】
実施例９：マウスにおける本発明の多重特異性結合タンパク質の薬物動態分析
マウスにおける本発明の多重特異性組換え結合タンパク質のＰＫ特性を評価するために、薬物動態（ＰＫ）試験を実施した。このようなＰＫ特性は、動物薬力学研究、毒物学研究、またはヒト臨床試験における本発明の多重特異性結合タンパク質の用量予測に有用である。
マウスにおける本発明の多重特異性組換え結合タンパク質のＰＫ特性を評価するために、薬物動態（ＰＫ）試験を実施した。このようなＰＫ特性は、動物薬力学研究、毒物学研究、またはヒト臨床試験における本発明の多重特異性結合タンパク質の用量予測に有用である。
【0357】
調査した本発明の多重特異性結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、２つのＨＳＡ特異的結合ドメインとそれに続く３つのスパイクタンパク質特異的結合ドメインを含む（表２を参照されたい）。ＨＳＡ特異的結合ドメインは、マウスの血清アルブミンと交差反応する。
【0358】
このＰＫ研究では、ナイーブなメスＢＡＬＢ／ｃマウスは、化合物の１ｍｇ／ｋｇの目標用量レベルで単回静脈内ボーラス注射を受けた。化合物投与後５分～１６５時間の間のいくつかの時点で血液試料を採取した。血清濃度は、ＥＬＩＳＡベースの分析方法で決定された。
【0359】
６時間以降、濃度－時間プロファイルは、最後のサンプリング時点である１６５時間まで、ほぼ単一指数関数的な減少に似た血清濃度のゆっくりとした着実な減少を示した。濃度時間プロファイルから、非コンパートメント分析を使用して薬物動態パラメーターを決定した。
【0360】
この実施例では、次の多重特異性結合タンパク質を試験した。
【0361】
【表13】
【0362】
インビボ動物実験
試験項目は、尾静脈への単回静脈内ボーラス注射として健康なメスＢＡＬＢ／ｃマウス（試験項目あたり６匹のマウス）に投与された。目標用量レベルは１ｍｇ／ｋｇであった。それぞれの化合物の研究のために、６匹のマウスを同数の動物を持つ２つの群に分けた。薬物動態調査のために、それぞれのマウスから４つずつの血清試料を、５分、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、及び１６５時間の時点で伏在静脈から採取した。それぞれのサンプリング時点への個々の動物の割り当ては、所定のスキームに従った。血液は室温で約３０分間保持して凝固を可能にし、続いて遠心分離した（５分／１２０００ｇ／４℃）。その後、血清を凍結し、分析まで－２０℃で保存した。インビボ実験では、大きな問題や薬物関連の有害作用は報告されなかった。
試験項目は、尾静脈への単回静脈内ボーラス注射として健康なメスＢＡＬＢ／ｃマウス（試験項目あたり６匹のマウス）に投与された。目標用量レベルは１ｍｇ／ｋｇであった。それぞれの化合物の研究のために、６匹のマウスを同数の動物を持つ２つの群に分けた。薬物動態調査のために、それぞれのマウスから４つずつの血清試料を、５分、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、及び１６５時間の時点で伏在静脈から採取した。それぞれのサンプリング時点への個々の動物の割り当ては、所定のスキームに従った。血液は室温で約３０分間保持して凝固を可能にし、続いて遠心分離した（５分／１２０００ｇ／４℃）。その後、血清を凍結し、分析まで－２０℃で保存した。インビボ実験では、大きな問題や薬物関連の有害作用は報告されなかった。
【0363】
ＥＬＩＳＡ法
捕捉のための抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体１－１－１によって認識されるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）部分の共通エピトープと、検出を容易にするために試験された結合タンパク質に存在するＮ－末端のＨｉｓタグとを使用する、ＥＬＩＳＡ法（図２４を参照されたい）を、多重特異性結合タンパク質の血清濃度を測定するために使用した。図２４（結合タンパク質の例としてＡＬＥ０４９を示す）に示すＥＬＩＳＡ設定スキームでは、血清試料中のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）足場エピトープを介して多重特異性結合タンパク質を捕捉する抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体１－１－１に結合する、ＥＬＩＳＡプレートに固定化されたモノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧを使用する。捕捉されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子は、マウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出される。ａＳＡ：抗血清アルブミン、ａＲＢＤ：抗受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）
捕捉のための抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体１－１－１によって認識されるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）部分の共通エピトープと、検出を容易にするために試験された結合タンパク質に存在するＮ－末端のＨｉｓタグとを使用する、ＥＬＩＳＡ法（図２４を参照されたい）を、多重特異性結合タンパク質の血清濃度を測定するために使用した。図２４（結合タンパク質の例としてＡＬＥ０４９を示す）に示すＥＬＩＳＡ設定スキームでは、血清試料中のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）足場エピトープを介して多重特異性結合タンパク質を捕捉する抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体１－１－１に結合する、ＥＬＩＳＡプレートに固定化されたモノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧを使用する。捕捉されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子は、マウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出される。ａＳＡ：抗血清アルブミン、ａＲＢＤ：抗受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）
【0364】
試験手順
ウェルあたり１００μＬのＰＢＳ中の１０ｎｍｏｌ／Ｌのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）をＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コーティングした。ウェルあたり３００μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ１０００シェーカー（４５０ｒｐｍ）で室温（ＲＴ）で１時間、０．２５％カゼインを補充した３００μＬのＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ－Ｃ）でウェルをブロッキングした。上記のようにプレートを洗浄した。ウェルあたり１００μＬの５ｎｍｏｌ／ＬのＰＢＳＴ－Ｃ中のウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。
ウェルあたり１００μＬのＰＢＳ中の１０ｎｍｏｌ／Ｌのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）をＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コーティングした。ウェルあたり３００μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ１０００シェーカー（４５０ｒｐｍ）で室温（ＲＴ）で１時間、０．２５％カゼインを補充した３００μＬのＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ－Ｃ）でウェルをブロッキングした。上記のようにプレートを洗浄した。ウェルあたり１００μＬの５ｎｍｏｌ／ＬのＰＢＳＴ－Ｃ中のウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。
【0365】
ＰＢＳＴ－Ｃ中で希釈した（最終血清濃度が１％（最終血清濃度５％の最初の１：２０希釈）になるようにナイーブマウス血清を補充）、１ウェルあたり１００μＬの希釈血清試料（１：２０～１：３１２５００、１：５希釈ステップ）、多重特異性結合タンパク質の品質管理試料（１００、１０、及び１ｎｍｏｌ／Ｌ）、または多重特異性結合タンパク質標準曲線試料（０、及び５０～０．００１ｎｍｏｌ／Ｌ、１：３希釈ステップ）を４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間適用した。上記のようにプレートを洗浄した。
【0366】
次いで、ウェルをＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μＬのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６）１：２０００とともにインキュベートし、室温、４５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。ＥＬＩＳＡは、ウェルあたり１００μＬのＴＭＢ基質溶液を５分間使用して発色し、ウェルあたり１００μＬの１ｍｏｌ／ＬのＨ2ＳＯ4を添加して停止した。４５０ｎｍでの吸光度と６２０ｎｍでの吸光度の差を計算した。試料は、２つの異なるプレートで二重で測定した。
【0367】
アッセイの性能をモニターするために、既知の濃度の品質管理試料を測定に含めた。
【0368】
ＣｅｒｔａｒａのＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）８．０プログラムを使用して、薬物動態データ分析を実施した。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく研究の薬物動態パラメーターの計算は、非コンパートメント分析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を使用して実行された。
【0369】
計算された薬物動態パラメーターには、少なくとも以下が含まれていた：ＡＵＣｉｎｆ＿ｐｒｅｄ、ＡＵＣラスト、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、ＡＵＣ＿％Ｂａｃｋ＿Ｅｘｔ＿ｐｒｅｄ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２（ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ＿ｚ）。
【0370】
結果を表１４及び図２５に示す。
【0371】
【表14】
【0372】
結果及び結論
単指数排出相では、ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９の血清濃度は、それぞれ４５．８時間、５０．８時間、及び４９．６時間の半減期で減少した。ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９のクリアランスは、それぞれ０．０００９４、０．０００９１、及び０．０００８１Ｌ／（ｈ＊ｋｇ）であると決定された。ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９の分布量（Ｖｓｓ）は、それぞれ０．０５８、０．０６３、及び０．０５５Ｌ／ｋｇと計算された。Ｖｓｓについて決定された値は、モノクローナル抗体と同様に、ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９が動物の全身循環に大きく限定されていることを示している。
単指数排出相では、ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９の血清濃度は、それぞれ４５．８時間、５０．８時間、及び４９．６時間の半減期で減少した。ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９のクリアランスは、それぞれ０．０００９４、０．０００９１、及び０．０００８１Ｌ／（ｈ＊ｋｇ）であると決定された。ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９の分布量（Ｖｓｓ）は、それぞれ０．０５８、０．０６３、及び０．０５５Ｌ／ｋｇと計算された。Ｖｓｓについて決定された値は、モノクローナル抗体と同様に、ＡＬＥ０３３、ＡＬＥ０４８、及びＡＬＥ０４９が動物の全身循環に大きく限定されていることを示している。
【0373】
結論として、用量レベル１ｍｇ／ｋｇでの静脈内投与後、本発明の３つの試験された多重特異性結合タンパク質は、マウスにおけるアルブミンの半減期の範囲の全身半減期を示す。マウス及びヒトにおけるアルブミンの半減期、ならびに以前のデータ（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ９，１２６２－１２６９（２０１７））を考慮すると、ヒトにおけるＡＬＥ０４９の終末相半減期は、約 ３ 週間に外挿されると予想される。ヒトにおけるＡＬＥ０３３及びＡＬＥ０４８の終末相半減期も同様に外挿されると予想される。
【0374】
実施例１０：シリアンハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害有効性実験
ＡＬＥ０４９の有効性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防的治療のシリアンハムスターモデルでさらに評価された。
ＡＬＥ０４９の有効性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防的治療のシリアンハムスターモデルでさらに評価された。
【0375】
シリアンハムスターは、それぞれ６匹のメスの動物の４つの群に分けられた。群は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する１６μｇ、１６０μｇ、または１６００μｇの多重特異性結合タンパク質、またはプラセボで盲検的に処置された。処置注射（ｉｐ、腹腔内）は、５×１０4ＴＣＩＤ５０（１００μｌ中）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｍｕｎｉｃｈ／ＢａｖＰａｔ１／２０２０）による動物の鼻腔内感染（０日目）の２４時間前（－１日目）に行われた。－２日目に、体重を測定し、採血し、最初の喉のスワブを実施した。動物は４日目に安楽死させ、組織を採取し、肉眼的病理学を実施した。喉のスワブをウイルス輸送培地に毎日採取し、等分して保存した。剖検時に、肉眼的病理検査が実施された。肺葉を検査し、背側から見た影響を受けた肺組織のパーセンテージの推定を行った。左肺葉と鼻甲介は、組織病理学のために１０％中性緩衝ホルマリン中で保存された。これらの組織の右側をホモジナイズし、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ及びウイルス力価測定にかけた。さらに、他の臓器が収集された。ウイルス学的分析のために組織試料を凍結し、秤量し、感染培地中でホモジナイズし、力価測定前に短時間遠心分離した。すべての動物の肺甲介及び鼻甲介に対して組織病理学を実施した。１０％ホルマリンで固定した後、左肺及び左鼻甲介の切片をパラフィンに包埋し、組織学的検査のために組織切片をＨ＆Ｅで染色した。ウイルス学的分析では、四重の１０倍段階希釈を使用して、Ｖｅｒｏ Ｅ６のコンフルエント層のウイルス力価を決定した。この目的のために、試料（咽喉スワブ及び組織ホモジネート）の段階希釈を行い、Ｖｅｒｏ Ｅ６単層上で３７℃で１時間インキュベートした。Ｖｅｒｏ Ｅ６単層を洗浄し、３７℃で４～６日間インキュベートした後、プレートにＷＳＴ８のスコアを付けた。ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）は、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒの方法を使用して計算された。読み出しには、体重、肺病変、ウイルス力価、及び組織病理学の観察が含まれていた。
【0376】
組織病理学
１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後、左肺、左鼻甲介、及び気管の切片をパラフィンに包埋した。組織切片は、組織病理学的評価のためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。肺胞炎及び肺胞損傷の程度が、０％；１～２５％；２６～５０％；または＞５０％であった場合、それぞれ０、１、２、または３の半定量的スコアが与えられた。肺の炎症の程度と重症度の累積スコアは、動物ごとの肺胞炎の合計スコアを提供した（表１５の列「程度＋重症度の合計」を参照されたい）。肺胞炎、細気管支炎、及び気管支炎の重症度については、炎症細胞が存在しない場合、数が少ない場合、数が中程度の場合、または多数の場合に、それぞれ０、１、２、または３の半定量的スコアが与えられた。肺胞浮腫、肺胞出血、及びＩＩ型肺細胞過形成の存在については、それらが存在しない場合または存在する場合にそれぞれ０または１のスコアが与えられた。表１６では、肺胞浮腫、肺胞出血、及びＩＩ型肺細胞過形成の存在は、数値スコアの代わりに「はい」及び「いいえ」で示されている。
１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後、左肺、左鼻甲介、及び気管の切片をパラフィンに包埋した。組織切片は、組織病理学的評価のためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。肺胞炎及び肺胞損傷の程度が、０％；１～２５％；２６～５０％；または＞５０％であった場合、それぞれ０、１、２、または３の半定量的スコアが与えられた。肺の炎症の程度と重症度の累積スコアは、動物ごとの肺胞炎の合計スコアを提供した（表１５の列「程度＋重症度の合計」を参照されたい）。肺胞炎、細気管支炎、及び気管支炎の重症度については、炎症細胞が存在しない場合、数が少ない場合、数が中程度の場合、または多数の場合に、それぞれ０、１、２、または３の半定量的スコアが与えられた。肺胞浮腫、肺胞出血、及びＩＩ型肺細胞過形成の存在については、それらが存在しない場合または存在する場合にそれぞれ０または１のスコアが与えられた。表１６では、肺胞浮腫、肺胞出血、及びＩＩ型肺細胞過形成の存在は、数値スコアの代わりに「はい」及び「いいえ」で示されている。
【0377】
読み出しには、体重、肺病変、ウイルス力価、及び組織病理学の観察が含まれていた。１６００μｇの用量で、ＡＬＥ０４９は肺のウイルス力価の有意な低下を示した（図２６ａ）。モデルは高い動物間のばらつきを示したが、ウイルス力価の用量依存的減少（図２６ａ）、肉眼的に決定された肺病変の用量依存的減少（図２６ｂ）、及び体重減少の用量依存的減少（図２６ｂ）、及び体重減少の用量依存的減少（図２６ｃ）の傾向が観察され、１６０μｇと１６００μｇの用量の両方が抗ウイルス活性を示したことを示している。咽頭スワブのウイルス力価はさらに、１６００μｇの用量、及びより少ない程度ではあるが１６０μｇの用量がウイルス力価を阻害し、及び／または、４日間感染後の期間の喉のウイルス力価の低下を加速させたことを示した（図２６ｄ）。鼻甲介におけるウイルス力価（図２６ｅ）及び組織病理学データ（表１５及び１６、図２７）により、１６００μｇの用量が最も強力な抗ウイルス防御効果を有することが確認された。これらの有望な初期の発見に基づいて、さらなる動物実験が進行中である。
【0378】
【表15】
【表16】
【0379】
実施例１１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント阻害有効性実験
ＡＬＥ０４９（配列番号３１）及びＡＬＥ１０９（配列番号７５）の有効性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントＢ．１．１．７（「英国バリアント」）及びＢ．１．３５１（「南アフリカバリアント」）、及びスパイクタンパク質に単一の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対して評価された。
ＡＬＥ０４９（配列番号３１）及びＡＬＥ１０９（配列番号７５）の有効性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントＢ．１．１．７（「英国バリアント」）及びＢ．１．３５１（「南アフリカバリアント」）、及びスパイクタンパク質に単一の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対して評価された。
【0380】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、ヒトＡＣＥ２受容体への結合を介して細胞侵入を媒介する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ネコやミンクなどの非霊長類宿主にも感染し得る（Ｏｕｄｅ Ｍｕｎｎｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１，１７２－１７７）。複数宿主のライフスタイルの無差別性は、多くの場合、ウイルスの新しい宿主への初期の、まだ最適ではない適応の指標である。これは、固有の動的可塑性と、さらなるヒトへの適応の可能性を示唆している。スパイクタンパク質内の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＡＣＥ２との界面を形成する。部位変異導入スキャニングと構造解析により、Ｌ４５５、Ｆ４５６、Ａ４７５、Ｆ４８６、Ｆ４９０、及びＱ４９３など、この相互作用に重要なアミノ酸残基が明らかになった（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７，１４４４－１４４８；Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７，６２１－６３０）。特に、単一アミノ酸置換Ｎ４３９Ｒ、Ｌ４５２Ｋ、Ｎ４７０Ｔ、Ｅ４８４Ｐ、Ｑ４９８Ｙ、及びＮ５０１Ｔは、ヒトＡＣＥ２に対する親和性を高めることが示されている（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０（示した場所））。これらの実験結果と一致して、変異Ｎ４３９Ｋと変異Ｎ５０１Ｙは、急速に広がるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクバリアントに現れ、受容体結合の促進と伝達率の増加に関連している（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｃｅｌｌ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２１．０１．０３７）。ＲＢＤドメインも免疫原性があり、他の残基の中でも、Ｋ４４４、Ｅ４８４、及びＦ４８６が中和抗体の結合に重要であることが示されている（Ｋｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２，４６９）。
【0381】
この実施例では、ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９の中和能力に対するスパイクタンパク質の選択された変異の影響を分析した（図２８）。
【0382】
Ｈｉｓタグ付き一価ＲＢＤ結合剤、ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ１０９、及びＡＬＥ１０９のドメインノックアウトバリアントの生成
実施例１及びＷａｌｓｅｒら、２０２０（ｂｉｏＲｘｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０８．２５．２５６３３９）に記載されているように選択及びクローニングされたアンキリンリピートタンパク質構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞に形質転換し、ＬＢ寒天培地（１％ブドウ糖と５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に播種し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。それぞれの構築物について、単一のコロニーをＴＢ培地（１％ブドウ糖及び５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）につつき入れ、２３０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。新鮮なＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に１：２０の一晩培養物を接種し、３７℃、２３０ｒｐｍでインキュベートした。ＯＤ６００＝１．１でＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）の添加により培養物を誘導し、３７℃、２３０ｒｐｍでさらに５時間インキュベートした。遠心分離（１０分間、５０００×ｇ）によって収穫を行った。超音波処理による細胞破壊の後、６２．５℃で３０分間の熱処理とその後の遠心分離（１５分間、１２０００×ｇ）により一次回収を行った。２０ｍＭのイミダゾールと１％トリトンＸ－１００を上清に添加し、０．２２μｍで遠心分離した上清を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による洗浄ステップと及び２５０ｍＭ イミダゾールによるステップ溶出を含む、Ｎ－末端Ｈｉｓタグを使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ｃｒｕｄｅ，Ｃｙｔｉｖａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によってさらに精製した。次のステップでは、ＩＭＡＣステップの溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００，Ｃｙｔｉｖａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に適用し、目的の画分をプールして濃縮した。最後に、エンドトキシンの除去と滅菌ろ過及び品質管理のために、濃縮試料を０．２２μｍ Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルターでろ過した。
実施例１及びＷａｌｓｅｒら、２０２０（ｂｉｏＲｘｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０８．２５．２５６３３９）に記載されているように選択及びクローニングされたアンキリンリピートタンパク質構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞に形質転換し、ＬＢ寒天培地（１％ブドウ糖と５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に播種し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。それぞれの構築物について、単一のコロニーをＴＢ培地（１％ブドウ糖及び５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）につつき入れ、２３０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。新鮮なＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に１：２０の一晩培養物を接種し、３７℃、２３０ｒｐｍでインキュベートした。ＯＤ６００＝１．１でＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）の添加により培養物を誘導し、３７℃、２３０ｒｐｍでさらに５時間インキュベートした。遠心分離（１０分間、５０００×ｇ）によって収穫を行った。超音波処理による細胞破壊の後、６２．５℃で３０分間の熱処理とその後の遠心分離（１５分間、１２０００×ｇ）により一次回収を行った。２０ｍＭのイミダゾールと１％トリトンＸ－１００を上清に添加し、０．２２μｍで遠心分離した上清を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による洗浄ステップと及び２５０ｍＭ イミダゾールによるステップ溶出を含む、Ｎ－末端Ｈｉｓタグを使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ｃｒｕｄｅ，Ｃｙｔｉｖａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によってさらに精製した。次のステップでは、ＩＭＡＣステップの溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００，Ｃｙｔｉｖａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に適用し、目的の画分をプールして濃縮した。最後に、エンドトキシンの除去と滅菌ろ過及び品質管理のために、濃縮試料を０．２２μｍ Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルターでろ過した。
【0383】
モノクローナル参照抗体、ＲＡ１及びＲＡ２の生成
モノクローナル抗体ＲＡ１及びＲＡ２（米国食品医薬品局は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療のためのカクテルとして投与されるＲＡ１及びＲＡ２の緊急使用許可を発行した）からの公開されている可変ドメインの配列を使用して、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で対応するｃＤＮＡ断片を合成し、独自の発現ベクターにクローニングされた。定常免疫グロブリンｈＩｇＧ１鎖またはカッパ軽鎖を含む生成されたベクターは、Ｅｖｉｔｒｉａによるチャイニーズハムスター卵巣細胞へのトランスフェクションに使用された。滅菌ろ過した細胞上清を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムによるアフィニティー精製と、それに続く、ＰＢＳ ｐＨ７．４中でのＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。アッセイで使用する前に、選択した画分をプールし、（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、及びエンドトキシン測定により）品質管理を行った。
モノクローナル抗体ＲＡ１及びＲＡ２（米国食品医薬品局は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療のためのカクテルとして投与されるＲＡ１及びＲＡ２の緊急使用許可を発行した）からの公開されている可変ドメインの配列を使用して、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で対応するｃＤＮＡ断片を合成し、独自の発現ベクターにクローニングされた。定常免疫グロブリンｈＩｇＧ１鎖またはカッパ軽鎖を含む生成されたベクターは、Ｅｖｉｔｒｉａによるチャイニーズハムスター卵巣細胞へのトランスフェクションに使用された。滅菌ろ過した細胞上清を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムによるアフィニティー精製と、それに続く、ＰＢＳ ｐＨ７．４中でのＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。アッセイで使用する前に、選択した画分をプールし、（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、及びエンドトキシン測定により）品質管理を行った。
【0384】
ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型変異ベクターの生成
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードするプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ｗａｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０（示した場所））を、単一及び複数のスパイクタンパク質変異体を生成するためのテンプレートとして使用した。変異をコードするフォワード及びリバースの相補的プライマーは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって合成された。高忠実度のＰｈｕｓｉｏｎ ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）をすべてのＤＮＡ増幅に使用した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードするプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ｗａｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０（示した場所））を、単一及び複数のスパイクタンパク質変異体を生成するためのテンプレートとして使用した。変異をコードするフォワード及びリバースの相補的プライマーは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって合成された。高忠実度のＰｈｕｓｉｏｎ ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）をすべてのＤＮＡ増幅に使用した。
【0385】
スパイクタンパク質の単一変異は、高忠実度のＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用して、スパイクのＯＲＦの２つのＰＣＲ断片を介して生成された。第１の断片は、スパイクのＯＲＦの上流でアニーリングする一般的なフォワードプライマー（ｐＣＡＧＧＳ－５）と、変異をコードする特定のリバースプライマーを介して生成された。第２の断片は、変異をコードする特定のフォワードプライマーとリバースプライマー（ｒｂｇｌｏｂｐＡ－Ｒ）を使用して生成された。２つの断片をゲル精製し、フランキングプライマーを追加せずにアセンブリＰＣＲのインプットとして使用した。
【0386】
多変異スパイクタンパク質の場合、それぞれの変異をコードする相補的なプライマー（フォワード及びリバース）のペアが設計された。断片１は、フォワードプライマーｐＣＡＧＧＳ－５及び変異１をコードするリバースプライマーを使用して生成された。断片２は、変異１をコードするフォワードプライマー及び変異２をコードするリバースプライマーを使用して生成された。後続の断片はすべて同様に生成された。ＤＮＡ断片をゲル精製し、等モル量で混合した。この混合物は、外部プライマーｐＣＡＧＧＳ－５及びｒｂｇｌｏｂｐＡ－Ｒを使用する完全なスパイクのＯＲＦの再構築に使用された。
【0387】
単一変異スパイクタンパク質と複数変異スパイクタンパク質の両方について、完全長のスパイクのＯＲＦをアガロースゲルから分離し、制限酵素ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＡＧＧＳベクターバックボーンに挿入した。正確な配列は、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってスパイクタンパク質の全ＯＲＦを配列決定することによって検証された。
【0388】
変異解析及びＡＬＥ１０９ドメインノックアウトについてのＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型中和アッセイ
偽型のウイルス系は、糖タンパク質遺伝子（Ｇ）が削除され、緑色蛍光タンパク質とルシフェラーゼをコードする遺伝子に置き換えられたＶＳＶ＊ΔＧ－Ｌｕｃベクターである組換え体に基づいていた（Ｂｅｒｇｅｒ Ｒｅｎｔｓｃｈ ａｎｄ Ｚｉｍｍｅｒ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１０）：ｅ２５８５８）。疑似ウイルスは、以前に報告されたように生成された（Ｔｏｒｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１９ Ｍａｙ；５３１：５７－６８；Ｔｏｒｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１９ Ｍａｒ ５；９３（６）：ｅ０１７４４－１８）。中和アッセイでは、化合物の最初の希釈に続いて、２０μＭのヒト血清アルブミンを補充したＤＭＥＭ－２％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］ＦＣＳ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）中での四重の３倍希釈を行った。混合物を等量のウェルあたり２５０ＩＵの ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 偽ウイルスを含むＤＭＥＭ－２％ＦＣＳと混合し、３７℃で９０分間インキュベートした。混合物を、３７℃で９０分間、底が透明な白色の壁の９６ウェルプレート内のＶｅｒｏ Ｅ６細胞に接種した。接種物を取り除き、新鮮な培地を加え、細胞をさらに３７℃で１６時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳ）に従って細胞を溶解し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ（登録商標）ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１ルミノメーターを使用して発光を記録した。生データ（相対光単位値）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０１にエクスポートされ、中和％値は、未処理のＰｓＶシグナルに対して正規化された。９５％信頼区間のＩＣ50は、対数（阻害剤）対正規化応答曲線の設定にフィッティングされた非線形回帰適合のモデルによって推定された。
偽型のウイルス系は、糖タンパク質遺伝子（Ｇ）が削除され、緑色蛍光タンパク質とルシフェラーゼをコードする遺伝子に置き換えられたＶＳＶ＊ΔＧ－Ｌｕｃベクターである組換え体に基づいていた（Ｂｅｒｇｅｒ Ｒｅｎｔｓｃｈ ａｎｄ Ｚｉｍｍｅｒ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１０）：ｅ２５８５８）。疑似ウイルスは、以前に報告されたように生成された（Ｔｏｒｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１９ Ｍａｙ；５３１：５７－６８；Ｔｏｒｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１９ Ｍａｒ ５；９３（６）：ｅ０１７４４－１８）。中和アッセイでは、化合物の最初の希釈に続いて、２０μＭのヒト血清アルブミンを補充したＤＭＥＭ－２％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］ＦＣＳ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）中での四重の３倍希釈を行った。混合物を等量のウェルあたり２５０ＩＵの ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 偽ウイルスを含むＤＭＥＭ－２％ＦＣＳと混合し、３７℃で９０分間インキュベートした。混合物を、３７℃で９０分間、底が透明な白色の壁の９６ウェルプレート内のＶｅｒｏ Ｅ６細胞に接種した。接種物を取り除き、新鮮な培地を加え、細胞をさらに３７℃で１６時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳ）に従って細胞を溶解し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ（登録商標）ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１ルミノメーターを使用して発光を記録した。生データ（相対光単位値）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０１にエクスポートされ、中和％値は、未処理のＰｓＶシグナルに対して正規化された。９５％信頼区間のＩＣ50は、対数（阻害剤）対正規化応答曲線の設定にフィッティングされた非線形回帰適合のモデルによって推定された。
【0389】
細胞及びウイルス
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と補充成分（２ｍＭのＬ－グルタミン、１％非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０６％重炭酸ナトリウム、すべてＢｉｏｓｗｉｓｓｔｅｃ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから）を含む、最小必須培地（ＭＥＭ）（カタログ番号Ｍ３３０３）中で３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2で継代された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ／ＩＤＦ０３７２／２０２０）は、２％ＦＢＳと補充成分を含むＭＥＭ（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ）中、３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2でのＶｅｒｏ Ｅ６細胞内で増殖させた。ウイルス力価は、他の箇所に記載されているように、標準的なプラークアッセイによって決定された。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と補充成分（２ｍＭのＬ－グルタミン、１％非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０６％重炭酸ナトリウム、すべてＢｉｏｓｗｉｓｓｔｅｃ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから）を含む、最小必須培地（ＭＥＭ）（カタログ番号Ｍ３３０３）中で３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2で継代された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ／ＩＤＦ０３７２／２０２０）は、２％ＦＢＳと補充成分を含むＭＥＭ（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ）中、３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2でのＶｅｒｏ Ｅ６細胞内で増殖させた。ウイルス力価は、他の箇所に記載されているように、標準的なプラークアッセイによって決定された。
【0390】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ及びリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された本物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス中和
モノドメイン及びマルチドメインのアンキリンリピート結合タンパク質のウイルス中和能力は、細胞生存率アッセイで防御された細胞のＡＴＰレベルを測定することにより、１００ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について決定された。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、９６ウェルプレート内で、１００μｌの１０μＭのＨＳＡが強化された細胞培養培地（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ）中で４０ｎＭから２．４ｐＭまで１：４で段階希釈された。希釈されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質を、１００μｌの２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ＋ＨＳＡ中の１００ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質／ウイルス混合物（２００μｌ）を８０％コンフルエントのＶｅｒｏ Ｅ６細胞に移した。対照は、最大の細胞変性効果を決定するためにウイルス懸濁液のみに曝露されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞と、細胞のベースライン状態を決定するために培地のみでインキュベートされた細胞とからなった。プレートを３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2で３日間インキュベートした。細胞生存率は、メーカーのプロトコール（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）に記載されているように、すべてのウェルから１００μｌの上清を除去し、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加えることによって決定した。オービタルシェーカーで２分間振盪した後、混合物を不透明壁プレートに移し、ＧｌｏＭａｘ装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して室温で１０分間インキュベートした後、発光を読み取った。ウイルス複製の阻害を決定するために、以前に取り出した上清（１００μｌ）を４００μｌのＡＶＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び４００μｌの１００％エタノールで不活化し、ＭａｇＮＡＰｕｒｅ ９６システム（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して１００μｌで抽出及び溶出した。ウイルスＲＮＡは、５μｌのＲＮＡ及び４５μｌのＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、Ｅ遺伝子を標的とするリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって定量化された（参照Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｜ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９－ｎＣｏＶ）ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）。回帰分析と内部標準を使用して、ウイルスゲノム等価物（ｇｅ）を計算した。
モノドメイン及びマルチドメインのアンキリンリピート結合タンパク質のウイルス中和能力は、細胞生存率アッセイで防御された細胞のＡＴＰレベルを測定することにより、１００ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について決定された。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、９６ウェルプレート内で、１００μｌの１０μＭのＨＳＡが強化された細胞培養培地（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ）中で４０ｎＭから２．４ｐＭまで１：４で段階希釈された。希釈されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質を、１００μｌの２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ＋ＨＳＡ中の１００ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質／ウイルス混合物（２００μｌ）を８０％コンフルエントのＶｅｒｏ Ｅ６細胞に移した。対照は、最大の細胞変性効果を決定するためにウイルス懸濁液のみに曝露されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞と、細胞のベースライン状態を決定するために培地のみでインキュベートされた細胞とからなった。プレートを３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2で３日間インキュベートした。細胞生存率は、メーカーのプロトコール（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）に記載されているように、すべてのウェルから１００μｌの上清を除去し、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加えることによって決定した。オービタルシェーカーで２分間振盪した後、混合物を不透明壁プレートに移し、ＧｌｏＭａｘ装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して室温で１０分間インキュベートした後、発光を読み取った。ウイルス複製の阻害を決定するために、以前に取り出した上清（１００μｌ）を４００μｌのＡＶＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び４００μｌの１００％エタノールで不活化し、ＭａｇＮＡＰｕｒｅ ９６システム（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して１００μｌで抽出及び溶出した。ウイルスＲＮＡは、５μｌのＲＮＡ及び４５μｌのＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、Ｅ遺伝子を標的とするリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって定量化された（参照Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｜ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９－ｎＣｏＶ）ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）。回帰分析と内部標準を使用して、ウイルスゲノム等価物（ｇｅ）を計算した。
【0391】
多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９または参照抗体１もしくは２（それぞれＲＡ１及びＲＡ２）を使用した中和試験の結果を表１７に示す。表１８は、スパイクタンパク質バリアントに対する個々の結合剤としてのＡＬＥ０４９（配列番号３１）の３つのスパイクタンパク質結合ドメインの活性を示す。
【0392】
【表17-1】
【表17-2】
【表18-1】
【表18-2】
【0393】
これらの結果は、ＡＬＥ０４９がバリアントＢ．１．１．７及びＢ．１．３５１を、１桁台前半のｎｇ／ｍＬ範囲のＩＣ50値で野生型と同じくらい効率的に中和できることを示している。ＡＬＥ１０９は、Ｂ．１．３５１バリアントを、１桁台前半のｎｇ／ｍＬ範囲のＩＣ50値で野生型と同じくらい効率的に同様に中和する。英国バリアントＢ．１．１．７に対する ＡＬＥ１０９のわずかな効力の低下 が観察された（ＩＣ５０値７０ｎｇ／ｍｌ）。それにもかかわらず、英国バリアントＢ．１．１．７に対するＡＬＥ１０９の効力は治療範囲内であった。興味深いことに、ＡＬＥ１０９のＲＢＤ結合剤（すなわちＲ１ｂ）は、Ｂ．１．１．７ に対して野生型と同じ中和能力を保持していた。ＡＬＥ１０９で観察されたわずかな効力低下は、Ｓ２ドメインの露出した変異（潜在的にＰ６８１Ｈ及びＴ７１６Ｉ）単独またはＮＴＤ変異との組み合わせによって引き起こされる可能性がある。このわずかな効力低下の原因となる構造的決定要因は現在調査中である。まとめると、結果は、試験された多重特異性結合タンパク質であるＡＬＥ０４９とＡＬＥ１０９の両方が、１桁台前半のｎｇ／ｍＬ範囲のＩＣ50値で野生型を強力に中和し、Ｂ．１．１．７（英国）及びＢ．１．３５１（ＳＡ）を、治療範囲内のＩＣ50値（すなわち、１桁台前半から２桁台のｎｇ／ｍＬ範囲）で中和したことを示した。
【0394】
多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子ＡＬＥ０４９とＡＬＥ１０９の両方も、試験したすべての個々の変異に対して十分に防御したが、ＡＬＥ０４９と３つすべての一価ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ＲＢＤ結合剤についてのＦ４８６Ｖは例外であった。Ｆ４８６はＡＣＥ２結合にとって重要な残基であるため、ウイルスに対する選択圧はその保存に有利に働き、したがって、ＡＬＥ０４９の結合に重要な固定要素を維持する。以前の構造解析では、Ｆ４８６がＡＬＥ０４９の３つの関連しているが異なるＲＢＤ結合剤のコア相互作用残基として特定されていたため、ＡＬＥ０４９に対するこの変異の大きな影響は驚くべきことではない（Ｗａｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０２０（示した場所））。その結果、変異Ｆ４８６ＶはＡＬＥ０４９分子のスパイクタンパク質への結合を不安定にする。まとめると、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の多重特異性設計から予想されるように、我々の分析は、本発明の多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子が、最も頻繁に観察される変異、及び中和抗体の結合に影響を与えることが知られている変異を有するスパイクタンパク質に対して非常に強力であり続けることを確認する。
【0395】
図２９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型に対するＡＬＥ１０９の単一ドメインノックアウト（ｋ．ｏ．）構築物の中和効力を示している。これらの実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性へのＡＬＥ１０９の３つのスパイクタンパク質結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ドメインのそれぞれの寄与を決定した。ＡＬＥ１０９と比較して、ＮＴＤノックアウト構築物では効力の低下は観察されかったが、ＲＢＤ及びＳ２ノックアウト構築物ではいくらかの効力の低下が観察された。理論に拘束されることを望むものではないが、ＡＬＥ１０９のＮＴＤ結合ドメインは、例えば、変異スパイクタンパク質への結合力を増加させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異型またはバリアントに対するＡＬＥ１０９の中和活性において重要な役割を果たすと考えられている。
【0396】
実施例１２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス継代
以前の研究では、ウイルスエスケープ変異体が治療の選択圧の下で急速に出現し得るが示されている（Ｋｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１（示した場所）；Ａｎｄｒｅａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＤＯＩ：１０．１１０１／２０２０．１２．２８．４２４４５１）。Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，１０１４－１０１８（２０２０）から翻案したウイルス継代モデルを使用して、一価のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合剤Ｒ１ｂ（配列番号３）及び単一分子として適用されたモノクローナル抗体Ｓ３０９、ＲＡ１、及びＲＡ２と比較した、多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９ならびに参照抗体のカクテルＲＡ１及びＲＡ２の治療圧からのウイルスエスケープのリスクを推定した。Ｓ３０９は、２００３年に重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）から回復した患者から分離された抗体であり、細胞及び動物モデルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して有効であることが示されている（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ５８３，ｐ．２９０－２９５，９ Ｊｕｌｙ ２０２０）。Ｓ３０９は、ＲＡ１及びＲＡ２と同じ方法で調製した（上記の実施例１１を参照されたい）。
以前の研究では、ウイルスエスケープ変異体が治療の選択圧の下で急速に出現し得るが示されている（Ｋｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１（示した場所）；Ａｎｄｒｅａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＤＯＩ：１０．１１０１／２０２０．１２．２８．４２４４５１）。Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，１０１４－１０１８（２０２０）から翻案したウイルス継代モデルを使用して、一価のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合剤Ｒ１ｂ（配列番号３）及び単一分子として適用されたモノクローナル抗体Ｓ３０９、ＲＡ１、及びＲＡ２と比較した、多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９ならびに参照抗体のカクテルＲＡ１及びＲＡ２の治療圧からのウイルスエスケープのリスクを推定した。Ｓ３０９は、２００３年に重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）から回復した患者から分離された抗体であり、細胞及び動物モデルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して有効であることが示されている（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ５８３，ｐ．２９０－２９５，９ Ｊｕｌｙ ２０２０）。Ｓ３０９は、ＲＡ１及びＲＡ２と同じ方法で調製した（上記の実施例１１を参照されたい）。
【0397】
実験プロトコール：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質及びモノクローナル抗体の１００／μｇｍｌから０．０３２μｇ／ｍｌまでの１：５段階希釈を２％ＦＢＳ、補充成分、及び１０μＭのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ ＋ ＨＳＡ）で調製した。２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ＋ＨＳＡ中の１．５×１０6プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型と比較して以下の変化を含むフランス単離株：Ｖ３６７Ｆ；Ｅ９９０Ａ）を含むウイルス懸濁液５００ｕｌを５００μｌの段階希釈したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質またはモノクローナル抗体と混合し、続いて３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物を１２ウェルプレート中の８０％コンフルエントのＶｅｒｏ Ｅ６細胞に移し、３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2で４日間インキュベートした。それぞれの培養ウェルは、顕微鏡によって細胞変性効果（ＣＰＥ）について評価された。顕著なＣＰＥを示した（２０％を超える）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質または抗体の濃度が最も高いウェルから上清を取り出し、全ＲＮＡ抽出とさらなる継代に使用された。その後の継代ラウンドでは、選択したウェルの残りの９００μｌの上清を２％－ＦＣＳ－ＭＥＭ＋ＨＳＡ中で４ｍｌに希釈し、その５００μｌをＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質または抗体の段階希釈物と混合し、インキュベートし、混合物を上記のように新鮮なＶｅｒｏ Ｅ６細胞を含む１２ウェルプレートに移した。４日後に細胞培養ウェルのＣＰＥを再度評価し、明らかなウイルス複製（ＣＰＥ）を示すＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質または抗体濃度が最も高いウェルの上清を回収し、追加の継代に使用した（図３０を参照されたい）。この方法で合計４つの継代が実行された。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質及びモノクローナル抗体の１００／μｇｍｌから０．０３２μｇ／ｍｌまでの１：５段階希釈を２％ＦＢＳ、補充成分、及び１０μＭのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）（２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ ＋ ＨＳＡ）で調製した。２％－ＦＢＳ－ＭＥＭ＋ＨＳＡ中の１．５×１０6プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型と比較して以下の変化を含むフランス単離株：Ｖ３６７Ｆ；Ｅ９９０Ａ）を含むウイルス懸濁液５００ｕｌを５００μｌの段階希釈したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質またはモノクローナル抗体と混合し、続いて３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物を１２ウェルプレート中の８０％コンフルエントのＶｅｒｏ Ｅ６細胞に移し、３７℃、８５％を超える湿度と５％ＣＯ2で４日間インキュベートした。それぞれの培養ウェルは、顕微鏡によって細胞変性効果（ＣＰＥ）について評価された。顕著なＣＰＥを示した（２０％を超える）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質または抗体の濃度が最も高いウェルから上清を取り出し、全ＲＮＡ抽出とさらなる継代に使用された。その後の継代ラウンドでは、選択したウェルの残りの９００μｌの上清を２％－ＦＣＳ－ＭＥＭ＋ＨＳＡ中で４ｍｌに希釈し、その５００μｌをＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質または抗体の段階希釈物と混合し、インキュベートし、混合物を上記のように新鮮なＶｅｒｏ Ｅ６細胞を含む１２ウェルプレートに移した。４日後に細胞培養ウェルのＣＰＥを再度評価し、明らかなウイルス複製（ＣＰＥ）を示すＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質または抗体濃度が最も高いウェルの上清を回収し、追加の継代に使用した（図３０を参照されたい）。この方法で合計４つの継代が実行された。
【0398】
結果：
抵抗性エスケープバリアントは、抗ウイルスタンパク質の濃度を増加させる選択圧を維持しながら、新鮮な細胞に対する最大の選択圧下で有意なウイルス誘発性細胞変性効果を示す培養上清を継代することによって選択された。図３１は、１回目から４回目のインキュベーションサイクル（継代番号１～番号４）後に得られた結果を示している。４日間の第１のインキュベーションサイクルの後（継代番号１）、一価ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合剤Ｒｂ１及び多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９、ならびにモノクローナル抗体ＲＡ１及び２つのモノクローナル抗体ＲＡ１及びＲＡ２のカクテルは、同じ濃度０．４μｇ／ｍＬで防御を付与した。モノクローナル抗体Ｓ３０９は効率が低く、防御のためにより高い濃度（１０μｇ／ｍＬ）を必要とした。単一分子としてのモノクローナル抗体ＲＡ２は、試験された最高濃度の５０μｇ／ｍＬまでは防御的ではなかった。継代２から４までの継続的な選択圧下で、一価ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合剤Ｒｂ１、及び個々のモノクローナル抗体ＲＡ２及びＲＡ１は、ウイルス誘発性の細胞変性効果から細胞を防御する能力を失い、試験した最高の選択圧まで完全なＣＰＥを示した。対照的に、単一分子または混合物としての２つの多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９、ならびに２つのモノクローナル抗体（ＲＡ１及びＲＡ２）のカクテルは、４回の継代を通じて効果を維持し、ＣＰＥから細胞を防御した。
抵抗性エスケープバリアントは、抗ウイルスタンパク質の濃度を増加させる選択圧を維持しながら、新鮮な細胞に対する最大の選択圧下で有意なウイルス誘発性細胞変性効果を示す培養上清を継代することによって選択された。図３１は、１回目から４回目のインキュベーションサイクル（継代番号１～番号４）後に得られた結果を示している。４日間の第１のインキュベーションサイクルの後（継代番号１）、一価ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合剤Ｒｂ１及び多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９、ならびにモノクローナル抗体ＲＡ１及び２つのモノクローナル抗体ＲＡ１及びＲＡ２のカクテルは、同じ濃度０．４μｇ／ｍＬで防御を付与した。モノクローナル抗体Ｓ３０９は効率が低く、防御のためにより高い濃度（１０μｇ／ｍＬ）を必要とした。単一分子としてのモノクローナル抗体ＲＡ２は、試験された最高濃度の５０μｇ／ｍＬまでは防御的ではなかった。継代２から４までの継続的な選択圧下で、一価ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）結合剤Ｒｂ１、及び個々のモノクローナル抗体ＲＡ２及びＲＡ１は、ウイルス誘発性の細胞変性効果から細胞を防御する能力を失い、試験した最高の選択圧まで完全なＣＰＥを示した。対照的に、単一分子または混合物としての２つの多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９、ならびに２つのモノクローナル抗体（ＲＡ１及びＲＡ２）のカクテルは、４回の継代を通じて効果を維持し、ＣＰＥから細胞を防御した。
【0399】
多特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９は、単剤としてそれぞれ濃度２μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬで４回の継代後のエスケープ変異体の選択を妨げた。一方、２つの多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９の組み合わせは、０．０８μｇ／ｍＬという低濃度でも有効性を保持していた。抗体カクテルＲＡ１及びＲＡ２は継代４の後、０．４μｇ／ｍＬの濃度でエスケープ変異体の選択を妨げた。
【0400】
実施例１３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス（ＰｓＶ ｎＣｏＶ）を使用する中和アッセイにおけるいくつかの多重特異性結合タンパク質の比較
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス（ＰｓＶ ｎＣｏＶ）を用いる中和アッセイにおいて、本発明のいくつかの多重特異性結合タンパク質を比較した。中和アッセイは、上記の実施例４に記載したのと同様に行った。試験された多重特異性結合タンパク質には、ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５８、ＡＬＥ１０９、ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３が含まれていた。ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５８、及びＡＬＥ１０９は上記で説明されている。ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３は、ｖＳ０７＿０８Ｆ１０ｖ２７（配列番号７６）を含むＡＬＥ１０９と比較してさらに操作されたＳ１－ＮＴＤ結合ドメイン（ｖＳ０７＿０８Ｆ１０ｖ４７；配列番号８５）を含む。ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３は、Ｓ１－ＮＴＤ結合ドメインとＳ２結合ドメイン（配列番号７７）を連結するリンカーの長さのみが互いに異なる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス（ＰｓＶ ｎＣｏＶ）を用いる中和アッセイにおいて、本発明のいくつかの多重特異性結合タンパク質を比較した。中和アッセイは、上記の実施例４に記載したのと同様に行った。試験された多重特異性結合タンパク質には、ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５８、ＡＬＥ１０９、ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３が含まれていた。ＡＬＥ０４９、ＡＬＥ０５８、及びＡＬＥ１０９は上記で説明されている。ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３は、ｖＳ０７＿０８Ｆ１０ｖ２７（配列番号７６）を含むＡＬＥ１０９と比較してさらに操作されたＳ１－ＮＴＤ結合ドメイン（ｖＳ０７＿０８Ｆ１０ｖ４７；配列番号８５）を含む。ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３は、Ｓ１－ＮＴＤ結合ドメインとＳ２結合ドメイン（配列番号７７）を連結するリンカーの長さのみが互いに異なる。
【0401】
ＰｓＶ ｎＣｏＶアッセイの結果をｎＭで示されたＥＣ５０値とともに図３２に示す。実験は、試験されたすべての多重特異性結合タンパク質が、このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ偽ウイルス中和アッセイで全体的に匹敵する中和能力を持っていることを示した。試験されたすべての構築物のＥＣ５０値は、２０～５０ｐＭの範囲であった。
【0402】
実施例１４：マウスにおける本発明の多重特異性結合タンパク質の薬物動態分析
マウスにおける本発明のいくつかの多重特異性組換え結合タンパク質のＰＫ特性を評価するために、別の薬物動態（ＰＫ）試験を実施した。このようなＰＫ特性は、動物薬力学研究、毒物学研究、またはヒト臨床試験における本発明の多重特異性結合タンパク質の用量予測に有用である。
マウスにおける本発明のいくつかの多重特異性組換え結合タンパク質のＰＫ特性を評価するために、別の薬物動態（ＰＫ）試験を実施した。このようなＰＫ特性は、動物薬力学研究、毒物学研究、またはヒト臨床試験における本発明の多重特異性結合タンパク質の用量予測に有用である。
【0403】
ＰＫ研究は、本質的に実施例９に記載のように実施した。
【0404】
この研究では、次の多重特異性結合タンパク質を試験した。
【表19】
【0405】
実施例９にも記載されているように、ＣｅｒｔａｒａのＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）８．０プログラムを使用して、薬物動態データ分析を実施した。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく研究の薬物動態パラメーターの計算は、非コンパートメント分析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を使用して実行された。
【0406】
計算された薬物動態パラメーターには、少なくとも以下が含まれていた：ＡＵＣｉｎｆ＿ｐｒｅｄ、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、ＡＵＣ＿％Ｂａｃｋ＿Ｅｘｔ＿ｐｒｅｄ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２（ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ＿ｚ）。結果を表２０ならびに図３３及び３４に示す。
【0407】
【表20】
【0408】
結果及び結論
結果は、ＡＬＥ１０９が、前駆体分子ＡＬＥ０５８と比較して、全身投与について改善された薬物動態特性を有することを実証した。血清濃度時間プロファイルの単一指数関数的消失相では、ＡＬＥ１０９血清濃度は３１．５時間の半減期で減少したが、ＡＬＥ０５８は２０時間の半減期を示した。さらに、さらに操作された結合タンパク質ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３は、ＡＬＥ１０９と比較した場合、さらに長い半減期、すなわちそれぞれ３６．７時間、４１．４時間、及び４１．１時間の半減期を示した。
結果は、ＡＬＥ１０９が、前駆体分子ＡＬＥ０５８と比較して、全身投与について改善された薬物動態特性を有することを実証した。血清濃度時間プロファイルの単一指数関数的消失相では、ＡＬＥ１０９血清濃度は３１．５時間の半減期で減少したが、ＡＬＥ０５８は２０時間の半減期を示した。さらに、さらに操作された結合タンパク質ＡＬＥ１２６、ＡＬＥ１２９、及びＡＬＥ１３３は、ＡＬＥ１０９と比較した場合、さらに長い半減期、すなわちそれぞれ３６．７時間、４１．４時間、及び４１．１時間の半減期を示した。
【0409】
実施例１５：ロボロフスキードワーフハムスターモデルにおける２つの多重特異性結合タンパク質、ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９の治療効果のインビボ評価
この研究では、ロボロフスキードワーフハムスターモデルを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する潜在的な抗ウイルス剤としての本発明の２つの多重特異性結合タンパク質の有効性を評価した。ロボロフスキードワーフハムスターモデルは、重度の臨床徴候（例えば、体重減少または体温低下）、上気道と下気道の両方でのウイルス複製、及び組織病理学的変化によって示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する感受性が高いため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２研究にとって貴重な非トランスジェニックげっ歯類モデルである（Ｔｒｉｍｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３３，１０８４８８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ８，２０２０）。
この研究では、ロボロフスキードワーフハムスターモデルを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する潜在的な抗ウイルス剤としての本発明の２つの多重特異性結合タンパク質の有効性を評価した。ロボロフスキードワーフハムスターモデルは、重度の臨床徴候（例えば、体重減少または体温低下）、上気道と下気道の両方でのウイルス複製、及び組織病理学的変化によって示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する感受性が高いため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２研究にとって貴重な非トランスジェニックげっ歯類モデルである（Ｔｒｉｍｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３３，１０８４８８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ８，２０２０）。
【0410】
したがって、この研究の目的は、体重減少、上気道及び下気道におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製、ならびに組織病理学的変化を阻害または防止するＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９の治療可能性を調査することであった。
【0411】
試験された結合タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９は、長時間作用型活性をサポートするために、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（及びハムスター血清アルブミン）に結合するドメインで延長された血清半減期である。インビトロデータは、両方の結合タンパク質による細胞培養力価測定実験で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染の強力な阻害を示した。
【0412】
研究デザインでは、それぞれ６匹の動物からなる５つの群を使用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の接種後０、６、または２４時間後に試験した結合タンパク質による処置を行った。研究デザインを図３５に示する（この実施例では、ＡＬＥ０４９はＭＰ０４２０とも呼ばれる）。動物は、静脈内投与の安全で再現性のある代替手段として役立つ腹腔内（ｉ．ｐ．）投与により処置された。群１の動物は、０時間に２０ｍｇ／ｋｇのＡＬＥ０４９で処置された。群２～４の動物は、それぞれ感染後０時間、６時間、または２４時間に２０ｍｇ／ｋｇのＡＬＥ１０９ で処置された。対照群（群５）の動物は、０時間にプラセボ（すなわち、試験されたタンパク質のみのビヒクル）で処置された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染は、鼻腔内（ｉ．ｎ．）経路を介して行われた。そのための用量と感染経路は、以前の（モデル開発）研究の結果に基づいていた。動物の体重を量り、体温を毎日測定した。剖検を実施するために、感染後３日目及び５日目にそれぞれの群のそれぞれ３匹の動物を安楽死させた。肺及び咽頭組織のウイルス負荷は、ｑＰＣＲまたはウイルス滴定及びプラーク形成単位（ＰＦＵ）のカウントによって決定された。安楽死後に、選択した組織の組織病理学的変化を評価した。
【0413】
材料
製剤緩衝液及びすべての試験項目及び対照項目の製剤は、投与日に調製し、それぞれの群に適切な量に分注し、投与まで４℃で保存した。投与される試験／対照項目の体積は、動物あたり１００μＬとし、投与日に測定した動物の体重に調整した。感染物質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢｅｔａＣｏＶ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＢａｖＰａｔ１／２０２０株であった。
製剤緩衝液及びすべての試験項目及び対照項目の製剤は、投与日に調製し、それぞれの群に適切な量に分注し、投与まで４℃で保存した。投与される試験／対照項目の体積は、動物あたり１００μＬとし、投与日に測定した動物の体重に調整した。感染物質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢｅｔａＣｏＶ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＢａｖＰａｔ１／２０２０株であった。
【0414】
動物
６～９週齢、研究開始日－２での体重範囲が２０～２５グラムの範囲のロボロフスキードワーフハムスター（Ｐｈｏｄｏｐｕｓ ｒｏｂｏｒｏｖｓｋｉｉ）を使用した。
６～９週齢、研究開始日－２での体重範囲が２０～２５グラムの範囲のロボロフスキードワーフハムスター（Ｐｈｏｄｏｐｕｓ ｒｏｂｏｒｏｖｓｋｉｉ）を使用した。
【0415】
手順
麻酔と鎮痛
感染及び安楽死の前に、メデトミジン、ミダゾラム、及びブトルファノールを、それぞれ０．１５、２．０、及び２．５ｍｇ／ｋｇの用量で注射して動物を麻酔した。感染後、麻酔は０．１５ｍｇ／ｋｇアチパメゾールで拮抗された。
麻酔と鎮痛
感染及び安楽死の前に、メデトミジン、ミダゾラム、及びブトルファノールを、それぞれ０．１５、２．０、及び２．５ｍｇ／ｋｇの用量で注射して動物を麻酔した。感染後、麻酔は０．１５ｍｇ／ｋｇアチパメゾールで拮抗された。
【0416】
腹腔内投与
腹腔内投与のために、首の皮膚と背中の皮膚を親指と指でつかむことによって動物を固定した。その後、動物が手のひらに背を向けて休むように手をひっくり返した。動物の頭部は器官への／器官の注射／損傷を防ぐために下向きに保ち、針は鼠径部領域の正中線の左側、第４と第５の乳腺／乳頭の間に挿入した。最後に、針はスムーズな動きで取り除かれた。
腹腔内投与のために、首の皮膚と背中の皮膚を親指と指でつかむことによって動物を固定した。その後、動物が手のひらに背を向けて休むように手をひっくり返した。動物の頭部は器官への／器官の注射／損傷を防ぐために下向きに保ち、針は鼠径部領域の正中線の左側、第４と第５の乳腺／乳頭の間に挿入した。最後に、針はスムーズな動きで取り除かれた。
【0417】
鼻腔内投与
鼻腔内投与のために、動物を仰向けに保持し、ピペットを使用して接種物（２０μｌ）を両方の鼻孔に均等に分配した。動物は、完全な接種物が吸入されるまで仰向けに保たれ、その後回復するためにケージに戻された。
鼻腔内投与のために、動物を仰向けに保持し、ピペットを使用して接種物（２０μｌ）を両方の鼻孔に均等に分配した。動物は、完全な接種物が吸入されるまで仰向けに保たれ、その後回復するためにケージに戻された。
【0418】
組織学のためのサンプリング
選択された組織からの組織病理学的分析は、実験的または人道的なエンドポイント（すなわち、２、５、及び７日目）で安楽死させたすべての動物について実施した。４％ホルマリンで最低４８時間固定した後、肺と喉の切片をパラフィンに包埋し、組織切片を染色して組織学的検査を行った。
選択された組織からの組織病理学的分析は、実験的または人道的なエンドポイント（すなわち、２、５、及び７日目）で安楽死させたすべての動物について実施した。４％ホルマリンで最低４８時間固定した後、肺と喉の切片をパラフィンに包埋し、組織切片を染色して組織学的検査を行った。
【0419】
エンドポイント血清試料
感染後２、５、及び７日目の血清試料を安楽死中に収集し、すぐに血餅活性化剤を含む適切なチューブに移した。
感染後２、５、及び７日目の血清試料を安楽死中に収集し、すぐに血餅活性化剤を含む適切なチューブに移した。
【0420】
ウイルス学的分析
ウイルスＲＮＡの検出
製造者の使用説明書に従って、ＲＴＰ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｃ，Ｂｉｒｋｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、鼻洗浄液と気管スワブからＲＮＡを抽出した。組織試料からのＲＮＡ抽出には、ｉｎｎｕＰＲＥＰ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｊｅｎａ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。ウイルスＲＮＡは、製造者の使用説明書に従って、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）上で、ＮＥＢ Ｌｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）及び２０１９－ｎＣｏＶ ＲＴ－ｑＰＣＲプライマー及びプローブ（Ｅ＿Ｓａｒｂｅｃｏ）によるワンステップＲＴ ｑＰＣＲ反応を使用して定量化された。次いで、ウイルスＲＮＡコピーを、前述のように細胞ＲＰＬ１８に対して正規化した。絶対定量化のための標準曲線は、細菌人工染色体としてクローン化され、Ｅ．ｃｏｌｉ．で増殖された全長ウイルスゲノムから得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの段階希釈から作成された。
ウイルスＲＮＡの検出
製造者の使用説明書に従って、ＲＴＰ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｃ，Ｂｉｒｋｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、鼻洗浄液と気管スワブからＲＮＡを抽出した。組織試料からのＲＮＡ抽出には、ｉｎｎｕＰＲＥＰ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｊｅｎａ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。ウイルスＲＮＡは、製造者の使用説明書に従って、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）上で、ＮＥＢ Ｌｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）及び２０１９－ｎＣｏＶ ＲＴ－ｑＰＣＲプライマー及びプローブ（Ｅ＿Ｓａｒｂｅｃｏ）によるワンステップＲＴ ｑＰＣＲ反応を使用して定量化された。次いで、ウイルスＲＮＡコピーを、前述のように細胞ＲＰＬ１８に対して正規化した。絶対定量化のための標準曲線は、細菌人工染色体としてクローン化され、Ｅ．ｃｏｌｉ．で増殖された全長ウイルスゲノムから得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの段階希釈から作成された。
【0421】
複製可能なウイルスの検出
二重の１０倍段階希釈を使用して、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のコンフルエント層のウイルス力価を決定した（Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価測定）。この目的のために、試料（肺組織ホモジネート）の段階希釈を行い、Ｖｅｒｏ Ｅ６単層上で３７度で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、１．５％アビセルを含む半固体細胞培養培地を重層し、３７度で４８時間インキュベートした後、プレートを４％ホルマリンで固定し、プラーク計数用に０．７５％クリスタルバイオレットで染色した。
二重の１０倍段階希釈を使用して、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のコンフルエント層のウイルス力価を決定した（Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価測定）。この目的のために、試料（肺組織ホモジネート）の段階希釈を行い、Ｖｅｒｏ Ｅ６単層上で３７度で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、１．５％アビセルを含む半固体細胞培養培地を重層し、３７度で４８時間インキュベートした後、プレートを４％ホルマリンで固定し、プラーク計数用に０．７５％クリスタルバイオレットで染色した。
【0422】
組織病理学
選択された組織からの組織病理学的分析は、実験的または人道的なエンドポイントに達したために安楽死させられたすべての動物に対して行われた。４％ホルマリンで４８時間固定した後、肺の切片をパラフィンに包埋し、組織切片を染色して組織学的検査を行った。
選択された組織からの組織病理学的分析は、実験的または人道的なエンドポイントに達したために安楽死させられたすべての動物に対して行われた。４％ホルマリンで４８時間固定した後、肺の切片をパラフィンに包埋し、組織切片を染色して組織学的検査を行った。
【0423】
結果
この研究の目的は、ＣＯＶＩＤ－１９ロボロフスキードワーフハムスターモデルにおける結合タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９の治療の可能性を評価することであった。この評価のために、ハムスターは動物あたり１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２鼻腔内チャレンジの０、６、または２４時間後に、２０ｍｇ／ｋｇの結合タンパク質で治療的に処置された。
この研究の目的は、ＣＯＶＩＤ－１９ロボロフスキードワーフハムスターモデルにおける結合タンパク質ＡＬＥ０４９及びＡＬＥ１０９の治療の可能性を評価することであった。この評価のために、ハムスターは動物あたり１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２鼻腔内チャレンジの０、６、または２４時間後に、２０ｍｇ／ｋｇの結合タンパク質で治療的に処置された。
【0424】
感染後０、６、または２４時間のいずれかに本発明の結合タンパク質で処置した２４匹の動物はすべて屠殺の日（すなわち、３日目または５日目）まで生存したが、プラセボ群の６匹中５匹の動物は重度の臨床症状及び体重減少のために、３日目までに研究終点の前に研究から除外されなければならなかった。体重の平均は、５つの研究群のそれぞれで決定された。プラセボ群は、３日目の時点まで体重の着実な減少を示した。この時点の後、プラセボ群からの１匹の動物のみがさらなる評価のために５日目に持ち越された。すべての試験タンパク質で処置された群は、体重減少がないか、またはわずかな体重減少しか示さなかった。処置のさまざまな時点を比較した場合、またはＡＬＥ０４９とＡＬＥ１０９を比較した場合、臨床症状または体重減少に関して有意差は観察されなかった（図３６を参照されたい）。一般に、ウイルス感染または処置のいずれかに対する個々の動物の応答には多少のばらつきがあるようであり、体重減少が比較的広範囲に広がった。
【0425】
肺ホモジネートの生ウイルス力価測定及びプラーク計数による肺のウイルス力価の測定は、すでに３日目に生ウイルスの減少が観察できることを示した（図３７Ａ）。これは、ウイルスチャレンジの直後に治療が開始された時点（０時間の時点）で特に顕著であった。それでも、ウイルスチャレンジの６時間後または２４時間後に投与されたＡＬＥ１０９による処置注射は、すでに３日目に感染性ウイルスの負荷のかなりの減少を示した。この効果は、５日目に残っている３匹の動物でさらに顕著であるように見えた。結合タンパク質で処置した動物１２匹中５匹のみが、肺ホモジネート中に検出可能な感染性ウイルスを有していた（図３７Ｂ）。ｑＰＣＲによって検出されたウイルスＲＮＡゲノムコピーの減少は、感染性ウイルスの排除よりもかなり遅いように見えた。３日目には、０時間のそれぞれの時点で３匹の動物のうち１匹のみが肺でウイルスＲＮＡの減少を示した（図３７Ｃ）。ウイルスゲノムレベルでは、結合タンパク質処置群とプラセボ群の間のより顕著な差異は、感染後５日目にのみ発生し、処置の初期の時点でウイルスゲノムＲＮＡのより良好な減少の傾向が再び観察された（図３７Ｄ）。０時間の時点で ＡＬＥ０４９とＡＬＥ１０９を比較すると、ＡＬＥ０４９の方がウイルス除去が優れている傾向が見られた。
【0426】
異なる組織のさまざまなパラメーターの組織病理学的評価は、０（明らかな組織病理学的徴候なし）から４（最も重度の組織病理学的徴候）までのランク付けでスコア化された。すべてのスコアは、異なる処置群について平均され、４つのセット：ｉ）炎症、ｉｉ）血管、ｉｉｉ）肺胞、及びｉｖ）気管支に分類された。すべての平均化されたパラメーターの合計グラフを図３８Ａ～３８Ｄに示す。一般に、４つのカテゴリすべてで、結合タンパク質で処置されたハムスターとプラセボで処置されたハムスターの間に明確な差異が観察された。組織病理学的評価によると、すべての結合タンパク質処置は、プラセボ群と比較した場合、気管支（図３８Ｄ）、肺胞（図３８Ｃ）、及び血管（図３８Ｂ）の組織損傷の減少に最も強い影響を及ぼし、炎症細胞（図３８Ａ）の減少に対する影響は最も低かった。ウイルス感染後６時間の時点でＡＬＥ１０９で処置した群は、結合タンパク質で処置したすべての群の中で、炎症と組織損傷の最小の減少を示した。
【0427】
結論
１０５ＰＦＵのウイルス接種で、ロボロフスキードワーフハムスターモデルは、適切なＣＯＶＩＤ－１９疾患モデルであり、未処置の動物は一般に、安楽死の基準に達する強い臨床症状を発症する。ウイルスチャレンジの０時間後のＡＬＥ０４９、またはウイルスチャレンジの０、６、または２４時間後のＡＬＥ１０９による動物の治療処置は、すべての結合タンパク質処置群に匹敵する重篤な臨床症状の有意な減少をもたらした。２４匹の結合タンパク質処置動物はいずれも、３日目または５日目の公式の屠殺時点の前に安楽死基準に達することなく、一方で６匹のプラセボ処置動物では、２日目に２匹の動物、３日目に別の３匹の動物が強い臨床症状を発症し、研究から除外されなければならなく、５日目まで研究に残ったプラセボで処置された動物は１匹だけであった。
１０５ＰＦＵのウイルス接種で、ロボロフスキードワーフハムスターモデルは、適切なＣＯＶＩＤ－１９疾患モデルであり、未処置の動物は一般に、安楽死の基準に達する強い臨床症状を発症する。ウイルスチャレンジの０時間後のＡＬＥ０４９、またはウイルスチャレンジの０、６、または２４時間後のＡＬＥ１０９による動物の治療処置は、すべての結合タンパク質処置群に匹敵する重篤な臨床症状の有意な減少をもたらした。２４匹の結合タンパク質処置動物はいずれも、３日目または５日目の公式の屠殺時点の前に安楽死基準に達することなく、一方で６匹のプラセボ処置動物では、２日目に２匹の動物、３日目に別の３匹の動物が強い臨床症状を発症し、研究から除外されなければならなく、５日目まで研究に残ったプラセボで処置された動物は１匹だけであった。
【0428】
感染性ウイルスまたはウイルスゲノムコピーのウイルス負荷に関しては、すべての結合タンパク質処置群で明らかな減少が観察された。この減少は３日目から５日目にかけて増加し、早期に処置を行った処置群は、より顕著な減少で応答したようである。０時間に投与されたＡＬＥ０４９をＡＬＥ１０９と比較すると、ＡＬＥ０４９処置群は、処置群あたりの動物数がかなり少ないことを考慮すると、わずかに良好に反応した。
【0429】
肺の組織病理学的所見は、プラセボ群と比較した場合、すべての結合タンパク質処置群の病理学的スコアの明らかな減少を示した。これらの調査結果は、この研究で試験された処置レジメンとは無関係であるようである。
【0430】
結論として、ＡＬＥ０４９とＡＬＥ１０９の両方が、ロボロフスキードワーフハムスターモデルを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する治療の可能性を実証した。
【0431】
本明細書は、本明細書内で引用されている参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用されたすべての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、その全体が参照により組み込まれる。参照により組み込まれた資料がこの仕様と矛盾または不一致である限り、仕様はそのような資料に取って代わりれる。本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【0432】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図14e】
【図14f】
【図15a】
【図15b】
【図16】
【図17】
【図18a】
【図18b】
【図18c】
【図18d】
【図19】
【図20】
【図21a】
【図21b】
【図21c】
【図22a】
【図22b】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26a】
【図26b】
【図26c】
【図26d】
【図26e】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37a】
【図37b】
【図37c】
【図37d】
【図38a】
【図38b】
【図38c】
【図38d】
【配列表】
【国際調査報告】