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特表2023-525581補体の活性化を検出するための細胞外小胞の使用方法、並びに補体性疾患の処置を評価及び／又は監視するためのその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-16
(54)【発明の名称】補体の活性化を検出するための細胞外小胞の使用方法、並びに補体性疾患の処置を評価及び／又は監視するためのその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230609BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230609BHJP
G01N 33/552 20060101ALI20230609BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230609BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230609BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20230609BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20230609BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20230609BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20230609BHJP
A61K 31/7105 20060101ALN20230609BHJP
A61K 31/713 20060101ALN20230609BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/53 Y
G01N33/53 U
G01N33/543 541A
G01N33/552
C07K16/18
C12N15/113 Z
C12N5/071
A61P43/00 111
A61K48/00
A61K39/395 N
A61K31/7105
A61K31/713
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022569106
(86)(22)【出願日】2021-05-13
(85)【翻訳文提出日】2023-01-13
(86)【国際出願番号】 US2021032241
(87)【国際公開番号】W WO2021231720
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】63/025,557
(32)【優先日】2020-05-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503102674
【氏名又は名称】アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ミルマン， エレン イー．
(72)【発明者】
【氏名】キャメット， トビン ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AC14
4B065BA25
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZC411
4C084ZC412
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZC41
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
生物学的試料における補体の活性を検出する方法が本明細書に開示されている。本開示はまた、対象における補体性疾患の診断又は予後評価のための方法、及び対象における補体モジュレーターを用いた補体性疾患の処置に対する応答を監視するための方法にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象由来の生物学的試料において補体活性を検出する方法であって、（ａ）細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む前記生物学的試料の一部を、少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片で単離して、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上において、ＥＶ特異的マーカー又は前記ＥＶ上に表示される組織特異的マーカーを含む第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｂ）場合により、前記試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）前記捕捉されたＥＶ又は前記その膜結合部分の上の補体系関連構成要素の存在又はレベルを、前記補体系関連構成要素に特異的である少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片を用いて定性的に又は定量的に検出し、それにより前記生物学的試料における補体活性化を検出することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記第１の捕捉マーカーが、ＥＶ特異的マーカーを含み、場合による前記第２の捕捉マーカーが、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上に表示される組織特異的マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１の捕捉マーカー及び前記第２の捕捉マーカーがいずれも存在しており、ＥＶ特異的マーカーを含む前記第１の捕捉マーカー、及び組織特異的マーカーを含む第２の捕捉マーカーが検出される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記生物学的試料が、組織、臓器、又は体液由来である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記生物学的試料が、膀胱細胞、腎細胞、全血、赤血球、血小板、血清、血漿、血清若しくは血漿以外の血液画分、リンパ液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、涙、膣分泌物、精液、腺分泌物、滲出液、嚢胞若しくは糞便の内容物、洗浄液、又は腹水由来の、ＥＶ又はその膜結合部分を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記生物学的試料が、腎臓の糸球体足細胞、曲尿細管、又は膀胱上皮、又は赤血球（ＲＢＣ）由来の、ＥＶ又はその膜結合部分を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の捕捉抗体又は前記その抗原結合断片が、第１の固体支持体へ結合しており、場合により前記第２の捕捉抗体又は前記その抗原結合断片が、第２の固体支持体へ結合しており、及び検出抗体が、検出可能なマーカーへ結合している、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記生物学的試料の一部を、前記第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片及び前記第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含み、前記第１の捕捉抗体又は前記その抗原結合断片及び前記第２の捕捉抗体又は前記その抗原結合断片が、同じ支持体又は異なる支持体へ結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記検出可能なマーカーが、フルオロホア、色原体、及びビオチンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記検出可能なマーカーは、吸収極大が５００ｎｍ～１０００ｎｍの間にあり、且つ発光極大が５５０ｎｍ～１１００ｎｍの間にあるフルオロホアである、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記検出可能なマーカーが、フィコエリトリン（ＰＥ）である、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記検出可能なマーカーが、ビオチンである、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１及び第２の固体支持体が独立して、ナノ粒子、ミクロ粒子、ビーズ、磁気ビーズ、ナノ構造、組織培養プレート、シリカ、及びナノマトリックスからなる群から選択される、請求項７～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記第１のマーカーが、細胞外小胞関連タンパク質からなる群から選択され、場合により、前記第２のマーカーが、組織特異的細胞外小胞関連タンパク質からなる群から選択され、並びに
前記補体系関連構成要素が、（ａ）代替的な補体経路（ＡＰ）の構成要素、（ｂ）従来の経路（ＣＰ）と関連した構成要素、及び（ｃ）レクチン経路（ＭＢＬ）と関連した構成要素からなる群から選択される、請求項１～１３のいずれかの記載の方法。
【請求項15】
前記補体系関連構成要素が、（ａ）代替的な経路（ＡＰ）の構成要素、及び（ｂ）従来の経路（ＣＰ）と関連した構成要素からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記補体系関連構成要素が、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃｌｑ、Ｃ９、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、ＴＦ、ＣＲＰ、ｐＣＲＰ、ＭＡＣ、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＲ１、Ｃ５ａＲｌ、及びＣ５ａからなる群から選択されるタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記第１のマーカーが、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＦ１０６、ＣＤ５６、ＣＤ５１、ＣＤ８２、インテグリン、テトラスパニン、アネキシン、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、シンテニン１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、アクチン、Ｒａｂ５、クラスリン、フロチリン１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、アクチニン４、ＧＰ９６、ＥＨＤ４、ミトフィリン、及びＬＡＭＰ２からなる群から選択され、前記第２のマーカーが、ポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、ウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）、ポドシン（ＮＰＨＳ２）、グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）、ムチン１、２型Ｎａ－Ｋ－２Ｃ１共輸送体（ＮＫＣＣ２）、アクアポリン１（ＡＱＰ １）、α－グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（アルファ－ＧＳＴ）、Ｔａｍｍ－Ｈｏｒｓｆａｌｌタンパク質（ＴＨ）、カルビンディン－Ｄ２８Ｋ（ＣａｌＤ）、メガリン、キュビリン、ネフリン（Ｎｐｈｓｌ）、クローディン１、アネキシンＶ、シナプトポディン（Ｓｙｎｐｏ）、ウィルム腫瘍タンパク質（Ｗｔｌ）、バンド３、ストマチン（ＳＴＯＭ）、ＢＧＰ１、グロビン、グリコホリンＢ、Ｒｈポリペプチド、及びＲｈ糖タンパク質からなる群から選択され、並びに
前記補体タンパク質が、ＭＡＣ、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃｌｑ、及びＣ９からなる群から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記生物学的試料が、腎臓細胞由来のＥＶを含み、前記第２のマーカーが、ポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、アクアポリン２（ＡＱＰ ２）、ウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）、及びポドシン（ＮＰＨＳ２）からなる群から選択される腎臓特異的ＥＶマーカーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記試料が、赤血球（ＲＢＣ）由来のＥＶを含み、前記第２のマーカーが、グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）から選択されるＲＢＣ特異的ＥＶマーカーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記試料が、第１のマーカーとしてのＣＤ８１及び／又は第２のマーカーとしてのウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）に対して陰性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記捕捉マーカー及び前記検出マーカーが、同じＥＶ又はその膜結合部分の中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上にある前記補体経路の前記構成要素の前記存在又はレベルを対照と比較することを含む、前記対象が補体性疾患に罹患しているかどうか又は補体性疾患を発症するリスクがあるかどうかを判定することをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記対照が、健常対象由来の同等の試料を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記対象から得られた前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上の前記補体経路の前記構成要素の前記レベル又は前記存在が、前記対照と比較して高い場合、前記対象が、補体性疾患に罹患していること又は補体性疾患を発症するリスクがあることを示すことを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項25】
対象における補体性疾患の診断又は予後評価のための方法であって、（ａ）前記対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む試料を得ることと、
（ｂ）前記試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、前記試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）前記少なくとも１つの第１のマーカーと場合により前記少なくとも１つの第２のマーカーとを含む前記捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）前記検出抗体又は前記その抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上の前記補体経路の前記構成要素の存在又はレベルを測定し、対照と比較して、前記対象の試料における前記補体経路の前記構成要素の前記存在又はレベルが高いと、前記対象が前記補体性疾患に罹患していること又は前記補体性疾患を発症するリスクがあることを示すことと
を含む、方法。
【請求項26】
前記第１のマーカーが、ＥＶ特異的マーカー又はＥＶ上に表示される組織特異的マーカーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記第１のマーカーが、ＥＶ特異的マーカーを含み、前記第２のマーカーが、ＥＶ上に表示される組織特異的マーカーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
対象において補体モジュレーターを用いた補体性疾患の処置に対する応答を監視するための方法であって、（ａ）前記処置の前及び後の前記対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む試料を得ることと、
（ｂ）前記試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、前記試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）前記少なくとも１つの第１のマーカーと場合により前記少なくとも１つの第２のマーカーとを含む前記捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）前記検出抗体又は前記その抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを測定し、前記補体モジュレーターを用いた処置の前と比較して、前記補体モジュレーターを用いた処置の後の前記対象の試料における前記補体経路の前記構成要素の前記存在又はレベルが減弱していると、前記対象が前記補体モジュレーターに応答していることを示すことと
を含む、方法。
【請求項29】
前記補体のメディエーターが、補体５（Ｃ５）阻害剤、補体５ａ（Ｃ５ａ）阻害剤、補体５受容体（Ｃ５Ｒ１）阻害剤、補体３（Ｃ３）阻害剤、Ｄ因子（ＦＤ）阻害剤、Ｈ因子（ＦＨ）阻害剤、Ｂ因子（ＦＢ）阻害剤、ＭＡＳＰ２阻害剤、ＭＡＳＰ３阻害剤、プロペルジン阻害剤、又はこれらの組み合わせである、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記疾患が、炎症性疾患又は血栓性疾患である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記疾患が、血栓性血液学的疾患又は血栓性腎疾患である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記疾患が、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、デンスデポジット病（ＤＤＤ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ＩｇＡ腎症（ＩＮ）、ループス腎炎（ＬＮ）、膜性腎症（ＭＮ）、移植患者における血液透析による合併症、抗体関連型拒絶反応（ＡＭＲ）、及び抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）からなる群から選択される腎疾患である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記疾患が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、実質臓器の移植又は造血性幹細胞の移植による二次性ＨＵＳ、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、及び寒冷凝集素症（ＣＡＤ）からなる群から選択される血液学的疾患である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記検出が、免疫検定法（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ）、電子顕微鏡法（ＥＭ）、タンデムマスタグ（ＴＭＴ）、発光アッセイ（例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ）、又は蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
検出ステップが、マルチプレックスフォーマットにおいて行われる、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
検出ステップが、１つの試料におけるいくつかの別個の組織中のマーカーを測定することによって、並びに／又は単一のアッセイにおける複数の有望な補体タンパク質及び補体経路を監視することによって行われる、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記第１のマーカー及び場合により前記第２のマーカーが、前記個々の抗体又は前記その抗原結合断片と接触する前に、ＥＶ濃縮ステップが行われる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記生物学的試料が、非侵襲的な液体生検プロトコルから獲得される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
対象の腎組織における補体活性化を検出する方法であって、（ａ）細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜の上に表示されるＥＶ特異的マーカー又は組織特異的マーカーである第１のマーカーを含むＥＶ又はその膜結合部分を含む、前記対象由来の尿試料を、前記第１のマーカーに特異的な第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させ、それにより、前記第１のマーカーを含有するＥＶ又は膜を捕捉することと、
（ｂ）場合により、前記試料を第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記第１のマーカーとは異なる第２の捕捉マーカーを含むＥＶ又はその膜結合部分を捕捉することと、
（ｃ）前記捕捉されたＥＶ又は前記その膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを、前記構成要素に特異的な抗体又はその抗原結合断片を用いて定性的に又は定量的に検出し、それにより前記生物学的試料における補体活性化を検出することと
を含む、方法であって、
前記ＥＶ特異的マーカーが、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１からなる群から選択され、
前記組織特異的マーカーが、
（１）糸球体における足細胞に特異的なポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、
（２）曲尿細管上皮に特異的なアクアポリン２（ＡＱＰ２）、
（３）膀胱上皮に特異的なウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）、及び
（４）赤血球（ＲＢＣ）に特異的なグリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）
からなる群から選択され、並びに
前記補体経路の前記構成要素が、ＭＡＣ、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃ１ｑ、及びＣ９からなる群から選択される、方法。
【請求項40】
少なくとも１つの第１の標的を捕捉するための少なくとも１つの第１の捕捉抗体、少なくとも１つの第２の標的を捕捉するための少なくとも１つの第２の捕捉抗体、及び捕捉された前記少なくとも１つの第１の標的の量、捕捉された前記少なくとも１つの第２の標的の量、又はその両方の量を検出するための、補体タンパク質に特異的な少なくとも１つの検出抗体の、使用。
【請求項41】
補体調節について試験化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）補体性疾患に罹患している対象（例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ラマ、イヌ、サル、チンパンジーなどの動物、又はヒト）への前記試験化合物の投与の前及び後の、前記対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含有する試料を得ることと、
（ｂ）前記試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、前記試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）前記捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）前記検出抗体又は前記その抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、前記ＥＶ又は前記その膜結合部分の上の前記補体構成要素の存在又はレベルを測定し、前記試験化合物の投与前と比較した、前記試験化合物の投与後の前記対象の試料中の前記補体構成要素の前記存在又はレベルの調節（例えば、上昇又は低下、好ましくは低下）が、前記試験化合物が補体を調節することができることを示すことと
を含む、方法。
【請求項42】
前記試験化合物が、Ｃｌｑ、Ｃｌ、Ｃｌｓ、Ｃ２、ＭＡＳＰ－２、ＭＡＳＰ－３、Ｄ因子、Ｂ因子、プロペルジン（Ｐ因子）、Ｈ因子、Ｃ３／Ｃ５コンベルターゼ、Ｃ５、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ、Ｃ３ａ／Ｃ３ａＲ、Ｃ６、又はＣＤ５９を特異的に調節することができる、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記試験化合物が、モノクローナル抗体又は小分子又はｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉである、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
前記試験化合物の調節活性が、補体調節活性を有する分子の調節活性と比較される、請求項４１に記載の方法。
【請求項45】
前記分子が、表Ａにおいて提供される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１５日出願の米国仮特許出願第６３／０２５，５５７号の優先権及び利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月１５日出願の米国仮特許出願第６３／０２５，５５７号の優先権及び利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、生物学的試料における補体の活性化を検出する方法に関する。本開示はまた、対象における補体性疾患の診断又は予後評価のための方法、並びに補体モジュレーターを用いた補体性疾患の処置中及び処置後の応答を監視するための方法にも関する。
【背景技術】
【0003】
補体系は、先天免疫系の一部であり、細胞性病原体及びウイルス性病原体の侵入から身体を防御する他の免疫学的な系とともに作用する。補体経路には少なくとも２５のタンパク質があり、循環血漿タンパク質と細胞膜補因子とからなる複合体の集合体としてみられる。血漿タンパク質は、脊椎動物の血清中のグロブリンの約１０％を構成する。補体タンパク質は、不活性前駆体として血中を循環し、いくつかのトリガのうちの１つによって刺激されると、当該系におけるプロテアーゼが特異的タンパク質を開裂させて、サイトカインを放出し、更なる開裂の増幅カスケードを開始させる。
【0004】
補体の構成要素は、細胞表面の複雑なシリーズ、並びに酵素による正確な開裂及び原形質膜結合事象を包含する流体相相互作用を活性化することによって、当該構成要素の免疫防御機能を達成する。結果として生じる補体カスケードは、オプソニン化機能、免疫調節機能、溶解機能を持つ生成物の生成につながる。
【0005】
補体カスケードは、従来の経路、代替的な経路、又はレクチン経路を介して進行する。これらの経路は、多くの構成要素を共有し、初期段階は異なるものの、標的細胞の活性化及び破壊の原因となる同じ「終末補体」構成要素（Ｃ５～Ｃ９）を共有する。
【0006】
従来の経路（ＣＰ）は典型的には、標的細胞の抗原性部位を抗体が認識し結合することによって開始される。代替的な経路（ＡＰ）は、抗体非依存性であり、病原体表面上のある特定の分子によって自動活性化できる。加えて、レクチン経路は典型的には、高マンノース基質へのマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）の結合で開始される。これらの経路は、補体の構成要素Ｃ３が活性のあるプロテアーゼによって開裂してＣ３ａ及びＣ３ｂを生じる地点で収束する。補体の攻撃を活性化する他の経路は後に、補体の機能の種々の態様につながる事象の流れにおいて作用することができる。
【0007】
この補体の系は、疾患を攻撃するためにヒトの体内で極めて重要な役割を担っており、補体の系における構成要素の測定は、疾患の診断及び／又は予後に、並びに補体性疾患の処置に対する応答を監視するのに有用であり得る。
【0008】
組織生検は、ほとんどの疾患の診断のための最終的な臨床エビデンスを提供し、疾患の病理発生における補体についての役割を確認するための直接的な方法であり得る。しかしながら、生検は有痛且つ高価であり、その手順と関係したリスクがある。反復組織生検はあまり行われない。それゆえ、複数回局所組織生検を介した処置に対する縦断的な応答を監視することはできない。
【0009】
細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞によって作られる小さな膜結合型の被覆された粒子（３０～１００ｎｍ）である。ＥＶは、親細胞の原形質膜（ＰＭ）から放出され、機能的な膜及び細胞質のタンパク質、脂質、及びＲＮＡを含有する。ＥＶについての他の用語としては、微小胞、エクトソーム、小胞、脱粒小胞、ミクロ粒子、及びエキソソームがある。ＥＶ外膜は、ＥＶ特異的タンパク質マーカー、及び親細胞に特異的なＰＭマーカーを含有する。ＥＶ膜タンパク質の向きは、親ＰＭと同じである。細胞外小胞は、タンパク質のテトラスパニンスーパーファミリーのメンバーであるＣＤ９、ＣＤ６３、又はＣＤ８１などの正準ＥＶマーカーを保有する。テトラスパニンは、ＥＶの最も豊富な膜タンパク質である。いくつかのＥＶはまた、ＣＤ５５及びＣＤ５９など、当該ＥＶの表面上に補体調節因子も保有する。健常者の尿はおおよそ１０９個尿ＥＶ／ｍＬ（ｕＥＶ／ｍＬ）を含有し、これは、腎臓、尿路上皮、及び（男性では）生殖器から主として生じる。ストレス下での細胞は、ＥＶ産生を上昇させるであろう。
【0010】
補体診断薬及び補体療法の分野において現在満たされていない必要性は、終末補体複合体の局所化した組織配置を測定するための高感度、特異的、且つ非侵襲的な臨床検査である。処置中の細胞表面補体活性の頻繁な縦断的監視を可能にする非侵襲的な検査は、具体的な臓器の局所レベルで療法の薬物動態作用についての新規の情報を提供するであろうし、このことは、流体相補体活性の測定に制限される現行の方法に対し有意な進展を表す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
様々な補体性疾患に罹患している患者における処置応答を診断及び／又は監視するための非侵襲的な、高感度の、且つ特異的な検査として細胞外小胞を使用する方法が本明細書に提供される。一態様において、ＥＶは、尿を含む生物学的流体から単離された液体生検源とみなすことができる。本開示は部分的に、ＥＶにおける補体沈着の発見に基づいており、当該知見は、インビボでの補体活性を監視するためのサロゲートとしての患者の試料のエクスビボ分析、補体経路を調節する薬物の効能を監視するための方法、患者を経時的に監視するための方法、並びに全身的な及び／又は局所的な組織表面補体活性を調節する試験化合物をスクリーニングするための方法など、多くの応用に対して活用することができる。
【0012】
本アッセイは、臓器特異的な組織のレベルでの補体活性及び調節不全、並びに処置中の調節を定量するための免疫蛍光検出を備えたビーズ系免疫捕捉プロトコルを利用する。尿試料を用いた例証される概念実証に基づいて、本方法は、抗体タグ付ビーズ及びフルオロホアを含むタンパク質及び組織特異的検出試薬を用いたいずれかの液体マトリックスにおける補体攻撃の下でいずれかの臓器又は組織を監視するために広範に適用することができる。本アッセイの原理及び尿中で行われる概念実証は、終末補体複合体沈着によって損傷を受けた組織由来のＥＶを含む他の組織／臓器由来の脱粒したＥＶの分析のために、血液及び脳脊髄液へ潜在的に拡大することができる。
【0013】
一態様において、本開示は、ＥＶを単離及び濃縮するための、並びに治療介入前、治療介入中、及び治療介入後のＥＶの表面上の補体の半定量監視のための容易に使用される方法を提供する。本方法は、広範な種々のアッセイフォーマットへ容易にマルチプレックス処理及び適応させることができ、並びに／又は種々の分析技術、例えば、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、質量分析（ＭＳ）若しくは超解像顕微鏡と組み合わせることができる。
【0014】
本開示は、以下の非限定的な態様に関する。
【0015】
本開示は、生物学的試料における補体活性を検出する方法であって、
（ａ）細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む生物学的試料の一部を、少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片で単離して、ＥＶ又はその膜結合部分の上において、ＥＶ特異的マーカー又はＥＶ上に表示される組織特異的マーカーを含む第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｂ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分の上の補体系関連構成要素の存在又はレベルを、補体系関連構成要素に特異的である少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片を用いて定性的に又は定量的に検出し、それにより生物学的試料における補体活性化を検出することと
を含む、方法を提供する。
（ａ）細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む生物学的試料の一部を、少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片で単離して、ＥＶ又はその膜結合部分の上において、ＥＶ特異的マーカー又はＥＶ上に表示される組織特異的マーカーを含む第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｂ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分の上の補体系関連構成要素の存在又はレベルを、補体系関連構成要素に特異的である少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片を用いて定性的に又は定量的に検出し、それにより生物学的試料における補体活性化を検出することと
を含む、方法を提供する。
【0016】
第１及び／又は第２のマーカーは、独立して、膜貫通である場合はＥＶの膜上にあってもよく、又は可溶性の場合（Ｃ５など）はＥＶの内側にあってもよく、したがって、「の上に」はまた「の中に」又は「の内側に」も含む。
【0017】
一実施形態において、第１の捕捉マーカーは、ＥＶ特異的マーカーを含み、場合による第２の捕捉マーカーは、ＥＶ又はその膜結合部分の上に表示される組織特異的マーカーを含む。一実施形態において、第１の捕捉マーカー及び第２の捕捉マーカーはいずれも存在しており、第１の捕捉マーカーはＥＶ特異的マーカーを含み、第２の捕捉マーカーは組織特異的マーカーを含み、これらが検出される。
【0018】
一実施形態において、生物学的試料中の細胞外小胞は、尿などの液体生検由来である。この生物学的試料は、液体生検プロトコルから獲得される。
【0019】
一実施形態において、生物学的試料は、組織、臓器、又は体液由来である。一実施形態において、生物学的試料は、膀胱細胞、腎細胞、全血、赤血球、血小板、血清、血漿、血清若しくは血漿以外の血液画分、リンパ液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、涙、膣分泌物、精液、腺分泌物、滲出液、嚢胞若しくは糞便の内容物、洗浄液、又は腹水由来の、ＥＶ又はその膜結合部分を含む。一実施形態において、生物学的試料は、腎臓の糸球体足細胞、曲尿細管、又は膀胱上皮、又は赤血球（ＲＢＣ）由来の、ＥＶ又はその膜結合部分を含む。一態様において、生物学的試料は、尿試料である。一態様において、生物学的試料は、赤血球（ＲＢＣ）試料である。
【0020】
一実施形態において、第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片は、第１の固体支持体へ結合しており、場合により第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片は、第２の固体支持体へ結合しており、検出抗体は、検出可能なマーカーへ結合している。一実施形態において、本明細書に開示される方法は、生物学的試料の一部を第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片及び第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含み、第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片及び第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片が、同じ支持体又は異なる支持体へ結合している。
【0021】
一実施形態において、検出可能なマーカーは、フルオロホア、色原体、及びビオチンからなる群から選択される。一実施形態において、検出可能なマーカーは、吸収極大が約５００ｎｍ～約９００ｎｍの間、約６００ｎｍ～約１０００ｎｍの間、又は約５００ｎｍ～約１０００ｎｍの間にあり、且つ発光極大が約５５０ｎｍ～約９００ｎｍの間、約６００ｎｍ～約１０００ｎｍの間、又は約５５０ｎｍ～約１１００ｎｍの間にあるフルオロホアである。一実施形態において、検出可能なマーカーは、ストレプトアビジンと結合した又は結合していないフィコエリトリン（ＰＥ）である。一実施形態において、検出可能なマーカーは、ストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）とともに使用するためのビオチンである。
【0022】
一実施形態において、第１及び第２の固体支持体は独立して、ナノ粒子、ミクロ粒子、ビーズ、磁気ビーズ、ナノ構造、組織培養プレート、シリカ、及びナノマトリックスからなる群から選択される。
【0023】
一実施形態において、第１のマーカーは、細胞外小胞関連タンパク質からなる群から選択され、場合により接触している第２のマーカーは、組織特異的細胞外小胞関連タンパク質からなる群から選択され、補体系関連構成要素は、（ａ）代替的な補体経路（ＡＰ）の構成要素、（ｂ）従来の補体経路（ＣＰ）の構成要素、及び（ｃ）レクチン補体経路（ＭＢＬ）の構成要素からなる群から選択される。好ましい実施形態では、補体系関連構成要素は、（ａ）代替的な経路（ＡＰ）の構成要素、及び（ｂ）従来の経路（ＣＰ）の構成要素からなる群から選択される。
【0024】
一実施形態において、補体系関連構成要素は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ５ｂ－９（膜攻撃複合体（ＭＡＣ））、ＴＦ、ＣＲＰ、ｐＣＲＰ、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、Ｃ５ａＲ１、プロペルジン、Ｈ因子、Ｈ因子関連タンパク質、及びＩ因子からなる群から選択されるタンパク質である。図１１（Ｋａｒａｓｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９（７２１），２０１８から改作した画像）を参照されたい。
【0025】
一実施形態において、第１のマーカーは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＦ１０６、ＣＤ５６、ＣＤ５１、ＣＤ８２、インテグリン、テトラスパニン、アネキシン、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、シンテニン１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、アクチン、Ｒａｂ５、クラスリン、フロチリン１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、アクチニン４、ＧＰ９６、ＥＨＤ４、ミトフィリン、及びＬＡＭＰ２からなる群から選択され、第２のマーカーは、ポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、ウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）、ポドシン（ＮＰＨＳ２）、グリコホリンＡ（ＧＹＰ Ａ）、ムチン１、２型Ｎａ－Ｋ－２Ｃ１共輸送体（ＮＫＣＣ２）、アクアポリン１（ＡＱＰ １）、α－グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（アルファ－ＧＳＴ）、カルビンディン－Ｄ２８Ｋ（ＣａｌＤ）、メガリン、キュビリン、ネフリン（Ｎｐｈｓｌ）、クローディン１、アネキシンＶ、シナプトポディン（Ｓｙｎｐｏ）、ウィルム腫瘍タンパク質（Ｗｔｌ）、バンド３、ストマチン（ＳＴＯＭ）、ＢＧＰ１、グロビン、グリコホリンＢ、Ｒｈポリペプチド、及びＲｈ糖タンパク質からなる群から選択され、補体タンパク質は、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃｌｑ、及びＣ９からなる群から選択される。
【0026】
一実施形態において、生物学的試料は、腎臓系由来のＥＶを含み、第２のマーカーは、ポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、アクアポリン２（ＡＱＰ ２）、ウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）、及びポドシン（ＮＰＨＳ２）からなる群から選択される腎臓特異的ＥＶマーカーである。
【0027】
一実施形態において、試料は、赤血球（ＲＢＣ）由来のＥＶを含み、第２のマーカーは、グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）から選択されるＲＢＣ特異的ＥＶマーカーである。
【0028】
一実施形態において、試料は、第１のマーカーとしてのＣＤ８１に対して陰性である、第２のマーカーとしてのウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）に対して陰性である、又は第１のマーカーとしてのＣＤ８１及び第２のマーカーとしてのＵＰＫ１Ｂの両方に対して陰性であるＥＶを含む。
【0029】
一実施形態において、捕捉マーカー及び検出マーカーは、同じＥＶ又はその膜結合部分の中に存在する。
【0030】
一実施形態において、方法はさらに、ＥＶ又はその膜結合部分の上にある補体経路の構成要素の存在又はレベルを対照と比較することを含む、対象が補体性疾患に罹患しているかどうか又は補体性疾患を発症するリスクがあるかどうかを判定することを含む。一実施形態において、対照は、健常対象者由来の同等の試料を含む。一実施形態において、方法は、対象から得られたＥＶ又はその膜結合部分の上の補体経路の構成要素のレベル又は存在が、対照と比較して高い場合、すなわち、対象から得られたレベルが、補体性疾患と診断されていない対照対象由来の試料と比較して高い場合、対象が、補体性疾患に罹患していること又は補体性疾患を発症するリスクがあることを示す。
【0031】
本発明はさらに、対象における補体性疾患の診断又は予後評価のための方法であって、
（ａ）対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む試料を得ることと、
（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）少なくとも１つの第１のマーカーと場合により少なくとも１つの第２のマーカーとを含む捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを測定し、対照と比較して、対象の試料における補体経路の構成要素の存在又はレベルが高いと、対象が補体性疾患に罹患している又は補体性疾患を発症するリスクがあることを示すことと
を含む、方法を提供する。
（ａ）対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む試料を得ることと、
（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）少なくとも１つの第１のマーカーと場合により少なくとも１つの第２のマーカーとを含む捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを測定し、対照と比較して、対象の試料における補体経路の構成要素の存在又はレベルが高いと、対象が補体性疾患に罹患している又は補体性疾患を発症するリスクがあることを示すことと
を含む、方法を提供する。
【0032】
本発明はまた、先に論議したステップ（ａ）～ステップ（ｅ）を含む、対象が補体性疾患に罹患しているかどうか又は罹患しているリスクがあるかどうかを示す方法も提供する。
【0033】
一実施形態において、第１のマーカーは、ＥＶ特異的マーカー又はＥＶ上に表示される組織特異的マーカーを含む。一実施形態において、第１のマーカーは、ＥＶ特異的マーカーを含み、第２のマーカーは、ＥＶ上に表示される組織特異的マーカーを含む。
【0034】
本発明はさらに、対象において補体モジュレーターを用いた補体性疾患の処置に対する応答を監視するための方法であって、
（ａ）処置の前及び後の対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む試料を得ることと、
（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）少なくとも１つの第１のマーカーと場合により少なくとも１つの第２のマーカーとを含む捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを測定し、補体モジュレーターを用いた処置の前と比較して、補体モジュレーターを用いた処置の後の対象の試料における補体経路の構成要素の存在又はレベルが減弱していると、対象が補体モジュレーターに応答していることを示すことと
を含む、方法を提供する。
（ａ）処置の前及び後の対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含む試料を得ることと、
（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）少なくとも１つの第１のマーカーと場合により少なくとも１つの第２のマーカーとを含む捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを測定し、補体モジュレーターを用いた処置の前と比較して、補体モジュレーターを用いた処置の後の対象の試料における補体経路の構成要素の存在又はレベルが減弱していると、対象が補体モジュレーターに応答していることを示すことと
を含む、方法を提供する。
【0035】
いくつかの実施形態において、補体モジュレーターは、表Ａに列挙される分子である。好ましくは、補体モジュレーターは、Ｃ１ｑ、Ｃ１、Ｃ１ｓ、Ｃ２、ＭＡＳＰ－２、ＭＡＳＰ－３、Ｄ因子、Ｂ因子、プロペルジン（Ｐ因子）、Ｈ因子、Ｃ３／Ｃ５コンベルターゼ、Ｃ５、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ、Ｃ３ａ／Ｃ３ａＲ、Ｃ６、及び／又はＣＤ５９から選択される補体構成要素の活性を調節する（例えば、上昇させる又は低減させる、好ましくは低減させる）分子である。特に、補体モジュレーターは、補体構成要素の小分子阻害剤、又は補体構成要素を標的とするｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ、又は補体構成要素へ特異的に結合する抗体である。
【0036】
一実施形態において、補体メディエーターは、補体５（Ｃ５）阻害剤、補体５ａ（Ｃ５ａ）阻害剤、補体５受容体（Ｃ５Ｒ１）阻害剤、補体３（Ｃ３）阻害剤、Ｄ因子（ＦＤ）阻害剤、Ｈ因子（ＦＨ）阻害剤、Ｂ因子（ＦＢ）阻害剤、ＭＡＳＰ２阻害剤、ＭＡＳＰ３阻害剤、プロペルジン阻害剤、又はこれらの組み合わせである。
【0037】
一実施形態において、疾患は、炎症性疾患又は血栓性疾患である。一実施形態において、疾患は、血栓性血液学的疾患又は血栓性腎疾患である。一実施形態において、疾患は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、デンスデポジット病（ＤＤＤ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ＩｇＡ腎症（ＩＮ）、ループス腎炎（ＬＮ）、膜性腎症（ＭＮ）、移植患者における血液透析による合併症、抗体関連型拒絶反応（ＡＭＲ）、及び抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）からなる群から選択される腎疾患である。一実施形態において、疾患は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、実質臓器の移植又は造血性幹細胞の移植による二次性ＨＵＳ、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、及び寒冷凝集素症（ＣＡＤ）からなる群から選択される血液学的疾患である。一実施形態において、疾患は、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）、全身型重症筋無力症（ｇＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び原発性進行性多発性硬化症（ＰＰＭＳ）から選択される神経学的疾患である。
【0038】
一実施形態において、検出は、免疫検定法（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ）、電子顕微鏡法（ＥＭ）、タンデムマスタグ（ＴＭＴ）、発光アッセイ（例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ）、又は蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）（免疫蛍光検定法（ＩＦ）とも呼ばれる）を含む。一実施形態において、検出ステップは、マルチプレックスフォーマットにおいて行われ、すなわち、検出は、１つの試料におけるいくつかの別個の組織中のマーカーを測定することによって、並びに／又は単一のアッセイにおける複数の有望な補体タンパク質及び補体経路を監視することによって行われる。
【0039】
本発明はさらに、対象の腎組織における補体活性化を検出する方法であって、
（ａ）細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜の上に表示されるＥＶ特異的マーカー又は組織特異的マーカーである第１のマーカーを含むＥＶ又はその膜結合部分を含む、対象由来の尿試料を、第１のマーカーに特異的な第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させ、それにより、第１のマーカーを含有するＥＶ又は膜を捕捉することと、
（ｂ）場合により、尿試料を第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、第１のマーカーとは異なる第２の捕捉マーカーを含むＥＶ又はその膜結合部分を捕捉することと、
（ｃ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを、この構成要素に特異的な抗体又はその抗原結合断片を用いて定性的に又は定量的に検出し、それにより尿試料における補体活性化を検出することと
を含む、方法であって、
ＥＶ特異的マーカーが、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１からなる群から選択され、
組織特異的マーカーが、
（１）糸球体における足細胞に特異的なポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、
（２）曲尿細管上皮に特異的なアクアポリン２（ＡＱＰ２）、
（３）膀胱上皮に特異的なウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）、及び
（４）赤血球（ＲＢＣ）に特異的なグリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）
からなる群から選択され、並びに
補体経路の構成要素が、ＭＡＣ、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃ１ｑ、及びＣ９からなる群から選択される、方法を提供する。
（ａ）細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜の上に表示されるＥＶ特異的マーカー又は組織特異的マーカーである第１のマーカーを含むＥＶ又はその膜結合部分を含む、対象由来の尿試料を、第１のマーカーに特異的な第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させ、それにより、第１のマーカーを含有するＥＶ又は膜を捕捉することと、
（ｂ）場合により、尿試料を第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、第１のマーカーとは異なる第２の捕捉マーカーを含むＥＶ又はその膜結合部分を捕捉することと、
（ｃ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分の上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを、この構成要素に特異的な抗体又はその抗原結合断片を用いて定性的に又は定量的に検出し、それにより尿試料における補体活性化を検出することと
を含む、方法であって、
ＥＶ特異的マーカーが、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１からなる群から選択され、
組織特異的マーカーが、
（１）糸球体における足細胞に特異的なポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、
（２）曲尿細管上皮に特異的なアクアポリン２（ＡＱＰ２）、
（３）膀胱上皮に特異的なウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）、及び
（４）赤血球（ＲＢＣ）に特異的なグリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）
からなる群から選択され、並びに
補体経路の構成要素が、ＭＡＣ、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃ１ｑ、及びＣ９からなる群から選択される、方法を提供する。
【0040】
いくつかの実施形態において、本開示は、補体調節について試験化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）補体性疾患に罹患している対象（例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ラマ、イヌ、サル、チンパンジーなどの動物、又はヒト）への試験化合物の投与の前及び後の、この対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含有する試料を得ることと、
（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体構成要素の存在又はレベルを測定し、試験化合物の投与前と比較した、試験化合物の投与後の対象の試料中の補体構成要素の存在又はレベルの調節（例えば、上昇又は低下、好ましくは低下）は、試験化合物が補体を調節することができることを示すことと
を含む、方法に関する。
（ａ）補体性疾患に罹患している対象（例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ラマ、イヌ、サル、チンパンジーなどの動物、又はヒト）への試験化合物の投与の前及び後の、この対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含有する試料を得ることと、
（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、
（ｄ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体構成要素の存在又はレベルを測定し、試験化合物の投与前と比較した、試験化合物の投与後の対象の試料中の補体構成要素の存在又はレベルの調節（例えば、上昇又は低下、好ましくは低下）は、試験化合物が補体を調節することができることを示すことと
を含む、方法に関する。
【0041】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、Ｃｌｑ、Ｃｌ、Ｃｌｓ、Ｃ２、ＭＡＳＰ－２、ＭＡＳＰ－３、Ｄ因子、Ｂ因子、プロペルジン（Ｐ因子）、Ｈ因子、Ｃ３／Ｃ５コンベルターゼ、Ｃ５、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ、Ｃ３ａ／Ｃ３ａＲ、Ｃ６、及び／又はＣＤ５９から選択される補体構成要素を特異的に調節することができる。いくつかの実施形態において、試験化合物は、モノクローナル抗体又は低分子又はｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉである。いくつかの実施形態において、試験化合物の調節活性は、表Ａにおいて提供される分子など、補体調節活性を有する分子（例えば、陽性対照又は標準物質）の活性と比較される。
【0042】
本発明はさらに、少なくとも１つの第１の標的を捕捉するための少なくとも１つの第１の捕捉抗体の使用、少なくとも１つの第２の標的を捕捉するための少なくとも１つの第２の捕捉抗体の使用、及び捕捉された少なくとも１つの第１の標的の量、捕捉された少なくとも１つの第２の標的の量、又はその両方を検出するための補体タンパク質に特異的な少なくとも１つの検出抗体の使用を準備する。
【0043】
また、本明細書で説明されるようなバイオマーカーへ結合する１つ以上の抗体を含有するキットも提供される。本明細書で説明されるキットのいくつかの実施形態において、このキットは、免疫検定法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法である。本明細書で説明されるキットのいずれかが、本明細書で説明される方法のいずれかを実行するために使用することができる。いくつかの実施形態において、このキットはさらに、本明細書で説明される方法のいずれかを実行するための説明書を含むことができる。かかるキットはまた、非限定例として、試料を調製する上で有用な試薬、細胞外小胞を濃縮するのに有用な試薬、固定された抗体への試料中の標的タンパク質又は構成要素の結合を検出するのに有用な試薬、精製された標的タンパク質／構成要素を含む対照試料、及び／又は使用のための説明書、のうちの１つ以上を含むこともできる。
【0044】
例えば、本明細書で説明される方法において有用なキットは、本明細書で説明されるようなバイオマーカーへ特異的に結合する１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の）抗体又はその断片を含むことができる。例えば、このキットにおいて提供される１つ以上の抗体は、表面上に（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又は遺伝子チップアレイの形態で）固定することができる。
【0045】
特許又は出願のファイルは、カラーで描かれた少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を伴う本特許又は本特許出願の複写は、申請及び必要な料金の支払いを行うと、特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1A】図１のパネル（Ａ）及びパネル（Ｂ）は、ＮＴＡによる尿ＥｘｏＱｕｉｃｋ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ中のＥＶマーカーの相対量を示す。抗体はすべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製であり、Ｍｓ－α－ＣＤ９＝ＰＥ、クローンＨＩ９ａ、Ｍｓ－α－ＣＤ６３＝ＰＥ、クローンＨ５Ｃ６、Ｍｓ－α－ＣＤ８１＝ＰＥ、クローン５Ａ６であって、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ ＧｍｂＨによるＺｅｔａＶｉｅｗ ＰＭＸ１１０において分析を実施。
【図1B】図１のパネル（Ａ）及びパネル（Ｂ）は、ＮＴＡによる尿ＥｘｏＱｕｉｃｋ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ中のＥＶマーカーの相対量を示す。抗体はすべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製であり、Ｍｓ－α－ＣＤ９＝ＰＥ、クローンＨＩ９ａ、Ｍｓ－α－ＣＤ６３＝ＰＥ、クローンＨ５Ｃ６、Ｍｓ－α－ＣＤ８１＝ＰＥ、クローン５Ａ６であって、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ ＧｍｂＨによるＺｅｔａＶｉｅｗ ＰＭＸ１１０において分析を実施。
【図5】図５は、Ｌｕｍｉｎｅｘによる尿ＥＶ部分セットの検出を示す。ＣＤ９：クローンＭＭ２／５７（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＤ６３：クローンＨ５Ｃ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８１：クローン１Ｄ６（Ａｂｃａｍ）、Ｍｓ ＩｇＧ：クローンＭＧ１－４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【図6】図６は、腎ＰＯＤＸＬが、ＣＤ９＋ＥＶにおいてのみ検出されることを示す。（１）：Ｒｂ－α－ＰＯＤＸＬ：ＵＳＢカタログ番号２１２６７２－ビオチン、（２）：Ｒｂ－α－ＰＯＤＸＬ：ＬＳＢｉｏカタログ番号ＬＳ－Ｃ１４１１６１。
【図7】図７は、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズが、糸球体特異的ＥＶを特定することができることを示す。Ｒｂ－α－ＰＯＤＸＬ（ＵＳＢ２１２６７２）は、ＣＤ９又はＣＤ４０Ｌを含有するＥＶ上で検出することができるが、ＣＤ６３又はＣＤ８１を含有するＥＶ上では検出することができない。シグナルが、２つの異なるα－ＰＯＤＸＬ抗体を用いて認められた。このことは、両方のタンパク質が同じ構造上にある場合にのみ生じ得る。
【図8】図８は、ネフロン特異的ＥＶレベルが、疾患に伴い上昇することを示す。対照の尿中よりもＩｇＡＮ尿中でＰＯＤＸＬ＋ＥＶが多い。上昇は、ＣＤ９＋／ＰＯＤＸＬ＋及びＣＤ４０＋／ＰＯＤＸＬ＋ＥＶの両集団においてみられる。ＣＤ６３＋及びＣＤ８１＋ＥＶはなお陰性である。
【図9】図９のパネル（Ａ）及びパネル（Ｂ）は、ＬｕｍｉｎｅｘビーズがＥＶ膜上で補体を測定することができることを示すグラフを示す。Ｃ３ｃ及びＣ５ｂ－９は、ＣＤ９＋及びＰＯＤＸＬ＋の両ビーズ上でＬＮ患者の尿中で検出されるが、ＣＤ６３＋又はＣＤ８１＋の上では検出されない。これらの結果は、１０のＬＮ、６のＩｇＡＮ、及び７の対照試料において確認された（データは示されていない）。ＬＮ及びＩｇＡＮの両試料は、対照試料と比較してＰＯＤＸＬ＋及びＡＱＰ２＋の両ＥＶの上でＣ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、及びＣ１ｑの沈着を有し得るが、これらに限定されない。
【図10-1】図１０のパネル（Ａ）、パネル（Ｂ）、及びパネル（Ｃ）は、ラブリズマブ処置に伴う糸球体Ｃ５ｂ－９沈着の低下を示すグラフを示す。ａＨＵＳ患者は、足細胞膜上に沈着するＣ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ１ｑ、及びＣ４（示されていない）のうちのいずれかの組み合わせを服用してよい。Ｃ３は、ラブリズマブ処置中、変化しない。ＥＶ上のＣ５ｂ－９及びＣ１ｑのレベルは、ラブリズマブ処置中、迅速に低減する。
【発明を実施するための形態】
【0047】
定義
「約」という語は、その値のプラス１０％又はマイナス１０％の範囲を意味し、例えば、「約５」は４．５～５．５を意味し、本開示の文脈が、別段に示さない限り、又はかかる解釈と矛盾しない限り、そうである。例えば、「約４９、約５０、約５５」など数値の列挙において、「約５０」は、その前の値とその後の値との間隔の半分に至らない範囲、例えば、４９．５よりも大きく５２．５よりも小さいことを意味する。
「約」という語は、その値のプラス１０％又はマイナス１０％の範囲を意味し、例えば、「約５」は４．５～５．５を意味し、本開示の文脈が、別段に示さない限り、又はかかる解釈と矛盾しない限り、そうである。例えば、「約４９、約５０、約５５」など数値の列挙において、「約５０」は、その前の値とその後の値との間隔の半分に至らない範囲、例えば、４９．５よりも大きく５２．５よりも小さいことを意味する。
【0048】
値の範囲が本開示において提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその記載された範囲内のいずれかの他の記載された値又は介在値が、本開示内に包含されることは意図される。例えば、１ｍＭ～８ｍＭの範囲が記載されている場合、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、及び７ｍＭもまた、明白に開示されることが意図されている。
【0049】
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれより多数であり得る。
【0050】
本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、試料中の１つ以上のパラメータの測定によって試料と関係する１つの値、又は複数の値からなる１つのセットを決定するプロセスを指しており、さらに、試験試料を基準試料と比較することを含んでもよい。本開示に従って、補体マーカーの検出には、１つ以上のマーカーを同定すること、アッセイすること、測定すること、及び／又は定量することを含む。
【0051】
「細胞外小胞」という語によって意味されるのは、対象から得られた試料（例えば、生物学的流体）中に存在する、脂質系のミクロ粒子若しくはナノ粒子、又は高タンパク質凝集体である。細胞外小胞はまた、当該技術分野及び本明細書でエキソソーム、ミクロ小胞、又はナノ小胞とも称される。本開示において、細胞外小胞は、直径約３０ｎｍ～約１０００ｎｍの間である。細胞外小胞は、様々な異なる哺乳動物細胞型から分泌され又は脱粒する。細胞外小胞の非限定例、及び哺乳動物対象から得られる試料（例えば、生物学的流体）から細胞外小胞を濃縮するための方法の非限定例が、本明細書で説明される。細胞外小胞の追加の例、及び哺乳動物対象から得られる試料から細胞外小胞を濃縮するための方法の追加の例は、当該技術分野で公知である。
【0052】
「膜結合」という用語は、生物学的膜、すなわち、半透性遮蔽を形成する細胞及び小器官の外側被覆を含有するいずれかの構造を意味する。この用語は典型的には、外側の細胞膜に由来する、又はゴルジ装置、小胞体、核、若しくはミトコンドリアなど小器官に由来する、リン脂質及びタンパク質を含有する構造を指す。
【0053】
本明細書で使用されるような「膜タンパク質」という用語は、ＥＶの生物学的膜の一部と相互作用する、又は当該一部である、タンパク質を指す。膜タンパク質には、内在性膜タンパク質及び表在性膜タンパク質があり得るがこれらに限定されない。
【0054】
本明細書で使用されるような「疾患特異的膜タンパク質」という用語は、特定の疾患、例えば、ａＨＵＳなど補体性疾患に関係する膜タンパク質を指す。この疾患特異的膜タンパク質は、個々に疾患をコードし得、或いは疾患特異的膜タンパク質の群が疾患をコードし得る。
【0055】
「試料」又は「生物学的試料」という用語が意味するのは、哺乳動物対象から得られるいずれかの生物学的流体（例えば、血液、血漿、血清又は他の血液画分、リンパ液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、母乳、涙、膣分泌物、羊水、洗浄液、精液、腺分泌物、滲出液、嚢胞又は糞便の内容物）である。好ましい実施形態において、この試料は、血液、血清、又は血漿を含む。
【0056】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原、例えば、補体タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体、又はその機能的な部分若しくは断片を意味する。この用語は、最も広範な意味で使用され、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖抗体断片を含む、インタクトな抗体及び機能的（抗原結合）抗体断片を含むポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。この用語は、ＩｇＧ及びその下位クラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、並びにＩｇＤを含む、いずれかのクラス又は下位クラスの天然抗体、遺伝子操作された抗体、並びに／又はその他の改変抗体を包含する。
【0057】
「抗原」という用語は、抗体又はその抗原結合断片へ特異的に結合することができるいずれかの分子、例えば、タンパク質又はその断片を指す。
【0058】
「抗原断片」という用語は、抗原特異的抗体によって認識されることができる抗原の一部を指す。
【0059】
「ビーズ」は、所望の捕捉抗体が固定された粒子を指す。このビーズは概して、単一の濾過マトリックス内で均一の大きさであるが、異なる濾過マトリックス間で約１ｎｍ～約１０，０００ｎｍの範囲の大きさで様々であってよい。好ましい形状は球形であるが、いずれかの他の形状の粒子を採用することができ、その理由は、このパラメータが本発明の性質に重要ではないからである。
【0060】
「ストリップ」は、所望の捕捉ビーズ又は所望の捕捉抗体が固定された細長い平らな要素を指す。ストリップは概して、大きさが均一の薄いフィルムであるが、固定される捕捉抗体の量及びタイプに応じて、大きさ及び色が様々であってよい。
【0061】
「マルチプレックス」という用語は、単一の試料にわたる複数のマーカーの検出、及び／又は複数の試料にわたる少なくとも１つのマーカーの検出を指す。
【0062】
本明細書で使用されるような「マルチプレックスビーズアレイプラットフォーム」という用語は、識別可能な粒子又はミクロ粒子を利用するいずれかのプラットフォームを指す。かかる識別可能な粒子は、例えば、マルチプレックス免疫検定法又は分子プローブ系アッセイを行うために利用され得る。代表例としては、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙがある。
【0063】
本明細書で使用されるような「分類色素」という用語は、機器が粒子を選別及び分類することができる分類色素の混合物を有する、マルチプレックスアッセイにおいて使用されるミクロ粒子又はビーズのいずれかの混合物又は組み合わせを指す。
【0064】
「レポーター分子」という用語には、アッセイにおいて検出分子へ結合するありとあらゆる蛍光タグを含むが、これらに限定されない。ヒト抗体を測定するよう設計された免疫検定法の場合、検出分子は、例えば、フィコエリトリンで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧであり得る。
【0065】
補体活性化と関係する生物学的活性の簡潔な要約は、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎにおいて提供されている。
【0066】
本明細書で使用されるような「対象」は、いずれかの哺乳動物であり得る。対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、又はチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、又はマウスであり得る。形質転換動物又は遺伝子改変（例えば、ノックアウト又はノックイン）動物が含まれる。
【0067】
本明細書で使用される場合、「予防の必要のある」、「処置の必要ある」、又は「その必要のある」対象は、適切な医療従事者（例えば、医師、看護師、又はヒトの場合、看護実務者、非ヒト哺乳動物の場合、獣医）の判断によって、補体性疾患又は補体性障害を処置するための所与の処置、すなわち、特定の治療薬から合理的に利益があるであろうものを指す。
【0068】
「補体構成要素」又は「補体タンパク質」とは、補体系の活性化に関与する、又は１つ以上の補体介在性活性において参画する分子である。従来の補体経路の構成要素には、例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ５ｂ－９複合体があり、これらは、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）及び上述のいずれかの活性断片又は酵素開裂産物とも称される（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ５ａなど）。代替的な経路の構成要素には、例えば、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、及びＩ因子、並びにプロペルジンがあり、Ｈ因子並びにＩ因子は、当該経路の負の調節因子である。レクチン経路の構成要素には、例えば、ＭＢＬ２、ＭＡＳＰ－１及びＭＡＳＰ－２がある。補体構成要素にはまた、可溶性補体構成要素のための細胞結合受容体もある。かかる受容体には、例えば、Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ１及びＣ５ａＲ２）、Ｃ３ａ受容体（Ｃ３ａＲ）、補体受容体１（ＣＲ１）、補体受容体２（ＣＲ２）、補体受容体３（ＣＲ３）などがある。「補体構成要素」という用語が、補体活性化のための「トリガ」として機能するこれらの分子及び分子構造、例えば、抗原－抗体複合体、又は微生物表面若しくは人工表面などの上に認められる外来構造を含むよう意図するものではないことは理解されるであろう。この用語には、いずれかの補体調節タンパク質（例えば、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｐ因子、Ｈ因子、Ｉ因子、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９）が含まれるが、これらに限定されない。
【0069】
本明細書で使用されるような「処置すること」は、処置を提供すること、すなわち、対象のいずれかの種類の医学的管理又は外科的管理を提供することを指す。この処置は、障害若しくは容態の進行を逆転させる、緩和する、阻害する、障害若しくは容態の確度を防止する若しくは低減させる、又は障害若しくは容態の１つ以上の症状若しくは症状発現の進行を逆転させる、緩和する、阻害する、若しくは防止する、障害若しくは容態の１つ以上の症状若しくは症状発現の確度を防止する若しくは低減させるために提供することができる。「防止する」は、少なくともいくつかの個体においてかかる障害若しくは容態、又は症状若しくは症状発現を少なくともある期間生じさせないことを指す。処置することは、補体性容態を示す１つ以上の症状又は症状発現の発症後に、治療薬／補体モジュレーターを対象へ投与して、例えば、容態の重症度を逆転させる、緩和する、低減させることができ、及び／又は容態の進行を阻害する若しくは防止することができ、及び／又は容態の重症度を逆転させる、緩和する、低減させることができ、及び／又は容態の１つ以上の症状若しくは症状発現を阻害することができる。本明細書で説明される方法によると、組成物／補体モジュレーターは、補体性疾患若しくは補体性容態を発症した、又は一般的な集団のメンバーと比較して、かかる障害を発症するリスクが高い、対象へ投与することができる。かかる組成物／モジュレーターは、予防として、すなわち、容態のいずれかの症状又は症状発現の発症の前に投与することができる。典型的には、この場合、対象は、補体活性化組成物、例えば、治療薬を封入した粒子又はナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子など、によって送達される遺伝子療法又は治療薬において使用されるウイルス粒子へ曝露されると、容態を発症させるリスクがあるであろう。
【0070】
治療薬又は補体モジュレーターなど活性のある作用薬の「有効量」は、所望の生物学的応答を惹起するのに（又は、等価に、望ましくない生物学的応答を阻害するのに）十分な、活性のある作用薬の量を指す。有効である特定の作用薬の絶対量は、所望の生物学的評価項目、送達される作用薬、標的組織などの因子に応じて変わり得る。「有効量」は、単回用量で投与され得、又は複数回用量の投与によって達成され得る。治療薬の有効量は、例えば、障害の少なくとも１つの症状を軽減するのに十分な量であり得る。有効量は、慢性的且つ進行性の障害の進行を遅滞させて、例えば、障害の１つ以上の症状若しくは徴候それ自体を顕在化させる前の時間を延長させるのに、又は障害に罹患している個体がある特定のレベルの悪化に到達するまでの時間を延長させるのに十分な量であり得る。有効量は、この作用薬の非存在下で生じるであろう損傷からより迅速に又はより大きく回復させることができるのに十分な量であり得る。
【0071】
本明細書で使用される場合、「診断」という用語は、補体性疾患を含むがこれに限定されない所与の疾患又は容態に対象が罹患している可能性があるかどうかの判断を下すことができる方法を指す。当業者は、１つ以上の診断指標、例えば、マーカーを基に診断を行うことが多く、その存在、非存在、量、又は量の変化は、疾患又は容態の存在、重症度、又は非存在を示す。他の診断指標には、患者の病歴、身体的な症状、例えば、生命事象又は表現型、遺伝子型、又は環境因子若しくは遺伝的因子の不明な変化を含むことができる。当業者は、「診断」という用語が、ある特定の経過又は結果が生じるであろう確率が高いこと、すなわち、経過又は結果が所与の特徴、例えば、診断指標の存在又はレベルを呈する患者において生じる可能性が、その特徴を呈さない個体と比較すると大きい確率が高いことを指す。本開示の診断方法は、独立して、又は他の診断方法と組み合わせて使用して、経過又は結果が、所与の特徴を呈する患者において生じる可能性がより高いかどうかを判定することができる。
【0072】
「確度」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、確率、相対的な確率、存在若しくは非存在、又は程度を指す。
【0073】
本明細書で使用される場合、「マーカー」という用語は、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療介入に対する薬理学的応答、例えば、補体阻害剤を用いた処置、の指標として客観的に測定することができる特徴を指す。マーカーの代表的なタイプには、例えば、マーカーのレベル、濃度、活性、又は特性の変化を含む、マーカーの構造（例えば、配列又は長さ）又は数の分子レベルの変化を含む。
【0074】
「対照」という用語は、本明細書で使用される場合、健常細胞から単離された対照ＥＶ及びこれに類するものなど、試験試料についての参照を指す。「参照試料」は、本明細書で使用される場合、比較のために使用される、疾患を有していても有していなくてもよい組織又は細胞の試料を指す。したがって、「参照」試料はこれにより、別の試料、例えば、ＥＶを含有する尿試料を比較することができる基点を提供する。対照的に、「試験試料」は、参照試料と比較される試料を指す。参照試料は、参照試料及び試験試料が同じ患者から時間によって分離されて得られたときなど、疾患非含有である必要はない。
【0075】
「レベル」という用語は、特定の分子種の存在を示す、二進法の（例えば、非存在／存在）、定性的な（例えば、非存在／低／中／高）、又は定量的な情報（例えば、数、頻度、又は濃度に比例した値）を指すことができる。
【0076】
「実質的に」という用語は、意図した目的に対して作用するのに十分であることを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、当該技術分野の当業者が期待するであろうような、しかし、全体的な成績に明らかに影響を及ぼすことがない（例えば、±１０％）、絶対的な又は完全な状態、寸法、測定、結果、又はこれらに類するものからのわずかな、有意ではない変化を許容する。
【0077】
「補体性」障害又は「補体性」疾患という用語は、対象の自己保護機序（例えば、ＣＤ５５（崩壊加速性因子）、ＣＤ５９（プロテクチン）、Ｈ因子、及びこれらに類するものを含む、自己保護タンパク質）を超越する、且つ対象の細胞及び／又は組織に対して損傷を生じる補体活性化を包含する障害を指す。
【0078】
本明細書で使用される場合、疾患又は障害についての「リスクがある」という用語は、特定の疾患に易罹患性である対象（例えば、ヒト）を指す。この易罹患性は、遺伝的であり得る（又は他の因子（例えば、環境条件、高血圧、活性レベル、メタボリックシンドロームなど）により得る）。したがって、本開示が、いずれかの特定のリスクに限定されるべきであることが意図されておらず、本発明が補体に関するいずれかの特定の種類の障害又は機能不全（例えば、ａＨＵＳ）に限定されるべきであることも意図されていない。
【0079】
様々な補体性疾患に罹患している患者において処置応答を診断及び／又は監視するための非侵襲性、高感度且つ特異的な試験としての非侵襲性液体生検プロトコル由来の細胞外小胞を用いるための方法が本明細書で提供される。免疫沈降／免疫分析を用いてＥＶ表面マーカーを単離及び分析する治療介入の前、その間、及びその後のＥＶ上での表面補体の発現を監視するための半定量法が説明されている。これらの方法は、インビボ活性のためのサロゲートとしての補体の沈着のエクスビボ監視のためにＥＶをうまく活用することができる。したがって、これらの方法を用いて、研究者及び医師は、ツールを用いて、腎臓の複数の領域など別個の特定可能な組織の補体攻撃を、処置の経過の間、直接的に監視する。
【0080】
生検は、補体性疾患の部分セットの差次的診断のための現行標準である。しかしながら、重症の合併症についてのリスクは、患者の選別及び試験の頻度を制限する。細胞外小胞は、処置前及び処置中、特定の組織において進行中の補体沈着を監視するための容易に接近可能な機会を提供する。細胞外小胞はまた、組織の補体攻撃の正確な細胞レベルの特定も提供することができる。独特なＰＭマーカーを備えた目的のいずれかの細胞型又は組織は、補体沈着を調べるために使用され得る。
【0081】
免疫沈降／免疫分析
本開示の免疫沈降／免疫分析は、補体攻撃の下にある特定の組織を正確に示すことができ、且つ処置応答を監視することができる、免疫蛍光検出を用いたビーズ系免疫捕捉プロトコルを使用する。この技術は、正しいセットの抗体ツールを与えられたいずれかの液体マトリックスにおいて補体攻撃の下にあるいずれかの臓器又組織を監視するよう広範に適用することができる。本明細書で論議される方法の一態様は、ＥＶ濃縮と、脱粒したＥＶの表面上に存在する組織特異的バイオマーカーの免疫捕捉との組み合わせである。捕捉バイオマーカーは、正準ＥＶ特異的タンパク質（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１など）又は組織特異的タンパク質のいずれかであり得る。検出抗体は、Ｃ５ｂ－９、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１ｑ、及びＣ９など、補体構成要素に特異的である。尿中の組織特異的標的の例としては、糸球体における足細胞に特異的なポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、曲尿細管上皮に特異的なアクアポリン２（ＡＱＰ２）、又は膀胱上皮に特異的なウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）がある。更なる態様は、捕捉標的及び検出標的が同じ構造上に存在するときに正のシグナルが生じるのみであり得ることである。
本開示の免疫沈降／免疫分析は、補体攻撃の下にある特定の組織を正確に示すことができ、且つ処置応答を監視することができる、免疫蛍光検出を用いたビーズ系免疫捕捉プロトコルを使用する。この技術は、正しいセットの抗体ツールを与えられたいずれかの液体マトリックスにおいて補体攻撃の下にあるいずれかの臓器又組織を監視するよう広範に適用することができる。本明細書で論議される方法の一態様は、ＥＶ濃縮と、脱粒したＥＶの表面上に存在する組織特異的バイオマーカーの免疫捕捉との組み合わせである。捕捉バイオマーカーは、正準ＥＶ特異的タンパク質（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１など）又は組織特異的タンパク質のいずれかであり得る。検出抗体は、Ｃ５ｂ－９、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１ｑ、及びＣ９など、補体構成要素に特異的である。尿中の組織特異的標的の例としては、糸球体における足細胞に特異的なポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、曲尿細管上皮に特異的なアクアポリン２（ＡＱＰ２）、又は膀胱上皮に特異的なウロプラキン１ｂ（ＵＰＫ１ｂ）がある。更なる態様は、捕捉標的及び検出標的が同じ構造上に存在するときに正のシグナルが生じるのみであり得ることである。
【0082】
例えば、腎生検は、慢性腎疾患の差次的診断のための現行標準である。しかしながら、腎生検は、侵襲的手順である。しかしながら、尿中細胞外小胞（ｕＥＶ）は、ネフロンのすべての部分を含む腎臓系に沿ったあらゆる細胞型を起源とする、小胞とバイオマーカーとからなる複合体の源である。例えば、ＰＯＤＸＬは、糸球体における足細胞上でのみ作られ、ＡＱＰ２は、近位曲尿細管及び遠位曲尿細管に由来し、ＲＢＣ由来のグリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）は、血漿から濾液へのＥＶ漏出を測定するために使用することができる。炎症又は悪性腫瘍など、ある特定の病状は、細胞によって脱粒されるｕＥＶの数を増加させる。正準ＥＶマーカーとともに、ｕＥＶは、腎臓系の「健康状態」への新規の洞察を提供し得る、親細胞に由来する原形質膜結合タンパク質を運搬する。
【0083】
実施例の節及び他の個所において、本開示の様々な実施形態を行う上で有用である抗体の代表的なタイプが、例えば、特定の販売業者及び／又はカタログ番号に関する情報とともに提供される。本開示が、特定の販売業者／製造元からの抗体検出試薬を利用する例示的な実施形態に限定されないことは、理解されるべきである。本開示のバイオマーカー／分析物に対する抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（ＵＳＢ）（Ｓａｌｅｍ，ＭＡ）、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＳＢＩＯ）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むいずれかの製造元から得ることができる。例えば、ウサギ抗ＰＯＤＸＬ抗体は、ＵＳＢ（カタログ番号２１２６７２）、ＬＳＢＩＯ（カタログ番号ＬＳ－Ｃ１４１１６１）、Ａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ２０５３５０）及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号ＨＰＡ００２１１０）から購入することができ、抗ＣＤ９抗体のクローンＭＭ２／５７は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（カタログ番号９３１０）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号ＣＢＬ１６２）、ＶＷＲ（カタログ番号８９３６６）、及びＢＩＯ ＲＡＤ（カタログ番号ＭＣＡ４６９Ｇ）から購入することができる。抗体はまた、従来技術、例えば、マウス若しくはウサギなどの哺乳動物の免疫化及び／又はハイブリドーマ技術を用いても生成され得る。
【0084】
ＥＶの特徴づけ
細胞外小胞（ＥＶ）は、尿中細胞外小胞（ｕＥＶ）など、同時の免疫沈降／免疫分析、すなわち、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプラットフォームによって特徴づけられることができ、表面の表現型及びＥＶの部分セットの組織起源を判定するために問い合わせシグナルを与えることができる。
細胞外小胞（ＥＶ）は、尿中細胞外小胞（ｕＥＶ）など、同時の免疫沈降／免疫分析、すなわち、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプラットフォームによって特徴づけられることができ、表面の表現型及びＥＶの部分セットの組織起源を判定するために問い合わせシグナルを与えることができる。
【0085】
Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）は、装置及び、免疫沈降を多重免疫検定法と組み合わせるｘＭＡＰ（商標）技術を作っている。ｘＭＡＰ（商標）は、捕捉抗体で被覆することができる一連の専売の色分けされたミクロスフェアである。開放アーキテクチャのｘＭＡＰ（商標）技術は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、ＰＣＲ、及び従来のアレイなど、従来の方法を上回る生物学的試験（アッセイ）の多重化、時間、労力、及び経費の削減ができる。ｘＭＡＰ（商標）技術を用いたシステムは、ミクロスフェアとして公知の色分けされたビーズの表面上で別個のアッセイを行い、次に、コンパクトな解析装置において読み取る。複数のレーザ又はＬＥＤ及び高速デジタル信号プロセッサを用いて、解析装置は、各個々のミクロスフェア上で生じる反応を報告することによって、多重アッセイ結果を読み取る。
【0086】
Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを用いることで、免疫検定法の前に免疫沈降によるＥＶ濃縮が可能となる。このことは、最初の試料加工／ＥＶ濃縮についての必要性を取り除き、したがって、潜在的な誤結果を制限する。
【0087】
多重化フォーマットを用いることで、１つの試料上のいくつかの個別の組織の監視が可能となる。多重ウェルプレートフォーマットにおいて作業することで、複数の潜在的な補体タンパク質と、１つのアッセイにおける複数の潜在的な補体タンパク質及び補体経路の監視が可能となる。
【0088】
概して、捕捉ビーズは、標的特異的抗体へ結合している。結合したビーズは、マトリックスからの（例えば、尿など液体試料からの）標的タンパク質を免疫沈降させるために使用される。フィコエリトリン（ＰＥ）又はビオチン＋ストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）などの標識へ結合した検出抗体は、分析中にビーズ捕捉標的を検出及び定量するために使用される。
【0089】
ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１など、正準小胞マーカーに対する抗体を用いて被覆されたｘＭＡＰビーズのアレイは、尿など、生物学的試料由来の別個のＥＶ部分セットを濃縮するために使用される。各ビーズセットは次に、部分セットの表現型を規定し、組織起源に結びつける他のバイオマーカーの存在について解析し、次に、補体経路タンパク質の存在についてさらに解析する。このように、非侵襲的「液体生検」法は、差次的診断、予後評価、及び／又は処置に対する応答の縦断的な監視について、特定の組織（腎臓など）の疾患のカギとなるバイオマーカーを試料採取及び監視するために構築される。
【0090】
標的タンパク質の結合
溶液中の又はアレイ上に固定された抗体に対する標的タンパク質の結合は、当該技術分野で公知の検出技術を用いて検出することができる。かかる技術の例としては、競合的結合アッセイ及びサンドイッチアッセイなどの免疫学的技術、共焦点スキャナ、共焦点顕微鏡、又はＣＣＤ系システムなどの機器を用いた蛍光検出、蛍光、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、全内反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光補正分光法（ＦＣＳ）などの技術、比色／分光法技術、表面に吸着された材料の質量の変化を測定することができる表面プラズモン共鳴法、従来の放射性同位体結合及びシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を含む、放射性同位体を用いる技術、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、ＨＰＬＣ－ＭＳ、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）及びＭＡＬＤＩ飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析などの質量分析、タンパク質フィルムの厚さを測定するための光学的な方法である偏光解析法、表面に吸着する材料の質量を測定するための非常に高感度な方法である水晶微量天秤（ＱＣＭ）、原子力顕微鏡（ＡＦＭ）及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）などの走査型プローブ顕微鏡、並びに電気化学的検出、インピーダンス検出、音響検出、マイクロ波検出、及び赤外線（ＩＲ）／ラマン検出などの技術がある。
溶液中の又はアレイ上に固定された抗体に対する標的タンパク質の結合は、当該技術分野で公知の検出技術を用いて検出することができる。かかる技術の例としては、競合的結合アッセイ及びサンドイッチアッセイなどの免疫学的技術、共焦点スキャナ、共焦点顕微鏡、又はＣＣＤ系システムなどの機器を用いた蛍光検出、蛍光、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、全内反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光補正分光法（ＦＣＳ）などの技術、比色／分光法技術、表面に吸着された材料の質量の変化を測定することができる表面プラズモン共鳴法、従来の放射性同位体結合及びシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を含む、放射性同位体を用いる技術、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、ＨＰＬＣ－ＭＳ、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）及びＭＡＬＤＩ飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析などの質量分析、タンパク質フィルムの厚さを測定するための光学的な方法である偏光解析法、表面に吸着する材料の質量を測定するための非常に高感度な方法である水晶微量天秤（ＱＣＭ）、原子力顕微鏡（ＡＦＭ）及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）などの走査型プローブ顕微鏡、並びに電気化学的検出、インピーダンス検出、音響検出、マイクロ波検出、及び赤外線（ＩＲ）／ラマン検出などの技術がある。
【0091】
補体の阻害／調節の測定
いずれかの適切な方法は、補体活性化（又はいずれかの他の関連特性）を阻害する作用因子又は作用因子を含有する組成物の能力を評価するために使用することができる。いくつかのインビトロアッセイを使用することができる。従来の又は代替的な補体経路を阻害する作用因子の能力は、例えば、作用因子の有無の下で赤血球（例えば、抗体感受性又は非感受性ウサギ又はヒツジ赤血球）の補体介在性溶血をヒト血清又は１セットの補体構成要素によって測定することによって評価することができる。Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｂ因子又はＤ因子など１つ以上の補体構成要素へ結合する作用因子の能力は、例えば、等温滴定熱量測定法又は液相中で行うのに適した他の方法を用いて評価することができる。補体構成要素へ結合する作用因子の能力は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。他の使用方法としては、表面プラズモン共鳴、平衡透析などがある。
いずれかの適切な方法は、補体活性化（又はいずれかの他の関連特性）を阻害する作用因子又は作用因子を含有する組成物の能力を評価するために使用することができる。いくつかのインビトロアッセイを使用することができる。従来の又は代替的な補体経路を阻害する作用因子の能力は、例えば、作用因子の有無の下で赤血球（例えば、抗体感受性又は非感受性ウサギ又はヒツジ赤血球）の補体介在性溶血をヒト血清又は１セットの補体構成要素によって測定することによって評価することができる。Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｂ因子又はＤ因子など１つ以上の補体構成要素へ結合する作用因子の能力は、例えば、等温滴定熱量測定法又は液相中で行うのに適した他の方法を用いて評価することができる。補体構成要素へ結合する作用因子の能力は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。他の使用方法としては、表面プラズモン共鳴、平衡透析などがある。
【0092】
インビトロ又はインビボで起こる全身性又は局所性補体活性化を測定するための方法、及びかかる活性を阻害する補体阻害因子の能力を決定するため方法は、当該技術分野で公知である。Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ５ｂ－９など補体活性化産物の測定は例えば、補体活性化の程度の示度を提供する。かかる産物の量の低下は、補体活性化の阻害を示す。いくつかの実施形態において、活性のある開裂産物とその不活性デスアルギニン（ｄｅｓＡｒｇ）形態との比が測定される（例えば、Ｃ３ａ／Ｃ３ａｄｅｓＡｒｇ）。当業者は、ジモサン、リポ多糖、免疫複合体など測定される補体活性化産物及び／又は補体の適切な活性化因子の適切な選択によって、従来の経路と、代替経路と、レクチン経路とを識別することができる。他の方法は、終末複合体形成の結果としての赤血球の補体性溶血を測定することを包含する。
【0093】
インビボでの補体活性化及び／又は補体阻害因子によるその阻害は、適切な生物学的試料において測定することができる。全身性補体活性化及び／又は補体阻害因子によるその阻害は、例えば、血液試料中で測定することができる。補体阻害因子の投与前に開始する連続測定は、補体阻害因子が補体活性化を阻害する程度の示度、並びに阻害の時間経過及び持続時間を提供する。活性化産物の低下は、補体阻害因子の投与の前に存在する活性化産物が分解又は除去されると、明らかとなるに過ぎない可能性があることは認識されるであろう。
【0094】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される補体調節因子は、対象における補体性障害を処置又は治療するのに有用な、追加の活性のある作用因子とともに製剤することができる。対象における補体性障害を処置するための追加の作用因子としては、抗高血圧薬（例えば、アンギオテンシン変換酵素阻害剤）、抗凝固薬、コルチコステロイド（例えば、プレドニソン）、又は免疫抑制薬（例えば、ビンクリスチン又はシクロスポリンＡ）、抗凝固薬（例えば、ワルファリン（クマジン）、ヘパリン、フェニンジオン、フォンダパリヌックス、イドラパリヌックス）、トロンビン阻害薬（例えば、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、又はダビガトラン）、線維素溶解薬（例えば、アンクロッド、ε－アミノカプロン酸、抗プラスミン薬ａ１、プロスタサイクリン、及びデフィブロチド）、脂質低下薬、又はリツキシマブなどの抗ＣＤ２０薬があるが、これらに限定されない。
【0095】
比較法
本明細書で説明されるいくつかの実施形態において、方法は、補体バイオマーカーの検出されたレベルを参照レベルと比較することを含む。いくつかの実施形態において、参照は、健常対照、すなわち、補体性疾患と診断されなかった対象におけるバイオマーカーのレベルを表す。いくつかの実施形態において、参照レベルは、参照コホートにおける中央値又はカットオフ値レベル、例えば、統計的に有意に異なる群を規定するカットオフ値、例えば、参照コホートの上位又は下位の三分位数、四分位数、五分位数、又は他の百分位数である。
本明細書で説明されるいくつかの実施形態において、方法は、補体バイオマーカーの検出されたレベルを参照レベルと比較することを含む。いくつかの実施形態において、参照は、健常対照、すなわち、補体性疾患と診断されなかった対象におけるバイオマーカーのレベルを表す。いくつかの実施形態において、参照レベルは、参照コホートにおける中央値又はカットオフ値レベル、例えば、統計的に有意に異なる群を規定するカットオフ値、例えば、参照コホートの上位又は下位の三分位数、四分位数、五分位数、又は他の百分位数である。
【0096】
検出されるタンパク質バイオマーカーの同一性に応じて、参照レベルを上回る又は下回るレベルは、疾患の存在又は高いリスクを示し得、すなわち、高いレベル（すなわち、参照を上回るレベル）又は低いレベル（すなわち、参照を下回るレベル）は、疾患の存在又は低下を示す。
【0097】
いくつかの実施形態において、参照レベルを上回る高いレベルは、統計的に有意であり、又は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、若しくは１０００％高い。上昇は、本明細書で説明されるように、閾値又はベースライン値（例えば、タンパク質の有無を決定するためのアッセイの閾値検出レベル、又は参照対象（例えば、健常参照）における参照タンパク質の参照レベルとの比較によって決定することができる。いくつかの実施形態において、参照レベルを下回る低いレベルは、統計的に有意であり、又は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％低い。低下は、本明細書で説明されるように、閾値又はベースライン値（例えば、タンパク質の有無を決定するためのアッセイの閾値検出レベル、又は参照対象（例えば、健常参照対象又は補体性疾患に罹患していない対象）におけるタンパク質の参照レベルとの比較によって決定することができる。
【0098】
いくつかの実施形態において、方法は、対象試料におけるタンパク質バイオマーカーのレベルと参照レベルとの比を計算することと、この比が閾値比よりも大きな場合、対象は本明細書で説明されるような補体性疾患に罹患している又はこの補体性疾患を発症するリスクがあると判定することと、を含む。いくつかの実施形態において、比が正か負かを判定され、正又は負の比の存在は、対象が本明細書で説明されるような補体性疾患に罹患していること又はこの補体性疾患を発症するリスクがあることを示す。なお、正の比又は負の比が疾患の存在、又は高いリスク若しくは低いリスクを示しているのかは、本明細書の本開示により容易に判定することができる。
【0099】
補体系は、病原体の除去において免疫系を支援するよう機能する生化学的カスケードへと組織化されたいくつかの小さなタンパク質から構成される。補体タンパク質は、不活性前駆体として血中を循環している。いくつかのトリガの１つによって刺激されると、この系におけるプロテアーゼは、特異的なたんぱく質を開裂させて、サイトカインを放出し、更なる開裂のカスケードの増幅を開始する。
【0100】
補体活性化の測定
インビトロ又はインビボで生じる全身性又は局所性の補体活性化を測定するための方法は、当該技術分野で公知である。Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ５ｂ－９などの補体活性化産物の測定は、例えば、補体活性化の程度の示度を提供する。かかる産物の量の低下は、補体活性化の阻害を示す。いくつかの実施形態において、活性のある開裂産物とその不活性ｄｅｓＡｒｇ形態との比が測定される（例えば、Ｃ３ａ／Ｃ３ａ ｄｅｓＡｒｇ）。当業者は、ジモサン、リポ多糖、免疫複合体など測定される補体活性化産物及び／又は補体の適切な活性化因子の適切な選択によって、従来の経路と、代替経路と、レクチン経路とを識別することができる。他の方法は、終末複合体（ＭＡＣ）形成の結果としての赤血球の補体性溶血を測定することを包含する。
インビトロ又はインビボで生じる全身性又は局所性の補体活性化を測定するための方法は、当該技術分野で公知である。Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ５ｂ－９などの補体活性化産物の測定は、例えば、補体活性化の程度の示度を提供する。かかる産物の量の低下は、補体活性化の阻害を示す。いくつかの実施形態において、活性のある開裂産物とその不活性ｄｅｓＡｒｇ形態との比が測定される（例えば、Ｃ３ａ／Ｃ３ａ ｄｅｓＡｒｇ）。当業者は、ジモサン、リポ多糖、免疫複合体など測定される補体活性化産物及び／又は補体の適切な活性化因子の適切な選択によって、従来の経路と、代替経路と、レクチン経路とを識別することができる。他の方法は、終末複合体（ＭＡＣ）形成の結果としての赤血球の補体性溶血を測定することを包含する。
【0101】
補体性応答の１つ以上の特徴を模擬する病理学的特徴を有するいくつかの異なる動物モデルは、当該技術分野で公知である。補体性疾患の処置のための補体モジュレーターの適用は、障害を呈する、又は適切なプロトコルへ供することによって障害が実験的に誘発された、マウス、ラット、イヌ、霊長類などへ様々な用量で投与することができる。この障害の１つ以上の徴候又は症状を予防又は処置するモジュレーターの能力は、標準的な方法及び基準を用いて評価される。
【0102】
許容され得る安全性や、ヒト対象における関連する小胞外の場所において補体性疾患を有効に処置すると期待される用量を投与する実行可能性など、動物試験において有望な結果を示す化合物又は補体モジュレーターは、例えば、試験下の特定の障害のための療法についての臨床試験のための標準プロトコル及び評価項目を用いて、ヒトにおいて検査され得る。
【0103】
上述の組成物は、とりわけ、対象における様々な補体関連障害を処置又は予防するための方法において有用である。この組成物は、対象、例えば、ヒト対象へ、投与経路に部分的に依存する様々な方法を用いて投与することができる。この経路は、例えば、静脈内注射若しくは静脈内注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）注射、又は筋肉内注射（ＩＭ）であり得る。
【0104】
投与は、例えば、局所的な注入、注射によって、又はインプラントによって達成することができる。インプラントは、シラスティック膜などの膜、又は繊維を含む、多孔性の、非多孔性の、又はゼラチン状の材料からできていることができる。インプラントは、対象への組成物の徐放又は周期性放出のために構成されることができる（米国特許出願公開第２００８０２４１２２３号明細書、米国特許第５，５０１，８５６号明細書、同第４，８６３，４５７号明細書、及び同第３，７１０，７９５号明細書、欧州特許第４８８４０１号明細書、並びに欧州特許第４３０５３９号明細書；各開示の全体が参照により本明細書に援用される）。組成物は、例えば、分散性、腐食性、又は対流系に基づいて、例えば、浸透圧ポンプ、生分解性インプラント、電気分散系、電気浸透圧系、蒸気圧ポンプ、電解性ポンプ、発泡性ポンプ、圧電性ポンプ、腐食性の系、又は電気機械系に基づいた植込み型装置によって、対象へ送達することができる。
【0105】
いくつかの実施形態において、治療薬は、対象へ局所投与によって送達される。本明細書で使用される場合、「局所投与」又は「局所送達」は、組成物又は作用因子をその意図した標的組織又は標的部位へ循環器系を介して輸送することに頼らない送達を指す。この組成物は、例えば、組成物若しくは作用因子の注入若しくは埋め込みによって、又は組成物若しくは作用因子を含有する装置の注入若しくは埋め込みによって送達することができる。標的組織又は標的部位の近傍における局所投与に続いて、この組成物若しくは作用因子、又はその１つ以上の構成要素は、意図される標的組織又は標的部位へ拡散し得る。
【0106】
実施例の節において詳細に概略されるように、本開示のアッセイ方法は、ＥＶにおける補体構成要素の発現又はレベルの変化の測定を含む。ＥＶは、尿、血液、リンパ液、脳脊髄液、腹水、膿、胸水、ヘモグロビン、乳、羊水、滑液、粘液、唾液、痰、眼房水、硝子体、又はこれらに類するものなど、いずれかの生物学的試料を源とすることができる。
【0107】
いくつかの実施形態において、差次的超遠心、密度勾配超遠心、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、及び親和性／免疫親和性捕捉法などのアプローチが、生物学的試料からＥＶを濃縮するために使用され得るが、このステップは場合による。好ましくは、ＥＶ濃縮ステップは、第１のマーカー及び場合により第２のマーカーが個々の抗体又は抗原結合断片と接触する前に行われる。
【0108】
次に、ＥＶは、集団レベル又は単一粒子レベルで特徴づけられる。ここで、タンパク質、脂質、又は核酸など、ＥＶの中の分子の組成及びレベルが分析される。技術は、光散乱顕微鏡法又は分光法から、プロテオミクスを用いた分子フィンガープリント法にまで及ぶ。独特な分子の全体的なレベルはまた集団内で測定することができる。単一粒子分析については、光学顕微鏡法及びフローサイトメトリー（ＥＶ＞２００ｎｍの場合）、単一粒子干渉反射画像法（＞４０ｎｍ）、ナノフローサイトメトリー（約４０ｎｍ）、並びに電子顕微鏡法など特化した方法が使用される。特に、電子顕微鏡法及びフローサイトメトリーは、生物学的マトリックスからの分離の前に特段の注力をすることなく個々のＥＶの試験を可能にする。
【0109】
いくつかの実施形態において、ＥＶは、溶解緩衝液、例えば、ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ １ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＮＰ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ｂ－グリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン）により溶解し得る。
【0110】
ＥＶの特徴づけは、ＥＶ上のマーカー（例えば、典型的にはタンパク質又はペプチドだが、他の抗原を含み得る）へ特異的に結合する捕捉抗体の使用を含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＶマーカーに特異的である単一の捕捉抗体が使用される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの捕捉抗体が使用され、この中で、第１の捕捉抗体はＥＶ特異的マーカーに対して特異的であり、第２の捕捉抗体はＥＶ上に表示される組織特異的マーカーに対して特異的である。
【0111】
ＥＶ特異的マーカーとしては、ＡＬＩＸ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ８ＷＵＭ４）、ＴＳＧ１０１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ９９８１６）、ＣＤ９（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２１９２６）、ＣＤ６３（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０８９６２）、ＣＤ８１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ６００３３）、ＣＤ４０Ｌ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２９９６５）、ＣＤ２６（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２７４８７）、ＣＤ３１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１６２８４）、ＣＤ４５（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０８５７５）、ＣＤ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０６７２９、Ｑ５３Ｆ９６）、ＣＤ１１ａ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２０７０１）、ＣＤ２４（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２５０６３）、ＣＤ５５（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０８１７４）、ＣＤ５９（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１３９８７、Ｑ６ＦＨＭ９）、ＣＦ１０６（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ９Ｈ６Ｋ１）、ＣＤ５６（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１３５９１）、ＣＤ５１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０６７５６）、ＣＤ８２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２７７０１）、インテグリン、テトラスパニン、アネキシン、ＨＳＰ９０（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０７９００（α１）、Ｑ１４５６８（α２）、Ｐ１４６２５（β））、ＨＳＰ７０（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１１０２１）、シンテニン１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ００５６０）、ＡＤＡＭ１０（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ１４６７２）、ＥＨＤ４（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ９Ｈ２２３）、アクチン、Ｒａｂ５（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２０３３９（α）、Ｐ６１０２０（β）、Ｐ５１１４８（γ））、クラスリン（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０９４９６（α）、Ｐ０９４９７（β）、Ｑ００６１０（Ｈ））、フロチリン１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ７５９５５）、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、アクチニン４（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ４３７０７）、ＧＰ９６（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１４６２５）、ＥＨＤ４（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ９Ｈ２２３）、ミトフィリン（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ１６８９１）、及びＬＡＭＰ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１３４７３）、又はこれらの断片があるが、制限されない。
【0112】
組織特異性に関して、腎臓の糸球体足細胞、曲尿細管、又は膀胱上皮に特異的なＥＶは、腎臓病学的疾患の研究において有用であり、赤血球（ＲＢＣ）由来のＥＶは、血液学的疾患の研究において有用である。いくつかの実施形態において、組織特異的ＥＶとしては、以下のものがあるが、これらに限定されない。
ＰＯＤＸＬ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ００５９２）は、ファロピー管、子宮、及び精子小胞における糸球体足細胞、上皮細胞、腺細胞に多く発現している。
ＡＱＰ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ４１１８１）は、腎臓の集合管主細胞の頂端細胞膜において、及び細胞内小胞において認められる。
ＵＰＫ１ｂ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ７５８４１）は、膀胱の非対称性二重膜において認められる。
ＮＰＨＳ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ９ＮＰ８５）は、胎児及び成体の腎糸球体の足細胞において発現している。
ＧＹＰＡ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０２７２４）は、モノクローナル抗体ＴＥＲ１１９によって特異的に認識される、赤血球の主要内在性膜タンパク質である。
ムチン１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１５９４１、Ｑ７Ｚ５５１）は、前者が特に気道、乳房、及び子宮の上皮細胞の頂端表面上に発現しており、後者がＴ細胞において発現しており、乳癌又は卵巣癌など上皮腫瘍において、及び非上皮腫瘍細胞においても過剰発現している。
ＮＫＣＣ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ１３６２１）は、腎臓特異的腎Ｎａ、Ｋ及びＣｌ共輸送体である。
ＡＱＰ１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２９９７２）は、赤血球及び腎臓近位尿細管の原形質膜において発現している。
ＧＳＴ－アルファとしては、例えば、主として小腸及び大腸並びに結腸において発現しリンパ球においては弱く発現しているＧＳＴα１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０８２６３）、脳、胎盤、及び骨格筋において高レベルで発現しているＧＳＴα２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０９２１０）、ＧＳＴα３（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ１６７７２）、及びＧＳＴα４（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ１５２１７）、並びにＧＳＴα５（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ７ＲＴＶ２）がある。
ＴＨＰ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０７９１１）は、腎臓の尿細管細胞において、特に厚いヘンレ係蹄上行脚及び遠位尿細管管腔の上皮細胞の近傍に発現している。
カルビンディン－Ｄ２８Ｋ（ＣａｌＢ１）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０５９３７）は、哺乳動物腎臓において認められ、また、いくつかのニューロン細胞及び内分泌細胞、特に小脳において発現している。
メガリン（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ９８１６４）は、多くの吸収上皮細胞の原形質膜において認められる多重リガンド結合受容体である。
キュビリン（ＣＵＢＮ）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ６０４９４）は、腎臓及び小腸において発現している。
ネフリン（Ｎｐｈｓ１）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ６０５００）は、腎臓糸球体の足細胞において発現している。
クローディン１（ＣＬＤＮ１）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ９５８３２）は、肝臓及び腎臓において強く発現しており、心臓、脳、脾臓、肺、及び精巣において発現している。
アネキシンＶ（ＡＮＸＡ５）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０８７５８）は、多くの組織及び血球において発現している。
シナプトポディン（Ｓｙｎｐｏ、Ｑ８Ｎ３Ｖ７）は、ニューロン及び大脳皮質において発現している。
ウィルム腫瘍タンパク質（Ｗｔ１、Ｐ１９５４４）は、腎臓及び、造血細胞の部分セットにおいて発現している。
アニオン輸送タンパク質であるバンド３（ＳＬＣ４Ａ１、Ｐ０２７３０）は、赤血球において発現しており（ＰＭＩＤ：７５０６８７１、ＰＭＩＤ：２６５４２５７１）、アイソフォーム２は、腎臓において発現している（ＰＭＩＤ：７５０６８７１）。
ストマチン（ＳＴＯＭ、Ｐ２７１０５）は、赤血球において検出され、広く発現している。
癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＢＧＰ１、Ｐ１３６８８）は、結腸の円柱上皮細胞において（ＰＭＩＤ：１０４３６４２１）、Ｔ細胞において（ＰＭＩＤ：１８４２４７３０）発現し、顆粒球及びリンパ球において発現している。
グロビン（例えば、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）、Ｑ８ＷＷＭ９）は、心臓、胃、膀胱、及び小腸において発現している。
グリコホリンＢ（ＧＹＰＢ、Ｐ０６０２８）は、腎臓の内皮及び上皮において発現している。
Ｒｈポリペプチド、Ｒｈ糖タンパク質（ＲＨＡＧ、Ｑ０２０９４）は、赤血球において発現している。
ＰＯＤＸＬ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ００５９２）は、ファロピー管、子宮、及び精子小胞における糸球体足細胞、上皮細胞、腺細胞に多く発現している。
ＡＱＰ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ４１１８１）は、腎臓の集合管主細胞の頂端細胞膜において、及び細胞内小胞において認められる。
ＵＰＫ１ｂ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ７５８４１）は、膀胱の非対称性二重膜において認められる。
ＮＰＨＳ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ９ＮＰ８５）は、胎児及び成体の腎糸球体の足細胞において発現している。
ＧＹＰＡ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０２７２４）は、モノクローナル抗体ＴＥＲ１１９によって特異的に認識される、赤血球の主要内在性膜タンパク質である。
ムチン１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１５９４１、Ｑ７Ｚ５５１）は、前者が特に気道、乳房、及び子宮の上皮細胞の頂端表面上に発現しており、後者がＴ細胞において発現しており、乳癌又は卵巣癌など上皮腫瘍において、及び非上皮腫瘍細胞においても過剰発現している。
ＮＫＣＣ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ１３６２１）は、腎臓特異的腎Ｎａ、Ｋ及びＣｌ共輸送体である。
ＡＱＰ１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２９９７２）は、赤血球及び腎臓近位尿細管の原形質膜において発現している。
ＧＳＴ－アルファとしては、例えば、主として小腸及び大腸並びに結腸において発現しリンパ球においては弱く発現しているＧＳＴα１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０８２６３）、脳、胎盤、及び骨格筋において高レベルで発現しているＧＳＴα２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０９２１０）、ＧＳＴα３（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ１６７７２）、及びＧＳＴα４（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ１５２１７）、並びにＧＳＴα５（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ７ＲＴＶ２）がある。
ＴＨＰ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０７９１１）は、腎臓の尿細管細胞において、特に厚いヘンレ係蹄上行脚及び遠位尿細管管腔の上皮細胞の近傍に発現している。
カルビンディン－Ｄ２８Ｋ（ＣａｌＢ１）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０５９３７）は、哺乳動物腎臓において認められ、また、いくつかのニューロン細胞及び内分泌細胞、特に小脳において発現している。
メガリン（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ９８１６４）は、多くの吸収上皮細胞の原形質膜において認められる多重リガンド結合受容体である。
キュビリン（ＣＵＢＮ）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ６０４９４）は、腎臓及び小腸において発現している。
ネフリン（Ｎｐｈｓ１）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ６０５００）は、腎臓糸球体の足細胞において発現している。
クローディン１（ＣＬＤＮ１）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ９５８３２）は、肝臓及び腎臓において強く発現しており、心臓、脳、脾臓、肺、及び精巣において発現している。
アネキシンＶ（ＡＮＸＡ５）（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０８７５８）は、多くの組織及び血球において発現している。
シナプトポディン（Ｓｙｎｐｏ、Ｑ８Ｎ３Ｖ７）は、ニューロン及び大脳皮質において発現している。
ウィルム腫瘍タンパク質（Ｗｔ１、Ｐ１９５４４）は、腎臓及び、造血細胞の部分セットにおいて発現している。
アニオン輸送タンパク質であるバンド３（ＳＬＣ４Ａ１、Ｐ０２７３０）は、赤血球において発現しており（ＰＭＩＤ：７５０６８７１、ＰＭＩＤ：２６５４２５７１）、アイソフォーム２は、腎臓において発現している（ＰＭＩＤ：７５０６８７１）。
ストマチン（ＳＴＯＭ、Ｐ２７１０５）は、赤血球において検出され、広く発現している。
癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＢＧＰ１、Ｐ１３６８８）は、結腸の円柱上皮細胞において（ＰＭＩＤ：１０４３６４２１）、Ｔ細胞において（ＰＭＩＤ：１８４２４７３０）発現し、顆粒球及びリンパ球において発現している。
グロビン（例えば、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）、Ｑ８ＷＷＭ９）は、心臓、胃、膀胱、及び小腸において発現している。
グリコホリンＢ（ＧＹＰＢ、Ｐ０６０２８）は、腎臓の内皮及び上皮において発現している。
Ｒｈポリペプチド、Ｒｈ糖タンパク質（ＲＨＡＧ、Ｑ０２０９４）は、赤血球において発現している。
【0113】
次に、捕捉されたＥＶ上の補体系関連構成要素の存在又はレベルが検出される。いずれかの方法が、例えば、補体構成要素に特異的である検出抗体又はその抗原結合断片を用いた補体構成要素の検出において使用され得、アプタマーもまた使用され得る。検出のための実例となる方法としては、例えば、免疫組織化学的染色、ウエスタンブロット法、細胞内ウエスタン、免疫蛍光染色、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、又は当該技術分野で公知のいずれかの方法がある。
【0114】
概して、抗原上のエピトープの検出に使用される２つの戦略があり、直接法及び間接法である。直接法は、１段階染色を含み、ＥＶ上／内の抗原と直接反応する標識化抗体（例えば、ＦＩＴＣ結合抗体）を包含し得る。間接法は、体液又は組織の抗原と反応する標識されていない一次抗体と、この一次抗体と反応する標識済みの二次抗体とを含む。標識には、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素があり得る。これらのアッセイを実施する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ Ｙ，１９８８）、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ Ｙ，１９９９）、Ｖｉｒｅｌｌａ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉｎｆｏｒｍａ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）、及びＤｉａｍａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６）を参照されたい。これらのアッセイを実施するためのキットは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。
【0115】
広範な種々の補体タンパク質は、本方法を用いて検出され得、例えば、（ａ）代替経路（ＡＰ）の構成要素、（ｂ）従来の経路（ＣＰ）と関係する構成要素、及び（ｃ）レクチン経路（ＭＢＬ）と関係する構成要素を含む。いくつかの実施形態において、異なる経路由来の複数の構成要素、例えば、ＡＰ及びＣＰ由来の構成要素が検出され得る。
【0116】
好ましい実施形態において、補体系関連構成要素は、例えば、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃ１ｑ、Ｃ９、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、ＴＦ、ＣＲＰ、ｐＣＲＰ、ＭＡＣ、ＣＤ５９、ＣＦ５５、ＣＲ１、Ｃ５ａＲ１、及びＣ５から選択されるＡＰ又はＣＰの構成要素であり、好ましくはＭＡＣ、Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４、Ｃ１ｑ、及びＣ９である。様々な構成要素の組み合わせ、例えば、Ｃ３とＣ５の組み合わせが検出され得る。この中で、構成要素は、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）であり、方法はＭＡＣ、例えば、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９分子のいずれかのサブユニット又はすべてのサブユニットの検出を含み得る。
【0117】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ある特定のマーカー、例えば、ＣＤ８１（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ６００３３）などのエキソソーム特異的マーカー、Ｂ細胞上に発現するタンパク質（ＰＭＩＤ：２０２３７４０８）、単球／マクロファージ（ＰＭＩＤ：１２７９６４８０）、肝細胞（ＰＭＩＤ：１２４８３２０５）、さらにはＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＰＭＩＤ：２２３０７６１９）を欠失するＥＶを用いて測定することを含む。
【0118】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、目的以外の組織、例えば、尿路系の脈絡においては膀胱に対して特異的であるＥＶを用いて測定することを含む。例としては、例えば、膀胱上皮において発現するＵＰＫ１Ｂ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｏ７５８４１）がある。
【0119】
通例の方法を使用して、所望ではないマーカーに対して陽性であるＥＶを選別することができ、例えば、ＦＡＣＳである。
【0120】
下流でのアッセイ法の適用
生物学的試料において補体活性化を検出するための本方法は、下流での多くの適用において使用され得る。例えば、この方法は、（生物学的試料が得られた）対象が補体性疾患に罹患しているかどうか又は補体性疾患を発症するリスクがあるかどうかを判定するために使用され得る。補体性障害の発症又はリスクの測定は、ＥＶ又はその膜結合部分上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを対照（又は参照標準物質）と比較することによって行われる。典型的には、対照又は参照標準物質は、健常対象由来の同等の生物学的試料から単離されたＥＶを含有する。通例の方法は、異なる対象から得られた試料の加工及び正規化について実行されてもよい。
生物学的試料において補体活性化を検出するための本方法は、下流での多くの適用において使用され得る。例えば、この方法は、（生物学的試料が得られた）対象が補体性疾患に罹患しているかどうか又は補体性疾患を発症するリスクがあるかどうかを判定するために使用され得る。補体性障害の発症又はリスクの測定は、ＥＶ又はその膜結合部分上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを対照（又は参照標準物質）と比較することによって行われる。典型的には、対照又は参照標準物質は、健常対象由来の同等の生物学的試料から単離されたＥＶを含有する。通例の方法は、異なる対象から得られた試料の加工及び正規化について実行されてもよい。
【0121】
同様に、本方法はまた、補体性疾患の進行又は退縮を経時的に判定するためにも使用され得る。このことは、２つの異なる時点（例えば、ｔ１及びｔ２であって、ｔ２＞ｔ１）の対象の試料におけるＥＶ又はその膜結合部分上の補体経路の構成要素の存在又はレベルを比較することによって実施される。ｔ１と比較したｔ２での補体の存在／レベルの低減は、補体状態の改善及び補体疾患の退縮を示し、ｔ２での補体の存在／レベルがｔ１と比較して高い場合、逆もまた真である。測定間の間隔（例えば、ｔ２－ｔ１）は、疾患の性質に依存し得、何日間から何年間に及び得、例えば、数週間、１か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、５年、１０年、又はそれより長く、例えば、２０年であり得る。
【0122】
薬物の効能の測定
本開示の方法及びアッセイは、補体モジュレーターを用いた補体性疾患の処置に対する応答を監視するために使用することができる。補体モジュレーターは、直接的又は間接的に、補体構成要素、例えば、構成要素タンパク質を調節することができる、例えば、活性化することができるか又は阻害することができる分子である。いずれかの様式で制限されることなく、本明細書で説明される方法により効能が検査され得る代表的な補体モジュレーターは、表Ａにおいて提供される。
本開示の方法及びアッセイは、補体モジュレーターを用いた補体性疾患の処置に対する応答を監視するために使用することができる。補体モジュレーターは、直接的又は間接的に、補体構成要素、例えば、構成要素タンパク質を調節することができる、例えば、活性化することができるか又は阻害することができる分子である。いずれかの様式で制限されることなく、本明細書で説明される方法により効能が検査され得る代表的な補体モジュレーターは、表Ａにおいて提供される。
【0123】
【表A-1】
【0124】
【表A-2】
【0125】
【表A-3】
【0126】
【表A-4】
【0127】
例として、本開示は、様々な補体性疾患の療法の効能を監視するための以下の方法に関する。
（Ａ）抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた、対象における自己免疫疾患（例えば、ＧＢＳ、ｗＡＩＨＡ、自己抗体疾患）又は神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＨＤ、緑内障／地図状萎縮（ＧＡ））の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｂ）Ｃ１－ＩＮＨ（例えば、ＢＥＲＩＮＥＲＴ、ＲＵＣＯＮＥＳＴ、ＣＹＮＲＩＺＥ）を用いた、対象における遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｃ）（１）抗Ｃ１ｓモノクローナル抗体（例えば、ＢＩＶＶ０２０又は活性化型抗Ｃ１ｓ抗体）を用いた、対象における寒冷凝集素症（ＣＡＤ）における溶血事象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｃ）（２）Ｃ１ｓペプチドを用いた、対象における寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、温式抗体自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、神経変性疾患（例えば、ＨＤ、ＡＤ、ＡＬＳ、ＧＢＳ）から選択される補体性疾患の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｄ）抗Ｃ２モノクローナル抗体（例えば、ＰＲＯ－０２）を用いた、対象における抗体介在性炎症又は虚血再灌流損傷の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｅ）α－ＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体（例えば、ナルソプリマブ）を用いた、対象における造血幹細胞移植関連血栓性微小血管症（ＨＳＣＴ－ＴＭＡ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、又はＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｆ）α－ＭＡＳＰ－３モノクローナル抗体（例えば、ＯＭＳ９０６）を用いた、対象における発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）などの補体性疾患の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｇ）α－Ｄ因子（ＦＤ）モノクローナル抗体（例えば、ラムパリズマブ）を用いた、対象における地図状移植（ＧＡ）／加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｈ）小分子Ｄ因子（ＦＤ）阻害剤（例えば、ダニコパン（ＡＣＨ－４４７１）又はＡＣＨ－５２２８）を用いた、対象における輸血依存性貧血、溶血を伴うＰＮＨ（ＥＶＨ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｉ）小分子Ｄ因子（ＦＤ）阻害剤（例えば、ＢＣＸ９９３０又は参照により本明細書に援用される米国特許第９３８８１９９号明細書におけるＦＤ阻害剤）を用いた、対象における補体性障害の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｊ）Ｂ因子（ＦＢ）阻害剤（例えば、Ｂ因子ｓｉＲＮＡ ＩＯＮＩＳ－ＦＢ－ＬＲＸ又はα－ＦＢモノクローナル抗体）を用いた、対象におけるＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）などの補体性障害の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｋ）Ｂ因子（ＦＢ）阻害剤（ＬＮＰ０２３）を用いた、対象におけるＰＮＨ、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、膜性糸球体腎炎及び他の腎疾患の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｌ）α－プロペルジン（Ｐ因子）モノクローナル抗体（例えば、ＣＬＧ５６１）を用いた、対象における腎疾患又は変性疾患（例えば、ＡＭＤ又はＧＡ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｍ）Ｈ因子（ＦＨ）モジュレーター（例えば、ミニＨ因子、ＡＭＹ－２０１、又はＣＲ２－Ｈ因子／ＴＴ３０）を用いた、対象における歯周病又はＰＮＨの処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｎ）コンプスタチン又はその誘導体（例えば、ＡＰＬ２、ＡＰＬ９、ＡＭＹ－１０１）又はｓＣＲ１／ＴＰ１０又はミロコセプトを用いた、ＧＡ、ＰＮＨ、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、ｗＡＩＨＡ、補体性腎症（ＣＤＮ）、及びＣ３Ｇから選択される補体性障害の対象の処置、又は歯周病、移植片拒絶反応、同種移植片における虚血再灌流損傷、若しくは遺伝子療法におけるアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の拒絶の減衰に対する応答を監視するための方法。
（Ｏ）抗Ｃ５モノクローナル抗体（例えば、エクリズマブ又はそのバイオ後続品、例えば、ＡＢＰ９５９、Ｅｌｉｚａｒｉａ、又はＳＢ１２）を用いた、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、重症筋無力症（ｇＭＧ）、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（１）ノマコパン（コバーシン、ｒＶＡ５７６）を用いた、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、ぶどう膜炎、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、角結膜炎、関節リウマチ（ＲＡ）の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（２）ジルコプラン（ＲＡ１０１４９５）を用いた、ｇＭＧ、ＡＬＳ、免疫性壊死性ミオパチー（ＩＭＮＭ）、又は腎疾患の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（３）抗Ｃ５ｓｉＲＮＡセムジシラン（ＡＬＮ－ＣＣ５）を用いた、ａＨＵＳの対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（４）ジムラ（Ｚｉｍｕｒａ）（ＡＲＣ１９０５）を用いたＧＡ／ＡＭＤ、血管新生ＡＭＤ、又はＳｔａｒｇａｒｄｔ病の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｑ）改善された抗Ｃ５モノクローナル抗体（例えば、ラブリズマブ）を用いた、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、ｇＭＧ、ＮＭＯＳＤ、造血性幹細胞移植（ＨＳＣＴ）－ＴＭＡ、ＡＬＳ、補体性ＴＭＡ、又は重症ＣＯＶＩＤ－１９の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｒ）（１）抗Ｃ５アフィボディ（例えば、ＳＯＢＩ００５）を用いた、補体性障害の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｒ）（２）抗Ｃ５抗体テシドルマブ（ＬＦＧ３１６）を用いた、移植後微小血管症（ＴＡＭ）、全ぶどう膜炎、ＡＭＤ、ＧＡ、ＰＮＨ、又は腎移植拒絶反応の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｒ）（３）ポゼリマブ又はクロバリマブ（ＳＫＹ０５９）である抗Ｃ５抗体を用いた、ＰＮＨの対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｓ）（１）アバコパン（ＣＣＸ－１６８）を用いた、抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｓ）（２）抗Ｃ５モノクローナル抗体（例えば、オレンダリズマブ（ＡＬＸＮ１００７）又はＢＤＢ－００１又はＩＦＸ２）を用いた、ＧＶＨＤ又はＣＯＶＩＤ－１９の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｔ）（１）抗Ｃ６モノクローナル抗体及びＣ６アンチセンスＲＮＡから選択される補体Ｃ６阻害剤を用いた、自己免疫疾患又は重症筋無力症（ＭＧ）の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｔ）（２）補体Ｃ６阻害剤ＣＰ０１０を用いた、神経変性障害の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｕ）可溶性ＣＤ５９（ＨＭＲ５９）をコードするアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を用いた、萎縮型及び滲出型のＡＭＤの対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ａ）抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた、対象における自己免疫疾患（例えば、ＧＢＳ、ｗＡＩＨＡ、自己抗体疾患）又は神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＨＤ、緑内障／地図状萎縮（ＧＡ））の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｂ）Ｃ１－ＩＮＨ（例えば、ＢＥＲＩＮＥＲＴ、ＲＵＣＯＮＥＳＴ、ＣＹＮＲＩＺＥ）を用いた、対象における遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｃ）（１）抗Ｃ１ｓモノクローナル抗体（例えば、ＢＩＶＶ０２０又は活性化型抗Ｃ１ｓ抗体）を用いた、対象における寒冷凝集素症（ＣＡＤ）における溶血事象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｃ）（２）Ｃ１ｓペプチドを用いた、対象における寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、温式抗体自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、神経変性疾患（例えば、ＨＤ、ＡＤ、ＡＬＳ、ＧＢＳ）から選択される補体性疾患の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｄ）抗Ｃ２モノクローナル抗体（例えば、ＰＲＯ－０２）を用いた、対象における抗体介在性炎症又は虚血再灌流損傷の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｅ）α－ＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体（例えば、ナルソプリマブ）を用いた、対象における造血幹細胞移植関連血栓性微小血管症（ＨＳＣＴ－ＴＭＡ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、又はＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｆ）α－ＭＡＳＰ－３モノクローナル抗体（例えば、ＯＭＳ９０６）を用いた、対象における発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）などの補体性疾患の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｇ）α－Ｄ因子（ＦＤ）モノクローナル抗体（例えば、ラムパリズマブ）を用いた、対象における地図状移植（ＧＡ）／加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｈ）小分子Ｄ因子（ＦＤ）阻害剤（例えば、ダニコパン（ＡＣＨ－４４７１）又はＡＣＨ－５２２８）を用いた、対象における輸血依存性貧血、溶血を伴うＰＮＨ（ＥＶＨ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｉ）小分子Ｄ因子（ＦＤ）阻害剤（例えば、ＢＣＸ９９３０又は参照により本明細書に援用される米国特許第９３８８１９９号明細書におけるＦＤ阻害剤）を用いた、対象における補体性障害の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｊ）Ｂ因子（ＦＢ）阻害剤（例えば、Ｂ因子ｓｉＲＮＡ ＩＯＮＩＳ－ＦＢ－ＬＲＸ又はα－ＦＢモノクローナル抗体）を用いた、対象におけるＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）などの補体性障害の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｋ）Ｂ因子（ＦＢ）阻害剤（ＬＮＰ０２３）を用いた、対象におけるＰＮＨ、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、膜性糸球体腎炎及び他の腎疾患の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｌ）α－プロペルジン（Ｐ因子）モノクローナル抗体（例えば、ＣＬＧ５６１）を用いた、対象における腎疾患又は変性疾患（例えば、ＡＭＤ又はＧＡ）の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｍ）Ｈ因子（ＦＨ）モジュレーター（例えば、ミニＨ因子、ＡＭＹ－２０１、又はＣＲ２－Ｈ因子／ＴＴ３０）を用いた、対象における歯周病又はＰＮＨの処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｎ）コンプスタチン又はその誘導体（例えば、ＡＰＬ２、ＡＰＬ９、ＡＭＹ－１０１）又はｓＣＲ１／ＴＰ１０又はミロコセプトを用いた、ＧＡ、ＰＮＨ、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、ｗＡＩＨＡ、補体性腎症（ＣＤＮ）、及びＣ３Ｇから選択される補体性障害の対象の処置、又は歯周病、移植片拒絶反応、同種移植片における虚血再灌流損傷、若しくは遺伝子療法におけるアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の拒絶の減衰に対する応答を監視するための方法。
（Ｏ）抗Ｃ５モノクローナル抗体（例えば、エクリズマブ又はそのバイオ後続品、例えば、ＡＢＰ９５９、Ｅｌｉｚａｒｉａ、又はＳＢ１２）を用いた、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、重症筋無力症（ｇＭＧ）、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（１）ノマコパン（コバーシン、ｒＶＡ５７６）を用いた、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、ぶどう膜炎、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、角結膜炎、関節リウマチ（ＲＡ）の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（２）ジルコプラン（ＲＡ１０１４９５）を用いた、ｇＭＧ、ＡＬＳ、免疫性壊死性ミオパチー（ＩＭＮＭ）、又は腎疾患の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（３）抗Ｃ５ｓｉＲＮＡセムジシラン（ＡＬＮ－ＣＣ５）を用いた、ａＨＵＳの対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｐ）（４）ジムラ（Ｚｉｍｕｒａ）（ＡＲＣ１９０５）を用いたＧＡ／ＡＭＤ、血管新生ＡＭＤ、又はＳｔａｒｇａｒｄｔ病の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｑ）改善された抗Ｃ５モノクローナル抗体（例えば、ラブリズマブ）を用いた、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、ｇＭＧ、ＮＭＯＳＤ、造血性幹細胞移植（ＨＳＣＴ）－ＴＭＡ、ＡＬＳ、補体性ＴＭＡ、又は重症ＣＯＶＩＤ－１９の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｒ）（１）抗Ｃ５アフィボディ（例えば、ＳＯＢＩ００５）を用いた、補体性障害の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｒ）（２）抗Ｃ５抗体テシドルマブ（ＬＦＧ３１６）を用いた、移植後微小血管症（ＴＡＭ）、全ぶどう膜炎、ＡＭＤ、ＧＡ、ＰＮＨ、又は腎移植拒絶反応の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｒ）（３）ポゼリマブ又はクロバリマブ（ＳＫＹ０５９）である抗Ｃ５抗体を用いた、ＰＮＨの対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｓ）（１）アバコパン（ＣＣＸ－１６８）を用いた、抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｓ）（２）抗Ｃ５モノクローナル抗体（例えば、オレンダリズマブ（ＡＬＸＮ１００７）又はＢＤＢ－００１又はＩＦＸ２）を用いた、ＧＶＨＤ又はＣＯＶＩＤ－１９の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｔ）（１）抗Ｃ６モノクローナル抗体及びＣ６アンチセンスＲＮＡから選択される補体Ｃ６阻害剤を用いた、自己免疫疾患又は重症筋無力症（ＭＧ）の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｔ）（２）補体Ｃ６阻害剤ＣＰ０１０を用いた、神経変性障害の対象の処置に対する応答を監視するための方法。
（Ｕ）可溶性ＣＤ５９（ＨＭＲ５９）をコードするアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を用いた、萎縮型及び滲出型のＡＭＤの対象の処置に対する応答を監視するための方法。
【0128】
処置に対する応答を測定するための上述の代表的な方法は概して、ＥＶにおける補体タンパク質を検出するための先の方法に従って、例えば、（ａ）処置の前及び後で対象から細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含有する試料を得ること、（ｂ）この試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉すること、（ｃ）場合により、試料の一部を、少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉すること、（ｄ）捕捉したＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させること、並びに（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分上の補体経路の構成要素のレベルの存在を測定することによって実施され、この中で、補体モジュレーターを用いた処置前と比較した、処置後の対象の試料における補体経路の構成要素の存在又はレベルの調節（例えば、上昇又は低下、好ましくは低下）は、対象が補体モジュレーターに応答していることを示す。
【0129】
いくつかの実施形態において、補体モジュレーターは、Ｃ１ｑ、Ｃ１、Ｃ１ｓ、Ｃ２、ＭＡＳＰ－２、ＭＡＳＰ－３、Ｄ因子、Ｂ因子、プロペルジン（Ｐ因子）、Ｈ因子、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼ、Ｃ５、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ、Ｃ３ａ／Ｃ３ａＲ、Ｃ６、又はＣＤ５９のモジュレーターであり、好ましくは、表Ａに示されるように、モノクローナル抗体又は小分子阻害剤又はｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉなどの補体阻害剤である。
【0130】
先の方法は、例えば、Ｃ５軸又はＣ３軸における終末補体の活性化又は活性を阻害する分子の効能を検査するのに特に有用である。特に、先の方法は、Ｃ５阻害剤、例えば、エクリズマブ又はラブリズマブなどの後続の分子の効能を検査するのに特に適用可能である。
【0131】
検査化合物を調節する補体についてスクリーニングする方法
いくつかの実施形態において、本開示は、補体調節について試験化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）補体性疾患に罹患している対象（例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ラマ、イヌ、サル、チンパンジー、又はヒトなどの動物）への試験化合物の投与の前及び後の、対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含有する試料を得ることと、（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、（ｄ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体構成要素の存在又はレベルを測定し、試験化合物の投与前と比較した、試験化合物の投与後の対象の試料中の補体構成要素の存在又はレベルの調節（例えば、上昇又は低下、好ましくは低下）が、試験化合物が補体を調節することができることを示すことと、を含む、方法に関する。好ましくは、試験化合物は、Ｃ１ｑ、Ｃ１、Ｃ１ｓ、Ｃ２、ＭＡＳＰ－２、ＭＡＳＰ－３、Ｄ因子、Ｂ因子、プロペルジン（Ｐ因子）、Ｈ因子、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼ、Ｃ５、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ、Ｃ３ａ／Ｃ３ａＲ、Ｃ６、若しくはＣＤ５９、又はこれらの組み合わせである補体を調節することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、補体調節について試験化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）補体性疾患に罹患している対象（例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ラマ、イヌ、サル、チンパンジー、又はヒトなどの動物）への試験化合物の投与の前及び後の、対象由来の細胞外小胞（ＥＶ）又はその膜結合部分を含有する試料を得ることと、（ｂ）試料の一部を少なくとも１つの第１の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第１のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、（ｃ）場合により、試料の一部を少なくとも１つの第２の捕捉抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ＥＶ又はその膜結合部分の上において第２のマーカーを少なくとも１つ捕捉することと、（ｄ）捕捉されたＥＶ又はその膜結合部分を、補体系関連構成要素に特異的な少なくとも１つの検出抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、（ｅ）検出抗体又はその抗原結合断片を定性的に又は定量的に検出して、ＥＶ又はその膜結合部分の上の補体構成要素の存在又はレベルを測定し、試験化合物の投与前と比較した、試験化合物の投与後の対象の試料中の補体構成要素の存在又はレベルの調節（例えば、上昇又は低下、好ましくは低下）が、試験化合物が補体を調節することができることを示すことと、を含む、方法に関する。好ましくは、試験化合物は、Ｃ１ｑ、Ｃ１、Ｃ１ｓ、Ｃ２、ＭＡＳＰ－２、ＭＡＳＰ－３、Ｄ因子、Ｂ因子、プロペルジン（Ｐ因子）、Ｈ因子、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼ、Ｃ５、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ、Ｃ３ａ／Ｃ３ａＲ、Ｃ６、若しくはＣＤ５９、又はこれらの組み合わせである補体を調節することができる。
【0132】
いくつかの実施形態において、試験化合物の調節活性は、表Ａにおいて提供される分子など、補体調節活性を有する分子（例えば、陽性対照又は標準物質）の調節活性と比較される。
【0133】
Ｃ５の活性化又は活性を阻害する化合物
代表的な実施形態において、先の方法に従って活性が試験又はスクリーニングされる補体モジュレーターは、Ｃ５の活性化を阻害する分子であり、それにより補体介在効果を低減、抑制、及び／又は排除する（例えば、ＣＳＲ又はＣＡＲＰＡ）。Ｃ５の開裂は、有力なアナフィラトキシン且つ走化性因子であるＣ５ａを放出し、溶解性種末補体複合体であるＣ５ｂ－９の形成につながる。Ｃ５ａ及びＣ５ｂ－９はまた、加水分解性酵素、活性酸素種、アラキドン酸代謝産物及び様々なサイトカインなどの下流の炎症性因子の放出を増幅することによって多面的な細胞活性化特性も有する。
代表的な実施形態において、先の方法に従って活性が試験又はスクリーニングされる補体モジュレーターは、Ｃ５の活性化を阻害する分子であり、それにより補体介在効果を低減、抑制、及び／又は排除する（例えば、ＣＳＲ又はＣＡＲＰＡ）。Ｃ５の開裂は、有力なアナフィラトキシン且つ走化性因子であるＣ５ａを放出し、溶解性種末補体複合体であるＣ５ｂ－９の形成につながる。Ｃ５ａ及びＣ５ｂ－９はまた、加水分解性酵素、活性酸素種、アラキドン酸代謝産物及び様々なサイトカインなどの下流の炎症性因子の放出を増幅することによって多面的な細胞活性化特性も有する。
【0134】
ある特定の治療薬（例えば、粒子又はナノ粒子に封入された治療薬）の治療上の投与中に生じる補体介在性効果を低減、抑制、及び／又は排除する上で使用するのに適した補体阻害剤は、Ｃ５へ結合し得る。例示的な作用因子としては、抗体、抗体断片、ポリペプチド、小分子、及びアプタマーがある。例示的な抗体は、米国特許第６，５３４，０５８号明細書において、及びＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：８９５５－８９５９，１９９５において説明されている。Ｃ５へ結合しこれを阻害する例示的な化合物は、米国特許第７，３４８，４０１号明細書及び同第７，９９９，０８１号明細書において説明されている。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、米国特許第６，５３４，０５８号明細書において説明されている抗体と実質的に同じ、Ｃ５上の結合部位へ結合する抗体、小分子、アプタマー、若しくはポリペプチド、又は米国特許第７，３４８，４０１号明細書において説明されるペプチドである。米国特許第７，５３８，２１１号明細書は、Ｃ５へ結合してこれを阻害するアプタマーを開示している。Ｃ５又はＣＳＲの局所発現を阻害するＲＮＡｉ作用因子もまた、本明細書で説明される方法において使用することができる。
【0135】
他の実施形態において、この作用因子は、Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）のアンタゴニストである。
【0136】
Ｃ５ａは、代替的なＣ５コンバターゼ又は従来のＣ５コンバターゼのいずれかによってＣ５のアルファ鎖から開裂する。コンバターゼ作用についての開裂部位は、Ｃ５ａのアルファ鎖のアミノ酸残基７３３に、又はそのすぐ近くにある。この開裂部位で、又はその近くで結合するであろう化合物は、この開裂部位に対するＣ５コンバターゼ酵素の接近を遮断する能力を有するであろうし、それにより相補体阻害剤として作用するであろう。開裂部位に対して遠位の部位でＣ５へ結合する化合物はまた、例えば、Ｃ５とＣ５コンバターゼとの相互作用の立体障害阻害によって、Ｃ５開裂を遮断する能力も有し得る。例示的なＣ５ａ受容体アンタゴニストとしては、米国特許第６，８２１，９５０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１１７１７１号明細書、及び／若しくは国際公開第２００６／０９９３３０号パンフレットにおいて説明されているものなど、様々な小分子ペプチド、又はモノクローナル抗体ＢＢ５．１（Ｆｒｅｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１：１４１－９，１９８７）、ＢＢ５．１の一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、又は抗ＢＢ５．１Ｆａｂ（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１１５（６）：１５９０－１６００，２００５）があり、Ｃ５ａ及びＣ５ｂの形成を防止する。
【0137】
ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、抗Ｃ５抗体を含む。本明細書での使用に適した抗Ｃ５抗体（又はそれに由来するＶＨ／ＶＬドメイン）は、当該技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。或いは、当該技術分野で認識されている抗Ｃ５抗体を使用することができる。Ｃ５に対して結合するための当該技術で認識されているこれらの抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。
【0138】
ＣＤＲの実際の境界は、異なる方法によって異なって定義されてきた。いくつかの実施形態において、軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメイン内でのＣＤＲ又はフレームワーク領域の位置は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．［（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．”ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ］によって定義されているようにあり得る。かかる場合において、ＣＤＲは、「Ｋａｂａｔ ＣＤＲ」と称することができる（例えば、「Ｋａｂａｔ ＬＣＤＲ２」又は「Ｋａｂａｔ ＨＣＤＲ１」）。いくつかの実施形態において軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７ ８３，１９８９）によって定義されるとおりであり得る。したがって、これらの領域は、「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」（例えば、「Ｃｈｏｔｈｉａ ＬＣＤＲ２」又は「ＣｈｏｔｈｉａＨＣＤＲ３」）と称することができる。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ Ｃｈｏｔｈｉａの組み合わされた定義によって定義されるとおりであり得る。かかる実施形態において、これらの領域は、「組み合わされたＫａｂａｔ Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」（Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：１３８９ ４０１，１９９６）が、Ｋａｂａｔの定義及びＣｈｏｔｈｉａの定義により、ＣＤＲ境界の同定を例示していると称することができる。
【0139】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、その教示が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１５／１３４８９４号パンフレット及び米国特許第９，０７９，９４９号明細書において説明されるように、抗体ＢＮＪ４２１である。
【0140】
抗Ｃ５抗体は、例えば、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へ結合する可変ヒトＦｃ定常領域を含むことができ、この中で、可変ヒトＦｃ ＣＨ３定常領域は、ＥＵ番号付けにおいて各々、天然のヒトＩｇＧ Ｆｃ定常領域のメチオニン４２８及びアスパラギン４３４に対応する残基において、Ｍｅｔ－４２９－Ｌｅｕ置換及びＡｓｎ－４３５－Ｓｅｒ置換を含む。
【0141】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許第８，２４１，６２８号明細書及び同第８，８８３，１５８号明細書において説明されている７０８６抗体である。
【0142】
別の例示的な抗Ｃ５抗体はこれもまた、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許第８，２４１，６２８号明細書及び同第８，８８３，１５８号明細書において説明されている８１１０抗体である。
【0143】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許第９，７６５，１３５号明細書において説明されている３０５ＬＯ５抗体である。
【0144】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、ＳＫＹ５９抗体である（Ｆｕｋｕｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，７：１０８０，２０１７であり、その開示が参照により本明細書に援用される）。
【0145】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、米国特許出願公開第２０１７／０３５５７５７号明細書又は国際公開第２０１７２１８５１５号パンフレットにおいて説明されているＲＥＧＮ３９１８抗体（Ｈ４Ｈ１２１６６ＰＰとしても公知）であり、その開示は参照により本明細書に援用される。
【0146】
別の実施形態において、この抗体は、先に記載の抗体（例えば、７０８６抗体、８１１０抗体、３０５ＬＯ５抗体、ＳＫＹ５９抗体、又はＲＥＧＮ３９１８抗体）と同じ、Ｃ５上のエピトープとの結合について競合し、及び／又はこのエピトープへ結合する。抗Ｃ５抗体は、例えば、先に記載の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の可変領域同一性）を有することができる。
【0147】
本明細書に説明される抗Ｃ５抗体は、いくつかの実施形態において、変異体ヒトＦｃ定常領域が由来する天然のヒトＦｃ定常領域の親和性よりも大きな親和性でヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へ結合する変異体ヒトＦｃ定常領域を含む。Ｆｃ定常領域は、例えば、変異体ヒトＦｃ定常領域が由来する天然のヒトＦｃ定常領域に対する１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、若しくは８又はそれより多数）のアミノ酸置換を含むことができる。例えば、置換は、相互作用のｐＨ依存性を維持しながら、変異体Ｆｃ定常領域を含有するＩｇＧ抗体のｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する結合親和性を増大させることができる。抗体のＦｃ定常領域における１つ以上の置換が、（相互作用のｐＨ依存性を維持しながら）ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対するＦｃ定常領域の親和性を増大させるかどうかを試験するための方法は、当該技術分野で公知であり、作業例において例示されている（国際公開第２０１５１３４８９４号パンフレット及び米国特許第９，０７９，９４９号明細書；各開示が全体として参照により本明細書に援用される）。
【0148】
ＦｃＲｎに対する抗体Ｆｃ定常領域の結合親和性を増強する置換としては、（１）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ三重置換（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：２３５１４２４，２００６）、（２）Ｍ４２８Ｌ置換又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ置換（Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：６２１３ ６，２００４、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６：３４６５６，２００６）、及び（３）Ｎ４３４Ａ置換又はＴ３０７／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ置換（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：１７５９ ６９，２００６）がある。追加の置換対形成、例えば、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、及びＤ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈもまた、説明されている（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２：１７０９ １７，２００７）。引用される参考文献の各々の全体的な教示は、参照により本明細書に援用される。
【0149】
いくつかの実施形態において、変異体定常領域は、ＥＵアミノ酸残基２５５でバリンに対する置換を有する。いくつかの実施形態において、変異体定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３０９でアスパラギンに対する置換を有する。いくつかの実施形態において、変異体定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３１２でイソロイシンに対する置換を有する。いくつかの実施形態において、変異体定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３８６でる置換を有する。
【0150】
いくつかの実施形態において、変異体Ｆｃ定常領域は、由来する天然の定常領域に対して３０以下（例えば、２９以下、２８以下、２７以下、２６以下、２５以下、２４以下、２３以下、２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下）のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含む。いくつかの実施形態において、変異体Ｆｃ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、及びＶ３０８Ｆからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、変異体ヒトＦｃ定常領域は、位置４２８でメチオニンを、及び位置４３４でアスパラギンを含み、各々ＥＵ番号付けである。いくつかの実施形態において、変異体Ｆｃ定常領域は、例えば、その開示が全体として参照により本明細書に援用される米国特許第８，０８８，３７６号明細書において説明されるような４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換を含む。
【0151】
いくつかの実施形態において、これらの突然変異の正確な位置は、抗体操作により、天然のヒトＦｃ定常領域から移行され得る。ＩｇＧ２／４キメラＦｃにおいて使用されるときの４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換は、例えば、その開示が全体として参照により本明細書に援用される米国特許第９，０７９，９４９号明細書において説明されるＭ４２９Ｌ変異体及びＮ４３５Ｓ変異体と同様に、４２９Ｌ及び４３５Ｓに対応し得る。
【0152】
いくつかの実施形態において、変異体定常領域は、天然のヒトＦｃ定常領域に対してアミノ酸位置２３７、２３８、２３９、２４８、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６５、２７０、２８６、２８９、２９７、２９８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３２５、３３２、３３４、３６０、３７６、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２４、４２８、４３３、４３４、又は４３６（ＥＵ番号付け）で置換を含む。いくつかの実施形態において、この置換は、位置２３７でのグリシンに対するメチオニン、位置２３８でのプロリンに対するアラニン、位置２３９でのセリンに対するリジン、位置２４８でのリジンに対するイソロイシン、位置２５０でのトレオニンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシン、位置２５２でのメチオニンに対するフェニルアラニン、トリプトファン、又はチロシン、位置２５４でのセリンに対するトレオニン、位置２５５でのアルギニンに対するグルタミン酸、位置２５６でのトレオニンに対するアスパラギン酸、グルタミン酸、又はグルタミン、位置２５７でのプロリンに対するアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、又はバリン、位置２５８でのグルタミン酸に対するヒスチジン、位置２６５でのアスパラギン酸に対するアラニン、位置２７０でのアスパラギン酸に対するフェニルアラニン、位置２８６でのアスパラギンに対するアラニン又はグルタミン酸、位置２８９でのトレオニンに対するヒスチジン、位置２９７でのアスパラギンに対するアラニン、位置２９８でのセリンに対するグリシン、位置３０３でのバリンに対するアラニン、位置３０５でのバリンに対するアラニン、位置３０７でのトレオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、又はチロシン、位置３０８でのバリンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、又はトレオニン、位置３０９でのロイシン又はバリンに対するアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、又はアルギニン、位置３１１でのグルタミンに対するアラニン、ヒスチジン、又はイソロイシン、位置３１２でのアスパラギン酸に対するアラニン又はヒスチジン、位置３１４でのロイシンに対するリジン又はアルギニン、位置３１５でのアスパラギンに対するアラニン又はヒスチジン、位置３１７でのリジンに対するアラニン、位置３２５でのアスパラギンに対するグリシン、位置３３２でのイソロイシンに対するバリン、位置３３４でのリジンに対するロイシン、位置３６０でのリジンに対するヒスチジン、位置３７６でのアスパラギン酸に対するアラニン、位置３８０でのグルタミン酸に対するアラニン、位置３８２でのグルタミン酸に対するアラニン、位置３８４でのアスパラギン又はセリンに対するアラニン、位置３８５でのグリシンに対するアスパラギン酸又はヒスチジン、位置３８６でのグルタミンに対するプロリン、位置３８７でのプロリンに対するグルタミン酸、位置３８９でのアスパラギンに対するアラニン又はセリン、位置４２４でのセリンに対するアラニン、位置４２８でのメチオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシン、位置４３３でのヒスチジンに対するリジン、位置４３４でのアスパラギンに対するアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、又はチロシン、及び位置４３６でのチロシン又はフェニルアラニンに対するヒスチジンからなる群から選択され、すべてＥＵ番号付けである。
【0153】
一実施形態において、抗体は、ｐＨ７．４且つ２５℃で（及び、さもなくば生理学的条件下で）、Ｃ５に対して少なくとも０．１ｎＭ（例えば、少なくとも０．１５ｎＭ、０．１７５ｎＭ、０．２ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．２７５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．３２５ｎＭ、０．３５ｎＭ、０．３７５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．４２５ｎＭ、０．４５ｎＭ、０．４７５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．５２５ｎＭ、０．５５ｎＭ、０．５７５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．６２５ｎＭ、０．６５ｎＭ、０．６７５ｎＭ、０．７ｎＭ、０．７２５ｎＭ、０．７５ｎＭ、０．７７５ｎＭ、０．８ｎＭ、０．８２５ｎＭ、０．８５ｎＭ、０．８７５ｎＭ、０．９ｎＭ、０．９２５ｎＭ、０．９５ｎＭ、又は０．９７５ｎＭ）である親和性解離定数（ＫＤ）で結合する。いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体又はその抗原結合断片のＫＤは、１ｎＭ以下（例えば、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、又は０．２ｎＭ）である。
【0154】
他の実施形態において、［（ｐＨ６．０、２５℃でのＣ５に対する抗体のＫＤ）／（ｐＨ７．４、２５℃でのＣ５に対する抗体のＫＤ）］は、２１より大きい（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、又は８０００より大きい）。
【0155】
Ｂ因子の活性化又は活性を阻害する化合物
ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、Ｂ因子の活性化を阻害する。補体阻害剤は、例えば、Ｂ因子へ結合することができ、それにより活性化を阻害する。例示的な作用因子としては、抗体、抗体断片、ペプチド、小分子、及びアプタマーがある。Ｂ因子を阻害する例示的な抗体は、米国特許出願公開第２００５０２６０１９８号明細書において説明されている。ある特定の実施形態において、単離された抗体又は抗原結合断片は、第３の短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）ドメイン内でＢ因子へ選択的に結合する。ある特定の実施形態において、抗体は、Ｃ３ｂＢｂ複合体の形成を防止する。ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、Ｄ因子によってＢ因子の開裂を防止又は阻害する。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、米国特許出願公開第２００５０２６０１９８号明細書において説明される抗体と実質的に同じ、Ｂ因子上の結合部位へ結合する抗体、小分子、アプタマー、若しくはポリペプチドであり、又はＢ因子の局所発現を阻害するＲＮＡｉ作用因子である。Ｂ因子へ結合してこれを阻害するペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。
ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、Ｂ因子の活性化を阻害する。補体阻害剤は、例えば、Ｂ因子へ結合することができ、それにより活性化を阻害する。例示的な作用因子としては、抗体、抗体断片、ペプチド、小分子、及びアプタマーがある。Ｂ因子を阻害する例示的な抗体は、米国特許出願公開第２００５０２６０１９８号明細書において説明されている。ある特定の実施形態において、単離された抗体又は抗原結合断片は、第３の短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）ドメイン内でＢ因子へ選択的に結合する。ある特定の実施形態において、抗体は、Ｃ３ｂＢｂ複合体の形成を防止する。ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、Ｄ因子によってＢ因子の開裂を防止又は阻害する。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、米国特許出願公開第２００５０２６０１９８号明細書において説明される抗体と実質的に同じ、Ｂ因子上の結合部位へ結合する抗体、小分子、アプタマー、若しくはポリペプチドであり、又はＢ因子の局所発現を阻害するＲＮＡｉ作用因子である。Ｂ因子へ結合してこれを阻害するペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。
【0156】
Ｄ因子の活性を阻害する化合物
ある特定の実施形態において、補体阻害剤はＤ因子を阻害する。補体阻害剤は、例えば、Ｄ因子へ結合し、それによりＤ因子を阻害し得る。例示的な作用因子としては、抗体、抗体断片、ペプチド、小分子、及びアプタマーがある。Ｄ因子はその比較的低い血清濃度と代替的な経路の活性化を阻害する能力との結果として、全身性補体阻害のための所望の標的と示唆されてきたが、本開示は、Ｄ因子を阻害する局所的に投与される作用因子の治療能に関する。Ｄ因子を阻害する例示的な抗体は、米国特許第７，１１２，３２７号明細書において説明される。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、米国特許第７，１１２，３２７号明細書において説明される抗体と実質的に同じ、Ｄ因子上の結合部位へ結合する抗体、小分子、アプタマー、又はポリペプチドである。代替的な経路の活性化を阻害し、Ｄ因子を阻害すると考えられている例示的なポリペプチドは、米国特許出願公開第２００４００３８８６９号明細書において開示されている。Ｄ因子へ結合しこれを阻害するペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。
ある特定の実施形態において、補体阻害剤はＤ因子を阻害する。補体阻害剤は、例えば、Ｄ因子へ結合し、それによりＤ因子を阻害し得る。例示的な作用因子としては、抗体、抗体断片、ペプチド、小分子、及びアプタマーがある。Ｄ因子はその比較的低い血清濃度と代替的な経路の活性化を阻害する能力との結果として、全身性補体阻害のための所望の標的と示唆されてきたが、本開示は、Ｄ因子を阻害する局所的に投与される作用因子の治療能に関する。Ｄ因子を阻害する例示的な抗体は、米国特許第７，１１２，３２７号明細書において説明される。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、米国特許第７，１１２，３２７号明細書において説明される抗体と実質的に同じ、Ｄ因子上の結合部位へ結合する抗体、小分子、アプタマー、又はポリペプチドである。代替的な経路の活性化を阻害し、Ｄ因子を阻害すると考えられている例示的なポリペプチドは、米国特許出願公開第２００４００３８８６９号明細書において開示されている。Ｄ因子へ結合しこれを阻害するペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。
【0157】
多重モードの補体阻害剤／モジュレーター
本明細書に説明される方法において有用な補体阻害剤は、１つを超える補体タンパク質へ結合することができ、且つ／又は補体活性化経路における１つを超えるステップを阻害することができる。かかる補体阻害剤は、「多重モード」と本明細書で称される。
本明細書に説明される方法において有用な補体阻害剤は、１つを超える補体タンパク質へ結合することができ、且つ／又は補体活性化経路における１つを超えるステップを阻害することができる。かかる補体阻害剤は、「多重モード」と本明細書で称される。
【0158】
補体阻害剤は、例えば、ウイルス補体制御タンパク質（ＶＣＣＰ）であり得る（米国特許第７，９４７，２６７号明細書及び国際公開第２００６０４２２５２号パンフレット）。ある特定の実施形態において、ＶＣＣＰは、ポックスウイルス補体制御タンパク質（ＰＶＣＣＰ）、又はヘルペスウイルス補体制御タンパク質（ＨＶＣＣＰ）である。
【0159】
ＶＣＣＰは、従来の補体経路、代替的な補体経路、レクチン経路、又はこれらのいずれかの２つ以上を阻害し得る。ＶＣＣＰ、例えば、ＰＶＣＣＰは、例えば、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、又はその両方へ結合することができる。ＰＶＣＣＰは、１つ以上の推定ヘパリン結合部位（Ｋ／Ｒ－－Ｘ－－Ｋ／Ｒ）を含むことができ、且つ／又は全体的な正の電荷を有する。いくつかの実施形態において、ＰＶＣＣＰは、少なくとも３つのＳＣＲモジュール（例えば、モジュール１～３）、例えば、４つのＳＣＲモジュールを含む。ＰＶＣＣＰタンパク質は、成熟ＰＶＣＣＰの前駆体であり得（すなわち、このタンパク質がウイルス感染した細胞において発現するとき正常に開裂するシグナル配列を含むことができる）、又は成熟型であり得る（例えば、シグナル配列を欠失している）。
【0160】
ワクシニア補体制御タンパク質（ＶＣＰ）は、Ｃ３及びＣ４へ結合してこれらの構成要素のＩ因子介在性開裂のための補因子として作用する能力を介して、並びに既存のコンバターゼの崩壊を促進することを介して、補体活性化の従来の経路を阻害することが示されている（Ｋｏｔｗａｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：８２７－３０，１９９０、ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６６：１２４５－５０，１９９２）。また、Ｃ３ｂをｉＣ３ｂへと開裂させ、それにより代替的な経路であるＣ３コンバターゼの形成を防止することによって、代替的な経路を阻害することも示されている（Ｓａｈｕ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，５５９６－６０４，１９９８）。ＶＣＰは、したがって、複数のステップで補体の活性化を遮断し、炎症促進性走化性因子Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、及びＣ５ａのレベルを低減させる。補体酵素の痘瘡阻害剤（ＳＰＩＣＥ）など、ＶＣＰのホモログ、例えば、４つのＳＣＲを含有するＳＰＩＣＥ関連ポリペプチドは、本明細書に説明される方法において使用することができる。その上、牛痘ウイルス（ＩＭＰ）又はサル痘ウイルス（ＭＣＰ）由来の補体制御タンパク質もまた、本明細書に説明される方法において使用することができる。
【0161】
ＶＣＣＰに加えて、補体経路において１つ以上のステップに干渉するいくつかの他のウイルスタンパク質が存在し、本明細書に説明される方法において使用することができ、例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＶＺＶ、ＰＲＶ、ＢＨＶ－１、ＥＨＶ－１、及びＥＨＶ－４由来の糖タンパク質ｇＣである（Ｓｃｈｒｅｕｒｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：２２５１－７，１９８８）。ＶＺＶの例外はあるが、これらのウイルスによってコードされるｇＣタンパク質は、Ｃ３ｂへ結合し（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：６３３－５，１９８４）、ｇＣ１（ＨＳＶ－１由来）は、従来の経路であるＣ３コンバターゼの崩壊を加速させ、Ｃ３に対するプロペルジン及びＣ５の結合を阻害する。上述のタンパク質は、ウイルス補体干渉タンパク質（ＶＣＩＰ）と集約的に称される。補体活性化の１つ以上のステップに干渉すること、補体構成要素の崩壊を加速させること、及び／又は補体調節タンパク質の活性を亢進することなど、様々な手段のいずれかによって、これらのＶＣＩＰは補体を阻害するといわれる。これらのタンパク質、又はその誘導体、その断片、若しくはその変異体のいずれかを、本明細書に説明される方法において治療薬として使用することができる。
【0162】
補体を阻害する追加の作用因子、モジュレーター、混合物、及び修飾物
様々な他の補体阻害剤を、本明細書に説明する方法の種々の実施形態において使用することができる。いくつかの実施形態において、補体阻害剤は、天然に生じる哺乳動物補体調節タンパク質又はその断片若しくは誘導体である。補体調節タンパク質は、例えば、ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＦＨ、又はＣＦＩであり得る。いくつかの実施形態において、補体調節ポリペプチドは、その天然に生じる状態で通常、膜結合型であるものである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインの一部又はすべてを欠失するかかるポリペプチドの断片が使用される。例えば、補体受容体１の可溶性形態（ｓＣＲ１）を使用することができる。例えば、ＴＰ１０又はＴＰ２０（Ａｖａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）として公知の化合物を使用することができる。Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）もまた使用される。いくつかの実施形態において、可溶性補体制御タンパク質、例えば、ＣＦＨが使用される。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、その溶解度を高めるよう修飾される。
様々な他の補体阻害剤を、本明細書に説明する方法の種々の実施形態において使用することができる。いくつかの実施形態において、補体阻害剤は、天然に生じる哺乳動物補体調節タンパク質又はその断片若しくは誘導体である。補体調節タンパク質は、例えば、ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＦＨ、又はＣＦＩであり得る。いくつかの実施形態において、補体調節ポリペプチドは、その天然に生じる状態で通常、膜結合型であるものである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインの一部又はすべてを欠失するかかるポリペプチドの断片が使用される。例えば、補体受容体１の可溶性形態（ｓＣＲ１）を使用することができる。例えば、ＴＰ１０又はＴＰ２０（Ａｖａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）として公知の化合物を使用することができる。Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）もまた使用される。いくつかの実施形態において、可溶性補体制御タンパク質、例えば、ＣＦＨが使用される。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、その溶解度を高めるよう修飾される。
【0163】
Ｃ１ｓの阻害剤が使用される（例えば、米国特許第６，５１５，００２号明細書は、Ｃ１ｓを阻害する化合物（フラニルアミジン及びチエニルアミジン、複素環式アミジン、並びにグアニジン）を説明しており、米国特許第６，５１５，００２号明細書及び同第７，１３８，５３０号明細書は、Ｃ１ｓを阻害する複素環式アミジンを説明しており、米国特許第７，０４９，２８２号明細書は、従来の経路の活性化を阻害するペプチドを説明しており、米国特許第７，０４１，７９６号明細書は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体受容体様分子、及び補体の活性化を阻害するためのその使用を開示しており、米国特許第６，９９８，４６８号明細書は、補体の活性化の抗Ｃ２／Ｃ２ａ阻害剤を開示しており、米国特許第６，６７６，９４３号明細書は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のヒト補体Ｃ３分解タンパク質を開示している）。
【0164】
２つ以上の補体阻害剤を用いる併用療法は、本明細書に説明される方法に包含される。この２つ以上の補体阻害剤は、同じ組成物中に提供され得る。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、２つ以上の異なる補体構成要素へ結合する。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、２つ以上の異なる可溶性補体タンパク質へ結合する。ある特定の実施形態において、補体阻害剤は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｂ因子、及びＤ因子から選択される少なくとも２つの補体タンパク質の活性化又は活性を阻害する。
【実施例】
【0165】
実施例１
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプラットフォームを用いた同時免疫沈降／免疫分析による尿細胞外小胞（ｕＥＶ）の特徴づけ。
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプラットフォームを用いた同時免疫沈降／免疫分析による尿細胞外小胞（ｕＥＶ）の特徴づけ。
【0166】
抗体で被覆したｘＭＡＰビーズのアレイを正準小胞マーカーＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１に対して使用して、尿からの個別のＥＶ部分セットを濃縮した。次いで、各ビーズセットを、部分セットの表現型を規定し、それを組織起源と結びつける他のバイオマーカーの存在について分析した。このように、非侵襲的「液体生検」法を構築して、差次的診断、予後評価、及び／又は処置に対する応答の縦断的な監視のために、特定の腎疾患のカギとなるバイオマーカーを試料採取及び監視した。
【0167】
電子顕微鏡法
電子顕微鏡法用の試料調製
１）新鮮な尿＋プロテアーゼ阻害剤で出発する。２．５Ｋ×ｇで遠心分離、上清を回収、
２）ＥｘｏＱｕｉｃｋ Ｕｌｔｒａ ＴＣキットを用いて３００μＬまで濃縮、
３）ＥＶ及び総粒子密度について生成物±ＥｘｏＧｌｏｗのＮＴＡ、
４）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０Ｋ ｍｖｃｏにおいて調製物を３０μＬまで濃縮、
５）等量のＫａｒｎｏｖｓｋｙ固定液を添加、
６）総粒子密度のみについてＮＴＡを反復、
７）撮像のために加工。
電子顕微鏡法用の試料調製
１）新鮮な尿＋プロテアーゼ阻害剤で出発する。２．５Ｋ×ｇで遠心分離、上清を回収、
２）ＥｘｏＱｕｉｃｋ Ｕｌｔｒａ ＴＣキットを用いて３００μＬまで濃縮、
３）ＥＶ及び総粒子密度について生成物±ＥｘｏＧｌｏｗのＮＴＡ、
４）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０Ｋ ｍｖｃｏにおいて調製物を３０μＬまで濃縮、
５）等量のＫａｒｎｏｖｓｋｙ固定液を添加、
６）総粒子密度のみについてＮＴＡを反復、
７）撮像のために加工。
【0168】
ＮＴＡによる尿ＥｘｏＱｕｉｃｋ ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔにおけるＥＶマーカーの相対量を図１に示す。尿のＥＶ粒子及び非ＥＶ粒子の電子顕微鏡画像を図２に示す。図３に示されている電子顕微鏡画像の対物のフェレット径の分布。
【0169】
質量分析
タンデムマスタグ（ＴＭＴ）標識
１）新鮮な尿＋プロテアーゼ阻害剤で出発する。３００×ｇで遠心分離し、上清を回収、
２）ＥｘｏＱｕｉｃｋ－Ｕｌｔｒａ ＴＣキットを用いて濃縮、
３）還元し、アミダートスルフヒドリル結合、
４）総タンパク質を８０％アセトン中で、－２０℃で一晩沈殿、
５）緩衝液中で再構成し、トリプシンで消化、
６）断片をＴＭＴ（商標）Ｉｓｏｂａｒｉｃ標識で標識、
７）試料を合わせ、乾燥、
８）Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００によって断片を分離、
９）ＯｒｂｉＴｒａｐ ＬｕｍｏｓによってＬＣ画分を分析。
タンデムマスタグ（ＴＭＴ）標識
１）新鮮な尿＋プロテアーゼ阻害剤で出発する。３００×ｇで遠心分離し、上清を回収、
２）ＥｘｏＱｕｉｃｋ－Ｕｌｔｒａ ＴＣキットを用いて濃縮、
３）還元し、アミダートスルフヒドリル結合、
４）総タンパク質を８０％アセトン中で、－２０℃で一晩沈殿、
５）緩衝液中で再構成し、トリプシンで消化、
６）断片をＴＭＴ（商標）Ｉｓｏｂａｒｉｃ標識で標識、
７）試料を合わせ、乾燥、
８）Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００によって断片を分離、
９）ＯｒｂｉＴｒａｐ ＬｕｍｏｓによってＬＣ画分を分析。
【0170】
ＰＳＭによる上位２５のタンパク質の相対量を図４に示す。
【0171】
【表1】
【0172】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの開発
ｄＵＣ試料の調製
１）新鮮な尿＋プロテアーゼ阻害剤で出発する。３００×ｇで遠心分離、上清を回収、
２）Ｓ３００をＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（商標）チューブへ移し、４℃、２００Ｋ×ｇで一晩遠心分離、
３）ペレットを冷ＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤＋２００ｍｇ／ｍＬ ＤＴＴ中で再懸濁しプール、
４）４℃、２００Ｋ×ｇで６時間遠心分離、
５）ペレットをＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤中で再懸濁、
６）分注し、－７０℃以下で保存。
ｄＵＣ試料の調製
１）新鮮な尿＋プロテアーゼ阻害剤で出発する。３００×ｇで遠心分離、上清を回収、
２）Ｓ３００をＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（商標）チューブへ移し、４℃、２００Ｋ×ｇで一晩遠心分離、
３）ペレットを冷ＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤＋２００ｍｇ／ｍＬ ＤＴＴ中で再懸濁しプール、
４）４℃、２００Ｋ×ｇで６時間遠心分離、
５）ペレットをＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤中で再懸濁、
６）分注し、－７０℃以下で保存。
【0173】
ＥＶのＦＳＬ－ビオチンタグづけ
ＦＳＬ－ビオチンは、疎水性表面をビオチンで標識するよう設計されたＫｏｄｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ構築物である。ＦＳＬ－ビオチンは、マレイミド担持型カルボキシメチルグリシン系リンカーへ結合したビオチン（ビタミンＢ７）のモノマーから構成され、これを次いで、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンの活性化型アジパート誘導体（ＫＯＤＥ Ｂｉｏｔｅｃｈウェブサイト：ｋｏｄｅｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｓａｌｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｉｎｆｏ．ｐｈｐ？ｉｄ＝１２９＆ｃａｔ＝ｒｄｔ（２０１８年９月２７日にアクセス））へ結合した。
ＦＳＬ－ビオチンは、疎水性表面をビオチンで標識するよう設計されたＫｏｄｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ構築物である。ＦＳＬ－ビオチンは、マレイミド担持型カルボキシメチルグリシン系リンカーへ結合したビオチン（ビタミンＢ７）のモノマーから構成され、これを次いで、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンの活性化型アジパート誘導体（ＫＯＤＥ Ｂｉｏｔｅｃｈウェブサイト：ｋｏｄｅｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｓａｌｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｉｎｆｏ．ｐｈｐ？ｉｄ＝１２９＆ｃａｔ＝ｒｄｔ（２０１８年９月２７日にアクセス））へ結合した。
【0174】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ設計
１）ｄＵＣで濃縮したｕＥＶの１Ｅ６ＥＶ／ウェルを使用、
２）等量の標識済みＭａｇＰｌｅｘ（商標）ビーズを添加、
３）４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベート、
４）ＰＢＳで２回洗浄
５）次のいずれかを添加
ａ．ＰＢＳ／ＢＳＡ中のビオチン化ポリクローナル抗体＋ＳＡＰＥ
ｂ．ＰＢＳ中のＦＳＬＢ＋ＳＡＰＥ
６）室温で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベート、
７）ＰＢＳで２回洗浄
８）シース液で２回洗浄、
９）Ｌｕｍｉｎｅｘ機で高ＰＭＴで読み取り。
１）ｄＵＣで濃縮したｕＥＶの１Ｅ６ＥＶ／ウェルを使用、
２）等量の標識済みＭａｇＰｌｅｘ（商標）ビーズを添加、
３）４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベート、
４）ＰＢＳで２回洗浄
５）次のいずれかを添加
ａ．ＰＢＳ／ＢＳＡ中のビオチン化ポリクローナル抗体＋ＳＡＰＥ
ｂ．ＰＢＳ中のＦＳＬＢ＋ＳＡＰＥ
６）室温で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベート、
７）ＰＢＳで２回洗浄
８）シース液で２回洗浄、
９）Ｌｕｍｉｎｅｘ機で高ＰＭＴで読み取り。
【0175】
【0176】
これらの結果は、ｕＥＶ及びＣＤ９＋部分セットについての本プロトコルの濃縮物が、腎組織起源のマーカーであるＰＯＤＸＬを含有していることを示している。感度及び特異性を改善した本プロトコルの最適化は、ｕＥＶ濃縮を改善し、より多量の腎バイオマーカーを同定すべきである。いったん最適化されると、本方法論は、健常ドナーと比較して差次的分析についての様々な疾患集団に適用され得る。
【0177】
実施例２
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプラットフォームを用いた尿細胞外小胞（ｕＥＶ）の同時免疫沈降／免疫分析による臓器及び組織における補体沈着の評価。
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプラットフォームを用いた尿細胞外小胞（ｕＥＶ）の同時免疫沈降／免疫分析による臓器及び組織における補体沈着の評価。
【0178】
抗体で被覆したｘＭＡＰビーズのアレイを、既定のネフロン領域に対して使用した。ポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）を糸球体足細胞用に、アクアポリン２（ＡＱＰ２）を曲尿細管用にした。次いで、各ビーズセットを起源細胞の原形質膜（ＰＭ）上に沈着した補体マーカーの存在について分析した。このように、差次的診断、予後評価、及び／又は処置に対する応答の縦断的な監視について、尿ＥＶを使用して、ネフロン中の補体の沈着を監視することができる。
【0179】
ＥＶは、その親細胞由来の表面マーカーを保有している。これらのマーカーを使用して、細胞起源に基づいたＥＶを免疫単離することができる。ＰＯＤＸＬは、糸球体における足細胞上でのみ作られる。ＡＱＰ２は、近位曲尿細管及び遠位曲尿細管に由来する。ＲＢＣ由来のグリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）を使用して、血漿から濾液へのＥＶの漏出を測定することができる。循環ＥＶ濃度は、炎症性容態及び血栓性容態において高くなっている。一部のＥＶは、その表面上にＣＤ５５及びＣＤ５９などの補体調節因子を保有している。細胞は、ＥＶを使用して、その表面から低濃度のＭＡＣ複合体を脱粒させることができる。ＥＶは、トロンビン生成のための座として作用し得る。
【0180】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの開発
アッセイ設計の目標
腎生検のための有用且つ実用的な代用物であるように、本アッセイは典型的には、（ａ）凍結試料で出発する能力、（ｂ）目標を達成するための最低限の加工を必要とする、（ｃ）複数の使用を同時に且つ一貫して分析する単純性及び能力、並びに（ｅ）膜の統合性を保持することなどの特徴を含む。このことは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ免疫沈降の前の小胞手段の事前濃縮選別が典型的には最小限となることを意味する。
アッセイ設計の目標
腎生検のための有用且つ実用的な代用物であるように、本アッセイは典型的には、（ａ）凍結試料で出発する能力、（ｂ）目標を達成するための最低限の加工を必要とする、（ｃ）複数の使用を同時に且つ一貫して分析する単純性及び能力、並びに（ｅ）膜の統合性を保持することなどの特徴を含む。このことは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ免疫沈降の前の小胞手段の事前濃縮選別が典型的には最小限となることを意味する。
【0181】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ設計
１）ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１：２に希釈した５０μＬ／ウェルの尿を使用、
２）１０００／ウェルの標識済みｘＭＡＰ（商標）ビーズを添加、
３）４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベート、
４）ＰＢＳで２回洗浄、
５）ＰＢＳ／ＢＳＡ中のビオチン化ポリクローナル抗体＋ＳＡＰＥを添加、
６）室温で穏やかに振盪しながら１時間インキュベート、
７）ＰＢＳで２回洗浄、
８）シース液で２回洗浄、
９）Ｌｕｍｉｎｅｘ機で、高ＰＭＴで読み取り。
１）ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１：２に希釈した５０μＬ／ウェルの尿を使用、
２）１０００／ウェルの標識済みｘＭＡＰ（商標）ビーズを添加、
３）４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベート、
４）ＰＢＳで２回洗浄、
５）ＰＢＳ／ＢＳＡ中のビオチン化ポリクローナル抗体＋ＳＡＰＥを添加、
６）室温で穏やかに振盪しながら１時間インキュベート、
７）ＰＢＳで２回洗浄、
８）シース液で２回洗浄、
９）Ｌｕｍｉｎｅｘ機で、高ＰＭＴで読み取り。
【0182】
【表2】
【0183】
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズは、子宮体特異的ＥＶを同定することができる。図７においてみられるように、Ｒｂ－α－ＰＯＤＸＬは、ＣＤ９又はＣＤ４０Ｌを含有するＥＶ上で検出することができるが、ＣＤ６３又はＣＤ８１を含有するＥＶ上では検出することができず、シグナルは、２つの異なるα－ＰＯＤＸＬ抗体を用いて認められ、両方のタンパク質が同じ構造上にある場合にのみ生じることができる。
【0184】
本結果は、ネフロン特異的ＥＶレベルが、疾患に伴って上昇することを示している。図８においてみられるように、対照尿においてよりも多量のＩｇＡＮ尿中ＰＯＤＸＬ＋ＥＶがあり、上昇は、ＣＤ９＋／ＰＯＤＸＬ＋集団及びＣＤ４０＋／ＰＯＤＸＬ集団の両方においてみられ、ＣＤ６３＋及びＣＤ８１＋ＥＶはなお陰性である。
【0185】
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズは、ＥＶ膜上の補体を測定することができる。図９においてみられるように、Ｃ３ｃ及びＣ５ｂ－９は、ＣＤ９＋ビーズ及びＰＯＤＸＬ＋ビーズの両方でＬＮ患者尿において検出されるが、ＣＤ６３＋又はＣＤ８１＋においては検出されず、これらの結果は、１０個のＬＮ試料、６個のＩｇＡＮ試料、及び７個の対照試料（データ非表示）において確認され、ＬＮ試料及びＩｇＡＮ試料の両方とも、対照試料と比較してＰＯＤＸＬ＋ＥＶ及びＡＱＰ２＋ＥＶの両方の上にＣ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ４及びＣ１ｑ沈着を有することができる。
【0186】
本結果はまた、糸球体Ｃ５ｂ－９沈着が、ラブリズマブ処置とともに低下することも示す。図１０にみられるように、ａＨＵＳ患者は、足細胞膜上にＣ３、Ｃ５ｂ－９、Ｃ１ｑ、及びＣ４のうちのいずれかの組み合わせを有し得、Ｃ３はラブリズマブ処置の間中、変化せず、Ｃ５ｂ－９及びＣ１ｑのＥＶ上でのレベルはラブリズマブ処置の間中、迅速に低減する。
【0187】
腎生検は、慢性腎疾患の差次的診断のための現行標準である。しかしながら、重症合併症についてのリスクは患者の選択及び検査の頻度を制限する。ＥＶは、処置の前及び間中の腎臓の膜の上での進行中の補体沈着を監視するための容易に接近可能な機会を提供する。また、ネフロンに沿った補体攻撃の正確な細胞レベルでの特定も可能となる。
【0188】
この技術は、腎臓及び尿を超えていずれかの生物学的試料へ拡張することができる。独特なＰＭマーカーとともに目的のいずれかの細胞型又は組織は補体の沈着を調べるために使用され得る。図１１は、本開示に従って分析され得るマーカーの概略図を提供する。
【0189】
実施例３：ＥＶデータを正規化するために修飾された膜結合フルオロホアを用いたバイオアッセイ
アッセイの頑強性を改善するために、各捕捉抗体で被覆されたＬＵＭＩＮＥＸビーズ上に単離された膜小胞の数を測定することは重要である。いくつかの態様において、「正規化」ステップは、個々のドナー内及びドナー間で、ビーズあたりの小胞の、及び試料マトリックス１ｍＬあたりの小胞の変化により行われる。したがって、修飾された膜結合フルオロホア－システイン－リジン－パルムトイル（ｐａｌｍｔｏｙｌ）基（ｍＣＬＩＮＧ、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７１０－ＭＣＫ）がアッセイを改善し得ることが企図された。一態様において、ｍＣＬＩＮＧを、ビオチニル化を介して修飾し、修飾されたｍＣＬＩＮＧを、免疫ビーズを保続したＥＶの複製ウェル内の各試験試料へ添加した。各ビーズセットを洗浄した後、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡ－ＰＥ）を添加し、蛍光強度をｍＣＬＩＮＧ試料及び符合する分析物試料について測定した。
アッセイの頑強性を改善するために、各捕捉抗体で被覆されたＬＵＭＩＮＥＸビーズ上に単離された膜小胞の数を測定することは重要である。いくつかの態様において、「正規化」ステップは、個々のドナー内及びドナー間で、ビーズあたりの小胞の、及び試料マトリックス１ｍＬあたりの小胞の変化により行われる。したがって、修飾された膜結合フルオロホア－システイン－リジン－パルムトイル（ｐａｌｍｔｏｙｌ）基（ｍＣＬＩＮＧ、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７１０－ＭＣＫ）がアッセイを改善し得ることが企図された。一態様において、ｍＣＬＩＮＧを、ビオチニル化を介して修飾し、修飾されたｍＣＬＩＮＧを、免疫ビーズを保続したＥＶの複製ウェル内の各試験試料へ添加した。各ビーズセットを洗浄した後、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡ－ＰＥ）を添加し、蛍光強度をｍＣＬＩＮＧ試料及び符合する分析物試料について測定した。
【0190】
一試験において、尿ＥＶを健常ボランティア（対照）並びにループス腎炎（ＬＮ）患者及びＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）患者から取得し、抗体捕捉ビーズのパネルで濃縮し、次いで、（ａ）ビオチン化ｍＣＬＩＮＧを用いた総ＥＶ、又は（ｂ）Ｑｕｉｄｅｌ抗体Ａ７１０（モノクローナル、新生抗原特異的）を用いた補体ｉＣ３ｂのいずれかについて複製ウェルにおいて表面表現型分類を行った。分析物（ｉＣ３ｂ）について正規化したシグナルは、ｉＣ３ｂシグナル及びビオチン化したｍＣＬＩＮＧについてのシグナルの比（シグナル＝（ｂ）／（ａ））を取ることによって生成された。結果を、ｉＣ３ｂについての代表的な正規化したＥＶデータである図１２に示す。正規化した応答（ｙ軸に示す）は、各マーカーについて報告された平均蛍光強度値（ｘ軸に示す）を、対応するｍＣＬＩＮＧ平均蛍光強度値によって除したものを表す。
【0191】
対照は、健常ドナーからの同等の試料を表す。患者（ＬＮ又はＩｇＡＮ）は、各マーカーについて一緒に提示される。
【0192】
データは、ある特定のＥＶ、例えばＣＤ９及びＰＯＤＸＬについて陽性であるものが、（図１２において横方向の破線によって示されるような）背景レベルを上回る補体（例えば、ｉＣ３ｂ）沈着を選択的に含有することを示している。データは、ｉＣ３ｂなどの活性化型補体経路タンパク質が、それぞれ２つの疾患部分セットＬＮ及びＩｇＡＮから得られるＥＶにおいて示されるように、補体性疾患の病理生理学的特徴と関係していることを示している。
【0193】
本明細書のいたるところで与えられるあらゆる最大数値限界が、あらゆるより低い数値限界を含むことは、かかるより高い数値限界が明らかに本明細書に記載されているかのように理解されるべきである。本明細書のいたるところで与えられるあらゆる最小数値限界は、あらゆるより高い数値限界を、かかるより高い数値限界がすべて明らかに本明細書に記載されているかのように含むであろう。本明細書のいたるところで与えられるあらゆる数的範囲は、かかるより狭い数的範囲がすべて明らかに本明細書に記載されているかのように、かかるより広い数的範囲内に収まるあらゆるより狭い数的範囲を含むであろう。
【0194】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。方法及び材料は、本発明における使用のために本明細書に説明されている。当該技術分野で公知の他の適切な方法及び材料も使用することができる。材料、方法、及び例は、実例であるに過ぎず、制限しているよう意図するものではない。引用文献、特許出願、特許、配列、データベースエントリー（例えば、ＰＵＢＭＥＤ、ＮＣＢＩ、又はＵＮＩＰＲＯＴ受入番号）、及び本明細書で述べられている他の参考文献は、その全体が参照により援用されている。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、優先される。
【0195】
本発明の特定の実施形態が例示及び説明されてきたが、様々な他の変更及び改変が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得ることは当業者に明白であろう。それゆえ、添付の特許請求の範囲において、本発明の範囲内であるかかる変更及び改変をすべて網羅するよう意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】