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特表2023-525665ヒトＩＬ－４Ｒαにおける特異的エピトープとの抗体結合及び抗体の適用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-19
(54)【発明の名称】ヒトＩＬ－４Ｒαにおける特異的エピトープとの抗体結合及び抗体の適用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230612BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230612BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230612BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230612BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230612BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230612BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230612BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230612BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230612BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230612BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230612BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230612BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230612BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20230612BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230612BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230612BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20230612BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230612BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230612BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230612BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230612BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230612BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230612BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/15
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61K48/00
A61P1/00
A61P1/04
A61P3/10
A61P11/00
A61P11/02
A61P11/06
A61P17/00
A61P17/04
A61P17/06
A61P19/02
A61P25/00
A61P27/02
A61P43/00 111
A61K35/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022564230
(86)(22)【出願日】2021-04-19
(85)【翻訳文提出日】2022-12-20
(86)【国際出願番号】 CN2021088139
(87)【国際公開番号】W WO2021213329
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】202010331685.3
(32)【優先日】2020-04-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521414818
【氏名又は名称】スーチョウ コネクト バイオファーマシューティカルズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100122471
【弁理士】
【氏名又は名称】籾井 孝文
(74)【代理人】
【識別番号】100193172
【弁理士】
【氏名又は名称】上川 智子
(72)【発明者】
【氏名】ヤン シン
(72)【発明者】
【氏名】チャン リミン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン ジエ
(72)【発明者】
【氏名】シァ ジン
(72)【発明者】
【氏名】パン ウービン
(72)【発明者】
【氏名】チェン ウェイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA86X
4B065AA87X
4B065AA87Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB19
4B065BD39
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084MA52
4C084MA55
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA02
4C084ZA33
4C084ZA34
4C084ZA59
4C084ZA66
4C084ZA89
4C084ZA96
4C084ZB07
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4C084ZB15
4C084ZB26
4C084ZC35
4C084ZC41
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085EE01
4C085GG08
4C085GG10
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087CA12
4C087MA52
4C087MA55
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA02
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4C087ZA59
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4C087ZA96
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4C087ZB15
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4C087ZC41
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA50
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
ヒトＩＬ－４Ｒ抗体又はその抗原結合フラグメントを開示する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ－４Ｒαと特異的に結合し、ヒトＩＬ－４Ｒαの特異的エピトープと結合する。さらに、本発明では、ヒトＩＬ－４／ＩＬ－１３シグナル伝達経路に対するヒトＩＬ－４Ｒ結合剤若しくは遮断剤のスクリーニングにおける該エピトープの使用、又は該特異的エピトープを用いることによる結合剤若しくは遮断剤の有効性の評定における使用も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトインターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）に位置し、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｄ９２、Ｖ９４、Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６、Ｃ２０７、Ｑ６３、及びＬ６４を含むエピトープに結合する、抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
前記エピトープが、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｄ９２、Ｖ９４、及びＤ９７を含み、より好ましくは、前記エピトープが、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：（１）Ｄ９２、
（２）Ｄ９７、
（３）Ｄ９２、Ｖ９４及びＤ９７、
（４）Ｄ９２及びＶ９４、
（５）Ｄ９２及びＤ９７、又は、
（６）Ｖ９４及びＤ９７、
を含み、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：（ｉ）Ｑ６３及びＬ６４を含むヒトＩＬ－４Ｒαのエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して異種間結合活性を有さず、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、カニクイザルＩＬ－４Ｒに結合せず、より好ましくはカニクイザルＩＬ－４Ｒαに結合せず、更に好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列に結合せず、好ましくは前記エピトープが、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６を含み、好ましくは前記エピトープが、１．Ｌ６７及びＬ６８、
２．Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６、又は、
３．Ａ９６、
を含み、
より好ましくは、前記エピトープが、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
（Ａ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｂ）Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｃ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｄ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＣ２０７、又は、
（Ｅ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＨ１５６、
を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
前記エピトープが、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：（Ｐ－１）Ｄ９７、Ｌ６７及びＬ６８、
（Ｐ－２）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＤ９２、
（Ｐ－３）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８及びＤ９２、
（Ｐ－４）Ｄ９７、Ｑ６３及びＬ６４、
（Ｐ－５）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４及びＤ９２、
（Ｐ－６）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｄ９２及びＡ９６、又は、
（Ｐ－７）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｌ６７及びＬ６８、
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域において、以下：（１）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（２）配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（３）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６、配列番号５７及び配列番号６２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（４）配列番号４４、配列番号４７及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（５）配列番号４８、配列番号４９及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（６）配列番号４４、配列番号５０及び配列番号５１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６、配列番号５７及び配列番号６９に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は、
（７）配列番号５２、配列番号３６及び配列番号３７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
の重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３とを含み、
好ましくは、前記重鎖可変領域が、以下の配列：配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２３若しくは配列番号２７に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は好ましくは、前記軽鎖可変領域が、以下の配列：配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３３若しくは配列番号３４に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、（１）前記重鎖可変領域が、配列番号３に示すアミノ酸配列又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４に示すアミノ酸配列又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（２）前記重鎖可変領域が、配列番号７に示すアミノ酸配列又は配列番号７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示すアミノ酸配列又は配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（３）前記重鎖可変領域が、配列番号９に示すアミノ酸配列又は配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１０に示すアミノ酸配列又は配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（４）前記重鎖可変領域が、配列番号１１に示すアミノ酸配列又は配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１２に示すアミノ酸配列又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（５）前記重鎖可変領域が、配列番号１５に示すアミノ酸配列又は配列番号１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示すアミノ酸配列又は配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（６）前記重鎖可変領域が、配列番号１７に示すアミノ酸配列又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１８に示すアミノ酸配列又は配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（７）前記重鎖可変領域が、配列番号１９に示すアミノ酸配列又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２０に示すアミノ酸配列又は配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（８）前記重鎖可変領域が、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３４に示すアミノ酸配列又は配列番号３４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（９）前記重鎖可変領域が、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３に示すアミノ酸配列又は配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１０）前記重鎖可変領域が、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２８に示すアミノ酸配列又は配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１１）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３４に示すアミノ酸配列又は配列番号３４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１２）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３に示すアミノ酸配列又は配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、
（１３）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２８に示すアミノ酸配列又は配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトインターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に、好ましくはヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）に、より好ましくはヒト可溶型ＩＬ－４Ｒα（ｓＩＬ－４Ｒα）に結合し、好ましくは、前記抗体がモノクローナル抗体又は一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記抗体がマウス抗体、キメラ抗体又は完全若しくは部分的にヒト化された抗体であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントがＩＬ－４Ｒ又はＩＬ－４Ｒαに特異的に結合することができる抗体のフラグメントである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト又はマウスの定常領域、好ましくはヒト又はマウスの重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を更に含み、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが重鎖及び軽鎖を含み、
好ましくは、前記抗体が免疫グロブリン、特にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、例えば、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、より好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプであり、
より好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥの重鎖定常領域、及び／又はカッパ型若しくはラムダ型の軽鎖定常領域を含み、例えば、前記重鎖定常領域がＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）型のものであり、前記軽鎖定常領域がカッパ型のものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、及び／又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項10】
請求項９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項11】
請求項９に記載の核酸分子若しくは請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞、又は請求項９に記載の核酸分子若しくは請求項１０に記載のベクターで形質転換若しくはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、又は請求項１１に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項13】
前記組成物が医薬組成物であり、好ましくは、前記医薬組成物が、薬学的に許容され得る賦形剤を含み、好ましくは、前記医薬組成物が、経口投与用及び非経口投与用の剤形に調製される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に関連する疾患若しくは障害、又はヒトインターロイキン４（ＩＬ－４）若しくはヒトインターロイキン１３（ＩＬ－１３）のシグナル伝達経路に関連する疾患若しくは障害の予防、治療又は改善のための医薬品の製造における、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、又は請求項１２若しくは１３に記載の組成物の使用。
【請求項15】
疾患又は障害を予防、治療、又は改善する方法であって、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、又は請求項１２若しくは１３に記載の組成物を（例えば、治療有効量）、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記疾患又は障害が、ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に関連しているか、又はヒトインターロイキン４（ＩＬ－４）若しくはヒトインターロイキン１３（ＩＬ－１３）のシグナル伝達経路に関連している、方法。
【請求項16】
前記疾患又は障害が、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、腫瘍、又は癌を含み、好ましくは、前記疾患又は障害が、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患、例えば皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）、喘息（例えば、２型炎症性喘息等の炎症性喘息）、慢性食道炎（例えば、好酸球性食道炎）、湿疹、鼻炎（例えば、アレルギー性鼻炎）、鼻ポリープ（例えば、鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎）、結膜炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、炎症性神経障害、関節炎（例えば、関節リウマチ）、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、乾癬、又はインスリン及び非インスリン依存性糖尿病、並びにその他の免疫又はアレルギーに関連する疾患を含み、
或いは、好ましくは、前記疾患又は障害が、腸癌、黒色腫、皮膚癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、肛門癌、神経膠芽腫、星細胞腫、肝臓癌、腎臓癌、食道癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、骨髄腫、骨癌、エイズ関連カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、前立腺腫瘍、リンパ腫、及び膵臓癌等の腫瘍又は癌を含む、請求項１４に記載の使用又は請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記医薬品が、請求項１６に規定される１つ以上の疾患又は障害の予防、治療又は改善のためのものであり、好ましくは、前記被験体が哺乳動物、好ましくは霊長類であり、より好ましくは、前記被験体がヒトである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の使用又は方法。
【請求項18】
ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に特異的に結合する結合剤又はヒトインターロイキン４（ＩＬ－４）若しくはヒトインターロイキン１３（ＩＬ－１３）のシグナル伝達経路を特異的に遮断する遮断剤をスクリーニングする方法であって、スクリーニングされる薬剤をヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部と接触させる工程と、次いで、該薬剤が請求項１～３のいずれか一項に規定されるエピトープと結合可能かどうかを検出する工程とを含む、方法。
【請求項19】
薬剤の有効性を評価する方法であって、評価される薬剤をヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）又はその一部と接触させる工程と、次いで、該薬剤が請求項１～３のいずれか一項に規定されるエピトープと結合可能かどうかを検出する工程とを含む、方法。
【請求項20】
スクリーニング又は評価される前記薬剤が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体等の抗体であり、好ましくは、前記抗体が、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部を免疫原として動物に免疫することによって得られ、
好ましくは、前記薬剤が前記エピトープに結合可能かどうかを検出することが、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部の部位特異的変異導入により前記エピトープによって含まれる１つ以上のアミノ酸残基を変異させること、変異後の前記ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する及び薬剤の結合活性又は結合親和性を変異前のものと比較すること、及び前記変異したヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する前記薬剤の結合活性又は結合親和性が著しく低いか、更には失われている場合、前記薬剤が前記エピトープに結合可能であると同定することによって行われる、請求項１８に記載の結合剤若しくは遮断剤をスクリーニングする方法、又は請求項１９に記載の薬剤の有効性を評価する方法。
【請求項21】
前記方法が、１）ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部の部位特異的変異導入により前記エピトープによって含まれる１つ以上のアミノ酸残基を変異させ、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部の変異体を得る工程と、
２）スクリーニングされる薬剤又は評価される薬剤を、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部、及びヒトＩＬ－４Ｒの変異体又はその一部とそれぞれ接触させ、それに対する結合活性又は結合親和性をそれぞれ検出する工程と、
３）前記変異したヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する前記薬剤の結合活性又は結合親和性が、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する前記薬剤の結合活性又は結合親和性と比較して著しく低いか、更には失われている場合、前記薬剤が前記エピトープに結合可能であると同定する工程と、
を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の結合剤若しくは遮断剤をスクリーニングする方法、又は薬剤の有効性を評価する方法。
【請求項22】
工程１）において前記エピトープによって含まれる１つ以上のアミノ酸残基をアラニン又は対応する位置のカニクイザルインターロイキン４受容体のアミノ酸残基に変異させ、ヒトＩＬ－４Ｒの変異体又はその一部を得て、好ましくは、前記ヒトＩＬ－４Ｒの一部が、ヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖、更にヒトｓＩＬ－４Ｒαであり、
好ましくは、前記方法がヒトＩＬ－４Ｒαを用いて行われ、ヒトＩＬ－４Ｒαの変異体が得られ、
好ましくは、前記方法がヒトｓＩＬ－４Ｒαを用いて行われ、工程１）における前記変異体として、本明細書の表３に列挙される１つ以上のヒトｓＩＬ－４Ｒαの変異体を使用する、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の結合剤若しくは遮断剤をスクリーニングする方法、又は薬剤の有効性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年４月２４日に出願された中国特許出願第２０２０１０３３１６８５．３号の優先権の利益を主張し、その全体が引用することで本明細書に包含される。
本出願は、２０２０年４月２４日に出願された中国特許出願第２０２０１０３３１６８５．３号の優先権の利益を主張し、その全体が引用することで本明細書に包含される。
【0002】
本開示は、バイオ医薬の分野に関し、特に、ヒトＩＬ－４Ｒαの特異的エピトープに結合可能な抗体及びその適用に関する。
【背景技術】
【0003】
ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）は、全身の様々な組織及び臓器、特に扁桃、虫垂、リンパ節、脾臓、及び骨髄等の免疫器官に広く発現されるＩ型膜貫通型タンパク質である。ＩＬ－４Ｒは、インターロイキン４（ＩＬ－４）及びインターロイキン１３（ＩＬ－１３）等のリガンドに結合すると、例えば、Ｔｈ２細胞の分化促進、Ｂ細胞によるＩｇＥ抗体の分泌調節、及びマクロファージの代替活性化の刺激等、様々な免疫調節作用を発揮することができる。
【0004】
ＩＬ－４Ｒは２本のポリペプチド鎖で構成されるヘテロダイマーであり、そのうちの１本のα鎖（ＩＬ－４Ｒα）はＩＬ－４に対して高い親和性を持つ。また、ＩＬ－４Ｒαは、ＩＬ－１３の細胞表面受容体のα鎖（ＩＬ－１３Ｒα）と別の形態のＩＬ－４Ｒヘテロダイマーを形成しているため、ＩＬ－１３に対しても高い親和性を持つ。
【0005】
ＩＬ－４Ｒαからは、可溶型（ｓＩＬ－４Ｒα）のタンパク質を製造することができる。かかる可溶型のタンパク質は、例えば、ＩＬ－４が媒介する細胞増殖及びＴ細胞が媒介するＩＬ－５のアップレギュレーション等、炎症に関連する様々なシグナル伝達を阻害することができる。したがって、このタンパク質を標的とした遮断抗体は、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、喘息又は湿疹、及びその他の疾患の治療及び緩和に有益である。また、ＩＬ－４及びＩＬ－１３はいずれも、活性化されたＴ細胞、単球、肥満細胞、好塩基球、及び好酸球によって最も多く産生される、炎症に関わる様々な反応に関与する非常に幅広い生物活性を持つサイトカインである。この２つのインターロイキンは、生物学的機能において多くの共通点があり、主な生物学的作用として、ＴＨ２細胞の分化及び増殖に対する刺激作用、活性化Ｂ細胞によるＩｇＥ抗体分泌に対する刺激作用等が挙げられる。ＩＬ－４及びＩＬ－１３は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、腫瘍、及びその他の疾患の免疫反応を媒介する上で非常に重要な役割を担っていることが研究により明らかにされており、常に人々が注目する研究ホットスポットの１つとなっている。
【0006】
ｓＩＬ－４ＲαはＩＬ－４への結合を支配し、他のサイトカインとも関連することから、現在、ｓＩＬ－４Ｒαを標的とした抗体の研究が多く行われており、この標的に対するヒトモノクローナル抗体が喘息、アトピー性皮膚炎等の疾患の緩和及び治療に有効であることが臨床的に実証されている。しかしながら、免疫反応におけるｓＩＬ－４Ｒαのエピトープはほとんど研究されておらず、特異的なエピトープはまだ明確に分かっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記技術的課題に対して、本発明者らは、ｓＩＬ－４Ｒαのエピトープについて検討した。本発明者らは、新たに得られた抗体がヒトｓＩＬ－４Ｒα及びカニクイザルｓＩＬ－４Ｒαと反応した場合に抗体によって示される種特異性に従い、ｓＩＬ－４Ｒαの幾つかの位置を選択し、その位置を変異させて関連する実験を行うことで、結合エピトープの幾つかの重要なアミノ酸を見出した。エピトープに関するこれらの結果は、ｓＩＬ－４Ｒα及び関連抗体に関する更なる研究にとって非常に重要である。
【0008】
したがって、本開示の目的は、ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することであり、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）の特異的エピトープに特異的に結合する。
【0009】
本開示によって提供される抗体又はその抗原結合フラグメントに基づいて、本開示の別の目的は、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントにおけるキードメイン（複数の場合もある）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供すること、核酸分子を含むベクターを提供すること、該ベクターを含む宿主細胞を提供すること、抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法を提供すること、抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供すること、及び抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は医薬組成物の医薬への使用を提供することである。
【0010】
本開示によって提供されるヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖の特異的エピトープに基づいて、本開示の更なる目的は、ヒトＩＬ－４Ｒの結合剤若しくはヒトＩＬ－４／ＩＬ－１３シグナル伝達経路の遮断剤の調製における該エピトープの使用、又は結合剤若しくは遮断剤の有効性の評価における該エピトープの使用を提供することである。
【0011】
本開示は、以下の技術的解決策を提供する。
【0012】
１つの態様では、本開示は、ヒトインターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）に位置し、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｄ９２、Ｖ９４、Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６、Ｃ２０７、Ｑ６３、及びＬ６４を含むエピトープに結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【0013】
好ましくは、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｄ９２、Ｖ９４、及びＤ９７を含む。
【0014】
本開示の特定の実施の形態によれば、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
（１）Ｄ９２、
（２）Ｄ９７、
（３）Ｄ９２、Ｖ９４及びＤ９７、
（４）Ｄ９２及びＶ９４、
（５）Ｄ９２及びＤ９７、又は、
（６）Ｖ９４及びＤ９７、
を含む。
（１）Ｄ９２、
（２）Ｄ９７、
（３）Ｄ９２、Ｖ９４及びＤ９７、
（４）Ｄ９２及びＶ９４、
（５）Ｄ９２及びＤ９７、又は、
（６）Ｖ９４及びＤ９７、
を含む。
【0015】
及び／又は、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：（ｉ）Ｑ６３及びＬ６４を含むヒトＩＬ－４Ｒαのエピトープに結合する。
【0016】
さらに、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して異種間結合活性を有しない。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、カニクイザルＩＬ－４Ｒに結合せず、より好ましくはカニクイザルＩＬ－４Ｒαに結合せず、更に好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列に結合しない。
【0017】
上記異種間結合活性に関して、本開示は、ヒトインターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）上に位置し、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６を含むエピトープに結合する。
【0018】
好ましくは、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
１．Ｌ６７及びＬ６８、
２．Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６、又は、
３．Ａ９６、
を含む。
１．Ｌ６７及びＬ６８、
２．Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６、又は、
３．Ａ９６、
を含む。
【0019】
本開示の特定の実施の形態によれば、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
（Ａ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｂ）Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｃ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｄ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＣ２０７、又は、
（Ｅ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＨ１５６、
を含む。
（Ａ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｂ）Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｃ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｄ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＣ２０７、又は、
（Ｅ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＨ１５６、
を含む。
【0020】
特に好ましくは、本開示によるエピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
（Ｐ－１）Ｄ９７、Ｌ６７及びＬ６８、
（Ｐ－２）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＤ９２、
（Ｐ－３）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８及びＤ９２、
（Ｐ－４）Ｄ９７、Ｑ６３及びＬ６４、
（Ｐ－５）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４及びＤ９２、
（Ｐ－６）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｄ９２及びＡ９６、又は、
（Ｐ－７）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｌ６７及びＬ６８、
を含む。
（Ｐ－１）Ｄ９７、Ｌ６７及びＬ６８、
（Ｐ－２）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＤ９２、
（Ｐ－３）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８及びＤ９２、
（Ｐ－４）Ｄ９７、Ｑ６３及びＬ６４、
（Ｐ－５）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４及びＤ９２、
（Ｐ－６）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｄ９２及びＡ９６、又は、
（Ｐ－７）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｌ６７及びＬ６８、
を含む。
【0021】
本開示で提供される抗体の抗原ＩＬ－４Ｒαへの結合を検出したところ、本開示の抗体は、ＥＣ５０値が５０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌ以下のｓＩＬ－４Ｒαへの結合活性を有することが判明した。また、１００μｌ×２５００ｎｇ／ｍｌの本開示の抗体は、１００μｌ×０．５μｇ／ｍｌでコーティングされたｓＩＬ－４Ｒα－９７に対して結合活性を示さず、ｓＩＬ－４Ｒα－９７は、ｓＩＬ－４Ｒα中の９７位のアミノ酸残基ＤからＡへの変異により得られることが分かった。さらに、１００μｌ×２５００ｎｇ／ｍｌの本開示の抗体は、１００μｌ×０．５μｇ／ｍｌでコーティングされたｓＩｌ－４Ｒα－ＱＳＭＤＨ及びｓＩｌ－４Ｒα－６３／６４から選択される少なくとも１つの変異抗原に対して結合活性を全く示さないか又は著しく低い結合活性を示すことがわかった。結合活性を、本開示の「発明を実施するための形態」のサブタイトル下の「（Ｉ）結合活性検出方法」の部分に記載された手順に従って測定した。
【0022】
さらに、本開示で提供される抗体は、ＩＬ－４又はＩＬ－１３のＩＬ－４Ｒへの結合を遮断することができるため、ＩＬ－４若しくはＩＬ－１３のＩＬ－４Ｒへの結合の遮断剤、又はＩＬ－４／ＩＬ－１３シグナル伝達経路の遮断剤として使用することができる。
【0023】
よって、含まれるドメインのアミノ酸配列に関して、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下のような重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３との組合せ：
（１）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（２）配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（３）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６、配列番号５７及び配列番号６２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（４）配列番号４４、配列番号４７及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（５）配列番号４８、配列番号４９及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（６）配列番号４４、配列番号５０及び配列番号５１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６、配列番号５７及び配列番号６９に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は、
（７）配列番号５２、配列番号３６及び配列番号３７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
を含む。
（１）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（２）配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（３）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６、配列番号５７及び配列番号６２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（４）配列番号４４、配列番号４７及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（５）配列番号４８、配列番号４９及び配列番号４６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
（６）配列番号４４、配列番号５０及び配列番号５１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６、配列番号５７及び配列番号６９に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は、
（７）配列番号５２、配列番号３６及び配列番号３７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
を含む。
【0024】
本明細書で提供される軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲの組合せは、本開示で提供される特定の抗体又はそのフラグメントに由来する。所与の抗体又はその抗原結合フラグメントの可変領域アミノ酸配列に含まれるＣＤＲは、当業者が日常的に決定することができる。例えば、本開示の特定の実施の形態によれば、ＩＭＧＴツールを使用して、可変領域のアミノ酸配列におけるＣＤＲを定義した。当該技術分野で既知の方法によって定義された軽鎖ＣＤＲ及び重鎖のＣＤＲの組合せは、全て本開示の範囲に包含される。
【0025】
本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、好ましくは、重鎖可変領域は、以下の配列：配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２３若しくは配列番号２７に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は好ましくは、軽鎖可変領域は、以下の配列：配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３３若しくは配列番号３４に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0026】
本開示の特定の実施の形態によれば、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、
（１）重鎖可変領域は、配列番号３に示すアミノ酸配列又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（２）重鎖可変領域は、配列番号７に示すアミノ酸配列又は配列番号７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号８に示すアミノ酸配列又は配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（３）重鎖可変領域は、配列番号９に示すアミノ酸配列又は配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０に示すアミノ酸配列又は配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（４）重鎖可変領域は、配列番号１１に示すアミノ酸配列又は配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１２に示すアミノ酸配列又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（５）重鎖可変領域は、配列番号１５に示すアミノ酸配列又は配列番号１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１６に示すアミノ酸配列又は配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（６）重鎖可変領域は、配列番号１７に示すアミノ酸配列又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１８に示すアミノ酸配列又は配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（７）重鎖可変領域は、配列番号１９に示すアミノ酸配列又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２０に示すアミノ酸配列又は配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（８）重鎖可変領域は、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３４に示すアミノ酸配列又は配列番号３４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（９）重鎖可変領域は、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３３に示すアミノ酸配列又は配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１０）重鎖可変領域は、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２８に示すアミノ酸配列又は配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１１）重鎖可変領域は、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３４に示すアミノ酸配列又は配列番号３４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１２）重鎖可変領域は、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３３に示すアミノ酸配列又は配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は
（１３）重鎖可変領域は、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２８に示すアミノ酸配列又は配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（１）重鎖可変領域は、配列番号３に示すアミノ酸配列又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（２）重鎖可変領域は、配列番号７に示すアミノ酸配列又は配列番号７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号８に示すアミノ酸配列又は配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（３）重鎖可変領域は、配列番号９に示すアミノ酸配列又は配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０に示すアミノ酸配列又は配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（４）重鎖可変領域は、配列番号１１に示すアミノ酸配列又は配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１２に示すアミノ酸配列又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（５）重鎖可変領域は、配列番号１５に示すアミノ酸配列又は配列番号１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１６に示すアミノ酸配列又は配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（６）重鎖可変領域は、配列番号１７に示すアミノ酸配列又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１８に示すアミノ酸配列又は配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（７）重鎖可変領域は、配列番号１９に示すアミノ酸配列又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２０に示すアミノ酸配列又は配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（８）重鎖可変領域は、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３４に示すアミノ酸配列又は配列番号３４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（９）重鎖可変領域は、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３３に示すアミノ酸配列又は配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１０）重鎖可変領域は、配列番号２７に示すアミノ酸配列又は配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２８に示すアミノ酸配列又は配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１１）重鎖可変領域は、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３４に示すアミノ酸配列又は配列番号３４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（１２）重鎖可変領域は、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３３に示すアミノ酸配列又は配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は
（１３）重鎖可変領域は、配列番号２３に示すアミノ酸配列又は配列番号２３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２８に示すアミノ酸配列又は配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0027】
特に、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、その両方が、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のような配置で上記ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。更に代替的には、「少なくとも７５％の同一性」によるアミノ酸配列中の２５％までの差は、重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域の任意のフレームワーク領域、又は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域以外の本開示による抗体若しくはその抗原結合フラグメントの任意のドメイン若しくは配列中に存在し得る。この差は、任意の位置におけるアミノ酸の欠失、付加又は置換に起因するものであってもよく、その置換は保存的置換であっても非保存的置換であってもよい。
【0028】
好ましくは、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトインターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に、好ましくはヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）に、より好ましくはヒト可溶型ＩＬ－４Ｒα（ｓＩＬ－４Ｒα）に結合する。
【0029】
好ましくは、本開示による抗体は、モノクローナル抗体又は一本鎖抗体であり得る。好ましくは、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、又は完全若しくは部分的にヒト化された抗体である。好ましくは、抗原結合フラグメントは、標的に特異的に結合可能な抗体のフラグメントである。例えば、抗原結合フラグメントは、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又はＦｖフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）である。
【0030】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト又はマウスの定常領域、好ましくは、ヒト又はマウスの重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を更に含む。更に好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは重鎖及び軽鎖を含む。例えば、抗体は、免疫グロブリン、特にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、例えば、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、より好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプである。
【0031】
好ましくは、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥの重鎖定常領域、及び／又はカッパ型若しくはラムダ型の軽鎖定常領域を含む。例えば、重鎖定常領域はＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）型のものであり、軽鎖定常領域はカッパ型のものである。更に好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、配列番号７０若しくは配列番号７１に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、又は配列番号７０若しくは配列番号７１に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、モノクローナル抗体の軽鎖定常領域は、配列番号７２に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、又は配列番号７２に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0032】
本開示の文脈で、「少なくとも７５％の同一性」は、７５％、８０％、８５％、９０％、更には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性等の７５％～１００％の間の任意のパーセント同一性である。
【0033】
別の態様では、本開示はまた、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、及び／又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【0034】
本開示による核酸分子は、ベクターにクローニングすることができ、さらにこのベクターは宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトされる。したがって、更なる態様では、本開示はまた、本開示による核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、人工染色体、ファージベクター等であり得る。
【0035】
本開示によるベクター又は核酸分子は、保存又は抗体発現等のために宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトするために使用され得る。したがって、更なる態様では、本開示は、本開示による核酸分子及び／又はベクターを含む宿主細胞、又は本開示による核酸分子及び／又はベクターで形質転換若しくはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞又は真核生物細胞、例えば細菌若しくは昆虫、真菌、植物又は動物の細胞であり得る。
【0036】
本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて得ることができる。例えば、抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖を本開示による核酸分子から取得することができ、次いでそれらを抗体の任意の他のドメインと集合させることにより、抗体を得る。或いは、本開示による宿主細胞を、宿主細胞が抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖を発現し、それらを抗体に集合させることを可能にする条件下で培養する。任意に、上記方法は、産生された抗体を回収する工程を更に含んでもよい。
【0037】
本開示による抗体又はその抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞は、実際に必要とされる様々な目的のために、組成物、より詳細には医薬製剤等の医薬組成物に含まれ得る。したがって、更なる態様では、本開示は、本開示による抗体若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞と、任意に薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、組成物、好ましくは医薬組成物も提供する。
【0038】
医薬組成物を、好ましくは経口投与及び非経口投与（皮下、筋肉内及び静脈内の投与を含む）のために、限定されるものではないが、固体剤形、液体剤形、半液体剤形、エアゾル剤形及び坐剤の剤形等を含む或る特定の剤形に調製することができる。例えば、経口投与に適した剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒、散剤、丸剤、粉末、トローチ、シロップ、及び懸濁液が挙げられ、非経口投与に適した剤形としては、水性又は非水性溶液、及びエマルジョン、例えば、皮下注射剤が挙げられる。
【0039】
好ましくは、本開示による医薬組成物は、抗体医薬にとって治療上有効な非経口又は非経口ではない（non-parenteral）（非経腸）経路を介して投与することができる。例えば、本開示による医薬組成物は、全身投与又は局所投与のための薬学的に許容され得る賦形剤（例えば、ビヒクル）を含む製剤に形成される。
【0040】
なお更なる態様では、本開示は、医薬品の製造における、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞及び／又は組成物の使用も提供する。好ましくは、医薬品は、ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に関連する疾患若しくは障害、又はヒトインターロイキン４（ＩＬ－４）若しくはヒトインターロイキン１３（ＩＬ－１３）のシグナル伝達経路に関連する疾患若しくは障害の予防、治療又は改善のためのものである。
【0041】
別の態様では、本開示はまた、疾患又は障害を予防、治療、又は改善する方法を提供し、該方法は、本開示による抗体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物を（例えば、治療有効量）、それを必要とする被験体に投与することを含む。好ましくは、疾患又は障害は、上記のように、ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）、又はヒトインターロイキン４（ＩＬ－４）若しくはヒトインターロイキン１３（ＩＬ－１３）のシグナル伝達経路と関連している。
【0042】
本開示によって提供される上記の使用又は方法において、疾患又は障害は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、腫瘍、又は癌を含む。
【0043】
好ましくは、疾患又は障害は、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患、例えば皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）、喘息（例えば、２型炎症性喘息等の炎症性喘息）、慢性食道炎（例えば、好酸球性食道炎）、湿疹、鼻炎（例えば、アレルギー性鼻炎）、鼻ポリープ（例えば、鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎）、結膜炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、炎症性神経障害、関節炎（例えば、関節リウマチ）、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、乾癬、又はインスリン及び非インスリン依存性糖尿病、並びにその他の免疫又はアレルギーに関連する疾患を含む。
【0044】
或いは、疾患又は障害は、腸癌、黒色腫、皮膚癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、肛門癌、神経膠芽腫、星細胞腫、肝臓癌、腎臓癌、食道癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、骨髄腫、骨癌、エイズ関連カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、前立腺腫瘍、リンパ腫、膵臓癌等の腫瘍又は癌を含む。
【0045】
好ましくは、医薬品は、上記の１つ以上の疾患又は障害の予防、治療又は改善のためのものである。
【0046】
好ましくは、被験体は哺乳動物、好ましくは霊長類であり、より好ましくは、被験体はヒトである。
【0047】
本開示により提供されるヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）の特異的エピトープに基づいて、本開示は、ヒトＩＬ－４Ｒの結合剤若しくはヒトＩＬ－４／ＩＬ－１３シグナル伝達経路の遮断剤のスクリーニングにおける特異的エピトープの使用、又は結合剤若しくは遮断剤の有効性の評価における特異的エピトープの使用も提供する。上記のように、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｄ９２、Ｖ９４、Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６、Ｃ２０７、Ｑ６３、及びＬ６４を含む。
【0048】
好ましくは、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｄ９２、Ｖ９４、及びＤ９７を含む。
【0049】
本開示の特定の実施の形態によれば、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
（１）Ｄ９２、
（２）Ｄ９７、
（３）Ｄ９２、Ｖ９４及びＤ９７、
（４）Ｄ９２及びＶ９４、
（５）Ｄ９２及びＤ９７、又は、
（６）Ｖ９４及びＤ９７、
を含む。
（１）Ｄ９２、
（２）Ｄ９７、
（３）Ｄ９２、Ｖ９４及びＤ９７、
（４）Ｄ９２及びＶ９４、
（５）Ｄ９２及びＤ９７、又は、
（６）Ｖ９４及びＤ９７、
を含む。
【0050】
及び／又は、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：（ｉ）Ｑ６３及びＬ６４を含む。
【0051】
及び／又は、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６を含む。
【0052】
好ましくは、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
１．Ｌ６７及びＬ６８、
２．Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６、又は、
３．Ａ９６、
を含む。
１．Ｌ６７及びＬ６８、
２．Ｌ６７、Ｌ６８及びＡ９６、又は、
３．Ａ９６、
を含む。
【0053】
本開示の特定の実施の形態によれば、エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
（Ａ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｂ）Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｃ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｄ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＣ２０７、又は、
（Ｅ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＨ１５６、
を含む。
（Ａ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｂ）Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｃ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ｈ１５６及びＣ２０７、
（Ｄ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＣ２０７、又は、
（Ｅ）Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＨ１５６、
を含む。
【0054】
特に好ましくは、本開示によるエピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の以下のアミノ酸残基：
（Ｐ－１）Ｄ９７、Ｌ６７及びＬ６８、
（Ｐ－２）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＤ９２、
（Ｐ－３）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８及びＤ９２、
（Ｐ－４）Ｄ９７、Ｑ６３及びＬ６４、
（Ｐ－５）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４及びＤ９２、
（Ｐ－６）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｄ９２及びＡ９６、又は、
（Ｐ－７）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｌ６７及びＬ６８、
を含む。
（Ｐ－１）Ｄ９７、Ｌ６７及びＬ６８、
（Ｐ－２）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６及びＤ９２、
（Ｐ－３）Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８及びＤ９２、
（Ｐ－４）Ｄ９７、Ｑ６３及びＬ６４、
（Ｐ－５）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４及びＤ９２、
（Ｐ－６）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｄ９２及びＡ９６、又は、
（Ｐ－７）Ｄ９７、Ｑ６３、Ｌ６４、Ｌ６７及びＬ６８、
を含む。
【0055】
上記のような特異的エピトープの使用に基づいて、本開示は、ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に特異的に結合する結合剤、又はヒトインターロイキン４（ＩＬ－４）若しくはヒトインターロイキン１３（ＩＬ－１３）のシグナル伝達経路を特異的に遮断する遮断剤をスクリーニングする方法であって、スクリーニングされる薬剤をヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部と接触させる工程と、次いで、該薬剤が本開示によるエピトープと結合可能かどうかを検出する工程とを含む、方法を提供する。本開示によるエピトープに結合可能な薬剤が検出される場合、その薬剤は結合剤又は遮断剤として同定される。
【0056】
或いは、本開示は、薬剤の有効性を評価する方法であって、評価される薬剤をヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）又はその一部と接触させる工程と、次いで、該薬剤が本開示によるエピトープと結合可能かどうかを検出する工程とを含む、方法も提供する。本開示によるエピトープに結合可能な薬剤が検出される場合、その薬剤は、ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）に特異的に結合する結合剤、又はヒトインターロイキン４（ＩＬ－４）若しくはヒトインターロイキン１３（ＩＬ－１３）のシグナル伝達経路を特異的に遮断する遮断剤として同定され、したがって、本開示に記載の疾患又は障害を予防、治療、又は改善するための有効性を有する。
【0057】
本開示による、結合剤若しくは遮断剤をスクリーニングする方法、又は薬剤の有効性を評価する方法において、好ましくは、スクリーニング又は評価される薬剤は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体等の抗体である。より好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部を免疫原として動物に免疫することによって得られる。
【0058】
結合剤若しくは遮断剤をスクリーニングする方法、又は薬剤の有効性を評価する方法において、好ましくは、薬剤が本開示によるエピトープに結合可能かどうかを検出することを、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部の部位特異的変異導入により、本開示によるエピトープによって含まれる１つ以上のアミノ酸残基を変異させること、変異後のヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する薬剤の結合活性又は結合親和性を変異前のものと比較すること、及び変異したヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する薬剤の結合活性又は結合親和性が著しく低いか、更には失われている場合、該薬剤が本開示によるエピトープに結合可能であると同定することによって行うことができる。
【0059】
特に、本開示による、結合剤若しくは遮断剤をスクリーニングする方法、又は薬剤の有効性を評価する方法は、
１）ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）又はその一部の部位特異的変異導入により本開示によるエピトープによって含まれる１つ以上のアミノ酸残基を変異させ、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部の変異体を得る工程と、
２）スクリーニングされる薬剤又は評価される薬剤を、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部、及びヒトＩＬ－４Ｒの変異体又はその一部とそれぞれ接触させ、それに対する結合活性又は結合親和性をそれぞれ検出する工程と、
３）変異したヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する薬剤の結合活性又は結合親和性が、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する薬剤の結合活性又は結合親和性と比較して著しく低いか、更には失われている場合、薬剤が本開示によるエピトープに結合可能であると同定する工程と、
を含み得る。
１）ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）又はその一部の部位特異的変異導入により本開示によるエピトープによって含まれる１つ以上のアミノ酸残基を変異させ、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部の変異体を得る工程と、
２）スクリーニングされる薬剤又は評価される薬剤を、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部、及びヒトＩＬ－４Ｒの変異体又はその一部とそれぞれ接触させ、それに対する結合活性又は結合親和性をそれぞれ検出する工程と、
３）変異したヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する薬剤の結合活性又は結合親和性が、ヒトＩＬ－４Ｒ又はその一部に対する薬剤の結合活性又は結合親和性と比較して著しく低いか、更には失われている場合、薬剤が本開示によるエピトープに結合可能であると同定する工程と、
を含み得る。
【0060】
当業者は、結合活性又は結合親和性が著しく低いか、又は失われているかどうかを日常的に判断することができる。例えば、ヒトＩＬ－４Ｒの変異体又はその一部に対する薬剤の結合活性又は結合親和性が、変異前の結合活性又は結合親和性の１０分の１であれば、結合活性又は結合親和性が著しく低いと判断することができる。
【0061】
好ましくは、工程１）においてエピトープによって含まれる１つ以上のアミノ酸残基をアラニン又は対応する位置のカニクイザルインターロイキン４受容体のアミノ酸残基に変異させ、ヒトＩＬ－４Ｒの変異体又はその一部を得る。
【0062】
好ましくは、本開示による方法において使用されるヒトＩＬ－４Ｒの一部は、ヒトＩＬ－４Ｒのアルファ鎖、更にヒトｓＩＬ－４Ｒアルファである。よって、好ましくは、上記方法は、ヒトＩＬ－４Ｒαを用いて行われ、ヒトＩＬ－４Ｒαの変異体が得られる。さらに、上記方法をヒトｓＩＬ－４Ｒαを用いて行うことができ、工程１）における変異体として、以下の表３に列挙される１つ以上のヒトｓＩＬ－４Ｒαの変異体を使用する。
【0063】
本開示において、ヒトＩＬ－４Ｒαは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００４０９．１による配列を指し、ヒトｓＩＬ－４Ｒαのアミノ酸配列は、配列番号１に示され、カニクイザルｓＩＬ－４Ｒαのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【0064】
実験は、本開示による抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトインターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）のアルファ鎖（ＩＬ－４Ｒα）上に位置するエピトープに結合し、該エピトープは配列番号１に示すアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基Ｄ９２、Ｖ９４、Ｄ９７、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６、Ｃ２０７、Ｑ６３及びＬ６４を含むことを証明する。免疫反応におけるｓＩＬ－４Ｒαのエピトープは、これまであまり研究されていなかったが、本開示において、抗ＩＬ－４Ｒ抗体のＩＬ－４Ｒへの結合における重要な位置が初めて定義された。
【0065】
したがって、本開示は、ＩＬ－４Ｒの新規エピトープに結合する、ヒトＩＬ－４Ｒ、特にＩＬ－４Ｒαに対する抗体を提供する。この抗体は、ヒトＩＬ－４Ｒ、特にＩＬ－４Ｒαに対する新規な、有用で有効な抗体であり得る。さらに、本開示は、本開示によって提供される抗体のヒトＩＬ－４Ｒαへの結合における重要な位置を解明することによって、ＩＬ－４Ｒ、特にヒトＩＬ－４Ｒαに対する可能性のある抗体又は薬剤の開発に対する代替アプローチを提供する。
【0066】
本開示の実施形態を、添付の図面を参照して以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0067】
【図1】ヒトＩＬ－４Ｒα（配列＿１；配列番号１）及びカニクイザルＩＬ－４Ｒα（配列＿２；配列番号２）のアラインメントを示す図である。
【図2】本開示の抗体の安定性を示す図であり、パネル２Ａは、４０℃で２週間保存した後の結果を示し、パネル２Ｂは、４０℃で４週間保存した後の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0068】
本開示において、「エピトープ」という用語は、抗体又はそのフラグメントが抗原に結合した場合に結合部位に対応する抗原のアミノ酸残基（複数の場合もある）、及び抗原の配列中のアミノ酸残基（複数の場合もある）の対応する位置（複数の場合もある）を指し、またエピトープのアミノ酸残基（複数の場合もある）の変異は、後述の「（Ｉ）結合活性の検出方法」に記載の手順に従って測定した場合に、結合活性が１０２ｎｇ／ｍｌを超えて低下するか、又は結合活性が失われている。
【0069】
本開示には、以下の実験手順又は定義が含まれる。本開示は、当該技術分野における他の従来技術によっても実施することができ、以下の実験手順に限定されるものではないことに留意されたい。
【0070】
（Ｉ）結合活性の検出方法
１．試薬の調製
抗原の調製：抗原をＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌ溶液に調製し、小分けにした後、－２０℃の冷蔵庫で保存した。
１．試薬の調製
抗原の調製：抗原をＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌ溶液に調製し、小分けにした後、－２０℃の冷蔵庫で保存した。
【0071】
検出される抗体の調製：１％ＢＳＡを含むＰＢＳで検出される抗体を、０ｎｇ／ｍｌ、０．０３２ｎｇ／ｍｌ、０．１６ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、及び２５００ｎｇ／ｍｌの所望の濃度に希釈した。
【0072】
二次抗体作業溶液の調製：二次抗体原液（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（ＨＲＰ）、sino biological、カタログ番号ＳＳＡ００１）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１６０００倍に希釈し、作業溶液を得た。例えば、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ １５９９９μｌに１μｌの二次抗体原液を加え、得られた混合物を上下の反転を繰り返してよく混合した。実験要件に応じてスケールアップすることで、所望の容積の二次抗体作業溶液を調製することができる。
【0073】
２．ＥＬＩＳＡ検出
１００μｇ／ｍｌの抗原溶液５０μｌを９．９５ｍｌのＰＢＳに加え、得られた混合物を上下に反転させてよく混合し、０．５μｇ／ｍｌの抗原コーティング溶液を得た。調製した抗原コーティング溶液を、１２チャネルピペット（RAININ）を用いてピペッティングし、９６ウェルプレート（Corning）に、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。９６ウェルプレートを防腐フィルムで包み（又は覆い）、４℃の冷蔵庫で一晩インキュベートした。翌日、９６ウェルプレートを取り出し、中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを静かに叩いて乾燥させた。９６ウェルプレートにＰＢＳを１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。プレートを室温で３分間放置した後、その中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを軽く叩いて乾燥させた。次いで、プレートを３回洗浄した。２％ＢＳＡを含むＰＢＳを９６ウェルプレートに、１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。９６ウェルプレートを防腐フィルムで包み（又は覆い）、３７℃の恒温インキュベーターで２時間インキュベートした。９６ウェルプレートを取り出し、その中の溶液を捨て、９６ウェルプレートを清潔なペーパータオルの上で静かに叩いて乾燥させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Beyotime、カタログ番号ＳＴ８２５）を含むＰＢＳを９６ウェルプレートに、１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。プレートを室温で３分間放置した後、その中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを軽く叩いて乾燥させた。その後、プレートを３回洗浄した。
１００μｇ／ｍｌの抗原溶液５０μｌを９．９５ｍｌのＰＢＳに加え、得られた混合物を上下に反転させてよく混合し、０．５μｇ／ｍｌの抗原コーティング溶液を得た。調製した抗原コーティング溶液を、１２チャネルピペット（RAININ）を用いてピペッティングし、９６ウェルプレート（Corning）に、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。９６ウェルプレートを防腐フィルムで包み（又は覆い）、４℃の冷蔵庫で一晩インキュベートした。翌日、９６ウェルプレートを取り出し、中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを静かに叩いて乾燥させた。９６ウェルプレートにＰＢＳを１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。プレートを室温で３分間放置した後、その中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを軽く叩いて乾燥させた。次いで、プレートを３回洗浄した。２％ＢＳＡを含むＰＢＳを９６ウェルプレートに、１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。９６ウェルプレートを防腐フィルムで包み（又は覆い）、３７℃の恒温インキュベーターで２時間インキュベートした。９６ウェルプレートを取り出し、その中の溶液を捨て、９６ウェルプレートを清潔なペーパータオルの上で静かに叩いて乾燥させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Beyotime、カタログ番号ＳＴ８２５）を含むＰＢＳを９６ウェルプレートに、１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。プレートを室温で３分間放置した後、その中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを軽く叩いて乾燥させた。その後、プレートを３回洗浄した。
【0074】
上記で順次希釈した検出される抗体をそれぞれ対応するウェルに、１ウェルあたり１００μｌずつ加え、各試料を３ウェルで複製した。９６ウェルプレートを防腐フィルムで包み（又は覆い）、３７℃の恒温インキュベーターで１時間インキュベートした。９６ウェルプレートを取り出し、その中の溶液を捨て、９６ウェルプレートを清潔なペーパータオルの上で静かに叩いて乾燥させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳを９６ウェルプレートに、１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。プレートを室温で３分間放置した後、その中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを軽く叩いて乾燥させた。その後、プレートを３回洗浄した。二次抗体作業溶液を９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。９６ウェルプレートを防腐フィルムで包み（又は覆い）、３７℃の恒温インキュベーターで１時間インキュベートした。次いで、９６ウェルプレートを取り出し、中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを静かに叩いて乾燥させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳを９６ウェルプレートに、１ウェルあたり３００μｌずつ加えた。プレートを室温で３分間放置した後、その中の溶液を捨て、清潔なペーパータオルの上でプレートを軽く叩いて乾燥させた。次いで、プレートを３回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（SurModics、カタログ番号ＴＭＤＳ－１０００－０１）を９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。次いで、プレートを３７℃の恒温インキュベーターで５分間インキュベートした後、直ちに２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を９６ウェルプレートに加え、反応を停止させた。９６ウェルプレートをｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３（Molecular Devices）に入れ、ＯＤ４５０値を読み取り、計算及び解析のためのデータを収集した。
【0075】
（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法
１．試薬の調製
ヒトＩＬ－４（Invivogen、カタログ番号ｒｈＩＬ－４）の調製：ヒトＩＬ－４をＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌ溶液に調製し、小分けにした後－２０℃の冷蔵庫で保存した。
１．試薬の調製
ヒトＩＬ－４（Invivogen、カタログ番号ｒｈＩＬ－４）の調製：ヒトＩＬ－４をＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌ溶液に調製し、小分けにした後－２０℃の冷蔵庫で保存した。
【0076】
ヒトＩＬ－１３（Invivogen、カタログ番号ｒｈＩＬ－１３）の調製：ヒトＩＬ－１３をＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌ溶液に調製し、小分けにした後－２０℃の冷蔵庫で保存した。
【0077】
Ｑｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ（Ｉ）溶液の調製：Ｑｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ（商標）粉末１パックを滅菌２５０ｍＬボトルに注ぎ、次いで、そこに滅菌水１００ｍＬを加えた。得られた混合物を静かに混合し、ボトルを３７℃の浴槽に３０分間入れた。粉末が完全に溶解したら、ボトルを４℃の冷蔵庫に入れ、暗所で一晩置いた。その後、その中の溶液を小分けにし、チューブ１本あたり１０ｍＬで－２０℃の暗所に保存した。この溶液は、６ヶ月間保存することができる。
【0078】
検出される抗体の調製：検出される抗体を１０％ＦＢＳ（Hyclone、カタログ番号ＳＶ３０１８４．０２）を含むＤＭＥＭ培地（HyClone、カタログ番号ＳＨ３００２２．０１）で、所望の濃度（１０００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１．６ｎｇ／ｍｌ、０．３２ｎｇ／ｍｌ、０．０６４ｎｇ／ｍｌ、０．０１２８ｎｇ／ｍｌ、０．００２５６ｎｇ／ｍｌ、及び０ｎｇ／ｍｌ）に希釈した。
【0079】
２．細胞培養
凍結したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞（Invivogen、カタログ番号ｈｋｂ－ｉｌ４１３）を液体窒素から取り出し、３７℃の水浴中で穏やかに振盪して急速に溶解させた。溶解した細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心管に移し、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（Blasticidin）、１００μｇ／ｍｌゼオシン（Zeocin）、及び１００μｇ／ｍｌノルモシン（Normocin）を含む）を１０ｍｌまでチューブに加えた後、このチューブを８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引し、残った細胞ペレットを１回洗浄した。ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを細胞に加え、細胞密度を１×１０５細胞／ｍｌ～１×１０６細胞／ｍｌに調整した。次いで、細胞懸濁液をＴ７５細胞培養ボトル（Nunc）に移し、定常培養のため、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo）に入れた。２日～３日ごとに細胞懸濁液を採取し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた細胞を１０ｍｌの培養培地に再懸濁し、そこから１×１０６個の細胞を数え、新しいＴ７５細胞培養ボトルに移し、そこに同時に培養培地を１０ｍｌまで補充した。細胞を２回～３回続けて継代し、細胞の増殖状態が良好（細胞が透明で、紡錘形であり、接着している）になってから、以下の実験を行うことができた。
凍結したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞（Invivogen、カタログ番号ｈｋｂ－ｉｌ４１３）を液体窒素から取り出し、３７℃の水浴中で穏やかに振盪して急速に溶解させた。溶解した細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心管に移し、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（Blasticidin）、１００μｇ／ｍｌゼオシン（Zeocin）、及び１００μｇ／ｍｌノルモシン（Normocin）を含む）を１０ｍｌまでチューブに加えた後、このチューブを８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引し、残った細胞ペレットを１回洗浄した。ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを細胞に加え、細胞密度を１×１０５細胞／ｍｌ～１×１０６細胞／ｍｌに調整した。次いで、細胞懸濁液をＴ７５細胞培養ボトル（Nunc）に移し、定常培養のため、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo）に入れた。２日～３日ごとに細胞懸濁液を採取し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた細胞を１０ｍｌの培養培地に再懸濁し、そこから１×１０６個の細胞を数え、新しいＴ７５細胞培養ボトルに移し、そこに同時に培養培地を１０ｍｌまで補充した。細胞を２回～３回続けて継代し、細胞の増殖状態が良好（細胞が透明で、紡錘形であり、接着している）になってから、以下の実験を行うことができた。
【0080】
３．ブロッキング実験
増殖状態の良い細胞を含むＴ７５細胞ボトルを取り、その中の上清を捨て、付着した細胞を１０ｍｌのＰＢＳで静かに剥離した。剥離した細胞を１５ｍｌの遠心管に移し、次いでこれを８００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を、再び８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、残った細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地５ｍｌに再懸濁し、細胞数を計数した後、培地を補充して細胞密度を６．６×１０５細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を３８４ウェルプレートに、１ウェルあたり３０μｌずつ加えた。上記のようにして調製した異なる濃度の検出される抗体を、３８４ウェルプレートのウェル中の細胞に、１ウェルあたり１０μｌずつ加えた（各試料を３ウェルに複製した）。ヒトＩＬ－４又はヒトＩＬ－１３を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２．５ｎｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルの最終細胞数が２×１０４個、ヒトＩＬ－４又はヒトＩＬ－１３の最終濃度が０．５ｎｇ／ｍｌ、３８４ウェルプレートの各ウェル内の最終容積が５０μｌとなるように、３８４ウェルプレートの対応するウェルに１ウェルあたり１０μｌずつ２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－４又はヒトＩＬ－１３を加えた。３８４ウェルプレートを、細胞を定常培養するために３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
増殖状態の良い細胞を含むＴ７５細胞ボトルを取り、その中の上清を捨て、付着した細胞を１０ｍｌのＰＢＳで静かに剥離した。剥離した細胞を１５ｍｌの遠心管に移し、次いでこれを８００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を、再び８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、残った細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地５ｍｌに再懸濁し、細胞数を計数した後、培地を補充して細胞密度を６．６×１０５細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を３８４ウェルプレートに、１ウェルあたり３０μｌずつ加えた。上記のようにして調製した異なる濃度の検出される抗体を、３８４ウェルプレートのウェル中の細胞に、１ウェルあたり１０μｌずつ加えた（各試料を３ウェルに複製した）。ヒトＩＬ－４又はヒトＩＬ－１３を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２．５ｎｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルの最終細胞数が２×１０４個、ヒトＩＬ－４又はヒトＩＬ－１３の最終濃度が０．５ｎｇ／ｍｌ、３８４ウェルプレートの各ウェル内の最終容積が５０μｌとなるように、３８４ウェルプレートの対応するウェルに１ウェルあたり１０μｌずつ２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－４又はヒトＩＬ－１３を加えた。３８４ウェルプレートを、細胞を定常培養するために３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
【0081】
４．データ統計
３８４ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベーターで２２時間インキュベートした後、新たな３８４ウェルプレートの各ウェルに４５μｌのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ溶液を加えた。２２時間インキュベートしたプレートの各ウェルの上清をピペッティングし、新たな３８４ウェルプレートの対応するウェルに、１ウェルあたり５μｌずつ加え、次いで、３７℃で６０分間インキュベートした。３８４ウェルプレートをｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３に入れ、ＯＤ６５０値を読み取り、計算及び解析のためのデータを収集した。
３８４ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベーターで２２時間インキュベートした後、新たな３８４ウェルプレートの各ウェルに４５μｌのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ溶液を加えた。２２時間インキュベートしたプレートの各ウェルの上清をピペッティングし、新たな３８４ウェルプレートの対応するウェルに、１ウェルあたり５μｌずつ加え、次いで、３７℃で６０分間インキュベートした。３８４ウェルプレートをｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３に入れ、ＯＤ６５０値を読み取り、計算及び解析のためのデータを収集した。
【0082】
以下に本開示を、具体例を参照して説明する。これらの実施例は本開示の単なる例示に過ぎず、本開示の範囲を何ら限定するものではないことが当業者には理解されよう。
【0083】
以下の実施例における実験手順は、特に明示がない限り、全て慣用のものである。以下の実施例で用いた原材料及び試薬は、特に明示がない限り、いずれも市販品である。
【0084】
ヒトｓＩＬ－４Ｒα：ＮＰ＿０００４０９．１、Ｍｅｔ１－Ｈｉｓ２３２、配列番号１に示す。
カニクイザルｓＩＬ－４Ｒα：ＥＨＨ６０２６５．１、Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２３２、配列番号２に示す。
カニクイザルｓＩＬ－４Ｒα：ＥＨＨ６０２６５．１、Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２３２、配列番号２に示す。
【実施例】
【0085】
実施例１ マウス抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体の作製
ヒトｓＩＬ－４Ｒα（配列番号１）により１０匹のマウスを免疫した。マウスの血液を採取し、「（Ｉ）結合活性の検出方法」及び「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って検出した。２つの検出結果の総合的な分析に従い、最も良い結果を示した２匹のマウスをそれぞれ融合に選択した。
ヒトｓＩＬ－４Ｒα（配列番号１）により１０匹のマウスを免疫した。マウスの血液を採取し、「（Ｉ）結合活性の検出方法」及び「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って検出した。２つの検出結果の総合的な分析に従い、最も良い結果を示した２匹のマウスをそれぞれ融合に選択した。
【0086】
異なる融合体から得られた上清を、再度「（Ｉ）結合活性の検出方法」及び「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って検出した。２つの検出結果の総合的な分析に従い、最も高い活性を示した親クローンをサブクローニングに選択した。「（Ｉ）結合活性の検出方法」及び「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載した手順に従い検出を行い、最終的に１４種類のマウスモノクローナル抗体をスクリーニングすることで得た。１４種類のモノクローナル抗体の塩基配列を決定し、９組の新たな配列を持つ抗体を得た。以下に、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、ＩＭＧＴツールで定義されたＣＤＲを下線で示す。
【0087】
Ｙ０１８８－１
重鎖可変領域（配列番号３；ＣＤＲは順次：配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYGMHWVRQAPGKGLEWVAHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRWFRAMDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号４；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQEKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
Ｙ０１８８－２
重鎖可変領域（配列番号５；ＣＤＲは順次：配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０）
EVQLIESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMDWVRQAPGKGLEWVARIRSKGSNFETNYADSVKDRFTISRDDSQSMVYLQMINLKTEDTAMYYCVRHRGGAWFAYWGQGTLVSVSA
軽鎖可変領域（配列番号６；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８）
DIVVTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVAIYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK
Ｙ０１８８－３
重鎖可変領域（配列番号７；ＣＤＲは順次：配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３）
QVQLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFSNYRMHWLRQPPGKRLEWIAVITVKSNNYGANYAESVKGRFAISRDDSKSSVYLEMNRLREEDTATYFCSRERAYGNPFDYWGQGTTLTVSS
軽鎖可変領域（配列番号８；ＣＤＲは順次：配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１）
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYGSYPYTFGGGTKLEIK
Ｙ０１８８－４
重鎖可変領域（配列番号９；ＣＤＲは順次：配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６）
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMNWVRQAPGQGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFIISRDDSESMVYLQMSNLRAADTAMYYCVRHLRAMDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号１０；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２）
DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPITFGSGTKLEIK
Ｙ０１８８－６
重鎖可変領域（配列番号１１；ＣＤＲは順次：配列番号４４、配列番号４７、配列番号４６）
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFNMYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNHYSTYYADSVKDRFTISRDDSASMFYLQMNNLKTEDTAMYFCVRHLRAMDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号１２；ＣＤＲは順次：配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５）
DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRASQSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNVQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVATYYCHHNRDLPFTFGSGTKLEIK
Ｙ０１８８－８
重鎖可変領域（配列番号１３；ＣＤＲは順次：配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０）
EVQLIESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMDWVRQAPGKGLEWVARIRSKGSNFETNYADSVKDRFTISRDDSQSMVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHRGGAWFAYWGQGTLVTVSA
軽鎖可変領域（配列番号１４；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８）
DIVVTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVAIYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK
Ｙ０１８８－９
重鎖可変領域（配列番号１５；ＣＤＲは順次：配列番号４８、配列番号４９、配列番号４６）
EVQLVESGGGLVRPKGSLKLSCAASGFSFNTYAMNWVRQAPGKGLEWIVWIRSKSHNYATYYADSVKDRFTISRDDSESMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHLRAMDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号１６；ＣＤＲは順次：配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSASGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPPTFGGGTKLEIK
Ｙ０１８８－１０
重鎖可変領域（配列番号１７；ＣＤＲは順次：配列番号４４、配列番号５０、配列番号５１）
EVRLVESGGGLVQPKGSLKLSCEASGFSFNMYAMNWVRQAPGKGLEWITHIRSKSNNYATYYADSVKDRFIISRDDSESMVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRLLRALDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号１８；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号６９）
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Ｙ０１８８－１４
重鎖可変領域（配列番号１９；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
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軽鎖可変領域（配列番号２０；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
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重鎖可変領域（配列番号３；ＣＤＲは順次：配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYGMHWVRQAPGKGLEWVAHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRWFRAMDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号４；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQEKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
Ｙ０１８８－２
重鎖可変領域（配列番号５；ＣＤＲは順次：配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０）
EVQLIESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMDWVRQAPGKGLEWVARIRSKGSNFETNYADSVKDRFTISRDDSQSMVYLQMINLKTEDTAMYYCVRHRGGAWFAYWGQGTLVSVSA
軽鎖可変領域（配列番号６；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８）
DIVVTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVAIYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK
Ｙ０１８８－３
重鎖可変領域（配列番号７；ＣＤＲは順次：配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３）
QVQLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFSNYRMHWLRQPPGKRLEWIAVITVKSNNYGANYAESVKGRFAISRDDSKSSVYLEMNRLREEDTATYFCSRERAYGNPFDYWGQGTTLTVSS
軽鎖可変領域（配列番号８；ＣＤＲは順次：配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１）
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Ｙ０１８８－４
重鎖可変領域（配列番号９；ＣＤＲは順次：配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６）
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軽鎖可変領域（配列番号１０；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２）
DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPITFGSGTKLEIK
Ｙ０１８８－６
重鎖可変領域（配列番号１１；ＣＤＲは順次：配列番号４４、配列番号４７、配列番号４６）
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFNMYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNHYSTYYADSVKDRFTISRDDSASMFYLQMNNLKTEDTAMYFCVRHLRAMDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号１２；ＣＤＲは順次：配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５）
DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRASQSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNVQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVATYYCHHNRDLPFTFGSGTKLEIK
Ｙ０１８８－８
重鎖可変領域（配列番号１３；ＣＤＲは順次：配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０）
EVQLIESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMDWVRQAPGKGLEWVARIRSKGSNFETNYADSVKDRFTISRDDSQSMVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHRGGAWFAYWGQGTLVTVSA
軽鎖可変領域（配列番号１４；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８）
DIVVTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVAIYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK
Ｙ０１８８－９
重鎖可変領域（配列番号１５；ＣＤＲは順次：配列番号４８、配列番号４９、配列番号４６）
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軽鎖可変領域（配列番号１６；ＣＤＲは順次：配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSASGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPPTFGGGTKLEIK
Ｙ０１８８－１０
重鎖可変領域（配列番号１７；ＣＤＲは順次：配列番号４４、配列番号５０、配列番号５１）
EVRLVESGGGLVQPKGSLKLSCEASGFSFNMYAMNWVRQAPGKGLEWITHIRSKSNNYATYYADSVKDRFIISRDDSESMVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRLLRALDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号１８；ＣＤＲは順次：配列番号５６、配列番号５７、配列番号６９）
DIVLTQSPASLAVFLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKAGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCHHSRELPITFGSGTKLEMK
Ｙ０１８８－１４
重鎖可変領域（配列番号１９；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYGMHWVRQAPGKGLEWVAHIRSKSSNYATYYADSVKDRLTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRWFRAMDYWGQGTSVTVSS
軽鎖可変領域（配列番号２０；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQEKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
【0088】
上記の可変領域配列を用い、重鎖定常領域をコードする配列として配列番号７１に示す配列を、軽鎖定常領域をコードする配列として配列番号７２に示す配列を使用して、９種類のキメラ抗体を構築した。９種類のキメラ抗体を発現及び精製し、マウス抗体名プラスＱと命名した。キメラ抗体のＩＣ５０値を「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って検出し、ヒトｓＩＬ－４Ｒαに対するキメラ抗体の親和性（ＫＤ）をＢＩＡＣＯＲＥ装置で測定した。結果を下の表１に示す。
【0089】
【表1】
【0090】
クローン番号１４のキメラ抗体（Ｙ０１８８－１４Ｑ）を選択してヒト化し、重鎖可変領域の７つのヒト化配列と軽鎖可変領域の７つのヒト化配列を得た。以下に、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヒト化したアミノ酸配列を示し、ＩＭＧＴツールで定義されたＣＤＲを下線で示す。
【0091】
重鎖可変領域：
>HV3-15-14H（配列番号２１；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-48-14H（配列番号２２；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-73*2-14H（配列番号２３；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSMYGMHWVRQASGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-72-14H（配列番号２４；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>Y01-14H（配列番号２５；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>162-14H（配列番号２６；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWFRAMDYWGQGTTVTVSS
>VH73-14H（配列番号２７；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSMYGMHWVRQASGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRWFRAMDYWGQGTTVTVSS
軽鎖可変領域：
>Y01-14L（配列番号２８；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRHTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGQGTKVEIK
>164-14L（配列番号２９；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKASQDVSTAVAWYLQKSGQSPQLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGFYYCQQHYSTPLTFGQGTKLEIK
>KV4-14L（配列番号３０；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1-27-14L（配列番号３１；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1-9-14L（配列番号３２；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1-NL1-14L（配列番号３３；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLLYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1D-43-14L（配列番号３４；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPAKAPKLFIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>HV3-15-14H（配列番号２１；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-48-14H（配列番号２２；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-73*2-14H（配列番号２３；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSMYGMHWVRQASGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-72-14H（配列番号２４；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>Y01-14H（配列番号２５；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>162-14H（配列番号２６；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWFRAMDYWGQGTTVTVSS
>VH73-14H（配列番号２７；ＣＤＲは順次：配列番号５２、配列番号３６、配列番号３７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSMYGMHWVRQASGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRWFRAMDYWGQGTTVTVSS
軽鎖可変領域：
>Y01-14L（配列番号２８；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRHTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGQGTKVEIK
>164-14L（配列番号２９；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKASQDVSTAVAWYLQKSGQSPQLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGFYYCQQHYSTPLTFGQGTKLEIK
>KV4-14L（配列番号３０；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1-27-14L（配列番号３１；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1-9-14L（配列番号３２；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1-NL1-14L（配列番号３３；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLLYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1D-43-14L（配列番号３４；ＣＤＲは順次：配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPAKAPKLFIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
【0092】
軽鎖可変領域と重鎖可変領域の対のヒト化配列を用い、重鎖定常領域をコードする配列として配列番号７１に示す配列を、軽鎖定常領域をコードする配列として配列番号７２に示す配列を使用して、４９種類のヒト化抗体を構築した。ヒト化抗体を発現させ、「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って抗体のＩＣ５０値を検出し、ＢＩＡＣＯＲＥ装置で抗体の細胞機能活性（ＫＤ）を確認した。好ましい６種類の可変領域の組合せを得た。結果を以下の表２に示す。
【0093】
【表2】
【0094】
実施例２ 結合エピトープに関する研究
２．１ 抗体のヒトＩＬ－４Ｒα及びカニクイザルＩＬ－４Ｒαへの結合における種差
抗原としてカニクイザルｓＩＬ－４Ｒα（ＥＨＨ６０２６５．１、Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２３２；配列番号２）を用い、「（Ｉ）結合活性の検出方法」に記載の手順に従って、抗原に対する抗体の結合活性を検出した。
２．１ 抗体のヒトＩＬ－４Ｒα及びカニクイザルＩＬ－４Ｒαへの結合における種差
抗原としてカニクイザルｓＩＬ－４Ｒα（ＥＨＨ６０２６５．１、Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２３２；配列番号２）を用い、「（Ｉ）結合活性の検出方法」に記載の手順に従って、抗原に対する抗体の結合活性を検出した。
【0095】
２．２ 抗原配列中の変異させる位置の選択
ヒトＩＬ－４Ｒα及びカニクイザルＩＬ－４Ｒαの配列を、図１に示すようにアラインメントした。ヒトＩＬ－４Ｒαの配列とカニクイザルＩＬ－４Ｒαの配列で異なる幾つかの位置は、抗体のＩＬ－４Ｒαへの結合を担う重要な位置であり、抗体がカニクイザルの配列ではなくヒトの配列に結合できるようにする可能性が高いと推測される。そこで、ヒトＩＬ－４Ｒα配列において、アミノ酸（複数の場合もある）が、カニクイザルＩＬ－４Ｒα配列中のアミノ酸（複数の場合もある）と異なる位置（複数の場合もある）を単一の点変異又は複合変異に供して、アミノ酸（複数の場合もある）をカニクイザルＩＬ－４Ｒα配列中の対応する位置（複数の場合もある）のアミノ酸（複数の場合もある）に変更し、また、異なるアミノ酸（複数の場合もある）が存在する位置（複数の場合もある）の近傍にある非アラニンアミノ酸（複数の場合もある）を単一の点変異又は複合変異に供して、アミノ酸（複数の場合もある）をアラニンに変更した。次いで、異なる変異の組合せを有するヒトｓＩＬ－４Ｒαの変異体を構築し（下記表３を参照されたい）、「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って、それらの活性を検証した。
ヒトＩＬ－４Ｒα及びカニクイザルＩＬ－４Ｒαの配列を、図１に示すようにアラインメントした。ヒトＩＬ－４Ｒαの配列とカニクイザルＩＬ－４Ｒαの配列で異なる幾つかの位置は、抗体のＩＬ－４Ｒαへの結合を担う重要な位置であり、抗体がカニクイザルの配列ではなくヒトの配列に結合できるようにする可能性が高いと推測される。そこで、ヒトＩＬ－４Ｒα配列において、アミノ酸（複数の場合もある）が、カニクイザルＩＬ－４Ｒα配列中のアミノ酸（複数の場合もある）と異なる位置（複数の場合もある）を単一の点変異又は複合変異に供して、アミノ酸（複数の場合もある）をカニクイザルＩＬ－４Ｒα配列中の対応する位置（複数の場合もある）のアミノ酸（複数の場合もある）に変更し、また、異なるアミノ酸（複数の場合もある）が存在する位置（複数の場合もある）の近傍にある非アラニンアミノ酸（複数の場合もある）を単一の点変異又は複合変異に供して、アミノ酸（複数の場合もある）をアラニンに変更した。次いで、異なる変異の組合せを有するヒトｓＩＬ－４Ｒαの変異体を構築し（下記表３を参照されたい）、「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って、それらの活性を検証した。
【0096】
【表3】
【0097】
２．３ 結合活性の検出
６種類のヒト化高活性抗体の抗原に対する結合活性は、ヒトｓＩＬ－４Ｒαタンパク質及び表３に示すｓＩＬ－４Ｒαの種々の変異体を抗原として、またこれらの抗体を一次抗体として使用して、「（Ｉ）結合活性の検出方法」に記載の手順に従って、検出した。結果を表４に示す。
６種類のヒト化高活性抗体の抗原に対する結合活性は、ヒトｓＩＬ－４Ｒαタンパク質及び表３に示すｓＩＬ－４Ｒαの種々の変異体を抗原として、またこれらの抗体を一次抗体として使用して、「（Ｉ）結合活性の検出方法」に記載の手順に従って、検出した。結果を表４に示す。
【0098】
ヒトｓＩＬ－４Ｒαタンパク質及び表３に示すｓＩＬ－４Ｒαの種々の変異体を抗原として、またこれらの抗体を一次抗体として使用して、９種類のキメラ抗体の抗原に対する結合活性を同様に検出した。結果を表５に示す。
【0099】
スクリーニングにより、ヒトとカニクイザルのｓＩＬ－４Ｒαの間で異なるアミノ酸を有するこれらの位置及びその近傍に変異アミノ酸（複数の場合もある）を伴うｓＩＬ－４Ｒα変異体に対する抗体の結合活性は、ｓＩＬ－４Ｒαに対する結合活性と比較して変化するか、更には逆転することがわかった。
【0100】
【表4】
【0101】
表４のデータから明らかなように、Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７の５つの位置に関して、そのうちのいずれか１つのアミノ酸残基が、カニクイザルＩＬ－４Ｒαの対応する位置のアミノ酸残基に変異しており、Ｌ６７及びＬ６８が変異位置の組合せに含まれていた場合、本開示で提供されるヒト化抗体の結合活性は、ｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対するそれらの結合活性と比較して著しく低いが、一方で、Ｌ６７とＬ６８を個別に変異させた場合、本開示のヒト化抗体は、ｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対するそれら本来の結合活性を維持した。
【0102】
Ｄ９２、Ｖ９４及びＤ９７の３つの位置に関して、それらのうちのいずれか１つのアミノ酸残基がアラニンに変異しており、変異位置の組合せにＤ９７が含まれていた場合、又はＤ９７のみが変異していた場合、本開示で提供されるヒト化抗体の結合活性はｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対するそれらの結合活性と比較して著しく低かった。
【0103】
【表5】
【0104】
表５のデータから明らかなように、Ｄ９２、Ｖ９４及びＤ９７の３つの位置に関して、そのうちのいずれか１つのアミノ酸残基がアラニンに変異しており、変異位置の組合せにＤ９７が含まれていた場合、又はＤ９７のみが変異していた場合、本開示で提供されるキメラ抗体の結合活性は、Ｙ０１８８－２Ｑ及びＹ０１８８－８Ｑを除いて、ｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対するそれらの結合活性と比較して著しく低かった。
【0105】
Ｌ６７、Ｌ６８、Ａ９６、Ｈ１５６及びＣ２０７の５つの位置に関して、そのうちのいずれか１つのアミノ酸残基が、カニクイザルＩＬ－４Ｒαの対応する位置のアミノ酸に変異しており、Ｌ６７及びＬ６８、又はＬ６７、Ｌ６８及びＡ９６が変異位置の組合せに含まれていた場合、キメラ抗体Ｙ０１８８－１Ｑ、Ｙ０１８８－３Ｑ、及びＹ０１８８－１０Ｑの結合活性は、ｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対するそれらの結合活性と比較して著しく低かったが、一方で、Ｌ６７及びＬ６８を個別に変異させた場合、キメラ抗体は、Ｙ０１８８－２Ｑ及びＹ０１８８－８Ｑを除いて、いずれもｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対するそれら本来の結合活性を維持したままであった。さらに、Ａ９６に関しては、変異位置の組合せにＡ９６が含まれていた場合、キメラ抗体Ｙ０１８８－３Ｑの結合活性はｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対する結合活性と比較して著しく低かった。
【0106】
Ｑ６３とＬ６４の２つの位置に関して、両位置がアラニンに変異していた場合、キメラ抗体の結合活性は、Ｙ０１８８－１Ｑ、Ｙ０１８８－２Ｑ及びＹ０１８８－８Ｑを除いて、ｓＩＬ－４Ｒ－Ｈｉｓに対するそれらの結合活性と比較して著しく低かった。
【0107】
実施例３ 抗体の安定性
抗体Ｅ５及び抗体Ｂ５を、１０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６において、それぞれ０．５９ｍｇ／ｍＬ、０．５４ｍｇ／ｍＬ及び６．４４ｍｇ／ｍＬで調製し、４０℃で２週間及び４週間保存し、「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って検出した。抗体濃度対ＯＤ６５０値のグラフをプロットし（図２）、次いで、そこからＩＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）を算出した。結果を以下の表６に示す。
抗体Ｅ５及び抗体Ｂ５を、１０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６において、それぞれ０．５９ｍｇ／ｍＬ、０．５４ｍｇ／ｍＬ及び６．４４ｍｇ／ｍＬで調製し、４０℃で２週間及び４週間保存し、「（ＩＩ）細胞機能活性の検出方法」に記載の手順に従って検出した。抗体濃度対ＯＤ６５０値のグラフをプロットし（図２）、次いで、そこからＩＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）を算出した。結果を以下の表６に示す。
【0108】
【表6】
【0109】
本発明の実施形態に関する以上の説明は、本発明を限定することを意図するものではなく、当業者は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で本発明に種々の変更及び修正を加えることができ、これは添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】