(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-19
(54)【発明の名称】人工抗原提示細胞システム及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0784 20100101AFI20230612BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230612BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0784
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022567826
(86)(22)【出願日】2021-05-07
(85)【翻訳文提出日】2023-01-05
(86)【国際出願番号】 CN2021092173
(87)【国際公開番号】W WO2021223742
(87)【国際公開日】2021-11-11
(31)【優先権主張番号】63/022,289
(32)【優先日】2020-05-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522434451
【氏名又は名称】セルテック，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】フー，チェ‐ミン ジャック
(72)【発明者】
【氏名】リン，ジュン‐チェン
(72)【発明者】
【氏名】スー，チュン‐ヤオ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065BD40
4B065CA44
(57)【要約】
１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞と、１つ以上のサイトカインを放出することができる制御放出システムと、を含む、人工抗原提示細胞システム。ゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法及び免疫細胞を活性化するための人工抗原提示細胞システムの使用もまた本明細書において提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
人工抗原提示細胞複合体であって、（ａ）１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞と、
（ｂ）１つ以上のサイトカインと会合した制御放出システムと、を含み、
前記１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞が、前記制御放出システムに付着している、人工抗原提示細胞複合体。
【請求項2】
前記１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞の表面上にディスプレイされた抗原ペプチドを更に含む、請求項１に記載の人工抗原提示細胞複合体。
【請求項3】
前記制御放出システムが、前記１つ以上のサイトカインを封入する微粒子を含む、請求項１又は２に記載の人工抗原提示細胞複合体。
【請求項4】
前記１つ以上のサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮλ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞。
【請求項5】
前記微粒子が、１つ以上の分解性ポリマーを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞複合体。
【請求項6】
前記１つ以上の分解性ポリマーが、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリウレタン、ポリアクリレート、又はそれらの組み合わせを含む、請求項５に記載の人工抗原提示細胞複合体。
【請求項7】
前記抗原ペプチドが、前記ゲル化ヒト樹状細胞上の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子によってディスプレイされる、請求項２～６のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞複合体。
【請求項8】
前記ゲル化ヒト細胞が、細胞内架橋ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞複合体。
【請求項9】
ゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法であって、（ａ）ヒト樹状細胞の集団を提供することと、
（ｂ）ゲル化緩衝液を前記ヒト樹状細胞中に透過させることであって、前記ゲル化緩衝液が、光開始剤、ポリマー又は重合性モノマー、及びジメチルスルホキシドを含む、透過させることと、
（ｃ）前記ゲル化緩衝液を透過させた前記ヒト樹状細胞を光に曝露して、前記ポリマーの架橋を引き起こし、それによって前記ゲル化ヒト樹状細胞を形成することと、を含む、方法。
【請求項10】
（ｄ）前記ゲル化ヒト樹状細胞を、１つ以上のサイトカインと会合している制御放出システムにカップリングすることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ゲル化緩衝液が、アクリルポリマーである前記ポリマーを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
前記アクリルポリマーが、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記アクリルポリマーが、約２５０～約２，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧ－ＤＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＰＥＧ－ＤＡが、約６００～約８００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ゲル化緩衝液が、前記重合性モノマーを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項16】
前記重合性モノマーが、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、アクリル酸、アクリル酸ナトリウム、エチレングリコールジメタクリレート、又はそれらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記光開始剤が、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンである、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法によって産生される、人工抗原提示ヒト樹状細胞。
【請求項19】
免疫細胞を活性化する方法であって、（ｉ）請求項１～８及び１８のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞複合体を提供することと、
（ｉｉ）前記人工抗原提示細胞複合体を、抗原ペプチドを用いてプライミングして、前記人工抗原提示細胞複合体中の前記ゲル化ヒト樹状細胞の表面上に前記ペプチドをディスプレイすることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において産生された前記人工抗原提示細胞複合体を、免疫細胞を含む細胞集団と接触させて、前記免疫細胞を活性化することと、を含む、方法。
【請求項20】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ペプチドが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、がん抗原、又は自己免疫疾患に関連する自己抗原に由来する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
ステップ（ｉｉｉ）において産生された前記活性化された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを更に含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月８日に出願された米国仮出願第６３／０２２，２８９号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月８日に出願された米国仮出願第６３／０２２，２８９号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）（天然に存在するＡＰＣ又は人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）を含む）を介したＴ細胞及びそれらの機能の直接的な調節は、がん、ウイルス感染、及び自己免疫疾患に及ぶ疾患に対する魅力的な治療戦略である。Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ ２０１６，１６８，７４－９５、及びＰａｌｕｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２，１２（４），２６５－７７．最近の臨床上の関心及びＴ細胞ベースの養子細胞療法の進歩は、エクスビボＴ細胞調節のためのＡＰＣの更なる採用を導き、これは、ネオ抗原特異的Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ウイルス標的化Ｔ細胞の拡大、並びに後の遺伝子改変ための一般のＴ細胞拡大を可能にする。Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６、及びＦｕｃｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９，１０，２３９３．
【0003】
人工ＡＰＣの開発は、維持、貯蔵、及び無菌要件の考慮に起因して関心事であった。Ｓｕｎｓｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）２０１３，８（７），１１７３－８９、Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２０１０，１６（４），３７４－８１、Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００９，５８（２），２０９－２０、Ｌａｔｏｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００，１８（４），４０５－９、及びＳａｓａｗａｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００６，８４（６），５１２－２１．しかしながら、生存樹状細胞（ＤＣ）などの天然に存在するＡＰＣを大いに模倣し得るａＡＰＣを構築することは依然として課題である。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、少なくとも部分的に、（ａ）抗原ペプチドをＴ細胞に提示することができるゲル化ヒト樹状細胞と、（ｂ）１つ以上のサイトカインを分泌することができる制御放出システムと、を含む、効率的な人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）システムの開発に基づいている。ヒト樹状細胞は、遺伝子改変され得る。あるいは、ヒト樹状細胞は、天然に存在し得る。本明細書に開示されるａＡＰＣシステムは、ＭＨＣ／ペプチド複合体のＴ細胞受容体との咬合によってトリガーされる一次シグナル伝達経路、Ｔ細胞上の共刺激受容体とそのリガンドとの間の相互作用によってトリガーされる共刺激シグナル伝達経路、及び刺激サイトカインの免疫細胞上のその受容体への結合によってトリガーされるシグナル伝達経路を含む、３つのシグナル伝達経路をトリガーすることを介して、Ｔ細胞などの免疫細胞を完全に活性化することができる。
【0005】
したがって、本開示の一態様は、人工抗原提示細胞複合体であって、（ａ）１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞と、（ｂ）１つ以上のサイトカインと会合した制御放出システムと、を含む、人工抗原提示細胞複合体を提供する。１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞は、制御放出システムに付着して、人工抗原提示細胞複合体を形成する。いくつかの実施形態では、人工抗原提示細胞複合体は、１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞の表面上にディスプレイされた抗原ペプチドを更に含み得る。
【0006】
いくつかの実施形態では、制御放出システムは、１つ以上のサイトカインを封入し得る微粒子を含む。例示的なサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮλ、及び／又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、微粒子は、１つ以上の分解性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリウレタン、ポリアクリレート、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【0007】
いくつかの実施形態では、抗原ペプチドは、ゲル化ヒト樹状細胞上の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子によってディスプレイされ得る。いくつかの実施形態では、ゲル化ヒト細胞は、細胞内架橋ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）を含み得る。
【0008】
別の態様では、本開示は、ゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法であって、（ａ）ヒト樹状細胞の集団を提供することと、（ｂ）ゲル化緩衝液をヒト樹状細胞中に透過させることであって、ゲル化緩衝液が、光開始剤、ポリマー又は重合性モノマー、及びジメチルスルホキシドを含む、透過させることと、（ｃ）ゲル化緩衝液を透過させたヒト樹状細胞を光に曝露して、ポリマーの架橋を引き起こし、それによってゲル化ヒト樹状細胞を形成することと、を含む、方法を特徴とする。いくつかの場合では、方法は、（ｄ）ゲル化ヒト樹状細胞を、１つ以上のサイトカインと会合している制御放出システムにカップリングすることを更に含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態では、ゲル化緩衝液中のポリマーは、アクリルポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり得る。いくつかの例では、アクリルポリマーは、約２５０～約２，０００ダルトンの平均分子量を有し得るＰＥＧ－ＤＡである。他の例では、ＰＥＧ－ＤＡは、約６００～約８００ダルトンの平均分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、ゲル化緩衝液は、重合性モノマー、例えば、ｗｈ ２－ヒドロキシエチルメタクリレート、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、アクリル酸、アクリル酸ナトリウム、エチレングリコールジメタクリレート、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【0010】
いくつかの実施形態では、光開始剤は、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンである。
【0011】
本明細書に開示される任意の方法によって産生される任意の人工抗原提示ヒト樹状細胞もまた本開示の範囲内である。
【0012】
更に別の態様では、本開示は、免疫細胞を活性化する方法であって、（ｉ）本明細書に開示される任意の人工抗原提示細胞複合体を提供することと、（ｉｉ）人工抗原提示細胞複合体を、抗原ペプチドを用いてプライミングして、人工抗原提示細胞複合体中のゲル化ヒト樹状細胞の表面上にペプチドをディスプレイすることと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において産生された人工抗原提示細胞複合体を、免疫細胞を含む細胞集団と接触させて、免疫細胞を活性化することと、を含む、方法を提供する。任意選択で、方法は、ステップ（ｉｉｉ）において産生された活性化された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを更に含み得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、がん抗原、又は自己免疫疾患に関連する自己抗原に由来する。
【0014】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明において記載される。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明から、また並びに添付の特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A-1D】ＤＭＳＯ媒介性モノマー及び光開始剤透過を介したゲル化樹状細胞（Ｇ－ＤＣ）の調製及び特徴付けを示す図である。図１Ａは、ＤＭＳＯの存在下での細胞の細胞内ドメイン中へのヒドロゲルモノマー及び光開始剤の直接透過後のゲル化樹状細胞の調製を示す模式図である。ＵＶクロスリンカーを、光活性化架橋のために使用する。図１Ｂ：１０重量％ＰＥＧ－ＤＡゲル化緩衝液中でのインキュベーション後の細胞のＰＥＧ定量化は、細胞内ＰＥＧ－ＤＡモノマー濃度が、５分間のインキュベーションの後に飽和に近づくことを示す。図１Ｃ：フルオレセイン－ＤＡを用いて調製したゲル化樹状細胞の蛍光及び明視野顕微鏡観察は、ゲル化樹状細胞が、ＰＢＳ中及び水中の懸濁に際して構造的完全性を保持することを示す。図１Ｄ：Ｇ－ＤＣの安定性を、ＰＢＳ中での２１日間の懸濁後に評価する。
【図2A-2F】Ｇ－ＤＣ抗原提示が、細胞内ヒドロゲル化後のペプチドパルスによって調節され得ることを示す図である。図２Ａ：ペプチド抗原が、細胞内ヒドロゲル化後にＪＡＷＳＩＩ細胞に付加され得ることを示す模式図。図２Ｂ～２Ｃ：ＪＡＷＳＩＩ細胞を、ＬＰＳで処理し、次いで、光活性化ヒドロゲルシステムによってゲル化した。非活性化Ｇ－ＤＣ群において、ペプチド及びＬＰＳ活性化なしの対照ＪＡＷＳＩＩ細胞をゲル化のために調製した。活性化Ｇ－ＤＣ群において、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、細胞内ヒドロゲル化前のＪＡＷＳＩＩのＬＰＳ活性化の間に添加した。ＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣ群において、ＪＡＷＳＩＩをＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの非存在下で活性化し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、ＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣ付加ＯＴ－Ｉペプチド群に細胞内ヒドロゲル化後に添加した。全ての群の表面上のＨ－２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体を、フローサイトメトリーによって観察した。非活性化、活性化及びＬＰＳ処理細胞を含む対照群もまた、表面マーカー比較のためにゲル化した。ヒストグラム（図２Ｂ）及び棒グラフ（図２Ｃ）は、回収したＣＤ８＋細胞集団上のＨ－２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の％を示す。非染色Ｔ細胞群（灰色ヒストグラムの塗りつぶしとして示す）を陰性対照フローサイトメトリーとして使用した。エラーバーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。（図２Ｄ～２Ｆ）ペプチド交換されたＧ－ＤＣ及びその対照群の、ＣＦＳＥ染色ＯＴ－Ｉ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養は、ペプチド交換され活性化されたＧ－ＤＣによるＴ細胞拡大を示したが、非活性化及びＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣによるＴ細胞拡大は示されなかった。ヒストグラムは、ＣＦＳＥ増殖プロファイルを示し、ＣＦＳＥ希釈ピークは、細胞分裂の程度を示す（図２Ｄ）。棒グラフは、様々な分裂の世代にある細胞のパーセンテージを示す（図２Ｅ）。様々なＧ－ＤＣとの共培養の後の細胞数及び相対的倍率変化を（図２Ｆ）に示す。各培養条件は、３：１のＴ細胞／Ｇ－ＤＣ比で、ウェル当たり８×１０４個の固定数のＤＣを含有した。棒グラフにおける棒の配置は、左から右へ、非活性化、ＬＰＳ処理及びＯＴＩパルス、ＬＰＳ処理のみ、並びにＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスである。
【図3A-3F】Ｇ－ＤＣを凍結及び凍結乾燥の両方によって貯蔵した後に、ＣＤ８０がペプチド交換されたＧ－ＤＣの表面上に提示されることを示す図である。１０重量％ＰＥＧ－ＤＡを用いて調製したゲル化ＪＡＷＳＩＩ細胞を、１０％スクロース中で－２０℃で凍結したか（図３Ｃ及び３Ｄ）、又は凍結乾燥した（図３Ｅ及び３Ｆ）。７２時間の貯蔵の後、Ｇ－ＤＣを、水中での融解又は再懸濁に際して観察した。細胞表面上のＭＨＣクラスＩ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の発現をフローサイトメトリーによって検出した。ヒストグラム（図３Ａ、３Ｃ、及び３Ｅ）並びに棒グラフ（図３Ｂ、３Ｄ、及び３Ｆ）は、回収した細胞集団における最大の％を示す。図３Ａ及び３Ｂは、対照、非凍結又は非凍結乾燥細胞である。同様のパターンは、ＬＰＳ処理及びＯＴＩパルス、ＬＰＳ処理並びにＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスＧ－ＤＣにおいて観察された。棒グラフにおける棒の配置は、左から右へ、非活性化、ＬＰＳ処理及びＯＴＩパルス、ＬＰＳ処理のみ、並びにＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスである。
【図4A-4G】Ｇ－ＤＣの機能性が凍結又は凍結乾燥での貯蔵後に保持されることを示す図である。図４Ａ：ゲル化ＪＡＷＳＩＩについての凍結によるか又は凍結乾燥による貯蔵を示す模式図。非活性化Ｇ－ＤＣ群において、ペプチド及びＬＰＳ活性化なしの対照ＪＡＷＳＩＩ細胞をゲル化のために調製した。活性化Ｇ－ＤＣ群において、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、細胞内ヒドロゲル化前のＪＡＷＳＩＩのＬＰＳ活性化の間に添加した。ＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣ群において、ＪＡＷＳＩＩをＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの非存在下で活性化し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、細胞内ヒドロゲル化後のＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣに添加した。ＰＢＳ中に懸濁した対照細胞及び様々なＧ－ＤＣの明視野顕微鏡法。様々な貯蔵及び再懸濁後のＧ－ＤＣの真球度を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。図４Ｂ～４Ｄ：様々なＧ－ＤＣを－８０Ｃで凍結し、Ｔ細胞拡大のために融解した。全ての群の、ＣＦＳＥ染色ＯＴ－Ｉ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養は、活性化Ｇ－ＤＣ及びパルス後群によるＴ細胞拡大を示したが、非活性化及びＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣによるＴ細胞拡大は示されなかった。ヒストグラムは、そのＣＦＳＥ増殖プロファイルを示し、ＣＦＳＥ希釈ピークは、分裂した時間を示した。棒グラフは、全ての群における世代のパーセント及び細胞数を示した。各培養条件は、３：１のＴ細胞／Ｇ－ＤＣ比で、ウェル当たり８×１０４個の固定数のＤＣを含有した。染色対照Ｔ細胞を参照として黒色でプロットする。図４Ｅ～４Ｇ：様々なＧ－ＤＣを、凍結乾燥し、次いで、Ｔ細胞拡大のために培地中で再構成した。エラーバーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。棒グラフにおける棒の配置は、左から右へ、非活性化、ＬＰＳ処理及びＯＴＩパルス、ＬＰＳ処理のみ、並びにＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスである。
【図5A-5D】Ｇ－ＤＣを凍結及び凍結乾燥の両方によって貯蔵した後に、ＭＨＣクラス－Ｉ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体がペプチド交換されたＧ－ＤＣの表面上に提示されることを示す図を含む。１０重量％ＰＥＧ－ＤＡを用いて調製したゲル化ＪＡＷＳＩＩ細胞を、１０％スクロース中で－２０℃で凍結したか、又は凍結乾燥した。７２時間の貯蔵後、Ｇ－ＤＣを、水中での融解又は再懸濁に際して観察した。細胞表面上のＭＨＣクラスＩ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の発現をフローサイトメトリーによって検出した。ヒストグラム（図５Ａ及び５Ｃ）並びに棒グラフ（図５Ｂ及び５Ｄ）は、回収した細胞集団における最大の％を示す。同様のパターンは、ＬＰＳ処理及びＯＴＩパルスＧ－ＤＣとＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスＧ－ＤＣとの間で観察された。棒グラフにおける棒の配置は、左から右へ、非活性化、ＬＰＳ処理及びＯＴＩパルス、ＬＰＳ処理のみ、並びにＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスである。
【図6】Ｇ－ＤＣが、凍結及び凍結乾燥の両方によって成功裏に貯蔵され得ることを示す写真を含む。１０重量％ＰＥＧ－ＤＡを注入したゲル化ＪＡＷＳＩＩ細胞を、１０％スクロース中で－２０℃で凍結するか、又は１０％スクロース中で凍結乾燥するかした。７２時間の貯蔵の後、Ｇ－ＤＣを、Ｈ２Ｏ中での融解又は再懸濁に際して観察した。様々な貯蔵条件下のＧ－ＤＣについて、識別可能な形態の変化は観察されなかった。スケールバー＝１００μｍ。
【図7A-7E】凍結又は凍結乾燥での貯蔵後のＧ－ｈＤＣの調製及び特徴付けを示す図を含む。図７Ａ：光活性化架橋後のＧ－ｈＤＣの調製を示す模式図。図７Ｂ：Ｇ－ｈＤＣを、凍結又は凍結乾燥での貯蔵後に顕微鏡を使用して画像化した。図７Ｃ：フルオレセイン－ＤＡを用いて調製したＧ－ｈＤＣの蛍光及び明視野顕微鏡観察は、Ｇ－ｈＤＣが、ＰＢＳ中及び水中での懸濁に際して構造的完全性を保持することを示す。図７Ｄ～７Ｅ：ｈＤＣを光活性化ヒドロゲルシステムによってゲル化した。細胞表面上の表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって検出した。ヒストグラム及び棒グラフは、回収したＣＤ８＋細胞集団上のヒトＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ（図７Ｄ）並びにＣＤ８０及びＣＤ８６（図７Ｅ）複合体の％を示す。非染色Ｔ細胞群（灰色ヒストグラムの塗りつぶしとして示す）を陰性対照フローサイトメトリーとして使用した。エラーバーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【図8A-8E】Ｇ－ＤＣがサイトカイン放出、抗原提示スフェロイドの調製に適応可能であることを示す図を含む。図８Ａ：Ｇ－ＤＣをサイトカインロード微粒子（ＧＣ－ＭＰ）に組み込むことによる人工抗原提示細胞の構築を示す模式図。図８Ｂ：代表的なＧＣ－ＭＰを共焦点顕微鏡法下で観察した。ＰＬＧＡベースのＭＰを、ダブルエマルジョンプロセスを使用してＰＬＧＡ及びスルホ－ｃｙ５を混合することによって合成した。ＭＰを、蛍光顕微鏡を使用して画像化した。ポリ－Ｌ－リジンでのコーティング後、ＭＰをＧＣと混合し、次いで、カルボシアニン膜色素であるＤｉＯで染色した。ＧＣ－ＭＰを、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。図８Ｃ：ＧＣ－ＭＰのサイズ分布を、顕微鏡法画像のＩｍａｇｅＪ分析を通じて決定した。図８Ｄ：ＧＣ－ＭＰは、高度に安定であり、３０日間の観察に際して構造的完全性を保持する。図８Ｅ：ＧＣ－ＭＰのインビトロ放出プロファイルを４℃及び３７℃で行った。
【図9】３７及び４Ｃでの様々な組成の微粒子による放出速度論を示すチャートである。
【図10A-10E】抗腫瘍療法のためのＧＣ－ＭＰによる抗原特異的Ｔ細胞の拡大を示す図を含む。ＪＡＷＳＩＩ細胞を、活性化のためにＬＰＳ及びＯＴＩペプチドパルスで処理し、次いで、光活性化ヒドロゲルシステムによってゲル化した。図１０Ａ～１０Ｃ：ＣＦＳＥ染色ＯＴ－Ｉ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の、培地のみ、ＩＬ２ロード微粒子（ＭＰ－ＩＬ－２；ＧＣコーティングなし）、ＧＣ－ＭＰ（ＩＬ－２なし）、又はＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２との共培養は、ＧＣ－ＭＰ及びＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２によるＴ細胞拡大を示した。図１０Ａ：ヒストグラムは、ＣＦＳＥ増殖プロファイルを示し、ＣＦＳＥ希釈ピークは、分裂のレベルを表す。図１０Ｂ：棒グラフは、様々な細胞の世代にある細胞のパーセントを示す。図１０Ｃ：様々なａＡＰＣシステムとの３及び６日間の共培養後の、全ての群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的倍率変化。図１０Ｄ：ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍治療のためのＴ細胞拡大及び投与スキームを示す模式図。図１０Ｅ：Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞（５×１０５個の細胞）を背側側腹部領域中の皮下に皮下移植し、拡大した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をｉ．ｖ．によって０日目に投与した。腫瘍サイズをモニターし、（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｗは幅であり、Ｌは長さである）として計算した。各培養条件は、３：１のＴ細胞／Ｇ－ＤＣ比で、ウェル当たり８×１０４個の固定数のＤＣを含有した。エラーバーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製するための従来の合成アプローチとは対照的に、本開示は、細胞内ゲル化を介して生存ヒト樹状細胞をａＡＰＣに変換するためのアプローチに関する。ゲル化ヒト樹状細胞は、サイトカインを分泌して、本明細書に開示されるように免疫細胞を完全に活性化することができる人工抗原提示細胞複合体を形成することができる制御放出システムと会合され得る。ゲル化細胞を作製するための方法は、ＪＡＷＳＩＩマウスＤＣ細胞株及びヒト初代ＤＣを、凍結又は凍結乾燥を介して貯蔵されることができる堅牢なａＡＰＣに成功裏に転換した。ＪＡＷＳＩＩ由来ａＡＰＣを使用して、ペプチド抗原交換を介した構築物のモジュール性及び微粒子カップリングを通じた持続性サイトカイン放出をすることができるゲル化細胞スフェロイドの調製が実証された。ＤＣ由来ａＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞の拡大を成功裏にトリガーし、マウスにおける養子Ｔ細胞療法の抗がん有効性を向上させた。
【0017】
したがって、生存ヒト樹状細胞から変換され得るゲル化ヒト樹状細胞、及び、任意選択で、サイトカインを分泌するための制御放出システムを含む人工抗原提示細胞システム、生存ヒト樹状細胞からゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法、並びに本明細書に開示されるａＡＰＣシステムを使用してＴ細胞などの免疫細胞を活性化するための方法が、本明細書に開示される。
【0018】
Ｉ．人工抗原提示細胞複合体
いくつかの態様では、本開示は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）複合体であって、生存ヒト樹状細胞に由来する１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞と、１つ以上のサイトカインを包含する制御放出システムと、を含む、人工抗原提示細胞を提供する。開示されるａＡＰＣ複合体は、免疫細胞を完全に活性化することができる。
いくつかの態様では、本開示は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）複合体であって、生存ヒト樹状細胞に由来する１つ以上のゲル化ヒト樹状細胞と、１つ以上のサイトカインを包含する制御放出システムと、を含む、人工抗原提示細胞を提供する。開示されるａＡＰＣ複合体は、免疫細胞を完全に活性化することができる。
【0019】
（ｉ）ゲル化ヒト樹状細胞
本明細書に開示されるゲル化ヒト樹状細胞は、細胞内ゲル化を介して生存ヒト樹状細胞から変換され得る。本明細書で使用される場合、ゲル化ヒト樹状細胞は、天然に存在するヒト樹状細胞に対して非天然である、細胞内架橋ポリマー（すなわち、ゲル化）を含むヒト樹状細胞を指す。ゲル化ヒト樹状細胞は、ヒトドナーから得られたヒト樹状細胞から変換され得る。あるいは、ゲル化ヒト樹状細胞は、インビトロで培養されたヒト樹状細胞株から変換され得る。
本明細書に開示されるゲル化ヒト樹状細胞は、細胞内ゲル化を介して生存ヒト樹状細胞から変換され得る。本明細書で使用される場合、ゲル化ヒト樹状細胞は、天然に存在するヒト樹状細胞に対して非天然である、細胞内架橋ポリマー（すなわち、ゲル化）を含むヒト樹状細胞を指す。ゲル化ヒト樹状細胞は、ヒトドナーから得られたヒト樹状細胞から変換され得る。あるいは、ゲル化ヒト樹状細胞は、インビトロで培養されたヒト樹状細胞株から変換され得る。
【0020】
好ましくは、ゲル化ヒト樹状細胞中の架橋ポリマーは、生体適合性である。当該技術分野で知られている任意の生体適合性ポリマーが、ゲル化ヒト樹状細胞を作製するために使用され得る。１つの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、これは、官能基、例えば、アクリル官能基を含み得る。別の例は、Ｎ（２－ヒドロプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）である。
【0021】
いくつかの実施形態では、ゲル化ヒト樹状細胞は、樹状細胞の表面上に発現されたＭＨＣ分子と複合体形成した抗原ペプチドを含む。いくつかの例では、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子によってゲル化樹状細胞の表面上にディスプレイされる。他の例では、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってゲル化樹状細胞の表面上にディスプレイされる。抗原ペプチドは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、がん抗原、又は自己免疫疾患に関連する自己抗原の断片であり得る。いくつかの場合では、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドであり得る。例えば、抗原ペプチドは、ＨＬＡ－Ａ（例えば、Ａ＊０２０１若しくはＡ＊２４０２）、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃに拘束され得る。他の場合では、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドであり得る。例えば、抗原ペプチドは、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、又はＨＬＡ－ＤＲＢ１に拘束され得る。１つ以上の特異的ＭＨＣクラスＩ分子及び／又はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するゲル化ヒト樹状細胞は、必要とされるＭＨＣ分子を有するヒトドナーから得られ得る。
【0022】
（ｉｉ）サイトカイン分泌のための制御放出システム
本明細書に開示される人工抗原提示細胞複合体は、本明細書に開示されるゲル化ヒト樹状細胞のうちの１つ以上と会合した制御放出システムを更に含み得る。制御放出システムは、１つ以上のサイトカインと会合しており、例えば、サイトカインのうちの１つ以上を封入している。制御放出システムは、１つ以上のサイトカインが延長された期間にわたって放出され得るように、会合したサイトカインを制御された速度で放出することができる送達システムである。いくつかの実施形態では、制御放出システムは、１つ以上のサイトカインが予め設計された様式で放出され得るようにして、１つ以上のサイトカインと慎重に組み合わされている１つ以上の生体適合性ポリマー（例えば、天然又は合成）を含む。サイトカインの放出は、長期間にわたって一定であり得る。あるいは、サイトカインの放出は、長期間にわたって周期的であり得るか、又は環境若しくは他の外部事象によってトリガーされ得る。制御放出システムは、それにサイトカインが共有結合的又は非共有結合的な相互作用（例えば、静電相互作用又は水素結合）を介して会合され得る、１つ以上の生体適合性材料を含み得る。生体適合性材料は、ポリマー、例えば、ヒドロゲルを形成する親水性ポリマーであり得る。ヒドロゲルは、親水性であるポリマー鎖のネットワークである。ヒドロゲルネットワークにおいて、親水性ポリマーは、ポリマーの架橋によって三次元構造を形成し得る。
本明細書に開示される人工抗原提示細胞複合体は、本明細書に開示されるゲル化ヒト樹状細胞のうちの１つ以上と会合した制御放出システムを更に含み得る。制御放出システムは、１つ以上のサイトカインと会合しており、例えば、サイトカインのうちの１つ以上を封入している。制御放出システムは、１つ以上のサイトカインが延長された期間にわたって放出され得るように、会合したサイトカインを制御された速度で放出することができる送達システムである。いくつかの実施形態では、制御放出システムは、１つ以上のサイトカインが予め設計された様式で放出され得るようにして、１つ以上のサイトカインと慎重に組み合わされている１つ以上の生体適合性ポリマー（例えば、天然又は合成）を含む。サイトカインの放出は、長期間にわたって一定であり得る。あるいは、サイトカインの放出は、長期間にわたって周期的であり得るか、又は環境若しくは他の外部事象によってトリガーされ得る。制御放出システムは、それにサイトカインが共有結合的又は非共有結合的な相互作用（例えば、静電相互作用又は水素結合）を介して会合され得る、１つ以上の生体適合性材料を含み得る。生体適合性材料は、ポリマー、例えば、ヒドロゲルを形成する親水性ポリマーであり得る。ヒドロゲルは、親水性であるポリマー鎖のネットワークである。ヒドロゲルネットワークにおいて、親水性ポリマーは、ポリマーの架橋によって三次元構造を形成し得る。
【0023】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される制御放出システムは、１つ以上のサイトカインと会合した微粒子又はナノ粒子を含む。いくつかの場合では、微粒子は、サイトカインを封入し得る。他の場合では、サイトカインは、微粒子に付着され得る。微粒子は、制御放出薬物送達システムにおいて一般的に使用されるポリマーを含む、１つ以上の好適なポリマーによって作製され得る。いくつかの例では、微粒子を作製するためのポリマーは、生分解性である。例としては、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリウレタン、ポリアクリレート、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
微粒子は、ゲル化ヒト樹状細胞のうちの１つ以上がそれに付着することを可能にする好適なサイズのものであり得る。例えば、微粒子は、約１～約１，０００ミクロン、例えば、約１０～１００、約１００～２００、約２００～４００、約４００～６００、約６００～８００、又は約８００～１，０００ミクロンの平均サイズを有し得る。いくつかの例では、本明細書に開示される微粒子の平均サイズは、約５０～１００ミクロン、例えば、約７５ミクロンであり得る。
【0025】
他の実施形態では、本明細書に開示される制御放出システムは、サイトカインと会合したリポソーム又は平面基材を含み得る。
【0026】
制御放出システム中に含有されるサイトカインは、Ｔ細胞などの免疫細胞を活性化し得るものを含み得る。例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－λ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0027】
本明細書に開示される任意の制御放出システム、例えば、微粒子は、従来の方法によって調製され得る。例えば、以下の実施例２を参照されたい。次いで、制御放出システムは、任意のゲル化ヒト樹状細胞と、直接的に又はリンカー、例えば、ポリ－リジン分子を介してのいずれかでカップリングされ得る。
【0028】
ＩＩ．ゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法
本明細書に開示されるものなどの、ゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法もまた本明細書において提供される。生体適合性ポリマーの細胞内架橋を有するゲル化細胞を作製するために、得られたゲル化細胞が細胞形態及び特定の機能、例えば、抗原提示を維持するように、ポリマーは、細胞膜構造を破壊することなしにインサイツ重合のために細胞中に送達される必要がある。伝統的に、凍結融解アプローチが、細胞にポリマーを注入するために使用された。例えば、ＷＯ２０１８／０２６６４４を参照されたい。このアプローチは制限を有する。なぜなら、それは脆弱な細胞に好適ではなく、スケーラビリティが発せられることを課し得るからである。それとは異なって、本明細書に開示される方法は、ＤＭＳＯ媒介性ポリマー注入アプローチの使用を含む。驚くべきことに、ＤＭＳＯの存在下で、低分子量ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）が、高効率で生存ヒト樹状細胞の形質膜を通して成功裏に透過したことが本明細書において示された。得られたゲル化樹状細胞は抗原提示活性を示し、これは、ＤＭＳＯ媒介性注入アプローチが、ゲル化細胞の膜構造の完全性を維持したことを実証する。
本明細書に開示されるものなどの、ゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法もまた本明細書において提供される。生体適合性ポリマーの細胞内架橋を有するゲル化細胞を作製するために、得られたゲル化細胞が細胞形態及び特定の機能、例えば、抗原提示を維持するように、ポリマーは、細胞膜構造を破壊することなしにインサイツ重合のために細胞中に送達される必要がある。伝統的に、凍結融解アプローチが、細胞にポリマーを注入するために使用された。例えば、ＷＯ２０１８／０２６６４４を参照されたい。このアプローチは制限を有する。なぜなら、それは脆弱な細胞に好適ではなく、スケーラビリティが発せられることを課し得るからである。それとは異なって、本明細書に開示される方法は、ＤＭＳＯ媒介性ポリマー注入アプローチの使用を含む。驚くべきことに、ＤＭＳＯの存在下で、低分子量ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）が、高効率で生存ヒト樹状細胞の形質膜を通して成功裏に透過したことが本明細書において示された。得られたゲル化樹状細胞は抗原提示活性を示し、これは、ＤＭＳＯ媒介性注入アプローチが、ゲル化細胞の膜構造の完全性を維持したことを実証する。
【0029】
したがって、ゲル化ヒト樹状細胞を産生するための方法であって、（ａ）ヒト樹状細胞の集団を提供することと、（ｂ）ゲル化緩衝液をヒト樹状細胞中に透過させることであって、ゲル化緩衝液が、光開始剤、ポリマー、及びジメチルスルホキシドを含む、透過させることと、（ｃ）ゲル化緩衝液を透過させたヒト樹状細胞を光に曝露して、ポリマー又は重合性モノマーの架橋を引き起こし、それによってゲル化ヒト樹状細胞を形成することと、を含む、方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ゲル化ヒト樹状細胞を、１つ以上のサイトカインと会合している制御放出システムにカップリングすることを更に含み得る。
【0030】
ヒト樹状細胞の集団は、体液ドナーに由来し得る。例えば、ヒト樹状細胞は、ヒト血液細胞又はヒト骨髄細胞から単離又は濃縮され得る。あるいは、ヒト樹状細胞の集団は、インビトロで培養されたＤＣ細胞株であり得る。
【0031】
ゲル化緩衝液は、光開始剤、ポリマー又は重合性モノマー、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ゲル化緩衝液は、活性化に際して互いに反応して、ポリマーの架橋を導き得る架橋部分を含むポリマーを含む。フリーラジカルなどの反応性種の存在下で架橋されて、ゲルを形成し得る任意の生体適合性ポリマーは、本明細書に開示されるゲル化ヒト樹状細胞を作製するために使用され得る。例えば、ポリマーは、熱、光、特定のｐＨ条件、又は化学物質によってトリガーされた架橋を形成し得る。いくつかの場合では、ポリマーは、架橋部分、例えば、アクリルポリマーを含む。いくつかの例では、アクリルポリマーは、ジアクリレート部分を含み得る。特定の例では、アクリルポリマーは、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）、例えば、約２５０～２，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧ－ＤＡである。いくつかの例では、本明細書で使用されるＰＥＧ－ＤＡは、約６００～約８００ダルトン（例えば、約７００ダルトン）の平均分子量を有し得る。ゲル化ヒト樹状細胞の作製における使用のための他の例示的なポリマーとしては、ポリアクリルアミド誘導体、例えば、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧトリブロックコポリマー、ヒドロキシエチルメタクリレート－メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ－ＭＭＡ）、ポリアクリロニトリル－ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ－ＰＶＣ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ｐｏｌｙＮＩＰＡＭ）、ポリ（Ｎ－ビニルカプロラクタム）、セルロース誘導体、エチレンオキシド－プロピレン、又はＭａｔｒｉｇｅｌが挙げられる。
【0032】
他の実施形態では、ゲル化緩衝液は、重合性モノマーを含み得、これは、例えば、フリーラジカルなどの反応性種の存在下で、活性化に際してポリマー又はヒドロゲルを形成することができる任意のモノマーである。重合性モノマーの例としては、アクリレート又はジアクリレート化合物が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、アクリル酸、アクリル酸ナトリウム、及びエチレングリコールジメタクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。活性化に際して、そのような重合性モノマーは、対応するポリマー、例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ（アクリル酸）、又はポリ（エチレングリコールジメタクリレート）を形成し得る。
【0033】
光開始剤は、エネルギー源（例えば、可視又はＵＶなどの光、熱など）に曝露されるときに反応性種、例えば、フリーラジカル、カチオン、又はアニオンを作る分子である。任意の光開始剤が、本明細書に開示される方法において使用され得る。光開始剤の例としては、カチオン性光開始剤（例えば、オニウム塩、有機金属、及びピリジニウム塩）、並びにフリーラジカル光開始剤（例えば、ベンゾフェノン、キサントン、キノン、ベンゾインエーテル、アセトフェノン、ベンゾイルオキシム、及びアシルホスフィン）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの特定の例では、光開始剤は、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンであり得る。他の光開始剤は、例えば、ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｇｅｎｅｒａｌ＿Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｏｒｓ．ｐｄｆ（その関連する開示は、本明細書で言及される目的及び主題のために参照により組み込まれる）で見出され得る。
【0034】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、その値がいかにして測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの制約に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例によって、許容可能な標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、より好ましくはなお最大±１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的なシステム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲において記載される場合、別段の記述がない限り、「約」という用語は黙示的であり、この文脈において、特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味する。
【0035】
光開始剤、ポリマー又は重合性モノマーがヒト樹状細胞中に入るとき、細胞はエネルギー源に曝露され得、この下で、光開始剤はフリーラジカルなどの反応性種を放出して、ポリマーの架橋をトリガーし、それによってゲル化ヒト樹状細胞を産生する。架橋部分を含むポリマーが使用されるとき、架橋は架橋部分を介して生じ得る。あるいは、架橋剤が使用されるとき、架橋剤はポリマーの架橋を媒介し得る。エネルギー源は、ＵＶ光又は可視光などの光であり得る。
【0036】
本明細書に開示される方法によって産生される任意のゲル化ヒト樹状細胞もまた、本開示の範囲内である。そのようなゲル化ヒト樹状細胞は、開示される任意の制御放出システムとともに、ゲル化細胞の制御放出システムとの複合体形成を可能にするために好適な条件下で好適な期間インキュベートされ得、それによって本明細書に開示される人工抗原提示細胞複合体を産生する。このカップリングプロセスは、ポリ－リジン分子の存在下で実施され得る。
【0037】
ＩＩＩ．免疫細胞活性化のための人工抗原提示細胞複合体の使用
本明細書に開示される任意の人工抗原提示細胞複合体を使用して、Ｔ細胞などの免疫細胞を活性化し得る。したがって、免疫細胞を活性化する方法であって、（ｉ）本明細書に開示される任意の人工抗原提示細胞複合体を提供することと、（ｉｉ）人工抗原提示細胞複合体を抗原ペプチドを用いてプライミングして、人工抗原提示細胞複合体中のゲル化ヒト樹状抗原提示細胞の表面上にペプチドをディスプレイすることと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において産生された人工抗原提示細胞複合体を、免疫細胞を含む細胞集団と接触させて、免疫細胞を活性化することと、を含む、方法もまた本明細書において提供される。
本明細書に開示される任意の人工抗原提示細胞複合体を使用して、Ｔ細胞などの免疫細胞を活性化し得る。したがって、免疫細胞を活性化する方法であって、（ｉ）本明細書に開示される任意の人工抗原提示細胞複合体を提供することと、（ｉｉ）人工抗原提示細胞複合体を抗原ペプチドを用いてプライミングして、人工抗原提示細胞複合体中のゲル化ヒト樹状抗原提示細胞の表面上にペプチドをディスプレイすることと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において産生された人工抗原提示細胞複合体を、免疫細胞を含む細胞集団と接触させて、免疫細胞を活性化することと、を含む、方法もまた本明細書において提供される。
【0038】
ａＡＰＣ複合体をプライミングするためのペプチドの選択は、活性化しようとするＴ細胞などの免疫細胞の特異性に依存する。例えば、抗腫瘍Ｔ細胞を活性化しようとする場合、腫瘍抗原に由来する抗原ペプチドを使用して、ａＡＰＣをプライミングし得る。標的ペプチドが決定されると、好適なａＡＰＣが、活性化のために標的ペプチドをＴ細胞に提示するために使用され得る。好適なａＡＰＣ複合体は、抗原提示のためにＭＨＣ／ペプチド複合体を形成することができる好適なＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を有するゲル化ヒト樹状細胞を含む。活性化のために標的ペプチド及び免疫細胞に基づいて好適なａＡＰＣ複合体を選択することは、当業者の知識の範囲内である。
【0039】
いくつかの実施形態では、抗腫瘍Ｔ細胞を活性化するために、腫瘍抗原に由来する抗原ペプチドを使用して、ａＡＰＣ複合体をプライミングする。次いで、得られた活性化抗腫瘍Ｔ細胞は、腫瘍抗原を担持する腫瘍を治療するために使用され得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、病原体に特異的なＴ細胞を活性化するために、病原体抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は寄生虫抗原）に由来する抗原ペプチドを使用して、ａＡＰＣ複合体をプライミングし得る。得られた活性化Ｔ細胞は、病原体によって引き起こされる感染症を治療するために使用され得る。
【0041】
いくつかの実施形態では、刺激性自己反応性ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞を抑制し得るＴ細胞、例えば、制御性Ｔ細胞（例えば、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞）を活性化するために、自己免疫疾患に関連する自己抗原に由来する抗原ペプチドを使用して、ａＡＰＣ複合体をプライミングし得る。ａＡＰＣ複合体を使用して、表面ディスプレイされたＭＨＣ－ＩＩ／ペプチド複合体を介してそのような制御性Ｔ細胞を活性化し、任意選択で、免疫抑制性サイトカイン、例えば、ＩＬ１０及びＴＧＦ－ベータを放出させ得る）。
【0042】
一般技術
本開示の実行は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用い、これは、当該技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献において十分に説明されている。
本開示の実行は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用い、これは、当該技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献において十分に説明されている。
【0043】
更なる詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明をその最大の程度まで利用し得ると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単に例示的であるとして解釈されるべきものであり、いかにしても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的又は主題のために参照により組み込まれる。
【実施例】
【0044】
本開示をその特定の実施形態を参照して説明したが、本開示の真の趣旨及び範囲から逸脱することなしに種々の変更がなされ得、等価物が代わりとなり得ることを当業者は理解するはずである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセスステップ又はステップを、本開示の目的、趣旨、及び範囲に適応させるために多くの改変がなされ得る。全てのそのような改変は、本開示の範囲内であることが意図される。
【0045】
実施例１．細胞内ヒドロゲル化を介したゲル化樹状細胞の調製及びゲル化樹状細胞の特徴付け
免疫療法及び養子細胞療法の発展は、Ｔ細胞活性化及び拡大のための天然抗原提示細胞を模倣する生体材料開発の漸増する関心を促した。合成基材にＴ細胞活性化のキューを積層することを目的とする従来のボトムアップアプローチとは対照的に、本研究は、生存樹状細胞（ＤＣ）を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に直接的に転換するための容易なヒドロゲル化技術を実証する。ＤＭＳＯ媒介性細胞内ヒドロゲルモノマー透過及びＵＶ活性化ラジカル重合を通じて、細胞内ヒドロゲル化がＤＣ中で迅速に生じ、凍結及び凍結乾燥によって貯蔵可能な、ペプチド抗原交換を受け入れる高度に堅牢なモジュールの細胞－ゲルハイブリッド構築物がもたらされる。
免疫療法及び養子細胞療法の発展は、Ｔ細胞活性化及び拡大のための天然抗原提示細胞を模倣する生体材料開発の漸増する関心を促した。合成基材にＴ細胞活性化のキューを積層することを目的とする従来のボトムアップアプローチとは対照的に、本研究は、生存樹状細胞（ＤＣ）を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に直接的に転換するための容易なヒドロゲル化技術を実証する。ＤＭＳＯ媒介性細胞内ヒドロゲルモノマー透過及びＵＶ活性化ラジカル重合を通じて、細胞内ヒドロゲル化がＤＣ中で迅速に生じ、凍結及び凍結乾燥によって貯蔵可能な、ペプチド抗原交換を受け入れる高度に堅牢なモジュールの細胞－ゲルハイブリッド構築物がもたらされる。
【0046】
材料及び方法
（ｉ）細胞内ゲル化
ゲル化緩衝液を、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）中に溶解した１．５ｇ／ｍＬの２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ Ｄ－２９５９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２０μＬを用いて調製し、２００μＬのポリ（エチレングリコール）－ジアクリレート（「ＰＥＧ－ＤＡ」）（これは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されていた）と混合した。ＰＥＧ－ＤＡは、７００Ｄａの平均分子量（Ｍｎ）を有する。５×１０６個のＪＡＷＳＩＩ細胞を収集し、１×プロテアーゼ阻害剤を含有するフェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）１ｍＬ中に懸濁した。ＤＭＥＭは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、番号ＣＡ２１０６３－０２９の下で市販されていた。細胞懸濁液中１０重量％のＰＥＧ－ＤＡ濃度に達するように、細胞懸濁液に、ゲル化緩衝液を１：１０の体積比で添加した。室温での５分間のインキュベートの後、細胞をペレット化し、ゲル化緩衝液を含まないフェノレッド不含ＤＭＥＭ ５００μｌ中に再懸濁し、ＵＶオーブン（ＵＶＰ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ，Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ、ＵＳ）中で５分間３６５ｎｍの青色光照射に供した。得られたゲル化細胞（「ＧＣ」）を、更なる実験の前にリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で洗浄した。
（ｉ）細胞内ゲル化
ゲル化緩衝液を、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）中に溶解した１．５ｇ／ｍＬの２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ Ｄ－２９５９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２０μＬを用いて調製し、２００μＬのポリ（エチレングリコール）－ジアクリレート（「ＰＥＧ－ＤＡ」）（これは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されていた）と混合した。ＰＥＧ－ＤＡは、７００Ｄａの平均分子量（Ｍｎ）を有する。５×１０６個のＪＡＷＳＩＩ細胞を収集し、１×プロテアーゼ阻害剤を含有するフェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）１ｍＬ中に懸濁した。ＤＭＥＭは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、番号ＣＡ２１０６３－０２９の下で市販されていた。細胞懸濁液中１０重量％のＰＥＧ－ＤＡ濃度に達するように、細胞懸濁液に、ゲル化緩衝液を１：１０の体積比で添加した。室温での５分間のインキュベートの後、細胞をペレット化し、ゲル化緩衝液を含まないフェノレッド不含ＤＭＥＭ ５００μｌ中に再懸濁し、ＵＶオーブン（ＵＶＰ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ，Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ、ＵＳ）中で５分間３６５ｎｍの青色光照射に供した。得られたゲル化細胞（「ＧＣ」）を、更なる実験の前にリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で洗浄した。
【0047】
ヒドロゲルの蛍光標識のために、１８ｍｇ／ｍＬのフルオレセインＯ，Ｏ’－ジアクリレート（これは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能であった）１００μＬをＤＭＳＯ中に溶解し、ＰＥＧ－ＤＡ、次いで、Ｉｒｇａｃｕｒｅ Ｄ－２９５９と上記のように混合した。蛍光性ゲル化緩衝液を、細胞ゲル化のために、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ及び収集した上清と混合した。
【0048】
（ｉｉ）細胞内ＰＥＧ－ＤＡの定量化
細胞内ＰＥＧ－ＤＡ濃度の定量化を、ヨウ素ベースの定量化方法を使用して行った。Ｇ－ＤＣを生成するために、４×１０５個のＪＡＷＳＩＩ細胞を、指示された時間に１０重量％のゲル化緩衝液を含有するフェノールレッド不含ＤＭＥＭ １ｍＬを用いて懸濁した。Ｇ－ＤＣをＰＢＳで洗浄した後、細胞内ＰＥＧ－ＤＡを、１ｍＬの蒸留水処理を使用してＧ－ＤＣから遊離させ、凍結融解プロセスに供した。細胞片を３０００×ｇで５分間の遠心分離を介してスピンダウンした。上清を収集し、ＢａＣｌ２及びヨウ素溶液と８：２：１の比率で１５分間の発色のために混合した。試料中のＰＥＧ－ＤＡ濃度を、５３５ｎｍにおける光吸収を測定することによって決定した。標準曲線を、段階希釈したＰＥＧ－ＤＡを用いて用意した。次いで、測定したＰＥＧ－ＤＡ含有量を、ＪＡＷＳＩＩ細胞の総体積で割って、細胞内ＰＥＧ－ＤＡ濃度を決定した。
細胞内ＰＥＧ－ＤＡ濃度の定量化を、ヨウ素ベースの定量化方法を使用して行った。Ｇ－ＤＣを生成するために、４×１０５個のＪＡＷＳＩＩ細胞を、指示された時間に１０重量％のゲル化緩衝液を含有するフェノールレッド不含ＤＭＥＭ １ｍＬを用いて懸濁した。Ｇ－ＤＣをＰＢＳで洗浄した後、細胞内ＰＥＧ－ＤＡを、１ｍＬの蒸留水処理を使用してＧ－ＤＣから遊離させ、凍結融解プロセスに供した。細胞片を３０００×ｇで５分間の遠心分離を介してスピンダウンした。上清を収集し、ＢａＣｌ２及びヨウ素溶液と８：２：１の比率で１５分間の発色のために混合した。試料中のＰＥＧ－ＤＡ濃度を、５３５ｎｍにおける光吸収を測定することによって決定した。標準曲線を、段階希釈したＰＥＧ－ＤＡを用いて用意した。次いで、測定したＰＥＧ－ＤＡ含有量を、ＪＡＷＳＩＩ細胞の総体積で割って、細胞内ＰＥＧ－ＤＡ濃度を決定した。
【0049】
（ｉｉｉ）Ｔ細胞単離及び蛍光標識
ＯＴ－Ｉ細胞（Ｈ２－Ｋｂ文脈においてＯＶＡ２５７－２６４ペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞）を、ＯＴ－Ｉトランスジェニックマウスから単離した。マウスを屠殺した後、その脾臓を取り出し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地中に入れた。単一脾細胞を回収するために、脾臓を粉砕し、無菌の４０μｍナイロンセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆａｌｃｏｎ，＃３５２３４０）に対して５ｍｌシリンジを用いて引いた。脾細胞を、ＲＢＣ枯渇のためにＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ溶解緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃５５５８９９）とともに３分間インキュベートした。その後、ＯＴ－Ｉ細胞を、Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃１９８５３ Ａ）によって脾細胞から単離した。ＯＴ－Ｉ細胞の標識のために。細胞を５μＭのＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃２１８８８）を含有するＰＢＳとともに３７℃で５分間インキュベートすることによって、ＯＴ－ＩＴ細胞をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色した。細胞を完全培地で３回洗浄した。ＣＦＳＥ標識ＯＴ－Ｉ細胞を、続く実験研究のために回収した。
ＯＴ－Ｉ細胞（Ｈ２－Ｋｂ文脈においてＯＶＡ２５７－２６４ペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞）を、ＯＴ－Ｉトランスジェニックマウスから単離した。マウスを屠殺した後、その脾臓を取り出し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地中に入れた。単一脾細胞を回収するために、脾臓を粉砕し、無菌の４０μｍナイロンセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆａｌｃｏｎ，＃３５２３４０）に対して５ｍｌシリンジを用いて引いた。脾細胞を、ＲＢＣ枯渇のためにＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ溶解緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃５５５８９９）とともに３分間インキュベートした。その後、ＯＴ－Ｉ細胞を、Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃１９８５３ Ａ）によって脾細胞から単離した。ＯＴ－Ｉ細胞の標識のために。細胞を５μＭのＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃２１８８８）を含有するＰＢＳとともに３７℃で５分間インキュベートすることによって、ＯＴ－ＩＴ細胞をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色した。細胞を完全培地で３回洗浄した。ＣＦＳＥ標識ＯＴ－Ｉ細胞を、続く実験研究のために回収した。
【0050】
結果
（ｉ）ＤＭＳＯ媒介性ヒドロゲル注入を介した容易な細胞内ヒドロゲル化
氷プレート上でのヒドロゲル架橋のための一過性ＵＶ曝露の後、ＤＭＳＯ媒介性２－ヒドロキシル－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン光開始剤（Ｉ２９５９）及びポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマー（ＰＥＧ－ＤＡ；Ｍｎ ７００）を含有するゲル化緩衝液の直接透過によって、ゲル化細胞（ＧＣ）を調製した（図１Ａ）。細胞固定のための細胞内ゲル化の実現可能性を評価するために、本発明者らは、ＪＡＷＳＩＩマウスＤＣを使用して、１０重量％でゲル化樹状細胞（Ｇ－ＤＣ）を調製した。５分間のみのインキュベーション後に、細胞にＰＥＧ－ＤＡが理論的総細胞内体積までほぼ完全に浸潤した（図１Ｂ）。細胞内部のヒドロゲルを可視化するために、Ｇ－ＧＣを、緑色蛍光をヒドロゲルに共有結合的に染め込むフルオレセイン－ジアクリレート（Ｆ－ＤＡ）を含有するゲル化緩衝液によって調製した。Ｆ－ＤＡでの膜染色の後、ＧＣは、内側のヒドロゲル成分を有した（図１Ｃ）。生存ＤＣと比較して、光学顕微鏡下でのＧ－ＤＣにおける著しい形態変化は存在しない（図１Ｃ）。更に、Ｇ－ＤＣは、低浸透圧下で水中で安定であったが、生存ＤＣは直ちに破裂し、これは、Ｇ－ＧＣにおける構造的完全性が内部のヒドロゲルネットワーク形成によって保存され得ることを示す（図１Ｃ）。更に、Ｇ－ＤＣは、ＰＢＳ中での３０日間の懸濁後に構造的完全性及び形態を保持したが、生存ＤＣは崩壊し、これは、Ｇ－ＤＣが生存ＤＣよりも安定であることを示す（図１Ｄ）。
（ｉ）ＤＭＳＯ媒介性ヒドロゲル注入を介した容易な細胞内ヒドロゲル化
氷プレート上でのヒドロゲル架橋のための一過性ＵＶ曝露の後、ＤＭＳＯ媒介性２－ヒドロキシル－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン光開始剤（Ｉ２９５９）及びポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマー（ＰＥＧ－ＤＡ；Ｍｎ ７００）を含有するゲル化緩衝液の直接透過によって、ゲル化細胞（ＧＣ）を調製した（図１Ａ）。細胞固定のための細胞内ゲル化の実現可能性を評価するために、本発明者らは、ＪＡＷＳＩＩマウスＤＣを使用して、１０重量％でゲル化樹状細胞（Ｇ－ＤＣ）を調製した。５分間のみのインキュベーション後に、細胞にＰＥＧ－ＤＡが理論的総細胞内体積までほぼ完全に浸潤した（図１Ｂ）。細胞内部のヒドロゲルを可視化するために、Ｇ－ＧＣを、緑色蛍光をヒドロゲルに共有結合的に染め込むフルオレセイン－ジアクリレート（Ｆ－ＤＡ）を含有するゲル化緩衝液によって調製した。Ｆ－ＤＡでの膜染色の後、ＧＣは、内側のヒドロゲル成分を有した（図１Ｃ）。生存ＤＣと比較して、光学顕微鏡下でのＧ－ＤＣにおける著しい形態変化は存在しない（図１Ｃ）。更に、Ｇ－ＤＣは、低浸透圧下で水中で安定であったが、生存ＤＣは直ちに破裂し、これは、Ｇ－ＧＣにおける構造的完全性が内部のヒドロゲルネットワーク形成によって保存され得ることを示す（図１Ｃ）。更に、Ｇ－ＤＣは、ＰＢＳ中での３０日間の懸濁後に構造的完全性及び形態を保持したが、生存ＤＣは崩壊し、これは、Ｇ－ＤＣが生存ＤＣよりも安定であることを示す（図１Ｄ）。
【0051】
まとめると、これらの結果は、本明細書におけるゲル化アプローチの開示が、厳しい条件下で安定であり、抗原提示などの意図される生物活性のために細胞膜完全性を保持するＧ－ＧＣを産生するための効率的な方法であることを示す。
【0052】
（ｉｉ）Ｇ－ＤＣ細胞は細胞内ヒドロゲル化後のペプチド置換を通じて表面上に抗原を成功裏に提示した
生存樹状細胞は、本明細書に開示される手順に従って、ゲル化樹状細胞（Ｇ－ＤＣ）に成功裏に転換された（例えば、図１を参照されたい）。細胞内ヒドロゲル化後のＭＨＣクラスＩ－ペプチド複合体の形成を介したＧ－ＤＣによる抗原提示を調べた。ヒドロゲル化後に、Ｇ－ＤＣを、培地、ＬＰＳのみ、及びＬＰＳ－ＯＴＩペプチドで処理した。ＬＰＳによる処理の後、ＤＣを、細胞内ヒドロゲル化後にＯＴＩペプチドに曝露した。この群を、ＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルス群と名付ける。
生存樹状細胞は、本明細書に開示される手順に従って、ゲル化樹状細胞（Ｇ－ＤＣ）に成功裏に転換された（例えば、図１を参照されたい）。細胞内ヒドロゲル化後のＭＨＣクラスＩ－ペプチド複合体の形成を介したＧ－ＤＣによる抗原提示を調べた。ヒドロゲル化後に、Ｇ－ＤＣを、培地、ＬＰＳのみ、及びＬＰＳ－ＯＴＩペプチドで処理した。ＬＰＳによる処理の後、ＤＣを、細胞内ヒドロゲル化後にＯＴＩペプチドに曝露した。この群を、ＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルス群と名付ける。
【0053】
フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ８０発現（シグナル２）を、ＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣ、ＬＰＳ処理／ＯＴＩパルスＧ－ＤＣ並びにＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルス群において観察した（図３）。この結果は、ヒドロゲル化及びペプチド置換の両方が、ＤＣ表面マーカー発現に対する影響をほとんど有しないことを示す。加えて、ＭＨＣ－Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の発現（シグナル１）は、ＬＰＳ処理／ＯＴＩパルスＧ－ＤＣの９８．１％及びＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスＧ－ＤＣの９９．５％において見出され、一方、ＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣの２．１％のみが、ＭＨＣ－Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体を発現する（シグナル１）ことが見出された（図２Ｂ及び２Ｃ）。これらの結果は、細胞内ゲル化後にＧ－ＤＣにペプチド抗原を成功裏にロードし得、ヒドロゲル化後のペプチド置換は、Ｇ－ＤＣ上に見出される膜結合リンパ球活性化シグナルを損なわなかったことを実証する。
【0054】
次に、ＭＨＣクラスＩ－ペプチド複合体／ＴＣＲ相互作用を介したＴ細胞拡大をトリガーすることに対するペプチド抗原提示Ｇ－ＤＣの活性を、ＯＴ－Ｉトランスジェニックマウスに由来するＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔ細胞をＧ－ＤＣとともにインキュベートすることによって調べた。ペプチド抗原提示Ｇ－ＤＣは、標的Ｔリンパ球の拡大を有効にトリガーし、ＬＰＳ処理及びＯＴＩパルスＧ－ＤＣと比較して、同様のレベルの増殖、世代、及び細胞数を示した。（図２Ｄ及び２Ｅ）。Ｔ細胞数の増加もまた、時間依存的様式で観察され（図２Ｆ）、これは、細胞内ヒドロゲル化後ペプチドパルスプロセスが、抗原特異的Ｔ細胞応答を調節するＧ－ＤＣの機能性に影響しないことを示す。
【0055】
総合すると、これらのデータは、抗原提示が、ヒドロゲル化後のＧ－ＤＣ上で置換及び調節され得ることを示す。
【0056】
（ｉｉｉ）凍結及び凍結乾燥プロセスはＧ－ＤＣの機能性に影響を及ぼさなかった
次に、凍結又は凍結乾燥のいずれかによる本明細書に開示されるＧ－ＤＣの貯蔵を検討した。図４Ａに示すように、Ｇ－ＤＣを、凍結又は凍結乾燥（ｌｙｍｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後の形態、表面マーカー、及び機能性の保持について検討した）。上記の種々の群のＧ－ＤＣを、まず１０％スクロース中で凍結又は凍結乾燥し、次いで、水中で再構成した。図４に示すように、Ｇ－ＤＣは、凍結又は凍結乾燥後にその形状を維持した。対照細胞、ＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣ、ＬＰＳ処理／ＯＴＩパルスＧ－ＤＣ、並びにＧ－ＤＣに対するＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスにおいて、構造的交代は観察されず（図６）、これは、Ｇ－ＤＣの細胞形態が、凍結及び／又は凍結乾燥プロセス後に有効に保存されたことを示す。
次に、凍結又は凍結乾燥のいずれかによる本明細書に開示されるＧ－ＤＣの貯蔵を検討した。図４Ａに示すように、Ｇ－ＤＣを、凍結又は凍結乾燥（ｌｙｍｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後の形態、表面マーカー、及び機能性の保持について検討した）。上記の種々の群のＧ－ＤＣを、まず１０％スクロース中で凍結又は凍結乾燥し、次いで、水中で再構成した。図４に示すように、Ｇ－ＤＣは、凍結又は凍結乾燥後にその形状を維持した。対照細胞、ＬＰＳ処理Ｇ－ＤＣ、ＬＰＳ処理／ＯＴＩパルスＧ－ＤＣ、並びにＧ－ＤＣに対するＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスにおいて、構造的交代は観察されず（図６）、これは、Ｇ－ＤＣの細胞形態が、凍結及び／又は凍結乾燥プロセス後に有効に保存されたことを示す。
【0057】
凍結及び凍結乾燥試料の機能性を更に評価した。凍結又は凍結乾燥プロセスが様々なＧ－ＤＣの生物学的機能に対して何らかの影響を有したかどうかを調べるために、種々の群のＧ－ＤＣを、本明細書に開示される表面マーカー検出アッセイ（図３及び６）並びにＴ細胞増殖アッセイ（図３Ｂ～３Ｇ）において検討した。興味深いことに、シグナル１（図６）並びにシグナル２（図３Ｂ及び３Ｃ）の同様の発現パターンが、非凍結／非凍結凍結Ｇ－ＤＣと比較して、凍結又は凍結乾燥Ｇ－ＤＣにおいて依然として維持された（図３Ａ及び３Ｂ）。ＬＰＳ処理及びゲル化後ＯＴＩパルスした凍結及び凍結乾燥の両方のＧ－ＤＣは、Ｔ細胞増殖をトリガーし、ＯＴ－ＩＴ細胞の数の増加をもたらした（図４Ｂ～４Ｇ）。これらの結果は、凍結又は凍結乾燥後、Ｇ－ＤＣが、その生物活性、例えば、Ｔ細胞の活性化を依然として保持したことを示す。
【0058】
（ｉｖ）ゲル化ヒト樹状細胞（Ｇ－ｈＤＣ）は凍結又は凍結乾燥での貯蔵後にＭＨＣ抗原複合体及び共刺激リガンドをその表面上に保持した。
更に、本明細書に開示される方法によって調製したゲル化ヒト樹状細胞が、凍結又は凍結乾燥後でさえも、安定性及びＴ細胞の活性化における生物活性を示したことが本明細書で実証された。
更に、本明細書に開示される方法によって調製したゲル化ヒト樹状細胞が、凍結又は凍結乾燥後でさえも、安定性及びＴ細胞の活性化における生物活性を示したことが本明細書で実証された。
【0059】
例示的な実験手順を図７Ａに示す。明視野画像及び蛍光シグナルは、１０％のＰＥＧＤＡでのゲル化ｈＤＣ内のヒドロゲルネットワーク構造を示した。図７Ｂ及び７Ｃ。これは、ｈＤＣが成功裏にゲル化されたことを示す。興味深いことに、ｈＧ－ＤＣにおける細胞膜完全性の維持の成功に起因して、１０重量％ＧＣ（１０重量％ＰＥＧ－ＤＡを使用して調製した）は、水が細胞質に入ることを有効に排除して、構造を維持した（図７Ｃ）。ｈＤＣ上のリンパ球活性化シグナル１／２がＤＣのゲル化後に適正にディスプレイされ得るかどうかを更に調べるために、ヒト初代樹状細胞をモデル細胞として使用した。フローサイトメトリーを使用して、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ８０を含む全ての表面マーカーが、生存ヒトＤＣ上のこれらの表面マーカーの発現レベルと同様に、ゲル化ヒトＤＣ上で高レベルで（それぞれ、９９．６％、９８．９％、９５．５％及び９４．８％）発現されることが観察された。図７Ｄ及び７Ｅ。驚くべきことに、表面マーカーの同様の発現レベルは、Ｇ－ｈＤＣ、凍結Ｇ－ｈＤＣ、及び凍結乾燥Ｇ－ｈＤＣにおいて観察され、これは、凍結及び凍結乾燥プロセスが、処理したＧ－ｈＤＣ上の表面マーカーに影響しなかったことを示す（図７Ｄ及び７Ｅ）。
【0060】
これらの結果は、臨床適用のために使用され得る人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）としてゲル化ヒト初代ＤＣを調製することの実現可能性を実証する。
【0061】
実施例２：ゲル化樹状細胞及び微粒子を含むサイトカイン放出システム
本実施例は、サイトカインを封入する微粒子と会合した上記実施例１に記載されるように調製したゲル化樹状細胞（Ｇ－ＤＣ）を含むサイトカイン放出システムを記載する。
本実施例は、サイトカインを封入する微粒子と会合した上記実施例１に記載されるように調製したゲル化樹状細胞（Ｇ－ＤＣ）を含むサイトカイン放出システムを記載する。
【0062】
方法
（ｉ）ＰＬＧＡ微粒子の合成
色素を含有するＰＬＧＡ微粒子（ＭＰ）を、ダブルエマルジョン方法、それに続く溶媒蒸発によって合成した。様々な粘度のＰＬＧＡを使用し、ここで、固有粘度０．１５～０．２５ｄＬ／ｇのＰＬＧＡをＰＬＧＡ（Ａ）、粘度０．５５～０．７５ｄＬ／ｇのものをＰＬＧＡ（Ｂ）と表示する。以下の一連のポリマー重量比を実施した：
ＰＬＧＡ（Ａ）：ＰＬＧＡ（Ｂ）＝１００：０、６５：３５、５０：５０、３５：６５、又は２０：８０。
（ｉ）ＰＬＧＡ微粒子の合成
色素を含有するＰＬＧＡ微粒子（ＭＰ）を、ダブルエマルジョン方法、それに続く溶媒蒸発によって合成した。様々な粘度のＰＬＧＡを使用し、ここで、固有粘度０．１５～０．２５ｄＬ／ｇのＰＬＧＡをＰＬＧＡ（Ａ）、粘度０．５５～０．７５ｄＬ／ｇのものをＰＬＧＡ（Ｂ）と表示する。以下の一連のポリマー重量比を実施した：
ＰＬＧＡ（Ａ）：ＰＬＧＡ（Ｂ）＝１００：０、６５：３５、５０：５０、３５：６５、又は２０：８０。
【0063】
簡単に述べると、ＰＬＧＡをジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解して（１００ｍｇ／ｍｌ）、油相を形成し、赤色色素を１００ｍＭ ｐＨ８ Ｎａ２ＨＰＯ４中に溶解して水相を形成した。次いで、２５０ｕＬの油相及び１０ｕＬの水相（体積比＝２５：１）を、４０％の振幅並びに１及び２秒のオンオフ持続時間を１分間のパルスモード下で、氷中でプローブソニケーターによって乳化した。次いで、エマルジョンを氷浴中の体積５ｍＬの高速撹拌緩衝液（１０ｍＭ ｐＨ８ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０００ｒｐｍで撹拌）に滴加して、ＤＣＭ蒸発を防止しながら微小液滴を分配した。エマルジョンを１０００ｒｐｍで５分間撹拌した。その後、エマルジョンを３５℃で３５分間加熱して、ＤＣＭを蒸発させ、加熱プロセスの間の撹拌速度をポリマー比に応じて調整した。ＰＬＧＡ（Ｂ）≧５０％（ＰＬＧＡ（Ａ）：ＰＬＧＡ（Ｂ）＝５０：５０、３５：６５、又は２０：８０）については、撹拌速度を１０００ｒｐｍに保った。ポリマーＢ＜５０％（ＰＬＧＡ（Ａ）：ＰＬＧＡ（Ｂ）＝１００：０、又は６５：３５）については、撹拌速度は５００ｒｐｍまで低下させた。その後、全ての群の撹拌速度は２００ｒｐｍまで低下させ、２０分間保って、ＤＣＭ蒸発の間の粒子の破壊を防止した。ＤＣＭが完全に蒸発された後、微粒子を、５００ｒｐｍで３分間の遠心分離、それに続く１ｍＬのｐＨ７ ＰＢＳ中のペレットの再懸濁によって２回洗浄した。最後に、粒子をｐＨ７リン酸緩衝液中で保存した。
【0064】
（ｉｉ）封入効率決定
封入効率（ＥＥ）を、以下の式を使用して計算した：
ＥＥ＝粒子中の色素（ｍｇ）／総色素（ｍｇ）。
封入効率（ＥＥ）を、以下の式を使用して計算した：
ＥＥ＝粒子中の色素（ｍｇ）／総色素（ｍｇ）。
【0065】
粒子を、８０％アセトン、それに続く溶媒蒸発によって破壊した。溶媒を蒸発させた後、水を添加して、色素を溶解した。ＰＬＧＡの破片を、３０，０００ｇでの遠心分離によって除去した。上清を収集し、光スペクトル（５１２ｎｍ）によって検出して、色素濃度を評価し、したがって、粒子中の色素の量を得た。
【0066】
（ｉｉｉ）放出研究
色素の放出を３７℃及び４℃で研究した。ヒト身体における放出を研究するために、３ｍｇのＭＰを、１０ｍｌのｐＨ７．４ ＰＢＳ中に３７℃で水浴中で１５０ｒｐｍの撹拌速度で懸濁した。放出された色素の量を決定するために、ＭＰを１０分間沈澱させ、ＰＢＳ上清を特定の期間で収集した。ＰＢＳを５１２ｎｍの波長の光スペクトルによって分析した。４℃の放出研究を、２ｍｇの粒子を２ｍｌのｐＨ７リン酸緩衝液中に保つことによって行った。同様に、ＰＢＳ上清を光吸収分析のために収集した。両方の研究における緩衝液を１２時間以内に更新して、ｐＨ値の一貫性を確実にした。
色素の放出を３７℃及び４℃で研究した。ヒト身体における放出を研究するために、３ｍｇのＭＰを、１０ｍｌのｐＨ７．４ ＰＢＳ中に３７℃で水浴中で１５０ｒｐｍの撹拌速度で懸濁した。放出された色素の量を決定するために、ＭＰを１０分間沈澱させ、ＰＢＳ上清を特定の期間で収集した。ＰＢＳを５１２ｎｍの波長の光スペクトルによって分析した。４℃の放出研究を、２ｍｇの粒子を２ｍｌのｐＨ７リン酸緩衝液中に保つことによって行った。同様に、ＰＢＳ上清を光吸収分析のために収集した。両方の研究における緩衝液を１２時間以内に更新して、ｐＨ値の一貫性を確実にした。
【0067】
結果
（ｉ）ＧＣ－ＭＰ複合体はサイトカイン放出ゲル化細胞スフェロイドとして作用した
生存抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞活性化における主要な役割を果たすリンパ球活性化サイトカインを分泌する。生存ＡＰＣを模倣するための、サイトカイン（ＩＬ２を例として使用した）を封入する微粒子と複合体形成したゲル化樹状細胞を含むサイトカイン放出システム（ＧＣ－ＭＰ）を本明細書において報告する。図８Ａに示すように、ＰＬＧＡベースのＭＰ及びＧ－ＤＣで構成されるＧＣ－ＭＰは、Ｔ細胞活性化のための３つ全てのリンパ球活性化シグナル、すなわち、一次シグナル伝達、二次シグナル伝達、及びサイトカインシグナル伝達をトリガーするための成分を持つ。
（ｉ）ＧＣ－ＭＰ複合体はサイトカイン放出ゲル化細胞スフェロイドとして作用した
生存抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞活性化における主要な役割を果たすリンパ球活性化サイトカインを分泌する。生存ＡＰＣを模倣するための、サイトカイン（ＩＬ２を例として使用した）を封入する微粒子と複合体形成したゲル化樹状細胞を含むサイトカイン放出システム（ＧＣ－ＭＰ）を本明細書において報告する。図８Ａに示すように、ＰＬＧＡベースのＭＰ及びＧ－ＤＣで構成されるＧＣ－ＭＰは、Ｔ細胞活性化のための３つ全てのリンパ球活性化シグナル、すなわち、一次シグナル伝達、二次シグナル伝達、及びサイトカインシグナル伝達をトリガーするための成分を持つ。
【0068】
ＭＰを、上記に開示したダブルエマルジョンプロセスによって調製した。親水性スルホ－Ｃｙ５色素を例示的なカーゴとして使用して、カーゴの封入及び放出の成功を検証した。図８Ａ及び８Ｂに示すように、ＭＰ中へのカーゴロードを、明視野顕微鏡法（図４Ａ）及び蛍光顕微鏡法の両方によって観察した。Ｇ－ＤＣ及びカーゴロードＭＰの複合体形成を、ポリ－リジンを使用して媒介した。複合体形成の成功を、共焦点顕微鏡法を使用して観察した。図８Ａ。Ｇ－ＤＣ、ＭＰ、及びＧＣ－ＭＰのサイズ分布は、それぞれ２０、７５及び１２５ｕｍであった（図８Ｃ）。とりわけ、Ｇ－ＤＣは、３０日間の貯蔵の間、ＭＰの表面に堅く付着したままであった（図８Ｄ）。ＧＣ－ＭＰのインビトロ放出プロファイルにおいて、ＩＬ－２は、３７℃でゆっくりと放出されたが、４℃では放出されなかった。
【0069】
ＩＬ－２放出速度論を図９に提供する。以下に示すように、ＧＣ－ＭＰからのＩＬ－２の放出は、完全にＴ細胞の活性化に寄与した。
【0070】
総合すると、結果は、完全にＴ細胞の活性化のための３つの活性化シグナル伝達経路をトリガーするために必要な全ての成分を含む人工ＡＰＣシステムの構築の成功を示した。そのような人工ＡＰＣシステムはまた、サイトカイン分泌のための制御放出能力を有する。
【0071】
（ｉｉ）ＧＣ－ＭＰはＣＤ８ Ｔ細胞の活性化及び増殖を成功裏に誘導するａＡＰＣ模倣生体材料として作用した
ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するための本明細書に開示されるＧＣ－ＭＰシステムの活性を検討した。まず、ＧＣ－ＭＰがＣＤ８ Ｔ細胞を完全に活性化し得るかどうかを調べた。ＣＦＳＥ標識ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞をＭＰ－ＩＬ－２、ＧＣ－ＭＰ又はＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２と共培養した後、ＣＤ８ Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーによって検出した。ＧＣ－ＭＰ及びＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２群においてＴ細胞数の増殖及び数の増加が観察されたが、ＭＰ－ＩＬ－２群においては観察されなかった。図１０Ａ～１０Ｃ。これは、ＧＣ－ＭＰ構造がＧ＝ＤＣの免疫調節機能に影響しなかったことを示す。とりわけ、ＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２（３つ全てのシグナル伝達経路をトリガーする）は、ＧＣ－ＭＰ（一次及び共刺激シグナル伝達経路のみをトリガーする）と比較して、より高いＴ細胞拡大をもたらした。図１０Ａ～１０Ｃ。この差異は、ＧＣ－ＭＰのサイトカイン放出機能が、免疫細胞の活性化において重要であることを示す。したがって、本明細書に開示されるＧ－ＤＣは、免疫応答を調節するために他の好適なプラットフォームと併用され得る。
ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するための本明細書に開示されるＧＣ－ＭＰシステムの活性を検討した。まず、ＧＣ－ＭＰがＣＤ８ Ｔ細胞を完全に活性化し得るかどうかを調べた。ＣＦＳＥ標識ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞をＭＰ－ＩＬ－２、ＧＣ－ＭＰ又はＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２と共培養した後、ＣＤ８ Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーによって検出した。ＧＣ－ＭＰ及びＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２群においてＴ細胞数の増殖及び数の増加が観察されたが、ＭＰ－ＩＬ－２群においては観察されなかった。図１０Ａ～１０Ｃ。これは、ＧＣ－ＭＰ構造がＧ＝ＤＣの免疫調節機能に影響しなかったことを示す。とりわけ、ＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２（３つ全てのシグナル伝達経路をトリガーする）は、ＧＣ－ＭＰ（一次及び共刺激シグナル伝達経路のみをトリガーする）と比較して、より高いＴ細胞拡大をもたらした。図１０Ａ～１０Ｃ。この差異は、ＧＣ－ＭＰのサイトカイン放出機能が、免疫細胞の活性化において重要であることを示す。したがって、本明細書に開示されるＧ－ＤＣは、免疫応答を調節するために他の好適なプラットフォームと併用され得る。
【0072】
養子Ｔ細胞療法の改善におけるＧＣ－ＭＰの効力を更に調べるために、ＧＣ－ＭＰ拡大ＯＴＩ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＥＧ７－ＯＶＡを移植したマウスにおいてインビボで更に評価した（図１０Ｄ）。結果は、ＧＣ－ＭＰ－ＩＬ－２ ａＡＰＣシステムによって活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞が、他の群と比較して、インビボで腫瘍サイズを有意に低下させたことを示した。図１０Ｅ。
【0073】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ、等価な、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置換され得る。したがって、別途の明示的な記述がない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の等価な又は同様の特徴の単なる一例である。
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ、等価な、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置換され得る。したがって、別途の明示的な記述がない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の等価な又は同様の特徴の単なる一例である。
【0074】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し得、その趣旨及び範囲から逸脱することなしに、本発明の種々の変更及び改変を、それを種々の使用法及び条件に適応させるようになし得る。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲内である。
【0075】
等価物
いくつかの発明実施形態を本明細書において記載及び例示したが、当業者は、機能を行うための、並びに／あるいは本明細書に記載される結果及び／又は利点のうちの１つ以上を得るための、多様な他の手段及び／又は構造に容易に想到し、そのような変形及び／又は改変の各々は、本明細書に記載される発明実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であると意図されること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、そのために発明の教示が使用される特定の適用又は複数の適用に依存することを容易に理解する。当業者は、本明細書に記載される特定の発明実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、又は日常的な実験にすぎないものを使用して確認することができる。したがって、前述の実施形態は、例としてのみ提示されていること、及び、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内で、発明実施形態は、具体的に記載され請求される以外で実行され得ることを理解されたい。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載される各々の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。
いくつかの発明実施形態を本明細書において記載及び例示したが、当業者は、機能を行うための、並びに／あるいは本明細書に記載される結果及び／又は利点のうちの１つ以上を得るための、多様な他の手段及び／又は構造に容易に想到し、そのような変形及び／又は改変の各々は、本明細書に記載される発明実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であると意図されること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、そのために発明の教示が使用される特定の適用又は複数の適用に依存することを容易に理解する。当業者は、本明細書に記載される特定の発明実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、又は日常的な実験にすぎないものを使用して確認することができる。したがって、前述の実施形態は、例としてのみ提示されていること、及び、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内で、発明実施形態は、具体的に記載され請求される以外で実行され得ることを理解されたい。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載される各々の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【0076】
本明細書で定義及び使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献における定義、及び／又は定義される用語の通常の意味を支配すると理解されたい。
【0077】
本明細書に開示される全ての参照文献、特許及び特許出願は、それについて各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、これは、いくつかの場合では、文献の全体を包含し得る。
【0078】
明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、それとは反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。
【0079】
明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される語句「及び／又は」は、そのように連接される要素の「いずれか又は両方」、すなわち、いくつかの場合では接続的に存在し、他の場合では選言的に存在する要素、を意味すると理解されたい。「及び／又は」を用いて列挙される複数の要素は、同様に、すなわち、そのように連接される要素のうちの「１つ以上」と解釈されたい。「及び／又は」句によって具体的に特定される要素以外の他の要素は、具体的に特定される要素に関係するか又は関係しないかにかかわらず、任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などのオープネンドの言葉と併せて使用されるとき、一実施形態では、Ａのみを（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみを（任意選択でＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態では、Ａ及びＢの両方を（任意選択で他の要素を含む）を指し得る、など。
【0080】
明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されたい。例えば、リスト中の項目を区切るとき、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であると解釈される。すなわち、数又は要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、１つ超も含み、任意選択で、追加の列挙されていない項目を含む。「のうちの１つのみ」又は「のうちの正確に１つ」、あるいは、特許請求の範囲で使用されるとき、「からなる」などの、明確にそれとは反対に示される用語のみが、数又は要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「又は」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」などの、排他性の用語によって先行されるときにのみ、排他的選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが両方でない」）を示すものとして解釈される。特許請求の範囲で使用されるとき、「本質的にからなる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有する。
【0081】
明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関する「少なくとも１つ」という語句は、要素のリスト中の要素のうちの任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙される各々及び全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しないと理解されたい。この定義はまた、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素に関係するか又は関係しないかにかかわらず、任意選択で存在し得ることを許容する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は、等価に、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は、等価に、「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ（任意選択で１つ超を含む）のＡで、Ｂは存在せず（及び任意選択でＢ以外の要素を含む）を、別の実施形態では、少なくとも１つ（任意選択で１つ超を含む）のＢで、Ａは存在せず（及び任意選択でＡ以外の要素を含む）を、更に別の実施形態では、少なくとも１つ（任意選択で１つ超を含む）のＡ、及び少なくとも１つ（任意選択で１つ超を含む）のＢ（及び任意選択で他の要素を含む）を指し得る、など。
【0082】
それとは反対に明確に示されない限り、１つ超のステップ又は行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が記載される順序に必ずしも限定されないこともまた理解されたい。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【国際調査報告】