▶ ザ バインディング サイト グループ リミティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-19
(54)【発明の名称】質量分析コントロール
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20230612BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230612BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N33/53 N
G01N27/62 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022569178
(86)(22)【出願日】2021-05-12
(85)【翻訳文提出日】2023-01-16
(86)【国際出願番号】 GB2021051136
(87)【国際公開番号】W WO2021229220
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】2007047.0
(32)【優先日】2020-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＱＲコード
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514212652
【氏名又は名称】ザ バインディング サイト グループ リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(72)【発明者】
【氏名】ステファン ハーディング
(72)【発明者】
【氏名】ダナンジャイ サクリカー
(72)【発明者】
【氏名】タラ エー．クラウス
(72)【発明者】
【氏名】グレッグ ウォーリス
【テーマコード（参考）】
2G041
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA04
2G041EA04
2G041EA12
2G041FA12
2G041JA02
2G041JA04
2G041JA06
2G041JA14
2G041LA09
(57)【要約】
本発明は、試料からの分析物を免疫精製し、特徴付ける方法を提供し、該方法は、（ｉ）酸性ｐＨ及び／又は還元剤によって切断可能な連結を介して基質に結合した所定量のコントロール物質と、基質に結合した任意選択のさらなる分析物特異的抗体又はその断片とを提供する工程であって、コントロール物質は分析物に特異的であるか又は分析物に特異的ではない工程；（ｉｉ）試料中に存在する場合、分析物がコントロール物質又は前記任意選択のさらなる分析物特異的抗体又は断片に結合することを可能にする工程であって、基質に結合したコントロール物質（ｉ）は、分析物を任意選択のさらなる分析物特異的抗体（ｉｉ）と接触させた後に提供することができる工程；（ｉｉｉ）結合していない材料を基質から洗い流す工程；（ｉｖ）少なくとも１つの基質から、それに結合した分析物を酸溶出する工程；（ｖ）質量分析を行って、２つ以上のピークを同定する工程であって、少なくとも１つのピークは、分析物の存在と関連し、少なくとも第２のピークは、コントロール物質の少なくとも一部と関連する工程；ならびに（ｖｉ）第２のピークのサイズ又は強度を所定の較正値と比較して、分析物に関連する第１のピークを較正することを可能にする工程を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料からの分析物を免疫精製し、特徴付ける方法であって、（ｉ）酸性ｐＨ及び／又は還元剤によって切断可能な連結を介して基質に結合した所定量のコントロール物質と、基質に結合した任意選択のさらなる分析物特異的抗体又はその断片とを提供する工程であって、コントロール物質は分析物に特異的であるか又は分析物に特異的ではない工程；
（ｉｉ）試料中に存在する場合、分析物がコントロール物質又は前記任意選択のさらなる分析物特異的抗体又は断片に結合することを可能にする工程であって、基質に結合したコントロール物質（ｉ）は、分析物を任意選択のさらなる分析物特異的抗体（ｉｉ）と接触させた後に提供することができる工程；
（ｉｉｉ）結合していない材料を基質から洗い流す工程；
（ｉｖ）少なくとも１つの基質から、それに結合した分析物を酸溶出する工程；
（ｖ）質量分析を行って、２つ以上のピークを同定する工程であって、少なくとも１つのピークは、分析物の存在と関連し、少なくとも第２のピークは、コントロール物質の少なくとも一部と関連する工程；ならびに
（ｖｉ）第２のピークのサイズ又は強度を所定の較正値と比較して、分析物に関連する第１のピークを較正することを可能にする工程
を含む方法。
【請求項2】
コントロール物質がヘテロポリマーであり、これは、２つ以上の分離可能なタンパク質サブユニットを含むタンパク質であり、第２のピークにおいて検出されるヘテロポリマーの部分が、前記タンパク質サブユニットのうちの１つの少なくとも一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
タンパク質が、少なくとも１つの重鎖又はその断片、及び少なくとも１つの軽鎖又はその断片を含む抗体又はその断片であり、第２のピークにおいて検出されるサブユニットが、軽鎖の少なくとも一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
抗体が分析物に特異的である、請求項４に記載の方法。
【請求項5】
コントロール物質が分析物に特異的ではなく、基質が前記さらなる分析物特異的抗体を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
分析物の存在なしに工程（ｉ）～（ｖ）を行い、コントロール物質の少なくとも一部を定量して、所定の較正値を生成することを含む、請求項１～５のいずれか１項に定義される所定の較正値を生成する方法。
【請求項7】
コントロール物質の少なくとも一部が、液体クロマトグラフィー－質量分析によって較正される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項8】
第２のピークにおいて検出されるコントロール物質の部分が、免疫グロブリン軽鎖又は軽鎖の断片である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
質量分析工程（ｖｉ）が行われる場合に、抗体又はその断片などのコントロール物質の一部のサイズが、分析物に関連する１つ以上のピークから分離された１つ以上のピークを生成するように予め選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
少なくとも１つのピーク及び少なくとも第２のピークが、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって決定され、ピークがｍ／ｚ強度である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記抗体又はその断片がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
分析物が、血清タンパク質、例えば、免疫グロブリン又はその断片である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
免疫グロブリン又はその断片が、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＥラムダ軽鎖若しくはカッパ軽鎖である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
抗体又はその断片がモノクローナル抗体又はその断片である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
モノクローナル抗体又はその断片が、免疫グロブリン分析物に対して質量分析によって分析される場合に、異なる質量及び／又は電荷を有するように選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
モノクローナル抗体又はその断片が、免疫グロブリン分析物に対して異なる質量を有するようにそれらの質量が修飾されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
抗体又はその断片が、重鎖クラス特異的、軽鎖タイプ特異的、遊離軽鎖タイプ特異的、又は重鎖クラス軽鎖タイプ特異的である、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
基質が、所定量のコントロール物質と、好ましくはポリクローナル抗体又はその断片である複数のさらなる分析物特異的抗体又はその断片とを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
基質が複数のビーズを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
請求項１～１９に記載の分析物の存在を検出することによって、疾患を検出し、モニタリングし又は予後する方法。
【請求項21】
疾患がＢ細胞関連疾患又は他の免疫関連疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
較正されるべき分析物を較正するための所定の較正値をさらに含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法で使用するための、酸切断可能な連結を介して基質に付着された所定量のコントロール基質と、任意選択的に複数の分析物特異的抗体又はそれらの断片とを含む少なくとも１つの基質を含むキット。
【請求項23】
基質に結合した複数のポリクローナル分析物特異的抗体又はその断片と、さらに所定量のコントロール物質とを含む少なくとも１つの基質を含むキット。
【請求項24】
分析物が免疫グロブリン又はその断片である、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項25】
抗体又はその断片が、重鎖クラス特異的、軽鎖タイプ特異的、遊離軽鎖タイプ特異的又は重鎖クラス－軽鎖タイプ特異的である、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項26】
請求項１～１１のいずれか１項に定義される工程（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）を実行する手段を有する質量分析計。
【請求項27】
質量分析計に請求項１～２２のいずれか１項に定義される工程（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）を実行させるための命令を含むコンピュータプログラム。
【請求項28】
１つ以上のプロセッサ上で実行した場合に、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法によって得られた第２のピークのサイズ又は強度を所定の較正値と比較する命令を含むコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分析物を免疫精製及び特徴付ける方法、ならびにそのような方法で使用するためのキットに関する。
【0002】
免疫グロブリンを含むタンパク質のような分析物の定量のためのインビトロ診断における質量分析の使用は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、ＷＯ２０１５／１５４０５２は、その全体が本明細書に組み込まれ、質量分析（ＭＳ）を用いて免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、又はそれらの混合物を検出する方法を開示している。免疫グロブリン軽鎖、重鎖又は混合物を含む試料を免疫精製し、質量分析にかけて試料の質量スペクトルを得る。これは、例えば、患者由来の試料中のモノクローナルタンパク質を検出するために使用することができる。また、モノクローナル抗体中のジスルフィド結合をフィンガープリント、アイソタイプ及び同定するために使用することもできる。
【0003】
ＭＳは、例えば、試料中のラムダ鎖及びカッパ鎖を質量及び電荷によって分離するために使用される。また、例えば、還元剤を使用して重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合を還元した後に、免疫グロブリンの重鎖成分を検出するために使用することもできる。ＭＳはまた、その全体が本明細書に組み込まれている、例えば、ＷＯ２０１５／１３１１６９に記載されている。
【0004】
試料中の分析物の精製は、典型的には、抗分析物特異的抗体を使用する。これらは、典型的には、当該技術分野で一般に知られている技術によって、ナノビーズ又はマイクロビーズのような基質に結合される。分析物を含有する試料を、ビーズに付着した抗体と混合又はインキュベートし、分析物を抗体に結合させ、非結合物質を洗い流す。次に、分析物を、ビーズから洗浄又は分離又は溶出し、質量分析により分析する。例えば、血清タンパク質の定量化のための質量分析インビトロ診断に関連する一つの問題は、それが報告された結果の精度及び精度に関して課題を提示することである。
【0005】
今日までの解決策には、例えば、手順の個々の特定の工程におけるコントロールの使用が含まれる。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦでは、コントロールを、ターゲットを調製する時点でマトリックスに含めることができ、かくして、レーザーによる結晶化プロセス及びその後のイオン化をコントロールすることができる。しかしながら、これは、上流に導入されたばらつきを説明するものではない。質量分析に使用される多くの獲得前精製技術では、分析物は免疫沈降によって精製される。これには、精製プロセスの各工程で失われた分析物の量を推定するために、既知量の標的タンパク質とともに精製プロセスの各工程でコントロールを使用する必要がある。しかしながら、これは、例えば、ピペッティング誤差のために、試料の沈殿及びその後の調製工程における例示的な変動をコントロールしない。
【発明の概要】
【0006】
本出願人は、放出可能なコントロール物質、例えば、タンパク質又はペプチド、ヘテロポリマー、又は抗体を、ビーズ又は固体表面などの他の基質に結合させて、精製又は濃縮工程で沈殿させることにより、放出可能なコントロール物質が、質量分析による検出工程まで、精製工程内のコントロールとして使用され得ることを確認した。ビーズ上の量が公知であるため、次に、これを使用して、この工程における任意の損失又は後続の工程における変動をコントロールすることができる。コントロールは、例えば、分析物自体を標的とする抗体由来であるため、質量分析スペクトルで測定されたコントロールの量と、同じスペクトルで測定された標的分析物の量との直接的な関係が存在するであろう。沈殿／濃縮工程におけるコントロールの量は既知であるため、値は元の試料中の標的分析物のレベルに割り当てることができる。
【0007】
例えば、分析物に特異的な捕捉抗体、又は実際には別の抗体を基質に結合させることができ、例えば捕捉抗体に結合した分析物が例えば酸溶出を介して溶出するとき、重鎖の定常領域を介して結合させ、軽鎖を捕捉抗体又は他の抗体から遊離させ、これらの軽鎖を質量分析により検出することができる。
【0008】
これらの軽鎖を、例えば、免疫グロブリンが分析物である軽鎖から区別する能力は、捕捉抗体又は他の抗体の軽鎖を選択することによって増強され得、その結果、それらは、分析物の軽鎖より重いか又は軽い。これは、例えば、モノクローナル抗体を選択し、１つ以上のアミノ酸、特に１～５個のアミノ酸を軽鎖に加えることによってモノクローナル抗体の軽鎖を改変することにより達成することができる。
【0009】
本出願人は、サブユニットの検出可能な部分が、例えば、酸溶出によって放出されるヘテロポリマーのような他のコントロールを使用することができることを認識している。例えば、１つ以上のサブユニットを含む非免疫グロブリンタンパク質を使用することができ、ここで、サブユニットが溶出工程によって放出される。
【0010】
これは、このことが、溶出の各段階及びその後の検出段階における変動をコントロールするという利点を有する。
【0011】
本発明は、試料からの分析物を免疫精製し、特徴付ける方法を提供し、該方法は、
（ｉ）酸性ｐＨ及び／又は還元剤によって切断可能な連結を介して基質に結合した所定量のコントロール物質と、基質に結合した任意選択のさらなる分析物特異的抗体又はその断片とを提供する工程であって、コントロール物質は分析物に特異的であるか又は分析物に特異的ではない工程；
（ｉｉ）試料中に存在する場合、分析物がコントロール物質又は任意選択のさらなる分析物特異的抗体又は断片に結合することを可能にする工程であって、基質に結合したコントロール物質は、分析物を任意選択のさらなる分析物特異的抗体と接触させた後に提供することができる工程；
（ｉｉｉ）結合していない材料を基質から洗い流す工程；
（ｉｖ）少なくとも１つの基質から、それに結合した分析物を酸溶出する工程；
（ｖ）質量分析を行って、２つ以上のピークを同定する工程であって、少なくとも１つのピークは、分析物の存在と関連し、少なくとも第２のピークは、コントロール物質の少なくとも一部と関連する工程；ならびに
（ｖｉ）第２のピークのサイズ（曲線下面積など）又は強度を所定の較正値と比較して、分析物に関連する第１のピークを較正することを可能にする工程を含む。
（ｉ）酸性ｐＨ及び／又は還元剤によって切断可能な連結を介して基質に結合した所定量のコントロール物質と、基質に結合した任意選択のさらなる分析物特異的抗体又はその断片とを提供する工程であって、コントロール物質は分析物に特異的であるか又は分析物に特異的ではない工程；
（ｉｉ）試料中に存在する場合、分析物がコントロール物質又は任意選択のさらなる分析物特異的抗体又は断片に結合することを可能にする工程であって、基質に結合したコントロール物質は、分析物を任意選択のさらなる分析物特異的抗体と接触させた後に提供することができる工程；
（ｉｉｉ）結合していない材料を基質から洗い流す工程；
（ｉｖ）少なくとも１つの基質から、それに結合した分析物を酸溶出する工程；
（ｖ）質量分析を行って、２つ以上のピークを同定する工程であって、少なくとも１つのピークは、分析物の存在と関連し、少なくとも第２のピークは、コントロール物質の少なくとも一部と関連する工程；ならびに
（ｖｉ）第２のピークのサイズ（曲線下面積など）又は強度を所定の較正値と比較して、分析物に関連する第１のピークを較正することを可能にする工程を含む。
【0012】
コントロール物質及び任意の分析物特異的抗体は、同じ基質又は異なる基質に結合され得る。例えば、コントロール物質は、ビーズの第１のグループに結合され得、さらなる分析物特異的抗体は、多くの場合、ビーズの第２のセットに結合され得る。あるいは、それらは、同じビーズに結合され得る。コントロール物質は、分析物特異的抗体又はその断片であってもよい。代替のコントロールは、例えば、分析物に特異的でない抗体又はその断片であってもよい。後者の例では、任意のさらなる分析物特異的抗体又は断片が、典型的には、洗浄工程の前に、分析物を基質に結合させるために提供される。
【0013】
少なくとも一部であるが、典型的には、実質的に全てのコントロール物質は、酸溶出工程によって基質から放出される。
【0014】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）のような１種以上のさらなる還元剤を適宜（例えば、ジスルフィド結合を用いて）含有して、切断可能な結合の減少及び切断を助けてもよい。
【0015】
コントロール物質は、潜在的に、放出されたときに質量分析工程によって検出され得る任意の部分であり得る。しかしながら、典型的には、検出される分析物と同様の質量及び電荷を有するように選択される。典型的には、質量及び電荷は、コントロール物質からのピークが、分析物のピークからベースラインで区別され得るように異なる。コントロール物質はまた、質量分析ターゲットプレート上に置かれた（スポットされた）分析物と同様の方法で結晶化するように選択され得る。
【0016】
分析物は、例えば、分析物のアナログであり得る。これは、質量を同位体的に変化させることによって、又は、例えば、質量を増加又は減少させることによって、例えば、分析物がタンパク質又はペプチドである１つ以上のアミノ酸の付加又は欠失によって、改変することができる。
【0017】
分析物が免疫グロブリン軽鎖又は重鎖である場合、コントロール物質、例えばコントロール軽鎖又は重鎖の質量の差は、コントロール物質のＭＳピークが分析物ピークから分離されることを確実にするために、少なくとも１０００Ｄａである。
【0018】
この連結は酸溶出液中で酸によって切断される。連結はまた、還元剤で切断可能であってもよい。連結の例には、酸及び／又は還元剤によって還元されてコントロール物質を放出するジスルフィド結合が含まれる。
【0019】
連結は、例えば、ビオチン分子を含み得る。基質又はコントロール物質の一方又は他方は、連結の一方の部分を備えることができ、他方は、基質－コントロール物質複合体の他方の部分に存在する。マレイミドはまた、スルフヒドリル基との反応を介して、タンパク質又はペプチドを基質に結合するために使用され得る。
【0020】
例えば、現在のシステムにおいても有用であり得る、酸切断可能な薬物送達システムにおいて使用されてきた他の酸または還元剤切断可能な結合には、例えば、オルトエステル、アセタール、ヒドラゾン、イミン、シス－アコニチル、 およびトリチル結合が含まれる（Binaud S. and Stenzel M. H. Chem Comm (2013), 49, 2082-2102）。
【0021】
コントロール物質は、典型的には、ペプチド又はタンパク質のような高分子であるが、ＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸を含む任意の検出可能な化合物であってもよい。
【0022】
コントロール物質は、ヘテロポリマーの一部であってもよい。これは、２つ以上のサブユニットを有する任意の化合物であってもよく、そのうちの１つは基質に結合しており、第２のサブユニット（コントロール物質として作用する）は、酸溶出によって分離可能であり、次に、第２のピークとして検出される。典型的には、第２のサブユニットは、分析物と実質的に同じイオン化特性を有し、典型的には、検出される分析物と類似するが同一ではない質量を有するように選択される。したがって、第２のサブユニットは、分析物の質量分析ピークと実質的にオーバーラップしない１つ以上の質量分析ピークを生成するように選択され、その結果、分析物の第１のピーク及びヘテロポリマーの少なくとも一部の第２のピークが区別され、測定され得る。
【0023】
ヘテロポリマーは、典型的にはタンパク質である。サブユニットは、例えば、１つ以上のジスルフィド結合を介して結合したサブユニットであってもよく、これは、酸溶出工程によって切断されて、１つ以上のサブユニットを放出することができる。
【0024】
ヘテロポリマーは、抗体又は任意の抗体の断片であり得る。それは、典型的には１つ以上のジスルフィド結合を介して連結された、少なくとも１つの重鎖又はその断片、及び少なくとも１つの軽鎖又はその断片を含み得る。
【0025】
抗体又は抗体断片は、それ自体、分析物特異的抗体又は断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）又は軽鎖であり得、その一部は、次に、第２のピークとして検出される。任意選択のさらなる分析物特異的抗体は、典型的には、その場合には使用されない。
【0026】
抗体又は断片が使用される場合、軽鎖の質量を増加させるために、Ｃ末端への１つ以上の（例えば、最大５つの）アミノ酸の付加又は欠失によって軽鎖を修飾することができる。
【0027】
抗体又は断片は、軽鎖の質量を増加させるために化学修飾剤を添加することによって修飾することもできる。例えば、Ｎ－スクシンイミジル３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、及び６－ビオチンアミドヘキサン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、ビオチン－ＰＥＧ３６－ペンタフルオロフェニル－エステル及びＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン。
【0028】
カッパ軽鎖は、例えば、ＩｇＧカッパ上で、ビオチン－ＰＦＰを含むいくつかの化学修飾剤によって優先的に結合され、またラムダ軽鎖と優先的に結合されることが見出されている。
カッパ軽鎖への結合のレベルは、コントロールされ得る。ラムダ軽鎖修飾も本出願人によって観察されている。
カッパ軽鎖への結合のレベルは、コントロールされ得る。ラムダ軽鎖修飾も本出願人によって観察されている。
【0029】
所定の較正値は、分析物の存在なしに、工程（ｉ）から（ｖ）の各々を行うことによって計算することができる。すなわち、少なくとも１つの基質に結合した所定量のコントロール物質を、抗体又は断片と接触させず、代わりに、分析物の存在なしにコントロール物質溶液と接触させ、洗浄工程（ｉｉｉ）及び酸溶出工程（ｉｖ）を、上記と同様に実施する。次に、溶出されたコントロール物質の量を定量する。これは、例えば、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって行うことができる。
【0030】
溶出された抗体の量は、その試料についての較正値を決定するために使用され得る。
【0031】
較正工程は、分析物を用いて精製工程及び特徴付け工程を実施するのと実質的に同時に実施することができる。あるいは、供給者の実験室において、例えば、基質に結合した分析物特異的抗体を供給する前に実施してもよい。次に、較正値は、基質に結合された分析物特異的抗体の各バッチとともに供給され得る。この所定の値は、分析物による精製手順の変動を計算することができる一定値を提供する。
【0032】
分析物は、例えば、免疫グロブリン又はその断片などの血清タンパク質、又はアルブミン、凝固因子、調節タンパク質、ベータ２－ミクログロブリン、Ｃ反応性タンパク質、アルファ－１アンチトリプシン、アルファ－１フェトプロテインなどの他の血清タンパク質であり得る。
【0033】
抗体の例には、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラット、マウス、ウサギ、ラクダ又は組換え抗体及び合成抗体由来のポリクローナル及びモノクローナル抗体が含まれる。
【0034】
抗体又はその断片は、インタクト抗体、又は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片であり得る。
【0035】
洗浄、酸溶出、及び質量分析の実施に関連する緩衝液は、当該技術分野で一般的に知られており、酸溶出工程のｐＨは、典型的には（専らではないが）ｐＨ７又は７未満であり、典型的には、５未満又は２～３のような１．５を超える。このような緩衝液は、典型的には、以下を含むＭＡＬＤＩ－ＴＯＦのような質量分析法と適合性である。
【0036】
以下に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦとともに使用するのに適した緩衝液、例えば、典型的な最大濃度を有するペプチド又はタンパク質を示す。
【0037】
【表1】
【0038】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦに対する界面活性剤／サーファクタント耐性（特に生体試料：ペプチド、タンパク質）
カテゴリーＡ 許容
カテゴリーＢ 負の影響はないか又は小さい
カテゴリーＣ シグナルの低減と品質への影響
カテゴリーＤ 典型的には、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦと互換性がない
カテゴリーＡ 許容
カテゴリーＢ 負の影響はないか又は小さい
カテゴリーＣ シグナルの低減と品質への影響
カテゴリーＤ 典型的には、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦと互換性がない
【0039】
【表2】
【0040】
典型的には、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を使用して、分析物（存在する場合）の少なくとも１つのピーク、及び精製工程で使用されるコントロール物質の少なくとも１つの断片に関連する第２のピークを生成する。
【0041】
第２のピークは、典型的には、抗体の軽鎖又は軽鎖の断片である。例えば、複数の荷電抗体断片又は抗体が質量分析プロセスによって生成される場合、２つ以上のピークが存在してもよい。酸溶出は、典型的には、抗体の軽鎖から重鎖を解離する。
【0042】
別個のコントロール物質が使用され、分析物が免疫グロブリンである場合、分析物特異的抗体を架橋して、重鎖に結合した軽鎖の放出を防止し、その結果、試料が、例えば、分析物特異的抗体又はその断片から放出された軽鎖と干渉することを防止することができる。
【0043】
したがって、分析物特異的抗体又はその断片は、例えば、酸溶出相関下で安定である連結で架橋され得る。
【0044】
ＷＯ２００６／０９９４８１Ａは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、ヒト抗体、調和抗体又はキメラ抗体、及びエピトープ結合断片などのポリペプチドを含む広範囲の巨大分子における鎖内及び鎖間チオエーテル架橋の使用を記載する。本文書は、架橋の目的が、抗体又は断片の安定性及び薬理学的及び機能的特性を高めることであることを記載している。特に、目的は、例えば、抗ＲＳＶ抗体を含む抗ウイルス抗原抗体のような異なるモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖を架橋することである。記載された目的は、抗体の薬学的特性を改善することである。
【0045】
ＷＯ００／４４７８８は、改良された治療剤の製造を目的として、異なる特異性を有する異なる抗体分子を架橋するためのチオエーテルの使用を記載している。同様に、種々の特異性を有する二特異的又は三特異的Ｆ（ａｂ）３又はＦ（ａｂ）４コンジュゲートをＷＯ９１／０３４９３に示す。
【0046】
チオエーテル類は、貯蔵中のレベルが増加するにつれて治療用抗体中に観察されている（Zhang Q et al JBC manuscript (2013) M113.468367）。軽鎖－重鎖ジスルフィド（ＬＣ２１４－ＨＣ２２０）はチオエーテル結合に変換することができる。１つのＩｇＧ１ｋ治療抗体は、血液中を循環している間に、０．１％／日の速度でその位置でチオエーテルに変換することが観察された。内因性抗体は、健康なヒト対象においても形成されることが観察された。Ｚｈａｎｇらはインビトロでチオエーテルの生成を繰り返した。これを用いて、治療用モノクローナル抗体に対するチオエーテル結合の安全性の影響を評価した。
【0047】
架橋は、典型的には、同じ抗体の鎖間の分子内である。
【0048】
架橋は、典型的にはチオエーテル結合を含む。
【0049】
チオエーテル架橋はチオエーテル結合を含む。
これは、結合が二硫酸結合ではなく単一の硫黄結合を有する抗体の残基間の結合である。すなわち、チオエーテル架橋は、当業者によく知られているジスルフィド架橋のような２つ以上の硫黄原子を含む結合を含まず、代わりに、チオエーテル架橋は、巨大分子の残基を架橋する単一の硫黄結合を含む。１つ以上の追加の非硫黄原子が、結合をさらに形成してもよい。
これは、結合が二硫酸結合ではなく単一の硫黄結合を有する抗体の残基間の結合である。すなわち、チオエーテル架橋は、当業者によく知られているジスルフィド架橋のような２つ以上の硫黄原子を含む結合を含まず、代わりに、チオエーテル架橋は、巨大分子の残基を架橋する単一の硫黄結合を含む。１つ以上の追加の非硫黄原子が、結合をさらに形成してもよい。
【0050】
チオエーテル架橋によって結合された残基は、天然残基又は非天然残基であり得る。チオエーテル架橋の形成は、当業者に認識されるように、残基から原子の喪失をもたらすことができ、例えば、２つのシステイン残基の側鎖間のチオエーテル架橋の形成は、残基から硫黄原子及び水素原子の喪失をもたらすことができるが、得られるチオエーテル架橋は、当業者によってシステイン残基を連結するものとして認識されるであろう。
【0051】
チオエーテル架橋は、抗体の任意の２つの残基を結合することができる。１つ以上の残基は、例えば、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンメチオニン及びチロシンから選択することができる。２つの残基は、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン及びチロシンからなる群より選択され得る。より典型的には、２つの残基はシステイン残基である。典型的には、１つのチオエーテル架橋だけが重鎖と軽鎖の間にある。あるいは、２つ、３つ又はそれ以上のチオエーテル架橋を使用してもよい。抗体の重鎖対又はその断片は、チオエーテル結合のような１つ以上の非ジスルフィド架橋によっても連結され得る。
【0052】
チオエーテル架橋は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０９９４８１、Zhang et al (2013) J. Biol. Chem. vol 288(23), 16371-8及びZhang & Flynn (2013) J. Biol. Chem, vol 288(43), 34325-35に記載されている。
【0053】
ホスフィンおよびホスファイトを使用することもできる。ここで、「ホスフィン」とは、一般式Ｒ３Ｐ（式中、Ｐ＝リン及びＲ＝任意の他の原子）を有する少なくとも１つの官能基ユニットを含む任意の化合物を指す。亜リン酸塩では、Ｒ位は酸素原子によって特異的に占められている。Ｒ３Ｐ含有化合物は、ジスルフィド結合を攻撃する強力な求核剤として作用する。この結果、ジスルフィドが還元されることもあるが、ある条件下ではチオエーテル結合が形成されることもある。
【0054】
化合物には以下のものが含まれる：
Ｔｒｉｓ（ジメチルアミノ）ホスフィン（ＣＡＳ番号１６０８－２６－０）
Ｔｒｉｓ（ジエチルアミノ）ホスフィン（ＣＡＳ番号２２８３－１１－６）
亜リン酸トリメチル（ＣＡＳ番号１２１－４５－９）
トリブチルホスフィン（ＣＡＳ番号９９８－４０－３）
Ｔｒｉｓ（ジメチルアミノ）ホスフィン（ＣＡＳ番号１６０８－２６－０）
Ｔｒｉｓ（ジエチルアミノ）ホスフィン（ＣＡＳ番号２２８３－１１－６）
亜リン酸トリメチル（ＣＡＳ番号１２１－４５－９）
トリブチルホスフィン（ＣＡＳ番号９９８－４０－３）
【0055】
参考文献：参考文献として本明細書に組み込まれる、Bernardes et al. (2008) Angew. Chem. Int. Ed., vol 47, 2244-2247。
【0056】
架橋はまた、遊離チオールと反応して抗体分子の鎖に架橋するマレイミド架橋剤のような架橋剤を含んでもよい。これは、ＷＯ００／４４７８８に記載されているように、チオール基の一方の側、及びさらにリシンカルボキシル基のような別の部分に結合させることができる。
【0057】
二官能性架橋剤は、リンカー、特に可撓性リンカーによって互いに連結された２つの反応性部分を含むことができる。リンカーは、鎖中で共有結合した１つ以上の炭素、例えば置換又は非置換アルキルを含み得る。リンカー、特にＣ１－Ｃ１０、最も典型的にはＣ２－Ｃ６又はＣ３－Ｃ６リンカー。本出願人は、α，α’－ジブロモ－ｍ－キシレン、ＢＭＯＥ（ビスマレイミドエタン）又はＢＭＢ（ビスマレイミドブタン）のような架橋剤を含有するＣ２－Ｃ６が、架橋タンパク質の回収レベルが比較的高い場合に特に有用であることを見出した。
【0058】
抗体又はその断片のサイズは、質量分析によって１つ以上のピークを生成するように予め選択することができ、それは、分析物に関連する１つ以上のピークによって分離される。これは、例えば、抗体又は断片のサイズを選択することによって、又は代替的に、抗体又は断片の電荷を選択することによって、可能である。
【0059】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析が使用される場合、ピークは典型的にはｍ／ｚ強度である。
【0060】
システムに添加された最初の抗体のようなコントロール物質の量が知られている。検体を使用しないで予想される抗体の量もまた、較正値のために知られている。したがって、分析物とともにピーク中の抗体の量は、あらゆる材料の損失、又は、例えば、ピペッティングエラーを考慮に入れるために、較正値によって補正され得る。標的と抗体との間のｍ／ｚピーク強度の比は、例えば、試料喪失、基質の喪失、標的捕獲、分析物溶出、分析物スポッティング及びイオン化をコントロールすることができる。
【0061】
抗体の既知の質量をビーズ上に正確にカップリングさせ、それに続く溶出及びｍ／ｚピーク強度を（標的ピークとの比較により）定量するために使用することができる能力。これにより、精度と精度が向上し、日常的な臨床処置に使用できるようになる。
【0062】
基質は、典型的には、ビーズ、例えば、磁性ビーズ、ラテックスビーズ、セラミックビーズ、ポリスチレン又は他の基質である。
【0063】
磁性及び常磁性ビーズは、当技術分野において一般に公知である。
【0064】
ビーズのような基質に対する抗体の吸収もまた、当該技術分野において一般に知られており、典型的には、それらは、アミノ基、カルボキシ基、エポキシ基、又はチオール活性化基を介して共有結合されていてもよい。受動吸着も使用することができる。
【0065】
磁性ビーズを使用する場合、分析物を含有する試料中の結合抗体とビーズを混合し、磁石を使用してビーズを沈殿させることが可能である。抗体又はその断片は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又はそれらの混合物であり得る。
【0066】
典型的には、抗体又は断片は、分析物の精製後に酵素的に消化されない。
【0067】
分析物は、潜在的に任意の適切な分析物であり得る。典型的には、質量分析標的に適用した場合、分析物及び免疫グロブリンは、実質的に同じ方法で共結晶化し、イオン化する。
【0068】
試料は、哺乳動物又は典型的にはヒトのような植物又は動物からであってもよい。これは、血液、血清、血漿、汗、唾液、脳脊髄液又は尿などの組織又は体液の試料であり得る。
【0069】
分析物は、免疫グロブリン又はその断片であり得る。例えば、免疫グロブリン又は断片は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ラムダ軽鎖又はカッパ軽鎖であり得る。
【0070】
分析物は、ヒト分析物であり得る。
【0071】
典型的には、分析物が免疫グロブリンである場合、抗体又はその断片は、モノクローナル抗体又はその断片である。これは、モノクローナル抗体のサイズを、例えば、モノクローナル抗体のサイズを選択することによって、又は代替的に、抗体の断片の欠失又は抗体へのアミノ酸の付加によって質量を調整することによって、抗体又はその断片が、例えば、分析物について観察されるｍ／ｚピークと重ならないことを確実にすることによって、調整することができるためである。
【0072】
免疫グロブリンは本質的に非常に多様である。したがって、いくつかのモノクローナル抗体の潜在的な問題は、それらがモノクローナル抗体のような分析物の全ての変異体を検出することはできないということである。これは、例えば、基質を所定量のモノクローナル抗体又はその断片でコーティングし、さらに、例えば、ポリクローナル抗体である複数のさらなる分析物特異的抗体又はその断片をコーティングすることによって改善することができる。これにより、例えば、既知のピーク又はｍ／ｚサイズを有する所定の抗体又は断片を提供すると同時に、分析物捕獲の広い特異性を達成することができる。例えば、９０～８０％のポリクローナル抗体に対する１０～２０％の所定のモノクローナル抗体（又は断片）の比を用いることができる。
【0073】
抗体又はその断片は、重鎖クラス特異的、軽鎖タイプ特異的、遊離軽鎖特異的、又は重鎖クラス軽鎖タイプ特異的であり得る。
【0074】
本方法は、分析物の存在を検出することによって、又は、例えば、試料中の分析物の濃度を検出することによって、疾患を検出又は予後決定するために使用され得る。疾患は、分析物が分析物特異的抗体を用いて精製され得る任意の疾患であり得る。例えば、Ｂ細胞関連疾患又は他の免疫グロブリン関連疾患。他の例としては、急性期マーカー、肝疾患、及び肺癌バイオマーカーが挙げられる
【0075】
抗体産生細胞に関連する多くの増殖性疾患がある。
【0076】
多くのこのような増殖性疾患では、形質細胞は増殖して、同一の形質細胞のモノクローナル腫瘍を形成する。この結果、大量の同一の免疫グロブリンが産生され、モノクローン性免疫グロブリン血症として知られている。
【0077】
骨髄腫及び原発性全身性アミロイドーシス（ＡＬアミロイドーシス）などの疾患は、英国におけるがん死亡のそれぞれ約１．５％及び０．３％を占める。多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫に続いて、２番目に多い血液悪性腫瘍である。白人集団では、発生率は年間１００万人当たり約４０人である。従来、多発性骨髄腫の診断は、骨髄中の過剰なモノクローン性形質細胞、血清又は尿中のモノクローン性免疫グロブリン、及び高カルシウム血症、腎不全、貧血又は骨病変などの関連臓器又は組織障害の存在に基づいている。骨髄の正常な形質細胞含有量は約１％であるが、多発性骨髄腫では、含有量は典型的には１０％を超え、しばしば３０％を超えるが、９０％を超えることがある。
【0078】
ＡＬアミロイドーシスは、アミロイド沈着物としてのモノクローン遊離軽鎖断片の蓄積を特徴とするタンパク質の立体構造異常である。典型的には、これらの患者は心不全又は腎不全を呈するが、末梢神経及び他の器官も侵されることがある。
【0079】
患者の血流中、又は実際には尿中にモノクローン性免疫グロブリンが存在することによって同定できる他の多くの疾患がある。これらには、形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫、骨髄外に発生し、あらゆる臓器に発生しうる形質細胞腫瘍がある。存在する場合、モノクローナルタンパク質は典型的にはＩｇＡである。多発性孤立性形質細胞腫は、多発性骨髄腫の証拠の有無にかかわらず発生することがある。ワルデンシュトレームマクログロブリン血症は、モノクローン性ＩｇＭの産生に関連する低悪性度のリンパ増殖性疾患である。米国では年間約１，５００件、英国では３００件の新規症例がある。血清ＩｇＭの定量化は、診断とモニタリングの両方に重要である。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫は、英国における全がん死亡の約２．６％を引き起こし、モノクローナル免疫グロブリンは、標準電気泳動法を用いて患者の約１０～１５％の血清中に同定されている。最初の報告では、患者の６０～７０％の尿中にモノクローン遊離軽鎖が検出されることが示されている。Ｂ細胞慢性リンパ性白血病では、遊離軽鎖免疫測定法によってモノクローン性蛋白が同定されている。
【0080】
さらに、いわゆるＭＧＵＳ状態が存在する。これらは意義不明のモノクローン性免疫グロブリン血症である。この用語は、多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症などの証拠がない患者に、モノクローン性の無傷の免疫グロブリンが予期せぬ存在することを意味する。ＭＧＵＳは５０歳以上の集団の１％、７０歳以上の集団の３％、及び８０歳以上の集団の１０％に認められる。これらの大部分はＩｇＧｏｒ ＩｇＭ関連であるが、ＩｇＡ関連又は二クローン性であることはまれである。ＭＧＵＳ患者のほとんどは非血縁疾患により死亡するが、ＭＧＵＳは悪性モノクローナル高ガンマグロブリン血症に転化することがある。
【0081】
上記で強調した疾患の少なくともいくつかの症例において、疾患は、異常な濃度のモノクローナル免疫グロブリン又は遊離軽鎖を提示する。病気が形質細胞の異常な複製を引き起こすと、その「モノクローン」が増殖して血液中に現れるように、そのタイプの細胞によって免疫グロブリンの産生が増加することがよくある。
【0082】
本発明の方法で使用するために、所定量の複数のコントロール物質と、所望により分析物特異的抗体又はその断片とを含む、少なくとも１つの基質を含むキットは、さらに、較正されるべき分析物を較正するための所定の較正値を含む。これは、基準値と組み合わせて提供され、基準値は、例えば、コンピュータにプログラムされる数値の形態であってもよく、又はコンピュータにロードするための自動化チップシステム上に提供されるものであってもよい。あるいは、これは、アッセイ装置にアップロードするためのバーコード又はＱＲコードとして提供されてもよい。較正値は、上述のように決定することができる。このようなキットでは、コントロール物質抗体又はその断片は、上記で定義した通りであってもよい。
【0083】
本発明のさらなる態様は、本発明の工程（ｖ）及び（ｖｉ）を実行する手段を有する質量分析計を提供する。本発明の工程（ｖ）及び（ｖｉ）を質量分析計に実施させるための命令を含むコンピュータプログラムも提供される。
【0084】
１つ以上のプロセッサ上で実行されるときに、本発明の方法によって得られた第２のピークのサイズ又は面積を所定の較正値と比較する命令を含むコンピュータ読み取り可能媒体も提供される。この媒体はまた、例えば、第２のピークのピークサイズ又はｍ／ｚ値と分析物ピークとの比を比較することができる。
【0085】
基質への抗体の結合の基質及び方法、ならびにその後の分析物及びコントロール物質、例えばヘテロポリマー、例えば抗体ピークの溶出及び検出は、当該技術分野で一般に知られており、ポリクローナル抗免疫グロブリン抗体、例えば抗軽鎖、抗遊離軽鎖、抗重鎖及び抗重鎖クラス－軽鎖抗体は、例えば、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍから入手可能である。モノクローナル抗重鎖及び抗軽鎖抗体は、当該技術分野で公知である。
【0086】
ここで、本発明は、以下の図面を参照することによってのみ、例として説明される。
【図面の簡単な説明】
【0087】
【図1】図１は、酸溶出及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦに続いて、ビーズに結合した抗体を利用する原理を示す。この例では、抗原は存在せず、基質から溶出された抗体の濃度は、クロマトグラフィー－質量分析によって検出され、定量される。抗体由来の軽鎖のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの質量スペクトルも示した。
【図7a】図７は、ビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰを用いたＤａｒａｔｕｍｕｍａｂカッパ軽鎖の質量修飾を示す。標識は、試薬の単回投与（図７ａ）を用いて２時間、又は２時間後に試薬の２回目の投与（図７ｂ）を加えて６時間行った。
【発明を実施するための形態】
【0088】
図１は、ビーズのようなマトリックスに結合した抗体を例示としてのみ示す概略図である。
抗体は、公知の技術によって付着させることができる。
抗体は、公知の技術によって付着させることができる。
【0089】
分析物が存在しない場合、または、あるいはこれがコントロール較正値を生成するために使用される場合、抗体は、酸溶出によって溶出され得、検出された抗体の量は、ＬＣ－ＭＳによって定量され得る。質量分析計は、この場合、溶出された抗体からの軽鎖の電荷及び質量に基づいて２つのピークを生成する。
【0090】
図２において、抗体を患者試料とインキュベートして、β２Ｍのような分析物に結合させる。酸溶出後、抗体と抗原を分離し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを用いて検出する。実施例では、軽鎖を重鎖から分離し、軽鎖を検出し、分析物の試料のピークと比較する。検体の量は、抗体の非存在下での酸溶出によって生成された既知量の軽鎖のために補正することができ、抗体は、所定の較正値を生成するために使用されている。
【0091】
図３は、患者試料からの軽鎖を検出するモノクローナル抗体の例を示す。この場合、モノクローナル抗体のサイズは、検出される試料の軽鎖よりも重い。これは、モノクローナル抗体中の軽鎖のサイズを選択することによって、又は、あるいはモノクローナル抗体をより重くすることによって、例えば、モノクローナル抗体の軽鎖残基のＮ末端又はＣ末端に１つ又は複数の付加的アミノ酸を添加することによって、生成することができる。このようなより重いモノクローナル抗体軽鎖、又は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって検出されるピークであるならば、実際にモノクローナル重鎖を産生する技術は、当技術分野で一般に公知である。
【0092】
上記のような他のコントロール物質も同様の方法で使用することができる。
【実施例1】
【0093】
背景
質量分析（ＭＳ）は質量電荷比（ｍ／ｚ）により分析物の分離を可能にする。ポリクローナル免疫グロブリン軽鎖は、種々の組の質量を有するので、典型的には、シグナル強度に対してｍ／ｚの正規分布したベル形の曲線を生成する。モノクローナル軽鎖は、ベル曲線から外れて伸びる鋭いピークとして解離する。本発明者らは以前に、二重荷電（軽鎖イオン（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）がｍ／ｚ １０９００～１２３００の範囲でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより最良の分解能を生成することを観察した。例示したＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳイムノアッセイ前分析段階は、（１）磁気ビーズによる分析物の免疫捕捉、（２）分析物の同時溶出及び還元、及び（３）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ標的プレート上への分析物のスポットの３つの主要工程を有する。本発明者らは、工程１の間に加えることができる磁性ビーズに付着した質量修飾タンパク質標準を、工程２の前に分析物とアマルガム化され、それと同時にスポットされ得るように、例として含めることを選択した。これは、工程１における変動をコントロールするために使用でき、次に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計から得られた分析物スペクトルシグナルを標準化又はコントロールするために使用できるので、重要である。
質量分析（ＭＳ）は質量電荷比（ｍ／ｚ）により分析物の分離を可能にする。ポリクローナル免疫グロブリン軽鎖は、種々の組の質量を有するので、典型的には、シグナル強度に対してｍ／ｚの正規分布したベル形の曲線を生成する。モノクローナル軽鎖は、ベル曲線から外れて伸びる鋭いピークとして解離する。本発明者らは以前に、二重荷電（軽鎖イオン（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）がｍ／ｚ １０９００～１２３００の範囲でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより最良の分解能を生成することを観察した。例示したＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳイムノアッセイ前分析段階は、（１）磁気ビーズによる分析物の免疫捕捉、（２）分析物の同時溶出及び還元、及び（３）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ標的プレート上への分析物のスポットの３つの主要工程を有する。本発明者らは、工程１の間に加えることができる磁性ビーズに付着した質量修飾タンパク質標準を、工程２の前に分析物とアマルガム化され、それと同時にスポットされ得るように、例として含めることを選択した。これは、工程１における変動をコントロールするために使用でき、次に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計から得られた分析物スペクトルシグナルを標準化又はコントロールするために使用できるので、重要である。
【0094】
方法
免疫グロブリンの大量修飾
ペンタフルオロフェニルエステル（ＰＦＰ）又はテトラフルオロフェニルエステル（ＴＦＰ）架橋剤を介して、ビオチン又はビオチン化ＰＥＧ分子を用いて免疫グロブリンを修飾した。これらはタンパク質中の第一級及び第二級アミンの両方を標的とし、架橋剤のより一般的に使用されるＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基よりも反応性が高く安定である。これらは、タンパク質及びアミノ酸の両方のビオチン標識に適していることが示されており、市販されている（例えば、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）ＰＦＰ－Ｂｉｏｔｉｎ、カタログ番号２１２１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、及びビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰエステル、カタログ番号ＢＰ－２４３１８、ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）。ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンを、ＤＭＳＯ中に溶解した種々の量のＰＦＰ又はＴＦＰ架橋剤とともに、種々の期間（数時間から数日間）、振とう機上の室温でインキュベートした。反応をグリシン（１：１モル）の添加により停止し、次に透析して非共役架橋剤を除去した。
免疫グロブリンの大量修飾
ペンタフルオロフェニルエステル（ＰＦＰ）又はテトラフルオロフェニルエステル（ＴＦＰ）架橋剤を介して、ビオチン又はビオチン化ＰＥＧ分子を用いて免疫グロブリンを修飾した。これらはタンパク質中の第一級及び第二級アミンの両方を標的とし、架橋剤のより一般的に使用されるＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基よりも反応性が高く安定である。これらは、タンパク質及びアミノ酸の両方のビオチン標識に適していることが示されており、市販されている（例えば、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）ＰＦＰ－Ｂｉｏｔｉｎ、カタログ番号２１２１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、及びビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰエステル、カタログ番号ＢＰ－２４３１８、ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）。ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンを、ＤＭＳＯ中に溶解した種々の量のＰＦＰ又はＴＦＰ架橋剤とともに、種々の期間（数時間から数日間）、振とう機上の室温でインキュベートした。反応をグリシン（１：１モル）の添加により停止し、次に透析して非共役架橋剤を除去した。
【0095】
質量スペクトル標準粒子又はビーズの調製
質量分析標準ビーズを調製するために、１０μｌの修飾された免疫グロブリンをＰＢＳ間で５０μｌに希釈し、抗ヒトＩｇＧ常磁性微粒子とともに１５分間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去し、ビーズをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回、水で１回洗浄し、使用するまで貯蔵した。
質量分析標準ビーズを調製するために、１０μｌの修飾された免疫グロブリンをＰＢＳ間で５０μｌに希釈し、抗ヒトＩｇＧ常磁性微粒子とともに１５分間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去し、ビーズをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回、水で１回洗浄し、使用するまで貯蔵した。
【0096】
ＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳイムノアッセイ
血清試料又は純粋なタンパク質を希釈し、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖（抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、総カッパ及び総ラムダ）に特異的な抗体を含有する常磁性微粒子を用いたＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳイムノアッセイ中に捕獲した。これらの微粒子を、安定化ヒツジポリクローナル抗体又は組換えラクダＶＨドメイン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかに結合させた。ビーズをペレット化し、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで連続的に洗浄した。質量分析標準粒子ビーズを混合物に添加し、ペレット化し、水で１回洗浄した。これを、還元剤及びイオン化コントロールタンパク質の両方を含有する酸性緩衝液で溶出した（例えば、ＷＯ２０２１／０１９２１１参照）。続いて、ＭＡＬＤＩマトリックス（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）を有するサンドイッチ中でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦターゲットプレート上に溶出物をスポットし、乾燥させた。質量スペクトルは、二重荷電（［Ｍ＋２Ｈ］２＋、ｍ／ｚ １０９００～１２３００）イオンの分析物（ヒトカッパ又はラムダ軽鎖）及び質量スペクトルｓｔｄを含むｍ／ｚ範囲５０００～３０，０００をカバーするＢｒｕｋｅｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ上で正イオンモードで取得した。
血清試料又は純粋なタンパク質を希釈し、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖（抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、総カッパ及び総ラムダ）に特異的な抗体を含有する常磁性微粒子を用いたＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳイムノアッセイ中に捕獲した。これらの微粒子を、安定化ヒツジポリクローナル抗体又は組換えラクダＶＨドメイン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかに結合させた。ビーズをペレット化し、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで連続的に洗浄した。質量分析標準粒子ビーズを混合物に添加し、ペレット化し、水で１回洗浄した。これを、還元剤及びイオン化コントロールタンパク質の両方を含有する酸性緩衝液で溶出した（例えば、ＷＯ２０２１／０１９２１１参照）。続いて、ＭＡＬＤＩマトリックス（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）を有するサンドイッチ中でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦターゲットプレート上に溶出物をスポットし、乾燥させた。質量スペクトルは、二重荷電（［Ｍ＋２Ｈ］２＋、ｍ／ｚ １０９００～１２３００）イオンの分析物（ヒトカッパ又はラムダ軽鎖）及び質量スペクトルｓｔｄを含むｍ／ｚ範囲５０００～３０，０００をカバーするＢｒｕｋｅｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ上で正イオンモードで取得した。
【0097】
結果
免疫グロブリンの大量修飾
ＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳシステムで使用可能な質量シフト分子を生成するためには、２つのパラメーターが満たされる必要がある；（１）分子の免疫沈降又は免疫捕獲を妨げない免疫グロブリン軽鎖の修飾、及び（２）ｍ／ｚシフトとして検出可能な質量を加える（又は実際に除去する）。治療用モノクローナルＩｇＧＫ ＤａｒａｔｕｍｕｍａｂへのＰＦＰ架橋を用いたビオチンの添加を用いて、免疫グロブリン軽鎖のｍ／ｚにおける対応する質量シフトを伴う完全な免疫グロブリンの修飾がＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって観察されることを示した（図４）。図５は、ビオチン化によるこの質量シフトが、ポリクローナルＩｇＡ及びＩｇＭ試料でも機能することを示している。３例すべてにおいて、ラクダ抗体ビーズによるこれらの質量修飾タンパク質の免疫沈降は影響を受けない。ビオチン単独で見られる質量増加は、＋２電荷状態イオンの予想される生物学的範囲を超えて質量をシフトさせるのに十分ではなく；１０９００～１２３００Ｄａ；これを達成するためには、より大きな分子が必要である。ビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰを、ポリクローナルＩｇＡ及びＩｇＭ、ならびにヒツジ抗カッパ軽鎖ビーズによって捕獲された分子に添加した。時間経過は、４時間の反応時間がカッパ軽鎖の質量を平均ｍ／ｚ １１７００～１２６５０に修正するのに十分であることを示している（図６）。本研究は、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂモノクローナルタンパク質のビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰ修飾を用いて拡大した（図７）。修飾物質の６時間の２段階の添加は、２時間の１段階の添加と比較して（図７ａ）、カッパ軽鎖のほぼすべての質量をシフトさせた（図７ｂ）。ビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰはまた、骨髄腫由来モノクローナル免疫グロブリン、ＩｇＡＫ（図８ａ）及びＩｇＧ２Ｋ（図８ｂ）上の軽鎖を質量シフトするために使用され得る。ヒト血清中のポリクローナル免疫グロブリンκ軽鎖の同様の質量シフトは、関連架橋剤（ビオチン－ＰＥＧ２４－ＴＦＰ）を用いて３時間又は一晩にわたって得ることができた（図９ａｂ）。
免疫グロブリンの大量修飾
ＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳシステムで使用可能な質量シフト分子を生成するためには、２つのパラメーターが満たされる必要がある；（１）分子の免疫沈降又は免疫捕獲を妨げない免疫グロブリン軽鎖の修飾、及び（２）ｍ／ｚシフトとして検出可能な質量を加える（又は実際に除去する）。治療用モノクローナルＩｇＧＫ ＤａｒａｔｕｍｕｍａｂへのＰＦＰ架橋を用いたビオチンの添加を用いて、免疫グロブリン軽鎖のｍ／ｚにおける対応する質量シフトを伴う完全な免疫グロブリンの修飾がＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって観察されることを示した（図４）。図５は、ビオチン化によるこの質量シフトが、ポリクローナルＩｇＡ及びＩｇＭ試料でも機能することを示している。３例すべてにおいて、ラクダ抗体ビーズによるこれらの質量修飾タンパク質の免疫沈降は影響を受けない。ビオチン単独で見られる質量増加は、＋２電荷状態イオンの予想される生物学的範囲を超えて質量をシフトさせるのに十分ではなく；１０９００～１２３００Ｄａ；これを達成するためには、より大きな分子が必要である。ビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰを、ポリクローナルＩｇＡ及びＩｇＭ、ならびにヒツジ抗カッパ軽鎖ビーズによって捕獲された分子に添加した。時間経過は、４時間の反応時間がカッパ軽鎖の質量を平均ｍ／ｚ １１７００～１２６５０に修正するのに十分であることを示している（図６）。本研究は、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂモノクローナルタンパク質のビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰ修飾を用いて拡大した（図７）。修飾物質の６時間の２段階の添加は、２時間の１段階の添加と比較して（図７ａ）、カッパ軽鎖のほぼすべての質量をシフトさせた（図７ｂ）。ビオチン－ＰＥＧ３６－ＰＦＰはまた、骨髄腫由来モノクローナル免疫グロブリン、ＩｇＡＫ（図８ａ）及びＩｇＧ２Ｋ（図８ｂ）上の軽鎖を質量シフトするために使用され得る。ヒト血清中のポリクローナル免疫グロブリンκ軽鎖の同様の質量シフトは、関連架橋剤（ビオチン－ＰＥＧ２４－ＴＦＰ）を用いて３時間又は一晩にわたって得ることができた（図９ａｂ）。
【0098】
ＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳ ｓｔｄ
インサイチュＭＳコントロールとしての質量修飾免疫グロブリンの使用を例証するために、ＤａｒａｔｕｍａｂにＢｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ３６－ＰＦＰを３日間標識した。ヒツジ抗ＩｇＧビーズを用いてＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳイムノアッセイを用いて分析した結果の軽鎖のｍ／ｚは、単一部位が修飾されていることを示唆した（図１０及び１１）。この単一の部位修飾は、抗ＩｇＧビーズによって免疫捕捉されるＩｇＧＫ免疫グロブリンの能力に影響することなく、＋２ｍ／ｚを１１７００から１２６００に増加させるのに十分であった。１０倍の範囲にわたるこの分子の希釈系列は、この濃度がＭＳシグナル強度と正に関連することを示した（図１１）。
インサイチュＭＳコントロールとしての質量修飾免疫グロブリンの使用を例証するために、ＤａｒａｔｕｍａｂにＢｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ３６－ＰＦＰを３日間標識した。ヒツジ抗ＩｇＧビーズを用いてＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳイムノアッセイを用いて分析した結果の軽鎖のｍ／ｚは、単一部位が修飾されていることを示唆した（図１０及び１１）。この単一の部位修飾は、抗ＩｇＧビーズによって免疫捕捉されるＩｇＧＫ免疫グロブリンの能力に影響することなく、＋２ｍ／ｚを１１７００から１２６００に増加させるのに十分であった。１０倍の範囲にわたるこの分子の希釈系列は、この濃度がＭＳシグナル強度と正に関連することを示した（図１１）。
【0099】
質量修飾Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂを抗ＩｇＧビーズに結合させ、ＥＸＥＮＴ ＱＩＰ－ＭＳ免疫沈降ＩｇＡアッセイを行ったところ、分析物と質量修飾分子の同時溶出が得られた。後者の質量修飾軽鎖＋２ピークは、骨髄腫ＩｇＡＬ患者（図１２）又は健康な試料に存在するポリクローナルＩｇＡから得られるものと明確に区別できる（図１３）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】