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特表2023-525870オメガ－グリコシド及びアルキルグリコシドの効率的な合成
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-19
(54)【発明の名称】オメガ－グリコシド及びアルキルグリコシドの効率的な合成
(51)【国際特許分類】
C12P 1/02 20060101AFI20230612BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20230612BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230612BHJP
C12P 19/00 20060101ALI20230612BHJP
C12R 1/72 20060101ALN20230612BHJP
【ＦＩ】
C12P1/02 D
C12N9/02
C12N1/19
C12P19/00
C12R1:72
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022569247
(86)(22)【出願日】2021-05-12
(85)【翻訳文提出日】2023-01-10
(86)【国際出願番号】 EP2021062756
(87)【国際公開番号】W WO2021229017
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】20174471.1
(32)【優先日】2020-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522442825
【氏名又は名称】アンフィスター
(71)【出願人】
【識別番号】514185611
【氏名又は名称】ユニベルシテイト ゲント
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＧＥＮＴ
【住所又は居所原語表記】Ｓｉｎｔ－Ｐｉｅｔｅｒｓｎｉｅｕｗｓｔｒａａｔ ２５， Ｂ－９０００ Ｇｅｎｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】スータート，ウィム
(72)【発明者】
【氏名】ローランツ，ソフィー
(72)【発明者】
【氏名】スティーブンス，クリスチャン
(72)【発明者】
【氏名】デルベーク，エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】ルイテン，ゲーデル
(72)【発明者】
【氏名】パラ，メリケ
(72)【発明者】
【氏名】レメリー，ジェル
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B064AF41
4B064AF45
4B064BJ10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA02
4B065AA72X
4B065AA73X
4B065AA75X
(57)【要約】
本発明は、新規のバイオ界面活性剤の製造の分野に関する。より詳細には、本発明は、１０％未満、好ましくは１％未満のω－１グリコシドを有する短鎖状のω－グリコシドを、真菌株、例えば、機能不全のＣＹＰ５２Ｍ１シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及び機能不全のＦＡＯ１脂肪アルコールオキシダーゼを有する酵母菌スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を使用して、効率的に発生させて、汚染α，ω－１ボラグリコシドを含まない多量の所謂不飽和（対称）α，ω－ボラグリコシドを生成すること、並びに、当該不飽和（対称）α，ω－ボラグリコシドを、例えば水中で実施されるオゾン分解を通してなどの、当該二重結合（複数可）の破壊を誘導する条件に供することに関する。より詳細には、本発明は、（アセチル化）Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド、Ｃ９：０ω－グルコシドアルデヒド、Ｃ９：０ω－糖脂質、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルコール及びＣ９：０ω－グルコシドアルコール並びにこれらのさらなる誘導体の発生を開示する。本発明は、アルキルソホロシドを、増加した比で生成する方法にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルキルグリコシドを製造するための方法であって、好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換してアルキルグリコシドを含む培養液を生成する工程を含み、前記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ及び機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログを有するように変異されている真菌株であり、又は前記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１、機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログ、及び機能不全の、ソホロ脂質生合成経路において第２グルコシル化工程に関与するグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有するように変異されている真菌株であり、前記真菌株が、少なくとも１つの、機能不全の、長鎖脂肪アルコールのω－酸化に関与する酸化酵素、を有するようにさらに変異されている、前記方法。
【請求項2】
前記真菌株が、天然ＳＬ生成真菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記真菌株が、スタルメレラ（カンジダ）ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）アピコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ａｐｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）マグノリアエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、スタルメレラ（カンジダ）バチスタエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂａｔｉｓｔａｅ）、スタルメレラ（カンジダ）フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ（カンジダ）ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｓｔｅｌｌａｔａ）、スタルメレラ（カンジダ）クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｋｕｏｉ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬＹ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及びスタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）のソホロ脂質生成株；からなる群から選択される酵母菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記の長鎖脂肪アルコールのω－酸化に関与する酸化酵素が、配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１、配列番号：１０３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ２、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４、配列番号：１０９に記載されているアミノ酸配列を含むＡ５、配列番号：１１１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ６、及び配列番号：１１３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ７を含む群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記真菌株が、少なくとも、機能不全の、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含む酸化酵素Ａ３、及び機能不全の、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含む酸化酵素Ａ４、を有するように変異されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記真菌株が、少なくとも、機能不全の、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含む酸化酵素Ａ３、機能不全の、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含む酸化酵素Ａ４、及び機能不全の、配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ１、を有するように変異されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記アルキルグリコシドが、アルキルグルコシド又はアルキルソホロシドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
１０％未満、好ましくは１％未満のω－１グリコシド、ω－２グリコシド及び／又はω－３グリコシドを含有するω－グリコシドを製造する方法であって、前記ω－グリコシドが、グリコシド結合を介して脂肪族炭素鎖の第１級又は末端炭素原子に結合している炭水化物を含み：ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満、好ましくは１％未満のα，ω－１ボラグリコシド、α，ω－２ボラグリコシド及び／又はα，ω－３ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程であって、前記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ及び機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログを有するように変異されている真菌株であり、又は前記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１、機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログ、及び、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有するように変異されている真菌株であり、
前記不飽和α，ω－ボラグリコシドが、グリコシド結合を介して脂肪族炭素鎖の第１級又は末端炭素原子にそれぞれ結合している２つの炭水化物を含み、前記脂肪族炭素鎖が少なくとも１つの二重結合を含む、工程
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液から前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程、並びに
ｃ．工程ａ）において生成した前記培養液内の前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを、前記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊するオゾン分解反応若しくは酵素反応に供する、又は工程ｂ）において精製された前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを、前記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊するオゾン分解反応若しくは酵素反応に供する工程
を含む、前記方法。
【請求項9】
前記酵素反応が、リポキシゲナーゼ、ヒドロキシペルオキシドリアーゼ、モノオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ／モノオキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ／モノオキシゲナーゼ、リパーゼ、又はこれらのいずれかの組み合わせ、好ましくはリポキシゲナーゼ及びヒドロキシペルオキシドリアーゼの組み合わせ又はモノオキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ／モノオキシゲナーゼの組み合わせによって媒介される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ω－グリコシドが、ω－ソホロシド、又はω－グルコシドである、請求項８又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ω－グリコシドが、ω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシドアルコール及び／若しくはω－糖脂質、又はこれらの誘導体である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記好適な基質が、好適な親水性基質と好適な疎水性基質との組み合わせであり、前記好適な親水性基質が、炭水化物及びポリオールを含む群から選択され、前記好適な疎水性基質が、少なくとも６個の炭素の脂肪族鎖長を有する、アルコール、好ましくはモノアルコール、脂肪酸、アルケン及び／又はアルカンを含む群から選択され、好ましくは、前記疎水性基質が、不飽和第１級脂肪アルコールである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記不飽和α，ω－ボラグリコシドが、対称である、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記真菌株が、天然ＳＬ生成真菌株である、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記真菌株が、スタルメレラ（カンジダ）ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）アピコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ａｐｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）マグノリアエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、スタルメレラ（カンジダ）バチスタエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂａｔｉｓｔａｅ）、スタルメレラ（カンジダ）フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ（カンジダ）ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｓｔｅｌｌａｔａ）、スタルメレラ（カンジダ）クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｋｕｏｉ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及びスタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）のソホロ脂質生成株からなる群から選択される酵母菌である、請求項８～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記不飽和α，ω－ボラグリコシドが、アセチル化されている、請求項８～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ω－グリコシドが、ω－Ｃ９ソホロシド又はω－Ｃ９グルコシドである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
オゾン分解の際、プロトン性求核試薬が溶媒として使用される、請求項８～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記プロトン性求核試薬が水である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
工程ｃ）において得られた前記ω－グリコシドを、アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化、加硫、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される化学的誘導体化経路に供する工程をさらに含む、請求項８～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成のための、配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ１若しくはそのホモログ、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ３若しくはそのホモログ、又は、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含む酵素若しくは酵素Ａ４若しくはそのホモログの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、（バイオ）界面活性剤として有用であり及び／又は抗微生物特性を保有する－例えば－ソホロシド及びグルコシドなどの有用なオメガ－グリコシドを効率的に製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、１０％未満の汚染（不飽和）アルファ，オメガ－１－ボラグリコシドを含む不飽和アルファ，オメガ－ボラ（ｂｏｌａ）グリコシドを生成する転換工程、続いての、当該不飽和アルファ，オメガ－ボラグリコシドを少なくとも１つの開裂可能な結合を破壊する反応条件に供する工程を含む方法を開示する。後者の方法は、１０％未満の汚染オメガ－１－グリコシドを含む高収率のオメガ－グリコシドの生成を結果として生じさせる。
【背景技術】
【0002】
化石資源の供給及びこれらの使用に関連する環境への懸念に対処する必要性を縮小することは、化学物質の生成に関して、持続可能な、安全且つ環境に配慮した技術の開発を必要としている（Ｓｈｅｌｄｏｎ，２０１４；Ｔｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。環境に優しく且つ持続可能な代替物への消費者の圧力は、市場のますます重要な原動力となってきている。環境に優しい化学の他の原理に固着しつつ再生可能なバイオマスを原料として利用すること（Ａｎａｓｔａｓ ＆ Ｅｇｈｂａｌｉ，２０１０）は、これらの目標を達成するための選択肢であると考えられている。しかし、バイオベースの化学物質の生成は、現在の化石ベースの経済から循環型のバイオベースの経済への移行を容易にするために、化石由来の化学物質のものと比較して経済的競争力も有するべきである（Ｐｈｉｌｐ
ｅｔ ａｌ．，２０１３）。バイオベースの化学物質の商業的開発は、（従来の類似物若しくは暫定的なものとは対照的に）優れた特性を有する全く新しい産業の化学物質を生成することによって並びに／又は（例えば、発酵プロセスの生産性を増加させること及び／若しくは化学（誘導体化）プロセスの所望の最終製品を生じる反応工程の数を減少させることによって）生成の効率を改良することによって、よりふさわしいものとなり得る（Ｆａｒｍｅｒ ＆ Ｍａｓｃａｌ，２０１５）。これらの目標は、いずれも、最終製品におけるバイオベース原料の構造及び機能性を役立てることによって実現され得る。バイオ界面活性剤又はバイオベースの界面活性剤は、かかるバイオベースの生化学物質の例である。バイオ界面活性剤は、化学的又は生物学的手段を通して生成され得、細菌性又は微生物性バイオ界面活性剤は、２０３０年よりも前に商業化されるべき最上の新興のバイオベース製品の１つと認定されている（Ｆａｂｂｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。バイオ界面活性剤は多様な分子構造及びタイプを構成するが、これら全てが両親媒性特性を付与する少なくとも１つの親水性部及び少なくとも１つの疎水性部を有するという共通点がある。商業化されている微生物性バイオ界面活性剤の分野は、タイプ及び生成者／供給者についてかなり限定されている。まとめると、商業化されている製品は、糖脂質（ソホロ脂質（ＳＬ）、ラムノリピド（ＲＬ）及びマンノシルエリトリトール脂質（ＭＥＬ））、リポペプチド、リン脂質／脂肪酸並びに粒子状及び高分子のバイオ界面活性剤である。
ｅｔ ａｌ．，２０１３）。バイオベースの化学物質の商業的開発は、（従来の類似物若しくは暫定的なものとは対照的に）優れた特性を有する全く新しい産業の化学物質を生成することによって並びに／又は（例えば、発酵プロセスの生産性を増加させること及び／若しくは化学（誘導体化）プロセスの所望の最終製品を生じる反応工程の数を減少させることによって）生成の効率を改良することによって、よりふさわしいものとなり得る（Ｆａｒｍｅｒ ＆ Ｍａｓｃａｌ，２０１５）。これらの目標は、いずれも、最終製品におけるバイオベース原料の構造及び機能性を役立てることによって実現され得る。バイオ界面活性剤又はバイオベースの界面活性剤は、かかるバイオベースの生化学物質の例である。バイオ界面活性剤は、化学的又は生物学的手段を通して生成され得、細菌性又は微生物性バイオ界面活性剤は、２０３０年よりも前に商業化されるべき最上の新興のバイオベース製品の１つと認定されている（Ｆａｂｂｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。バイオ界面活性剤は多様な分子構造及びタイプを構成するが、これら全てが両親媒性特性を付与する少なくとも１つの親水性部及び少なくとも１つの疎水性部を有するという共通点がある。商業化されている微生物性バイオ界面活性剤の分野は、タイプ及び生成者／供給者についてかなり限定されている。まとめると、商業化されている製品は、糖脂質（ソホロ脂質（ＳＬ）、ラムノリピド（ＲＬ）及びマンノシルエリトリトール脂質（ＭＥＬ））、リポペプチド、リン脂質／脂肪酸並びに粒子状及び高分子のバイオ界面活性剤である。
【0003】
グリコシド（ＧＳ）は、１つ以上の炭水化物分子がグリコシド結合を介して少なくとも１つの他の化合物に共有結合しているクラスの化合物である。「他の化合物」は－例えば－炭素分子の（官能化）脂肪族鎖であり得る。グリコシドは、化学的手段を通して、例えば、アルキルポリグルコシドを生じる、グルコース及び脂肪アルコールからの常套的なフィッシャー合成を通して（ＭｃＣｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、又は、生物学的手段を通して、例えば、ボラ－及び／若しくはアルキル／アルコール－ソホロシド（ＳＳ）及び－グルコシド（ＧＬｕＳ）を生じる、例えば、グルコース及び脂肪アルコールからの（全細胞）生体触媒による転換を通して（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）生成され得る。化学及び生物学的方法の組み合わせは、例えば、化学的に
合成されたアルキルポリグルコシドのさらなる生体触媒によるグリコシル化である（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。アルキルソホロシド（アルキルＳＳ）、ボラソホロシド（ボラＳＳ）、ボラグルコシド（ボラＧＬｕＳ）、アルキルグルコシド（アルキルＧＬｕＳ）は、グリコシド微生物性バイオ界面活性剤の非限定例である。
合成されたアルキルポリグルコシドのさらなる生体触媒によるグリコシル化である（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。アルキルソホロシド（アルキルＳＳ）、ボラソホロシド（ボラＳＳ）、ボラグルコシド（ボラＧＬｕＳ）、アルキルグルコシド（アルキルＧＬｕＳ）は、グリコシド微生物性バイオ界面活性剤の非限定例である。
【0004】
糖脂質（ＧＬｙ）は、１つ以上の炭水化物分子（複数可）が脂質分子に共有結合しているクラスの化合物である。糖脂質は、例えば、スクロース及び脂肪酸から出発して（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９７４）スクロースエステルに至る化学的手段を通して生成され得、又は、生物学的手段を通して、例えば、例えばグルコース及び脂肪酸／植物油からＳＬへの（全細胞）生体触媒による転換を通して生成され得る（Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｉｅｂｅｎｈａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
【0005】
ソホロ脂質（ＳＬ）、ボラソホロ脂質（ボラＳＬ）、糖脂質（ＧＬ）、ラムノリピド（ＲＬ）、マンノシルエリトリトール脂質（ＭＥＬ）は、糖脂質微生物性バイオ界面活性剤の非限定例である。
【0006】
上記のグリコシド－及び糖脂質微生物性バイオ界面活性剤は、再生可能な炭素源、例えば、第１世代のバイオマス、例えば、グルコース、植物油、脂肪酸／－アルコールを使用する（Ｌｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓａｅｒｅｎｓ，Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、並びに、さらには廃棄物及び支流、例えば、廃棄の料理用油、糖蜜、食品廃棄物などからの（Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）（修飾された）微生物株を使用して生成され得る。
【0007】
ソホロ脂質（ＳＬ）は、最もよく知られている微生物性バイオ界面活性剤のうちの１つであり、且つ、商業化されるべき最初のもののうちの１つである。Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）は、高い力価（２００ｇＬ－１超）を有するＳＬを生成するときＳＬ生成を目的として好ましく適用される酵母菌株であるが（Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、２ｇ／Ｌ．ｈを超える生産性が報告されている（Ｄｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＳＬの特異的な表面活性特性は、関連のある応用分野に使用することを対象としており（Ｄ．Ｗ．Ｇ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｌａｕｒｙｓｓｅｎ，２０１０；Ｌｏｕｒｉｔｈ ＆ Ｋａｎｌａｙａｖａｔｔａｎａｋｕｌ，２００９）、いくつかの環境保護の洗浄液及びパーソナルケア製品において現在商業的に適用されている。ＳＬはまた、生物活性特性を保有することも報告されており（例えば、抗微生物性、抗ウイルス性、抗菌性）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、この特定の理由で、特に、化粧品／パーソナルケア製品、例えば、にきび抑制石鹸及び制汗剤の用途も見出されている。他の微生物性糖脂質バイオ界面活性剤、例えば、ラムノリピドなどもまた、最近商業化されている。微生物性バイオ界面活性剤の市場全体でのボリューム及び商業的採用は、主に：これらのコスト及び分子多様性の欠失；という２つの理由であるが、依然として制限されたままである。コストの側面は、低い生成規模及び最適化されていない且つ不充分な生成技術を主な原因とする。（微生物性）バイオ界面活性剤の商業的採用は、故に、効率を増加させることによって及び利用可能な化合物／分子構造の多様性を増加させることによって加速され得る。分子多様性は、様々な物理化学的／生物学的特性につながり、後に、より多数の潜在的な応用分野へとつながり得る（Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。分子多様性を増加させることは、全く新しい性質のバイオ界面活性剤を生成することを目標として微生物を遺伝子操作することを通して並びに／又は（既存の）微生物性バイオ界面活性剤の化学的及び／若しくは酵素的修飾によって実現され得る。両方のストラテ
ジーの組み合わせもまた適用され得る。
ジーの組み合わせもまた適用され得る。
【0008】
微生物性バイオ界面活性剤糖脂質／グリコシドの、及び、より詳細にはＳＬの特定のタイプの化学的修飾に関しては、Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（ＳｙｎｔｈｅＺｙｍｅ），Ｄｅｌｂｅｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）及びＤｅｖｅｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｃｏｖｅｒ）のグループが、その後の化学的誘導体化のための出発物質としての、酵母菌スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）によって生成される野生型（ラクトン）ＳＬの使用のための方法を記載している（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｍｏｖｓｉｓｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２０１１；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＳＬは、天然には、オメガ－（ω）及びオメガ－１（ω－１）ＳＬの混合体であり、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）によって生成される主な化合物はω－１ Ｃ１８：１であり、そのＳＬ、ラクトンバージョンは、図１Ａに示されている（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔｕｌｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６２）。上記のグループは、多様性を増加させること並びに化学－及び／又は化学酵素経路を使用した新しいバイオ界面活性剤化合物の製品ラインアップを作り出すことを目標として前駆体としてＳＬを使用することを記載している。このことは、興味深い物理化学及び生物学的（例えば、抗微生物性）特性を有する新しい化合物、例えば、短鎖（オメガ－１）ソホロシドアルデヒド、短鎖（オメガ－１）ソホロ脂質、オメガ－１第４級アンモニウムソホロ脂質（ＱＡＳＬ）、ＳＳアミンオキサイド、ＳＳアミン、ボラ両親媒性ＳＳなどの大きなライブラリーを結果として生じさせた（Ｄｅｌｂｅｋｅ，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｌｏｚａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｍｏｖｓｉｓｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｅｌａｎｔｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。抗微生物特性を示すことに加えて、多くの合成されたＱＡＳＬがまた、高いトランスフェクション効率を示した（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｌｏｚａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。明白に、かかる適用は、家庭用洗剤における適用と比較して、より高い値を作り出すこと／より高いコストを許容することが予期される。野生型ＳＬ（ω－１及びωの混合物、主にω－１）から出発する、記載されている化学的誘導経路は、典型的には、かなり複雑な合成誘導体化経路に従う。例えば、（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）によって記載されている方法において、酵母菌由来のラクトンＳＬは、まず、ＳＬメチルエステルに変換され、（糖頭部基を保護するために）過アセチル化され、その後、オゾン分解に供されて、ＳＬに存在する二重結合を破壊し、最終的に、ω－１Ｃ９ソホロシドアルデヒドビルディングブロック（ωＣ９ソホロシドアルデヒドの存在量が少ない）、及び、除去されなければならない副生成物としてＣ９アルキル鎖分離物を得る（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。この最後の態様は、野生型ＳＬから出発するこの誘導体化方法に関する収率に負に影響し、最初の炭素原子のうちの３０％（３０のうち９）がこのプロセスにおいて失われる。さらに、Ｃ９副生成物は－言及されているように－Ｃ９ソホロシドアルデヒド生成物から除去されなければならず、これは、さらなる工程（同じく収率を低減する）及びコストの両方をプロセスに付加する。これらの障害にもかかわらず、上記のω－１Ｃ９ソホロシドアルデヒドビルディングブロックを、上記で既に言及されているようにバイオ界面活性剤の製品ラインアップにさらに誘導体化した。これらの誘導体もまた、そのため、ω－１（主）及びω－グリコシドの混合物である。これまでのところ、化学的及び／又は酵素的誘導体化と組み合わせたバイオプロセス工程に基づいた多様なω－グリコシドの生成は、主にω－１グリコシドが存在し且つω－グリコシドが非常に低量で存在する混合物を結果として生じさせた。混合物に存在するω－グリコシドの存在度が
低い理由は、微生物、例えば、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を生成する大部分の野生型ＳＬによる脂肪性基質の酵素的ヒドロキシル化が、ω又はω－１位におけるヒドロキシル化の相対量が脂肪族分子における構造体の長さと相関するため、かなり特異的であるという事実に起因している。二重結合は、例えば、脂肪酸鎖長を空間的に短くすることにより、オレイン酸のω及びω－１（主）の両方をヒドロキシル化させる一方で、ステアリン酸は明らかにω－ヒドロキシル化には長過ぎ、故に、ω－１位において排他的にヒドロキシル化される（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔｕｌｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６２）。この酵素的ヒドロキシル化は、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）の場合にはＣＹＰ５２Ｍ１酵素（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）及び微生物種を生成する他のＳＬにおいてはその機能的ホモログ（複数可）の活性を通して起こる。
低い理由は、微生物、例えば、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を生成する大部分の野生型ＳＬによる脂肪性基質の酵素的ヒドロキシル化が、ω又はω－１位におけるヒドロキシル化の相対量が脂肪族分子における構造体の長さと相関するため、かなり特異的であるという事実に起因している。二重結合は、例えば、脂肪酸鎖長を空間的に短くすることにより、オレイン酸のω及びω－１（主）の両方をヒドロキシル化させる一方で、ステアリン酸は明らかにω－ヒドロキシル化には長過ぎ、故に、ω－１位において排他的にヒドロキシル化される（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔｕｌｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６２）。この酵素的ヒドロキシル化は、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）の場合にはＣＹＰ５２Ｍ１酵素（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）及び微生物種を生成する他のＳＬにおいてはその機能的ホモログ（複数可）の活性を通して起こる。
【0009】
ＳＬ生成酵母菌株の遺伝子操作は、これらの課題のいくつかに対するいくつかの解決策を付与し得る。例えば、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１８）は、最近、ボラ形態ソホロシド（ω及びω－１の混合）の生成が、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）ノックアウト株ΔａｔΔｓｂｌｅΔｆａｏ１によって達成され得ることを示した（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。これらの化合物はまた、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）によって、別のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）ノックアウト株、すなわち、Δｆａｏ１によって生成されることが報告された。ボラ形態ＳＳ又はボラＳＳは、２つの同一の親水性ソロホース頭部基を含み、これらは両方が疎水性（不飽和）炭化水素リンカーとグルコシドによって連結されている。不飽和炭化水素リンカーに存在する二重結合は－野生型ＳＬに関する場合と同様に－例えば、オゾンによって開裂しやすく、これは、二重結合の開裂のためのプロセス条件に応じてアルファ位においてアルデヒド（ソホロシドアルデヒド）、アルコール（ソホロシドアルコール）又はカルボン酸（ソホロ脂質）官能性を有する２つのより短い鎖状のソホロシド単位（ω及びω－１の混合）の生成を理論的には結果として生じさせ得る。これは、野生型ＳＬを使用する場合における上記のアルキル部分割の損失を避けることができる。これらの新しい株によって生成されるこれらの化合物は、故に、いくつかの解決策を付与し得るが、得られるより短い鎖状のソホロシド単位及びこれらの誘導体もまた、そのω及びω－１化合物の混合物から構成され、これらの比（ω／ω－１）は、上流の発酵プロセスの変動を生じやすく、故に、バッチ間変動を生じやすい。化合物の比のかかる変動は、小さな分子変異さえも誘導生成物の対応する特性に劇的な影響を与え得るため、特定の混合物の特性の変動を生じる（Ｂａｃｃｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。さらに、両方の上記のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株が、副生成物としてのいくつかの他のタイプの（ボラ）ＳＬを依然として生成し（Ｆ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、そのため、同じく誘導体化を複雑にし且つさらなる精製工程を必要とし、同じくプロセスの際の炭素の損失並びにこれによる低い収率及び高いコストを結果として生じさせる。
【0010】
二重結合を開裂する方法の例は－上記で言及されているように－オゾン分解である。実際、オゾン分解は、オレフィン性化合物における二重結合の酸化開裂のための効率的な方法である（Ｆｒｉｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９５７；Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ ＆ Ｒｏｄｅｎｂｅｒｇ，１９６８）。そのため、オゾン分解は、植物油（例えば、ヒマワリ油、菜種油）に由来する油脂化学物質に広範に適用される。油脂化学物質のオゾン分解を介してのバイオベースの化学物質の生成について、意図するところは、アルデヒド、アルコール、モノ－若しくはジカルボン酸又はこれらの混合物を最終生成物として又は機能性中間体としてのいずれかで生成することである（Ｈａｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｏｃｋｒｉｔｚ ＆ Ｍａｒｔｉｎ，２０１１；Ｏｍｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）
。オゾン分解はまた－上記で言及されているように－機能性短鎖ソホロシドアルデヒド、短鎖ＳＬカルボン酸（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８）及び多くのさらなる誘導体化オプション（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）の形成も可能にする。オゾン分解反応の高い原子効率及び酸化体のオンサイト発生に起因する減少したリスクにもかかわらず、オゾン分解は、依然として、安全への懸念に悩まされている（Ｎｏｂｉｓ ＆ Ｒｏｂｅｒｇｅ，２０１１）。後者は、大部分が、高度に不安定な副生成物、例えば、爆発し得るオゾニド及びペルオキシドの発生から生じる（Ｎｏｂｉｓ ＆ Ｒｏｂｅｒｇｅ，２０１１）。これらの課題は、反応系及び反応条件の注意深い考慮によって取り組まれ得る（Ｉｒｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。さらに、関与する溶媒、例えば、水又は第１級アルコールの使用が、形成を制限し得る。しかし、いくつかの油脂化学物質は、低い水溶性に悩まされるため、後者の溶液の使用を制限する。これはまた、野生型ＳＬに関する場合もそうである。水中でのオゾン分解に基づく野生型ＳＬの誘導体化方法が開示されているが、多数の工程及びケアが、発泡の課題とのトレードにおいてラクトンＳＬの可溶化を保証するために必要とされる（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２０１１）。
。オゾン分解はまた－上記で言及されているように－機能性短鎖ソホロシドアルデヒド、短鎖ＳＬカルボン酸（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８）及び多くのさらなる誘導体化オプション（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）の形成も可能にする。オゾン分解反応の高い原子効率及び酸化体のオンサイト発生に起因する減少したリスクにもかかわらず、オゾン分解は、依然として、安全への懸念に悩まされている（Ｎｏｂｉｓ ＆ Ｒｏｂｅｒｇｅ，２０１１）。後者は、大部分が、高度に不安定な副生成物、例えば、爆発し得るオゾニド及びペルオキシドの発生から生じる（Ｎｏｂｉｓ ＆ Ｒｏｂｅｒｇｅ，２０１１）。これらの課題は、反応系及び反応条件の注意深い考慮によって取り組まれ得る（Ｉｒｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。さらに、関与する溶媒、例えば、水又は第１級アルコールの使用が、形成を制限し得る。しかし、いくつかの油脂化学物質は、低い水溶性に悩まされるため、後者の溶液の使用を制限する。これはまた、野生型ＳＬに関する場合もそうである。水中でのオゾン分解に基づく野生型ＳＬの誘導体化方法が開示されているが、多数の工程及びケアが、発泡の課題とのトレードにおいてラクトンＳＬの可溶化を保証するために必要とされる（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２０１１）。
【0011】
二重結合を開裂する方法の別の例は、酵素の作用によるものである。実際、酵素は、広範囲の活性を有する万能なタンパク質である。二重結合を開裂する酵素、例えば、ヘム及び非ヘムオキシゲナーゼが記載されている（Ｍｕｔｔｉ，２０１２）。生体触媒による方法の例は、２つの酵素、すなわち、リポキシゲナーゼ及び脂肪酸ヒドロキシペルオキシドリアーゼの使用における、脂肪族オレフィン性二重結合の酸化開裂に産業的に適用されている（Ｓｔｏｌｔｅｒｆｏｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。リポキシゲナーゼは、不飽和脂肪酸の過酸化を触媒し、得られるヒドロキシペルオキシ脂肪酸が、ヒドロキシルペルオキシドリアーゼによってアルデヒド及びオキソ酸にさらに変換される。アルデヒドは、アルコールヒドロゲナーゼの逆の作用によってさらに第１級アルコールに還元され、又はアルデヒドオキシダーゼを使用してそれぞれのカルボン酸に酸化され得る。両方のタイプのオキシドレダクターゼが市販されている。伝統的な産業的方法は、これらの酵素の供給源として植物抽出物を適用する。しかし、最近、微生物細胞工場での、かかるタイプの酵素、例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の異種共発現が、これらの酵素を（共－）発現するための実行可能な選択肢として出現している。二重結合を開裂する別の生体触媒方法は、エポキシド化であり、これは、ペルオキシダーゼ及び／又はモノオキシゲナーゼを使用する酸化を通して達成され得る（Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。得られるエポキシドは、その後、エポキシドヒドロラーゼによって近接のジオールに変換され得る（Ｋｏｔｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。これらのジオールは、アルコールヒドロゲナーゼによってケトン－アルコール若しくはジケトンにさらに酸化され得、又はモノオキシゲナーゼによってアルデヒド若しくはカルボン酸に酸化開裂され得る。
【0012】
ソホロシドアルデヒドは、さらに化学的－だけでなく酵素的な誘導体化も目的とした極めて万能な化合物である。これらは、アルコールヒドロゲナーゼの逆の作用を通して、上記で言及されているように、第１級アルコールにさらに還元され得、アルデヒドオキシダーゼ又はアルデヒドヒドロゲナーゼを適用することによってそれぞれのカルボン酸に酸化され得る。無数の化合物へのさらなる誘導体化は－化学的誘導体化について上記で言及されているように－生体触媒手段を通して達成することもできる。全ての記載されている生体触媒反応（複数可）はまた、ソホロ脂質／ソホロシド生成宿主におけるそれぞれの酵素の（異種）発現を通して生成プロセス内に一体化されてもよい。
【0013】
ＳＬから新しいバイオベースの分子を生成するためのオゾン分解を用いる以前の作業をまとめると、分割アルキル部と一緒になったω及びω－１（主にω－１）ソホロシドアルデヒド、ソホロ脂質（ジ）カルボン酸及び／又はソホロシドアルコールの混合物を、典型
的には、オレフィン性二重結合の位置及びワークアップ条件に応じて得ている（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｏｍｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。かかる混合物は、複雑な下流の処理（例えば、分離、精製）を必要とすることにより、最終製品（ω－１グリコシド及びω－１糖脂質並びにこれらの誘導体）のコストを増加させる。そのため、高度に効率的な、高い収率（炭素の損失を避ける）、溶解性の課題を回避したグリコシド（複数可）及び糖脂質（複数可）（ビルディングブロック）の選択的生成、並びにω及びω－１グリコシドの混合物の生成を可能にする方法を設計する緊急の必要性がある。
的には、オレフィン性二重結合の位置及びワークアップ条件に応じて得ている（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｏｍｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。かかる混合物は、複雑な下流の処理（例えば、分離、精製）を必要とすることにより、最終製品（ω－１グリコシド及びω－１糖脂質並びにこれらの誘導体）のコストを増加させる。そのため、高度に効率的な、高い収率（炭素の損失を避ける）、溶解性の課題を回避したグリコシド（複数可）及び糖脂質（複数可）（ビルディングブロック）の選択的生成、並びにω及びω－１グリコシドの混合物の生成を可能にする方法を設計する緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明は、従来技術の上記の問題の１つ以上を解決する。
【課題を解決するための手段】
【0015】
一態様において、１０％未満、好ましくは１％未満のω－１グリコシド、ω－２グリコシド及び／又はω－３グリコシドを含有するω－グリコシドを製造する方法であって、上記ω－グリコシドが、グリコシド結合を介して脂肪族炭素鎖の第１級又は末端炭素原子に結合している炭水化物を含んでおり：
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満、好ましくは１％未満のα，ω－１ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程であって、上記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ及び機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログを有するように変異されている真菌株であり、又は上記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１、機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログ、及び、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有するように変異されている真菌株であり、
上記不飽和α，ω－ボラグリコシドが、グリコシド結合を介して脂肪族炭素鎖の第１級又は末端炭素原子にそれぞれ結合している２つの炭水化物を含み、上記脂肪族炭素鎖が少なくとも１つの二重結合を含む、工程
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液から上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程、並びに
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊するオゾン分解反応若しくは酵素反応に供する、又は、工程ｂ）によって精製された上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊するオゾン分解反応若しくは酵素反応に供する工程
を含む、上記方法を提供する。
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満、好ましくは１％未満のα，ω－１ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程であって、上記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ及び機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログを有するように変異されている真菌株であり、又は上記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１、機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログ、及び、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有するように変異されている真菌株であり、
上記不飽和α，ω－ボラグリコシドが、グリコシド結合を介して脂肪族炭素鎖の第１級又は末端炭素原子にそれぞれ結合している２つの炭水化物を含み、上記脂肪族炭素鎖が少なくとも１つの二重結合を含む、工程
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液から上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程、並びに
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊するオゾン分解反応若しくは酵素反応に供する、又は、工程ｂ）によって精製された上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊するオゾン分解反応若しくは酵素反応に供する工程
を含む、上記方法を提供する。
【0016】
上記方法は、いくつかの明確な利点を付与する。１）工程ａ）において得られるα，ω不飽和ボラグリコシドの「ボラ」性質は、二重結合の開裂が、炭素の損失を回避するもの（図１２Ａを参照されたい）の代わりに２つのより短い鎖状のω－グリコシドを生じるため、高い収率（唯一の二重結合が不飽和α，ω－ボラグリコシドに存在する場合には１００％）を生じる。２）１つの二重結合が脂肪族リンカーの中ほどに存在すること（図７を参照されたい）を意味している、不飽和α，ω－ボラグリコシドが「対称」である実施形態は、２つの同一のω－グリコシドが二重結合の開裂後に得られるため、高い均一性を生じる（図７を参照されたい）。３）ボラグリコシドの高い親水性の性質、すなわち、これらの高い水溶性は、二重結合（複数可）を開裂する環境に優しい方法の開発を有意に容易にする、なぜなら、この方法が、有機溶媒の使用を回避しつつ、溶解性などを増加させる
いずれの適合又は制御も無しに水中で実施され得るからである。さらに、オゾン分解が二重結合を開裂する方法として使用される場合には、水中でのこの方法の実行は、環境に優しい性質だけでなく、プロセスの安全も劇的に増加させる。
いずれの適合又は制御も無しに水中で実施され得るからである。さらに、オゾン分解が二重結合を開裂する方法として使用される場合には、水中でのこの方法の実行は、環境に優しい性質だけでなく、プロセスの安全も劇的に増加させる。
【0017】
さらなる態様は、アルキルグリコシドを製造するための方法であって、上記の、好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換してアルキルグリコシドを含む培養液を生成することを含み、上記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特に、ＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ、及び機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼ、特に、ＦＡＯ１若しくはそのホモログを有するように変異されている真菌株であり、又は上記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特に、ＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ、機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼ、特に、ＦＡＯ１若しくはそのホモログ、及び、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼ、特に、ＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有するように変異されている真菌株であり、上記真菌株が、機能不全の、長鎖脂肪アルコール及び／又はアルカン／アルケンのω－酸化に関与している１つ以上の酸化酵素、好ましくは：配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１又はそのホモログ、配列番号：１０３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ２又はそのホモログ、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３又はそのホモログ、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４又はそのホモログ、配列番号：１０９に記載されているアミノ酸配列を含むＡ５又はそのホモログ、配列番号：１１１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ６又はそのホモログ、及び配列番号：１１３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ７又はそのホモログ；からなる群から選択される１つ以上の酸化酵素、を有するようにさらに変異されており、上記真菌株が、好ましくは天然ソホロ脂質生成真菌株、より好ましくは、スタルメレラ（カンジダ）ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）アピコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ａｐｉｃｏｌａ）、カンジダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、スタルメレラ（カンジダ）バチスタエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂａｔｉｓｔａｅ）、スタルメレラ（カンジダ）フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ（カンジダ）ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｓｔｅｌｌａｔａ）、スタルメレラ（カンジダ）クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ）
ｋｕｏｉ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及び（スタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）の）ソホロ脂質生成株（Ｓａｎｔｏｓ
ｅｔ ａｌ．，２０１８）からなる群から選択される酵母菌である、上記方法に関する。
ｋｕｏｉ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及び（スタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）の）ソホロ脂質生成株（Ｓａｎｔｏｓ
ｅｔ ａｌ．，２０１８）からなる群から選択される酵母菌である、上記方法に関する。
【0018】
酸化酵素Ａ１～Ａ７のうちの１つ以上における、特に、少なくともＡ３及びＡ４における、より特定的には、少なくともＡ３、Ａ４及びＡ１におけるさらなる変異は、アルキルソホロシドの生成の相対的増加（すなわち、ボラソホロシドの共生成が無い、少ない又は最小である）の利点を付与する。
【0019】
なおさらなる態様は、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成のための、配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ１若しくはそのホモログ、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ３若しくはそのホモログ、又は、
配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含む酵素若しくは酵素Ａ４若しくはそのホモログの使用に関する。
配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含む酵素若しくは酵素Ａ４若しくはそのホモログの使用に関する。
【0020】
本発明の上記及びさらなる態様及び好ましい実施形態を以下のセクション及び添付の特許請求の範囲に記載する。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書においてここに具体的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】ω－１糖脂質（Ａ及びＣ）（カルボン酸機能が存在することを示す灰色円）並びにω－１グリコシド（Ｂ及びＤ）の例。（Ａ）野生型ラクトンソホロ脂質（Ｂ）α，ω－１－ボラソホロシド（Ｃ）ボラソホロ脂質（Ｄ）ω－１ソホロシドアルデヒド。
【図2】Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド。
【図3-1】振とうフラスコにおける、親のΔｃｙｐ５２Ｍ１株（〇）と比較した、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株（●）の特性決定のための重要なパラメータ。平均値及びそれぞれの標準偏差をＡ）ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）、Ｂ）ｐＨ及びＣ）グルコース濃度（ｇ／Ｌ）で提示する。１．８（ｗ／ｖ）％のオレイルアルコールを疎水性基質として培養の４８時間後に添加した。
【図3-2】同上。
【図4】全てに１．８（ｗ／ｖ）％のオレイルアルコールを供給した（全て３ｘ希釈）、Ａ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株、Ｂ）Δｃｙｐ５２Ｍ１株、及びＣ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１ΔｕｇｔＢ１株についての振とうフラスコ実験の最終サンプルのＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラム。ＵＰＬＣ－ＭＳによって求めたそれぞれの質量をそれぞれのピークの上に示す。太字で、アルキルＳＳに対応する質量を示す。
【図5】オレイルアルコールを供給したときのΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株におけるアルキルソホロシド（ＳＳ）の提案された生成経路。（１）脂肪アルコールオキシダーゼｆａｏ１、（２）脂肪アルデヒドヒドロゲナーゼＦＡＤ、（３）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１、（４）グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＡ１、（５）グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１、（６）アセチルトランスフェラーゼＡＴ及び（７）ＳＬトランスポータＭＤＲ。ｆａｏ１及びｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子（クロスで示す）をノックアウトすることにより、脂肪アルコールは、対応する脂肪アルデヒドにも、対応するジオール（この場合、１，１８－オクタデセンジオール）にも変換されず、デノボ脂肪酸がヒドロキシル化されず（クロスで示す）次いでＳＬ生合成に入る。このようにして、蓄積するアルコールがグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＡ１及びＵＧＴＢ１によって直接グルコシル化され、それぞれ脂肪アルコール及びアルキルグルコシド骨格においてグルコース分子を逐次的に付加する。非アセチル化アルキルＳＳが得られ、これがアセチルトランスフェラーゼＡＴによってアセチル化されて、非、モノ－及びジ－アセチル化アルキルＳＳの混合物を生じることとなる。最終的に、これらのグリコシドは、推定上、野生型ＳＬの分泌に関与しているＭＤＲトランスポータによって細胞の外側にトランスポートされる傾向にある（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【図6】Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株を使用し且つこれにオレイルアルコールを供給する生成経路の概要。ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子をノックアウトすることにより、経路Ａにおいて示唆されるようにグリコシル化のみが実施され得、アルキルＳＳのアセチル化混合物（最大２のアセチル化）を生じることが予期された。アセチル化をＲ基として提示する。しかし、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）における予期されない酵素的活性に起因して、脂肪アルコールのヒドロキシル化が観察され、グリコシル化後にアセチル化ボラＳＳ（最大４のアセチル化）を生じた。最後に、主にボラＳＳ及び少しのアルキルＳＳの混合物が見られた。ヒドロキシル化は、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）によって報告されているΔａｔΔｓｂｌｅΔｆａｏ１株と対照的に、排他的に末端で（オメガ）起こった。
【図7】Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株によって生成される精製されたオレイルベース（Ｃ１８：１）ボラＳＳの構造的に確認された構成。末端（ω）ヒドロキシル化された化合物のみが生成されることが見出される。
【図8】異なる第１級アルコールを供給したときの（ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル又はオレイルアルコール）、培養時間の関数でのΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の、Ａ）ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）及びＢ）グルコース濃度。平均値及びそれぞれの標準偏差を提示する。それぞれ１．８（ｗ／ｖ）％のアルコールを培養の４８時間後に添加した。
【図9】培養の４８時間後、１．８（ｗ／ｖ）％の（Ａ）ラウリルアルコール、（Ｂ）ミリスチルアルコール、（Ｃ）パルミチルアルコール、（Ｄ）ステアリルアルコール又は（Ｅ）オレイルアルコールを供給した、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についての最終のＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラム。全ての最終培養液を３ｘ希釈する。アルキル（最大２の起こり得るアセチル化）及びボラＳＳ（最大４の起こり得るアセチル化）についての保持時間を示す。太字で、それぞれの供給アルコールがボラＳＳ（暗灰色）及びアルキルＳＳ（黒）、アルコールＧＬｕＳ及びアルキルＧＬｕＳ（淡灰色）に組み込まれたときのグリコシド化合物を示す。保持時間＜１分のピークは、糖、タンパク質及び塩としてサンプルに存在する強力に親水性の化合物の混合物に相当する。
【図10-1】１．８（ｗ／ｖ）％のそれぞれの第１級アルコールを培養の４８時間後に供給したときの、培養時間の関数でのΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株のボラＳＳ（Ａ）及びアルキルＳＳ生成（Ｂ）。生成をＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって求められるピーク面積（Ｖ．秒）の総計として表す。（Ｃ）培養の４８時間後に、１．８（ｗ／ｖ）％のラウリルアルコール（黒）、ミリスチルアルコール（暗灰色）、パルミチルアルコール（中程度の灰色）、ステアリルアルコール（淡灰色）又はオレイルアルコール（白）を供給した、異なるグリコシドタイプのＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって求めたＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の最終培養液の相対ピーク面積（％）。
【図10-2】同上。
【図11】トリプルノックアウト株Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１ΔｕｇｔＢ１は、（アセチル化）アルファ，オメガ－ボラグルコシド（ボラＧＬｕＳ又はボラＧＳ）を生成する。図は、（アセチル化）対称ボラグルコシドを合成する経路を示す。下の図は、実際の（アセチル化）対称ボラグルコシドＣ１８：１を示す。Ｒ＝ＣＯＣＨ３又はＨ。
【図12】Ａ）オゾン分解を使用した、対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドの１分子の二重結合の開裂、結果として生じる２つのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒド分子の発生の概略図。Ｂ）Ｃ９：０ω－ソホロシドの化学的誘導体化経路の例の概略図。オゾン分解プロセス条件に応じて、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルコール又はＣ９：０ωソホロ脂質が生じ、これらは、それぞれが、いくつかの非制限例が示されている適切な化学的－、酵素的－及び／又は化学酵素プロセスによってさらなる誘導体に変換され得る。
【図13】オゾン分解反応を実施後及び実施中のＮＭＲ分析であり、上が（１）Ｃ９：０ω－１－アルデヒドを生じるＣ１８：１ソホロ脂質ラクトン、下が（２）Ｃ９：０ω－１－ソホロシドアルデヒドを検出することなくＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを生じるＣ１８：１（非アセチル化）対称α，ω－ボラソホロシドについてのものである。上のＮＭＲスペクトルにおける２１．３ｐｐｍのピークは、サブ末端位置でのＣＨ３基に相当する（２１．３ｐｐｍ、ＣＨ３ＣＨ）。以下のスペクトルにおけるこの化学シフトにおいていずれのピークも存在しない。そのため、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドのみが、本発明に記載されているＣ１８：１α，ω－ボラソホロシドのオゾン分解後に形成される。Ｃ９：０ω－１－ソホロシドアルデヒド（上）（（Ｓ）－８－（［２”，３’，３”，４’，４”，６’，６”－ヘプタアセトキシ－２’－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル］－オキシ）－ノナナール） １３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δＣ２０．３（ＣＨ３Ｃ＝Ｏ），２０．４（２ｘＣＨ３Ｃ＝Ｏ），２０．５（ＣＨ３Ｃ＝Ｏ），２０．６（ＣＨ３Ｃ＝Ｏ），２０．６（ＣＨ３Ｃ＝Ｏ），２０．７（ＣＨ３Ｃ＝Ｏ），２１．３（ＣＨ３ＣＨ），２２．１（ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）Ｈ），２４．６（ＣＨ２（ＣＨ２）２），２９．３（ＣＨ２（ＣＨ２）２），２９．４（ＣＨ２（ＣＨ２）２），３６．４（ＣＨ２ＣＨＣＨ３），４３．７（ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）Ｈ），６１．９（ＣＨ２ＯＡｃ），６２．１（ＣＨ２ＯＡｃ），６８．２（ＣＨＯＣ），６８．７（ＣＨＯＣ），７１．２（ＣＨＯＣ），７１．５（ＣＨＯＣ），７１．６（ＣＨＯＣ），７２．９（ＣＨＯＣ），７４．６（ＣＨＯＣ），７７．３（ＣＨＯＣ），７７．９（ＣＨＯＣ），１００．３（ＣＨ（Ｏ）２），１０１．２（ＣＨ（Ｏ）２），１６９．３（ＣＨ３
Ｃ＝Ｏ），１６９．４（ＣＨ３
Ｃ＝Ｏ），１６９．６（ＣＨ３
Ｃ＝Ｏ），１６９．９（ＣＨ３
Ｃ＝Ｏ），１７０．１（ＣＨ３
Ｃ＝Ｏ），１７０．４（ＣＨ３
Ｃ＝Ｏ），１７０．５（ＣＨ３
Ｃ＝Ｏ），２０２．９（ＨＣ＝Ｏ）．Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド（下）（９－［（２’－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ノナナール）：１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δＣ２２．０（ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）Ｈ），２５．９（ＣＨ２（ＣＨ２）２），２９．０（ＣＨ２（ＣＨ２）２），２９．２（ＣＨ２（ＣＨ２）２），２９．３（ＣＨ２（ＣＨ２）２），２９．７（ＣＨＯＣＨ２
ＣＨ２），４３．５（ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）Ｈ），６１．３５（ＣＨ２ＯＨ），６１．３９（ＣＨ２ＯＨ），６９．１（ＣＨＯＣＨ２ＣＨ２），７０．２（ＣＨＯＣ），７０．３（ＣＨＯＣ），７５．３（Ｃ
２’’Ｈ），７６．５（Ｃ
３’Ｈ），７６．６（Ｃ
３’’Ｈ），７７．１（ＣＨＯＣ），７７．５（ＣＨＯＣ），８２．８（Ｃ
２’Ｈ），１０１．８（Ｃ
１’Ｈ），１０４．６（Ｃ
１’’Ｈ），２０３．９（ＨＣ＝Ｏ）．
【図14】オゾン分解反応時間の関数として、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド（△）及びＣ９：０ω－ソホロ脂質カルボン酸（◇）の相対含有率の展開と一緒にプロットしたアセチル化α，ω－ボラソホロシド（ｇＬ－１）（ドット）の濃度。
【図15】７つの対象遺伝子（ＧＯＩ）：ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５、ａ６又はａ７のうちの１を欠失させるためのノックアウトカセットを含むベクターの一般図。選択を、ｕｒａ３選択マーカーを使用して行う。
【図16-1】長鎖脂肪アルコール及び／又はアルカン／アルケンのω－酸化に関与している酸化酵素と同定された酵素（Ａ１～Ａ７）をコードする遺伝子（ａ１～ａ７）のヌクレオチド及びアミノ酸配列。ａ１（配列番号：１００）；Ａ１（配列番号：１０１）；ａ２（配列番号：１０２）；Ａ２（配列番号：１０３）；ａ３１（配列番号：１０４）；Ａ３（配列番号：１０５）；ａ４（配列番号：１０６）；Ａ４（配列番号：１０７）；ａ５（配列番号：１０８）；Ａ５（配列番号：１０９）；ａ６（配列番号：１１０）；Ａ６（配列番号：１１１）；ａ７（配列番号：１１２）；Ａ７（配列番号：１１３）。
【図16-2】同上。
【図16-3】同上。
【図16-4】同上。
【図16-5】同上。
【図17】Ａ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株、Ｂ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ３Δａ４株及びＣ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ１Δａ３Δａ４株についての振とうフラスコ実験の最終サンプルのＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラム。全ての株に１．８（ｗ／ｖ）％のオレイルアルコールを供給した。ＵＰＬＣ－ＭＳを用いて求めたそれぞれの質量をそれぞれのピークの上に示す。
【図18】オゾン分解を使用した、（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラグルコシドの１分子の二重結合の開裂、結果として生じる、（アセチル化）Ｃ９：０ω－グルコシドアルデヒド及び（アセチル化）Ｃ９：０ω－糖脂質酸分子の発生の概略図、並びに、実施例１（下のスペクトル）において生成される（アセチル化）グルコシド及びＤＭＳＯ中でのオゾン分解（上のスペクトル）後の最終サンプルの１Ｈ ＮＭＲスペクトルの比較。下のスペクトルにおいて存在するＣ１８分子からの５．３３ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）におけるアルケンプロトンの多重項ピークは、上のスペクトルにおいて、オゾン分解の際に消失した。９．６５ｐｐｍ（ＨＣ＝Ｏ）及び２．３９ｐｐｍ（ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）におけるＣ９：０ω－グルコシドアルデヒドのピーク並びに２．０４ｐｐｍ（ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）におけるＣ９：０ω－糖脂質酸のピークが最終サンプルのスペクトルにおいて現れた（上のパネル）。
【図19】リポキシゲナーゼ及びヒドロキシペルオキシドリアーゼの組み合わせを使用した、（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラグリコシド（ソホロシド（Ａ）及びグリコシド（Ｂ））の二重結合の開裂、結果として生じる（アセチル化）Ｃ９：０ω－グリコシドの発生の概略図。
【図20】モノオキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ及びアルコールヒドロゲナーゼ／モノオキシゲナーゼの組み合わせを使用した、（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラグリコシド（ソホロシド（Ａ）及びグリコシド（Ｂ））の二重結合の開裂、結果として生じる（アセチル化）Ｃ９：０ω－グリコシドの発生の概略図。
【発明を実施するための形態】
【0022】
別途定義されていない限り、技術的及び科学的用語を含めた、本発明を開示する際に使用されている全ての用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらなるガイダンスによって、本発明の教示をより認識するために用語の定義を含む。
【0023】
本明細書において使用されているとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明らかに示さない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
【0024】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、本明細書において使用されているとき、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的であり又はオープンエンドであり、さらなる列挙されていない部材、要素、又は方法工程を排除するものではない。ある特定の要素又は工程を含むとして実施形態を参照しているとき、これは、列挙されている要素又は工程から本質的になる実施形態も包含する。
【0025】
本発明は、実質的に均一なω－グリコシド（すなわち、炭水化物がω位以外の位置で官能化脂肪族炭素鎖に接続している汚染グリコシド、例えば、ω－１グリコシド、ω－２グリコシド及び／又はω－３グリコシドなどが無い又は最小である）の生成を開示する。「ω－グリコシド」又は「オメガ－グリコシド」は、本明細書に開示されているように（例えば、図２）、グリコシド結合が炭水化物を官能化脂肪族炭素鎖の第１級又は末端炭素原子に接続させるグリコシドである一方で、「ω－１グリコシド」又は「オメガ－１グリコシド」においては、このグリコシド結合が炭水化物を第２級又はサブ末端炭素原子に接続させる（例えば、図２におけるω－ソホロシドアルデヒド対図１Ｄにおけるω－１ソホロシドアルデヒドを参照されたい）。本明細書に開示されているω－グリコシドは、所謂不飽和α，ω－ボラグリコシドに由来しており、これらは、上記不飽和α，ω－ボラグリコシドの少なくとも１つの二重結合の開裂を好む反応条件を介して、１０％未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０％未満の汚染（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを有して生成される。より詳細には、後者の反応条件は、水中でのオゾン分解又は酵素の使用に関係し得る。より詳細には及び非限定例として、汚染のω－１、ω－２及び／又はω－３同種を含まない、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルコール及びＣ９：０ω－ソホロ脂質カルボン酸、並びにこれらの誘導体の選択的生成を好む条件が開示されている。
【0026】
故に、本発明は、第１態様において、特に、１０％未満、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満のω－１グリコシド、ω－２グリコシド及び／又はω－３グリコシドを含有するω－グリコシドを選択的に製造する方法であって：
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程；
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液からの上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程、並びに
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する、又は、工程ｂ）によって精製された上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する工程；
を含む上記方法に関する。
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程；
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液からの上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程、並びに
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する、又は、工程ｂ）によって精製された上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する工程；
を含む上記方法に関する。
【0027】
不飽和α，ω－ボラグリコシドに存在する結合した少なくとも１つの不飽和脂肪族の開裂は、有利には、アルキル部を損失せずに、プロセス条件に応じてアルデヒド（ω－グリコシドアルデヒド）、アルコール（ω－グリコシドアルコール）又はカルボン酸（ω－糖脂質）官能性を有する２つのより短い鎖状のω－グリコシド単位の生成を結果として生じさせ、これにより、改良された収率を生じる。
【0028】
１０％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液はまた、９０％超、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％超の不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液とも称され得る。
【0029】
用語「グリコシド」は、少なくとも１つの炭水化物分子がグリコシド結合を介して別の分子に共有結合している分子を概して称する。本明細書に開示されているグリコシドは、より詳細には、グリコシド結合を介して脂肪族炭素鎖の第１級又は末端炭素に共有結合しており、「オメガ－グリコシド」又は「ω’－グリコシド」と称され、これらの用語は、本明細書において互換可能に使用される。上記脂肪族炭素鎖は、好ましくは、上記脂肪族鎖のα位において、例えば、限定されないが、アルデヒド、カルボキシル若しくはアルコール官能性又はこれらの誘導体によって官能化されていてよい。カルボキシル基によってα位において官能化されている脂肪族炭素鎖に炭水化物分子がグリコシド結合を介して共有結合しているグリコシドもまた、本明細書において「糖脂質」と称される。そのため、本発明の枠組みにおいて、「糖脂質」は、１つ以上の炭水化物分子（複数可）が脂質分子に共有結合していて、これらの脂質の少なくとも１つが、カルボキシル官能性を含有する少なくとも６つの炭素原子の脂肪族炭素鎖（複数可）、例えば、脂肪酸などである化合物である。
【0030】
用語「ボラグリコシド」は、本明細書において使用されているとき、少なくとも２つの炭水化物を含有するグリコシド分子であって、炭水化物の両方が疎水性脂肪族リンカー、特に、かかる２つの炭水化物を接続させる脂肪族炭素原子鎖に結合している、上記グリコシド分子を称する。用語「α，ω－ボラグリコシド」は、２つの炭水化物分子がそれぞれ（官能化）脂肪族炭素鎖の「第１級」又は「末端」炭素原子に接続しているという事実を指す（例えば、図６及び１１を参照されたい）。上記炭水化物の一方が末端炭素原子以外の別の炭素原子において脂肪族鎖に接続している場合、本明細書において、「サブ末端」炭素原子への連結の場合には「α，ω－１－ボラグリコシド」又は「β，ω－ボラグリコシド」と言及する（例えば、図１Ｂを参照されたい）。同様に、用語「α，ω－２－ボラグリコシド」及び「γ，ω－ボラグリコシド」は、炭水化物の一方の、それぞれの側からカウントを開始して脂肪族鎖の３番目の炭素原子への連結を指し、用語「α，ω－３－ボラグリコシド」及び「δ，ω－ボラグリコシド」は、炭水化物の一方の、脂肪族鎖の４番
目の炭素原子への連結を指す。用語「不飽和」は、α，ω－ボラグリコシド及びα，ω－１－ボラグリコシドとの接続において使用されているとき、少なくとも１つの二重結合が両方の炭水化物分子を接続する脂肪族炭素鎖に存在するという事実を指す。「対称不飽和α，ωボラグリコシド」は、本明細書において使用されているとき、１つの二重結合が、２つの炭水化物を接続する脂肪族炭素原子鎖に存在する、及び上記二重結合が、上記疎水性リンカーの中ほどに位置しているという事実を指す。
目の炭素原子への連結を指す。用語「不飽和」は、α，ω－ボラグリコシド及びα，ω－１－ボラグリコシドとの接続において使用されているとき、少なくとも１つの二重結合が両方の炭水化物分子を接続する脂肪族炭素鎖に存在するという事実を指す。「対称不飽和α，ωボラグリコシド」は、本明細書において使用されているとき、１つの二重結合が、２つの炭水化物を接続する脂肪族炭素原子鎖に存在する、及び上記二重結合が、上記疎水性リンカーの中ほどに位置しているという事実を指す。
【0031】
そのため、本明細書に開示されているω－グリコシドは、脂肪族炭素鎖を含み、α炭素で官能化されていてよく且つω炭素において炭水化物を含有する。上記「炭水化物」は、当該分野において公知のいずれであってもよいが、好ましくはグルコース、ソロホース、マンノース、ラムノース、キシロース、アラビノース、トレハロース、セロビオース又はラクトースである。故に、本発明は、好ましくは、上記で記載されている方法であって、上記ω－グリコシドが、ω－グルコシド、ω－ソホロシド、ω－マンノシド、ω－ラムノシド、ω－キシロシド、ω－アラビノシド、ω－トレハロシド、ω－セロビオシド又はω－ラクトシドである、上記方法に関する。生成されるω－グリコシドのタイプは、例えば、微生物株（例えば、天然ソホロ脂質生成酵母菌株、例えば、スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ））の適当な選択を通して、及び／又は当該微生物株のさらなる遺伝子修飾を通して、当業者に知られているように適合され得る。例えば、グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１をスタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）セロビオシドにおけるトウモロコシ黒穂病菌のグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴ１遺伝子によって置き換える際に、ソホロシドの代わりに生成される（Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｅｎｇ．１１０：２４９４－２５０３）。
Ｂｉｏｅｎｇ．１１０：２４９４－２５０３）。
【0032】
本明細書に記載されている方法の好ましい実施形態において、ω－グリコシドは、特に、脂肪族鎖のα位において、アルデヒド基（ω－グリコシドアルデヒド）、アルコール基（ω－グリコシドアルコール）又はカルボン酸基（ω－糖脂質）によって官能化されている。上記ω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシドアルコール及びω－糖脂質は、本明細書において使用されているとき、用語「ω－グリコシド」に包含される。
【0033】
ω－グリコシドアルデヒドの生成が望ましいある特定の実施形態において、カタラーゼが、オゾン分解反応又は酵素反応に供される培養液（不飽和α，ω－ボラグリコシドを含有する）に添加されてよい。
【0034】
ω－糖脂質の生成が望ましいある特定の実施形態において、オゾン分解反応は、好ましくは少なくとも３時間だけ、又は、算出された反応時間の少なくとも１０００％だけ、好ましくは少なくとも１２００％だけ、より好ましくは少なくとも１４００％だけ延長されてよい。
【0035】
ω－糖脂質の生成が望ましい他の実施形態において、上記の方法は、酸化体（例えば、Ｏｘｏｎｅ（登録商標））を、オゾン分解反応若しくは酵素反応後の反応媒体に、又は上記反応媒体から回収したω－グリコシドアルデヒドに添加する工程をさらに含んでいてよい。
【0036】
ω－グリコシドアルコールの生成が望ましいある特定の実施形態において、上記の方法は、還元剤（例えば、ピコリン－ボラン）を、オゾン分解反応若しくは酵素反応後の反応媒体に、又は上記反応媒体から回収したω－グリコシドアルデヒドに添加する工程をさらに含んでいてよい。
【0037】
これらのω－グリコシド、特に、これらのω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシド
アルコール及びω－糖脂質は、次いで、当該分野で記載されている化学的誘導体化経路、例えば、限定されないが：例えば、（Ｄｅｌｂｅｋｅ，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ ｅｔ
ａｌ．，２０１８；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｌｏｚａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｍｏｖｓｉｓｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｅｌａｎｔｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ
ａｌ．，２０１３；Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）によって記載されている野生型ＳＬに関する分野において記載されている、例えば、限定されないが、ω－第４級アンモニウムＳＬ（ＱＡＳＬ）、ω－ＳＳアミンオキサイド、ω－ＳＳアミン、ω－ボラ両親媒性ＳＳなどへの、アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化、加硫、又はこれらのいずれかの組み合わせ；を通してさらに誘導体化され得る。用語「ω－グリコシド」は、本明細書において使用されているとき、上記ω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシドアルコール及びω－糖脂質の誘導体も包含する。
アルコール及びω－糖脂質は、次いで、当該分野で記載されている化学的誘導体化経路、例えば、限定されないが：例えば、（Ｄｅｌｂｅｋｅ，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ ｅｔ
ａｌ．，２０１８；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｌｏｚａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｍｏｖｓｉｓｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｅｌａｎｔｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ
ａｌ．，２０１３；Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）によって記載されている野生型ＳＬに関する分野において記載されている、例えば、限定されないが、ω－第４級アンモニウムＳＬ（ＱＡＳＬ）、ω－ＳＳアミンオキサイド、ω－ＳＳアミン、ω－ボラ両親媒性ＳＳなどへの、アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化、加硫、又はこれらのいずれかの組み合わせ；を通してさらに誘導体化され得る。用語「ω－グリコシド」は、本明細書において使用されているとき、上記ω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシドアルコール及びω－糖脂質の誘導体も包含する。
【0038】
本明細書に記載されている方法の実施形態において、上記の方法は、工程ｃ）において得られたω－グリコシド、特に、工程ｃ）において得られたω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシドアルコール及び／又はω－糖脂質を、本明細書においていずれかの箇所に記載されている化学的誘導体化経路、例えば、アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化及び／又は加硫などに供する工程をさらに含む。
【0039】
そのため、ω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシドアルコール及びω－糖脂質の誘導体を製造するための方法であって：
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程；
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液から上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程；
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する、又は、工程ｂ）によって精製された上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する工程；並びに
ｄ．工程ｃ）において得られたω－グリコシドを、化学的誘導体化経路、好ましくは：アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化及び／又は加硫；を含む群から選択される化学的誘導体化経路に供する工程；
を含む上記方法も本明細書に開示する。
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程；
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液から上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程；
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する、又は、工程ｂ）によって精製された上記不飽和α，ω－ボラグリコシドを上記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する工程；並びに
ｄ．工程ｃ）において得られたω－グリコシドを、化学的誘導体化経路、好ましくは：アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化及び／又は加硫；を含む群から選択される化学的誘導体化経路に供する工程；
を含む上記方法も本明細書に開示する。
【0040】
本明細書に記載されている方法は、１０％未満の汚染（不飽和）α，ω－１－ボラグリ
コシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含む不飽和α，ω－ボラグリコシドを生成する、「好適な微生物株」による好適な基質（複数可）の「転換」工程を含む。
コシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含む不飽和α，ω－ボラグリコシドを生成する、「好適な微生物株」による好適な基質（複数可）の「転換」工程を含む。
【0041】
好ましくは、この「転換」は、「全細胞の生体触媒転換」、すなわち、１つ以上の微生物によって実行される代謝生物学的プロセスであり、（生）化学的変化は、好適な微生物、例えば、細菌又は真菌に存在する一連の酵素の作用を通して好適な有機基質（複数可）に導入される。「好適な基質（複数可）」は、そのため、発現、及び、その後の、「好適な微生物株」によって一連の酵素をコードする一連の遺伝子の作用を通して、最終生成物（例えば、不飽和α，ω－ボラグリコシド）に変換される。
【0042】
好ましくは「好適な微生物株」は、天然ＳＬ生成酵母菌であり、ここで、少なくとも、（１）天然ＳＬ生合成の第１工程としての脂肪酸のヒドロキシル化（Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）において主にサブ末端（ω－１））に関与している遺伝子（複数可）が欠失しており（すなわち、野生型ＳＬ生合成がそれ以上起こらない）、合わせて、（２）脂肪アルデヒドへの脂肪アルコールの転換に関与している遺伝子（複数可）が欠失している。より詳細には及びそれぞれ、他のＳＬ生成酵母菌株におけるＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）又はこれらのホモログの場合でのＣＹＰ５２Ｍ１（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）及びＦＡＯ１（Ｆ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）遺伝子が、好適な微生物株において欠失している。実施形態において、好適な微生物株は、機能不全のアセチルトランスフェラーゼ及び／又は機能不全のラクトナーゼを有さない。
【0043】
不飽和α，ω－ボラグリコシドの生合成に関与している特定の生合成酵素は、ＵＤＰ－グルコース前駆体、（官能化）脂肪族炭素鎖前駆体、好ましくは（飽和）脂肪アルコール、及び、アセチル化の場合にはアセチル－ＣｏＡも利用する。
【0044】
ＳＬ生成では、ＳＬ生成酵母菌株が、典型的には、生成培地、例えば、好適な疎水性基質、例えば菜種油又はオレイン酸と組み合わせて、高いレベルの好適な親水性基質、例えば、グルコースを含有する、Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０００）（ａ．ｏ．）によって記載されているものにおいて培養される。親水性及び疎水性の両方の炭素源の組み合わせの供給は、最も高いＳＬ生産性を結果として生じるため、大抵は好ましい。親水性炭素源は－グルコースさえも－異化されて糖新生を経て、グルコースは、合成及び活性化されてＵＤＰ－グルコースとなる。疎水性炭素源は、β－及び／又はω－酸化を通して部分的に異化され得るが、ＳＬにも直接組み込まれ得る。
【0045】
ＳＬ生成微生物、例えば、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）もまた、親水性又は疎水性のいずれかの炭素源において供給されるとき、ＳＬを生成することができる（Ｃａｖａｌｅｒｏ ＆ Ｃｏｏｐｅｒ，２００３）。これは、内因性代謝経路が、後の解糖及び脂肪酸生合成経路の作用を通して、親水性炭素源、例えば、グルコースを脂肪酸に転換させるという事実に起因する。まず、アセチル－ＣｏＡを生じ、その後、後者を通して脂肪酸に変換される。（供給された親水性炭素源、例えば、グルコースに由来する）ＵＰＤ－グルコースと一緒に、これらの（デノボ）脂肪酸が、ＳＬ生合成経路のビルディングブロックである（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。反対のこと、例えば、その後のβ－酸化及び糖新生の生合成経路の作用を通してのグルコースへの疎水性炭素源、例えば、脂肪酸の転換もそうである。まず、脂肪酸をアセチル－ｃｏＡに変換し、これが、後者を通してグルコースにさらに変換され得る（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【0046】
したがって、実施形態において、好適な微生物株に、親水性炭素源（好ましくはグルコ
ース）及び／又は疎水性炭素源（好ましくは（不飽和）第１級脂肪アルコール、好ましくはオレイルアルコール）、好ましくは親水性炭素源及び疎水性炭素源が供給されて、工程ａ）における上記炭素源（複数可）を変換して、１０％未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液とする。
ース）及び／又は疎水性炭素源（好ましくは（不飽和）第１級脂肪アルコール、好ましくはオレイルアルコール）、好ましくは親水性炭素源及び疎水性炭素源が供給されて、工程ａ）における上記炭素源（複数可）を変換して、１０％未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液とする。
【0047】
実施形態において、本明細書に記載されている好適な微生物株は、さらなる遺伝子修飾を有することで、親水性炭素源、例えばグルコース（疎水性炭素源を供給しない）、又は、疎水性炭素源、例えば脂肪酸若しくは植物油（親水性炭素源を供給しない）のいずれかの、１０％未満のα，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－１－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３ボラグリコシドを有する不飽和α，ω－ボラグリコシドの生成のための使用を可能にする。
【0048】
特に、上記の好適な微生物株は、当該分野において記載されている方法によってさらに操作されて、適合した株が、上記の方法にしたがって、親水性炭素源が供給されていない疎水性基質として、脂肪酸、例えば、オレイン酸、又は植物油、例えば、高オレインヒマワリ油（ＨＯＳＯ）を使用することを可能にし得る。このことは、供給した植物油／脂肪酸をかかる好適な株において脂肪アルコールに効率的に変換する２つの酵素の（過剰）発現によって達成され得る。かかる酵素の例は、例えば、カルボン酸レダクターゼ酵素であり（Ｋａｌｉｍ Ａｋｈｔａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換し、これが、その後、例えば、アルデヒドレダクターゼ又はアルデヒドデカルボキシラーゼの同時発現によって脂肪アルコールに変換され得る（Ｆａｔｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋａｎｇ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，２０１７）。完全飽和脂肪酸もまた、供給されて、脂肪酸デサチュラーゼのさらなる発現を通して不飽和脂肪酸に変換され得る（Ｃｉｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。上記の好適な株におけるかかるさらなる操作は、得られる株に、親水性炭素源を同時に供給することなく脂肪酸及び／又は脂肪酸含有油／脂肪を専ら供給して、１０％未満の汚染α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを有する不飽和α，ω－ボラグリコシドの生成をさらに可能にする。脂肪酸は、すなわち、上記で記載されているように脂肪アルコールに変換されるが、β－酸化を通してアセチル－ＣｏＡにも変換され、次いで、糖新生を介してＵＤＰ－グルコースに同じく変換される。共に、これらは－上記で言及されているように－α，ω－ボラグリコシドへの生合成経路に入る所要の前駆体である。しかし、かかる新しい操作された株には－上記で定義されているように－好ましくは、親水性炭素源（好ましくはグルコース）と、より高い生産性を生じる疎水性炭素源（好ましくは（不飽和）第１級脂肪アルコール、好ましくはオレイルアルコール）との組み合わせが供給される。
【0049】
上記の好適な微生物株はまた、疎水性炭素源を供給することなく、親水性炭素源、例えば、グルコース、グリセロール、スクロース、フルクトース、マルトデキストリン、デンプン加水分解物、ラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、糖蜜など又はこれらの混合物を使用して、１０％未満の汚染（不飽和）α，ω－１ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含む不飽和α，ω－ボラグリコシドを生成するのに使用され得る。記載されている株は、その内因性経路を使用して、親水性炭素源、例えば、グルコースを、解糖（アセチル－ＣｏＡを生じる）、続いてのデノボ脂肪酸生合成を通して、脂肪酸に変換することができる。これらの脂肪酸は、その後、上記の遺伝子／酵素の発現によって脂肪アルコールにさらに変換され得る。供給された親水性炭素源に由来する、ＵＤＰ－グルコースと共に、これらの脂肪アルコールは、不飽和α，ω－ボラグリコシドへの生合成経路に入る。
【0050】
実施形態において、本明細書に記載されている好適な微生物株は、当該分野において記載されている方法によってさらに操作されて、アルカン及び／又はアルケンから選択される疎水性基質の供給を可能にして、１０％未満の（不飽和）α，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを含む不飽和α，ω－ボラグリコシドの合成を可能にし得る。特に、好適な微生物株は、アルカンをアルケンに変換する任意選択的には（内因性）デサチュラーゼ、及び、（内因性）酸化酵素、例えば、対応する不飽和脂肪アルコールへのアルケンの酸化を可能にするＣＹＰ５２Ｍ１酵素のさらなる（過剰）発現によってさらに操作されて、次いで、上記で記載されているように不飽和α，ω－ボラグリコシドにさらに変換され得る。
【0051】
実施形態において、「好適な基質（複数可）」は、親水性基質、例えば、グルコース及び／又は疎水性基質、好ましくは、親水性基質、例えば、グルコース及び疎水性基質の組み合わせ、より好ましくは、親水性基質、例えば、グルコース及び不飽和の疎水性基質、例えば、少なくとも６個の炭素の脂肪族のテール鎖長を有する脂肪アルコールの組み合わせを称する。
【0052】
親水性基質（複数可）の非限定例は、炭水化物、例えば、グルコース、グリセロール、スクロース、フルクトース、マルトデキストリン、デンプン加水分解物、ラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、糖蜜など又はこれらの混合物を含有する基質である。疎水性基質（複数可）の非限定例は、脂肪アルコール、脂肪酸、植物若しくは動物油／脂肪、飽和及び／若しくは不飽和炭化水素、例えば、直鎖状アルカン、アルケンなど並びに／又はこれらの混合物である。好ましくは脂肪アルコールが使用され、非限定例は、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、パルミトレイルアルコール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オクタデセノール、イソステアリルアルコール、ノナデカノール、イコサノール、ヘンエイコサノール、ドコサノール、ドコセノール及び／又はこれらの混合物である。さらなる実施形態において、（脂肪）アルコールは、最大１つのヒドロキシル基を有し（すなわち、モノアルコール）、好ましくは（脂肪）アルコールは、第１級脂肪アルコールである。さらなる実施形態において、（脂肪）アルコールは、ジオールではない。より好ましくは、第１級、不飽和の直鎖状脂肪アルコールが使用され、上記脂肪アルコール内の二重結合は、上記アルコール内のいずれかの隣の炭素原子対の間に位置し得るが、さらなる分子では、好ましくは、上記アルコールの「中ほど」に位置している。この最後の場合では、これの誘導された不飽和α，ω－ボラグリコシドが「対称」であり、すなわち、二重結合が疎水性脂肪族リンカーの中ほどに存在し、炭水化物によって両側に位置する。二重結合が、供給されたアルコールに存在しない場合、かかる不飽和は、微生物に存在する内因性「デサチュラーゼ」酵素（複数可）の作用を通して導入され得る。代替的には、異種「デサチュラーゼ」遺伝子／酵素は、好適な株において発現され得る。故に、さらなる実施形態において、好適な疎水性基質は、少なくとも６個の炭素の脂肪族鎖長を有する不飽和脂肪アルコール、好ましくは、Ｃ９位に（すなわち、Ｃ１８リンカーの中ほどに）存在する二重結合を有して１８個の炭素原子の鎖長を有する不飽和脂肪アルコールである。本発明の方法の実施形態において、上記不飽和α，ω－ボラグリコシドは完全に対称である。本発明の方法の実施形態において、脂肪アルコールは、望ましくない且つ汚染のα，ω－１－ボラグリコシド、α，ω－２－ボラグリコシド及び／又はα，ω－３－ボラグリコシドを形成することなく、上記脂肪アルコールを不飽和α，ω－ボラグリコシドに変換するために、好適な微生物によって代謝される。
【0053】
実施形態において、好適な微生物株に、ジオールが供給されていない。
【0054】
本明細書に記載されている方法の任意選択的な工程において、不飽和α，ω－ボラグリ
コシドは－当該分野において公知のいずれの方法によって－例えば、微生物細胞を除去する精密ろ過、続いての二段階の限外ろ過プロセスによって、大きい及び小さい両方のサイズの汚染物質を、これらの分子が作製されたバイオプロセス培養液から除去して、精製されたα，ω－ボラグリコシド液体ストリームを結果として生じ、任意選択的に凍結乾燥され得ることによって、精製され得る（Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）
コシドは－当該分野において公知のいずれの方法によって－例えば、微生物細胞を除去する精密ろ過、続いての二段階の限外ろ過プロセスによって、大きい及び小さい両方のサイズの汚染物質を、これらの分子が作製されたバイオプロセス培養液から除去して、精製されたα，ω－ボラグリコシド液体ストリームを結果として生じ、任意選択的に凍結乾燥され得ることによって、精製され得る（Ｒｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）
【0055】
本明細書に記載されている方法のさらなる工程において、バイオプロセス培養液に存在する、任意選択的に精製されている不飽和α，ω－ボラグリコシドは、不飽和α，ω－ボラグリコシドにおける少なくとも１つの二重結合の開裂を好む反応条件に供される。かかる反応条件の非限定例は、オゾン分解反応であり、上記不飽和α，ω－ボラグリコシドの二重結合（複数可）の酸化開裂を結果として生じて、ボラグリコシド分子当たり２つのより短い鎖状のω－グリコシド分子の形成を生じる。実施形態において、ボラグリコシド当たり２つの同一のオメガ－グリコシドが、上記不飽和α，ω－ボラグリコシドが対称である場合に生じ得る。本明細書においていずれかの箇所に記載されているように、上記のより短い鎖状のオメガ－グリコシドは、アルデヒド基、アルコール基又はカルボン酸基によって－α位において－さらに官能化され得る。α位にアルデヒド（ソホロシドアルデヒド）、アルコール（ソホロシドアルコール）又は酸性（ソホロ脂質）基を有するこれらのより短い鎖状のω－グリコシドは、不飽和α，ω－ボラグリコシドの二重結合を開裂する特定のプロセス条件を変動することによって選択的に作製され得る（Ｄｅｌｂｅｋｅ，２０１６；Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌｏｒｅｒ，２０１７）。
【0056】
不飽和α，ω－ボラグリコシド（対称であり得る）を生成する好適な微生物は、例えば、機能不全の、ＳＬ生合成経路における第１ヒドロキシル化工程に関与しているシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特に、ＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ、並びに、機能不全の、対応する脂肪アルデヒド（及び、アルデヒドヒドロゲナーゼの作用によってさらに脂肪酸となる）への脂肪アルコールの転換に関与している脂肪アルコールオキシダーゼ、特に、ＦＡＯ１若しくはそのホモログ、を有する変異されている真菌株、又は、機能不全の、ＳＬ生合成経路において第１ヒドロキシル化工程に関与しているシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特に、ＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ、機能不全の、対応する脂肪アルデヒド（及び、アルデヒドヒドロゲナーゼの作用によってさらに脂肪酸となる）への脂肪アルコールの転換に関与している脂肪アルコールオキシダーゼ、特に、ＦＡＯ１若しくはそのホモログ、並びに、機能不全の、ＳＬ生合成経路において第２グルコシル化工程に関与している、グルコシルトランスフェラーゼ、特に、ＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有する変異されている真菌株であり、上記真菌株は、好ましくは、スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））、最初はＴ．マグノリア（ｍａｇｎｏｌｉａ）と同定されたスタルメレラアピコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ａｐｉｃｏｌａ）（Ｇｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９６１）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））、Ｃ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）（Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７０）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、シュードハイホジーマ・ボゴリエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）（以前はロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））（Ｔｕｌｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６８）、スタルメレラ・バチスタエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂａｔｉｓｔａｅ）（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））、スタルメレラ・フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）（Ｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ・
ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｓｔｅｌｌａｔａ）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））及びカンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、スタルメレラ・クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｋｕｏｉ）（Ｋｕｒｔｚｍａｎ，２０１２）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、カンジダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードジマ・アンタークティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）並びにいずれか他の（スタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）の）ＳＬ生成株からなる群から選択される酵母菌である。
ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｓｔｅｌｌａｔａ）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））及びカンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、スタルメレラ・クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｋｕｏｉ）（Ｋｕｒｔｚｍａｎ，２０１２）（以前はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、カンジダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードジマ・アンタークティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）並びにいずれか他の（スタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）の）ＳＬ生成株からなる群から選択される酵母菌である。
【0057】
用語「変異されている真菌株」は、酵素ＣＹＰ５２Ｍ１又はそのホモログ及びＦＡＯ１又はそのホモログが非機能性又は機能不全であるように変異されている、上記で定義されている真菌株を指す。ＣＹＰ５２Ｍ１又はそのホモログ（複数可）に関しては、このことは、（生成したデノボ）脂肪酸のω－１（又はω－２）ヒドロキシル化が起こり得ないが、脂肪アルコールのかかるヒドロキシル化がこの酵素によってこれ以上起こり得ず、かかる株によって生成するＳＬが結果として存在しないことを意味する（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＦＡＯ１又はそのホモログ（複数可）に関しては、このことは、（α，ω－ボラグリコシドへの生合成経路の）脂肪アルコール前駆体に存在するＯＨ基が対応するアルデヒドに酸化し、かかるアルデヒドが、脂肪酸に次いでさらに酸化され、次いで、ヒドロキシル化されてＳＬに組み込まれることがこれ以上起こり得ないことを意味する。より詳細には、（デノボ）脂肪酸及び脂肪アルコール（脂肪酸に変換される）からのＳＬ生成への経路が遮断される。理論において及び当該分野における情報に基づくと、これにより、この株に脂肪アルコール（複数可）及び親水性炭素源、例えば、グルコースを供給する際にアルキルソホロシド（汚染ＳＬを含まない）の選択的生成を生じることになる。驚くべきことに、この株は、少量のアルキルソホロシドと一緒に脂肪アルコール（複数可）及びグルコースが供給されたときに、代わりに、不飽和α，ω－ボラソホロシドを生成する。有利には、これらの株は、不飽和α，ω－ボラソホロシドを選択的に生成し、すなわち、脂肪酸由来のソホロ脂質、例えば、ＣＹＰ５２Ｍ１又はそのホモログによって変異されていない対応する株によって産生される酸性のラクトン又はボラソホロ脂質を含まない又はこれを最小で含む。したがって、本明細書に記載されている方法のその後の工程において得られるω－グリコシドもまた、これらのソホロ脂質又はこれらのソホロ脂質の誘導体によって汚染されておらず、または汚染が最小である。
【0058】
用語「機能不全の」は、「正常に」機能していない、及び／又は、機能が存在しない若しくは損なわれている、遺伝子又はタンパク質を概して意味する。当該用語は、そのため：ａ）存在しないため機能性でない、ｂ）依然として存在しているが非機能性にされている、又はｃ）存在するが、機能が弱められている若しくは低減されている遺伝子又はタンパク質、例えば、対応する野生型遺伝子又はタンパク質の機能又は活性の９０％、８０、７０％、６０％又は５０％、４０％又は３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらにより好ましくは５％未満、例えば、４％、３％、２％又は１％未満である機能又は活性を保持している遺伝子又はタンパク質を指す。用語「機能不全の」は、完全に機能性の酵素ＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ（複数可）及びＦＡＯ１若しくはそのホモログ（複数可）についてコードするその能力を損失している遺伝子、又は、そのＣＹＰ５２Ｍ１及びＦＡＯ１活性を完全又は部分的のいずれかで損失しているポリペプチド／タンパク質を具体的には指す。「部分的に」は、後者の酵素の活性－当該分野において公知のいずれの方法によって測定される－が上記酵素の野生型カウンターパートの活性と比較したとき有意に低い（ｐ＜０．０５）、例えば、上記酵素の野生型カウンターパートの活性と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少
なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％低いことを意味する。
なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％低いことを意味する。
【0059】
「機能不全の」核酸分子は、上記で定義されているように、変異によって、又は上記核酸の転写若しくは翻訳をサイレンシングするいずれか公知の手段によって得られ得る。後者は、核酸フラグメント、マーカー遺伝子、若しくは、標的遺伝子におけるいずれか他の分子の挿入、標的遺伝子の変異若しくは除去、特異的なｓｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡ若しくはこれらの組み合わせの使用、又は当業者に公知のいずれか他の手段を含む。
【0060】
用語「変異」は、上記真菌株のゲノムにおける、自発的変異並びに／又は誘導及び／若しくは定方向変異を指す。上記変異は、点変異、欠失、フレームシフト、挿入又はいずれか他のタイプの変異であり得る。
【0061】
同様に、「機能不全の」ポリペプチドは、上記で定義されているように、本明細書に記載されている標的遺伝子の機能を弱める又は妨げるいずれかの（小）化合物又は手段によって得られ得る。転写若しくは翻訳をサイレンシングする手段、又は、本発明の標的遺伝子の機能を妨げる手段、又は、標的遺伝子の必要なレギュレータ／アクチベータタンパク質の機能を妨げる手段は、いずれかの分子、例えば－限定されないが－抗体、アミノ酸、ペプチド、小分子、アプタマー、リボザイム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を開始するのに使用されるｄｓＲＮＡのようなオリゴリボヌクレオチド配列、又はアンチセンス核酸の使用を含む。かかる分子は、そのため、標的タンパク質若しくはそのアクチベータ／レギュレータタンパク質において結合することが可能であり、又は－例えば－標的タンパク質若しくはそのアクチベータ／レギュレータについての結合及びｍＲＮＡのコーディング劣化によって、標的酵素若しくはそのアクチベータ／レギュレータの細胞合成に干渉することが可能である。
【0062】
「機能不全の」ＣＹＰ５２Ｍ１又はそのホモログ（複数可）及びＦＡＯ１又はそのホモログ（複数可）は、当業者に公知のいずれかの方法によって得られる、活性が低減した酵素を指す。上記方法の非限定例は、点変異の導入、切断又は変異酵素の使用、インヒビタ又は抗体の使用、及び上記の方法のいずれかである。
【0063】
用語「機能不全の」はまた、そのため、適用された真菌株のゲノムにおける上記の特定の遺伝子（ｃｙｐ５２Ｍ１及びｆａｏ１）の非存在を指す。
【0064】
遺伝子並びにこれらのコードされた酵素ＣＹＰ５２Ｍ１及びＦＡＯ１及びＵＧＴＢ１は、当該分野において周知であり、且つ－例えば－特許ＷＯ２０１１１５４５２３号（Ｓｏｅｔａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０）（ＣＹＰ５２Ｍ１、ＵＧＴＢ１）及びＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）（ＦＡＯ１）に記載されている。
【0065】
この後者の株は、当該分野において公知のいずれの方法によって作製されてもよく、上記に記載されている。
【0066】
さらなる実施形態において、上記で記載されているように変異されている真菌株は、機能不全の、ソホロ脂質／ソホロシド生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼ、特に、ＵＧＴＢ１又はそのホモログ、をさらに含む。
【0067】
用語「ＳＬ生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼ」は、ＷＯ２０１１１５４５２３（Ｓｏｅｔａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０
１０）に詳細に記載されている。実際、ＷＯ２０１１１５４５２３は、ＳＬ経路において第１グリコシル化（ＷＯ２０１１１５４５２３の実施例２を参照されたい）及び第２グリコシル化工程（ＷＯ２０１１１５４５２３の実施例３を参照されたい）が存在し、「第１」（すなわち、ＵＧＴＡ１又はそのホモログ）及び「第２」グリコシルトランスフェラーゼ（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＨＭ４４０９７４を有し、Ｓａｅｒｅｎｓ，ｅｔ
ａｌ．，（２０１１）においても詳細に記載されているＵＧＴＢ１又はそのホモログ）が関与していることを開示している。
１０）に詳細に記載されている。実際、ＷＯ２０１１１５４５２３は、ＳＬ経路において第１グリコシル化（ＷＯ２０１１１５４５２３の実施例２を参照されたい）及び第２グリコシル化工程（ＷＯ２０１１１５４５２３の実施例３を参照されたい）が存在し、「第１」（すなわち、ＵＧＴＡ１又はそのホモログ）及び「第２」グリコシルトランスフェラーゼ（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＨＭ４４０９７４を有し、Ｓａｅｒｅｎｓ，ｅｔ
ａｌ．，（２０１１）においても詳細に記載されているＵＧＴＢ１又はそのホモログ）が関与していることを開示している。
【0068】
不飽和α，ω－ボラグリコシドの生成に向けた所要の酵素工程を表す当該分野において記載されている方法によって修飾され（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，２０１６；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）且つα，ω－１又はα，ω－２又はα，ω－３（不飽和）ボラグリコシドのいずれか１つ以上の生合成を結果として生じる酵素活性を有さないいずれか他の微生物宿主株が本発明の方法において使用され得る。
【0069】
実施形態において、上記不飽和α，ω－ボラグリコシドは、（テトラ－、トリ－、ジ－、モノ－及び／又は非）アセチル化され得、二重結合の破壊後にジ－又はモノ－アセチル化された誘導されたω－グリコシドを結果として生じさせる。
【0070】
用語「アセチル化」により、具体的には、上記ボラグリコシドに存在する糖部位の６’又は６’’位に「アセチル」官能性を含有するグリコシドが意図される。用語「アセチル化」（又はエタノイル化）は、より一般には、アセトキシ基を結果として生じる化学的化合物にアセチル官能基を導入する反応、すなわち、活性水素原子をアセチル基で置換することを記載している。アセチル基（ＣＨ３ＣＯ）によるヒドロキシル基の水素原子の置き換えを含む反応は、特定のエステル、アセテートを生じさせる。
【0071】
特定の実施形態において、生成されるω－グリコシドは、Ｃ９：０ω－ソホロシド又はＣ９：０ω－グルコシドである。
【0072】
実施形態において、本発明は、オゾン分解の際のプロトン性求核試薬、好ましくは水が、オゾン分解による安全性の懸念を克服し、プロセスの環境に優しい性質を増加させるために、溶媒として使用される、上記で記載されている方法に関する。
【0073】
特定の実施形態において、Ｃ９：０ω－ソホロシドを製造するための方法であって：
ａ．グルコース及びオレイルアルコールの転換により、１０％未満のＣ１８：１α／ω－１ボラソホロシド及び／又はＣ１８：１α／ω－２ボラソホロシドを含有する対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドをＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株と共に含む培養液を生成する工程であって、遺伝子ｃｙｐ５２Ｍ１及びｆａｏ１遺伝子がノックアウトされている工程；
ｂ．任意選択的に、上記対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドを精製する工程；
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドを、オゾン分解反応、好ましくは水中でのオゾン分解反応に供する工程；並びに
ｄ．工程ｃ）において得られたＣ９：０ω－ソホロシドを、好適な化学的誘導体化経路、好ましくは：アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化及び／又は加硫；を含む群から選択される化学的誘導体化経路に任意選択的に供する工程；
を含む上記方法が提供される。
ａ．グルコース及びオレイルアルコールの転換により、１０％未満のＣ１８：１α／ω－１ボラソホロシド及び／又はＣ１８：１α／ω－２ボラソホロシドを含有する対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドをＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株と共に含む培養液を生成する工程であって、遺伝子ｃｙｐ５２Ｍ１及びｆａｏ１遺伝子がノックアウトされている工程；
ｂ．任意選択的に、上記対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドを精製する工程；
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドを、オゾン分解反応、好ましくは水中でのオゾン分解反応に供する工程；並びに
ｄ．工程ｃ）において得られたＣ９：０ω－ソホロシドを、好適な化学的誘導体化経路、好ましくは：アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化及び／又は加硫；を含む群から選択される化学的誘導体化経路に任意選択的に供する工程；
を含む上記方法が提供される。
【0074】
特定の実施形態において、Ｃ９：０ω－グルコシドを製造するための方法であって：
ａ．グルコース及びオレイルアルコールの転換により、１０％未満の対称Ｃ１８：１α，ω－１ボラグルコシド及び／又はＣ１８：１α，ω－２ボラグルコシドを含有する対称Ｃ１８：１α，ω－ボラグルコシドを、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株と共に含む培養液を生成する工程であって、遺伝子ｃｙｐ５２Ｍ１、ｆａｏ１遺伝子及びｕｇｔＢ１遺伝子がノックアウトされている工程
ｂ．任意選択的に、上記対称Ｃ１８：１α，ω－ボラグルコシドを精製する工程
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記対称α，ω－ボラグルコシドを、オゾン分解反応、好ましくは水中でのオゾン分解反応に供する工程
ｄ．工程ｃ）において得られたＣ９：０ω－グルコシドを、好適な化学的誘導体化経路、好ましくは：アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化及び／又は加硫；を含む群から選択される化学的誘導体化経路に任意選択的に供する工程
を含む上記方法が提供される。
ａ．グルコース及びオレイルアルコールの転換により、１０％未満の対称Ｃ１８：１α，ω－１ボラグルコシド及び／又はＣ１８：１α，ω－２ボラグルコシドを含有する対称Ｃ１８：１α，ω－ボラグルコシドを、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株と共に含む培養液を生成する工程であって、遺伝子ｃｙｐ５２Ｍ１、ｆａｏ１遺伝子及びｕｇｔＢ１遺伝子がノックアウトされている工程
ｂ．任意選択的に、上記対称Ｃ１８：１α，ω－ボラグルコシドを精製する工程
ｃ．工程ａ）による上記培養液内の上記対称α，ω－ボラグルコシドを、オゾン分解反応、好ましくは水中でのオゾン分解反応に供する工程
ｄ．工程ｃ）において得られたＣ９：０ω－グルコシドを、好適な化学的誘導体化経路、好ましくは：アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化及び／又は加硫；を含む群から選択される化学的誘導体化経路に任意選択的に供する工程
を含む上記方法が提供される。
【0075】
本発明はまた、α位において官能化されていないためα位において非官能化メチル機能によって特徴付けられるグリコシドを生成する方法も提供する。α位において官能化されていない上記グリコシドは、本明細書において「アルキルグリコシド」と称される。「アルキルグリコシド」は、本明細書に記載されているように、そのため、少なくとも１つの炭水化物分子がα位において官能化されていない脂肪族炭素鎖にグリコシド結合を介して共有結合している分子を指す。少なくとも１つの炭水化物分子が、脂肪族炭素鎖の第１級若しくは末端炭素（すなわち、ω－アルキルグリコシド）又は脂肪族炭素鎖の第２級若しくはサブ末端炭素原子（例えば、ω－１－アルキルグリコシド、ω－２－アルキルグリコシド）に結合している。好ましい実施形態において、アルキルグリコシドは、ω－アルキルグリコシドである。アルキルグリコシドは、ジ－、モノ－及び／又は非アセチル化されていてよい（すなわち、アルキルグリコシドは、上記アルキルグリコシドに存在する糖部位の６’又は６’’にアセチル官能性を含有し得る。アルキルグリコシドの非限定例は、アルキルソホロシド及びアルキルグルコシドである。
【0076】
増加した比でアルキルグリコシドを生成する改良された方法を本明細書において提供する。特に、アルキルグリコシドを生成する方法であって、好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換してアルキルグリコシドを含む培養液を生成する工程を含む、上記方法を提供する。「好適な基質（複数可）」は、本明細書においていずれかの箇所に記載されているω－グリコシドを選択的に生成する方法における使用に好適である基質であり、好ましい基質は第１級脂肪アルコールである。ω－１アルキルグリコシド及びω－２アルキルグリコシドの生成のために、上記の株にそれぞれ第２級又は第３級脂肪アルコールが供給され得る。「好適な株」は、本明細書においていずれかの箇所に記載されているω－グリコシドを選択的に生成する方法における使用に好適である株、より詳細には、上記で記載されているＳＬ生成株であり、これらは、ＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子若しくはそのホモログ（複数可）において変異されており且つＦＡＯ１遺伝子若しくはそのホモログ（アルキルソホロシドの生成のため）において変異されており；又は、ＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子若しくはそのホモログ（複数可）において変異されており且つＦＡＯ１遺伝子において変異されており且つＵＧＴＢ１遺伝子若しくはそのホモログ（複数可）（アルキルグルコシドの生成のため）において変異されている。好ましくは、「好適な株」は、長鎖脂肪アルコール及び／又はアルカン／アルケンのω－酸化に関与している「酸化性遺伝子／酵素」をコードする、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのかかる、より好ましくは少なく
とも３つの内因性遺伝子においてさらに変異されており、より特定的には、長鎖脂肪アルコール及び／又はアルカン／アルケンのω－酸化に関与している酸化酵素をコードする少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの内因性遺伝子が、上記酸化酵素が機能不全又は非機能性、好ましくは非機能性であるようにさらに変異されていて、アルキルグリコシド比の増加を結果として生じる。上記酸化酵素（複数可）は、α，ω－ボラグリコシドにさらに組み込まれ得る長鎖α，ω－脂肪ジオールの発生を生じる第１級脂肪アルコールの酸化に関与している。実施形態において、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの酸化酵素が：配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１又はそのホモログ、配列番号：１０３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ２又はそのホモログ、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３又はそのホモログ、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４又はそのホモログ、配列番号：１０９に記載されているアミノ酸配列を含むＡ５又はそのホモログ、配列番号：１１１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ６又はそのホモログ及び配列番号：１１３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ７又はそのホモログ；を含む群から選択される。
とも３つの内因性遺伝子においてさらに変異されており、より特定的には、長鎖脂肪アルコール及び／又はアルカン／アルケンのω－酸化に関与している酸化酵素をコードする少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの内因性遺伝子が、上記酸化酵素が機能不全又は非機能性、好ましくは非機能性であるようにさらに変異されていて、アルキルグリコシド比の増加を結果として生じる。上記酸化酵素（複数可）は、α，ω－ボラグリコシドにさらに組み込まれ得る長鎖α，ω－脂肪ジオールの発生を生じる第１級脂肪アルコールの酸化に関与している。実施形態において、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの酸化酵素が：配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１又はそのホモログ、配列番号：１０３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ２又はそのホモログ、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３又はそのホモログ、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４又はそのホモログ、配列番号：１０９に記載されているアミノ酸配列を含むＡ５又はそのホモログ、配列番号：１１１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ６又はそのホモログ及び配列番号：１１３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ７又はそのホモログ；を含む群から選択される。
【0077】
好ましい実施形態において、好適な株は、少なくとも、（配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３をコードする）配列番号：１０４に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ３又はそのホモログ及び（配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４をコードする）配列番号：１０６に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ４又はそのホモログにおいてさらに変異されている。好ましい実施形態において、好適な株は、少なくとも、（配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３をコードする）配列番号：１０４に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ３又はそのホモログ、（配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４をコードする）配列番号：１０６に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ４又はそのホモログ、及び（配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１をコードする）配列番号：１００に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ１又はそのホモログにおいてさらに変異されている。少なくとも遺伝子ａ３及びａ４におけるさらなる変異（少なくとも機能不全又は非機能性のＡ３及びＡ４を有するように）は、アルキルグリコシド生成を（選択的に）増加させ；少なくとも遺伝子ａ３、ａ４及びａ１におけるさらなる変異（少なくとも機能不全又は非機能性のＡ３、Ａ４及びＡ１を有するように）は、選択的アルキルグリコシド生成をさらに増加させる（すなわち、ボラ形態ソホロシドの共生成が少ない）。
【0078】
実施形態において、好適な株は、（配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１をコードする）配列番号：１００に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ１又はそのホモログ、（配列番号：１０３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ２をコードする）配列番号：１０２に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ２又はそのホモログ、（配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３をコードする）配列番号：１０４に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ３又はそのホモログ、（配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４をコードする）配列番号：１０６に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ４又はそのホモログ、（配列番号：１０９に記載されているアミノ酸配列を含むＡ５をコードする）配列番号：１０８に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ５又はそのホモログ、（配列番号：１１１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ６をコードする）配列番号：１１０に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ６又はそのホモログ、及び（配列番号：１１３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ７をコードする配列番号：１１２に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ７又はそのホモログにおいてさらに変異されている。
【0079】
さらなる態様は、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成のための、配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ１若しくはそのホモログ、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ３若しくはそのホモログ、又は、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含む酵素若しくは酵素Ａ４若しくはそのホモログの使用に関する。
【0080】
関連態様は、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成のための方法であって、脂肪アルコール、好ましくは第１級脂肪アルコールを、配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ１若しくはそのホモログ、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含む酵素Ａ３若しくはそのホモログ、又は、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含む酵素若しくは酵素Ａ４若しくはそのホモログと接触させて、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールを生成するようにすることを含む、上記方法を対象とする。
【0081】
本明細書に記載されているいくつかの方法は、本明細書に開示されている第１級脂肪アルコールの酸化に関与している（精製された）酸化酵素、特に、酵素Ａ１、Ａ３又はＡ４、及び脂肪アルコール基質、好ましくは第１級脂肪アルコール基質を使用した、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成に関する。例えば、宿主細胞は、本明細書に開示されている第１級脂肪アルコールの酸化に関与している酸化酵素、特に、酵素Ａ１、Ａ３又はＡ４を（過剰）発現するように遺伝子操作され得る。組換え宿主細胞は、酸化酵素の（過剰）発現を可能にするのに充分な条件下で培養され得る。細胞不含抽出物は、次いで、公知の方法を使用して生じ得る。例えば、宿主細胞は、洗剤を使用して又は超音波処理によって溶解され得る。過剰発現した酸化酵素は、公知の方法を使用して精製され得、又は細胞不含抽出物は、ジオールの生成のためにこうして使用され得る。宿主細胞はまた、本明細書に開示されている第１級脂肪アルコールの酸化に関与している酸化酵素、特に、酵素Ａ１、Ａ３又はＡ４を（過剰）発現する、並びに、上記酸化酵素を培養培地内で分泌するように遺伝子操作され得る。分泌シグナル配列は、酸化酵素をこの末端までコードする核酸に操作可能に連結され得る。これに関連して、「操作可能に連結される」は、分泌シグナルペプチドをコードする配列及び分泌されるポリペプチドをコードする配列がインフレーム又はインフェイスで接続されて、その結果、発現の際にシグナルペプチドがこのようにリンクされたポリペプチドの分泌を容易にするようになっていることを示す。分泌された酸化酵素は、次いで、培養培地から分離され、細胞不含抽出物を含有する必要性が無く、公知の方法を使用して任意選択的に精製され得る。
【0082】
次に、脂肪アルコール、好ましくは、第１級脂肪アルコールは、細胞不含抽出物又は（精製された）酸化酵素に添加されて、脂肪アルコール基質又は第１級脂肪アルコール基質の末端ヒドロキシル化を可能にする条件下で維持され得、これにより、それぞれジオール又はα，ω－ジオールを生成する。ジオール又はα，ω－ジオールは、公知の技術を使用して分離及び精製され得る。
【0083】
本明細書に記載されている他の方法は、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成に関し、当該方法は、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成を可能にするように、培養培地において遺伝子操作された宿主細胞を培養することを含み、上記宿主細胞は、本明細書に開示されている第１級脂肪アルコールの酸化に関与している酸化酵素をコードする遺伝子（すなわち、上記遺伝子操作された宿主細胞は、本明細書に開示されている第１級脂肪アルコールの酸化に関与している酸化酵素をコードする（組換え）核酸を含む）、特に、（配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１をコードする）配列番号：１００に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ１若しくはそのホモログ、（配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３をコードする）配列番号：１０４に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ３若しくはそのホモログ、
又は（配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４をコードする）配列番号：１０６に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ４若しくはそのホモログを（過剰）発現するように遺伝子操作される。
又は（配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４をコードする）配列番号：１０６に記載されているヌクレオチド配列を含む遺伝子ａ４若しくはそのホモログを（過剰）発現するように遺伝子操作される。
【0084】
本明細書に記載されているジオールの生成のための方法における使用に好適な宿主細胞の非限定例として、油性真菌、例えば、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えば、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、及びリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属からの酵母菌、並びに、本明細書においていずれかの箇所に記載されている天然ソホロ脂質生成真菌株、例えば、スタルメレラ（カンジダ）ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）アピコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ａｐｉｃｏｌａ）、カンジダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、スタルメレラ（カンジダ）バチスタエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ
（Ｃａｎｄｉｄａ） ｂａｔｉｓｔａｅ）、スタルメレラ（カンジダ）フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ（カンジダ）ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｓｔｅｌｌａｔａ）、スタルメレラ（カンジダ）クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｋｕｏｉ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及びスタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ
ｃｌａｄｅ）のソホロ脂質生成株が挙げられ、上記天然ソホロ脂質生成真菌株は、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路においてグリコシル化工程（複数可）に関与しているグルコシルトランスフェラーゼ（複数可）、例えば、機能不全のＵＧＴＡ１又はそのホモログ及び機能不全のＵＧＴＢ１又はそのホモログを有するように好ましくは変異されている。
（Ｃａｎｄｉｄａ） ｂａｔｉｓｔａｅ）、スタルメレラ（カンジダ）フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ（カンジダ）ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｓｔｅｌｌａｔａ）、スタルメレラ（カンジダ）クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｋｕｏｉ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及びスタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ
ｃｌａｄｅ）のソホロ脂質生成株が挙げられ、上記天然ソホロ脂質生成真菌株は、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路においてグリコシル化工程（複数可）に関与しているグルコシルトランスフェラーゼ（複数可）、例えば、機能不全のＵＧＴＡ１又はそのホモログ及び機能不全のＵＧＴＢ１又はそのホモログを有するように好ましくは変異されている。
【0085】
遺伝子操作された又は組換え宿主細胞は、宿主細胞によって、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成に好適な条件下で培養される。より特定的には、このことは、本明細書に開示されている酸化酵素をコードする遺伝子、特に、遺伝子ａ１、ａ３又はａ４の「（過剰）発現を可能にするのに充分な条件」を示唆しており、本明細書に記載されているように、宿主細胞が、本明細書に開示されている酸化酵素を（過剰）生成することを可能にするあらゆる条件を意味する。ジオール、好ましくはα，ω－ジオールの生成に好適な条件は、宿主細胞に含まれる組換え核酸によってコードされる酸化酵素によって末端がヒドロキシル化されている、少なくとも１つの脂肪アルコール基質、好ましくは少なくとも１つの第１級脂肪アルコール基質を含む培養培地において宿主細胞を培養することをさらに示唆し得る。
【0086】
さらなる実施形態において、ジオール、好ましくはα，ω－ジオールを生成するための方法であって、上記に記載されている工程に加えて、宿主細胞又は培養培地からジオール又はα，ω－ジオールを回収する工程を含む、上記方法を提供する。好適な精製は、当業者に公知の方法によって、例えば、溶解方法、抽出、イオン交換、電気透析、限外ろ過、ナノろ過などを使用することによって実施され得る。
【0087】
なおさらなる態様は、本明細書に開示されている方法によって得られ得るジオール、好
ましくはα，ω－ジオールに関する。
ましくはα，ω－ジオールに関する。
【0088】
本発明は、ここで、以下の非限定例によってさらに示される。
【実施例】
【0089】
実施例１：α，ω－１－ボラソホロシドを含まない（アセチル化）（対称）α，ω－ボラソホロシド及びα，ω－１－ボラグルコシドを含まない（アセチル化）（対称）α，ω－ボラグルコシドの生成
材料及び方法
株、培地及び培養条件
親株として、ＳＬ欠損Δｃｙｐ５２Ｍ１株Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を使用した（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ノックアウトしたＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）脂肪アルコールオキシダーゼｆａｏ１を、ｕｒａ３遺伝子を自身のプロモータ及びチロシンキナーゼ（ｔｋ）ターミネータの調節制御下にΔｃｙｐ５２Ｍ１株におけるｆａｏ１遺伝子座において一体化することによって、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）によって記載されているものと同様に得た。新しい株の３つの形質転換細胞コロニーをΔｃｙｐ５２Ｍ１親株と並行して成長及び糖脂質生成に関して評価した。培養、選択及び形質転換を、Ｌｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）に記載されているように実施した。
材料及び方法
株、培地及び培養条件
親株として、ＳＬ欠損Δｃｙｐ５２Ｍ１株Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を使用した（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ノックアウトしたＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）脂肪アルコールオキシダーゼｆａｏ１を、ｕｒａ３遺伝子を自身のプロモータ及びチロシンキナーゼ（ｔｋ）ターミネータの調節制御下にΔｃｙｐ５２Ｍ１株におけるｆａｏ１遺伝子座において一体化することによって、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）によって記載されているものと同様に得た。新しい株の３つの形質転換細胞コロニーをΔｃｙｐ５２Ｍ１親株と並行して成長及び糖脂質生成に関して評価した。培養、選択及び形質転換を、Ｌｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）に記載されているように実施した。
【0090】
Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を使用した生成実験を、Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０００）によって記載されている生成培地を使用して実施した。振とうフラスコ実験では、５ｍＬの試験管培養を２４時間（３０℃）に設定し、その後、振とうフラスコに移した（４％イノキュレーション）。生成実験を培養の４８時間後に添加した脂肪アルコール：オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール又はセチルアルコールを供給して実施した。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株もまた疎水性アルコールを添加せずにアセスメントした。生成実験毎に、グルコースが培地から枯渇したら培養を停止した。実験を二重に実施した。平均値を標準偏差と共に提示する。
【0091】
分子技術
一般的な技術
一般的な分子技術をＧｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，（２０１２）によって記載されているように用いた。線状欠失カセットを、ｐＧＥＭ－Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐＪＥＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ベクターをベースとして、大腸菌においてクローン化及び維持したベクター骨格から生じさせた。クローニング工程を以下に記載する。全てのプライマー配列を表１に表す。
一般的な技術
一般的な分子技術をＧｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，（２０１２）によって記載されているように用いた。線状欠失カセットを、ｐＧＥＭ－Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐＪＥＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ベクターをベースとして、大腸菌においてクローン化及び維持したベクター骨格から生じさせた。クローニング工程を以下に記載する。全てのプライマー配列を表１に表す。
【0092】
【表1】
【0093】
Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１ノックアウト株の作製
ｆａｏ１ノックアウトカセットの作製は、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）に記載されている。これを使用してＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）Δｕｒａ３：：０Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿Ｔｔｋ株、又はさらにはΔｕｒａ３Δｃｙｐ５２Ｍ１株と呼ばれる；を形質転換した。ｈｐｈ遺伝子をストレプ
トミセスヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｕｓ）から単離し、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ耐性についてコードした（Ｇｒｉｔｚ ＆ Ｄａｖｉｅｓ，１９８３）。形質転換後、ｕｒａ３陽性コロニーを選択的ＳＤ培地において選択した。カセットの正確な統合をコロニーＰＣＲによって確認した。新たに作り出されたΔｕｒａ３：：０Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿ｔＴＫ Δｆａｏ１：：Ｐｕｒａ３＿ｕｒａ３＿Ｔｔｋ株では、さらにはΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１と呼ばれるものにおいて、それぞれ、３つの成功したコロニーを選んだ。
ｆａｏ１ノックアウトカセットの作製は、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）に記載されている。これを使用してＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）Δｕｒａ３：：０Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿Ｔｔｋ株、又はさらにはΔｕｒａ３Δｃｙｐ５２Ｍ１株と呼ばれる；を形質転換した。ｈｐｈ遺伝子をストレプ
トミセスヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｕｓ）から単離し、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ耐性についてコードした（Ｇｒｉｔｚ ＆ Ｄａｖｉｅｓ，１９８３）。形質転換後、ｕｒａ３陽性コロニーを選択的ＳＤ培地において選択した。カセットの正確な統合をコロニーＰＣＲによって確認した。新たに作り出されたΔｕｒａ３：：０Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿ｔＴＫ Δｆａｏ１：：Ｐｕｒａ３＿ｕｒａ３＿Ｔｔｋ株では、さらにはΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１と呼ばれるものにおいて、それぞれ、３つの成功したコロニーを選んだ。
【0094】
下流の処理及び特性決定
オレイルを供給したときに生じたΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の生成物の精製を、アルカリ加水分解（ｐＨ１２、５Ｍ ＮａＯＨ、３７℃、１時間）を実施して糖脂質を完全に脱アセチル化することによって行い、分析用のより均一な生成物を得た。精製及び乾燥した生成物をＮＭＲ分析用分取液体クロマトグラフィ（ＰＬＣ）（以下参照）によってさらに精製した。
オレイルを供給したときに生じたΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の生成物の精製を、アルカリ加水分解（ｐＨ１２、５Ｍ ＮａＯＨ、３７℃、１時間）を実施して糖脂質を完全に脱アセチル化することによって行い、分析用のより均一な生成物を得た。精製及び乾燥した生成物をＮＭＲ分析用分取液体クロマトグラフィ（ＰＬＣ）（以下参照）によってさらに精製した。
【0095】
分取層クロマトグラフィ（ＰＬＣ）
環境に優しい蛍光指示薬（Ｆ２５４）（Ａｎａｌｔｅｃｈ）を含浸した２ｍｍシリカゲルでコーティングしたＵｎｉｐｌａｔｅ２０×２０ｃｍ ＰＬＣプレートを使用した。まず、１００ｍｇのサンプルをＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。その後、溶液を当該プレートの底部から２ｃｍにおいて長い画線として適用した。ＰＬＣプレートを、ＳＬ溶媒混合物クロロホルム／メタノール／水（６５／１５／２、ｖ／ｖ／ｖ）を含有する溶媒チャンバに置いた（Ａｓｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。溶媒展開及びそれぞれの蒸発後、プレートを２５４ｎｍのＵＶ光下に置いた。その後、対象となるハイライトしたゾーンを、外科用メスを使用して擦り落とし、擦り落とされたシリカゲルを収集した。化合物を、その後、２０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水をファルコンに添加することによって分割し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を収集し、プロセスを繰り返した。ボラＳＳ生成物を含有する全上清をろ過し（カットオフ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ）、残余シリカゲル粒子を除去した。最後に、アルファ１－４凍結乾燥製剤（Ｃｈｒｉｓｔ）を使用して水を除去して、ＮＭＲ分析に好適な乾燥した高度に純粋な生成物を得た。
環境に優しい蛍光指示薬（Ｆ２５４）（Ａｎａｌｔｅｃｈ）を含浸した２ｍｍシリカゲルでコーティングしたＵｎｉｐｌａｔｅ２０×２０ｃｍ ＰＬＣプレートを使用した。まず、１００ｍｇのサンプルをＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。その後、溶液を当該プレートの底部から２ｃｍにおいて長い画線として適用した。ＰＬＣプレートを、ＳＬ溶媒混合物クロロホルム／メタノール／水（６５／１５／２、ｖ／ｖ／ｖ）を含有する溶媒チャンバに置いた（Ａｓｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。溶媒展開及びそれぞれの蒸発後、プレートを２５４ｎｍのＵＶ光下に置いた。その後、対象となるハイライトしたゾーンを、外科用メスを使用して擦り落とし、擦り落とされたシリカゲルを収集した。化合物を、その後、２０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水をファルコンに添加することによって分割し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を収集し、プロセスを繰り返した。ボラＳＳ生成物を含有する全上清をろ過し（カットオフ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ）、残余シリカゲル粒子を除去した。最後に、アルファ１－４凍結乾燥製剤（Ｃｈｒｉｓｔ）を使用して水を除去して、ＮＭＲ分析に好適な乾燥した高度に純粋な生成物を得た。
【0096】
分析技術
成長の追跡
培養の光学密度（ＯＤ）を、生理溶液（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で希釈した１ｍＬサンプルについてＪａｓｃｏ Ｖ６３０ Ｂｉｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して６００ｎｍで測定した。培養実験における酵母菌細胞の生存率を、培養体積当たりのＣＦＵの平均の対数をｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）として表したコロニー形成単位（ＣＦＵ）を求めることによってアセスメントした（Ｓａｅｒｅｎｓ，Ｓａｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。代替的には、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を、風袋の重さを量ったエッペンドルフ管において１ｍＬの発酵サンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、細胞ペレットを１ｍＬの生理溶液で２回洗浄することによって求めた。残存する細胞ペレットを７０℃のオーブンに５日間置き、次いでその後、秤量した。エッペンドルフ管の空の重量を除算した後にＣＤＷ（ｇ／Ｌ）を算出した。
成長の追跡
培養の光学密度（ＯＤ）を、生理溶液（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で希釈した１ｍＬサンプルについてＪａｓｃｏ Ｖ６３０ Ｂｉｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して６００ｎｍで測定した。培養実験における酵母菌細胞の生存率を、培養体積当たりのＣＦＵの平均の対数をｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）として表したコロニー形成単位（ＣＦＵ）を求めることによってアセスメントした（Ｓａｅｒｅｎｓ，Ｓａｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。代替的には、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を、風袋の重さを量ったエッペンドルフ管において１ｍＬの発酵サンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、細胞ペレットを１ｍＬの生理溶液で２回洗浄することによって求めた。残存する細胞ペレットを７０℃のオーブンに５日間置き、次いでその後、秤量した。エッペンドルフ管の空の重量を除算した後にＣＤＷ（ｇ／Ｌ）を算出した。
【0097】
グルコース濃度の追跡
グルコース濃度を、２７００Ｓｅｌｅｃｔ生化学分析器（ＹＳＩ Ｉｎｃ．）を使用して、又は、蒸発光散乱検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）をカップリングした超高速液体クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）（ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ）を使用して求めた。ＵＰＬＣ分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を３５℃で使用し、０．５ｍＬ／分の定組成流量
の７５％アセトニトリル及び０．２％トリエチルアミン（ＴＥＡ）を適用した（５分／サンプル）。ＥＬＳ検出では、ネブライザを１５℃に冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保った。線形範囲が、ＥＬＳ検出で１００のゲインを使用して０～５ｇ／Ｌのグルコースにあることを見出した（Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア）。グルコース消費を表すために、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって得られたグルコース濃度を通して線形曲線をフィッティングし、それぞれの傾きを採取してグルコース消費速度（ｇ／Ｌ．ｈ）として示した。
グルコース濃度を、２７００Ｓｅｌｅｃｔ生化学分析器（ＹＳＩ Ｉｎｃ．）を使用して、又は、蒸発光散乱検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）をカップリングした超高速液体クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）（ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ）を使用して求めた。ＵＰＬＣ分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を３５℃で使用し、０．５ｍＬ／分の定組成流量
の７５％アセトニトリル及び０．２％トリエチルアミン（ＴＥＡ）を適用した（５分／サンプル）。ＥＬＳ検出では、ネブライザを１５℃に冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保った。線形範囲が、ＥＬＳ検出で１００のゲインを使用して０～５ｇ／Ｌのグルコースにあることを見出した（Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア）。グルコース消費を表すために、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって得られたグルコース濃度を通して線形曲線をフィッティングし、それぞれの傾きを採取してグルコース消費速度（ｇ／Ｌ．ｈ）として示した。
【0098】
糖脂質／グリコシドの分析
糖脂質分析用のサンプルを、１ｍＬの純粋なエタノール及び０．５ｍＬの発酵培養液の混合物を５分間激しく振とうすることによって調製した。その後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、細胞ペレットを除去し、上清をＰＴＦＥフィルタ（カットオフ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用してろ過し、５０％エタノール（別途記述されていない限り）において適切に希釈した後、（超）高速液体クロマトグラフィ－質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）及び（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）において分析した。
糖脂質分析用のサンプルを、１ｍＬの純粋なエタノール及び０．５ｍＬの発酵培養液の混合物を５分間激しく振とうすることによって調製した。その後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、細胞ペレットを除去し、上清をＰＴＦＥフィルタ（カットオフ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用してろ過し、５０％エタノール（別途記述されていない限り）において適切に希釈した後、（超）高速液体クロマトグラフィ－質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）及び（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）において分析した。
【0099】
ＨＰＬＣ－ＭＳを、ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣ）検出システムにカップリングしたＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用して実施した。異なる成分を、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ－１８ Ｅｎｄｃａｐｐｅｄ １００－４．６ｍｍカラム（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）において３０℃で極性によって分離した。ＬＣ－ＭＳ方法は、２つの溶媒：０．５％酢酸を含むＭｉｌｌｉＱ、及び純粋なアセトニトリル（ＡＣＮ）；に基づいた勾配溶離を使用する。分析の際、１ｍＬ／分の流量を適用した。勾配は５％アセトニトリルで開始し、４０分にわたって９５％まで線形増加させる。この後、９５％アセトニトリルをさらに１０分間保持し、その後、これを５分で５％アセトニトリルまで戻す。サンプル当たりの合計分析時間は６０分／サンプルである。ＭＳの走査範囲を２１５～１１００ｇ／ｍｏｌに設定した。ＨＰＬＣ－ＭＳについて言及したものと同様の条件を使用して、ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を、２０００ＥＳ ＥＬＳＤ（Ａｌｌｔｅｃｈ）をカップリングしたＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって４０℃で実施した。全ての他の条件は、ＨＰＬＣ－ＭＳについて言及したものと同様である。
【0100】
ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を、ＵＰＬＣ－ＭＳと同じカラム及び分析方法を用いて、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）及びＡｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。ＥＬＳＤ検出では、ネブライザを１２℃で冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保ち、ゲインを２００に設定した。糖脂質を定量化するために、精製された生成物を希釈系列で調製した。市販のＣ１８：１アセチル化ボラＳＳの精製されたバッチ（バッチ番号ＳＬ２４Ａ）及び精製されたアセチル化Ｃ１６：０アルキルＳＳバッチ（バッチ番号ａＡｌｋＣ１６＿２）をそれぞれボラＳＳ及びアルキルＳＳの定量化に用いた。
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。ＥＬＳＤ検出では、ネブライザを１２℃で冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保ち、ゲインを２００に設定した。糖脂質を定量化するために、精製された生成物を希釈系列で調製した。市販のＣ１８：１アセチル化ボラＳＳの精製されたバッチ（バッチ番号ＳＬ２４Ａ）及び精製されたアセチル化Ｃ１６：０アルキルＳＳバッチ（バッチ番号ａＡｌｋＣ１６＿２）をそれぞれボラＳＳ及びアルキルＳＳの定量化に用いた。
【0101】
代替的には、ＵＰＬＣ－ＭＳを、Ａｃｃｅｌａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。糖脂質分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）並びに０．６ｍＬ／分の流量でのｍｉｌｌｉＱ中０．５％酢酸（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）に基づく勾配溶離システムを適用した。方法は以下の通りであった：初期濃度の５％のＢ（９５％のＡ）は、最初の６．８分の間に９５％のＢ（５％のＡ）まで線形増加し、次いで、１．８分の間に５％のＢ（９５％のＡ）までさらに線形減少した。その後、ランの終わりまで５％のＢ（９５％のＡ）を維持する（１０分／サンプル）。陰イオンモードを使用し、２μＬのサンプルを注入した。ＭＳ検出を、加熱したエレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源によって行い、条件を、定性的
な方法で２１５～１３００ｍ／ｚの範囲の質量を検出するように設定した。
な方法で２１５～１３００ｍ／ｚの範囲の質量を検出するように設定した。
【0102】
全ての１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、１Ｈ／ＢＢ ｚ－勾配プローブ（ＢＢＯ、５ｍｍ）を装備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩにおいてそれぞれ４００及び１００．６ＭＨｚで記録した。ＤＭＳＯ－［Ｄ６］を溶媒として及び内部化学シフト標準として使用した（１Ｈでは２．５０ｐｐｍ及び１３Ｃでは３９．５２ｐｐｍ）。全てのスペクトルを、ＴＯＰＳＰＩＮ３．２ソフトウェアを使用して処理した。アタッチドプロトンテスト（ＡＰＴ）、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、及びＨＳＱＣのスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒパルスプログラムライブラリにおいて利用可能な標準配列を通して取得した。文献（Ｇｈｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）にしたがって、カスタム設定をＨＭＢＣ（３２スキャン）、ＴＯＣＳＹ（１００ミリ秒のＭＬＥＶスピンロック、０．１秒の混合時間、１．２７秒の緩和遅延、１６スキャン）、及びＨ２ＢＣ（２１．８ミリ秒の混合時間、１．５秒の緩和遅延、１６スキャン）に使用した。
【0103】
統計的分析
２つの異なる基を比較するときには、ウエルチの検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０４ソフトウェアを使用して、９５％の信頼水準で実施した。複数の群の比較では、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０４ソフトウェアを使用して９５％の信頼水準でボンフェローニの多重比較検定補正を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。パラメータｐＨ、ＣＦＵ、ＯＤ及びグルコース消費では、（培養の４８時間後）酵母菌細胞を静止期に取得したときの平均値を採取した。概して、グラフに表されているデータは、２回の実験の繰り返しの平均および標準偏差である（別途記述されていない限り）。
２つの異なる基を比較するときには、ウエルチの検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０４ソフトウェアを使用して、９５％の信頼水準で実施した。複数の群の比較では、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０４ソフトウェアを使用して９５％の信頼水準でボンフェローニの多重比較検定補正を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。パラメータｐＨ、ＣＦＵ、ＯＤ及びグルコース消費では、（培養の４８時間後）酵母菌細胞を静止期に取得したときの平均値を採取した。概して、グラフに表されているデータは、２回の実験の繰り返しの平均および標準偏差である（別途記述されていない限り）。
【0104】
結果
ノックアウト株の構成
脂肪アルコールオキシダーゼｆａｏ１ノックアウトカセット（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）において記載されている）を使用して、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｕｒａ３株を形質転換した。選択的ＳＤプレートにおけるｕｒａ３＋コロニーの選択後、ノックアウトカセットの両側における正確な統合を、２つのプライマー組み合わせを使用してコロニーＰＣＲを実施することによって制御した（表１を参照されたい）。新たに作り出されたΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の３つの正確なコロニーを選択し、さらに特性決定した。新規の株の３つの選択された形質転換細胞は、ＯＤ、ＣＦＵ、グルコース消費及び糖脂質生成の観点において互いに類似する挙動を示した。そのため、成長、ｐＨ、グルコース消費及び糖脂質生成の観点での親Δｃｙｐ５２Ｍ１株との比較について次のセクションにおいて１つのコロニーのみを検討する。
ノックアウト株の構成
脂肪アルコールオキシダーゼｆａｏ１ノックアウトカセット（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）において記載されている）を使用して、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｕｒａ３株を形質転換した。選択的ＳＤプレートにおけるｕｒａ３＋コロニーの選択後、ノックアウトカセットの両側における正確な統合を、２つのプライマー組み合わせを使用してコロニーＰＣＲを実施することによって制御した（表１を参照されたい）。新たに作り出されたΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の３つの正確なコロニーを選択し、さらに特性決定した。新規の株の３つの選択された形質転換細胞は、ＯＤ、ＣＦＵ、グルコース消費及び糖脂質生成の観点において互いに類似する挙動を示した。そのため、成長、ｐＨ、グルコース消費及び糖脂質生成の観点での親Δｃｙｐ５２Ｍ１株との比較について次のセクションにおいて１つのコロニーのみを検討する。
【0105】
ノックアウト株の最初の特性決定
野生型Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）では、菜種油（６０～８０％のオレイン酸）又は純粋なオレイン酸が、最も良好なＳＬ力価を結果として生じる（Ａｓｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｒａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）（すなわち、Ｃ１８炭素鎖長を有する疎水性基質）。そのため、新たに作り出されたｆａｏ１ノックアウト株を、まず、疎水性基質としてＣ１８脂肪アルコール、すなわち、オレイルアルコール（Ｃ１８：１）を供給した振とうフラスコにおいてアセスメントした。
野生型Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）では、菜種油（６０～８０％のオレイン酸）又は純粋なオレイン酸が、最も良好なＳＬ力価を結果として生じる（Ａｓｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｒａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）（すなわち、Ｃ１８炭素鎖長を有する疎水性基質）。そのため、新たに作り出されたｆａｏ１ノックアウト株を、まず、疎水性基質としてＣ１８脂肪アルコール、すなわち、オレイルアルコール（Ｃ１８：１）を供給した振とうフラスコにおいてアセスメントした。
【0106】
成長、ｐＨ及びグルコース消費
重要なパラメータ、例えば、ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）、ｐＨ及びグルコース消費を図３に示す。アセスメントした２回分の平均値及び標準偏差を提示する。ＯＤ６００の展開は、オレイルアルコール基質による測定の干渉に起因して、提示しなかった。培養時間の関
数でのｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）値の観点で（図３Ａ）、新しい株と参照株との間にＣＦＵ値の有意な差は観察されなかった。観察されたｐＨ降下は等しかった（図３Ｂ）。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１及び親株についてのグルコース消費速度は、図３Ｃに提示されているように、類似している（０．４７±０．０６及び０．４７±０．０１ｇ／Ｌ．ｈ）。
重要なパラメータ、例えば、ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）、ｐＨ及びグルコース消費を図３に示す。アセスメントした２回分の平均値及び標準偏差を提示する。ＯＤ６００の展開は、オレイルアルコール基質による測定の干渉に起因して、提示しなかった。培養時間の関
数でのｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）値の観点で（図３Ａ）、新しい株と参照株との間にＣＦＵ値の有意な差は観察されなかった。観察されたｐＨ降下は等しかった（図３Ｂ）。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１及び親株についてのグルコース消費速度は、図３Ｃに提示されているように、類似している（０．４７±０．０６及び０．４７±０．０１ｇ／Ｌ．ｈ）。
【0107】
糖脂質生成
図４に示されている、アセスメントした株の糖脂質生成を見ると、Δｃｙｐ５２Ｍ１親株と比較して、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株について明らかに異なる生成プロファイルを観察することができる。
図４に示されている、アセスメントした株の糖脂質生成を見ると、Δｃｙｐ５２Ｍ１親株と比較して、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株について明らかに異なる生成プロファイルを観察することができる。
【0108】
親Δｃｙｐ５２Ｍ１株（図４Ｂ）は、糖脂質／グリコシドを全く生成しなかった（又は非常に少量で生成した）（＜７分）。オレイン酸に相当する小さなピーク（２８２ｇ／ｍｏｌ）が、より後の保持時間（＞７分）において明らかである（Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株について観察されたものと類似）。アルキルＳＳがほとんど検出されないという事実は、供給されたオレイルアルコールが、主に、依然として機能性のω－酸化経路によって、対応するオレイン酸に酸化されるということを示している（ＦＡＯがノックアウトされていないため）。その後、オレイン酸のヒドロキシル化は、ｃｙｐ５２Ｍ１ノックアウトによって阻害されるため、グルコシルトランスフェラーゼは、脂肪酸をグリコシル化することができず、そのため、オレイン酸が蓄積する又はβ－酸化経路によって分解される。
【0109】
親株とは対照的に、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株（図４Ａ）ではグリコシド生成が明らかに観察される。３．０～４．５分の保持時間では相当量のグリコシドが見られ、５．５～６．５分では少量のグリコシドが見られた。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析後、驚くべきことに、初期の保持時間（３～４．５分）における質量が、実際には、目的としたアルキルＳＳ（５５０～７００ｇ／ｍｏｌの範囲）の代わりに、ボラＳＳ（９００～１１００ｇ／ｍｏｌの範囲）に対応したことが見出された。アルキルＳＳは実際に検出されたが、５．５～６．５分において上記の少量のみであった。このボラＳＳ合成は、この株においては理論的に（当該技術を基準にして）不可能である、なぜなら、供給された脂肪アルコールのヒドロキシル化を通しての（ボラＳＳ合成に必要な）ジオール形成（図５を参照されたい）が、ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子の欠失に起因して可能であるはずがないからである。実際、かかる作用は、親株において観察されておらず（図４Ｂを参照されたい）、当該技術において言及されているように、実際、オレイルアルコール（図４Ｂを参照されたい）又はオレイン酸及び／若しくは菜種油（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）へのいずれの酸化／ヒドロキシル化活性も示していない。
【0110】
そのため、驚くべきことに、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株は、オレイルアルコールが供給されたとき主にボラＳＳを生成し（図６）、初期の保持時間（３．０～４．５分）に対応する。ＡＴ遺伝子はこの株においてノックアウトされないため（ボラＳＳを生成するように設計されている株（Ｓｏｅｔａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）とは対照的）、ボラＳＳのアセチル化もまた、この上記の新しい株において観察される。４．４分におけるテトラ－アセチル化Ｃ１８：１ボラＳＳ（１１００ｇ／ｍｏｌ）は、生成されるボラＳＳの最も豊富な成分であり、続いて豊富であるのは、トリ－及びジ－アセチル化されたものである（それぞれ１０１６及び１０５８ｇ／ｍｏｌ）。非及びモノ－アセチル化Ｃ１８：１ボラＳＳも検出された（それぞれの９３２及び９７４ｇ／ｍｏｌ）。モノ－、ジ－及びトリ－アセチル化ボラＳＳが２つの異なるピーク４．０５及び４．１５分において現れるという事実は、文献（Ａ．Ｍ．Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓａｅｒｅｎｓ，２０１２；Ｓａｅｒｅｎｓ，Ｓａｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）において示されている酸性ＳＬについて示されているのと同様に、分子の異なるアセチル化パターンによって恐らくは説明される。Ｃ１
８：１ボラＳＳの他にも、供給されたオレイルアルコール基質（基質中にセチルアルコール又は１－ヘキサデカノールが２～１０％の汚染量で存在する）におけるＣ１６の量から生じた、Ｃ１６：０ベースのＳＳ（９０６ｇ／ｍｏｌ）も検出される。少量のアルキルＳＳも生成され、主に、Ｃ１８：１非、モノ－及びジ－アセチル化アルキルＳＳが検出された（それぞれ５９２／６３４／６７６ｇ／ｍｏｌ）が、微量のＣ１６：０アルキルＳＳも見られた（それぞれ５６６／６０８／６５０ｇ／ｍｏｌ）。
８：１ボラＳＳの他にも、供給されたオレイルアルコール基質（基質中にセチルアルコール又は１－ヘキサデカノールが２～１０％の汚染量で存在する）におけるＣ１６の量から生じた、Ｃ１６：０ベースのＳＳ（９０６ｇ／ｍｏｌ）も検出される。少量のアルキルＳＳも生成され、主に、Ｃ１８：１非、モノ－及びジ－アセチル化アルキルＳＳが検出された（それぞれ５９２／６３４／６７６ｇ／ｍｏｌ）が、微量のＣ１６：０アルキルＳＳも見られた（それぞれ５６６／６０８／６５０ｇ／ｍｏｌ）。
【0111】
そのため、供給されたアルコールは、対応するジオールに好ましくはヒドロキシル化されるため、単に蓄積してアルキルＳＳとなる代わりに、ＵＧＴＡ１及びＵＧＴＢ１のグリコシル化サイクルを２回経てボラＳＳを生じるようである（図６を参照されたい）。アルコールが供給された親株は、オレイルアルコールで供給したときにこれらの化合物を生成しなかったため、ｃｙｐ５２Ｍ１及びｆａｏ１ノックアウトの組み合わせは、重要且つ予想外の両方であるようである。
【0112】
生成された化合物の詳細な特性決定を可能にするために、ボラＳＳ及びアルキルＳＳを上記のように混合物から精製した。
【0113】
ＮＭＲ構造分析
ＮＭＲ分析を、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の培養液に由来する精製された非アセチル化Ｃ１８：１ボラＳＳ生成物において実施した。
ＮＭＲ分析を、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の培養液に由来する精製された非アセチル化Ｃ１８：１ボラＳＳ生成物において実施した。
【0114】
驚くべきことに、ＮＭＲ分析は、生成されたボラＳＳにおいて、両方のソロホース部位が、図７に提示されている、Ｃ１８：１疎水性リンカーに末端（ω）形式で専ら連結されていることを示した。完全対称グリコシド分子は、化学式Ｃ４２Ｈ７６Ｏ２２を有して、こうして得られる。用語「対称」は、二重結合が化合物の中ほどに存在することを示すのに使用される。
【0115】
異なる鎖長の脂肪アルコールの供給
予想外に、オレイルアルコールを供給したときにはΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についてアルキルＳＳの均一な生成の成功は得られなかった。代わりに、ボラＳＳ及びアルキルＳＳの混合物が見られたが、新規のグリコシドの大部分が（アセチル化）ボラＳＳであり、ほんの少量のアルキルＳＳを生成した。テトラ－アセチル化ボラＳＳの生成は予期されなかった、なぜなら、ＣＹＰ５２Ｍ１酵素が、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）における糖脂質生成の第１工程に関与する唯一の重要なヒドロキシ化／酸化酵素であるとされたからである。グリコシド生成への第１級アルコールの鎖長に対する影響をアセスメントするために、異なる基質をΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株に供給した。親株Δｃｙｐ５２Ｍ１を並行してアセスメントした。中及び長鎖アルコールを、アルカンについて報告されている（Ａ．－Ｍ．Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）のと同様に、１２～１８の鎖長間で選択した。上記の実験と同様に、疎水性基質を培養の４８時間後に添加した。
予想外に、オレイルアルコールを供給したときにはΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についてアルキルＳＳの均一な生成の成功は得られなかった。代わりに、ボラＳＳ及びアルキルＳＳの混合物が見られたが、新規のグリコシドの大部分が（アセチル化）ボラＳＳであり、ほんの少量のアルキルＳＳを生成した。テトラ－アセチル化ボラＳＳの生成は予期されなかった、なぜなら、ＣＹＰ５２Ｍ１酵素が、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）における糖脂質生成の第１工程に関与する唯一の重要なヒドロキシ化／酸化酵素であるとされたからである。グリコシド生成への第１級アルコールの鎖長に対する影響をアセスメントするために、異なる基質をΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株に供給した。親株Δｃｙｐ５２Ｍ１を並行してアセスメントした。中及び長鎖アルコールを、アルカンについて報告されている（Ａ．－Ｍ．Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）のと同様に、１２～１８の鎖長間で選択した。上記の実験と同様に、疎水性基質を培養の４８時間後に添加した。
【0116】
成長、ｐＨ及びグルコース消費
ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール又はオレイルアルコールの添加は、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株と比較して、Δｃｙｐ５２Ｍ１についてＣＦＵ値に充分に影響しなかった（図８）。しかし、全ての他の供給した基質とは対照的に、ラウリルアルコールを添加したとき、ＣＦＵの有意な降下が顕著であった（図８Ａ）。セチル又はステアリルアルコールと比較して、ミリスチル又はオレイルアルコールを供給したとき、有意により高いグルコース消費速度が見られた（０．４８ｇ／Ｌ．ｈ対０．３８ｇ／Ｌ．ｈ）。ラウリルアルコールの添加後（イノキュレーション後４８時間）、グルコース消費を停止した。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についてのみ、全てのグルコースが
枯渇するまで、基質添加後１００時間でグルコース消費を再び開始した（０．３３ｇ／Ｌ．ｈ）。これは、ＣＦＵの展開と一致している（図８Ａ）。
ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール又はオレイルアルコールの添加は、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株と比較して、Δｃｙｐ５２Ｍ１についてＣＦＵ値に充分に影響しなかった（図８）。しかし、全ての他の供給した基質とは対照的に、ラウリルアルコールを添加したとき、ＣＦＵの有意な降下が顕著であった（図８Ａ）。セチル又はステアリルアルコールと比較して、ミリスチル又はオレイルアルコールを供給したとき、有意により高いグルコース消費速度が見られた（０．４８ｇ／Ｌ．ｈ対０．３８ｇ／Ｌ．ｈ）。ラウリルアルコールの添加後（イノキュレーション後４８時間）、グルコース消費を停止した。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についてのみ、全てのグルコースが
枯渇するまで、基質添加後１００時間でグルコース消費を再び開始した（０．３３ｇ／Ｌ．ｈ）。これは、ＣＦＵの展開と一致している（図８Ａ）。
【0117】
疎水性基質を添加しなかったときのΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株も研究した。ＣＦＵ及びグルコース消費は、アルコール（ラウリルアルコールを除く）を供給した培養と大きく異ならなかった。
【0118】
グリコシド生成
第１級アルコールの添加前、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１及びΔｃｙｐ５２Ｍ１培養は、定量化可能な糖脂質生成を示さなかった。このことは、デノボ脂肪酸がｃｙｐ５２Ｍ１ノックアウトに起因して糖脂質生成経路内に組み入れられ得ないため、また、当該アルコールが新規のグリコシド生成を開始するために供給されなければならないため、予期されたことであった。後者は、上記で記載されているように酵母菌株がデノボ合成された脂肪酸を脂肪アルコールに変換することを可能にし得るさらなる操作を通して避けられ得る。例えばアルデヒドレダクターゼ又はアルデヒドデカルボキシラーゼの同時発現によってその後脂肪アルコールに変換され得る（Ｆａｔｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋａｎｇ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，２０１７）脂肪アルデヒドに脂肪酸を酵素変換する、例えば、カルボン酸レダクターゼの発現（Ｋａｌｉｍ Ａｋｈｔａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）は、このことを可能にし得る。
第１級アルコールの添加前、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１及びΔｃｙｐ５２Ｍ１培養は、定量化可能な糖脂質生成を示さなかった。このことは、デノボ脂肪酸がｃｙｐ５２Ｍ１ノックアウトに起因して糖脂質生成経路内に組み入れられ得ないため、また、当該アルコールが新規のグリコシド生成を開始するために供給されなければならないため、予期されたことであった。後者は、上記で記載されているように酵母菌株がデノボ合成された脂肪酸を脂肪アルコールに変換することを可能にし得るさらなる操作を通して避けられ得る。例えばアルデヒドレダクターゼ又はアルデヒドデカルボキシラーゼの同時発現によってその後脂肪アルコールに変換され得る（Ｆａｔｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋａｎｇ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，２０１７）脂肪アルデヒドに脂肪酸を酵素変換する、例えば、カルボン酸レダクターゼの発現（Ｋａｌｉｍ Ａｋｈｔａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）は、このことを可能にし得る。
【0119】
Δｃｙｐ５２Ｍ１株の疎水性基質の添加後、ＥＬＳＤにおける分析後にピークが見られず、このことは、上記の予測及び当該分野において記載されていること（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）と一致している。ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤにおいて分析した異なる供給された第１級アルコールについてのΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株のグリコシド末端生成プロファイルを図９に表し、実験全体を通してのこれらの外観を図１０Ａ及びＢに表し、これらのそれぞれの比を図１０Ｃに表す。供給した各アルコールについて、アセチル化ボラ及びアルキルＳＳの混合物を生成した。予期した通り、全ての生成したグリコシドが、供給されたアルコールから直接生じたものであった。後者は、ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子がノックアウトされたという事実に起因しているため、いずれのデノボ（主にＣ１６－Ｃ１８）又は発生した（アルコールの起こり得る酸化）脂肪酸の組み入れも排除した。
【0120】
ラウリルアルコールでは、非アセチル化からテトラまでのアセチル化のＣ１２：０ボラＳＳが検出された（５８０／９３４／９７６／１０１８ｇ／ｍｏｌ）。Ｃ１２：０ボラＳＳに加えて、後の保持時間で非アセチル化からジアセチル化のＣ１２：０アルキルＳＳ（５１０／５５２／５９４ｇ／ｍｏｌ）が検出された。しかし、クロマトグラムにおける最も豊富なピークは、Ｃ１２：０アルキルグルコシド（ＧＬｕＳ）（３４８ｇ／ｍｏｌ）に対応した。
【0121】
ミリスチル及びセチルアルコールでは、非常に類似する生成プロファイルが観察された。Ｃ１４：０又はＣ１６：０ボラＳＳ（３．００～４．００分及び３．００～４．３分）及びＣ１４：０又はＣ１６：０アルキルＳＳ（４．５～５．８分及び５．２～６．５分）に対応する明確な保持時間がそれぞれのアセチル化物と識別された。ＭＳを使用してＣ１４：０及びＣ１６：０非アセチル化アルキルＧＬｕＳ（３７６及び４０４ｇ／ｍｏｌ）が検出された。少量のジ－アセチル化Ｃ１４：０／又はＣ１６：０アルコールＳＳ（又はボラＧＬ）（６３８又は６６６ｇ／ｍｏｌ）が検出された。
【0122】
Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株にステアリルアルコールを供給すると、アセチル化Ｃ１８：０ボラＳＳ（９３４／９７６／１０１８／１０６０／１１０２ｇ／ｍｏｌ）及びＣ１８：０アルキルＳＳ（５９４／６３６／６７８ｇ／ｍｏｌ）の再びの混合生成が観察され
る。加えて、少量のＣ１８：０アルキルＧＬｕＳ（４３２ｇ／ｍｏｌ）が検出された。ミリスチル及びセチルアルコールと同様に、ジ－アセチル化Ｃ１８：０アルコールＳＳ（又はボラＧＳ）（６９４ｇ／ｍｏｌ）が検出された。
る。加えて、少量のＣ１８：０アルキルＧＬｕＳ（４３２ｇ／ｍｏｌ）が検出された。ミリスチル及びセチルアルコールと同様に、ジ－アセチル化Ｃ１８：０アルコールＳＳ（又はボラＧＳ）（６９４ｇ／ｍｏｌ）が検出された。
【0123】
オレイルアルコールの添加は、上記の糖脂質生成プロファイルを結果として生じた。非、モノ－及びジ－アセチル化Ｃ１６：０及びＣ１８：１アルキルＳＳ（それぞれ５６６／６０８／６５０ｇ／ｍｏｌ及び５９２／６３４／６７６ｇ／ｍｏｌ）並びに非アセチル化Ｃ１６：０及びＣ１８：１アルキルＧＬｕＳ（４０４及び４３０ｇ／ｍｏｌ）も検出された。他のアルコールと同様に、ジ－アセチル化Ｃ１８：１アルコールＳＳ（又はボラＧＬ）（６９２ｇ／ｍｏｌ）も検出された。
【0124】
対称ボラグルコシドの生成のためのトリプルノックアウト株（ΔＣＹＰ５２Ｍ１ΔＦＡＯ１ΔＵＧＴＢ１）の発生。
【0125】
トリプルノックアウト株（ΔＣＹＰ５２Ｍ１ΔＦＡＯ１ΔＵＧＴＢ１）の発生のために、ｕｒａ３マーカーを、まず、Ｌｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）によって記載されているようにダブルノックアウト株（ΔＣＹＰ５２Ｍ１ ΔＦＡＯ１）から除去した。ｕｒａ３マーカーによる線状ＵＧＴＢ１ノックアウトカセットを、ＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）並びにプライマー対ＧＴＩＩ－４７２Ｆ及びＧＴＩＩ＋２３９Ｒ（ＧＴＩＩ－４７２Ｆｏｒ：５’－ＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＴＴＣ－３’（配列番号１９）／ＧＴＩＩ＋２３９Ｒｅｖ：５’－ＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＡＧ－３’（配列番号２０））を使用してＳａｅｒｅｎｓ，Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）によって記載されているプラスミド「ｐＧＫＯ ｕｇｔＢ１」から生じさせた。この欠失カセットをｕｒａ３陰性ΔＣＹＰ５２Ｍ１ΔＦＡＯ１株に形質転換し、正確な形質転換細胞を選択した。
【0126】
得られる株は、図１１に模式的に示されているように、（アセチル化）対称α，ω－ボラグルコシドを生成した。
【0127】
３つのコロニーを選択し、成長及び糖脂質生成の観点で評価して、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１親株と比較した。生成実験を疎水性基質としてのオレイルアルコールの供給により実施した。培養条件及び分析技術は上記で言及されている通りであった。ＣＤＷ、ｐＨ及びグルコース消費についての値、並びにこれらの生成プロファイルは、３つの選択されたコロニーのものと非常に類似した。ｐＨ降下は、Δｃｙｐ５２Ｍ１ΔｆａｏΔｕｇｔｂ１株及びΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株に関するものとほぼ同一であった。
【0128】
Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１ΔｕｇｔＢ１株のアセスメントされたコロニーのうちの１つのＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラムを、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析を使用して検出したグリコシド質量と一緒に図４Ｃに示す。モノ－及びジ－アセチル化Ｃ１８：１ボラグルコシド（ＧＬｕＳ）は最も豊富な化合物であった（それぞれ、４．４５分において６５０ｇ／ｍｏｌ及び４．８５分において６９２ｇ／ｍｏｌ）。非アセチル化Ｃ１８：１ボラＧＬｕＳ（６０８ｇ／ｍｏｌ）は４．０５分で溶離した。他のグリコシド（ボラＧＬｕＳの中間体）も検出された：非アセチル化Ｃ１８：１アルコールＧＬｕＳ（４．７２分において４４６ｇ／ｍｏｌ）及び非アセチル化Ｃ１８：１アルキルＧＬｕＳ（６．３８分において４３０ｇ／ｍｏｌ）。
【0129】
アルコール－、及びオレイルアルコールに基づくボラグルコシドの生成経路を図１１に示す。アルキルグルコシドを、アルキルソホロシドについての図６に示されているものと同様に、ヒドロキシル基におけるオレイルアルコール基質の直接のグルコシル化によって生成した。他の鎖長を有する脂肪アルコールの供給は、ボラＳＳについて上記で記載され
ているものと同様に供給された基質（複数可）の鎖長に関連する他の鎖長を有するボラＧｌｕＳを生じた。
ているものと同様に供給された基質（複数可）の鎖長に関連する他の鎖長を有するボラＧｌｕＳを生じた。
【0130】
実施例２：ω（アセチル化）Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド及びＣ９：０ω－ソホロ脂質の生成
材料
化学物質及び前駆体
全ての化学試薬（ＤＭＳＯ－ｄ６、ＭｅＯＤ－ｄ４、ＣＤＣｌ３）をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製せずに使用した。酸素（９９．９％、Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）をオゾン発生の出発物質として使用した。アセチル化及び非アセチル化Ｃ１８：１対称α，ω－ボラソホロシド（Ｃ１８：１）（図１２）を、実施例１に記載されているように且つ（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に先に記載されているように生成した。
材料
化学物質及び前駆体
全ての化学試薬（ＤＭＳＯ－ｄ６、ＭｅＯＤ－ｄ４、ＣＤＣｌ３）をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製せずに使用した。酸素（９９．９％、Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）をオゾン発生の出発物質として使用した。アセチル化及び非アセチル化Ｃ１８：１対称α，ω－ボラソホロシド（Ｃ１８：１）（図１２）を、実施例１に記載されているように且つ（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に先に記載されているように生成した。
【0131】
合成手順
実験室スケールでのオゾン分解を介してのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの生成
反応を、フリットディスクを備える、３００ｍｌの容量を有する実験室型ガス洗浄ボトルにおいて実施した。ボトルをオゾン発生器（Ｏｚｏｎｉａ Ｔｒｉｏｇｅｎ Ｍｏｄｅｌ ＬＡＢ２Ｂ）に接続した。Ｏ３／Ｏ２混合物の流れをマスフローメータ（Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ Ｆｌｏｗ－Ｂｕｓ Ｅ－７０００）を使用して測定した。オフガスストリームにおけるオゾンの濃度をオゾン分析器（Ａｎｓｅｒｏｓ Ｏｚｏｍａｔ ＧＭ非分散型ＵＶ－分析器）によってモニタリングした。典型的な実験において、脱塩水（１００ｍＬ）に溶解した１０ｇのアセチル化（１０．７２ｍｍｏｌ）又は非アセチル化（９．０９ｍｍｏｌ）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドをガス洗浄ボトルに入れた。溶液を６００ｒｐｍの速度で磁気攪拌器によって混合した。供給ガスとしての乾燥酸素（９９．９％、Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）を、オゾン発生器を通過させることによって、オゾンを生成した。オゾンを、ガス洗浄ボトルの底部に位置するガラスフリットを介して微細に分散された気泡として反応媒体に導入した。合計反応時間を以下の式にしたがって算出／推定した。
実験室スケールでのオゾン分解を介してのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの生成
反応を、フリットディスクを備える、３００ｍｌの容量を有する実験室型ガス洗浄ボトルにおいて実施した。ボトルをオゾン発生器（Ｏｚｏｎｉａ Ｔｒｉｏｇｅｎ Ｍｏｄｅｌ ＬＡＢ２Ｂ）に接続した。Ｏ３／Ｏ２混合物の流れをマスフローメータ（Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ Ｆｌｏｗ－Ｂｕｓ Ｅ－７０００）を使用して測定した。オフガスストリームにおけるオゾンの濃度をオゾン分析器（Ａｎｓｅｒｏｓ Ｏｚｏｍａｔ ＧＭ非分散型ＵＶ－分析器）によってモニタリングした。典型的な実験において、脱塩水（１００ｍＬ）に溶解した１０ｇのアセチル化（１０．７２ｍｍｏｌ）又は非アセチル化（９．０９ｍｍｏｌ）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドをガス洗浄ボトルに入れた。溶液を６００ｒｐｍの速度で磁気攪拌器によって混合した。供給ガスとしての乾燥酸素（９９．９％、Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）を、オゾン発生器を通過させることによって、オゾンを生成した。オゾンを、ガス洗浄ボトルの底部に位置するガラスフリットを介して微細に分散された気泡として反応媒体に導入した。合計反応時間を以下の式にしたがって算出／推定した。
【0132】
【数1】
【0133】
式中：
ｔ＝反応時間（分）、
ｎ＝二重結合のモル（ｍｍｏｌ）、
ＭＷＯ３＝オゾンの分子量（ｍｇ／ｍｍｏｌ－１）、
ＣＯ３＝ガスストリーム中のオゾン濃度（ｍｇ／ｌ－１）
Ｑ＝ガスストリームの流量（Ｌ／分－１）
ｔ＝反応時間（分）、
ｎ＝二重結合のモル（ｍｍｏｌ）、
ＭＷＯ３＝オゾンの分子量（ｍｇ／ｍｍｏｌ－１）、
ＣＯ３＝ガスストリーム中のオゾン濃度（ｍｇ／ｌ－１）
Ｑ＝ガスストリームの流量（Ｌ／分－１）
【0134】
反応を、オゾン分析器によってオフガスオゾン濃度をモニタリングすることによって追跡した。反応が進行するにつれて、オフガスオゾン濃度が最終的には入口ガスと同じ濃度まで増加し、これは、基質が完全に変換されたことを示唆した。反応においてこの点に達した後、供給ガスを算出反応時間の１／５を超えて供給し続け、出発物質の完全な転換を確実にした。反応の終わりに、得られた反応混合物を０．０５ｍｂａｒで凍結乾燥して、オフホワイトの粉末を得た。
【0135】
小規模パイロットスケールにおけるオゾン分解を介してのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの生成
パイロットスケールにおけるオゾン分解反応を、７Ｌの反応器容量を有するステンレス鋼発酵槽において実施した。反応器は、温度センサ、ｐＨプローブ、オゾン／酸素ガス混合物を導入するためのエアスパージャー、及び１００～１０００ｒｐｍで作動することができる直径０．０８ｍのインペラを備えた。反応器を、オフガスを連続的に除去する２つの排気装置を設けたＬｅｘａｎキャビネットに入れた。Ｍｉｄａｓオゾン検出センサを設けて、あらゆる起こり得るガス漏れを検出した。オゾン分解反応を、Ａｎｓｅｒｏｓ ＣＯＭ－Ａｄ－０８オゾン発生器（流量範囲：０～３００Ｌｈ－１、及び、オゾン濃度：３００Ｌｈ－１において最大４０ｇｈ－１）を使用して実施した。酸素ガスを使用してオゾンを発生させた。マスフローメータを使用して酸素／オゾンガス流を制御した。（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシド生成物をＲＯ水に溶解し、反応器に移した。反応の進行をオフラインＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析によって追跡した。ボラソホロシド濃度がゼロまで減少したら、オゾン発生を停止させ、溶液をＯ２で数分間、次いでＮ２で３０分間フラッシングして、あらゆる残存オゾンを除去した。終わりに、反応溶液をガスボトル内に出口を通して収集し、４℃で保った。最終工程として、反応溶液を、Ｖｉｒｔｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓパイロット凍結乾燥器を使用することによって凍結乾燥した。
パイロットスケールにおけるオゾン分解反応を、７Ｌの反応器容量を有するステンレス鋼発酵槽において実施した。反応器は、温度センサ、ｐＨプローブ、オゾン／酸素ガス混合物を導入するためのエアスパージャー、及び１００～１０００ｒｐｍで作動することができる直径０．０８ｍのインペラを備えた。反応器を、オフガスを連続的に除去する２つの排気装置を設けたＬｅｘａｎキャビネットに入れた。Ｍｉｄａｓオゾン検出センサを設けて、あらゆる起こり得るガス漏れを検出した。オゾン分解反応を、Ａｎｓｅｒｏｓ ＣＯＭ－Ａｄ－０８オゾン発生器（流量範囲：０～３００Ｌｈ－１、及び、オゾン濃度：３００Ｌｈ－１において最大４０ｇｈ－１）を使用して実施した。酸素ガスを使用してオゾンを発生させた。マスフローメータを使用して酸素／オゾンガス流を制御した。（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシド生成物をＲＯ水に溶解し、反応器に移した。反応の進行をオフラインＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析によって追跡した。ボラソホロシド濃度がゼロまで減少したら、オゾン発生を停止させ、溶液をＯ２で数分間、次いでＮ２で３０分間フラッシングして、あらゆる残存オゾンを除去した。終わりに、反応溶液をガスボトル内に出口を通して収集し、４℃で保った。最終工程として、反応溶液を、Ｖｉｒｔｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓパイロット凍結乾燥器を使用することによって凍結乾燥した。
【0136】
分析手順
ＮＭＲ分光法
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）及び１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）スペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ Ｎａｎｏｂａｙ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計において２５℃で記録した。１Ｈ及び１３Ｃ化学シフトをｐｐｍで報告し、残りの溶媒ピークを参照する。化合物を重水素化溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６又はＭｅＯＤ－ｄ４）に溶解した。異なるピークの割り当てを、２Ｄ－ＨＳＱＣ及び２Ｄ－ＣＯＳＹスペクトルを使用して実施した。
ＮＭＲ分光法
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）及び１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）スペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ Ｎａｎｏｂａｙ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計において２５℃で記録した。１Ｈ及び１３Ｃ化学シフトをｐｐｍで報告し、残りの溶媒ピークを参照する。化合物を重水素化溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６又はＭｅＯＤ－ｄ４）に溶解した。異なるピークの割り当てを、２Ｄ－ＨＳＱＣ及び２Ｄ－ＣＯＳＹスペクトルを使用して実施した。
【0137】
ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ及びＵＰＬＣ－ＭＳ分析用のサンプル処理
グリコシド分析用のサンプルを、１ｍＬの純粋なエタノール及び０．５ｍＬの発酵培養液の混合物を５分間激しく振とうすることによって調製した。その後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、細胞ペレットを除去し、上清をＰＴＦＥフィルタ（カットオフ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用してろ過し、５０％エタノール（別途記述されていない限り）において適切に希釈した後、（超）高速液体クロマトグラフィ－質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）及び（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）において分析した。
グリコシド分析用のサンプルを、１ｍＬの純粋なエタノール及び０．５ｍＬの発酵培養液の混合物を５分間激しく振とうすることによって調製した。その後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、細胞ペレットを除去し、上清をＰＴＦＥフィルタ（カットオフ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用してろ過し、５０％エタノール（別途記述されていない限り）において適切に希釈した後、（超）高速液体クロマトグラフィ－質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）及び（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）において分析した。
【0138】
ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラフィ
ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を、ＵＰＬＣ－ＭＳと同じカラム及び分析方法を用いて、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）及びＡｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。ＥＬＳＤ検出では、ネブライザを１２℃で冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保ち、ゲインを２００に設定した。糖脂質を定量化するために、精製された生成物の希釈系列で調製した。精製されたアセチル化対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドバッチ（バッチ番号ＳＬ２４Ａ）をボラＳＳの定量化に用いた。
ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を、ＵＰＬＣ－ＭＳと同じカラム及び分析方法を用いて、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）及びＡｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。ＥＬＳＤ検出では、ネブライザを１２℃で冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保ち、ゲインを２００に設定した。糖脂質を定量化するために、精製された生成物の希釈系列で調製した。精製されたアセチル化対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドバッチ（バッチ番号ＳＬ２４Ａ）をボラＳＳの定量化に用いた。
【0139】
ＬＣ－ＭＳクロマトグラフィ
２．７μｍの融合コア粒子（細孔径９０Å）を含むＳｕｐｅｌｃｏ Ａｓｃｅｎｔｉｓ
Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム（Ｌ３ｃｍ×ＩＤ４．６ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ装置をＬＣ－ＭＳ分析に使用した。この装置はＵＶ検出器（２２０．８ｎｍ、２５４．８
ｎｍ及び２８０．８ｎｍで動作する）を備えており、エレクトロスプレーイオン化幾何学（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）（ＥＳＩ７０ｅＶ）を有し且つ質量選択検出器（シングル四重極）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズのＬＣ／ＭＳＤ型質量分析計に接続した。
２．７μｍの融合コア粒子（細孔径９０Å）を含むＳｕｐｅｌｃｏ Ａｓｃｅｎｔｉｓ
Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム（Ｌ３ｃｍ×ＩＤ４．６ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ装置をＬＣ－ＭＳ分析に使用した。この装置はＵＶ検出器（２２０．８ｎｍ、２５４．８
ｎｍ及び２８０．８ｎｍで動作する）を備えており、エレクトロスプレーイオン化幾何学（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）（ＥＳＩ７０ｅＶ）を有し且つ質量選択検出器（シングル四重極）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズのＬＣ／ＭＳＤ型質量分析計に接続した。
【0140】
代替的には、ＵＰＬＣ－ＭＳを、Ａｃｃｅｌａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。糖脂質分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）並びに０．６ｍＬ／分の流量でのｍｉｌｌｉＱ中０．５％酢酸（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）に基づく勾配溶離システムを適用した。方法は以下の通りであった：初期濃度の５％のＢ（９５％のＡ）は、最初の６．８分の間に９５％のＢ（５％のＡ）まで線形増加し、次いで、１．８分の間に５％のＢ（９５％のＡ）までさらに線形減少した。その後、ランの終わりまで５％のＢ（９５％のＡ）を維持する（１０分／サンプル）。陰イオンモードを使用し、２μＬのサンプルを注入した。ＭＳ検出を、加熱したエレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源によって行い、条件を、定性的な方法で２１５～１３００ｍ／ｚの範囲の質量を検出するように設定した。
【0141】
結果
Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドの生成。
Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドの生成。
【0142】
アセチル化及び非アセチル化対称α，ω－ボラソホロシドＣ１８：１を、上記で記載されているＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）ΔＣＹＰ５２Ｍ１ΔＦＡＯ１株を使用して、且つ、以前に報告されている発酵及び精製方法（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）にしたがって、調製した。生成したアセチル化及び非アセチル化対称α，ω－ボラソホロシドを、その後、出発物質／原材料／原料として使用して、オゾン分解を介した二重結合の開裂によってＣ９：０ω－ソホロシド（ＳＳ）を生成した（図１２）。オゾン分解反応を水中で実施して、この方法の環境に優しい特質を保持した。さらに、水の存在下でのオゾン分解は、より安全な反応環境、及び、不安定なオゾニド構造の生成を制限することによるアルデヒドの直接合成のための手段を付与する。ボラソホロシドは、ラクトンソホロ脂質とは対照的に、かなり水溶性であり、この方法を簡潔にする。
【0143】
対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドのオゾン分解。
【0144】
オゾン分解実験を実験室及びパイロットスケールで実施した。実験室スケールにおいて適用した実験パラメータの概要を表２に付与する。両方の基質について、実験を三重に実施した。
【0145】
【表2】
【0146】
反応混合物はバイオ界面活性剤であるソホロシドからなるため、発泡を、オゾン分解実験の際に反応器の外への基質の同伴を引き起こし得る操作的な課題と同定した。そのため、発泡を制限した予備試験に基づいて、両方の基質について１００ｇ／Ｌ－１の最適な基質濃度を選択した。実験の間、非ＡｃボラＳＳのフォーム安定性は、ＡｃボラＳＳと比較して高かった（すなわち、より持続性）。
【0147】
非アセチル化α，ω－ボラソホロシド（非ＡｃボラＳＳ）の溶液は、１０ｇ／Ｌ－１の低濃度でさえもゲル化し、連動するのにむしろ難しい基質とした。そのため、全ての実験を通して、反応混合物の適当な混合を確実にした。オゾンの供給が開始されたら、ゲル化は、非ＡｃボラＳＳからＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドへの転換に起因して徐々に消失した。両方の基質についての反応時間の僅かな差は、両方の一連の実験を同一のＯ３流量で実施したため、これらの分子量の差に関連した（反応時間の算出については実験のセクションを参照されたい）。
【0148】
オゾン分解を、オゾニド分解の発熱の性質に起因して低温条件で典型的には実施するが、実験の際、温度の有意な増加は観察されなかった。この観察は、酸化カルボニル中間体が水によって効果的に捕捉されて、オゾニドの形成を制限し得ることを示唆している。
【0149】
結果のＮＭＲスペクトルを図１３に示し、（Ｄｅｌｂｅｋｅ，Ｒｏｅｌａｎｔｓ，ｅｔ
ａｌ．，２０１６）によって記載されているように野生型ＳＬにおいてオゾン分解を実施することについて得られたＮＭＲスペクトルと比較する。上方のＮＭＲスペクトルにおける２１．３ｐｐｍでの二重項ピークは、サブ末端位置におけるＣＨ３基（２１．３ｐｐｍ、ＣＨ ３ ＣＨ）に相当する。下方のスペクトルにおいては、この化学シフトでのいずれのピークも存在しない。そのため、本発明に記載されているα，ω－ボラソホロシドのオゾン分解後に、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドのみが形成されている。
ａｌ．，２０１６）によって記載されているように野生型ＳＬにおいてオゾン分解を実施することについて得られたＮＭＲスペクトルと比較する。上方のＮＭＲスペクトルにおける２１．３ｐｐｍでの二重項ピークは、サブ末端位置におけるＣＨ３基（２１．３ｐｐｍ、ＣＨ ３ ＣＨ）に相当する。下方のスペクトルにおいては、この化学シフトでのいずれのピークも存在しない。そのため、本発明に記載されているα，ω－ボラソホロシドのオゾン分解後に、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドのみが形成されている。
【0150】
実験室スケールで実施した実験の結果を表３に提示する。オゾン分解実験の再現性は良好であった。両方の基質についての主な同定された生成物は、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドであった。少量で存在する別の生成物は、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質カルボン酸（Ｃ９：０ω－ソホロ脂質）と同定された。Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド及びＣ９：０ω－ソホロ脂質の相対含有率は、両方の基質について同様であった。ソロホース単位におけるアセチル基の存在又は非存在は、オゾン分解の結果に顕著な影響を及ぼさなかったようである。還元性又は酸化性ワークアップを実施してアルデヒド及び酸生成物を得る必要性を排除することは、用いられる反応系の利点とみなされ得る。（共）溶媒としてのＨ２Ｏの使用は、同様の結果を与えることが報告されており、水による酸化カルボニル中間体の捕捉に起因した（Ｓｃｈｉａｆｆｏ ＆ Ｄｕｓｓａｕｌｔ，２００８）。
【0151】
【表3】
【0152】
実験室スケールで実施した最初の一連の実験にしたがって、ＡｃボラＳＳ及び非Ａｃボ
ラＳＳを使用するオゾン分解実験を専用のオゾン分解セットアップにおいてパイロットスケールで行った。パイロットスケールの実験の際に用いた実験条件の概要を表４に提示する。温度増加は実験室スケールの実験の際に観察されなかったが、より多量のオゾン及び基質を使用したため、パイロットスケールにおける必要な予防措置を依然として取った。例えば、基質の濃度は、あらゆる起こり得るオゾニド分解の影響を含むことができるように５０ｇＬ－１に制限した。
ラＳＳを使用するオゾン分解実験を専用のオゾン分解セットアップにおいてパイロットスケールで行った。パイロットスケールの実験の際に用いた実験条件の概要を表４に提示する。温度増加は実験室スケールの実験の際に観察されなかったが、より多量のオゾン及び基質を使用したため、パイロットスケールにおける必要な予防措置を依然として取った。例えば、基質の濃度は、あらゆる起こり得るオゾニド分解の影響を含むことができるように５０ｇＬ－１に制限した。
【0153】
【表4】
【0154】
アセチル化ボラＳＳの濃度プロファイルを、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド及びＣ９：０ω－ソホロ脂質化合物の相対含有率の展開と共に図１４に示す。（オフラインＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析によってモニタリングした）アセチル化ボラＳＳの量は、反応が進行するにつれて減少し、２４０分後にはほぼ終了した。しかし、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド及びＣ９：０ω－ソホロ脂質の相対含有率の展開は、過酸化が、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質対Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの相対比が３００分後に７５：２５となる程度まで起こったことを示した。
【0155】
次に、非ＡｃボラＳＳのオゾン分解もまた、パイロットスケールで実施した。溶液（２５ｇＬ－１）の濃度は、高濃度での非ＡｃボラＳＳのゲル化傾向に起因してＡｃボラＳＳのもの（５０ｇＬ－１）より低かった。反応混合物へのＯ２／Ｏ３の導入の際、かなりの発泡が起こった。そのため、より低いＯ２／Ｏ３流量（すなわち、より低いオゾン濃度）を非ＡｃボラＳＳのオゾン分解実験の間に適用した。Ｎ２による反応器のヘッドスペース圧（５ｂａｒ）の増加は、発泡の低減を助けた。しかし、反応は、ｐＨ（１２．０～６．５）が降下してＣ９：０ω－ソホロ脂質の形成を有意に示唆したため、１５３分後に停止した。より低いオゾン濃度の適用及びより高い初期ｐＨにもかかわらず、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質が依然として形成された。反応の終わりに、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質に対するＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの相対含有率は、１Ｈ ＮＭＲ分析によって求めると、６５～３５であった。Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドをオフホワイトの粉末として得た一方で、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド／Ｃ９：０ω－ソホロ脂質混合物を凍結乾燥後にオフホワイトのゲルとして得た。
【0156】
オゾン分解を通して二重結合を破壊することによってボラ分子当たり２つのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒド単位を発生させるための（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ωボラソホロシドの使用は、野生型ＳＬ並びにω－及びω－１化合物の混合物について記載されている炭素の損失を回避する興味深い経路である。さらに、これらの革新的化合物の高い水溶性は、野生型ＳＬについて当該分野において記載されているように（Ｄ．Ｄｅｖｅｌｔｅｒ ＆ Ｆｌｅｕｒａｃｋｅｒｓ，２００８）、ｐＨなどを適応させる必要無く溶媒としての水の使用を可能にする。さらに、反応溶媒としての水の使用は、当該分野にお
けるものと比較して第２の利点を有し、すなわち、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド又はＣ９：０ω－ソホロ脂質を誘導体化するのにさらなるワークアップを必要とせず、これは、重大な利点である。結果として、（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドのオゾン分解は、汚染Ｃ９：０ω－１ソホロシドを含まないＣ９：０ω－ソホロシドを生成する魅力的な選択肢である。
けるものと比較して第２の利点を有し、すなわち、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド又はＣ９：０ω－ソホロ脂質を誘導体化するのにさらなるワークアップを必要とせず、これは、重大な利点である。結果として、（アセチル化）対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドのオゾン分解は、汚染Ｃ９：０ω－１ソホロシドを含まないＣ９：０ω－ソホロシドを生成する魅力的な選択肢である。
【0157】
実施例３：アルキルソホロシドの選択的生成。
材料及び方法
株、培地及び培養条件
大腸菌Ｔｏｐ１０株を使用してプラスミドを保存及び複製した。大腸菌株を、溶原性培養液（ＬＢ）培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母菌抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ（Ｂｒｅｎｎｔａｃｈ）、１５ｇ／Ｌ寒天）において、３７℃、２００ｒｐｍで成長させた。プラスミド形質転換大腸菌株を、５０ｍｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢ培地において選択した。
材料及び方法
株、培地及び培養条件
大腸菌Ｔｏｐ１０株を使用してプラスミドを保存及び複製した。大腸菌株を、溶原性培養液（ＬＢ）培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母菌抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ（Ｂｒｅｎｎｔａｃｈ）、１５ｇ／Ｌ寒天）において、３７℃、２００ｒｐｍで成長させた。プラスミド形質転換大腸菌株を、５０ｍｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢ培地において選択した。
【0158】
スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ２２２１４を野生型（ＷＴ）株として使用し、実施例１にて記載されている、それに由来するΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株を親株として使用した。Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）の成長のために、酵母菌抽出物Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＹＰＤ）培地を使用した（２０ｇ／Ｌグルコース．Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ酵母菌抽出物、２０ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏペプトン、２０ｇ／Ｌ寒天）。３Ｃ－寒天固体培地（１１０ｇ／Ｌグルコース．Ｈ２Ｏ、酵母菌抽出物１０ｇ／Ｌ、尿素１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）を使用してコロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントした。使用する選択的培地は左右され：ｕｒａ３マーカーを損失したコロニーを選択するために、５－フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を含有する培地であるが、ウラシルを含まない選択的最小培地を使用してｕｒａ３陽性コロニー用に選択した（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７））。
Ｂａｃｔｏペプトン、２０ｇ／Ｌ寒天）。３Ｃ－寒天固体培地（１１０ｇ／Ｌグルコース．Ｈ２Ｏ、酵母菌抽出物１０ｇ／Ｌ、尿素１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）を使用してコロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントした。使用する選択的培地は左右され：ｕｒａ３マーカーを損失したコロニーを選択するために、５－フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を含有する培地であるが、ウラシルを含まない選択的最小培地を使用してｕｒａ３陽性コロニー用に選択した（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７））。
【0159】
Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を使用した生成実験を、Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０００）によって記載されている生成培地を使用して実施した。振とうフラスコ実験では、５ｍＬ管での培養を２４時間（３０℃）に設定し、その後、振とうフラスコに移した（４％イノキュレーション）。生成実験を疎水性基質：培養の４８時間後に添加したオレイン酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール又はセチルアルコール；を供給して実行した。グルコースが培地から枯渇したら培養を停止した。
【0160】
分子技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）によって記載されている一般的な分子技術を適用した。Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出をＲｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されているように実施した。環状ポリメラーゼ抽出クローニング（ＣＰＥＣ）を、線状ＤＮＡフラグメント（挿入片及び骨格）からの環状プラスミドを作り出すために使用した。ノックアウト株を作製するために、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を、Ｌｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）によって記載されているように線状化したＤＮＡによるエレクトロポレーションによって形質転換し、選択的培地上にプレーティングし、コロニーが現れるまで３０℃でインキュベートした。新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）ノックアウト株が発生したら、クライオチューブを生じさせ、次の工程において、導入したｕｒａ３マーカーは、ｕｒａ３ターミネータ（Ｔ）に融合されたｕｒａ３プロモータ（Ｐ）からなるｕｒａ３ＰＴ回収カセットによって新規の株を形質転換すること、及びＶａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）によって記載されているようにｕｒａ３陽性株には毒性の５－ＦＯＡ（５－フルオロ－オロチン酸）含有選択培地においてｕｒａ３陰性株に
ついて選択することによって、再び除去した。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）によって記載されている一般的な分子技術を適用した。Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出をＲｏｅｌａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されているように実施した。環状ポリメラーゼ抽出クローニング（ＣＰＥＣ）を、線状ＤＮＡフラグメント（挿入片及び骨格）からの環状プラスミドを作り出すために使用した。ノックアウト株を作製するために、Ｓ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を、Ｌｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）によって記載されているように線状化したＤＮＡによるエレクトロポレーションによって形質転換し、選択的培地上にプレーティングし、コロニーが現れるまで３０℃でインキュベートした。新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）ノックアウト株が発生したら、クライオチューブを生じさせ、次の工程において、導入したｕｒａ３マーカーは、ｕｒａ３ターミネータ（Ｔ）に融合されたｕｒａ３プロモータ（Ｐ）からなるｕｒａ３ＰＴ回収カセットによって新規の株を形質転換すること、及びＶａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）によって記載されているようにｕｒａ３陽性株には毒性の５－ＦＯＡ（５－フルオロ－オロチン酸）含有選択培地においてｕｒａ３陰性株に
ついて選択することによって、再び除去した。
【0161】
ノックアウトカセットの正確な統合をコロニーＰＣＲによって確認した。
【0162】
ａ１遺伝子（配列番号：１００）が欠失された株の発生及びチェックに使用したプライマー及びこれらの配列：
・ｏＣＡＲＢＯ９７５７：ＡＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＣＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣ（配列番号：２１）
・ｏＣＡＲＢＯ９７５８：ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣ（配列番号：２２）
・ｏＣＡＲＢＯ９７５９：
ＣＧＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＣＴＣＴＴＧ（配列番号：２３）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６０：
ＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＡＣＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＧ（配列番号：２４）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６１：
ＡＣＴＣＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＣＧ（配列番号：２５）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６２：
ＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＴＡＴＡＣＣＣＧＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号：２６）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６３：ＣＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＣ（配列番号：２７）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６４：ＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧＡＴＣＧＧＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号：２８）
・ｏＣＡＲＢＯ９９５８：ＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号：２９）
・ｏＣＡＲＢＯ９９５９：ＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号：３０）
・ｏＣＡＲＢＯ１００２５：ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ（配列番号：３１）
・ｏＣＡＲＢＯ１００２６：ＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号：３２）
・ｏＣＡＲＢＯ９７５７：ＡＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＣＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣ（配列番号：２１）
・ｏＣＡＲＢＯ９７５８：ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣ（配列番号：２２）
・ｏＣＡＲＢＯ９７５９：
ＣＧＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＣＴＣＴＴＧ（配列番号：２３）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６０：
ＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＡＣＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＧ（配列番号：２４）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６１：
ＡＣＴＣＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＣＧ（配列番号：２５）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６２：
ＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＴＡＴＡＣＣＣＧＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号：２６）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６３：ＣＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＣ（配列番号：２７）
・ｏＣＡＲＢＯ９７６４：ＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧＡＴＣＧＧＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号：２８）
・ｏＣＡＲＢＯ９９５８：ＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号：２９）
・ｏＣＡＲＢＯ９９５９：ＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号：３０）
・ｏＣＡＲＢＯ１００２５：ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ（配列番号：３１）
・ｏＣＡＲＢＯ１００２６：ＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号：３２）
【0163】
ａ２遺伝子（配列番号：１０２）が欠失された株の発生及びチェックに使用したプライマー及びこれらの配列。
・ｏＣＡＲＢＯ１００７６：
ＴＣＡＧＡＡＧＣＧＴＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：３３）
・ｏＣＡＲＢＯ１００７７：
ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧＡＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣ（配列番号：３４）
・ｏＣＡＲＢＯ１００７８：ＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＧＣＡＴＡＧ（配列番号：３５）
・ｏＣＡＲＢＯ１００７９：
ＣＡＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＡＡＧ（配列番号：３６）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８０：
ＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧ（配列番号：３７）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８１：
ＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号：３８）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８２：
ＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＣＧＣＡＴＡＡＧＣ（配列番号：３９）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８３：
ＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＣ（配列番号：４０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１８９：ＴＣＡＴＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣ（配列番号：４１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９０：ＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号：４２）
・Ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０３８６：ＧＣＧＴＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣ（配列番号：４４）
・ｏＣＡＲＢＯ１００７６：
ＴＣＡＧＡＡＧＣＧＴＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：３３）
・ｏＣＡＲＢＯ１００７７：
ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧＡＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣ（配列番号：３４）
・ｏＣＡＲＢＯ１００７８：ＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＧＣＡＴＡＧ（配列番号：３５）
・ｏＣＡＲＢＯ１００７９：
ＣＡＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＡＡＧ（配列番号：３６）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８０：
ＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧ（配列番号：３７）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８１：
ＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号：３８）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８２：
ＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＣＧＣＡＴＡＡＧＣ（配列番号：３９）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８３：
ＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＣ（配列番号：４０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１８９：ＴＣＡＴＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣ（配列番号：４１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９０：ＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号：４２）
・Ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０３８６：ＧＣＧＴＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣ（配列番号：４４）
【0164】
ａ３遺伝子（配列番号：１０４）が欠失された株の発生及びチェックに使用したプライマー及びこれらの配列。
・ｏＣＡＲＢＯ１００８４：
ＴＴＣＴＴＡＴＣＧＧＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧ（配列番号：４５）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８５：
ＡＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号：４６）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８６：
ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣ（配列番号：４７）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８７：
ＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴＴＡＧＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧ（配列番号：４８）
・ｏＣａｒｂｏ１００８８：
ＧＴＧＣＣＴＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧ（配列番号：４９）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８９：
ＡＴＧＧＣＧＴＧＧＴＡＴＡＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号：５０）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９０：
ＡＡＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＴＡＴＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＧＡＧ（配列番号：５１）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９１：
ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：５２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９１：ＴＣＡＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣ（配列番号：５３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９２：ＡＣＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＧ（配列番号：５４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０３８４：ＡＧＣＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＴＡＧＧ（配列番号：５５）
・ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８４：
ＴＴＣＴＴＡＴＣＧＧＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧ（配列番号：４５）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８５：
ＡＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号：４６）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８６：
ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣ（配列番号：４７）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８７：
ＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴＴＡＧＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧ（配列番号：４８）
・ｏＣａｒｂｏ１００８８：
ＧＴＧＣＣＴＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧ（配列番号：４９）
・ｏＣＡＲＢＯ１００８９：
ＡＴＧＧＣＧＴＧＧＴＡＴＡＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号：５０）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９０：
ＡＡＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＴＡＴＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＧＡＧ（配列番号：５１）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９１：
ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：５２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９１：ＴＣＡＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣ（配列番号：５３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９２：ＡＣＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＧ（配列番号：５４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０３８４：ＡＧＣＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＴＡＧＧ（配列番号：５５）
・ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
【0165】
ａ４遺伝子（配列番号：１０６）が欠失された株の発生及びチェックに使用したプライマー及びこれらの配列。
・ｏＣＡＲＢＯ１００９４：ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：５６）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９５：ＡＡＡＧＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＣＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号：５７）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９６：ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号：５８）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９８＿ＨＲ１Ｅ６：ＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣ（配列番号：５９）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９９：
ＧＡＧＴＧＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣ（配列番号：６０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１００：
ＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号：６１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０１：
ＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣ（配列番号：６２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０２：
ＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧ（配列番号：６３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１７８：ＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号：６４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１７９：ＡＡＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧ（配列番号：６５）
・Ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０３８８：ＣＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＧ（配列番号：６６）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９４：ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：５６）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９５：ＡＡＡＧＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＣＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号：５７）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９６：ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号：５８）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９８＿ＨＲ１Ｅ６：ＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣ（配列番号：５９）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９９：
ＧＡＧＴＧＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣ（配列番号：６０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１００：
ＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号：６１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０１：
ＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣ（配列番号：６２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０２：
ＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧ（配列番号：６３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１７８：ＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号：６４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１７９：ＡＡＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧ（配列番号：６５）
・Ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０３８８：ＣＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＧ（配列番号：６６）
【0166】
ａ５遺伝子（配列番号：１０８）が欠失された株の発生及びチェックに使用したプライマー及びこれらの配列。
・ｏＣＡＲＢＯ９７３１：ＧＣＡＡＣＧＡＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号：６７）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３２：ＣＡＧＡＣＧＴＣＴＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：６８）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３３：ＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＣ（配列番号：６９）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３４：ＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧ（配列番号：７０）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３５：ＣＴＣＣＴＴＴＣＡＴＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣ（配列番号：７１）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３６：ＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＧ（配列番号：７２）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３７：ＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＴＡＴＡＣＣＣＧＧＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣ（配列番号：７３）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３８：ＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＴＣＴＧ（配列番号：７４）
・ｏＣＡＲＢＯ１００１５：ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣ（配列番号：７５）
・ｏＣＡＲＢＯ１００１６：ＧＡＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＴＣＴＧ（配列番号：７６）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１１８：ＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧ（配列番号：７７）
・ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３１：ＧＣＡＡＣＧＡＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号：６７）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３２：ＣＡＧＡＣＧＴＣＴＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：６８）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３３：ＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＣ（配列番号：６９）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３４：ＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧ（配列番号：７０）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３５：ＣＴＣＣＴＴＴＣＡＴＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣ（配列番号：７１）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３６：ＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＧ（配列番号：７２）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３７：ＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＴＡＴＡＣＣＣＧＧＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣ（配列番号：７３）
・ｏＣＡＲＢＯ９７３８：ＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＴＣＴＧ（配列番号：７４）
・ｏＣＡＲＢＯ１００１５：ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣ（配列番号：７５）
・ｏＣＡＲＢＯ１００１６：ＧＡＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＴＣＴＧ（配列番号：７６）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１１８：ＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧ（配列番号：７７）
・ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
【0167】
ａ６遺伝子（配列番号：１１０）が欠失された株の発生及びチェックに使用したプライマー及びこれらの配列。
・ｏＣＡＲＢＯ１００９７：ＣＡＧＴＴＴＧＴＡＡＡＣＴＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号：７８）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０３：ＣＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号：７９）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０４：ＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＡＧ（配列番号：８０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０５：ＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＣ（配列番号：８１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０６：ＧＧＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧ（配列番号：８２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０７：ＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号：８３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０８：ＡＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ（配列番号：８４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０９：ＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧ（配列番号：８５）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９３：ＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧ（配列番号：８６）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９４：ＴＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＴＴＴＡＣ（配列番号：８７）
・Ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０９０４：ＧＴＣＴＴＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＴＡ（配列番号：８８）
・ｏＣＡＲＢＯ１００９７：ＣＡＧＴＴＴＧＴＡＡＡＣＴＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号：７８）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０３：ＣＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号：７９）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０４：ＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＡＧ（配列番号：８０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０５：ＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＣ（配列番号：８１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０６：ＧＧＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧ（配列番号：８２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０７：ＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号：８３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０８：ＡＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ（配列番号：８４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１０９：ＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧ（配列番号：８５）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９３：ＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧ（配列番号：８６）
・ｏＣＡＲＢＯ１０１９４：ＴＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＴＴＴＡＣ（配列番号：８７）
・Ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０９０４：ＧＴＣＴＴＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＴＡ（配列番号：８８）
【0168】
ａ７遺伝子（配列番号：１１２）が欠失された株の発生及びチェックに使用したプライマー及びこれらの配列。
・ｏＣＡＲＢＯ１０２１７：ＧＧＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＣＧＡＴＡＣＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：８９）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２１８：ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧ（配列番号：９０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２１９：ＣＡＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＣ（配列番号：９１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２０：ＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＣ（配列番号：９
２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２１：ＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧ（配列番号：９３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２２：ＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＡＴＣＧＴＡＴＴＴＣＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣ（配列番号：９４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２３：ＡＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＧＴＧＡＡＡＴＡＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ（配列番号：９５）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２４：ＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＴＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＧ（配列番号：９６）
・ｏＣＡＲＢＯ１１４９３：ＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＣ（配列番号：９７）
・ｏＣＡＲＢＯ１１４９４＿Ｎ３ＣＡＳＳ＿ＲＥＶ：ＧＴＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＧ（配列番号：９８）
・ｏＣＡＲＢＯ１１４９５：ＡＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号：９９）
・ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２１７：ＧＧＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＣＧＡＴＡＣＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧ（配列番号：８９）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２１８：ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧ（配列番号：９０）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２１９：ＣＡＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＣ（配列番号：９１）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２０：ＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＣ（配列番号：９
２）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２１：ＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧ（配列番号：９３）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２２：ＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＡＴＣＧＴＡＴＴＴＣＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣ（配列番号：９４）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２３：ＡＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＧＴＧＡＡＡＴＡＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ（配列番号：９５）
・ｏＣＡＲＢＯ１０２２４：ＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＴＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＧ（配列番号：９６）
・ｏＣＡＲＢＯ１１４９３：ＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＣ（配列番号：９７）
・ｏＣＡＲＢＯ１１４９４＿Ｎ３ＣＡＳＳ＿ＲＥＶ：ＧＴＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＧ（配列番号：９８）
・ｏＣＡＲＢＯ１１４９５：ＡＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号：９９）
・ｐ２０２：ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号：４３）
【0169】
分析技術
成長の追跡
培養の光学密度（ＯＤ）を、生理溶液（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で希釈した１ｍＬサンプルについてＪａｓｃｏ Ｖ６３０ Ｂｉｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して６００ｎｍで測定した。培養実験における酵母菌細胞の生存率を、培養体積当たりのＣＦＵの平均の対数をｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）として表したコロニー形成単位（ＣＦＵ）を求めることによってアセスメントした（Ｓａｅｒｅｎｓ，Ｓａｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。代替的には、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を、風袋の重さを量ったエッペンドルフ管において１ｍＬの発酵サンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、細胞ペレットを１ｍＬの生理溶液で２回洗浄することによって求めた。残存する細胞ペレットを７０℃のオーブンに５日間置き、次いでその後、秤量した。エッペンドルフ管の空の重量を除算した後にＣＤＷ（ｇ／Ｌ）を算出した。
成長の追跡
培養の光学密度（ＯＤ）を、生理溶液（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で希釈した１ｍＬサンプルについてＪａｓｃｏ Ｖ６３０ Ｂｉｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して６００ｎｍで測定した。培養実験における酵母菌細胞の生存率を、培養体積当たりのＣＦＵの平均の対数をｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）として表したコロニー形成単位（ＣＦＵ）を求めることによってアセスメントした（Ｓａｅｒｅｎｓ，Ｓａｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。代替的には、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を、風袋の重さを量ったエッペンドルフ管において１ｍＬの発酵サンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、細胞ペレットを１ｍＬの生理溶液で２回洗浄することによって求めた。残存する細胞ペレットを７０℃のオーブンに５日間置き、次いでその後、秤量した。エッペンドルフ管の空の重量を除算した後にＣＤＷ（ｇ／Ｌ）を算出した。
【0170】
グルコース濃度の追跡
グルコース濃度を、２７００Ｓｅｌｅｃｔ生化学分析器（ＹＳＩ Ｉｎｃ．）を使用して、又は、蒸発光散乱検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）をカップリングした超高速液体クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）（ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ）を使用して求めた。ＵＰＬＣ分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を３５℃で使用し、０．５ｍＬ／分の定組成流量の７５％アセトニトリル及び０．２％トリエチルアミン（ＴＥＡ）を適用した（５分／サンプル）。ＥＬＳ検出では、ネブライザを１５℃に冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保った。ＥＬＳ検出について１００のゲインを使用して０～５ｇ／Ｌのグルコースにおける線形範囲を見出した（Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア）。グルコース消費を表すために、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって得られたグルコース濃度を通して線形曲線をフィッティングし、それぞれの傾きを採取してグルコース消費速度（ｇ／Ｌ．ｈ）として示した。
グルコース濃度を、２７００Ｓｅｌｅｃｔ生化学分析器（ＹＳＩ Ｉｎｃ．）を使用して、又は、蒸発光散乱検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）をカップリングした超高速液体クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）（ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ）を使用して求めた。ＵＰＬＣ分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を３５℃で使用し、０．５ｍＬ／分の定組成流量の７５％アセトニトリル及び０．２％トリエチルアミン（ＴＥＡ）を適用した（５分／サンプル）。ＥＬＳ検出では、ネブライザを１５℃に冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保った。ＥＬＳ検出について１００のゲインを使用して０～５ｇ／Ｌのグルコースにおける線形範囲を見出した（Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア）。グルコース消費を表すために、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって得られたグルコース濃度を通して線形曲線をフィッティングし、それぞれの傾きを採取してグルコース消費速度（ｇ／Ｌ．ｈ）として示した。
【0171】
糖脂質／グリコシドの分析
糖脂質分析用のサンプルを、１ｍＬの純粋なエタノール及び０．５ｍＬの発酵培養液の混合物を５分間激しく振とうすることによって調製した。その後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、細胞ペレットを除去し、上清をＰＴＦＥフィルタ（カットオフ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用してろ過し、５０％エタノール（別途記述されていない限
り）において適切に希釈した後、（超）高速液体クロマトグラフィ－質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）及び（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）において分析した。
糖脂質分析用のサンプルを、１ｍＬの純粋なエタノール及び０．５ｍＬの発酵培養液の混合物を５分間激しく振とうすることによって調製した。その後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、細胞ペレットを除去し、上清をＰＴＦＥフィルタ（カットオフ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用してろ過し、５０％エタノール（別途記述されていない限
り）において適切に希釈した後、（超）高速液体クロマトグラフィ－質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）及び（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）において分析した。
【0172】
ＨＰＬＣ－ＭＳを、ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣ）検出システムにカップリングしたＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用して実施した。異なる成分を、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ－１８ Ｅｎｄｃａｐｐｅｄ １００－４．６ｍｍカラム（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）において３０℃で極性によって分離した。ＬＣ－ＭＳ方法は、２つの溶媒：０．５％酢酸を含むＭｉｌｌｉＱ、及び純粋なアセトニトリル（ＡＣＮ）；に基づいた勾配溶離を使用する。分析の際、１ｍＬ／分の流量を適用した。勾配は５％アセトニトリルで開始し、４０分にわたって９５％まで線形増加させる。この後、９５％アセトニトリルをさらに１０分間保持し、その後、これを５分で５％アセトニトリルまで戻す。サンプル当たりの合計分析時間は６０分／サンプルである。ＭＳの走査範囲を２１５～１１００ｇ／ｍｏｌに設定した。ＨＰＬＣ－ＭＳについて言及したものと同様の条件を使用して、ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を、２０００ＥＳ ＥＬＳＤ（Ａｌｌｔｅｃｈ）をカップリングしたＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって４０℃で実施した。全ての他の条件は、ＨＰＬＣ－ＭＳについて言及したものと同様である。
【0173】
ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を、ＵＰＬＣ－ＭＳと同じカラム及び分析方法を用いて、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）及びＡｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。ＥＬＳＤ検出では、ネブライザを１２℃で冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保ち、ゲインを２００に設定した。糖脂質を定量化するために、精製された生成物の希釈系列で調製した。市販のＣ１８：１アセチル化ボラＳＳの精製されたバッチ（バッチ番号ＳＬ２４Ａ）及び精製されたアセチル化Ｃ１６：０アルキルＳＳバッチ（バッチ番号ａＡｌｋＣ１６＿２）をそれぞれボラＳＳ及びアルキルＳＳの定量化に用いた。
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。ＥＬＳＤ検出では、ネブライザを１２℃で冷却し、ドリフト管を５０℃の温度で保ち、ゲインを２００に設定した。糖脂質を定量化するために、精製された生成物の希釈系列で調製した。市販のＣ１８：１アセチル化ボラＳＳの精製されたバッチ（バッチ番号ＳＬ２４Ａ）及び精製されたアセチル化Ｃ１６：０アルキルＳＳバッチ（バッチ番号ａＡｌｋＣ１６＿２）をそれぞれボラＳＳ及びアルキルＳＳの定量化に用いた。
【0174】
代替的には、ＵＰＬＣ－ＭＳを、Ａｃｃｅｌａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。糖脂質分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）並びに０．６ｍＬ／分の流量でのｍｉｌｌｉＱ中０．５％酢酸（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）に基づく勾配溶離システムを適用した。方法は以下の通りであった：初期濃度の５％のＢ（９５％のＡ）は、最初の６．８分の間に９５％のＢ（５％のＡ）まで線形増加し、次いで、１．８分の間に５％のＢ（９５％のＡ）までさらに線形減少した。その後、ランの終わりまで５％のＢ（９５％のＡ）を維持する（１０分／サンプル）。陰イオンモードを使用し、２μＬのサンプルを注入した。ＭＳ検出を、加熱したエレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源によって行い、条件を、定性的な方法で２１５～１３００ｍ／ｚの範囲の質量を検出するように設定した。
【0175】
全ての１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、１Ｈ／ＢＢ ｚ－勾配プローブ（ＢＢＯ、５ｍｍ）を装備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩにおいてそれぞれ４００及び１００．６ＭＨｚで記録した。ＤＭＳＯ－［Ｄ６］を溶媒として及び内部化学シフト標準として使用した（１Ｈでは２．５０ｐｐｍ及び１３Ｃでは３９．５２ｐｐｍ）。全てのスペクトルを、ＴＯＰＳＰＩＮ３．２ソフトウェアを使用して処理した。アタッチドプロトンテスト（ＡＰＴ）、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、及びＨＳＱＣのスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒパルスプログラムライブラリにおいて利用可能な標準配列を通して取得した。文献（Ｇｈｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）にしたがって、カスタム設定をＨＭＢＣ（３２スキャン）、ＴＯＣＳＹ（１００ミリ秒のＭＬＥＶスピンロック、０．１秒の混合時間、１．２７秒の緩和遅延、１６スキャン）、及び
Ｈ２ＢＣ（２１．８ミリ秒の混合時間、１．５秒の緩和遅延、１６スキャン）に使用した。
Ｈ２ＢＣ（２１．８ミリ秒の混合時間、１．５秒の緩和遅延、１６スキャン）に使用した。
【0176】
結果
欠失株Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１ Δａ１ Δａ２ Δａ３ Δａ４ Δａ５ Δａ６ Δａ７の発生
実施例１にて記載されているΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株を親株として使用した。この株を、ｕｒａ３陽性Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株をｕｒａ３ターミネータ（Ｔ）に融合したｕｒａ３プロモータ（Ｐ）からなるｕｒａ３ＰＴ回収カセットによって形質転換すること、及びＶａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）によって記載されているようにｕｒａ３陰性コロニーを選択することによってｕｒａ３マーカーを再び選択的に除去することによって、再びｕｒａ３陰性とした。
欠失株Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１ Δａ１ Δａ２ Δａ３ Δａ４ Δａ５ Δａ６ Δａ７の発生
実施例１にて記載されているΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株を親株として使用した。この株を、ｕｒａ３陽性Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株をｕｒａ３ターミネータ（Ｔ）に融合したｕｒａ３プロモータ（Ｐ）からなるｕｒａ３ＰＴ回収カセットによって形質転換すること、及びＶａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）によって記載されているようにｕｒａ３陰性コロニーを選択することによってｕｒａ３マーカーを再び選択的に除去することによって、再びｕｒａ３陰性とした。
【0177】
その後、ｕｒａ３陰性Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株をさらに修飾して、ａ１～ａ７遺伝子を１つずつノックアウトした。これらのそれぞれのノックアウトカセットを、ｕｒａ３遺伝子を選択マーカーとして使用して、且つ、並行するワークフローにしたがって、全て発生させた。新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）ノックアウト株を（ｕｒａ３陽性）を発生させたら、得られた株を、次いで、ｕｒａ３遺伝子を選択マーカーとして再び使用して、その後の欠失期間に使用した。このことは、図１５に示されているベクターシステムの使用を可能にし、７つの全ての酸化酵素Ａ１～Ａ７の特定のノックアウトカセットを発生させた。
【0178】
線状ノックアウトカセットを、発生させたプラスミドから発生させ、線状ＤＮＡ（およそ１０００ｎｇ）を使用して特定のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株を形質転換し、その後、材料及び方法に記載されている適切な選択的培地においてプレーティングした。ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５、ａ６及び／又はａ７ノックアウトカセットによって形質転換した欠失株について、ｕｒａ３陽性株の選択を、Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ
ａｌ．（２００７）によって記載されているように行った。３０℃におけるインキュベーション後、複数のコロニーがプレートに現れた。それぞれ形質転換された株からの１０個のコロニーを、当該プレート及びＬｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）によって記載されている酵母菌コロニーＰＣＲからピックアップした。対象の遺伝子（ノックアウトカセットの組み込み）の欠失を確認するために使用したプライマーセットは、ａ１：ｏＣＡＲＢＯ１００２５及びｏＣＡＲＢＯ１００２６用、ａ２：Ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０３８６、ａ３：ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０３８４用、ａ４：Ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０３８８用、ａ５：ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０１１８用、ａ６：Ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０９０４用、並びにａ７：ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１１４９５用であった。
ａｌ．（２００７）によって記載されているように行った。３０℃におけるインキュベーション後、複数のコロニーがプレートに現れた。それぞれ形質転換された株からの１０個のコロニーを、当該プレート及びＬｏｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）によって記載されている酵母菌コロニーＰＣＲからピックアップした。対象の遺伝子（ノックアウトカセットの組み込み）の欠失を確認するために使用したプライマーセットは、ａ１：ｏＣＡＲＢＯ１００２５及びｏＣＡＲＢＯ１００２６用、ａ２：Ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０３８６、ａ３：ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０３８４用、ａ４：Ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０３８８用、ａ５：ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０１１８用、ａ６：Ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１０９０４用、並びにａ７：ｐ２０２及びｏＣＡＲＢＯ１１４９５用であった。
【0179】
新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株の評価
発生した、上記に記載されている新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株（各形質転換工程において、新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株を発生させた）を、材料のセクション下で記載されている多数のパラメータについて評価した。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ３Δａ４及びΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ１Δａ３Δａ４株の成長に連結した一般的特徴及び全生存率は、親株ＰＴ３６；Δｃｙｐ５２Ｍ１及びΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１と同様に残存した。
発生した、上記に記載されている新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株（各形質転換工程において、新規のＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）株を発生させた）を、材料のセクション下で記載されている多数のパラメータについて評価した。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ３Δａ４及びΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ１Δａ３Δａ４株の成長に連結した一般的特徴及び全生存率は、親株ＰＴ３６；Δｃｙｐ５２Ｍ１及びΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１と同様に残存した。
【0180】
グリコシド／糖脂質生成プロファイルは、株間で変動した。Δｃｙｐ５２Ｍ１株は、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって検出可能な糖脂質／グリコシド、又は油、脂肪酸若しくは脂肪アルコールを生成しなかったが、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株は、実施例１下に記載されている及び図１７Ａに示されている脂肪アルコールを供給したとき、相当な量の（アセ
チル化）α，ω－ボラソホロシドを生成した。ａ１～ａ７遺伝子の１つ以上がさらに欠損した新規の発生したＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）のうちのいくつか、特に、ａ３及びａ４遺伝子が欠失した株は、アルキルソホロシドの富化した生成プロファイルを特徴とした（Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ３Δａ４株については図１７Ｂ及びΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ１Δａ３Δａ４株については図１７Ｃを参照されたい）。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ１Δａ３Δａ４株の生成プロファイル（図１７Ｃに示すＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラム）は、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株について３～４．５分の間で溶離したＣ１８：１ボラＳＳの非存在下で、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の生成プロファイルとはさらに異なった。代わりに、モノ－アセチル化Ｃ１８：１アルキルＳＳ（５．７５分において６３４ｇ／ｍｏｌ）は、最も主要な生成物ピークを形成した。非及びジ－アセチル化Ｃ１８：１アルキルＳＳの存在（それぞれ５９２及び６７６ｇ／ｍｏｌ）をＨＰＬＣ－ＭＳによって同じく確認した。他の鎖長を有するアセチル化及び非アセチル化アルキルソホロシドも検出された。成長実験において生成したアルキルソホロシドのアルキル鎖は、生成培地に供給した特定の脂肪アルコールの鎖長に対応する。
チル化）α，ω－ボラソホロシドを生成した。ａ１～ａ７遺伝子の１つ以上がさらに欠損した新規の発生したＳ．ボンビコラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）のうちのいくつか、特に、ａ３及びａ４遺伝子が欠失した株は、アルキルソホロシドの富化した生成プロファイルを特徴とした（Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ３Δａ４株については図１７Ｂ及びΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ１Δａ３Δａ４株については図１７Ｃを参照されたい）。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１Δａ１Δａ３Δａ４株の生成プロファイル（図１７Ｃに示すＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラム）は、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株について３～４．５分の間で溶離したＣ１８：１ボラＳＳの非存在下で、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の生成プロファイルとはさらに異なった。代わりに、モノ－アセチル化Ｃ１８：１アルキルＳＳ（５．７５分において６３４ｇ／ｍｏｌ）は、最も主要な生成物ピークを形成した。非及びジ－アセチル化Ｃ１８：１アルキルＳＳの存在（それぞれ５９２及び６７６ｇ／ｍｏｌ）をＨＰＬＣ－ＭＳによって同じく確認した。他の鎖長を有するアセチル化及び非アセチル化アルキルソホロシドも検出された。成長実験において生成したアルキルソホロシドのアルキル鎖は、生成培地に供給した特定の脂肪アルコールの鎖長に対応する。
【0181】
得られたノックアウト株（複数可）におけるｕｇｔＢ１遺伝子のさらなる欠失は、アルキルソホロシドの代わりに、対応するアルキルグルコシドの生成を生じた。
【0182】
実施例４：（アセチル化）Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質及びＣ９：０ω－ソホロシドアルコールの生成並びに（アセチル化）Ｃ９：０ω－グルコシドの生成の最適化。
材料及び方法
化学物質及び前駆体
化学試薬（Ｏｘｏｎｅ（登録商標）（２ＫＨＳＯ３・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４）、ＤＭＳＯ－ｄ６、ＭｅＯＤ－ｄ４）をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ）をそれぞれＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ及びＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃａｔａｚｙｍｅ（登録商標）２５ＬをＮｏｖｏｚｙｍｅｓから購入した。これらをさらに精製せずに使用した。酸素（９９．９％、Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）を出発物質として使用して、オゾンを生じさせた。アセチル化及び非アセチル化Ｃ１８：１対称α，ω－ボラソホロシド（Ｃ１８：１）を実施例１に記載されているように生成した。
材料及び方法
化学物質及び前駆体
化学試薬（Ｏｘｏｎｅ（登録商標）（２ＫＨＳＯ３・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４）、ＤＭＳＯ－ｄ６、ＭｅＯＤ－ｄ４）をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ）をそれぞれＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ及びＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃａｔａｚｙｍｅ（登録商標）２５ＬをＮｏｖｏｚｙｍｅｓから購入した。これらをさらに精製せずに使用した。酸素（９９．９％、Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）を出発物質として使用して、オゾンを生じさせた。アセチル化及び非アセチル化Ｃ１８：１対称α，ω－ボラソホロシド（Ｃ１８：１）を実施例１に記載されているように生成した。
【0183】
小規模パイロットスケールにおけるカタラーゼの存在下でのオゾン分解を介してのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの生成
小規模パイロットスケールでのオゾン分解反応を、実施例２において上記で記載されているようにステンレス鋼７Ｌ反応器において実施した。Ｈ２Ｏ２によるＣ９：０ω－ソホロ脂質酸へのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの過酸化を抑制するために、カタラーゼ溶液（Ｃａｔａｚｙｍｅ（登録商標）２５Ｌ）（インサイチュで形成されるＨ２Ｏ２に対して１０当量）を実験前に反応混合物に添加した。確実にｐＨがカタラーゼ酵素に最適となるようにするために、オゾン分解を２Ｌ緩衝剤溶液（ｐＨ＝６．９～７．１）において実施した。反応パラメータの概要を表５に提示する。
小規模パイロットスケールでのオゾン分解反応を、実施例２において上記で記載されているようにステンレス鋼７Ｌ反応器において実施した。Ｈ２Ｏ２によるＣ９：０ω－ソホロ脂質酸へのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの過酸化を抑制するために、カタラーゼ溶液（Ｃａｔａｚｙｍｅ（登録商標）２５Ｌ）（インサイチュで形成されるＨ２Ｏ２に対して１０当量）を実験前に反応混合物に添加した。確実にｐＨがカタラーゼ酵素に最適となるようにするために、オゾン分解を２Ｌ緩衝剤溶液（ｐＨ＝６．９～７．１）において実施した。反応パラメータの概要を表５に提示する。
【0184】
持続的オゾン分解を介してのジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロ脂質の生成
ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロ脂質酸を、実験室スケール及び小規模パイロットスケールでジアセチル化又は非アセチル化対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドの持続的オゾン分解を介して生成した。同じ機器セットを上記で記載されているように使用して、オゾン分解を介してＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを生成した。反応パラメータを表７に示す。
ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロ脂質酸を、実験室スケール及び小規模パイロットスケールでジアセチル化又は非アセチル化対称Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドの持続的オゾン分解を介して生成した。同じ機器セットを上記で記載されているように使用して、オゾン分解を介してＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを生成した。反応パラメータを表７に示す。
【0185】
Ｏｘｏｎｅ（登録商標）による酸化を介してのジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロ脂質の生成
ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドをＯｘｏｎｅ（登録商標）による酸化に供して、対応するＣ９：０ω－ソホロ脂質を得た。簡潔には、ジアセチル化又は非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド（１当量）を５０ｍＬのフラスコにおいて２５ｍＬの脱塩水に溶解した。Ｏｘｏｎｅ（０．５当量）を反応混合物に添加し、室温で一晩（１８時間）撹拌した。その後、反応混合物を減圧下で濃縮し、メタノールに再溶解して、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）塩を析出させた。塩のろ過の際、ろ液を減圧下で濃縮した。
ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドをＯｘｏｎｅ（登録商標）による酸化に供して、対応するＣ９：０ω－ソホロ脂質を得た。簡潔には、ジアセチル化又は非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド（１当量）を５０ｍＬのフラスコにおいて２５ｍＬの脱塩水に溶解した。Ｏｘｏｎｅ（０．５当量）を反応混合物に添加し、室温で一晩（１８時間）撹拌した。その後、反応混合物を減圧下で濃縮し、メタノールに再溶解して、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）塩を析出させた。塩のろ過の際、ろ液を減圧下で濃縮した。
【0186】
ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルコールの生成
ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを、還元剤として（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ＆ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ（２０１７）による手順にしたがって合成された）ピコリン－ボランを用いる還元に供し、対応するＣ９：０ω－ソホロシドアルコールを得た。簡潔には、ジアセチル化又は非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド（１当量）を５０ｍＬのフラスコにおいて１５ｍＬの脱塩水に溶解した。ピコリン－ボラン（１当量）を反応混合物に添加し、これを酢酸によってｐＨ＝６まで酸性化した。反応混合物を室温で一晩（１８時間）撹拌した。その後、反応媒体をトルエンで洗浄した。水相を減圧下で濃縮し、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルコールを白色固体として得た。
ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを、還元剤として（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ＆ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ（２０１７）による手順にしたがって合成された）ピコリン－ボランを用いる還元に供し、対応するＣ９：０ω－ソホロシドアルコールを得た。簡潔には、ジアセチル化又は非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒド（１当量）を５０ｍＬのフラスコにおいて１５ｍＬの脱塩水に溶解した。ピコリン－ボラン（１当量）を反応混合物に添加し、これを酢酸によってｐＨ＝６まで酸性化した。反応混合物を室温で一晩（１８時間）撹拌した。その後、反応媒体をトルエンで洗浄した。水相を減圧下で濃縮し、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルコールを白色固体として得た。
【0187】
実験室スケールにおけるω（アセチル化）Ｃ９：０ω－グルコシドアルデヒド及びＣ９：０ω－糖脂質の生成
（アセチル化）Ｃ１８：１対称α，ω－ボラグルコシド（Ｃ１８：１）を実施例１に記載されているように生成し、基質として使用して、オゾン分解を介してＣ９：０α，ω－グルコシドを生成した。同じ実験室スケールのオゾン分解機器を上記で記載されているように使用してＣ９：０α，ω－ソホロシドを生成した。簡潔には、０．０６Ｌの脱塩水に溶解した０．５２ｇの基質を、ガス洗浄ボトルにおいて室温でオゾン分解（オゾン送達：２．４ｍｇ／分）に供した。溶液を実験の際に６００ｒｐｍで混合した。反応混合物のｐＨを、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液をある特定の間隔で添加することによって実験全体にわたって８～１０の間に維持した。実験を１９分後に終了させた。生成物溶液を１Ｈ ＮＭＲ及びＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。
（アセチル化）Ｃ１８：１対称α，ω－ボラグルコシド（Ｃ１８：１）を実施例１に記載されているように生成し、基質として使用して、オゾン分解を介してＣ９：０α，ω－グルコシドを生成した。同じ実験室スケールのオゾン分解機器を上記で記載されているように使用してＣ９：０α，ω－ソホロシドを生成した。簡潔には、０．０６Ｌの脱塩水に溶解した０．５２ｇの基質を、ガス洗浄ボトルにおいて室温でオゾン分解（オゾン送達：２．４ｍｇ／分）に供した。溶液を実験の際に６００ｒｐｍで混合した。反応混合物のｐＨを、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液をある特定の間隔で添加することによって実験全体にわたって８～１０の間に維持した。実験を１９分後に終了させた。生成物溶液を１Ｈ ＮＭＲ及びＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。
【0188】
分析手順
ＮＭＲ分光法及びＬＣ－ＭＳクロマトグラフィを、実施例２に記載しているように実施した。
ＮＭＲ分光法及びＬＣ－ＭＳクロマトグラフィを、実施例２に記載しているように実施した。
【0189】
結果
ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルデヒドの生成
オゾン分解の際にインサイチュ形成されるＨ２Ｏ２による、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質へのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの過酸化を軽減するために、オゾン分解反応をカタラーゼ酵素の存在下で実施した。これらの実験に用いた反応パラメータは表５に見ることができる。結果を表６に示す。
ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルデヒドの生成
オゾン分解の際にインサイチュ形成されるＨ２Ｏ２による、Ｃ９：０ω－ソホロ脂質へのＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの過酸化を軽減するために、オゾン分解反応をカタラーゼ酵素の存在下で実施した。これらの実験に用いた反応パラメータは表５に見ることができる。結果を表６に示す。
【0190】
【表5】
【0191】
カタラーゼが反応媒体中に存在するとき、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの選択性の増加が生じた（表６）。
【0192】
【表6】
【0193】
ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロ脂質の生成
（ｉ）Ｏｘｏｎｅ（登録商標）によるＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの酸化を介する
オゾン分解の終わり得られたＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）を酸化体として使用する酸化に供した。有利には、当該反応は、水を除去することなくオゾン分解の直後に実施することができる。ジアセチル化及び非アセチル化の両方のωＣ９：０ソホロ脂質を、対応するＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドから出発して９８％の収率で得た。
（ｉ）Ｏｘｏｎｅ（登録商標）によるＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの酸化を介する
オゾン分解の終わり得られたＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）を酸化体として使用する酸化に供した。有利には、当該反応は、水を除去することなくオゾン分解の直後に実施することができる。ジアセチル化及び非アセチル化の両方のωＣ９：０ソホロ脂質を、対応するＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドから出発して９８％の収率で得た。
【0194】
（ｉｉ）Ｃ１８：１α，ω－ボラソホロシドの持続的オゾン分解を介する
代替的には、オゾン分解時間を延長することによって、形成されたＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの酸化によりＣ９：０ω－ソホロ脂質とした。実験室スケール及び小規模パイロットスケールにおける持続的オゾン分解実験に対応する反応パラメータを表７に提示する。
代替的には、オゾン分解時間を延長することによって、形成されたＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの酸化によりＣ９：０ω－ソホロ脂質とした。実験室スケール及び小規模パイロットスケールにおける持続的オゾン分解実験に対応する反応パラメータを表７に提示する。
【0195】
【表7】
【0196】
実験室スケールの実験において、ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの完全な転換に必要とされるオゾン量は、対応するＣ１８：１α，ω－ボラソホロシドと比較して４８及び２２当量であった。ジアセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの脱アセチル化は、延長されたオゾン分解の間に起こり、結果として、より多くのオゾン消費を引き起こした。パイロットスケールの実験の場合において、１５及び１６当量のオゾンが、それぞれ、ジアセチル化及び非アセチル化Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドの完全な転換に必要であった。これらの持続的オゾン分解実験の終わりに、Ｃ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを対応するωＣ９：０ソホロ脂質に変換し、これは、反応混合物の凍結乾燥後に、粘性のオフホワイトのゲルとして現れた。
【0197】
ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルコールの生成
オゾン分解の終わりに得られたＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを、ピコリン－ボランを還元剤として使用して対応するアルコールに還元した。ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルコールを、反応混合物をトルエンで洗浄し、続いて水相を減圧下で蒸発させた後に、白色固体として得た。ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルコールをそれぞれ８１％及び９７％の収率で得た。
オゾン分解の終わりに得られたＣ９：０ω－ソホロシドアルデヒドを、ピコリン－ボランを還元剤として使用して対応するアルコールに還元した。ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルコールを、反応混合物をトルエンで洗浄し、続いて水相を減圧下で蒸発させた後に、白色固体として得た。ジアセチル化及び非アセチル化ωＣ９：０ソホロシドアルコールをそれぞれ８１％及び９７％の収率で得た。
【0198】
実験室スケールでのＣ９：０α，ω－グルコシドの生成
アセチル化度が変動するＣ１８：１α，ω－ボラグルコシドを実験室スケールにおける脱塩水でのオゾン分解に供した。オゾン分解実験の終わりに、終点サンプル及び出発物質を、１Ｈ ＮＭＲを通して比較した（図１８を参照されたい）。この比較は、図１８に模式的に示されているように、出発物質（α，ωＣ１８：１ボラグルコシド）に存在する二重結合が開裂され、これによりＣ９：０ω－グルコシドアルデヒド及びＣ９：０ω－糖脂質酸分子の形成と共にＣ１８：１分子が変換されることを示している。
アセチル化度が変動するＣ１８：１α，ω－ボラグルコシドを実験室スケールにおける脱塩水でのオゾン分解に供した。オゾン分解実験の終わりに、終点サンプル及び出発物質を、１Ｈ ＮＭＲを通して比較した（図１８を参照されたい）。この比較は、図１８に模式的に示されているように、出発物質（α，ωＣ１８：１ボラグルコシド）に存在する二重結合が開裂され、これによりＣ９：０ω－グルコシドアルデヒド及びＣ９：０ω－糖脂質酸分子の形成と共にＣ１８：１分子が変換されることを示している。
【0199】
実施例５：不飽和α，ω－ボラグリコシドにおける不飽和脂肪族結合の酵素的開裂
図１９に模式的に示されているように、二工程の酵素的経路を適用して、不飽和α，ω－ボラグリコシドにおける二重結合を開裂する：第１工程において、ヒドロペルオキシド（ＨＰＯ）官能基を、ダイズリポキシゲナーゼ－１（ＳＢＬＯ－１）によって不飽和アルキル鎖の二重結合において導入する（Ｃｌａｐｐ ｅｔ ａｌ．（２００６））。その後の工程において、ヒドロペルオキシドを、ヒドロキシペルオキシドリアーゼによって（Ｓ
ｔｏｌｔｅｒｆｏｈｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９））、酸性条件下で自発的に分解するヘミアセタールの形成を伴ってさらに変換する。
図１９に模式的に示されているように、二工程の酵素的経路を適用して、不飽和α，ω－ボラグリコシドにおける二重結合を開裂する：第１工程において、ヒドロペルオキシド（ＨＰＯ）官能基を、ダイズリポキシゲナーゼ－１（ＳＢＬＯ－１）によって不飽和アルキル鎖の二重結合において導入する（Ｃｌａｐｐ ｅｔ ａｌ．（２００６））。その後の工程において、ヒドロペルオキシドを、ヒドロキシペルオキシドリアーゼによって（Ｓ
ｔｏｌｔｅｒｆｏｈｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９））、酸性条件下で自発的に分解するヘミアセタールの形成を伴ってさらに変換する。
【0200】
実施例６：不飽和α，ω－ボラグリコシドにおける不飽和脂肪族結合の酵素的開裂
図２０に模式的に示されているように、三工程の酵素的経路を適用して、不飽和α，ω－ボラグリコシドにおける二重結合を開裂する：第１工程において、脂肪族アルケンを、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種からのスチレンモノオキシゲナーゼを含有する生体触媒系を使用してエポキシアルカンに変換する（Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。次の工程において、エポキシドヒドロラーゼ（Ａｒｃｈｅｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６））を使用してオキシラン環を開環し、これにより隣接ジオールを生じさせる。その後の工程において、隣接ジオールにおけるＣ－Ｃ結合を酸化酵素シトクロムＰ４５０酵素によって開裂する（Ｏｒｔｉｚ（２００５））。
図２０に模式的に示されているように、三工程の酵素的経路を適用して、不飽和α，ω－ボラグリコシドにおける二重結合を開裂する：第１工程において、脂肪族アルケンを、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種からのスチレンモノオキシゲナーゼを含有する生体触媒系を使用してエポキシアルカンに変換する（Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。次の工程において、エポキシドヒドロラーゼ（Ａｒｃｈｅｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６））を使用してオキシラン環を開環し、これにより隣接ジオールを生じさせる。その後の工程において、隣接ジオールにおけるＣ－Ｃ結合を酸化酵素シトクロムＰ４５０酵素によって開裂する（Ｏｒｔｉｚ（２００５））。
【0201】
記述
本発明は、特に、以下のナンバリングされた態様及び実施形態のいずれか１つ、又は、これらのうちの１つ以上と、いずれか他の態様、記述及び／若しくは実施形態とのいずれかの組み合わせによって捉えられる：
態様１：１０％未満のω－１グリコシド、ω－２グリコシド及び／又はω－３グリコシドを含有するω－グリコシドを製造する方法であって：
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満のα，ω－１ボラグリコシド、α，ω－２ボラグリコシド及び／又はα，ω－３ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程、
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液からの前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程、並びに
ｃ．工程ａ）において生成した前記培養液内の前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを、前記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する、又は、工程ｂ）において精製された前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを、前記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する工程
を含む、前記方法。
本発明は、特に、以下のナンバリングされた態様及び実施形態のいずれか１つ、又は、これらのうちの１つ以上と、いずれか他の態様、記述及び／若しくは実施形態とのいずれかの組み合わせによって捉えられる：
態様１：１０％未満のω－１グリコシド、ω－２グリコシド及び／又はω－３グリコシドを含有するω－グリコシドを製造する方法であって：
ａ．好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換して１０％未満のα，ω－１ボラグリコシド、α，ω－２ボラグリコシド及び／又はα，ω－３ボラグリコシドを含有する不飽和α，ω－ボラグリコシドを含む培養液を生成する工程、
ｂ．任意選択的に、工程ａ）の培養液からの前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを精製する工程、並びに
ｃ．工程ａ）において生成した前記培養液内の前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを、前記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する、又は、工程ｂ）において精製された前記不飽和α，ω－ボラグリコシドを、前記不飽和α，ω－ボラグリコシド内の少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族結合を破壊する反応に供する工程
を含む、前記方法。
【0202】
態様２：結合している少なくとも１つの不飽和の開裂可能な脂肪族を破壊する前記反応が、オゾン分解反応若しくは酵素反応である、態様１に記載の方法。
【0203】
態様３：前記酵素反応が、リポキシゲナーゼ、ヒドロキシペルオキシドリアーゼ、モノオキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ／モノオキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、アルコールヒドロゲナーゼ／モノオキシゲナーゼ、又はこれらのいずれかの組み合わせによって媒介される、態様２に記載の方法。
【0204】
態様４：前記ω－グリコシドが、ω－ソホロシド、ω－グルコシド、ω－マンノシド、ω－ラムノシド、ω－キシロシド、ω－アラビノシド、ω－トレハロシド、ω－セロビオシド又はω－ラクトシドである、態様１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0205】
態様５：前記ω－グリコシドが、ω－グリコシドアルデヒド、ω－グリコシドアルコール及び／若しくは糖脂質、又はこれらの誘導体である、態様１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0206】
態様６：前記好適な基質が、好適な親水性基質と好適な疎水性基質との組み合わせであり、前記好適な親水性基質が、炭水化物及びポリオールを含む群から選択され、前記好適な疎水性基質が、少なくとも６個の炭素の脂肪族鎖長を有するアルコール、脂肪酸、アル
ケン及び／又はアルカンを含む群から選択される、態様１～５のいずれか１つに記載の方法。
ケン及び／又はアルカンを含む群から選択される、態様１～５のいずれか１つに記載の方法。
【0207】
態様７：前記不飽和α，ω－ボラグリコシドが、対称である、態様１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0208】
態様８：前記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ及び機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログを有するように変異されている天然ＳＬ生成真菌株であり、又は、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ、及び、機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログ、及び、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有するように変異されている天然ＳＬ生成真菌株であり、前記のＳＬ生成真菌株が、スタルメレラ（カンジダ）ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）アピコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ａｐｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）マグノリアエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、スタルメレラ（カンジダ）バチスタエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂａｔｉｓｔａｅ）、スタルメレラ（カンジダ）フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ（カンジダ）ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｓｔｅｌｌａｔａ）、スタルメレラ（カンジダ）クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｋｕｏｉ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ）（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及び（スタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）の）ソホロ脂質生成株から選択される好ましくは酵母菌である、態様１～７のいずれか１つに記載の方法。
【0209】
態様９：前記不飽和α，ω－ボラグリコシドが、アセチル化されている、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。
【0210】
態様１０：前記ω－グリコシドが、ω－Ｃ９ソホロシド又はω－Ｃ９グルコシドである、態様７～９のいずれか１つに記載の方法。
【0211】
態様１１：オゾン分解の際、プロトン性求核試薬が溶媒として使用される、態様３～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0212】
態様１２：前記プロトン性求核試薬が水である、態様１１に記載の方法。
【0213】
態様１３：工程ｃ）において得られたω－グリコシドを：アシル化、アルキル化、アミド化、アミン化、アリール化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボニル化、環付加、カップリング反応、エーテル化、エステル化、グリコシル化、ハロゲン化、メタル化、メタセシス、ニトリル形成、オレフィン化、酸化、ホスフィニル化、ホスホニル化、ホスホリル化、４級化、転位反応、還元、シリル化、チオール化、加硫、及びこれらの組み合わせ；を含む群から選択される化学的誘導体化経路に供する工程をさらに含む、態様１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0214】
態様１４：アルキルグリコシドを製造するための方法であって、好適な微生物株により好適な基質（複数可）を転換してアルキルグリコシドを含む培養液を生成することを含み、前記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１若しくはそのホモログ及び機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログを有するように変異されており、又は、前記微生物株が、機能不全のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１、機能不全の脂肪アルコールオキシダーゼＦＡＯ１若しくはそのホモログ、及び、機能不全の、ソホロ脂質生合成経路において第２グルコシル化工程に関与しているグルコシルトランスフェラーゼ、ＵＧＴＢ１若しくはそのホモログ、を有するように変異されており、前記微生物株が、機能不全の、長鎖脂肪アルコールのω－酸化に関与している少なくとも１つの酸化酵素、を有するようにさらに変異されており、前記微生物株が、好ましくは天然ＳＬ生成真菌株、より好ましくは、スタルメレラ（カンジダ）ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）アピコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ）ａｐｉｃｏｌａ）、スタルメレラ（カンジダ）マグノリアエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、カンジダ・グロペンギエセリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、スタルメレラ（カンジダ）バチスタエ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｂａｔｉｓｔａｅ）、スタルメレラ（カンジダ）フロリコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、カンジダ・リオドセンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、スタルメレラ（カンジダ）ステラータ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｓｔｅｌｌａｔａ）、スタルメレラ（カンジダ）クオイ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ （Ｃａｎｄｉｄａ） ｋｕｏｉ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８、シュードハイホジーマ（ロドトルラ、カンジダ）ボゴリエンシス種（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈｏｚｙｍａ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ、及び、スタルメレラ分岐群（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｃｌａｄｅ）のソホロ脂質生成株からなる群から選択される酵母菌である、前記方法。
【0215】
態様１５：前記の長鎖脂肪アルコールのω－酸化に関与している酸化酵素が：配列番号：１０１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ１、配列番号：１０３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ２、配列番号：１０５に記載されているアミノ酸配列を含むＡ３、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列を含むＡ４、配列番号：１０９に記載されているアミノ酸配列を含むＡ５、配列番号：１１１に記載されているアミノ酸配列を含むＡ６及び配列番号：１１３に記載されているアミノ酸配列を含むＡ７；を含む群から選択される、態様１４に記載の方法。
【0216】
参照文献
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Ｉｒｆａｎ，Ｍ．，Ｇｌａｓｎｏｖ，Ｔ．Ｎ．，＆ Ｋａｐｐｅ，Ｃ．Ｏ．（２０１１）．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ ｏｚｏｎｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｃａｌｅ ｒｅａｃｔｏｒ．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１３（５），９８４－９８７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｌ１０２９８４ｈ
Ｋａｌｉｍ Ａｋｈｔａｒａ，Ｍ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．Ｊ．，＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｒ．（２０１３）．Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｆａ
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Ｌｉ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｊ．，＆ Ｓｏｎｇ，Ｘ．（２０１６）．Ａｌｋａｎｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｉｎ Ｓｏｐｈｏｒｏｌｉｐｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ ＣＧＭＣＣ １５７６．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｒｅｖｉｅｗｓ： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５（２），５８－６３．
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【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図16-5】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】