特表 2023-525883 コクシジウム症の治療へのＴＬＲ４モジュレーターの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-19

(54)【発明の名称】コクシジウム症の治療へのＴＬＲ４モジュレーターの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/739 20060101AFI20230612BHJP

   A61P 33/02 20060101ALI20230612BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20230612BHJP

   A23K 10/16 20160101ALI20230612BHJP

   A23K 50/75 20160101ALI20230612BHJP

【ＦＩ】

A61K31/739

A61P33/02 173

A61K35/74 G

A23K10/16

A23K50/75

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022569562

(86)(22)【出願日】2021-05-14

(85)【翻訳文提出日】2022-11-14

(86)【国際出願番号】 US2021032457

(87)【国際公開番号】W WO2021231869

(87)【国際公開日】2021-11-18

(31)【優先権主張番号】17/320,706

(32)【優先日】2021-05-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/024,886

(32)【優先日】2020-05-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522444645

【氏名又は名称】ジボ バイオサイエンス，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー エー．ダール

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム ピー．ファンド

(72)【発明者】

【氏名】エイミー イー．ステフェク

【テーマコード（参考）】

2B005

2B150

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

2B005DA03

2B150AA05

2B150AB10

2B150AC01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA20

4C086GA17

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZB38

4C086ZC64

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC54

4C087MA52

4C087NA14

4C087ZC64

(57)【要約】

疾患に関連することが多い炎症反応を調節することにより、さまざまな疾患を制御する効果的な治療メカニズムが開示されている。 開示された発明概念は、Variovorax 群又は Rhodobacter 群のメンバーの使用によるＴＬＲ４の調節に基づいている。 具体的には、グラム陰性菌Variovorax paradoxusまたは グラム陰性菌Rhodobacter sphaeroidesは、開示された発明概念に従って、炎症反応を低減又は阻害することによる疾患の治療に使用される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グラム陰性菌由来のリポ多糖類を含む有効量の飼料成分を含む、動物におけるコクシジウム症の治療のための組成物。

【請求項2】

前記グラム陰性菌が、Rhodobacter群のメンバーである、請求項1に記載の組成物。

【請求項3】

前記Rhodobacter群のメンバーが、Rhodobacter sphaeroidesである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記グラム陰性菌が、Variovorax群のメンバーである、請求項1に記載の組成物。

【請求項5】

前記Variovorax群のメンバーが、Variovorax paradoxusである、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物が、家禽のコクシジウム症の治療用である、請求項1に記載の組成物。

【請求項7】

グラム陰性菌由来のリポ多糖類を含む、動物におけるＴＬＲ経路の調節のための組成物。

【請求項8】

前記グラム陰性菌由来のリポ多糖類が、ＴＬＲ経路のアゴニストである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記グラム陰性菌が、Rhodobacter群のメンバーである、請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

前記Rhodobacter群のメンバーが、Rhodobacter sphaeroidesである、請求項７に記載の組成物。

【請求項11】

前記グラム陰性菌が、Variovorax群のメンバーである、請求項７に記載の組成物。

【請求項12】

前記Variovorax群のメンバーが、Variovorax paradoxusである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

ＴＬＲ 経路の調節による無症候性又は臨床性コクシジウム症の動物の治療方法であって、無症候性又は臨床性コクシジウム症の治療に有効な量でグラム陰性菌に由来する化合物を含むバイオマスベースの組成物を投与することを含む方法。

【請求項14】

前記バイオマスベースの組成物が、完成飼料１トン当たり約０．５ポンド～約１１．０ポンドの濃度範囲で投与される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記バイオマスベースの組成物が、完成飼料１トン当たり約３．５ポンドの濃度で投与される、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

ＴＬＲ 経路の調節による無症候性又は臨床性コクシジウム症の動物の治療方法であって、無症候性または臨床性コクシジウム症の治療に有効な量で、グラム陰性菌に由来する精製リポ多糖を含む組成物を投与することを含む方法。

【請求項17】

前記組成物が、飲料水１リットル当たり約２．０ｍｃｇ（μｇ）及び約２０．０ｍｃｇ（μｇ）の濃度で投与される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

グラム陰性菌のメンバーに由来するリポ多糖化合物を含む、ＴＬＲ経路の選択的モジュレーターであって、前記グラム陰性菌由来のリポ多糖が、ＴＬＲ経路のアゴニストである、選択的モジュレーター。

【請求項19】

前記グラム陰性菌が、Rhodobacter群のメンバーである、請求項1８に記載の選択的モジュレーター。

【請求項20】

前記グラム陰性菌が、Variovorax群のメンバーである、請求項1８に記載の選択的モジュレーター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１４日に出願された、「コクシジウム症の治療へのＴＬＲ４ 阻害剤の使用」と題する米国仮特許出願第６３/０２４，８８６号の米国非仮特許出願であり、その開示は、参照により本明細書に組込まれる。

【0002】

本発明は、Ｔｏｌｌ受容体４（ＴＬＲ４）及び疾患の治療におけるその調節に関する。 より具体的には、本発明は、ＴＬＲ４の選択的調節へのグラム陰性細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

リポ多糖 (ＬＰＳ) は、多くのグラム陰性菌の外膜に見られる成分である。 Ｔｏｌｌ様受容体 ４ (ＴＬＲ４) は、Ｔｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバーであるタンパク質である。 ＴＬＲ４ は ＬＰＳ を認識し、自然免疫系の活性化につながる炎症誘発性サイトカインの産生と放出を媒介するように刺激される可能性がある。

【0004】

特定の状況下では、ＴＬＲ４ 分子自体を直接活性化又は阻害することによって、又は関連する経路の下流の他の点で、ＴＬＲ４ カスケードを選択的に調節することが望ましい場合がある。 阻害のポイントに関係なく、その結果、炎症誘発性サイトカインの産生が遅くなったり停止したりし、特定の状況下で免疫の健康が改善される。 阻害は、サイトカインの産生と放出を仲介するために必要なシグナル伝達をブロックすることによって達成される。 他の状況では、ＴＬＲ４及び関連する下流経路を選択的に活性化すると、侵入する病原体に対する免疫応答が高まり又は加速され、それによって病気を予防又は闘う動物の能力が高まる可能性がある。

【0005】

炎症誘発性サイトカインの調節は、ヒト及び多くの動物種における特定の疾患の治療及び予防における重要な要素である。 そのような病気の非限定的な例は、家禽産業において一般的で非常に破壊的な病気であるコクシジウム症である。 この疾患は宿主の腸系の損傷を引き起こし、壊死性腸炎などの他の有害な状態に動物をしばしばかかりやすくし、最終的には動物の死に至る可能性がある。 この疾患に対する宿主の炎症反応は、腸の損傷と、壊死性腸炎の原因物質であるClostridium perfringensなどの他の病原体による感染に対する感受性の一因となる。

【0006】

コクシジウム症などの疾患に対する現在の治療計画には、抗生物質、イオノフォア、又は他の化学薬品の使用が含まれる。 しかし、ある程度の成功をもたらす一方で、これらの処置は家禽産業にかなりのコストを追加する。 さらに、家禽産業における抗生物質の過剰使用は、1 つ又は複数の抗生物質に対する耐性の増加に関する懸念を引き起こす。 従って、家禽におけるコクシジウム症などの病原性感染症の非抗生物質ベースの治療法を開発することが望ましい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

開示された本発明の概念は、疾患に通常関連する炎症反応の調節を通じて、多種多様な疾患に対する有効な治療を提供する。 疾患の治療としての開示された発明概念の非限定的な例示的使用は、コクシジウム症などの寄生虫感染の治療におけるコクシジオスタットの代替としての使用である。 調節された炎症反応は、腸バリアの完全性の促進を含む腸の形態の改善をもたらすことがわかっている。家禽の健康の改善は、抗生物質を使用せずに達成された。組成物の送達は、飼料又は飲料水に混合された活性物質の経口投与によって行われる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

開示された発明概念は、Variovorax群のメンバー又はRhodobacter群のメンバーなどのグラム陰性菌株から産生される化合物によるＴＬＲ経路の調節に基づく。具体的には、グラム陰性菌Variovorax paradoxus又はグラム陰性菌Rhodobacter sphaeroidesは、炎症反応を調節することにより、開示された発明概念に従って疾患治療に使用され得る。

【0009】

従って、開示された発明概念は、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を選択的に調節することができる化合物として説明される。 この化合物は、Variovorax群又はRhodobacter群のメンバーに由来するリポ多糖を含む。

【0010】

好ましい実施形態によれば、リポ多糖は、グラム陰性菌Variovorax paradoxusｖ細菌Rhodobacter sphaeroidesに由来する。

【0011】

別の好ましい実施形態によれば、Variovorax paradoxus又はRhodobacter sphaeroidesの一方又は両方に由来するリポ多糖化合物は、家禽の腸の健康を改善するために穀物ベースの飼料内に組み込まれる。

【0012】

本発明をより完全に理解するために、添付の図面を参照する必要がある。 図に示されているように、「Ｎｏ Ｔｘ， Ｎｏ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ」という表示は、意図的にコクシジウム症に感染していない被験動物に処置を施さなかった試験を指す。 「Ｎｏ Ｔｘ， Ｃｏｃｃｉ」という名称は、意図的にコクシジウム症に感染させた対象動物に何の処置も施さなかった試験を指す。 「Ａｎｔｉ－ｃｏｃｃｉ， Ｃｏｃｃｉ」という名称は、対象動物をコクシジウム症に感染させ、その動物に抗コクシジウムを投与した試験を指す。

【0013】

「ＺＩＶＯ Ａ、Ｃｏｃｃｉ」という名称は、対象動物がコクシジウム症に感染し、開示された発明概念による第１の治療組成物が動物に投与された試験を指す。 「ＺＩＶＯ Ｓ、Ｃｏｃｃｉ」という名称は、対象動物がコクシジウム症に感染し、開示された発明概念に従って動物に第２の治療組成物が投与された試験を指す。「ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ, Ｃｏｃｃｉ」という名称は、対象動物がコクシジウム症に感染し、開示された発明概念による第３の治療組成物が動物に投与された試験を指す。 「ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ、Ｃｏｃｃｉ」という名称は、対象動物がコクシジウム症に感染し、開示された発明概念による第４の治療組成物が動物に投与された試験を指す。

【0014】

添付の図は以下のように説明されている：

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、０～７日目までの被験者の飼料換算データを示すグラフである。

【0016】

【図2】図２は、０～１４日目までの被験者の飼料換算データを示すグラフである。

【0017】

【図3】図３は、０～２１日目までの被験者の飼料換算データを示すグラフである。

【0018】

【図4】図４は、０～２８日目までの被験者の飼料換算データを示すグラフである。

【0019】

【図5】図５は、０～４２日目までの被験者の飼料換算データを示すグラフである。

【0020】

【図6】図６は、０～７日目までの被験者死亡率を示すグラフである。

【0021】

【図7】図７は、０～１４日目までの被験者死亡率を示すグラフである。

【0022】

【図8】図８は、０～２１日目までの被験者死亡率を示すグラフである。

【0023】

【図9】図９は、０～２８日目までの被験者死亡率を示すグラフである。

【0024】

【図10】図１０は、０～４２日目までの被験者死亡率を示すグラフである。

【0025】

【図11】図１１は、２１日目に測定された被験者の病変スコアを示すグラフである。

【0026】

【図12】図１２は、４２日目に測定された被験者の病変スコアを示すグラフである。

【0027】

【図13】図１３は、２１日目の被験者の十二指腸ループオーシスト数（グラム／鳥／面積）を示すグラフである。

【0028】

【図14】図１４は、４２日目の被験者の十二指腸ループオーシスト数（グラム／鳥／面積）を示すグラフである。

【0029】

【図15】図１５は、２１日目の被験者の中腸オーシスト数（グラム／鳥／面積）を示すグラフである。

【0030】

【図16】図１６は、４２日目の被験者の中腸オーシスト数（グラム／鳥／面積）を示すグラフである。

【0031】

【図17】図１７は、２１日目の被験者の全盲腸オーシスト数（グラム／鳥／面積）を示すグラフである。

【0032】

【図18】図１８は、４２日目の被験者の全盲腸オーシスト数（グラム／鳥／面積）を示すグラフである。

【0033】

【図19】図１９は、２１日目の被験者のカンピロバクター糞便数を示すグラフである。

【0034】

【図20】図２０は、４２日目の被験者のカンピロバクター糞便数を示すグラフである。

【0035】

【図21】図２１は、２１日目の被験者のカンピロバクター盲腸菌数を示すグラフである。

【0036】

【図22】図２２は、４２日目の被験者のカンピロバクター盲腸菌数を示すグラフである。

【0037】

【図23】図２３は、２１日目の被験者サルモネラ便数を示すグラフである。

【0038】

【図24】図２４は、４２日目の被験者サルモネラ便数を示すグラフである。

【0039】

【図25】図２５は、２１日目の被験者のサルモネラ盲腸菌数を示すグラフである。

【0040】

【図26】図２６は、４２日目の被験者のサルモネラ盲腸菌数を示すグラフである。

【0041】

【図27】図２７は、２１日目の被験者Clostridium perfringensの糞便数を示すグラフである。

【0042】

【図28】図２８は、４２日目の被験者Clostridium perfringensの糞便数を示すグラフである。

【0043】

【図29】図２９は、２１日目の被験者大腸菌糞便数を示すグラフである。

【0044】

【図30】図３０は、４２日目の被験者大腸菌糞便数を示すグラフである。

【0045】

【図31】図３１は、０～４２日目までの被験者の飼料消費量を示すグラフである。

【0046】

【図32】図３２は、０～４２日目までの被験者の平均体重をグラムで示すグラフである。

【0047】

【図33】図３３は、０～４２日目までの１日当たりのグラム数で表した被験者の平均体重増加を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0048】

以下の説明では、さまざまな構成の実施形態について、さまざまな動作パラメータ及び構成要素について説明する。 これらの特定のパラメータ及び構成要素は例として含まれており、限定することを意図したものではない。 特にことわらない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって理解されるように、それらの共通の意味を与えられるべきである。

【0049】

治療に使用される化合物

【0050】

一般的に、組成物の送達は、飼料又は飲料水に混合された活性物質の経口投与によって行われる。 開示された治療方法は、絶対的ではないが好ましくは、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）から一般的に誘導される化合物を利用する。 ブロイラーライフの初期に化合物を投与することにより、免疫調節による病気の予防と治療が達成される。 本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、別の分子、受容体、細胞構造、又は器官によって誘導される活性を低減又は減衰させる分子を指す。例として、宿主免疫細胞の表面に存在するＴＬＲ４などであるが、これに限定されないＴＬＲのＬＰＳ依存性活性化をブロックし得る化合物は、この特定の経路の阻害剤と見なされる。 逆に、「活性剤」又は「アゴニスト」という用語は、別の分子、受容体、細胞構造、又は器官によって誘導される活性を増加又は増強する分子を指す。

【0051】

本明細書で使用する場合、用語「藻類培養物」は、液体培地中で一緒に増殖する藻類生物及び細菌（１つ又は複数のタイプ）として定義される。 特に明記しない限り、「藻類バイオマス」という用語は、藻類細胞及び細菌細胞（液体培養培地を除去したもの）を指す。 「藻類バイオマス」は、湿った材料又は乾燥した材料であり得る。

【0052】

特に明記しない限り、「藻類上清」という用語は、藻類バイオマスから排出された化合物を含む、藻類バイオマスが増殖する培地として定義される。 藻類の上清は、藻類のバイオマスを培養液中で適切な時間増殖させた後、濾過及び/又は遠心分離によって藻類及び細菌細胞を除去することによって得られる。

【0053】

Variovorax 属及び Rhodobacter 属の細菌は、代謝的に多様であることが知られている。 Variovorax は、さまざまな条件下で増殖できるグラム陰性の好気性細菌である。 それはサブクラスのプロテオバクテリアの一部であり、植物や藻類によって生成されたいくつかの天然化合物を代謝的に利用することができる。Rhodobacterは、光合成と化学合成の両方を利用して、さまざまな条件下で増殖できる。 成長は、嫌気的及び好気的条件下でも達成できる。 Rhodobacter sphaeroides は、グラム陰性の通性細菌の代表であり、プロテオバクテリアの α－３亜種のメンバーである。

【0054】

本明細書に記載の疾患の治療に使用される化合物の実施形態には、ＴＬＲ４経路などのＴＬＲシグナル伝達経路の選択的モジュレーターとして使用するための、グラム陰性菌株によって産生される１つ又は複数のＬＰＳ／リピドＡ化合物が含まれる。開示された発明概念は、以下の３つの基本的な工程の任意の組み合わせを含む：(1) グラム陰性菌は ＬＰＳ/リピドＡ 化合物を産生し； （２）ＬＰＳ／脂質化合物は、阻害又は活性化を通じてＴＬＲ４活性を調節し；そして (３) 下流の効果は、ＴＬＲ４シグナル伝達の調節を介して炎症の調節と腸の免疫細胞の動員をもたらし、それによってコクシジウム症、壊死性腸炎、及び腸の炎症に関連するその他の状態の治療に役立つ。

【0055】

１つの実施形態によれば、ＴＬＲ４シグナル伝達経路の選択的モジュレーターとして使用されるＬＰＳ／リピドＡ化合物は、Variovorax paradoxus株から産生される。 Variovorax paradoxus 株は、天然に存在する株である可能性がある。

【0056】

別の実施形態によれば、ＴＬＲ４シグナル伝達経路の選択的モジュレーターとして使用されるＬＰＳ／リピドＡ化合物は、Rhodobacter sphaeroideｓ株から産生される。 Rhodobacter sphaeroides の構造と機能に関して、広範な研究が行われている。 より焦点を絞った研究により、Rhodobacter sphaeroides の光合成特性が調べられた。 Rhodobacter sphaeroides 由来のリポ多糖は、ＬＰＳ／ＴＬＲ４ シグナル伝達をブロックすることによって ＴＬＲ４ を介した炎症を防ぐ、ヒト細胞における有効な ＴＬＲ４ アンタゴニストであることが知られている。 他の種の細胞では、Rhodobacter sphaeroides 由来の ＬＰＳ が ＴＬＲ４ 経路のアゴニストとして機能する。発明者らは、Rhodobacter sphaeroides 由来のＬＰＳ化合物が家禽のコクシジオスタットとして有効であることが証明されたという結論に到達するために、家禽の複数の免疫応答メカニズムに対処するための試験方法を採用した。 初期のデータは、ＬＰＳ様分子による調節を示唆していましたが、Rhodobacter sphaeroides に向けられた特定の試験が、家禽のコクシジウム症の治療など、病気の治療におけるこの細菌の有効性を明らかにするまではなかった。 研究ではさらに、ＴＬＲ４阻害剤とＴＬＲ２の活性化剤 (グラム陰性菌由来のリポタンパク質など) を組み合わせることで、抗コクシジウム症効果が得られることが示された。

【0057】

従って、本開示による疾患の治療に使用される化合物の実施形態は、 ＴＬＲ４シグナル伝達経路の選択的モジュレーターとして使用するための、Variovorax群又はRhodobacter群のグラム陰性菌株によって産生される１つ又は複数のＬＰＳ／リピドＡ化合物に向けられる。開示された発明概念の特定の実施形態は、Variovorax paradoxus株及びRhodobacter sphaeroides株から産生されるＴＬＲ４シグナル伝達経路の選択的調節因子として使用されるＬＰＳ／リピドＡ化合物の使用を対象とする。

【0058】

本明細書で使用されるＬＰＳ／リピドＡ化合物は、Variovorax paradoxus株及び／又はRhodobacter sphaeroides株から任意の適切な方法によって得ることができるが、特定の実施形態では、以下のような標準的な多段階ＬＰＳ抽出プロトコルを使用して抽出される：（１） フェノール／グアニジンチオシアネートの溶液で凍結乾燥細菌を抽出し、凍結乾燥のために水層を集め；(２)凍結乾燥画分を水に再溶解し； (３) 可溶化画分を限外濾過して低分子量物質と塩類を除去し；（４）Ａｆｆｉ-ｐｒｅｐポリミキシンマトリックス材料（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）などのポリミキシンＢ樹脂カラムを使用して高分子量画分をアフィニティー精製し、そこから活性画分を１％デオキシコール酸で溶出し、場合によっては；(５) サイズ排除クロマトグラフィーを使用して追加の精製を行う。

【0059】

いくつかの例では、細菌からＬＰＳ化合物を得るために複数のタイプのＬＰＳ抽出プロトコルが使用され、抽出手順は２回以上実施され得る。 ＬＰＳ化合物が細菌から抽出され、精製されると、リピドＡ画分は、酸加水分解又は他の適切な技術によって調製され得る。

【0060】

Variovorax paradoxus や Rhodobacter sphaeroides などのグラム陰性細菌株に由来する 1 つ又は複数の ＬＰＳ/リピド Ａ 化合物は、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を選択的に調節して、炎症反応を調節し、さまざまな用途や用途で免疫の健康を改善する可能性がある。 １つの実施形態によれば、Variovorax paradoxus又はRhodobacter sphaeroidesに由来するＬＰＳ／リピドＡ化合物は、家禽の腸の健康を改善するために穀物ベースの飼料内に組み込まれてもよい。

【0061】

Variovorax paradoxus又はRhodobacter sphaeroidesに由来する開示されたＬＰＳ/リピドＡ化合物は、様々な機序を通じて家禽の健康を改善するために使用され得る。 例えば、阻害剤として作用する場合、ＬＰＳ/リピド Ａ化合物は、典型的な炎症カスケードにおける ＴＬＲ４ 発現のダウンレギュレーション及び下流の ＮＦ－κＢ 活性化の阻害を介して炎症性メディエーターを負に調節することにより、家禽の内部炎症から保護する可能性がある。 別の例では、ＬＰＳ／リピドＡ化合物は、システイン残基媒介受容体二量体化を妨害することによって、家禽におけるＴＬＲ４の活性化を阻害し得る。さらに別の例では、ＬＰＳ／リピドＡ化合物は、非感染性及び感染性刺激がＴＬＲ４と相互作用して炎症誘発性応答を誘発する能力を阻害し、それによって家禽の腸の完全性を改善することができる。 あるいは、ＴＬＲ４ 経路のアゴニストとして働く場合、ＬＰＳ/リピドＡ化合物は、病気の攻撃に先立って特定の病気と闘う免疫細胞を腸組織に動員することにより、侵入する病原体に対するより良い応答をするように免疫系を刺激し、それにより、その後の病原体への曝露に対する免疫応答が加速及び強化される。

【0062】

特定の処置化合物

【0063】

開示された処置化合物は、上記の細菌株を含む１つ以上の淡水藻類バイオマスに基づく。 より具体的には、藻類バイオマスは、Variovorax paradoxus株又はグラム陰性Rhodobacter sphaeroides株などのグラム陰性菌を含み得る。

【0064】

前述のように、４つの治療用化合物が提示され、検討されている。 これらの化合物は、上記の藻類バイオマスの共通の特徴を共有しており、動物の治療に使用されている。 藻類バイオマスベースの製品は、トウモロコシやトウモロコシ大豆ミール（ＳＢＭ）などの配合飼料で動物に与えられるか、飲料水で提供される。 言及したように、特定の治療組成物には、「ＺＩＶＯ Ａ」、「ＺＩＶＯ Ｓ」、「ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ」、及び「ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ」が含まれる。

【0065】

ＺＩＶＯ Ａ処置化合物

【0066】

ＺＩＶＯ Ａ処置化合物は、大豆油などの飼料添加物と組み合わせて動物飼料として提供されるグラム陰性菌を含む淡水藻類バイオマスであり、好ましくは土壌油２部対藻類バイオマス１部の比率であるが、これに限定されない。 バイオマスと飼料添加物が好ましいプレミックスレベルまで混合されると、混合されたバッチは、最終飼料を含むリボンミキサーに均一に注がれるか又は投与される。組み合わされたバッチは、好ましくは完成飼料１トン当たり約０．５ポンド～約１１．０ポンドの間の量で提供され、排他的ではないが、より好ましくは無駄を伴わずに良好な効率で飼料１トン当たり約３．５ポンドの量で提供される。一般的に、ＺＩＶＯ Ａ 治療化合物を使用した治療は、４２ 日間で １羽当たり約 ７００ｍｇである。

【0067】

ＺＩＶＯ S処置化合物

【0068】

ＺＩＶＯ Ｓ処置化合物は、液体の藻類の上清である（淡水藻類の成長後に収集された培養液を表す）。 ＺＩＶＯ Ｓ処置化合物は、動物が消費するために飲料水で希釈した ５００ｘ 液体藻類上清であることが好ましく、絶対的ではないが、５００ｘ ストックの ４００ｍｃｌの量が飲料水１ リットルに加えられ、完全に混合される。 一般的に、ＺＩＶＯ Ｓ 治療化合物を使用した治療は、１羽あたり ４２ 日間で約９ｇである。

【0069】

ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ 及びＴ－ｌｏｗ ＬＰＳ処置化合物

【0070】

ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ及びＴ－ｌｏｗ ＬＰＳ 治療化合物には、Rhodobacter sphaeroides 由来の精製リポ多糖を表す ＬＰＳ－ＲＳ と、Variovorax paradoxus 由来の精製リポ多糖を表す ＬＰＳ－ＶＰ の両方が含まれている。 一般的に、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ 又は Ｔ－ｌｏｗ 治療用化合物を使用した治療は、１ 羽あたり４２ 日間で約２０ｍｇである。 ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ ＬＰＳ 治療化合物は、５ｍｇ の凍結乾燥製品を含むバイアルで提供される。可溶化後は冷蔵保存（４℃）で１ヶ月間安定である。 必要に応じて、エンドトキシンを含まない水１ｍＬを加えて各バイアルを可溶化し、３０ 秒間、又は目視で完全に可溶化されるまでボルテックスする。 最良の結果を得るために、必要になるまでＴ－ｈｉ治療組成物を冷凍庫（－２０℃）に保存する。

【0071】

ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ ＬＰＳ－ＲＳ 処置化合物の場合、可溶化製品を水１リットル当たり ４ ｍｃＬ (つまり、０．００４ｍＬ／Ｌ) の割合で水に加え、十分に混合する。 ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ ＬＰＳ－ＲＳ 治療組成物、「低用量」治療グループの場合、可溶化製品を水 １ リットル当たり０．４ｍｃＬ(すなわち、０．０００４ｍＬ／Ｌ) の割合で水に加え、十分に混合する。

【0072】

「中間」原液は、飲料水中の精製リポ多糖の最終製品濃度が それぞれ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ 及び ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗグループで ２０ ｍｃｇ／Ｌ 及び ２ ｍｃｇ／Ｌ であるという条件で、より便利な移動容量を考慮して調製することができる。

【実施例】

【0073】

研究

【0074】

様々な治療用化合物の応答及び有効性を決定するために研究が行われた。 ペレット飼料は、トウモロコシ－大豆飼料タイプの市販の配給製剤を使用して、ＺＩＶＯ Ａ処置化合物に採用された。 ＺＩＶＯ Ｓ 治療化合物と ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ 及び Ｔ－ｌｏｗ ＬＰＳ－ＲＳ 治療化合物を含む２つの試験物質も飲料水で投与した。

【0075】

研究－処置方法

【0076】

合計 ２，１８４ 羽の雌雄混合ブロイラーヒナが、０ 日目 (孵化及び配置日) に、糞便に汚染された鶏群から孵化後 １２ 時間以内に得られた。 多数の雄雌混合のブロイラーヒヨコ (性比 ５０：５０) を、０ 日目に個別の体重によっていくつかの試験群の囲いの １ つに無作為に割り当て、それぞれに複製を作成した。 抗生物質を含まない鳥のみが調達され、孵化場又は研究中のいかなる時点でも、コクシジウム症ワクチンは投与されなかった。 ひよこは、研究結果に影響を与える可能性のある疾患又はその他の合併症の徴候について、受領時に評価された。 弱い鳥は人道的に犠牲にした。 試験中、鳥の交換は行わなかった。

【0077】

検査の後、ヒヨコの体重を測定し、無作為化されたブロック デザインを使用して、さまざまな処置グループの囲いに割り当てた。 投与前に、個々の試験群の平均の標準偏差を対照群の標準偏差と比較することにより、治療群全体の体重分布を評価した。 対照群と試験群の間の差が標準偏差の １以内である場合、群全体の体重分布はこの研究で許容できると見なされた。

【0078】

処置グループ－治療グループ、試験物質のレベル、複製数、鳥の複製数、及び投与経路は、次のように確立された。

【表1】

【0079】

全ての鳥は、栄養的に十分な食物又は飲み物の化合物を与えられた。 鳥は、孵化の日から４２日歳(米国におけるブロイラー ニワトリの典型的な平均市場齢) まで、それぞれの処置食餌を自由に与えられた。 鳥は、家禽生産で典型的に経験されるストレス条件をさらに模倣するために、溜まったゴミで飼育された。

【0080】

ＺＩＶＯ Ａ 処置化合物については、各製剤期間の開始時に飼料の重量を量り、次の３段階で給餌した: スターター飼料 (生後 ０ ～２１日歳)、グローワー飼料 (生後 ２２ ～３５日歳)、フィニッシャー飼料 (生後３６～４２日齢）。 飼料は、研究期間全体にわたってペレットとして与えられた (ペレットは０ ～ ２１日目にクランブルとして提供された)。 ７日目の球菌チャレンジ前の球菌接種鳥の８時間の絶食期間を除いて、すべての治療複合食は完全給餌の制限なしに自由に与えられた。

【0081】

７日目及び７日齢 (試験 ０日目 ＝ 孵化及び配置日) に、全ての鳥の平均で１００％ の充填能力の割合で消費するために、適切な飼料を正確に計量した。 これは、前日の ２４ 時間以内に消費された飼料の量を各ペンで測定することによって決定された。 また、７日目には、チャレンジ群の全ての鳥に、Eimeria acervulina、Eimeria maxima、及び Eimeria tenella の混合物を含むオーシストを接種した餌を与えた。特に、鳥は、E．acervulinaの鳥当たり １００，０００ のオーシスト、E. maximaの鳥当たり ５０，０００ のオーシスト、及び E. tenellaの鳥当たり ７５，０００ のオーシストの混合物を含む栄養を受け取った。

【0082】

球菌挑戦モデル－全ての挑戦生物は、５０♯ミキサーを使用して、約１０分間の十分な混合時間でスターター 飼料に混合された。挑戦の前に、球菌を接種した全ての鳥を８時間絶食させた。 鳥には接種飼料を与えた。 ２時間後、残っている全ての接種済み飼料を取り出し、１羽当たりと １羽当たりの消費量が等しくなるように秤量した。 飼料の量（配置と回収の両方）は、各ペンの飼料記録に記録された。

【0083】

研究全体を通して、鳥の全体的な健康状態、行動、及び毒性の証拠について、少なくとも １ 日３ 回観察した。 ペンは、温度、照明、水、飼料、ごみの状態、及び予想外の鶏舎の状態/出来事を含む環境条件について監視された。 ペンの死亡率を毎日チェックした。 検査は、死亡又は瀕死状態で発見されたすべてのブロイラーで実施された。死亡率を記録し（日付と体重）、そして検査した（内部及び外部の両方の体重）。 研究全体を通して、商業生産に関連するストレス誘発性の健康リスクをシミュレートするために、地元の養鶏場から入手した少なくとも３つの以前の鶏群からの蓄積されたゴミで鳥を飼育した。

【0084】

サンプル収集スケジュール－調査は、次の収集スケジュールに従っている：

【表2】

【0085】

研究評価

【0086】

未処置の鳥と病気にかかっていない鳥、未処置の病気の鳥、０日から４２日間の様々な期間にわたって従来の抗生物質で処置された病気の鳥、及び異なる本発明の化合物で処置された病気の鳥との間の違いを、図 １ ～３３に示すグラフに示す。グラフは、飼料換算率（ＦＣＲ）、死亡率、病変スコア、十二指腸ループオーシスト数、中腸オーシスト数、全盲腸オーシスト数、さまざまな糞便数（カンピロバクター、サルモネラ菌、ウェルシュ菌、大腸菌）、平均体重、飼料消費率、及び平均体重増加に向けられる。

【0087】

飼料転換 － 図 １ ～５に示すように、０～ ７、０～１４、０～２１、０～２８、及び０～４２ 日について、死亡率を補正した飼料転換率を測定し、そして報告した。開示された本発明の化合物は、未処置及びコクシジウム症に罹患した群と比較した場合、一貫して改善された結果を提供した。 最も注目に値するのは、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ 処置化合物の適用によって達成された肯定的な結果であり、全てのサンプリングで抗生物質で処置された感染鳥よりも改善を示している。

【0088】

死亡率 － 図６～１０に示すように、死亡率は０～７日、０～１４日、０～２１日、０～２８日、及び０～４２日について計算された。 全ての年齢期間にわたって、未処置群と罹患群の死亡率は、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及び ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ で処置された群より一貫して高かった。０日目～７日目（図６に示す）では、死亡率の差は比較的劇的であり、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ群によって顕著な改善が示された。 経時的に、０日目から４２日目までに最も鮮明に（図１０に示される）、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及びＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗで処置された群のすべてが、未処置及び病気の鳥と比較して死亡率を有意に低下させた。

【0089】

病変スコアリング－２１ 日目と４２日目に、肉眼的剖検と病変スコアリングを実施した。鳥を選択し、犠牲にし、体重を測定し、コクシジウム病変の存在と程度、及び腸内層のスラッフィングの量を調べた。図１１及び１２に示すように、ＣＥＣＡ損傷スコアを評価し、そして記録した。４２日目までに、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及びＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗで処置したすべての群にわたって病変スコアが有意に減少した。

【0090】

オーシスト スコア－動物のさまざまな場所で ２１ 日目と ４２ 日目に肉眼的剖検とオーシスト スコアリングを実施した。以前にオーシストを接種した鳥を選択し、犠牲にし、体重を測定し、十二指腸ループ、中腸、及び盲腸全体におけるオーシストの存在と程度を調べた。 研究の結果を図１３～１８に示す。それぞれ、図１３及び１４の２１日目及び４２日目の十二指腸ループオーシスト数に関して、４２日目まで、十二指腸ループオーシスト数は、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及びＺＩＶＯ T-lowで処置された群にわたって比較的変化しないままであった。中腸オーシストは、図１５及び１６に示されるようにほとんど変化を示さず、図１７及び１８に示されるように全盲腸数について同様の結果を示した。

【0091】

細菌－上記のように、コクシジウム症は動物の腸に損傷を与えるため、細菌感染や壊死性腸炎などの結果的な病気の急速な発症の素因となることが良くある。家禽は、カンピロバクター、サルモネラ菌、ウェルシュ菌、大腸菌などのさまざまな細菌に感染しやすい。 図１９～３０に示されるように、盲腸及び糞便からのサンプルを、２１日目及び４２日目の両方で細菌の存在について評価した。 腸及び糞便のサンプルを分析して、総好気性プレート数（ＡＰＣ）を決定した。

【0092】

カンピロバクターに関するデータに関して、図１９及び２０は、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及びＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ処置されたすべての動物において糞便数が一般的に低下したことが分かる２１日目と４２日目の差異を示している。同じことが、図２１及び２２に示されるカンピロバクター盲腸カウントの結果に関して一般的に当てはまる。

【0093】

サルモネラ菌に関するデータに関して、図２３及び２４は、２１日目と４２日目との間の差異を示しており、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及びＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗで処置されたすべての動物において糞便数が一般的に低下したことが分かる。図２５及び２６に示されるサルモネラ盲腸カウントの結果に関して、同じ結果が一般に当てはまる。

【0094】

ウェルシュ菌に関するデータに関して、図２７及び２８は、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及びＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗで処置された全ての動物において糞便数が一般的に低下したことが分かる２１日目と４２日目の差異を示す。

【0095】

大腸菌に関するデータに関して、図２９及び３０は、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、及びＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉで処置された全ての動物において糞便数が一般的に低下したことが分かる２１日目と４２日目の差異を示しているが、 しかし、ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ で処置した動物では効果が低かった。

【0096】

ライブ パフォーマンス評価－ライブ パフォーマンス パラメーターは、研究全体を通して毎週記録された。ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及び ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ で処置されたグループは、すべての年齢範囲で、体重増加、飼料効率、及び死亡率において、未処置及びコクシジウム症に罹患したグループよりも優れていたという事実によって証明されているので、図３１～３ に示されるように、疾病挑戦環境 (球菌挑戦＋ 溜まったゴミ) が効果的に使用された。

【0097】

飼料消費 －図３１に示すように、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及び ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ で処置したグループでは、未処置及びコクシジウム症に罹患したグループと比較して、飼料消費が一貫して改善された。

【0098】

体重評価 － 図３２及び３３に示すように、研究の０日目～４２日目までの個々の体重をグラム単位及びグラム/日単位でそれぞれ記録した。 全ての年齢期間にわたって、ＺＩＶＯ Ａ、ＺＩＶＯ Ｓ、ＺＩＶＯ Ｔ－ｈｉ、及び ＺＩＶＯ Ｔ－ｌｏｗ で処置されたグループの平均体重と平均体重増加は、未処置及びコクシジウム症に罹患したグループと比較して有意に増加した。

【0099】

結果

【0100】

一般的に、結果の分析は、コクシジウム症に感染した家禽の治療に革新的な化合物を使用すると、治療を受けていない家禽と比較して、病気の家禽の健康状態が大幅に改善されるという結論を支持している。 以下に示す肯定的な結果は、開示された発明概念の組成物の異なる細菌バリエーションで確認された。

【0101】

結果は次のように要約される:

【0102】

ＦＣＲは、開示された組成物で処置されたサンプル家禽において、処置されていない病気にかかった鳥と比較して改善を示した。

【0103】

死亡率は、開示された組成物で処置されたサンプル家禽において、０日目から７日目以降、未処置の病気にかかった鳥と比較して劇的に減少した。 研究期間中、死亡率は概して低いままであった。

【0104】

屠殺されたサンプル鳥の検査により、開示された組成物で処置されたサンプル家禽の十二指腸及び盲腸の両方の平均病変スコアは、屠殺された未処置の病気にかかった鳥のスコアよりも低いことがわかった。

【0105】

屠殺した鳥のサンプルを調べると、開示された組成物で処置された鳥のサンプルの十二指腸、中腸、及び盲腸の平均オーシスト数は、犠牲にされた未処置の病気にかかった鳥のスコアよりも低いことがわかった。

【0106】

カンピロバクター、サルモネラ菌、ウェルシュ菌、及び大腸菌などのさまざまな細菌の存在が、未処置の鳥と比較して、処置された鳥では一般的に減少していることがわかった。

【0107】

開示された組成物で処置されたサンプル家禽の平均体重は、未処置の病気にかかった鳥の平均体重よりも大きい。

【0108】

開示された本発明の組成物による処置の結果として、病気にかかった家禽の全体的な健康状態の改善は、抗生物質を使用することなく達成された。

【0109】

全体として、本発明の組成物は、動物の病状の処置に対する費用効果が高く実用的なアプローチを示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【国際調査報告】