特表 2023-525936 ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、その調製方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-19

(54)【発明の名称】ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、その調製方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/50 20060101AFI20230612BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20230612BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230612BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230612BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230612BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230612BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230612BHJP

【ＦＩ】

C12N15/50 ZNA

A61K39/215

A61K31/7105

A61P31/14

A61P37/04

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022571198

(86)(22)【出願日】2021-05-14

(85)【翻訳文提出日】2022-12-02

(86)【国際出願番号】 CN2021093741

(87)【国際公開番号】W WO2021233213

(87)【国際公開日】2021-11-25

(31)【優先権主張番号】202010419984.2

(32)【優先日】2020-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522452787

【氏名又は名称】康希諾（上海）生物科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】朱涛

(72)【発明者】

【氏名】王浩猛

(72)【発明者】

【氏名】李▲じん▼

(72)【発明者】

【氏名】晏巧玲

(72)【発明者】

【氏名】▲しぇん▼春林

(72)【発明者】

【氏名】邵忠▲き▼

(72)【発明者】

【氏名】李軍強

(72)【発明者】

【氏名】宇学峰

(72)【発明者】

【氏名】巣守柏

【テーマコード（参考）】

2G045

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA37

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC08

4C085CC40

4C085EE01

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA06

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB33

(57)【要約】

本発明は、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、及びｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物を含むｍＲＮＡワクチンを提供する。前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、を含む。本発明はまた、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物及びｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物を含むｍＲＮＡワクチンの、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患を予防及び／又は治療する医薬品（特にワクチン）の調製における使用を提供する。
【選択図】図１８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、を含むことを特徴とするｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項2】

前記新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは、同一のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株又は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来することを特徴とする請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項3】

前記Ｓタンパク質又はそのバリアントは野生型全長Ｓタンパク質又は融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質を含み、好ましくは、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は６８２ＲＲＡＲ６８５位突然変異を含む、及び／又は９８６ＫＶ９８７位を突然変異して、Ｓタンパク質を融合前立体構造として固定化し、さらに好ましくは、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は野生型全長Ｓタンパク質の６８２ＲＲＡＲ６８５をＧＳＡＧに突然変異した、及び／又は９８６ＫＶ９８７をＰＰに突然変異したものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項4】

前記野生型全長Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２若しくは１５と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項３に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項5】

前記Ｓタンパク質又はそのバリアントは、シグナルペプチドを含まない、野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むか、又は野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むとともに、そのシグナルペプチドの前に強いシグナルペプチドを追加し、前記強いシグナルペプチドは好ましくは組織プラスミノーゲンアクチベータのシグナルペプチド又は血清免疫グロブリンＥのシグナルペプチドであることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項6】

前記ＲＢＤのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３若しくは１３と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項7】

前記ＲＢＤ又はそのバリアントは、シグナルペプチドを含まない、野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むか、又は野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むとともに、そのシグナルペプチドの前に強いシグナルペプチドを追加し、前記強いシグナルペプチドは好ましくは組織プラスミノーゲンアクチベータのシグナルペプチド又は血清免疫グロブリンＥのシグナルペプチドであることを特徴とする請求項１又は６に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項8】

前記新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは、個別の２本のｍＲＮＡ配列又は１本に連結されたｍＲＮＡ配列であることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項9】

１本に連結されたｍＲＮＡ配列では、５’から３’への連結順序は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列にＳタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列が続くか、又は、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列に新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列が続き、好ましくは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは内部リボソーム進入部位により連結され、前記内部リボソーム進入部位は、小ＲＮＡウイルス、コレラウイルス、ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、豚熱ウイルス、マウス角膜白斑ウイルス、サル免疫不全ウイルス又はコオロギ麻痺ウイルスから選ばれることを特徴とする請求項８に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項10】

前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は、５’キャップ構造、５’非コード領域及びポリアデニル酸テールをさらに含むことを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項11】

前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、３’保存配列要素及び３’非コード領域のうちの１種又は２種以上の組み合わせをさらに含むことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項12】

前記ｍＲＮＡは従来のｍＲＮＡ、自己増幅型ｍＲＮＡ又はトランス増幅型ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１～１１のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項13】

新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とを連結した１本のｍＲＮＡ配列を含み、このｍＲＮＡ配列は、
Ａ）５’キャップ構造、５’非コード領域、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｂ）５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｃ）５’キャップ構造、５’非コード領域、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｄ）５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｅ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｆ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｇ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、又は
Ｈ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列のいずれか１群であることを特徴とする請求項１～１２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項14】

２本のｍＲＮＡ配列の組み合わせを含み、この２本のｍＲＮＡ配列は、
ａ）５’キャップ構造、５’非コード領域、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｂ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｃ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｄ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｅ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、又は
ｆ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせのいずれか１群であることを特徴とする請求項１～１２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項15】

前記ＲＮＡ複製酵素コード領域はαウイルス、小ＲＮＡウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス及びカリシウイルスから選ばれることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物を含むことを特徴とするｍＲＮＡワクチン。

【請求項17】

前記ｍＲＮＡワクチン中の新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡと、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡとの質量比が（１～５）：（１～５）であることを特徴とする請求項１６に記載のｍＲＮＡワクチン。

【請求項18】

前記ｍＲＮＡワクチンはカチオン又はポリカチオン化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１６又は１７に記載のｍＲＮＡワクチン。

【請求項19】

前記ｍＲＮＡワクチンは脂質をさらに含むことを特徴とする請求項１６～１８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。

【請求項20】

前記ｍＲＮＡワクチンはリポソーム、脂質複合体又は脂質ナノ粒子であることを特徴とする請求項１６～１９のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。

【請求項21】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物とカチオン又はポリカチオン化合物とを混合したものを脂質でパッケージングすることを含むことを特徴とするｍＲＮＡワクチンの調製方法。

【請求項22】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物又は請求項１６～２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチンの使用であって、前記使用は、
Ａ）新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患を予防及び／又は治療する医薬品の調製における使用、又は、
Ｂ）抗新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染薬の調製における使用を含み、
好ましくは、前記新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患はＣＯＶＩＤ－１９であることを特徴とする使用。

【請求項23】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又は請求項１６～２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチンを対象に投与することを含むことを特徴とする抗体スクリーニング方法。

【請求項24】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又は請求項１６～２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチンを対象に投与することを含むことを特徴とする対象の中和抗原特異的免疫応答の誘導方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ワクチンの開発の技術分野に関し、具体的には、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とを含む。本発明は、１種又は２種のｍＲＮＡを含む組成物、及び前記ｍＲＮＡ又は組成物の、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防及び／又は治療する医薬品（特にワクチン）の調製における使用に関する。

【背景技術】

【0002】

コロナウイルスはセグメント無しの一本鎖正鎖ＲＮＡウイルスであり、ニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）オルトコロナウイルス亜科（Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）に属し、コロナウイルス亜科は血清型とゲノムの特徴によりα、β、γ、δの４つの属に分類される。これまでに、α属の２２９ＥとＮＬ６３、β属のＯＣ４３とＨＫＵ１、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳｒ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ）、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の合計７種類のコロナウイルスがヒトに感染している。このうち後者の３つだけが、深刻な人間の疾患や死に至ることになる。

【0003】

コロナウイルスはエンベロープがあり、粒子は円形や楕円形をしており、多形性であるものが多く、直径は通常５０～２００ｎｍである。Ｓタンパク質はウイルスの表面に位置して棒状構造を形成し、ウイルスの主要な抗原タンパク質の一つとして、タイピングに用いられる主要な遺伝子である。Ｎタンパク質はウイルスゲノムを包み込み、診断抗原として有用である。コロナウイルスの理化学的特性に対する理解の多くはＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶの研究によるものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶの全長Ｓタンパク質に基づいて設計されたワクチンは大量の非中和抗体を誘導し、動物モデルでウイルス攻撃に失敗し、深刻な副反応を引き起こし、例えば発病率を増加させ、肝部組織の強い炎症反応と肝損傷を引き起こすことが報告されている（文献：「Evaluation of modified vaccinia virus ankara based recombinant SARS vaccine in ferrets」，Vaccine 23，2273-2279.を参照）。そのため、ワクチン設計において免疫優位性を持つ非中和エピトープの暴露を避けることはワクチンの安全性を保障する基礎である。

【0004】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤは高度に類似した１つのコア構造と違いが非常に大きい１セグメントの受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）との２つの部分から構成されている。ＲＢＭの違いにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶはそれぞれ異なる受容体を認識する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶはアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を認識し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶはジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）を認識する。

【0005】

現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶワクチンの研究開発に関わるワクチンプラットフォームは、ウイルスベクターワクチン、ＤＮＡワクチン、サブユニットワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチン、全ウイルス不活化ワクチン及び弱毒化ワクチンがある。

【0006】

全ウイルス不活化ワクチンは、理論上、迅速に生産して新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の爆発に対応できるが、ウイルスの培養には生物安全性３級実験室が必要で、ワクチン企業は一般的にその生産要求を満たすことが難しい一方、安全性にも問題があるかもしれないが、研究開発中のＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶの全ウイルス不活化ワクチンはいずれもマウスモデルでウイルスを攻撃した後、肺部にアレルギー病理現象を発見することが報告されている（文献：「Immunization with inactivated middle east respiratory syndrome coronavirus vaccine leads to lung immunopathology on challenge with live virus」，Hum. Vaccin. Immunother. 12，2351-2356.を参照）ため、全ウイルス不活化ワクチンの形式はＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの研究開発に最適な選択ではない。

【0007】

高齢者や免疫力が低下した人もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の宿主であり、弱毒化生ワクチンプラットフォームで製造されたワクチンは高齢者や免疫力が低下した対象には適さないため、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの研究開発には適さない。

【0008】

ＤＮＡワクチンとウイルスベクターワクチンはいずれもＤＮＡをワクチン接種者の細胞内に送達して発現することであり、例えばアデノウイルスベクターワクチンに基づいたワクチンは現在、ゲノムに組み込まれて組み換えられたという報告がないが、この可能性を完全に排除することはできず、依然として一定の安全リスクがある。サブユニットワクチンとＶＬＰワクチンは最適化発現、精製方法を確立する必要があり、しかも一般的に適切なアジュバントを必要とし、このため、研究には数年間の時間がかかり、急速に発展する疫病に対応することは難しい。

【0009】

近年ＲＮＡ分子分野の関連技術が画期的に進展し、ｍＲＮＡワクチンはインフルエンザウイルス、エボラウイルスやジカウイルスなど多くの感染症で一定の研究成果を遂げており、ｍＲＮＡワクチンはｍＲＮＡを細胞に送達し、タンパク質を発現・産生することで、生体に免疫保護を付与する。従来の組換えタンパク質ワクチン、不活化ワクチンや弱毒化ワクチンと比べ、ｍＲＮＡワクチンの調製ステップは簡単で、伝染性疾患の制御に対して重大な意義がある。また、ｍＲＮＡワクチンは従来の組み換えワクチンよりも高温により強く、またより安定している。また、ｍＲＮＡワクチンは強力なＣＤ４＋やＣＤ８＋のＴ細胞応答を引き起こすことができ、ＤＮＡ免疫接種と異なり、ｍＲＮＡワクチンは１、２回の低用量接種で抗体を動物体内で産生することができる。

【0010】

したがって、本発明は、他のワクチンプラットフォームの欠点を回避し、安全で信頼性の高いｍＲＮＡワクチンを提供する。

【発明の概要】

【0011】

本発明の第１態様は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質（スパイクタンパク質）又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ（受容体結合ドメイン）又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、を含むｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物を提供する。

【0012】

前記新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは、同一のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株又は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来する。

【0013】

好ましくは、前記Ｓタンパク質又はそのバリアントは、野生型全長Ｓタンパク質又は融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質を含む。

【0014】

さらに好ましくは、安定立体構造であり、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は６８２ＲＲＡＲ６８５位突然変異を含む、及び／又は９８６ＫＶ９８７位を突然変異して、Ｓタンパク質を融合前立体構造として固定化する。最も好ましくは、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は野生型全長Ｓタンパク質の６８２ＲＲＡＲ６８５をＧＳＡＧに突然変異した、及び／又は９８６ＫＶ９８７をＰＰに突然変異したものである。

【0015】

また、従来の特許で開示された一部の内容も本発明の技術的解決手段をサポートし、例えば、第１セグメントのヘプタペプチドリピート領域に近づく、又は第１セグメントヘプタペプチドリピート領域において１つ又は２つのアミノ酸をプロリンに変更することは立体構造を極めて効率的に安定化することができる（出願番号２０２０００６１１８５、ＰＲＥＦＵＳＩＯＮ ＣＯＲＯＮＡＶＩＲＵＳ ＳＰＩＫＥ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ａｎｄ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥの米国特許を参照）。

【0016】

本発明の１つの特定実施形態では、前記野生型全長Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。

【0017】

本発明の１つの特定実施形態では、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２若しくは１５と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。

【0018】

好ましくは、前記Ｓタンパク質又はそのバリアントは、シグナルペプチドを含まない、野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むか、又は野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むとともに、そのシグナルペプチドの前に強いシグナルペプチドを追加し、前記強いシグナルペプチドは好ましくは組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）のシグナルペプチド又は血清免疫グロブリンＥ（ｌｇＥ）のシグナルペプチドである。

【0019】

本発明の１つの特定実施形態では、シグナルペプチドを含まない野生型２０１９－ｎＣｏＶ Ｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。

【0020】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ＲＢＤのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は１３と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。

【0021】

好ましくは、前記ＲＢＤ又はそのバリアントは、シグナルペプチドを含まない、野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むか、又は野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むとともに、そのシグナルペプチドの前に強いシグナルペプチドを追加し、前記強いシグナルペプチドは好ましくは組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）のシグナルペプチド又は血清免疫グロブリンＥ（ｌｇＥ）のシグナルペプチドである。

【0022】

本発明の１つの特定実施形態では、ＩｇＥシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、９－１１のいずれか１つに示される。

【0023】

好ましくは、前記ｍＲＮＡはモノシストロン、ビスシストロン又はポリシストロンｍＲＮＡである。前記ビスシストロン又はポリシストロンｍＲＮＡは２つ以上のコード領域を含有するｍＲＮＡである。

【0024】

好ましくは、前記新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは、個別の２本のｍＲＮＡ配列又は１本に連結されたｍＲＮＡ配列である。

【0025】

さらに好ましくは、１本に連結されたｍＲＮＡ配列では、５’から３’への連結順序は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列にＳタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列が続くか、又はＳタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列に新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列が続く。よりさらに好ましくは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により連結される。

【0026】

ここでは、前記ＩＲＥＳは２つのコード領域を隔てることに用いられてもよい。

【0027】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ＩＲＥＳ配列は、小ＲＮＡウイルス（例えばＦＭＤＶ）、コレラウイルス（例えばＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（例えばＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（例えばＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（例えばＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（例えばＨＣＶ）、豚熱ウイルス（例えばＣＳＦＶ）、マウス角膜白斑ウイルス（例えばＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（例えばＳＩＶ）又はコオロギ麻痺ウイルス（例えばＣｒＰＶ）を含むが、これらに限定されるものではない。

【0028】

好ましくは、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は５’キャップ構造、５’非コード領域及びポリアデニル酸テールをさらに含む。

【0029】

さらに好ましくは、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、３’保存配列要素及び３’非コード領域のうちの１種又は２種以上の組み合わせをさらに含む。

【0030】

好ましくは、前記ｍＲＮＡは従来のｍＲＮＡ、自己増幅型ｍＲＮＡ又はトランス増幅型ｍＲＮＡである。

【0031】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡは従来のｍＲＮＡであり、即ち、前記ｍＲＮＡは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列に加えて、５’キャップ構造、５’非コード領域、３’非コード領域及び／又はポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡ配列をさらに含む。

【0032】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡは自己増幅型ｍＲＮＡであり、即ち、前記ｍＲＮＡは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列に加えて、５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるものをさらに含む。ここでは、使用可能なＲＮＡ複製酵素コード領域は、αウイルス（例えばＳＦＶ）、小ＲＮＡウイルス（例えばＦＭＤＶ）、フラビウイルス（例えばＤＥＮＶ）、パラミクソウイルス（例えばＨＭＰＶ）又はカリシウイルス（例えばＮＶ）を含むが、これらに限定されるものではない。

【0033】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡはトランス増幅型ｍＲＮＡであり、即ち、前記標的遺伝子をコードするｍＲＮＡは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列に加えて、５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなるものをさらに含み、ＲＮＡ複製酵素は単独した従来のｍＲＮＡによりコードされる。

【0034】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とを連結した１本のｍＲＮＡ配列を含み、このｍＲＮＡ配列は以下のいずれか１群である。

【0035】

Ａ）５’キャップ構造、５’非コード領域、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列
Ｂ）５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｃ）５’キャップ構造、５’非コード領域、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｄ）５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｅ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｆ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｇ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、又は
Ｈ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなる配列。
本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は、２本のｍＲＮＡ配列の組み合わせを含み、この２本のｍＲＮＡ配列は以下のいずれか１群である。

【0036】

ａ）５’キャップ構造、５’非コード領域、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｂ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｃ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｄ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｅ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、又は
ｆ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ。
本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物に含まれるｍＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６～１９のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。

【0037】

好ましくは、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物はカチオン又はポリカチオン化合物をさらに含む。

【0038】

好ましくは、前記カチオン又はポリカチオン化合物は遊離するか、又はｍＲＮＡに結合される。

【0039】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物をより安定的にするために、カチオン又はポリカチオン化合物が前記ｍＲＮＡに結合された形態が使用される。

【0040】

好ましくは、前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は脂質をさらに含む。

【0041】

さらに好ましくは、前記脂質は、ウイルスサイズの粒子（～１００ｎｍ）の自己集合形成を促進し得るリポソーム、ｍＲＮＡをエンドソームから細胞内に放出させるリポソーム、リン脂質二分子層構造を支持するリポソーム又は安定化剤として機能するリポソームを含むが、これらに限定されるものではない。

【0042】

より好ましくは、ＬＮＰ（脂質ナノ粒子）の半減期を延ばすために、前記脂質はＰＥＧ化脂質をさらに含んでもよい。

【0043】

本発明の１つの特定実施形態では、前記脂質はカチオン脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロール及び／又はリン脂質を含む。

【0044】

本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物はリポソーム、脂質複合体又は脂質ナノ粒子であってもよい。前記リポソームは、１,２－ジオレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、１,２－ジリノレオイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２,２－ジリノレオイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１,３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）リポソームの形態で調製されるリポソームであってもよい。前記脂質複合体又は脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ポリエチレングリコール化脂質及びアミノアルコール脂質から選ばれる脂質で形成されてもよい。

【0045】

本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。前記薬学的に許容される賦形剤は担体、希釈剤、アジュバント又はアジュバントをコードするヌクレオチド配列、可溶化剤、粘着剤、潤滑剤、懸濁助剤、トランスフェクション促進剤などであってもよい。前記トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体などの界面活性剤、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄｓ）不完全アジュバント、ＬＰＳ類縁体（例えばモノホスホリル脂質Ａ）、ムラミルペプチド、ベンゾキノン類縁体、スクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、カチオン、ポリカチオン（例えばポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ））又はナノ粒子、又は他の公知のトランスフェクション促進剤を含むが、これらに限定されるものではない。前記アジュバントをコードするヌクレオチド配列は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１７、ＩＦＮｇ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、抗ＰＤ１／２、ラクトフェリン、プロタミン、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－α、ｈＧＨ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性なＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びそれらの機能性断片のうちの少なくとも１種のアジュバントをコードするヌクレオチド配列である。

【0046】

本発明の第２態様は、本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物を含むｍＲＮＡワクチンを提供する。

【0047】

好ましくは、前記ｍＲＮＡワクチンにおいて、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードする配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードする配列とは、それぞれ、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来し、これにより、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に対するクロスプロテクションを免疫学的に発生させる。本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡワクチンにおいて、ＩｇＥシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をコードするＲＢＤには、５０１Ｙ．Ｖ２系統のＫ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ突然変異が含まれ、好ましくは、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示され、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードする配列はＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ｉｓｏｌａｔｅに由来し、これには、５０１Ｙ．Ｖ２系統のＬ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２－Ｌ２４４削除突然変異（Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ）、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ及びＡ７０１Ｖが含まれ、好ましくは、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される。

【0048】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡワクチンは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、を含み、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示され、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される。

【0049】

本発明の別の特定実施形態では、前記ｍＲＮＡワクチンは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、を含み、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される。

【0050】

本発明の別の特定実施形態では、前記ｍＲＮＡワクチンは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、を含み、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。好ましくは、前記ｍＲＮＡワクチンにおいて、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡと、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡとの質量比が（１～５）：（１～５）である。

【0051】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡワクチンにおいて、ＩｇＥシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡと、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとの質量比が、（１～２）：（１～２）である。

【0052】

好ましくは、前記ｍＲＮＡワクチンはカチオン又はポリカチオン化合物をさらに含む。

【0053】

好ましくは、前記カチオン又はポリカチオン化合物は遊離するか、又はｍＲＮＡに結合される。

【0054】

本発明の１つの特定実施形態では、前記ｍＲＮＡワクチンをより安定的にするために、カチオン又はポリカチオン化合物が前記ｍＲＮＡに結合された形態が使用される。

【0055】

好ましくは、前記ｍＲＮＡワクチンは脂質をさらに含む。

【0056】

さらに好ましくは、前記脂質は、ウイルスサイズの粒子（～１００ｎｍ）の自己集合形成を促進し得るリポソーム、ｍＲＮＡをエンドソームから細胞内に放出させるリポソーム、リン脂質二分子層構造を支持するリポソーム又は安定化剤として機能するリポソームを含むが、これらに限定されるものではない。

【0057】

より好ましくは、ＬＮＰの半減期を延ばすために、前記脂質はＰＥＧ化脂質をさらに含んでもよい。

【0058】

本発明の１つの特定実施形態では、前記脂質はカチオン脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロール及び／又はリン脂質を含む。

【0059】

本発明の前記ｍＲＮＡワクチンはリポソーム、脂質複合体又は脂質ナノ粒子であってもよい。前記リポソームは、１,２－ジオレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、１,２－ジリノレオイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２,２－ジリノレオイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１,３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）リポソームの形態で調製されるリポソームであってもよい。前記脂質複合体又は脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ポリエチレングリコール化脂質及びアミノアルコール脂質から選ばれる脂質で形成されてもよい。

【0060】

本発明の前記ｍＲＮＡワクチンは薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。前記薬学的に許容される賦形剤は担体、希釈剤、アジュバント又はアジュバントをコードするヌクレオチド配列、可溶化剤、粘着剤、潤滑剤、懸濁助剤、トランスフェクション促進剤などであってもよい。前記トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体などの界面活性剤、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄｓ）不完全アジュバント、ＬＰＳ類縁体（例えばモノホスホリル脂質Ａ）、ムラミルペプチド、ベンゾキノン類縁体、スクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、カチオン、ポリカチオン（例えばポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ））又はナノ粒子、又は他の公知のトランスフェクション促進剤を含むが、これらに限定されるものではない。前記アジュバントをコードするヌクレオチド配列は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１７、ＩＦＮｇ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、抗ＰＤ１／２、ラクトフェリン、プロタミン、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－α、ｈＧＨ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、活性のないＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びそれらの機能性断片のうちの少なくとも１種のアジュバントをコードするヌクレオチド配列である。

【0061】

本発明の第３態様は、ｍＲＮＡとカチオン又はポリカチオン化合物とを混合したものを脂質でパッケージングすることを含むｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物の調製方法を提供する。

【0062】

好ましくは、前記脂質は、ウイルスサイズの粒子（～１００ｎｍ）の自己集合形成を促進し得るリポソーム、ｍＲＮＡをエンドソームから細胞内に放出させるリポソーム、リン脂質二分子層構造を支持するリポソーム又は安定化剤として機能するリポソームを含むが、これらに限定されるものではない。より好ましくは、ＬＮＰの半減期を延ばすために、前記脂質はＰＥＧ化脂質をさらに含んでもよい。

【0063】

本発明の１つの特定実施形態では、前記脂質はカチオン脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロール及び／又はリン脂質を含む。

【0064】

本発明の第４態様は、本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物とカチオン又はポリカチオン化合物とを混合したものを脂質でパッケージングすることを含むｍＲＮＡワクチンの調製方法を提供する。好ましくは、脂質ナノ粒子としてパッケージングする。

【0065】

好ましくは、前記脂質は、ウイルスサイズの粒子（～１００ｎｍ）の自己集合形成を促進し得るリポソーム、ｍＲＮＡをエンドソームから細胞内に放出させるリポソーム、リン脂質二分子層構造を支持するリポソーム又は安定化剤として機能するリポソームを含むが、これらに限定されるものではない。より好ましくは、ＬＮＰの半減期を延ばすために、前記脂質はＰＥＧ化脂質をさらに含んでもよい。

【0066】

本発明の１つの特定実施形態では、前記脂質はカチオン脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロール及び／又はリン脂質を含む。

【0067】

本発明の第５態様は、本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物又はｍＲＮＡワクチンの、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患の予防及び／又は治療における使用を提供する。

【0068】

好ましくは、前記新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むが、これに限定されるものではない。

【0069】

本発明の第６態様は、本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物又はｍＲＮＡワクチンの、抗新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染における使用を提供する。

【0070】

本発明の第７態様は、本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物又はｍＲＮＡワクチンの、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患を予防及び／又は治療する医薬品の調製における使用を提供する。

【0071】

好ましくは、前記新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むが、これに限定されるものではない。

【0072】

本発明の第８態様は、本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物又はｍＲＮＡワクチンの、抗新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染薬の調製における使用を提供する。

【0073】

本発明の第９態様は、対象に本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又はｍＲＮＡワクチンの有効量を投与することを含む新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患の治療及び／又は予防方法を提供する。

【0074】

本発明の第１０態様は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染していない対象に本発明の前記ｍＲＮＡワクチンの有効量を投与することを含む新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防方法を提供する。

【0075】

本発明の第１１態様は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染した対象に本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを含む組成物又はｍＲＮＡワクチンの有効量を投与することで、対象の体内で中和抗体を産生して新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対応することを含む新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療方法を提供する。

【0076】

本発明の第１２態様は、対象に本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又はｍＲＮＡワクチンの有効量を投与するステップを含む抗体スクリーニング方法を提供する。

【0077】

ここでは、前記抗体スクリーニング方法は治療方法ではない。該方法は中和抗体をスクリーニングし、抗体の薬効について検出や比較を行って、どの抗体が医薬品として有用であるか、どの抗体が医薬品として好適ではないかを決定するか、又は、各医薬品の薬効感度を比較し、即ち治療効果は必然的なものであり、可能性のあるものに過ぎない。

【0078】

本発明の第１３態様は、対象に本発明のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又はｍＲＮＡワクチンを投与することを含む対象の中和抗原特異的免疫応答の誘導方法を提供する。

【0079】

好ましくは、前記抗原特異的免疫応答はＴ細胞応答及び／又はＢ細胞応答を含む。

【0080】

本発明の第１４態様は、本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物によりコードされるタンパク質を提供する。

【0081】

好ましくは、前記タンパク質は、融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質である。さらに好ましくは、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は、６８２ＲＲＡＲ６８５位突然変異を含む、及び／又は９８６ＫＶ９８７位を突然変異して、Ｓタンパク質を融合前立体構造として固定化する。最も好ましくは、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は、野生型全長Ｓタンパク質の６８２ＲＲＡＲ６８５をＧＳＡＧに突然変異した、及び／又は９８６ＫＶ９８７をＰＰに突然変異したものである。

【0082】

本発明の第１５態様は、本発明の前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。

【0083】

本発明の第１６態様は、本発明の前記ヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

【0084】

本発明の第１７態様は、本発明の前記タンパク質、前記ヌクレオチド配列及び／又は前記ベクターを含む細胞を提供する。

【0085】

本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、及びｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物を含むｍＲＮＡワクチンの優位性は以下の通りである。１、インビトロで合成するので、細胞培養が不要であり、動物由来汚染のリスクがない。２、研究・開発、生産が効率的であり、標準化生産が行われ、量産や品質制御が容易であり、同一の生産プロセスが複数の製品に適用できる。３、所定時間内で持続的な発現ができ、これにより、抗原暴露時間が長くなり、免疫反応の強度及び品質が向上する。４、自然感染の過程を模擬して、ヒト細胞内で翻訳、修飾され、ＭＨＣ Ｉ類分子に提示されて、より強い細胞免疫を誘発することができる。５、細胞内タンパク質、膜貫通タンパク質、ＶＬＰなど、多種類のタンパク質形式をサポートし、しかもＶＬＰの生産量が低いことによる精製の問題を避けることができる。６、自己アジュバント効果があり、アジュバントスクリーニングを行う必要がない。７、感染、ゲノム組み込みのリスクがない。８、既得免疫がなく、何度も免疫ができる。

【0086】

本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物の発現産物は、ＲＢＤ又はそのバリアントと、Ｓタンパク質又はそのバリアントと、を含み、ＲＢＤは主要な中和エピトープを含み、高レベルの中和抗体力価を誘発することができ、さらに、非中和エピトープが比較的少ないので、安全性が高い。全長Ｓタンパク質は高レベルの特異的細胞免疫を誘導することができ、中和抗体のＲＢＤを特異的に誘導し、極めて優れた免疫効果を果たすことができる。さらに、実施例によっても、本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物の発現産物は人体で高レベルの中和抗体及びサイトカインの産生を誘発できることが証明されている。

【0087】

また、従来技術で開示された内容の一部も本発明の技術的解決手段をサポートし、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤの配列を解析し、その構造のシミュレーション予測を行うことにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質とＡＣＥ２が相互作用する構造立体構造を維持することが考えられる（Xintian, Xら(2020)，Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission，Sci China Life Sci.を参照）。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤの異なる断片を比較することにより、タンパク質断片３７７～５８８が主要中和ドメインであり、即ち、マウス及びウサギのモデルにおいて最高の中和抗体力価を引き起こし得ることが確認され、しかも、この主要中和ドメインはまだ受容体ｈＤＰＰ４と結合することができ、これによって、構造立体構造を維持することが確認され、線形エピトープに加えて、構造エピトープを提供することもできる（Cuiqing, Mら(2014)，Searching for an ideal vaccine candidate among different MERS coronavirus receptor-binding fragments--the importance of immunofocusing in subunit vaccine design，Vaccine. 32(46):6170-6176.を参照）。

【0088】

本発明の前記「対象」は哺乳類とヒトを含む。前記哺乳類は、げっ歯類（例えばマウス、ラット）、サル、ゼブラフィッシュ、ブタ、ニワトリ、ウサギなどを含むが、これらに限定されるものではない。

【0089】

本発明の前記「予防」とは、疾患発症前又は後に本発明の前記製品を投与することにより症状を回避するか、又は特定の症状進行を遅延させる全ての行為であり、好ましくは、前記予防は本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを含む組成物をワクチンとして使用することを含む。

【0090】

本発明の前記「治療」とは、疾患進行の場合疾患又は病態の徴候、症状などを改善する治療的介入であり、好ましくは、前記治療は、本発明の前記ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを含む組成物に結合する抗体をスクリーニングして、治療に用いることを含む。

【0091】

本発明の前記「有効量」とは、単一又は複数の用量で患者又は器官に投与した後、期待される治療又は予防を付与する本発明の前記製品の量又は用量である。

【0092】

本発明の前記「Ｓタンパク質」とは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する構造タンパク質であり、名称がスパイクタンパク質である。

【0093】

本発明の前記「ＲＢＤ」とは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する構造タンパク質であり、名称がスパイクタンパク質受容体結合ドメインである。

【0094】

本発明の前記「同一性」とは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列を使用する上、使用する配列が従来技術により得られる配列と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％（含むが、これらに限定されるものではない）の相同性を有するとともに、元のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と同じ又は類似の機能を有し、例えば元の配列と同一性を有するアミノ酸配列も中和抗体をインビボで誘発してサイトカインを産生する機能を有し、元の配列と同一性を有するｍＲＮＡ配列発現産物も中和抗体をインビボで誘発し、サイトカインを産生する機能を有するように、当業者が実際のニーズに応じて配列を調整してもよいことを意味する。

【図面の簡単な説明】

【0095】

以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。

【図1】ｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードする配列の配列決定結果である。

【図2】図２Ａ及び図２Ｂの組み合わせは野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする配列の配列決定結果である。

【図3】Ｔ７プロモータ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙＡテールを含む基礎プラスミドテンプレートの配列図である。

【図4】ホルムアルデヒド変性ゲルを用いてキャップ化により精製されたｍＲＮＡを検出し、ここで、Ｍはマーカーであり、１はｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡであり、２は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡである。

【図5】ウエスタンブロット（ＷＢ：Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果であり、ここで、１はｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡの発現上清であり、２は陰性対照である。

【図6】免疫蛍光結果である。

【図7】動的光散乱（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒径及び粒径分布の検出結果であり、ここで、ＡはＲＢＤ＋Ｓ－１－ＬＮＰを表し、ＢはＲＢＤ＋Ｓ－２－ＬＮＰを表し、ＣはＲＢＤ＋Ｓ－３－ＬＮＰを表し、ＤはＲＢＤ－ＬＮＰを表し、ＥはＳ－ＬＮＰを表す。

【図8】ホルムアルデヒド変性ゲルを用いたパッケージング後のサンプルのｍＲＮＡ完全性の検出結果であり、ここで、１はｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡであり、２はＲＢＤ＋Ｓ－１であり、３はＲＢＤ＋Ｓ－２であり、４はＲＢＤ＋Ｓ－３であり、５は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異する融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡである。

【図9】一次免疫、二次免疫後のＳタンパク質の特異的抗体の力価であり、ここで、Ｎｅｇａｔｉｖｅは陰性対照である。

【図10】ＥＬＩＳｐｏｔ（酵素結合免疫スポット法）によるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の検出結果であり、ここで、縦座標は脾臓細胞１００万個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ：ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）であり、Ｎｅｇａｔｉｖｅは陰性対照である。

【図11】ＣＤ４ ＣＫ細胞内染色法（ＩＣＳ）によるＩＦＮ－γ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）の検出結果である。

【図12】ＣＤ８ ＣＫ細胞内染色法（ＩＣＳ）によるＩＦＮ－γ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）の検出結果である。

【図13】ホルムアルデヒド変性ゲルを用いてキャップ化により精製されたｍＲＮＡを検出し、ここで、Ｍはマーカーであり、１は実施例１で調製された、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、２は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、３は、ＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡである。その結果、ｍＲＮＡはサイズが正しく、ほぼ分解していない。

【図14】ＷＢの検出結果であり、ここで、１は、ＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡの発現上清であり、２は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現上清であり、３は陰性対照の細胞上清であり、４はＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡの発現細胞沈殿であり、５は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現細胞沈殿であり、６は陰性対照の細胞沈殿である。

【図15】動的光散乱（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒径及び粒径分布の検出結果である。

【図16】一次免疫、二次免疫後の５０１Ｙ．Ｖ２系統に対するＳタンパク質特異的抗体の力価である。

【図17】一次免疫、二次免疫後のＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ｉｓｏｌａｔｅに対するＳタンパク質特異的抗体の力価である。

【図18】替代性中和抗体力価の結果であり、左の４群はＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ｉｓｏｌａｔｅに対する替代性中和抗体力価であり、右の４群の５０１Ｙ．Ｖ２系統に対する替代性中和抗体力価である。

【図19】ＣＤ４＋Ｔ細胞Ｔｈ１細胞の免疫応答の検出結果である。

【図20】ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔｈ１細胞の免疫応答の検出結果である。

【発明を実施するための形態】

【0096】

以下、本発明の実施例の図面を参照しながら、本発明の実施例の技術的解決手段を明確かつ完全に説明するが、明らかに、説明する実施例は本発明の実施例の一部に過ぎず、全ての実施例ではない。当業者が本発明の実施例に基づいて創造的な努力を必要とせずに得る他の全ての実施例は本発明の特許範囲に属する。

【0097】

実施例に使用される試薬の由来
替代性中和抗体の検出はワクチン免疫マウスの血清中の中和抗体の検出であり、ＡＣＥ２タンパク質とＲＢＤタンパク質の競合結合を利用する。

【0098】

特異的抗体の検出はワクチン免疫マウスの血清中の特異的抗体の検出であり、ＲＢＤタンパク質を利用する。

【0099】

Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ｉｓｏｌａｔｅに対する検出に使用されるＲＢＤタンパク質は野生型ＲＢＤタンパク質である（製造元：ジェンスクリプト社、品番：Ｚ０３４８３－１）。

【0100】

５０１Ｙ．Ｖ２系統に対する検出に使用されるＲＢＤタンパク質は５０１Ｙ．Ｖ２系統突然変異を含むＲＢＤタンパク質である（製造元：上海近岸科技有限公司、品番：ＤＲＡ１２５）。

【0101】

実施例１：ｍＲＮＡの調製及び検出
１、抗原設計用の遺伝子配列をそれぞれ人工合成した。
２、固相ホスホロアミダイトトリエステルによって短ヌクレオチド鎖（プライマー）を合成した。
３、プライマーを互いのテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。
４、ステップ３の増幅産物をｐＵＣ５７ベクターに連結し、形質転換して配列決定した。
５、配列決定の結果、配列は予測した通りであり、結果は図１～２に示される。具体的には、図１は、ｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードする配列の配列決定結果を示し、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示され、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。図２は、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードする配列の配列決定結果であり、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示され、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
６、Ｔ７プロモータ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙＡテールを含む、配列が図３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に示される基礎プラスミドテンプレートを準備した。
７、基礎プラスミドテンプレートと相同であるプライマーによりＰＣＲを行った結果、正しいものである。

【0102】

基礎プラスミドテンプレートを制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩで線形化した。ＰＣＲ産物をそれぞれ相同組換えにより基礎プラスミドテンプレートに連結し、それぞれＸｌ１－Ｂｌｕｅ菌株に形質転換し、配列決定を行って配列が正しいと確認すると、転写テンプレートを構築した。振とうフラスコを用いて菌株を発酵し、エンドトキシンフリープラスミド大量抽出キットで精製し、転写テンプレートを得た。

【0103】

転写テンプレートを制限エンドヌクレアーゼＢｂｓＩで線形化した。Ｔ７インビトロ転写キットで転写し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～５のキャップ化されていないｍＲＮＡ（ｍＲＮＡの具体的な配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６～１７である）をそれぞれ得た。ＤＮａｓｅＩで転写テンプレートをそれぞれ消化して、沈殿法によりｍＲＮＡを精製した。Ｃａｐ１キャップ化キットを用いてｍＲＮＡをキャップ化し、ｍＲＮＡ精製キットを用いてキャップ化後のｍＲＮＡをそれぞれ精製した。精製後のｍＲＮＡを酸性クエン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、保管しておく。

【0104】

ホルムアルデヒド変性ゲルを用いて、キャップ化により精製されたｍＲＮＡを検出し、図４に示すように、１はｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡであり、２は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡである。その結果、ｍＲＮＡはサイズが正しく、ほぼ分解していない。

【0105】

２４ウェルプレートの３つのウェルにＨＥＫ２９３細胞を接種し、これらのうち、ウェル１、２のそれぞれでは、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、キャップ化により精製されたｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡと、コード６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質のｍＲＮＡと、を０．５μｇトランスフェクションし、ウェル３では、陰性対照としてｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬を加えた。２４ｈトランスフェクション後、ウェル１、３内の細胞上清を取ってＷＢ検出を行い、ウェル２、３内の細胞を固定化した後、抗Ｓタンパク質多価抗体で免疫蛍光検出を行った。ＷＢ検出結果を図５に示し、ここで、１はｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡの発現上清であり、２は陰性対照である。その結果、発現させたタンパク質のサイズが正しい。免疫蛍光結果を図６に示し、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡが正常に発現できることが証明された。

【0106】

実施例２：ｍＲＮＡワクチンの調製及び免疫
１、原料の準備
１）カチオン脂質Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ジステアロイルホスファチジルコリンＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ化脂質ＰＥＧ－ＤＭＧの４つの成分を５０：１０：３８．５：１．５のモル比でエタノールに溶解して混合した。
２）実施例１で調製された、ｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡと、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡの２種のｍＲＮＡを１：１、２：１、１：２の質量比でそれぞれ混合し、混合後のｍＲＮＡを得て、ＲＢＤ＋Ｓ－１、ＲＢＤ＋Ｓ－２及びＲＢＤ＋Ｓ－３と略称した。
２、試験ステップ
脂質混合物：ｍＲＮＡを、１：３の流速比で、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のナノ粒子製造装置Ｉｇｎｉｔｅにてそれぞれ混合し、ＲＢＤ＋Ｓ－１、ＲＢＤ＋Ｓ－２、ＲＢＤ＋Ｓ－３、ｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡ、及び６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡをパッケージングした。パッケージングしたｍＲＮＡ－ＬＮＰ（ＬＮＰは脂質ナノ粒子）を透析し、限外濾過してＤＰＢＳ内に濃縮させ、無菌ろ過すると、後続の動物実験用のサンプルを得た。ＤＬＳによりｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒径及び粒径分布を検出し、検出結果を図７に示し、パッケージング後のサンプルは全て粒径が７０ｎｍ～１００ｎｍであり、ＰＤＩが０．２未満である。ここで、ＲＢＤ＋Ｓ－１－ＬＮＰ：粒径平均値７７．１５ｎｍ、ＰＤＩ値０．０３８、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９５８、具体的には表１を参照し、ＲＢＤ＋Ｓ－２－ＬＮＰ：粒径平均値７７．０４ｎｍ、ＰＤＩ値０．０５５、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９５９、具体的には表２を参照し、ＲＢＤ＋Ｓ－３－ＬＮＰ：粒径平均値９１．４３ｎｍ、ＰＤＩ値０．０４９、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９７４、具体的には表３を参照し、ＲＢＤ－ＬＮＰ：粒径平均値７７．９２ｎｍ、ＰＤＩ値０．０３６、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９５４、具体的には表４を参照し、Ｓ－ＬＮＰ：粒径平均値７６．８９ｎｍ、ＰＤＩ値０．０３１、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９７７、具体的には、表５を参照する。

【0107】

【0108】

【0109】

【0110】

【0111】

【0112】

ホルムアルデヒド変性ゲルを用いて、パッケージング後のサンプルのｍＲＮＡ完全性を検出し、結果を図８に示し、ここで、１はｔＰＡシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードするｍＲＮＡであり、２はＲＢＤ＋Ｓ－１であり、３はＲＢＤ＋Ｓ－２であり、４はＲＢＤ＋Ｓ－３であり、５は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡである。以上から、ｍＲＮＡはほぼ分解していない。

【0113】

６週齢程度のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを６匹ずつ６群にランダムに分けた。それぞれ０日目及び２８日目に免疫後、脚の筋肉に１０μｇを接種し、２８日目及び４２日目にＳタンパク質の特異的抗体力価を検出し、４２日目にマウスを殺してサイトカインを検出した。

【0114】

３、実験結果
一次免疫、二次免疫後のＳタンパク質の特異的抗体力価を図９に示し、Ｓ全長単独で二次免疫後の特異的抗体力価はＲＢＤ単独免疫の場合よりもはるかに低く、ＳとＲＢＤの組み合わせで免疫した３群のうち、２群は、ＲＢＤ単独免疫の場合と比較して、特異的抗体力価に有意差がなく、ＲＢＤ＋Ｓ－１では、相乗効果が認められ、特異的抗体力価はＲＢＤ単独免疫の場合よりもはるかに高いことが分かった。ＥＬＩＳｐｏｔによるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の検出結果を図１０に示し、Ｓ全長単独免疫によるＩＦＮ－γ分泌のレベルはＲＢＤ単独免疫の場合よりもはるかに高く、ＳとＲＢＤの組み合わせで免疫した３群のうち、２群はＳ全長単独免疫の場合と比較して、ＩＦＮ－γ分泌レベルには有意差がなく、ＲＢＤ＋Ｓ－３では、相乗効果が認められ、ＩＦＮ－γ分泌レベルはＳ全長単独免疫の場合よりもはるかに高いことが分かった。ＣＫ細胞内染色法（ＩＣＳ）によるＩＦＮ－γ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）の検出結果を図１１及び図１２に示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、反応が低く、対象の違いが大きく、指導意義が低く、一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出結果はＥＬＩＳｐｏｔの検出結果とほぼ一致し、ＳとＲＢＤの組み合わせで免疫した３群のうち、２群はＳ全長単独免疫の場合と比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αの分泌レベルには有意差がなく、ＲＢＤ＋Ｓ－３では、有意な相乗効果が認められた。Ｓ全長とＲＢＤの組み合わせはＳ全長の細胞免疫の優位性とＲＢＤの体液免疫の優位性とを組み合わせるに加えて、相乗効果を果たし、２０１９－ｎＣｏＶ型冠状ウイルス感染の予防において優れた効果が得られることが示された。

【0115】

実施例３：配列が異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来のｍＲＮＡの調製及び検出
１、プライマーを互いのテンプレートとして増幅し、ＩｇＥシグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤをコードする配列を合成し、ここで、この配列は、５０１Ｙ．Ｖ２系統のＫ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ突然変異を含み、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示され、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される。

【0116】

２、プライマーを互いのテンプレートとして増幅し、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードする配列を合成し、この配列は、５０１Ｙ．Ｖ２系統のＬ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２－Ｌ２４４削除突然変異（Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ）、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ及びＡ７０１Ｖを含み、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示され、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される。

【0117】

３、Ｔ７プロモータ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙＡテールを含む、配列が図３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に示される基礎プラスミドテンプレートを準備した。

【0118】

４、基礎プラスミドテンプレートと相同であるプライマーによりＰＣＲを行った結果、正しいものである。

【0119】

基礎プラスミドテンプレートを制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩで線形化した。ＰＣＲ産物をそれぞれ相同組換えにより基礎プラスミドテンプレートに連結し、それぞれＸｌ１－Ｂｌｕｅ菌株に形質転換し、配列決定を行って配列が正しいと確認すると、転写テンプレートを構築した。振とうフラスコを用いて菌株を発酵し、エンドトキシンフリープラスミド大量抽出キットで精製し、転写テンプレートを得た。

【0120】

転写テンプレートを制限エンドヌクレアーゼＢｂｓＩで線形化した。Ｔ７インビトロ転写キットで転写し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、１４のキャップ化されていないｍＲＮＡ（ｍＲＮＡの具体的な配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９である）をそれぞれ得た。ＤＮａｓｅＩで転写テンプレートをそれぞれ消化して、沈殿法によりｍＲＮＡを精製した。Ｃａｐ１キャップ化キットを用いてｍＲＮＡをキャップ化し、ｍＲＮＡ精製キットを用いてキャップ化後のｍＲＮＡをそれぞれ精製した。精製後のｍＲＮＡを酸性クエン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、保管しておく。

【0121】

ホルムアルデヒド変性ゲルを用いて、キャップ化により精製されたｍＲＮＡを検出し、図１３に示すように、１は実施例１で調製された、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、２は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、３はＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡである。その結果、ｍＲＮＡはサイズが正しく、ほぼ分解していない。

【0122】

２４ウェルプレートの３つのウェルにＨＥＫ２９３細胞を接種し、これらのうち、ウェル１、２のそれぞれでは、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、キャップ化により精製されたＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡと、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを０．５μｇトランスフェクションし、ウェル３では、陰性対照とした。２４ｈトランスフェクション後、遠心分離して、細胞上清及び細胞沈殿を得て、それぞれＷＢ検出に供した。ＷＢ検出結果を図１４に示し、ここで、１はＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡの発現上清であり、２は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現上清であり、３は陰性対照の細胞上清であり、４はＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡの発現細胞沈殿であり、５は６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現細胞沈殿であり、６は陰性対照の細胞沈殿である。その結果、発現させたタンパク質のサイズが正しい。

【0123】

実施例４：配列が異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来のｍＲＮＡ組み合わせワクチンの調製及び免疫
１、原料の準備
１）カチオン脂質Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ジステアロイルホスファチジルコリンＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ化脂質ＰＥＧ－ＤＭＧの４つの成分を５０：１０：３８．５：１．５のモル比でエタノールに溶解して混合した。

【0124】

２）実施例１で調製された、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと、実施例３で調製された、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと、実施例３で調製された、ＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡを準備した。

【0125】

３）実施例３で調製された、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと、実施例３で調製された、ＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡと、を１：２の質量比で混合し、混合後のｍＲＮＡを得て、ｃｏｍｂｏ Ａと略称した。

【0126】

４）実施例１で調製された、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと、実施例３で調製された、ＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡと、を１：２の質量比で混合し、混合後のｍＲＮＡを得て、ｃｏｍｂｏ Ｂと略称した。

【0127】

２、試験ステップ
脂質混合物：ｍＲＮＡを、１：３の流速比で、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓのナノ粒子製造装置Ｉｇｎｉｔｅにてそれぞれ混合し、ｃｏｍｂｏ Ａ、ｃｏｍｂｏ Ｂ、実施例３で調製された、６８２ＲＲＡＲ６８５がＧＳＡＧに突然変異し、９８６ＫＶ９８７がＰＰに突然変異した融合前立体構造として固定化された５０１Ｙ．Ｖ２系統の全長Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと、実施例３で調製された、ＩｇＥシグナルペプチドを含む５０１Ｙ．Ｖ２系統の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡとをパッケージングし、パッケージングしたｍＲＮＡ－ＬＮＰを得て、それぞれｃｏｍｂｏ Ａ－ＬＮＰ、ｃｏｍｂｏ Ｂ－ＬＮＰ、Ｓ－ＳＡ－ＬＮＰ及びＲＢＤ－ＳＡ－ＬＮＰと略称した。パッケージングしたｍＲＮＡ－ＬＮＰを透析し、限外濾過してＤＰＢＳ内に濃縮させ、無菌ろ過すると、後続の動物実験用のサンプルを得た。ＤＬＳによりｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒径及び粒径分布を検出し、検出結果を図１５に示し、パッケージング後のサンプルは全て粒径が７０ｎｍ～１００ｎｍであり、ＰＤＩが０．２未満である。ここで、ｃｏｍｂｏ Ａ－ＬＮＰ：粒径平均値７９．８７ｎｍ、ＰＤＩ値０．１３２、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９６２、具体的には表６を参照し、ｃｏｍｂｏ Ｂ－ＬＮＰ：粒径平均値８０．６１ｎｍ、ＰＤＩ値０．１２３、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９５８、具体的には表７を参照し、Ｓ－ＳＡ－ＬＮＰ：粒径平均値８１．１３ｎｍ、ＰＤＩ値０．１５９、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９３９、具体的には表８を参照し、ＲＢＤ－ＳＡ－ＬＮＰ：粒径平均値８２．７４ｎｍ、ＰＤＩ値０．１１２、インターセプト（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）０．９６０、具体的には表９を参照する。

【0128】

【0129】

【0130】

【0131】

【0132】

６週齢程度のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを６匹ずつ５群にランダムに分けた。それぞれ０日目及び１４日目に免疫後、脚の筋肉に５μｇを接種し、１４日目及び第２８日目にＳタンパク質の特異的抗体力価を検出し、２８日目にマウスを殺してサイトカインを検出した。

【0133】

３、実験結果
一次免疫、二次免疫後の５０１Ｙ．Ｖ２系統のＳタンパク質の特異的抗体力価を図１６に示し、各群間で有意差がなかった。一次免疫、二次免疫後のＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ｉｓｏｌａｔｅのＳタンパク質の特異的抗体力価を図１７に示し、その結果、ＳとＲＢＤの組み合わせの２群では、免疫による特異的抗体力価には有意差がないが、Ｓ全長単独とＲＢＤ単独で二次免疫後の特異的抗体力価は、いずれも異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来のｍＲＮＡ組み合わせ（ｃｏｍｂｏ Ｂ）よりも低かった。一方、替代性中和抗体力価の結果からも、（図１８に示すように、左の４群はＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ｉｓｏｌａｔｅに対する替代性中和抗体力価であり、右の４群は５０１Ｙ．Ｖ２系統に対する替代性中和抗体力価）、ｃｏｍｂｏ Ｂは、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ｉｓｏｌａｔｅに対する替代性中和抗体力価が、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株（５０１Ｙ．Ｖ２系統）に由来のｍＲＮＡ組み合わせ（ｃｏｍｂｏ Ａ）、Ｓ全長単独とＲＢＤ単独よりもはるかに高く、ｃｏｍｂｏ Ｂは、５０１Ｙ．Ｖ２系統に対する替代性中和抗体力価がｃｏｍｂｏ Ａ及びＲＢＤ単独の場合と比較して、有意差がなく、Ｓ全長単独の場合よりも遥かに高いことが示された。これは、Ｓ全長とＲＢＤの組み合わせはＳ全長単独と比較して、体液免疫の優位性を持ち、しかも、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来のｍＲＮＡ組み合わせは、体液免疫においては、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来のｍＲＮＡ組み合わせよりも、良好なクロスプロテクション効果を付与することを証明した。

【0134】

ＣＤ４＋Ｔ細胞Ｔｈ１細胞の免疫応答の検出結果は図１９に示され、ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔｈ１細胞の免疫応答の検出結果は図２０に示され、その結果、Ｓ全長とＲＢＤの組み合わせは、ＲＢＤ単独の場合と比較して、細胞免疫の優位性を持つ。これも、Ｓ全長とＲＢＤの組み合わせの設計はワクチンの使用上優位性があることを検証した。

【0135】

以上は本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明は上記実施形態の詳細に限定されるものではなく、本発明の技術的構想を逸脱することなく、本発明の技術的解決手段について様々な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は全て本発明の特許範囲に属する。

【0136】

なお、上記の具体的な実施形態に記載の各特定技術的特徴は、矛盾しない限り、任意の適切な方式で組み合わせられてもよく、不要な重複を回避しないように、本発明は各種の可能な組み合わせの形態については、再度説明しない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

2023525936000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-12-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、を含む、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項2】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、前記Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは、同一のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株又は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株に由来する、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項3】

前記Ｓタンパク質又はそのバリアントは野生型全長Ｓタンパク質又は融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質を含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項4】

前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は６８２ＲＲＡＲ６８５位突然変異、及び／又は９８６ＫＶ９８７位突然変異を含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項5】

前記野生型全長Ｓタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記融合前立体構造として固定化された全長Ｓタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ若しくはＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２若しくは１５と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項6】

前記Ｓタンパク質又はそのバリアントは、シグナルペプチドを含まず、野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むか、又は野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むとともに、そのシグナルペプチドの前に強いシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項7】

前記ＲＢＤは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３若しくは１３と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項8】

前記ＲＢＤ又はそのバリアントは、シグナルペプチドを含まず、野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むか、又は野生型Ｓタンパク質のシグナルペプチドを含むとともに、そのシグナルペプチドの前に強いシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項9】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列と、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列とは、個別の２本のｍＲＮＡ配列又は１本に連結されたｍＲＮＡ配列である、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項10】

１本に連結されたｍＲＮＡ配列では、５’から３’への連結順序は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列にＳタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列が続くか、又は、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列が続く、請求項９に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項11】

前記ｍＲＮＡは従来のｍＲＮＡ、自己増幅型ｍＲＮＡ又はトランス増幅型ｍＲＮＡである、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項12】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列及びＳタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列からなるｍＲＮＡ配列を含み、該ｍＲＮＡ配列が、
Ａ）５’キャップ構造、５’非コード領域、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｂ）５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｃ）５’キャップ構造、５’非コード領域、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｄ）５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｅ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｆ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
Ｇ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、並びに
Ｈ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素、及びポリアデニル酸テールからなる配列、
のいずれかから選択される、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項13】

２本のｍＲＮＡ配列の組み合わせを含み、前記２本のｍＲＮＡ配列が、
ａ）５’キャップ構造、５’非コード領域、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｂ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’保存配列要素、ＲＮＡ複製酵素コード領域、サブゲノムプロモータ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｃ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｄ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＩＲＥＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
ｅ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、並びに
ｆ）５’キャップ構造、５’保存配列要素、サブゲノムプロモータ、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡ配列、３’保存配列要素及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡと、５’キャップ構造、５’非コード領域、ＲＮＡ複製酵素コード領域、３’非コード領域及びポリアデニル酸テールからなるｍＲＮＡとの組み合わせ、
のいずれかから選択される、請求項１に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項14】

前記ＲＮＡ複製酵素コード領域はαウイルス、小ＲＮＡウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス及びカリシウイルスから選択される、請求項１３に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物を含む、ｍＲＮＡワクチン。

【請求項16】

前記ｍＲＮＡワクチン中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡと、Ｓタンパク質中のＲＢＤ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡとの質量比が（１～５）：（１～５）である、請求項１５に記載のｍＲＮＡワクチン。

【請求項17】

前記ｍＲＮＡワクチンが、リポソーム、脂質複合体又は脂質ナノ粒子である、請求項１５に記載のｍＲＮＡワクチン。

【請求項18】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又は請求項１５～１７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチンの使用であって、前記使用は、
Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患を予防及び／又は治療する医薬品の調製における使用、又は、
Ｂ）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染薬の調製における使用を含み、
好ましくは、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に起因する疾患はＣＯＶＩＤ－１９である、使用。

【請求項19】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又は請求項１５～１７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチンを個体に投与することを含む、抗体をスクリーニングするための方法。

【請求項20】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ組成物、又は請求項１５～１７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチンを個体に投与することを含む、個体の中和抗原特異的免疫応答を誘導するための方法。

【国際調査報告】