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特表2023-525969インビトロおよびインビボでのＣＤ３＋細胞における遺伝子治療産物の発現のためのプロモータ配列
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-20
(54)【発明の名称】インビトロおよびインビボでのＣＤ３＋細胞における遺伝子治療産物の発現のためのプロモータ配列
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230613BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230613BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230613BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/867 Z
C12N15/861 Z
C12N15/86 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/869 Z
C12N15/62 Z
C12N15/13
C12N15/19
C12N15/52 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022564528
(86)(22)【出願日】2021-05-19
(85)【翻訳文提出日】2022-10-24
(86)【国際出願番号】 IB2021000343
(87)【国際公開番号】W WO2021234455
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】63/026,964
(32)【優先日】2020-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522035443
【氏名又は名称】イグザカ フランス
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ボッシュ，セシール
(72)【発明者】
【氏名】モウレーン，フレデリック
(72)【発明者】
【氏名】バイヤン，ルノー
(72)【発明者】
【氏名】パシュリー，ラシェル
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA87X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA44
(57)【要約】
ＣＤ３＋細胞における導入遺伝子の発現に使用するプロモータ配列が提供される。プロモータ配列は、導入遺伝子の近傍の５‘非翻訳領域のベクターに挿入することができる。プロモータはＣＤ３＋細胞における発現に選択的であり、ＣＤ３＋細胞に見出される転写因子の結合部位を含有している。 このプロモータは、ポリマー封入型レンチウイルスベクターナノ粒子などのベクターに組み込むことができ、がんや感染症を治療するための遺伝子免疫療法のためにＴ細胞を形質導入するために使用され得る。プロモータのＴ細胞選択性は、インビボおよびインビトロにおける免疫療法にウイルスベクターを使用する際の安全性を向上させるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ３＋細胞におけるプロモータ配列の制御下での導入遺伝子の発現に使用するためのプロモータ配列であって、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれかのヌクレオチド１５０１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含む、プロモータ配列。
【請求項2】
プロモータ配列が、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド１００１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項１に記載のプロモータ配列。
【請求項3】
プロモータ配列が、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド５０１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項１に記載のプロモータ配列。
【請求項4】
プロモータ配列が、配列番号２～１６のいずれか１つのヌクレオチド、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項１に記載のプロモータ配列。
【請求項5】
プロモータ配列が、ＮＦ－カッパＢ、ＡＰ－１、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－３、およびＮＦＡＴからなる群より選択される１つ以上の転写因子に対する結合配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載のプロモータ配列。
【請求項6】
ＣＤ３－細胞と比較して、ＣＤ３＋細胞においてより高いレベルで導入遺伝子を発現させることができるプロモータ配列である、請求項１～５のいずれかに記載のプロモータ配列。
【請求項7】
ＣＤ３＋細胞とＣＤ３－細胞における発現の比率が少なくとも２：１である、請求項６に記載のプロモータ配列。
【請求項8】
ＣＤ３＋細胞におけるプロモータ配列の制御下での導入遺伝子の発現に使用するためのプロモータ配列であって、前記プロモータ配列は、配列番号２、 配列番号３、 配列番号７、 配列番号１１、または配列番号１３を含む。
【請求項9】
請求項１～８のいずれかに記載のプロモータ配列を含むベクター、プラスミド、または核酸分子。
【請求項10】
ウイルスベクターである請求項９に記載のベクター。
【請求項11】
レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスである請求項１０に記載のウイルスベクター。
【請求項12】
ナノ粒子に組み込まれる、請求項９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項13】
ナノ粒子に組み込まれていない、請求項９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項14】
エンベロープが融合タンパク質を欠く、請求項９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項15】
前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、抗体およびその抗原結合フラグメントならびにそれらの変異体、酵素、構造タンパク質およびレポーター遺伝子からなる群より選択される産物をコードする導入遺伝子を含む、請求項９～１４のいずれかに記載のベクター。
【請求項16】
ＲＮＡ分子である請求項９に記載の核酸分子。
【請求項17】
請求項９～１６のいずれかに記載の前記ベクター、プラスミド、または核酸分子を含む細胞。
【請求項18】
ゲノム統合型ウイルスベクターを含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項19】
前記細胞が前記ベクターのエピソームの形態を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項20】
請求項９～１５のいずれかに記載の前記ベクターを含むナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ＣＤ３＋細胞へのベクターの送達が可能である。
【請求項21】
前記ナノ粒子が、ＣＤ３＋細胞へのナノ粒子の選択的な進入を促進する標的部位を含む、請求項２０に記載のナノ粒子。
【請求項22】
前記ナノ粒子が、ＣＤ３－細胞へのベクターの送達も可能である、請求項２０または２１に記載のナノ粒子。
【請求項23】
前記ナノ粒子がポリマーを含む、請求項２０～２２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項24】
前記ポリマーがポリ（β-アミノエステル）である、請求項２３に記載のナノ粒子。
【請求項25】
ＣＤ３＋細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、以下のステップを含む方法：（ａ）請求項９～１５のいずれかに記載のベクター、または請求項２０～２４のいずれかに記載のナノ粒子、およびＣＤ３＋細胞を提供するステップであって、前記ベクターが前記導入遺伝子を含んでいる、ステップ、
（ｂ）前記細胞を前記ベクターで形質導入または核酸導入するステップ、および
（ｃ）形質導入された細胞または核酸導入された細胞において導入遺伝子を発現するようにするステップ。
【請求項26】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ＣＤ３＋細胞が、ＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、またはＣＤ８－である、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
ステップ（ｂ）が、前記ベクターをＣＤ３＋細胞およびＣＤ３－細胞の混合物と接触させることを含み、前記ＣＤ３＋細胞が選択的に形質導入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
ステップ（ｂ）がインビボで行なわれる、請求項２５～２８のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
ステップ（ｂ）が、インビボで行われ、静脈内、腫瘍内、髄内、または腹腔内注射によるベクターの投与を含む、請求項２５～２８のいずれかに記載の方法。
【請求項31】
請求項９～１５のいずれか１項に記載のベクターの製造方法であって、ＣＤ３＋細胞の形質導入に用いるベクターに、請求項１～８のいずれかに記載のプロモータ配列を付加することを含む、前記方法。
【請求項32】
前記プロモータ配列が、前記ベクターの製造に使用されるパッケージング細胞または生産者細胞における導入遺伝子の発現を支持しない、請求項３１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、導入遺伝子の発現に使用するプロモータ配列に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫細胞に導入された外来遺伝子の標的化された発現によって特定の部類の免疫細胞の活性を改変する能力の開発に大きな関心が持たれている。 ＣＤ３＋Ｔ細胞のような特定の細胞種に所望の導入遺伝子をコードするＤＮＡを導入するには、プラスミドやウイルスベクターなどさまざまな方法があり、これらはしばしば標的ナノ粒子のような送達媒体に包装される。しかし、たとえ導入遺伝子を所望の細胞にうまく特異的に送達できたとしても、標的細胞で十分な発現が起こるのに適した状況で導入遺伝子を提示する必要性が残る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
そのため、ＣＤ３＋細胞などの特定の細胞集団で必要なレベルの導入遺伝子を発現させ、免疫療法およびその他の治療パラダイムをうまく遂行できるプロモータ配列を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本技術は、ＣＤ３＋Ｔ細胞における導入遺伝子の発現を促進するのに適したいくつかのプロモータ配列を提供する。プロモータ配列は、ＣＤ３＋Ｔ細胞での発現を意図した導入遺伝子のオープンリーディングフレームの５‘位に配置すると、ウイルスベクターなどのベクターに使用することができる。 好ましくは、本技術のプロモータによってサポートされる発現は、ＣＤ３＋Ｔ細胞に対して選択的である。例えば、該プロモータは、好ましくは、ＣＤ３＋Ｔ細胞などのＣＤ３＋細胞において、ＣＤ１９＋、ＣＤ３－Ｂ細胞などのＣＤ３－細胞よりも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、あるいは５０倍または１００倍高いレベルで導入遺伝子の発現をサポートする。
【0005】
本技術のプロモータは、配列番号２～１６もしくは１９～２９のいずれかのヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド配列などの核酸配列、あるいは配列番号２～１６もしくは１９～２９のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するその配列変異体を含むか、またはそれらからなる核酸配列を含んでいる。
【0006】
本技術の他のプロモータは、配列番号２～１６または１９～２９のいずれかの１以上のフラグメント、またはそのようなフラグメントの組み合わせが任意の順序で組み立てられ、任意にフラグメント間のリンカー配列を含むか、またはそれらからなることが可能である。 このようなフラグメントは、配列番号２～１６または１９～２９のいずれかの連続する１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上、３００個以上、３５０個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上または７００個以上のヌクレオチドのいずれかであり得る。
【0007】
フラグメントは、配列番号２～１６または１９～２９のいずれかの５‘末端または３‘末端から採取することができる。 フラグメントは、配列番号１～１６および１９～２９のいずれかの３‘末端から始まり、５’末端に向かう、１００、２００、３００、４００、５００、６００または７００個の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらから成ることができる。フラグメントは、配列番号１～１０、１２～１６および１９～２９のいずれかの３‘末端から始まり、５’末端に向かう、１００、２００、３００、４００、５００、６００または７００個の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらから成ることができる。
【0008】
フラグメントはまた、配列番号２～１６および１９～２９において同定され、それらは配列番号２～１６ または１９～２９のいずれかと組み合わせることができるか、またはそれに挿入できる、転写因子ＮＦ－カッパＢ、ＡＰ－１、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－３、およびＮＦＡＴなどの転写因子の任意の結合部位、または上記に定義するそのフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれらからなることができる。 好ましくは、本技術のプロモータは、ＮＦ－カッパＢ、ＡＰ－１、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－３、およびＮＦＡＴの１つ以上のための結合部位から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、または２０個の転写因子結合部位を含有するか、または配列番号２～１６および１９～２９のいずれかに示される転写因子結合部位のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するその変異体を含有する。 転写因子結合部位は、プロモータ配列内の任意のその配列における所望の位置に、任意の順序で配置することができる。また、他の転写因子の結合部位も本技術のプロモータに含めることができる。好ましいプロモータ配列は、ＩＣＯＳ（配列番号１３）およびＣＴＬＡ４（配列番号７）である。 他の好ましいプロモータ配列は、ＣＤ３＋特異的プロモータのＬＡＩＲ２（配列番号２）、ＴＮＦＳ８（配列番号３）、ＴＣＲ（配列番号１１）およびＬＴＫ（配列番号１４）で、これらのプロモータはそれぞれ２未満のＮＦΚＢ部位、８未満のＮＦＡＴボックスおよび８未満のＮＦΚＢ＋ＡＰ１部位を含んでいる。
【0009】
この技術をさらにまとめると、次のような特徴がある。
１．ＣＤ３＋細胞におけるプロモータ配列の制御下での導入遺伝子の発現に使用するためのプロモータ配列であって、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれかのヌクレオチド１５０１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含む、プロモータ配列である。
２．プロモータ配列が、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド１００１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる、特徴１に記載のプロモータ配列。
３．プロモータ配列が、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド５０１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる、特徴２に記載のプロモータ配列。
４．プロモータ配列が、配列番号２～１６のいずれか１つのヌクレオチド、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる、特徴３に記載のプロモータ配列。
５．プロモータ配列が、ＮＦ－カッパＢ、ＡＰ－１、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－３、およびＮＦＡＴからなる群より選択される１つ以上の転写因子のための結合配列からなる、特徴１～４のいずれかに記載のプロモータ配列。
１．ＣＤ３＋細胞におけるプロモータ配列の制御下での導入遺伝子の発現に使用するためのプロモータ配列であって、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれかのヌクレオチド１５０１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含む、プロモータ配列である。
２．プロモータ配列が、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド１００１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる、特徴１に記載のプロモータ配列。
３．プロモータ配列が、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド５０１～２０００、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる、特徴２に記載のプロモータ配列。
４．プロモータ配列が、配列番号２～１６のいずれか１つのヌクレオチド、または前記配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる、特徴３に記載のプロモータ配列。
５．プロモータ配列が、ＮＦ－カッパＢ、ＡＰ－１、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－３、およびＮＦＡＴからなる群より選択される１つ以上の転写因子のための結合配列からなる、特徴１～４のいずれかに記載のプロモータ配列。
【0010】
６．ＣＤ３－細胞と比較して、ＣＤ３＋細胞においてより高いレベルで導入遺伝子を発現させることができるプロモータ配列である、特徴１～５のいずれかに記載のプロモータ配列。
７．ＣＤ３＋細胞とＣＤ３－細胞における発現の比率が少なくとも２：１である、特徴６に記載のプロモータ配列。
８．ＣＤ３＋細胞におけるプロモータ配列の制御下での導入遺伝子の発現に使用するためのプロモータ配列であって、該プロモータ配列は配列番号２、 配列番号３、 配列番号７、 配列番号１１、または配列番号１３を含む。
９．特徴１～８のいずれかに記載のプロモータ配列を含むベクター、プラスミド、または核酸分子。
１０．ウイルスベクターである特徴９に記載のベクター。
１１．レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスである特徴１０に記載のウイルスベクター。
１２．ナノ粒子に組み込まれる、特徴９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
７．ＣＤ３＋細胞とＣＤ３－細胞における発現の比率が少なくとも２：１である、特徴６に記載のプロモータ配列。
８．ＣＤ３＋細胞におけるプロモータ配列の制御下での導入遺伝子の発現に使用するためのプロモータ配列であって、該プロモータ配列は配列番号２、 配列番号３、 配列番号７、 配列番号１１、または配列番号１３を含む。
９．特徴１～８のいずれかに記載のプロモータ配列を含むベクター、プラスミド、または核酸分子。
１０．ウイルスベクターである特徴９に記載のベクター。
１１．レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスである特徴１０に記載のウイルスベクター。
１２．ナノ粒子に組み込まれる、特徴９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
【0011】
１３．ナノ粒子に組み込まれない、特徴９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
１４．エンベロープが融合タンパク質を欠く、特徴９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
１５．前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、抗体およびその抗原結合フラグメントならびにそれらの変異体、酵素、構造タンパク質およびレポーター遺伝子からなる群より選択される産物をコードする導入遺伝子を含む、特徴９～１４のいずれかに記載のベクター。
１６．ＲＮＡ分子である特徴９に記載の核酸分子。
１７．特徴９～１６のいずれかに記載の前記ベクター、プラスミド、または核酸分子を含む細胞。
１８．ゲノム統合型ウイルスベクターからなる、特徴１７に記載の細胞。
１９．細胞がベクターのエピソームの形態を含む、特徴１７に記載の細胞。
１４．エンベロープが融合タンパク質を欠く、特徴９～１１のいずれかに記載のウイルスベクター。
１５．前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、抗体およびその抗原結合フラグメントならびにそれらの変異体、酵素、構造タンパク質およびレポーター遺伝子からなる群より選択される産物をコードする導入遺伝子を含む、特徴９～１４のいずれかに記載のベクター。
１６．ＲＮＡ分子である特徴９に記載の核酸分子。
１７．特徴９～１６のいずれかに記載の前記ベクター、プラスミド、または核酸分子を含む細胞。
１８．ゲノム統合型ウイルスベクターからなる、特徴１７に記載の細胞。
１９．細胞がベクターのエピソームの形態を含む、特徴１７に記載の細胞。
【0012】
２０．特徴９～１５のいずれかに記載のベクターを含むナノ粒子であって、ナノ粒子が、ＣＤ３＋細胞へのベクターの送達が可能である。
２１．ナノ粒子が、ＣＤ３＋細胞へのナノ粒子の選択的な進入を促進する標的部位を含む、特徴２０に記載のナノ粒子。
２２．ナノ粒子が、ＣＤ３－細胞へのベクターの送達も可能である、特徴２０または２１に記載のナノ粒子。
２３．ナノ粒子がポリマーからなる、特徴２０～２２のいずれかに記載のナノ粒子。
２４．ポリマーがポリ（β-アミノエステル）である、特徴２３に記載のナノ粒子。
２１．ナノ粒子が、ＣＤ３＋細胞へのナノ粒子の選択的な進入を促進する標的部位を含む、特徴２０に記載のナノ粒子。
２２．ナノ粒子が、ＣＤ３－細胞へのベクターの送達も可能である、特徴２０または２１に記載のナノ粒子。
２３．ナノ粒子がポリマーからなる、特徴２０～２２のいずれかに記載のナノ粒子。
２４．ポリマーがポリ（β-アミノエステル）である、特徴２３に記載のナノ粒子。
【0013】
２５．ＣＤ３＋細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、以下のステップを含む方法：
（ａ）特徴９～１５のいずれかに記載のベクター、または特徴２０～２４のいずれかに記載のナノ粒子、およびＣＤ３＋細胞を提供するステップであって、前記ベクターが前記導入遺伝子を含んでいる、ステップ、
（ｂ）細胞をベクターで形質導入または核酸導入するステップ、および
（ｃ）形質導入された細胞または核酸導入された細胞において導入遺伝子が発現されるようにするステップ。
２６．ベクターがレンチウイルスベクターである、特徴２５に記載の方法。
２７．前記ＣＤ３＋細胞が、ＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、またはＣＤ８－である、特徴２５に記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）が、ベクターをＣＤ３＋細胞およびＣＤ３－細胞の混合物と接触させることを含み、ＣＤ３＋細胞が選択的に形質導入される、特徴２５に記載の方法。
（ａ）特徴９～１５のいずれかに記載のベクター、または特徴２０～２４のいずれかに記載のナノ粒子、およびＣＤ３＋細胞を提供するステップであって、前記ベクターが前記導入遺伝子を含んでいる、ステップ、
（ｂ）細胞をベクターで形質導入または核酸導入するステップ、および
（ｃ）形質導入された細胞または核酸導入された細胞において導入遺伝子が発現されるようにするステップ。
２６．ベクターがレンチウイルスベクターである、特徴２５に記載の方法。
２７．前記ＣＤ３＋細胞が、ＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、またはＣＤ８－である、特徴２５に記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）が、ベクターをＣＤ３＋細胞およびＣＤ３－細胞の混合物と接触させることを含み、ＣＤ３＋細胞が選択的に形質導入される、特徴２５に記載の方法。
【0014】
２９．ステップ（ｂ）がインビボで行なわれる、特徴２５～２８のいずれかに記載の方法。
３０．ステップ（ｂ）が、インビボで行われ、静脈内、腫瘍内、髄内、または腹腔内注射によるベクターの投与を含む、特徴２５～２８のいずれかに記載の方法。
３１．特徴９～１５のいずれか１つに記載のベクターの製造方法であって、ＣＤ３＋細胞の形質導入に用いるベクターに、特徴１～８のいずれかに記載のプロモータ配列を付加することを含む、前記方法。
３２．プロモータ配列が、ベクターの製造に使用されるパッケージング細胞またはプロデューサー細胞における導入遺伝子の発現を支持しない、特徴３１に記載の方法。
３０．ステップ（ｂ）が、インビボで行われ、静脈内、腫瘍内、髄内、または腹腔内注射によるベクターの投与を含む、特徴２５～２８のいずれかに記載の方法。
３１．特徴９～１５のいずれか１つに記載のベクターの製造方法であって、ＣＤ３＋細胞の形質導入に用いるベクターに、特徴１～８のいずれかに記載のプロモータ配列を付加することを含む、前記方法。
３２．プロモータ配列が、ベクターの製造に使用されるパッケージング細胞またはプロデューサー細胞における導入遺伝子の発現を支持しない、特徴３１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、異なるヒトＴ細胞特異的プロモータの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を用いて得られたインビボの結果である。フローサイトメトリーにより分析した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図１Ａ）、Ｒａｍｏｓ細胞（図１Ｂ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１Ｃ）の導入後７２時間における各試験プロモータに対する導入効率を示す。対照細胞は形質導入せず（ＮＴ）、実験中ずっと培養しておき、陽性対照はＧＦＰの発現を駆動するためにユビキタスＣＭＶプロモータを運ぶＬＶで形質導入された細胞によって得られた。各プロモータについて、３種類の複数感染（ＭＯＩ）を評価した。
【0016】
【図2A】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃは、異なるヒトＴ細胞特異的プロモータの制御下でＧＦＰをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）をヒトＰＢＭＣに形質導入した後に得られたインビボの 結果を示す。総合ＣＤ４５＋細胞（図２Ａ）、ＣＤ１９＋細胞（図２Ｂ）、ＣＤ３＋細胞（図２Ｃ）のいずれかのフローサイトメトリーにより、形質導入後７２時間における各試験プロモータについて形質導入効率を測定した。対照細胞（ＮＴ）は形質導入されなかったが、実験中ずっと活性化され培養されたままだった。
【0017】
【発明を実施するための形態】
【0018】
詳細な説明
本技術は、CD3+細胞で所望の導入遺伝子を発現させるために使用するプロモータ配列を提供する。各プロモータ配列は、導入遺伝子を発現させるためのベクターに、導入遺伝子配列のすぐ上流、導入遺伝子に最も近接した５’位の非翻訳領域に挿入することができる。このプロモータはＣＤ３＋細胞での発現に特異的であり、遺伝子導入や免疫療法、特にベクターを患者に導入するｉｎ ｖｉｖｏ療法に用いる場合の安全性と特異性の高レベルを追加する。
本技術は、CD3+細胞で所望の導入遺伝子を発現させるために使用するプロモータ配列を提供する。各プロモータ配列は、導入遺伝子を発現させるためのベクターに、導入遺伝子配列のすぐ上流、導入遺伝子に最も近接した５’位の非翻訳領域に挿入することができる。このプロモータはＣＤ３＋細胞での発現に特異的であり、遺伝子導入や免疫療法、特にベクターを患者に導入するｉｎ ｖｉｖｏ療法に用いる場合の安全性と特異性の高レベルを追加する。
【0019】
本技術の一態様は、ＣＤ３＋細胞における導入遺伝子の発現に使用するためのプロモータ配列である。プロモータ配列は、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれかの少なくともヌクレオチド１５０１～２０００またはその変異体を含む。 あるいは、プロモータ配列は、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド１００１～２０００、配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド５０１～２０００、または配列番号２～１０もしくは１２～１６のいずれか１つのヌクレオチド１～２０００、もしくはこれらのいずれかの配列変異体を含むことが可能である。 さらなるプロモータ配列は、配列の３’末端から始まり５’方向に伸びるヌクレオチドの１つ以上のブロックを含むことによって、配列番号２～１６のいずれか、またはその変異体から誘導することができ、ヌクレオチドのそのようなブロックは、２００、３００、４００、５００、６００、７００、またはそれ以上のヌクレオチドを含み、５‘末端の配列の第１のヌクレオチドの最大まで伸長し得る。例えば、実施例８に記載された配列番号１９～２９を参照されたい。上記のような配列変異体は、記載の配列またはその相補体に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有することが可能である。
【0020】
本技術のプロモータ配列の別の態様は、ＮＦ－カッパＢ、ＡＰ－１、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－３、およびＮＦＡＴからなる群から選択される１つ以上の転写因子、または別の転写因子に対する結合配列を含有することができることである。転写因子結合部位は、プロモータ配列内で、任意の組み合わせ、任意の位置、任意の順序で存在することができる。プロモータ配列またはプロモータ候補配列における転写因子結合部位を同定するためのオンラインツールは、http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3 で利用可能である。
【0021】
本技術のプロモータ配列のさらに別の態様は、ＣＤ３－細胞と比較して、ＣＤ３＋細胞における導入遺伝子のインビトロ またはインビボ発現を選択的に促進することができることである。例えば、ＣＤ３－細胞に対するＣＤ３＋細胞の発現比率は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、またはさらに５０：１もしくは１００：１、もしくはそれ以上であり得る。プロモータ配列は、ＣＤ４＋またはＣＤ４－であるＣＤ３＋細胞、ＣＤ８＋またはＣＤ８－であるＣＤ３＋細胞、あるいはＣＤ４＋ ＣＤ８＋またはＣＤ４－ ＣＤ８－であるＣＤ３＋細胞における導入遺伝子の発現を促進することができる。
【0022】
本技術のさらに別の態様は、上述したいずれかのプロモータ配列を含有するベクターである。ベクターは、例えば、レンチウイルスベクター（ＬＶ）などのウイルスベクターであることができる。ベクターはまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／１４５７９６Ａ２に記載されるような、ベクター粒子の表面にウイルス融合タンパク質を欠く「はげた」レンチウイルス・ベクター、または他のウイルスベクターであり得る。遺伝子導入ビークルとして使用されるレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルスなどの他のウイルスベクターは、上記のプロモータ配列を組み入れることができます。ベクターは、免疫療法に用いられる細胞や、組換えタンパク質の生産に用いられる細胞などに存在させることができる。本技術のプロモータはまた、プラスミドまたはｍＲＮＡ分子を含むＲＮＡ分子などの核酸分子に、その制御下にある１つ以上の導入遺伝子とともに、細胞に送達させるためにパッケージすることができる。ベクター、プラスミド、または核酸分子は、ポリマーカプセル化ベクターを含むか、またはポリマーカプセル化ベクターからなるナノ粒子を含む、ポリマー含有ナノ粒子などのナノ粒子にパッケージすることができる。このようなナノ粒子のポリマーは、オリゴペプチドのエンドキャップを含有するＰＢＡＥポリマーを含む、ポリ（β-アミノエステル）であることができる。ベクターには、標的細胞で発現させるための導入遺伝子を含有する。導入遺伝子は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞、Ｔｈ細胞、またはＴｒｅｇ細胞を含むＴ細胞またはＴ細胞のサブ集団の活性を高めることに関与する免疫療法を意図する遺伝子を含む、任意の遺伝子であり得る。
【0023】
本技術のプロモータは、任意の導入遺伝子の発現を促進するために用いることができるが、導入遺伝子は、例えば、ＣＴＬＡ―４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ ３、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、４－１ＢＢ、またはＣＤ４７の阻害剤などの抗チェックポイントタンパク質またはポリペプチドをコードすることができる。導入遺伝子は、その代わりに、腫瘍抗原や細菌、ウイルス、酵母、寄生虫などの病原体表面の抗原など、任意の所望の抗原に対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードすることができる。ＣＡＲは、ＣＡＲ結合用のドメインと、腫瘍抗原や細菌、ウイルス、酵母、寄生虫などの病原体表面の抗原との結合に適した抗原結合ドメインを有するアダプター分子に結合する、万能ＣＡＲとすることができる。導入遺伝子は、免疫反応を誘発し、ワクチンとして機能することができるタンパク質またはタンパク質の組み合わせとすることができる。誘発された免疫応答は、予防的または治療的であり得、細菌、ウイルス、その他の微生物病原体、または癌細胞、あるいは被験者の体内に見出された別の望ましくない細胞タイプに対する免疫応答を刺激することができる。
【0024】
本技術の別の態様は、ＣＤ３＋細胞において導入遺伝子を発現させる方法である。本方法は、以下のステップを含む：（ａ）上記のようなベクターまたはナノ粒子およびＣＤ３＋細胞を提供するステップ；（ｂ）ベクターまたはナノ粒子で、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞を形質導入するステップ、および（ｃ）形質導入された細胞において導入遺伝子が発現されるようにするステップ。ベクターまたはナノ粒子は、導入遺伝子、およびその遺伝子の近傍の５’位の非翻訳領域に上述したようなプロモータを含む。
本技術のさらに別の態様は、上記のベクターを製造する方法である。本方法は、ＣＤ３＋細胞の形質導入に用いるベクターに、上述したプロモータ配列のいずれかを付加することを含む。
本技術のさらに別の態様は、上記のベクターを製造する方法である。本方法は、ＣＤ３＋細胞の形質導入に用いるベクターに、上述したプロモータ配列のいずれかを付加することを含む。
【実施例】
【0025】
実施例１：Ｔ細胞プロモータの制御下にある導入遺伝子を含有するレンチウイルスベクターの作製。
異なるバッチのレンチウイルスベクター（ＬＶ）を調製し、導入遺伝子の発現を調べるためにインビトロで試験した。ＬＶは以下の材料と方法で作製した。
異なるバッチのレンチウイルスベクター（ＬＶ）を調製し、導入遺伝子の発現を調べるためにインビトロで試験した。ＬＶは以下の材料と方法で作製した。
【0026】
Ｔ細胞プロモータの選択
Ｔリンパ球は、ＣＤ３－陽性の免疫細胞の多様な集団を表し、主な種類として、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋、Ｔｃ細胞）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋、Ｔｈ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）がある。ＣＤ３受容体を発現する造血系には、様々な分化の段階の未熟な集団（ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）や、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を起源とする自然リンパ系細胞も含まれている。
ＣＤ３陽性細胞に特異的に発現するプロモータを直交する手法で設計した。ＣＤ３＋細胞で過剰発現させるために、１５個のプロモータのセットを選択した（配列番号２～１６）；これらのプロモータを表１に示す。このうち、３つのプロモータ（配列番号８、１２、１５）は、ＴｒｅｇおよびＢ細胞で部分的に抑制されていることが文献に説明されている。
Ｔリンパ球は、ＣＤ３－陽性の免疫細胞の多様な集団を表し、主な種類として、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋、Ｔｃ細胞）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋、Ｔｈ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）がある。ＣＤ３受容体を発現する造血系には、様々な分化の段階の未熟な集団（ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）や、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を起源とする自然リンパ系細胞も含まれている。
ＣＤ３陽性細胞に特異的に発現するプロモータを直交する手法で設計した。ＣＤ３＋細胞で過剰発現させるために、１５個のプロモータのセットを選択した（配列番号２～１６）；これらのプロモータを表１に示す。このうち、３つのプロモータ（配列番号８、１２、１５）は、ＴｒｅｇおよびＢ細胞で部分的に抑制されていることが文献に説明されている。
【0027】
Ｔ細胞プロモータの分子クローニング
プロモータはＭｌｕＩとＢａｍＨＩ制限部位で挟まれた合成遺伝子としてオーダーされ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流でトランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰにサブクローン化された。ＣＭＶプロモータ（配列番号：１）は、ユビキタスな方法で高レベルで導入遺伝子の発現を駆動するので、参照物質として選択された。配列番号３、４、５については、プロモータ領域内にＢａｍＨＩサイトが存在するため、ＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩサイトをフランキングサイトとして選択した。
同じ戦略で、細胞アッセイで実証されたＴ細胞特異的活性を持つプロモータを、ヒトＣＤ１９抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＯＲＦの上流の第２のトランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ＣＡＲ－ＣＤ１９にサブクローン化した。
プロモータはＭｌｕＩとＢａｍＨＩ制限部位で挟まれた合成遺伝子としてオーダーされ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流でトランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰにサブクローン化された。ＣＭＶプロモータ（配列番号：１）は、ユビキタスな方法で高レベルで導入遺伝子の発現を駆動するので、参照物質として選択された。配列番号３、４、５については、プロモータ領域内にＢａｍＨＩサイトが存在するため、ＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩサイトをフランキングサイトとして選択した。
同じ戦略で、細胞アッセイで実証されたＴ細胞特異的活性を持つプロモータを、ヒトＣＤ１９抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＯＲＦの上流の第２のトランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ＣＡＲ－ＣＤ１９にサブクローン化した。
【0028】
【表1-1】
【表1-2】
【0029】
素材
トランスファーベクタープラスミドは、pARA-XXX-GFP と pARA-XXX-CAR-CD19であった。プロウイルス（ＨＩＶ－１、ＮＬ４－３株由来の非病原性・非複製型遺伝子組み換えプロウイルスＤＮＡ）をコードするカナマイシン耐性プラスミドで、ＧＦＰまたはＣＡＲ ＣＤ１９をコードする発現カセットがクローニングされている。このインサートには、導入遺伝子、導入遺伝子発現のためのプロモータ、導入遺伝子の発現を増加させ、レンチウイルスベクターが非正常細胞を含むあらゆる種類の細胞を形質導入できるようにするために加えられた配列が含まれていた。プロモータは、ヒトＴ細胞プロモータ、またはエンハンサー配列を除いたＣＭＶプロモータであった。非コード配列と発現シグナルは、５’ＬＴＲはシスアクティブな要素を全て含むロング・ターミナル・リピート配列（ＬＴＲ）（Ｕ３－Ｒ－Ｕ５）に、３’ＬＴＲはプロモータ領域を欠くため削除したもの（ΔＵ３－Ｒ－Ｕ５）に対応した。転写および統合実験のために、カプセル化配列（ＳＤおよび５’Ｇａｇ）、ベクターの核内転位のための中央ポリプリン体トラクト／中央終結部位、およびＢＧＨポリアデニル化部位を追加した。
トランスファーベクタープラスミドは、pARA-XXX-GFP と pARA-XXX-CAR-CD19であった。プロウイルス（ＨＩＶ－１、ＮＬ４－３株由来の非病原性・非複製型遺伝子組み換えプロウイルスＤＮＡ）をコードするカナマイシン耐性プラスミドで、ＧＦＰまたはＣＡＲ ＣＤ１９をコードする発現カセットがクローニングされている。このインサートには、導入遺伝子、導入遺伝子発現のためのプロモータ、導入遺伝子の発現を増加させ、レンチウイルスベクターが非正常細胞を含むあらゆる種類の細胞を形質導入できるようにするために加えられた配列が含まれていた。プロモータは、ヒトＴ細胞プロモータ、またはエンハンサー配列を除いたＣＭＶプロモータであった。非コード配列と発現シグナルは、５’ＬＴＲはシスアクティブな要素を全て含むロング・ターミナル・リピート配列（ＬＴＲ）（Ｕ３－Ｒ－Ｕ５）に、３’ＬＴＲはプロモータ領域を欠くため削除したもの（ΔＵ３－Ｒ－Ｕ５）に対応した。転写および統合実験のために、カプセル化配列（ＳＤおよび５’Ｇａｇ）、ベクターの核内転位のための中央ポリプリン体トラクト／中央終結部位、およびＢＧＨポリアデニル化部位を追加した。
【0030】
パッケージングプラスミドはpARA-Packであった。カナマイシン耐性プラスミドには、レンチウイルス・プロウイルスのカプセル化にトランスで使用される、構造レンチウイルスタンパク質（ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＴＡＴ、ＲＥＶ）をコードした。コード化配列はポリシストロン遺伝子gag-pol-tat-revに対応し、構造タンパク質（マトリックスＭＡ、カプシドＣＡおよびヌクレオカプシドＮＣ）、酵素タンパク質（プロテアーゼＰＲ、 インテグラーゼＩＮおよびリバーストランスクリプターゼ ＲＴ）および制御タンパク質（ＴＡＴ および ＲＥＶ）をコードしていた。非コード配列および発現シグナルは、転写開始のためのＣＭＶからの最小プロモータ、転写停止のためのインスリン遺伝子からのポリアデニル化シグナル、パッケージングＲＮＡの核エキスポートに関係するＨＩＶ－１Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）に対応していた。
【0031】
エンベローププラスミドは、使用する場合はｐＥＮＶ１であった。このカナマイシン耐性プラスミドは、レンチウイルスベクターの一部のシュードタイピングに使用した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）インディアナ株の糖タンパク質Ｇをコードしていた。ＶＳＶ－Ｇ遺伝子は、ヒト細胞での発現にコドン最適化され、ｐＶＡＸ１プラスミド（Invitrogen社製）にクローン化された。コード配列はコドン最適化されたＶＳＶ－Ｇ遺伝子に対応し、非コード配列と発現シグナルは、転写開始のためのＣＭＶからの最小プロモータと、ＲＮＡを安定化するためのＢＧＨポリアデニル化部位に対応していた。
【0032】
ＶＳＶ－Ｇの製造－（”はげた”）レンチウイルスベクター粒子の作製
【0033】
ＬＶ２９３細胞を、１０００ｍＬのＬＶ－Ｍａｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中の２ Ｘ ３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）中で５ｘ１０５ 細胞／ｍＬで播種した。２つのエルレンマイヤーを３７℃、６５ｒｐｍ、８ ％ＣＯ２加湿下で培養した。播種翌日、一過性のトランスフェクションを行った。PEIProトランスフェクタント試薬（PolyPlus Transfection、Illkirch、フランス）を、トランスファーベクタープラスミド（pARA-CMV-GFPまたはpARA-XXX-GFPまたはpARA-XXX-CAR-CD19）および包装プラスミド（pARA-Pack）と混合した。室温で培養した後、PEIPro/Plasmidの混合物を細胞株に滴下し、３７℃、６５ｒｐｍ、８％ＣＯ２加湿下で培養した。３日目、レンチベクター作製は最終濃度５ ｍＭの酪酸ナトリウムで刺激された。このバルク混合物を３７℃、６５ｒｐｍ、加湿８％ＣＯ２下で２４時間培養した。５μｍと０．５μｍで深層ろ過（Pall Corporation製）によって清澄化した後、清澄化したバルク混合物を室温で１時間培養し、ＤＮａｓｅ処理を行った。
【0034】
レンチベクターの精製はQ mustang membrane （Pall Corporation製）を用いたクロマトグラフィーで行い、ＮａＣｌ 勾配で溶出させた。接線流ろ過は１００ ｋＤａのＨＹＤＲＯＳＯＲＴ膜（Sartorius社製）で行い、容量を減らし、ｐＨ７の特定のバッファーで調製し、少なくとも２年間の安定性を確保することができた。０．２２ μｍ （Millipore社製） で無菌ろ過した後、バルク製剤を２ ｍＬ ガラスバイアルに１ ｍｌ 未満のアリコートを充填し、ラベルを付けて冷凍保存し、＜ －７０℃ で保存した。
【0035】
はげたＬＶ数は、p24 ELISAとqRT-PCRの２つの方法による物理的力価定量で評価した。p24 ELISAは、レンチウイルスに関連するHIV-1 p24コアタンパク質のみを検出・定量することにより行った（Cell Biolabs Inc.製）サンプルを前処理することで、遊離したｐ２４と破壊されたレンチベクターを区別することができる。qRT-PCRは、Nucleospin ＲＮＡウイルスキット（Macherey Nagel社製）でレンチウイルスＲＮＡを精製し、Lenti-X qRT-PCR 滴定キット（Takara社製）で定量することにより行った。各ＬＶバッチについて、物理的力価、粒子径、粒度分布をナノ粒子トラッキングアナライザーと動的光散乱法（それぞれViewsizer 3000とNanoPartica SZ-100V2装置、Horiba Instruments Inc製、 米国）で測定した。分析は、ＬＶを製剤用緩衝液で希釈（ＤＬＳは１０倍、ＮＴＡは３００倍）した後、室温で行ったが、サンプルの生物物理学的特性に影響を与えないようにろ過は行わなかった。結果は、各装置の制御用堀場製作所製ソフトウエアを用いて決定した。
ＶＳＶ－Ｇの製造－（”類似型”）レンチウイルス・ベクター粒子の作製
ＶＳＶ－Ｇの製造－（”類似型”）レンチウイルス・ベクター粒子の作製
【0036】
PEIProトランスフェクタント試薬 （PolyPlus社製、 115-010）を、トランスファーベクタープラスミド（pARA-CMV-GFPまたはpARA-XXX-GFPまたはpAra-XXX-CAR-CD19）、包装プラスミド（pARA-Pack）およびエンベローププラスミド（pENV1）と混合した以外は上記と同様の方法を用いた。擬似型レンチベクターに対する滴定は、バイオプロダクションの際に得られた清澄バルクをHEK293T細胞（8x105細胞／ウェル）に形質導入して３日後に定量ＰＣＲによって行った。
【0037】
表２に示すように、これらのプロモータ領域が著しく長いにもかかわらず、生産収量はＣＭＶプロモータを用いて得られたものと概ね同程度の効果を示した。すべてのコンストラクトにおいて、力価は少なくとも107TU/mLの範囲にあり、異なる生産ステップ間で一貫していた。配列番号４と８をベースにしたプロモータで最も低い力価が得られた。生産収量が低いと将来的に工業化が困難になるため、生産収量はプロモータの選定基準となっている。いずれにせよ、工業的なバイオプロダクションに影響を与えるような問題は見られなかった。
【0038】
表２：バイオインフォマティクスアプローチによりCD3陽性細胞で発現することが確認された１４のヒトプロモータの制御下でＧＦＰをコードする擬似型ＬＶについて得られた生産収量の概要。
【0039】
【表2】
【0040】
実施例２：Ｔ細胞プロモータの制御下で導入遺伝子を含有するレンチウイルスベクターによるHEK293T、RamosおよびJurkat細胞の形質導入。
バイオインフォマティクスツールで同定した１５個のプロモータのＣＤ３特異的活性を調べるため、所定のプロモータの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を導入した疑似型レンチウィルス・ベクターを用いて、異なるヒト細胞型を形質導入し、ＧＦＰ発現を解析した。これらの研究は、ＣＤ３陽性のＪｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病ヒト細胞株 - ATCC TIB-152）、ＣＤ３陰性のＲａｍｏｓ（バーキットリンパ腫ヒト細胞株 - ATCC CRL-1596）および非リンパ球のHEK293T（ヒト胚腎細胞株 - ATCC CRL-1573）を用いて実施された。
バイオインフォマティクスツールで同定した１５個のプロモータのＣＤ３特異的活性を調べるため、所定のプロモータの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を導入した疑似型レンチウィルス・ベクターを用いて、異なるヒト細胞型を形質導入し、ＧＦＰ発現を解析した。これらの研究は、ＣＤ３陽性のＪｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病ヒト細胞株 - ATCC TIB-152）、ＣＤ３陰性のＲａｍｏｓ（バーキットリンパ腫ヒト細胞株 - ATCC CRL-1596）および非リンパ球のHEK293T（ヒト胚腎細胞株 - ATCC CRL-1573）を用いて実施された。
【0041】
ＨＥＫＴ２９３細胞を１０％ ＦＢＳ （Gibco Invitrogen社製）、 １％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（Gibco Invitrogen社製）にウェル当たり８ｘ１０４個の細胞密度で２４ウェルプレートに播種し、４時間インキュベートして固着させた。その後、培地を３００μＬのレンチウイルベクター（ＭＯＩ１、５または１０）で置き換えて、培養培地または培養培地（ＮＴコントロール）中で細胞を形質導入し、その後３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートした。 吸着後、各ウェルに1mLの完全培地を添加した。形質導入後７２時間目に細胞をトリプシン処理し、２００μＬのＣｅｌｌｆｉｘ １Ｘに再懸濁した後、ＢＬ１チャンネルを用いてＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（ThermoFisher社製）でＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを測定した。
【0042】
ＪｕｒｋａｔとＲａｍｏｓ細胞を１０％ＦＢＳ（Gibco Invitrogen社製）、 １％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Gibco Invitrogen社製）中にウェル当たり８ｘ１０４個の細胞密度で２４ウェルプレートに播種した。その後、培養培地中、または培養培地単独（ＮＴコントロール）で培地を300μLのレンチウイルスベクター（感染数（ＭＯＩ）１０、３０、５０）で置き換えて、細胞を形質導入させた。３７℃，５％，ＣＯ２下で２時間培養した後，５００μLの新鮮な完全培地を各ウェルに加えた。ＧＦＰ導入遺伝子を発現している細胞の割合は、BL1チャンネルを使用したAttune NxTフローサイトメーターで形質導入後７２時間後に測定された。
【0043】
生細胞とGFP陽性細胞の割合は、デブリ除外/生存/単細胞でゲーティングすることにより測定された。グラフ化されたデータは、代表的な実験の３連の平均を表す。
【0044】
図１Ａ（HEK293T細胞）, 1B（Ramos CD3-細胞）, 1C（Jurkat CD3+細胞）に示した結果から、全ての細胞種において、プロモータ間で発現パターンの違いが観察されたことがわかる。 ユビキタスCMVプロモータで観察されたレベルより低いものの、有意なGFP発現（10%以上）は、3つの試験したMOIで、ヒトCD3陰性リンパ球（ラモス細胞）および非リンパ球細胞（HEK293T）において、プロモータZAP70（配列番号：５）、BCL11B（配列番号６）、TCF7（配列番号８）、TIGIT（配列番号９）、GIMAP7（配列番号１０）およびEOMES（配列番号１２）で測定し、CD3陽性細胞に特異性がないことを除外していた。
【0045】
TNFS8（配列番号：３）, UBASH3（配列番号：４）, CTLA4（配列番号：７）, ICOS（配列番号：１３） およびLCK（配列番号：１４） プロモータは、ＣＤ３陽性Jurkat細胞において、CMVプロモータと同等のレベルの最高のGFP発現（MOI 10で40 %以上）を駆動していることを示した。しかし、これらのプロモータを持つCD3陰性細胞では、バックグラウンドのGFP発現（5-10 %のGFP陽性細胞）が検出された。プロモータLAIR2（配列番号２）、TCR（配列番号１１） およびITK（配列番号１５） により、用量依存的かつ厳密にCD3陽性Jurkat細胞に限定したGFP発現が達成された。これら最後の３つのプロモータのCD3特異的活性は、より弱いGFPの発現をもたらし、MOI50で最大値45 %に達した。
注目すべきは、テストしたプロモータのいずれも、形質導入された細胞の生存率に影響を及ぼさなかったことである（データは示されていない）。
注目すべきは、テストしたプロモータのいずれも、形質導入された細胞の生存率に影響を及ぼさなかったことである（データは示されていない）。
【0046】
実施例３：Ｔ細胞プロモータの制御下にある導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターを用いたヒトＰＢＭＣの形質導入。
ヒトＰＢＭＣの精製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なドナー（Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes社製）から入手したバフィーコートから分離された。血液をDPBSで希釈した後、PBMCをFICOLL密度勾配（ＧＥヘルスケア社）上で分離し、DPBSで２回洗浄した。その後、ACK溶解バッファー（Gibco社）中でPBMCを５分間インキュベートし、さらにDPBS洗浄を行う間に残留赤血球を溶解させた。BMCは１０％DMSO（Sigma社）、90 % FBS（Gibco社）中で２０ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で凍結し、使用時まで－１５０℃で保存した。
ヒトＰＢＭＣの精製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なドナー（Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes社製）から入手したバフィーコートから分離された。血液をDPBSで希釈した後、PBMCをFICOLL密度勾配（ＧＥヘルスケア社）上で分離し、DPBSで２回洗浄した。その後、ACK溶解バッファー（Gibco社）中でPBMCを５分間インキュベートし、さらにDPBS洗浄を行う間に残留赤血球を溶解させた。BMCは１０％DMSO（Sigma社）、90 % FBS（Gibco社）中で２０ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で凍結し、使用時まで－１５０℃で保存した。
【0047】
ＶＳＶ－Ｇ＋（擬似型）レンチウイルスベクターによるＰＢＭＣの活性化と形質導入
実施例２でスクリーニングした６つのプロモータのCD3特異的活性を、所定のプロモータの制御下でGFP導入遺伝子を導入したＬＶで以って、ヒト静止細胞内にて評価し、あらかじめ凍結したヒトPBMCに形質導入した。解凍したヒトPBMCを１０％ FBS（Gibco社） と１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco社） を含むRPMI培地に細胞当たり１ｘ１０６ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、CD3-CD28 Dynabeads（Gibco社） 存在下で活性化して３７と５％CO2下で７２時間インキュベートした。次に、活性化したPMBCをプールし、１Ｘ１０５個の細胞の密度で２４ウェルプレートの培養培地または培養培地のみ（ＮＴコントロール）中で、カプセル化した偽型ＬＶ（２０、５０または１００のMOIで）で形質導入した。３７℃、５％ＣＯ２下で２時間培養した後，５００μＬの新鮮な培養液（Gibco Invitrogen社製）を各ウェルに加え、７２時間培養した。GFPを発現している細胞の割合は、Attune NxTフローサイトメーターを用いて形質導入後７２時間後に測定した。GFP導入遺伝子を発現する形質導入細胞の表現型は、製造元の指示（Biolegend社）：CD3-AF700, CD14-PE-Cy7, CD16-BV711, CD19- BV605, CD45-BV510, CD56-BV421 およびZombie NIRによる生死識別、に従い、以下の細胞種に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー染色により決定した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を５００×ｇで ２分間遠心分離し、CellFix溶液（BD Biosciences社製）で固定した。BL1（GFP）, RL2（AF700色素）, RL3（Zombie NIR）, VL1（BV421 色素）, VL2（BV510 dye）, VL3（BV605 dye）, VL4（BV711色素） および YL4（PE-Cy7 色素） チャンネルのフローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen, Inc） によって蛍光陽性細胞のカウントをした．細胞の表現型は、ＣＤ４５＋、生存細胞、単一細胞について以下のように定義した。Ｔリンパ球（ＣＤ３＋－ＣＤ１９－）、Bリンパ球（ＣＤ３－－ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－－ＣＤ１９－－ＣＤ５６＋）、単球（ＣＤ１４＋）および顆粒球（ＳＳＣｈｉｇｈ－ＣＤ１６＋）である。
実施例２でスクリーニングした６つのプロモータのCD3特異的活性を、所定のプロモータの制御下でGFP導入遺伝子を導入したＬＶで以って、ヒト静止細胞内にて評価し、あらかじめ凍結したヒトPBMCに形質導入した。解凍したヒトPBMCを１０％ FBS（Gibco社） と１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco社） を含むRPMI培地に細胞当たり１ｘ１０６ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、CD3-CD28 Dynabeads（Gibco社） 存在下で活性化して３７と５％CO2下で７２時間インキュベートした。次に、活性化したPMBCをプールし、１Ｘ１０５個の細胞の密度で２４ウェルプレートの培養培地または培養培地のみ（ＮＴコントロール）中で、カプセル化した偽型ＬＶ（２０、５０または１００のMOIで）で形質導入した。３７℃、５％ＣＯ２下で２時間培養した後，５００μＬの新鮮な培養液（Gibco Invitrogen社製）を各ウェルに加え、７２時間培養した。GFPを発現している細胞の割合は、Attune NxTフローサイトメーターを用いて形質導入後７２時間後に測定した。GFP導入遺伝子を発現する形質導入細胞の表現型は、製造元の指示（Biolegend社）：CD3-AF700, CD14-PE-Cy7, CD16-BV711, CD19- BV605, CD45-BV510, CD56-BV421 およびZombie NIRによる生死識別、に従い、以下の細胞種に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー染色により決定した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を５００×ｇで ２分間遠心分離し、CellFix溶液（BD Biosciences社製）で固定した。BL1（GFP）, RL2（AF700色素）, RL3（Zombie NIR）, VL1（BV421 色素）, VL2（BV510 dye）, VL3（BV605 dye）, VL4（BV711色素） および YL4（PE-Cy7 色素） チャンネルのフローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen, Inc） によって蛍光陽性細胞のカウントをした．細胞の表現型は、ＣＤ４５＋、生存細胞、単一細胞について以下のように定義した。Ｔリンパ球（ＣＤ３＋－ＣＤ１９－）、Bリンパ球（ＣＤ３－－ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－－ＣＤ１９－－ＣＤ５６＋）、単球（ＣＤ１４＋）および顆粒球（ＳＳＣｈｉｇｈ－ＣＤ１６＋）である。
【0048】
図に示した結果２Ａ（全ＣＤ４５＋ ＰＢＭＣ）、２Ｂ （ＰＢＭＣ中ＣＤ１９＋ 細胞 ） および ２Ｃ（ＰＢＭＣ中ＣＤ３＋ 細胞 ） は、試験したプロモータで得られたＧＦＰ発現パターンの違いを示している。最も高いＧＦＰ発現（４０％以上）は、全ＣＤ４５＋ＰＢＭＣに対して、プロモータＣＴＬＡ４（配列番号７）およびＩＣＯＳ（配列番号１３）を有する２つの試験済みＭＯＩおけるゲートが設けられたＣＤ３＋ Ｔ細胞間で測定された。しかしＬＡＩＲ２（配列番号２）、ＬＣＫ（配列番号：１４）、 ＴＣＲ（配列番号：１１）、ＴＮＰＳ８（配列番号：３）ではＣＤ３＋細胞株に対するよりもＣＤ３＋一次細胞におけるＧＦＰ発現の方が弱い（２０％以下）ことがわかった。また、ＭＯＩ１００のＬＣＫ（配列番号１４）のみ、ＣＤ１９＋細胞にＣＭＶと同レベルのＧＦＰ発現を誘発することが示された。他の選択されたプロモータはＣＭＶより弱いＧＦＰ発現となり、細胞株、一次サンプルともにＣＤ３＋選択性が確認された。注目すべきは、テストしたプロモータのいずれも、形質導入された細胞の生存率に影響を及ぼさなかったことである（データは示されていない）。
【0049】
実施例４：ＰＢＡＥ－カプセル化ＶＳＶ－Ｇ－（”はげた”）ＬＶを用いた一次リンパ球およびＰＢＭＣの形質導入。
実施例２および３でスクリーニングしたプロモータのＣＤ３特異的活性を、所定のプロモータの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を運ぶＰＢＡＥカプセル化はげたＬＶを用いてヒト静止細胞において評価し、ヒトＰＢＭＣに形質導入した。ＰＢＭＣは、健康なドナー（Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes）から得たバフィーコートから、あるいはLonzaおよびCALYM Network（Centre Hospitalier Lyon-Sud, France） バイオバンクで入手できる精製・冷凍細胞としてのリンパ腫患者の血液サンプルから分離したものである。
実施例２および３でスクリーニングしたプロモータのＣＤ３特異的活性を、所定のプロモータの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を運ぶＰＢＡＥカプセル化はげたＬＶを用いてヒト静止細胞において評価し、ヒトＰＢＭＣに形質導入した。ＰＢＭＣは、健康なドナー（Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes）から得たバフィーコートから、あるいはLonzaおよびCALYM Network（Centre Hospitalier Lyon-Sud, France） バイオバンクで入手できる精製・冷凍細胞としてのリンパ腫患者の血液サンプルから分離したものである。
【0050】
ヒトＰＢＭＣの精製
新鮮な血液をＤＰＢＳで希釈した後、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ密度勾配（ＧＥヘルスケア社）上で分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＡＣＫ溶解バッファー（Gibco社）中でＰＢＭＣを５分間インキュベートし、さらにＤＰＢＳ洗浄を行う間に残留赤血球を溶解させた。ＰＢＭＣは１０％ ＤＭＳＯ（Sigma社）、９０％ ＦＢＳ （Gibco社）中で２０ｘ１０６ 細胞／ｍＬ の密度で凍結し、使用時まで－１５０℃で保存した。
新鮮な血液をＤＰＢＳで希釈した後、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ密度勾配（ＧＥヘルスケア社）上で分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＡＣＫ溶解バッファー（Gibco社）中でＰＢＭＣを５分間インキュベートし、さらにＤＰＢＳ洗浄を行う間に残留赤血球を溶解させた。ＰＢＭＣは１０％ ＤＭＳＯ（Sigma社）、９０％ ＦＢＳ （Gibco社）中で２０ｘ１０６ 細胞／ｍＬ の密度で凍結し、使用時まで－１５０℃で保存した。
【0051】
ＰＢＡＥの形質導入－ＶＳＶ－Ｇ－（はげた）レンチウイルスベクターのカプセル化
一般に非分裂細胞はＬＶでの形質導入が困難であるため（サイトカインやCD3-CD28の活性化なしで）、代わりにオリゴペプチド修飾ポリ（β-アミノエステル）ポリマーがトランスフェクション剤として使用されている。ＯＭ－ＰＢＡＥは、遺伝物質（プラスミドまたは他の核酸分子）を真核細胞に送達できるポリマーカプセル化ビヒクルを形成するトランスフェクション剤として既に文献に記載されている（US2016/0145348A1, Mangravitiet al. 2015,Andersonet al. 2004、WO2016/116887）。ＯＭ－ＰＢＡＥは、形質導入不全のレンチウイルスベクターをコーティングし、レポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質－ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ）およびＣＡＲを含む様々な導入遺伝子を安定的に発現するようにヒト細胞を遺伝子操作するのに首尾よく使用された（WO2019/145796を参照）。以下のカプセル化実験に使用したポリマーは、荷電ペプチドと結合したポリ（β-アミノエステル）（ＰＢＡＥ）である。ポリマーＰＢＡＥ－ＣＲ３は、ペプチドＣＲＲＲ（配列番号：１７（両末端が同じペプチド））に結合したＰＢＡＥを意味する。ＰＢＡＥ－ＣＨ３ポリマーは、ペプチドＣＨＨＨ（配列番号：１８）に結合したＰＢＡＥを意味する。これらのＯＭ－ＰＢＡＥを６０／４０のモル比で混合して試験する。
一般に非分裂細胞はＬＶでの形質導入が困難であるため（サイトカインやCD3-CD28の活性化なしで）、代わりにオリゴペプチド修飾ポリ（β-アミノエステル）ポリマーがトランスフェクション剤として使用されている。ＯＭ－ＰＢＡＥは、遺伝物質（プラスミドまたは他の核酸分子）を真核細胞に送達できるポリマーカプセル化ビヒクルを形成するトランスフェクション剤として既に文献に記載されている（US2016/0145348A1, Mangravitiet al. 2015,Andersonet al. 2004、WO2016/116887）。ＯＭ－ＰＢＡＥは、形質導入不全のレンチウイルスベクターをコーティングし、レポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質－ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ）およびＣＡＲを含む様々な導入遺伝子を安定的に発現するようにヒト細胞を遺伝子操作するのに首尾よく使用された（WO2019/145796を参照）。以下のカプセル化実験に使用したポリマーは、荷電ペプチドと結合したポリ（β-アミノエステル）（ＰＢＡＥ）である。ポリマーＰＢＡＥ－ＣＲ３は、ペプチドＣＲＲＲ（配列番号：１７（両末端が同じペプチド））に結合したＰＢＡＥを意味する。ＰＢＡＥ－ＣＨ３ポリマーは、ペプチドＣＨＨＨ（配列番号：１８）に結合したＰＢＡＥを意味する。これらのＯＭ－ＰＢＡＥを６０／４０のモル比で混合して試験する。
【0052】
ヒトＰＢＭＣは、１０％ＦＢＳおよび１％ ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地中で、１ｘ１０５ 細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種される。その後、培地を１００～３００μＬの培養液中にカプセル化した偽型ＬＶまたは培養液のみ（ＮＴコントロール）で置き換えることにより、細胞を形質導入する。３７℃，５％ＣＯ２下で２時間培養した後、６００μＬの新鮮な完全培地を各ウェルに加えた。ＧＦＰを発現している細胞の割合は、ＢＬ１チャンネルを使用したＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターで形質導入後７２時間で測定された。ＧＦＰ導入遺伝子を発現する形質導入細胞の表現型は、製造元の指示に従い、以下の細胞種に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー染色により決定した（Biolegend社）:CD3-AF700, CD14-PE-Cy7, CD16-BV711, CD19- BV605, CD45-BV510, CD56-BV421 および生死識別のためのZombie NIR。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を５００×ｇで ２分間遠心分離し、ＣｅｌｌＦｉｘ溶液（BD Biosciences社製）で固定した。BL1（GFP）, RL2（AF700色素）, RL3（Zombie NIR）, VL1（BV421 色素）, VL2（BV510 dye）, VL3（BV605 dye）, VL4（BV711 色素） および YL4（PE-Cy7 色素） チャンネルに対するフローサイトメトリー （AttuneNXT; Invitrogen社） によって蛍光陽性細胞のカウントをした．細胞の表現型は、ＣＤ４５＋、生存細胞、単一細胞について以下のように定義した。Ｔリンパ球（ＣＤ３＋－ＣＤ１９－）、Bリンパ球（ＣＤ３－－ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－－ＣＤ１９－－ＣＤ５６＋）、単球（ＣＤ１４＋）および顆粒球（ＳＳＣｈｉｇｈ－ＣＤ１６＋）である。
【0053】
最後に、この一連の実験は、細胞内ＧＦＰの発現に最も厳しいＣＤ３特異的活性を示したプロモータを用いて行われるが、リンパ球の表面に発現する導入遺伝子の文脈では、ＶＳＶ－Ｇエンベロープを持たず、所定のプロモータの制御下で抗ＣＤ１９ ＣＡＲを運搬するＬＶを用いて、健康なドナーおよびリンパ腫患者のＰＢＭＣを形質導入させることが行われる。ＣＡＲ ＣＤ１９を発現している細胞の割合は、ＢＬ１チャンネルを用い、製造元の指示に従い、ヒトＣＤ１９検出試薬（Miltenyi社）と抗ビオチンＢＢ５１５抗体（Miltenyi社）を用いたフローサイトメトリーにより、導入後７２時間で測定される。
【0054】
実施例５：ＶＳＶ－Ｇの（はげた）レンチウイルスベクター粒子をＯＭ－ＰＢＡＥにカプセル化して、末梢血単核球をインビボ で形質導入。
実施例４で確認した、リンパ球におけるＧＦＰの発現を誘発する最適な２つのプロモータのＣＤ３特異的活性を、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣまたはリンパ腫患者からのＰＢＭＣを移植した免疫不全ＮＳＧマウスにおいてインビボで評価する。また、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植したＮＳＧマウスは、ヒト免疫細胞集団の多系統生着を示すマウスモデルとして使用することができる。所定のプロモータの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を有するＬＶで構成され、ＣＤ３ターゲティング剤と共有結合したＰＢＡＥを含むか、含まないように処方された実施例４に記載のナノ粒子を、ＰＢＭＣまたはＣＤ３４陽性造血幹細胞を以前に注入したマウスに繰り返し静脈内注入する。対照動物には、ビヒクルまたはＶＳＶ－Ｇエンベロープを欠き、ＰＢＡＥポリマーにカプセル化されていない形質導入欠損レンチウイルスベクターを注入する。
実施例４で確認した、リンパ球におけるＧＦＰの発現を誘発する最適な２つのプロモータのＣＤ３特異的活性を、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣまたはリンパ腫患者からのＰＢＭＣを移植した免疫不全ＮＳＧマウスにおいてインビボで評価する。また、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植したＮＳＧマウスは、ヒト免疫細胞集団の多系統生着を示すマウスモデルとして使用することができる。所定のプロモータの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を有するＬＶで構成され、ＣＤ３ターゲティング剤と共有結合したＰＢＡＥを含むか、含まないように処方された実施例４に記載のナノ粒子を、ＰＢＭＣまたはＣＤ３４陽性造血幹細胞を以前に注入したマウスに繰り返し静脈内注入する。対照動物には、ビヒクルまたはＶＳＶ－Ｇエンベロープを欠き、ＰＢＡＥポリマーにカプセル化されていない形質導入欠損レンチウイルスベクターを注入する。
【0055】
発現したＧＦＰ導入遺伝子の生体内分布は、Biolegend社から購入した特定の抗体パネル（CD3-AF700, CD11b-APC, CD11c-PE, CD14-PE-Cy7, CD16-BV711, CD19-BV605, CD45-BV510, CD56-BV421, CD66b-PerCP-Cy5.5, HLA-DR PE-Dazzle594, ゾンビNIR）およびＴ細胞パネル（CD3-AF700, CD4-PerCP-Cy5.5, CD8-BV605, CD25-PE, CD45-BV510, CD45RA-BV711, CD69-PE-Dazzle594, CD127-APC, TCRg/d-PE-Cy7, CCR7（CD197）-BV421 およびゾンビNIR）を用いてフローサイトメトリーで染色し、２４～９０日間毎週全血液細胞について評価する。
【0056】
犠牲時に、脾臓や骨髄から採取した血球や細胞懸濁液で、ＧＦＰ発現細胞の表現型を決定する。犠牲時に採取した血液および臓器から抽出したゲノムＤＮＡを用いた二重定量ＰＣＲにより、ゲノム統合型レンチウイルスベクターの組織生体内分布を解析する。治療毒性は、治療前および治療後１週間間隔で採取した血液サンプルにおける血球数（実施例２に既に記載したフローサイトメトリー）、ＡＬＴ／ＡＳＴ肝酵素（酵素活性キット）およびサイトカインレベル（Ｔｈ１／Ｔｈ２ サイトカイン・ビード・アレイ）の測定によって評価される。週３回、動物の行動、体重、水と餌の消費量を治療の安全性と忍容性を確認するための追加出力として記録する。
【0057】
最後に、この一連の動物実験は、実施例４で選択したプロモータを用いて行うが、リンパ球の表面に発現する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子の状況では、実施例４で選択したプロモータを用いて行う。上述の動物手順との唯一の違いは、実施例４に既に記載した製造者の指示に従って、ヒトＣＤ１９検出試薬（Miltenyi社）および抗ビオチンＢＢ５１５抗体（Miltenyi社）を用いたフローサイトメトリーにより決定するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の表現型の評価にある。
【0058】
実施例６：ＯＭ－ＰＢＡＥにカプセル化した、 ＶＳＶ－Ｇ（”はげた”）レンチウイルスベクター粒子を用いて末梢血単核細胞にしたインビボの形質導入の効率。
実施例４でスクリーニングした、リンパ球におけるＣＡＲ ＣＤ１９の発現を誘発する最良の２つのプロモータのＣＤ３特異的活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を構成的に発現するように改変したラモス癌細胞を有する免疫不全ＮＳＧマウスにおいてインビボで評価する。種々のＮＳＧマウスモデルを使用：健康なドナーのヒトＰＢＭＣまたはリンパ腫患者のＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウス、そして最後に、ヒト免疫細胞集団の多系統移植を示すヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植したＮＳＧマウスである。
実施例４でスクリーニングした、リンパ球におけるＣＡＲ ＣＤ１９の発現を誘発する最良の２つのプロモータのＣＤ３特異的活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を構成的に発現するように改変したラモス癌細胞を有する免疫不全ＮＳＧマウスにおいてインビボで評価する。種々のＮＳＧマウスモデルを使用：健康なドナーのヒトＰＢＭＣまたはリンパ腫患者のＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウス、そして最後に、ヒト免疫細胞集団の多系統移植を示すヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植したＮＳＧマウスである。
【0059】
所定のプロモータの制御下でＣＡＲ ＣＤ１９を有するＬＶで構成され、ＣＤ３ターゲティング剤と共有結合したＰＢＡＥを含むか、含まないように処方された実施例４に記載のナノ粒子を、ラモス－Ｌｕｃ細胞を以前に注入したマウスに繰り返し静脈内注入する。対照動物には、ビヒクルまたはＶＳＶ－Ｇエンベロープを欠き、ＰＢＡＥポリマーにカプセル化されていない形質導入欠損レンチウイルスベクターを注入する。
【0060】
インビボでの有効性は、２４日から９０日間にわたり毎週、動物全体の生物発光イメージングにより、治療群と対照群における腫瘍の成長と循環するラモスＬｕｃ細胞に関連する速度および生存率を測定することにより評価される。治療毒性は、治療前および治療後１週間間隔で採取した血液サンプルにおける血球数（実施例５に既に記載したフローサイトメトリー）、ＡＬＴ／ＡＳＴ肝酵素（酵素活性キット）およびサイトカインレベル（サイトカイン・ビード・アレイ）の測定によって評価される。週３回、動物の行動、体重、水と餌の消費量を治療の安全性と忍容性を確認するための追加出力として記録する。
【0061】
実施例７：Ｔ細胞特異的キメラプロモータの設計
上記のプロモータ配列には、ＮＦΚＢ；ＡＰ１、Ｓｔａｔｓ、ＧＡＴＡ、ＮＦＡＴなど、いくつかの転写因子結合部位を含有する。表３は、各プロモータ配列の内部にそれらの結合配列が存在することをまとめたものである。転写因子結合部位は配列中にも描かれている。
上記のプロモータ配列には、ＮＦΚＢ；ＡＰ１、Ｓｔａｔｓ、ＧＡＴＡ、ＮＦＡＴなど、いくつかの転写因子結合部位を含有する。表３は、各プロモータ配列の内部にそれらの結合配列が存在することをまとめたものである。転写因子結合部位は配列中にも描かれている。
【0062】
表３：プロモータ配列のＴ細胞特異的転写因子結合部位を用いたマッピング。斜体で示したのは、導入遺伝子を非特異的に発現させるプロモータである（図１に記載した実験による）。
ＣＤ３＋特異的プロモータ（LAIR2、TNFS8、TCRおよびITK）は、ＮＦΚＢ部位が２箇所未満、ＮＦＡＴボックスが８箇所未満、ＮＦΚＢ＋ＡＰ１部位が８箇所未満である。
【表3】
【0063】
実施例８：プロモータ配列の最適化および短縮化
遺伝子発現の誘導や導入遺伝子の発現量増加に関わる重要な領域を定義するために5,6,7、２ｋｂ－プロモータを短縮した５’位欠失コンストラクトが設計された。
Ｔ細胞プロモータの短縮化と分子クローニング
１５のプロモータの組合せのうち、ＣＴＬＡ４（配列番号７） とＩＣＯＳ（配列番号１３） は、ＣＤ３発現細胞株と一次細胞で過剰発現し、非ＣＤ３発現細胞では低発現または無発現のものを選択した。合成遺伝子を鋳型とし、フージョンＨＦ高忠実度ＤＮＡ ポリメラーゼ（Thermofisher社）を用いたＰＣＲにより、プロモータを５’から３’に短縮した。ＭｌｕＩ制限部位を含むフォワードプライマーはＣＴＬＡ４とＩＣＯＳの５’領域に特異的であり、ＢｇｌＩＩ部位を含むリバースプライマー（配列番号２４－２５用）またはＢａｍＨＩ部位（配列番号１９－２３、 ２６－２９用）を含むリバースプライマーはＣＴＬＡ４またはＩＣＯＳの３’末端に特異的であった。ＰＣＲフラグメントは、ＧＦＰをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流で、ＣＭＶプロモータの代わりに、トランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰにサブクローニングされた。
遺伝子発現の誘導や導入遺伝子の発現量増加に関わる重要な領域を定義するために5,6,7、２ｋｂ－プロモータを短縮した５’位欠失コンストラクトが設計された。
Ｔ細胞プロモータの短縮化と分子クローニング
１５のプロモータの組合せのうち、ＣＴＬＡ４（配列番号７） とＩＣＯＳ（配列番号１３） は、ＣＤ３発現細胞株と一次細胞で過剰発現し、非ＣＤ３発現細胞では低発現または無発現のものを選択した。合成遺伝子を鋳型とし、フージョンＨＦ高忠実度ＤＮＡ ポリメラーゼ（Thermofisher社）を用いたＰＣＲにより、プロモータを５’から３’に短縮した。ＭｌｕＩ制限部位を含むフォワードプライマーはＣＴＬＡ４とＩＣＯＳの５’領域に特異的であり、ＢｇｌＩＩ部位を含むリバースプライマー（配列番号２４－２５用）またはＢａｍＨＩ部位（配列番号１９－２３、 ２６－２９用）を含むリバースプライマーはＣＴＬＡ４またはＩＣＯＳの３’末端に特異的であった。ＰＣＲフラグメントは、ＧＦＰをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流で、ＣＭＶプロモータの代わりに、トランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰにサブクローニングされた。
【0064】
同じ戦略で、ヒトＣＤ１９抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＯＲＦの上流にある第２のトランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ＣＡＲ－ＣＤ１９に切断したプロモータをサブクローン化した。切断されたプロモータの配列の同一性、および導入遺伝子上流のインフレーム挿入は、サンガー配列決定により確認された。その結果、最適化されたプロモータ配列は表４に示す通りである。
【0065】
表４：ＣＴＬＡ４とＩＣＯＳのプロモータの短縮化。
【表4】
【0066】
ヒト細胞株および初代細胞のＬＶ作製と形質導入
ＧＦＰおよびＣＤ１９標的ＣＡＲをコードする導入プラスミドを用いて、実施例３および４に記載したように、ＬＶおよび導入細胞株および一次細胞を作製した。ＧＦＰまたはＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子の発現はフローサイトメトリーで測定した。
ＧＦＰおよびＣＤ１９標的ＣＡＲをコードする導入プラスミドを用いて、実施例３および４に記載したように、ＬＶおよび導入細胞株および一次細胞を作製した。ＧＦＰまたはＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子の発現はフローサイトメトリーで測定した。
【0067】
実施例９：レンチウイルスベクターのＣＡＲによる”シュードタイピング“
実施例３および４の実験により、ＯＭ－ＰＢＡＥカプセル化などによりナノ粒子にパッケージされたはげたＬＶは、Ｔリンパ球を含むＰＢＭＣを形質導入し、導入遺伝子の発現を誘導する能力を有することが示された。ＣＡＲ Ｔ細胞療法の目的は、ＣＡＲをＴ細胞に導入し、そのＴ細胞の表面にＣＡＲを発現させることであるため、ＣＡＲ Ｔ細胞の生産に使用する予定のＬＶの表面に発現したＣＡＲが存在すると、ＬＶを偽型化し、ＣＡＲ Ｔ細胞による攻撃を意図した細胞をＬＶに形質導入させるようにともすると誘導する可能性があるかという疑問が湧いて来る。以下に述べる実験は、この疑問を解決するために設計されたものである。
実施例３および４の実験により、ＯＭ－ＰＢＡＥカプセル化などによりナノ粒子にパッケージされたはげたＬＶは、Ｔリンパ球を含むＰＢＭＣを形質導入し、導入遺伝子の発現を誘導する能力を有することが示された。ＣＡＲ Ｔ細胞療法の目的は、ＣＡＲをＴ細胞に導入し、そのＴ細胞の表面にＣＡＲを発現させることであるため、ＣＡＲ Ｔ細胞の生産に使用する予定のＬＶの表面に発現したＣＡＲが存在すると、ＬＶを偽型化し、ＣＡＲ Ｔ細胞による攻撃を意図した細胞をＬＶに形質導入させるようにともすると誘導する可能性があるかという疑問が湧いて来る。以下に述べる実験は、この疑問を解決するために設計されたものである。
【0068】
ＣＤ１９ ＣＡＲをコード化したレンチウイルスベクター粒子の作製
はげたＬＶ粒子の製造は、実施例１に記載の方法で行った。簡単に説明すると、ＬＶ２９３細胞は播種翌日に一時的に核酸導入された。PEIProトランスフェクタント試薬 （PolyPlus Transfection社, Illkirch, France） をトランスファーベクタープラスミドpARA-hUBC-CAR-CD19 およびパッケージングプラスミド pARA-Pack と混合した。ＯＭ－ＰＢＡＥにカプセル化されたはげたＬＶ粒子を実施例３に記載したように調製し、ＬＶ２９３細胞またはヒトＰＢＭＣを形質導入するために使用した。
はげたＬＶ粒子の製造は、実施例１に記載の方法で行った。簡単に説明すると、ＬＶ２９３細胞は播種翌日に一時的に核酸導入された。PEIProトランスフェクタント試薬 （PolyPlus Transfection社, Illkirch, France） をトランスファーベクタープラスミドpARA-hUBC-CAR-CD19 およびパッケージングプラスミド pARA-Pack と混合した。ＯＭ－ＰＢＡＥにカプセル化されたはげたＬＶ粒子を実施例３に記載したように調製し、ＬＶ２９３細胞またはヒトＰＢＭＣを形質導入するために使用した。
【0069】
ＣＤ１９ ＣＡＲ検出
ＤＰＢＳ洗浄工程の後、細胞（ＬＶ２９３トランスフェクトおよび非トランスフェクトまたはＬＶ形質導入されたＰＢＭＣ）を、実施例４に既に記載したように、製造者の指示に従って、ヒトＣＤ１９検出試薬（Miltenyi社）および抗ビオチン－ＢＢ５１５抗体（Miltenyi社）で染色した。
ＤＰＢＳ洗浄工程の後、細胞（ＬＶ２９３トランスフェクトおよび非トランスフェクトまたはＬＶ形質導入されたＰＢＭＣ）を、実施例４に既に記載したように、製造者の指示に従って、ヒトＣＤ１９検出試薬（Miltenyi社）および抗ビオチン－ＢＢ５１５抗体（Miltenyi社）で染色した。
【0070】
図３Ａに示した結果は、ＬＶの生産に使用したＬＶ２９３細胞（pARA-hUBC-CAR-CD19およびpARA-Packプラスミドで核酸導入した）の表面におけるＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示している。核酸導入していない細胞を対照として使用した。ＣＤ１９ ＣＡＲの強い発現は、トランスフェクション後のＬＶ２９３産生細胞表面でのみ検出された。
【0071】
さらに、図３Ｂに示された結果は、ｈＵＢＣプロモータの制御下でＣＤ１９ ＣＡＲを、またはＣＭＶプロモータの制御下でＧＦＰをコードする、ＶＳＶ－Ｇ－（”はげた”）ＬＶで形質導入したヒトＰＢＭＣ上で得られた発現を示している。はげたＬＶに曝露したＰＢＭＣではＧＦＰの発現が見られなかったが、ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーでカプセル化すると、その形質導入効率が回復することがわかった。ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするＶＳＶ－Ｇ－（”はげた”）ＬＶを使用してＰＢＭＣを形質導入した場合、ＭＯ－ＰＢＡＥポリマーの有無にかかわらず、キメラ受容体の発現レベルは同程度であった。
【0072】
これらの結果から、ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を制御するためにユビキタスプロモータを使用すると、ＬＶ２９３細胞株の表面にキメラ受容体が発現し、膜タンパク質で飾られたＬＶ（はげたまたは偽型の）を産生することを示唆する。このＣＤ１９ ＣＡＲによる偽型化は、はげたＬＶがもともと形質導入に欠けるため、はげたベクターが細胞に結合して人工的なＣＤ１９－ＣＡＲシグナルを発生させるには十分でなければならない、なぜならば、ＣＤ１９－ＣＡＲはＬＶのエンドソーム脱出をさせないため、偽型蛋白として効率的ではないけれども、はげたＬＶはもともと形質導入に不十分であるからである）。 この”偽型”は、通常のＬＶ（ＶＳＶ－Ｇを有する）がインビトロでもインビボでもＣＤ１９＋Ｂリンパ球を直接標的とするため、安全性の問題につながる可能性がある。 ここで得られた結果は、本明細書に記載されているようなＴ細胞特異的プロモータの使用により、ＬＶ２９３の表面におけるＣＤ１９ ＣＡＲの発現が消失し、ＬＶの偽型化が観察されないことを示している。これにより、ＣＡＲ Ｔ細胞を作るように設計されたＬＶの安全マージンを高めることができるであろう。
【0073】
配列表
各プロモータ配列の転写因子結合部位は以下のように描かれている。ＮＦｋＢ（太字）、ＡＰ－１（下線）、ＳＴＡＴＳ（斜体）、ＧＡＴＡ－３（二重下線）、ＮＦＡＴ（箱囲み）。注目すべきは、いくつかの結合部位が重なっていることである。
各プロモータ配列の転写因子結合部位は以下のように描かれている。ＮＦｋＢ（太字）、ＡＰ－１（下線）、ＳＴＡＴＳ（斜体）、ＧＡＴＡ－３（二重下線）、ＮＦＡＴ（箱囲み）。注目すべきは、いくつかの結合部位が重なっていることである。
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
【化1-5】
【化1-6】
【化1-7】
【化1-8】
【化1-9】
【化1-10】
【化1-11】
【化1-12】
【化1-13】
【化1-14】
【化1-15】
【化1-16】
【化1-17】
【化1-18】
【化1-19】
【化1-20】
【化1-21】
【化1-22】
【化1-23】
【化1-24】
【化1-25】
【化1-26】
【化1-27】
【化1-28】
【化1-29】
【0074】
本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」とは、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを含めることを可能にする。本明細書の「含む」という用語の任意の記述は、特に組成物の成分の説明において、または装置の要素の説明において、選択肢表現の「本質的にからなる」または「からなる」と交換することができる。
本発明は特定の好ましい実施態様と併せて説明されてきたが、当業者の１人が、前述の明細書を読んだ後、本明細書に記載の組成物および方法に様々な変更、同等物の置換、および他の変更を行うことができる。
本発明は特定の好ましい実施態様と併せて説明されてきたが、当業者の１人が、前述の明細書を読んだ後、本明細書に記載の組成物および方法に様々な変更、同等物の置換、および他の変更を行うことができる。
【0075】
参考文献
1. Blood. 2014 Apr 24;123(17）:e68-78
2.Molecular and cellular biology 1997, p.4220-4229.
3.Science 07 Nov 2003: Vol. 302, Issue 5647, pp. 1041-1043
4. J Immunol. 2015 Oct 1;195(7）:3058-70
5.J Immunol.1996 156:4154-4159
6.J Biol.Chem.2006 Sep 29; Vol.281, No 39, pp.28666-28678
7. European J Immunol. 2012. 42:1850-1862
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7. European J Immunol. 2012. 42:1850-1862
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【配列表】
【国際調査報告】