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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-20
(54)【発明の名称】セルフリーＤＮＡサイズ検出
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6855 20180101AFI20230613BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20230613BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20230613BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6855 Z
C12Q1/6851 Z
C40B40/06
C12N15/10 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568686
(86)(22)【出願日】2021-05-11
(85)【翻訳文提出日】2023-01-11
(86)【国際出願番号】 US2021031815
(87)【国際公開番号】W WO2021231455
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】63/024,489
(32)【優先日】2020-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/054,617
(32)【優先日】2020-07-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/065,375
(32)【優先日】2020-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/106,741
(32)【優先日】2020-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＡＮＤＲＯＩＤ
(71)【出願人】
【識別番号】519049444
【氏名又は名称】アキュラーゲン ホールディングス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウェン，リ
(72)【発明者】
【氏名】ファハム，マレック
(72)【発明者】
【氏名】ウィットコップ，トビアス
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ジョニー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR20
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QR90
4B063QS24
4B063QS36
4B063QX01
(57)【要約】
【解決手段】
セルフリー核酸サイズ分析の方法が本明細書で提供される。例えば、本明細書の方法は、対象からの複数のセルフリー核酸分子から第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することと、対照からの複数のセルフリー核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することとを含むことができる。
【選択図】図３
セルフリー核酸サイズ分析の方法が本明細書で提供される。例えば、本明細書の方法は、対象からの複数のセルフリー核酸分子から第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することと、対照からの複数のセルフリー核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することとを含むことができる。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸分析のための方法であって、（ａ）第１の複数の核酸分子から第１の一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、前記第１の複数の核酸分子が、対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することであって、前記第２の複数の核酸分子が、対照由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと、（ｃ）前記第１の複数の核酸分子の少なくとも一部に対して第１のサイズ分布を測定するために前記第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することと、（ｄ）前記第２の複数の核酸分子の少なくとも一部に対して第２のサイズ分布を測定するために前記第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することと、（ｅ）前記第１のサイズ分布と前記第２のサイズ分布との間のサイズの差を決定するために、前記第１のサイズ分布および前記第２のサイズ分布を使用することとを含む、方法。
【請求項2】
（ａ）が、前記第１の複数の核酸分子を変性させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｂ）が、前記第２の複数の核酸分子を変性させることを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
（ａ）が、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、前記第１の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
（ｂ）が、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、前記第２の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
（ａ）が、（ｉ）第１の複数の環状核酸分子を形成するために、前記第１の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと、（ｉｉ）第１の複数の増幅された核酸分子を得るために、前記第１の複数の環状核酸分子を増幅することとを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
（ｂ）が、（ｉ）第２の複数の環状核酸分子を形成するために、前記第２の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと、（ｉｉ）第２の複数の増幅された核酸分子を得るために、前記第２の複数の環状核酸分子を増幅することとを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
環状化することが、前記個々の核酸分子の５’末端を前記個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項9】
環状化することが、アダプターを前記個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記増幅が、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項12】
前記増幅が、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項13】
前記増幅が、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項６または請求項７に記載の方法。１つまたは複数の標的配列について前記第１の複数の核酸分子または前記第２の複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記濃縮することが、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記濃縮することが、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは前記第２の一本鎖ＤＮＡライブラリに対して前記サイズ分布を測定することが、前記第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは前記第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
配列決定することが、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ゲノム特徴を有するとして、前記一本鎖ＤＮＡライブラリまたは前記第２の一本鎖ライブラリの個々の核酸分子を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記ゲノム特徴がエピジェネティック修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記エピジェネティック修飾が、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ゲノム特徴が、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、転座またはこれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
前記第１の複数の核酸分子または前記第２の複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記セルフリー生物学的試料が体液を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記体液が、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記第１の複数の核酸分子が腫瘍核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記第２の複数の核酸分子が、健康な対照に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
前記差が所定の閾値より大きい場合に、前記対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
前記第１のサイズ分布の平均が前記第２のサイズ分布の平均よりも小さい場合に、前記対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
前記疾患が癌である、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記癌が、結腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記疾患の進行または退行について前記対象を監視するために、前記差を使用することをさらに含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
核酸分析のための方法であって、（ａ）複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、前記複数は対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと、（ｂ）ゲノム特徴を有するとして、前記一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することと、（ｃ）前記個々の核酸分子についてサイズを測定することと、（ｄ）前記個々の核酸分子の前記サイズに基づいて、前記ゲノム特徴を疾患と関連付けることとを含む、方法。
【請求項35】
（ａ）が、前記複数の核酸分子を変性させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
（ａ）が、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
（ａ）が、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと、（ｉｉ）複数の増幅された核酸分子を得るために、前記複数の環状核酸分子を増幅することとを含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
環状化することが、前記個々の核酸分子の５’末端を前記個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
環状化することが、アダプターを前記個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
前記増幅が、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項42】
前記増幅が、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項43】
前記増幅が、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項44】
１つまたは複数の標的配列について前記複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項45】
前記濃縮することが、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記濃縮することが、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項47】
（ｂ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項48】
（ｃ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項49】
配列決定することが、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記ゲノム特徴がエピジェネティック修飾を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項51】
前記エピジェネティック修飾が、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記ゲノム特徴が、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、転座またはこれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項53】
前記複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項54】
前記セルフリー生物学的試料が体液を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記体液が、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記複数の核酸が腫瘍核酸を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項57】
前記個々の核酸分子が所定の閾値を下回る平均サイズを有する場合に、前記ゲノム特徴を有する前記個々の核酸分子が疾患に関連すると判定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項58】
前記ゲノム特徴を有する前記個々の核酸分子が前記ゲノム特徴を有しない核酸分子よりも小さい平均サイズを有する場合に、前記ゲノム特徴を有する前記個々の核酸分子が疾患に関連すると判定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項59】
前記ゲノム特徴を有する前記個々の核酸分子が所定の閾値を下回るサイズを有する場合に、前記対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項60】
前記疾患が癌である、請求項３４または請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記癌が、結腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記疾患の進行または退行について前記対象を監視するために、前記ゲノム特徴または前記サイズを使用することをさらに含む、請求項５７～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
核酸分析のための方法であって、（ａ）複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、前記複数は対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと、（ｂ）ゲノム特徴を有するとして、前記一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することと、（ｃ）前記個々の核酸分子について少なくとも５’末端または３’末端を同定することと、（ｄ）前記個々の核酸分子の前記５’末端または前記３’末端に基づいて、前記ゲノム特徴を疾患と関連付けることとを含む、方法。
【請求項66】
（ａ）が、前記複数の核酸分子を変性させることを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
（ａ）が、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む、請求項６５または請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
（ａ）が、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと、（ｉｉ）複数の増幅された核酸分子を得るために、前記複数の環状核酸分子を増幅することとを含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
環状化することが、前記個々の核酸分子の５’末端を前記個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
環状化することが、アダプターを前記個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
前記増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる、請求項６８に記載の方法。
【請求項72】
前記増幅が、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる、請求項６８に記載の方法。
【請求項73】
前記増幅が、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項74】
前記増幅が、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項75】
１つまたは複数の標的配列について前記複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項76】
前記濃縮することが、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記濃縮することが、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項78】
（ｂ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項79】
（ｃ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項80】
配列決定することが、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む、請求項７８または請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記ゲノム特徴がエピジェネティック修飾を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項82】
前記エピジェネティック修飾が、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記ゲノム特徴が、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失またはこれらの組み合わせを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項84】
前記複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する、請求項６５に記載の方法。
【請求項85】
前記セルフリー生物学的試料が体液を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記体液が、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
前記複数の核酸が腫瘍核酸を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項88】
前記ゲノム特徴を有する前記個々の核酸分子の前記５’末端または前記３’末端が所定の配列を有する場合に、前記対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項89】
前記疾患が癌である、請求項６５または請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記癌が、結腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項92】
前記対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む、請求項８８～９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項93】
前記疾患の進行または退行について前記対象を監視するために、前記ゲノム特徴または前記５’末端または３’末端を使用することをさらに含む、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを調製するための方法であって、セルフリー生物学的試料からの核酸分子の集団を、所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子の濃縮に供し、それにより、癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを作製することを含む、方法。
【請求項95】
前記濃縮が、核酸分子の前記集団のサイズ選択を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
サイズ選択が、核酸分子の前記集団のビーズ精製またはゲル精製を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項97】
前記濃縮が、（ａ）アダプターを核酸分子の前記集団に連結することと、（ｂ）核酸分子の前記集団を切断剤と接触させることとを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
前記切断剤がヌクレアーゼを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
前記濃縮が、小断片を好む酵素を使用して核酸分子の前記集団の個々の核酸分子を環状化することを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項100】
前記濃縮が、（ａ）核酸分子の前記集団の個々の核酸分子を環状化することと、（ｂ）核酸分子の前記集団を切断剤と接触させることとを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項101】
環状化することが、前記個々の核酸分子の５’末端を前記個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む、請求項９９または請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
環状化することが、アダプターを前記個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む、請求項９９または請求項１００に記載の方法。
【請求項103】
前記所定の閾値未満のサイズを有する前記核酸分子を増幅することをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項104】
前記増幅することが、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項105】
前記増幅することが、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項106】
前記増幅することが、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項107】
前記増幅することが、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項108】
１つまたは複数の標的配列について、前記所定の閾値未満のサイズを有する前記核酸分子を濃縮することをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項109】
前記濃縮することが、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項110】
前記濃縮することが、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項111】
前記セルフリー生物学的試料が体液を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項112】
前記体液が、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項113】
核酸分析のための方法であって、（ａ）複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、前記複数の核酸分子は対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと、（ｂ）ゲノム特徴を有するとして、前記一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することと、（ｃ）前記個々の核酸分子についてサイズを測定することと、（ｄ）前記ゲノム特徴を有しない前記一本鎖ＤＮＡライブラリの複数の核酸分子を同定することと、（ｅ）前記複数の核酸分子についてサイズを測定することと、（ｆ）ゲノム特徴を有する前記核酸分子と、前記ゲノム特徴を有しない前記一本鎖ＤＮＡライブラリの前記複数の核酸分子との間のサイズ差を決定することと、（ｅ）前記サイズ差に基づいて、前記ゲノム特徴を疾患と関連付けることとを含む、方法。
【請求項114】
前記個々の核酸分子および前記複数の核酸分子が単一のゲノム遺伝子座に由来する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項115】
（ａ）が、前記複数の核酸分子を変性させることを含む、請求項１１３または請求項１１４に記載の方法。
【請求項116】
（ａ）が、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む、請求項１１３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項117】
（ａ）が、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと、（ｉｉ）複数の増幅された核酸分子を得るために、前記複数の環状核酸分子を増幅することとを含む、請求項１１３～１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項118】
環状化することが、前記個々の核酸分子の５’末端を前記個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項119】
環状化することが、アダプターを前記個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項120】
前記増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる、請求項１１７に記載の方法。
【請求項121】
前記増幅が、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる、請求項１１７に記載の方法。
【請求項122】
前記増幅が、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項123】
前記増幅が、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項124】
１つまたは複数の標的配列について前記複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項125】
前記濃縮することが、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項126】
前記濃縮することが、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる、請求項１１３に記載の方法。
【請求項127】
（ｂ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項128】
（ｃ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項129】
（ｄ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項130】
（ｅ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項131】
配列決定することが、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む、請求項１２７～１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項132】
前記ゲノム特徴がエピジェネティック修飾を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項133】
前記エピジェネティック修飾が、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項134】
前記ゲノム特徴が、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失またはこれらの組み合わせを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項135】
前記複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項136】
前記セルフリー生物学的試料が体液を含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項137】
前記体液が、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項138】
前記複数の核酸が腫瘍核酸を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項139】
前記疾患が癌である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項140】
前記癌が、結腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項141】
前記方法が、３’末端充填工程またはエキソヌクレアーゼ処理工程を含まない、請求項１１３に記載の方法。
【請求項142】
核酸分析のための方法であって、（ａ）複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、前記複数の核酸分子は対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと、（ｂ）前記個々の核酸分子について少なくとも５’末端または３’末端を同定することと、（ｃ）前記個々の核酸分子の前記５’末端または前記３’末端を疾患と関連付けることとを含む、方法。
【請求項143】
（ａ）が、前記複数の核酸分子を変性させることを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項144】
（ａ）が、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む、請求項１４２または請求項１４３に記載の方法。
【請求項145】
（ａ）が、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、前記複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと、（ｉｉ）複数の増幅された核酸分子を得るために、前記複数の環状核酸分子を増幅することとを含む、請求項１４２～１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項146】
環状化することが、前記個々の核酸分子の５’末端を前記個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項147】
環状化することが、アダプターを前記個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項148】
前記増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる、請求項１４５に記載の方法。
【請求項149】
前記増幅が、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる、請求項１４５に記載の方法。
【請求項150】
前記増幅が、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項151】
前記増幅が、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に前記個々の核酸分子を接触させることを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項152】
１つまたは複数の標的配列について前記複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項153】
前記濃縮することが、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる、請求項１５２に記載の方法。
【請求項154】
前記濃縮することが、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる、請求項１５２に記載の方法。
【請求項155】
（ｂ）が前記一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項156】
配列決定することが、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む、請求項１５５に記載の方法。
【請求項157】
ゲノム特徴を有するとして、前記一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することをさらに含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項158】
前記ゲノム特徴がエピジェネティック修飾を含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項159】
前記エピジェネティック修飾が、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される、請求項１５８に記載の方法。
【請求項160】
前記ゲノム特徴が、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失またはこれらの組み合わせを含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項161】
前記複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する、請求項１４２に記載の方法。
【請求項162】
前記セルフリー生物学的試料が体液を含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項163】
前記体液が、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである、請求項１６２に記載の方法。
【請求項164】
前記複数の核酸が腫瘍核酸を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項165】
前記個々の核酸分子の前記５’末端または前記３’末端が所定の配列を有する場合に、前記対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項166】
前記疾患が癌である、請求項１４２または請求項１６５に記載の方法。
【請求項167】
前記癌が、結腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項168】
治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１６５～１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項169】
前記対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む、請求項１６５～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項170】
前記疾患の進行または退行について前記対象を監視するために、前記５’末端または３’末端を使用することをさらに含む、請求項１６５～１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項171】
（ａ）が末端修復を含まない、請求項１４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２０年５月１３日に出願された米国仮出願第６３／０２４，４８９号、２０２０年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０５４，６１７号、２０２０年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／０６５，３７５号、および２０２０年１０月２８日に出願された米国仮出願第６３／１０６，７４１号の恩典を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２０年５月１３日に出願された米国仮出願第６３／０２４，４８９号、２０２０年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０５４，６１７号、２０２０年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／０６５，３７５号、および２０２０年１０月２８日に出願された米国仮出願第６３／１０６，７４１号の恩典を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
セルフリー核酸の検出および分析は、個体の健康を研究するための重要な方法として浮上している。例えば、セルフリー核酸のレベルの増加は、癌を有する個体において観察される。さらに、妊婦におけるセルフリー核酸の分析は、胎児中の染色体異常の非侵襲的出生前スクリーニングを可能にする。
【発明の概要】
【0003】
セルフリーＤＮＡサイズ検出および分析の方法が本明細書で提供される。二本鎖ライブラリプレップよりも一本鎖ライブラリプレップを使用することによるより顕著なサイズ差の方法が本明細書で開示される。例えば、後期癌と健康の間での断片サイズの差は、一本鎖ＤＮＡライブラリプレップを使用して２９ｂｐであり得、二本鎖プレップを使用して１２ｂｐであり得る。
【0004】
癌と健康なセルフリーＤＮＡの間で異なってメチル化された分子間でのサイズ差がより顕著に観察される方法が、本明細書中にさらに開示されている。
【0005】
一態様において、核酸分析のための方法であって、（ａ）第１の複数の核酸分子から第１の一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、第１の複数の核酸分子が、対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと；（ｂ）第２の複数の核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することであって、第２の複数の核酸分子が、対照由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと；（ｃ）第１の複数の核酸分子の少なくとも一部に対して第１のサイズ分布を測定するために第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することと；（ｄ）第２の複数の核酸分子の少なくとも一部に対して第２のサイズ分布を測定するために第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することと；（ｅ）第１のサイズ分布と第２のサイズ分布との間のサイズの差を決定するために、第１のサイズ分布および第２のサイズ分布を使用することとを含む、方法が本明細書において提供される。いくつかの事例において、（ａ）は、第１の複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの事例において、（ｂ）は、第２の複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの事例において、（ａ）は、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、第１の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。いくつかの事例において、（ｂ）は、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、第２の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。いくつかの事例において、（ａ）は、（ｉ）第１の複数の環状核酸分子を形成するために、第１の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）第１の複数の増幅された核酸分子を得るために、第１の複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。いくつかの事例において、（ｂ）は、（ｉ）第２の複数の環状核酸分子を形成するために、第２の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）第２の複数の増幅された核酸分子を得るために、第２の複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。
【0006】
環状化することが、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む、請求項６または請求項７に記載の方法。いくつかの事例において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの事例において、増幅は、個々の核酸分子を、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に接触させることを含む。いくつかの事例において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について第１の複数の核酸分子または第２の複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。いくつかの事例において、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリについてのサイズ分布は、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。いくつかの事例において、配列決定することは、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む。いくつかの事例において、本方法は、ゲノム特徴を有するとして、一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ライブラリの個々の核酸分子を同定することをさらに含む。いくつかの事例において、ゲノム特徴はエピジェネティック修飾を含む。いくつかの事例において、エピジェネティック修飾は、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される。いくつかの事例において、ゲノム特徴は、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、転座またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの事例において、第１の複数の核酸分子または第２の複数の核酸分子はセルフリー生物学的試料に由来する。いくつかの事例において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの事例において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。いくつかの事例において、第１の複数の核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの事例において、第２の複数の核酸は、健康な対照に由来する。いくつかの事例において、差が所定の閾値より大きい場合に、対象は疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、第１のサイズ分布の平均が第２のサイズ分布の平均よりも小さい場合に、対象は疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、疾患は癌である。いくつかの事例において、癌は、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される。いくつかの事例において、本方法は、対象に治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、疾患の進行または退行について対象を監視するために差を使用することをさらに含む。
【0007】
別の態様において、核酸分析のための方法であって、（ａ）複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、複数は対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと；（ｂ）ゲノム特徴を有するとして、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することと；（ｃ）個々の核酸分子についてサイズを測定することと；（ｄ）個々の核酸分子のサイズに基づいて、ゲノム特徴を疾患と関連付けることとを含む、方法が提供される。いくつかの事例において、（ａ）は、複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの事例において、（ａ）は、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。いくつかの事例において、（ａ）は、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）複数の増幅された核酸分子を得るために、複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。いくつかの事例において、環状化することは、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む。いくつかの事例において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの事例において、増幅は、個々の核酸分子を、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に接触させることを含む。いくつかの事例において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。いくつかの事例において、（ｂ）は、一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。いくつかの事例において、（ｃ）は、一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。いくつかの事例において、配列決定することは、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む。いくつかの事例において、ゲノム特徴はエピジェネティック修飾を含む。いくつかの事例において、エピジェネティック修飾は、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される。いくつかの事例において、ゲノム特徴は、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、転座またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの事例において、複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する。いくつかの事例において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの事例において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。いくつかの事例において、複数の核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの事例において、個々の核酸分子が所定の閾値を下回る平均サイズを有する場合に、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子が疾患に関連すると判定される。いくつかの事例において、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子がゲノム特徴を有しない核酸分子よりも小さい平均サイズを有する場合に、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子が疾患に関連すると判定される。いくつかの事例において、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子が所定の閾値を下回るサイズを有する場合に、対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、疾患は癌である。いくつかの事例において、癌は、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される。いくつかの事例において、本方法は、対象に治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、疾患の進行または退行について対象を監視するためにゲノム特徴またはサイズを使用することをさらに含む。
【0008】
さらなる態様において、核酸分析のための方法であって、（ａ）複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、複数は対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと；（ｂ）ゲノム特徴を有するとして、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することと；（ｃ）個々の核酸分子について少なくとも５’末端または３’末端を同定することと；（ｄ）個々の核酸分子の５’末端または３’末端に基づいて、ゲノム特徴を疾患と関連付けることとを含む、方法が提供される。いくつかの事例において、（ａ）は、複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの事例において、（ａ）は、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。いくつかの事例において、（ａ）は、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）複数の増幅された核酸分子を得るために、複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。いくつかの事例において、環状化することは、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む。いくつかの事例において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの事例において、増幅は、個々の核酸分子を、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に接触させることを含む。いくつかの事例において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。いくつかの事例において、（ｂ）は、一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。いくつかの事例において、（ｃ）は、一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。いくつかの事例において、配列決定することは、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む。いくつかの事例において、ゲノム特徴はエピジェネティック修飾を含む。いくつかの事例において、エピジェネティック修飾は、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される。いくつかの事例において、ゲノム特徴は、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの事例において、複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する。いくつかの事例において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの事例において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。いくつかの事例において、複数の核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの事例において、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子の５’末端または３’末端が所定の配列を有する場合に、対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、疾患は癌である。いくつかの事例において、癌は、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される。いくつかの事例において、本方法は、対象に治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、疾患の進行または退行について対象を監視するためにゲノム特徴または５’末端もしくは３’末端を使用することをさらに含む。
【0009】
別の態様において、癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを調製するための方法であって、セルフリー生物学的試料からの核酸分子の集団を、所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子の濃縮に供し、それにより、癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを作製することを含む、方法が提供される。いくつかの事例において、濃縮は、核酸分子の集団のサイズ選択を含む。いくつかの事例において、サイズ選択は、核酸分子の集団のビーズ精製またはゲル精製を含む。いくつかの事例において、濃縮は、（ａ）アダプターを核酸分子の集団に連結することと、（ｂ）核酸分子の集団を切断剤と接触させることとを含む。いくつかの事例において、切断剤はヌクレアーゼを含む。いくつかの事例において、濃縮は、小断片を好む酵素を使用して核酸分子の集団の個々の核酸分子を環状化することを含む。いくつかの事例において、濃縮は、（ａ）核酸分子の集団の個々の核酸分子を環状化することと；（ｂ）核酸分子の集団を切断剤と接触させることとを含む。いくつかの事例において、環状化することは、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む。いくつかの事例において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。いくつかの事例において、本方法は、所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子を増幅することをさらに含む。いくつかの事例において、増幅することは、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅することは、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅することは、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの事例において、増幅することは、個々の核酸分子を、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に接触させることを含む。いくつかの事例において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について、所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子を濃縮することをさらに含む。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。いくつかの事例において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの事例において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。
【0010】
一態様において、セルフリー核酸サイズ分析の方法であって、（ａ）対象からの複数のセルフリー核酸分子から第１の一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することと；（ｂ）対照からの複数のセルフリー核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することと；（ｃ）対象からの複数の核酸分子の少なくとも一部について第１のサイズを測定するために、第１の一本鎖ライブラリを使用することと；（ｄ）対照からの複数の核酸分子の少なくとも一部について第２のサイズを測定するために、第２の一本鎖ライブラリを使用することと；（ｅ）対象が癌を有するか、または癌を有するリスクがある場合に、第１のサイズと第２のサイズの差を検出することとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、二本鎖ライブラリを使用する方法と比較して、差は増強される。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖ライブラリおよび第２の一本鎖ライブラリについて、メチル化状態が判定される。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖ライブラリおよび第２の一本鎖ライブラリについて、コピー数多型（ＣＮＶ）が判定される。いくつかの実施形態において、差が所定の閾値より大きい場合に、対象は癌のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの実施形態において、第１のサイズが第２のサイズより小さい場合に、対象は癌のリスクがあるか、または癌を有すると判定される。
【0011】
別の態様において、核酸分析のための方法であって、（ａ）複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することであって、複数は対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、調製することと；（ｂ）個々の核酸分子について少なくとも５’末端または３’末端を同定することと；（ｃ）個々の核酸分子の５’末端または３’末端を疾患と関連付けることとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）は、複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの実施形態において、（ａ）は、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。いくつかの実施形態において、（ａ）は、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）複数の増幅された核酸分子を得るために、複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。いくつかの実施形態において、環状化することは、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む。いくつかの実施形態において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。いくつかの実施形態において、増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの実施形態において、増幅は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの実施形態において、増幅は、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、増幅は、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの実施形態において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。いくつかの実施形態において、（ｂ）は、一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、配列決定することは、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ゲノム特徴を有するとして、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ゲノム特徴はエピジェネティック修飾を含む。いくつかの実施形態において、エピジェネティック修飾は、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ゲノム特徴は、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する。いくつかの実施形態において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの実施形態において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、複数の核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの実施形態において、個々の核酸分子の５’末端または３’末端が所定の配列を有する場合に、対象は疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、癌は、結腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本方法は、対象に治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、疾患の進行または退行について対象を監視するために５’末端または３’末端を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態において、（ａ）は末端修復を含まない。
【0012】
本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、上記または本明細書の他の箇所の方法のいずれかを実施する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【0013】
本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサと、これに結合されたコンピュータメモリとを備えるシステムを提供する。コンピュータメモリは、１つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、上記または本明細書の他の箇所の方法のいずれかを実施する機械実行可能コードを含む。
【0014】
本開示のさらなる態様および利点は、本開示の例示的実施形態のみが示され、記載されている以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの細部は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明白な点で修正が可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示と見なされるべきであり、限定と見なされるべきではない。
【0015】
参照による組み入れ
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限度で、本明細書は、任意のそのような矛盾する資料に優位するおよび／または優先するものとする。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限度で、本明細書は、任意のそのような矛盾する資料に優位するおよび／または優先するものとする。
【図面の簡単な説明】
【0016】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および添付の図面（本明細書では「図」および「ＦＩＧ．」とも称される。）を参照することによって得られるであろう。
【0017】
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明の様々な実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態は例として提供されているに過ぎないことは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更および置換を行い得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替形態が使用され得ることを理解されたい。
【0019】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対して許容され得る誤差範囲内にあることを意味し、１つには、値がどのようにして測定または決定されるかに、すなわち測定系の限界に依存し得る。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１標準偏差以内または１標準偏差超を意味することができる。別の例として、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。生物学的システムまたは過程に関して、「約」という用語は、１桁以内、例えば値の５倍以内または２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、当該値について許容され得る誤差範囲内にあることを意味する。
【0020】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般に、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、セルフリー核酸、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から規定される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾され得る。
【0021】
本明細書で使用される「対象」という用語は、一般に、脊椎動物などの個体を指す。脊椎動物は、哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物およびペットが含まれるが、これらに限定されない。インビボで得られたまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。対象は患者であり得る。対象は、疾患（例えば、癌）に関して症候性であり得る。代替として、対象は、疾患に関して無症候性であり得る。
【0022】
「早期癌」という用語は、個体においてまだ転移していない癌（すなわち、癌は、その当初の位置を離れて他の位置に広がっていない）を指す。いくつかの事例において、早期癌は「非転移性癌」である。正確な病期分類は癌の種類に依存し、詳細は本明細書に記載されている。
【0023】
本明細書で使用される「腫瘍負荷」および「腫瘍量」という用語は、一般に、対象の体内の腫瘍のサイズまたは疾患（例えば、癌）の量を指す。
【0024】
本明細書で使用される「健康な対照」という用語は、一般に、対象の健康な状態についての基準点を指す。健康な対照は、疾患（例えば、癌）を有していないもしくは疾患（例えば、癌）を有していると疑われていない対象からのものであり得るか、または疾患を有しているもしくは有している疑いがある対象からであるが、そうでなければ非疾患参照として使用され得る位置（例えば、白血球）からのものであり得る。健康な対照は、ゲノムまたはゲノムの一部であり得る。健康な対照は、リボ核酸分子および／またはデオキシリボ核酸分子であり得る。
【0025】
本明細書で使用される「試料」という用語は、一般に、哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象に由来するか、または対象から得られた試料を指す。試料は、生物学的試料であり得る。試料は、毛髪、指の爪、皮膚、汗、涙、眼液、鼻腔スワブまたは鼻咽頭洗浄液、痰、咽頭スワブ、唾液、粘液、血液、血清、血漿、胎盤液、羊水、臍帯血、強調液、腔液、耳垢、油、腺分泌物、胆汁、リンパ、膿、微生物叢、胎便、母乳、骨髄、骨、中枢神経系組織、脳脊髄液、脂肪組織、滑液、便、胃液、尿、精液、膣分泌物、胃、小腸、大腸、直腸、膵臓、肝臓、腎臓、膀胱、肺、ならびに対象に由来するまたは対象から得られる他の組織および流体を含み得るが、これらに限定されない。生物学的試料は、セルフリー（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）（またはセルフリー（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ））生物学的試料であり得る。
【0026】
本明細書で使用される「セルフリー」という用語は、一般に、細胞を含まない、対象に由来するまたは対象から得られた試料を指す。セルフリー生物学的試料には、血液、血清、血漿、鼻腔スワブまたは鼻咽頭洗浄液、唾液、尿、胃液、涙、便、粘液、汗、耳垢、油、腺分泌物、胆汁、リンパ、脳脊髄液、組織、精液、膣液、腫瘍組織に由来する間質液を含む間質液、眼液、髄液、咽頭スワブ、呼気、毛髪、指の爪、皮膚、生検、胎盤液、羊水、臍帯血、強調液、腔液、痰、膿、微生物叢、胎便、母乳および／または他の排泄物が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0027】
核酸のサイズ分析の方法
核酸サイズ分析などの核酸分析のための方法が本明細書で提供される。核酸分析のための方法は、第１の複数の核酸分子から第１の一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することを含み得、第１の複数の核酸分子は、対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。並行してまたは後続して、本方法は、第２の複数の核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することを含み得、第２の複数の核酸分子は、対照由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。次に、本方法は、第１の複数の核酸分子の少なくとも一部について第１のサイズ分布を測定するために、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することを含み得る。並行してまたは後続して、本方法は、第２の複数の核酸分子の少なくとも一部について第２のサイズ分布を測定するために、第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することを含み得る。次に、ライブラリは、第１のサイズ分布と第２のサイズ分布の間でのサイズの差を決定するために、第１のサイズ分布および第２のサイズ分布を使用することを含み得る。
核酸サイズ分析などの核酸分析のための方法が本明細書で提供される。核酸分析のための方法は、第１の複数の核酸分子から第１の一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することを含み得、第１の複数の核酸分子は、対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。並行してまたは後続して、本方法は、第２の複数の核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することを含み得、第２の複数の核酸分子は、対照由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。次に、本方法は、第１の複数の核酸分子の少なくとも一部について第１のサイズ分布を測定するために、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することを含み得る。並行してまたは後続して、本方法は、第２の複数の核酸分子の少なくとも一部について第２のサイズ分布を測定するために、第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを使用することを含み得る。次に、ライブラリは、第１のサイズ分布と第２のサイズ分布の間でのサイズの差を決定するために、第１のサイズ分布および第２のサイズ分布を使用することを含み得る。
【0028】
本明細書の核酸分析の方法の一態様において、方法は一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することを含み得る。いくつかの事例において、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、第１の複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの事例において、第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、第２の複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの事例において、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、第１の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。いくつかの事例において、第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、第２の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。
【0029】
一本鎖ＤＮＡライブラリを調製するいくつかの方法では、個々の一本鎖ＤＮＡ分子が環状化される。いくつかの事例において、個々の一本鎖ＤＮＡ分子は変性されている。いくつかの事例において、個々の一本鎖ＤＮＡ分子は変性されていない。いくつかの事例において、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、（ｉ）第１の複数の環状核酸分子を形成するために、第１の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）第１の複数の増幅された核酸分子を得るために、第１の複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。いくつかの事例において、第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、（ｉ）第２の複数の環状核酸分子を形成するために、第２の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）第２の複数の増幅された核酸分子を得るために、第２の複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。いくつかの事例において、環状化することは、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む。いくつかの事例において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの事例において、増幅は、個々の核酸分子を、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に接触させることを含む。
【0030】
本明細書で提供される核酸分析の方法の一態様において、一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡからの少量の夾雑二本鎖ＤＮＡを含み得る。いくつかの事例において、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡから最大で５％の二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの事例において、第２の一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡから最大で５％の二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの事例において、第１のまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡから最大で１％の二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの事例において、第１のまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡから最大で０．５％の二本鎖ＤＮＡを含む。
【0031】
本明細書で提供される核酸分析の方法の一態様において、本方法は、１つまたは複数の標的配列を濃縮するための濃縮工程をさらに含み得る。いくつかの事例において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について第１の複数の核酸分子または第２の複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。
【0032】
本明細書で提供される核酸分析の方法の一態様において、方法は、一本鎖ＤＮＡライブラリについてサイズ分布を測定することを含み得る。いくつかの事例において、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリについてサイズ分布を測定することは、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。いくつかの事例において、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリについてサイズ分布を測定することは、配列決定、バイオアナライザ断片分析、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ハイスループットゲル電気泳動、ハイスループットキャピラリー電気泳動、およびＤＮＡ断片のサイズを提供する任意の他の適切な方法を含み得るが、これらに限定されない。
【0033】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、方法は、一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含み得る。いくつかの事例において、配列決定することは、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む。
【0034】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、方法は、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリについてエピジェネティック修飾を決定することを含み得る。いくつかの事例において、エピジェネティック修飾は、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される。
【0035】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、方法は、第１の一本鎖ＤＮＡライブラリまたは第２の一本鎖ＤＮＡライブラリについて、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、転座またはこれらの組み合わせを決定することを含み得る。
【0036】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、複数の核酸分子は、セルフリー生物学的試料などの試料に由来し得る。いくつかの事例において、第１の複数の核酸分子または第２の複数の核酸分子はセルフリー生物学的試料に由来する。いくつかの事例において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの事例において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。いくつかの事例において、複数の核酸は、癌などの疾患を有すると疑われる対象に由来する。いくつかの事例において、複数の核酸は健康な対照に由来する。いくつかの事例において、第１の複数の核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの事例において、第２の複数の核酸は、健康な対照に由来する。
【0037】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、分析は、対象における疾患のリスクまたは疾患の存在をさらに提供する。いくつかの事例において、サイズの差が所定の閾値より大きい場合に、対象は疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、第１のサイズ分布の平均が第２のサイズ分布の平均よりも小さい場合に、対象は疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、疾患は癌である。いくつかの事例において、癌は、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される。いくつかの事例において、本方法は、対象に治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、疾患の進行または退行について対象を監視するために差を使用することをさらに含む。
【0038】
セルフリー核酸サイズ分析の方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの事例において、方法は、対象からの複数のセルフリー核酸分子から第１の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することと、対照からの複数のセルフリー核酸分子から第２の一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することとを含む。次に、いくつかの事例において、対象からの複数の核酸分子の少なくとも一部について第１のサイズを測定するために第１の一本鎖ライブラリが使用され、対照からの複数の核酸分子の少なくとも一部について第２のサイズを測定するために第２の一本鎖ライブラリが使用される。次いで、いくつかの事例において、対象が癌を有するまたは癌を有するリスクがある場合に、第１のサイズと第２のサイズの差が検出される。いくつかの事例において、二本鎖ライブラリを使用する方法と比較して、差は増強される。いくつかの事例において、第１の一本鎖ライブラリおよび第２の一本鎖ライブラリについて、メチル化状態が判定される。いくつかの事例において、第１の一本鎖ライブラリおよび第２の一本鎖ライブラリについて、コピー数多型（ＣＮＶ）が判定される。いくつかの事例において、差が所定の閾値より大きい場合に、対象は癌のリスクがあるか、または癌を有すると判定される。いくつかの事例において、第１のサイズが第２のサイズより小さい場合に、対象は癌のリスクがあるか、または癌を有すると判定される。
【0039】
ゲノム特徴の核酸分析および核酸末端分析のための方法
さらなる態様において、核酸分析のための方法であって、複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することを含み、複数の核酸分子は、対象に由来する一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、方法が提供される。本方法は、次いで、ゲノム特徴を有するとして、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することを含み得る。代替としてまたは組み合わせて、本方法は、次いで、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子の５’末端および／または３’末端を同定することを含み得る。次に、本方法は、個々の核酸分子についてサイズを測定することを含み得る。次いで、本方法は、個々の核酸分子のサイズに基づいてゲノム特徴を疾患と関連付けることを含み得る。代替としてまたは組み合わせて、本方法は、個々の核酸分子の５’末端および／または３’末端を疾患と会合することを含み得る。
さらなる態様において、核酸分析のための方法であって、複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することを含み、複数の核酸分子は、対象に由来する一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、方法が提供される。本方法は、次いで、ゲノム特徴を有するとして、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定することを含み得る。代替としてまたは組み合わせて、本方法は、次いで、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子の５’末端および／または３’末端を同定することを含み得る。次に、本方法は、個々の核酸分子についてサイズを測定することを含み得る。次いで、本方法は、個々の核酸分子のサイズに基づいてゲノム特徴を疾患と関連付けることを含み得る。代替としてまたは組み合わせて、本方法は、個々の核酸分子の５’末端および／または３’末端を疾患と会合することを含み得る。
【0040】
さらなる態様において、核酸分析のための方法であって、複数の核酸分子から一本鎖デオキシ核酸（ＤＮＡ）ライブラリを調製することを含み、複数の核酸分子は、対象由来の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む、方法が提供される。次に、一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子は、ゲノム特徴を有すると同定され得る。次いで、個々の核酸分子について少なくとも５’末端または３’末端が同定され得る。次いで、ゲノム特徴は、個々の核酸分子の５’末端または３’末端に基づいて疾患に関連付けられ得る。
【0041】
本明細書の核酸分析の方法の一態様において、方法は一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することを含み得る。いくつかの事例において、一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、複数の核酸分子を変性させることを含む。いくつかの事例において、一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、一本鎖ＤＮＡに対して特異的なＤＮＡリガーゼを用いて、複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端、３’末端または５’および３’末端にアダプターを連結することを含む。
【0042】
一本鎖ＤＮＡライブラリを調製するいくつかの方法では、個々の一本鎖ＤＮＡ分子が環状化される。いくつかの事例において、核酸試料は、一本鎖ＤＮＡを作製するために変性に供される。いくつかの事例において、核酸試料は、変性に供されない。いくつかの事例において、一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することは、（ｉ）複数の環状核酸分子を形成するために、第１の複数の核酸分子の個々の一本鎖ＤＮＡ分子を環状化することと；（ｉｉ）第１の複数の増幅された核酸分子を得るために、複数の環状核酸分子を増幅することとを含む。いくつかの事例において、環状化することは、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む。いくつかの事例において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅は、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの事例において、増幅は、個々の核酸分子を、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に接触させることを含む。
【0043】
本明細書で提供される核酸分析の方法の一態様において、一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡからの少量の夾雑二本鎖ＤＮＡを含み得る。いくつかの事例において、一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡから最大で５％の二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの事例において、一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡから最大で１％の二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの事例において、一本鎖ＤＮＡライブラリは、元の投入ＤＮＡから最大で０．５％の二本鎖ＤＮＡを含む。
【0044】
本明細書で提供される核酸分析の方法の一態様において、本方法は、１つまたは複数の標的配列を濃縮するための濃縮工程をさらに含み得る。いくつかの事例において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について複数の核酸分子を濃縮することをさらに含む。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。
【0045】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、ゲノム特徴を有するものとして一本鎖ＤＮＡライブラリの個々の核酸分子を同定すること；個々の核酸分子についてサイズを測定すること；または個々の核酸分子の５’末端もしくは３’末端を同定することは、一本鎖ＤＮＡライブラリを配列決定することを含み得る。いくつかの事例において、配列決定することは、合成による配列決定、連結による配列決定、ナノポア配列決定、ナノボール配列決定、イオン検出、ハイブリダイゼーションによる配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定、ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）およびイオントレント配列決定のうちの１つまたは複数から選択される方法を含む。
【0046】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、方法は、ゲノム特徴を有するとして核酸分子を同定することを含み得る。いくつかの事例において、ゲノム特徴はエピジェネティック修飾を含む。いくつかの事例において、エピジェネティック修飾は、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、リボシル化、シトルリン化および断片化からなる群から選択される。いくつかの事例において、ゲノム特徴は、コピー数多型（ＣＮＶ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、転座またはこれらの組み合わせを含む。
【0047】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、複数の核酸分子は、セルフリー生物学的試料などの試料に由来し得る。いくつかの事例において、複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する。いくつかの事例において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの事例において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。いくつかの事例において、複数の核酸は、癌などの疾患を有すると疑われる対象に由来する。いくつかの事例において、複数の核酸は健康な対照に由来する。いくつかの事例において、第１の複数の核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの事例において、第２の複数の核酸は、健康な対照に由来する。
【0048】
本明細書で提供される核酸分析の一態様において、分析は、対象における疾患のリスクまたは疾患の存在をさらに提供する。いくつかの事例において、個々の核酸分子が所定の閾値を下回る平均サイズを有する場合に、対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、個々の核酸分子が所定の閾値を下回る平均サイズを有する場合に、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子が疾患に関連すると判定される。いくつかの事例において、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子がゲノム特徴を有しない核酸分子よりも小さい平均サイズを有する場合に、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子が疾患に関連すると判定される。いくつかの事例において、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子が所定の閾値を下回るサイズを有する場合に、対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、ゲノム特徴を有する個々の核酸分子の５’末端または３’末端が所定の配列を有する場合に、対象が疾患のリスクがあるか、または疾患を有すると判定される。いくつかの事例において、疾患は癌である。いくつかの事例において、癌は、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、皮膚癌、悪性黒色腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌および脳癌からなる群から選択される。いくつかの事例において、本方法は、対象に治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、対象にさらなる癌モニタリングを推奨することをさらに含む。いくつかの事例において、本方法は、疾患の進行または退行について対象を監視するためにゲノム特徴、サイズまたは５’末端もしくは３’末端を使用することをさらに含む。
【0049】
核酸濃縮の方法
一態様において、癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを調製するための方法が提供される。ライブラリを調製するための方法は、セルフリー生物学的試料からの核酸分子の集団を、所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子の濃縮に供し、それにより、癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを作製することを含み得る。いくつかの事例において、所定の閾値は３６０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１８０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１５０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１２０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１１０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１００ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は９０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は８０ｂｐである。
一態様において、癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを調製するための方法が提供される。ライブラリを調製するための方法は、セルフリー生物学的試料からの核酸分子の集団を、所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子の濃縮に供し、それにより、癌由来の核酸が濃縮されたライブラリを作製することを含み得る。いくつかの事例において、所定の閾値は３６０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１８０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１５０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１２０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１１０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は１００ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は９０ｂｐである。いくつかの事例において、所定の閾値は８０ｂｐである。
【0050】
本明細書のライブラリを調製する方法の態様において、濃縮は、核酸分子の集団のサイズ選択であり得る。いくつかの事例において、サイズ選択は、核酸分子の集団のビーズ精製またはゲル精製を含む。いくつかの事例において、サイズ選択は、電気泳動、キャピラリー電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを含む。
【0051】
代替としてまたは組み合わせて、本明細書のライブラリを調製する方法では、濃縮は、最初にアダプターを核酸分子の集団に連結すること、次いで核酸分子の集団を切断剤と接触させることを含み得る。いくつかの事例において、切断剤はヌクレアーゼを含む。いくつかの事例において、切断剤は化学物質を含む。いくつかの事例において、切断剤は酸を含む。いくつかの事例において、切断は亜硫酸水素塩処理を含む。いくつかの事例において、切断は超音波処理を含む。いくつかの事例において、切断は物理的剪断を含む。さらなる非限定的な非酵素的切断方法は、Ａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｎｏｎ－Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９，ｅ１１５９５０に記載されている。いくつかの事例において、濃縮は、小断片を好む酵素を使用して核酸分子の集団の個々の核酸分子を環状化することを含む。
【0052】
代替としてまたは組み合わせて、本明細書のライブラリを調製する方法では、濃縮は、核酸分子の集団の個々の核酸分子を環状化すること、次いで核酸分子の集団を切断剤と接触させることを含み得る。いくつかの事例において、環状化することは、個々の核酸分子の５’末端を個々の核酸分子の３’末端に連結することを含む。いくつかの事例において、環状化することは、アダプターを個々の核酸分子の３’末端、５’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合することを含む。
【0053】
本明細書のライブラリを調製する方法のいくつかの態様において、本方法は、所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子を増幅することを含み得る。いくつかの事例において、増幅することは、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅することは、鎖置換活性を有しないポリメラーゼによって行われる。いくつかの事例において、増幅することは、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に個々の核酸分子を接触させることを含む。いくつかの事例において、増幅することは、個々の核酸分子を、標的特異的プライマーを含む増幅反応混合物に接触させることを含む。
【0054】
本明細書のライブラリを調製する方法のいくつかの態様において、本方法は、１つまたは複数の標的配列について所定の閾値未満のサイズを有する核酸分子を濃縮することを含み得る。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数のプライマーまたは捕捉プローブを用いて行われる。いくつかの事例において、濃縮することは、１つまたは複数の抗体またはその断片を用いて行われる。
【0055】
本明細書で提供されるライブラリを調製することの一態様において、複数の核酸分子は、セルフリー生物学的試料などの試料に由来し得る。いくつかの事例において、複数の核酸分子がセルフリー生物学的試料に由来する。いくつかの事例において、セルフリー生物学的試料は体液を含む。いくつかの事例において、体液は、尿、唾液、血液、血清、血漿、涙、痰、脳脊髄液、滑液、粘液、胆汁、精液、リンパ液、羊水、月経液またはこれらの組み合わせである。いくつかの事例において、複数の核酸は、癌などの疾患を有すると疑われる対象に由来する。いくつかの事例において、複数の核酸は健康な対照に由来する。いくつかの事例において、第１の複数の核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの事例において、第２の複数の核酸は、健康な対照に由来する。
【0056】
増幅およびライブラリ調製の方法
本明細書の方法は、対象からの試料中に存在するポリヌクレオチドの増幅を含み得る。本明細書で使用される増幅の方法は、ローリングサークル増幅を含み得る。代替としてまたは組み合わせて、本明細書で使用される増幅の方法はＰＣＲを含み得る。いくつかの事例において、本明細書における増幅の方法は、線形増幅を含む。いくつかの事例において、増幅は１つの遺伝子または遺伝子のセットを標的とせず、核酸試料全体が増幅される。いくつかの事例において、本方法は、複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に連結部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成することと、環状ポリヌクレオチドを増幅して増幅されたポリヌクレオチドを作製することとを含む。さらなる事例において、増幅の方法は、増幅されたポリヌクレオチドを剪断して剪断されたポリヌクレオチドを作製することを含み、各剪断されたポリヌクレオチドは５’末端および／または３’末端に１つまたは複数の剪断点を含む。いくつかの事例において、本方法は、１つの標的配列または複数の標的配列を濃縮することを含む。いくつかの事例において、本方法は、標的配列を濃縮することを含まない。いくつかの事例において、本方法は、ｃｆＤＮＡポリヌクレオチド配列を参照ゲノムに整列させることまたはマッピングすることを含まない。いくつかの事例において、本方法は末端修復を含まない。
本明細書の方法は、対象からの試料中に存在するポリヌクレオチドの増幅を含み得る。本明細書で使用される増幅の方法は、ローリングサークル増幅を含み得る。代替としてまたは組み合わせて、本明細書で使用される増幅の方法はＰＣＲを含み得る。いくつかの事例において、本明細書における増幅の方法は、線形増幅を含む。いくつかの事例において、増幅は１つの遺伝子または遺伝子のセットを標的とせず、核酸試料全体が増幅される。いくつかの事例において、本方法は、複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に連結部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成することと、環状ポリヌクレオチドを増幅して増幅されたポリヌクレオチドを作製することとを含む。さらなる事例において、増幅の方法は、増幅されたポリヌクレオチドを剪断して剪断されたポリヌクレオチドを作製することを含み、各剪断されたポリヌクレオチドは５’末端および／または３’末端に１つまたは複数の剪断点を含む。いくつかの事例において、本方法は、１つの標的配列または複数の標的配列を濃縮することを含む。いくつかの事例において、本方法は、標的配列を濃縮することを含まない。いくつかの事例において、本方法は、ｃｆＤＮＡポリヌクレオチド配列を参照ゲノムに整列させることまたはマッピングすることを含まない。いくつかの事例において、本方法は末端修復を含まない。
【0057】
一般に、環状ポリヌクレオチドを形成するために（直接、または１つもしくは複数の中間アダプターオリゴヌクレオチドを用いて）ポリヌクレオチドの末端を互いに連結すると、連結配列を有する連結部を生成する。ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端がアダプターポリヌクレオチドを介して連結される場合、用語「連結部」は、ポリヌクレオチドとアダプターの間の連結部（例えば、５’末端連結部または３’末端連結部の１つ）、またはアダプターポリヌクレオチドによって形成され、アダプターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの５’末端と３’末端との間の連結部を指すことができる。ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端が介在するアダプターなしで連結されている場合（例えば、一本鎖ＤＮＡの５’末端および３’末端）、「連結部」という用語は、これらの２つの末端が連結されている点を指す。連結部は、連結部を含むヌクレオチドの配列（「連結配列」とも呼ばれる）によって同定され得る。
【0058】
いくつかの実施形態において、試料は、天然の分解過程（細胞溶解、細胞死、ならびにその中でポリヌクレオチドがさらに分解され得る細胞の周囲環境へと、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリヌクレオチドが細胞から放出されるその他の過程、例えばセルフリーポリヌクレオチド、例えばセルフリーＤＮＡおよびセルフリーＲＮＡ）によって形成された末端の混合物を有するポリヌクレオチドを含む。介在するアダプターなしでポリヌクレオチド末端が連結されている場合、連結配列は、参照配列への整列によって同定され得る。例えば、２つの成分配列の順序が参照配列に対して逆転しているように見える場合には、そこで逆転が生じているように見える点は、その点での連結部を示す指標であり得る。ポリヌクレオチド末端が１つまたは複数のアダプター配列を介して連結される場合には、連結部は、既知のアダプター配列への近接によって、または配列決定リードが環状化されたポリヌクレオチドの５’および３’末端の両方から配列を得るのに十分な長さのものであれば、上記のような整列によって同定され得る。
【0059】
いくつかの実施形態において、個々のポリヌクレオチドを環状化することは、複数のポリヌクレオチドを連結反応に供することによって達成される。連結反応は、リガーゼ酵素を含み得る。いくつかの実施形態において、リガーゼ酵素は、増幅前に分解される。増幅前のリガーゼの分解は、増幅可能なポリヌクレオチドの回収率を増加させることができる。いくつかの実施形態において、複数の環状化されたポリヌクレオチドは、増幅前に精製または単離されない。いくつかの実施形態において、環状化されていない直鎖ポリヌクレオチドは、増幅前に分解される。
【0060】
ポリヌクレオチド（例えば、試料由来のポリヌクレオチド）は、環状化の前に濃縮され得る。これは、標的特異的プライマーを使用して実施され得る。あるいは、これは、基材に結合されたプルダウンプローブまたは捕捉配列（例えば、アレイまたはビーズに結合されたプルダウンプローブまたは捕捉配列）などの捕捉配列を使用して実施され得る。環状化の前に標的特異的配列を濃縮するために、ベイトのセットが使用され得る。
【0061】
いくつかの事例において、環状化は、複数のポリヌクレオチド中のポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方にアダプターポリヌクレオチドを連結する操作を含む。前述されるように、ポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端がアダプターポリヌクレオチドを介して連結される場合、用語「連結部」は、ポリヌクレオチドとアダプターの間の連結部（例えば、５’末端連結部または３’末端連結部の１つ）、またはアダプターポリヌクレオチドによって形成され、アダプターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの５’末端と３’末端との間の連結部を指すことができる。
【0062】
環状化されたポリヌクレオチドは、例えば、リガーゼ酵素の分解後に増幅されて、増幅されたポリヌクレオチドを得ることができる。環状ポリヌクレオチドを増幅することは、ポリメラーゼによって達成することができる。いくつかの事例において、ポリメラーゼは鎖置換活性を有するポリメラーゼである。いくつかの事例において、ポリメラーゼはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。あるいは、ポリメラーゼは、鎖置換活性を有しないポリメラーゼである。いくつかの事例において、ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。代替としてまたは組み合わせて、ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、またはＴａｑポリメラーゼファミリー中のポリメラーゼである。いくつかの事例において、増幅はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。ＲＣＡから生じる増幅されたポリヌクレオチドは、直鎖コンカテマー、すなわち鋳型ポリヌクレオチドからの標的配列（例えば、サブユニット配列）の１つより多くのコピーを含むポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、増幅することは、環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む。いくつかの実施形態において、増幅することは、環状ポリヌクレオチドを、標的化されたプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む。あるいは、環状ポリヌクレオチドは、非標的化様式で増幅され得、増幅後に１つまたは複数の標的配列が濃縮され得る。いくつかの事例において、増幅することは、それぞれが配列相補性を介して異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含む増幅反応混合物に、環状ポリヌクレオチドを供することを含む。いくつかの事例において、増幅することは、環状ポリヌクレオチドを、インバースプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む。
【0063】
試料由来のセルフリーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、これらのいずれかの断片、またはこれらの任意の２つ以上の組み合わせを含むがこれらに限定されない様々なポリヌクレオチドのいずれでもあり得る。いくつかの実施形態において、試料はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、試料はセルフリーゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、プライマーとＤＮＡポリメラーゼの任意の適切な組み合わせを使用したプライマー伸長反応などの増幅によって生成されたＤＮＡを含む。プライマー伸長反応のための鋳型がＲＮＡである場合、逆転写の産物は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と呼ばれる。プライマー伸長反応において有用なプライマーは、１つまたは複数の標的に特異的な配列、ランダム配列、部分的にランダムな配列およびこれらの組み合わせを含むことができる。一般に、試料ポリヌクレオチドは、試料中に存在する任意のポリヌクレオチドを含み、標的ポリヌクレオチドを含むことがあり得、または含まないことがあり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の方法に供されるポリヌクレオチドは一本鎖ポリヌクレオチドであり、一本鎖ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドの存在下であり得、または二本鎖ポリヌクレオチドの存在下でないことがあり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、一本鎖形態で単離されるｓｓＤＮＡ、または二本鎖形態で単離され、その後本開示の方法中の１つまたは複数の工程のために一本鎖にされるＤＮＡであり得る。
【0064】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、抽出工程なしに、および／または精製工程なしに、その後の工程（例えば、環状化および増幅）に供される。例えば、流体試料は、抽出工程なしに細胞を除去して精製された液体試料および細胞試料を生成するために処理され得、精製された流体試料からのＤＮＡの単離が後続し得る。沈殿または基材への非特異的結合後に結合したポリヌクレオチドを放出させるために基材を洗浄することによるなど、ポリヌクレオチドの単離のための様々な手順が利用可能である。ポリヌクレオチドが細胞抽出工程なしに試料から単離される場合には、ポリヌクレオチドは、大部分が、セルフリーＤＮＡおよびセルフリーＲＮＡなどの細胞外または「セルフリー」ポリヌクレオチドであり、これは死細胞または損傷した細胞に相当し得る。このような細胞の独自性は、腫瘍細胞（例えば、癌検出において）、胎児細胞（例えば、出生前診断において）、移植された組織由来の細胞（例えば、移植不全の早期検出において）、または微生物群のメンバーなど、このような細胞が由来する細胞または細胞の集団を特徴付けるために使用され得る。
【0065】
所望であれば、試料からのポリヌクレオチドは、さらなる処理の前に断片化され得る。いくつかの事例において、断片化はより大きな断片を好み、したがって、セルフリーＤＮＡのより小さな断片が濃縮され得る。断片化は、化学的、酵素的および機械的断片化を含む様々な方法のいずれかによって達成され得る。いくつかの実施形態において、断片は、約１０～約１，０００ヌクレオチド長、例えば１０～８００、１０～５００、５０～５００、９０～２００または５０～１５０ヌクレオチドの平均長または中央値長を有する。いくつかの実施形態において、断片は、約１００、２００、３００、５００、６００、８００、１０００もしくは１５００ヌクレオチドまたは約１００、２００、３００、５００、６００、８００、１０００もしくは１５００ヌクレオチド未満の平均長または中央値長を有する。いくつかの実施形態において、断片は約９０～２００ヌクレオチドの範囲であり、および／または約１５０ヌクレオチドの平均長を有する。いくつかの実施形態において、断片化は、機械的に達成され、試料ポリヌクレオチドを音響音波処理に供することを含む。いくつかの実施形態において、断片化は、二本鎖核酸切断を生成するために１つまたは複数の酵素に適した条件下で試料ポリヌクレオチドを１つまたは複数の酵素で処理することを含む。ポリヌクレオチド断片の生成において有用な酵素の例としては、配列特異的および非配列特異的ヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＤＮａｓｅＩ、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ、制限エンドヌクレアーゼ、これらの変異型、およびこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、ＤＮａｓｅＩによる消化は、Ｍｇ＋＋の非存在下およびＭｎ＋＋の存在下でＤＮＡ中にランダムな二本鎖切断を誘導することができる。いくつかの実施形態において、断片化は、試料ポリヌクレオチドを１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼで処理することを含む。断片化は、５’オーバーハング、３’オーバーハング、平滑末端またはこれらの組み合わせを有する断片を生成することができる。いくつかの実施形態において、例えば断片化が１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼの使用を含む場合、試料ポリヌクレオチドの切断は、予測可能な配列を有するオーバーハングを残す。断片化されたポリヌクレオチドは、カラム精製、ビーズ精製、またはアガロースゲルからの単離などの標準的な方法によって断片をサイズ選択する工程に供され得る。
【0066】
いくつかの事例において、本明細書の方法は、ポリヌクレオチドからのＤＮＡライブラリの調製を含む。例えば、本明細書の方法は、一本鎖ＤＮＡライブラリの調製を含む。一本鎖ＤＮＡライブラリを調製する任意の適切な方法が、本明細書の方法における使用について企図される。例えば、一本鎖ＤＮＡライブラリを調製する方法は、複数のｓｓＤＮＡを作製するためにＤＮＡ試料を変性させること；ｓｓＤＮＡ分子の３’末端にアダプターを連結すること；アダプターに相補的なプライマーを使用して第２の鎖を合成すること；二本鎖アダプターを伸長産物に連結すること；第１のアダプターおよび第２のアダプターを標的とするプライマーを使用して（例えば、ＰＣＲを使用して）第２の鎖を増幅すること；配列決定装置でライブラリを配列決定することを含む。一本鎖ライブラリ調製のさらなる方法は、複数のｓｓＤＮＡを作製するために、ＤＮＡ試料を変性させること；アダプターをｓｓＤＮＡ分子の３’末端に連結すること；アダプターに相補的なプライマーを使用することによって第２の鎖を合成すること；二本鎖アダプターを伸長産物に連結すること；第１および第２のアダプターを標的とするプライマーを使用して第２の鎖を（例えば、ＰＣＲによって）第２の鎖を増幅すること；いくつかの事例においては、捕捉プローブとのハイブリダイゼーションを使用して関心対象の領域を濃縮すること；捕捉された生成物を（例えば、ＰＣＲによって）増幅すること；配列決定装置でライブラリを配列決定することを含む。
【0067】
一本鎖ライブラリ調製のさらなる例としては、参照により全体が本明細書に組み入れられるＧａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．８（４）７３７－７４８に記載されているように、ＤＮＡ鎖の５’および３’末端から残存するリン酸基を除去するために、ＤＮＡを熱不安定性ホスファターゼで処理する工程；ＤＮＡ鎖からのシトシン脱アミノ化に由来するデオキシウラシルの除去工程；約１０ヌクレオチドと長い３’ビオチン化スペーサーアームとを有する５’リン酸化アダプターオリゴヌクレオチドの、ＤＮＡ鎖の３’末端への連結工程；ストレプトアビジンビーズ上への、アダプターが連結された分子の固定化工程；Ｂｓｔポリメラーゼを使用してアダプターに相補的な５’－尾部付きプライマーを使用して鋳型鎖を複製する工程；過剰なプライマーを洗い流す工程；Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた３’オーバーハングの除去工程；平滑末端連結を使用して、新たに合成された鎖に第２のアダプターを連結する工程；余分なアダプターを洗い流す工程；熱変性によってライブラリ分子を放出させる工程；尾部付きプライマーを使用した増幅を通じて、バーコードを含む全長アダプター配列を付加する工程；ならびにライブラリを配列決定する工程を含む方法が挙げられる。
【0068】
本明細書で提供されるいくつかのライブラリ調製アプローチでは、ある特定の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡポリヌクレオチド）が、複数の核酸分子（例えば、総ｃｆＤＮＡ）から選択されるかまたは濃縮される。ある特定の核酸分子または標的配列は、これらが有益な結果をもたらす可能性がより高い場合に選択または濃縮され得る。例えば、ある特定の核酸分子または標的配列は、これらが、健康な対象と比較して、癌（例えば、早期癌）を有する対象において変化したサイズ差を有するｃｆＤＮＡ配列に対応する場合に選択され得る。ある特定の核酸分子は、標的特異的プライマーを用いた増幅によって選択または濃縮され得る。ある特定の核酸分子は、標的核酸分子をプローブに結合させることによって選択または濃縮され得る。例えば、そのような核酸分子は、ベイトのセットを使用して選択または濃縮される。
【0069】
さらなるライブラリ調製方法では、抗体を使用して、ある特定の特徴を有するｃｆＤＮＡ断片が選択される。いくつかの事例において、メチル化または高度メチル化されたｃｆＤＮＡ断片は、抗体を使用して選択される。次いで、選択されたｃｆＤＮＡ断片は、環状化、一本鎖ＤＮＡライブラリ調製および二本鎖ＤＮＡライブラリ調製を含む、本明細書に記載される任意のライブラリ調製方法において使用される。そのような単離されたｃｆＤＮＡ断片を配列決定することは、メチル化または高度メチル化などの修飾を含む、ｃｆＤＮＡ中に存在する特徴に関する情報を提供する。
【0070】
いくつかの実施形態によれば、試料からの複数のポリヌクレオチドのうちのポリヌクレオチドが環状化される。環状化は、同じポリヌクレオチドの３’末端に、試料中の別のポリヌクレオチドの３’末端に、または異なる源からのポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドアダプターなどの人工ポリヌクレオチド）の３’末端にポリヌクレオチドの５’末端を連結することを含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの５’末端は、同じポリヌクレオチドの３’末端に連結されている（「自己連結」とも呼ばれる）。いくつかの実施形態において、環状化反応の条件は、特定の平均長さの環状化されたポリヌクレオチドの集団を生成するように、特定の長さの範囲内のポリヌクレオチドの自己連結を好むように選択される。例えば、環状化反応条件は、約５０００、２５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０またはより少ないヌクレオチド長より短いポリヌクレオチドの自己連結を好むように選択され得る。いくつかの実施形態において、環状化されたポリヌクレオチドの平均長さがそれぞれの範囲内に入るように、５０～５０００ヌクレオチド、１００～２５００ヌクレオチドまたは１５０～５００ヌクレオチドの長さを有する断片が好まれる。いくつかの実施形態においては、環状化された断片の８０％以上が、５０～５００ヌクレオチド長、例えば５０～２００ヌクレオチド長である。最適化され得る反応条件には、連結反応に対して割り当てられた時間の長さ、様々な試薬の濃度、および連結されるべきポリヌクレオチドの濃度が含まれる。いくつかの実施形態において、環状化反応は、環状化前の試料中に存在する断片長の分布を保存する。例えば、環状化前の試料中および環状化されたポリヌクレオチドの断片長の平均、中央値、最頻値および標準偏差の１つまたは複数は、互いに７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％超以内である。
【0071】
いくつかの事例においては、自己連結環状化生成物を優先的に形成するよりはむしろ、試料中のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端が１つまたは複数の介在するアダプターオリゴヌクレオチドによって連結されて環状ポリヌクレオチドを形成するように、１つまたは複数のアダプターオリゴヌクレオチドが使用される。例えば、ポリヌクレオチドの５’末端をアダプターの３’末端に連結させることができ、同じアダプターの５’末端を同じポリヌクレオチドの３’末端に連結させることができる。アダプターオリゴヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチドに連結することができる配列であって、少なくともその一部が知られている配列を有する任意のオリゴヌクレオチドを含む。アダプターオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体、非標準ヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むことができる。アダプターオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖または部分的二重鎖であり得る。一般に、部分的二重鎖アダプターは、１つまたは複数の一本鎖領域および１つまたは複数の二本鎖領域を含む。二本鎖アダプターは、互いにハイブリダイズした２つの別個のオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチド二重鎖」とも呼ばれる）を含むことができ、ハイブリダイゼーションは、１つもしくは複数の平滑末端、１つもしくは複数の３’オーバーハング、１つもしくは複数の５’オーバーハング、ミスマッチしたヌクレオチドおよび／もしくは対形成していないヌクレオチドから生じる１つもしくは複数の膨隆、またはこれらの任意の組み合わせを残し得る。アダプターの２つのハイブリダイズした領域がハイブリダイズしていない領域によって互いに隔てられている場合には、「バブル」構造が生じる。異なる配列のアダプターなど、異なる種類のアダプターを組み合わせて使用することができる。異なるアダプターは、逐次反応でまたは同時に試料ポリヌクレオチドに連結することができる。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの両端に同一のアダプターが付加される。例えば、第１および第２のアダプターを同じ反応に添加することができる。アダプターは、試料ポリヌクレオチドと組み合わせる前に操作することができる。例えば、末端リン酸を付加または除去することができる。
【0072】
アダプターオリゴヌクレオチドが使用される場合、アダプターオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の増幅プライマーアニーリング配列またはその相補物、１つまたは複数の配列決定プライマーアニーリング配列またはその相補物、１つまたは複数のバーコード配列、複数の異なるアダプターまたは異なるアダプターの一部の間で共有される１つまたは複数の共通配列、１つまたは複数の制限酵素認識部位、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドオーバーハングに相補的な１つまたは複数のオーバーハング、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．によって開発されたようなフローセルなどの超並列シーケンシング用のフローセルなどのシーケンシングプラットフォームに取り付けるための）１つまたは複数のプローブ結合部位、１つまたは複数のランダムまたはほぼランダムな配列（例えば、１つまたは複数の位置において２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチドであり、１つまたは複数の位置において選択された異なるヌクレオチドのそれぞれが、ランダムな配列を含むアダプターのプールで表される）、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な配列要素の１つまたは複数を含有することができる。いくつかの事例において、例えば、アダプターと相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドで被覆されており、正しいアダプターを有する閉環へのハイブリダイゼーションによって正しいアダプターを有する閉環を「捕捉」することができるビーズ（特に、取り扱いを容易にするために磁気ビーズ）を使用することによってアダプターを含有する環を精製し、アダプターを含有しない環および一切の連結されていない成分を洗い流し、次いで捕捉された環をビーズから放出させるために、アダプターが使用され得る。さらに、いくつかの事例においては、直接ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などによって、コンカテマーを生成するために、ハイブリダイズした捕捉プローブと標的の環との複合体を直接使用することができる。いくつかの実施形態においては、環内のアダプターを配列決定プライマーとして使用することもできる。２つ以上の配列要素は、互いに隣接しないことができ（例えば、１つまたは複数のヌクレオチドによって分離されている）、互いに隣接することができ、部分的に重複することができ、または完全に重複することができる。例えば、増幅プライマーアニーリング配列は、配列決定プライマーアニーリング配列としても機能することができる。配列要素は、３’末端もしくはその近傍、５’末端もしくはその近傍、またはアダプターオリゴヌクレオチドの内部に位置することができる。配列要素は、任意の適切な長さ、例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれを超えるヌクレオチド長または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれを超えるヌクレオチド長未満のものであり得る。アダプターオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドを構成する１つまたは複数の配列要素を収容するのに少なくとも十分な任意の適切な長さを有することができる。いくつかの実施形態において、アダプターは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００もしくはそれを超えるヌクレオチド長または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００もしくはそれを超えるヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、約１２～４０ヌクレオチド長、例えば約１５～３５ヌクレオチド長の範囲である。
【0073】
いくつかの実施形態において、１つの試料またはアダプター連結反応に由来するポリヌクレオチドを別の試料またはアダプター連結反応に由来するポリヌクレオチドから区別するためにバーコード配列を使用することができるように、１つの試料由来の断片化されたポリヌクレオチドに連結されたアダプターオリゴヌクレオチドは、すべてのアダプターオリゴヌクレオチドに共通の１つまたは複数の配列と、その特定の試料のポリヌクレオチドに連結されたアダプターに固有のバーコードとを含む。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドオーバーハングに相補的な５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方を含む。相補的オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超えるヌクレオチド長を含むがこれらに限定されない、１またはそれより大きいヌクレオチド長であり得る。相補的オーバーハングは、固定された配列を含み得る。１つまたは複数のヌクレオチドが１つまたは複数の位置において２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択され、１つまたは複数の位置において選択された異なるヌクレオチドのそれぞれが、ランダムな配列を含む相補的オーバーハングを有するアダプターのプールで表されるように、アダプターオリゴヌクレオチドの相補的オーバーハングは、１つまたは複数のヌクレオチドのランダムな配列を含み得る。いくつかの実施形態において、アダプターオーバーハングは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成される標的ポリヌクレオチドオーバーハングと相補的である。いくつかの実施形態において、アダプターオーバーハングは、アデニンまたはチミンからなる。
【0074】
ポリヌクレオチドを環状化するための様々な方法が利用可能である。いくつかの実施形態において、環状化は、リガーゼ（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼ）の使用などの酵素反応を含む。Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（ＤＮＡとＲＮＡの両方に作用するｓｓＲＮＡリガーゼ）を含むがこれらに限定されない様々なリガーゼが利用可能である。さらに、ｄｓＤＮＡ鋳型が存在しなければ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはｓｓＤＮＡを連結することもできるが、これは一般に遅い反応である。リガーゼの他の非限定的な例としては、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、サーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）ＤＮＡリガーゼ（ＩおよびＩＩ）、耐熱性リガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ耐熱性ＤＮＡリガーゼ、ＶａｎＣ型リガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｐ ＤＮＡリガーゼおよび生物資源探査によって発見された新規リガーゼを含むＮＡＤ依存性リガーゼ；Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ１、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶを含むＡＴＰ依存性リガーゼ、および生物資源探査によって発見された新規リガーゼ；ならびにこれらの野生型、変異体アイソフォームおよび遺伝子操作された変異型が挙げられる。自己連結が望まれる場合、分子間構造ではなく分子内環の形成を促進するために、ポリヌクレオチドおよび酵素の濃度を調節することができる。反応温度および時間も調整することができる。いくつかの実施形態において、分子内環を促進するために６０℃が使用される。いくつかの実施形態において、反応時間は、１２～１６時間である。反応条件は、選択された酵素の製造業者によって指定された反応条件であり得る。いくつかの実施形態において、環状化反応後に任意の連結されなかった核酸を消化するためにエキソヌクレアーゼ工程を含めることができる。すなわち、閉じた環は、遊離の５’または３’末端を含有せず、したがって、５’または３’エキソヌクレアーゼの導入は、閉じた環を消化せず、連結されていない成分を消化する。これは、多重システムにおいて特定の用途を見出し得る。
【0075】
一般に、環状ポリヌクレオチドを形成するために（直接、または１つもしくは複数の中間アダプターオリゴヌクレオチドを用いて）ポリヌクレオチドの末端を互いに連結すると、連結配列を有する連結部を生成する。ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端がアダプターポリヌクレオチドを介して連結される場合、用語「連結部」は、ポリヌクレオチドとアダプターの間の連結部（例えば、５’末端連結部または３’末端連結部の１つ）、またはアダプターポリヌクレオチドによって形成され、アダプターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの５’末端と３’末端との間の連結部を指すことができる。ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端が介在するアダプターなしで連結されている場合（例えば、一本鎖ＤＮＡの５’末端および３’末端）、「連結部」という用語は、これらの２つの末端が連結されている点を指す。連結部は、連結部を含むヌクレオチドの配列（「連結配列」とも呼ばれる）によって同定され得る。いくつかの実施形態において、試料は、天然の分解過程（細胞溶解、細胞死、ならびにセルフリーＤＮＡおよびセルフリーＲＮＡなどのセルフリーポリヌクレオチドにおけるように、その中でＤＮＡがさらに分解され得る細胞の周囲環境へとＤＮＡが細胞から放出されるその他の過程など）、試料処理（固定、染色および／または保存手順など）の副産物である断片化および特定の標的配列に限定せずにＤＮＡを切断する方法（例えば、音波処理などによる機械的断片化；ＤＮａｓｅ Ｉ、フラグメンターゼなどの非配列特異的ヌクレアーゼ処理）による断片化によって形成される末端の混合物を有するポリヌクレオチドを含む。試料が末端の混合物を有するポリヌクレオチドを含む場合、２つのポリヌクレオチドが同じ５’末端端または３’末端を有する可能性は低く、２つのポリヌクレオチドが独立して同じ５’末端および３’末端の両方を有する可能性は極めて低い。したがって、いくつかの実施形態において、２つのポリヌクレオチドが同じ標的配列を有する部分を含む場合でさえ、異なるポリヌクレオチドを区別するために、連結部が使用され得る。介在するアダプターなしでポリヌクレオチド末端が連結されている場合、連結配列は、参照配列への整列によって同定され得る。例えば、２つの成分配列の順序が参照配列に対して逆転しているように見える場合には、そこで逆転が生じているように見える点は、その点での連結部を示す指標であり得る。ポリヌクレオチド末端が１つまたは複数のアダプター配列を介して連結される場合には、連結部は、既知のアダプター配列への近接によって、または配列決定リードが環状化されたポリヌクレオチドの５’および３’末端の両方から配列を得るのに十分な長さのものであれば、上記のような整列によって同定され得る。いくつかの実施形態において、特定の連結部の形成は、その形成が試料の環状化されたポリヌクレオチドの間で特有であるような十分にまれな事象である。
【0076】
配列決定の方法
いくつかの実施形態によれば、直鎖および／または環状化されたポリヌクレオチド（いくつかの事例では濃縮されていることがあり得る、これらの増幅産物）は、配列決定リードを生成するために配列決定反応に供される。このような方法によって作製された配列決定リードは、本明細書中に開示される他の方法に従って使用され得る。様々な配列決定方法、特にハイスループット配列決定方法が利用可能である。例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製の配列決定システム（ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）などの配列決定システム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）など）、Ｒｏｃｈｅの４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓシステム、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓシステム、ＭＧＩなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、配列決定は、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００もしくはそれを超えるヌクレオチド長のリードまたは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００もしくはそれを超えるヌクレオチド長を超えるリードを作製するためのＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）システムの使用を含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、個々のヌクレオチドが成長中のプライマー伸長産物に付加されるにつれて個々のヌクレオチドが反復的に同定される合成過程による配列決定を含む。パイロシークエンシングは、得られた合成混合物を配列決定反応の副生成物、すなわちピロリン酸の存在についてアッセイすることによってヌクレオチドの取り込みを同定する合成過程による配列の一例である。特に、プライマー／鋳型／ポリメラーゼ複合体を単一種類のヌクレオチドと接触させる。そのヌクレオチドが組み込まれれば、重合反応は、三リン酸鎖のαおよびβリン酸間のヌクレオシド三リン酸を切断し、ピロリン酸を放出する。次いで、ピロリン酸をＡＭＰとともにＡＴＰに変換し、次いで、測定可能な光シグナルを生成するためにルシフェラーゼ酵素を使用してＡＴＰを測定する化学発光酵素レポーター系を使用して、放出されたピロリン酸の存在が同定される。光が検出される場合には、塩基が組み込まれているが、光が検出されない場合には、塩基は組み込まれていない。適切な洗浄工程の後、鋳型配列中の後続の塩基を順次同定するために、様々な塩基を複合体と繰り返し接触させる。例えば、参照により全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，２１０，８９１号を参照されたい。
いくつかの実施形態によれば、直鎖および／または環状化されたポリヌクレオチド（いくつかの事例では濃縮されていることがあり得る、これらの増幅産物）は、配列決定リードを生成するために配列決定反応に供される。このような方法によって作製された配列決定リードは、本明細書中に開示される他の方法に従って使用され得る。様々な配列決定方法、特にハイスループット配列決定方法が利用可能である。例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製の配列決定システム（ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）などの配列決定システム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）など）、Ｒｏｃｈｅの４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓシステム、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓシステム、ＭＧＩなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、配列決定は、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００もしくはそれを超えるヌクレオチド長のリードまたは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００もしくはそれを超えるヌクレオチド長を超えるリードを作製するためのＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）システムの使用を含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、個々のヌクレオチドが成長中のプライマー伸長産物に付加されるにつれて個々のヌクレオチドが反復的に同定される合成過程による配列決定を含む。パイロシークエンシングは、得られた合成混合物を配列決定反応の副生成物、すなわちピロリン酸の存在についてアッセイすることによってヌクレオチドの取り込みを同定する合成過程による配列の一例である。特に、プライマー／鋳型／ポリメラーゼ複合体を単一種類のヌクレオチドと接触させる。そのヌクレオチドが組み込まれれば、重合反応は、三リン酸鎖のαおよびβリン酸間のヌクレオシド三リン酸を切断し、ピロリン酸を放出する。次いで、ピロリン酸をＡＭＰとともにＡＴＰに変換し、次いで、測定可能な光シグナルを生成するためにルシフェラーゼ酵素を使用してＡＴＰを測定する化学発光酵素レポーター系を使用して、放出されたピロリン酸の存在が同定される。光が検出される場合には、塩基が組み込まれているが、光が検出されない場合には、塩基は組み込まれていない。適切な洗浄工程の後、鋳型配列中の後続の塩基を順次同定するために、様々な塩基を複合体と繰り返し接触させる。例えば、参照により全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，２１０，８９１号を参照されたい。
【0077】
関連する配列決定過程では、プライマー／鋳型／ポリメラーゼ複合体を基材上に固定化され、複合体を標識されたヌクレオチドと接触させる。複合体の固定化は、プライマー配列、鋳型配列および／またはポリメラーゼ酵素を通じたものであり得、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、複合体の固定化は、ポリメラーゼまたはプライマーと基材表面の間での結合を介したものであり得る。代替の構成では、ヌクレオチドは、除去可能なターミネータ基ありおよびなしで提供される。組み込まれると、標識は複合体と結合し、したがって検出可能である。ターミネータを有するヌクレオチドの場合には、個々に同定可能な標識を有する４つの異なるヌクレオチドすべてを複合体と接触させる。標識されたヌクレオチドの組み込みは、ターミネータの存在によって伸長を停止させ、複合体に標識を付加し、組み込まれたヌクレオチドの同定を可能にする。次いで、組み込まれたヌクレオチドから標識およびターミネータを除去し、適切な洗浄工程の後、この過程が繰り返される。ターミネータなしのヌクレオチドの場合には、パイロシークエンシングと同様に、単一の種類の標識されたヌクレオチドが組み込まれるかどうかを決定するために、単一の種類の標識されたヌクレオチドが複合体に加えられる。ヌクレオチド上の標識基の除去および適切な洗浄工程の後、様々な異なるヌクレオチドを同じ過程で反応混合物に繰り返した。例えば、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み入れられる、米国特許第６，８３３，２４６号を参照されたい。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍは、国際公開第９８／４４１５１号に記載されている技術に基づいており、ＤＮＡ分子は、アンカープローブ結合部位（フローセル結合部位とも呼ばれる）を介して配列決定プラットフォーム（フローセル）に結合され、スライドガラス上でインサイチュ増幅される。ＤＮＡ分子がその上で増幅される固体表面は、複数の第１および第２の結合されたオリゴヌクレオチドを含むことができ、第１の結合されたオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの一方の末端付近または一方の末端の配列に相補的であり、第２の結合されたオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの他方の末端付近または他方の末端の配列に相補的である。この配置は、米国特許出願公開第２０１４０１２１１１６号に記載されているようなブリッジ増幅を可能にする。次いで、ＤＮＡ分子を配列決定プライマーにアニーリングさせ、可逆的ターミネータアプローチを使用して塩基ごとに並行して配列決定する。配列決定プライマーのハイブリダイゼーションの前に、架橋を固定する結合されたオリゴヌクレオチドの１つの中の切断部位における二本鎖架橋ポリヌクレオチドの１つの鎖の切断が先行してもよく、その結果、一方の一本鎖は、変性によって除去され得る固体基材に結合せず、他方の鎖は結合して、配列決定プライマーへのハイブリダイゼーションに利用可能となる。いくつかの事例において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍは、８個のチャネルを有するフローセルを利用して、１８～３６塩基長の配列決定リードを生成し、実行ごとに＞１．３ Ｇｂｐの高品質データを生成する（ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ参照）。
【0078】
合成過程によるさらなる配列では、鋳型依存性合成が行われている最中に、異なって標識されたヌクレオチドの取り込みがリアルタイムで観察される。特に、蛍光標識されたヌクレオチドが組み込まれている最中に、個々の固定化されたプライマー／鋳型／ポリメラーゼ複合体が観察され、塩基が添加されている最中に、各添加された塩基のリアルタイムな同定が可能になる。この過程では、標識基は、取り込み中に切断されるヌクレオチドの一部に結合される。例えば、取り込み中に除去されたリン酸鎖の一部、すなわちヌクレオシドポリリン酸上のβ、γまたはその他の末端リン酸基に標識基を付着させることによって、標識は新生鎖中に取り込まれず、代わりに天然のＤＮＡが産生される。個々の分子の観察は、非常に小さい照射体積内での複合体の光閉じ込めを含み得る。複合体を光学的に閉じ込めることによって、ランダムに拡散するヌクレオチドは極めて短期間存在する一方で、組み込まれたヌクレオチドは、それが組み込まれている間は、より長く観察体積内に保持される監視領域が作出される。これは、取り込み事象と関連する特徴的なシグナルをもたらし、このシグナルは、添加されている塩基に特徴的なシグナルプロファイルによっても特徴付けられる。関連する態様においては、取り込み事象が標識成分を相互作用する近傍に配置し、この場合も同様に、取り込まれている塩基に特徴的である特徴的なシグナルが生成するように、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素対などの相互作用する標識成分が、ポリメラーゼまたは複合体の他の部分および組み込まれているヌクレオチドに対して提供される（例えば、それぞれが参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第６，９１７，７２６号、同第７，０３３，７６４号、同第７，０５２，８４７号、同第７，０５６，６７６号、同第７，１７０，０５０号、同第７，３６１，４６６号、同第７，４１６，８４４；および米国特許出願公開第２００７０１３４１２８号を参照）。
【0079】
いくつかの実施形態において、試料中の核酸は連結によって配列決定することができる。例えば、ポロニー法およびＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、現在はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において使用されるように、この方法は、標的配列を同定するためにＤＮＡリガーゼ酵素を使用し得る。一般に、配列決定された位置に従って標識された、固定長のすべての可能なオリゴヌクレオチドのプールが提供される。オリゴヌクレオチドはアニーリングおよび連結され、一致した配列に対するＤＮＡリガーゼによる優先的な連結が、その位置で相補的配列に対応するシグナルをもたらす。
【0080】
いくつかの実施形態において、試料中の核酸は、ナノポア技術を使用して配列決定される。
【0081】
本明細書の配列決定方法は、本明細書の方法において有用な情報を提供する。いくつかの事例において、配列決定は多型領域の配列を提供する。さらに、配列決定は、ｃｆＤＮＡを含むＤＮＡなどのポリヌクレオチドの長さを提供する。さらに、配列決定は、ｃｆＤＮＡなどのＤＮＡの切断点または末端の配列を提供する。配列決定は、タンパク質結合部位の境界またはＤＮａｓｅ高感受性部位の境界の配列をさらに提供する。
【0082】
コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図７は、本開示の方法を実施するようにプログラムまたはその他構成されたコンピュータシステム７０１を示す。コンピュータシステム７０１は、例えば、対象が疾患（例えば、癌）を有するかまたは有するリスクがあると判定するための方法などの本開示の方法の様々な態様を制御することができる。
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図７は、本開示の方法を実施するようにプログラムまたはその他構成されたコンピュータシステム７０１を示す。コンピュータシステム７０１は、例えば、対象が疾患（例えば、癌）を有するかまたは有するリスクがあると判定するための方法などの本開示の方法の様々な態様を制御することができる。
【0083】
コンピュータシステム７０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサとすることができる中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」とも称される）７０５を含む。コンピュータシステム７０１は、メモリまたは記憶場所７１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置７１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース７２０（例えば、ネットワークアダプター）、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、および／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺装置７２５も含む。メモリ７１０、記憶装置７１５、インターフェース７２０および周辺装置７２５は、マザーボードなどの通信バス（ソリッドなライン）を介してＣＰＵ７０５と通信する。記憶装置７１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）とすることができる。コンピュータシステム７０１は、通信インターフェース７２０の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）７３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク７３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットとすることができる。ネットワーク７３０は、いくつかの事例においては、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク７３０は、１つまたは複数のコンピュータサーバを含むことができ、コンピュータサーバはクラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる。ネットワーク７３０は、いくつかの事例において、コンピュータシステム７０１の助けを借りて、コンピュータシステム７０１に結合された装置がクライアントまたはサーバとして動作することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実装することができる。
【0084】
ＣＰＵ ７０５は、プログラムまたはソフトウェアで具体化することができる一連の機械読み取り可能な命令を実行することができる。命令は、メモリ７１０などの記憶場所に記憶させ得る。命令は、ＣＰＵ ７０５に向けられることができ、その後、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ ７０５をプログラムまたはその他構成することができる。ＣＰＵ ７０５によって実行される動作の例は、フェッチ、デコード、実行およびライトバックを含むことができる。
【0085】
ＣＰＵ ７０５は、集積回路などの回路の一部とすることができる。システム７０１の１つまたは複数の他の構成要素を回路に含めることができる。いくつかの事例において、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【0086】
記憶装置７１５は、ドライバ、ライブラリおよび保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶装置７１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザ嗜好およびユーザプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム７０１は、いくつかの事例において、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム７０１と通信するリモートサーバ上に位置するなど、コンピュータシステム７０１の外部にある１つまたは複数の追加のデータ記憶装置を含むことができる。
【0087】
コンピュータシステム７０１は、ネットワーク７３０を介して１つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム７０１は、ユーザ（例えば、医療提供者または患者）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が含まれる。ユーザは、ネットワーク７３０を介してコンピュータシステム７０１にアクセスすることができる。
【0088】
本明細書に記載される方法は、例えばメモリ７１０または電子記憶装置７１５などのコンピュータシステム７０１の電子記憶場所に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）で実行可能なコードによって実施されることができる。機械で実行可能なまたは機械で読み取り可能なコードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ７０５によって実行することができる。いくつかの事例において、コードは、記憶装置７１５から読み出され、プロセッサ７０５による即時のアクセスのためにメモリ７１０に記憶され得る。いくつかの状況では、電子記憶装置７１５を除外することができ、機械で実行可能な命令がメモリ７１０に記憶される。
【0089】
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械とともに使用するために事前にコンパイルおよび構成することができるか、または実行時にコンパイルすることができる。コードは、コードが事前にコンパイルされたまたは同時にコンパイルされる様式で実行することを可能にするように選択することができるプログラミング言語で供給することができる。
【0090】
コンピュータシステム７０１など、本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。本技術の様々な態様は、典型的には機械（またはプロセッサ）で実行可能なコードおよび／またはある種類の機械可読媒体上に搭載されるかまたは機械可読媒体に具体化される関連データの形態の「製品」または「製造品」として考えることができる。機械で実行可能なコードは、メモリ（例えば、読み出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に記憶することができる。「記憶」タイプの媒体は、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的記憶を提供し得る、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリ、または様々な半導体メモリ、テープ装置、ディスクドライブなどの有形メモリの関連モジュールのいずれかまたはすべてを含むことができる。ソフトウェアの全部または一部は、時には、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して通信され得る。このような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたはプロセッサへの、例えば管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を運び得る別のタイプの媒体には、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを横切り、有線および光の地上通信線ネットワークを通って、様々なエアリンクを通じて使用されるような、光波、電波および電磁波が含まれる。有線または無線リンク、光リンクなど、このような波を搬送する物理的要素もまた、ソフトウェアを運ぶ媒体と考え得る。本明細書で使用される場合、非一時的な有形の「記憶」媒体に限定されていなければ、コンピュータまたは機械で「読み取り可能な媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を付与することに関与する任意の媒体を指す。
【0091】
したがって、コンピュータで実行可能なコードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体には、例えば、図面に示されているデータベースなどを実装するために使用され得るような、任意のコンピュータなどの中の任意の記憶装置などの光学または磁気ディスクが含まれる。揮発性記憶媒体には、このようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが含まれる。有形伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む、銅線および光ファイバが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるような音波もしくは光波の形態をとり得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を搬送する搬送波、このような搬送波を搬送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータをそこから読み取り得る任意の他の媒体が含まれる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のために１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスをプロセッサに伝えることに関与し得る。
【0092】
コンピュータシステム７０１は、例えば、本開示の方法の結果を提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）７４０を備える電子ディスプレイ７３５を含むことができ、またはこれと通信することができる。ＵＩの例には、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザインターフェースが含まれるが、これらに限定されない。
【0093】
本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実施することができる。アルゴリズムは、中央処理装置７０５による実行時にソフトウェアによって実施することができる。アルゴリズムは、例えば、サポートベクターマシンまたはニューラルネットワークなどの、例えば、訓練されたアルゴリズム（または訓練された機械学習アルゴリズム）であり得る。
【0094】
試料
本明細書に記載される様々な方法の実施形態において、試料は対象由来であり得る。対象は、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含むがこれらに限定されない任意の動物であり得、通常はヒトなどの哺乳動物である。試料ポリヌクレオチドは、例えば、生検、血液試料、または核酸を含有する流体試料（例えば、唾液）を含む組織試料、体液試料、または器官試料など、対象から単離され得る。いくつかの事例においては、試料は完全な状態の細胞を含まず、細胞を除去するために処理されるか、または（例えば、セルフリーＤＮＡなどのセルフリーポリヌクレオチドを単離するために）細胞抽出工程なしでポリヌクレオチドが単離される。試料源の他の例としては、血液、尿、糞便、鼻孔、肺、腸、他の体液または排泄物、これらに由来する物質、またはそれらの組み合わせに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、試料は、血液試料またはその一部（例えば、血漿または血清）である。血清および血漿は、このような組織での悪性細胞死のより高い割合に関連する腫瘍ＤＮＡが相対的に濃縮されているために、特に興味深いものであり得る。いくつかの実施形態において、単一の個体からの試料は、２つ組、３つ組、４つ組またはそれより多くの組での分析など、本開示の方法に独立して供される複数の別個の試料（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの別個の試料）に分割される。試料がある対象からのものである場合には、分析されている試料からのコンセンサス配列または同じ対象の別の試料もしくは組織からのポリヌクレオチドの配列など、参照配列もその対象に由来し得る。例えば、血液試料はｃｔＤＮＡ変異について分析され得る一方、別の試料（例えば、頬側試料または皮膚試料）からの細胞ＤＮＡは参照配列を決定するために分析される。
本明細書に記載される様々な方法の実施形態において、試料は対象由来であり得る。対象は、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含むがこれらに限定されない任意の動物であり得、通常はヒトなどの哺乳動物である。試料ポリヌクレオチドは、例えば、生検、血液試料、または核酸を含有する流体試料（例えば、唾液）を含む組織試料、体液試料、または器官試料など、対象から単離され得る。いくつかの事例においては、試料は完全な状態の細胞を含まず、細胞を除去するために処理されるか、または（例えば、セルフリーＤＮＡなどのセルフリーポリヌクレオチドを単離するために）細胞抽出工程なしでポリヌクレオチドが単離される。試料源の他の例としては、血液、尿、糞便、鼻孔、肺、腸、他の体液または排泄物、これらに由来する物質、またはそれらの組み合わせに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、試料は、血液試料またはその一部（例えば、血漿または血清）である。血清および血漿は、このような組織での悪性細胞死のより高い割合に関連する腫瘍ＤＮＡが相対的に濃縮されているために、特に興味深いものであり得る。いくつかの実施形態において、単一の個体からの試料は、２つ組、３つ組、４つ組またはそれより多くの組での分析など、本開示の方法に独立して供される複数の別個の試料（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの別個の試料）に分割される。試料がある対象からのものである場合には、分析されている試料からのコンセンサス配列または同じ対象の別の試料もしくは組織からのポリヌクレオチドの配列など、参照配列もその対象に由来し得る。例えば、血液試料はｃｔＤＮＡ変異について分析され得る一方、別の試料（例えば、頬側試料または皮膚試料）からの細胞ＤＮＡは参照配列を決定するために分析される。
【0095】
ポリヌクレオチドは、任意の適切な方法に従って試料から抽出され得る。ポリヌクレオチドの抽出のために様々なキットが利用可能であり、キットの選択は試料の種類または単離すべき核酸の種類に依存し得る。本明細書に開示される様々な態様のいずれかに関して記載されるものなど、抽出方法の例が本明細書に提供されている。一例では、試料は、ＥＤＴＡチューブ（例えば、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）中に採取された試料などの血液試料であり得る。血漿は、遠心分離（例えば、４℃で、１９００×ｇで１０分間）によって末梢血細胞から分離することができる。６ｍＬの血液試料に対してこのようにして実施された血漿分離は、２．５～３ｍＬの血漿を与え得る。循環セルフリーＤＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、ＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）を使用することなどによって、血漿試料から抽出することができる。次いで、（例えば、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡキットとＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で）ＤＮＡを定量し得る。一例として、健常者からのこのような血漿試料からの循環ＤＮＡの収量は、血漿１ｍＬ当たり１ｎｇ～１０ｎｇの範囲であり得、癌患者試料では著しくより多い。
【0096】
いくつかの実施形態において、複数のポリヌクレオチドは、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、セルフリーＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）または循環腫瘍ＲＮＡ（ｃｔＲＮＡ）などのセルフリーポリヌクレオチドを含む。セルフリーＤＮＡは、健康な個体と病気の個体の両方において循環する。セルフリーＲＮＡは、健康な個体と病気の個体の両方において循環する。腫瘍からのｃｆＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、いずれかの特定の癌型に限定されず、異なる悪性腫瘍にわたって共通の所見であるようである。いくつかの測定によれば、血漿中の遊離の循環ＤＮＡ濃度は、対照対象では約１４～１８ｎｇ／ｍｌであり、新生物を有する患者では約１８０～３１８ｎｇ／ｍｌである。アポトーシス細胞死および壊死性細胞死は、体液中のセルフリー循環ＤＮＡに寄与する。例えば、前立腺癌患者ならびに良性前立腺肥大症および前立腺症などの他の前立腺疾患の血漿中に、著しく増加した循環ＤＮＡレベルが観察されている。さらに、循環腫瘍ＤＮＡは、原発腫瘍が発生する器官に由来する流体中に存在する。したがって、乳管洗浄液中に乳癌検出、便中に結腸直腸癌検出；痰中に肺癌検出、および尿または精液中に前立腺癌の検出を達成することができる。セルフリーＤＮＡは、様々な供給源から取得され得る。１つの一般的な供給源は、対象の血液試料である。しかしながら、ｃｆＤＮＡまたは他の断片化されたＤＮＡは、様々な他の供給源に由来し得る。例えば、尿および便試料は、ｃｔＤＮＡを含むｃｆＤＮＡの供給源であり得る。セルフリーＲＮＡは、様々な供給源から取得され得る。
【0097】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、抽出工程なしに、および／または精製工程なしに、その後の工程（例えば、環状化および増幅）に供される。例えば、流体試料は、抽出工程なしに細胞を除去して精製された液体試料および細胞試料を生成するために処理され得、精製された流体試料からのＤＮＡの単離が後続し得る。沈殿または基材への非特異的結合後に結合したポリヌクレオチドを放出させるために基材を洗浄することによるなど、ポリヌクレオチドの単離のための様々な手順が利用可能である。ポリヌクレオチドが細胞抽出工程なしに試料から単離される場合には、ポリヌクレオチドは、大部分が、細胞外または「セルフリー」ポリヌクレオチドである。例えば、セルフリーポリヌクレオチドは、セルフリーＤＮＡ（「循環」ＤＮＡとも呼ばれる）を含み得る。いくつかの実施形態において、循環ＤＮＡは、体液または排泄物（例えば血液試料）からなどの、腫瘍細胞からの循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。セルフリーポリヌクレオチドは、セルフリーＲＮＡ（「循環」ＲＮＡとも呼ばれる）を含み得る。いくつかの実施形態において、循環ＲＮＡは腫瘍細胞からの循環腫瘍ＲＮＡ（ｃｔＲＮＡ）である。腫瘍は、しばしばアポトーシスまたは壊死を示し、その結果、腫瘍核酸が、様々な機構を介して、異なる形態および異なるレベルで、対象の血流を含む体内に放出される。いくつかの事例において、ｃｔＤＮＡのサイズは、より高濃度のより小さな断片、一般に７０～２００ヌクレオチド長から、より低濃度の最大数千キロベースの大きな断片の範囲であり得る。
【0098】
癌
本明細書の方法は、癌の検出を提供することができ、例えば、いくつかの事例において、早期癌を検出することができる。癌の病期分類は、癌の種類に依存し得、それぞれの癌の種類はその独自の分類システムを有する。癌病期分類または分類システムの例を以下により詳細に記載する。
本明細書の方法は、癌の検出を提供することができ、例えば、いくつかの事例において、早期癌を検出することができる。癌の病期分類は、癌の種類に依存し得、それぞれの癌の種類はその独自の分類システムを有する。癌病期分類または分類システムの例を以下により詳細に記載する。
【0099】
【表1】
【0100】
【表2】
【0101】
【表3】
【0102】
【表4】
【0103】
【表5】
【0104】
【表6】
【0105】
【表7】
【0106】
【表8】
【0107】
【表9】
【0108】
【表10】
【0109】
【表11】
【0110】
【表12】
【0111】
【表13】
【0112】
【表14】
【0113】
【表15】
【0114】
【表16】
【0115】
【表17】
【0116】
【表18】
【0117】
【表19】
【0118】
【表20】
【0119】
【表21】
【0120】
【表22】
【0121】
【表23】
【0122】
【表24】
【0123】
【表25-1】
【0124】
【表25-2】
【0125】
【表26】
【0126】
【表27】
【0127】
本明細書で提供される方法は、癌の早期検出または非転移性癌の検出を可能にし得る。本明細書中に開示される方法に従って検出され得る癌の例としては、限定されないが、棘細胞腫、腺房細胞癌腫、視神経腫瘍、末端黒子型黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、エナメル上皮腫、腺癌、腺様嚢胞癌腫、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質癌腫、成人Ｔ細胞白血病、侵襲性ＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞状軟部肉腫、エナメル芽細胞線維腫、肛門癌、未分化大細胞型リンパ腫、未分化甲状腺癌、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管筋細胞腫、血管肉腫、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、基底様癌腫、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリーニ管癌腫、胆道癌、膀胱癌、芽細胞腫、骨癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞癌腫、ブラウン腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明の癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、上皮内癌、陰茎の癌腫、原発部位不明の癌腫、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、胆管細胞癌腫、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌腫、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、明細胞腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、類皮嚢胞、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胚性癌腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜子宮癌、子宮内膜腫瘍、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣芽腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイングファミリーの腫瘍、ユーイングファミリー肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、乳房外パジェット病、卵管癌、胎児封入奇形、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、胆嚢癌、胆嚢癌、神経節膠腫、神経節神経腫、胃癌、胃リンパ腫、胃腸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質性腫瘍、胃腸間質性腫瘍、胚細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛性腫瘍、骨巨細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫、有毛細胞白血病、有毛細胞白血病、毛状細胞白血病、頭頸部癌、頭頸部癌、心臓癌、血管芽腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部神経膠腫、炎症性乳癌、眼球内黒色腫、膵島細胞癌腫、膵島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎癌、クラッツキン腫瘍、クルケンベルク腫瘍、喉頭癌、喉頭癌、悪性黒子由来黒色腫、白血病、白血病、口唇および口腔癌、脂肪肉腫、肺癌、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、骨の悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肥満細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様癌、髄芽腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌腫、中皮腫、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頸部癌、転移性尿路上皮癌腫、混合ミュラー管腫瘍、単球性白血病、口癌、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉症、菌状息肉症、骨髄異形成障害、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔癌、鼻咽頭癌、鼻咽頭癌腫、新生物、神経鞘腫、神経芽腫、神経芽腫、神経線維腫、神経腫、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、眼腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、膨大細胞腫、視神経鞘髄膜腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、乳房のパジェット病、パンコースト腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭癌、褐色細胞腫、中分化の松果体実質腫瘍、松果体芽腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、多胎芽腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、原発性肝細胞癌、原発性肝臓癌、原発性腹膜癌、原始神経外胚葉性腫瘍、前立腺癌、腹膜偽粘液腫、直腸癌、腎細胞癌腫、１５番染色体上のＮＵＴ遺伝子が関与する気道癌腫、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター形質転換、仙尾部奇形腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫症、脂腺癌腫、続発性新生物、精上皮腫、漿液性腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、性索間質性腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌腫、皮膚癌、小青色円形細胞腫瘍、小細胞癌腫、小細胞肺癌、小細胞リンパ腫、小腸癌、軟部組織肉腫、ソマトスタチノーマ、煤イボ、脊髄腫瘍、脊椎腫瘍、脾臓周辺帯リンパ腫、扁平上皮癌腫、胃癌、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、表面上皮間質腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、終末リンパ腺癌、精巣癌、莢膜細胞腫、咽喉癌、胸腺癌腫、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、移行上皮癌腫、尿膜管癌、尿道癌、泌尿生殖器新生物、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣癌、ヴェルナー・モリソン症候群、いぼ状癌腫、視覚路神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【実施例】
【0128】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられており、決して本発明を限定することを意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載される方法とともに、現在好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであって、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神の範囲内に包含されるその中での変更およびその他の使用が、当業者には想起されるであろう。
【0129】
実施例１：超小型断片からのエピジェネティックシグナルを含むマルチオミクスアプローチを使用した早期癌検出
背景
血漿セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）およびタンパク質からの遺伝的シグナルおよびエピジェネティックシグナルは、癌を早期に検出することが示されている。環状連結および増幅（ＣＬＡｍｐ－ｓｅｑ）は、変異を非常に感度よく検出することが示されており、分子バーコードに基づく方法よりも高い性能を実証した。同じ一本鎖をベースとする技術は、典型的には二本鎖連結に依存する従来の方法よりもはるかに大きな割合の小さな断片（＜１００ｂｐ）をもたらし、本発明者らが超短断片における癌のエピジェネティックシグネチャを調べることを可能にした。以下のデータは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、卵巣癌（ＯＣ）および肝細胞癌腫（ＨＣＣ）を検出する上でこれらの遺伝的変化およびエピジェネティック変化ならびにタンパク質のマルチオミクスアプローチを使用して性能を測定する。
背景
血漿セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）およびタンパク質からの遺伝的シグナルおよびエピジェネティックシグナルは、癌を早期に検出することが示されている。環状連結および増幅（ＣＬＡｍｐ－ｓｅｑ）は、変異を非常に感度よく検出することが示されており、分子バーコードに基づく方法よりも高い性能を実証した。同じ一本鎖をベースとする技術は、典型的には二本鎖連結に依存する従来の方法よりもはるかに大きな割合の小さな断片（＜１００ｂｐ）をもたらし、本発明者らが超短断片における癌のエピジェネティックシグネチャを調べることを可能にした。以下のデータは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、卵巣癌（ＯＣ）および肝細胞癌腫（ＨＣＣ）を検出する上でこれらの遺伝的変化およびエピジェネティック変化ならびにタンパク質のマルチオミクスアプローチを使用して性能を測定する。
【0130】
方法
ＣＬＡｍｐ－ｓｅｑおよび伝統的な二本鎖ライブラリ調製を使用した全ゲノム配列解析（ＷＧＳ）によって、健康な試料および後期癌試料を評価した。次いで、６９人のＣＲＣ、５７人のＨＣＣ、４９人のＯＣ患者および５５６人の年齢を一致させた健康な個体を含む７３１人の患者の血漿試料からｃｆＤＮＡを分析した。疾患試料のうち、病期Ｉ～ＩＶの数は、それぞれ４９、３９、７１、および１６である。癌エピジェネティックシグネチャを発見するために、ＣＬＡｍｐ－ｓｅｑ ＷＧＳを５８の健康な試料および６６の癌試料に対して実施した。さらに、タンパク質のパネルおよび既知の変異部位を含むＣＬＡｍｐ－ｓｅｑの標的とされるパネルについて、すべての試料を分析した。
ＣＬＡｍｐ－ｓｅｑおよび伝統的な二本鎖ライブラリ調製を使用した全ゲノム配列解析（ＷＧＳ）によって、健康な試料および後期癌試料を評価した。次いで、６９人のＣＲＣ、５７人のＨＣＣ、４９人のＯＣ患者および５５６人の年齢を一致させた健康な個体を含む７３１人の患者の血漿試料からｃｆＤＮＡを分析した。疾患試料のうち、病期Ｉ～ＩＶの数は、それぞれ４９、３９、７１、および１６である。癌エピジェネティックシグネチャを発見するために、ＣＬＡｍｐ－ｓｅｑ ＷＧＳを５８の健康な試料および６６の癌試料に対して実施した。さらに、タンパク質のパネルおよび既知の変異部位を含むＣＬＡｍｐ－ｓｅｑの標的とされるパネルについて、すべての試料を分析した。
【0131】
結果
二本鎖ライブラリプレップによる健康者での１５％および後期での＜１％と比較して、後期癌でＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑを使用することは、その断片の３３％を１００ｂｐよりも小さいとして示した。さらに、後期癌と健康の間での断片サイズの差は、ＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑを使用すると２９ｂｐ、伝統的な二本鎖プレップを使用すると１２ｂｐであった（図１、図２）。次に、ＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑを用いて、小断片上に癌に特異的なエピジェネティックシグネチャが検出された。全ゲノム解析からのデータを使用すると、エピジェネティックシグネチャのみを使用した、９７％の特異性で５０％の感度の成績が実証された（図４）。変異およびタンパク質と組み合わせると、本発明者らは、病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶでそれぞれ５０％、８８％、８８％および１００％の感度９７％の特異性で得た。同じ９７％の特異性で、本発明者らは、ＣＲＣ、ＯＣおよびＨＣＣにおいてそれぞれ７３％、１００％および８５％の感度を得た。
二本鎖ライブラリプレップによる健康者での１５％および後期での＜１％と比較して、後期癌でＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑを使用することは、その断片の３３％を１００ｂｐよりも小さいとして示した。さらに、後期癌と健康の間での断片サイズの差は、ＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑを使用すると２９ｂｐ、伝統的な二本鎖プレップを使用すると１２ｂｐであった（図１、図２）。次に、ＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑを用いて、小断片上に癌に特異的なエピジェネティックシグネチャが検出された。全ゲノム解析からのデータを使用すると、エピジェネティックシグネチャのみを使用した、９７％の特異性で５０％の感度の成績が実証された（図４）。変異およびタンパク質と組み合わせると、本発明者らは、病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶでそれぞれ５０％、８８％、８８％および１００％の感度９７％の特異性で得た。同じ９７％の特異性で、本発明者らは、ＣＲＣ、ＯＣおよびＨＣＣにおいてそれぞれ７３％、１００％および８５％の感度を得た。
【0132】
結論
本明細書では、ＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑが癌において濃縮されている小断片を検出することが実証された。予測的エピジェネティックシグネチャは、これらの小断片中に見出された。変異およびタンパク質と組み合わせると、９７％の特異性で８０％の感度の性能が得られた。
本明細書では、ＣＬＡｍｐ－Ｓｅｑが癌において濃縮されている小断片を検出することが実証された。予測的エピジェネティックシグネチャは、これらの小断片中に見出された。変異およびタンパク質と組み合わせると、９７％の特異性で８０％の感度の性能が得られた。
【0133】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態は例として提供されているに過ぎないことは当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることを意図しない。前述の明細書を参照して本発明を説明してきたが、本明細書の実施形態の説明および例示が限定的な意味で解釈されるべきことは意図されない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更および置換に想到するであろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載される特定の描写、構成または相対的な割合に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明を実施する上で使用され得ることを理解されたい。したがって、本発明は、任意のそのような代替形態、修正、変形または均等物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が本発明の範囲よって包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】