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特表2023-526045可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドを含むＣ型肝炎核酸ワクチン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-20
(54)【発明の名称】可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドを含むＣ型肝炎核酸ワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/29 20060101AFI20230613BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230613BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230613BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230613BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230613BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230613BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230613BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/40 20060101ALN20230613BHJP
C12N 15/86 20060101ALN20230613BHJP
C12N 15/863 20060101ALN20230613BHJP
【ＦＩ】
A61K39/29
C12N15/861 Z
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/761
A61P1/16
A61P31/14
A61P37/04
C12N15/40 ZNA
C12N15/86 Z
C12N15/863 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568765
(86)(22)【出願日】2021-05-11
(85)【翻訳文提出日】2022-12-27
(86)【国際出願番号】 AU2021050437
(87)【国際公開番号】W WO2021226664
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】2020901506
(32)【優先日】2020-05-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510332958
【氏名又は名称】マクファーレン バーネット インスティテュート フォー メディカル リサーチ アンド パブリック ヘルス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＣＦＡＲＬＡＮＥ ＢＵＲＮＥＴ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＰＵＢＬＩＣ ＨＥＡＬＴＨ ＬＴＤ
(71)【出願人】
【識別番号】511301083
【氏名又は名称】ザ チャンセラー，マスターズ アンド スカラーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ オックスフォード
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】ドラマー，ヘイディー
(72)【発明者】
【氏名】バーネス，エラナー ジェーン
(72)【発明者】
【氏名】チンナカナン，センティル クマール
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA75
4C084ZB09
4C084ZB33
4C085AA03
4C085BA92
4C085BB23
4C085CC33
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA75
4C087ZB09
4C087ZB33
(57)【要約】
ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（例えば、Ｅ２Ｄｅｌｔａ１２３）をコードする核酸分子を含む、医薬組成物。組成物は、ＨＣＶ感染症の治療又は予防における使用に、使用に、又はそれにおいて使用される場合に好適である。核酸分子は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は修飾若しくは合成形態であり得るか、あるいはプラスミド、ワクチン接種のためのウイルスベクター若しくは非ウイルスベクター、ポリヌクレオチド発現カセット、又はベクター増殖のための細胞内に含まれ得る。プライム及びブーストワクチンとしての投与の方法も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＣＶ感染症の治療又は予防に使用するための、又はそれにおいて使用される場合の、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物であって、前記使用が、前記核酸を対象に投与することを含み、可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質が、前記対象において産生され、前記対象におけるＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を含む免疫応答を生成する、組成物。
【請求項2】
ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２をコードする前記核酸分子が、ワクチン接種のためのウイルスベクター又は非ウイルスベクター内に含まれる、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項3】
ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２をコードする核酸分子が、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらの修飾若しくは合成形態である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項4】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、又はポックスウイルスベクターである、請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項5】
前記核酸分子が、２つ又は３つ全ての表面に露出された可変ドメインを欠失したＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２（Ｄｅｌｔａ２３Ｅ２、Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２）をコードする、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項6】
前記核酸分子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドをコードする、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項7】
前記核酸分子が、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項8】
前記機能的Ｂ細胞応答が、高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（例えば、ＨＭＷＤｅｌｔａ１２３）の対応する投与後に生成された総抗体力価よりも低い前記総抗体力価を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項9】
前記機能的Ｂ細胞応答が、高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（例えば、ＨＭＷＤｅｌｔａ１２３）の対応する投与後に生成された前記機能的Ｂ細胞応答に相当する、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項10】
前記機能的免疫応答が、高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（ＨＭＷＤｅｌｔａ１２３）の対応する投与後に生成されたＣＤ８１阻害力価に相当するか、又はそれより高い、前記ＣＤ８１阻害力価を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項11】
別の治療的又は予防的活性成分を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項12】
ＨＣＶ感染症の治療又は予防のための核酸又は核酸ベクター医薬品における、又はその製造における、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子の、使用。
【請求項13】
ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする前記核酸分子が、ワクチン接種のためのウイルスベクター又は非ウイルスベクター内に含まれる、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２をコードする前記核酸分子が、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はそれらの修飾形態である、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項15】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター又はＭＶＡなどのポックスウイルスベクターである、請求項１３に記載の使用。
【請求項16】
前記核酸分子が、２つ又は３つ全ての表面に露出された可変ドメインを欠失したＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２（例えば、Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２）をコードする、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項17】
前記核酸分子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドをコードする、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項18】
前記核酸分子が、前記核酸分子が、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項19】
ＨＣＶ感染症の治療又は予防の方法であって、対象におけるＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を生成する期間及び条件下での前記対象への請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物の投与を含む、方法。
【請求項20】
前記組成物が、プライムワクチン接種として、又はプライム及びブーストワクチン接種として投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記組成物が、プライムワクチン接種、続く２回のブースターワクチン接種として投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記組成物が、プライムワクチン接種として投与され、ブースターワクチン接種が、ＨＣＶの高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドを含む、請求項１９に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、対象において発現され、ＨＣＶに対する機能的及び交差保護免疫応答を刺激する抗原をコードする核酸分子の形態の修飾されたＨＣＶ Ｅ２ワクチン抗原を使用する、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の治療又は予防に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃ型肝炎ウイルスは、フラビウイルス科内の固有のヘパシウイルス属に属する小型のエンベロープを有するプラスセンスＲＮＡウイルスである。ＨＣＶは７つの遺伝子型（ＧＴ１～７）に分類され、遺伝子型１～３が世界的に分布している。感染した個体は、準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）と称される密接に関連するウイルスの群を抱えている。この配列変動の程度は、ＨＩＶ及びインフルエンザについて観察されたものを超えており、ワクチン開発に大きな課題をもたらす。ＨＣＶは、シグナルペプチダーゼによってウイルスポリタンパク質から切断される２つの構造エンベロープ糖タンパク質、Ｅ１及びＥ２をコードする。Ｅ１Ｅ２は、ウイルスの侵入を媒介するヘテロ二量体として機能する。Ｅ２は、その受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介して、細胞受容体、ＣＤ８１及びスカベンジャー受容体クラスＢ型１への付着を媒介する。Ｅ１の機能、は現在不明である。
【0003】
ＨＣＶのゲノムは、３，０１０～３，０３３アミノ酸残基の単一のポリタンパク質をコードする１つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のみを有する、約９，６００ヌクレオチドの一本鎖プラスセンスＲＮＡである。ＨＣＶ ＯＲＦは、ウイルス複製に必要とされる高度に保存された５’及び３’非翻訳領域（５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ）に隣接している。５’－ＵＴＲは、広範な二次構造を形成し、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に依存する様式で翻訳開始を調節する。しかしながら、ピコルナウイルスとは対照的に、ＨＣＶ ＩＲＥＳは、任意の他の正規の翻訳開始因子の非存在下で４０Ｓリボソームサブユニットに直接結合することができ、それによって、ＯＲＦの真正な開始因子ＡＵＧコドンを正確にリボソームのＰ部位に位置付ける。３’－ＵＴＲは、ポリ（Ａ）尾部を欠き、ＲＮＡ複製に関与することになっている３つの配列要素、非保存可変領域（３０～５０ヌクレオチド）、ポリ（Ｕ・Ｃ）ストレッチ（２０～２００ヌクレオチド）、及び３つのステムループ（ＳＬ）構造を形成する３’Ｘ領域と称される保存された９８ヌクレオチド配列からなる。
【0004】
Ｃ型肝炎ウイルスは、７，０００万人超に影響を及ぼし、毎年７０万人超が死亡している。３５００万人が未診断の感染症を有していると推定されており、ウイルスの継続的な拡散の手段となっている。急性Ｃ型肝炎は、曝露の１～２週間以内での血清中のＨＣＶ ＲＮＡの出現、続く血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の上昇、次いで黄疸の症状によって特徴付けられる。ＨＣＶに対する抗体（抗ＨＣＶ）は、遅れて生じる傾向にある。急性肝炎の解消では、ＨＣＶ ＲＮＡが除去され、血清ＡＬＴレベルが正常に低下する。しかしながら、５５％～８５％の患者がウイルスを除去せず、慢性Ｃ型肝炎を発症する。慢性Ｃ型肝炎は多くの場合、無症候性であるが、通常、ＡＬＴレベルの持続的又は変動的な上昇と関連している。Ｃ型肝炎の慢性後遺症には、進行性肝線維症、肝硬変、及び肝細胞がん（腫）が含まれる。肝外症状には、自己免疫疾患、乾燥症候群、クリオグロブリン血症、糸球体腎炎、及び晩発性皮膚ポルフィリン症が含まれる。直接作用する抗ウイルス薬は、９０％超の症例においてＨＣＶ感染症を治癒することができるが、抗ウイルス剤だけでは、その高いコスト、再感染のリスク、及び感染しているほとんどの人々がＨＣＶと診断されていないという事実のため、ＨＣＶ排除を達成する可能性は低い。ＨＣＶ感染症の顕著な低減を達成するために、伝染を制限するワクチンが必要であると主張されている。
【0005】
ＨＣＶワクチンの潜在的な成功の中心は、７つの循環ＨＣＶ遺伝子型に対して広範で効果的な保護を付与する能力である。各遺伝子型は、タンパク質レベルで約３０％の変動を示し、それ自体がタンパク質レベルで約２０％の変動を示す６７を超える亜型を含む。最近の研究は、感染症を自発的に除去するヒトは、感染症の早期に広域中和抗体（ｂＮＡｂ）を生成し、ヒトｂＮＡｂでの動物の受動免疫化が、ＨＣＶチャレンジからそれらを保護することができることを示した。
【0006】
中和抗体応答は、主に、Ｅ２ウイルスエンベロープ糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対して指向されている（Ｄｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：３２９，２０１４）。しかしながら、ＨＣＶ Ｅ２は、ｂＮＡｂの生成を制限するための複数の免疫回避機序を示し、それは、例えば、グリカン遮蔽、ｂＮＡｂエピトープの提示をアロステリックに抑制する超可変領域（ＨＶＲ）における集中されたアミノ酸配列進化、及び免疫逃避及び非中和抗体を駆動する単離特異的ＮＡｂを優先的に生成するエピトープの免疫優位性を含む（Ｄｒｕｍｍｅｒら、上記）。
【0007】
発明者が以前に決定したように、天然のＨＣＶ Ｅ２形態では、超可変領域は、協調して作用して、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）を決定する保存されたエピトープを閉塞し、これにより、ｂＮＡｂの生成を防止する。代わりに、可変領域中の単離特異的エピトープ及び非中和エピトープが抗体応答を支配する。ＷＯ２００８／０２２４０１及びＷＯ２０１２／０１６８６３７に記載されているように、発明者は、ＨＣＶ Ｅ２の修飾形態、特に、３つの表面露出ＨＶＲがＲＢＤから欠失されている修飾形態（Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２６６１と称される）を開発している。このＨＶＲ枯渇形態のＥ２を野生型Ｅ２と比較し、単量体、二量体、三量体、及びより高次反復形態を含む分子の種々の提示と比較した。Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６５（４），２０１７で報告されているように、３つの超可変領域（Ｄ１２３ＨＭＷ）を欠くＥ２の高分子量ジスルフィド連結オリゴマーは、実験動物においてＨＣＶの７つの遺伝子型全てを中和することができる高力価ｂＮＡｂを誘発する。Ｅ２のＨＭＷオリゴマー形態は、ＨＶＲが枯渇した場合でさえ非中和抗体を刺激するＥ２の単量体又は二量体形態よりもはるかに効果的であった。この研究の前に、ＨＣＶ Ｅ２の単量体形態は、最適なワクチン構築物を提供すると仮定された。例えば、哺乳動物発現細胞培養において同定された高分子量種の性質は、十分に特徴付けられておらず、ワクチンに対するそれらの重要性は理解されなかった。
【0008】
しかしながら、Ｄ１２３ＨＭＷ Ｅ２（超可変領域ＨＶＲ１、ＨＶＲ２及びｉｇＶＲを欠くＥ２の高分子量オリゴマー形態）は、非常に低収率で哺乳動物細胞発現中に自発的に産生されるため、ワクチンとしての使用に好適な形態で産生することに問題がある。実際、発明者は、Ｅ２が、単量体、二量体、オリゴマー、及び他の立体配座を含む、複数の不均一な形態で哺乳動物細胞発現中に産生されることを決定した。したがって、Ｄ１２３ＨＭＷ Ｅ２を他の望ましくない形態のＥ２から分離するために、複雑な単離手順が必要であろう。別の選択肢は、ヒト試験のために均質なＨＭＷＤ１２３ＨＣＶ Ｅ２のインビトロタンパク質産生を単純化しようとすることであろう。発明者によって記載される１つの驚くべき効果的なアプローチ（国際公開第２０１８／０５８１７７号を参照されたく、かつ国際公開第２０１２／０１６２９０号に記載される発明に基づく）は、ＨＣＶ Ｅ２ Ｄ１２３ポリペプチドのシステイン修飾形態を生成することであり、これは、ほぼ完全に単量体Ｅ２ Ｄ１２３として発現され、次いで、インビトロで単量体ＨＣＶ Ｅ２を処理して、ワクチン接種研究に好適な均質ＨＭＷ Ｅ２ポリペプチドを形成する。
【0009】
複製欠損アデノウイルスベクターは、非構造的（ＮＳ）ＨＣＶタンパク質に対する持続的Ｔ細胞応答をプライムすることが以前に示されている。ヒトにおけるワクチン接種の場合、ワクチンの有効性を妨げる可能性のある前から存在する抗ベクター免疫応答を回避するために、まれな（低血清有病率）のデノウイルスベクター又はチンパンジーアデノウイルスベクターが用いられる。Ｔ細胞応答をブーストする必要がある場合、ブーストレジメンは、修飾されたポックスウイルスベクターなどの異なるベクターを含むことが提案される。
【0010】
特に発展途上国における流行性ＨＣＶ感染症の世界的な問題を考えると、有効なＨＣＶワクチン及び少なくとも高レベルの機能的中和抗体及び低レベルの非機能的抗体を誘発するワクチンに対する緊急の満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【0011】
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、記載された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。
【0012】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及は、単一の組成物、及び２つ以上の組成物を含み、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つの薬剤、及び２つ以上の薬剤を含み、「本開示（ｔｈｅ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）」への言及は、本開示の単一及び複数の態様などを含む。
【0013】
「及び／又は」という用語、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものと理解され、両方の意味又はいずれかの意味の明示的な支持を提供するものと理解される必要がある。
【0014】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、逆に述べられない限り、指定された値の＋／－１０％、又は＋／－５％を指す。
【0015】
「欠失した可変領域」という用語は、欠失又は置換されたＨＣＶ Ｅ２の可変領域のうちの１、２、又は３つを含む。可変ドメインを欠失させることによって例示されるが、当業者は、領域の置換又は変異が欠失と同じ結果を達成する可能性があることを理解するであろう。
【0016】
天然ＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドを修飾して、有効な機能的抗体及び低レベルの非機能的抗体を生じさせることができる均質なワクチン候補としての高分子量（ＨＭＷ又は＞３／４／５の高次）可変領域欠失（例えば、Ｄｅｌｔａ１２３）ＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドを産生するには、高レベルのヒト介入が必要であった。当該技術分野では、Ｄｅｌｔａ１２３ Ｅ２単量体をコードする核酸分子が、発現時に、ＨＭＷ Ｄｅｌｔａ１２３ Ｅ２と同様に振る舞い、哺乳動物宿主への投与時に非機能的抗体よりも優先的に機能的抗体を生じさせることは予想されなかったであろう。インビトロで真核細胞株によって発現された組換えＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質は、概して、単量体、二量体、三量体及び高次形態の混合物として存在することが知られている。抗原の単量体形態の存在は、機能的抗体産生を犠牲にして高レベルの非機能的抗体を誘発することが日常的に予想されていたであろう。本開示によれば、本発明者らは、Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２のコード核酸形態の投与後の中和力価が驚くほど高く、Ｄｅｌｔａ１２３ＨＭＷ Ｅ２ポリペプチドがタンパク質形態で単独で投与される場合よりも、中和抗体がより交差反応性であることを決定した。したがって、ＨＣＶ Ｅ２ワクチンを、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター中などの核酸形態で投与することが提案され、したがって、実行可能であり、低コストであるが、効果的な、タンパク質単独の投与に対する代替物を提供する。
【0017】
したがって、一態様では、本発明は、Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２などのＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、ウイルスベクターは、その合成バージョンを含むアデノウイルス発現ベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、その合成バージョン及び前駆体を含む、弱毒化ワクシニアゲノムベクターなどのポックスウイルス又はワクシニアベースの発現ベクターである。例示的な発現ベクター及び発現カセットは、図２０及び図２７～３５などの図に示されているが、多くのバージョン又は代替要素（シャトルプラスミド、リーダー配列、プロモーター、ポリアデニル化配列、薬物耐性オペレーター部位、ＢＡＣゲノム、及び制限部位）が、当該技術分野で既知である。好適な細胞株におけるウイルス救出及び増殖も当該技術分野で既知である。
【0018】
一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムベースのウイルスベクターである。
【0019】
一実施形態では、ウイルスベクターは、ポックスウイルス又はワクシニアゲノムベースのウイルスベクターである。
【0020】
実施形態では、本発明は、本明細書に記載の可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードするウイルスベクターを発現する細胞株の細胞を提供する。したがって、一実施形態では、ウイルスベクターは、弱毒化アデノウイルスベクター又は弱毒化ワクシニアベクターであり得る。
【0021】
一実施形態では、本発明は、核酸／ウイルスベクターベースのワクチン若しくは免疫原性組成物、又はそれらを含む医薬組成物若しくは生理学的組成物の製造における本明細書に記載のベクター、又は本明細書に記載の可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードするウイルスベクターを発現する細胞の使用を提供する。
【0022】
一態様では、本開示は、対象におけるＨＣＶ感染症の治療又は予防の方法であって、Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２又はそのバリアントなどの可変ドメイン欠失ＨＣＶ Ｅ２タンパク質性分子をコードする核酸分子を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0023】
したがって、一態様では、本開示は、既知の薬学的製造技法に従って好都合に調製される生理学的組成物又は医薬組成物を提供する。これらの組成物は、活性物質のうちの１つに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当該技術分野において周知の他の物質を含み得る。かかる材料は無毒である必要があり、有効成分の有効性を妨げてはならない。担体は、例えば、これらに限定されないが、療法で使用するため、又はＨＣＶ感染症の治療若しくは予防のための静脈内、鼻腔内、皮内、経口又は非経口の投与のために所望の製剤の形態に応じて多種多様な形態をとることができ、核酸は、対象に投与され、可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質が産生され、対象におけるＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を含む免疫応答を生成する。組成物は、生物学的又は他の点で望ましくないものではない、生理学的又は薬理学的又は薬学的に許容されるビヒクルを含む。本明細書に記載の化合物の薬理学的に許容される塩、エステル、プロドラッグ、又は誘導体は、生物学的に又はその他の点で望ましくないものではない塩、エステル、プロドラッグ、又は誘導体である。
【0024】
ベクター及び発現カセットは、内因性ヒト細胞、すなわち、ヒト治療又はワクチンレシピエントにおける可変ドメイン欠失Ｅ２の発現に好適であるか、又は適応している。
【0025】
一実施形態では、組成物は、ワクチンとして療法で使用するためのものである。
【0026】
一実施形態では、本発明は、ＨＣＶ感染症の治療又は予防に使用するための、又はそれにおいて使用される場合の、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む医薬組成物を含む組成物を可能にし、使用は、核酸を対象に投与することを含み、可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質が、対象において産生され、対象におけるＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を含む免疫応答を生成する。
【0027】
この態様では、使用は、中和Ｂ細胞応答を増強するのに使用するためであってもよく、核酸分子は、発現された場合、対象において、ＨＭＷ Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２を使用して生成されたものと比較して増強されたＢ細胞応答を生成する。
【0028】
Ｄｅｌｔａ１２３で例示されるが、Ｄｅｌｔａ２３もまた、野生型Ｅ２よりも中和差反応性Ｂ細胞応答に影響を与えることが想定される。
【0029】
一実施形態では、核酸投与は、可変ドメイン欠失Ｅ２をコードするウイルスベクターでプライムすること、及び可変ドメイン欠失Ｅ２、又は高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（例えば、ＨＭＷＤｅｌｔａ１２３）をコードする同じ又は異種のベクター又は核酸でブーストすることを含む。
【0030】
【0031】
一実施形態では、核酸分子は、コードされた糖タンパク質に対するＴ細胞応答を更に生じさせる。
【0032】
本明細書で使用される、ＨＣＶに対する「機能的」Ｂ細胞応答とは、ＨＣＶウイルスによる宿主細胞侵入を低減することができる交差反応性中和抗体の産生、及び非中和抗体の産生が低い又は産生がないことを意味する。主に非機能的Ｂ細胞応答は、ＨＣＶのＲＢＤを認識しないか、又は交差中和可能性を有しない抗体の産生を意味する。例えば、単量体野生型Ｅ２ポリペプチドが投与された場合、交差中和可能性を有するコアドメインを認識する低レベルの抗体、非中和であり、他のバリアントとの交差反応性が乏しい高レベルの抗体を誘発する。
【0033】
「コードする」及び「発現することができる」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0034】
一実施形態では、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２をコードする核酸分子は、投与及び／又は細胞内送達のためのウイルスベクター又は非ウイルスベクター内に含まれるか、又はそれに付着している。
【0035】
一実施形態では、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２をコードする核酸分子は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド又はそれらの修飾若しくは合成形態である。
【0036】
一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである。ベクターとして有用であるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルス、並びにそれらの弱毒化形態が含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、当該技術分野で既知の独自の利点及び欠点を有する。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター及びポックスウイルスベクターが特に挙げられるが、これらに限定されない。
【0037】
非ウイルスベクター又は付着／コンジュゲートには、脂質、炭水化物、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、リポソーム、ウイルス様粒子、ビロソーム、エマルジョンが含まれる。脂質などの両親媒性薬剤は、水溶液中のミセル、不溶性単層、液晶又はラメラ層として凝集体で存在し得る。
【0038】
一実施形態では、核酸分子は、３つ全ての表面に露出された可変ドメインを欠失したＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２（例えば、Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２）をコードする。他のバリアントには、欠失された１つ又は２つの可変ドメインが含まれ得る。一実施形態では、ＨＶＲ１（３９４～４０８）は欠失されない。一実施形態では、ＨＶＲ２（４６０～４９５）及びｉｇＶＲ（５７０～５８０）領域は、実質的に又は完全に欠失される。
【0039】
一実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、可変ドメイン欠失を有しないＨＣＶゲノム又は完全長Ｅ２ポリペプチドをコードしない。
【0040】
一非限定的な実施形態では、核酸分子は、実施例で用いられるＤｅｌｔａ１２３ Ｅ２のタンパク質配列である、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドをコードする。
【0041】
別の実施形態では、発明者によってＷＯ２０１２／０１６２９０に記載された受容体結合ドメインのシステイン修飾バージョンが可能である。したがって、配列番号１又は２のバージョンは、Ｃ５８１～Ｃ６２０から選択される少なくとも４つの変異又は破壊されたシステインがコードされ、コードされたポリペプチドはＣＤ８１結合を保持することが企図される。ＷＯ２０１２／０１６２９０に記載のＥ２のシステイン修飾バージョンは、単量体として組換えられて発現され、高分子量形態に再び折り畳まれ得る。
【0042】
一実施形態では、核酸分子は、ヒト発現に最適化されたＤｅｌｔａ１２３Ｅ２コドンのヌクレオチド配列である、配列番号２に記載のＨＣＶベースの配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、任意の他のエンベロープタンパク質をコードしない。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２に記載の配列、又はＧ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、若しくはＧ７などのＨＣＶの任意の遺伝子型由来の対応する配列を含む。８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列番号２のバリアントが企図される。
【0043】
バリアントへの言及には、部分、誘導体、及び化学類似体が含まれる。企図される化学類似体には、側鎖の修飾、合成中の非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の組み込み、並びにリンカー若しくは架橋剤の使用、又はとりわけ立体構造的制約を課すための他の方法が含まれる。
【0044】
より高い又はより低いレベルへの言及は、適切な対照と比較して、顕著に高い又はより低いレベル、例えば、少なくとも５０％、７５％、１００％、３倍、４倍、５倍以上又はそれ以下の抗体又はアイソタイプを意味する。総抗体力価、アイソタイプ、及び中和抗体力価は、実施例に記載のものなどの技術分野で認識される技法によって測定される。
【0045】
一実施形態では、機能的Ｂ細胞応答は、高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（例えば、ＨＭＷＤｅｌｔａ１２３）の対応する投与後に生成された総抗体力価よりも低い総抗体力価を含む。
【0046】
一実施形態では、機能的Ｂ細胞応答は、高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（ＨＭＷＤｅｌｔａ１２３）の対応する投与後に生成された機能的Ｂ細胞応答に相当する。
【0047】
いくつかの実施形態では、機能的免疫応答は、高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチド（ＨＭＷＤｅｌｔａ１２３）の対応する投与後に生成されたＣＤ８１阻害力価に相当するか、又はそれより高い、ＣＤ８１阻害力価を含む。
【0048】
一実施形態では、組成物は、別の生理学的、治療的又は予防的活性成分を含む。
【0049】
したがって、本開示は、対象におけるＨＣＶ感染症の治療又は予防のための、ＮＡ又はＮＡベクター医薬品における、又はその製造における、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子の使用を可能にする。
【0050】
一実施形態では、可変ドメインデルタＥ２を発現するウイルスベクターによってプライムされたＢ細胞応答は、ＨＣＶに対する免疫応答を増強する。
【0051】
一実施形態では、Ｅ２を投与された核酸は、ＨＭＷ Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２によって提供される免疫応答を上回ってＨＣＶに対する免疫応答を増強する。
【0052】
本明細書で使用される場合、本記載で企図される「対象」は、実験室動物又は技術分野で許容される試験動物又はビヒクル動物を含むヒト又は動物である。一実施形態では、対象は、哺乳動物である。好ましくは、対象は、ヒトであるが、本記載は、霊長類及び実験室試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）を含む他の哺乳動物患者の治療及び／又は予防に及ぶ。
【0053】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子は、ワクチン接種のためのウイルスベクター又は非ウイルスベクター内に含まれる。
【0054】
一実施形態では、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２をコードする核酸分子は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はそれらの修飾形態である。
【0055】
一実施形態では、核酸配列は、ヒト細胞における発現のために最適化されたコドンである。
【0056】
一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＭＶＡなどのポックスウイルスベクターである。
【0057】
一実施形態では、核酸分子は、３つ全ての表面に露出された可変ドメインを欠失したＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２（Ｄｅｌｔａ１２３Ｅ２）をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又はＨＣＶ遺伝子型２～７の株由来の対応する配列を有するＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドをコードする。例示的な実施形態では、核酸分子は、配列番号２に記載の配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【0058】
本開示はまた、対象におけるＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を生成する期間及び条件下での対象へのＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物の投与を含む、ＨＣＶ感染症の治療又は予防の方法を可能にする。
【0059】
本開示はまた、対象におけるＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を生成する期間及び条件下での対象へのＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物の投与を含む、対象におけるＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を誘導する方法を可能にする。
【0060】
一実施形態では、アデノウイルスゲノムベースのウイルスベクターは、図２７に記載のＣｈＡｄＯｘ１のポリヌクレオチド配列、図２７に記載のＣｈＡｄＯｘ１－ＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３のポリヌクレオチド配列、図２８に配置されるベクター、図２９に記載のポリヌクレオチド配列、図３０の免疫原カセットのレイアウト、図３１に記載の免疫原カセット配列のうちの１つ又は２つ以上、図３２のポリヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む。
【0061】
一実施形態では、ワクシニアゲノムベースのウイルスベクターは、図３３に記載のＭＶＡのポリヌクレオチド配列、図３３に記載のＭＶＡ－ＴＰＡ－Ｅ２Ｄｅｌｔａ１２３のポリヌクレオチド配列、図３４のベクターのレイアウト、又は図３５に記載の配列による要素のうちの１つ又は２つ以上のうちの１つ以上を含む。
【0062】
一実施形態では、Ｅ２ Ｄ１２３配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターは、０日目（ｄ０）に投与され、任意選択で、続いて、後続の１～６ヶ月にわたって同じものの１回以上のブーストが実施される。
【0063】
一実施形態では、遺伝子型１ａ Ｅ２ Ｄ１２３配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターは、０日目（ｄ０）に投与され、任意選択で、続いて、後続の１～６ヶ月にわたって同じものの１回以上のブーストが実施される。
【0064】
一実施形態では、Ｅ２ Ｄ１２３配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターは、０日目（ｄ０）に投与され、任意選択で、続いて、後続の１～６ヶ月にわたって１回以上のブーストが実施される。
【0065】
一実施形態では、遺伝子型１ａ Ｅ２ Ｄ１２３配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターは、０日目（ｄ０）に投与され、任意選択で、続いて、後続の１～６ヶ月にわたって１回以上のブーストが実施される。
【0066】
一実施形態では、ブースト投与は、可溶性の精製された高分子量Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質を含む組成物のものであり得る。
【0067】
一実施形態では、ブースト投与は、Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質をコードする異種（非アデノウイルス）ウイルスベクターを含む組成物のものであり得る。
【0068】
一実施形態では、異種ウイルスベクターは、ワクシニアゲノムベースのウイルスベクターなどの脊索動物ゲノムベースのウイルスベクターである。
【0069】
一実施形態では、ブーストは、可溶性の精製された高分子量Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質を用いてである。
【0070】
本方法の一実施形態では、ＨＣＶ Ｅ２ Ｄｅｌｔａ１２３をコードする核酸を含む組成物は、プライムワクチン接種として、又はプライム及びブーストワクチン接種として投与される。
【0071】
一実施形態では、組成物は、プライムワクチン接種、続く２回のブースターワクチン接種として投与される。
【0072】
一実施形態では、プライムワクチン接種は、ＭＶＡを用いてであり、ブースターワクチン接種は、同じものを用いて、又は可溶性高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質を含む組成物を用いてである。
【0073】
一実施形態では、プライムワクチン接種は、ＭＶＡを用いてであり、ブースターワクチン接種は、同じものを用いて、かつ／又は可溶性高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質を含む組成物を用いてである。
【0074】
一実施形態では、プライムワクチン接種は、ＭＶＡを用いてであり、ブースターワクチン接種は、同じものを用いて、かつ／又は可溶性の精製された高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質を用いてである。
【0075】
一実施形態では、プライムワクチン接種は、ＭＶＡを用いてであり、ブースターワクチン接種は、同じものを用いて、又は可溶性の精製された高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質を用いてである。
【0076】
一実施形態では、プライムワクチン接種は、ＭＶＡを用いてであり、ブースターワクチン接種は、同じものを用いて、又は可溶性の精製された高分子量Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質を用いてである。
【0077】
一実施形態では、組成物は、プライムワクチン接種として投与され、ブースターワクチン接種は、ＨＣＶの高分子量可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【0078】
【図1】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３（群１）及び同じものでブーストされた免疫原性、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でのブースト（群３）を比較する、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて実施された免疫化実験の概略図を示す。
【図2】実験群別にグラフ化された全ての時点での、チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成された相互抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図3】ワクチンのスケジュール別にグラフ化された全ての時点での、チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成された相互抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4】実験群別にグラフ化された、チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成された５６日目の抗体応答曲線を示す。
【図5】実験群別にグラフ化された、チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成された５６日目の抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図6】５６日目に生成された免疫血清がＨＣＶ細胞受容体ＣＤ８１とＥ２受容体結合ドメインとの間の相互作用を阻害する能力を示す。免疫血清がＥ２のＣＤ８１への結合を５０％（Ａ）又は８０％（Ｂ）阻害する能力を１２点希釈曲線から計算した。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図7】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成されたＨＣＶ Ｅ２の４０８～４２８領域に対する５６日目の抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図8】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成されたＨＣＶ Ｅ２の４３０～４５１領域に対する５６日目の抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図9】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成されたＨＣＶ Ｅ２の５２３～５４９領域に対する５６日目の抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図10】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物における５６日目の相同中和力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図11】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物における遺伝子型３ａ ＨＣＶに対する５６日目の異種中和力価を示す。
【図12】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物における遺伝子型５ａ ＨＣＶに対する５６日目の異種中和力価を示す。
【図13】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において５６日目に生成された抗体のアイソタイプを示す。アイソタイプを、マウスアイソタイピングキットを使用して測定し、観察された総抗体アイソタイプに対する割合として表した。
【図14】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において５６日目に生成された抗体のアイソタイプを示す。アイソタイプを、マウスアイソタイピングキットを使用して測定し、観察された総抗体アイソタイプに対する割合として円グラフで表した。これは、円グラフに示される図１３に示されるものと同じデータである。
【図15】チンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス１内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において５６日目に生成された抗体のアイソタイプを比較する。アイソタイプを、マウスアイソタイピングキットを使用して測定し、総抗体アイソタイプに対する割合として表した。＊ｐ＜０．０３３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図16】例示のみを目的として、この研究において使用されるＤ１２３のタンパク質及びＤＮＡ配列を示す。
【図17】チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ又はＣｈＡｄＯｘ１）内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成されたＨＣＶ Ｅ２の遺伝子型３ａ（Ｓ５２分離株）の４０８～４２８エピトープＩ領域、４３０～４５１エピトープＩＩ領域、及び５２３～５４９ＣＤ８１結合ループ領域（エピトープＩＩＩ）に対する５６日目の交差反応性抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０３３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図18】ＩｇＧ１力価の関数として計算され、ＩｇＧ１ ｌｏｇ１０力価をＩｇＧ２ａ ｌｏｇ１０力価で割ったもの（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）として表示される免疫血清のＩｇＧ２ａ力価を示す。力価が低いほど、ＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１比は１：１に近くなり、ＩｇＧ１のＩｇＧ２ａへのクラススイッチングを示す。相互力価（１／ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ）を、Ｃ／Ｐ／Ｐ及びＰ／Ｐ／Ｐを受けた動物由来の免疫血清のＨＣＶｐｐ ＩＤ５０力価に対してプロットし、任意の相関を決定した。全てのバーは中央値であり、四分位範囲が表示されている。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ及びＰｅａｒｓｏｎ検定を使用して、データ分布の正規性を決定し、複数の比較を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを実施して、９５％信頼区間での２つの群中央値間の有意差を決定した。Ｐ値は、＜０．０５＊、＜０．０１＊＊、＜０．００１＊＊＊、＜０．０００１＊＊＊＊の場合、群間の有意差を示す。ＩｇＧ２ａがＩｇＧ１力価の関数として（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）発現された場合、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３免疫血清（群１及び群３）は、Ｅ２Δ１２３ＨＭＷ免疫血清と比較して、有意に低い相互力価を有し、ＧＣクラススイッチングの増加を示した（群１対群２について、ｐ＜０．０００１＊＊＊＊、群２対群３について、ｐ＝０．００１４＊＊）。Ｅ２Δ１２３ＨＭＷ免疫血清（群２及び３を合わせたもの）について、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの相互力価は、ＨＣＶｐｐ中和力価と正の相関がある（ｒ＝０．３９７４、ｐ＝０．０４９２）。
【図19】機能的抗体指数を示した、全体のＡｂ力価の関数としての免疫血清の相互ＩＤ５０阻害力価を示す。機能的抗体指数を、ＣＤ８１遮断として示されるＥ２－ＣＤ８１阻害の両方について計算した。機能的抗体指数を、中和として示される相同偽型ウイルスのウイルス侵入の阻害について計算した。相互ＩＤ５０力価（ＣＤ８１阻害及びＨＣＶｐｐ）が全体のＡｂ力価（機能的抗体指標）と関連して解釈される場合、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３免疫血清（群１及び３）は、Ｅ２Δ１２３ＨＭＷ免疫血清と比較して有意に高い機能的指標を有し、総Ａｂ力価に対して、ワクチンで誘導されたＡｂ応答の中和能力が高いことを示した。
【図20】Ｅ２Ｄ１２３の発現を駆動するために使用されるウイルスベクターの概略図を示す。Ａ．ＣｈＡｄＯｘ１中のＤ１２３の発現カセットの概略図。Ｂ．ＣｈＡｄＯｘ１中のＲＢＤの発現カセットの概略図。Ｃ．ＭＶＡ中のＤ１２３の発現カセットの概略図。
【図21】ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３プライム、続く４週目のＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３ブーストを受けた動物の免疫化スケジュールを示す。ブーストの２週間後に動物を出血させ、抗体及びＴ細胞反応性を測定した。動物に、０週目のＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３プライム（４０ｕＬの滅菌ＰＢＳ中、１０８感染単位［ＩＵ］）、続く４週目のＭＶＡ－Ｅ２Ｄ１２３（４０ｕＬの滅菌ＰＢＳ中、１０７プラーク形成単位［ＰＦＵ］）を投与した。
【図22】図２２Ａは、図２１示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３での免疫化に対して惹起した免疫血清の反応性を示す。免疫血清を、Ｅ２Δ１２３単量体に対してＥＬＩＳＡにおいて評価した。免疫血清の連続希釈液をＥ２Δ１２３単量体コーティングプレートに適用し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウス免疫グロブリン及びＴＭＤ基質で結合された抗体を検出した。バックグラウンド結合の１０倍を達成するために必要な相互力価を計算した。結果は、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３がＥ２に対して高い力価抗体反応性を生成することを示す。図２２Ｂは、５６日目に生成された免疫血清がＨＣＶ細胞受容体ＣＤ８１とＥ２受容体結合ドメインとの間の相互作用を阻害する能力を示す。免疫血清がＥ２のＣＤ８１への結合を５０％阻害する能力を連続希釈曲線から計算した。結果は、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３が、相同Ｅ２とＣＤ８１との間の結合を阻害することができる高力価抗体を生成することを示す。
【図23】図２３Ａは、図２１示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３での免疫化に対して惹起した免疫血清の、ＡＳ４１２（Ｅ２４０８－４２８）、ＡＳ４３４（Ｅ２４３０－４５１）、ＣＤ８１結合ループ（Ｅ２５２３－５４９）への反応性を示す。バックグラウンド結合の１０倍を達成するために必要な相互力価を連続希釈曲線から計算した。結果は、全ての動物が、広域中和抗体の標的である３つの異なるエピトープに結合することができる抗体を生成したことを示す。図２３Ｂは、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３を惹起した免疫血清（図２１）の相同（Ｇ１ａ）及び異種（Ｇ３ａ）中和力価を示す。５０％のウイルス侵入を阻害するために必要な免疫血清の相互力価を連続希釈曲線から計算した。結果は、７／１０の動物が、Ｈｕｈ７細胞株への相同遺伝子型１ａのＣ型肝炎ウイルスの侵入を防止することができる抗体を生成し、６／１０の動物が、異種遺伝子型３ａウイルスのＨｕｈ７肝臓細胞株への侵入を防止することができる抗体を生成したことを示す。検出限界は点線で示されている。
【図24】図２１に示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３で免疫化したマウスにおけるＴ細胞応答を示す。脾細胞を６週目に採取し、ＨＣＶプロテオーム（Ａ及びＣ）の長さ及びペプチドプール（Ｂ及びＤ）についてカバーするＨＣＶペプチド（１１ａａ重複する１５ｍｅｒ）を使用してエクスビボで刺激した。ｇｔ－１ａ（Ｈ７７）、ｇｔ－１ｂ（Ｊ４）、又はｇｔ－３ａ（ｋ３ａ６５０）について、Ｃｏｒｅ－Ｅ１－Ｅ２、ＮＳ３－４、及びＮＳ５。ＩＦＮｇ＋ＣＤ４＋（Ａ及びＢ）及びＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋（Ｃ及びＤ）のＴ細胞頻度を、それぞれ総ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度又はＣＤ８＋Ｔ細胞頻度のパーセンテージとして、細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリーによって決定した。全てのデータは、中央値及び四分位範囲としてプロットされる。結果は、ｃｏｒｅＥ１Ｅ２領域内のエピトープ、おそらくＥ２に焦点を当て、動物が相同ペプチドに対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を生成したことを示す。２／７の試験した動物が遺伝子型１ｂに対する交差反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を保有したが、ＣＤ８＋交差反応性は観察されなかった。
【図25】図２１に示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３で免疫化したマウスにおけるＥ２特異的Ｔ細胞応答を示す。脾細胞を６週目に採取し、Ｅ２領域の長さをカバーする遺伝子型１ａ（１１ａａ重複する１５ｍｅｒ）由来のＥ２ペプチドプールを使用してエクスビボで刺激した。データは、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３でワクチン接種したマウスが、Ｅ２特異的ＩＦＮｇ＋Ｔ細胞を生成することを示す。
【図26】図２１に示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３で免疫化したマウスにおける多機能Ｔ細胞応答の分析を示す。産生されたサイトカイン、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、及びＩＬ－２を検出するために、ｇｔ－１ａ（Ｈ７７）についてのＨＣＶプロテオームの長さをカバーするＨＣＶペプチド（１１ａａ重複する１５ｍｅｒ）を使用して、脾細胞刺激後のＩＣＳ及びフローサイトメトリーを介して、ワクチンで誘導されたＴ細胞の多機能性を決定した。円の基本は、中央値であり、Ｐｅｓｔｌｅ及びＳＰＩＣＥソフトウェアを使用して計算されている。全てのデータは、中央値及び四分位範囲としてプロットされる。結果は、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３でのワクチン接種が、高度に多機能的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成することを示す。
【図27-1】ＣｈＡｄＯｘ１－ＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３の例示的なヌクレオチド配列を提供する。
【図28】ＣｈＡｄＯｘ１－ＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３のレイアウトマップを提供する。
【図29-1】ＣｈＡｄＯｘ１ポリヌクレオチド配列５’からＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３免疫原カセットを提供する。
【図30】ＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３免疫原カセットのレイアウトを提供する。
【図31-1】ＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３免疫原カセット配列、Ｔｅｔオペレーター配列を有するＣＭＶプロモーター、余剰配列、Ｋｏｚａｋ配列、ＴＰＡ配列、ＴＰＡアミノ酸配列、Ｅ２Ｄ１２３配列、Ｅ２Ｄ１２３アミノ酸配列、余剰配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を提供する。
【図32-1】ＣｈＡｄＯｘ１配列５’からＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３免疫原カセットのポリヌクレオチド配列を提供する。
【図33】ＭＶＡ－ＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３のポリヌクレオチド配列を提供する。
【図34】ＭＶＡ－ＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３のレイアウトを提供する。
【図35-1】ＭＶＡ－ＴＴＰＡ－Ｅ２Ｄ１２３の配列情報、Ｆ１１－Ｌ－フランク配列、ｍＨ５プロモーター配列、ＴＰＡ配列、ＴＰＡアミノ酸配列、Ｅ２Ｄ１２３配列、及びＦ１１－Ｒ－フランク配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0079】
【0080】
異種ＨＣＶ遺伝子型に対する機能的Ｂ細胞応答を誘発することができる可変領域欠失ＨＣＶ Ｅ２抗原を、ＨＣＶ抗原をコードする核酸の形態で投与することができることが、本発明に従って同定されている。驚くべきことに、核酸分子は、レシピエントにおいて複数のＨＣＶ遺伝子型に対して機能的なＢ細胞応答を生じることができた。例示的な実施形態では、可変領域欠失ＨＣＶ Ｅ２ ＲＢＤをコードする核酸は、ウイルスベクター中で投与された。マウスワクチン接種研究では、可変領域欠失ＨＣＶ Ｅ２ ＲＢＤをコードするＤＮＡが、タンパク質単独又はタンパク質とＤＮＡとの組み合わせの投与と比較して最も低いレベルの抗体応答を生成したが、これらの抗体応答は、その細胞受容体ＣＤ８１へのＥ２の結合を防止することによってなどの感染症を予防することができる最も高いレベルの機能的抗体を示したことが実証されている。ＤＮＡワクチンはまた、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂのより強い刺激因子であり、ウイルス除去を補助する補体の強力な活性化因子であった。支持するデータを、実施例１及び図１～図１６に示す。更なる支持するデータを、本明細書に記載の実施例２及び３並びに図１７～２６に示す。本明細書は、ＣｈＡｄＤ１２３でワクチン接種し、次いで２つのタンパク質ブーストした動物における交差反応性抗体特異性の生成（図１７）、並びにタンパク質単独と比較したＣｈＡｄＤ１２３での３回のワクチン接種又はＣｈＡｄＤ１２３でのプライム接種に続くＨＭＷ Ｅ２Ｄ１２３での２つのタンパク質ブーストのいずれかを受けた動物におけるより高いレベルの機能的抗体（図１９）のより多くの証拠を提供する。クラススイッチングの証拠は、Ｂ細胞応答の成熟を示す。ＣｈＡｄ－Ｄ１２３は、タンパク質ワクチン接種単独に対して異なるクラススイッチングを誘導するようであり、中和と相関する（図１８）。実施例３は、Ｄ１２３がまたＭＶＡウイルスベクター中で送達され得るという証拠を記載する（図２０～２６）。マウスをＣｈＡｄＤ１２３でプライムし、次いでＭＶＡ－Ｄ１２３でブーストすることによって実験を実施した。動物は、Ｅ２に対する抗体を産生し（図２２Ａ）、それはＥ２とＣＤ８１２２ｂとの間の相互作用を阻害すし、３つ全ての主要な中和エピトープに指向された（図２３Ａ）。抗体は、相同ウイルス（２３Ｂ ＬＨＳ）及び異種Ｇ３ａウイルス（２３Ｂ ＲＨＳ）の両方に対して中和した。
【0081】
なお更に、Ｇ１ａペプチドに対してＣＤ４＋Ｔ細胞応答が生成され、いくつかはＧ３ａペプチドに対して交差反応性であった（図２４Ａ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＣｏｒｅＥ１Ｅ２領域に指向されており（図２４Ｂ）、いくつかはＧ３ａに交差反応性であった（図２４Ｂ）。Ｇ１ａペプチドに対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答が生成された（図２４Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答はＣｏｒｅＥ１Ｅ２領域に指向された（図２４Ｂ）。全てのＴ細胞はＥ２ペプチドに指向された（図２５）。多機能的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が生成され、主にＴＮＦαを生成した３つのサイトカイン及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成した（図２６）。
【0082】
したがって、本明細書では、核酸ベースのワクチンの投与に基づいて、現在又は将来のＨＣＶ感染症に対して対象にワクチンを接種するための組成物及び方法が開示される。
【0083】
一態様では、本開示は、対象におけるＨＣＶ感染症を予防又は低減する方法であって、可変ドメイン欠失ＨＣＶ Ｅ２タンパク質性分子をコードする核酸分子を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0084】
一態様では、本開示は、療法に使用するため、又はＨＣＶ感染症の治療若しくは予防のため、又は免疫応答を誘導するための、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を提供し、核酸は、対象に投与され、可変ドメイン欠失Ｅ２タンパク質は、対象において産生され、ＨＣＶに対する機能的Ｂ細胞応答を含む免疫応答を生成する。
【0085】
したがって、一実施形態では、組成物は、宿主において、したがって宿主間のウイルス増殖を低減又は防止することができる有効な機能的Ｂ細胞応答を生じさせる、予防的又は治療的ワクチンとして使用するためのものである。
【0086】
したがって、一実施形態では、組成物は、宿主において、したがって宿主間のウイルス増殖を防止するためのワクチンとして使用するためのものである。
【0087】
「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」は、フラビウイルス科のヘパシウイルス属に属する小型のエンベロープを有するプラスセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。本明細書で使用される場合、その用語は、任意の遺伝子型のＨＣＶ、例えば、これらに限定されないが、ＨＣＶ遺伝子型１（Ｇ１）、ＨＣＶ遺伝子型２（Ｇ２）、ＨＣＶ遺伝子型３（Ｇ３）、ＨＣＶ遺伝子型４（Ｇ４）、ＨＣＶ遺伝子型５（Ｇ５）、ＨＣＶ遺伝子型６（Ｇ６）、ＨＣＶ遺伝子型７（Ｇ７）、ＨＣＶ遺伝子型８（Ｇ８）の株を指し、任意の亜型又は準種、例えば、亜型ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅなどを含み得る。ＨＣＶは、宿主細胞へのウイルス侵入に必要な２つの糖タンパク質Ｅ１及びＥ２をコードする。「ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質」、「Ｅ２糖タンパク質」、「Ｅ２二量体」、「Ｅ２三量体」又は「Ｅ２」、「Ｅ２単量体」、「ＨＣＶ Ｅ２」などの用語は、ＨＣＶの任意の遺伝子型又は単離物由来のＥ２糖タンパク質を含む。この用語は、完全長Ｅ２糖タンパク質の部分を含む天然に生じないバリアントを更に含み、例えば、受容体結合を媒介するか、又は立体構造及び／若しくは他のエピトープを認識する１つ以上の抗体による中和抗体結合を媒介するか、又はＥ１Ｅ２二量体形成を媒介するものを含む。
【0088】
ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質は、約１１個の主に保存されたＮ連結グリコシル化部位及び不安定なジスルフィドを形成する１８個の保存されたシステインを含有する。受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、他のＥ１Ｅ２配列とは独立して折り畳まれ、ＮＡｂ結合部位の大部分を含有する。ＲＢＤは、アミノ酸残基３８４～６６１（Ｇ１）までまたがっている。ＲＢＤは、残基６６１を超えて、Ｅ２の外部ドメインのＣ末端境界まで延びる可能性がある。Ｅ２ ＲＢＤの異種発現は、ＣＤ８１と結合する能力を保持する可溶性タンパク質の分泌をもたらす。ＲＢＤ内には、３つの高度可変領域又はＨＶＲ、ＨＶＲ１（アミノ酸３８４～４１０）、ＨＶＲ２（アミノ酸４６０～４８１）、及びｉｇＶＲ（遺伝子型間可変領域、５７０～５８０）が位置する（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：９５８４－９５９０，２００７）。可変領域は、基礎となる保存残基を遮蔽する免疫おとりとして機能するため、免疫回避において主要な役割を果たす。「免疫グロブリン中和面」又は「中和面」は、Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻害する免疫グロブリンを生成するＥ２の面を指す。３つの可変領域は、それらが保存されたコアドメインの外側にあることを示すその天然の折り畳みを破壊することなく、ＲＢＤから同時に欠失させることができる。ＲＢＤは、本来、保存されたＣ末端ステムを介して膜貫通ドメインに連結している。Ｘ線結晶学及び電子顕微鏡法は、ＲＢＤコアがコンパクトな免疫グロブリン様折り畳みを採用することを明らかにした。全てのＨＣＶ株の主要な細胞受容体であるＣＤ８１の結合部位は、ｂＮＡｂエピトープと重複する４つの高度に保存された表面に露出したセグメントを含む（Ｄｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１１１４３－１１１４７，２００２）。結晶構造は、以前に提案されたように、ＨＶＲ２及びｉｇＶＲが、ジスルフィド結合した表面に露出したループを形成することを裏付ける。
【0089】
ＨＣＶ Ｅ２は、高い免疫原性であるが、ＨＣＶ Ｅ２に対して産生された抗体のうち、感染症予防に有効なものはほとんどない。Ｎ末端ＨＶＲ１に対して指向された抗体は、免疫優性であるが、ＨＣＶの異種株及び遺伝子型を中和する能力が制限された単離物特異的である。結果として、ＨＶＲ１に対する抗体は、免疫逃避を駆動し、ＨＶＲ１は、免疫おとりであることが提案されている。エピトープがＣＤ８１結合に関与する配列と重複する中和抗体は、概して、この領域における高程度の配列保存に起因して広域に中和するが、通常、感染症の慢性期中にのみ出現する。ＣＤ８１結合を遮断するヒトＮＡｂは、４つの免疫原性ドメイン内に位置するエピトープを認識する。ＨＶＲ１特異的抗体は、ＣＤ８１結合部位及びその中の保存されたＮＡｂエピトープを遮蔽することができ、結合活性を競合し、ドメインＥへのＮＡｂの有効性を低減させる。非ＮＡｂの高い力価は、天然の免疫応答及びワクチンで生成された免疫応答の両方において生成され、ＣＤ８１結合部位からＥ２の反対側の面に位置するドメインＡにマッピングされる。これらの非ＮＡｂは免疫優性であり、Ｅ２－ＣＤ８１結合を防止することができず、複数の遺伝子型に対して交差反応性であり、ＮＡｂの活性を妨げる。これらの研究は、ＨＣＶに対する効果的な保護抗体応答が、感染症を予防するために相乗的に作用する選択された抗体特異性の生成を必要とすることを明らかにした。
【0090】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８１」は、分化クラスター８１を指し、テトラスパニンスーパーファミリーの膜貫通タンパク質であり、種々のＨＣＶ株の主要な宿主細胞受容体である。
【0091】
本明細書で使用される場合、「Δ１２３Ｅ２」又はＤｅｌｔａ１２３Ｅ２」は、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１２において概して記載されているとおり、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びｉｇＶＲ／ＶＲ３が除去又は欠失されており、任意選択で、リンカーで置き換えられているＥ２ポリペプチドを指す。一実施形態では、本発明は、Ｅ２Ｄｅｌｔａ１２３をコードする核酸で示されており、可変ドメインコード領域の各々が除去されている。しかしながら、この実施形態は、最も有効である可能性が高いが、可変領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの部分領域又は部分は、可変領域を含む完全なままの対照Ｅ２ポリペプチドと比較して、保持され、依然として中和及び減少した非中和抗体応答を誘発し得ることが理解され、これらの実施形態は包含される。したがって、例えば、一実施形態では、総可変領域ポリヌクレオチド配列の１％～５０％が保持され得、依然として本発明の範囲内であることが想定される。一実施形態では、３０％未満、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は１％未満のＥ２可変ドメインポリヌクレオチドが保持される。一実施形態では、２０％未満、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は１％未満のＥ２可変ドメインポリヌクレオチドが保持される。一実施形態では、１０％未満、又は５％未満、４％、３％、２％、１％、又は１％未満のＥ２可変ドメインポリヌクレオチドが保持される。Δ１２３ポリペプチドは、ＣＤ８１の結合能力を保持し、単量体、二量体、三量体、及び様々なオリゴマー形態で存在し得る。一実施形態では、ＨＭＷ形態は、ＨＭＷ１又はＨＭＷ２であり得る。本明細書で使用される場合、「ＨＭＷ１」は、約２４０２ｋＤａの分子量を有するΔ１２３のオリゴマー形態を指す。本明細書で使用される場合、「ＨＭＷ２」は、約２３９．３ｋＤａの分子量を有するΔ１２３のオリゴマー形態を指す。
【0092】
ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質の一例示的な形態は、遺伝子型Ｈ７７ ｌａのアミノ酸３８４～６６１（Ｅ２６６１）又は別のＨＣＶ遺伝子型由来の対応する部分を含むＥ２糖タンパク質の受容体結合部分である。
【0093】
本明細書で使用される場合、「遺伝子型特異的抗体」は、単一のＨＣＶ遺伝子型又は２つの非常に類似した遺伝子型に結合する抗体を指す。当業者は、ＨＣＶ遺伝子型が任意のＨＣＶ遺伝子型であり得ることを理解するであろう。一実施形態では、ＨＣＶ遺伝子型は、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、及びＧ７のうちの１つ以上から選択される。
【0094】
一実施形態では、Ｅ２タンパク質は、Ｅ２６６１Δ１２３（ＡＨＶＲ１２３、本明細書ではΔ１２３、Ｄ１２３、ＡＨＶＲｌ＋２＋３、Ｄ１２３Ｅ２６６ｉ－ｈｉｓ、ＤＩ２３Ε２６６１、Δ１２３Ｅ２６６１及びΔ１２３Ｅ２６６１－ｈｉｓとも称される）である。いくつかの実施形態では、Ε２６６１Δ１２３ Ｅ２は、可変領域１及び２並びにｉｇＶＲ（３）が、短いリンカーモチーフで置き換えられた（ＡＨＶＲ１２３）ＨＣＶ Ｈ７７ｃのアミノ酸３８４～６６１を含む。本発明の他の実施形態は、短いリンカーによって欠失又は置き換えられたＨＶＲ１、ＨＶＲ２、又はｉｇＶＲの任意の組み合わせを有するＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含む。これらは、Δ１、Δ１，２（Δ１２）、Δ２、Δ２，３（Δ２３）、Δ３、及びΔ１，３（Δ１３）と略すことができる。
【0095】
「単離された」及び「精製された」という用語は、その天然状態において通常それに付随する構成要素を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離された核酸分子」は、天然に生じる状態でそれに隣接する配列から単離された核酸又はポリヌクレオチド、例えば、断片に通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。特に、単離されたＨＣＶ Ｅ２は、その天然の細胞環境、及び細胞の他の構成要素との会合からのタンパク質のインビトロ単離及び／又は精製を含む。限定されないが、単離された核酸、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はポリペプチドは、精製によって単離される天然配列、又は組換え若しくは合成手段によって産生される配列を指し得る。
【0096】
本明細書で使用される場合、「広域中和抗体」は、免疫原／ＨＣＶの複数の遺伝子型又は亜型に対する交差保護を提供する抗体を指す。一実施形態では、広域中和抗体は、ＨＣＶの２つ以上の遺伝子型及び／又は亜型を認識する。一実施形態では、広域中和抗体は、少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、又は少なくとも８つのＨＣＶ遺伝子型を認識する。一実施形態では、ＨＣＶ遺伝子型は、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７から選択される。一実施形態では、広域中和抗体は、３つのＨＣＶ遺伝子型に結合する。一実施形態では、広域中和抗体は、４つのＨＣＶ遺伝子型に結合する。一実施形態では、広域中和抗体は、５つのＨＣＶ遺伝子型に結合する。一実施形態では、広域中和抗体は、６つのＨＣＶ遺伝子型に結合する。一実施形態では、広域中和抗体は、７つのＨＣＶ遺伝子型に結合する。一実施形態では、広域中和抗体は、他のＨＣＶ遺伝子型に結合する。当業者は、広域中和抗体が、対象において発達するのに数週間又は数ヶ月を要し得ることを理解するであろう。
【0097】
本明細書に記載の核酸分子は、インビトロ転写されたＲＮＡ若しくは合成ＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはＰＮＡ、又はそれらの混合物を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの任意の形態であり得る。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えによって産生され、化学的に合成された分子、及びそれらの修飾形態が含まれる。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、直鎖又は環を形成するように共有結合で閉じられていてもよい。ＲＮＡは、安定化配列、キャッピング、及びポリアデニル化によって修飾され得る。ＲＮＡ又はＤＮＡであり、かつ抗原を発現し、免疫応答を誘導するためのプラスミドとして送達され得る。ＲＮＡベースのアプローチが、概して好ましく、これらは増幅又は非自己増幅構築物を含み得る。
【0098】
いくつかの実施形態では、一過性インビボトランスフェクションによって投与されるポリヌクレオチドは、化学修飾されたＲＮＡであり、それは少なくとも１つの種類のヌクレオチド、例えば、シトシンの割合（例えば、１０％、３０％、５０％、又は１００％）がインビボでその安定性を増加させるように化学修飾されている。例えば、いくつかの場合でが、修飾されたシストシンは、５－メチルシトシンである。かかるポリヌクレオチドは、特にトランスフェクション／送達剤と組み合わせた場合に、インビボで細胞への送達／トランスフェクションに特に有用である。いくつか場合では、化学修飾されたＲＮＡは、シストシンの大部分（例えば、全て）が５－メチルシトシンであり、ウラシルの大部分（例えば、全て）がプソイドウラシルである化学修飾されたＲＮＡである。かかる修飾されたＲＮＡの合成及び使用は、例えば、ＷＯ２０１１／１３０６２４に記載されている。ＤＮＡ及びＲＮＡポリヌクレオチドのインビボトランスフェクションのための方法は、例えば、Ｌｉｕら（２０１５）及びＹｏｕｎら（２０１５）に要約されているように、当該技術分野で既知である。
【0099】
「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは、完全に又は実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより産生されたＲＮＡ、並びに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更によって天然に生じるＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡを含む。かかる変更は、ＲＮＡの末端、又は内部、例えば、ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドなどでの非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に生じないヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドなどの非標準的なヌクレオチドを含み得る。これらの変更されたＲＮＡは、天然に生じるＲＮＡの類似体又は類似体と称され得る。
【0100】
したがって、一実施形態では、核酸コード領域のコード領域のＧ／Ｃ含量は、その特定の野生型コード配列、すなわち、修飾されていないｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比較して、修飾され、特に増加する。ｍＲＮＡのコードされたアミノ酸配列は、特定の野生型ｍＲＮＡのコードされたアミノ酸配列と比較して修飾されないことが好ましい。
【0101】
最適化されたｍＲＮＡベースの組成物は、当該技術分野で既知のように翻訳効率及び細胞内安定性を最適化する５’及び３’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）、並びに可変領域欠失ＨＣＶ Ｅ２をコードするオープンリーディングフレームを含み得る。一実施形態では、キャップされていない５’－トリホスフェートの除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成され得る。ＲＮＡは、その安定性を増加させ、及び／又は細胞傷害性を低減させるために、修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施形態では、ＲＮＡにおいて、５－メチルシチジンが、シチジンと部分的又は完全に置換される。代替的又は追加的に、プソイドウリジンが、ウリジンと部分的又は完全、好ましくは完全に置換される。これらの修飾はまた、ＲＮＡの翻訳を妨げ得る無差別な免疫不活性化を低減し得る。一実施形態では、「修飾」という用語は、５’キャップ又は５’キャップ類似体を有するＲＮＡを提供することに関する。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出されるキャップ構造を指し、概して、普通にはない５’から５’へのトリホスフェート連結を介してｍＲＮＡに接続したグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは、７位でメチル化されている。「従来の５’キャップ」という用語は、天然に生じるＲＮＡ５’キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップを指す。「５’キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に似ており、ＲＮＡを安定化し、及び／又はＲＮＡの翻訳を増強する能力を有するように修飾される５’キャップ類似体を含む。５’キャップ又は５’キャップ類似体を有するＲＮＡの提供は、当該５’キャップ又は５’キャップ類似体の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、当該５’キャップは、生成されたＲＮＡ鎖に同時転写的に組み込まれるか、又はＲＮＡは、例えば、インビトロ転写によって生成され得、５’キャップは、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して、転写後のＲＮＡに結合され得る。
【0102】
ＲＮＡの更なる修飾は、Ｘ領域尾部などの天然に生じるＵＴＲの伸長若しくは切断、又は当該ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入などの５’若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の変更、例えば、アルファ２－グロビン、アルファ－グロビン、ベータ－グロビンなどのグロビン遺伝子に由来する１つ以上、好ましくは２つのコピーの３’－ＵＴＲとの既存の３’－ＵＴＲの交換又は挿入であり得る。マスクされていないポリＡ配列を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。
【0103】
「ポリ（Ａ）尾部」又は「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡ分子の３’末端に位置し得るアデニル（Ａ）残基の配列に関するものであり、「マスクされていないポリＡ配列」とは、ＲＮＡ分子の３’末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終わり、ポリＡ配列の３’末端、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが続かないことを意味する。更に、約１２０塩基対の長いポリＡ配列は、ＲＮＡの最適な転写安定性及び翻訳効率をもたらす。
【0104】
したがって、ＲＮＡの安定性及び／又は発現を増加させるために、好ましくは１０～５００、より好ましくは３０～３００、更により好ましくは６５～２００、及び特に１００～１５０のアデノシン残基の長さを有する異種ポリＡ配列と併せて存在するように修飾され得る。特に好ましい実施形態では、ポリＡ配列は、約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性及び／又は発現を更に増加させるために、ポリＡ配列は、マスクされなくてもよい。
【0105】
加えて、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をＲＮＡ分子の３’非翻訳領域に組み込むことにより、翻訳効率の向上がもたらされ得る。相乗効果は、かかる３’非翻訳領域のうちの２つ以上を組み込むことによって達成され得る。３’非翻訳領域は、それらが導入されるＲＮＡに対して自己又は異種であり得る。特定の一実施形態では、３’非翻訳領域は、ヒトβ－グロビン遺伝子に由来する。
【0106】
上述の修飾の組み合わせ、すなわち、任意選択でのポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のマスキングなし、及び１つ以上の３’非翻訳領域の組み込みは、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率の増加に相乗的に影響する。
【0107】
ＲＮＡの発現を増加させるために、ＧＣ含有量を増加させて、ｍＲＮＡ安定性を増加させ、コドン最適化を行い、したがって、細胞内の翻訳を向上させるために、コード領域内を修飾し得る。修飾されたｍＲＮＡは、酵素的に合成され、脂質ナノ粒子などのナノ粒子にパッケージ化され、例えば、筋肉内で投与され得る。自己複製ＲＮＡ又はプロタミン複合体化ＲＮＡアプローチはまた、ウイルス感染に対する免疫応答を生成することが示されている。
【0108】
核酸分子は、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンに封入され得る。かかる技法は当該技術分野で既知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．，ｅｄ．（２０００）に開示されている。
【0109】
ナノ粒子又はコロイド系としての核酸の全身投与のための様々なアプローチが既知である。非ウイルスアプローチでは、カチオン性リポソームを使用して、ＤＮＡ／ＲＮＡ凝縮を誘導し、細胞の取り込みを促進する。カチオン性リポソームは、通常、ＤＯＴＡＰのようなカチオン性脂質、及びＤＯＰＥのような１つ以上のヘルパー脂質からなる。いわゆる「リポプレックス」は、カチオン性（正に帯電した）リポソーム及びアニオン性（負に帯電した）核酸から形成することができる。最も単純な場合、リポプレックスは、特定の混合プロトコルで核酸とリポソームとを混合することによって自発的に形成されるが、様々な他のプロトコルが適用されてもよい。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックスなどのナノ粒子ＲＮＡ製剤は、定義された粒子サイズで産生され、粒子の正味電荷はゼロ又は負に近い。例えば、ＲＮＡ及びリポソームからの電気的に中性又は負に荷電したリポプレックスは、ＷＯ２０１３／１４３６８３に開示されているように、全身投与後に脾臓又は免疫細胞において実質的なＲＮＡ発現をもたらす。一実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質を含む。一実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、モノカチオン性又はポリカチオン性であり得る。任意のカチオン性両親媒性分子、例えば、少なくとも１つの親水性及び親油性部分を含む分子は、本発明の意味の範囲内のカチオン性脂質である。一実施形態では、正電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質によって寄与され、負電荷は、ＲＮＡによって寄与される。一実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は、中性又は陰イオン性脂質であり得る。ヘルパー脂質は、リン脂質若しくは天然脂質の類似体などの天然脂質、又は天然脂質との類似性を有さない完全に合成された脂質若しくは脂質様分子であり得る。一実施形態では、カチオン性脂質及び／又はヘルパー脂質は、二重層形成脂質である。
【0110】
一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、ｌ，２－ジ－０－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）若しくはその類似体若しくは誘導体、及び／又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）若しくはその類似体若しくは誘導体を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのヘルパー脂質は、１，２－ジ（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）若しくはその類似体若しくは誘導体、コレステロール（Ｃｈｏｉ）若しくはその類似体若しくは誘導体、及び／又はｌ，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）若しくはその類似体若しくは誘導体を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのヘルパー脂質は、１，２－ジ（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）若しくはその類似体若しくは誘導体、コレステロール（Ｃｈｏｉ）若しくはその類似体若しくは誘導体、及び／又はｌ，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）若しくはその類似体若しくは誘導体を含む。
【0111】
一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのヘルパー脂質とのモル比は、１０：０～３：７、好ましくは９：１～３：７、４：１～１：２、４：１～２：３、７：３～１：１、又は２：１～１：１、好ましくは約１：１である。一実施形態では、この比率において、カチオン性脂質のモル量は、カチオン性脂質のモル量にカチオン性脂質内の正電荷の数を乗じて得られる。本明細書に記載のナノ粒子において、脂質は、ＲＮＡと複合体を形成し得、及び／又はＲＮＡを封入し得る。一実施形態では、ナノ粒子は、リポプレックス又はリポソームを含む。一実施形態では、脂質は、当該ＲＮＡを封入する小胞に含まれる。小胞は、多層小胞、単層小胞、又はそれらの混合物であり得る。小胞は、リポソームであり得る。
【0112】
抗原コード配列は、任意の好適なベクターに挿入され得る。ベクターの目的は、少なくとも一実施形態では、コード核酸を宿主環境に送達し、タンパク質発現及び宿主免疫応答への提示を促進することである。ベクターは、複製であり得るか、又は非複製であり得る。
【0113】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、抗原コード配列が少なくとも挿入される任意の送達部分を含み、これには、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、ウイルス様粒子、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹ウイルス、ＣＭＶ、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスなどのウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、若しくはＰＩ人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターが含まれる。ベクターは、発現ベクター及びクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含み、概して、所望のコード配列及び特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、又は哺乳動物）又はインビトロ発現系において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、概して、特定の所望のＤＮＡ断片を操作及び増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
【0114】
発現ベクターは、概して、Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された転写及び翻訳調節核酸を含む。この文脈における「作動可能に連結された」とは、転写及び翻訳調節ＤＮＡが、転写が開始されるような様式で、Ｅ２ポリペプチドのコード配列に対して位置付けられることを意味する。概して、これは、プロモーター及び転写開始又は開始配列がタンパク質コード領域に対して５’に配置されることを意味する。転写及び翻訳調節核酸は、概して、外来タンパク質を発現するために使用される細胞に適切であり、例えば、哺乳動物細胞、特にヒト由来の転写及び翻訳調節核酸配列は、好ましくは、哺乳動物及びヒトにおいてタンパク質を発現するために使用される。多数の種類の適切な発現ベクター、及び好適な制御配列が当該技術分野で既知である。
【0115】
ウイルスベクターは、修飾されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を含み得る。ウイルスベクターは、プライムブーストレジメンにおいてワクチンブーストとして使用する場合、ＭＶＡを含み得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含み得る。ウイルスベクターは、弱毒化ウイルスベクターであり得る。
【0116】
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等のあらゆる材料及び方法を使用して、本開示を実践又は試験することができる。実践者は、特に、当技術分野の定義及び用語並びに当業者に既知の他の方法について、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９、Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８６、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．，ｅｄ．（２０００）に指示されている。
【0117】
別の実施形態では、組成物は、薬学的又は生理学的に許容される担体又は希釈剤を更に含む。
【0118】
医薬組成物は、従来の薬学的配合技法に従って好都合に調製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．，ｅｄ．（２０００）以降の版を参照されたい。これらの組成物は、活性物質のうちの１つに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当該技術分野において周知の他の物質を含み得る。かかる材料は無毒である必要があり、有効成分の有効性を妨げてはならない。担体は、例えば、静脈内、経口又は非経口の投与に所望される調製物の形態に応じて多種多様な形態をとり得る。
【0119】
本明細書に記載のワクチン組成物は、他のワクチン又は治療と組み合わせ得る。既存の抗ＨＣＶ薬物治療は、非常に効果的であり、当該技術分野で既知である。例えば、チェックポイント阻害剤による、又は他のアジュバント型分子を含むことによる免疫応答を改善する薬剤は、主題のワクチンと組み合わせて使用することが企図される。
【0120】
一実施形態では、核酸分子は、アジュバントと組み合わせて投与される。
【0121】
一実施形態では、核酸分子は、従来使用されてきたワクチンアジュバントなしで投与される。
【0122】
１つ以上のアジュバントとの混合物として投与する場合、免疫原に対する免疫応答を増強することができる。免疫アジュバントは、典型的には、以下の方法のうちの１つ以上で機能する：（１）免疫調節（２）強化された提示（３）ＣＴＬ産生（４）標的化、及び／又は（５）デポ生成。
【0123】
含んでもよく、又は含まなくてもよい例示的なアジュバントとしては、粒子状又は非粒子状アジュバント、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、アルミニウム塩、エマルジョン、ＩＳＣＯＭＳ、ＭＰＬなどのＬＰＳ誘導体、及び３Ｄ－ＭＰＬ、ＧＬＡ、及びＡＧＰなどのそれらの誘導体、ムラミルジペプチド又はムラミルトリペプチドなどのマイコバクテリア由来タンパク質、ＱＳ２１、ＱＳ７、及びＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）サポニンなどのＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ由来の特定のサポニン、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、並びにサイモシンα１などのペプチドが挙げられる。サポニン構成要素に加えて、アジュバントは、ベータ－シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、及びコレステロールなどのステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、アジュバントは、例えば、スクアレン、アルファ－トコフェロール、及び界面活性剤（例えば、Ｗ０９５／１７２１０を参照されたい）を含む水中油エマルジョンの形態で、又はリポソームの形態で提示される。「リポソーム」という用語は、本明細書で使用される場合、水性内部を囲む単一又は多層脂質構造を指す。リポソーム及びリポソーム製剤は、当技術分野で周知である。リポソーム提示は、例えば、ＷＯ９６／３３７３９及びＷＯ２００７／０６８９０７に記載されている。リポソームを形成することができる脂質には、脂肪又は脂肪様の特性を有する全ての物質が含まれる。動的レーザー光散乱は、当業者に周知のリポソームのサイズを測定するために使用される方法である。アジュバントの詳細な説明は、Ｃｏｘ ａｎｄ Ｃｏｕｌｔｅｒ，“Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，Ｅｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｋ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９２，ａｎｄ ｉｎ Ｃｏｘ ａｎｄ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ １５（３）：２４８－２５６，１９９７に見出すことができる。
【0124】
これらの実施形態によれば、組成物は、概して、機能的Ｅ２特異的抗体の生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下で投与される。本発明の組成物は、単回用量又は適用として投与され得る。代替的には、組成物は、反復投与又は適用を伴ってもよく、例えば、組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回又はそれよりも多く投与され得る。
【0125】
本出願によって企図されるワクチン接種レジメンの例は以下のとおりである。最初のワクチン接種の後、対象は、典型的には、２～４週間の間隔、例えば、３週間の間隔の後にブーストを受け、任意選択で、反復ブーストを受ける。
【0126】
いくつかの実施形態では、核酸ワクチン接種対象は、補体を活性化し、補体媒介機序を介してウイルスを除去する能力を示すＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ３抗体の存在について試験される。一実施形態では、ワクチン接種された対象は、ワクチン接種された対象が非機能的抗体ではなく機能的抗体応答を産生する能力を示すＩｇＧ２ａ、３及び／又はＩｇＭの存在について試験される。
【0127】
いくつかの実施形態では、インビボで発現されたＥ２ポリペプチドに対して生成された抗体は、宿主細胞侵入又はウイルス出芽などのＨＣＶライフサイクルの重要な部分を少なくとも部分的又は実質的に中和する抗体を含む。機能的抗体は、食作用又は細胞傷害性、又は補体媒介除去を促進することによって、そのライフサイクル遮断効果を示し得る。
【0128】
一実施形態では、本明細書は、ＨＣＶ感染症の治療又は予防のための、核酸ベースの医薬品における、又はその製造における、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子の使用について提供する。「製造」という用語は、産生又はスクリーニングを含む。
【0129】
別の実施形態では、本開示は、対象又は患者における体液性免疫応答を誘発する方法を提供し、本方法は、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドを発現することができる核酸分子の有効量を対象に投与することを含む。
【0130】
一実施形態では、可変欠失Ｅ２は、Ｄｅｌｔａ１２３である。一実施形態では、Ｅ２ Ｄｅｌｔａ １２３などの可変欠失Ｅ２は、Ｃ５８１～Ｃ６２０から選択される少なくとも４つの変異又は破壊されたシステインを有する。
【0131】
関連する態様では、本開示は、対象の集団にＨＣＶに対するワクチン接種する方法であって、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドを発現することができる核酸分子の有効量を対象に投与することを含み、ワクチンは、例えば、図６に示されるような機能的抗体力価における対象間の可変性によって、又は図７若しくは図８若しくは図９に示されるようなペプチド結合によって測定可能な集団内で実質的に均一な抗体応答を産生する、方法を提供する。
【0132】
関連する実施形態では、本発明は、対象におけるＣ型肝炎感染症を治療するための、又は対象をＣ型肝炎感染症に対して免疫化するための方法であって、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0133】
本明細書で使用される「治療有効量」及び「予防有効量」を含む「有効量」という用語は、少なくともいくつかの対象において所望の治療効果、予防効果、又は生理学的効果を提供する、単回用量、又は一連の若しくは徐放系の一部のいずれかとしての本発明の組成物の十分な量を意味する。望ましくない効果、例えば、副作用は、時には所望の治療効果とともに現れることがあり、したがって、実践者は、適切な「有効量」を決定する際に潜在的な利益と潜在的なリスクとのバランスを取る。
【0134】
必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢及び全身状態、投与様式などに応じて、対象ごとに変化するだろう。したがって、正確な「有効量」を特定することができない場合がある。しかしながら、任意の個々の場合における適切な「有効量」は、日常的な技術又は実験を使用して、当業者によって決定され得る。当業者であれば、組成物又は他の薬剤の以前の投与、対象のサイズ、対象の症状の重症度、又は感染集団における症状の重症度、ウイルス量、及び選択される特定の組成物又は投与経路などのかかる因子に基づいて、必要量を決定することができるであろう。
【0135】
「治療」という用語は、少なくともいくつかの対象におけるＨＣＶの１つ以上の症状、又はＨＣＶの進行症状の発症のリスク、又はＨＣＶの伝染のリスクの測定可能又は統計学的に有意な改善を指す。
【0136】
「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」及び「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」などの用語は、互換的に使用され、後続の感染症を予防若しくは減弱させる、又は感染するリスクを低減させる、又はＨＣＶ感染症に関連する状態若しくは状態の徴候の重症度若しくは発症を低減させる目的で、ＨＣＶに感染したことが知られていない対象に本発明の組成物を投与することを含む。
【0137】
ワクチン組成物の投与は、概して、予防目的である。組成物の予防的投与は、任意の後続の感染症を予防又は減弱させる役割を果たす。「薬理学的に許容される」組成物は、レシピエント患者によって容認される組成物である。有効量のワクチンが投与されることが企図される。「有効量」は、ライフサイクルの少なくとも１つの段階を遮断するのに十分な体液性免疫を誘導するような所望の生物学的効果を達成するのに十分な量である。これは、ワクチンの種類、レシピエントの年齢、性別、健康、及び体重に依存し得る。所望の生物学的効果の例として、無症状の産生、症状の低減、組織又は鼻腔分泌物中のウイルス力価の低減、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染症に対する完全な保護、及びＣ型肝炎ウイルスによる感染症に対する部分的な保護、集団免疫の改善、肝炎、肝細胞がんなどの慢性感染症の結果に対する保護が挙げられるが、これらに限定されない。
【0138】
典型的には、ウイルスベクターの場合、約５×１０７～５×１０１２個のウイルス粒子、典型的には、約５×１０９～５×１０１０個のウイルス粒子が投与される。
【0139】
Ｄｅｌｔａ１２３ＨＣＶ Ｅ２をコードする活性剤ｍＲＮＡに好適な用量は、これに限定されるものではないが、患者当たり約１０ｎｇ～１ｇ、１００ｎｇ～１００ｍｇ、１マイクログラム～１０マイクログラム、又は３０～３００マイクログラムのｍＲＮＡの範囲であり得る。一実施形態では、組成物は、それに応じて、１回用量、２回用量、３回用量、又は更に多くの用量を含むように製剤化される。
【0140】
ＨＶＣ Ｅ２をコードする核酸分子の静脈内投与に好適な投薬量範囲は、概して約０．００１～１０マイクログラムの核酸である。鼻腔内投与に好適な投薬量範囲は、概して、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から推定することができる。坐剤は、概して、０．５重量％～１０重量％の範囲の活性成分を含有し、経口組成物は、好ましくは、１０％～９５％の活性成分を含有する。
【0141】
いくつかの態様では、核酸ワクチンの投与及び／又はブースター投与は、繰り返されてもよく、かかる投与は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、例えば１～５日、１～１０日、５～１５日、１０～２０日、１５～２５日、２０～３０日、２５～３５日、３０～５０日、４０～６０日、５０～７０日、１～７５日、又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月、１年、２年、３年、５年、１０年、１５年、２０年、３０年、４０年、５０年、６０年、又はそれ以上、隔ててもよい。特定の態様では、本発明のワクチンは、対象に単回用量として年に１回投与され得る。
【0142】
特定の態様では、核酸ワクチンは、直接的な抗ウイルス薬治療の投与前に、例えば、抗ウイルス薬療法の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、例えば１～５日、１～１０日、５～１５日、１０～２０日、１５～２５日、２０～３０日、２５～３５日、３０～５０日、４０～６０日、５０～７０日、１～７５日、又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月前に、感染した対象に少なくとも１回、好ましくは２回以上投与され得る。次いで、第２の又は更なる用量は、治療の前に、治療と同時に又は治療の後に直接投与され得る。
【0143】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン又は組成物は、その存在が、感染性Ｃ型肝炎ウイルスの少なくとも１つの株に対する少なくとも１つの一次又は二次体液性応答を増強するか、又はその増強を示すレシピエント患者の生理学における検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に有意である。ワクチン組成物は、ウイルス感染症から保護するために投与される。「保護」は絶対的である必要はなく、すなわち、対照集団又は患者のセットと比較して統計学的に有意な改善がある場合、Ｃ型肝炎感染症を完全に予防又は根絶する必要はない。保護は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の症状の発症の重症度又は急速さを低減することに限定されてもよい。
【0144】
一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、感染症の発症前（予想される感染症を予防又は減弱させるため）又は感染症の開始後のいずれかに対象に提供され、それによってウイルス感染症から保護される。いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物は、対象間のウイルス伝染を低減させるために、感染症の発症の前又は後に対象に提供される。
【0145】
本発明の組成物は、唯一の活性薬剤として投与され得るか、又は１つ以上の薬剤と組み合わせて使用して、Ｃ型肝炎感染症又はＨＣＶ感染症に関連する症状を治療又は予防することができることが更に理解されるであろう。本発明の組成物又は組成物の組み合わせと組み合わせて投与される他の薬剤は、ＨＣＶ感染症によって引き起こされる疾患のための療法、又は直接的若しくは間接的な機序によってＨＣＶウイルス複製を抑制する療法を含む。これらの薬剤には、宿主免疫調節剤（例えば、インターフェロンアルファ、ＰＥＧ化インターフェロンアルファ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）；イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼなどの宿主細胞機能を阻害する抗ウイルス化合物（例えば、リバビリンなど）；免疫機能を調節するサイトカイン（例えば、インターロイキン２、インターロイキン６、及びインターロイキン１２）；１型ヘルパーＴ細胞応答の発達を増強する化合物；干渉ＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；ＨＣＶ抗原又はＨＣＶに対して指向された抗原アジュバントの組み合わせを含むワクチン；宿主細胞成分と相互作用して、ＨＣＶウイルス複製の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）開始翻訳ステップを阻害することによってウイルスタンパク質合成を遮断するか、又は膜タンパク質のビロポリンファミリーを標的とする薬剤でウイルス粒子の成熟及び放出を遮断する、薬剤、例えば、ＨＣＶ Ｐ７など；並びに、ＮＳ３ ＮＳ４Ａプロテアーゼ、ＮＳ３ヘリカーゼ、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ、ＮＳ４Ａタンパク質、及びＮＳ５Ａタンパク質の阻害剤など、ウイルス複製に関与するウイルスゲノムの他のタンパク質を標的とすることによってＨＣＶの複製を阻害し、及び／又は他のウイルス標的の機能を妨害する任意の薬剤又は薬剤の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0146】
更に別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼ、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むがこれらに限定されない、ＨＣＶライフサイクルにおける標的の他の阻害剤を更に含み得る。
【0147】
投与は、概して、機能的Ｅ２特異的抗体の生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下である。免疫原性組成物は、肺、経口、静脈内（水溶性である場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内、若しくは坐剤経路、又は移植（例えば、徐放、製剤を使用する）などの好都合な方法で投与され得る。投与は、全身又は局所であってもよいが、全身の方が好都合である。他の企図される投与経路は、パッチ、細胞移植、インプラント、舌下、眼内、局所、経口、直腸、膣、経鼻、又は経皮によるものである。投与は、インビボ又はエクスビボ、インビトロであり得る。エレクトロポレーション、遺伝子ガン、超音波又は高圧注射を利用する方法を、例えば、細胞へのヌクレオチドの直接送達のために適用し得る。
【0148】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗体を作製し、組成物に対する免疫を発達させることを含む、本発明の組成物の存在に対する身体全体の反応を指す。したがって、抗原に対する免疫応答はまた、目的の抗原に対する体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答の対象における発達も含む。「体液性免疫応答」は、形質細胞によって産生された抗体によって媒介される。「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球によって媒介される免疫応答である。
【0149】
本発明の実施形態はまた、組成物に対する機能的免疫応答を評価するためのアッセイを提供する。アッセイは、抗体応答及び遅延型過感受性応答を測定するアッセイなどのインビボアッセイを含み得る。一実施形態では、抗体応答を測定するためのアッセイは、主にＢ細胞機能及びＢ細胞／Ｔ細胞相互作用を測定し得る。抗体応答アッセイについて、血液中の抗体力価は、抗原性チャレンジ後に比較され得る。これらのレベルは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのような抗体の型に従って定量され得る。また、抗原刺激なしの血液中の抗体及びリンパ球のレベルを決定することによって、免疫系の発達を評価し得る。
【0150】
また、一実施形態では、表現型細胞アッセイを実施して、特定の細胞型の頻度を決定し得る。末梢血液細胞計数は、血液中のリンパ球又はマクロファージの数を決定するために実施され得る。ＣＤ４細胞数及びＣＤ４／ＣＤ８比を決定する非限定的な例として、抗体を使用して末梢血リンパ球をスクリーニングして、特定の抗原を発現する細胞のパーセントを決定し得る。
【0151】
これらの実施形態によれば、組成物は、概して、Ｅ２特異的抗体又は機能的免疫応答、補体活性化、食作用及び細胞傷害性などの生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下で投与される。本発明の組成物は、単回用量又は適用として投与され得る。代替的には、組成物は、反復投与又は適用を伴ってもよく、例えば、組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回又はそれよりも多く投与され得る。複数の投与は、２ヶ月以上の間隔又はより頻繁に投与され得る。
【0152】
「薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤」は、その他の点で望ましくないものではない、すなわち、それ自体又は活性組成物との実質的な有害反応を引き起こす可能性が低い材料からなる薬学的ビヒクルである。担体は、全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、張性を調整する、吸収率又は除去率の増加又は減少するための薬剤、ｐＨを維持するための緩衝剤、キレート剤、膜又はバリア横断剤を含み得る。薬学的に許容される塩は、その他の点で望ましくないものではない塩である。薬剤又は薬剤を含む組成物は、酸付加塩又は金属錯体などの薬学的に許容される非毒性塩の形態で投与され得る。
【0153】
経口投与のために、組成物は、カプセル、丸薬、錠剤、ロゼンジ、粉末、懸濁液、又はエマルジョンなどの固体又は液体製剤に製剤化され得る。経口剤形の組成物の調製では、経口液体調製物（例えば、懸濁液、エリキシル剤、及び溶液など）の場合は、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤、懸濁化剤、又は経口固体調製物（例えば、粉末、カプセル、及び錠剤など）の場合は、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体などの通常の医薬媒体のうちのいずれかを用いてもよい。錠剤及びカプセルは、それらの投与の容易さのために、最も有利な単位経口剤形を表し、その場合、固体薬学的担体が明らかに用いられる。錠剤は、トラガカント、トウモロコシデンプン若しくはゼラチンなどの結合剤、アルギン酸などの崩壊剤、及びステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含有し得る。所望の場合、錠剤は、標準的な技法によって糖コーティング又は腸溶性コーティングされ得る。活性組成物は、消化管を通過するのを安定させるために封入され得る。例えば、国際特許出願公開第９６／１１６９８号を参照されたい。
【0154】
非経口投与の場合、組成物は担体に溶解され、溶液又は懸濁液として投与され得る。経粘膜又は経皮（パッチを含む）送達の場合、組成物を送達するために当該技術分野で既知の適切な浸透剤が使用される。吸入の場合、乾燥粉末エアロゾル、液体送達系、エアジェットネブライザー、推進剤系などの任意の好都合な系を使用する。例えば、製剤は、エアロゾル又はミストの形態で投与され得る。組成物はまた、持続送達又は持続放出形式で送達され得る。例えば、生分解性微粒子若しくはカプセル、又は持続的送達が可能な他のポリマー構成が製剤に含まれ得る。製剤は、薬物動態及び生体分布を変化させるように修飾され得る。薬物動態学の一般的な議論については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎのもの（上記）を参照されたい。いくつかの実施形態では、製剤は、リポソーム又はミセルなどの脂質単層又は二重層に組み込まれ得る。当該技術分野で既知の標的療法を使用して、薬剤をより特異的に特定の種類の細胞又は組織に送達し得る。
【0155】
投与される活性剤の実際の量、及び投与の速度及び時間経過は、疾患の性質及び重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば、投薬量、タイミングなどの決定は一般医師又は専門医の責任の範囲内であり、典型的には、個々の患者の状態、送達部位、投与の方法、及び医師に既知の他の因子を考慮に入れる。技法及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎのもの（上記）において見出され得る。
【0156】
調製され得る持続放出製剤は、免疫応答を誘導するのに特に好都合である。持続放出製剤の例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、マトリックスは成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸及びエチル－Ｌ－グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、並びにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日超の間分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。脂質含有量が約３０％超のコレステロールであり、選択された割合は最適な療法のために調整される、小さい（約２００～８００オングストローム）単層型のリポソームが使用され得る。
【0157】
別の態様では、本発明は、ＨＣＶの可変ドメイン欠失Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、キットを提供する。本発明のキット又は基質は、診断、予後、治療又は予防の用途で使用するため、並びにＨＣＶ Ｅ２結合分子又はＨＣＶ受容体結合分子の設計及び／又はスクリーニングで使用するために企図されている。
【0158】
一実施形態では、本出願は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター内で、又はそれらに付着した主題の核酸分子を産生する方法を提供し、本方法は、主題の核酸分子又はそれらの相補配列を好適なウイルスベクター又は非ウイルスベクターに付着又は組み込むことを含む。ベクターは、使用前に保管又は凍結されてもよく、又は使用の取扱説明書とともにキットに組み込まれてもよい。
【0159】
ポリペプチドの「バリアント」は、参照配列と比較した場合、置換、好ましくは保存的置換のアミノ酸を含み得る（例えば、１～２５、特に１～１０、及び特に１個などの１～５０個のアミノ酸残基変化し得る）。好適には、かかる置換は、エピトープの領域では生じず、したがって、抗原の免疫原性の特性に重大な影響を及ぼさない。「保存的アミノ酸置換」という用語は、１つのかかる群に由来するアミノ酸の、同じ群に由来する異なるアミノ酸での（概念的に、又はその他での）置換を指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義するための機能的方法は、相同性生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｎｎｅｒ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ）。かかる分析によれば、アミノ酸の群は、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換し、したがって、タンパク質構造全体への影響において互いに最も類似している場合に定義され得る。この方法で定義されるアミノ酸の群のセットの一例としては、（ｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる荷電の群、（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる正荷電の群、（ｉｉｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる負荷電の群、（ｉｖ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる芳香族の群、（ｖ）Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる窒素環の群、（ｖｉ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＨｅからなる大脂肪族非極性の群、（ｖｉｉ）Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる微極性の群、（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ及びＰｒｏからなる小さな残基の群、（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる脂肪性の群、並びに（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる小さなヒドロキシルの群が挙げられる。タンパク質バリアントはまた、参照配列と比較して追加のアミノ酸が挿入されるものも含み得、例えば、かかる挿入は、１～１０個の位置（１～５個の位置、好適には１個の位置又は２個の位置、特に１個の位置など）で生じ得、例えば、各位置で５０個以下（２０個以下、特に１０個以下、特に５個以下など）のアミノ酸の付加を伴い得る。好適には、かかる挿入は、エピトープの領域では生じず、したがって、抗原の免疫原性の特性に重大な影響を及ぼさない。バリアントにはまた、参照配列と比較してアミノ酸が欠失しているものも含まれ、例えば、かかる欠失は、１～１０個の位置（１～５個の位置、好適には１個の位置又は２個の位置、特に１個の位置など）で生じ得、例えば、各位置で５０個以下（２０個以下、特に１０個以下、特に５個以下など）のアミノ酸の欠失を伴い得る。好適には、かかる欠失は、エピトープの領域では生じず、したがって、抗原の免疫原性の特性に重大な影響を及ぼさない。当業者は、特定のタンパク質バリアントが、置換、欠失、及び付加（又はそれらの任意の組み合わせ）を含み得ることを認識するであろう。バリアントは、好ましくは、関連する参照配列と少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、及び最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性（少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％など）を示す。配列同一性及び配列類似性パーセントを判定するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌに記載されている。
【0160】
本明細書は、図及び図の凡例と併せて読まれる以下の情報によって更に例示される。
【0161】
実施例１
免疫化の略図及びこの研究で使用した動物群を図１に提供する。１２匹の群の８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ６マウスを、以下のいずれかで免疫化した。（群１）０日目（ｄ０）に、１０８Ｉ．Ｕ．の遺伝子型１ａ Ｅ２ Ｄ１２３配列（図１６も参照されたい）の遺伝子をコードするチンパンジーアデノウイルス１で免疫化、続くｄ２６及びｄ４６に同じものでのブースト、又は（群２）０日目、２６日目及び４６日目に２０ｕｇの可溶性の精製された高分子量Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質、又は（群３）動物に、０日目に、１０８Ｉ．Ｕ．の遺伝子型１ａ Ｅ２ Ｄ１２３配列の遺伝子をコードするチンパンジーアデノウイルス１でプライムを与え、続いて２６日目及び４６日目に２０ｕｇの可溶性の精製された高分子量Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質のブーストを与えたプライムブーストプロトコル。５６日目に全ての動物を屠殺し、血液及び脾臓を採取した。
免疫化の略図及びこの研究で使用した動物群を図１に提供する。１２匹の群の８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ６マウスを、以下のいずれかで免疫化した。（群１）０日目（ｄ０）に、１０８Ｉ．Ｕ．の遺伝子型１ａ Ｅ２ Ｄ１２３配列（図１６も参照されたい）の遺伝子をコードするチンパンジーアデノウイルス１で免疫化、続くｄ２６及びｄ４６に同じものでのブースト、又は（群２）０日目、２６日目及び４６日目に２０ｕｇの可溶性の精製された高分子量Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質、又は（群３）動物に、０日目に、１０８Ｉ．Ｕ．の遺伝子型１ａ Ｅ２ Ｄ１２３配列の遺伝子をコードするチンパンジーアデノウイルス１でプライムを与え、続いて２６日目及び４６日目に２０ｕｇの可溶性の精製された高分子量Ｅ２ Ｄ１２３タンパク質のブーストを与えたプライムブーストプロトコル。５６日目に全ての動物を屠殺し、血液及び脾臓を採取した。
【0162】
３週目（ｗｋ）（プライム後）、６週目（プライム後及び１回のブースト）及び８週目（プライム後及び２回のブースト）の単量体Ｄ１２３タンパク質に対する相互抗体力価を、図２に示す。相互希釈は、１２ポイントの希釈曲線から１０倍のバックグラウンドを与えるのに必要な血清の希釈として計算された。多重比較の一元配置Ｋｒｕｓｋａｌ－ｗａｌｌｉｓ検定を使用してデータを分析した。この図において、データを、各プロトコル内で生成された相対的抗体力価を経時的に比較するために、群別に配置した。データは、抗体力価が８週目でピークに達し、３週目（第２及び３群）又は６週目（第１群）での抗体力価よりも有意に高かったことを示す。
【0163】
図３は、３週目（ｗｋ）（プライム後）、６週目（プライム後及び１回のブースト）及び８週目（プライム後及び２回のブースト）の単量体Ｄ１２３タンパク質に対する相互抗体力価を示す。相互希釈は、１２ポイントの希釈曲線から１０倍のバックグラウンドを与えるのに必要な血清の希釈として計算された。多重比較の一元配置Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を使用してデータを分析した。この図において、データを、所与の時点での各ワクチン接種プロトコルによって生成された相対的抗体力価を比較するために、週別に配置した。データは、３週目で、タンパク質単独を受けた動物（群２）が、群１及び３と比較して有意に低い抗体力価を有したことを示している。６週目及び８週目では、ＣｈＡｄ－Ｄ１２３単独を受けた動物（群１）は、タンパク質単独（群２）又はウイルスプライム、タンパク質ブースト（ｘ２）（群３）を受けた動物と比較して、有意に低い抗体力価を有した。ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３での３回のワクチン接種を受けた動物は、６週目及び８週目に最も低い抗体力価を有した。
【0164】
図４は、５６日目に得られた血清の単量体Ｅ２Ｄ１２３タンパク質に対する希釈曲線を示す。データは、ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３プライム（群１及び３）が、３回のタンパク質ワクチン接種（群２）と比較して異なる滴定曲線を生成することを示す。しかしながら、ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３プライム／ブースト（群１）及びＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３プライムに続くタンパク質ブースト（群３）は、動物においてより均一な抗体応答を生成した。
【0165】
図５は、単量体Ｄ１２３タンパク質に対する５６日目の血清の相互抗体力価を示す。データは、ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３での３回のワクチン接種を受けた動物が、タンパク質のみ又はＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３プライム及び２つのタンパク質ブーストをそれぞれ受けた群２及び３の動物よりも有意に低い抗体力価を生成したことを示している。
【0166】
図６は、組換えＣＤ８１タンパク質の完全なままのＥ２受容体結合ドメインへの結合を（Ａ）５０％又は（Ｂ）８０％阻害するために必要な抗体の相互希釈を示す。データは、３回のＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスワクチン接種を受け、Ｅ２ Ｄ１２３への反応性の総抗体の最も低い力価を誘発した群１にもかかわらず、その細胞受容体ＣＤ８１へのＥ２結合を防止することができる機能的抗体の総量は、３回のタンパク質ワクチン接種を受け、ほぼ１００倍の抗体を生成した群２と相当であったことを示している。Ｅ２がその細胞受容体ＣＤ８１に結合することを防止することができる機能的抗体の最も高い力価を生成した群は、１回のＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスプライム、続く２回のタンパク質ブーストを受けた群３であった。この態様の方法は、例えば、Ｖｉｅｔｈｅｅｒ，Ｐ．Ｔ．；Ｂｏｏ，Ｉ．；Ｇｕ，Ｊ．；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｋ．；Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．；Ｏｗｃｚａｒｅｋ，Ｃ．；Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｐ．；Ｆａｂｒｉ，Ｌ．；Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．；Ｐｏｕｍｂｏｕｒｉｏｓ，Ｐ．；Ｄｒｕｍｍｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ２ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１７，６５，（４），１１１７－１１３１に記載されている。
加えて、免疫応答の変動は、３回のタンパク質ワクチン接種（群２）を受けた動物（それぞれ、７５～４７０ｃ．ｗ．０．１５～１１１の範囲）と比較して、ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスプライム、続く２回のタンパク質ブーストにおいて小さかった。
加えて、免疫応答の変動は、３回のタンパク質ワクチン接種（群２）を受けた動物（それぞれ、７５～４７０ｃ．ｗ．０．１５～１１１の範囲）と比較して、ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスプライム、続く２回のタンパク質ブーストにおいて小さかった。
【0167】
図７は、アミノ酸４０８～４２８を含む合成ペプチドに対して指向された抗体の相互力価を示す。この合成ペプチドは、ＨＣＶ１、ＭＡｂ２４、及び他のｂＮＡｂによって認識される非常に重要な広域中和抗体（ｂＮＡｂ）エピトープにわたる。結果は、全てのワクチン接種スケジュールが、このペプチドに反応する抗体を生成し、３回のタンパク質ワクチン接種（第２群）又はＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスプライム、続く２回のタンパク質ブースト（第３群）のいずれかを受けた動物において観察された最も高い力価を示し、これらは互いに有意に異なるものではなかった。
【0168】
図８は、アミノ酸４３０～４５１を含む合成ペプチドに対して指向された抗体の相互力価を示す。この合成ペプチドは、ＨＣＶ８４．１及びＨＣＶ８４．２７、並びに他のｂＮＡｂによって認識される非常に重要なｂＮＡｂエピトープにわたる。結果は、全てのワクチン接種スケジュールが、このペプチドに反応する抗体を生成し、３回のタンパク質ワクチン接種（第２群）又はＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスプライム、続く２回のタンパク質ブースト（第３群）のいずれかを受けた動物において観察された最も高い力価を示し、これらは互いに有意に異なるものではなかった。
【0169】
図９は、アミノ酸５２３～５４９を含む合成ペプチドに対して指向された抗体の相互力価を示す。この合成ペプチドは、ＭＡｂ４４及び他のＮＡｂによって認識され、ＣＤ８１結合ループを構成する、非常に重要な中和抗体（ＮＡｂ）エピトープにわたる。結果は、全てのワクチン接種スケジュールが、このペプチドに反応する抗体を生成し、３回のタンパク質ワクチン接種（第２群）又はＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスプライム、続く２回のタンパク質ブースト（第３群）のいずれかを受けた動物において観察された最も高い力価を示し、これらは互いに有意に異なるものではなかった。
【0170】
図１０は、５６日目の免疫血清の相同中和力価を示す。このデータは、中和抗体が産生され、ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ウイルスプライム、続く２回のタンパク質ブーストを受けた群３で最も生成され、これが群１及び２で観察される応答よりも有意に高かったことを示す。
【0171】
図１１は、遺伝子型３ａウイルスに対する５６日目の免疫血清の異種中和力価を示す。データは、中和抗体が産生され、３つの群全てにおいて類似していることを示す。これは、低い抗体力価が群１によって生成されたが、タンパク質のみ又はウイルスプライムタンパク質ブーストスケジュールと同じ量の機能的抗体を作るように見えることを考えると驚くべきことである。
【0172】
図１２は、遺伝子型５ａウイルスに対する５６日目の免疫血清の異種中和力価を示す。データは、中和抗体が産生され、３つの群全てにおいて類似していることを示す。これは、低い抗体力価が群１によって生成されたが、タンパク質のみ又はウイルスプライムタンパク質ブーストスケジュールと同じ量の機能的抗体を作るように見えることを考えると驚くべきことである。
【0173】
図１３は、ワクチン接種スケジュールの各々において生成された抗体のアイソタイプを示す。ＩｇＧ１は、全てのワクチンによって生成された優性アイソタイプであり、続いてＩｇＧ２ｂであった。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３及びＩｇＭは、少数派のアイソタイプであった。生成された各アイソタイプの割合を比較すると、データは、３回のワクチン接種全て（群１）、又はプライムのみ（群３）のいずれかにおけるＣｈＡｄウイルスでのワクチン接種が、タンパク質ワクチン接種単独（群２）よりも高い割合のＩｇＧ２ａ、３及びＭを生成したことを示す。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、補体のより強力な活性化因子であり、これはウイルス除去を助け得る。パーセンテージとして、ＩｇＧ３は非常に小さい。それは第２群より多い。
【0174】
【0175】
図１５は、各ワクチン接種レジメンで生成された各アイソタイプのパーセンテージを比較する。データは、ＣｈＡｄワクチンでプライムとして、続く２回のタンパク質ブーストでＤ１２３を受けた動物（群３）、又はＣｈＡｄとして３回全てのワクチン接種を受けた動物（群１）と比較して、３回全てのワクチン接種で可溶性ＨＭＷＤ１２３でワクチン接種された動物（群２）において産生されたＩｇＧ１が、有意に多かったことを示している。ＣｈＡｄとして３回全てのワクチン接種を受けた（群１）、又はＣｈＡｄ－Ｄ１２３でのプライム、続く２回のタンパク質ブーストを受けた（群３）動物よりも
可溶性ＨＭＷＤ１２３タンパク質で３回のワクチン接種を受けた動物（群２）において、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは、有意に少なかった。可溶性ＨＭＷＤ１２３（群２）で３回のワクチン接種を受けた動物は、３回のＣｈＡｄ－Ｄ１２３ワクチン接種を受けた動物（群１）と比較して、ＩｇＧ３が有意に少なかった。
可溶性ＨＭＷＤ１２３タンパク質で３回のワクチン接種を受けた動物（群２）において、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは、有意に少なかった。可溶性ＨＭＷＤ１２３（群２）で３回のワクチン接種を受けた動物は、３回のＣｈＡｄ－Ｄ１２３ワクチン接種を受けた動物（群１）と比較して、ＩｇＧ３が有意に少なかった。
【0176】
図１６は、例示のみを目的として、この研究において使用されるＨＣＶ Ｄ１２３ Ｅ２のタンパク質及びＤＮＡ配列を示す。
【0177】
実施例２
生成されたデータは、ＣｈＡｄＤ１２３でワクチン接種し、次いで２つのタンパク質ブーストした動物における交差反応性抗体特異性の生成（図１７）、並びにＣｈＡｄＤ１２３で３回のワクチン接種を受けた動物におけるより高いレベルの機能的抗体（図１９）の更なる証拠を提供する。また、データは、Ｂ細胞応答の成熟を示すクラススイッチングの証拠を提供する。ＣｈＡｄ－Ｄ１２３は、タンパク質ワクチン接種単独に対して異なるクラススイッチングを誘導するようであり、これは中和と相関する（図１８）。
生成されたデータは、ＣｈＡｄＤ１２３でワクチン接種し、次いで２つのタンパク質ブーストした動物における交差反応性抗体特異性の生成（図１７）、並びにＣｈＡｄＤ１２３で３回のワクチン接種を受けた動物におけるより高いレベルの機能的抗体（図１９）の更なる証拠を提供する。また、データは、Ｂ細胞応答の成熟を示すクラススイッチングの証拠を提供する。ＣｈＡｄ－Ｄ１２３は、タンパク質ワクチン接種単独に対して異なるクラススイッチングを誘導するようであり、これは中和と相関する（図１８）。
【0178】
図１７は、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ又はＣｈＡｄＯｘ１）内にコードされたＤ１２３でワクチン接種され（群１）、同じものでブーストされた、又は高分子量可溶性タンパク質及び同じものでブーストされた場合（群２）、又はチンパンジーアデノウイルス内にコードされたＤ１２３でのプライム、及び高分子量可溶性タンパク質でブーストされた（群３）動物において生成されたＨＣＶ Ｅ２の遺伝子型３ａ（Ｓ５２分離株）の４０８～４２８エピトープＩ領域、４３０～４５１エピトープＩＩ領域、及び５２３～５４９ＣＤ８１結合ループ領域（エピトープＩＩＩ）に対する５６日目の交差反応性抗体力価を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、ＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３でのプライム、続くＨＭＷ Ｅ２Ｄ１２３での２回のタンパク質ブーストが、３回のＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３ワクチン接種と比較して、エピトープＩ及びＩＩＩに対する交差反応性抗体のより高い力価を生成することを示す。ウイルスベクターを作製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、ｖｏｎ Ｄｅｌｆｔ，Ａ．；Ｄｏｎｎｉｓｏｎ，Ｔ．Ａ．；Ｌｏｕｒｅｎｃｏ，Ｊ．；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，Ｃ．；Ｍｕｌｌａｒｋｅｙ，Ｃ．Ｅ．；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．；Ｐｙｂｕｓ，Ｏ．Ｇ．；Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｐ．；Ｃｈｉｎｎａｋａｎｎａｎ，Ｓ．；Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．，Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｍｉａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｅｄ ＨＣＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＣＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１８，３６，（２），３１３－３２１において提供される。
【0179】
図１８は、ＩｇＧ１力価の関数として計算され、ＩｇＧ１ ｌｏｇ１０力価をＩｇＧ２ａ ｌｏｇ１０力価で割ったもの（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）として表示される免疫血清のＩｇＧ２ａ力価を示す。力価が低いほど、ＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１比は１：１に近くなり、ＩｇＧ１のＩｇＧ２ａへのクラススイッチングを示す。相互力価（１／ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ）を、Ｃ／Ｐ／Ｐ及びＰ／Ｐを受けた動物由来の免疫血清のＨＣＶｐｐ ＩＤ５０力価に対してプロットし、任意の相関を決定した。全てのバーは中央値であり、四分位範囲が表示されている。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ及びＰｅａｒｓｏｎ検定を使用して、データ分布の正規性を決定し、複数の比較を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを実施して、９５％信頼区間での２つの群中央値間の有意差を決定した。Ｐ値は、＜０．０５＊、＜０．０１＊＊、＜０．００１＊＊＊、＜０．０００１＊＊＊＊の場合、群間の有意差を示す。ＩｇＧ２ａがＩｇＧ１力価の関数として（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）発現された場合、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３免疫血清（群１及び群３）は、Ｅ２Δ１２３ＨＭＷ免疫血清と比較して、有意に低い相互力価を有し、ＧＣクラススイッチングの増加を示した（群１対群２について、ｐ＜０．０００１＊＊＊＊、群２対群３について、ｐ＝０．００１４＊＊）。Ｅ２Δ１２３ＨＭＷ免疫血清（群２及び３を合わせたもの）について、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの相互力価は、ＨＣＶｐｐ中和力価と正の相関がある（ｒ＝０．３９７４、ｐ＝０．０４９２）。
【0180】
図１９は、機能的抗体指数を示した、全体のＡｂ力価の関数としての免疫血清の相互ＩＤ５０阻害力価を示す。機能的抗体指数を、ＣＤ８１遮断として示されるＥ２－ＣＤ８１阻害の両方について計算した。機能的抗体指数を、中和として示される相同偽型ウイルスのウイルス侵入の阻害について計算した。相互ＩＤ５０力価（ＣＤ８１阻害及びＨＣＶｐｐ）が全体のＡｂ力価（機能的抗体指標）と関連して解釈される場合、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３免疫血清（群１及び３）は、Ｅ２Δ１２３ＨＭＷ免疫血清と比較して有意に高い機能的指標を有し、総Ａｂ力価に対して、ワクチンで誘導されたＡｂ応答の中和能力が高いことを示した。
【0181】
実施例３－ＨＣＶ Ｄ１２３ Ｅ２はまた、ＭＶＡウイルスベクターにおける免疫化のために成功裏に送達され得る。
図２０は、Ｅ２Ｄ１２３の発現を駆動するために使用されるウイルスベクターの概略図を示す。Ａ．ＣｈＡｄＯｘ１中のＤ１２３の発現カセットの概略図。Ｂ．ＣｈＡｄＯｘ１中のＲＢＤの発現カセットの概略図。Ｃ．ＭＶＡ中のＤ１２３の発現カセットの概略図。これらの発現系は、例示的であり、バリエーションは当該技術分野において既知である。当該技術分野で既知のように、誘導性発現系も用いられ得る。例示的な方法は、ｖｏｎ Ｄｅｌｆｔ，Ａ．；Ｄｏｎｎｉｓｏｎ，Ｔ．Ａ．；Ｌｏｕｒｅｎｃｏ，Ｊ．；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，Ｃ．；Ｍｕｌｌａｒｋｅｙ，Ｃ．Ｅ．；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．；Ｐｙｂｕｓ，Ｏ．Ｇ．；Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｐ．；Ｃｈｉｎｎａｋａｎｎａｎ，Ｓ．；Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．，Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｍｉａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｅｄ ＨＣＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＣＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１８，３６，（２），３１３－３２１、及びＳｗａｄｌｉｎｇ，Ｌ．；Ｃａｐｏｎｅ，Ｓ．；Ａｎｔｒｏｂｕｓ，Ｒ．Ｄ．；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．；Ｎｅｗｅｌｌ，Ｅ．Ｗ．；Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｊ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．；Ｂｏｗｅｎ，Ｄ．；Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ，Ｊ．；Ｋｕｒｉｏｋａ，Ａ．；Ａｍｍｅｎｄｏｌａ，Ｖ．；ＤｅｌＳｏｒｂｏ，Ｍ．；Ｇｒａｚｉｏｌｉ，Ｆ．；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｍ．Ｌ．；Ｓｉａｎｉ，Ｌ．；Ｔｒａｂｏｎｉ，Ｃ．；Ｈｉｌｌ，Ａ．；Ｃｏｌｌｏｃａ，Ｓ．；Ｄａｖｉｓ，Ｍ．；Ｎｉｃｏｓｉａ，Ａ．；Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．；Ｆｏｌｇｏｒｉ，Ａ．；Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｐ．；Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．，Ａ ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ａｎｄ ＭＶＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｐｒｉｍｅｓ，ｂｏｏｓｔｓ，ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＨＣＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１４，６，（２６１），２６１ｒａ１５３を含む、当該技術分野で提供される。
図２０は、Ｅ２Ｄ１２３の発現を駆動するために使用されるウイルスベクターの概略図を示す。Ａ．ＣｈＡｄＯｘ１中のＤ１２３の発現カセットの概略図。Ｂ．ＣｈＡｄＯｘ１中のＲＢＤの発現カセットの概略図。Ｃ．ＭＶＡ中のＤ１２３の発現カセットの概略図。これらの発現系は、例示的であり、バリエーションは当該技術分野において既知である。当該技術分野で既知のように、誘導性発現系も用いられ得る。例示的な方法は、ｖｏｎ Ｄｅｌｆｔ，Ａ．；Ｄｏｎｎｉｓｏｎ，Ｔ．Ａ．；Ｌｏｕｒｅｎｃｏ，Ｊ．；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，Ｃ．；Ｍｕｌｌａｒｋｅｙ，Ｃ．Ｅ．；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．；Ｐｙｂｕｓ，Ｏ．Ｇ．；Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｐ．；Ｃｈｉｎｎａｋａｎｎａｎ，Ｓ．；Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．，Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｍｉａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｅｄ ＨＣＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＣＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１８，３６，（２），３１３－３２１、及びＳｗａｄｌｉｎｇ，Ｌ．；Ｃａｐｏｎｅ，Ｓ．；Ａｎｔｒｏｂｕｓ，Ｒ．Ｄ．；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．；Ｎｅｗｅｌｌ，Ｅ．Ｗ．；Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｊ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．；Ｂｏｗｅｎ，Ｄ．；Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ，Ｊ．；Ｋｕｒｉｏｋａ，Ａ．；Ａｍｍｅｎｄｏｌａ，Ｖ．；ＤｅｌＳｏｒｂｏ，Ｍ．；Ｇｒａｚｉｏｌｉ，Ｆ．；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｍ．Ｌ．；Ｓｉａｎｉ，Ｌ．；Ｔｒａｂｏｎｉ，Ｃ．；Ｈｉｌｌ，Ａ．；Ｃｏｌｌｏｃａ，Ｓ．；Ｄａｖｉｓ，Ｍ．；Ｎｉｃｏｓｉａ，Ａ．；Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．；Ｆｏｌｇｏｒｉ，Ａ．；Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｐ．；Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．，Ａ ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ａｎｄ ＭＶＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｐｒｉｍｅｓ，ｂｏｏｓｔｓ，ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＨＣＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１４，６，（２６１），２６１ｒａ１５３を含む、当該技術分野で提供される。
【0182】
図２１は、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３プライム、続く４週目のＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３ブーストを受けた動物の免疫化スケジュールを示す。ブーストの２週間後に動物を出血させ、抗体及びＴ細胞反応性を測定した。動物に、０週目のＣｈＡｄ－Ｅ２Ｄ１２３プライム（４０ｕＬの滅菌ＰＢＳ中、１０８感染単位［ＩＵ］）、続く４週目のＭＶＡ－Ｅ２Ｄ１２３（４０ｕＬの滅菌ＰＢＳ中、１０７プラーク形成単位［ＰＦＵ］）を投与した。
【0183】
図２２Ａは、図２１示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３での免疫化に対して惹起した免疫血清の反応性を示す。誤解を避けるために、デルタ記号「Δ」又は「Ｄｅｌｔａ」という単語は、「欠失」を指すために互換的に使用される。免疫血清を、Ｅ２Δ１２３単量体に対してＥＬＩＳＡにおいて評価した。免疫血清の連続希釈液をＥ２Δ１２３単量体コーティングプレートに適用し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウス免疫グロブリン及びＴＭＤ基質で結合された抗体を検出した。バックグラウンド結合の１０倍を達成するために必要な相互力価を計算した。結果は、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３がＥ２に対して高い力価抗体反応性を生成することを示す。図２２Ｂは、５６日目に生成された免疫血清がＨＣＶ細胞受容体ＣＤ８１とＥ２受容体結合ドメインとの間の相互作用を阻害する能力を示す。免疫血清がＥ２のＣＤ８１への結合を５０％阻害する能力を連続希釈曲線から計算した。結果は、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３が、相同Ｅ２とＣＤ８１との間の結合を阻害することができる高力価抗体を生成することを示す。
【0184】
図２３Ａは、図２１示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３での免疫化に対して惹起した免疫血清の、ＡＳ４１２（Ｅ２４０８－４２８）、ＡＳ４３４（Ｅ２４３０－４５１）、ＣＤ８１結合ループ（Ｅ２５２３－５４９）への反応性を示す。バックグラウンド結合の１０倍を達成するために必要な相互力価を連続希釈曲線から計算した。結果は、全ての動物が、広域中和抗体の標的である３つの異なるエピトープに結合することができる抗体を生成したことを示す。図２３Ｂは、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３を惹起した免疫血清（図２１）の相同（Ｇ１ａ）及び異種（Ｇ３ａ）中和力価を示す。５０％のウイルス侵入を阻害するために必要な免疫血清の相互力価を連続希釈曲線から計算した。結果は、７／１０の動物が、Ｈｕｈ７細胞株への相同遺伝子型１ａのＣ型肝炎ウイルスの侵入を防止することができる抗体を生成し、６／１０の動物が、異種遺伝子型３ａウイルスのＨｕｈ７肝臓細胞株への侵入を防止することができる抗体を生成したことを示す。検出限界は点線で示されている。遺伝子型３ａに対する交差中和抗体応答は、ＡＳ４１２（Ｅ２４０８－４２８）、ＡＳ４３４（Ｅ２４３０－４５１）、ＣＤ８１結合ループ（Ｅ２５２３－５４９）に対する交差反応抗体が、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３で動物にワクチン接種することによって生成されたという観察と一致する。
【0185】
図２４は、図２１に示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３で免疫化したマウスにおけるＴ細胞応答を示す。脾細胞を６週目に採取し、ＨＣＶプロテオーム（Ａ及びＣ）の長さ及びペプチドプール（Ｂ及びＤ）についてカバーするＨＣＶペプチド（１１ａａ重複する１５ｍｅｒ）を使用してエクスビボで刺激した。ｇｔ－１ａ（Ｈ７７）、ｇｔ－１ｂ（Ｊ４）、又はｇｔ－３ａ（ｋ３ａ６５０）について、Ｃｏｒｅ－Ｅ１－Ｅ２、ＮＳ３－４、及びＮＳ５。ＩＦＮｇ＋ＣＤ４＋（Ａ及びＢ）及びＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋（Ｃ及びＤ）のＴ細胞頻度を、それぞれ総ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度又はＣＤ８＋Ｔ細胞頻度のパーセンテージとして、細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリーによって決定した。全てのデータは、中央値及び四分位範囲としてプロットされる。結果は、ｃｏｒｅＥ１Ｅ２領域内のエピトープ、おそらくＥ２に焦点を当て、動物が相同ペプチドに対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を生成したことを示す。２／７の試験した動物が遺伝子型１ｂに対する交差反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を保有したが、ＣＤ８＋交差反応性は観察されなかった。
【0186】
図２５は、図２１に示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３で免疫化したマウスにおけるＥ２特異的Ｔ細胞応答を示す。脾細胞を６週目に採取し、Ｅ２領域の長さをカバーする遺伝子型１ａ（１１ａａ重複する１５ｍｅｒ）由来のＥ２ペプチドプールを使用してエクスビボで刺激した。データは、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３でワクチン接種したマウスが、Ｅ２特異的ＩＦＮｇ＋Ｔ細胞を生成することを示す。
【0187】
図２６は、図２１に示すように、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３で免疫化したマウスにおける多機能Ｔ細胞応答の分析を示す。産生されたサイトカイン、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、及びＩＬ－２を検出するために、ｇｔ－１ａ（Ｈ７７）についてのＨＣＶプロテオームの長さをカバーするＨＣＶペプチド（１１ａａ重複する１５ｍｅｒ）を使用して、脾細胞刺激後のＩＣＳ及びフローサイトメトリーを介して、ワクチンで誘導されたＴ細胞の多機能性を決定した。円の基本は、中央値であり、Ｐｅｓｔｌｅ及びＳＰＩＣＥソフトウェアを使用して計算されている。全てのデータは、中央値及び四分位範囲としてプロットされる。結果は、ＣｈＡｄ－Ｅ２Δ１２３／ＭＶＡ－Ｅ２Δ１２３でのワクチン接種が、高度に多機能的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成することを示す。ＣＤ４応答は、３つ全てのサイトカインの産生によって特徴付けられ、一方でＣＤ８＋応答は、主にＴＮＦアルファに対してであった。
【0188】
本明細書に引用又は参照された全ての文書、並びに本明細書に言及されている、又は参照により本明細書に組み込まれている任意の文書における任意の製品についての製造業者の指示、説明、製品仕様、及び製品シートとともに文書を引用して本明細書に引用又は参照された全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0189】
当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態において様々な修正及び変更を行うことができることを認識するであろう。かかる全ての修正及び変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。したがって、本実施形態は、全ての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
参考文献
Ｄｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：３２９，２０１４。
ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：９５８４－９５９０，２００７。
Ｄｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１１１４３－１１１４７，２００２。
ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１２。
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（２０１５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１６（２）：１５２－１６５。
Ｙｏｕｎ ｅｔ ａｌ（２０１５），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（９）：１３３７－１３４
Ｖｉｅｔｈｅｅｒ Ｐ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６５（４），２０１７ｖｏｎ Ｄｅｌｆｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１８，３６，（２），３１３－３２１
Ｓｗａｄｌｉｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１４，６，（２６１），２６１ｒａ１５３。
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Ｓｗａｄｌｉｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１４，６，（２６１），２６１ｒａ１５３。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27-1】
【図27-2】
【図27-3】
【図27-4】
【図27-5】
【図27-6】
【図27-7】
【図27-8】
【図27-9】
【図27-10】
【図27-11】
【図27-12】
【図28】
【図29-1】
【図29-2】
【図29-3】
【図30】
【図31-1】
【図31-2】
【図32-1】
【図32-2】
【図32-3】
【図32-4】
【図32-5】
【図32-6】
【図32-7】
【図32-8】
【図32-9】
【図33】
【図34】
【図35-1】
【図35-2】
【国際調査報告】