特表 2023-526047 ＳＬＣ２６Ａ４関連難聴を治療するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-20

(54)【発明の名称】ＳＬＣ２６Ａ４関連難聴を治療するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230613BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230613BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230613BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230613BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20230613BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230613BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230613BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20230613BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230613BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/12 ZNA

C12N7/01

C12N5/10

A01K67/027

A61K38/17

A61K48/00

A61P27/16

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022568802

(86)(22)【出願日】2021-05-12

(85)【翻訳文提出日】2022-12-09

(86)【国際出願番号】 US2021031983

(87)【国際公開番号】W WO2021231567

(87)【国際公開日】2021-11-18

(31)【優先権主張番号】63/024,466

(32)【優先日】2020-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519062144

【氏名又は名称】アコーオス インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】502290266

【氏名又は名称】タイペイ・ベテランズ・ジェネラル・ホスピタル

【氏名又は名称原語表記】Ｔａｉｐｅｉ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】サイモンズ， エマニュエル ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ング， ロバート

(72)【発明者】

【氏名】チェン， イェン－フ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD15

4B065BD17

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC50

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA341

4C084ZA342

4C084ZB211

4C084ZB212

(57)【要約】

本開示は、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む構築物であって、コード配列がペンドリンタンパク質をコードする、構築物を提供する。例示的な構築物としては、ＡＡＶ構築物が挙げられる。また、難聴及び／または聴覚喪失の治療のために、開示された構築物を使用する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む構築物であって、前記コード配列が、ペンドリンタンパク質をコードする、前記構築物。

【請求項2】

前記コード配列が、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である、請求項１に記載の構築物。

【請求項3】

前記ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、霊長類ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である、請求項２に記載の構築物。

【請求項4】

前記ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である、請求項２または３に記載の構築物。

【請求項5】

前記ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に記載の核酸配列を含む、請求項４に記載の構築物。

【請求項6】

前記ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、配列番号１に記載の核酸配列を含む、請求項４または５に記載の構築物。

【請求項7】

前記ペンドリンタンパク質が、霊長類ペンドリンタンパク質である、請求項１に記載の構築物。

【請求項8】

前記ペンドリンタンパク質が、ヒトペンドリンタンパク質である、請求項１または７に記載の構築物。

【請求項9】

前記ペンドリンタンパク質が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の構築物。

【請求項10】

前記プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項１～９のいずれか１項に記載の構築物。

【請求項11】

前記プロモーターが、内耳細胞特異的プロモーターである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の構築物。

【請求項12】

前記内耳細胞特異的プロモーターが、ＧＪＢ２プロモーター、ＧＪＢ６プロモーター、ＳＬＣ２６Ａ４プロモーター、ＴＥＣＴＡプロモーター、ＤＦＮＡ５プロモーター、ＣＯＣＨプロモーター、ＮＤＰプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＰＬＰプロモーター、ＴＡＫ１プロモーター、ＳＯＸ２１プロモーター、ＳＯＸ２プロモーター、ＦＧＦＲ３プロモーター、ＰＲＯＸ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ１プロモーター、ＬＧＲ５プロモーター、ＨＥＳ１プロモーター、ＨＥＳ５プロモーター、ＮＯＴＣＨ１プロモーター、ＪＡＧ１プロモーター、ＣＤＫＮ１Ａプロモーター、ＣＤＫＮ１Ｂプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、Ｐ７５プロモーター、ＣＤ４４プロモーター、ＨＥＹ２プロモーター、ＬＦＮＧプロモーター、またはＳ１００ｂプロモーターである、請求項１１に記載の構築物。

【請求項13】

前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＣＢ７プロモーターである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の構築物。

【請求項14】

前記プロモーターが、配列番号４３に記載の核酸配列を含む、請求項１３に記載の構築物。

【請求項15】

２つのＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）を更に含み、前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、前記コード配列及びプロモーターに隣接する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の構築物。

【請求項16】

前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲであるか、またはＡＡＶ２ ＩＴＲに由来する、請求項１５に記載の構築物。

【請求項17】

前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、
（ｉ）配列番号１０に記載の核酸配列を含む５’ＩＴＲ及び配列番号１１に記載の核酸配列を含む３’ＩＴＲ、または
（ｉｉ）配列番号１２に記載の核酸配列を含む５’ＩＴＲ及び配列番号１３に記載の核酸配列を含む３’ＩＴＲを含む、請求項１５に記載の構築物。

【請求項18】

前記構築物が、配列番号３９に記載の核酸配列を含む、請求項１に記載の構築物。

【請求項19】

前記構築物が、配列番号４０に記載の核酸配列を含む、請求項１に記載の構築物。

【請求項20】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の構築物を含む、ＡＡＶ粒子。

【請求項21】

ＡＡＶカプシドを更に含み、前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ｒｈ８、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、もしくはＡＡＶ Ａｎｃ８０カプシドであるか、またはそれに由来する、請求項２０に記載のＡＡＶ粒子。

【請求項22】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ Ａｎｃ８０カプシドである、請求項２１に記載のＡＡＶ粒子。

【請求項23】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の構築物を含む、組成物。

【請求項24】

請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子を含む、組成物。

【請求項25】

前記組成物が、薬学的組成物である、請求項２３または２４に記載の組成物。

【請求項26】

薬学的に許容される担体を更に含む、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物を含む、エクスビボ細胞。

【請求項28】

エクスビボ細胞に、
（ｉ）請求項１５～１９のいずれか１項に記載の構築物と、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子、ＡＡＶ ＶＡ遺伝子、ＡＡＶ Ｅ２ａ遺伝子、及びＡＡＶ Ｅ４遺伝子を一括して含む、１つ以上のヘルパープラスミドと、をトランスフェクトすることを含む、方法。

【請求項29】

対象の内耳に、請求項２５または２６に記載の組成物を導入することを含む、方法。

【請求項30】

対象の内耳に、請求項２５または２６に記載の組成物を導入することを含む、治療方法。

【請求項31】

請求項２５または２６に記載の組成物が、前記対象の蝸牛に導入される、請求項２９または３０に記載の方法。

【請求項32】

請求項２５または２６に記載の組成物が、正円窓膜注入により導入される、請求項２９～３１に記載の方法。

【請求項33】

前記対象の聴力レベルを測定することを更に含む、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

聴力レベルが、聴性脳幹応答（ＡＢＲ）試験を実行することによって測定される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記対象の前記聴力レベルを参照聴力レベルと比較することを更に含む、請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

前記参照聴力レベルが、公開されたまたは既往の参照聴力レベルである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記対象の前記聴力レベルが、請求項２５または２６に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照聴力レベルが、請求項２５または２６に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象の聴力レベルである、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記対象におけるペンドリンタンパク質のレベルを測定することを更に含む、請求項２９～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ペンドリンタンパク質のレベルが、前記対象の内耳において測定される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ペンドリンタンパク質のレベルが、前記対象の蝸牛において測定される、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

前記対象における前記ペンドリンタンパク質のレベルを、参照ペンドリンタンパク質レベルと比較することを更に含む、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記参照ペンドリンタンパク質レベルが、公開されたまたは既往のペンドリンタンパク質レベルである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記対象における前記ペンドリンタンパク質のレベルが、請求項２５または２６に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照ペンドリンタンパク質レベルが、請求項２５または２６に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象のペンドリンタンパク質レベルである、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

難聴に罹患しているか、もしくは難聴のリスクがある対象における難聴の治療のための、請求項１～１９のいずれか１項に記載の構築物、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２３～２７のいずれか１項に記載の組成物の、使用。

【請求項45】

難聴の治療のための医薬の製造における、請求項１～１９のいずれか１項に記載の構築物、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２３～２７のいずれか１項に記載の組成物の、使用。

【請求項46】

医薬として使用するための、請求項１～１９のいずれか１項に記載の構築物、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２３～２７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項47】

難聴の治療に使用するための、請求項１～１９のいずれか１項に記載の構築物、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２３～２７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項48】

遺伝子改変マウスであって、そのゲノムが、配列番号５７に記載のポリペプチドをコードする改変Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子を含み、前記遺伝子改変マウスが、聴覚分析実験での使用に好適なマウス株の遺伝子改変バージョンである、前記遺伝子改変マウス。

【請求項49】

前記聴覚分析実験での使用に好適なマウス株が、ＣＢＡ／ＣａＪまたはＣＢＡ／Ｊではない、請求項４８に記載の遺伝子改変マウス。

【請求項50】

前記聴覚分析実験での使用に好適なマウス株が、ＦＶＢ、１２９／Ｓｖ－＋ｐ＋Ｔｙｒ－ｃ＋Ｍｇｆ－ＳＩＪ／Ｊ、Ａ／ＨｅＪ、ＡＫＲ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＤＰ／Ｊ、ＢＸＳＢ／ＭｐＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、ＣＡＳＡ／ＲＫ、ＣＡＳＴ／Ｅｉ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＺＥＣＨ ＩＩ／Ｅｉ、ＤＢＡ／２ＨａＳｍｎ、ＦＶＢ／ＮＪ、ＨＲＳ／Ｊ ｈｒｌ＋、ＭＯＬＤ／Ｒｋ、ＭＯＬＦ／Ｅｉ、ＭＯＬＧ／Ｄｎ、ＮＯＮ／ＬｔＪ、ＮＺＢ／Ｂ１ＮＪ、ＮＺＯ／ＮＩＪ、ＮＺＷ／ＬａｃＪ、ＰＥＲＡ／ｃａｍＥｉ、ＰＥＲＣ／Ｅｉ、ＰＬ／Ｊ、ＲＢＡ／Ｄｎ、ＲＢＦ／ＤｎＪ、ＲＦ／Ｊ、ＲＨＪ／Ｌｅ ｈｒｒｈ－Ｊ／＋、ＲＩＩＩＳ／Ｊ、ＳＥＣ／１ＲｅＪ、ＳＥＮＣＡＲＣ／ＰｔＪ、ＳＦ／ＣａｍＥｉ、ＳＨＲ／ＧｎＥｉ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＭ／Ｊ、ＳＰＲＥＴ／Ｅｉ、ＳＴ／ｂＪ、またはＳＷＲ／Ｊ株である、請求項４８に記載の遺伝子改変マウス。

【請求項51】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物を、請求項４８～５０のいずれか１項に記載のマウスの正円窓膜の穿孔を通じて注入することを含む、方法。

【請求項52】

難聴を治療する方法であって、
請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、前記方法。

【請求項53】

前記組成物が、正円窓膜注入により導入される、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記難聴が、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異と関連付けられている、請求項５２または５３に記載の方法。

【請求項55】

前記難聴及び難聴の治療が、任意の治療を受ける前に記録され、治療後のＡＢＲ及び／または歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）測定値と比較されたＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値の関数として特徴付けられる、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の構築物を含む組成物、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子を含む組成物、または請求項２３～２７のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。

【請求項57】

前記組成物が、デバイスに事前に装填される、請求項５６に記載のキット。

【請求項58】

前記デバイスが、マイクロカテーテルである、請求項５７に記載のキット。

【請求項59】

前記マイクロカテーテルが、外耳道を介して中耳腔に入り、前記マイクロカテーテルの端部をＲＷＭと接触させることができるように成形される、請求項５８に記載のキット。

【請求項60】

前記マイクロカテーテルの遠位端が、１０～１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルから構成される、請求項５７または５８に記載のキット。

【請求項61】

デバイスを更に含む、請求項５６に記載のキット。

【請求項62】

前記デバイスが、図１５～１８に記載のデバイスまたは本明細書に記載のデバイスである、請求項６１に記載のキット。

【請求項63】

前記デバイスが、屈曲部分及び角度のある先端を含むニードルを含む、請求項６２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１３日に出願された米国仮出願第６３／０２４，４６６号の利益を主張し、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

難聴は、伝音性（外耳道もしくは中耳から生じる）、感音性（内耳もしくは聴神経から生じる）、または混合性であり得る。非症候性聴力喪失のほとんどの形態は、内耳の構造の損傷によって引き起こされる永続的な難聴（感音性難聴）に関連付けられているが、一部の形態は、中耳の変化（伝音性難聴）を伴うことがある。ヒト感音性難聴の大部分は、蝸牛におけるコルチ器官の有毛細胞の異常（有毛細胞機能の低下）が原因である。有毛細胞は、出生時に異常である場合もあれば、個体の生涯中に（例えば、騒音外傷または感染の結果として）損傷される場合もある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示は、難聴に関連する疾患または状態が、例えば、特定の遺伝子産物の置き換えまたは付加によって治療できるという認識を提供する。本開示は更に、内耳細胞の発達、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物が、有毛細胞と関連する及び／または細胞喪失を支持する疾患または状態の治療に有用であり得ることを提供する。したがって、本開示は、支持細胞及び有毛細胞を含む内耳細胞の発達、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物の発現をもたらす組成物の投与、及び／または難聴、もしくは難聴に関連する疾患または状態の治療におけるそのような組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ペンドリンタンパク質またはその特徴部分であり得る。

【0004】

本開示は更に、ＡＡＶ粒子が、内耳細胞の発達、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物の発現をもたらす組成物の投与、及び／または難聴、もしくは難聴に関連する疾患または状態の治療に有用であり得ることを示す。本明細書に記載されるように、ＡＡＶ粒子は、（ｉ）ＡＡＶポリヌクレオチド構築物（例えば、組換えＡＡＶポリヌクレオチド構築物）と、（ｉｉ）カプシドタンパク質を含むカプシドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶポリヌクレオチド構築物は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分を含む。

【0005】

本開示は更に、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分を含むポリヌクレオチド構築物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、構築物は、コード配列に作動可能に結合された調節要素を更に含んでもよい。ある特定の実施形態では、含まれる調節要素は、生理学的に好適なレベルで組織特異的発現を促進する。

【0006】

本開示はまた、ゲノムが改変Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子を含む遺伝子改変マウスも提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、配列番号５７に記載のポリペプチドをコードする改変Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、聴覚分析実験での使用に好適なマウス株のものである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、配位分析実験での使用に好適なマウス株のものである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、ＣＢＡ／ＣａＪまたはＣＢＡ／Ｊ株ではない。いくつかの実施形態では、聴覚分析実験での使用に好適な遺伝子改変マウスは、ＦＶＢ株のものである。いくつかの実施形態では、聴覚分析実験での使用に好適な遺伝子改変マウスは、ＦＶＢ、１２９／Ｓｖ－＋ｐ＋Ｔｙｒ－ｃ＋Ｍｇｆ－ＳＩＪ／Ｊ、Ａ／ＨｅＪ、ＡＫＲ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＤＰ／Ｊ、ＢＸＳＢ／ＭｐＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、ＣＡＳＡ／ＲＫ、ＣＡＳＴ／Ｅｉ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＺＥＣＨ ＩＩ／Ｅｉ、ＤＢＡ／２ＨａＳｍｎ、ＦＶＢ／ＮＪ、ＨＲＳ／Ｊ ｈｒｌ＋、ＭＯＬＤ／Ｒｋ、ＭＯＬＦ／Ｅｉ、ＭＯＬＧ／Ｄｎ、ＮＯＮ／ＬｔＪ、ＮＺＢ／Ｂ１ＮＪ、ＮＺＯ／ＮＩＪ、ＮＺＷ／ＬａｃＪ、ＰＥＲＡ／ｃａｍＥｉ、ＰＥＲＣ／Ｅｉ、ＰＬ／Ｊ、ＲＢＡ／Ｄｎ、ＲＢＦ／ＤｎＪ、ＲＦ／Ｊ、ＲＨＪ／Ｌｅ ｈｒｒｈ－Ｊ／＋、ＲＩＩＩＳ／Ｊ、ＳＥＣ／１ＲｅＪ、ＳＥＮＣＡＲＣ／ＰｔＪ、ＳＦ／ＣａｍＥｉ、ＳＨＲ／ＧｎＥｉ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＭ／Ｊ、ＳＰＲＥＴ／Ｅｉ、ＳＴ／ｂＪ、またはＳＷＲ／Ｊ株のものである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、本明細書に記載のＡＡＶ粒子、構築物、または組成物で処置される。

【0007】

本明細書に記載される構築物及び組成物を投与する方法もまた、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、投与は、外科的介入及び治療構築物を含むｒＡＡＶ粒子の送達を伴う。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、正円窓膜を通じた外科的導入によって、それを必要とする対象の内耳に送達され得る。いくつかの実施形態では、介入の目的は、対象における難聴を治療することである。いくつかの実施形態では、介入の有効性は、確立された試験を通じて判定され、測定値は、既知の対照測定値と比較される。

【0008】

定義
本開示の範囲は、本明細書に添付される請求項によって定義され、本明細書に記載される特定の実施形態によって限定されない。本明細書を読む当業者は、そのような記載された実施形態と等価であり得る、またはそうでなければ特許請求の範囲の範囲内であり得る様々な修正を認識するであろう。一般に、本明細書で使用される用語は、別途明確に示されない限り、当該技術分野におけるそれらの理解される意味に従う。特定の用語の明示的な定義を以下に提供する。本明細書を通じて、特定の例におけるこれらの用語及び他の用語の意味は、文脈から当業者に明らかとなるであろう。

【0009】

請求項要素を修正するための特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序を表す用語の使用は、それ自体が、ある請求項要素の他の要素に対するいかなる優先順位（ｐｒｉｏｒｉｔｙ）、優先性（ｐｒｅｃｅｄｅｎｃｅ）、もしくは順序、または方法の行為が実行される時間的順序を意味するものではなく、請求項要素を区別するために、特定の名称を有する１つの請求項要素を同一の名称を有する別の要素（ただし、順序用語の使用のため）と区別するための標識としてのみ使用される。

【0010】

本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対のことが明確に示されていない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。ある群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、この群のメンバーのうちの１つ、２つ以上、または全てが、反対のことが明確に示されていない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、そこで使用されるか、またはそうでなければそれに関連する場合に、満たされるとみなされる。いくつかの実施形態では、ある群の正確に１つのメンバーは、所与の生成物またはプロセスに存在するか、そこで使用されるか、またはそうでなければそれに関連する。いくつかの実施形態では、２つ以上の、または全ての群のメンバーは、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、そこで使用されるか、またはそうでなければそれに関連する。本開示は、列挙された特許請求の範囲のうちの１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述的用語などが、別途示されない限り、または矛盾もしくは不整合が生じることが当業者に明らかでない限り、同じ基本請求項に従属する別の請求項（または関連する任意の他の請求項）に導入される、全ての変形、組み合わせ、及び順列を包含することを理解されたい。要素がリストとして（例えば、マーカッシュ群または同様の形式で）提示される場合、要素の各サブグループも開示され、任意の要素（複数可）を群から除去することができることを理解されたい。一般に、実施形態または態様が、特定の要素、機構などを「含む」と記載される場合、ある特定の実施形態または態様は、そのような要素、特質などを「からなる」、または「本質的になる」ことを理解されたい。単純化のために、本明細書では、これらの実施形態は、全ての事例において多くの語で具体的に説明されてはいない。特定の除外が本明細書に列挙されているか否かにかかわらず、任意の実施形態または態様を、特許請求の範囲から明示的に除外できることもまた理解されるべきである。

【0011】

本明細書全体を通して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが一連の文字（例えば、ポリヌクレオチドの場合、それぞれアデノシン、シチジン、グアノシン、及びチミジンを示すＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）で表される場合はいつでも、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、左から右に、５’→３’またはＮ末端→Ｃ末端の順に提示される。

【0012】

投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、典型的には、組成物を対象または系に投与して、対象または系への薬剤の送達を達成することを指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、組成物であるか、または組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、組成物またはその１つ以上の成分の代謝を通じて生成される。当業者は、適切な状況で、対象、例えばヒトへの投与のために利用され得る様々な経路を認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、全身性であっても局所的であってもよい。いくつかの実施形態では、全身投与は、静脈内であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、局所的であり得る。局所投与は、例えば、正円窓膜を通じたもしくは鼓室階への注入、内リンパ、外リンパ及び／または管切開（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）後の内リンパを通じた中央階注入を介した蝸牛外リンパへの送達を伴い得る。いくつかの実施形態では、投与は、単回用量のみを伴ってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、固定数の用量の適用を伴ってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間的に分離された複数の用量）及び／または周期的（例えば、共通の期間によって分離された個々の用量）投薬を伴ってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投薬（例えば、灌流）を伴ってもよい。

【0013】

対立遺伝子：本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」という用語は、特定の多型遺伝子座の２つ以上の既存の遺伝子バリアントのうちの１つを指す。

【0014】

軽快：本明細書で使用される場合、「軽快」という用語は、対象の状態の予防、低減もしくは軽減、または状態の改善を指す。改善は、疾患、障害もしくは状態の完全な回復または完全な予防を含み得るが、それを必要としない。

【0015】

アミノ酸：その最も広い意味で、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、例えば、１つ以上のペプチド結合の形成を通じて、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造、例えば、Ｈ_２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般的に見られる２０個の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成的に調製されるのか、天然源から得られるのかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ末端アミノ酸及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、上に示されるような一般構造と比較して、構造修飾を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造と比較して、（例えば、アミノ基、カルボン酸基、１つ以上のプロトン、及び／またはヒドロキシル基の）メチル化、アミド化、アセチル化、ペグ化、グリコシル化、リン酸化、及び／または置換によって修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、例えば、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を、他の点では同一の非修飾アミノ酸を含有するポリペプチドと比較して変化させ得る。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、他の点では同一の非修飾アミノ酸を含有するポリペプチドと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連する活性を有意に変化させない。

【0016】

およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値に類似する値を含む、目的の１つ以上の値に適用されてもよい。いくつかの実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途記載がない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、記載された参照値の±１０％（より大きいまたは小さい）内に収まる範囲の値を指す。例えば、いくつかの実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、参照値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲の値を包含し得る。

【0017】

関連付けられている：本明細書で使用される場合、「関連付けられている」という用語は、一方の存在、レベル、及び／または形態が他方の存在、レベル、及び／または形態と相関している場合、２つの事象または実体が互いに「関連付けられている」と説明する。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベル、及び／または形態が、（例えば、関連する集団全体にわたって）疾患、障害、または状態の発生率及び／または感受性と相関する場合、特定の疾患、障害、または状態に関連付けられているとみなされる。いくつかの実施形態では、２つ以上の実体は、直接的または間接的に相互作用する場合、互いに物理的に「関連付けられている」ため、それらは互いに物理的に近接している及び／または互いに物理的に近接した状態のままである。いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連付けられている２つ以上の実体は、互いに共有連結しており、いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連付けられている２つ以上の実体は、互いに共有連結していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びそれらの組み合わせによって非共有結合的に関連付けられている。

【0018】

生物学的に活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性」という用語は、目的の薬剤または実体によって達成される観察可能な生物学的効果または結果を指す。例えば、いくつかの実施形態では、特異的結合相互作用は、生物活性である。いくつかの実施形態では、生物学的経路または事象の調節（例えば、誘導、増強、または阻害）は、生物学的活性である。いくつかの実施形態では、生物学的活性の存在または程度は、目的の生物学的経路または事象によって産生される直接的または間接的な生成物の検出を通じて評価される。

【0019】

特徴部分：本明細書で使用される場合、「特徴部分」という用語は、最も広い意味で、物質の存在（または不在）が、その物質の特定の特質、属性、または活性の存在（または不在）と相関する物質の部分を指す。いくつかの実施形態では、物質の特徴部分は、所与の物質、及び特定の特性、属性、または活性を共有する関連物質には見出されるが、特定の特質、属性、または活性を共有しないものには見出されない部分である。いくつかの実施形態では、特徴部分は、無傷の物質と少なくとも１つの機能的特徴を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの「特徴部分」は、一緒にタンパク質またはポリペプチドの特徴である連続したアミノ酸の伸長、または連続したアミノ酸の伸長の集合を含有する部分である。いくつかの実施形態では、そのような連続した各伸長は、一般に、少なくとも２、５、１０、１５、２０、５０、またはそれ以上のアミノ酸を含有する。一般に、物質（例えば、タンパク質、抗体など）の特徴部分は、上記で特定した配列及び／または構造同一性に加えて、関連する無傷の物質と少なくとも１つの機能的特徴を共有する部分である。いくつかの実施形態では、特徴部分は、生物学的に活性であってもよい。

【0020】

特徴的な配列：本明細書で使用される場合、「特徴的な配列」という用語は、ポリペプチドまたは核酸のファミリーの全てのメンバーに見出され、したがって、当業者がファミリーのメンバーを定義するために使用することができる配列である。

【0021】

特徴的な配列要素：本明細書で使用される場合、「特徴的な配列要素」という語句は、ポリマー（例えば、ポリペプチドまたは核酸）の特徴部分を表す、そのポリマーに見出される配列要素を指す。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素の存在は、ポリマーの特定の活性もしくは特性の存在またはレベルと相関する。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素の存在（または不在）は、特定のポリマーを、そのようなポリマーの特定のファミリーまたは群のメンバー（またはメンバーではない）として定義する。特徴的な配列要素は、典型的には、少なくとも２つのモノマー（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のモノマー（例えば、連続して連結したモノマー）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素は、配列要素を共有するポリマー間で長さが異なるまたは異ならない場合がある１つ以上のスペーサー領域によって離間された連続したモノマーの少なくとも第１及び第２の伸長を含む。

【0022】

併用療法：本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、対象が２つ以上の治療レジメン（例えば、２つ以上の治療剤）に同時に曝露される状況を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤を同時に投与してもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤を順次投与してもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤を重複投薬レジメンで投与してもよい。

【0023】

同等：本明細書で使用される場合、「同等」という用語は、互いに同一ではないが、当業者が、観察される差異または類似性に基づいて合理的に結論が得られ得ることを理解するように、それらの間の比較を可能にするのに十分に類似している、２つ以上の薬剤、実体、状況、一連の条件、対象、集団などを指す。いくつかの実施形態では、薬剤、実体、状況、一連の条件、対象、集団などの同等なセットは、複数の実質的に同一の特質及び１つまたは少数の多様な特質によって特徴付けられる。当業者は、文脈において、同等であるとみなされる２つ以上のそのような薬剤、実体、状況、一連の条件、対象、集団などについて、任意の所与の状況でどの程度の同一性が必要であるかを理解するであろう。例えば、当業者は、薬剤、実体、状況、一連の条件、対象、集団などのセットが、状況（ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅｓ）、刺激、薬剤、実体、状況（ｓｉｔｕａｔｉｏｎｓ）、一連の条件、対象、集団などの異なるセットの下で、またはそれらの異なるセットとともに得られた結果または観察された現象の差異が、変化するそれらの特質の変動によって引き起こされるか、またはその変動を示すという合理的な結論を保証するのに十分な数及び種類の実質的に同一の特質によって特徴付けられる場合に、互いに同等であることを理解するであろう。

【0024】

構築物：本明細書で使用される場合、「構築物」という用語は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを担持することが可能なポリヌクレオチドを含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体（例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））またはウイルス構築物、及び任意のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）プラスミドであり得る。構築物は、例えば、発現のための十分なシス作用要素を含むことができ、発現のための他の要素は、宿主霊長類細胞によって、またはインビトロ発現系において供給できる。構築物は、適切な制御要素と会合したときに複製することが可能な任意の遺伝子要素（例えば、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルス構築物など）を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、「構築物」は、クローニング及び／または発現構築物及び／またはウイルス構築物（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物、アデノウイルス構築物、レンチウイルス構築物、またはレトロウイルス構築物）を含んでもよい。

【0025】

保存的：本明細書で使用される場合、「保存的」という用語は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む、保存的アミノ酸置換を説明する例を指す。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能的特性、例えば、受容体が配位子に結合する能力を実質的に変化させないであろう。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、及びイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）などの脂肪族側鎖；セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）及びスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）などの脂肪族－ヒドロキシル側鎖；アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）などのアミド含有側鎖；フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）などの芳香族側鎖；リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）などの塩基性側鎖；アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）などの酸性側鎖；ならびにシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）及びメチオン（Ｍｅｔ、Ｍ）などの硫黄含有側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン（Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｖ／Ｌ／Ｉ）、フェニルアラニン／チロシン（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ｆ／Ｙ）、リジン／アルギニン（Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｋ／Ｒ）、アラニン／バリン（Ａｌａ／Ｖａｌ、Ａ／Ｖ）、グルタメート／アスパルテート（Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｅ／Ｄ）、及びアスパラギン／グルタミン（Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｎ／Ｑ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発で使用されるような、タンパク質中の任意の天然残基のアラニンでの置換であり得る。いくつかの実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する保存的置換が作製される。いくつかの実施形態では、置換は、中程度の保存的置換であり、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負の値を有する。当業者であれば、異なる種由来の同じタンパク質間で保存されていないアミノ酸の変化（例えば、置換、付加、欠失など）が、タンパク質の機能に影響を及ぼす可能性が低く、したがって、これらのアミノ酸が変異に対して選択されるべきであることを理解するであろう。これらの変異は、タンパク質の機能の変化をもたらす可能性が高いため、異なる種由来の同じタンパク質間で保存されているアミノ酸は、変更（例えば、欠失、付加、置換など）すべきではない。

【表1】

【0026】

対照：本明細書で使用される場合、「対照」という用語は、結果を比較する基準である「対照」の当該技術分野で理解されている意味を指す。典型的には、対照は、そのような変数について結論を出すために変数を分離することによって、実験における整合性を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、対照は、比較対象を提供するための試験反応またはアッセイと同時に実行される反応またはアッセイである。例えば、１つの実験では、「試験」（すなわち、試験される変数）が適用される。第２の実験では、「対照」、すなわち、試験される変数は適用されない。いくつかの実施形態では、対照は、既往対照（例えば、以前に実行された試験もしくはアッセイ、または以前に知られている量もしくは結果）である。いくつかの実施形態では、対照は、印刷されたまたは他の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、対照は、陽性対照である。いくつかの実施形態では、対照は、陰性対照である。

【0027】

決定すること、測定すること、評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）、評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）、アッセイすること、及び分析すること：本明細書で使用される場合、「決定すること」、「測定すること」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイすること」、及び「分析すること」という用語は、任意の形態の測定を指すために同義的に使用されてもよく、要素が存在するか否かを決定することを含む。これらの用語は、定量的及び／または定性的決定の両方を含む。アッセイすることは、相対的であっても絶対的であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、「～の存在についてアッセイすること」は、存在するものの量を決定すること、及び／またはそれが存在するか否かを決定することであり得る。

【0028】

操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）：一般に、本明細書で使用される場合、「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、人間の手によって操作されている（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ）態様を指す。例えば、細胞または生物は、その遺伝子情報が改変されるように操作されている場合（例えば、以前に存在しなかった新たな遺伝子材料が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、もしくは他の機構によって導入されているか、あるいは以前に存在した遺伝子材料が、例えば、置換もしくは欠失変異によって、または交配プロトコルによって改変または除去されている場合）、「操作されている」とみなされる。一般的な慣行であり、当業者に理解されているように、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、実際の操作が以前の実体上で実行されたとしても、通常、「操作された」と呼ばれている。

【0029】

賦形剤：本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の一貫性または安定化効果を提供するか、またはそれに寄与するために、薬学的組成物に含まれてもよい非活性（例えば、非治療的）薬剤を指す。いくつかの実施形態では、好適な薬学的賦形剤には、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれ得る。

【0030】

発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」という用語は、核酸配列からの任意の遺伝子産物（例えば、転写産物、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、ポリペプチドなど）の生成を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、転写産物であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列の発現は、以下のうちの１つ以上を伴う：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）；（３）ＲＮＡのポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳；及び／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。

【0031】

機能的：本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、それが特徴付けられる特性及び／または活性を示す形態で存在するものを説明する。例えば、いくつかの実施形態では、「機能的」生体分子は、それが特徴付けられる性質及び／または活性を示す形態の生体分子である。いくつかのそのような実施形態では、機能的生体分子は、「非機能的」バージョンが「機能的」分子と同じまたは同等の特性及び／または活性を示さないという点で、非機能的である別の生体分子と比較して特徴付けられる。生体分子は、１つの機能、２つの機能（すなわち、二機能的）、または多くの機能（すなわち、多機能的）を有してもよい。

【0032】

遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ産物、例えば、ポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、遺伝子は、コード（例えば、エクソン）配列と非コード（例えば、イントロン）配列の両方を含んでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、遺伝子発現の１つ以上の態様（例えば、細胞型特異的発現、誘導性発現など）を制御またはそれに影響を与え得る１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び／またはイントロン配列を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、概して、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸の一部分を指す。この用語は、文脈から当業者に明らかであるように、任意選択的に調節配列を包含してもよい。この定義は、「遺伝子」という用語の非タンパク質コード発現単位への適用を除外することを意図せず、むしろ、ほとんどの場合、本文書で使用される用語が、ポリペプチドコード核酸を指すことを明らかにすることを意図する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ポリペプチドをコードし得るが、そのポリペプチドは、機能的でなくてもよく、例えば、遺伝子バリアントは、野生型遺伝子に対して、同じように機能しないか、または全く機能しないポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、いくつかの実施形態では、閾値レベルを超えて毒性であり得る転写産物をコードし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ポリペプチドをコードし得るが、そのポリペプチドは、機能的でなくてもよく、及び／または閾値レベルを超えて毒性であってもよい。

【0033】

難聴：本明細書で使用される場合、「難聴」という用語は、生体の耳が部分的または完全に聞こえないことを指して使用され得る。いくつかの実施形態では、難聴は後天性であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は遺伝性であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、遺伝的であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、疾患または外傷（例えば、身体外傷、難聴を引き起こす１つ以上の薬剤による処置など）の結果であってもよい。いくつかの実施形態では、難聴は、１つ以上の既知の遺伝的原因及び／または症候群に起因し得る。いくつかの実施形態では、難聴は、未知の病因のものであり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、補聴器もしくは他の処置の使用によって軽減される場合も、軽減されない場合もある。

【0034】

異種：本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、別の領域及び／または別の分子と比較して、特定の分子の１つ以上の領域に関連して使用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドドメインは、ポリペプチドドメインが一緒に（例えば、同じポリペプチド内で）天然には存在しないという事実を指す。例えば、ヒトの手によって生成された融合タンパク質では、１つのポリペプチド由来のポリペプチドドメインは、異なるポリペプチド由来のポリペプチドドメインに融合され得る。そのような融合タンパク質では、２つのポリペプチドドメインは、それらが一緒に天然には存在しないため、互いに対して「異種」であるとみなされるであろう。

【0035】

同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。２つの核酸またはポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列をアラインメントすることによって実行することができる（例えば、ギャップを、最適なアラインメントのために第１及び第２の配列のうちの一方または両方に導入することができ、同一でない配列は、比較のために無視できる）。いくつかの実施形態では、比較のためにアラインメントした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％であり、次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占められている場合、２つの分子（すなわち、第１及び第２の分子）は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある各ギャップの長さを考慮して、比較される２つの配列が共有する同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムで行われる核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。

【0036】

改善する、増加する、増強する、阻害する、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、「増強する」、「阻害する」、「低減する」、またはそれらの文法的等価物という用語は、ベースラインまたは他の参照測定値に相対的な値を示す。いくつかの実施形態では、値は、ベースラインまたは他の参照測定値との統計的に有意な差である。いくつかの実施形態では、適切な参照測定値は、特定の薬剤もしくは処置の不在下（例えば、その前及び／またはその後）、または適切な同等の参照薬剤の存在下での、（例えば、単一の個体の）特定の系における測定値であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な参照測定値は、関連する薬剤または処置の存在下で、特定の方法で応答することが知られているか、または期待される、同等の系における測定値であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な参照は、負の参照である。いくつかの実施形態では、適切な参照は、正の参照である。

【0037】

核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれることができる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル連結を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれることができる化合物及び／または物質である。文脈から明らかであるように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、またはそれを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しない点で核酸と異なる。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト連結を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレーションされた塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然核酸中の糖類と比較して、１つ以上の修飾糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組換え細胞または系での再現、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基、またはそれ以上の長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に一本鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列に相補的である、少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。

【0038】

作動可能に連結された：本明細書で使用される場合、記載される成分が、それらの意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。機能的要素に「作動可能に連結された」制御要素は、機能的要素の発現及び／または活性が制御要素と適合する条件下で達成されるような方法で関連付けられる。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」制御要素は、目的のコード要素と連続している（例えば、共有結合している）。いくつかの実施形態では、制御要素は、目的の機能的要素に対してトランスで、またはそうでなければ、目的の機能的要素で作用する。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」とは、調節配列と、後者の発現をもたらす異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれるときに、第２の核酸配列と作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、例えば、機能的連結は、転写制御を含んでもよい。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに連続することができ、例えば、２つのタンパク質コード領域を接合するために必要な場合、同じ読み取りフレーム内にある。

【0039】

薬学的組成物：本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、活性剤が１つ以上の薬学的に許容される担体とともに製剤化される組成物を指す。いくつかの実施形態では、活性剤は、関連集団に投与されたときに所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンにおける投与に適切な単位用量で存在する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得、固体または液体形態としては、例えば、水性もしくは非水性の溶液または懸濁液である注射用製剤、あるいは外耳道に投与されるように設計された液滴などの、投与などに適合されたものが含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、特定の臓器または区画（例えば、耳に直接）または全身（例えば、静脈内）のいずれかで、注入により投与するために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、製剤は、ドレンチ（水性もしくは非水性溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト、カプセル、粉末などであってもよく、またはそれらを含んでもよい。いくつかの実施形態では、活性剤は、単離された、精製された、または純粋な化合物であってもよく、またはそれを含んでもよい。

【0040】

薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、例えば、本明細書に開示される薬学的組成物を製剤化するために使用される担体、希釈剤、または賦形剤に関して使用されてもよく、担体、希釈剤、または賦形剤が組成物の他の成分と適合性であり、その受容体に有害ではないことを意味する。

【0041】

薬学的に許容される担体：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、１つの器官、または身体の一部から別の器官、または身体の一部への主題化合物の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と互換性があり、患者に損傷を与えないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能することができる材料のいくつかの例としては、乳糖、グルコース及びスクロースなどの糖類、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などの油、プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、ｐＨ緩衝液、ポリエステル、ポリカーボネート及び／またはポリ無水物、ならびに薬学的製剤に用いられる他の非毒性の適合物質が挙げられる。

【0042】

ポリアデニル化：本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」とは、ポリアデニリル部分またはその修飾されたバリアントの、メッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合を指す。真核生物では、大半のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化されている。いくつかの実施形態では、３’ポリ（Ａ）テールは、酵素のポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を通じてプレｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチド（例えば、５０、６０、７０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００）の長い配列である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールを、特定の配列、ポリアデニル化シグナルまたは「ポリ（Ａ）配列」を含有する転写産物に付加することができる。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを助ける。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸出、及び翻訳に影響を及ぼすことができる。通常、ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写の直後に核内で起こるが、追加的に、細胞質内でも後に起こり得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を通じて切断され得る。切断部位は、切断部位の近くに塩基配列ＡＡＵＡＡＡが存在することによって特徴付けられ得る。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基を切断部位の遊離３’末端に付加することができる。本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）配列」は、ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断、及び切断ｍＲＮＡの３’末端への一連のアデノシンの付加を引き起こす配列である。

【0043】

ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、典型的には、ペプチド結合によって連結される残基（例えば、アミノ酸）の任意の高分子鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然には生じないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人の手の作用によって設計及び／または産生されるという点で操作されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、もしくはその両方を含み得るか、またはそれらからなってもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのＮ末端にて、ポリペプチドのＣ末端にて、もしくはそれらの任意の組み合わせにて、１つ以上のアミノ酸側鎖を修飾するか、またはそれらに結合する１つ以上のペンダント基または他の修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、かかるペンダント基または修飾は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、ペグ化など（それらの組み合わせを含む）であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはこれらの両方を含有し得、かつ当該技術分野において既知の様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含有し得る。いくつかの実施形態では、有用な修飾は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などであり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含み得る。「ペプチド」という用語は、概して、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、それらの生物学的に活性な部分、及び／またはそれらの特徴部分である。

【0044】

ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸の任意の高分子鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の天然核酸残基であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の核酸類似体であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しない点で核酸と異なる。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト連結を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレーションされた塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然核酸中の糖類と比較して、１つ以上の修飾糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然源からの単離、相補鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組換え細胞または系での再現、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基、またはそれ以上の長さである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、部分的または全体的に一本鎖であり、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補物である、少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、酵素活性を有する。

【0045】

タンパク質：本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸群）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであってもよい）、及び／または他の方法で加工または修飾されてもよい。当業者は、「タンパク質」が、細胞によって産生される完全なポリペプチド鎖（シグナル配列の有無にかかわらず）であることができるか、またはその特徴部分であることができることを理解するであろう。当業者であれば、タンパク質は、例えば１つ以上のジスルフィド結合によって連結された、または他の手段によって会合された、２つ以上のポリペプチド鎖を含むことができることを理解するであろう。

【0046】

組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現構築物を使用して発現されるポリペプチド、組換え、組み合わせヒトポリペプチドライブラリーから単離されるポリペプチド；ポリペプチド、またはその１つ以上の成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）の発現をコードする及び／または指示する１つ以上の遺伝子または遺伝子成分についてトランスジェニックであるか、またはそうでなければ１つ以上の遺伝子を発現するように操作された動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、魚など）から単離されたポリペプチド；選択された核酸配列要素を互いにスプライシングまたはライゲーションすること、選択された配列要素を化学的に合成すること、及び／またはそうでなければポリペプチドまたはその１つ以上の成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）の発現をコードする及び／または指示する核酸を生成することを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離されたポリペプチドを指すことを意図される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の１つ以上は、天然に見出される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の１つ以上は、インシリコで設計される。いくつかの実施形態では、１つ以上のかかる選択された配列要素は、既知の配列要素の突然変異誘発（例えば、インビボまたはインビトロ）、例えば、目的の供給源生物（例えば、ヒト、マウスなど）の生殖細胞系などの天然または合成供給源から生じる。

【0047】

参照：本明細書で使用される場合、「参照」という用語は、比較が実行される標準または対照を示す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値を、参照または対照の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値と比較する。いくつかの実施形態では、参照または対照は、目的の試験または決定と実質的に同時に試験及び／または決定される。いくつかの実施形態では、参照または対照は、任意選択的に有形媒体において具現化された既往の参照または対照である。典型的には、当業者によって理解されるように、参照または対照は、評価されるものと同等の条件または状況下で決定されるか、または特徴付けられる。当業者は、特定の可能な参照または対照への依存及び／またはそれに対する比較を正当化するのに十分な類似性が存在するときに理解するであろう。いくつかの実施形態では、参照は、陰性対照参照であり、いくつかの実施形態では、参照は、陽性対照参照である。

【0048】

調節要素：本明細書で使用される場合、「調節要素」または「調節配列」という用語は、１つ以上の特定の遺伝子の発現を何らかの方法で調節するＤＮＡの非コード領域を指す。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子は、所与の調節要素に並置されるか、またはその「近傍」に存在する。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子は、所与の調節要素からかなり遠くに位置する。いくつかの実施形態では、調節要素は、１つ以上の遺伝子の転写を損なうか、または増強する。いくつかの実施形態では、調節要素は、調節されている遺伝子に対してシスに位置し得る。いくつかの実施形態では、調節要素は、調節されている遺伝子に対してトランスに位置し得る。例えば、いくつかの実施形態では、調節配列は、調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現を調節する核酸配列を指す。そのようないくつかの実施形態では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現を調節する他の調節要素であってもよい。

【0049】

試料：本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、典型的には、目的の供給源から得られるか、またはそれに由来する材料のアリコートを指す。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、生物学的供給源または環境的供給源である。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、微生物（例えば、ウイルス）、植物、もしくは動物（例えば、ヒト）などの細胞または生物であり得るか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、生体組織もしくは流体であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、生体組織または流体は、羊水、房水、腹水、胆汁、骨髄、血液、母乳、脳脊髄液、耳垢、乳び、び汁、精液、内リンパ、滲出液、糞便、胃酸、胃液、リンパ液、粘液、心膜液、外リンパ、腹腔液、胸水、膿、カタル性分泌物、唾液、皮脂、精液、血清、恥垢、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、硝子体液、嘔吐物、及び／またはそれらの組み合わせもしくは成分（複数可）であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、生体流体は、細胞内流体、細胞外流体、血管内流体（血漿）、間質流体、リンパ液、及び／または経細胞流体であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、生体流体は、植物滲出液であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、生体組織または試料は、例えば、吸引、生検（例えば、細ニードルまたは組織生検）、スワブ（例えば、経口、鼻、皮膚、または膣スワブ）、掻把、手術、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）もしくは洗浄（ｌａｖａｇｅ）（例えば、気管支肺胞上皮、管、鼻、眼、口腔、子宮、膣、または他の洗浄もしくは洗浄）によって得ることができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、個体から得られた細胞であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、試料は、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接得られる「一次試料」である。いくつかの実施形態では、文脈から明らかになるように、「試料」という用語は、一次試料を加工することによって（例えば、その１つ以上の成分を除去することによって、及び／またはそれに１つ以上の薬剤を添加することによって）得られる調製物を指す。例えば、半透膜を使用したフィルタリングである。かかる「加工試料」は、例えば、試料から抽出した核酸もしくはタンパク質、または一次試料を、核酸の増幅もしくは逆転写、特定の成分の単離及び／または精製などの１つ以上の技術に通すことによって得られた核酸もしくはタンパク質を含んでもよい。

【0050】

対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態では、出生前ヒト形態を含む）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害または状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に感受性である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の任意の症状または特徴を示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に対する感受性またはそのリスクの１つ以上の特質を有する者である。いくつかの実施形態では、対象は、患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または療法が投与される及び／または投与された個体である。

【0051】

実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全もしくはほぼ全程度（ｅｘｔｅｎｔ）または程度（ｄｅｇｒｅｅ）を示す定性的条件を指す。当業者であれば、生物学的及び化学的現象が完了に至ること、及び／または完全の域まで進行すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしてもまれであることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に内在する潜在的な完全性の欠如を捉えるために使用される。

【0052】

治療：本明細書で使用される場合、「治療」（また、「治療する」もしくは「治療すること」）という用語は、特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特質、及び／または原因を部分的もしくは完全に緩和する、軽快する、排除する、逆転させる、軽減する、阻害する、その発症を遅らせる、その重症度を低減する、及び／またはその発生を低減する療法の任意の投与を指す。いくつかの実施形態では、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の兆候を示さない対象、及び／または疾患、障害、及び／または状態の早期兆候のみを示す対象のものであってもよい。代替的に、または追加的に、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象のものであってもよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態に罹患していると診断された対象のものであり得る。いくつかの実施形態では、治療は、所与の疾患、障害、及び／または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象のものであってもよい。

【0053】

バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、別のバージョンとは何らかの形で異なるもの（例えば、遺伝子配列のバージョン）を指す。バリアントであるかどうかを判断するために、典型的には、参照バージョンが選択され、バリアントは、その参照バージョンとは異なる。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型配列と同じまたは異なる（例えば、増加または減少した）レベルの活性または機能性を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、バリアントは、例えば、阻害性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）によって分解に抵抗するようにコドン最適化される場合、野生型配列と比較して改善された機能性を有することができる。このような変異体は、本明細書では、機能獲得バリアントと呼ばれる。いくつかの実施形態では、バリアントは、負の結果をもたらす活性または機能性の減少もしくは除去、または活性の変化（例えば、細胞死をもたらす慢性的な脱分極をもたらす電気活性の増加）を有する。このようなバリアントは、本明細書では、機能喪失バリアントと呼ばれる。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子配列は、機能的タンパク質をコードし、かつＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含有するゲノムを有する種のメンバーの大部分に存在する野生型配列である。いくつかのそのような実施形態では、機能獲得バリアントは、野生型ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子配列と比較して１つ以上のヌクレオチド差異を含有するＳＬＣ２６Ａ４の遺伝子配列であってもよい。いくつかの実施形態では、機能獲得バリアントは、対応する野生型（例えば、非コドン最適化）バージョンよりも向上した特性（例えば、分解に対する感受性が低く、例えば、ｍｉＲＮＡ媒介性分解に対する感受性が低い）を有し得る転写産物またはポリペプチドをコードするコドン最適化配列である。いくつかの実施形態では、機能喪失バリアントは、野生型転写産物及び／またはポリペプチドと比較して、何らかの形で欠陥がある（例えば、機能低下、非機能性）転写産物またはポリペプチドをもたらす１つ以上の変化を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４配列の変異は、非機能的または別の欠陥があるペンドリンタンパク質をもたらす。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】パネル（Ａ）は、簡略化された内因性ＡＡＶゲノムを示し、パネル（Ｂ）は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を発現することができる簡略化された組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物を示す。

【図2】例示的なヌクレオチド構築物配列マップを示す。

【図3】ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。

【図4】ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。

【図5】例示的なｒＡＡＶ構築物がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるペンドリンタンパク質の発現を示す。

【図6】例示的なｒＡＡＶ構築物が形質導入されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及び野生型新生児ＣＤ１外植片におけるＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図7】例示的なｒＡＡＶ構築物が形質導入された野生型新生児ＣＤ１外植片の内耳形態を示す。

【図8】パネル（Ａ）は、Ｐ２１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの内耳形態を示し、パネル（Ｂ）は、例示的なｒＡＡＶ構築物を含む組成物の片側蝸牛内注入をＰ３日目に受けたＰ２１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスの内耳形態を示す。

【図9】パネル（Ａ）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊヘテロ接合性Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／＋}マウスにおける対照聴力レベルを示し、パネル（Ｂ）は、例示的なｒＡＡＶ構築物を含む組成物の片側耳内注入をＰ０日目に行ったＰ２１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスからの聴性脳幹応答（ＡＢＲ）結果を示し、パネル（Ｃ）は、対照及び例示的なｒＡＡＶ構築物を含む組成物をＰ０日目またはＰ３日目に注入された試験マウスからのＡＢＲデータのグラフィック表現であり、パネル（Ｄ）は、例示的なｒＡＡＶ構築物を含む組成物の片側蝸牛内注入をＰ３日目に受けたＰ２１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスからの聴性脳幹応答結果を示す。

【図10】様々な例示的なプロモーターの力を受けたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｅＧＦＰタンパク質発現を示し、細胞を選別し、トランスフェクションの７２時間後に定量した。

【図11】対照ホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４変異体マウス（Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}）、対照ＷＴマウス（Ｓｌｃ２６ａ４^{ＷＴ／ＷＴ}）、及びＰ２日目に正円窓膜（ＲＷＭ）注入により、図４に示されるような構築物が提供されたホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、クリック刺激に応答してｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は、Ｐ３０～Ｐ１８０の範囲の測定時の年齢を表し、注入された耳は「処置された」として記録され、注入されていない耳は「対側」である。

【図12】Ｐ２日目（Ｎ＝４）のＲＷＭ注入により、図４に示されるような構築物が提供されたホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は提供されたノイズ刺激（記載された周波数でのクリック、または純音）を表す。測定はＰ３０に行われ、注入された耳は「処置」として記載され、注入されていない耳は「対側」である。

【図13A】Ｐ２３日目の後半規管（ＰＳＣＣ）開窓によるＲＷＭ注入により、図４に示されるような構築物が提供されたホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は提供されたノイズ刺激（記載された周波数でのクリック、または純音）を表す。注入前の測定はＰ２２に行われ、注入後の測定はＰ５０に行われ、注入された耳は「処置済」として記載され、注入されていない耳は「対側」である。

【図13B】Ｐ２３日目のＰＳＣＣ開窓によるＲＷＭ注入により、図４に示されるような構築物を提供したホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は提供されたノイズ刺激（記載された周波数でのクリック、または純音）を表す。注入前の測定はＰ２２に行われ、注入後の測定はＰ５０に行われ、注入された耳は「処置済」として記載され、注入されていない耳は「対側」である。

【図14A】経時的な（Ｐ３０～Ｐ１５０）、４群の未処置のホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、クリック刺激に応答したｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は、経時的な年齢を表す。マウスは、聴力レベルに基づいてグループ化される。旋回などの表現型は、変性聴力または安定したレベルの不良聴力を有するマウスの群で観察された。

【図14B】経時的な（Ｐ２１～Ｐ１５０）、１群の未処置のホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は提供されたノイズ刺激（記載された周波数でのクリック、または純音）を表す。この群の動物は、時間の経過とともに安定したレベルの重度の聴力不良を有し、旋回行動を示した。

【図14C】経時的な（Ｐ２１～Ｐ１５０）、１群の未処置のホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は提供されたノイズ刺激（記載された周波数でのクリック、または純音）を表す。この群の動物は、時間の経過とともに安定したレベルの聴力不良を有し、旋回行動を示した。

【図14D】経時的な（Ｐ３０～Ｐ１５０）、１群の未処置のホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は提供されたノイズ刺激（記載された周波数でのクリック、または純音）を表す。この群の動物は、Ｐ６０までに聴力が変性して不良となり、この時点で聴力は不良レベルで安定し、動物は旋回行動を示した。

【図14E】経時的な（Ｐ３０～Ｐ１５０）、１群の未処置のホモ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスからのＡＢＲ結果を示す。Ｙ軸には、ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値があり、Ｘ軸は提供されたノイズ刺激（記載された周波数でのクリック、または純音）を表す。この群の動物は、安定した聴力を有し、旋回行動を示さなかった。

【図15】本開示の態様に従った、流体を内耳に送達するためのデバイスの斜視図を示す。

【図16】本開示の態様による、屈曲ニードルサブアセンブリの側面図を示す。

【図17】本開示の態様による、流体を内耳に送達するためのデバイスの斜視図を示す。

【図18】本開示の態様による、デバイスの遠位端にカップリングされた屈曲ニードルサブアセンブリの斜視図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0055】

難聴
一般に、耳は、外耳、中耳、内耳、聴（音）神経、及び聴覚系（耳から脳に移動するときに音を加工する）を含むと説明することができる。耳は、音を検出するだけでなく、バランスを維持するのにも役立つ。したがって、いくつかの実施形態では、内耳の障害は、難聴、耳鳴り、めまい、アンバランス、またはそれらの組み合わせを引き起こす可能性がある。

【0056】

難聴は、遺伝的要因、環境的要因、または遺伝的要因と環境的要因の組み合わせの結果である可能性がある。耳鳴り－聴覚系における幻聴（ベルや鐘の音（ｒｉｎｇｉｎｇ）、ブーンという音（ｂｕｚｚｉｎｇ）、鳥や虫の鳴き声のような音（ｃｈｉｒｐｉｎｇ）、ハミング、または鼓動）がある人の約半数は、特定の音の周波数及び音量範囲に対して過敏であるか、許容範囲が狭くなっている（聴覚過敏（ｈｙｐｅｒａｃｕｓｉｓ）（ｈｙｐｅｒａｃｏｕｓｉｓという綴りもある）としても知られている）。様々な非症候性及び症候群関連性難聴は当業者に既知である（例えば、それぞれＤＦＮＢ４及びペンドレッド症候群）。聴覚障害または喪失の環境的な原因としては、例えば、特定の薬物、出生前もしくは出生後の特定の感染、及び／または長期間にわたる大きなノイズへの曝露が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、難聴は、耳の特定の部分に影響を与える騒音、耳毒性剤、老年難聴、疾患、感染、またはがんから生じ得る。いくつかの実施形態では、虚血性損傷は、病態生理学的機序を介して難聴を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、内因性異常、例えば、蝸牛の解剖学的もしくは生理学的に重要な役割を果たす遺伝子の先天的変異、または支持細胞及び／または有毛細胞の遺伝的もしくは解剖学的変化は、難聴の原因となり得るか、またはその一因となり得る。

【0057】

難聴及び／または聴力喪失は、ヒトの感覚障害の中で最も一般的なものであり、多くの理由で発生する可能性がある。いくつかの実施形態では、対象は、難聴を有するか、または聴力を持たずに生まれ得るが、他の対象は、経時的にゆっくりと聴力を失い得る。約３６００万人のアメリカの成人がある程度の難聴を報告しており、６０歳以上の３人に１人、８５歳以上の人の半数が難聴を経験している。１，０００人に約１．５人の子供が最重度難聴を伴って生まれ、１，０００人に２～３人の子供が部分難聴を伴って生まれている（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｌａｎｃｅｔ ３６５：８７９－８９０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。これらの症例の半分以上は遺伝的根拠に起因する（Ｄｉ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２６：２４９４－２４９９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。

【0058】

難聴の治療は、現在、軽度～重度の喪失のための聴力増幅と、重度～最重度喪失のための蝸牛移植から構成されている（Ｋｒａｌ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，２０１０，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：１４３８－１４５０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。この分野の最近の研究は、老年難聴、騒音損傷、感染、及び耳毒性を含む、最も一般的な難聴の形態に適用可能な蝸牛有毛細胞の再生に焦点を当てている。聴覚障害の源を修復及び／または緩和することができる、遺伝子治療などの効果的な治療が依然として必要とされている（例えば、ＷＯ２０１８／０３９３７５、ＷＯ２０１９／１６５２９２、及びＰＣＴ出願第ＵＳ２０１９／０６０３２８号（それらの各々が、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0059】

いくつかの実施形態では、非症候性難聴及び／または聴力喪失は、他の兆候及び症状と関連付けられない。いくつかの実施形態では、症候性難聴及び／または聴力喪失は、身体の他の部分の異常と併せて生じる。遺伝性難聴及び／または聴力喪失の症例の約７０パーセント～８０パーセントは非症候性であり、残りの症例はしばしば特定の遺伝的症候群によって引き起こされる。非症候性聴力喪失及び／または難聴は、異なる遺伝のパターンを有し得、任意の年齢で生じ得る。非症候性聴力喪失及び／または難聴の型は、一般に、その遺伝パターンに従って命名される。例えば、常染色体優性型はＤＦＮＡと呼ばれ、常染色体劣性型はＤＦＮＢと呼ばれ、Ｘ連鎖型はＤＦＮと呼ばれる。各型とも、最初に記載された順に番号が振られている。例えば、ＤＦＮＡ１は、非症候性聴力喪失聴の常染色体優性型として最初に記載された。遺伝的原因による難聴及び／または聴力喪失症例の７５パーセント～８０パーセントは、常染色体劣性パターンで遺伝しており、これは、各細胞における遺伝子の両方のコピーが変異を有することを意味する。通常、常染色体劣性難聴及び／または聴力喪失を有する個体の各親は、変異遺伝子の１つのコピーのキャリアであるが、この型の難聴の影響を受けない。非症候性難聴及び／または聴力喪失症例の更に２０％～２５％は、常染色体優性であり、これは、各細胞における改変された遺伝子の１つのコピーが、聴力喪失及び／または難聴をもたらすのに十分であることを意味する。常染色体優性聴力喪失及び／または難聴を有する人々は、ほとんどの場合、聴力喪失及び／または難聴を有する親から遺伝子の改変されたコピーを受け継ぐ。聴力喪失及び／または難聴の１～２パーセントの症例は、Ｘ連鎖遺伝パターンを示し、これは、状態の原因となる変異遺伝子がＸ染色体（２つの性染色体のうちの１つ）上に位置することを意味する。Ｘ連鎖非症候性難聴及び／または聴力喪失を有する男性は、同じ遺伝子変異のコピーを受け継ぐ女性よりも早期に重度の難聴を発症する傾向がある。Ｘ連鎖遺伝の特徴として、父親はＸ連鎖遺伝を息子に渡すことができないことが挙げられる。ミトコンドリアＤＮＡへの変化に起因するミトコンドリア非症候性難聴は、米国では１パーセント未満の症例で発生する。改変されたミトコンドリアＤＮＡは、母親から全ての息子及び娘に受け継がれる。この型の難聴は父親から受け継いだものではない。症候群及び非症候性聴力喪失及び／または難聴の原因は複雑である。研究者は、改変された場合、症候性及び／または非症候性聴力喪失及び／または難聴に関連付けられる３０以上の遺伝子を同定したが、これらの遺伝子の一部は完全には特徴付けられていない。同じ遺伝子における異なる変異は、異なる型の聴力喪失及び／または難聴に関連付けることができ、いくつかの遺伝子は、症候性及び非症候性聴力喪失及び／または難聴の両方に関連付けられる。

【0060】

いくつかの実施形態では、聴力喪失及び／または難聴は、伝音性（外耳道もしくは中耳から生じる）、感音性（内耳もしくは聴神経から生じる）、または混合性であり得る。いくつかの実施形態では、非症候性聴力喪失及び／または難聴は、内耳の構造の損傷によって引き起こされる永続的な難聴（感音性聴力喪失）と関連付けられる。いくつかの実施形態では、感音性難聴は、有毛細胞機能の不良に起因し得る。いくつかの実施形態では、感音性経聴覚障害は、脳の第８脳神経（内耳神経）または聴覚部分に関与する。そのようないくつかの実施形態では、脳の聴覚中心のみが影響を受ける。そのような状況では、正常な閾値では音が聞こえ得るが、知覚される音の質が非常に悪く、発話が理解できない皮質性聴力喪失が生じ得る。中耳の変化に起因する難聴は、伝音性難聴と呼ばれる。非症候性聴力喪失及び／または難聴のいくつかの形態は、混合性難聴と呼ばれる、内耳と中耳の両方における変化を伴う。子供が話すことを学ぶ前に存在する難聴及び／または聴力喪失は、言語習得前もしくは先天性難聴及び／または聴力喪失に分類することができる。発話発達後に生じる難聴及び／または聴力喪失は、言語習得後難聴及び／または聴力喪失として分類することができる。症候性または非症候性難聴に関連するほとんどの常染色体劣性遺伝子座は、重度～最重度の言語習得前難聴を引き起こす。

【0061】

当業者に既知のように、有毛細胞は、脊椎動物の耳の聴覚系及び前庭系の両方の感覚受容体である。有毛細胞は環境中の動きを検出し、哺乳動物では、有毛細胞は耳の蝸牛内、コルチ器官内に位置する。哺乳動物の耳には、内部有毛細胞と外部有毛細胞の２種類の有毛細胞があることが知られている。外部有毛細胞は、有毛細胞束の機械的な移動または有毛細胞小体の電気的に駆動される移動のいずれかを通じて、低レベルの音周波数を増幅することができる。内部有毛細胞は、蝸牛液中の振動を、聴覚神経が脳に伝達する電気信号に変換する。いくつかの実施形態では、有毛細胞は、出生時に異常であり得るか、または個体の生涯中に損傷され得る。いくつかの実施形態では、外部有毛細胞は、再生することができる場合がある。いくつかの実施形態では、内部有毛細胞は、病気または怪我の後に再生することができない。いくつかの実施形態では、感音性難聴は、有毛細胞の異常に起因する。

【0062】

当業者に既知のように、有毛細胞は単離されて生じるものではなく、それらの機能は、支持細胞と総称され得る多種多様な細胞によって支持される。支持細胞は、多数の機能を果たし得、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、ピラー細胞、クラウディウス細胞、内指節細胞、及び境界細胞を含むが、これらに限定されない、多数の細胞型を含む。いくつかの実施形態では、感音性難聴は、支持細胞の異常に起因する。いくつかの実施形態では、支持細胞は、出生時に異常であり得るか、または個体の生涯中に損傷され得る。いくつかの実施形態では、支持細胞は、再生することができる場合がある。いくつかの実施形態では、ある特定の支持細胞は、再生することができる場合がある。

【0063】

溶質輸送体ファミリー２６メンバー４（ＳＬＣ２６Ａ４）
ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、高度に保存され、ペンドリンタンパク質をコードする。ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、第７ｑ２２染色体上に位置する。この遺伝子は、約５７キロ塩基（ｋｂ）を包含する２１個のエクソンを含有する（ＮＣＢＩ受託番号ＮＧ＿００８４８９．１）。ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子から発現される完全長野生型ペンドリンタンパク質は、約７８０アミノ酸長である。

【0064】

ペンドリンは、陰イオン交換タンパク質であり、ナトリウム非依存性の塩化物－ヨウ化物交換体として機能するとともに、ギ酸塩及び炭酸水素塩の交換体として機能する。ペンドリンは、硫酸塩輸送体と相同性を有する。内耳では、ペンドリンは、イオン交換体として、具体的には塩化物及び炭酸水素塩交換体として機能し、そこで、ペンドリンは、内リンパ液のｐＨを制御するのに役立つと考えられている。適切に機能するペンドリンタンパク質が欠如すると、特定のイオンの不均衡が生じ得る。結果として生じるイオンの不均衡は、内耳内の甲状腺及び構造の発達及び／または機能を妨げる可能性がある。哺乳動物の内耳では、適切に機能するペンドリンが欠如すると、内リンパの酸性化、コルチ器官及び前庭斑における感覚細胞の重度の変性、ならびに耳石及び耳石膜の奇形が生じる。

【0065】

ペンドリンタンパク質は、複雑な三次構造を有し、かつ折り畳みが困難であると考えられている。ＳＬＣ２６Ａ４及び／またはペンドリンの変異の一部は、ミスフォールディング／欠陥輸送及びその後の分解につながると考えられている。いくつかのペンドリンバリアントは、原形質膜に到達し、輸送機能の障害を示すが。

【0066】

ＳＬＣ２６Ａ４タンパク質は、蝸牛、前庭迷路、及び内リンパ嚢及び管の複数の非感覚細胞集団において発現される。現在の理論によって限定されないが、内耳では、ペンドリンは、内リンパ嚢及び管の上皮内で、嚢、尿道、膨大部内の移行細胞の頂端膜上で、及び蝸牛内の多種多様な細胞型（内部及び外部有毛細胞、ダイテルス細、クラウディウス細胞、らせん靭帯、らせん神経節、らせん隆起、外らせん溝細胞）内、ならびに周辺細胞、中間細胞、及び基底細胞内で発現していると考えられている。

【0067】

ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異は、難聴及び聴力喪失と関連付けられている（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１４：７７３－７７９，２００６、及びＱｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ １９（１）：５２－５８，２０１５（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異は、ペンドリンの構造または機能を変化させ、その内因性機能を破壊する。ＳＬＣ２６Ａ４には、難聴に関連付けられた２００以上の変異が報告されている。例えば、点変異Ｅ２９Ｑ、Ｖ１３８Ｆ、Ｌ２３６Ｐ、Ｇ２０９Ｖ、Ｌ２３６Ｐ、Ｖ２３９Ｄ、Ｖ２５０Ａ、Ｄ２６６Ｎ、Ｅ３０３Ｑ、Ｆ３４５Ｓ、Ｎ３９２Ｙ、Ｒ４０９Ｈ、Ｔ４１０Ｍ、Ｔ４１６Ｐ、Ｌ４４５Ｗ、Ｌ５９７Ｓ、Ｄ６９７、Ｋ７１５Ｎ、Ｈ７２３Ｒ、及びＥ７３７Ｄは、世界中の患者（例えば、少なくとも中国人、台湾人、モンゴル人、トルコ人、パキスタン人、フランス人、スペイン人、チェコ人、イラン人、オランダ人、ドイツ人、イギリス人、及び／または北米の患者）に報告されており、症候性または非症候性の難聴と関連付けられている（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８（３）：２８１－２９０，２０１５、及びＴｓｕｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ．２０１５ Ｍａｙ；１２４ Ｓｕｐｐｌ １：６１Ｓ－７６Ｓ．（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴を有する対象において検出されたＳＬＣ２６Ａ４遺伝子における更なる例示的な変異、及びＳＬＣ２６Ａ４をコードする核酸を配列決定する方法は、例えば、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１４：７７３－７７９，２００６、及びＱｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ １９（１）：５２－５８，２０１５（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に記載されている。遺伝子における変異の検出方法は、当該技術分野において周知である。かかる技術の非限定的な例としては、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＰＣＲ、サンガー配列決定、次世代配列決定、サザンブロッティング、及びノーザンブロッティングが挙げられる。

【0068】

ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子及びコードされたペンドリンタンパク質の変異は、ペンドレッド症候群と関連している。ペンドレッド症候群は、先天性感音性難聴、蝸牛異常（前庭水管拡大またはモンディーニ奇形）、及び甲状腺肥大（甲状腺腫）を含む常染色体劣性遺伝障害である。先天性難聴症例の約８％がペンドレッド症候群に起因すると推定され、ペンドレッド症候群の罹患率は、米国またはＥＵ５の１０万出生児当たり約８～１６人であり、約４０～８０，０００人の個体の集団が罹患していることになる。ペンドレッド症候群の大半の人において、内耳の変化によって引き起こされる重度～最重度難聴は、出生前、出生時、または出生直後に明らかである。古典的には、難聴は両側性であり、重度～最重度であり、先天性（または言語習得前）である。しかしながら、難聴は発症が遅く、進行性である可能性があり、進行は幼児期に急速であり得、頭部損傷または感染に関連付けられ得る。

【0069】

ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異はまた、前庭水管（ＥＶＡ）の拡大を伴う常染色体劣性聴力喪失－４（ＤＦＮＢ４）を引き起こすことが知られており、これは難聴の別の先天的原因である。この疾患状態は、非症候性前庭水管拡大症（ＮＳＥＶＡ）と呼ばれる場合もある。ＳＬＣ２６Ａ４の特定の変異は、ＤＦＮＢ４を引き起こす可能性が高い一方で、他の変異は、ペンドレッド症候群とより関連している（Ａｚａｉｅｚ，ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１２２（５）：４５１－７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＤＦＮＢ４の患者は、概して、ペンドレッド症候群の追加の甲状腺腫の徴候を欠いている。

【0070】

ペンドレッド症候群と２つの変異体ＳＬＣ２６Ａ４対立遺伝子の存在との間の相関が報告されているが、一方でＤＦＮＢ４は、変異体ＳＬＣ２６Ａ４対立遺伝子のいずれか１つと関連付けられているか、または更にはそのいずれとも関連付けられていない場合があることが報告されている。まれに、ＤＦＮＢ４は、ＦＯＸＩ１遺伝子の変異、またはＳＬＣ２６Ａ４遺伝子及び相互作用遺伝子ＦＯＸＩ１もしくはＫＣＮＪ１０におけるヘテロ接合変異の２遺伝子遺伝を通じても生じ得る。ＤＦＮＢ４難聴を有する個体の場合、聴覚障害の程度及びその発現は異なる場合がある。例えば、ＤＦＮＢ４を有する人々は、正常な聴力で生まれ、幼少期に徐々に聴覚障害になるのが一般的である。ＤＦＮＢ４患者の大部分（約８０％）は、聴力の変動を報告している。

【0071】

Ｓｌｃ２６Ａ４ノックアウト（ＫＯ）に対してホモ接合性である特定のマウスモデルは、胚１５日後、出生後第２週までに内リンパ拡張、コルチ器官及び前庭斑における感覚細胞の重度の変性を示したことが報告されており、耳石及び耳石膜の奇形が生じている。マウスでは、ペンドリンの喪失は、内リンパの酸性化と関連付けられている。

【0072】

上述のように、数百のＳＬＣ２６Ａ４遺伝子変異が同定されており、近年、様々なマウスモデルが、かかる遺伝子変異に関連するＤＦＮＢ４及びペンドレッド症候群の病因の理解を加速させている（例えば、Ａ．Ｎｉｓｈｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｌｃ２６ａ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ａｑｕｅｄｕｃｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（２０１６）７４ｅ８２、Ｔ．Ｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｓｔｒｉａ ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ Ｓｌｃ２６ａ４－ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ａｑｕｅｄｕｃｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３１０（２０１５）１８８ｅ１９７、Ｙ．Ｃ．Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐ．Ｈ７２３Ｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｄｅａｆｎｅｓｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＳＬＣ２６Ａ４ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（６）（２０１４），ｅ６４９０６、Ｔ．Ｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｌｃ２６ａ４－ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｓ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｎｇ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｓｔｒｉａ ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．６６（２０１４）５３ｅ６５、Ｐ．Ｗａｎｇｅｍａｎｎ，Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｐｅｎｄｒｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｏｃｈｌｅａｒ ａｎｄ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２（７）（２０１３）１５７ｅ１６５、及びＸ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，ＳＬＣ２６Ａ４ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ ｒｅｓｃｕｅｓ ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ＳＬＣ２６Ａ４ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．９（７）（２０１３），ｅ１００３６４１（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0073】

いくつかの状況では、異なるＳＬＣ２６Ａ４変異を有する患者は、異なる臨床表現型と関連付けられている（例えば、Ｈ．Ａｚａｉｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＳＬＣ２６Ａ４－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅａｆｎｅｓｓ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１２２（５）（２００７）４５１ｅ４５７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ヒトと同様に、異なる変異を有するマウスは、異なる表現型を有することが報告されている。例えば、ｐｄｓ－／－マウスは完全に聴力喪失であり、前庭機能不全の兆候も見られ、コルチ器官及び前庭の両方で重度の有毛細胞の変性が生じ、前庭で耳石及び耳石膜の奇形が観察された。ｐ．Ｓ４０８Ｆ変異を有するＳｌｃ２６ａ４^{ｌｏｏｐ／ｌｏｏｐ}マウスは最重度の聴力喪失であり、耳石の異常な前庭挙動及び奇形を呈するが、前庭有毛細胞の形態は正常である。しかしながら、ｐ．Ｈ７２３Ｒ変異を有するＳｌｃ２６ａ４^{ｔｍ２Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ２Ｄｏｎｔｕｈ}マウスは、正常な音声及び前庭表現型及び内耳形態を示し得る。細胞株研究は、特定のＳＬＣ２６Ａ４変異がペンドリンの機能を部分的に損なうだけであることを示しており、Ｂ．Ｙ．Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｏ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＳＬＣ２６Ａ４ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ａｑｕｅｄｕｃｔ：ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｒ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ？Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３０（４）（２００９）５９９ｅ６０８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、いくつかの状況では、異なる変異のそれぞれに関連付けられた病理が異なることを示す。加えて、患者は典型的に、中等度～最重度の感音性聴覚障害を呈する（例えば、Ｙ．Ｙｕａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ＳＬＣ２６Ａ４ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｌａｒｇｅｄ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ａｑｕｅｄｕｃｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（１１）（２０１２），ｅ４９９８４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）が、しかしながら、ほぼ全ての場合において、既存のＳｌｃ２６ａ４変異体マウス株（例えば、Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ２Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ２Ｄｏｎｔｕｈ}）は、聴覚及び前庭機能の最重度の喪失、ならびに必ずしもヒト表現型を模倣していない重度の内耳奇形を有する。

【0074】

本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を利用して、Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}マウスを作製して、白人における最も一般的なＳＬＣ２６Ａ４変異を模倣した（例えば、Ｊ．Ｓ．Ｙｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ＳＬＣ２６Ａ４ ｍｕｔａｎｔｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４５（７）（２００８）４１１ｅ４１９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。変異体Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}マウスは、疾患兆候のヒトスペクトルを模倣して、可変の表現型プロファイルを有する。いくつかの実施形態では、Ｌ２３６Ｐマウスは、中等度～最重度の難聴を呈した（例えば、図１４Ａを参照されたい）。Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスは、ヒト疾患状態を模倣することができ、ペンドレッド症候群の発症機序及びペンドレッド症候群に関連付けられた症状を緩和するための潜在的な遺伝子治療の有効性を説明するための有用なツールを提供する。いくつかの実施形態では、そのようなモデルで生成された結果は、以前に記載されたマウスモデルと比較して、ヒト疾患状態及び潜在的な治療介入の結果をより正確に模倣し得る。

【0075】

ＳＬＣ２６Ａ４ポリヌクレオチド
とりわけ、本開示は、ポリヌクレオチド、例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含む組成物、及びそのようなポリヌクレオチド及び／または組成物を利用する方法を提供する。

【0076】

いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分を含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のエクソン及び／またはイントロンを含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分を含むポリヌクレオチドから発現される。いくつかの実施形態では、かかるポリヌクレオチドの発現は、１つ以上の制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位など）を利用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、１つ以上の制御要素を含み得る。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、哺乳動物ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、マウスＳｌｃ２６ａ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、霊長類ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である。例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ ｃＤＮＡ配列は、配列番号１または配列番号２の配列であるか、またはそれを含む。例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３に見出すことができる。非翻訳領域を含む例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ ｃＤＮＡ配列は、配列番号４または５の配列であるか、またはそれを含む。
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ ｃＤＮＡコード配列（配列番号１）
ＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＴＣＴＡＣＴＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＧＴＧＡＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＧＧＡＧＴＴＡＧＴＡＣＴＧＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＡＴＧＧＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＴＧＡＧＧＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＡＴＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＴＣＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＧＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＧＧＴＣＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＣＧＴＧＴＡＴＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴＡＣＴＡＧＣＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＡＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＡＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＴＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＴＧＣＣＡＴＴＡＧＡＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＧＡＧＡＴＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＧＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＣＧＧＴＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＡＣＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＣＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＧＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＡＴＧＣＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＡＴＣＣＴＡＡ
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ ｃＤＮＡコード配列（配列番号２）
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例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ゲノムＤＮＡ配列（配列番号３）
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【表2】

非翻訳領域を含む例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ ｃＤＮＡ配列（配列番号４）
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非翻訳領域を含む例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４ ｃＤＮＡ配列（配列番号５）
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【0079】

本開示は、ポリヌクレオチド配列へのある特定の変化が、その発現、または上記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質に影響を及ぼさないことを認識する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のサイレント変異を有するＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のサイレント変異を有するＳＬＣ２６Ａ４遺伝子、例えば、配列番号１、２、３、４、または５とは異なる配列を有するが、機能的ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子と同じアミノ酸配列をコードするＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、２、３、４、または５とは異なる配列を有し、１つ以上の変異を含むアミノ酸配列（例えば、機能的ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子から産生されるものと比較して、異なるアミノ酸配列）をコードするＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供し、１つ以上の変異は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、２、３、４、または５とは異なる配列を有し、１つ以上の変異を含むアミノ酸配列（例えば、機能的ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子から産生されるものと比較して、異なるアミノ酸配列）をコードするＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供し、１つ以上の変異は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはコードされたペンドリンタンパク質の特徴部分内にはない。いくつかの実施形態では、本開示によるポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、または５の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、または５の配列と同一であるＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含む。当技術分野において理解できるように、配列番号１、２、３、４または５は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて増加したまたは最適な発現を達成するように最適化され得る（例えば、コドン最適化され得る）。

【0080】

ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子によってコードされるポリペプチド
とりわけ、本開示は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分によってコードされるポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、哺乳動物ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、Ｓｌｃ２ａ４遺伝子は、マウスＳｌｃ２ａ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、霊長類ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子は、ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である。

【0081】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ペンドリンタンパク質またはその特徴部分を含む。いくつかの実施形態では、ペンドリンタンパク質またはその特徴部分は、哺乳動物ペンドリンタンパク質またはその特徴部分、例えば、霊長類ペンドリンタンパク質またはその特徴部分である。いくつかの実施形態では、ペンドリンタンパク質またはその特徴部分は、ヒトペンドリンタンパク質またはその特徴部分である。

【0082】

いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリペプチドは、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるペンドリンタンパク質またはその特徴部分は、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、グリコシル化（例えば、Ｎ連結グリコシル化、Ｏ連結グリコシル化）、リン酸化、アセチル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、硫酸化、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。

【0083】

例示的なヒトペンドリンタンパク質配列は、配列番号６の配列であるか、またはそれを含む。Ｃ末端フラグタグを有する例示的なヒトペンドリンタンパク質配列は、配列番号７の配列であるか、またはそれを含む。
例示的なヒトペンドリンタンパク質配列（配列番号６）
ＭＡＡＰＧＧＲＳＥＰＰＱＬＰＥＹＳＣＳＹＭＶＳＲＰＶＹＳＥＬＡＦＱＱＱＨＥＲＲＬＱＥＲＫＴＬＲＥＳＬＡＫＣＣＳＣＳＲＫＲＡＦＧＶＬＫＴＬＶＰＩＬＥＷＬＰＫＹＲＶＫＥＷＬＬＳＤＶＩＳＧＶＳＴＧＬＶＡＴＬＱＧＭＡＹＡＬＬＡＡＶＰＶＧＹＧＬＹＳＡＦＦＰＩＬＴＹＦＩＦＧＴＳＲＨＩＳＶＧＰＦＰＶＶＳＬＭＶＧＳＶＶＬＳＭＡＰＤＥＨＦＬＶＳＳＳＮＧＴＶＬＮＴＴＭＩＤＴＡＡＲＤＴＡＲＶＬＩＡＳＡＬＴＬＬＶＧＩＩＱＬＩＦＧＧＬＱＩＧＦＩＶＲＹＬＡＤＰＬＶＧＧＦＴＴＡＡＡＦＱＶＬＶＳＱＬＫＩＶＬＮＶＳＴＫＮＹＮＧＶＬＳＩＩＹＴＬＶＥＩＦＱＮＩＧＤＴＮＬＡＤＦＴＡＧＬＬＴＩＶＶＣＭＡＶＫＥＬＮＤＲＦＲＨＫＩＰＶＰＩＰＩＥＶＩＶＴＩＩＡＴＡＩＳＹＧＡＮＬＥＫＮＹＮＡＧＩＶＫＳＩＰＲＧＦＬＰＰＥＬＰＰＶＳＬＦＳＥＭＬＡＡＳＦＳＩＡＶＶＡＹＡＩＡＶＳＶＧＫＶＹＡＴＫＹＤＹＴＩＤＧＮＱＥＦＩＡＦＧＩＳＮＩＦＳＧＦＦＳＣＦＶＡＴＴＡＬＳＲＴＡＶＱＥＳＴＧＧＫＴＱＶＡＧＩＩＳＡＡＩＶＭＩＡＩＬＡＬＧＫＬＬＥＰＬＱＫＳＶＬＡＡＶＶＩＡＮＬＫＧＭＦＭＱＬＣＤＩＰＲＬＷＲＱＮＫＩＤＡＶＩＷＶＦＴＣＩＶＳＩＩＬＧＬＤＬＧＬＬＡＧＬＩＦＧＬＬＴＶＶＬＲＶＱＦＰＳＷＮＧＬＧＳＩＰＳＴＤＩＹＫＳＴＫＮＹＫＮＩＥＥＰＱＧＶＫＩＬＲＦＳＳＰＩＦＹＧＮＶＤＧＦＫＫＣＩＫＳＴＶＧＦＤＡＩＲＶＹＮＫＲＬＫＡＬＲＫＩＱＫＬＩＫＳＧＱＬＲＡＴＫＮＧＩＩＳＤＡＶＳＴＮＮＡＦＥＰＤＥＤＩＥＤＬＥＥＬＤＩＰＴＫＥＩＥＩＱＶＤＷＮＳＥＬＰＶＫＶＮＶＰＫＶＰＩＨＳＬＶＬＤＣＧＡＩＳＦＬＤＶＶＧＶＲＳＬＲＶＩＶＫＥＦＱＲＩＤＶＮＶＹＦＡＳＬＱＤＹＶＩＥＫＬＥＱＣＧＦＦＤＤＮＩＲＫＤＴＦＦＬＴＶＨＤＡＩＬＹＬＱＮＱＶＫＳＱＥＧＱＧＳＩＬＥＴＩＴＬＩＱＤＣＫＤＴＬＥＬＩＥＴＥＬＴＥＥＥＬＤＶＱＤＥＡＭＲＴＬＡＳ
Ｃ末端フラグタグを有する例示的なヒトペンドリンタンパク質配列（配列番号７）
ＭＡＡＰＧＧＲＳＥＰＰＱＬＰＥＹＳＣＳＹＭＶＳＲＰＶＹＳＥＬＡＦＱＱＱＨＥＲＲＬＱＥＲＫＴＬＲＥＳＬＡＫＣＣＳＣＳＲＫＲＡＦＧＶＬＫＴＬＶＰＩＬＥＷＬＰＫＹＲＶＫＥＷＬＬＳＤＶＩＳＧＶＳＴＧＬＶＡＴＬＱＧＭＡＹＡＬＬＡＡＶＰＶＧＹＧＬＹＳＡＦＦＰＩＬＴＹＦＩＦＧＴＳＲＨＩＳＶＧＰＦＰＶＶＳＬＭＶＧＳＶＶＬＳＭＡＰＤＥＨＦＬＶＳＳＳＮＧＴＶＬＮＴＴＭＩＤＴＡＡＲＤＴＡＲＶＬＩＡＳＡＬＴＬＬＶＧＩＩＱＬＩＦＧＧＬＱＩＧＦＩＶＲＹＬＡＤＰＬＶＧＧＦＴＴＡＡＡＦＱＶＬＶＳＱＬＫＩＶＬＮＶＳＴＫＮＹＮＧＶＬＳＩＩＹＴＬＶＥＩＦＱＮＩＧＤＴＮＬＡＤＦＴＡＧＬＬＴＩＶＶＣＭＡＶＫＥＬＮＤＲＦＲＨＫＩＰＶＰＩＰＩＥＶＩＶＴＩＩＡＴＡＩＳＹＧＡＮＬＥＫＮＹＮＡＧＩＶＫＳＩＰＲＧＦＬＰＰＥＬＰＰＶＳＬＦＳＥＭＬＡＡＳＦＳＩＡＶＶＡＹＡＩＡＶＳＶＧＫＶＹＡＴＫＹＤＹＴＩＤＧＮＱＥＦＩＡＦＧＩＳＮＩＦＳＧＦＦＳＣＦＶＡＴＴＡＬＳＲＴＡＶＱＥＳＴＧＧＫＴＱＶＡＧＩＩＳＡＡＩＶＭＩＡＩＬＡＬＧＫＬＬＥＰＬＱＫＳＶＬＡＡＶＶＩＡＮＬＫＧＭＦＭＱＬＣＤＩＰＲＬＷＲＱＮＫＩＤＡＶＩＷＶＦＴＣＩＶＳＩＩＬＧＬＤＬＧＬＬＡＧＬＩＦＧＬＬＴＶＶＬＲＶＱＦＰＳＷＮＧＬＧＳＩＰＳＴＤＩＹＫＳＴＫＮＹＫＮＩＥＥＰＱＧＶＫＩＬＲＦＳＳＰＩＦＹＧＮＶＤＧＦＫＫＣＩＫＳＴＶＧＦＤＡＩＲＶＹＮＫＲＬＫＡＬＲＫＩＱＫＬＩＫＳＧＱＬＲＡＴＫＮＧＩＩＳＤＡＶＳＴＮＮＡＦＥＰＤＥＤＩＥＤＬＥＥＬＤＩＰＴＫＥＩＥＩＱＶＤＷＮＳＥＬＰＶＫＶＮＶＰＫＶＰＩＨＳＬＶＬＤＣＧＡＩＳＦＬＤＶＶＧＶＲＳＬＲＶＩＶＫＥＦＱＲＩＤＶＮＶＹＦＡＳＬＱＤＹＶＩＥＫＬＥＱＣＧＦＦＤＤＮＩＲＫＤＴＦＦＬＴＶＨＤＡＩＬＹＬＱＮＱＶＫＳＱＥＧＱＧＳＩＬＥＴＩＴＬＩＱＤＣＫＤＴＬＥＬＩＥＴＥＬＴＥＥＥＬＤＶＱＤＥＡＭＲＴＬＡＳＧＳＲＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ
例示的なマウスペンドリンタンパク質配列（配列番号５６）
ＭＡＡＲＧＧＲＳＥＰＰＱＬＡＥＹＳＣＳＹＴＶＳＲＰＶＹＳＥＬＡＦＱＱＱＲＥＲＲＬＰＥＲＲＴＬＲＤＳＬＡＲＳＣＳＣＳＲＫＲＡＦＧＶＶＫＴＬＬＰＩＬＤＷＬＰＫＹＲＶＫＥＷＬＬＳＤＩＩＳＧＶＳＴＧＬＶＧＴＬＱＧＭＡＹＡＬＬＡＡＶＰＶＱＦＧＬＹＳＡＦＦＰＩＬＴＹＦＶＦＧＴＳＲＨＩＳＶＧＰＦＰＶＶＳＬＭＶＧＳＶＶＬＳＭＡＰＤＤＨＦＬＶＰＳＧＮＧＳＡＬＮＳＴＴＬＤＴＧＴＲＤＡＡＲＶＬＬＡＳＴＬＴＬＬＶＧＩＩＱＬＶＦＧＧＬＱＩＧＦＩＶＲＹＬＡＤＰＬＶＧＧＦＴＴＡＡＡＦＱＶＬＶＳＱＬＫＩＶＬＮＶＳＴＫＮＹＮＧＩＬＳＩＩＹＴＬＩＥＩＦＱＮＩＧＤＴＮＩＡＤＦＩＡＧＬＬＴＩＩＶＣＭＡＶＫＥＬＮＤＲＦＫＨＲＩＰＶＰＩＰＩＥＶＩＶＴＩＩＡＴＡＩＳＹＧＡＮＬＥＫＮＹＮＡＧＩＶＫＳＩＰＳＧＦＬＰＰＶＬＰＳＶＧＬＦＳＤＭＬＡＡＳＦＳＩＡＶＶＡＹＡＩＡＶＳＶＧＫＶＹＡＴＫＨＤＹＶＩＤＧＮＱＥＦＩＡＦＧＩＳＮＶＦＳＧＦＦＳＣＦＶＡＴＴＡＬＳＲＴＡＶＱＥＳＴＧＧＫＴＱＶＡＧＬＩＳＡＶＩＶＭＶＡＩＶＡＬＧＲＬＬＥＰＬＱＫＳＶＬＡＡＶＶＩＡＮＬＫＧＭＦＭＱＶＣＤＶＰＲＬＷＫＱＮＫＴＤＡＶＩＷＶＦＴＣＩＭＳＩＩＬＧＬＤＬＧＬＬＡＧＬＬＦＡＬＬＴＶＶＬＲＶＱＦＰＳＷＮＧＬＧＳＶＰＳＴＤＩＹＫＳＩＴＨＹＫＮＬＥＥＰＥＧＶＫＩＬＲＦＳＳＰＩＦＹＧＮＶＤＧＦＫＫＣＩＮＳＴＶＧＦＤＡＩＲＶＹＮＫＲＬＫＡＬＲＲＩＱＫＬＩＫＫＧＱＬＲＡＴＫＮＧＩＩＳＤＩＧＳＳＮＮＡＦＥＰＤＥＤＶＥＥＰＥＥＬＮＩＰＴＫＥＩＥＩＱＶＤＷＮＳＥＬＰＶＫＶＮＶＰＫＶＰＩＨＳＬＶＬＤＣＧＡＶＳＦＬＤＶＶＧＶＲＳＬＲＭＩＶＫＥＦＱＲＩＤＶＮＶＹＦＡＬＬＱＤＤＶＬＥＫＭＥＱＣＧＦＦＤＤＮＩＲＫＤＲＦＦＬＴＶＨＤＡＩＬＨＬＱＮＱＶＫＳＲＥＧＱＤＳＬＬＥＴＶＡＲＩＲＤＣＫＤＰＬＤＬＭＥＡＥＭＮＡＥＥＬＤＶＱＤＥＡＭＲＲＬＡＳ
例示的なマウス変異体ペンドリンタンパク質配列（配列番号５７）
ＭＡＡＲＧＧＲＳＥＰＰＱＬＡＥＹＳＣＳＹＴＶＳＲＰＶＹＳＥＬＡＦＱＱＱＲＥＲＲＬＰＥＲＲＴＬＲＤＳＬＡＲＳＣＳＣＳＲＫＲＡＦＧＶＶＫＴＬＬＰＩＬＤＷＬＰＫＹＲＶＫＥＷＬＬＳＤＩＩＳＧＶＳＴＧＬＶＧＴＬＱＧＭＡＹＡＬＬＡＡＶＰＶＱＦＧＬＹＳＡＦＦＰＩＬＴＹＦＶＦＧＴＳＲＨＩＳＶＧＰＦＰＶＶＳＬＭＶＧＳＶＶＬＳＭＡＰＤＤＨＦＬＶＰＳＧＮＧＳＡＬＮＳＴＴＬＤＴＧＴＲＤＡＡＲＶＬＬＡＳＴＬＴＬＬＶＧＩＩＱＬＶＦＧＧＬＱＩＧＦＩＶＲＹＬＡＤＰＬＶＧＧＦＴＴＡＡＡＦＱＶＬＶＳＱＰＫＩＶＬＮＶＳＴＫＮＹＮＧＩＬＳＩＩＹＴＬＩＥＩＦＱＮＩＧＤＴＮＩＡＤＦＩＡＧＬＬＴＩＩＶＣＭＡＶＫＥＬＮＤＲＦＫＨＲＩＰＶＰＩＰＩＥＶＩＶＴＩＩＡＴＡＩＳＹＧＡＮＬＥＫＮＹＮＡＧＩＶＫＳＩＰＳＧＦＬＰＰＶＬＰＳＶＧＬＦＳＤＭＬＡＡＳＦＳＩＡＶＶＡＹＡＩＡＶＳＶＧＫＶＹＡＴＫＨＤＹＶＩＤＧＮＱＥＦＩＡＦＧＩＳＮＶＦＳＧＦＦＳＣＦＶＡＴＴＡＬＳＲＴＡＶＱＥＳＴＧＧＫＴＱＶＡＧＬＩＳＡＶＩＶＭＶＡＩＶＡＬＧＲＬＬＥＰＬＱＫＳＶＬＡＡＶＶＩＡＮＬＫＧＭＦＭＱＶＣＤＶＰＲＬＷＫＱＮＫＴＤＡＶＩＷＶＦＴＣＩＭＳＩＩＬＧＬＤＬＧＬＬＡＧＬＬＦＡＬＬＴＶＶＬＲＶＱＦＰＳＷＮＧＬＧＳＶＰＳＴＤＩＹＫＳＩＴＨＹＫＮＬＥＥＰＥＧＶＫＩＬＲＦＳＳＰＩＦＹＧＮＶＤＧＦＫＫＣＩＮＳＴＶＧＦＤＡＩＲＶＹＮＫＲＬＫＡＬＲＲＩＱＫＬＩＫＫＧＱＬＲＡＴＫＮＧＩＩＳＤＩＧＳＳＮＮＡＦＥＰＤＥＤＶＥＥＰＥＥＬＮＩＰＴＫＥＩＥＩＱＶＤＷＮＳＥＬＰＶＫＶＮＶＰＫＶＰＩＨＳＬＶＬＤＣＧＡＶＳＦＬＤＶＶＧＶＲＳＬＲＭＩＶＫＥＦＱＲＩＤＶＮＶＹＦＡＬＬＱＤＤＶＬＥＫＭＥＱＣＧＦＦＤＤＮＩＲＫＤＲＦＦＬＴＶＨＤＡＩＬＨＬＱＮＱＶＫＳＲＥＧＱＤＳＬＬＥＴＶＡＲＩＲＤＣＫＤＰＬＤＬＭＥＡＥＭＮＡＥＥＬＤＶＱＤＥＡＭＲＲＬＡＳ

【0084】

本開示は、本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸配列における特定の変異（例えば、ペンドリンまたはその特徴部分を含む）が、ポリペプチドの発現、折り畳み、または活性に影響を及ぼさないことを認識する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、ペンドリンまたはその特徴部分を含む）は、１つ以上の変異を含み、１つ以上の変異は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、本開示に従うポリペプチドは、配列番号６の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるペンドリンまたはその特徴部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるポリペプチドは、配列番号６の配列と同一であるペンドリンまたはその特徴部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示に従うポリペプチドは、配列番号７の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるペンドリンまたはその特徴部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるポリペプチドは、配列番号７の配列と同一のペンドリンタンパク質またはその特徴部分を含む。

【0085】

構築物
とりわけ、本開示は、本明細書に記載される一部のポリヌクレオチドがポリヌクレオチド構築物であることを提供する。本開示によるポリヌクレオチド構築物には、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドもしくはリポソームに含まれる）及びウイルス構築物（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス構築物）を含む当該技術分野において既知の全てのものが含まれる。当業者は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれかを作製するために好適な構築物、及び細胞を選択することができるであろう。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミド（すなわち、細胞内で自律的に複製することができる環状ＤＮＡ分子）である。いくつかの実施形態では、構築物は、コスミド（例えば、ｐＷＥまたはｓＣｏｓシリーズ）であり得る。

【0086】

いくつかの実施形態では、構築物は、ウイルス構築物である。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス構築物である。いくつかの実施形態では、構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物である（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：６９９－７０８０，２０１２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、アデノウイルス構築物である。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、アルファウイルスに基づくか、またはそれに由来し得る。アルファウイルスとしては、シンドビス（及びＶＥＥＶ）ウイルス、オーラウイルス、ババンキウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エヴァグレーズウイルス、フォートモーガンウイルス、ゲタウイルス、ハイランズＪウイルス、キジラガッハウイルス、マヤロウイルス、Ｍｅ Ｔｒｉウイルス、ミドルバーグウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミナミゾウアザラシウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｔｒｏｃａｒａウイルス、ウナウイルス、ベネベラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、及びワタロアウイルスが挙げられる。概して、そのようなウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質において翻訳され得る非構造的（例えば、レプリコン）及び構造的タンパク質（例えば、カプシド及びエンベロープ）をコードする。ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は、いずれも、コード配列送達のためのウイルス構築物を開発するために使用されている。偽型ウイルスは、アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質及びレトロウイルスカプシドを組み合わせることによって形成され得る。アルファウイルス構築物の例は、米国特許公開第２０１５００５０２４３号、同第２００９０３０５３４４号、及び同第２００６０１７７８１９号に見出すことができ、構築物及びそれらの作製方法は、その全体が各公開物を参照することによって本明細書に組み込まれる。

【0087】

本明細書において提供される構築物は、異なるサイズであり得る。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミドであり、最大約１ｋｂ、最大約２ｋｂ、最大約３ｋｂ、最大約４ｋｂ、最大約５ｋｂ、最大約６ｋｂ、最大約７ｋｂ、最大約８ｋｂ、最大約９ｋｂ、最大約１０ｋｂ、最大約１１ｋｂ、最大約１２ｋｂ、最大約１３ｋｂ、最大約１４ｋｂ、または最大約１５ｋｂの全長を含むことができる。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミドであり、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約１ｋｂ～約９ｋｂ、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約１ｋｂ～約１１ｋｂ、約１ｋｂ～約１２ｋｂ、約１ｋｂ～約１３ｋｂ、約１ｋｂ～約１４ｋｂ、または約１ｋｂ～約１５ｋｂの範囲の全長を有することができる。

【0088】

いくつかの実施形態では、構築物は、ウイルス構築物であり、最大１０ｋｂの総ヌクレオチド数を有することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約１ｋｂ～約９ｋｂ、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約９ｋｂ、約２ｋｂ～約１０ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約９ｋｂ、約３ｋｂ～約１０ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約９ｋｂ、約４ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約９ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約６ｋｂ～約１０ｋｂ、約７ｋｂ～約８ｋｂ、約７ｋｂ～約９ｋｂ、約７ｋｂ～約１０ｋｂ、約８ｋｂ～約９ｋｂ、約８ｋｂ～約１０ｋｂ、または約９ｋｂ～約１０ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有することができる。

【0089】

いくつかの実施形態では、構築物は、レンチウイルス構築物であり、最大８ｋｂの総ヌクレオチド数を有することができる。いくつかの例では、レンチウイルス構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、または約７ｋｂ～約８ｋｂの総ヌクレオチド数を有することができる。

【0090】

いくつかの実施形態では、構築物は、アデノウイルス構築物であり、最大８ｋｂの総ヌクレオチド数を有することができる。いくつかの実施形態では、アデノウイルス構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、または約７ｋｂ～約８ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有することができる。

【0091】

本明細書に記載の構築物のうちのいずれかは、制御配列、例えば、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＲＮＡスプライシング配列、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、及び／または転写前もしくは転写後調節及び／または制御要素を収容し得る追加の非翻訳領域から選択される制御配列を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターであり得る。制御配列の非限定的な例は、本明細書に記載される。

【0092】

ＡＡＶ粒子
とりわけ、本開示は、本明細書に記載のＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴的部分をコードする構築物、及び本明細書に記載のカプシドを含むＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、血清型を有するものとして説明することができ、これは構築物株及びカプシド株の説明である。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２として説明されてもよく、粒子は、ＡＡＶ２カプシド及び特徴的なＡＡＶ２反転末端反復（ＩＴＲ）を含む構築物を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、偽型として説明されてもよく、カプシド及び構築物は、異なるＡＡＶ株に由来し、例えば、ＡＡＶ２／９は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドを利用する構築物を含むＡＡＶ粒子を指す。

【0093】

ＡＡＶ構築物
本開示は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分を含むポリヌクレオチドは、ＡＡＶ粒子に含まれ得る。

【0094】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、天然に存在するＡＡＶゲノム構築物に由来するかまたはそれから改変された１つ以上の成分を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物に由来する配列は、ＡＡＶ１構築物、ＡＡＶ２構築物、ＡＡＶ３構築物、ＡＡＶ４構築物、ＡＡＶ５構築物、ＡＡＶ６構築物、ＡＡＶ７構築物、ＡＡＶ８構築物、ＡＡＶ９構築物、ＡＡＶ２．７ｍ８構築物、ＡＡＶ８ＢＰ２構築物、ＡＡＶ２９３構築物、またはＡＡＶ Ａｎｃ８０構築物である。本明細書で使用することができる追加の例示的なＡＡＶ構築物は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｋａｎａａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ８：１８４－１９７，２０１７、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（７）：１２５２－１２６０，２００８、Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：３０７５，２０１４、Ｉｓｇｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０（１）：４２７，２０１９、及びＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（１２）：６３８１－６３８８，２００４（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0095】

いくつかの実施形態では、提供される構築物は、コード配列、例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分、１つ以上の調節配列及び／または対照配列、ならびに任意選択的に５’及び３’ＡＡＶ由来の反転末端反復（ＩＴＲ）を含む。５’及び３’ＡＡＶ由来のＩＴＲが利用されるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物と呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、提供されるｒＡＡＶ構築物は、ＡＡＶ粒子を形成するためにＡＡＶカプシドにパッケージングされる。

【0096】

いくつかの実施形態では、（ポリヌクレオチド構築物に含まれる）ＡＡＶ由来の配列は、典型的には、シス作用の５’及び３’ＩＴＲ配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，”ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８，１９９０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。典型的なＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列は、約１４５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、典型的なＩＴＲ配列の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）が、本明細書において提供される構築物に組み込まれる。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０ ５３２，１９９６（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などのテキストを参照されたい。）いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコード配列及び／または構築物のいずれかは、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在特定されているＡＡＶタイプを含む、任意の既知のＡＡＶから得られ得る。

【0097】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、本開示に従って、かつ当該技術分野に既知のパターンで記載されている（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：６９９－７０８０，２０１２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、典型的には、コード配列またはその一部、少なくとも１つ及び／または制御配列、ならびに任意選択的に５’及び３’ＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）からなる。いくつかの実施形態では、提供される構築物をカプシド内にパッケージングして、ＡＡＶ粒子を作製することができる。ＡＡＶ粒子は、選択された標的細胞に送達されてもよい。いくつかの実施形態では、提供される構築物は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）または他の遺伝子産物をコードする、構築物配列に対して異種の核酸配列（例えば、阻害核酸配列）である追加の任意のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸コード配列は、標的組織の細胞におけるコード配列転写、翻訳、及び／または発現を可能にする方法で、成分に作動可能に連結及び／またはそれを制御している。

【0098】

図１のパネル（Ａ）に示すように、非修飾ＡＡＶ内在性ゲノムは、ＩＴＲに隣接する「ｃａｐ」及び「ｒｅｐ」という２つのオープンリーディングフレームを含む。図１のパネル（Ｂ）に示すように、例示的なｒＡＡＶ構築物は、同様に、コード領域、例えば、コード配列（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子）に隣接するＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物はまた、本開示によって産生されたプラスミド構築物がトランスフェクトされた細胞または本開示によって産生されたウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳、及び／または発現を可能にする方法で、コード配列に作動可能に連結される従来の制御要素を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物は、任意選択的に、プロモーター（図１のパネル（Ｂ）に示される）、エンハンサー、非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシング部位（例えば、受容部位、供与部位）、ポリアデニル化部位（図１のパネル（Ｂ）に示される）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。かかる追加の要素は、本明細書において更に説明する。

【0099】

いくつかの実施形態では、構築物は、ｒＡＡＶ構築物である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物は、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも３．５ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、または少なくとも４．５ｋｂを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物は、最大７．５ｋｂ、最大７ｋｂ、最大６．５ｋｂ、最大６ｋｂ、最大５．５ｋｂ、最大５ｋｂ、最大４．５ｋｂ、最大４ｋｂ、最大３．５ｋｂ、最大３ｋｂ、または最大２．５ｋｂを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、または約４ｋｂ～約５ｋｂを含むことができる。

【0100】

本明細書に記載の構築物のうちのいずれかは、調節配列及び／または制御配列、例えば、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＲＮＡスプライシング配列、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、及び／またはそれらの任意の組み合わせの群から選択される制御配列を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターであり得る。制御配列の非限定的な例は、本明細書に記載される。

【0101】

例示的な構築物成分
反転末端反復配列（ＩＴＲ）
構築物のＡＡＶ由来配列は、典型的には、シス作用の５’及び３’ＩＴＲを含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８，１９９０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一般に、ＩＴＲはヘアピンを形成することができる。ヘアピンを形成する能力は、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的な合成を可能にする、自己プライムするＩＴＲの能力に寄与することができる。ＩＴＲは、ＡＡＶ構築物をＡＡＶ粒子内で効率的にカプシド化するのを助ける。

【0102】

本開示のｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０粒子）は、コード配列（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子）及び５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する関連する要素を含むｒＡＡＶ構築物を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、約１４５個の核酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲをコードする配列の全てまたは実質的に全てが使用される。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在特定されている哺乳動物ＡＡＶタイプを含む、任意の既知のＡＡＶから得られ得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0103】

本開示で使用される構築物分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用」構築物であり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節要素は、５’または「左」及び３’または「右」のＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。５’及び左という名称は、センス方向で左から右に読まれた構築物全体に対するＩＴＲ配列の位置を指す。例えば、いくつかの実施形態では、５’または左のＩＴＲは、構築物がセンス方向で線形に示されている場合、所与の構築物のプロモーターに最も近いＩＴＲである（ポリアデニル化配列とは異なる）。同時に、３’及び右という名称は、センス方向で左から右に読まれた構築物全体に対するＩＴＲ配列の位置を指す。例えば、いくつかの実施形態では、３’または右のＩＴＲは、構築物がセンス方向で線形に示されている場合、所与の構築物のポリアデニル化配列に最も近いＩＴＲである（プロモーター配列とは異なる）。本明細書において提供されるＩＴＲは、センス鎖に従って、５’から３’の順で示される。したがって、当業者は、センス方向からアンチセンス方向に変換するときに、５’または「左」方向のＩＴＲも３’または「右」ＩＴＲとして描写することができることを理解するであろう。更に、所与のセンスＩＴＲ配列（例えば、５’／左ＡＡＶ ＩＴＲ）をアンチセンス配列（例えば、３’／右ＩＴＲ配列）に変換することは、十分に当業者の能力の範囲内である。当業者であれば、５’／左または３’／右のＩＴＲ、またはそのアンチセンスバージョンのいずれかとして使用するために、所与のＩＴＲ配列をどのように修飾するかを理解するであろう。

【0104】

例えば、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号１０による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、配列番号１１による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、当技術分野で知られているように、１つ以上の修飾、例えば、切断、欠失、置換、または挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、１４５個未満のヌクレオチド、例えば、１２７、１３０、１３４、または１４１個のヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、または１４５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号１２による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、配列番号１３による配列を有することができる。

【0105】

５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号１０である。３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号１１である。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶ構築物は、５’ＡＡＶ ＩＴＲ及び／または３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１２である。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１３である。いくつかの実施形態では、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、配列番号１０及び１１、または１２及び１３）は、コード配列の一部分、例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子（例えば、配列番号１または２）の全部または一部分に隣接する。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などのテキストを参照されたい。）いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ配列は、配列番号１０または１２で表される５’ＩＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲ配列は、配列番号１１または１３で表される３’ＩＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。
例示的な５’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１０）
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
例示的な３’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１１）
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ
例示的な５’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１２）
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
例示的な３’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１３）
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ

【0106】

プロモーター
いくつかの実施形態では、構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）は、プロモーターを含む。「プロモーター」という用語は、作動可能に連結された遺伝子（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子）の転写を促進する及び／または開始することができる酵素／タンパク質によって認識されるＤＮＡ配列を指す。例えば、プロモーターは、典型的には、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または任意の関連因子が結合し、そこから転写を開始することができるヌクレオチド配列を指す。したがって、いくつかの実施形態では、構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）は、本明細書に記載の非限定的な例示的プロモーターの１つに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、哺乳動物細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、キメラプロモーター、人工プロモーター、組織特異的プロモーター、または当技術分野で既知の任意の他のタイプのプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＨＩプロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター、またはブタＵ６プロモーターを含むがこれらに限定されないＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。プロモーターは、一般に、内耳細胞内で転写を促進することができるプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、蝸牛特異的プロモーターまたは蝸牛指向プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、有毛細胞特異的プロモーター、または支持細胞特異的プロモーターである。

【0108】

様々なプロモーターが当該技術分野で既知であり、本明細書で使用することができる。本明細書で使用できるプロモーターの非限定的な例としては、ヒトＥＦ１α、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（米国特許第５，１６８，０６２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１、ポリオーマアデノウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、β－グロビン、β－アクチン、α－フェトプロテイン、γ－グロビン、β－インターフェロン、γ－グルタミルトランスフェラーゼ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス、ラットインスリン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、メタロチオネインＩＩ（ＭＴ ＩＩ）、アミラーゼ、カテプシン、ＭＩムスカリン受容体、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＨＴＬＶ）、ＡＡＶ ＩＴＲ、インターロイキン－２、コラゲナーゼ、血小板由来増殖因子、アデノウイルス５ Ｅ２、ストロメリシン、マウスＭＸ遺伝子、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４）、α－２－マクログロブリン、ビメンチン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子Ｈ－２_Ｋｂ、ＨＳＰ７０、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、甲状腺刺激ホルモンα遺伝子、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ ＤＱα及びＤＱ、インターロイキン２受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲα、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼＩ、アルブミン遺伝子、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ＨＡ－ｒａｓ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイド（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮ Ｉ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヒト免疫不全ウイルス、ギボンサル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）プロモーターが挙げられる。プロモーターの更なる例は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｌｏｄｉｓｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００７（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターまたはＣＡＧ／ＣＢＡプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１４を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１５を含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号１６に例示されるＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター構築物を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号１７に例示されるＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター構築物を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４３に例示されるＣＡＧプロモーターまたはＣＭＶ／ＣＢＡ／ＳＶ－４０エンハンサー／プロモーター構築物を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４４に例示されるＣＡＧプロモーターまたはＣＭＶ／ＣＢＡ／ＳＶ－４０エンハンサー／プロモーター構築物を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号１４または１５で表されるプロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号１６、１７、４３、または４４で表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。

【0109】

「構成的」プロモーターという用語は、タンパク質をコードする核酸（例えば、ペンドリンタンパク質）と作動可能に連結された場合に、ほとんどまたは全ての生理学的条件下で細胞において核酸からＲＮＡを転写させるヌクレオチド配列を指す。

【0110】

構成的プロモーターの例には、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０，１９８５（その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１－アルファプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0111】

誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度等の環境因子、または特定の生理学的状態（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞においてのみ）の存在によって調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導性系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含むが、これらに限定されない様々な商業的供給源から入手可能である。誘導性プロモーターの更なる例は、当該技術分野で既知である。

【0112】

外因的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（ＷＯ９８／１００８８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．９３：３３４６－３３５１，１９９６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．８９：５５４７－５５５１，１９９２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、テトラサイクリン誘導性系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６－１７６９，１９９５、またＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２－５１８，１９９８（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい）、ＲＵ４８６誘導性系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９－２４３，１９９７、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２－４４１，１９９７（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、及びラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５－２８７２，１９９７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。

【0113】

「組織特異的」プロモーターという用語は、ある特定の細胞型及び／または組織でのみ活性なプロモーターを指す（例えば、特定の遺伝子の転写は、組織特異的プロモーターに結合する転写調節及び／または対照タンパク質を発現する細胞内でのみ起こる）。

【0114】

いくつかの実施形態では、調節配列及び／または制御配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。いくつかの場合では、組織特異的調節及び／または対照配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。

【0115】

いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、蝸牛特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、蝸牛有毛細胞特異的プロモーターである。蝸牛有毛細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、ＡＴＯＨ１プロモーター、ＰＯＵ４Ｆ３プロモーター、ＬＨＸ３プロモーター、ＭＹＯ７Ａプロモーター、ＭＹＯ６プロモーター、α９ＡＣＨＲプロモーター、及びαｌ０ＡＣＨＲプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＰＲＥＳＴＩＮプロモーターまたはＯＮＣＯＭＯＤプロモーターなどの蝸牛有毛細胞特異的プロモーターである。例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０５：１４９－１５５，２０００；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３ ｌ：１９９－２０３，２００４；及びＲｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．６６：９９－１１５，２００９を参照されたい。

【0116】

いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、耳細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、内耳細胞特異的プロモーターである。内耳非感覚細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＳＬＣ２６Ａ４、ＴＥＣＴＡ、ＤＦＮＡ５、ＣＯＣＨ、ＮＤＰ、ＳＹＮ１、ＧＦＡＰ、ＰＬＰ、ＴＡＫ１、またはＳＯＸ２１。いくつかの実施形態では、蝸牛非感覚細胞特異的プロモーターは、内耳支持細胞特異的プロモーターであり得る。内耳支持細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＳＯＸ２、ＦＧＦＲ３、ＰＲＯＸ１、ＧＬＡＳＴ１、ＬＧＲ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＮＯＴＣＨ１、ＪＡＧ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＳＯＸ１０、Ｐ７５、ＣＤ４４、ＨＥＹ２、ＬＦＮＧ、またはＳ１００ｂ。

【0117】

いくつかの実施形態では、提供されるＡＡＶ構築物は、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、またはＣＢ７プロモーターから選択されるプロモーター配列を含む。本明細書に記載の治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のまたは単独のＡＡＶ構築物は、蝸牛及び／または内耳特異的プロモーターから選択される少なくとも１つのプロモーター配列を更に含む。
例示的なＣＢＡプロモーター（配列番号１４）
ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
例示的なＣＢＡプロモーター（配列番号１５）
ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
例示的なＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター（配列番号１６）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
例示的なＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター（配列番号１７）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
例示的なＣＡＧエンハンサー／プロモーター（配列番号４３）
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例示的なＣＡＧエンハンサー／プロモーター（配列番号４４）
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【0118】

ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号１８に記載の内因性ヒトＡＴＯＨ１エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号１８で表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なヒトＡＴＯＨ１エンハンサー－プロモーター（配列番号１８）
ＣＴＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＣＡＴＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡＣＡＴＡＴＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＡＴＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＡＧＴＧＣＴＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＡＴＴＡＧＣＡＡＴＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＡＴＡＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＴＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＣＧＧＧＴＴＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＡＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＣＧＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＣＧＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＣＧＣＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＧＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＴＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＧＧＧＧＴＧＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＣＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＧＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＧＴＴＧＣＡＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡ

【0119】

ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４５または４６に記載される内因性ヒトＳＬＣ２６Ａ４即時（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４７、４８、または５０に記載の内因性ヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号４５、４６、４７、４８、または５０で表されるプロモーターまたはエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４７、４８、または５０内に含まれるヒトＳＬＣ２６Ａ４内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４即時プロモーター（配列番号４５）
ＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧ
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４即時プロモーター（配列番号４６）
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例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーター（配列番号４７）
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例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーター（配列番号４８）
ＧＧＣＴＧＣＴＣＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＣＧＣＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＴＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＡＧＡＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＧＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＡＣＴＴＴＣＧＧＴＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＴＴＣＴＡＧＧＡＧＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＴＡＣＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＧＣＴＡＡＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＧＣＴＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＣＧＴＡＡＣＴＡＧＡＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＡＧ
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーター（配列番号５０）
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【0120】

ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号５１に記載のヒトＬＧＲ５エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号５１で表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号５１内に含まれるヒトＬＧＲ５内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＬＧＲ５エンハンサー－プロモーター（配列番号５１）
ＡＧＧＧＣＴＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＴＴＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＧＧＧＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＣＡＴＴＣＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＡＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＧＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧＧＴＣＴＣＴＣＣＧＡＡＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＡＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＴＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＣＧＴＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＣＣＣＣＴＡＣＴＴＣＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＴ

【0121】

ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号５２に記載のヒトＳＹＮ１エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号５２で表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号５２内に含まれるヒトＳＹＮ１内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＳＹＮ１エンハンサー－プロモーター（配列番号５２）
ＴＧＣＧＴＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＣＣＴＧＡＣＧＡＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＧＣＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＡＧＡＡ

【0122】

ある特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号５３に記載のヒトＧＦＡＰエンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号５３で表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号５３内に含まれるヒトＧＦＡＰ内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＧＦＡＰエンハンサー－プロモーター（配列番号５３）
ＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＡＣＡＡＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＣＡＣＴＴＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＣＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＴＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＡＡＣＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＡＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＣ

【0123】

エンハンサー
場合によっては、構築物には、エンハンサー配列を含めることができる。「エンハンサー」という用語は、目的のタンパク質（例えば、ペンドリンタンパク質）をコードする核酸の転写のレベルを増加させることができるヌクレオチド配列を指す。エンハンサー配列（一般に、長さが５０～１５００ｂｐ）は、一般に、転写関連タンパク質（例えば、転写因子）に追加の結合部位を提供することによって転写のレベルを増加させる。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、イントロン配列内に見られる。プロモーター配列とは異なり、エンハンサー配列は、（例えば、プロモーターと比較して）転写開始部位からより離れた距離で作用することができる。エンハンサーの非限定的な例には、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、及び／またはＳＶ４０エンハンサーが含まれる。いくつかの実施形態では、構築物は、配列番号１９によって例示されるＣＭＶエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号１９で表されるエンハンサー配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＳＶ－４０由来エンハンサーは、配列番号２０によって例示されるＳＶ－４０Ｔイントロン配列である。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号２０で表されるエンハンサー配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なＣＭＶエンハンサー（配列番号１９）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧ
例示的なＳＶ－４０合成イントロン（配列番号２０）
ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧ

【0124】

隣接する非翻訳領域である５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物のいずれかは、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。遺伝子のＵＴＲは転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲは、転写開始部位から開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に開始し、転写終結シグナルまで続く。ＵＴＲの調節機構及び／または制御機構は、本明細書に記載の構築物、組成物、キット、または方法のうちのいずれかに組み込まれて、ペンドリンタンパク質の発現を増強するか、またはそうでなければ調節することができる。

【0125】

天然５’ＵＴＲは、翻訳開始に役割を果たす配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、Ｋｏｚａｋ配列のように、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られている配列を含むことができる。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサス配列ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（ＡまたはＧ）であり、開始コドンの後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することでも知られている。

【0126】

いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかに含まれる。以下の遺伝子：アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、及び第ＶＩＩＩ因子由来のものを含む５’ＵＴＲの非限定的な例を使用して、ｍＲＮＡなどの核酸分子の発現を増強することができる。

【0127】

いくつかの実施形態では、蝸牛内の細胞によって転写されるｍＲＮＡからの５’ＵＴＲは、本明細書に記載されている構築物、組成物、キット、及び方法のうちのいずれかに含めることができる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子座に由来し、配列番号２１によって例示される内因性配列の全部または一部を含み得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、配列番号２１で表される５’ＵＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。

【0128】

３’ＵＴＲは、目的の遺伝子の終止コドンのすぐ３’に見出される。いくつかの実施形態では、蝸牛内の細胞によって転写されるｍＲＮＡからの３’ＵＴＲは、本明細書に記載されている構築物、組成物、キット、及び方法のうちのいずれかに含めることができる。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、内因性ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子座に由来し、配列番号２２によって例示される内因性配列の全部または一部を含み得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２２で表される３’ＵＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。

【0129】

３’ＵＴＲは、アデノシン及びウリジン（ＲＮＡ形態）またはチミジン（ＤＮＡ形態）の伸長がそれらに埋め込まれていることで知られている。これらのＡＵリッチ特性は、特に高い回転率を有する遺伝子に見られる。それらの配列特質及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）は３つのクラスに分類され得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５７７７－５７８８，１９９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：２０１０－２０１８，１９９５（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）：クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内のＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含む。例えば、ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤ ｍＲＮＡは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２つ以上の重複ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－アルファｍＲＮＡは、クラスＩＩのＡＲＥを含有する例である。クラスＩＩＩのＡＲＥはあまり定義されてない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含まず、このクラスの２つのよく研究された例は、ｃ－Ｊｕｎ及びミオゲニンｍＲＮＡである。

【0130】

ＡＲＥに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られている一方で、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、最も顕著には、ＨｕＲがｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つのクラスの全てのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を操作して核酸分子の３’ＵＴＲに入れることにより、ＨｕＲ結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化がもたらされるであろう。

【0131】

いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ ＡＲＥの導入、除去、または修飾を使用して、ペンドリンタンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性を調節することができる。他の実施形態では、ＡＲＥを除去または変異させて、細胞内安定性を増加させ、したがって、ペンドリンタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。

【0132】

他の実施形態では、非ＡＲＥ配列が、５’または３’ＵＴＲに組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、イントロンまたはイントロン配列の一部が、本明細書において提供される構築物、組成物、キット、及び方法のうちのいずれかにおいて、ポリヌクレオチドの隣接領域に組み込まれてもよい。イントロン配列の組み込みにより、タンパク質産生、ならびにｍＲＮＡレベルが増加し得る。
例示的な５’ＵＴＲ配列（配列番号２１）
ＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＡＧＧＡＴＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＧＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＣ
例示的な３’ＵＴＲ配列（配列番号２２）
ＡＡＧＴＧＧＧＴＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＴＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＡＡＧＡＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧＧＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＴＡＧＡＧＴＧＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＡＧＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＴＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＴＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＡＧＴＡＴＣＴＡＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＡＴＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＴＴＡＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＣＡＴＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＴＡＧＴＣＴＡＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＴＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＡＴＧＴＡＴＡＧＧＴＡＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧＣＴＴＡＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＧＴＡＡＴＣＴＴＴＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣＴＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＡＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＧＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＣＴＴＧＣＴＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＴＧＧＴＡＴＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴＧＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＣＴＡＧＧＡＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＡＣＴＡＣＴＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＴＣＧＣＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＣＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＴＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＴＡＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＡＴＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＡＡＧＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＣＧＧＧＡＡＴＡＣＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＧＧＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＣＴＴＴＴＡＡＡＣＴＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡ

【0133】

配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
いくつかの実施形態では、ペンドリンタンパク質をコードする構築物は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むことができる。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳが位置する場所からすぐ下流にｍＲＮＡを有する任意の位置から翻訳を開始させる複雑な二次構造を形成する（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（３）：１１０３－１１１２，１９８８を参照されたい）。

【0134】

例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、コオロギ麻痺ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びポリオウイルス（ＰＶ）由来のものを含む、当業者に既知のＩＲＥＳ配列がいくつか存在する。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２、及びＨｅｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５（１３）：１５９３－６１２，２００１（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0135】

いくつかの実施形態では、ペンドリンタンパク質、またはペンドリンタンパク質のＣ末端部分をコードする構築物に組み込まれるＩＲＥＳ配列は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列である。口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリプロテインの切断を媒介することが示されている小さなペプチド（約１８アミノ酸長）である（Ｒｙａｎ，ＭＤ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ４：９２８－９３３，１９９４、Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８１２４－８１２７，１９９６、Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８６４－８７３，２００１、及びＨａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：４５３－４５９，１９９９（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。２Ａ配列の切断活性は、プラスミド及び遺伝子療法構築物（ＡＡＶ及びレトロウイルス）を含む人工系において以前に実証されている（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ４：９２８－９３３，１９９４、Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８１２４－８１２７，１９９６、Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８６４－８７３，２００１、及びＨａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：４５３－４５９，１９９９、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１９８－２０８，１９９９、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉ Ｉ：１９２１－１９３１，２０００、及びＫｌｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８１１－８１７，２００１（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。

【0136】

ＩＲＥＳは、ＡＡＶ構築物において利用することができる。いくつかの実施形態では、ペンドリンタンパク質のＣ末端部分をコードする構築物は、ポリヌクレオチド配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、２つ以上の構築物を含む組成物の一部であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、単一遺伝子転写産物から２つ以上のポリペプチドを産生するために使用される。

【0137】

スプライス部位
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される構築物のうちのいずれかは、転写中に生じるＲＮＡプロセシング中に機能的である、スプライス供与配列及び／またはスプライス受容配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、スプライス部位は、トランススプライシングに関与する。
例示的なスプライス供与イントロン（配列番号４１）
ＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴ
例示的なスプライス受容イントロン（配列番号４２）
ＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ

【0138】

ポリアデニル化配列
いくつかの実施形態では、本発明で提供する構築物は、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナル配列を含むことができる。大半の新生真核生物ｍＲＮＡは、それらの３’末端、に、一次転写物の切断及びポリ（Ａ）シグナル配列によって駆動される共役ポリアデニル化反応を含む複雑なプロセス中に付加されるポリ（Ａ）テールを有する（例えば、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０８：５０１－５１２，２００２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの安定性及び転移性を付与する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、コード配列に対して３’に配置される。

【0139】

本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」とは、ポリアデニリル部分またはその修飾されたバリアントの、メッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合を指す。真核生物では、大半のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってプレｍＲＮＡに付加される長い（例えば、５０、６０、７０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００）アデニンヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、特定の配列、例えば、ポリ（Ａ）シグナルを含む転写産物に付加される。ポリ（Ａ）テール及び関連タンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを助ける。ポリアデニル化はまた、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸出、及び翻訳においても役割を果たす。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写の直後に核内で生じるが、後に細胞質内でも生じ得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用によって切断される。切断部位は、通常、切断部位の近くに塩基配列ＡＡＵＡＡＡが存在することによって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の遊離３’末端に付加される。

【0140】

本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）シグナル配列」または「ポリアデニル化シグナル配列」とは、ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断及び一連のアデノシンの切断されたｍＲＮＡの３’末端への付加を誘発する配列である。

【0141】

ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）（Ｗｏｙｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．８１（１３）：３９４４－３９４８，１９８４、米国特許第５，１２２，４５８号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、マウス－β－グロビン、マウス－α－グロビン（Ｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ４（２）：４５３－４５６，１９８５、Ｔｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７１（２）：３１３－３１９，１９８８（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ヒトコラーゲン、ポリオーマウイルス（Ｂａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（９）：４７８３－４７９０，１９９５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ ＴＫ）、ＩｇＧ重鎖遺伝子ポリアデニル化シグナル（ＵＳ２００６／００４０３５４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ １５（７）：１３４０－１３４７，２００７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＳＶ４０後期及び初期ポリ（Ａ）部位などのＳＶ４０ポリ（Ａ）部位（Ｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（１２）：５３８６－５３９３，１９９２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に由来するものを含む、いくつかのポリ（Ａ）シグナル配列を使用することができる。

【0142】

ｐｏｌｙ（Ａ）シグナル配列はＡＡＴＡＡＡにすることができる。ＡＡＴＡＡＡ配列は、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ＣＡＴＡＡＡ、ＴＡＴＡＡＡ、ＧＡＴＡＡＡ、ＡＣＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＴＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＡＴＧＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＴＡＡＣ、ＡＡＴＡＧＡ、ＡＡＴＴＡＡ、またはＡＡＴＡＡＧを含む、ＡＡＴＡＡＡと相同性を有し、ポリアデニル化をシグナル伝達することができる他のヘキサヌクレオチド配列で置換され得る（例えば、ＷＯ０６／１２４１４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0143】

いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、合成ポリアデニル化部位であり得る（例えば、Ｌｅｖｉｔｔ ｅｌ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３（７）：１０１９－１０２５，１９８９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づくＰｒｏｍｅｇａのｐＣｌ－ｎｅｏ発現構築物を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、可溶性ニューロピリン－１（ｓＮＲＰ）のポリアデニル化シグナル（ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＧ（配列番号２３））である（例えば、ＷＯ０５／０７３３８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナルは、配列番号２５を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、ｂＧＨｐＡを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナルは、配列番号２４を含むか、またはそれからなる。ポリ（Ａ）シグナル配列の更なる例は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、配列番号２４または２５で表されるポリ（Ａ）配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列（配列番号２４）
ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧ
例示的なＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列（配列番号２５）
ＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡ

【0144】

追加の配列
いくつかの実施形態では、本開示の構築物は、Ｔ２Ａ要素または配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本開示の構築物は、１つ以上のクローニング部位を含んでもよい。そのようないくつかの実施形態では、クローニング部位は、対象への投与のための製造前に完全に除去されない場合がある。いくつかの実施形態では、クローニング部位は、リンカー配列として、またはＫｏｚａｋ部位の一部分としてなどの機能的役割を有し得る。当業者に理解されるように、クローニング部位は、所望の機能を保持しながら、一次配列において著しく変化し得る。いくつかの実施形態では、構築物は、クローニング部位の任意の組み合わせを含有し得、例示的なクローニング部位は、配列番号２６～３３で表される。
例示的なクローニング部位Ａ（配列番号２６）
ＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴ
例示的なクローニング部位Ｂ（配列番号２７）
ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣ
例示的なクローニング部位Ｃ（配列番号２８）
ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡ
例示的なクローニング部位Ｄ（配列番号２９）
ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧ
例示的なクローニング部位Ｅ（配列番号３０）
ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴ
例示的なクローニング部位Ｆ（配列番号３１）
ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣ
例示的なクローニング部位Ｇ（配列番号３２）
ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡ
例示的なクローニング部位Ｈ（配列番号３３）
ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＣＴ

【0145】

不安定化ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される構築物のうちのいずれかは、タンパク質発現の時間的制御のための不安定化ドメイン（「不安定化配列」）をコードする配列を任意選択的に含むことができる。不安定化配列の非限定的な例としては、ＦＫ５０６配列、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）配列、または他の例示的な不安定化配列をコードする配列が挙げられる。

【0146】

安定化配位子の不在下で、不安定化配列に作動可能に連結されたタンパク質配列は、ユビキチン化によって分解される。対照的に、安定化配位子の存在下では、タンパク質分解が阻害され、それによって、不安定化配列に作動可能に連結されたタンパク質配列を活性的に発現させることができる。タンパク質発現の安定化のための陽性対照として、タンパク質発現は、酵素、放射線撮影、比色、蛍光、または他の分光法アッセイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイ、免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学）を含む従来の手段によって検出することができる。

【0147】

不安定化配列の更なる例は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、不安定化配列は、ＦＫ５０６結合タンパク質及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）配列であり、安定化配位子は、Ｓｈｉｅｌｄ－１（Ｓｈｌｄ１）である（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ １２６（５）：９９５－１００４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、不安定化配列は、ＤＨＦＲ配列であり、安定化配位子は、トリメトプリム（ＴＭＰ）である（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １７：９８１－９８８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。

【0148】

いくつかの実施形態では、不安定化配列は、ＦＫＢＰ１２配列であり、対象細胞（例えば、支持蝸牛外部有毛細胞）中のＦＫＢＰ１２遺伝子を担持するＡＡＶ構築物の存在は、ウエスタンブロッティングによって検出される。いくつかの実施形態では、不安定化配列は、本明細書に記載されるＡＡＶ構築物のうちのいずれかの時間的特異的活性を検証するために使用され得る。
例示的なＤＨＦＲ不安定化アミノ酸配列（配列番号３４）
ＭＩＳＬＩＡＡＬＡＶＤＹＶＩＧＭＥＮＡＭＰＷＮＬＰＡＤＬＡＷＦＫＲＮＴＬＮＫＰＶＩＭＧＲＨＴＷＥＳＩＧＲＰＬＰＧＲＫＮＩＩＬＳＳＱＰＳＴＤＤＲＶＴＷＶＫＳＶＤＥＡＩＡＡＣＧＤＶＰＥＩＭＶＩＧＧＧＲＶＩＥＱＦＬＰＫＡＱＫＬＹＬＴＨＩＤＡＥＶＥＧＤＴＨＦＰＤＹＥＰＤＤＷＥＳＶＦＳＥＦＨＤＡＤＡＱＮＳＨＳＹＣＦＥＩＬＥＲＲ
例示的なＤＨＦＲ不安定化ヌクレオチド配列（配列番号３５）
ＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＡＣＧＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＣＣＧＡＧＴＡＣＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＡ
例示的な不安定化ドメイン（配列番号３６）
ＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＡＣＧＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＣＣＧＡＧＴＡＣＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＧＡ
例示的なＦＫＢＰ１２不安定化ペプチドアミノ酸配列（配列番号３７）
ＭＧＶＥＫＱＶＩＲＰＧＮＧＰＫＰＡＰＧＱＴＶＴＶＨＣＴＧＦＧＫＤＧＤＬＳＱＫＦＷＳＴＫＤＥＧＱＫＰＦＳＦＱＩＧＫＧＡＶＩＫＧＷＤＥＧＶＩＧＭＱＩＧＥＶＡＲＬＲＣＳＳＤＹＡＹＧＡＧＧＦＰＡＷＧＩＱＰＮＳＶＬＤＦＥＩＥＶＬＳＶＱ

【0149】

レポーター配列または要素
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される構築物は、任意選択的に、レポーターポリペプチド及び／またはタンパク質をコードする配列（「レポーター配列」）を含むことができる。レポーター配列の非限定的な例としては、ベータ－ラクタマーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリ性ホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、及びルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。レポーター配列の更なる例は、当該技術分野において既知である。レポーター配列は、それらの発現を駆動する制御要素と関連付けられている場合、酵素、放射線写真、比色分析、蛍光、または他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイ、免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学）を含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供することができる。

【0150】

いくつかの実施形態では、レポーター配列はＬａｃＺ遺伝子であり、哺乳動物細胞（例えば、蝸牛有毛細胞）におけるＬａｃＺ遺伝子を担持する構築物の存在は、ベータ－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。レポーターが蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）またはルシフェラーゼである場合、哺乳動物細胞（例えば、蝸牛有毛細胞）における蛍光タンパク質またはルシフェラーゼを担持する構築物の存在は、蛍光技法（例えば、蛍光顕微鏡法もしくはＦＡＣＳ）または照度計（例えば、分光光度計もしくはＩＶＩＳ撮像機器）における光生成によって測定され得る。いくつかの実施形態では、レポーター配列を使用して、本明細書に記載される構築物のうちのいずれかの組織特異的標的化能力及び組織特異的プロモーター調節及び／または制御活性を検証することができる。

【0151】

いくつかの実施形態では、レポーター配列は、ＦＬＡＧタグ（例えば、３×ＦＬＡＧタグ）であり、哺乳動物細胞（例えば、内耳細胞、例えば、蝸牛有毛細胞または支持細胞）中のＦＬＡＧタグを担持する構築物の存在は、タンパク質結合または検出アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、質量分析）によって検出される。例示的な３×ＦＬＡＧタグ配列は、配列番号３８として提供される。
例示的な３×ＦＬＡＧタグ配列（配列番号３８）
ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ

【0152】

ＡＡＶカプシド
本開示は、ＡＡＶカプシドにパッケージングされた１つ以上のポリヌクレオチド構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ８、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３もしくはＡｎｃ８０血清型のＡＡＶカプシド、もしくはその１つ以上のハイブリッドからのものであるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ祖先血清型に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、祖先（Ａｎｃ）ＡＡＶカプシドである。Ａｎｃカプシドは、進化的確率及び進化的モデリングを使用して構築され、可能性の高い祖先配列を決定する構築配列から作製される。このように、Ａｎｃカプシド／構築物配列は、天然に存在したことが知られていない。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、Ａｎｃ８０カプシド（例えば、Ａｎｃ８０Ｌ６５カプシド）である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号８を含むテンプレートヌクレオチドコード配列を使用して作製される。いくつかの実施形態では、カプシドは、配列番号９で表されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、カプシドは、配列番号９で表されるポリペプチドに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。

【0153】

本明細書において提供されるように、ＡＡＶカプシド及びＡＡＶ構築物（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含む）の任意の組み合わせは、本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子において使用され得る。例えば、野生型またはバリアントＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡｎｃ８０カプシド、野生型またはバリアントＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドなど。本開示のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２成分から完全に構成される（例えば、カプシド及びＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型である）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９粒子（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＡＡＶ構築物を有するＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシド）である。本開示のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ構築物を、コード配列の一部、例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子またはその特徴部分（例えば、配列番号１、２、３、４、または５）に隣接するＡＡＶ ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号１０及び１１）でカプシド化するＡｎｃ８０カプシド（例えば、配列番号９のポリペプチドを含む）を含むＡＡＶ２／Ａｎｃ８０粒子である。他のＡＡＶ粒子は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ １５；８１（２－３）：２７３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、カプシド配列は、それぞれ、配列番号８または９で表されるカプシドヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なＡＡＶ Ａｎｃ８０カプシドＤＮＡ配列（配列番号８）
ＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＣＧＴＡＣＣＴＧＣＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＴＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＴＡＧＡＧＣＡＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＴＣＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＧＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＣＴＣＧＧＡＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＴＡＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＧＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＡＣＧＴＴＧＣＡＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＧＧＣＣＴＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＡＧＣＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣＧＡＴＧＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＴＡＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＡＣＡＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＣＧＧＡＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＣＧＴＴＡＣＣＴＣＡＣＣＣＧＴＡＡＴＣＴＧ
例示的なＡＡＶ Ａｎｃ８０カプシドアミノ酸配列（配列番号９）
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＮＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＳＧＴＡＧＮＲＴＬＱＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＡＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＳＮＶＤＬＤＮＶＭＩＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＴＶＡＴＮＬＱＳＳＮＴＡＰＡＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ＊

【0154】

組成物
とりわけ、本開示は組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される１つ以上の構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数の構築物を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の構築物が組成物に含まれる場合、構築物はそれぞれ異なる。

【0155】

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、複数のＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のＡＡＶ粒子が組成物に含まれるとき、ＡＡＶ粒子はそれぞれ異なる。

【0156】

いくつかの実施形態では、組成物は、ペンドリンタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組成物は細胞を含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的組成物であるか、または薬学的組成物を含む。

【0158】

単一ＡＡＶ構築物組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、単一の構築物から構成されるＡＡＶ粒子を含む組成物または系を提供する。そのようないくつかの実施形態では、単一の構築物は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の機能的（例えば、野生型または他の機能的、例えば、コドン最適化された）コピーをコードするポリヌクレオチドを送達してもよい。いくつかの実施形態では、構築物は、ｒＡＡＶ構築物であるか、またはそれを含む。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、単一のｒＡＡＶ構築物は、標的細胞（例えば、内耳細胞）において、全長ＳＬＣ２６Ａ４メッセンジャーＲＮＡまたはその特徴的なタンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態では、単一の構築物（例えば、本明細書に記載の構築物のうちのいずれか）は、機能的ペンドリンタンパク質（例えば、機能的ペンドリンタンパク質を生成する任意の構築物）をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、単一の構築物（例えば、本明細書に記載の構築物のうちのいずれか）は、機能的ペンドリンタンパク質（例えば、機能的ペンドリンタンパク質を生成する任意の構築物）及び任意選択的に追加のポリペプチド配列（例えば、調節配列、及び／またはレポーター配列）をコードする配列を含むことができる。

【0159】

いくつかの実施形態では、単一の構築物組成物または系は、本明細書に記載の例示的な構築物成分のうちのいずれかまたはそれらの全てを含み得る。いくつかの実施形態では、例示的な単一構築物は、配列番号３９で表される。いくつかの実施形態では、例示的な単一構築物は、配列番号４０で表される。いくつかの実施形態では、例示的な単一構築物は、配列番号３９または４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。当業者は、構築物が、コドン最適化、新規であるが機能的に等価の導入（例えば、サイレント変異）、レポーター配列の付加、及び／または他のルーチン修飾を含む追加の修飾を受け得ることを認識するであろう。

【0160】

いくつかの実施形態では、例示的な構築物は、配列番号１０によって例示される５’ＩＴＲ、任意選択的に配列番号２６によって例示されるクローニング部位、配列番号１９によって例示されるＣＭＶエンハンサー、配列番号１４によって例示されるＣＢＡプロモーター、配列番号２０によって例示されるキメライントロン、任意選択的に配列番号２７によって例示されるクローニング部位、配列番号１によって例示されるＳＬＣ２６Ａ４コード領域、任意選択的に配列番号２８によって例示されるクローニング部位、配列番号２４によって例示されるポリ（Ａ）部位、任意選択的に配列番号２９によって例示されるクローニング部位、及び配列番号１２によって例示される３’ＩＴＲを含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、例示的な構築物は、配列番号１１によって例示される５’ＩＴＲ、任意選択的に配列番号３０によって例示されるクローニング部位、配列番号１９によって例示されるＣＭＶエンハンサー、配列番号１５によって例示されるＣＢＡプロモーター、配列番号２０によって例示されるキメライントロン、任意選択的に配列番号３１によって例示されるクローニング部位、配列番号１によって例示されるＳＬＣ２６Ａ４コード領域、任意選択的に配列番号３８によって例示されるレポーター配列、任意選択的に配列番号３２によって例示されるクローニング部位、配列番号２４によって例示されるポリ（Ａ）部位、任意選択的に配列番号３４によって例示されるクローニング部位、及び配列番号１３によって例示される３’ＩＴＲを含む。
例示的な単一構築物配列（配列番号３９）
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ＦＬＡＧレポーターを有する例示的な単一構築物配列（配列番号４０）
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＴＣＴＡＣＴＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＧＴＧＡＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＧＧＡＧＴＴＡＧＴＡＣＴＧＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＡＴＧＧＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＴＧＡＧＧＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＡＴＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＴＣＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＧＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＧＧＴＣＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＣＧＴＧＴＡＴＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴＡＣＴＡＧＣＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＡＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＡＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＴＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＴＧＣＣＡＴＴＡＧＡＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＧＡＧＡＴＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＧＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＣＧＧＴＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＡＣＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＣＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＧＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＡＴＧＣＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ

【0162】

複数のＡＡＶ構築物組成物
本開示は、タンパク質（例えば、ペンドリンタンパク質）をコードするいくつかのコード配列が、コード配列を、それぞれ異なる構築物に含まれる複数の部分に分割することによって送達されてもよいことを認識する。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、少なくとも２つの異なる構築物（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ）を含む組成物または系である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる構築物のそれぞれは、コード領域の異なる部分をコードするコード配列（例えば、標的タンパク質、例えば、内耳標的タンパク質、例えば、ペンドリンタンパク質をコードする）を含み、コード部分のそれぞれは、少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約６０個のアミノ酸、少なくとも約７０個のアミノ酸、少なくとも約８０個のアミノ酸、少なくとも約９０個のアミノ酸、少なくとも約１００個のアミノ酸、少なくとも約１１０個のアミノ酸、少なくとも約１２０個のアミノ酸、少なくとも約１３０個のアミノ酸、少なくとも約１４０個のアミノ酸、少なくとも約１５０個のアミノ酸、少なくとも約１６０個のアミノ酸、少なくとも約１７０個のアミノ酸、少なくとも約１８０個のアミノ酸、少なくとも約１９０個のアミノ酸、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約２１０個のアミノ酸、少なくとも約２２０個のアミノ酸、少なくとも約２３０個のアミノ酸、少なくとも約２４０個のアミノ酸、少なくとも約２５０個のアミノ酸、少なくとも約２６０個のアミノ酸、少なくとも約２７０個のアミノ酸、少なくとも約２８０個のアミノ酸、少なくとも約２９０個のアミノ酸、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約３１０個のアミノ酸、少なくとも約３２０個のアミノ酸、少なくとも約３３０個のアミノ酸、少なくとも約３４０個のアミノ酸、少なくとも約３５０個のアミノ酸、少なくとも約３６０個のアミノ酸、少なくとも約３７０個のアミノ酸、少なくとも約３８０個のアミノ酸、少なくとも約３９０個のアミノ酸、少なくとも約４００個のアミノ酸、少なくとも約４１０個のアミノ酸、少なくとも約４２０個のアミノ酸、少なくとも約４３０個のアミノ酸、少なくとも約４４０個のアミノ酸、少なくとも約４５０個のアミノ酸、少なくとも約４６０個のアミノ酸、少なくとも約４７０個のアミノ酸、少なくとも約４８０個のアミノ酸、少なくとも約４９０個のアミノ酸、少なくとも約５００個のアミノ酸、少なくとも約５１０個のアミノ酸、少なくとも約５２０個のアミノ酸、少なくとも約５３０個のアミノ酸、少なくとも約５４０個のアミノ酸、少なくとも約５５０個のアミノ酸、少なくとも約５６０個のアミノ酸、少なくとも約５７０個のアミノ酸、少なくとも約５８０個のアミノ酸、少なくとも約５９０個のアミノ酸、少なくとも約６００個のアミノ酸、少なくとも約６１０個のアミノ酸、少なくとも約６２０個のアミノ酸、少なくとも約６３０個のアミノ酸、少なくとも約６４０個のアミノ酸、少なくとも約６５０個のアミノ酸、少なくとも約６６０個のアミノ酸、少なくとも約６７０個のアミノ酸、少なくとも約６８０個のアミノ酸、少なくとも約６９０個のアミノ酸、少なくとも約７００個のアミノ酸、少なくとも約７１０個のアミノ酸、少なくとも約７２０個のアミノ酸、少なくとも約７３０個のアミノ酸、少なくとも約７４０個のアミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約７６０アミノ酸、少なくとも約７７０アミノ酸、少なくとも約７８０個のアミノ酸、少なくとも約７９０個のアミノ酸、少なくとも約８００個のアミノ酸、少なくとも約８１０個のアミノ酸、または少なくとも約８２０個のアミノ酸）であって、コードされた部分の各々のアミノ酸配列が、任意選択的に、コードされた部分の異なるアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、少なくとも２つの異なる構築物の単一の構築物は、活性標的タンパク質をコードしておらず、少なくとも２つの異なる構築物が、対象細胞（例えば、動物細胞、例えば、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞）に導入されると、互いに相同組換えを受け、ここで、組換え核酸が、活性標的タンパク質（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子によってコードされる遺伝子産物またはその特徴部分）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸構築物のうちの１つは、標的タンパク質（例えば、内耳標的タンパク質、例えば、ペンドリンタンパク質）の一部分をコードするコード配列を含むことができ、コード部分は、最大でも約８２０個のアミノ酸（例えば、最大でも約１０個のアミノ酸、最大でも約２０個のアミノ酸、最大でも約３０個のアミノ酸、最大でも約６０個のアミノ酸、最大でも約７０個のアミノ酸、最大でも約８０個のアミノ酸、最大でも約９０個のアミノ酸、最大でも約１００個のアミノ酸、最大でも約１１０個のアミノ酸、最大でも約１２０個のアミノ酸、最大でも約１３０個のアミノ酸、最大でも約１４０個のアミノ酸、最大でも約１５０個のアミノ酸、最大でも約１６０個のアミノ酸、最大でも約１７０個のアミノ酸、最大でも約１８０個のアミノ酸、最大でも約１９０個のアミノ酸、最大でも約２００個のアミノ酸、最大でも約２１０個のアミノ酸、最大でも約２２０個のアミノ酸、最大でも約２３０個のアミノ酸、最大でも約２４０個のアミノ酸、最大でも約２５０個のアミノ酸、最大でも約２６０個のアミノ酸、最大でも約２７０個のアミノ酸、最大でも約２８０個のアミノ酸、最大でも約２９０個のアミノ酸、最大でも約３００個のアミノ酸、最大でも約３１０個のアミノ酸、最大でも約３２０個のアミノ酸、最大でも約３３０個のアミノ酸、最大でも約３４０個のアミノ酸、最大でも約３５０個のアミノ酸、最大でも約３６０個のアミノ酸、最大でも約３７０個のアミノ酸、最大でも約３８０個のアミノ酸、最大でも約３９０個のアミノ酸、最大でも約４００個のアミノ酸、最大でも約４１０個のアミノ酸、最大でも約４２０個のアミノ酸、最大でも約４３０個のアミノ酸、最大でも約４４０個のアミノ酸、最大でも約４５０個のアミノ酸、最大でも約４６０個のアミノ酸、最大でも約４７０個のアミノ酸、最大でも約４８０個のアミノ酸、最大でも約４９０個のアミノ酸、最大でも約５００個のアミノ酸、最大でも約５１０個のアミノ酸、最大でも約５２０個のアミノ酸、最大でも約５３０個のアミノ酸、最大でも約５４０個のアミノ酸、最大でも約５５０個のアミノ酸、最大でも約５６０個のアミノ酸、最大でも約５７０個のアミノ酸、最大でも約５８０個のアミノ酸、最大でも約５９０個のアミノ酸、最大でも約６００個のアミノ酸、最大でも約６１０個のアミノ酸、最大でも約６２０個のアミノ酸、最大でも約６３０個のアミノ酸、最大でも約６４０個のアミノ酸、最大でも約６５０個のアミノ酸、最大でも約６６０個のアミノ酸、最大でも約６７０個のアミノ酸、最大でも約６８０個のアミノ酸、最大でも約６９０個のアミノ酸、最大でも約７００個のアミノ酸、最大でも約７１０個のアミノ酸、最大でも約７２０個のアミノ酸、最大でも約７３０個のアミノ酸、最大でも約７４０個のアミノ酸、最大でも約７５０個のアミノ酸、最大でも約７６０個のアミノ酸、最大でも約７７０個のアミノ酸、最大でも約７８０個のアミノ酸、最大でも約７９０個のアミノ酸、最大でも約８００個のアミノ酸、最大でも約８１０個のアミノ酸、または最大でも約８２０個のアミノ酸）である。

【0163】

いくつかの実施形態では、構築物のうちの少なくとも１つは、標的ゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソン（例えば、内耳標的ゲノムＤＮＡ、例えば、ＳＬＣ２６Ａ４ゲノムＤＮＡ）にわたるヌクレオチド配列を含み、２つの隣接するエクソンの間に天然に存在するイントロン配列を欠く。

【0164】

いくつかの実施形態では、構築物の各々のコード部分のアミノ酸配列は、部分的であっても、コード部分の異なるアミノ酸配列と重複しない。いくつかの実施形態では、構築物のコード部分のアミノ酸配列は、異なる構築物のコード部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。いくつかの実施形態では、各構築物のコード部分のアミノ酸配列は、少なくとも１つの異なる構築物のコード部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。いくつかの実施形態では、重複するアミノ酸配列は、約１０個のアミノ酸残基～約８２０個のアミノ酸、またはこの範囲のサブ範囲のうちのいずれか（例えば、約１０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１１０個のアミノ酸、約１２０個のアミノ酸、約１３０個のアミノ酸、約１４０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約１６０個のアミノ酸、約１７０個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸、約１９０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２１０個のアミノ酸、約２２０個のアミノ酸、約２３０個のアミノ酸、約２４０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約２６０個のアミノ酸、約２７０個のアミノ酸、約２８０個のアミノ酸、約２９０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約３１０個のアミノ酸、約３２０個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、約３４０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸、約３６０個のアミノ酸、約３７０個のアミノ酸、約３８０個のアミノ酸、約３９０個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約４１０個のアミノ酸、約４２０個のアミノ酸、約４３０個のアミノ酸、約４４０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸、約４６０個のアミノ酸、約４７０個のアミノ酸、約４８０個のアミノ酸、約４９０個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸、約５１０個のアミノ酸、約５２０個のアミノ酸、約５３０個のアミノ酸、約５４０個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸、約５６０個のアミノ酸、約５７０個のアミノ酸、約５８０個のアミノ酸、約５９０個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸、約６１０個のアミノ酸、約６２０個のアミノ酸、約６３０個のアミノ酸、約６４０個のアミノ酸、約６５０個のアミノ酸、約６６０個のアミノ酸、約６７０個のアミノ酸、約６８０個のアミノ酸、約６９０個のアミノ酸、約７００個のアミノ酸、約７１０個のアミノ酸、約７２０個のアミノ酸、約７３０個のアミノ酸、約７４０個のアミノ酸、約７５０個のアミノ酸、約７６０個のアミノ酸、約７７０個のアミノ酸、約７８０個のアミノ酸、約７９０個のアミノ酸、約８００個のアミノ酸、約８１０個のアミノ酸、または約８２０個のアミノ酸長）である。

【0165】

いくつかの実施例では、所望の遺伝子産物（例えば、治療用遺伝子産物）は、少なくとも２つの異なる構築物によってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる構築物のそれぞれは、イントロンの異なるセグメントを含み、イントロンは、標的ゲノムＤＮＡ（例えば、内耳細胞標的ゲノムＤＮＡ（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４ゲノムＤＮＡ）（例えば、本明細書に記載の配列番号３における例示的なイントロンのうちのいずれか）に存在するイントロンのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、異なるイントロンセグメントが重複する。いくつかの実施形態では、異なるイントロンセグメントは、最大でも約１２，０００ヌクレオチド（例えば、最大でも約１００ヌクレオチド、最大でも約２００ヌクレオチド、最大でも約３００ヌクレオチド、最大でも約６００ヌクレオチド、最大でも約７００ヌクレオチド、最大でも約８００ヌクレオチド、最大でも約９００ヌクレオチド、最大でも約１，０００ヌクレオチド、最大でも約１，１００ヌクレオチド、最大でも約１，２００ヌクレオチド、最大でも約１，３００ヌクレオチド、最大でも約１，４００ヌクレオチド、最大でも約１，５００ヌクレオチド、最大でも約１，６００ヌクレオチド、最大でも約１，７００ヌクレオチド、最大でも約１，８００ヌクレオチド、最大でも約１，９００ヌクレオチド、最大でも約２，０００ヌクレオチド、最大でも約２，１００ヌクレオチド、最大でも約２，２００ヌクレオチド、最大でも約２，３００ヌクレオチド、最大でも約２，４００ヌクレオチド、最大でも約２，５００ヌクレオチド、最大でも約２，６００ヌクレオチド、最大でも約２，７００ヌクレオチド、最大でも約２，８００ヌクレオチド、最大でも約２，９００ヌクレオチド、最大でも約３，０００ヌクレオチド、最大でも約３，１００ヌクレオチド、最大でも約３，２００ヌクレオチド、最大でも約３，３００ヌクレオチド、最大でも約３，４００ヌクレオチド、最大でも約３，５００ヌクレオチド、最大でも約３，６００ヌクレオチド、最大でも約３，７００ヌクレオチド、最大でも約３，８００ヌクレオチド、最大でも約３，９００ヌクレオチド、最大でも約４，０００ヌクレオチド、最大でも約４，１００ヌクレオチド、最大でも約４，２００ヌクレオチド、最大でも約４，３００ヌクレオチド、最大でも約４，４００ヌクレオチド、最大でも約４，５００ヌクレオチド、最大でも約４，６００ヌクレオチド、最大でも約４，７００ヌクレオチド、最大でも約４，８００ヌクレオチド、最大でも約４，９００ヌクレオチド、最大でも約５，０００ヌクレオチド、最大でも約５，１００ヌクレオチド、最大でも約５，２００ヌクレオチド、最大でも約５，３００ヌクレオチド、最大でも約５，４００ヌクレオチド、最大でも約５，５００ヌクレオチド、最大でも約５，６００ヌクレオチド、最大でも約５，７００ヌクレオチド、最大でも約５，８００ヌクレオチド、最大でも約５，９００ヌクレオチド、最大でも約６，０００ヌクレオチド、最大でも約６，１００ヌクレオチド、最大でも約６，２００ヌクレオチド、最大でも約６，３００ヌクレオチド、最大でも約６，４００ヌクレオチド、最大でも約６，５００ヌクレオチド、最大でも約６，６００ヌクレオチド、最大でも約６，７００ヌクレオチド、最大でも約６，８００ヌクレオチド、最大でも約６，９００ヌクレオチド、最大でも約７，０００ヌクレオチド、最大でも約７，１００ヌクレオチド、最大でも約７，２００ヌクレオチド、最大でも約７，３００ヌクレオチド、最大でも約７，４００ヌクレオチド、最大でも約７，５００ヌクレオチド、最大でも約７，６００ヌクレオチド、最大でも約７，７００ヌクレオチド、最大でも約７，８００ヌクレオチド、最大でも約７，９００ヌクレオチド、最大でも約８，０００ヌクレオチド、最大でも約８，１００ヌクレオチド、最大でも約８，２００ヌクレオチド、最大でも約８，３００ヌクレオチド、最大でも約８，４００ヌクレオチド、最大でも約８，５００ヌクレオチド、最大でも約８，６００ヌクレオチド、最大でも約８，７００ヌクレオチド、最大でも約８，８００ヌクレオチド、最大でも約８，９００ヌクレオチド、最大でも約９，０００ヌクレオチド、最大でも約９，１００ヌクレオチド、最大でも約９，２００ヌクレオチド、最大でも約９，３００ヌクレオチド、最大でも約９，４００ヌクレオチド、最大でも約９，５００ヌクレオチド、最大でも約９，６００ヌクレオチド、最大でも約９，７００ヌクレオチド、最大でも約９，８００ヌクレオチド、最大でも約９，９００ヌクレオチド、最大でも約１０，０００ヌクレオチド、最大でも約１０，１００ヌクレオチド、最大でも約１０，２００ヌクレオチド、最大でも約１０，３００ヌクレオチド、最大でも約１０，４００ヌクレオチド、最大でも約１０，５００ヌクレオチド、最大でも約１０，６００ヌクレオチド、最大でも約１０，７００ヌクレオチド、最大でも約１０，８００ヌクレオチド、最大でも約１０，９００ヌクレオチド、最大でも約１１，０００ヌクレオチド、最大でも約１１，１００ヌクレオチド、最大でも約１１，２００ヌクレオチド、最大でも約１１，３００ヌクレオチド、最大でも約１１，４００ヌクレオチド、最大でも約１１，５００ヌクレオチド、最大でも約１１，６００ヌクレオチド、最大でも約１１，７００ヌクレオチド、最大でも約１１，８００ヌクレオチド、最大でも約１１，９００ヌクレオチド、または最大でも約１２，０００ヌクレオチド）の分だけ配列が重複する。いくつかの実施形態では、異なる構築物のうちのいずれか２つにおける重複ヌクレオチド配列は、標的遺伝子（例えば、内耳細胞標的遺伝子（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子）（例えば、本明細書に記載される配列番号３における例示的なエクソンのうちのいずれか１つ以上）のうちの１つ以上のエクソンの一部または全てを含むことができる。

【0166】

いくつかの実施形態では、組成物または系は、２つ、３つ、４つ、または５つの異なる構築物であるか、またはそれを含む。組成物中の異なる構築物の数が２つである組成物では、２つの異なる構築物のうちの第１のものは、タンパク質（例えば、ペンドリンタンパク質）のＮ末端部分をコードするコード配列を含むことができ、これはリード部分、第１の構築物、または５’部分（例えば、内耳細胞タンパク質のＮ末端部分、例えば、ペンドリンタンパク質のＮ末端部分）と呼ばれ得る。いくつかの例では、標的遺伝子のＮ末端部分は、少なくとも約１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約６０個のアミノ酸、少なくとも約７０個のアミノ酸、少なくとも約８０個のアミノ酸、少なくとも約９０個のアミノ酸、少なくとも約１００個のアミノ酸、少なくとも約１１０個のアミノ酸、少なくとも約１２０個のアミノ酸、少なくとも約１３０個のアミノ酸、少なくとも約１４０個のアミノ酸、少なくとも約１５０個のアミノ酸、少なくとも約１６０個のアミノ酸、少なくとも約１７０個のアミノ酸、少なくとも約１８０個のアミノ酸、少なくとも約１９０個のアミノ酸、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約２１０個のアミノ酸、少なくとも約２２０個のアミノ酸、少なくとも約２３０個のアミノ酸、少なくとも約２４０個のアミノ酸、少なくとも約２５０個のアミノ酸、少なくとも約２６０個のアミノ酸、少なくとも約２７０個のアミノ酸、少なくとも約２８０個のアミノ酸、少なくとも約２９０個のアミノ酸、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約３１０個のアミノ酸、少なくとも約３２０個のアミノ酸、少なくとも約３３０個のアミノ酸、少なくとも約３４０個のアミノ酸、少なくとも約３５０個のアミノ酸、少なくとも約３６０個のアミノ酸、少なくとも約３７０個のアミノ酸、少なくとも約３８０個のアミノ酸、少なくとも約３９０個のアミノ酸、少なくとも約４００個のアミノ酸、少なくとも約４１０個のアミノ酸、少なくとも約４２０個のアミノ酸、少なくとも約４３０個のアミノ酸、少なくとも約４４０個のアミノ酸、少なくとも約４５０個のアミノ酸、少なくとも約４６０個のアミノ酸、少なくとも約４７０個のアミノ酸、少なくとも約４８０個のアミノ酸、少なくとも約４９０個のアミノ酸、少なくとも約５００個のアミノ酸、少なくとも約５１０個のアミノ酸、少なくとも約５２０個のアミノ酸、少なくとも約５３０個のアミノ酸、少なくとも約５４０個のアミノ酸、少なくとも約５５０個のアミノ酸、少なくとも約５６０アミノ酸、少なくとも約５７０個のアミノ酸、少なくとも約５８０個のアミノ酸、少なくとも約５９０個のアミノ酸、少なくとも約６００個のアミノ酸、少なくとも約６１０個のアミノ酸、少なくとも約６２０個のアミノ酸、少なくとも約６３０個のアミノ酸、少なくとも約６４０個のアミノ酸、少なくとも約６５０個のアミノ酸、少なくとも約６６０個のアミノ酸、少なくとも約６７０個のアミノ酸、少なくとも約６８０個のアミノ酸、少なくとも約６９０個のアミノ酸、少なくとも約７００個のアミノ酸、少なくとも約７１０個のアミノ酸、少なくとも約７２０個のアミノ酸、少なくとも約７３０個のアミノ酸、少なくとも約７４０個のアミノ酸、少なくとも約７５０個のアミノ酸、少なくとも約７６０個のアミノ酸、少なくとも約７７０個のアミノ酸、少なくとも約７８０個のアミノ酸、少なくとも約７９０個のアミノ酸、少なくとも約８００個のアミノ酸、少なくとも約８１０個のアミノ酸、または少なくとも約８２０個のアミノ酸）の長さを有する。いくつかの実施例では、第１の構築物は、プロモーター（例えば、本明細書に記載される、または当該技術分野において既知のプロモーターのうちのいずれか）及びＫｏｚａｋ配列（例えば、本明細書に記載される、または当該技術分野において既知の例示的なＫｏｚａｋ配列のうちのいずれか）のうちの１つまたは両方を含む。いくつかの実施例では、第１の構築物は、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。いくつかの例では、２つの異なる構築物のうちの第２のものは、タンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含み、これは、末端部分、第２の構築物、または３’部分（例えば、内耳細胞標的タンパク質のＣ末端部分、例えば、ペンドリンタンパク質のＣ末端部分）と呼ばれ得る。いくつかの例では、標的タンパク質のＣ末端部分は、少なくとも約１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約６０個のアミノ酸、少なくとも約７０個のアミノ酸、少なくとも約８０個のアミノ酸、少なくとも約９０個のアミノ酸、少なくとも約１００個のアミノ酸、少なくとも約１１０個のアミノ酸、少なくとも約１２０個のアミノ酸、少なくとも約１３０個のアミノ酸、少なくとも約１４０個のアミノ酸、少なくとも約１５０個のアミノ酸、少なくとも約１６０個のアミノ酸、少なくとも約１７０個のアミノ酸、少なくとも約１８０個のアミノ酸、少なくとも約１９０個のアミノ酸、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約２１０個のアミノ酸、少なくとも約２２０個のアミノ酸、少なくとも約２３０個のアミノ酸、少なくとも約２４０個のアミノ酸、少なくとも約２５０個のアミノ酸、少なくとも約２６０個のアミノ酸、少なくとも約２７０個のアミノ酸、少なくとも約２８０個のアミノ酸、少なくとも約２９０個のアミノ酸、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約３１０個のアミノ酸、少なくとも約３２０個のアミノ酸、少なくとも約３３０個のアミノ酸、少なくとも約３４０個のアミノ酸、少なくとも約３５０個のアミノ酸、少なくとも約３６０個のアミノ酸、少なくとも約３７０個のアミノ酸、少なくとも約３８０個のアミノ酸、少なくとも約３９０個のアミノ酸、少なくとも約４００個のアミノ酸、少なくとも約４１０個のアミノ酸、少なくとも約４２０個のアミノ酸、少なくとも約４３０個のアミノ酸、少なくとも約４４０個のアミノ酸、少なくとも約４５０個のアミノ酸、少なくとも約４６０個のアミノ酸、少なくとも約４７０個のアミノ酸、少なくとも約４８０個のアミノ酸、少なくとも約４９０個のアミノ酸、少なくとも約５００個のアミノ酸、少なくとも約５１０個のアミノ酸、少なくとも約５２０個のアミノ酸、少なくとも約５３０個のアミノ酸、少なくとも約５４０個のアミノ酸、少なくとも約５５０個のアミノ酸、少なくとも約５６０アミノ酸、少なくとも約５７０個のアミノ酸、少なくとも約５８０個のアミノ酸、少なくとも約５９０個のアミノ酸、少なくとも約６００個のアミノ酸、少なくとも約６１０個のアミノ酸、少なくとも約６２０個のアミノ酸、少なくとも約６３０個のアミノ酸、少なくとも約６４０個のアミノ酸、少なくとも約６５０個のアミノ酸、少なくとも約６６０個のアミノ酸、少なくとも約６７０個のアミノ酸、少なくとも約６８０個のアミノ酸、少なくとも約６９０個のアミノ酸、少なくとも約７００個のアミノ酸、少なくとも約７１０個のアミノ酸、少なくとも約７２０個のアミノ酸、少なくとも約７３０個のアミノ酸、少なくとも約７４０個のアミノ酸、少なくとも約７５０個のアミノ酸、少なくとも約７６０個のアミノ酸、少なくとも約７７０個のアミノ酸、少なくとも約７８０個のアミノ酸、少なくとも約７９０個のアミノ酸、少なくとも約８００個のアミノ酸、少なくとも約８１０個のアミノ酸、または少なくとも約８２０個のアミノ酸）の長さを有する。いくつかの実施例では、第２の構築物は、ポリ（Ａ）配列を更に含む。

【0167】

組成物中の異なる構築物の数が２つであるいくつかの例では、２つの構築物のうちの１つによってコードされるＮ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質（例えば、配列番号６または７）のアミノ酸位置１～約アミノ酸位置８２０、またはこの範囲の任意のサブ範囲（例えば、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１４０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１５０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸１９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２４０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２５０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸２９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３４０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３５０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸３９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４４０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４５０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸４９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５４０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５５０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸５９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６４０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６５０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸６９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７１０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７２０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７３０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７４０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７５０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７６０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７７０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７８０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸７９０、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸８００、アミノ酸１～少なくとも約アミノ酸８１０、もしくはアミノ酸１～少なくとも約アミノ酸８２０）を含む部分を含み得る。組成物中の異なる構築物の数が２つであるいくつかの例では、前駆内耳細胞標的タンパク質のＮ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質（例えば、配列番号６または７）の、最大でもアミノ酸位置１～アミノ酸位置８２０、またはこの範囲の任意のサブ範囲（例えば、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１４０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１５０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸１９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２４０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２５０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸２９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３４０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３５０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸３９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４４０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４５０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸４９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５４０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５５０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸５９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６４０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６５０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸６９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７１０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７２０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７３０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７４０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７５０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７６０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７７０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７８０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸７９０、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸８００、アミノ酸１～最大でも約アミノ酸８１０、もしくはアミノ酸１～最大でも約アミノ酸８２０）を含む部分を含み得る。

【0168】

組成物中の異なる構築物の数が２つであるいくつかの例では、２つの構築物のうちの１つによってコードされるＣ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質（例えば、配列番号６または７）の最後のアミノ酸（例えば、アミノ酸位置８２０）～約アミノ酸位置１、またはこの範囲の任意のサブ範囲（例えば、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１４０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１５０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸１９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２４０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２５０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸２９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３４０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３５０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸３９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４４０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４５０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸４９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５４０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５５０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸５９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６４０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６５０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸６９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７１０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７２０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７３０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７４０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７５０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７６０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７７０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７８０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸７９０、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸８００、アミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸８１０、もしくはアミノ酸８２０～少なくとも約アミノ酸８２０）を含む部分を含み得る。組成物中の異なる構築物の数が２つであるいくつかの例では、前駆体内耳細胞標的タンパク質のＣ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質（例えば、配列番号６または７）の最後のアミノ酸（例えば、約アミノ酸位置８２０）～最大でも約アミノ酸位置１、またはこの範囲の任意のサブ範囲（例えば、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１４０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１５０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸１９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２４０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２５０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸２９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３４０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３５０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸３９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４４０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４５０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸４９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５４０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５５０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸５９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６４０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６５０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸６９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７１０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７２０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７３０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７４０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７５０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７６０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７７０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７８０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸７９０、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸８００、アミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸８１０、もしくはアミノ酸８２０～最大でも約アミノ酸８２０）を含む部分またはそれらの間の任意の長さの配列を含み得る。

【0169】

いくつかの実施形態では、スプライス部位は、トランススプライシングに関与する。いくつかの実施形態では、スプライス供与部位（Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４－２１１，２０１４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））は、Ｎ末端構築物のコード配列に従う。Ｃ末端構築物では、スプライス受容部位は、ＳＬＣ２６Ａ４のコード配列の直前にサブクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、コード配列内で、サイレント変異を導入し、制限消化のための追加の部位を生成することができる。

【0170】

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される構築物のうちのいずれかは、症候性及び／または非症候性難聴に関連付けられた症状の改善のために動物に投与するのに好適な組成物に含まれ得る。

【0171】

薬学的組成物
とりわけ、本開示は、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成物は、症候性及び／または非症候性難聴に関連付けられた症状の軽快のために動物に投与するのに好適である。

【0172】

いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物は、例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、例えば、１つ以上の構築物を含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶ粒子、例えば、１つ以上のＡＡＶ血清型カプシドによってカプシド化された１つ以上のｒＡＡＶ構築物を含み得る。

【0173】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤等を含む。補足的活性化合物もまた、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに組み込まれることができる。かかる組成物は、１つ以上の緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など）、１つ以上の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、及びデキストラン）、マンニトール、１つ以上のタンパク質、ポリペプチド、もしくはアミノ酸（例えば、グリシン）、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のキレート剤（例えば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン）、及び／または１つ以上の保存料を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、注射用溶液、注射用ゲル、薬物放出カプセルなどの剤形である。

【0174】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、蝸牛内投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、脂質ナノ粒子、高分子ナノ粒子、ミニサークルＤＮＡ及び／またはＣＥＬｉＤ ＤＮＡを含むように製剤化される。

【0175】

いくつかの実施形態では、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化される。例えば、いくつかの実施形態では、合成外リンパ液は、２０～２００ｍＭのＮａＣｌ、１～５ｍＭのＫＣｌ、０．１～１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１～１０ｍＭのグルコース、及び２～５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、約６～約９のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、生理学的に好適な溶液を含むように製剤化される。例えば、いくつかの実施形態では、生理学的に適切な溶液は、８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭのリン酸一カリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、１７２ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．００１％プルロン酸Ｆ６８の最終濃度に調製されたプルロン酸Ｆ６８を含む市販の１×ＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、代替のプルロン酸が利用される。いくつかの実施形態では、代替のイオン濃度が利用される。

【0176】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物のうちのいずれかは、哺乳動物細胞（例えば、リポソームまたはカチオン性脂質）への核酸または本明細書に記載の構築物のいずれかの進入を促進する１つ以上の薬剤を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかは、天然及び／または合成ポリマーを使用して製剤化され得る。本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに含まれ得るポリマーの非限定的な例としては、ＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）製の製剤、ＰｈａｓｅＲＸポリマー製剤（例えば、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰｈａｓｅＲＸ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）製のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）製のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびにｐＨ応答性コブロックポリマー（例えば、ＰｈａｓｅＲＸ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）によって製造されたものであるが、これに限定されない）が含まれ得るが、これらに限定されない。これらのポリマーの多くは、哺乳動物細胞へのオリゴヌクレオチドのインビボでの送達における有効性を実証している（例えば、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：１２５－１３２，２００８、Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２－１２８８７，２００７、Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２－１２８８７，２００７、Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：８９８４－８９８２，２００５、Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：５７１５－５７２１，２００７（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0177】

いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、または静菌水）を含む。溶液は、製剤化されると、剤形と適合した様式で、かつ治療的に有効な量で、投与される。製剤は、例えば、注射用溶液、注射用ゲル、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。

【0178】

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成物は、例えば、それらの意図される投与経路と適合するように製剤化され得る。意図される投与経路の非限定的な例は、局所投与（例えば、蝸牛内投与）である。

【0179】

いくつかの実施形態では、提供される組成物は、１つの核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、２つ以上の異なる構築物を含む。いくつかの実施形態では、ペンドリンタンパク質及び／またはその機能的特徴部分をコードするコード配列を含む単一の核酸構築物を含む組成物。いくつかの実施形態では、組成物は、ペンドリンタンパク質及び／またはその機能的特徴部分をコードするコード配列を含む単一の核酸構築物を含み、哺乳動物細胞に導入されると、そのコード配列は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる構築物、例えば、構築物を含む組成物は、ペンドリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、構築物は、哺乳動物細胞内の活性ペンドリンタンパク質（例えば、全長ペンドリンタンパク質）をコードする配列を生成するように組み合わせ、それによって、関連付けられた症候性または非症候性の感音性難聴の治療を必要とする対象においてそれを行うことができる。

【0180】

本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。いくつかの実施形態では、キットは、固体組成物（例えば、本明細書に記載される少なくとも２つの異なる構築物を含む凍結乾燥組成物）及び凍結乾燥組成物を可溶化するための液体を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを含む事前に充填されたシリンジを含み得る。

【0181】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の組成物（例えば、水性組成物、例えば、水性医薬組成物として製剤化されたもの）のうちのいずれかを含むバイアルを含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを行うための取扱説明書を含み得る。

【0183】

投薬及び投与量
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えば、本明細書に開示される１つまたは複数のＡＡＶベクターは、単回用量として、または複数回用量として投与される。

【0184】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、複数回用量、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回用量として投与される。

【0185】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物（例えば、本明細書に開示される１つまたは複数のｒＡＡＶ構築物を含む組成物）は、約０．０１ｍＬ、約０．０２ｍＬ、約０．０３ｍＬ、約０．０４ｍＬ、約０．０５ｍＬ、約０．０６ｍＬ、約０．０７ｍＬ、約０．０８ｍＬ、約０．０９ｍＬ、約１．００ｍＬ、約１．１０ｍＬ、約１．２０ｍＬ、約１．３０ｍＬ、約１．４０ｍＬ、約１．５０ｍＬ、約１．６０ｍＬ、約１．７０ｍＬ、約１．８０ｍＬ、約１．９０ｍＬ、または約２．００ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０１ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０２ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０３ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０４ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０５ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０６ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０７ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０８ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約０．０９ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．００ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．１０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．２０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．３０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．４０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．５０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．６０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．７０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．８０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約１．９０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、約２．００ｍＬの容量で投与される。

【0186】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物（例えば、本明細書に開示される１つまたは複数のｒＡＡＶ構築物を含む組成物）は、約０．０１～２．００ｍＬ、約０．０２～１．９０ｍＬ、約０．０３～１．８ｍＬ、約０．０４～１．７０ｍＬ、約０．０５～１．６０ｍＬ、約０．０６～１．５０ｍＬ、約０．０６～１．４０ｍＬ、約０．０７～１．３０ｍＬ、約０．０８～１．２０ｍＬ、または約０．０９～１．１０ｍＬの容量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物（例えば、本明細書に開示される１つまたは複数のｒＡＡＶ構築物を含む組成物）は、約０．０１～２．００ｍＬ、約０．０２～２．００ｍＬ、約０．０３～２．００ｍＬ、約０．０４～２．００ｍＬ、約０．０５～２．００ｍＬ、約０．０６～２．００ｍＬ、約０．０７～２．００ｍＬ、約０．０８～２．００ｍＬ、約０．０９～２．００ｍＬ、約０．０１～１．９０ｍＬ、約０．０１～１．８０ｍＬ、約０．０１～１．７０ｍＬ、約０．０１～１．６０ｍＬ、約０．０１～１．５０ｍＬ、約０．０１～１．４０ｍＬ、約０．０１～１．３０ｍＬ、約０．０１～１．２０ｍＬ、約０．０１～１．１０ｍＬ、約０．０１～１．００ｍＬ、約０．０１～０．０９ｍＬの容量で投与される。

【0187】

遺伝子改変細胞
本開示はまた、本明細書に記載の核酸、構築物、または組成物のうちのいずれかを含む細胞（例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞）も提供する。いくつかの実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞（例えば、ヒト支持細胞またはヒト有毛細胞）である。他の実施形態では、動物細胞は、非ヒト哺乳動物（例えば、サル細胞、ネコ科細胞、イヌ科細胞など）である。本明細書に記載される核酸及び構築物が、任意の動物細胞（例えば、獣医学的介入に好適な任意の動物の支持細胞または有毛細胞）に導入され得ることを当業者は理解するであろう。構築物及び構築物を動物細胞に導入するための方法の非限定的な例が本明細書に記載される。

【0188】

いくつかの実施形態では、動物細胞は、有毛細胞及び／または支持細胞を含む内耳の任意の細胞であり得る。そのような細胞の非限定的な例としては、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、内リンパ嚢及び管の細胞、小嚢、卵形嚢、及び膨大部内の移行細胞、内部及び外部有毛細胞、らせん靭帯細胞、らせん神経節細胞、らせん隆起細胞、外嚢細胞、周辺細胞、中間細胞、基底細胞、内柱細胞、外柱細胞、クラウディウス細胞、内境界細胞、内指節細胞、または血管条の細胞が挙げられる。

【0189】

いくつかの実施形態では、動物細胞は、蝸牛の特殊化細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、有毛細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、蝸牛内部有毛細胞または蝸牛外部有毛細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、蝸牛内部有毛細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、蝸牛外部有毛細胞である。

【0190】

いくつかの実施形態では、動物細胞は、インビトロである。いくつかの実施形態では、動物細胞は、動物、例えば、霊長類及び／またはヒトに内因的に存在する細胞型である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、動物から得られ、エクスビボで培養された自己細胞である。

【0191】

遺伝子改変モデル動物
本開示はまた、本明細書に記載の核酸、構築物、または組成物のうちのいずれかを試験するのに好適な動物（例えば、哺乳動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット）も提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸及び／または構築物は、任意の動物細胞（例えば、獣医学的介入に好適な任意の動物の支持細胞または有毛細胞）に導入され得る。しかしながら、一部の動物は、制御された聴覚分析実験に適している。構築物の導入に好適な動物の非限定的な例及び上記構築物を分析するための方法が本明細書に記載される。

【0192】

いくつかの実施形態では、本開示は、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子を含むように動物を遺伝子改変することを含む、動物の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、内因性Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、配列番号５６と比較したときに、Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子によってコードされるポリペプチドがＬ２３６Ｐ変異を含むように改変される。いくつかの実施形態では、内因性Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子によってコードされるポリペプチドが配列番号５７に従って配列を含むかまたはそれからなるように改変される。

【0193】

いくつかの実施形態では、内因性Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、遺伝子改変動物においてノックアウトされるか、または阻害される。いくつかの実施形態では、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、遺伝子改変動物にノックインされるか、または付加される。いくつかの実施形態では、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、配列番号５６と比較したときに、Ｌ２３６Ｐ変異を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、配列番号５７に記載の配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする。

【0194】

いくつかの実施形態では、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子の内因性遺伝子座に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子に対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子に対してヘテロ接合性である。

【0195】

とりわけ、いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子改変マウスであって、そのゲノムが、１つ以上の既知のヒト疾患遺伝子型を反復する組換えＳｌｃ２６ａ４遺伝子を含む、遺伝子改変マウスを提供する。いくつかの実施形態では、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子は、配列番号５６と比較したときに、Ｌ２３６Ｐ変異を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、変異体Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子変異は、配列番号５７に記載のポリペプチドをコードする。

【0196】

いくつかの実施形態では、本開示は、聴覚分析実験での使用に好適な遺伝子改変動物を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、遺伝子改変マウスである。いくつかの実施形態では、聴覚分析実験での使用に好適な遺伝子改変マウスは、ＦＶＢ株である。いくつかの実施形態では、聴覚分析実験での使用に好適な遺伝子改変マウスは、ＦＶＢ、１２９／Ｓｖ－＋ｐ＋Ｔｙｒ－ｃ＋Ｍｇｆ－ＳＩＪ／Ｊ、Ａ／ＨｅＪ、ＡＫＲ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＤＰ／Ｊ、ＢＸＳＢ／ＭｐＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、ＣＡＳＡ／ＲＫ、ＣＡＳＴ／Ｅｉ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＺＥＣＨ ＩＩ／Ｅｉ、ＤＢＡ／２ＨａＳｍｎ、ＦＶＢ／ＮＪ、ＨＲＳ／Ｊ ｈｒｌ＋、ＭＯＬＤ／Ｒｋ、ＭＯＬＦ／Ｅｉ、ＭＯＬＧ／Ｄｎ、ＮＯＮ／ＬｔＪ、ＮＺＢ／Ｂ１ＮＪ、ＮＺＯ／ＮＩＪ、ＮＺＷ／ＬａｃＪ、ＰＥＲＡ／ｃａｍＥｉ、ＰＥＲＣ／Ｅｉ、ＰＬ／Ｊ、ＲＢＡ／Ｄｎ、ＲＢＦ／ＤｎＪ、ＲＦ／Ｊ、ＲＨＪ／Ｌｅ ｈｒｒｈ－Ｊ／＋、ＲＩＩＩＳ／Ｊ、ＳＥＣ／１ＲｅＪ、ＳＥＮＣＡＲＣ／ＰｔＪ、ＳＦ／ＣａｍＥｉ、ＳＨＲ／ＧｎＥｉ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＭ／Ｊ、ＳＰＲＥＴ／Ｅｉ、ＳＴ／ｂＪ、またはＳＷＲ／Ｊ株（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｎ ８０ ｉｎｂｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｂｙ ＡＢＲ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．１９９９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなもの）のものである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスに含まれる変異は、聴覚分析実験に好適なバックグラウンドで作成される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、配位分析実験での使用に好適なマウス株のものである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、ＣＢＡ／ＣａＪまたはＣＢＡ／Ｊ株ではない。

【0197】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、本明細書に記載のＡＡＶ粒子、構築物、または組成物で処置される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物に、本明細書に記載のＡＡＶ粒子を注入する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物に、本明細書に記載の組成物を注入する。いくつかの実施形態では、注入は、電子メールにおける正円窓膜の穿孔を通して実行される。

【0198】

本開示は、本明細書に記載のＡＡＶ粒子を評価及び／または特徴付けるための、本明細書に記載の遺伝子改変動物の使用を提供する。

【0199】

本開示は、本明細書に記載の組成物を評価及び／または特徴付けるための、本明細書に記載の遺伝子改変動物の使用を提供する。

【0200】

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される使用は、放出試験の一部であり得る。

【0201】

方法
とりわけ、本開示は、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の組成物を、対象の内耳（例えば、蝸牛）に導入することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒト）の内耳（例えば、蝸牛）に、治療有効量の本明細書に記載の任意の組成物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、以前に、欠陥のある内耳細胞標的遺伝子（例えば、遺伝子によってコードされる支持細胞及び／または聴覚細胞標的タンパク質の発現及び／または活性の低下をもたらす変異を有する支持細胞及び／または聴覚細胞標的遺伝子）を有すると特定されている。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、導入または投与ステップの前に、対象が欠陥のある内耳細胞標的遺伝子を有することを決定することを更に含む。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、対象における内耳細胞標的遺伝子の変異を検出することを更に含むことができる。本方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、対象を、非症候性または症候性感音性難聴を有するとして特定または診断することを更に含むことができる。

【0202】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒト）の内耳における内耳細胞標的遺伝子欠損（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の欠損）を修正する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象の内耳に、治療有効量の本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを投与することを含み、投与することは、対象の内耳の任意の細胞サブセットにおける内耳細胞標的遺伝子欠損を修復及び／または改善する。いくつかの実施形態では、内耳標的細胞は、感覚細胞、例えば、有毛細胞、及び／または非感覚細胞、例えば、支持細胞、及び／または内耳細胞の全てもしくは任意のサブセットであり得る。

【0203】

本明細書ではまた、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒト）の内耳細胞の任意のサブセットにおける内耳細胞標的タンパク質の発現レベルを増加させる方法であって、対象の内耳に、治療有効量の本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを投与することを含み、投与することが、対象の内耳の任意の細胞サブセットにおける内耳細胞標的タンパク質（例えば、ペンドリンタンパク質）の発現レベルの増加をもたらす、方法も提供される。いくつかの実施形態では、内耳標的細胞は、感覚細胞、例えば、有毛細胞、及び／または非感覚細胞、例えば、支持細胞、及び／または内耳細胞の全てもしくは任意のサブセットであり得る。

【0204】

また、欠陥のある内耳細胞標的遺伝子を有すると特定された対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒト）の難聴、例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴の治療方法であって、対象の内耳に、治療有効量の本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法も本明細書において提供される。

【0205】

また、本明細書では、内耳障害を有すると特定もしくは診断された対象において、シナプスを回復させる及び／またはらせん神経節神経を保存する方法であって、対象の内耳に、治療有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法も提供される。

【0206】

また、本明細書では、前庭水管のサイズを縮小する、及び／または前庭水管を適切なサイズに復元する方法も提供される。また、本明細書では、内耳障害を有すると特定または診断された対象において、適切な及び／または許容されるレベルまで内リンパ性ｐＨを回復させる方法であって、対象の内耳に、治療有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法も提供される。

【0207】

対象の内耳に、治療有効量の本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法も本明細書において提供される。

【0208】

また、本明細書では、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）の治療のための外科的方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の切開を第１の切開点で対象の蝸牛に導入するステップと、治療有効量の本明細書において提供される組成物のうちのいずれかを蝸牛内投与するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開点で対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開内にまたはそれを介して対象に投与される。

【0209】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の組成物は、蝸牛卵円窓膜内にまたはそれを通じて対象に投与される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかは、蝸牛正円窓膜内にまたはそれを介して対象に投与される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、正円窓膜内に複数の切開を作製することができる医療デバイスを使用して投与される。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、概ね円形の第１の側面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルは、少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、組成物を保持することができる基部及び／または貯蔵部を含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、組成物を移送することができる管腔を個別に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、少なくとも部分的真空を発生させるための手段を含む。

【0210】

いくつかの実施形態では、本開示の技術は、難聴を有する対象または難聴のリスクがある対象を治療するために使用される。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、ＳＬＣ２６Ａ４の少なくとも１つの病原性バリアントに起因する常染色体劣性難聴を有する。当業者は、ＳＬＣ２６Ａ４における多くの異なる変異が病原性バリアントをもたらし得ることを理解するであろう。そのようないくつかの実施形態では、病原性バリアントは、難聴を引き起こすか、または引き起こすリスクがある。

【0211】

いくつかの実施形態では、難聴を経験する対象は、難聴を引き起こし得る１つ以上の変異が存在し得るかどうか、及びどこに存在し得るかを判定するために評価される。いくつかのそのような実施形態では、（例えば、タンパク質もしくは配列決定分析により）ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子産物または機能の状態を評価する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象または動物は哺乳動物であり、いくつかの実施形態では、哺乳動物は家畜動物、農場動物、動物園動物、非ヒト霊長類、またはヒトである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、動物、対象、または哺乳動物は、成人、ティーンエージャー、少年少女、子供、幼児、乳児、または新生児である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、動物、対象、または哺乳動物は、１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、２～５、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、１０～１１０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～１００、２０～１１０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、６０～８０、６０～９０、６０～１００、７０～９０、７０～１００、７０～１１０、８０～１００、８０～１１０、または９０～１１０歳である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象または哺乳動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月齢である。

【0212】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも１００日、少なくとも１０５日、少なくとも１１０日、少なくとも１１５日、少なくとも１２０日、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、または少なくとも１２ヶ月間、聴力の改善を必要とする対象においてその改善（例えば、本明細書に記載の聴力の改善を判定するための測定基準のうちのいずれか）をもたらす。

【0213】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、症候性または非症候性の感音性難聴を有するか、またはそれを発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子に変異を有することが以前に特定されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、本明細書に記載されるか、または当該技術分野において、症候性もしくは非症候性感音性難聴に関連付けられていることが知られているＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異のうちのいずれかを有する。

【0214】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子における変異のキャリアであると（例えば、遺伝子検査によって）特定されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子に変異を有すると特定され、症候性または非症候性の感音性難聴と診断されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、症候性または非症候性の感音性難聴を有すると特定されている。

【0215】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、難聴のリスク（例えば、遺伝子変異、例えば、ＳＬＣ２６Ａ４変異のキャリアであるリスク）があると特定されている。いくつかのそのような実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、難聴の特定のリスク因子、または難聴のリスク（例えば、親がキャリアであることが知られている、兄弟姉妹が罹患している、または難聴の症状）を有し得る。いくつかのそのような実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、以前に特定されていない（すなわち、ＳＬＣ２６Ａ４の公開されていないか、または他の方法で知られているバリアントではない）ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子（例えば、遺伝子検査によって）における変異のキャリアであると特定されている。いくつかのそのような実施形態では、特定された変異は、新規であってもよく（すなわち、以前に文献に記載されていない）、難聴に罹患しているかまたはそれに感受性のある対象の治療方法は、特定の患者の変異（複数可）に個別化される。

【0216】

いくつかの実施形態では、症候性または非症候性の感音性難聴の成功した処置は、当該技術分野で知られている従来の機能的聴力試験のうちのいずれかを使用して、対象において判定することができる。機能的聴力試験の非限定的な例は、様々なタイプの聴力測定アッセイ（例えば、純音試験、発話試験、中耳の試験、聴性脳幹応答、及び耳音響放射）である。

【0217】

本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の組成物の２回以上の用量が、対象の蝸牛に導入されるか、または投与される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、第１の用量の組成物を対象の蝸牛に導入または投与することと、第１の用量の導入または投与後に対象の聴覚機能を評価することと、追加の用量の組成物を、正常範囲内で聴覚機能を有しないと判明した対象の蝸牛に投与することと、を含むことができる（例えば、当該技術分野で知られている聴力のための任意の試験を使用して判定される）。

【0218】

本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、蝸牛内投与のために製剤化され得る。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、蝸牛内投与または局所投与を介して投与され得る。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載の例示的な医療デバイスのうちのいずれか）の使用を通じて投与される。

【0219】

いくつかの実施形態では、蝸牛内投与は、本明細書に記載の方法または当該技術分野で既知の方法のうちのいずれかを使用して実行することができる。例えば、いくつかの実施形態では、以下の外科的技術を使用して、組成物を投与するか、または蝸牛に導入することができる：まず、０度、２．５ｍｍの剛性内視鏡を用いた視覚化を使用し、外耳道を清浄にし、ラウンドナイフを使用して、約５ｍｍの外耳道鼓膜弁の輪郭をはっきりと描画する。その後、外耳道鼓膜弁を持ち上げ、中耳に後方から進入する。鼓索神経を特定して分割し、キュレットを使用して鼓室骨を取り除き、正円窓膜を露出させる。投与または導入された組成物の頂端分布を増強するために、外科用レーザーを使用して卵円窓内に２ｍｍの小さい開窓を作製して、組成物の経正円窓膜注入中の外リンパ置換を可能にすることができる。その後、マイクロインフュージョンデバイスをプライミングし、手術野に至らせる。このデバイスを正円窓に向かって操縦し、先端を正円窓の骨突出部内に設置して、マイクロニードル（複数可）による膜の貫通を可能にする。足踏みペダルを係合連動させて、組成物の測定された一定の注入を可能にする。その後、このデバイスを引き抜き、正円窓及びアブミ骨底をゲルフォームパッチで密封する。

【0220】

本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、対象は、症候性または非症候性の感音性難聴を有するか、またはそれを発症するリスクがある。本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、対象は、内耳細胞標的遺伝子、支持細胞及び／または有毛細胞で発現され得る遺伝子に変異を有することが以前に特定されている。

【0221】

本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、対象は、内耳細胞標的遺伝子における変異のキャリアであると（例えば、遺伝子検査によって）特定されている。本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、対象は、内耳細胞標的遺伝子に変異を有すると特定され、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴、例えば、ペンドレッド症候群またはＤＦＮＢ４）と診断されている。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）を有すると特定されている。いくつかの実施形態では、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）の成功した処置は、当該技術分野で知られている従来の機能的聴力試験のうちのいずれかを使用して、対象において判定することができる。機能的聴力試験の非限定的な例は、様々なタイプの聴力測定アッセイ（例えば、純音試験、発話試験、中耳の試験、聴性脳幹応答、及び耳音響放射）を含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、対象細胞は、インビトロである。いくつかの実施形態では、対象細胞は、最初に対象から得られ、エクスビボで培養される。いくつかの実施形態では、対象細胞は、以前に、欠陥のある内耳細胞標的遺伝子を有すると判定されている。いくつかの実施形態では、対象細胞は、以前に、欠陥のある有毛細胞標的遺伝子を有すると判定されている。いくつかの実施形態では、対象細胞は、以前に、欠陥のある支持細胞標的遺伝子を有すると判定されている。

【0223】

これらの方法のいくつかの実施形態では、治療後、例えば、本明細書に記載の組成物の１つまたは２つ以上の投与後、活性な内耳細胞標的タンパク質（例えば、ペンドリンタンパク質）の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性な内耳標的タンパク質（例えば、ペンドリンタンパク質）の発現の増加は、例えば、本明細書に記載の任意の構築物（複数可）を含む組成物の導入前の内耳細胞標的タンパク質の発現レベルと比較して、対照レベルと相対的である。

【0224】

標的タンパク質（例えば、ペンドリンタンパク質）の発現及び／または活性を検出する方法は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、内耳細胞標的タンパク質の発現レベルは、直接検出することができる（例えば、内耳細胞標的タンパク質または標的ｍＲＮＡを検出する）。標的ＲＮＡまたはタンパク質（例えば、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子産物及び／またはペンドリンタンパク質もしくはその機能的特徴部分）の発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技術の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学、質量分析、または免疫蛍光が挙げられる。いくつかの実施形態では、内耳細胞標的タンパク質の発現は、間接的に（例えば、機能的聴力試験を通じて）検出され得る。

【0225】

デバイス、投与、及び外科的方法
本明細書では、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）を治療するための治療送達システムが提供される。一態様では、治療用送達系は、ｉ）内耳の正円窓膜への１つまたは複数の切開の作製を必要とする対象の内耳の正円窓膜に１つまたは複数の切開を作製することができる医療デバイス、及びｉｉ）組成物（例えば、本明細書に記載の組成物のうちのいずれか）の有効用量を含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。

【0226】

また、本明細書では、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）の治療のための外科的方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の切開点で第１の切開を対象の蝸牛に導入するステップと治療有効量の本明細書で提供される組成物のうちのいずれかを蝸牛内に投与するステップ。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開点で対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開内にまたは第１の切開を通じて対象に投与される。

【0227】

本明細書に提供される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかは、蝸牛卵円窓膜内にまたはそれを介して対象に投与される。本明細書に提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかは、蝸牛正円窓膜内にまたはそれを介して対象に投与される。本明細書に提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、正円窓膜内に複数の切開を作製することができる医療デバイスを使用して投与される。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、概ね円形の第１の態様を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルは、少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、組成物を保持することができる基部及び／または貯蔵部を含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、組成物を移送することができる管腔を個別に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、少なくとも部分的真空を発生させるための手段を含む。

【0228】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、蝸牛内投与のための滅菌懸濁液として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、１ミリリットル（ｍＬ）当たり少なくとも１Ｅ１１、少なくとも５Ｅ１１、少なくとも１Ｅ１２、少なくとも５Ｅ１２、少なくとも１Ｅ１３、少なくとも２Ｅ１３、少なくとも３Ｅ１３、少なくとも４Ｅ１３、少なくとも５Ｅ１３、少なくとも６Ｅ１３、少なくとも７Ｅ１３、少なくとも８Ｅ１３、少なくとも９Ｅ１３、または少なくとも１Ｅ１４ベクターゲノム（ｖｇ）の量で構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１ミリリットル（ｍＬ）当たり、最大でも１Ｅ１５、最大でも５Ｅ１４、最大でも１Ｅ１４、最大でも５Ｅ１３、最大でも１Ｅ１３、最大でも９Ｅ１２、最大でも８Ｅ１２、最大でも７Ｅ１２、最大でも６Ｅ１２、最大でも５Ｅ１２、最大でも４Ｅ１２、最大でも３Ｅ１２、最大でも２Ｅ１２、または最大でも１Ｅ１２ベクターゲノム（ｖｇ）の量で構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１ミリリットル（ｍＬ）当たり１Ｅ１２～１Ｅ１３、５Ｅ１２～５Ｅ１３、または１Ｅ１３～２Ｅ１３ベクターゲノム（ｖｇ）の量の構築物を含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、耳外科手術を実行した経験を持つ委員会認定の外科医によって、制御された無菌条件下で手術室において投与される。いくつかの実施形態では、投与処置は、顕微鏡または内視鏡補助の経外耳道探索的鼓室開放術及びレーザー補助式顕微アブミ骨手術、及びそれに続く本明細書に開示される組成物を含有する溶液０．０９ｍＬを送達する正円窓注入である。経外耳道探索的鼓室開放術は、中耳の構造を露出させるために使用される一般的な処置である。経外耳道探索的鼓室開放術は、例えば、耳硬化症の患者のために、レーザー補助式アブミ骨切除術（アブミ骨底板の除去）またはアブミ骨切開術（アブミ骨底板に穴を開ける）を伴うことが多い。いくつかの実施形態では、アブミ骨底板の約０．２５ｍｍの通気孔（耳科用レーザーを使用して作製）は、迷路内圧の潜在的な有害な上昇を防止する役割を果たす。

【0230】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組成物を、アブミ骨底板に位置する通気孔を用いて、正円窓膜を通じて内耳の外リンパ液に投与するための、無菌で単回使用の送達デバイスである。いくつかの実施形態では、このカスタムデバイスは、蝸牛内投与経路用に特別に設計されているため、治療剤の安全性と有効性の両方の可能性に関して、入手可能な材料よりも利点がある。いくつかの実施形態では、送達デバイスの設計要素は、注入された流体の滅菌性の維持、内耳に導入された気泡の最小化、制御された流速で小量を正確に送達する能力（標準的なポンプの使用とともに）、正円窓膜の可視化及び外科医による外耳道を通る送達のための許容値、正円窓膜への損傷の最小化、または正円窓膜を超えた蝸牛構造への損傷の最小化、及び／または正円窓膜からの逆流の最小化を含む。

【0231】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、患者、例えば、ＤＦＮＢ４またはペンドレッド症候群症状を有する患者における安全性及び忍容性を評価するための用量漸増研究を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、本明細書に開示される投薬レジメンで投与される。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、例えば、本明細書に記載されるような、本明細書に開示される組成物の用量の片側蝸牛内投与または両側蝸牛内投与のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、蝸牛当たり、少なくとも０．０１ｍＬ、少なくとも０．０２ｍＬ、少なくとも０．０３ｍＬ、少なくとも０．０４ｍＬ、少なくとも０．０５ｍＬ、少なくとも０．０６ｍＬ、少なくとも０．０７ｍＬ、少なくとも０．０８ｍＬ、少なくとも０．０９ｍＬ、少なくとも０．１０ｍＬ、少なくとも０．１１ｍＬ、少なくとも０．１２ｍＬ、少なくとも０．１３ｍＬ、少なくとも０．１４ｍＬ、少なくとも０．１５ｍＬ、少なくとも０．１６ｍＬ、少なくとも０．１７ｍＬ、少なくとも０．１８ｍＬ、少なくとも０．１９ｍＬ、または少なくとも０．２０ｍＬの容量で送達することを含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、最大でも０．３０ｍＬ、最大でも０．２５ｍＬ、最大でも０．２０ｍＬ、最大でも０．１５ｍＬ、最大でも０．１４ｍＬ、最大でも０．１３ｍＬ、最大でも０．１２ｍＬ、最大でも０．１１ｍＬ、最大でも０．１０ｍＬ、最大でも０．０９ｍＬ、最大でも０．０８ｍＬ、最大でも０．０７ｍＬ、最大でも０．０６ｍＬ、または最大でも０．０５ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、集団に応じて、蝸牛当たり、約０．０５ｍＬ、約０．０６ｍＬ、約０．０７ｍＬ、約０．０８ｍＬ、約０．０９ｍＬ、約０．１０ｍＬ、約０．１１ｍＬ、約０．１２ｍＬ、約０．１３ｍＬ、約０．１４ｍＬ、または約０．１５ｍＬの容量での送達を含む。

【0232】

本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の組成物の２回以上の用量が、対象の蝸牛に導入されるか、または投与される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、第１の用量の組成物を対象の蝸牛に導入または投与することと、第１の用量の導入または投与後に対象の聴覚機能を評価することと、追加の用量の組成物を、正常範囲内で聴覚機能を有しないと判明した対象の蝸牛に投与することと、を含むことができる（例えば、当該技術分野で知られている聴力のための任意の試験を使用して判定される）。

【0233】

本明細書において提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、蝸牛内投与のために製剤化され得る。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、蝸牛内投与または局所投与を介して投与され得る。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載の例示的な医療デバイスのうちのいずれか）の使用を通じて投与される。

【0234】

いくつかの実施形態では、対象細胞は、インビトロである。いくつかの実施形態では、対象細胞は、最初に対象から得られ、エクスビボで培養される。いくつかの実施形態では、対象細胞は、そうでなければ健康であるとみなされ、エクスビボで培養され、拡大される。いくつかの実施形態では、対象細胞は、以前に、欠陥のある内耳細胞標的遺伝子を有すると判定されている。いくつかの実施形態では、対象細胞は、以前に、欠陥のある有毛細胞標的遺伝子を有すると判定されている。いくつかの実施形態では、対象細胞は、以前に、欠陥のある支持細胞標的遺伝子を有すると判定されている。

【0235】

いくつかの実施形態では、対象がげっ歯類、例えば、マウスである場合、注入時の動物の年齢に関係なく、堅牢で信頼性の高い形質導入を実証した後半規管の開窓を伴う正円窓膜を通じた送達を含む、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１８に記載の外科的アプローチが使用される（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ２０１８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。要するに、側頭骨にアクセスするために耳後部切開が行われる。胸鎖乳突筋の一部分が分割され、耳胞を露出させる。直径０．５～０．６ｍｍの耳科用ドリルを使用して、聴疱に小さな穴を開け、その穴を広げてアブミ骨動脈及び正円窓膜を可視化する。耳科用ドリル（直径０．５～０．６ｍｍ）を用いて後半規管の開窓を実行して、蝸牛投与中に内耳の通気孔として機能させる。正円窓膜は、ホウケイ酸塩毛細血管ピペット及び１０μＬのハミルトンシリンジからなるマウス送達デバイスで貫通され、ウイルス粒子を含む１μＬの溶液（内耳総体積の約４０～５０％）は、３００ｎＬ／分の速度で正円窓膜を通して鼓室階内に送達される。

【0236】

いくつかの実施形態では、対象がＮＨＰであるとき、耳後部切開が行われ、軟組織の解離が骨膜のレベルまで実行される。いくつかの実施形態では、骨膜を切開して持ち上げ、乳様突起骨を露出させる。皮質乳突切除術は、高速切断とダイヤモンドドリルバーとの組み合わせで実行する。次いで、顔面神経窩を開き、適切な正円窓及び卵円窓（ＯＷ）の視覚化が可能になる。ＯＷ内のアブミ骨底板の開窓を、ローゼンニードルを使用して実行する。他のモデルと同様に、開窓は、内耳に損傷を与えることなくより大きな容積を注入することを可能にする。更に、通気により、ｒＡＡＶ粒子を含む溶液が蝸牛の頂点に向かって流れることを可能にする。ｒＡＡＶ粒子を含む３０μＬの溶液（内耳総体積の約４０～５０％）を、正円窓膜を通して、速度３０μＬ／分で送達する。

【0237】

いくつかの実施形態では、対象が哺乳動物、例えば、ヒトである場合、例えば、関連する構造は、出生時でさえも比較的大きいので、外耳道を通る低侵襲アプローチが使用される。いくつかの実施形態では、臨床投与処置は、経外耳道探索的鼓室開放術及びレーザー補助式アブミ骨切除術（アブミ骨底板に小さな通気孔（約０．２５ｍｍ）を配置するためのリン酸チタニルカリウム［ＫＴＰ］またはＣＯ２耳科用レーザーを使用）、続いて、本明細書に開示される組成物（例えば、ｒＡＡＶ－ＳＬＣ２６Ａ４粒子）を含む溶液約０．０９ｍＬ（もしくは９０μＬ、内耳総体積の約４０～５０％）を、３分の期間内に正円窓膜を通じて送達するための正円窓注入である。いくつかの実施形態では、通気は、迷路内圧の潜在的な有害な上昇を防止する役割を果たす。経外耳道探索的鼓室開放術は、中耳の構造を露出させるために使用される一般的な処置である。経外耳道探索的鼓室開放術は、例えば、耳硬化症の患者のために、レーザー補助式アブミ骨切除術（アブミ骨底板の除去）またはアブミ骨切開術術（アブミ骨底板に穴を開ける）を伴うことが多い。

【0238】

いくつかの実施形態では、本開示は、外耳道を介して中耳及び／または内耳にアクセスするための、最低侵襲的で十分に受け入れられた外科技術を利用する送達アプローチを説明する。処置は、卵円窓における中耳と内耳との間の物理的バリアのうちの１つを開くことと、その後、例えば、図１５～１８に示すように、本明細書に開示されるデバイスを使用して、正円窓膜を介して、制御された流速でかつ固定された容量で本明細書に開示される組成物を送達することと、を含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギ）、霊長類（例えば、ＮＨＰ（例えば、マカク、チンパンジー、サル、もしくは類人猿）、またはヒト）の外科的処置は、蝸牛の長さに沿ってＡＡＶベクター形質導入率を増加させるための通気を含み得る。いくつかの実施形態では、手術中の通気孔の不在は、通気孔を用いて実行された手術後のＡＡＶベクターの蝸牛細胞形質導入率と比較して、より低いＡＡＶベクターの蝸牛細胞形質導入率をもたらし得る。いくつかの実施形態では、通気は、蝸牛全体を通して約７５～１００％のＩＨＣの形質導入率を促進する。いくつかの実施形態では、通気は、蝸牛の基部で約５０～７０％、約６０～８０％、約７０～９０％、または約８０～１００％のＩＨＣ形質導入率を可能にする。いくつかの実施形態では、通気は、蝸牛の頂点で約５０～７０％、約６０～８０％、約７０～９０％、または約８０～１００％のＩＨＣ形質導入率を可能にする。

【0240】

本明細書に記載の送達デバイスは、手術室の滅菌野に配置されてもよく、チューブの端部は、滅菌野から取り外され、本明細書に開示される組成物（例えば、１つ以上のＡＡＶベクター）を装填され、かつポンプに取り付けられたシリンジに接続されてもよい。空気を除去するためにシステムを適切にプライミングした後、ニードルを可視化（外科用顕微鏡、内視鏡、及び／または遠位先端カメラ）下で中耳を通過させてもよい。ニードル（または微小ニードル）を使用して、ＲＷＭを穿刺することができる。ニードルは、ストッパーがＲＷＭに接触するまで挿入することができる。次いで、デバイスは、本明細書に開示される組成物が、選択された期間、制御された流速で内耳に送達される間、その位置に保持され得る。いくつかの実施形態では、流速（または注入速度）は、約３０μＬ／分、または約２５μＬ／分～約３５μＬ／分、または約２０μＬ／分～約４０μＬ／分、または約２０μＬ／分～約７０μＬ／分、または約２０μＬ／分～約９０μＬ／分、または約２０μＬ／分～約１００μＬ／分の速度を含んでもよい。いくつかの実施形態では、流速は、約２０μＬ／分、約３０μＬ／分、約４０μＬ／分、約５０μＬ／分、約６０μＬ／分、約７０μＬ／分、約８０μＬ／分、約９０μＬ／分または約１００μＬ／分である。いくつかの実施形態では、選択された期間（すなわち、本明細書に開示される組成物が流れる期間）は、約３分、または約２．５分～約３．５分、または約２分～約４分、または約１．５分～約４．５分、または約１分～約５分であってもよい。いくつかの実施形態では、内耳に流れる本明細書に開示される組成物の総容量は、約０．０９ｍＬ、または約０．０８ｍＬ～約０．１０ｍＬ、または約０．０７ｍＬ～約０．１１ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の総容量は、内耳の体積の約４０％～約５０％に等しい。

【0241】

デリバリーが完了すると、デバイスを取り外すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイスは、単回使用の使い捨て製品として構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載のデバイスは、例えば、交換可能及び／または滅菌可能なニードルサブアセンブリとともに、多用途の滅菌可能な製品として構成され得る。単回使用デバイスは、投与が完了した後、適切に廃棄され得る（例えば、バイオハザード鋭利物容器内）。

【0242】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、外科的処置によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、投与、例えば、外科的処置を介して、本明細書に記載の送達デバイスを介して、本明細書に開示される組成物を内耳に注入することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される外科的処置は、経外耳道的鼓室開放を実行することと、本明細書に記載の送達デバイスを介して本明細書に開示される組成物を内耳に注入することと、を含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、外科的処置は、経外耳道的鼓室開放を実行することと、レーザー補助式顕微アブミ骨手術を実行することと、本明細書に記載される送達デバイスを介して本明細書に開示される組成物を内耳に注入することと、対象の正円窓及び／または卵円窓の周りにシーラントを適用することと、対象の外耳道鼓膜弁を解剖学的位置に下げることと、を含む。

【0244】

いくつかの実施形態では、外科的処置は、経外耳道的鼓室開放を実行することと、対象の正円窓を準備することと、レーザー補助式顕微アブミ骨手術を実行することと、本明細書に記載される送達デバイスと、内耳への送達のための本明細書に開示される組成物との両方を準備することと、送達デバイスを介して本明細書に開示される組成物を内耳に注入することと、対象の正円窓及び／または卵円窓の周囲にシーラントを適用することと、対象の外耳道鼓膜弁を解剖学的位置に下げることと、を含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、レーザー補助式アブミ骨手術を実行することは、ＫＴＰ耳科用レーザー及び／またはＣＯ２耳科用レーザーを使用することを含む。

【0246】

別の例として、本明細書に開示される組成物は、蝸牛内投与経路に特異的に設計されたデバイス及び／またはシステムを使用して投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデバイスの設計要素は、注入された流体の無菌性の維持、内耳に導入された気泡の最小化、制御された速度で低容量を正確に送達する能力、外科医による外耳道を通じた送達、正円窓膜（ＲＷＭ）もしくは内耳への損傷の最小化、例えば、ＲＷＭを超えた蝸牛構造への損傷の最小化、及び／またはＲＷＭを通じた注入流体の逆漏出の最小化を含み得る。

【0247】

本明細書において提供されるデバイス、システム、及び方法はまた、例えば本明細書に記載されるように、聴覚障害を含むがこれらに限定されない、本明細書に開示される組成物の内耳への送達から利益を受けるであろう状態及び障害を治療するために、組成物を内耳に安全かつ効率的に送達する可能性を説明する。別の例として、アブミ骨底板に通気孔を配置し、ＲＷＭを通して注入することによって、本明細書に開示される組成物は、作用部位で希釈を最小限に抑えて、蝸牛全体に分散される。記載されているデバイスの開発により、外科的投与処置をヒトの外耳道を介して実行することが可能になる。記載されたデバイスは、一定量の流体を蝸牛の外リンパに注入した後、耳から取り出すことができる。対象において、デバイスは、外科的顕微鏡的制御下で、または内視鏡とともに、外耳道を通って前進させてもよい。

【0248】

本明細書に開示される方法のうちのいずれかで使用するための例示的なデバイスを図１５～１８に記載する。図１５は、流体を内耳に送達するための例示的なデバイス１０を示している。デバイス１０は、ローレットハンドル１２と、伸縮式ハイポチューブニードル支持体２４にカップリングする遠位ハンドル接着剤１４（例えば、Ｌｏｃｔｉｔｅ ４０１４などのエポキシ）と、を含む。ローレットハンドル１２（またはハンドル部分）は、グリップを強化するためのローレット機構及び／または溝を含んでもよい。ローレットハンドル１２（またはハンドル部分）は、約５ｍｍ～約１５ｍｍの厚さ、または約５ｍｍ～約１２ｍｍの厚さ、または約６ｍｍ～約１０ｍｍの厚さ、または約６ｍｍ～約９ｍｍの厚さ、または約７ｍｍ～約８ｍｍの厚さであり得る。ローレットハンドル１２（またはハンドル部分）は、使用中に流体がデバイス１０を通過することができるように中空であり得る。デバイス１０はまた、ローレットハンドル１２の近位端１８における近位ハンドル接着剤１６、デバイス１０の遠位端２０におけるストッパー２８（図１６に示される）を有するニードルサブアセンブリ２６（図１６に示される）、及びストレインリリーフ機構２２を含んでもよい。ひずみ緩和機構２２は、Ｓａｎｔｏｐｒｅｎｅ材料、Ｐｅｂａｘ材料、ポリウレタン材料、シリコーン材料、ナイロン材料、及び／または熱可塑性エラストマーから構成され得る。伸縮式ハイポチューブニードル支持体２４は、その中に配置された屈曲ニードル３８（図１６に示される）を取り囲み、支持する。

【0249】

なお、図１５を参照すると、ストッパー２８は、熱可塑性材料またはプラスチックポリマー（例えば、ＵＶ硬化ポリマー）、ならびに他の好適な材料で構成されてもよく、屈曲ニードル３８が外耳道のあまりにも奥まで挿入されるのを防ぐために（例えば、側壁または他の内耳構造への屈曲ニードル３８の挿入を防ぐために）使用されてもよい。デバイス１０はまた、ローレットハンドル１２と、伸縮式ハイポチューブニードル支持体２４にカップリングされる遠位ハンドル接着剤１４との間に配置されたテーパー部分２３を含んでもよい。ローレットハンドル１２（またはハンドル部分）は、ハンドル部分１２の遠位端にテーパー部分２３を含んでもよい。デバイス１０はまた、デバイス１０の近位端１６に流体接続されたチューブ３６を含んでもよく、デバイスを上流構成要素（例えば、いくつかの実施形態では、制御システム及び／または電源（図示せず）にカップリングされてもよいポンプ、シリンジ、及び／または上流構成要素）に接続する流体入口ラインとして機能してもよい。いくつかの実施形態では、屈曲ニードル３８（図１６に示される）は、遠位端２０から、伸縮式ハイポチューブニードル支持体２４を通して、テーパー部分２３を通して、ローレットされたハンドル１２を通して、及びひずみ緩和機構２２を通して延在し、チューブ３６に直接流体接続する。他の実施形態では、屈曲ニードル３８は、ローレットハンドルの中空の内部と流体接続し（例えば、伸縮式ハイポチューブニードルサポート２４を介して）、その後、チューブ３６と近位端１６で流体接続する。屈曲ニードル３８がデバイス１０の内部を通って全く延在しない実施形態では、接触領域（例えば、重なり合った入れ子式のハイポチューブ４２間）、許容差、及び／またはインターフェース構成要素間のシーラントは、治療用流体がデバイス１０から漏出するのを防ぐのに十分でなければならない（これは、比較的低い圧力（例えば、約１パスカル～約５０Ｐａ、または約２Ｐａ～約２０Ｐａ、または約３Ｐａ～約１０Ｐａ）で動作する）。

【0250】

図１６は、本開示の実施形態の態様による、屈曲ニードルサブアセンブリ２６の側面図を示す。屈曲ニードルサブアセンブリ２６は、屈曲部分３２を有するニードル３８を含む。屈曲ニードルサブアセンブリ２６はまた、屈曲部分３２にカップリングされたストッパー２８を含んでもよい。屈曲部分３２は、耳の膜（例えば、ＲＷＭ）を穿孔するために、デバイス１０の遠位端２０に角度のある先端３４を含む。ニードル３８、屈曲部分３２、及び角度のある上部３４は、流体がそこを流れることができるように中空である。屈曲部分３２の（図１８に示されるような）角度４６は、変化し得る。ストッパー２８の幾何学形状は、円筒形、円盤形、環状形、ドーム形、及び／または他の適切な形状であり得る。ストッパー２８は、屈曲部分３２上の所定の位置に成形され得る。例えば、ストッパー２８は、接着剤または圧縮継手を使用して、屈曲部分３２の周りに同心円状に配置され得る。接着剤の例としては、紫外線硬化性接着剤（例えば、Ｄｙｍａｘ ２０３Ａ－ＣＴＨ－Ｆ－Ｔ）、エラストマー接着剤、熱硬化性接着剤（例えば、エポキシもしくはポリウレタン）、またはエマルジョン接着剤（例えば、ポリ酢酸ビニル）が挙げられる。ストッパー２８は、角度のある先端３４が所望の挿入深さで耳に挿入されるように、屈曲部分３２の周りに同心円状に適合する。屈曲ニードル３８は、増分形成、及び他の好適な技術を使用して、まっすぐなニードルから形成され得る。

【0251】

図１７は、流体を内耳に送達するための例示的なデバイス１０の斜視図を示す。チューブ３６は、長さが約１３００ｍｍ（図１７の寸法１１）～約１６００ｍｍ、または約１４００ｍｍ～約１５００ｍｍ、または約１４３０ｍｍ～約１４５０ｍｍであり得る。ひずみ解放機構２２は、長さが約２５ｍｍ～約３０ｍｍの長さ（図１７の寸法１５）、または約２０ｍｍ～約３５ｍｍであってもよい。ハンドル１２は、長さが約１５５．４ｍｍ（図１７の寸法１３）、または約１５０ｍｍ～約１６０ｍｍ、または約１４０ｍｍ～約１７０ｍｍであり得る。伸縮式ハイポチューブニードル支持体２４は、２つ以上の入れ子式ハイポチューブ、例えば３つの入れ子式ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、及び４２Ｃ、または４つの入れ子式ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、及び４２Ｄを有し得る。ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ及び先端アセンブリ２６（図３１の寸法１７）の全長は、約２５ｍｍ～約４５ｍｍ、または約３０ｍｍ～約４０ｍｍ、または約３５ｍｍであり得る。加えて、伸縮式ハイポチューブニードル支持体２４は、長さが約３６ｍｍ、または約２５ｍｍ～約４５ｍｍであってもよく、または約３０ｍｍ～約４０ｍｍを形成してもよい。３つの入れ子式ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、及び４２Ｃは、それぞれ、３．５ｍｍ、８．０ｍｍ、及び１９．８ｍｍ、それぞれプラスまたはマイナス約２０％の長さを有してもよい。伸縮式ハイポチューブ支持体２４の最も内側の入れ子式ハイポチューブ（または最も狭い部分）は、ニードル３８の周りに同心円状に配置されてもよい。

【0252】

図１８は、本開示の実施形態の態様による、デバイス１０の遠位端２０に結合された屈曲ニードルサブアセンブリ２６の斜視図を示す。図１８に示されるように、屈曲ニードルサブアセンブリ２６は、屈曲部分３２にカップリングされたニードル３８を含んでもよい。他の実施形態では、屈曲ニードル３８は、単一のニードル（例えば、後に所望の角度４６を含むように屈曲されるまっすぐなニードル）であってもよい。ニードル３８は、３３ゲージのニードルであってもよく、または約３２～約３４、または約３１～３５のゲージを含んでもよい。より細かいゲージでは、チューブ３６がねじれたり損傷したりしないように注意を払わなければならない。ニードル３８をハンドル１２に取り付けて、ニードル３８を内耳に安全かつ正確に配置することができる。図１８に示されるように、屈曲ニードルサブアセンブリ２６は、屈曲部分３２の周りに配置されたストッパー２８を含んでもよい。図１８はまた、屈曲部分３２が耳の膜（例えば、ＲＷＭ）を穿孔するための角度のある先端３４を含んでもよいことを示す。ストッパー２８は、約０．５ｍｍ、または約０．４ｍｍ～約０．６ｍｍ、または約０．３ｍｍ～約０．７ｍｍの高さ４８を有し得る。屈曲部分３２は、約１．４５ｍｍ、または約１．３５ｍｍ～約１．５５ｍｍ、または約１．２ｍｍ～約１．７ｍｍの長さ５２を有してもよい。他の実施形態では、屈曲部分３２は、ストッパー２８の遠位端と角度のある先端３４の遠位端との間の距離が、約０．５ｍｍ～約１．７ｍｍ、または約０．６ｍｍ～約１．５ｍｍ、または約０．７ｍｍ～約１．３ｍｍ、または約０．８ｍｍ～約１．２ｍｍであるように、２．０ｍｍを超える長さを有し得る。図１８は、ストッパー２８が円筒形、円盤形、及び／またはドーム形である幾何学形状を有してもよいことを示す。当業者は、他の幾何学形状が使用され得ることを理解するであろう。

【0253】

難聴及び回復の評価
いくつかの実施形態では、聴覚機能は、聴性脳幹応答測定値（ＡＢＲ）を使用して判定される。いくつかの実施形態では、聴力は、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を測定することによって試験される。そのようないくつかの実施形態では、測定は、対象の一方または両方の耳から取得される。そのようないくつかの実施形態では、記録は、例えば、正常な聴力として定義されるべき難聴対許容可能な聴力範囲を定義するために使用されるそのような応答測定値に関する同じ対象及び／または既知の閾値に関する以前の記録と比較される。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に記録されたＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で処置された対象は、処置前と比較して、処置後のＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値が改善されるであろう。いくつかの実施形態では、ＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定は、処置が投与された後、及び処置後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。

【0254】

いくつかの実施形態では、聴覚機能は、発話パターン認識を使用して判定されるか、または発話療法士によって判定される。いくつかの実施形態では、聴覚機能は、純音試験によって判定される。いくつかの実施形態では、聴覚機能は、骨伝導試験によって判定される。いくつかの実施形態では、聴覚機能は、聴音反射試験によって判定される。いくつかの実施形態では、聴覚機能は、ティンパノメトリーによって判定される。いくつかの実施形態では、聴覚機能は、当該技術分野で知られている聴覚分析の任意の組み合わせによって決定される。そのようないくつかの実施形態では、測定は、全体的に、及び／または対象の片方もしくは両方の耳から行われる。そのようないくつかの実施形態では、記録及び／または専門的な分析は、例えば、正常な聴力として定義されるべき難聴対許容可能な聴力範囲を定義するために使用されるそのような応答測定値に関する同じ対象及び／または既知の閾値に関する以前の記録／分析と比較される。いくつかの実施形態では、対象は、任意の処置を受ける前に実施される、発話パターン認識、純音試験、骨伝導試験、聴音反射試験及び／またはティンパノメトリー測定及び／または分析を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で処置される対象は、処置前と比較して、処置後の発話パターン認識、純音試験、骨伝導試験、聴音反射試験、及び／またはティンパノメトリー測定の改善を有する。いくつかの実施形態では、発話パターン認識、純音試験、骨伝導試験、聴音反射試験及び／またはティンパノメトリー測定は、処置が施された後、及び処置後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。

【0255】

いくつかの実施形態では、処置された耳と対側対照耳の両方における聴覚機能は、本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶ遺伝子治療製品による形質導入の関数として著しく変化し得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、新生児及び／または成体動物において、処置された耳と対側耳との間で交差し得る。いくつかの実施形態では、このような交差は、げっ歯類蝸牛の開存性（例えば、外リンパ、ＣＳＦ、及び対側耳の外リンパ間の液体連通）に起因し得る。

【0256】

特徴付け方法
「ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異」という用語は、既知のコンセンサス機能的ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子における修飾であって、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸置換、及び１つ以上のアミノ酸挿入のうちの１つ以上を有するペンドリンタンパク質の産生を、コンセンサス機能的ペンドリンタンパク質と比較してもたらす、及び／または変異を有さない哺乳動物細胞におけるコードされたペンドリンタンパク質の発現レベルと比較して哺乳動物細胞におけるコードされたペンドリンタンパク質の発現レベルの低下をもたらす、修飾を指す。いくつかの実施形態では、変異は、１個以上のアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上のアミノ酸）の欠失を有するペンドリンタンパク質の産生をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるフレームシフトをもたらし得る。「フレームシフト」という用語は、コード配列の読み取りフレームにおけるシフトをもたらすコード配列における任意の変異を包含することが当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、フレームシフトは、非機能的タンパク質をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、点変異は、ナンセンス変異であり得る（すなわち、遺伝子のエクソンにおける早期停止コドンをもたらす）。ナンセンス変異は、（対応するコンセンサス機能的タンパク質と比較して）機能的であっても機能的でなくてもよい短縮タンパク質の産生をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡもしくはペンドリンタンパク質、またはｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の発現の喪失（またはレベルの低下）をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、コンセンサス機能的ペンドリンタンパク質と比較して１つ以上の生物学的活性（機能）の喪失または減少を有する改変ペンドリンタンパク質の産生をもたらし得る。

【0257】

いくつかの実施形態では、変異は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの挿入である。いくつかの実施形態では、変異は、ペンドリン遺伝子の調節及び／または制御配列、すなわち、コード配列ではない遺伝子の一部分にある。いくつかの実施形態では、調節及び／または制御配列の変異は、プロモーターまたはエンハンサー領域にあり得、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の適切な転写を防止または低減し得る。いくつかの実施形態では、変異は、ペンドリンタンパク質またはＳＬＣ２６Ａ４遺伝子（例えば、ＦＯＸＩ１またはＫＣＮＪ１０）と相互作用することが知られている既知の異種遺伝子にある。

【0258】

ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ及び／またはペンドリンタンパク質の遺伝子型決定及び／または発現もしくは活性の検出方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２０１３ Ｍａｙ ２８；３（２）：２６－３４、及びＲｏｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ；１９（１）：２０９（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡまたはペンドリンタンパク質の発現レベルは、直接検出され得る（例えば、ペンドリンタンパク質の検出、ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡの検出など）。ＳＬＣ２６Ａ４の発現及び／または活性を直接検出するために使用することができる技術の非限定的な例としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学、質量分析、または免疫蛍光が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４及び／またはペンドリンタンパク質の発現は、（例えば、機能的聴力試験、ＡＢＲ、ＤＰＯＡＥなどを通じて）間接的に検出され得る。

【0259】

いくつかの実施形態では、組織試料（例えば、１つ以上の内耳細胞を含み、例えば、１つ以上の有毛細胞及び／または１つ以上の支持細胞を含む）は、形態学的分析によって評価されて、本明細書に記載の任意の薬剤（例えば、組成物、例えば、構築物及び／または粒子を含む組成物など）の投与の前後に、有毛細胞及び／または支持細胞の形態を決定してもよい。そのようないくつかの実施形態では、標準的な免疫組織化学的または組織学的分析が実行されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞がインビトロまたはエクスビボで使用される場合、追加の免疫細胞化学分析または免疫組織化学分析が実行され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質または転写産物の１つ以上のアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ポリメラーゼ連鎖反応）は、対象またはインビトロ細胞集団からの１つ以上の試料上で実行されてもよい。

【0260】

対象の治療方法
本開示は、とりわけ、本明細書に記載される技術を使用して、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異を特徴とする耳疾患（例えば、ＤＦＮＢ４及び／またはペンドレッド症候群）に罹患しているか、またはそのリスクがある対象における基礎疾患及び／または症状を治療し得ることを提供する。

【0261】

いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療方法である。いくつかの実施形態では、対象は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異を特徴とする耳疾患（例えば、ＤＦＮＢ４及び／またはペンドレッド症候群）に罹患しているか、またはそのリスクがある対象である。

【0262】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することは、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異を特徴とする耳疾患（例えば、ＤＦＮＢ４及び／またはペンドレッド症候群）に関連付けられた１つ以上の症状を緩和及び／または軽快し得る。症状には、例えば、感音性聴覚障害、前庭水管の拡大、蝸牛の低形成（例えば、蝸牛の回転数が少なすぎる）、運動失調／協調運動障害、神経性発話障害、及び／またはめまいが含まれ得る。

【0263】

いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の技術（例えば、リアルタイムＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学、質量分析、または免疫蛍光、遺伝子及び／またはタンパク質の発現の間接的な表現型決定（例えば、機能的聴力試験、ＡＢＲ、ＤＰＯＡＥなどを通じて）など）で処置する前、処置中、及び／または処置後に、本明細書に記載のように遺伝的及び／または症状的に特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子（例えば、ＤＦＮＢ４及び／またはペンドレッド症候群）の変異によって特徴付けられる耳疾患に罹患しているか、またはそのリスクがある対象は、組織サンプリング（例えば、１つ以上の内耳細胞を含み、例えば、１つ以上の有毛細胞及び／または１つ以上の支持細胞を含む）によって特徴付けられるそれらの関連疾患状態を有し得る。いくつかの実施形態では、組織は、本明細書に記載の任意の技術（例えば、方法論、例えば、組成物、例えば、構築物及び／または粒子を含む組成物など）の投与前、投与中及び／または投与後に、有毛細胞及び／または支持細胞の形態を決定するための形態分析によって評価される。そのようないくつかの実施形態では、標準的な免疫組織化学的または組織学的分析が実行されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞がインビトロまたはエクスビボで使用される場合、追加の免疫細胞化学分析または免疫組織化学分析が実行され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質または転写産物の１つ以上のアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ポリメラーゼ連鎖反応）は、対象またはインビトロ細胞集団からの１つ以上の試料上で実行されてもよい。

【0264】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することは、本明細書に記載の技術による処置前に実行された免疫組織化学試験と比較したとき、または対照集団と比較したときに、患者の免疫組織化学評価（例えば、上記のような試験）を改善する。

【0265】

産生方法
ＡＡＶ系は、一般に、当該技術分野において周知である（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）、Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）、及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ＡＡＶ構築物の生成及び使用方法は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第４，７９７，３６８号及びＰＣＴ出願第ＵＳ２０１９／０６０３２８号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に記載されている。

【0266】

ウイルス構築物を得るための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、ＡＡＶ構築物を産生するために、本方法は、典型的には、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）及びコード配列から構成される組換えＡＡＶ構築物、及び／または組換えＡＡＶ構築物のＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを伴う。

【0267】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物をＡＡＶカプシドに包装するために宿主細胞内で培養される成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。あるいは、任意の１つ以上の成分（例えば、組換えＡＡＶ構築物、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）は、当業者に既知の方法を使用して１つ以上のかかる成分を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。いくつかの実施形態では、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下でそのような成分（複数可）を含有する。いくつかの実施形態では、そのような成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分（複数可）及び１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分（複数可）を含有してもよい。例えば、ＨＥＫ２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含有する安定した宿主細胞を生成してもよい。他の安定した宿主細胞は、当業者によって、常套的な方法を使用して生成され得る。

【0268】

本開示のＡＡＶの産生に必要な組換えＡＡＶ構築物、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子要素（例えば、構築物）を使用してパッケージング宿主細胞に送達されてもよい。選択された遺伝子要素は、例えば、核酸操作の当業者に当技術分野で知られている任意の好適な方法によって送達され得、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。同様に、ＡＡＶ粒子の生成方法は周知であり、任意の好適な方法を本開示とともに使用することができる（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）及び米国特許第５，４７８，７４５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0269】

いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、（例えば、米国特許第６，００１，６５０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような）トリプルトランスフェクション方法を使用して産生され得る。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能構築物、及び付属機能構築物にパッケージングされる組換えＡＡＶ構築物（コード配列を含む）を宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能構築物は、生産的なＡＡＶ複製及びカプシド化のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能構築物は、任意の検出可能な野生型ＡＡＶ粒子（すなわち、機能的ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶ粒子）を生成することなく、効率的なＡＡＶ構築物産生成をサポートする。本開示での使用に好適な構築物の非限定的な例としては、ｐＨＬＰ１９（例えば、米国特許第６，００１，６５０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）及びｐＲｅｐ６ｃａｐ６構築物（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）が挙げられる。付属機能構築物は、ＡＡＶが複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能（すなわち、「付属機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。付属機能には、ＡＡＶ複製に必要な機能が含まれてもよく、これには、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスに基づく付属機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、及びワクシニアウイルスなどの任意の既知のヘルパーウイルスに由来することができる。

【0270】

対象への送達に好適なＡＡＶウイルス構築物を生成及び単離するための更なる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号、米国特許第７，２８２，１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及び米国特許第７，５８８，７７２号（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。１つの系では、プロデューサー細胞株には、ＩＴＲに隣接するコード配列をコードする構築物、及びｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）が一過的にトランスフェクトされる。別の系では、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株には、ＩＴＲに隣接するコード配列をコードする構築物が一過的にトランスフェクトされる。これらの系のそれぞれにおいて、ＡＡＶ粒子は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ＡＡＶは、汚染ウイルスから分離される。他の系は、ＡＡＶ－ヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）を回復するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としない。そのような系では、ヘルパー機能は、ヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションによって供給されてもよく、または細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するように操作されてもよく、その発現は、転写レベルまたは転写後レベルで制御されてもよい。

【0271】

いくつかの実施形態では、精製後のウイルス構築物力価が決定される。いくつかの実施形態では、力価は、定量的ＰＣＲを使用して決定される。ある特定の実施形態では、構築物に特異的なＴａｑＭａｎプローブを利用して構築物レベルを決定する。ある特定の実施形態では、ＴａｑＭａｎプローブは配列番号４９で表され、一方、順方向及び逆方向の増幅プライマーはそれぞれ配列番号５４及び５５で例示される。
構築物の定量のための例示的なＴａｑＭａｎプローブ（配列番号４９）
／５６－ＦＡＭ／ＴＡＡＴＴＣＣＡＡ／ＺＥＮ／ＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／
構築物（配列番号５４）の定量のための例示的な順方向ｑＰＣＲプライマー
ＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣ
構築物（配列番号５５）の定量のための例示的な逆方向ｑＰＣＲプライマー
ＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＴＧ

【0272】

本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、本開示のウイルス構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ Ａｎｃ８０、ならびにそれらのバリアントを含む、いくつかのＡＡＶ血清型が特徴付けられている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、またはＡＡＶ２／Ａｎｃ８０粒子（例えば、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡｎｃ８０カプシドを伴う、ＡＡＶ２ ＩＴＲを伴う構築物）である。他のＡＡＶ粒子及び構築物は、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ．１５；８１（２－３）：２７３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般に、任意のＡＡＶ粒子を使用して、本明細書に記載のコード配列を送達し得る。しかしながら、血清型は、例えば、異なる組織に優先的に感染するなど、異なるトロピズムを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物は、自己相補的ＡＡＶ構築物である。

【0273】

本開示は、とりわけ、ＡＡＶに基づく構築物の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、宿主細胞の使用を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、付属機能構築物、及び／または組換えＡＡＶの産生に関連付けられた他の転移ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列がトランスフェクトされた細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫が、天然、偶発的、または意図的な変異により、元の親としての形態、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において完全に同一であるとは限らないことが理解される。

【0274】

対象への送達に好適なＡＡＶ粒子を生成及び単離するための更なる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号、米国特許第７，２８２，１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及び米国特許第７，５８８，７７２号（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。１つの系では、プロデューサー細胞株には、ＩＴＲに隣接するコード配列をコードする構築物、及びｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）が一過的にトランスフェクトされる。別の系では、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株には、ＩＴＲに隣接するコード配列をコードする構築物が一過的にトランスフェクトされる。これらの系のそれぞれにおいて、ＡＡＶ粒子は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ＡＡＶ粒子は、汚染ウイルスから分離される。他の系は、ＡＡＶ粒子－ヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）を回復するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としない。そのような系では、ヘルパー機能は、ヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションによって供給されてもよく、または細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するように操作されてもよく、その発現は、転写レベルまたは転写後レベルで制御されてもよい。

【0275】

更に別の系では、ＩＴＲに隣接するコード配列及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスに基づく構築物での感染によって昆虫宿主細胞に導入される。かかる産生システムは、当該技術分野において既知である（概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。これら及び他のＡＡＶ産生システムの作製及び使用方法は、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，７４１，６８３号、同第６，０５７，１５２号、同第６，２０４，０５９号、同第６，２６８，２１３号、同第６，４９１，９０７号、同第６，６６０，５１４号、同第６，９５１，７５３号、同第７，０９４，６０４号、同第７，１７２，８９３号、同第７，２０１，８９８号、同第７，２２９，８２３号、及び同第７，４３９，０６５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）にも記載されている。

【実施例】

【0276】

本開示は、以下の実験例を参照して更に詳細に説明される。これらの実施例は、例証目的のためのみに提供されており、別途明記されない限り、限定するようには意図されていない。したがって、本開示は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

【0277】

当業者は、前述の説明及び以下の実施例、ならびに当技術分野で既知であるものを使用して、本開示の技術を作製及び利用することができると考えられる。

【0278】

実施例１：ウイルス構築物の構築
本実施例は、本明細書に記載のウイルス構築物の生成の説明を提供する。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：３９９４－４００３，１９９９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって使用されるアデノウイルスを使用しない方法を用いたトランスフェクションによって生成した。ＡＡＶ ＩＴＲを有するシスプラスミド、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子を有するトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスゲノムからの必須領域を有するヘルパープラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞において同時トランスフェクトした。ｒＡＡＶ構築物は、記載されている構築物を使用して、単一の構築物戦略下でヒトペンドリンを発現した。ＡＡＶ Ａｎｃ８０カプシドを調製して、独自のｒＡＡＶペンドリンタンパク質コード構築物をカプセル化した。

【0279】

当業者は、同様の構築物がこの実施例に従って作製され得ることを容易に理解するであろう。例えば、単一、二重、またはマルチ構築物戦略下で哺乳動物、霊長類、またはヒトペンドリンを発現するｒＡＡＶ構築物を作製することができる。ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ８、ｒｈｌ０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、及びＡｎｃ８０をそれぞれ調製して、４組のペンドリン構築物をカプセル化して、（ｉ）コンカテマー化トランスプライシング、（ｉｉ）ハイブリッドイントロン相同組換えトランスプライシング戦略、（ｉｉｉ）Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．２：１５００９，２０１５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に要約されるような、エクソン相同組換え戦略、及び（ｉｖ）単一の構築物戦略を試験することができる。

【0280】

実施例２：ウイルス粒子の生成及び精製
本実施例は、ウイルス粒子（例えば、実施例１に記載されているように作製された粒子）の精製の説明を提供する。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を、標準的なトリプルトランスフェクションプロトコルを使用して産生し、（例えば、Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１５００９，２０１５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、２つの連続する塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配によって）精製した。第２の遠心分離の終わりに、５００μＬの１１画分をＣｓＣｌ密度勾配チューブから回収し、１×ＰＢＳ中で透析によって精製した。画分をドットブロットにより分析し、ｒＡＡＶゲノムを含有するものを決定した。各調製物のウイルスゲノム数（ｖｇ）は、ＡＡＶ構築物ゲノムのＩＴＲ領域に対応するプライマー及びプローブを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲベースの滴定法によって決定した（Ｂａｒｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１３：２０－２８，２００６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。当業者は、代替の産生及び／または精製プロセスがこの実施例に従って実施され得ることを容易に理解するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、当該技術分野において既知の様々なカラムクロマトグラフィー法を使用して精製されてもよく、及び／またはウイルスゲノムは、代替プライマーセットを使用して定量されてもよい。

【0281】

実施例３：ウイルス粒子の製剤化
本実施例は、ｒＡＡＶ粒子、及び生理学的に許容される溶液を含む組成物の調製に関する。ｒＡＡＶを、実施例２に記載されるように産生し、４．４５^１２ｖｇ／ｍＬの力価まで精製し、次いで、生理学的に許容される溶液（例えば、８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭのリン酸一カリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、１７２ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．００１％プルロン酸Ｆ６８の最終濃度に調製された、プルロン酸Ｆ６８を含む市販の１×ＰＢＳ）で６×１０^４、１．３×１０^５、１．８×１０^５、４．５×１０^９、及び１．３×１０^１０ｖｇ／ｍＬの希釈で調製した。

【0282】

当業者は、代替の製剤がこの実施例に従って調製され得ることを容易に理解するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子を代替の力価に精製し、代替の希釈液で調製し、代替の好適な溶液に懸濁してもよい。例えば、ｒＡＡＶを生成し、定量された力価に精製し、生理学的に許容される溶液（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．１１０：１－１９，２００５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような、ＮａＯＨで滴定してｐＨを７．５（総Ｎａ^＋濃度：１３０ｍＭ）に調整した、ＮａＣｌ １２０ｍＭ、ＫＣｌ ３．５ｍＭ、ＣａＣｌ２ １．５ｍＭ、グルコース ５．５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭを含む人工外リンパ）で適宜希釈して調製した。

【0283】

実施例４：デバイスの説明
本実施例は、ｒＡＡＶ粒子（例えば、実施例３に記載されるように製剤化されている）を内耳に送達するのに好適なデバイスに関する。ｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、正円窓膜（ＲＷＭ）を一貫して安全に穿孔するように設計された専用マイクロカテーテルを使用して、対象の蝸牛に送達される。マイクロカテーテルは、送達処置を実行する外科医が外耳道を介して中耳腔に入り、マイクロカテーテルの端部をＲＷＭと接触させることができるように成形される。マイクロカテーテルの遠位端は、約１０ミクロン～約１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルを含んでもよく、これにより、記載されるようなｒＡＡＶ粒子構築物（例えば、本開示のｒＡＡＶ構築物を含む）が、内耳を損傷しない速度（例えば、生理学的に許容可能な速度、例えば、約３０μＬ／分～約９０μＬ／分の速度）で、しかし、外科的修復をせずに治癒するのに十分に小さい速度で、ｒＡＡＶ粒子構築物が鼓室階の蝸牛の外リンパに進入するのに十分な穿孔がＲＷＭに作製される。マイクロカテーテルの残りの部分は、マイクロニードル（複数可）の近位に、定義された力価（例えば、約１×１０^１２～５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ）でｒＡＡＶ／人工外リンパ配合物を充填する。マイクロカテーテルの近位端は、約３０μＬ～約１００μＬの正確な低容量注入を可能にするマイクロマニピュレータに接続されている。

【0284】

実施例５：ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ及びペンドリンタンパク質産生（抗ＦＬＡＧ抗体）のインビトロ実証。
本実施例は、インビトロまたはエクスビボで成長した哺乳動物細胞内でＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含む構築物を発現するｒＡＡＶ粒子（例えば、実施例３に記載されるように製剤化される）の導入及び発現分析に関する。Ａｎｃ８０カプシドによって封入されたｒＡＡＶ構築物（図４に示す）を含む疑似ｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子を、上記実施例１～３に記載されるように調製し、２４ウェル形式で、ウェル当たり６×１０^４または１．８×１０^５ｖｇ／細胞の多重感染（ＭＯＩ）でウェル当たり１．５×１０^５細胞の密度で播種したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に形質導入した。細胞を、形質導入から７２時間後に、１ウェル当たり１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または３５０μＬのＲＬＴ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して採取した。タンパク質発現分析のために、３０マイクロリットルの試料を、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル中の個々のウェルに充填し、当該技術分野で知られている標準的なウエスタンブロッティング処置を行った。試験抗ＦＬＡＧ抗体及びビンクリンを対照として、蛍光リーダーを使用してバンドパターンを決定した。トランスジェニックペンドリンタンパク質のバンドパターンを決定した（図５）。ＲＮＡ発現分析のために、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。対照としてのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して、ｈＳＬＣ２６Ａ４特異的増幅プライマー及びＴａｑＭａｎプローブ（配列番号４９、５４、及び５５）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、相対的ｍＲＮＡ発現レベルを決定した。堅牢かつ用量依存的なＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ産生が観察された（図６）。

【0285】

加えて、野生型外植片（エクスビボ）に形質導入されたｒＡＡＶ構築物からｍＲＮＡ発現レベルを決定するための実験を行った。Ａｎｃ８０カプシドによってカプシド化されたｒＡＡＶ構築物（図４に示す）を含む疑似ｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子を調製し、４．５×１０^９ｖｇ／蝸牛または１．５×１０^１０ｖｇ／蝸牛のＭＯＩで外植片に形質導入した。細胞を、３５０μＬのＲＬＴ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して形質導入から７２時間後に採取し、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡ試料を調製した。対照としてのマウスＧＡＰＤＨプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して、ヒトＳＬＣ２６Ａ４特異的増幅プライマー及びＴａｑＭａｎプローブ（配列番号４９、５４、及び５５）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、相対的ｍＲＮＡ発現レベルを決定した。堅牢かつ用量依存的なＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ産生が観察された（図６）。

【0286】

当業者は、本実施例、例えば、代替的なウイルス力価、ＭＯＩ、細胞濃度、細胞採取までの時間、細胞採取またはｍＲＮＡもしくはタンパク質解析に利用される試薬、ＡＡＶ血清型、及び／またはＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を含む構築物に対する標準的な修飾が、本実施例の実用的かつ予想される変更であることを容易に理解するであろう。

【0287】

実施例６：野生型新生児蝸牛外植片におけるＳＬＣ２６Ａ４過剰発現の有毛細胞忍容性の予備的評価。
本実施例は、Ｐ２～Ｐ３日目の野生型Ｃ１マウスからの新生児蝸牛外植片におけるＳＬＣ２６Ａ４遺伝子（例えば、実施例３に記載されるように製剤化される）を過剰発現するための構築物を含むｒＡＡＶ粒子の導入及び発現分析に関する。Ａｎｃ８０カプシドによりカプシド化されたｒＡＡＶ構築物（図４に示すように）を含む疑似ｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子を、上記実施例１～３に記載されるように調製し、４．５×１０^９または１．３×１０^１０ｖｇ／蝸牛で新生児蝸牛外植片に形質導入した。外植片を形質導入後７２時間増殖させ、次いで４％ＰＦＡを使用して固定し、免疫蛍光染色／イメージングまたはＲＮＡ抽出のために調製した。定量的ＰＣＲを用いて過剰発現を確認した。免疫蛍光染色／イメージングを使用して、有毛細胞毒性の忍容性及び欠如を決定し、Ｍｙｏ７ａ（Ｐｒｏｔｅｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して内耳有毛細胞を描写し、ＤＡＰＩ染色を使用して核位置決めを定義した。ＳＬＣ２６Ａ４過剰発現後、有毛細胞（Ｍｙｏ７）毒性は観察されなかった（図７）。

【0288】

実施例７：高齢マウスにおける外科的方法
実施例７．１－高齢マウスへのｒＡＡＶ粒子導入方法
本実施例は、老化したマウスの内耳への本明細書に記載の構築物の導入に関する。ＡＡＶカプシド及びペンドリンタンパク質またはその特徴的な機能的部分をコードする構築物を含むｒＡＡＶ粒子を、製剤緩衝液中で調製し（例えば、人工外リンパ、またはプルロン酸Ｆ６８を含む１×ＰＢＳ）、次いで、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｄｏｉ・１０ １０８９／ｈｕｍ．２０１６ ０５３，Ｊｕｎｅ ２０１６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））に記載されるように、マウスの鼓室階に投与する。Ｐ１５よりも高齢の雄及び雌マウスを、キシラジン（約５～１０ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（約９０～１２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いて麻酔する。電気加熱パッドを使用して、体温を３７℃に維持する。右耳後部領域から切開を行い、鼓室胞と後半規管が露出する。鼓室胞を外科用ニードルで穿孔し、小さな穴を拡張して蝸牛へのアクセスを提供する。鼓室階の蝸牛側壁の骨を歯科用ドリルで薄くし、膜状の側壁をそのまま残す。次いで、後半規管（ＰＳＣＣ）に小さな穴を開ける。管吻合部の開存は、外リンパのゆっくりとした漏出の可視化によって確認される。ガラスマイクロピペットと組み合わせたナノリットマイクロインジェクションシステムを使用して、緩衝液を含有する合計約１μＬの構築物（例えば、人工外リンパまたはプルロン酸Ｆ６８を有する１×ＰＢＳ中の蝸牛当たり約４．５×１０^９～５×１０^１０ｖｇ／で本明細書に記載されるｒＡＡＶ構築物）を、２ｎＬ／秒の速度で鼓室階に送達する。注入後５分間、ガラスマイクロピペットを所定の位置に放置する。内耳開窓術及び注入後、鼓室胞及びＰＳＣＣの開口部を小片の脂肪で密封し、筋肉及び皮膚を縫合する。マウスを麻酔から覚醒させ、その疼痛を０．１５ｍｇ／ｋｇの塩酸ブプレノルフィンで３日間制御する。

【0289】

実施例７．２－高齢マウスへのｒＡＡＶ粒子の導入
本明細書に記載される（例えば、実施例３に記載される）構築物を含む粒子を含む製剤を、高齢マウス（例えば、高齢Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウス）の内耳に投与した。ＡＡＶカプシド及びペンドリンタンパク質またはその特徴的な機能的部分をコードする構築物を含むｒＡＡＶ粒子を、製剤緩衝液（例えば、人工外リンパ、またはプルロン酸Ｆ６８を有する１×ＰＢＳ）中で調製し、次いで、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｄｏｉ・１０ １０８９／ｈｕｍ．２０１６ ０５３，Ｊｕｎｅ ２０１６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））に記載されるように、マウスの鼓室階に投与した。Ｐ１５（例えば、Ｐ２３）よりも高齢の雄及び雌マウスを、キシラジン（約５～１０ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（約９０～１２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いて麻酔した。電気加熱パッドを使用して、体温を３７℃に維持した。右耳後部領域から切開を行い、鼓室胞と後半規管が露出した。鼓室胞を外科用ニードルで穿孔し、小さな穴を拡張して蝸牛へのアクセスを提供した。鼓室階の蝸牛側壁の骨を歯科用ドリルで薄くし、膜状の側壁をそのまま残した。次いで、後半規管（ＰＳＣＣ）に小さな穴を開けた。管吻合部の開存は、外リンパのゆっくりとした漏出の可視化によって確認された。ガラスマイクロピペットと組み合わせたナノリットルマイクロインジェクションシステムを使用して、緩衝液を含有する合計約１μＬの構築物（例えば、人工外リンパまたはプルロン酸Ｆ６８を有する１×ＰＢＳ中の蝸牛当たり約４．５×１０^９～５×１０^１０ｖｇ／で本明細書に記載されるｒＡＡＶ構築物）を、２ｎＬ／秒の速度で鼓室階に送達した。注入後５分間、ガラスマイクロピペットを所定の位置に放置した。内耳開窓術及び注入後、鼓室胞及びＰＳＣＣの開口部を小片の脂肪で密封し、筋肉及び皮膚を縫合した。マウスを麻酔から覚醒させ、その疼痛を０．１５ｍｇ／ｋｇの塩酸ブプレノルフィンで３日間制御した。

【0290】

実施例８：ＳＬＣ２６Ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスにおけるペンドリンタンパク質のトランスジェニック発現及びイメージング。
本実施例は、マウスにおけるトランスジェニックペンドリンタンパク質のトランスジェニック発現及び分析に関する。Ｐ３歳の新生児Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型またはＳｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}変異体マウスを、氷上で加温によって麻酔し、本明細書に記載される組成物の導入を準備した（例えば、実施例３を参照されたい）。ビヒクル対照、疑似ｒＡＡＶ粒子、またはＡｎｃ８０カプシドによってカプシド化されたｒＡＡＶ構築物（図４に示す）を調製し、正円窓膜（ＲＷＭ）を通してマウス内耳に導入した。ｒＡＡＶ粒子の導入は、以下のステップによって実行した：Ａ）蝸牛胞を曝露するための耳前切開、Ｂ）約１０μｍの最終ＯＤまでマイクロピペットプラー（カタログ番号Ｐ８７－Ｓｕｔｔｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で引っ張られたガラス製マイクロピペット（カタログ番号４８７８－ＷＰＩ）を使用して、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物（ナノリットル２０００マイクロマニピュレータ－ＷＰＩによって保持されるマイクロピペット）を鼓室階内に手動で送達し、これにより内耳細胞へのアクセスが可能になる、Ｃ）本明細書に記載の組成物（例えば、プルロン酸Ｆ６８を含む１×ＰＢＳ中、蝸牛当たり約４．５×１０^９～５×１０^１０ｖｇ／蝸牛の本明細書に記載されるｒＡＡＶ構築物）１μＬを、０．３μｌ／分（ＭＩＣＲＯ４マイクロインジェクションコントローラ－ＷＰＩによって制御される）の放出速度で各試験蝸牛に注入した。上記のように、陰性対照としてビヒクルを用いてシャム手術を実行した。追加の介入を行うことなく、マウスを手術から回復させた。Ｐ２１日目に、免疫蛍光染色／イメージングのためにマウスを採取した。対照またはＳｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}変異体マウスの蝸牛切片を、核発現のためのＤＡＰＩ、抗ペンドリン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いて画像化した（図８）。

【0291】

実施例９：ＳＬＣ２６Ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスにおける、ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ及びペンドリンタンパク質のトランスジェニック発現の表現型分析。
本実施例は、内耳においてＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ及びペンドリンタンパク質をトランスジェニック発現していたマウスの聴力の表現型分析に関する。Ｐ０またはＰ３齢の新生児Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型またはＳｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}変異体マウス（例えば、実施例８に記載されているように、参照されたい）を、氷上温熱療法によって麻酔し、本明細書に記載される組成物の導入のために準備した。疑似ｒＡＡＶ粒子、またはＡｎｃ８０カプシドによってカプシド化されたｒＡＡＶ構築物（図４に示す）を調製し、正円窓膜（ＲＷＭ）を通してマウス内耳に導入した。ｒＡＡＶ粒子の導入は、以下のステップによって実行した：Ａ）蝸牛胞を曝露するための耳前切開、Ｂ）約１０μｍの最終ＯＤまでマイクロピペットプラー（カタログ番号Ｐ８７－Ｓｕｔｔｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で引っ張られたガラス製マイクロピペット（カタログ番号４８７８－ＷＰＩ）を使用して、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物（ナノリットル２０００マイクロマニピュレータ－ＷＰＩによって保持されるマイクロピペット）を鼓室階内に手動で送達し、これにより内耳細胞へのアクセスが可能になった、Ｃ）本明細書に記載の組成物（例えば、プルロン酸Ｆ６８を含む１×ＰＢＳ中、蝸牛当たり約４．５×１０^９～５×１０^１０ｖｇ／蝸牛の本明細書に記載されるｒＡＡＶ構築物）１μＬを、０．３μｌ／分（ＭＩＣＲＯ４マイクロインジェクションコントローラ－ＷＰＩによって制御される）の放出速度で各試験蝸牛に注入した。上記のように、陰性対照としてビヒクルを用いてシャム手術を実行した。追加の介入を行うことなく、マウスを手術から回復させた。

【0292】

Ｐ２１日目に、片側組成物注入を受けた変異体Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスを、腹腔内に送達されたペントバルビタールナトリウム（３５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。次いで、グランドし、かつ音響的及び電気的に絶縁された試験室内の頭部ホルダー内にマウスを配置し、維持した。誘発電位検出システム（Ｓｍａｒｔ ＥＰ ３．９０，Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を使用して、マウスにおける聴性脳幹応答（ＡＢＲ）の閾値を測定した。クリック音、ならびに様々な強度（１０～１３０ｄＢ ＳＰＬ）での８、１６、及び３２ｋＨｚのトーンバーストを使用して、試験マウスにおいてＡＢＲを誘発した。応答信号を、マウスの耳に腹部外側に挿入した皮下ニードル電極で記録した。この実施例は、本明細書に記載の例示的な構築物の導入（例えば、図４に示すように）が難聴を救済することができることを確認し、更なる分析は、正確な投与タイミング枠及びＳＬＣ２６Ａ４救済が分子的にどのように機能するかを決定するのに役立ち得る。結果は、図９全体に示される。図９のパネル（Ａ）は、刺激に応答する能力を保持した対照ヘテロ接合Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／＋}マウスからのＡＢＲを示す。図９のパネル（Ｂ）は、Ｐ０日目に本明細書に記載の組成物を片側に注入した、Ｐ２１日目のＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスからの例示的な記録結果を示し、対照耳と比較したときに、ＡＢＲ性能の改善が試験耳で観察された。新生児マウスでは、注入された耳から注入されていない耳への交差に起因する、刺激への応答の改善もまた、注入されていない耳で観察された。図９のパネル（Ｃ）は、Ｐ０日目またはＰ３日目にそれぞれ片側に注入されたＳｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスと比較して、Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／＋}マウスで応答を生成するのに必要なＡＢＲ閾値（ｄＢ ＳＰＬで測定された特定の周波数で）のグラフ表現を示す。図９のパネル（Ｄ）は、Ｐ３日目に本明細書に記載の組成物を片側に注入した、Ｐ２１日目のＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｓｌｃ２６ａ４^{ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ／ｔｍ１Ｄｏｎｔｕｈ}マウスの例示的な記録結果を示し、ＡＢＲ性能の改善は観察されず、更なる分析は、投与タイミング枠を決定するために関連し得る。

【0293】

実施例１０：ＳＬＣ２６Ａ４変異体マウスにおけるＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ及びペンドリンタンパク質のトランスジェニック発現の表現型分析。
実施例１０．１－トランスジェニックマウスの表現型分析のための方法
本実施例は、内耳においてＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ及びペンドリンタンパク質をトランスジェニック発現しているマウスの聴力の表現型分析に関する（例えば、実施例３に記載されるようなものを参照されたい）。Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３齢の新生児ＦＶＢ野生型またはＳＬＣ２６Ａ４変異体マウス（例えば、ヒトＬ２３６Ｐ変異を模倣するマウス、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ ５１５，ｐｇ ３５９－３６５，２０１９に記載されるような、例えば、ＣＢＡ／ＣａＪ系統のＳｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ＋}変異マウス）を（例えば、氷上温熱療法によって）麻酔し、本明細書に記載の組成物の導入の準備を行う。ビヒクル対照、疑似ｒＡＡＶ粒子、またはＡｎｃ８０カプシドによってカプシド化されたｒＡＡＶ構築物（例えば、図３または図４によって表される）を調製し、正円窓膜（ＲＷＭ）を通してマウス内耳に導入する（例えば、実施例７を参照されたい）。ｒＡＡＶ粒子の導入は、以下のステップによって実行する：Ａ）蝸牛胞を曝露するための耳前切開、Ｂ）約１０μｍの最終ＯＤまでマイクロピペットプラー（カタログ番号Ｐ８７－Ｓｕｔｔｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で引っ張られたガラス製マイクロピペット（カタログ番号４８７８－ＷＰＩ）を使用して、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物（ナノリットル２０００マイクロマニピュレータ－ＷＰＩによって保持されるマイクロピペット）を鼓室階内に手動で送達し、これにより内耳細胞へのアクセスが可能になる、Ｃ）本明細書に記載の組成物（例えば、プルロン酸Ｆ６８を含む１×ＰＢＳ中、蝸牛当たり約４．５×１０^９～５×１０^１０ｖｇ／蝸牛の本明細書に記載されるｒＡＡＶ構築物）１μＬを、０．３μｌ／分（ＭＩＣＲＯ４マイクロインジェクションコントローラ－ＷＰＩによって制御される）の放出速度で各試験蝸牛に注入する。上記のように、陰性対照としてビヒクルを用いてシャム手術を実行する。追加の介入を行うことなく、マウスを手術から回復させる。

【0294】

術後の規定日（例えば、Ｐ２１日目、Ｐ２８日目、Ｐ３０日目、Ｐ６０日目、２ヶ月目、Ｐ９０日目、Ｐ１２０日目、Ｐ１５０日目、Ｐ１８０日目、６ヶ月目、及び／または１２ヶ月目）に、片側組成物注入を受けたＳｌｃ２６ａ４変異体マウスを、腹腔内に送達されたペントバルビタールナトリウム（例えば、約３５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔する。次いで、グランドし、かつ音響的及び電気的に絶縁された試験室内の頭部ホルダー内にマウスを配置し、維持する。誘発電位検出システム（Ｓｍａｒｔ ＥＰ ３．９０，Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を使用して、マウスにおける聴性脳幹応答（ＡＢＲ）の閾値を測定する。クリック音、ならびに様々な強度（１０～１３０ｄＢ ＳＰＬ）での８、１６、及び３２ｋＨｚのトーンバーストを使用して、試験マウスにおいてＡＢＲを誘発する。応答信号を、マウスの耳に腹部外側に挿入した皮下ニードル電極で記録する。シャム注入されたマウスは陰性対照として機能し、疑似注入された耳はＡＢＲ試験の内部対照として機能し、対照耳及び／または動物と比較した場合、ＡＢＲ性能の改善が試験耳で観察される。

【0295】

ＦＶＢバックグラウンドの新生児及び／または成体Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異マウスは、Ｐ１日目、Ｐ２日目、Ｐ２３日目、またはＰ２８日目に、後半規管の開窓を伴う、または伴わない正円窓膜注入を通して、図３または図４に示されるようなｒＡＡＶ粒子の送達を含む、片側または両側手術を受ける。手術の前に、マウスは任意選択的に、上述のように初期ＡＢＲの読み取りを受ける。定義された術後の日付（例えば、Ｐ２１日目、Ｐ２８日目、Ｐ３０日目、Ｐ６０日目、２ヶ月目、Ｐ９０日目、Ｐ１２０日目、Ｐ１５０日目、Ｐ１８０日目、６ヶ月目、及び／または１２ヶ月目）で、マウスを表現型提示のために試験し、例えば、ＡＢＲの読み取り値を上述のように測定し、及び／または協調のための代用として働く表現型（例えば、歩行、旋回行動、遊泳など）を測定する。結果は、新生児及び／または生体の遺伝子療法が、処置された及び／または対側の耳における難聴表現型、及び／または協調性表現型の喪失を救済することを示す。

【0296】

実施例１０．２－トランスジェニックマウスの表現型分析
内因性遺伝子座におけるＬ２３６Ｐ変異を含む変異体Ｓｌｃ２６ａ４マウスを、ＦＶＢ遺伝子バックグラウンドにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組み込みを使用して作製した。Ｐ２齢の新生児ＦＶＢ Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスを、氷上温熱療法によって麻酔し、本明細書に記載される組成物の導入を準備した。変異体マウスに、試験耳の正円窓膜（ＲＷＭ）を通じて、片側ｒＡＡＶ粒子（図４に示すように）注入を行った（例えば、実施例７を参照）。ｒＡＡＶ粒子の導入は、以下のステップによって実行した：Ａ）蝸牛胞を曝露するための耳前切開を行った、Ｂ）ガラス製マイクロピペット（カタログ番号４８７８－ＷＰＩ）を約１０μｍの最終ＯＤまでマイクロピペットプラー（カタログ番号Ｐ８７－Ｓｕｔｔｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で引っ張り、使用して、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物（ナノリットル２０００マイクロマニピュレータ－ＷＰＩによって保持されるマイクロピペット）を鼓室階内に手動で送達し、これにより内耳細胞へのアクセスが可能になった、Ｃ）本明細書に記載の組成物（例えば、プルロン酸Ｆ６８を含む１×ＰＢＳ中、約８．２Ｅ１２ｖｇ／ｍｌの本明細書に記載されるｒＡＡＶ構築物）約１μＬを、約０．３μｌ／分（ＭＩＣＲＯ４マイクロインジェクションコントローラ－ＷＰＩによって制御される）の放出速度で各試験蝸牛に注入した。追加の介入を行うことなく、マウスを手術から回復させた。

【0297】

Ｐ２日目（例えば、Ｐ３０日目、Ｐ６０日目、Ｐ９０日目、Ｐ１２０日目、Ｐ１５０日目、及びＰ１８０日目）の手術後の規定の日付に、対照Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウス、対照Ｓｌｃ２６ａ４^{ＷＴ／ＷＴ}マウス、及び片側組成物注入を受けたＳｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスを、腹腔内に送達されたペントバルビタールナトリウム（例えば、約３５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。次いで、グランドし、かつ音響的及び電気的に絶縁された試験室内の頭部ホルダー内にマウスを配置し、維持した。誘発電位検出システム（Ｓｍａｒｔ ＥＰ ３．９０，Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を使用して、上記マウスにおける聴性脳幹応答（ＡＢＲ）の閾値を測定した。クリック音を使用して、試験マウスにおいてＡＢＲを誘発した。応答信号を、マウスの耳に腹部外側に挿入した皮下ニードル電極で記録した。シャム注入変異体マウス及びＷＴマウスは、ＡＢＲ試験の対照として作用し、対照動物と比較した場合、処置耳及び対側耳の両方の試験動物においてＡＢＲ性能の改善が観察された（図１１を参照）。これらの結果は、新生児遺伝子治療が治療された耳と対側耳の両方で難聴表現型を救済したことを示す。

【0298】

Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウス（Ｎ＝４）の別のコホートは、上述のように、Ｐ２日目に片側手術を受けた（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を含む１μＬの注射用液を、プルロン酸Ｆ６８を含む１×ＰＢＳ中に約８．２Ｅ１２ｖｇ／ｍｌでＲＷＭ注入した）。Ｐ３０日目に、マウスを、腹腔内に送達されたペントバルビタールナトリウム（例えば、約３５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。次いで、グランドし、かつ音響的及び電気的に絶縁された試験室内の頭部ホルダー内にマウスを配置し、維持した。誘発電位検出システム（Ｓｍａｒｔ ＥＰ ３．９０，Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を使用して、上記マウスにおける聴性脳幹応答（ＡＢＲ）の閾値を測定した。クリック音、ならびに様々な強度（１０～１３０ｄＢ ＳＰＬ）での８、１６、及び３２ｋＨｚのトーンバーストを使用して、試験マウスにおいてＡＢＲを誘発する。応答信号を、マウスの耳に腹部外側に挿入した皮下ニードル電極で記録した。有効な聴力を示すＡＢＲ性能は、治療した耳と対側耳の両方で試験動物で観察された（図１２を参照）。

【0299】

２匹の成体Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスは、Ｐ２３日目に、後半規管の開窓を伴う正円窓膜を通じて、図４に示されるようなｒＡＡＶ粒子の送達を含む片側手術を受けた（例えば、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子を１μＬ注射用液をプルロン酸Ｆ６８で含む１×ＰＢＳ中に約８．２Ｅ１２ｖｇ／ｍｌでＲＷＭ注入した）。手術前、Ｐ２２日目に、マウスを麻酔し、ＡＢＲ読み取りを上述の通り測定した。手術後、約Ｐ４９またはＰ５０日目に、マウスを麻酔し、ＡＢＲ読み取りを上述の通り測定した。図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、ｒＡＡＶ粒子注入の前に、両方のマウスは、注目された周波数でクリックまたは純音に曝露されたときに聴力が低かった。しかしながら、４つの耳のうちの３つは、注入後試験日において改善されたＡＢＲ性能を示し、Ｓｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}難聴表現型の効果的な聴力及びトランスジェニック救済を示した（マウスの観察は、図１３Ｂに提示される注入後の耳Ｐ５０が注入プロセスの一部として損傷を受けた可能性があることを示した）。更に、同じマウスを、協調のための代用として遊泳アッセイを使用して、Ｐ５０日目に試験した。遊泳試験は、前庭異常の評価のために修正されたＳＨＩＲＰＡ行動プロトコルに従って実施した。ＷＴ及び処置マウスの両方が、４肢全ての方向移動を含む遊泳能を明確に提示したが、変異マウスは水上に留まることができた（データ図示せず）。処置マウスは、対照と比較したときに、改善された遊泳能を示した。これらの結果は、成体の遺伝子治療が処置耳と対側耳の両方の難聴表現型を救済し、協調性を回復させたことを示した。

【0300】

社内で生成されたＳｌｃ２６ａ４^{Ｌ２３６Ｐ／Ｌ２３６Ｐ}変異体マウスは、様々な強度（１０～１３０ｄＢ ＳＰＬ）でクリック音、ならびに８、１６、及び３２ｋＨｚのトーンバーストを伴うＡＢＲを使用して測定した場合、重度の先天性難聴（図１４Ｂ）、先天性難聴（図１４Ｃ）、変性難聴（図１４Ｄ）、及び正常な聴力レベル（図１４Ｅ）の範囲の表現型提示（図１４Ａ）を示した。全ての変異体動物は、ある程度の表現型の浸透を有したが、表現型のばらつきを経験した。この現象は、難聴及び前庭異常のためのマウスモデルでは珍しくなく、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ ５１５，ｐｇ．３５９－３６５，２０１９に記載されている同様のマウスモデルにおいて以前に観察された。この表現型変動性を制御するために、ＡＢＲを使用して手術前にマウスを評価し、ベクターとともに投与したのは、明らかな難聴（ＷＴと比較して＞２０ｄＢの閾値増加）を有するマウスのみであった。聴覚表現型の範囲は、他のＤＦＮＢ４及び／またはペンドレッド症候群の症状（例えば、旋回行動及び／または遊泳できないことによって表される）の代用として作用することができる追加の行動表現型と相関する。

【0301】

実施例１１：ヒト臨床実施例
本実施例は、ＳＬＣ２６Ａ４関連症候性または非症候性の難聴の治療につながり、かつ、それをもたらす一連の事象に関する。患者は、病原性ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子を有すると診断される。患者は、全身麻酔下に置かれる。外科医は、外耳道から鼓膜に近づき、外耳道の下端で小さな切開を行い、そこで鼓膜に到達し、弁としての鼓膜を持ち上げて中耳の空間を露出させる。外科用レーザーは、アブミ骨底板に小さな開口部（約２ｍｍ）を作製するために使用される。次に、外科医は、適切な力価（例えば、約１×１０^１２～５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ）で生理学的に適切な緩衝液（例えば、人工外リンパ）中で調製された、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子配列を含む少なくとも１つのＡＡＶに基づく構築物の混合物の溶液を充填したマイクロカテーテルで正円窓膜を穿孔する。マイクロカテーテルを、生理学的に許容される容量の混合物（例えば、約５０μＬ～約１００μＬ）を定常的であるが認識可能な速度（例えば、約３０μＬ／分～９０μＬ／分）で注入するマイクロマニピュレータに接続する。輸液の終了時に、外科医はマイクロカテーテルを引き抜き、アブミ骨底板及びＲＷＭの穴をジェルフォームパッチでパッチする。この処置は、患者が麻酔から離脱して回復する前に、鼓膜弁を交換することで終了する。

【0302】

実施例１２：ＳＬＣ２６Ａ４変異を検出するための母体血液の非侵襲的な出生前検査
この実施例は、迅速かつ有効な治療的介入を容易にするために、出産前に子孫のＳＬＣ２６Ａ４遺伝子型を決定するための母体血液の試験に関する。母体血液試料（２０～４０ｍＬ）を、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）チューブに収集する。２，０００ｇの二重遠心分離プロトコルを２０分間、続いて３，２２０ｇを３０分間、第１のスピンの後に上清移送して、各試料から少なくとも７ｍＬの血漿を単離する。ｃｆＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｍｐ循環核酸キットを使用して７～２０ｍＬの血漿から単離し、４５μＬのＴＥ緩衝液で溶出する。純粋な母体ゲノムＤＮＡを、第１の遠心分離後に得られたバフィーコートから単離する。

【0303】

アッセイの熱力学的モデリングを組み合わせて、前述の増幅アプローチ（Ｓｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９（１０）：１８４３－１８４８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））とのプローブ－プローブ相互作用の可能性を最小限に抑えたプローブを選択することにより、１１，０００アッセイの多重化を達成することができる。１１，０００個の標的特異的アッセイを使用して、母体ｃｆＤＮＡ及び母体ゲノムＤＮＡ試料を１５サイクルにわたって事前増幅し、アリコートを、二段階プライマーを使用して１５サイクルの第２のＰＣＲ反応に移す。試料を、第３の１２サイクルラウンドのＰＣＲにバーコード化タグを付加することによって、配列決定のために調製する。標的は、ペンドレッド症候群またはＤＦＮＢ４をもたらすことが知られているＳＬＣ２６Ａ４の２００超の変異に対応するＳＮＰ、及び／またはＳＬＣ２６Ａ４の全てのエクソンをカバーする配列を含み、これは、現在知られていないが潜在的な病原性バリアントを検出するためのものである。任意選択的に、ＦＯＸＩ１及び／またはＫＣＮＪ１０に対応する配列を増幅して、ＤＦＮＢ４またはペンドレッド症候群の可能性のある異種二遺伝子症例を特定する。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンサーを使用して、アンプリコンを配列決定する。ゲノム配列アラインメントは、市販のソフトウェアを使用して実行される。

【0304】

例示的な実施形態
実施形態１．プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む構築物であって、前記コード配列が、ペンドリンタンパク質をコードする、前記構築物。

【0305】

実施形態２．前記コード配列が、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である、実施形態１に記載の構築物。

【0306】

実施形態３．前記ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、霊長類ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である、実施形態２に記載の構築物。

【0307】

実施形態４．前記ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子である、実施形態２または３に記載の構築物。

【0308】

実施形態５．前記ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に記載の核酸配列を含む、実施形態４に記載の構築物。

【0309】

実施形態６．前記ヒトＳＬＣ２６Ａ４遺伝子が、配列番号１に記載の核酸配列を含む、実施形態４または５に記載の構築物。

【0310】

実施形態７．前記ペンドリンタンパク質が、霊長類ペンドリンタンパク質である、実施形態１に記載の構築物。

【0311】

実施形態８．前記ペンドリンタンパク質が、ヒトペンドリンタンパク質である、実施形態１または７に記載の構築物。

【0312】

実施形態９．前記ペンドリンタンパク質が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の構築物。

【0313】

実施形態１０．前記プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである、実施形態１～９のいずれか１つに記載の構築物。

【0314】

実施形態１１．前記プロモーターが、内耳細胞特異的プロモーターである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の構築物。

【0315】

実施形態１２．前記内耳細胞特異的プロモーターが、ＧＪＢ２プロモーター、ＧＪＢ６プロモーター、ＳＬＣ２６Ａ４プロモーター、ＴＥＣＴＡプロモーター、ＤＦＮＡ５プロモーター、ＣＯＣＨプロモーター、ＮＤＰプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＰＬＰプロモーター、ＴＡＫ１プロモーター、ＳＯＸ２１プロモーター、ＳＯＸ２プロモーター、ＦＧＦＲ３プロモーター、ＰＲＯＸ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ１プロモーター、ＬＧＲ５プロモーター、ＨＥＳ１プロモーター、ＨＥＳ５プロモーター、ＮＯＴＣＨ１プロモーター、ＪＡＧ１プロモーター、ＣＤＫＮ１Ａプロモーター、ＣＤＫＮ１Ｂプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、Ｐ７５プロモーター、ＣＤ４４プロモーター、ＨＥＹ２プロモーター、ＬＦＮＧプロモーター、またはＳ１００ｂプロモーターである、実施形態１１に記載の構築物。

【0316】

実施形態１３．前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＣＢ７プロモーターである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の構築物。

【0317】

実施形態１４．前記プロモーターが、配列番号４３に記載の核酸配列を含む、実施形態１３に記載の構築物。

【0318】

実施形態１５．２つのＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）を更に含み、前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、前記コード配列及びプロモーターに隣接する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の構築物。

【0319】

実施形態１６．前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲであるか、またはＡＡＶ２ ＩＴＲに由来する、実施形態１５に記載の構築物。

【0320】

実施形態１７．前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、（ｉ）配列番号１０に記載の核酸配列を含む５’ＩＴＲ及び配列番号１１に記載の核酸配列を含む３’ＩＴＲ、または（ｉｉ）配列番号１２に記載の核酸配列を含む５’ＩＴＲ及び配列番号１３に記載の核酸配列を含む３’ＩＴＲを含む、実施形態１５に記載の構築物。

【0321】

実施形態１８．前記構築物が、配列番号３９に記載の核酸配列を含む、実施形態１に記載の構築物。

【0322】

実施形態１９．前記構築物が、配列番号４０に記載の核酸配列を含む、実施形態１に記載の構築物。

【0323】

実施形態２０．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の構築物を含む、ＡＡＶ粒子。

【0324】

実施形態２１．ＡＡＶカプシドを更に含み、前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ｒｈ８、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、もしくはＡＡＶ Ａｎｃ８０カプシドであるか、またはそれに由来する、実施形態２０に記載のＡＡＶ粒子。

【0325】

実施形態２２．前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ Ａｎｃ８０カプシドである、実施形態２１に記載のＡＡＶ粒子。

【0326】

実施形態２３．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の構築物を含む、組成物。

【0327】

実施形態２４．実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子を含む、組成物。

【0328】

実施形態２５．前記組成物が、薬学的組成物である、実施形態２３または２４に記載の組成物。

【0329】

実施形態２６．薬学的に許容される担体を更に含む、実施形態２５に記載の組成物。

【0330】

実施形態２７．実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の組成物を含む、エクスビボ細胞。

【0331】

実施形態２８．エクスビボ細胞に、（ｉ）実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の構築物と、（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子、ＡＡＶ ＶＡ遺伝子、ＡＡＶ Ｅ２ａ遺伝子、及びＡＡＶ Ｅ４遺伝子を一括して含む、１つ以上のヘルパープラスミドと、をトランスフェクトすることを含む、方法。

【0332】

実施形態２９．対象の内耳に、実施形態２５または２６に記載の組成物を導入することを含む、方法。

【0333】

実施形態３０．対象の内耳に、実施形態２５または２６に記載の組成物を導入することを含む、治療方法。

【0334】

実施形態３１．実施形態２５または２６に記載の組成物が、前記対象の蝸牛に導入される、実施形態２９または３０に記載の方法。

【0335】

実施形態３２．実施形態２５または２６に記載の組成物が、正円窓膜注入により導入される、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の方法。

【0336】

実施形態３３．前記対象の聴力レベルを測定することを更に含む、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載の方法。

【0337】

実施形態３４．聴力レベルが、聴性脳幹応答（ＡＢＲ）試験を実行することによって測定される、実施形態３３に記載の方法。

【0338】

実施形態３５．前記対象の前記聴力レベルを参照聴力レベルと比較することを更に含む、実施形態３３または３４に記載の方法。

【0339】

実施形態３６．前記参照聴力レベルが、公開されたまたは既往の参照聴力レベルである、実施形態３５に記載の方法。

【0340】

実施形態３７．前記対象の前記聴力レベルが、実施形態２５または２６に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照聴力レベルが、実施形態２５または２６に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象の聴力レベルである、実施形態３５に記載の方法。

【0341】

実施形態３８．前記対象におけるペンドリンタンパク質のレベルを測定することを更に含む、実施形態２９～３７のいずれか１つに記載の方法。

【0342】

実施形態３９．前記ペンドリンタンパク質のレベルが、前記対象の内耳において測定される、実施形態３８に記載の方法。

【0343】

実施形態４０．前記ペンドリンタンパク質のレベルが、前記対象の蝸牛において測定される、実施形態３８または３９に記載の方法。

【0344】

実施形態４１．前記対象における前記ペンドリンタンパク質のレベルを、参照ペンドリンタンパク質レベルと比較することを更に含む、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法。

【0345】

実施形態４２．前記参照ペンドリンタンパク質レベルが、公開されたまたは既往の参照ペンドリンタンパク質レベルである、実施形態４１に記載の方法。

【0346】

実施形態４３．前記対象における前記ペンドリンタンパク質のレベルが、実施形態２５または２６に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照ペンドリンタンパク質レベルが、実施形態２５または２６に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象のペンドリンタンパク質レベルである、実施形態４１に記載の方法。

【0347】

実施形態４４．難聴に罹患しているか、もしくは難聴のリスクがある対象における難聴の治療のための、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の構築物、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子、または実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の組成物の、使用。

【0348】

実施形態４５．難聴の治療のための医薬の製造における、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の構築物、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子、または実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の組成物の、使用。

【0349】

実施形態４６．医薬として使用するための、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の構築物、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子、または実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の組成物。

【0350】

実施形態４７．難聴の治療に使用するための、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の構築物、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子、または実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の組成物。

【0351】

実施形態４８．遺伝子改変マウスであって、そのゲノムが、配列番号５７に記載のポリペプチドをコードする改変Ｓｌｃ２６ａ４遺伝子を含み、前記遺伝子改変マウスが、聴覚分析実験での使用に好適なマウス株の遺伝子改変バージョンである、前記遺伝子改変マウス。

【0352】

実施形態４９．前記聴覚分析実験での使用に好適なマウス株が、ＣＢＡ／ＣａＪまたはＣＢＡ／Ｊではない、実施形態４８に記載の遺伝子改変マウス。

【0353】

実施形態５０．前記聴覚分析実験での使用に好適なマウス株が、ＦＶＢ、１２９／Ｓｖ－＋ｐ＋Ｔｙｒ－ｃ＋Ｍｇｆ－ＳＩＪ／Ｊ、Ａ／ＨｅＪ、ＡＫＲ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＤＰ／Ｊ、ＢＸＳＢ／ＭｐＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、ＣＡＳＡ／ＲＫ、ＣＡＳＴ／Ｅｉ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＺＥＣＨ ＩＩ／Ｅｉ、ＤＢＡ／２ＨａＳｍｎ、ＦＶＢ／ＮＪ、ＨＲＳ／Ｊ ｈｒｌ＋、ＭＯＬＤ／Ｒｋ、ＭＯＬＦ／Ｅｉ、ＭＯＬＧ／Ｄｎ、ＮＯＮ／ＬｔＪ、ＮＺＢ／Ｂ１ＮＪ、ＮＺＯ／ＮＩＪ、ＮＺＷ／ＬａｃＪ、ＰＥＲＡ／ｃａｍＥｉ、ＰＥＲＣ／Ｅｉ、ＰＬ／Ｊ、ＲＢＡ／Ｄｎ、ＲＢＦ／ＤｎＪ、ＲＦ／Ｊ、ＲＨＪ／Ｌｅ ｈｒｒｈ－Ｊ／＋、ＲＩＩＩＳ／Ｊ、ＳＥＣ／１ＲｅＪ、ＳＥＮＣＡＲＣ／ＰｔＪ、ＳＦ／ＣａｍＥｉ、ＳＨＲ／ＧｎＥｉ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＭ／Ｊ、ＳＰＲＥＴ／Ｅｉ、ＳＴ／ｂＪ、またはＳＷＲ／Ｊ株である、実施形態４８に記載の遺伝子改変マウス。

【0354】

実施形態５１．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の組成物、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子、または実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の組成物を、実施形態４８～５０のいずれか１つに記載のマウスの正円窓膜の穿孔を通じて注入することを含む、方法。

【0355】

実施形態５２．難聴を治療する方法であって、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の組成物、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子、または実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、前記方法。

【0356】

実施形態５３．前記組成物が、正円窓膜注入により導入される、実施形態５２に記載の方法。

【0357】

実施形態５４．前記難聴が、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異と関連付けられている、実施形態５２または５３に記載の方法。

【0358】

実施形態５５．前記難聴及び難聴の治療が、任意の治療を受ける前に記録され、治療後のＡＢＲ及び／または歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）測定値と比較されたＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値の関数として特徴付けられる、実施形態５２～５４のいずれか１つに記載の方法。

【0359】

実施形態５６．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の構築物を含む組成物、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＡＡＶ粒子を含む組成物、または実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の組成物を含む、キット。

【0360】

実施形態５７．前記組成物が、デバイスに事前に装填される、実施形態５６に記載のキット。

【0361】

実施形態５８．前記デバイスが、マイクロカテーテルである、実施形態５７に記載のキット。

【0362】

実施形態５９．前記マイクロカテーテルが、外耳道を介して中耳腔に入り、前記マイクロカテーテルの端部をＲＷＭと接触させることができるように成形される、実施形態５８に記載のキット。

【0363】

実施形態６０．前記マイクロカテーテルの遠位端が、１０～１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルから構成される、実施形態５７または５８に記載のキット。

【0364】

実施形態６１．デバイスを更に含む、実施形態５６に記載のキット。

【0365】

実施形態６２．前記デバイスが、図１５～１８に記載のデバイスまたは本明細書に記載のデバイスである、実施形態６１に記載のキット。

【0366】

実施形態６３．前記デバイスが、屈曲部分及び角度のある先端を含むニードルを含む、実施形態６２に記載のキット。

【0367】

等価物
使用されている単語は、限定ではなく説明の単語であり、変更が、そのより広い態様において本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で行われ得ることを理解されたい。

【0368】

本発明は、記載されたいくつかの実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の特異性をもって説明されてきたが、任意のそのような詳細もしくは実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきではないことが意図されているが、従来技術の観点からそのような特許請求の範囲の最も広範な解釈を提供し、したがって、本発明の意図される範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。

【0369】

本開示はその詳細な説明と併せて説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本開示の範囲を限定するのではなく例証するよう意図されていることを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含む本明細書が優先される。加えて、セクションの見出し、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2023526047000001.app

【国際調査報告】