特表 2023-526061 熱安定性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-20

(54)【発明の名称】熱安定性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20230613BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20230613BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230613BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230613BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230613BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230613BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230613BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54

C12N9/10 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022568837

(86)(22)【出願日】2021-05-11

(85)【翻訳文提出日】2022-12-19

(86)【国際出願番号】 US2021031852

(87)【国際公開番号】W WO2021231483

(87)【国際公開日】2021-11-18

(31)【優先権主張番号】63/023,734

(32)【優先日】2020-05-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500358711

【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】520512579

【氏名又は名称】イルミナ・シンガポール・プライベイト・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｐｔｅ Ｌｔｄ

(71)【出願人】

【識別番号】507335687

【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100132263

【弁理士】

【氏名又は名称】江間 晴彦

(72)【発明者】

【氏名】ニランタル，サウラブ ラジェンドラ

(72)【発明者】

【氏名】チュア，ジャスミン プアイ スーザン

(72)【発明者】

【氏名】ペイサジョビッチ，セルジョ

(72)【発明者】

【氏名】イェウ，ウェン シャン

(72)【発明者】

【氏名】ゴ，メイベル ダーリーン コ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050CC07

4B050DD11

4B050LL10

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA29

4B065CA60

(57)【要約】

本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、ウシＴｄＴと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、組換えＴｄＴは、ウシＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換変異を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）であって、前記組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な１つ以上の位置に、１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）。

【請求項2】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項3】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９１Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９１Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９１Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９１Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌである、請求項１に記載に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項4】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＧｌｕ１９１Ｖａｌである、請求項１に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項5】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項6】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｌｙｓ１９３Ａｌａ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ１９３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１９３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１９３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１９３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１９３Ｔｙｒ、又はＬｙｓ１９３Ｖａｌである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項7】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＬｙｓ１９３Ａｓｎである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項8】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項9】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９４Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９４Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９４Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項10】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＧｌｕ１９４Ｇｌｙである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項11】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項12】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ａｓｐ２４２Ａｌａ、Ａｓｐ２４２Ａｒｇ、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｈｉｓ、Ａｓｐ２４２Ｉｌｅ、Ａｓｐ２４２Ｌｅｕ、Ａｓｐ２４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｍｅｔ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｐｒｏ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、又はＡｓｐ２４２Ｖａｌである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項13】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＡｓｐ２４２Ｔｙｒである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項14】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項15】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｌｙｓ２８７Ａｌａ、Ｌｙｓ２８７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｎ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ、Ｌｙｓ２８７Ｃｙｓ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２８７Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２８７Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２８７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ２８７Ｍｅｔ、Ｌｙｓ２８７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ２８７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ２８７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｒｐ、Ｌｙｓ２８７Ｔｙｒ、又はＬｙｓ２８７Ｖａｌである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項16】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＬｙｓ２８７Ｇｌｕである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項17】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項18】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ａｒｇ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｎ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｐ、Ｐｈｅ２９６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｈｉｓ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、Ｐｈｅ２９６Ｐｒｏ、Ｐｈｅ２９６Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｈｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｒｐ、Ｐｈｅ２９６Ｔｙｒ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項19】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＰｈｅ２９６Ｌｅｕである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項20】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項21】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｍｅｔ２９９Ａｌａ、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｎ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｐ、Ｍｅｔ２９９Ｃｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｙ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、Ｍｅｔ２９９Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２９９Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２９９Ｐｒｏ、Ｍｅｔ２９９Ｓｅｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｒｐ、Ｍｅｔ２９９Ｔｙｒ、又はＭｅｔ２９９Ｖａｌである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項22】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＭｅｔ２９９Ｌｙｓである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項23】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項24】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｔｈｒ３４２Ａｌａ、Ｔｈｒ３４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｐ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３４２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３４２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３４２Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｍｅｔ、Ｔｈｒ３４２Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、Ｔｈｒ３４２Ｔｒｐ、Ｔｈｒ３４２Ｔｙｒ、又はＴｈｒ３４２Ｖａｌである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項25】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異がＴｈｒ３４２Ｓｅｒである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項26】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項27】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置の前記アミノ酸置換変異が、Ｈｉｓ４２１Ａｌａ、Ｈｉｓ４２１Ａｒｇ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｐ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｕ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４２１Ｉｌｅ、Ｈｉｓ４２１Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４２１Ｌｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２１Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４２１Ｔｙｒ、又はＨｉｓ４２１Ｖａｌである、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項28】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異がＨｉｓ４２１Ｐｒｏである、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項29】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な２つ以上の位置に２つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項30】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な２つ以上の位置の前記２つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの２つ以上を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な３つ以上の位置に３つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項32】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な３つ以上の位置の前記３つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの３つ以上を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な４つ以上の位置に４つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項34】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な４つ以上の位置における前記４つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの４つ以上を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な５つ以上の位置に５つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項36】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な５つ以上の位置における前記５つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの５つ以上を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な６つ以上の位置に６つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項38】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な６つ以上の位置における前記６つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの６つ以上を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な７つ以上の位置に７つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項40】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な７つ以上の位置における前記７つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの７つ以上を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つ以上の位置に８つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項42】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つ以上の位置における前記８つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの８つ以上を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つの位置に８つのアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項44】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つの位置における前記８つのアミノ酸置換変異が、それぞれＬｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置に９つのアミノ酸置換変異を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項46】

配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置における前記９つのアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏである、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項48】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項49】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項50】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項51】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項52】

前記組換えＴｄＴが、４７℃以上の温度で安定である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項53】

前記組換えＴｄＴが、５０℃以上の温度で安定である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項54】

前記組換えＴｄＴが、５５℃以上の温度で安定である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項55】

前記組換えＴｄＴが、５８℃以上の温度で安定である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項56】

前記組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性が、同じ試験温度における、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、又は１２０％である、請求項１～５５のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項57】

前記試験温度が、３７℃、４７℃、５０℃、５５℃、又は５８℃である、請求項５６に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項58】

前記組換えＴｄＴが、小さなユビキチン様修飾剤（ＳＵＭＯ）断片を含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項59】

前記ＳＵＭＯ断片が、配列番号１３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項60】

前記組換えＴｄＴが、前記組換えＴｄＴのＮ末端上のＳＵＭＯ断片を含む、請求項５８～５９のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項61】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項62】

前記組換えＴｄＴが、配列番号１５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項63】

前記組換えＴｄＴが、前記組換えＴｄＴのＣ末端上のＳＵＭＯ断片を含む、請求項５８～５９のいずれか一項に記載の組換えＴｄＴ。

【請求項64】

請求項１～６３のいずれか一項に記載の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードするポリヌクレオチド。

【請求項65】

請求項６４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項66】

請求項１～６３のいずれか一項に記載の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と、
請求項６４に記載のポリヌクレオチドと、
請求項６５に記載の発現ベクターと、
のうちの１つ以上を含む、宿主細胞。

【請求項67】

キットであって、
請求項１～６３のいずれか一項に記載の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、請求項６４に記載のポリヌクレオチド、請求項６５に記載の発現ベクター、請求項６６に記載の宿主細胞、又はそれらの組合わせと、
及び前記組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、前記ポリヌクレオチド、前記発現ベクター、前記宿主細胞、又はそれらの組合わせを使用するための説明書と、を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，７３４号の優先権の利益を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

（配列表の参照）
本出願は、電子フォーマットでのシーケンス表と共に出願されている。配列表は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿４７ＣＸ－３１１９７１－ＷＯと題されたファイル（２０２１年５月１１日作成、５６Ｋｂのサイズ）として提供される。シーケンス表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

（発明の分野）
本開示は、概して、組換えタンパク質の分野、例えば、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに関する。

【背景技術】

【0004】

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、任意のヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡへの鋳型を含まない組込みを触媒する。しかしながら、野生型（ＷＴ）ＴｄＴは、３’修飾ヌクレオチドの組込みに対して最適化されない。更に、ＴｄＴはわずかに安定であり、３’ブロック組込みの能力のための進化は、ほとんどの変異が熱安定性の低下をもたらすため、不安定な変異体につながる可能性が高い。したがって、３’修飾ヌクレオチドの効率的な組込みを可能にする変異体の発生の開始点として機能することができる熱安定性ＴｄＴバリアントが必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の実施形態である。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な１つ以上の位置に、１つ以上のアミノ酸置換変異を含む。

【0006】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。Ｇｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９１Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９１Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９１Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９１Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。

【0007】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｌａ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ１９３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１９３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１９３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１９３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１９３Ｔｙｒ、又はＬｙｓ１９３Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、又はＬｙｓ１９３Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＬｙｓ１９３Ａｓｎとすることができる。

【0008】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９４Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９４Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９４Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＧｌｕ１９４Ｇｌｙとすることができる。

【0009】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｌａ、Ａｓｐ２４２Ａｒｇ、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｈｉｓ、Ａｓｐ２４２Ｉｌｅ、Ａｓｐ２４２Ｌｅｕ、Ａｓｐ２４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｍｅｔ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｐｒｏ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、又はＡｓｐ２４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、又はＡｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＡｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。

【0010】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、負電荷アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ａｌａ、Ｌｙｓ２８７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｎ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ、Ｌｙｓ２８７Ｃｙｓ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２８７Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２８７Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２８７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ２８７Ｍｅｔ、Ｌｙｓ２８７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ２８７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ２８７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｒｐ、Ｌｙｓ２８７Ｔｙｒ、又はＬｙｓ２８７Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＬｙｓ２８７Ａｓｐ又はＬｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＬｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。

【0011】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ａｒｇ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｎ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｐ、Ｐｈｅ２９６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｈｉｓ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、Ｐｈｅ２９６Ｐｒｏ、Ｐｈｅ２９６Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｈｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｒｐ、Ｐｈｅ２９６Ｔｙｒ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＰｈｅ２９６Ｌｅｕとすることができる。

【0012】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｌａ、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｎ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｐ、Ｍｅｔ２９９Ｃｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｙ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、Ｍｅｔ２９９Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２９９Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２９９Ｐｒｏ、Ｍｅｔ２９９Ｓｅｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｒｐ、Ｍｅｔ２９９Ｔｙｒ、又はＭｅｔ２９９Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、又はＭｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＭｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。

【0013】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｌａ、Ｔｈｒ３４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｐ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３４２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３４２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３４２Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｍｅｔ、Ｔｈｒ３４２Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、Ｔｈｒ３４２Ｔｒｐ、Ｔｈｒ３４２Ｔｙｒ、又はＴｈｒ３４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、又はＴｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＴｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。

【0014】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｌａ、Ｈｉｓ４２１Ａｒｇ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｐ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｕ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４２１Ｉｌｅ、Ｈｉｓ４２１Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４２１Ｌｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２１Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４２１Ｔｙｒ、又はＨｉｓ４２１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、又はＨｉｓ４２１Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

【0015】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な２つ以上の位置に２つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な２つ以上の位置における２つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの２つ以上を含むことができる。

【0016】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な３つ以上の位置に３つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な３つ以上の位置における３つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの３つ以上を含むことができる。

【0017】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な４つ以上の位置に４つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な４つ以上の位置における４つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの４つ以上を含むことができる。

【0018】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な５つ以上の位置に５つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な５つ以上の位置における５つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの５つ以上を含むことができる。

【0019】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な６つ以上の位置に６つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な６つ以上の位置における６つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの６つ以上を含むことができる。

【0020】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な７つ以上の位置に７つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な７つ以上の位置における７つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの７つ以上を含むことができる。

【0021】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つ以上の位置に８つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つ以上の位置における８つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの８つ以上を含むことができる。

【0022】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つの位置に８つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つの位置における８つのアミノ酸置換変異は、それぞれＬｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

【0023】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置に９つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置における９つのアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

【0024】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１２と少なくとも８０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、４７℃以上の温度で安定である。組換えＴｄＴは、５０℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５５℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５８℃以上の温度で安定であり得る。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、又は１２０％である。試験温度は、３７℃、４７℃、５０℃、５５℃、又は５８℃とすることができる。

【0026】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、小さなユビキチン様修飾剤（ＳＵＭＯ）断片を含む。ＳＵＭＯ断片は、配列番号１３と少なくとも８０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＮ末端にＳＵＭＯ断片を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＣ末端にＳＵＭＯ断片を含むことができる。

【0027】

本明細書には、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードするポリヌクレオチドの実施形態が開示される。本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの実施形態を本明細書に開示する。本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む宿主細胞の実施形態を本明細書に開示する。本明細書に開示されるのは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞の実施形態を含む。本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞の実施形態を本明細書に開示する。

【0028】

本明細書に開示されるのは、キットを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチド及び／又は組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、発現ベクター、ポリヌクレオチド、及び／又は組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又はそれらの組合わせを含む宿主細胞と、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、又はそれらの組合わせを使用するための説明書と、を含む。

【0029】

本明細書に記載されている主題の１つ以上の実施の詳細が、添付の図面及び以下の説明に記述されている。その他の特徴、態様、及び利点は、本明細書、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本概要も以下の発明を実施するための形態も、本発明の主題の範囲を定義又は制限するものと言っているわけではない。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】ＳＵＭＯ－ＴｄＴ（配列番号１４）とＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（配列番号１２）のアミノ酸１３９～５２０（配列番号１）との非限定的な例示的配列整列を示す図である。ＳＵＭＯ－ＴｄＴは、アミノ酸位置１２３～５０４にＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０を含み、アミノ酸位置２２～１１９にＮ末端ＳＵＭＯタグ（配列番号１３）を含む組換えＴｄＴを指す。本明細書で同定されたＳＵＭＯ－ＴｄＴ（及びそのＴｄＴバリアント）における置換変異の位置及びＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの対応する位置が強調されている。

【図2】３’－ＯＨから２塩基離れたヌクレオチド（２ｂＡ ＦＡＭ）上で、ＦＡＭ色素で活性ＴｄＴによるオリゴへのＣｙ５－ｄＣＴＰの組込みを検出するためのＦＲＥＴ反応の非限定的な例示的概略図である。第１ラウンドのスクリーニングでは、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ（ウシＴｄＴの最初の１３８アミノ酸が欠失しており、溶解性及び発現を改善するＮ末端ＳＵＭＯタグを含む組換えウシＴｄＴ）を親鋳型として使用し、変異体ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２を熱安定性として同定した。第２ラウンドのスクリーニングラウンドは、親鋳型としてＴｄＴ１－２を使用し、５０℃の熱処理を１分間行い、４つの熱安定性変異体を特定した（ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３、ＴｄＴ２－４）。第３ラウンドのスクリーニングでは、ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－３を親鋳型として使用し、ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３及びＴｄＴ２－４に見られる変異の異なる組合わせを有し、ＴｄＴ３－２を熱安定性として同定した。

【図3A】ＴｄＴ活性の検出のためのＦＲＥＴアッセイの確立を示す。３’－ＯＨから２塩基離れたヌクレオチド（２ｂＡ ＦＡＭ）上で、ＦＡＭ色素で活性ＴｄＴによるオリゴへのＣｙ５－ｄＣＴＰの組込みを検出するためのＦＲＥＴ反応の非限定的な例示的概略図である。

【図3B】ＴｄＴ活性の検出のためのＦＲＥＴアッセイの確立を示す。４５０ｎｍのＦＡＭ励起波長による６７０ｎｍにおけるＣｙ５発光の増加に対応する精製ＴｄＴ活性を検出するための図３Ａの概略図の予備試験を示す図である。

【図3C】ＴｄＴ活性の検出のためのＦＲＥＴアッセイの確立を示す。高濃度で、細胞溶解物中の内因性ヌクレアーゼがオリゴ基質を分解することを示す非限定的な例示的概略図である。溶解物の希釈は、ＴｄＴと比較して、ヌクレアーゼ活性を不均衡に低下させ、ＴｄＴ活性の検出を可能にする。はさみの記号は、ヌクレアーゼを指す。星の記号は、活性ＴｄＴを指す。

【図3D】ＴｄＴ活性の検出のためのＦＲＥＴアッセイの確立を示す。５’ＦＡＭタグ付きオリゴ（ＦＡＭ２０）及びｄＣＴＰとインキュベートした、ＴｄＴ緩衝液中のＴｄＴ発現細胞溶解物の様々な希釈の結果を示すゲル画像である。ＴｄＴ活性（囲まれている）を示すより高いバンドは、５０倍及び５００倍希釈でのみ見られ、より低い希釈は内因性ヌクレアーゼによる分解をもたらす（青色線の下）。

【図3E】ＴｄＴ活性の検出のためのＦＲＥＴアッセイの確立を示す。５０倍希釈細胞溶解物を使用したＳＵＭＯ－ＴｄＴ及び空のプラスミドを用いた９６ウェルプレートＦＲＥＴアッセイの結果を示す非限定的な例示的プロットである。６７０ｎｍでのより高いＦＲＥＴシグナルは、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ（赤線）を発現するが、空のプラスミド（青線）は発現せず、このアッセイを活性ＴｄＴのスクリーニングに使用することができることを示唆している。

【図4A】４５０ｎｍで励起したＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いた異なるＦＡＭタグ付きオリゴの発光波長走査を示す。ＴｄＴの存在下又は非存在下でのＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いたオリゴ１ｂＡ ＦＡＭの発光波長走査の非限定的な例示的なプロットである。５２０ｎｍでのＦＡＭの発光の減少は低く、ＴＡＭＲＡ色素へのエネルギーの非効率的な移動を示唆している。

【図4B】４５０ｎｍで励起したＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いた異なるＦＡＭタグ付きオリゴの発光波長走査を示す。ＴｄＴの存在下又は非存在下でのＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いたオリゴ２ｂＡ ＦＡＭの発光波長走査の非限定的な例示的なプロットである。ＴｄＴとのインキュベーションでは、ＦＡＭからの発光シグナルの減少及びＴＡＭＲＡからの発光シグナルの増加は、調査された４つのオリゴの中で最も良好であるようである。

【図4C】４５０ｎｍで励起したＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いた異なるＦＡＭタグ付きオリゴの発光波長走査を示す。ＴｄＴの存在下又は非存在下でのＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いたオリゴ５ｂＡ ＦＡＭの発光波長走査の非限定的な例示的プロットである。ＴｄＴが存在する場合のＦＡＭの発光シグナルの減少及びＴＡＭＲＡの発光シグナルの増加は、図４Ｂに示されるものよりも低い。

【図4D】４５０ｎｍで励起したＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いた異なるＦＡＭタグ付きオリゴの発光波長走査を示す。ＴｄＴの存在下又は非存在下でのＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰを用いたオリゴ１０ｂＡ ＦＡＭの発光波長走査の非限定的な例示的プロットである。ＴｄＴの有無でＦＡＭ及びＴＡＭＲＡの発光シグナルに差はなかった。

【図5A】異なるＦＲＥＴ対の発光波長走査を示す。ＴｄＴの存在下又は非存在下での２ｂＡ ＦＡＭオリゴ及びＴＡＭＲＡ－ｄＣＴＰの発光波長走査の非限定的な例示的プロットである。発光波長は、４８０ｎｍ～７００ｎｍで、４５０ｎｍで励起して走査された。２ｂＡオリゴは、ＴＡＭＲＡアクセプタ色素の発光に対応する５７５ｎｍで強いシグナルを示さなかった。

【図5B】異なるＦＲＥＴ対の発光波長走査を示す。ＴｄＴの存在下又は非存在下における２ｂＡ ＦＡＭオリゴ及びＣｙ５－ｄＣＴＰの発光波長走査の非限定的な例示的プロットである。発光波長は、４８０ｎｍ～７００ｎｍで、４５０ｎｍで励起して走査された。ＴｄＴが存在する場合、６７０ｎｍでシグナルが増加した。これは、ＦＡＭ及びＣｙ５ ＦＲＥＴ対を使用した活性ＴｄＴの検出の成功を示唆している。

【図5C】異なるＦＲＥＴ対の発光波長走査を示す。ＴｄＴの存在下又は非存在下における２ｂＡ ＦＡＭオリゴ及びＣｙ３－ｄＣＴＰの発光波長走査の非限定的な例示的プロットである。発光波長は、５３０ｎｍ～７００ｎｍで、５００ｎｍで励起して走査された。３’－ＯＨから２塩基の塩基上で標識されたＣｙ３色素を有するオリゴを、Ｃｙ５－ｄＣＴＰ及びＴｄＴと共にインキュベートした。図５Ｂと比較して、６７０ｎｍでシグナルの取得が低かった。

【図6】ＴｄＴ熱安定性スクリーニングのための非限定的な例示的方法論を示す概略図である。２つの連続希釈工程（１０倍及び５倍）は、正味５０倍希釈された溶解物をもたらす。

【図7A】３ラウンドの熱安定性スクリーニングにわたるＴｄＴバリアントのＦＲＥＴ読出しを示す。ＳＵＭＯ－ＴｄＴ並びに変異体ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２のＦＲＥＴ活性の比較を示す非限定的な例示的ヒストグラムである。未加熱処理は、反応の組込み前の細胞溶解物の熱処理はなく、加熱処理は、反応前に４７℃で１分間加熱された細胞溶解物を指す。反応時間経過の１５分～３０分の間のＳＵＭＯ－ＴｄＴ、ＴｄＴ１－１、ＴｄＴ１－２のＦＲＥＴ読出しを記録し、平均値を上記のヒストグラムに表示した。不等分散を伴うスチューデントのＴ試験を使用した分析を行い、これは、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ、ＴｄＴ１－１、及びＴｄＴ１－２の平均ＦＲＥＴ読出しが有意に異なることを示している。ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２の平均活性比は、加熱した場合のＦＲＥＴ読取り平均を加熱されていない場合のＦＲＥＴ読取り平均によって割ることにより計算された。ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２は、熱処理後により高い活性を保持した。両方ともＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも有意に高い。

【図7B】３ラウンドの熱安定性スクリーニングにわたるＴｄＴバリアントのＦＲＥＴ読出しを示す。５０℃で１分間熱処理する第２のスクリーニングのラウンドを示す非限定的な例示的ヒストグラムであり、親ＴｄＴ１－１よりも有意に高いＦＲＥＴ値及び活性比を有する変異体ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３、及びＴｄＴ２－４を同定した。

【図7C】３ラウンドの熱安定性スクリーニングにわたるＴｄＴバリアントのＦＲＥＴ読出しを示す。親鋳型ＴｄＴ１－１を使用した第３ラウンドのスクリーニングを示す非限定的な例示的ヒストグラムであり、ＴｄＴ３－１は、５５℃での熱処理後にＴｄＴ１－１よりも有意に高いＦＲＥＴ読出し及び活性比を有すると同定された。

【図7D】３ラウンドの熱安定性スクリーニングにわたるＴｄＴバリアントのＦＲＥＴ読出しを示す。親鋳型ＴｄＴ１－３（ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２のハイブリッド）を使用したスクリーニングの第３ラウンドを示す非限定的な例示的ヒストグラムであり、ＴｄＴ３－２は、５８℃で１分の熱処理後に、ＴｄＴ１－３よりも有意に高いＦＲＥＴ読出しを有し、かつ有意に高い割合の活性を保持した。

【図8A】ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の精製及び精製ＴｄＴにおけるヌクレアーゼ汚染の検証を示す。ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の精製を示す非限定的な例示的ゲル画像である。精製されたＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の収量は、それぞれ８．５ｍｇ／Ｌ培養物及び１４．１ｍｇ／Ｌ培養物であった。１μｇの各透析精製されたＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。ＳＵＭＯ－ＴｄＴの予想サイズは５７．９ｋＤであり、ＴｄＴ３－２は５７．７ｋＤである。それぞれのタンパク質に対応するＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の両方について、約５８ｋＤラダーの主要なバンドが観察された。主要なバンドの位置は、ニッケルＩＭＡＣ及びＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＩＥＸクロマトグラフィによるＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の精製の成功を示唆している。

【図8B】ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の精製及び精製ＴｄＴにおけるヌクレアーゼ汚染の検証を示す。精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のヌクレアーゼ汚染の存在を調べるためのヌクレアーゼ試験を示す非限定的な例示的ゲル画像である。３５塩基の一本鎖オリゴ基質を、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２と個別にインキュベートした。試料をＴＢＥ－尿素ゲル上で視覚化した。３５塩基よりも小さい観察されたバンドは、一本鎖オリゴ基質を分解するタンパク質試料中のヌクレアーゼの存在を示唆する。レーン３は、ヌクレアーゼが存在する時に、分解されたＤＮＡ産物の予想される観察を実証するための対照である。レーン３、４、及び５を比較すると、レーン４及び５で観察されたバンドがはるかに小さい。これは、精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２中に最小ヌクレアーゼが存在したことを示唆している。

【図9A】精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＴ_ｍ測定を示す。精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の非限定的な例示的プロットである。グラフのピークは、タンパク質の５０％がアンフォールディングである、タンパク質の遷移中点（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｉｄｐｏｉｎｔ）（Ｔ_ｍ又は融解温度）に対応する。ＳＵＭＯ－ＴｄＴの平均Ｔ_ｍは４０．２℃であり、ＴｄＴ３－２は５０．７℃であった。

【図9B】精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＴ_ｍ測定を示す。精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）の非限定的な例示的プロットである。温度に対するＦ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍの負の導関数のグラフで観察されたピークは、タンパク質のＴ_ｍに対応する。ＳＵＭＯ－ＴｄＴの平均Ｔ_ｍは、４３．５℃であり、ＴｄＴ３－２は５３．１℃であった。

【図9C】精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＴ_ｍ測定を示す。精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱シフトアッセイの結果の非限定的な例示的なプロットである。ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素は、アンフォールディングタンパク質の疎水性領域に非特異的に結合する。温度に対する－ｄＲＦＵ／温度のグラフで観察されるピークは、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＴ_ｍに対応する。ＳＵＭＯ－ＴｄＴ平均Ｔ_ｍは４１．５℃であり、ＴｄＴ３－２は５１．５℃であった。

【図9D】精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＴ_ｍ測定を示す。温度の関数として２２２ｎｍでのＣＤ楕円率の一次導関数の非限定的な例示的なプロットである。グラフに観察されたピークは、タンパク質のＴ_ｍに対応する。ＳＵＭＯ－ＴｄＴの平均Ｔ_ｍは４５．７℃であり、ＴｄＴ３－２は５２．５℃であった。

【図10A】様々な温度での市販の（ＮＥＢ）ＴｄＴ、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２活性の観察結果を示す非限定的な例示的ゲル画像である。全てのＴｄＴは、（図１０Ａ）２５℃で活性であった。

【図10B】様々な温度での市販の（ＮＥＢ）ＴｄＴ、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２活性の観察結果を示す非限定的な例示的ゲル画像である。全てのＴｄＴは、（図１０Ｂ）３６℃で活性であった。

【図10C】様々な温度での市販の（ＮＥＢ）ＴｄＴ、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２活性の観察結果を示す非限定的な例示的ゲル画像である。より高いサイズのバンドＤＮＡ生成物から観察されたように、ＴｄＴ３－２が、ｄＣＴＰを５’ＦＡＭ標識オリゴに２０分間、４７℃で組み込むことができ、一方ＮＥＢ ＴｄＴ及びＳＵＭＯ－ＴｄＴは５分以内に変性したことを示す。

【図10D】様々な温度での市販の（ＮＥＢ）ＴｄＴ、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２活性の観察結果を示す非限定的な例示的ゲル画像である。５分未満では、５８℃でのＴｄＴ３－２のみが活性であったことを示す。ＮＥＢ ＴｄＴ及びＳＵＭＯ－ＴｄＴを変性させた。

【図11】市販のＴｄＴ（ＮＥＢ ＴｄＴ）及びＴｄＴ３－２活性を、ｄｓ平滑末端ＤＮＡ基質で調べる非限定的な例示的プロットである。ＴｄＴ３－２は、３７℃及び５０℃の両方で、より多量のｄｄＣＴＰをｄｓ平滑末端ＤＮＡ基質に組み込むことができた。パーセンテージを５０℃で増加させた。３７℃で４分間、ＮＥＢ ＴｄＴによって組み込まれたｄｄＣＴＰを有するプライマーのパーセンテージは約１３．４％であり、ＴｄＴ３－２は５５．７％であった。５０℃で同じ期間にわたって、ＮＥＢ ＴｄＴによってプライマーへのｄｄＣＴＰの組込みの割合は約８％であり、ＴｄＴ３－２は約８９．９％であった。

【図12】ＮＥＢ ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２を有するＦＡＭタグ付きオリゴに組み込まれているｄｄＣＴＰを示す非限定的な例示的ゲルグラフである。バンドの強度を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して分析し、ＧｒａｐｈＰａｄを使用してプロットした。ＴｄＴ３－２は、より高い強度＋１バンドによって観察されるように、ＮＥＢ ＴｄＴよりも多くのｄｄＣＴＰを組み込んだ。５０℃の高温で、ＴｄＴ３－２は、５０℃で＋１バンドの割合を増加させることによって観察されるように、３７℃よりもｄｄＣＴＰをより組み込んだ。

【図13】蛍光偏光を介したオリゴ基質へのＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の結合親和性に関するデータを示す。様々な量のＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２を、マイクロプレートリーダー上で分極を読み取る前に、５ｎＭの５’－ＦＡＭ標識オリゴと３７℃で１０分間インキュベートした。

【図14】Ｐｈｙｒｅ２ウェブポータルを使用したＴｄＴ３－２の予測タンパク質構造を示す非限定的な例示的画像である。ＳＵＭＯ－ＴｄＴとは異なるＴｄＴ３－２中のアミノ酸残基は、表示されるように、暗い陰影で強調表示され、標識される。より薄い陰影で強調表示された残基（３３８Ｄ、３４０Ｄ、及び４２８Ｄ）は、組込み反応中に二価金属イオンに結合する残基に対応する。ＤＮＡに結合する残基は、強調表示されたアルファヘリックス（残基２５３～２５７）上にある。ＴｄＴ３－２のＬｏｏｐ１が強調表示される（残基３７６～３９４）。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下の詳細な説明では、添付の図面を参照し、添付の図面は本明細書の一部をなす。図面において、同様の記号は、文脈上特に指示されない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加え得る。本開示の態様は、本明細書に全般的に記載され、図面に例示されるように、多種多様な異なる構成で配置され、置換され、組み合わされ、分離され、及び設計され得ることが容易に理解され、それらの全てが本明細書で明示的に企図されており、本明細書の開示の一部をなす。

【0032】

本明細書で参照される全ての特許、公開された特許出願、その他の刊行物、及びＧｅｎＢａｎｋからの配列、及び本明細書で参照されるその他のデータベースは、関連技術に関してそれら全体が本明細書に参照により組み込まれる。

【0033】

合成技術による配列決定は、基礎となる生命のソースコードに関する膨大な量の情報の発見を可能にした。この情報から完全に利益を得るために、配列決定に由来する理解を使用して新しいシステムを予測可能に作成することができるかどうかを試験するために、完全合成遺伝子及びゲノムを作製する必要がある。例えば、化学合成オリゴを使用して構築されたゲノムを使用した合成生物の構築が実証されている。同様に、６４個のコドンの代わりにわずか５７個のコドンを有する合成酵母及び大腸菌（E.coli）を作製するための努力、又は、更には、絶滅した生物を再生するための努力（参考文献６及び７）は、生物工学における次の前進を表す。

【0034】

しかしながら、この努力は、現在のオリゴヌクレオチド及び遺伝子合成方法がホスホルアミダイト化学を使用する化学合成に依存するという事実によって妨げられる。この方法は、欠失及び副反応、並びに環境に有害な有機化学物質及び廃棄物の使用及び生成のために、２００ｂｐ未満の最大サイズ等の多くの制限を課す。その結果、ゲノム規模の構築コストは何百万ドルにも及び、これは大きな障害となる。

【0035】

野生型末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは非常に不安定であり、成長中のｓｓＤＮＡ鎖への単一の３’ブロックヌクレオチドの段階的組込み及び脱保護を使用した酵素的オリゴヌクレオチド及び遺伝子合成に最適化されていない。３’ブロックヌクレオチドを受容することができ、活性及び堅牢性が増加した操作されたＴｄＴが必要である。

【0036】

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、任意のヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡへの鋳型を含まない組込みを触媒する。ＴｄＴは、バイオテクノロジー及び臨床用途において広く使用されている。１つの可能な使用は、３’可逆的にブロックされたヌクレオチドのＴｄＴ媒介反復組込みとそれに続く脱ブロックによる長いｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ分子の合成である。しかしながら、野生型（ＷＴ）ＴｄＴは、３’修飾ヌクレオチドの組込みのために最適化されず、ＴｄＴ操作は、ＴｄＴがわずかに安定であり、中温性生物にのみ存在するという事実によって妨げられる。熱安定性ＴｄＴバリアントは、３’修飾ヌクレオチドの効率的な組込みを可能にするために、後続の進化のための骨格として機能することができる。嵩高い修飾ヌクレオチドを組み込む進化は一般に安定性の低下をもたらすため、熱安定性バリアントはそのような努力のための良好な出発点であろう。更に、熱安定性ＴｄＴは、より高い温度を使用してｄｓＤＮＡを融解させることができるため、ＤＮＡ二次構造がＷＴ活性を阻害する状況においても有用であろう。本開示に記載されるアッセイは、熱安定性ＴｄＴバリアントを同定するために開発された。約１０，０００個のＴｄＴ変異体をスクリーニングした後、ＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも１０℃より熱安定性であり、ＷＴ酵素の触媒特性を保存したＴｄＴ３－２と命名されたバリアントを同定した。本明細書に開示される任意の組換えＴｄＴは、３’ブロックヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡに組み込むことができるＴｄＴの進化のための足場として使用することができる。

【0037】

組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）のいくつかの実施形態本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な１つ以上の位置に、１つ以上のアミノ酸置換変異を含む。本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む宿主細胞の実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞の実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞の実施形態を含む。

【0038】

定義
別途定義されない限り、本開示書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照されたい。本開示の目的のために、次の用語を以下に定義する。

【0039】

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「同一性パーセント」という用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、又は目視検査によって測定して、最大の対応性のために比較し、整列させた場合に、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの指定されたパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。

【0040】

（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ、又はタンパク質のアミノ酸配列）２つの核酸又はポリペプチドの文脈における「実質的に同一」という語句は、配列比較アルゴリズムを使用して、又は目視検査によって測定される場合、最大の対応性のために比較及び整列された場合に、少なくとも約６０％、約８０％、約９０～９５％、約９８％、約９９％以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。そのような「実質的に同一」配列は、典型的には、実際の祖先を参照することなく「相同」であると考えられる。「実質的な同一性」は、長さが少なくとも約５０残基、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域上である配列の領域にわたって存在し得、最も好ましくは、配列が、少なくとも約１５０残基の領域にわたって、又は比較される２つの配列の全長にわたって実質的に同一である。

【0041】

タンパク質及び／又はタンパク質配列は、一般的な祖先タンパク質又はタンパク質配列から自然に又は人工的に由来する場合、「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は、共通の祖先核酸又は核酸配列から自然に又は人工的に由来する場合、相同である。相同性は、一般に、２つ以上の核酸又はタンパク質（又はその配列）間の配列類似性から推測される。相同性を確立するのに有用な配列間の類似性の正確なパーセンテージは、問題の核酸及びタンパク質によって異なるが、５０、１００、１５０以上の残基を超えるわずか２５％の配列類似性が、相同性を確立するために日常的に使用される。より高いレベルの配列類似性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％以上を使用して、相同性を確立することもできる。配列類似性パーセンテージを決定するための方法（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）が利用可能である。

【0042】

配列比較及び相同性決定のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを計算する。

【0043】

比較のための配列の最適な整列は、例えば、局所相同性アルゴリズムによって、相同性整列アルゴリズムによって、類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって、又は目視検査によって行うことができる。パーセント配列同一性及びパーセント配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、ｑｕｅｒｙ配列中の長さＷの短いワードを識別することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された時にいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか又はそれを満たす。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と呼ばれる。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するための種子として機能する。次いで、ワードヒットは、累積整列スコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（マッチング残基の対に対するリワードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチする残基のペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積整列スコアが、その最大達成値からの量Ｘ減少する場合に停止され、累積スコアは、１つ以上の負のスコアリング残基整列の蓄積のために０以下になり、又はいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（expectation：Ｅ）１０、カットオフ（cutoff）１００、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０及びＢＬＯＳＵＭ ６２スコアリングマトリックス（scoring matrix）を使用する。

【0044】

配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と同様であると考えられる。

【0045】

「機能的に等価な」アミノ酸位置のアミノ酸は、タンパク質において同じ機能的役割を有することができる（例えば、酵素）。一般に、２つ以上の異なるタンパク質における機能的に等価な置換変異は、タンパク質のアミノ酸配列内の相同アミノ酸位置で生じる。したがって、本明細書で使用される「機能的に等価」という用語は、変異アミノ酸の特定の機能が公知であるか否かにかかわらず、所与の変異と「位置的に等価」又は「相同」である変異も包含する。配列整列及び／又は分子モデリングに基づいて、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列中の位置的に同等又は相同なアミノ酸残基を同定することが可能である。

【0046】

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ操作
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、哺乳動物で発見された第１のＤＮＡポリメラーゼのうちの１つである。ＴｄＴは鋳型非依存性活性を有する。ＴｄＴの鋳型非依存性活性は、身体の抗体レパートリーの多様性を増加させることができる。ＴｄＴは、二価金属イオンの存在下で少なくとも３ヌクレオチド長である一本鎖ＤＮＡプライマーへのヌクレオチドの付加を触媒することができる。ＤＮＡポリメラーゼのＸファミリーのメンバーとして、ＴｄＴは、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌ μに最も類似している。Ｐｏｌ μに対して４２％の配列類似性を有する特定の理論に束縛されるものではないが、鋳型依存性におけるＴｄＴとＰｏｌ μとの間の差に寄与する因子は、柔軟なループ（Ｌｏｏｐ１と呼ばれる）の存在に起因すると考えられている。ＴｄＴにおけるＬｏｏｐ１の不安定化は、鋳型依存性活性を付与することが示されている。ＴｄＴとＰｏｌ μとの間のＬｏｏｐ１の切替えは、ＤＮＡ基質選好の部分的変化をもたらし得る。

【0047】

ＴｄＴの独特の活性により、ＴｄＴは臨床及びバイオテクノロジー分野で使用されてきた。ＴｄＴの１つの用途は、ＴＵＮＥＬアッセイである。ＴＵＮＥＬアッセイでは、アポトーシス細胞からのＤＮＡ断片は、曝露されたＤＮＡ断片へのフルオロフォア標識ヌクレオチドのＴｄＴ触媒組込みによって検出される。ＴｄＴはまた、遺伝子疾患のウイルス検出及び診断のために少量のＤＮＡ及びＲＮＡを検出する方法に使用することができる。

【0048】

鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼであるため、ＴｄＴは酵素的ＤＮＡ合成の理想的な候補である。ヌクレオチドコンジュゲートＴｄＴは、ＤＮＡ開始剤への単一組込みを可能にするために使用されてきた。ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成に対するＴｄＴの可能性を活用して、ＤＮＡへのデータ保存を可能にすることもできる。ＤＮＡは、非常に高い情報密度及び低い維持保存の利点を有し、データの品質を維持しながら、数百年間、ＤＮＡ１グラム当たり１０^１５～１０^２０バイトのデータである。ホモポリマーのストレッチ及びこれらの間の遷移のＴｄＴ媒介合成は、デジタルデータを符号化するために使用されてきた。しかしながら、これらの方法は、複雑な合成プロセス又は不均一な生成物の生成等のいくつかの固有の欠点を有する。任意のＤＮＡ配列を酵素的に生成する代替方法は、ＴｄＴを使用して、３’－Ｏ－アミノブロックヌクレオチド及び３’－Ｏ－アジドメチルブロックヌクレオチドを含む３’－Ｏ－ブロックヌクレオチド等の３’－ブロックヌクレオチドを可逆的に組み込むことであろう。酵素合成法を用いたユーザーフレンドリーなＤＮＡ合成機器は、これまで発売されていない。

【0049】

野生型（ＷＴ）ＴｄＴは、立体衝突のために嵩高い３’－ブロックヌクレオチドを組み込むことができない。ＴｄＴは、合成による配列決定等の配列決定に使用される可逆的にブロックヌクレオチドを受け入れるように操作することができる。しかしながら、可逆的にブロックされたヌクレオチドを組み込むようにＴｄＴを操作することは困難である。これは、部分的には、ＴｄＴが約４０℃のＴ_ｍを有し、わずかな安定性を有する中温性ポリメラーゼであるためである。所望の活性を付与する変異は、しばしば不安定化する可能性がある。したがって、更なる操作のためのより安定した初期構築物を得るためには、最初にＴｄＴの熱安定性を改善する必要がある。

【0050】

更に、酵素的ＤＮＡ合成は、ＤＮＡ生成物の長さが増加するにつれて、ヘアピン等の強力なＤＮＡ二次構造の形成を克服する必要がある可能性がある。１つの可能な解決策は、酵素的ＤＮＡ合成プロセスの温度を上昇させることである。しかしながら、ＷＴ ＴｄＴの最適温度は約３７℃であり、展開Ｔ_ｍは約４０℃である。したがって、熱安定性ＴｄＴを操作することは、より高温での合成を可能にすることによって、ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成中の二次ＤＮＡ構造の形成を最小限に抑えるのに役立つ。

【0051】

改善された熱安定性を有するように進化したＴｄＴバリアント（本明細書ではＴｄＴ変異体及び組換えＴｄＴとも呼ばれる）が本明細書に開示される。上昇する温度におけるインキュベーション後に細胞溶解物で実施することができる蛍光ベースのＴｄＴ活性アッセイを開発した（図２及び図３）。第２に、発現及び精製プロトコルを最適化して、ＷＴ及び変異酵素に適切な収率を得た。第３に、ＴｄＴバリアントの熱安定性は、ＤＳＣ、ＤＳＦ、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱シフトアッセイ及びＣＤによって検証された。最後に、本明細書でＴｄＴ３－２と称される熱安定化ＴｄＴ変異体の動的特性決定を実施して、熱安定性の増加により酵素の活性の犠牲が生じなかったことを実証した。

【0052】

組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
配列
本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の実施形態である。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（例えば、配列番号１２）と、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、又はそれに近い値、同一のアミノ酸配列、あるいはその断片（例えば、配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（例えば、配列番号１２）と、少なくとも、少なくとも約、多くとも、若しくは多くとも約、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲、同一のアミノ酸配列あるいはその断片（例えば、配列番号１２）を含む。例えば、組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０（例えば、配列番号１）等、ウシ又はＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの断片に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。図１は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０の配列を示す。例えば、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのバリアント、又はウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ断片（例えば、配列番号１１）のバリアントと配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、組換えＴｄＴは、配列番号１１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含むことができる。

【0054】

置換変異
組換えＴｄＴは、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（例えば、配列番号１２）のＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。各アミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。

【0055】

各アミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、親水性アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への置換変異であり得る。非極性アミノ酸は、例えば、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、又はバリンであり得る。極性アミノ酸は、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、又はチロシンであり得る。極性アミノ酸は、例えば、酸性極性アミノ酸、塩基性極性アミノ酸、又は非酸性非塩基性極性アミノ酸であり得る。塩基性極性アミノ酸又は正電荷アミノ酸は、例えば、アルギニン、ヒスチジン、又はリジンであり得る。酸性アミノ酸又は負電荷アミノ酸は、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり得る。非酸性非塩基性アミノ酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、又はチロシンであり得る。疎水性アミノ酸は、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンであり得る。芳香族アミノ酸は、例えば、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はチロシンであり得る。脂肪族（非芳香族）アミノ酸は、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、又はバリンであり得る。小アミノ酸は、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、又はセリンであり得る。親水性アミノ酸は、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、又はトレオニンであり得る。分岐鎖アミノ酸は、例えば、イソロイシン、ロイシン、バリンであり得る。

【0056】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。Ｇｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９１Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９１Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９１Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９１Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号２に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0057】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、グルタミン、セリン、又はトレオニンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｌａ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ１９３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１９３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１９３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１９３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１９３Ｔｙｒ、又はＬｙｓ１９３Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、又はＬｙｓ１９３Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＬｙｓ１９３Ａｓｎとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号３に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0058】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９４Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９４Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９４Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＧｌｕ１９４Ｇｌｙとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号４に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0059】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、又はチロシンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｌａ、Ａｓｐ２４２Ａｒｇ、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｈｉｓ、Ａｓｐ２４２Ｉｌｅ、Ａｓｐ２４２Ｌｅｕ、Ａｓｐ２４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｍｅｔ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｐｒｏ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、又はＡｓｐ２４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、又はＡｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＡｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号５に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0060】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、負電荷アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン酸又はグルタミン酸へのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ａｌａ、Ｌｙｓ２８７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｎ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ、Ｌｙｓ２８７Ｃｙｓ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２８７Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２８７Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２８７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ２８７Ｍｅｔ、Ｌｙｓ２８７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ２８７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ２８７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｒｐ、Ｌｙｓ２８７Ｔｙｒ、又はＬｙｓ２８７Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＬｙｓ２８７Ａｓｐ又はＬｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＬｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号６に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0061】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ａｒｇ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｎ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｐ、Ｐｈｅ２９６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｈｉｓ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、Ｐｈｅ２９６Ｐｒｏ、Ｐｈｅ２９６Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｈｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｒｐ、Ｐｈｅ２９６Ｔｙｒ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＰｈｅ２９６Ｌｅｕとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号７に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0062】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アルギニン、アルギニン、ヒスチジン、又はリジンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｌａ、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｎ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｐ、Ｍｅｔ２９９Ｃｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｙ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、Ｍｅｔ２９９Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２９９Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２９９Ｐｒｏ、Ｍｅｔ２９９Ｓｅｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｒｐ、Ｍｅｔ２９９Ｔｙｒ、又はＭｅｔ２９９Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、又はＭｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＭｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号８に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0063】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、シスチン、グルタミン、プロリン、又はセリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｌａ、Ｔｈｒ３４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｐ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３４２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３４２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３４２Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｍｅｔ、Ｔｈｒ３４２Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、Ｔｈｒ３４２Ｔｒｐ、Ｔｈｒ３４２Ｔｙｒ、又はＴｈｒ３４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、又はＴｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＴｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号９に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0064】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、シスチン、グルタミン、プロリン、セリン、又はトレオニンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｌａ、Ｈｉｓ４２１Ａｒｇ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｐ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｕ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４２１Ｉｌｅ、Ｈｉｓ４２１Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４２１Ｌｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２１Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４２１Ｔｙｒ、又はＨｉｓ４２１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、又はＨｉｓ４２１Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置のアミノ酸置換変異はＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号１０に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0065】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な２つ以上の位置に２つ以上のアミノ酸置換変異を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な３つ以上の位置に３つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な４つ以上の位置に４つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な５つ以上の位置に５つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な６つ以上の位置に６つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な７つ以上の位置に７つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つ以上の位置に８つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。

【0066】

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な２つ以上の位置における２つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの２つ以上を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な３つ以上の位置における３つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの３つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な４つ以上の位置における４つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの４つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な５つ以上の位置における５つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの５つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な６つ以上の位置における６つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの６つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な７つ以上の位置における７つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏの７つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つ以上の位置における８つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏを含むことができる。

【0067】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つの位置に８つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な８つの位置における８つのアミノ酸置換変異は、それぞれＬｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置に９つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に等価な位置における９つのアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

【0068】

熱安定性
組換えＴｄＴは熱的に安定であり得る。組換えＴｄＴは、異なる実施形態では異なる温度で安定であり得る。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃以上の温度、又はそれらに近い温度で安定であり得る。例えば、組換えＴｄＴは、４７℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５０℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５５℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５８℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲の温度で安定であり得る。

【0069】

活性化
組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ又はその断片よりも高くても低くてもよい。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、又は配列番号１４の組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、２００％以上、又はこれらに近い値である。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、又は配列番号１４の組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、２００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。例えば、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、又は配列番号１４の組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％又は１２０％であり得るか、又は少なくともそれらであり得る。

【0070】

試験温度は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、試験温度は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃以上、又はそれらに近い温度であり得る。例えば、試験温度は、３７℃、４７℃、５０℃、５５℃、又は５８℃とすることができる。いくつかの実施形態では、試験温度は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、多くとも約、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得る。

【0071】

追加の構成要素
いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、Ｈｉｓ－タグ又はグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ等の精製用タグを含む。精製のためのタグは、組換えＴｄＴのＮ末端、組換えＴｄＴのＣ末端、又は組換えＴｄＴの内部にあり得る。組換えＴｄＴは、精製のためのタグと別の構成要素（例えば、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ断片）又は組換えＴｄＴの残りとの間にプロテアーゼ切断配列、例えばＬｅｕＶａｌＰｒｏＡｒｇ／ＧｌｙＳｅｒ（トロンビン切断部位）又はＬｅｕＧｌｕＶａｌＬｅｕＰｈｅＧｌｎ／ＧｌｙＰｒｏ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位）を含むことができる。

【0072】

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、小さなユビキチン様修飾剤（ＳＵＭＯ）タンパク質、又はその断片を含む。組換えＴｄＴのＳＵＭＯタンパク質又はその断片の配列は、異なる実施形態において異なり得る。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴ中のＳＵＭＯタンパク質又はその断片は、ＳＵＭＯタンパク質（例えば、酵母におけるｍｉｆ ｔｗｏ ３のサプレッサー、ＳＭＴ ３）と、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、又はそれに近い値同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片（例えば、配列番号１３のアミノ配を含むＳＵＭＯ断片）を含む。例えば、組換えＴｄＴ中のＳＵＭＯ断片は、配列番号１３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴ中のＳＵＭＯタンパク質又はその断片は、ＳＵＭＯタンパク質（例えば、酵母におけるｍｉｆ ｔｗｏ ３のサプレッサー、ＳＭＴ ３）と、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片（例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＳＵＭＯ断片）を含む。

【0073】

組換えＴｄＴのＳＵＭＯ断片の位置は、異なる実施形態において異なり得る。いくつかの実施形態において、組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＮ末端にＳＵＭＯ断片を含む。いくつかの実施形態において、組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＣ末端にＳＵＭＯ断片を含む。

【0074】

組換えＴｄＴは、ＳＵＭＯ断片（例えば、配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むＳＵＭＯ断片を有する組換えＴｄＴ）を含む組換えＴｄＴと配列同一性又はほぼ配列同一性閾値を有するアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、ＳＵＭＯ断片（例えば、配列番号１４、又は配列番号１５）を含む組換えＴｄＴに対する配列同一性閾値を上回る、およそ上回る、下回る、又はおよそ下回る、配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、ＳＵＭＯ断片（例えば、配列番号１４又は配列番号１５）を含む組換えＴｄＴに対して、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、配列同一性閾値の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。配列同一性閾値は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、配列同一性閾値は、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。例えば、組換えＴｄＴは、配列番号１４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。別の例として、組換えＴｄＴは、配列番号１５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

【0075】

変異末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
本開示では、例えば、ＴｄＴモデル及びモデル予測に従って、又はランダム若しくは半ランダム変異手法を使用して、ＴｄＴを改変してバリアントを作製するために、様々な種類の変異誘発を使用することができる。一般に、任意の利用可能な変異誘発手順を、ＴｄＴ変異体を作製するために使用することができる。そのような変異誘発手順は、目的の１つ以上の活性（例えば、固体支持体上の増強された播種及び／又は増幅）のための変異核酸及びポリペプチドの選択を含むことができる。使用することができる手順には、部位特異的点変異誘発、ランダム点変異誘発、インビトロ又はインビボ相同組換え（ＤＮＡシャッフリング及び組合わせオーバーラップＰＣＲ）、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、縮重ＰＣＲ、二本鎖切断修復、及び当業者に公知の他の多くが含まれるが、これらに限定されない。変異のための出発ＴｄＴは、本明細書に記載のもののいずれかであり得る。

【0076】

変異誘発は、天然に存在するＴｄＴ分子からの既知の情報、又は既知の変更された若しくは変異したＴｄＴの既知の情報、例えば、本明細書に記載される、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造及び／又は他のものによって導くことができる。しかしながら、別のクラスの実施形態では、修飾は、本質的にランダムであり得る（例えば、古典的又は「ファミリー」ＤＮＡシャッフリングのように）。

【0077】

組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの作製及び単離
一般に、本明細書に提示される組換えＴｄＴをコードするポリヌクレオチド又は核酸は、クローニング、組換え、インビトロ合成、インビトロ増幅、及び／又は他の利用可能な方法によって作製することができる。本明細書に提示される組換えＴｄＴをコードする発現ベクターを発現させるために、様々な組換え方法を使用することができる。組換え核酸を作製するための方法、発現生成物の発現及び単離は既知である。多数の例示的な変異及び変異の組合わせ、並びに望ましい変異の設計の戦略が本明細書に記載されている。

【0078】

更に、細胞からプラスミド又は他の関連核酸を精製するためのキットが市販されている。任意の単離された及び／又は精製された核酸を更に操作して、細胞をトランスフェクトするために使用される他の核酸を生成することができ、関連するベクターに組み込まれて、発現のために生物に感染させる、及び／又は他のことができる。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、並びに特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、任意選択的に、少なくとも１つの独立したターミネーター配列を含有する一般的な発現カセット、真核生物又は原核生物、又はその両方のカセットの複製を可能にする配列、（例えば、シャトルベクター）及び原核生物及び真核生物系の両方の選択マーカーを含む一般的な発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、又はその両方における複製及び組込みに適している。

【0079】

特定のアミノ酸は、複数のコドンによってコードされ得、特定の翻訳系（例えば、原核生物又は真核細胞）は、多くの場合、コドンバイアスを示し、例えば、異なる生物は、多くの場合、同じアミノ酸をコードするいくつかの同義コドンのうちの１つを好む。したがって、本明細書に提示されるポリヌクレオチド又は核酸は、「コドン最適化」であり得、これは、ポリヌクレオチド又は核酸が、組換えＴｄＴを発現するために用いられる特定の翻訳系によって好ましいコドンを含むように合成される。例えば、組換えＴｄＴを細菌細胞（又は更に細菌の特定の株）で発現させることが望ましい場合、ポリヌクレオチド又は核酸は、組換えＴｄＴの効率的な発現のために、その細菌細胞のゲノムに最も頻繁に見られるコドンを含むように合成することができる。真核細胞において組換えＴｄＴを発現させることが望ましい場合、同様の戦略を用いることができ、例えば、核酸は、その真核細胞によって好ましいコドンを含むことができる。

【0080】

様々なタンパク質単離及び検出方法が公知であり、例えば、本明細書に提示される組換えＴｄＴを発現する細胞の組換え培養物から組換えＴｄＴを単離するために使用することができる。様々なタンパク質単離及び検出方法が知られている。組換えＴｄＴは、本明細書に開示されるように単離及び検出することができる。

【0081】

組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードする核酸
本明細書には、本開示のいずれかの組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードするポリヌクレオチドの実施形態が開示される。本開示のいずれかの組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの実施形態を本明細書に開示する。

【0082】

本明細書に更に提示されるのは、本明細書に提示されるＴｄＴをコードする核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）である。アミノ酸配列、好ましくはＴｄＴをコードする野生型ヌクレオチド配列も知られている種のＴｄＴの変異型である任意の所与の改変ＴｄＴについて、分子生物学の基本原理に従って変異体をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、ＴｄＴをコードする野生型ヌクレオチド配列が既知であると仮定すると、標準的な遺伝暗号を使用して、１つ以上のアミノ酸置換を有する任意の所与の変異型のＴｄＴをコードするヌクレオチド配列を推定することが可能である。同様に、ヌクレオチド配列は、他の種のＴｄＴの変異型について容易に誘導することができる。次いで、必要なヌクレオチド配列を有する核酸分子を、標準的な分子生物学技術を用いて構築することができる。

【0083】

本明細書に提示される実施形態によれば、定義される核酸は、同一の核酸だけでなく、特に、保存的アミノ酸置換における縮重コードに起因して同義コドン（同じアミノ酸残基を指定する異なるコドン）をもたらす場合の置換を含む任意の小さな塩基変異も含む。「核酸配列」という用語はまた、塩基変異に関して与えられる任意の一本鎖配列への相補的配列を含む。

【0084】

本明細書に記載される核酸分子はまた、有利には、そこからコードされるＴｄＴを適切な宿主において発現させるために適切な発現ベクターに含まれ得る。当該細胞のその後の形質転換及び形質転換された細胞のその後の選択のための適切な発現ベクターへのクローン化ＤＮＡの組込みは公知である。

【0085】

そのような発現ベクターは、当該ＤＮＡ断片の発現を行うことができるプロモーター領域等の調節配列に作動可能に連結された本明細書に提示される実施形態による核酸を有するベクターを含む。「作動可能に連結された」という用語は、記載される構成要素が、それらがそれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。そのようなベクターは、本明細書に提示される実施形態によるタンパク質の発現を提供するために適切な宿主細胞に形質転換され得る。

【0086】

核酸分子は、成熟タンパク質又はプロ配列を有するタンパク質（プレタンパク質上のリーダー配列をコードするものを含む）をコードし得、次いで、これが宿主細胞によって切断されて成熟タンパク質を形成する。ベクターは、例えば、複製起点と、場合により当該ヌクレオチドの発現のためのプロモーターと、場合によりプロモーターの調節因子とを備えたプラスミド、ウイルス又はファージベクターであり得る。ベクターは、例えば抗生物質耐性遺伝子等の１つ以上の選択可能なマーカーを含有し得る。

【0087】

発現に必要な調節要素としては、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、適切なレベルの転写開始及びリボソーム結合のための翻訳開始配列も指示するためのプロモーター配列が挙げられる。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーター等のプロモーター、並びに翻訳開始のためにシャイン－ダルガノ配列及び開始コドンＡＵＧを含み得る。同様に、真核生物発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの異種又は相同プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、及びリボソームの脱離のための終止コドンを含み得る。そのようなベクターは、商業的に入手され得るか、又は当該技術分野で周知の方法によって記載される配列から組み立てられ得る。

【0088】

高等真核生物によるＴｄＴをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を含めることによって最適化され得る。エンハンサーは、転写レベルを増加させるためにプロモーターに作用するＤＮＡのシス作用要素である。ベクターはまた、一般に、選択可能なマーカーに加えて複製の起源も含む。

【0089】

細胞
本開示のいずれかの組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む宿主細胞の実施形態を本明細書に開示する。本明細書に開示されるのは、本開示のいずれかの組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞の実施形態を含む。本開示のいずれかの組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞の実施形態を本明細書に開示する。

【0090】

キット
本明細書に開示されるのは、キットを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチド及び／又は組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、発現ベクター、ポリヌクレオチド、及び／又は組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示の組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又はそれらの組合わせを含む宿主細胞と、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、又はそれらの組合わせを使用するための説明書と、を含む。

【0091】

実施例
上述した実施形態のいくつかの態様が、以下の実施例において更に詳細に開示されるが、これらは、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。

【0092】

実施例１
熱安定性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの進化
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、任意のヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡへの鋳型を含まない組込みを触媒する。この特有の特徴により、ＴｄＴは、バイオテクノロジー及び臨床用途において広く使用されている。１つの可能な使用は、３’可逆的にブロックされたヌクレオチドのＴｄＴ媒介反復組込みとそれに続く脱ブロックによる長いｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ分子の合成である。しかしながら、野生型（ＷＴ）ＴｄＴは、３’修飾ヌクレオチドの組込みのために最適化されず、ＴｄＴ操作は、ＴｄＴがわずかに安定であり、中温性生物にのみ存在するという事実によって妨げられる。この実施例は、３’修飾ヌクレオチドの効率的な組込みを可能にするためのその後の進化のための骨格として機能するための熱安定性ＴｄＴバリアントの進化を記載する。嵩高い修飾ヌクレオチドを組み込む進化は一般にＴｄＴの安定性の低下をもたらすため、熱安定性バリアントはそのような努力のための良好な出発点であろう。更に、熱安定性ＴｄＴは、より高い温度を使用してｄｓＤＮＡを融解させることができるため、ＤＮＡ二次構造がＷＴ活性を阻害する場合においても有用であろう。熱安定性ＴｄＴバリアントを同定するためのアッセイを開発した。約１０，０００個のＴｄＴ変異体をスクリーニングした後、ＴｄＴ触媒特性を維持しながらＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも１０℃より熱安定性であったＴｄＴ３－２と名付けられた変異体が見出された。

【0093】

材料及び方法
プレートベースのＦＲＥＴアッセイの確立
オリゴヌクレオチド２ｂＡ ＦＡＭ（５’－ＣＧＣ ＴＴＧ ＣＡＣ ＡＧＧ ＴＧＣ ＧＴＴ／ｉＦｌｕｏｒＴ／ＣＡ－３’、配列番号１６）は、Ｔ塩基上のフルオレセイン（ＦＡＭ）色素からなり、３’－ＯＨからの２塩基は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）から購入した。Ｃｙ５－ｄＣＴＰ（ＮＵ－８０９－ＣＹ５）は、ＪｅｎａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。末端トランスフェラーゼ（ＮＥＢ ＴｄＴ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。

【0094】

ＦＡＭ及びＣｙ５フェルスター又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を用いたシグナルの獲得を、２００ｎＭの２ｂＡ ＦＡＭオリゴ、６００ｎＭのＣｙ５－ｄＣＴＰ、２０ＵのＮＥＢ ＴｄＴを１Ｘ ＴｄＴ緩衝液（２００ｍＭ酢酸カリウム、２５ｍＭトリス、０．０１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１ｍＭ塩化コバルト、ｐＨ７．２）中で使用して、最終体積５０μＬで試験した。ＮＥＢ ＴｄＴを含まない陰性対照を含めた。ＴｄＴによる２ｂＡ ＦＡＭオリゴへのＣｙ５－ｄＣＴＰの組込みのために、反応試料を室温で１分間インキュベートした。反応物を８０℃で５分間加熱することによってクエンチした。試料をＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ ＵＳＡ）におけるシグナル検出のために黒色底３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）に移した。４５０ｎｍの励起を設定し、発光波長を４８０ｎｍ～７００ｎｍに走査した。

【0095】

本開示におけるＳＵＭＯ－ＴｄＴは、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０と、溶解性及び発現を改善するＮ末端ＳＵＭＯタグと、を含む組換えＴｄＴを指す。表１は、ＳＵＭＯ－ＴｄＴの配列を示す。図１は、ＳＵＭＯ－ＴｄＴと、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴアミノ酸１３９～５２０との非限定的な例示的配列整列を示す。ＳＵＭＯ－ＴｄＴを担持するｐＥＴ２８ｂプラスミドは、製造者のプロトコルに従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ，ＵＳＡ）に形質転換し、２５０ｒｐｍのシェーカー中、１５℃で一晩、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で誘導した。ＴｄＴを発現する誘導された細胞溶解物を４つの部分（未希釈、１Ｘ ＴｄＴ緩衝液で、１０倍希釈、１００倍希釈、及び１０００倍希釈）に分注し、Ｑ７００ホーンソニケータ（Ｑｓｏｎｉｃａ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）を使用して溶解した。オリゴＦＡＭ２０（５’－／５６－ＦＡＭ／ＣＧＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧ－３’、配列番号１７）（ＩＤＴ，ＵＳＡ）及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ））を溶解及び希釈した細胞溶解物に添加し、最終細胞溶解物希釈を５倍、５０倍、５００倍及び５０００倍にした。ＴｄＴによるＦＡＭ２０へのｄＣＴＰの組込みのために、試料を３７℃で１分間インキュベートした。反応溶液を８０℃で５分間加熱し、等体積の２Ｘ ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を添加することによって、反応をクエンチした。

【0096】

クエンチした反応試料を２０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。Ｓ２ガラスプレート（Ａｐｏｇｅｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）をＡｌｃｏｎｏｘ及び水で洗浄した後、エタノール、水、５％ジクロロジメチルシラン（ＤＣＤＭＳ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及び水で拭き取った。プレートを０．８ｍｍスペーサー（Ａｐｏｇｅｅ，ＵＳＡ）、ゲルシールテープ（Ａｐｏｇｅｅ，ＵＳＡ）及びバインダークリップで組み立てた。水１ｍＬ中０．２％（ｖ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及び０．２％（ｖ／ｖ）テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）溶液を調製し、組み立てられたガラスプレートに注いだ。４５ｍＬの４０％アクリルアミド／ビス１９：１溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）及び４５ｍＬの水を混合した後、２２５μＬの１０％ＡＰＳ及び２２．５μＬのＴＥＭＥＤを添加することによって、２０％アクリルアミド溶液（９０ｍＬ）を調製した。２０％のアクリルアミド溶液を５０ｍＬのシリンジでガラスプレートに装填した。厚さ０．８ｍｍの３２ウェルプラスチックコーム（Ａｐｏｇｅｅ，ＵＳＡ）をゲルに挿入し、１時間３０分間重合させた。コーム及びゲルテープを慎重に取り外した後、ゲルプレートをＳ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ－Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に取り付けた。ランニング緩衝液、１Ｘ トリス／ボラート（ＴＢＥ）緩衝液を上部及び底部リザーバ、において、ゲル上約３ｃｍまで注いだ。ウェル中のゲル断片を除去した。試料をロードする前に、１７００Ｖで１５分間プレ電気泳動を行って、約５０℃のゲル表面温度を得た。１５μＬの各クエンチ反応試料を各ウェルにロードし、１７００Ｖで１時間３０分間実行した。Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ曝露を使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋（ＵＳＡ）でゲルを画像化した。

【0097】

図６に示すように、プレートベースのＦＲＥＴアッセイのワークフローを確立した。このアッセイの堅牢性を調べるために、ブラインド試験を行った。空のｐＥＴ２８ｂベクター及びＳＵＭＯ－ＴｄＴを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）コロニーを、９６ディープウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の各ウェルに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した２００μＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）に接種し、３７℃で一晩、２５０ｒｐｍで増殖させた。増殖した培養物を、新しい９６ディープウェルプレート中で５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した新鮮な４９５μＬのＬＢに１００倍継代培養し、２４℃で４時間インキュベートした後、０．５ｍＭのイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２４℃、８００ｒｐｍで少なくとも１６時間誘導した。誘導された細胞溶解物を０．２ｍＬのＰＣＲチューブプレート（ＡＩＴｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）中の１Ｘ ＴｄＴ緩衝液で１０倍希釈した。以下のパラメータ：Ａｍｐ９０、３分間のプロセス時間、５秒間のパルスオン及び１５秒間のパルスオフを用いて、ホーンソニケータを使用して細胞溶解物を溶解した。２００ｎＭの２ｂＡ ＦＡＭオリゴ、６００ｎＭのＣｙ５－ｄＣＴＰ及び１Ｘ ＴｄＴ緩衝液を含有する２４μＬのマスターミックスを黒色の３８４ウェルプレート中の各ウェルに添加した。溶解した細胞（６μＬ）の懸濁液を各それぞれのウェルに添加した。ＦＲＥＴシグナル検出を、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）ＥｎＳｐｉｒｅ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダーで３０分間、４５０ｎｍにおける励起及び６７０ｎｍにおける発光検出で行った。

【0098】

ＴｄＴ変異体ライブラリの作製
ＳＵＭＯ－ＴｄＴプラスミドを変異誘発のための骨格鋳型として使用した。エラープローン型ポリメラーゼｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、遺伝子プライマー１（５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧ－３’、配列番号１８）及び遺伝子プライマー２（５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡ－３’、配列番号１９）を使用して、遺伝子長当たり平均２～５個の変異のライブラリを作製した。変異誘発プールをｐＥＴ２８ｂベクターに連結し、プラスミドの増幅のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０－βコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）に形質転換した。細胞を回収し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した５０ｍＬのＬＢでスケールアップし、ＯＤ_{６００ｎｍ}～０．５が達成されるまで３７℃で増殖させた。細胞培養物を回収し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプラスミドを抽出した。第２ラウンドのスクリーニングのための親鋳型としてＴｄＴ１－１を使用して、同じ変異誘発プロセスを行った。

【0099】

第３ラウンドのスクリーニングのための変異体ライブラリは、ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３及びＴｄＴ２－４から同定された変異の異なる組合わせを組み込むための親鋳型としてＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－３を使用した。変異を親鋳型に導入するために使用されるプライマー：
プライマーＡ：５’－ＡＡＴＴＣＴＧＴＧＴＴＴＡＡＷＧＲＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＴＣＴＴＡＴＧＴＧ－３’（配列番号２０）
プライマーＢ：５’－ＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＴＲＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＡ－３’（配列番号２１）
プライマーＣ：５’－ＡＧＡＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＭＡＣＡＡＡＡＡＷＧＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴ－３’（配列番号２２）
プライマーＤ：５’－ＴＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＷＣＡＧＧＡＧＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧ－３’（配列番号２３）
プライマーＥ：５’－ＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＧＣＭＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＣＡＧＴ－３’（配列番号２４）

【0100】

潜在的に熱安定性のＴｄＴ変異体のスクリーニング
増幅した変異体ライブラリプラスミドを発現株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。回収した細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したＬＢ寒天上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを採取し、９６ディープウェルプレートに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した２００μＬのＬＢに接種した。増殖細胞培養及び下流プロセスは、「プレートベースのＦＲＥＴアッセイの確立」の下で上記のように実施した（図６）。希釈し溶解した細胞溶解物を異なる熱処理に供した後、２ｂＡ ＦＡＭオリゴ及びＣｙ５－ｄＣＴＰに添加した。

【0101】

ＳＵＭＯ－ＴｄＴ鋳型ベースの変異体ライブラリを用いた第１ラウンドのスクリーニングのために、希釈し溶解した細胞溶解物を２つの試料に分け、一方を熱処理せず、他方を４７℃で１分間供した。２７９０個の変異体のライブラリサイズをスクリーニングした。

【0102】

第２ラウンドの熱安定性スクリーニングでは、ラウンド１から同定されたＴｄＴ１－１を変異誘発のための鋳型として使用した。７３５６のライブラリサイズを、熱処理を受けていない各細胞溶解物の一定分量でスクリーニングし、残りの一定分量を５０℃で１分間熱処理した。

【0103】

第３ラウンドの熱安定性スクリーニングのための変異ライブラリの１つを、ＷＴ配列又はＴｄＴ１－１鋳型に基づくラウンド２の上位４つの変異体（ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３及びＴｄＴ２－４）から同定された変異のいずれかからそれぞれなる縮重プライマーを使用して作成して、組合わせ混合プールを得た。熱処理なしの各細胞溶解物試料の一定分量及び５５℃で１分間供した残りの細胞溶解物を用いて、７３６のライブラリサイズをスクリーニングした。熱処理なしの各細胞溶解物試料の一定分量及び５８℃で１分間供した残りのアリコートを用いて、ＴｄＴ１－３鋳型ベースの変異体ライブラリに対して同じことを行った。

【0104】

各ライブラリからの上位変異体（複数可）を同定した。遺伝子を配列決定のために調製した。得られた変異に関する情報を親プラスミドに挿入し、発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に再形質転換した。同じ変異体の約５個又は６個のコロニーを選択し、ＦＲＥＴアッセイの反復を行った。各変異体について読み取った１５～３０分の平均ＦＲＥＴシグナルからの平均データを得て、プロットした。各ＴｄＴの活性比は、熱処理下での平均ＦＲＥＴ読出しを、熱処理なしでの平均ＦＲＥＴ読出しで割ることによって得た。不等分散を仮定するスチューデントのＴ試験は、親ＴｄＴ及び変異体ＴｄＴからの平均ＦＲＥＴシグナル間の有意差を決定した。

【0105】

ＴｄＴの精製
ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２を含有するプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた。各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）構築物を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した６Ｌ ２ｘＹＴ ｂｒｏｔｈ（Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ，Ｃａｎａｄａ）中で増殖させた。ＯＤ_{６００ｎｍ}～０．８の時、１ｍＭのＩＰＴＧで細胞培養を誘導した。誘導は、１５℃で少なくとも１６時間、２５０ｒｐｍで行った。誘導された細胞を、５００ｍＬのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒプラスチック容器中でＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）ＪＬＡ１０．５００ロータを使用して６５００ｒｐｍ、４℃で６分間遠心分離することによって回収した。細胞ペレットを４℃で合計１２０ｍＬの結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．９）、５００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのイミダゾール）に再懸濁した。再懸濁した細胞を、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、２００００ｐｓｉの圧力で５回通過させて溶解した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＪＡ２５．５ロータを使用して２００００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上清を回収した。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）上でＮｉ^２＋を充填したＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して、上清からＨｉｓタグ付きＴｄＴを精製した。いくつかの画分からの試料を１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲルで分析した。ＴｄＴに対応する所望のバンドを含有する画分をプールし、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）を使用して緩衝液１（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのヒスチジン、０．１ｍＭの２，２’－ビピリジル）で４℃で少なくとも６時間透析した。緩衝液１を緩衝液２（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８）に少なくとも４時間、４℃で交換した後、透析したタンパク質を１０ｍＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填した。溶出は、１ＣＶを超える（１ＭのＮａＣｌ）によって行った。クロマトグラム上の高いＡｂｓ_{２８０ｎｍ}を有する画分の少量一定分量を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析した。それぞれのＴｄＴに対応する予想されるバンドを含む画分をプールし、タンパク質貯蔵緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８、１００ｍＭのＮａＣｌ）で透析した。透析したタンパク質を少量に分け、液体窒素で凍結させ、－８０℃で保存した。

【0106】

精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２純度を、ヌクレアーゼアッセイ試験を介して分析した。各タンパク質（０．５μｇ）を、１Ｘトリス／アセテート（ＴＡ）緩衝液（３０ｍＭのトリス、６６ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．８）中の１μｇの一本鎖ＤＮＡ（５’－ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＣＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴ－３’、配列番号２５）と３７℃で１６時間インキュベートした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのポリメラーゼ試料等のヌクレアーゼフリー酵素を使用した陰性対照及びＤＮａｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用した陽性対照を含めた。試料を１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）で可視化した。

【0107】

ＴｄＴ３－２の熱安定性の決定
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ，ＵＳＡ）を行って、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の熱安定性を検証した。２０℃～８０℃の温度範囲及び６０℃／ｈの走査速度を使用した。ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２を、１Ｘ ＴｄＴ緩衝液を用いて約１ｍｇ／ｍＬに希釈し、１ｍＬの各タンパク質をＤＳＣにロードした。各タンパク質の重複を積載し、熱容量の平均をグラフにプロットした。

【0108】

ナノ示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を行って、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の熱安定性を検証した。励起出力は、２０℃～８０℃の６０℃／ｈの走査速度で１４％に設定した。蛍光測定は、４７０ｎｍの励起波長で行った。ＤＳＦシグナル比Ｆ３５０／Ｆ３３０を、３３０ｎｍ（Ｆ３３０）及び３５０ｎｍ（Ｆ３５０）での放出強度から計算した。光散乱測定を並行して行った。約１ｍｇ／ｍＬの各タンパク質試料（１０μＬ）をナノＤＳＦに装填し、各試料の重複を測定した。比Ｆ３５０／Ｆ３３０の一次導関数の平均をプロットした。

【0109】

ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２熱安定性を検証するために、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱シフトアッセイを行った。最終的な５Ｘ ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む各タンパク質４μｇの重複物をアッセイに使用した。３０秒当たり０．５℃の増分を有する４℃～９５℃の温度範囲をプログラムした。温度（－ｄＲＦＵ／温度）に対する相対蛍光（ＲＦＵ）の変化を得、平均を温度に対してプロットした。

【0110】

ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の熱安定性を評価するために使用される円偏光二色性（Circular Dichroism：ＣＤ）を使用した。０．１ｍｍの手動石英キュベットを含むＣｈｉｒａｓｃａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）Ｑ１００をこの研究に使用した。タンパク質のアンフォールディングを温度の関数として１９８ｎｍ～２６０ｎｍの波長で監視し、２２２ｎｍの波長をデータ分析に使用した。試料を１Ｘ ＴｄＴ緩衝液で希釈して、１．６ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を得た。温度勾配は、２５℃～７０℃及び１℃／分の速度及び０．２℃の許容範囲に設定された。機器の帯域幅は、１点当たり１秒の取得時間で１ｎｍに設定した。各条件について２つの別個の測定を行った。ＣＤ（２２２ｎｍ）の一次導関数の平均をプロットした。

【0111】

２５℃、３６℃、４７℃、及び５８℃でのＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の活性を検証するために、エンドポイントアッセイを行った。ＮＥＢ ＴｄＴ（５単位）並びに精製ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２（それぞれ１００ｎＭ）を、２００ｎＭ ＦＡＭオリゴ（５’－／５６－ＦＡＭ／ＡＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣ－３’、配列番号２６）、５μＭのｄＣＴＰ及び１Ｘ ＴｄＴ緩衝液と２５℃、３６℃、４７℃及び５８℃で５分間、１０分間及び２０分間インキュベートした。試料を９０℃に５分間さらすことによって反応を停止させた。８０℃で５分間加熱する前に、等量の２Ｘ ＴＢＥ－尿素試料緩衝液を各試料に添加した。試料を１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（２４０Ｖ、６２分）で可視化した。ゲルをＧｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）で画像化した。

【0112】

平滑末端ＤＮＡ基質に対する市販のＮＥＢ ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の活性を試験した。平滑末端ＤＮＡ基質は、プライマー（５’－／５６－ＦＡＭ／ＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＣＧＣ－３’、配列番号２７）及び鋳型（５’－ＧＣＧＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＧ／３Ｐｈｏｓ／－３’、配列番号２８）からなっていた（ＩＤＴ，ＵＳＡ）。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ ＤＮＡ）産物を、４μＭのＤＮＡ（プライマー対鋳型、１：３）及び１Ｘ ＴｄＴ緩衝液の混合物を９５℃で５分間加熱することによって調製し、室温に少なくとも１５分間冷却した。酵素（１０μＬ）及び反応混合物（３０μＬ）をそれぞれの反応温度に３０秒間平衡化した。次いで、２００ｎＭのｄｓ ＤＮＡ、５０μＭの２’，３’－ジデオキシシチジン５’－三リン酸（ｄｄＣＴＰ）（ＪｅｎａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１Ｘ ＴｄＴ緩衝液及び０．５μＭの酵素（又はＮＥＢ ＴｄＴの場合は２５Ｕ／２０μＬ反応）を含む反応混合物に酵素を１分間、２分間及び４分間、３７℃～５０℃に等分した。各時点の試料（１０μＬ）を８．３μＭのディスプレーサオリゴ及び２Ｘ ＴＢＥ－尿素試料色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）（１２μＬ）と混合することによってクエンチし、９５℃で５分間加熱した後、室温に冷却した。ディスプレーサオリゴ（５’－ＴＴＴＣＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＣＧＣ／３Ｐｈｏｓ／－３’、配列番号２９）（ＩＤＴ，ＵＳＡ）は鋳型にアニールし、プライマーが置換され、ｓｓＤＮＡとして存在することを可能にし、一方、試料緩衝液及び高温は酵素を変性させる。試料を１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（２４０Ｖ、６８分）で視覚化し、ゲルをＧｅｌ Ｄｏｃで画像化した。各試料中のバンドの定量化は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を使用して完了した。反応を二連で行い、ｄｄＣＴＰ組込みを有するプライマーの平均パーセンテージをＧｒａｐｈＰａｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプロットした。

【0113】

ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の動態研究
２００ｎＭのＦＡＭオリゴ、様々なｄＣＴＰ濃度並びに８６ｎＭのＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２を用いて、２０μＬの最終体積で反応アッセイを設定した。ＴｄＴによるｄＣＴＰの組込みは、３７℃で１５秒間行った。１０ｍＭのＥＤＴＡ及び等しい総試料体積の２Ｘ ＴＢＥ－尿素試料緩衝液を添加し、８０℃で５分間加熱することによって、反応をクエンチした。試料を１５％ＴＢＥ－尿素ゲルに装填し、１８０Ｖで１時間３０分間実行した。ゲルをＧｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋で画像化し、バンドをＩｍａｇｅ Ｌａｂで分析した。レーン内の各バンドのバンドパーセンテージをソフトウェアから取得し、各バンドに対応するＦＡＭオリゴの量に変換した。バンドのサイズは、ＴｄＴによって実施されたｄＣＴＰの組込み数に関する情報を提供し、２０μＬの反応についてｎＭの総代謝ターンオーバーを計算した。得られた値をμＭに変換し、μＭ ｄＣＴＰ／ｓの酵素ターンオーバー速度を得た。酵素ターンオーバー速度は、ミカエリス・メンテン分析を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８におけるｄＣＴＰの濃度に対してプロットした。

【0114】

ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の動態も４７℃で試験した。２００ｎＭのＦＡＭオリゴ、１７３ｎＭのＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２並びに様々なｄＣＴＰ濃度（最終２０μＬ）で反応を設定した。ｄＣＴＰの組込みは、４７℃で５秒間実行した。後続のクエンチング及び分析は、上記段落において３７℃で行われる動態と同じである。

【0115】

ＴｄＴ３－２の３Ｄ構造のモデリング
Ｐｈｙｒｅ２ ｗｅｂ ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／ｈｔｍｌ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？ｉｄ＝ｉｎｄｅｘ）に、ＴｄＴ３－２（表１）のアミノ酸配列を入力した。「ＮＯＲＭＡＬ」モードを選択した。３Ｄ構造体をモデル化した。

【0116】

【表1】

【0117】

結果及び考察
ＴｄＴ活性の検出のためのプレートベースのＦＲＥＴアッセイの確立
この実施例に記載される熱安定性ＴｄＴバリアントをスクリーニングするためのハイスループットアッセイは、プライマーをヌクレオチドに共有結合させるＴｄＴ活性を決定するフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイである（図２及び図３Ａ）。第１に、ドナー染料及びアクセプタ色素の最適な距離を決定する必要がある。３’末端からのＦＡＭの距離を変化させながら、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ ＦＲＥＴ対を利用した。ＦＡＭドナー色素をオリゴの３’末端から２塩基離れた位置に有することにより、ＦＡＭ発光の最大の減少がもたらされた。しかしながら、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）からの対応する発光の増加は低かった（図４、表２）。より高いアクセプタ発光シグナルを得るために、３’末端から最適な２塩基離れたドナーを保持しながら、異なるＦＲＥＴ対（ＦＡＭ－Ｃｙ５及びＣｙ３－Ｃｙ５）を試験した（図４、表３）。ＦＡＭ－Ｃｙ５は、６７０ｎｍでのアクセプタＣｙ５の発光から検出されたシグナルの最大の増加をもたらした（図３Ｂ及び図５Ａ～図５Ｃ）。３’末端から２塩基のＦＡＭを有するプライマー（２ｂＡ ＦＡＭ）及びＣｙ５－ｄＣＴＰを、活性ＴｄＴ変異体のその後のスクリーニングに使用した（図３Ａ）。

【0118】

【表2】

【0119】

【表3】

【0120】

実際のハイスループットスクリーニングのためには、精製工程が時間及びコストの負担を追加するため、アッセイは未精製の溶解物を用いて行うのが最良であろう。しかしながら、粗細胞溶解物を利用することは、内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヌクレアーゼの存在がＴｄＴ活性をマスクする可能性があるため、問題があった（図３Ｃ、最上段）。この問題を克服するための１つの潜在的な方法は、細胞溶解物を希釈することであった。いかなる特定の理論にも拘束されないが、例えばＴｄＴがオリゴ基質に対してより高い結合親和性を有する場合、又はＴｄＴの過剰発現が細胞溶解物希釈後のヌクレアーゼと比較してより高い濃度のＴｄＴをもたらす場合、細胞溶解物を希釈すると、ＴｄＴと比較してヌクレアーゼ活性が不釣り合いに減少する可能性がある（図３Ｃ、最下列）。この仮説の妥当性を決定するために、ＳＵＭＯ－ＴｄＴを発現する細胞溶解物を５、５０、５００及び５０００倍希釈し、その後、組込み反応をポリアクリルアミドゲルで分析した。＋１以上に対応するバンドが５０倍及び５００倍希釈細胞溶解物について観察されたが、ヌクレアーゼ活性は５倍希釈で優勢であった（図３Ｄ）。上記のＦＡＭ－Ｃｙ５ ＦＲＥＴ対と共に、熱安定性スクリーニングのために５０倍希釈係数を選択した。

【0121】

得られたプレートベースのＦＲＥＴアッセイの堅牢性を決定するために、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ又は空のプラスミド（それぞれ４８個）のいずれかを発現するコロニーを９６ディープウェルプレートに接種し、それぞれの溶解物を、以前に開発されたＦＲＥＴアッセイを使用して５０倍希釈後にアッセイした。ＳＵＭＯ－ＴｄＴを発現する細胞溶解物は、より高いＦＲＥＴ読出しを有し、陰性対照と区別することができた（図３Ｅ）。この結果に基づいて、図６に示すように、潜在的に熱安定性のＴｄＴ変異体をスクリーニングするための９６ウェルプレートベースのＦＲＥＴアッセイのワークフローが確立された。これには、熱安定性及び熱感受性変異体を区別するための初期熱ショック工程が含まれる。選択圧力は、ヒートショック工程の温度及び持続時間を変更することによって調整することができることに留意されたい。

【0122】

耐熱性ＴｄＴ３－２の発見
変異体ライブラリは、ランダム変異誘発を介して生成された。第１の変異体ライブラリは、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ（すなわち、Ｎ末端１３８アミノ酸が欠失し、Ｎ末端ＳＵＭＯタグを含有しているウシ起源のＴｄＴ）を親鋳型として使用した。２７９０変異体のライブラリを４７℃で１分間熱処理してスクリーニングした。このラウンドは、熱安定性変異体ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２を熱安定性として同定した（図２及び表４Ａ及び４Ｂ）。ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２は、ＳＵＭＯ－ＴｄＴと比較して、熱処理なし及び熱処理ありで有意に高いＦＲＥＴ読出しを有する（図７Ａ）。また、ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２は、熱処理後にそれらの活性の高い割合を保持した（図７Ａ）。

【0123】

【表4】

【0124】

【表5】

【0125】

第２ラウンドのスクリーニングラウンドでは、ＴｄＴ１－１を親として使用して７６３６のライブラリサイズを生成した。ＴｄＴ１－１は、ＴｄＴ１－２と比較して熱処理なしのＦＲＥＴ読出しがより高いため、ＴｄＴ１－１を親鋳型として選択した。第２ラウンドのスクリーニングを５０℃で１分間熱処理して行い、４つの熱安定性変異体を同定した（ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３、ＴｄＴ２－４）（表４Ａ及び４Ｂ）。４つの変異体は、熱処理なし及び熱処理条件の両方で、ＴｄＴ１－１よりも著しく高いＦＲＥＴ読出しを有する（図７Ｂ）。４つ全ての変異体はまた、５０℃に１分間かけた後に、それらの活性のはるかにより高い割合を保持した（図７Ｂ）。

【0126】

ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３及びＴｄＴ２－４から同定された変異の組合わせは、熱安定性の相乗的増加をもたらすと推測された。熱安定性スクリーニングの３回目のラウンドでは、２つの変異体ライブラリが生成された。変異体ライブラリのうちの１つは、ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３、及びＴｄＴ２－４に見られる変異の異なる組合わせを有するＴｄＴ１－１鋳型に基づく。ＴｄＴ１－３を親鋳型として利用することを除いて他の変異体ライブラリを同様に作製した。ＴｄＴ１－３は、ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２における変異の組合わせから構成された（表４Ａ及び４Ｂ）。ＴｄＴ１－１ベースの変異体ライブラリを５５℃で１分間の熱ショックでスクリーニングした。このライブラリから上位変異体として同定されたＴｄＴ３－１（表４Ａ及び４Ｂ）は、熱ショックの有無にかかわらずはるかにより高いＦＲＥＴ読出しを有し、熱ショック後にそのＦＲＥＴ活性のより高い割合を保持した（図７Ｃ）。５８℃で１分間熱処理したＴｄＴ１－３系変異体ライブラリのスクリーニングにより、室温及び熱ショック処理の両方で有意に高いＦＲＥＴ読出しを有するＴｄＴ３－２が発見された（図７Ｄ及び表４Ａ及び４Ｂ）。ＴｄＴ３－２は、５８℃に１分間供された後、そのＦＲＥＴ活性の少なくとも半分を保持した（図７Ｄ）。これは、ＴｄＴ３－２がＴｄＴ１～３よりも有意に活性及び熱安定性が高いことを示唆している。表４Ａ及び４Ｂに示されるように、ＴｄＴ３－２は、Ｔ３２６Ｓを除いて、各ラウンドのスクリーンから上位変異体から特定された変異の大部分を担持する。

【0127】

ＴｄＴ３－２を最適な熱安定性変異体として同定した後、発現及び精製プロセスを最適化して、最小限のヌクレアーゼ汚染でＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２を得ることに成功した（図８）。ヌクレアーゼは下流特性決定試験を妨害するため、精製されたＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２が最小のヌクレアーゼ活性を有することが重要である。

【0128】

ＴｄＴ３－２の熱安定性の検証
ＴｄＴ３－２熱安定性の特性決定を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱シフトアッセイ及び円偏光二色性（ＣＤ）によって行った。ＤＳＣは、タンパク質三次構造を安定化する相互作用を破壊するのに必要なエネルギーを測定する。ＳＵＭＯ－ＴｄＴについてＤＳＣから得られたＴ_ｍは４０．２℃であり、ＴｄＴ３－２については５０．７℃である（図９Ａ）。ＤＳＣからのＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＴ_ｍを更に検証するために、同じタンパク質をＤＳＦによって試験した。ＤＳＦは、タンパク質がアンフォールディングである時に、内因性チロシン及びトリプトファン残基の蛍光シフトを測定する。蛍光読取り値の負の導関数を温度に対してプロットし、この導関数曲線の最大値はタンパク質のＴ_ｍに対応する。ＳＵＭＯ－ＴｄＴは４３．５℃のＴ_ｍが観察されたが、ＴｄＴ３－２は５３．１℃のＴ_ｍを有する（図９Ｂ）。ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２のＴ_ｍを、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱シフトアッセイによって更に検証した。ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素は、タンパク質アンフォールディング中に露出した疎水性領域に非特異的に結合する。蛍光シグナルの変化の導関数は、タンパク質のＴ_ｍに対応する。ＳＵＭＯ－ＴｄＴでは４１．５℃のＴ_ｍが記録されたが、ＴｄＴ３－２では５１．５℃が観察された（図９Ｃ）。円偏光二色性（ＣＤ）は、温度の関数としてタンパク質のアンフォールディングを追跡するための分光技術である。ＣＤは、α－ヘリックス及びβシートに起因し得る特徴的なスペクトルバンドを測定する。特徴的な波長での温度の関数としてのＣＤの変化を使用して、タンパク質のアンフォールディング転移の中点（Ｔ_ｍ）を決定することができる。波長２２２ｎｍでのＣＤの一次導関数値を温度に対してプロットし、最大値をＴ_ｍとした。ＳＵＭＯ－ＴｄＴのＴ_ｍは４５．７℃であり、ＴｄＴ３－２のＴ_ｍは５２．５℃であった（図９Ｄ）。

【0129】

両タンパク質のＴ_ｍ移行のＣＤ測定値は、他の技術と比較した場合、わずかに高かった。より高い溶融温度は、機器の設定に関連し得る。試料キュベットは、金属アダプタを介してペルチェホルダと接触しており、これは小さな熱放散をもたらし、１～２℃の試料温度の小さな過大評価をもたらし得る。それにもかかわらず、ＣＤデータは、２つのタンパク質間で同じ安定性傾向を示す他の実験技術と良好に一致した。データは、ＴｄＴ３－２がＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも約１０℃熱安定性であることを確認した。

【0130】

プライマー伸長反応を市販の（ＮＥＢ）ＴｄＴ、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ、及びＴｄＴ３－２を用いて行い、ＴｄＴ３－２が高温でヌクレオチドを組み込むかどうかを決定した。反応を２５℃、３６℃、４７℃及び５８℃で行い、ＤＮＡ産物をＴＢＥ－尿素ゲル上で可視化した。３つの酵素は全て、２５℃及び３６℃で活性である（図１０Ａ及び１０Ｂ）。４７℃で、組込みを有するバンドの強度が５分間、１０分間及び２０分間同じままであるため、市販のＴｄＴ及びＳＵＭＯ－ＴｄＴは５分以内に変性した。対照的に、ＴｄＴ３－２は、２０分間の反応でより多くの組込みが見られたため、２０分間活性であった（図１０Ｃ）。５８℃では、市販のＴｄＴ及びＳＵＭＯ－ＴｄＴは活性ではなかったが、バンドの強度がその後も同じままであるため、ＴｄＴ３－２は５分以内に変性した（図１０Ｄ）。この観察は、ＴｄＴ３－２がＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも熱安定性が高く、ＴｄＴ３－２がより高い温度で活性であることを強く確認する。

【0131】

ＴｄＴは、増幅前にｄｓＤＮＡ試料を伸長するためにライブラリ調製で使用されている。ＴｄＴがヌクレオチドをｓｓＤＮＡに添加すると、ｄｓ平滑末端ＤＮＡは、ＴｄＴのプライマーの３’末端での一過性溶融ＤＮＡに依存して、最初の数ヌクレオチドを組み込むことになる。高いＧＣ含有量を有するＤＮＡ試料は、より高いＴ_ｍにより、ＴｄＴを伸長させることが困難であり得る。ＴｄＴを使用してライブラリ調製中に温度を上昇させることにより、ＴｄＴがヌクレオチドを組み込むためのプライマーの３’末端でｓｓＤＮＡに一時的に融解するｄｓＤＮＡの割合が増加するであろう。しかしながら、ライブラリ調製で使用されるＴｄＴは熱安定性ではない。ライブラリ調製プロセスの改善におけるその潜在性を示すために、プライマーの３’に４つのＧＣ塩基対を含む、平滑末端ｄｓＤＮＡ上のＴｄＴ３－２を試験した。市販のＴｄＴとＴｄＴ３－２との間のｄｄＣＴＰの組込みの割合を比較すると、ＴｄＴ３－２は、３７℃及び５０℃の両方で市販のＴｄＴよりも良好に機能する。加えて、プライマーの伸長は、５０℃でのＴｄＴ３－２に対してより高い（図１１及び図１２）。これは、現在のライブラリ調製の改善におけるＴｄＴ３－２の潜在的な性能を示唆している。

【0132】

ＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の速度論的特性決定
熱安定化ＴｄＴバリアントがその末端トランスフェラーゼ活性を維持しているかどうかをより正確に決定するために、その定常状態活性をＳＵＭＯ－ＴｄＴの定常状態活性と比較した。定常状態アッセイは、酵素ターンオーバー当たりの組込み事象の数を区別することが不可能であったとしても複数のターンオーバーが観察され得るように、過剰のＤＮＡを用いて設定した。ｄＣＴＰ濃度の滴定を伴う３７℃での反応をそれぞれ１５秒でクエンチし、生成物の量を尿素－ＰＡＧＥで定量し、マイクロモル濃度のｄＣＴＰ／秒での総ターンオーバーを概算した（「材料及び方法」、表５及び表６の生データを参照されたい）。この速度をｄＣＴＰ濃度に対してプロットすると、ミカエリス・メンテン速度論と一致する双曲線関係が観察され、最大伸長速度及びミカエリス定数（Ｋ_Ｍ）の推定が可能になった。ＴｄＴ３－２は、ＳＵＭＯ－ＴｄＴと同等の活性を示し、わずかに上昇した伸長率及びより低いＫ_Ｍを有し、この酵素がわずかに改善された触媒活性を有することを示唆した（表７）。４７℃の高温でのＳＵＭＯ－ＴｄＴ及びＴｄＴ３－２の動態研究を行った。同じ分析方法を採用し、１秒当たりのマイクロモルｄＣＴＰにおける推定総ターンオーバーを得た（表８及び９）。ＴｄＴ３－２は、３７℃及び４７℃の両方で同等の活性を有していたが、ＳＵＭＯ－ＴｄＴは、飽和を達成することができなかったため、４７℃ではるかに低い活性を有していた（表７）。

【0133】

【表6-1】

【0134】

【表6-2】

【0135】

【表7-1】

【0136】

【表7-2】

【0137】

【表8】

【0138】

【表9】

【0139】

【表10】

【0140】

伸長反応に用いたｓｓＤＮＡオリゴに対するＴｄＴ３－２の親和性を推定することにより、定常状態であることを確認した。ＴｄＴの滴定の存在下でのＦＡＭ－オリゴの蛍光偏光を測定し、本発明者等の変異体及びＳＵＭＯ－ＴｄＴ酵素の両方に対する親和性は１μＭより大きいと推定された（図１３）。熱安定化変異体ＴｄＴ３－２は、おそらく活性のわずかな改善を伴うＳＵＭＯ－ＴｄＴ酵素の基質結合親和性及び触媒特性を保持した。

【0141】

ＴｄＴ３－２の相同に基づくモデリング
マウスＴｄＴ結晶構造は、利用可能であった（ＰＤＢ ＩＤ ４Ｉ２７）。ＴｄＴ３－２がウシ源に由来するため、３Ｄ構造上の変異の位置を視覚化することは、相同性モデリングによってのみ行われ得る。利用可能な相同配列及び既知の構造に基づいて、Ｐｈｙｒｅ２サーバは、そのアミノ酸ｑｕｅｒｙ配列からＴｄＴ３－２の３Ｄ構造を作成した。８つの変異及び他の重要な残基の位置は、Ｐｈｙｒｅ２から得られたモデルで可視化することができた（図１４）。しかしながら、このモデルは、その改善された熱安定性に寄与するＴｄＴ３－２における獲得変異の効果を正確に説明することができなかった。

【0142】

結論
熱安定性ＴｄＴバリアントは、温度を上昇させることによってオリゴヌクレオチド合成中の二次構造の存在を最小限に抑える等の実用的な用途に有用であろう。マウスＴｄＴからの熱安定性バリアントは、組込み反応中の温度を増加させることによって、いくつかのＧＣリッチヘアピンプライマーの伸長率を改善することができた。この実施例ではＴｄＴ３－２を発見するタンパク質操作方法は、広い配列空間の探索を可能にした。この実施例は、ＤＮＡ合成における適用のための熱安定性ＴｄＴを進化値及び有意性を示す。

【0143】

この実施例は、大腸菌（E.coli）細胞溶解物を使用して変異体ライブラリをスクリーニングするための適合可能なプレートベースのＦＲＥＴアッセイを確立する。第３ラウンドスクリーニングにより、著しくより熱安定性のバリアントＴｄＴ３－２の発見につながった。ＴｄＴ３－２は、ＤＳＣ、ＤＳＦ、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱シフトアッセイ及びＣＤで検証され、ＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも約１０℃高いＴ_ｍを有することが見出された。加えて、熱安定性の改善は、酵素活性を犠牲にして生じなかった。ＴｄＴ３－２は、その改善された熱安定性及び堅牢な活性のためにＳＵＭＯ－ＴｄＴを現在使用している広範囲の用途のためのより良好なツールである。更に、ＴｄＴ３－２は、可逆的にブロックされたヌクレオチドを効率的に組み込むことができるＴｄＴを最終的に進化させるための更なる操作の理想的な出発点でもあり、これは、ＤＮＡにおけるｄｅ ｎｏｖｏ遺伝子合成及び情報記憶の新生分野において特に有用であろう。

【0144】

一緒に、これらのデータは、この実施例では、個々に又は任意の組合わせで特定された９つのアミノ酸置換が、ＴｄＴ触媒活性を保存しながら、アミノ酸置換（複数可）を含有するＴｄＴ変異体の熱安定性を増加させることができることを示す。更に、この実施例で特定されたＴｄＴ変異体は、ＴｄＴ触媒活性を維持しながら熱安定性であり得る。

【0145】

用語
前述の実施形態のうちの少なくともいくつかにおいて、一実施形態で使用される１つ以上の要素は、このような交換が技術的に実行可能でない場合を除いて、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者であれば、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、上記の方法及び構造に、種々のその他の省略、追加、及び修正がなされてもよいことを理解するであろう。このような修正及び変更は全て、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、主題の範囲内に含まれることが意図される。

【0146】

本明細書における実質的に任意の複数形及び／又は単数形の用語の使用について、当業者は、文脈及び／又は用途に適切なように、複数形から単数形に、及び／又は単数形から複数形に置き換えることができる。明確性のために、種々の単数形／複数形の順列が本明細書に明示的に記載されてもよい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでない旨を明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書における「又は」への任意の言及は、特に指示しない限り、「及び／又は」を包含することを意図する。

【0147】

全般的に、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体）で使用される用語は、概して、「オープン」ターム（open terms）として意図される（例えば、用語「含む（including）」は、「～を含むがこれらに限定されない（including but not limited to）」と解釈されるべきであり、用語「有する（having）」は、「少なくとも有する（having at least）」と解釈されるべきであり、用語「含む（includes）」は、「～を含むがこれらに限定するものではない（includes but is not limited to）」と解釈されるべきであるなど）ことが、当業者によって理解されるであろう。導入された請求項記載の具体的な数が意図されている場合、このような意図が請求項に明示的に列挙され、このような記載がない場合、このような意図は存在しないことも、当業者には更に理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するための導入句「少なくとも１つの（at least one）」及び「１つ以上の（one or more）」の使用を含んでもよい。しかしながら、このような語句の使用は、同じ請求項が、「１つ以上の」又は「少なくとも１つの」、及び「ａ」若しくは「ａｎ」などの不定冠詞を含む（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」が、「少なくとも１つの」又は「１つ以上の」の意味に解釈されるべきである）場合であっても、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項記載の導入が、このような導入された請求項記載を含む任意の特定の請求項を、このような記載のうちの１つのみを含む実施形態に限定するものと解釈すべきではなく、請求項記載を導入するために使用される不定冠詞の使用についても同じく当てはまる。更に、導入された請求項記載の具体的な数が明示的に列挙されている場合であっても、このような記載が、少なくとも列挙された数の意味（例えば、「２つの記載」の無修飾の記載は、その他の修飾がないと、少なくとも２つの記載又は２つ以上の記載を意味する）で解釈されるべきであることを、当業者は認識するであろう。更に、「Ａ、Ｂ、及びＣなどのうちの少なくとも１つ」と類似した常套句が使用される場合には、全般的に、このような構造は、当業者がこの常套句を理解するであろう意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」としては、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢともに、Ａ及びＣともに、Ｂ及びＣともに、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣともに、などを有するシステムが挙げられるが、これらに限定されない）。「Ａ、Ｂ、又はＣなどのうちの少なくとも１つ」と類似した常套句が使用される場合には、全般的に、このような構造は、当業者がこの常套句を理解するであろう意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」としては、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢともに、Ａ及びＣともに、Ｂ及びＣともに、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣともに、などを有するシステムが挙げられるが、これらに限定されない）。本明細書、特許請求の範囲、又は図面にかかわらず、２つ以上の代替用語を提示する実質上任意の離接語及び／又は語句は、用語のうちの１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性を企図することが理解されるべきであると、当業者には更に理解されるであろう。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。

【0148】

加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群の観点で記載されている場合、それによって、当業者は、本開示がまた、マーカッシュ群の構成要素の任意の個々の構成要素又はサブグループの観点でも記載されていることを認識するであろう。

【0149】

当業者には理解されるように、書面による説明を提供するという観点からなどの任意の及び全ての目的において、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意の及び全ての可能なサブ範囲並びにそれらのサブ範囲の組合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が、少なくとも等半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されることを十分に記載し可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的実施例として、本明細書で説明される各範囲は、下部３分の１、中部３分の１、及び上部３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者には理解されるように、「最大で（up to）」、「少なくとも（at least）」、「より大きい（greater than）」、「より小さい（less than）」などの全ての言語は、列挙された数を含み、続いて上述のように下位範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は、各個々の構成要素を含む。したがって、例えば、１～３個の物品を有する群は、１個、２個、又は３個の物品を有する群を意味する。同様に、１～５個の物品を有する群は、１個、２個、３個、４個、又は５個の物品を有する群などを意味する。

【0150】

本明細書では様々な態様及び実施形態が開示されてきたが、他の態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様及び実施形態は、説明のためのものであり、以下の特許請求の範囲によって示される真の範囲及び趣旨により、限定することを意図するものではない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

2023526061000001.app

【国際調査報告】