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特表2023-526096ＣＡＲＤ９のスプライス調節のためのオリゴヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-20
(54)【発明の名称】ＣＡＲＤ９のスプライス調節のためのオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230613BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230613BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230613BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20230613BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230613BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230613BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230613BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230613BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230613BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230613BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230613BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230613BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12Q1/02
A61K31/7088
A61K47/61
A61K48/00
A61P1/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P3/10
A61P9/00
A61P13/12
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022570622
(86)(22)【出願日】2020-05-22
(85)【翻訳文提出日】2022-11-18
(86)【国際出願番号】 EP2020064285
(87)【国際公開番号】W WO2021233551
(87)【国際公開日】2021-11-25
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(71)【出願人】
【識別番号】507229331
【氏名又は名称】ベーリンガー・インゲルハイム・インターナショナル・ゲーエムベーハー
【住所又は居所原語表記】Ｂｉｎｇｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １７３，５５２１６ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100196243
【弁理士】
【氏名又は名称】運 敬太
(72)【発明者】
【氏名】ヘーイドーン，ピーダ
(72)【発明者】
【氏名】ヨーンソン，ラース
(72)【発明者】
【氏名】フーイ，アニャ・モールハート
(72)【発明者】
【氏名】ビケッサ，ヨーナス
(72)【発明者】
【氏名】バーン，ファーガス
(72)【発明者】
【氏名】ファイン，ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】ムボウ，ムハマドウ
(72)【発明者】
【氏名】ワーレ，ジョー・アダム
(72)【発明者】
【氏名】クライン，エリオット・サンフォード
(72)【発明者】
【氏名】サイ，クリスティナ・メアリー
(72)【発明者】
【氏名】シェン，フェイ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4C076AA95
4C076CC09
4C076CC11
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC21
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA13
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA36
4C084ZA68
4C084ZA75
4C084ZA81
4C084ZB26
4C084ZC35
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA68
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZB26
4C086ZC35
(57)【要約】
本発明は、ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡへのＣＡＲＤ９エクソン１１の包含を阻害するための、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡに相補的なスプライス調節オリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＩＢＤなどの炎症性疾患の処置に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物のＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングを調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが１０～４０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１に対して少なくとも９０％の相補性の少なくとも１０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
前記オリゴヌクレオチドが、１０～２５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に対して１００％の相補性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号６に対して相補的であり、例えば完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号７に対して相補的であり、例えば完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号８に対して相補的であり、例えば完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号９に対して相補的であり、例えば完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４又は５６５に対して相補的であり、例えば完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号１１～２８４からなる群から選択される配列に対して相補的である、請求項１～８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、Δ１１ＣＡＲＤ９の発現を増強することができる、請求項１～９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＷＴＣＡＲＤ９の発現を低下させることができる、請求項１～９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＷＴＣＡＲＤ９の発現を低下させ、Δ１１ＣＡＲＤ９の発現を増強することができる、請求項１～９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドのミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）であるか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項14】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、１０～２０ヌクレオチド長である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項15】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号２８５～５５８から選択される配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項16】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ここに提供されるオリゴヌクレオチド、例えば化合物ＩＤ ＮＯ＃２８５＿１～＃５５８＿１からなる群から選択される化合物を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
【請求項18】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１７に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容され得る塩。
【請求項19】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１７に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物。
【請求項20】
ＣＡＲＤ９を発現している標的細胞においてＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１８若しくは１９に記載の医薬組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項21】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、ＣＡＲＤ９Δ１１バリアントの発現増強をもたらす、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＷＴＣＡＲＤ９の発現低下をもたらす、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞がヒト細胞又は哺乳動物細胞のいずれかである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記ＣＡＲＤ９がヒトＣＡＲＤ９である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
治療有効量又は予防有効量の、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１８若しくは１９に記載の塩若しくは医薬組成物を、炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）；又は、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、炎症性疾患を処置又は予防するための方法。
【請求項26】
医薬として使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１８若しくは１９に記載の塩若しくは医薬組成物。
【請求項27】
炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）；又は、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患の処置における使用のための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１８若しくは１９に記載の塩若しくは医薬組成物。
【請求項28】
炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）；又は、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患を処置又は予防するための医薬を調製するための、請求項１～１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１８若しくは１９に記載の塩若しくは医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
本出願において提出された電子的に提出された配列表（名称：Ｐ３５１２０＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ｐｒｏｊｅｃｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：１３０，０９９バイト；作成日２０２０年５月５日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願において提出された電子的に提出された配列表（名称：Ｐ３５１２０＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ｐｒｏｊｅｃｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：１３０，０９９バイト；作成日２０２０年５月５日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は、成熟ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡへのＣＡＲＤ９エクソン１１の取り込みを減少させる、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡに相補的なスプライス調節オリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患（クローン病又は潰瘍性大腸炎など）；又は、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患を含む様々な医学的障害の処置に有用である。
本発明は、成熟ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡへのＣＡＲＤ９エクソン１１の取り込みを減少させる、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡに相補的なスプライス調節オリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患（クローン病又は潰瘍性大腸炎など）；又は、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患を含む様々な医学的障害の処置に有用である。
【背景技術】
【0003】
背景
ＣＡＲＤ９（カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質（Ｃａｓｐａｓｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）９）は、Ｃ型レクチン受容体を介した抗真菌自然免疫シグナル伝達の中心的構成要素である。これは、ＮＦ－κＢの活性化による自然免疫応答において重要な役割を果たすＣＡＲＤファミリーのメンバーである。ＣＡＲＤ９は、ＴＮＦα、ＩＬ－６及びＩＬ－１βを含む炎症促進性サイトカイン産生を媒介し、それによってＴｈ１及びＴｈ１７細胞の応答を調節する。
ＣＡＲＤ９（カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質（Ｃａｓｐａｓｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）９）は、Ｃ型レクチン受容体を介した抗真菌自然免疫シグナル伝達の中心的構成要素である。これは、ＮＦ－κＢの活性化による自然免疫応答において重要な役割を果たすＣＡＲＤファミリーのメンバーである。ＣＡＲＤ９は、ＴＮＦα、ＩＬ－６及びＩＬ－１βを含む炎症促進性サイトカイン産生を媒介し、それによってＴｈ１及びＴｈ１７細胞の応答を調節する。
【0004】
ＣＡＲＤ９は、多くの疾患及び障害に関連している。例えば、ＣＡＲＤ９発現は、心血管疾患、自己免疫疾患、がん及び肥満に関連している（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１８）９：５２）。
【0005】
さらに、ＣＡＲＤ９は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、強直性脊椎炎、原発性硬化性胆管炎及びＩｇＡ腎症のリスクに関連する遺伝子として同定されている（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１５ Ｏｃｔ ２０；４３（４）：７１５－７２６）。
【0006】
Ｙａｍａｍｏｔｏ－Ｆｕｒｕｓｈｏは、ＣＡＲＤ９の発現が潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の活動型と寛解型を区別することができることを示した。したがって、ＣＡＲＤ９は、ＵＣ患者における標的として提案された（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（２０１８）１５：１３）。
【0007】
さらに、ＣＡＲＤ９発現が重症急性膵炎（ＳＡＰ）患者において上方制御されることが示された。タウロコール酸ナトリウムで刺激したＳＡＰラットにおけるＣＡＲＤ９発現レベルを低下させるために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が用いられた。非処置群と比較した場合、ｓｉＲＮＡ処置を受けたコホートは、膵臓損傷、好中球浸潤、ミエロペルオキシダーゼ活性及び炎症促進性サイトカインの有意な減少を示した。したがって、ＣＡＲＤ９は急性膵炎の処置の標的として示唆された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６；２１（６）：１０８５－１０９３）。
【0008】
さらに、ＣＡＲＤ９は、好中球性皮膚疾患の処置の標的として提案された（Ｔａｒｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５，２０１８，２０１（６）１６３９－１６４４）。
【0009】
複雑な疾患のほとんどの遺伝的危険因子とは異なり、ＣＡＲＤ９対立遺伝子は、ＩＢＤの素因型と保護型の両方で存在する。素因型バリアントであるＣＡＲＤ９ Ｓ１２Ｎは、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）によって同定された一般的なコード一塩基多型であり、ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡの発現増加に関連する（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１５ Ｏｃｔ ２０；４３（４）：７１５－７２６）。保護型バリアントであるＣＡＲＤ９ Ｓ１２ＮΔ１１は、ＣＡＲＤ９のエクソン１１が欠失している稀なスプライスバリアントである。ＧＷＡＳ遺伝子座のディープ・シーケンシングによって同定されたこの対立遺伝子は、Ｃ末端がトランケートされたタンパク質をもたらし、疾患に対する強力な保護を付与する（Ｐ＜１０－１６）（Ｂｅａｕｄｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１３；９：ｅ１００３７２３；Ｒｉｖａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１１；４３：１０６６－１０７３）。
【0010】
小分子阻害剤は、ＣＡＲＤ９エクソン１１スプライシング事象を直接標的化して保護的ｅ ＣＡＲＤ９ Ｓ１２ＮΔ１１バリアントを模倣し、小分子阻害剤を使用してＩＢＤからの保護に関連するＣＡＲＤ９突然変異の抗炎症機能を再現することの実現可能性を決定するために使用されている（Ｌｅｓｈｃｈｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１７ Ｏｃｔ ２４；１１４（４３）：１１３９２－１１３９７）。
【0011】
アンチセンス媒介スプライシング調節は、稀な遺伝性疾患の潜在的治療を提供するためにいくつかの方法で利用することができるツールである。このアプローチは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び脊髄性筋萎縮症のための承認された治療法をもたらした－アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したスプライス調節のための様々なアプローチの総説については、Ａｒｅｃｈａｖａｌａ－Ｇｏｍｅｚａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ．２０１４；７：２４５－２５２を参照のこと。
【0012】
本発明者らは、ＣＡＲＤ９エクソン１１を標的とするスプライススイッチング化合物を開発した。本発明の化合物は、ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡへのＣＡＲＤ９エクソン１１の包含を調節し、それによってｄΔ１１ ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡの発現を増強する。
【0013】
本発明の目的
本発明は、ＣＡＲＤ９エクソン１１の包含を調節し、それによってＣＡＲＤ９ ｄΔ１１バリアントの発現を増強することができる、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡに相補的なスプライス調節オリゴヌクレオチド（オリゴマー）を提供する。ＣＡＲＤ９ ｄΔ１１タンパク質バリアントは、炎症性腸疾患からの保護を提供することが示されているＣＡＲＤ９バリアントである。別の言い方をすると、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのプロセシングにおいてエクソン１１のスキップをもたらし、ＣＡＲＤ９エクソン１１配列の一部又は全部を欠く成熟ｍＲＮＡをもたらすスプライススイッチングオリゴヌクレオチドである。得られたＣＡＲＤ９ ｄΔ１１転写物の発現は、ＣＡＲＤ９ ｄΔ１１タンパク質の発現又は発現増加をもたらす。
本発明は、ＣＡＲＤ９エクソン１１の包含を調節し、それによってＣＡＲＤ９ ｄΔ１１バリアントの発現を増強することができる、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡに相補的なスプライス調節オリゴヌクレオチド（オリゴマー）を提供する。ＣＡＲＤ９ ｄΔ１１タンパク質バリアントは、炎症性腸疾患からの保護を提供することが示されているＣＡＲＤ９バリアントである。別の言い方をすると、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのプロセシングにおいてエクソン１１のスキップをもたらし、ＣＡＲＤ９エクソン１１配列の一部又は全部を欠く成熟ｍＲＮＡをもたらすスプライススイッチングオリゴヌクレオチドである。得られたＣＡＲＤ９ ｄΔ１１転写物の発現は、ＣＡＲＤ９ ｄΔ１１タンパク質の発現又は発現増加をもたらす。
【0014】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される様々な医学的障害、例えば炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）；又は、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患の処置に有用である。
【発明の概要】
【0015】
発明の概要
本発明は、ＣＡＲＤ９核酸に相補的であり、その発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び医学におけるその使用を提供する。
本発明は、ＣＡＲＤ９核酸に相補的であり、その発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び医学におけるその使用を提供する。
【0016】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングの調節をもたらす注目すべき標的部位である、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的化に適した、ＣＡＲＤ９核酸内に存在する有利な標的部位配列の同定に関する。
【0017】
遊離には、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのプロセシングにおいてエクソン１１のスキップを増強させることができ、ＣＡＲＤ９エクソン１１配列の一部又は全部を欠く成熟ｍＲＮＡをもたらす。得られたＣＡＲＤ９ ｄΔ１１転写物の発現は、炎症性腸疾患などの炎症症状を保護又は緩和するタンパク質バリアントであるＣＡＲＤ９ ｄΔ１１タンパク質（ＣＡＲＤ９Δ１１）の発現又は発現増加をもたらす。
【0018】
本発明は、野生型ＣＡＲＤ９（ＷＴＣＡＲＤ９）タンパク質の発現を減少させる、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡに相補的なスプライス調節オリゴヌクレオチド（オリゴマー）を提供する。ＷＴ ＣＡＲＤ９タンパク質の減少は、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡなどの代替転写物の産生によって達成され得る。いくつかの実施形態では、ＷＴＣＡＲＤ９の発現の減少は、転写物の脱安定化（例えば、ナンセンス媒介性の崩壊を介する）によるものであり得る。
【0019】
本発明はさらに、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患の予防又は処置に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0020】
本発明はさらに、炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）などの炎症性障害の予防又は処置に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0021】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡ（例えば、配列番号１）のエクソン１１配列の包含を阻害するように、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡ上のスプライシングを調節することができる。
【0022】
本発明者らは、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのエクソン１１、例えば本明細書において配列番号６、７、８、９、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４又は５６５として特定される標的部位のスプライシングを調節するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的化に対して特に感受性であるヒトＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡの領域（本明細書において配列番号１として示される）を特定した。
【0023】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、標的部位に相補的であり、例えば配列番号６に完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば約１０～約４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0024】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号７に相補的であり、場合によっては完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0025】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号８に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0026】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号９に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0027】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５５９に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0028】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６０に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0029】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６１に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0030】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６２に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0031】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６３に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0032】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６４に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0033】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６５に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0034】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１、６、７、８、９、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４又は５６５からなる群から選択される標的配列などの標的配列に完全に相補的な１０～２５ヌクレオチド長又は１０～２０ヌクレオチド長である。
【0035】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号６に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0036】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号７に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0037】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号８に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0038】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号９に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0039】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５５９に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0040】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６０に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0041】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６１に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0042】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６２に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0043】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６３に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0044】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６４に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0045】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６５に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0046】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号１１～２８４からなる群から選択される配列に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0047】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号１１～２８４からなる群から選択される配列に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0048】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号１１～２８４からなる群から選択される配列に相補的であり、例えば完全に相補的である、少なくとも１４ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0049】
本発明は、配列番号２８５～５５８から選択される配列の領域と同一である少なくとも１０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0050】
本発明は、配列番号２８５～５５８から選択される配列に存在する少なくとも１０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0051】
本発明は、配列番号２８５～５５８から選択される配列と同一である連続ヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0052】
本発明は、配列番号２８５～５５８から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0053】
本発明は、化合物ＩＤ Ｎｏ ＃２８５～＃５５８からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。化合物を実施例セクションの「化合物及びデータ表」に示す（「オリゴ＿構造」のカラムを参照）。
【0054】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のコンジュゲート基を含んでもよく、すなわち、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートであってもよい。
【0055】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
【0056】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩である。
【0057】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと、リン酸緩衝生理食塩水などの薬学的に許容され得る溶媒とを含む、本発明のオリゴヌクレオチドの薬学的溶液を提供する。
【0058】
本発明は、凍結乾燥粉末の形態などの固体粉末形態の本発明のオリゴヌクレオチドを提供する。
【0059】
典型的には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、ＣＡＲＤ９標的核酸、例えば配列番号１、６、７、８、９、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４又は５６５に対して少なくとも９０％相補的であり、例えば完全に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドは、連続ヌクレオチド配列を形成する。
【0060】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３０ヌクレオチドまでの長さを有し、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１などのＣＡＲＤ９標的核酸、又はその中の標的部位、例えば配列番号６、７、８、９、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４若しくは５６５からなる群から選択される標的部位（標的配列）に少なくとも９０％相補的であり、例えば完全に相補的である。
【0061】
有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができ、例えば、ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡへのエクソン１１ ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡの包含を阻害又は減少させることができる。これにより、Δ１１ＣＡＲＤ９バリアント（本明細書では配列番号５として提供されるアミノ酸配列として示される）の発現がもたらされる。
【0062】
本発明は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡを発現している標的細胞において、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を有効量で前記細胞に投与することによって、哺乳動物ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、オリゴヌクレオチドの投与が、細胞におけるＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡの発現又は発現の増加をもたらす方法を提供する（例示のために配列番号４に示される）。細胞におけるＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡの発現は、ＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質（本明細書において配列番号５として提供されるアミノ酸配列として示される）の発現又は発現増強をもたらす。本明細書の他の箇所に記載されるように、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現は、未処理対照細胞と比較して増加し得る。
【0063】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物の投与は、ＣＡＲＤ９ ＷＴ ｍＲＮＡ（配列番号２）又はタンパク質（例示については配列番号３を参照）の発現の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物の投与は、ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡの選択的スプライスバリアントの比の変化、例えば、ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡと比較したＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡの発現比（すなわち、ＣＡＲＤ９エクソン１１配列を含むＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ）の増加をもたらす。
【0064】
したがって、ＣＡＲＤ９発現の調節は、ＣＡＲＤ９のスプライスバリアント転写物の比の変化、例えばＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ（例えば配列番号２によって示される）のレベルの減少及び／又はＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ（例えば配列番号４によって示される）のレベルの増加を指し得る。いくつかの実施形態では、エクソン１１を含むＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡのレベルに対するＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルの比は増加する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的細胞中に存在する場合、上記比を増加させることができる。
【0065】
ＣＡＲＤ９発現の調節はまた、スプライスバリアント転写物によってコードされるタンパク質の比の変化、例えば、ＷＴＣＡＲＤ９タンパク質（例えば配列番号３によって示される）のレベルの減少及び／又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質（例えば配列番号５によって示される）のレベルの増大を指し得る。いくつかの実施形態では、ＷＴＣＡＲＤ９タンパク質のレベルに対するＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質のレベルの比が増加する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的細胞中に存在する場合、上記比を増加させることができる。
【0066】
スプライス調節オリゴヌクレオチドは、典型的には、分解機構（ＲＮａｓｅＨ媒介阻害など）を介するのではなく、占有に基づく機構を介して作用する。しかしながら、スプライス調節は、例えば、非センス媒介性崩壊を介して、代替転写物の分解をもたらし得る。
【0067】
配列表
本出願と共に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表と明細書又は図面との間に不一致がある場合、明細書（図面を含む）に開示された情報は正しいと見なされる。標的核酸又は標的配列又は標的部位に関して、本明細書に開示される配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列に由来するＤＮＡ配列を指し、インビトロ又はインビボで細胞内の核酸の表現として提供され、例えばＲＮＡ分子であり得る（例えば、ＲＮＡ標的配列では、添付のＤＮＡ配列に示されるチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）が存在する）ことが理解されよう。配列番号６～９、１１～２８４、５５９～５６５などの標的核酸は、参照標的配列から転写されたＲＮＡ配列（配列番号１又はその天然バリアントなど）を含む。
ＣＡＲＤ９参照配列
本出願と共に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表と明細書又は図面との間に不一致がある場合、明細書（図面を含む）に開示された情報は正しいと見なされる。標的核酸又は標的配列又は標的部位に関して、本明細書に開示される配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列に由来するＤＮＡ配列を指し、インビトロ又はインビボで細胞内の核酸の表現として提供され、例えばＲＮＡ分子であり得る（例えば、ＲＮＡ標的配列では、添付のＤＮＡ配列に示されるチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）が存在する）ことが理解されよう。配列番号６～９、１１～２８４、５５９～５６５などの標的核酸は、参照標的配列から転写されたＲＮＡ配列（配列番号１又はその天然バリアントなど）を含む。
ＣＡＲＤ９参照配列
【表1】
【0068】
ヒトＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡの例示的なエクソン領域及びイントロン領域－配列番号１を参照して例示する
【表2】
【表3】
【0069】
したがって、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド８４６５～８５４１によって例示されるようなエクソン１１領域又はその少なくとも一部を欠く。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡにおいてエクソン１１全体が欠いており、したがって、いくつかの実施形態では、Δ１１ ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡは、エクソン１０及びエクソン１２にわたって形成された連続配列を有することを特徴とし得るいくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡは、エクソン１～１０、１２及び１３を含むが、エクソン１１を欠く。
【図面の簡単な説明】
【0070】
【図1】例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＣＡＲＤ９エクソン１１プレｍＲＮＡのスプライス調節。Ｘ軸は、配列番号１に対する各オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの位置を表す（位置）。Ｙ軸は、（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔ／ＣＡＲＤ９ＷＴＴ）／（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃ／ＣＡＲＤ９ＷＴＣ）として計算された応答を表し、式中、ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔ 及びＣＡＲＤ９ＷＴＴは、それぞれオリゴ処理細胞から測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ及びＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルであり、ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃ及びＣＡＲＤ９ＷＴＣは、それぞれ未処理（対照）細胞から測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ及びＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである（実施例参照）。明るい灰色のバーは、セリン及びアルギニンリッチのスプライシング因子（ＳＲＳＦ）に対する潜在的な結合部位を表す。潜在的な結合部位は以下の通りである：ＣＧＧＣＧＧＧ、ＡＧＣＣＣＧＡ、ＣＡＧＣＣＣＵ、ＣＡＣＣＡＧＧ、ＡＧＣＡＧＧＵ、ＣＣＣＡＵＧＵ、ＧＧＣＵＧＣＣＵ、ＧＵＵＵＵＧＣＧ、ＡＡＣＣＣＣＣＡ、ＵＧＣＡＧＣ、ＵＧＣＡＣＣ及びＵＧＣＧＧＡ。
【0071】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称されうる。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称されうる。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
【0072】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよい。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって約５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
本明細書で用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよい。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって約５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
【0073】
いくつかの実施形態では、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオシドを含まなくてもよい。
【0074】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることが有利であり得る。
【0075】
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドが連続ヌクレオチド配列を構成する。連続ヌクレオチド配列は、標的核酸又は標的配列に相補的であり、場合によっては完全に相補的である本発明のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列である。
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドが連続ヌクレオチド配列を構成する。連続ヌクレオチド配列は、標的核酸又は標的配列に相補的であり、場合によっては完全に相補的である本発明のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列である。
【0076】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域又はスプライス調節領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意には、さらなるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基（例えば、コンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、それ自体としてオリゴヌクレオチドより長くなることはできないことと、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列より短くなることはできないことと、が理解される。
【0077】
ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ぶことができる。
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ぶことができる。
【0078】
修飾ヌクレオシド
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの１つ以上は、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。本発明の化合物に使用され得る例示的な修飾ヌクレオシドには、ＬＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ及びモルホリノヌクレオシド類似体が含まれる。
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの１つ以上は、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。本発明の化合物に使用され得る例示的な修飾ヌクレオシドには、ＬＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ及びモルホリノヌクレオシド類似体が含まれる。
【0079】
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
【0080】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオアートである。
【0081】
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【0082】
ＥＰ ２ ７４２ １３５に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これはＥＰ ２ ７４２ １３５によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。
【0083】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
【0084】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【0085】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示されてもよく、ここで、各文字は、任意に等価機能の改変された核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【0086】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドであることが有利であり得る。
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドであることが有利であり得る。
【0087】
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
【0088】
用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【0089】
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
【0090】
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【0091】
ハイブリダイゼーション
本明細書で用いられる「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８、及びＨｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定し得る。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５ に記載の最近接モデを用いて、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載される適切に得られる熱力学的パラメータを使用し、数値的に推定し得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０から－６０ｋｃａｌ、例えば－１２から－４０、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、又は－１６から－２７ｋｃａｌ、例えば－１８から－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
本明細書で用いられる「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８、及びＨｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定し得る。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５ に記載の最近接モデを用いて、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載される適切に得られる熱力学的パラメータを使用し、数値的に推定し得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０から－６０ｋｃａｌ、例えば－１２から－４０、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、又は－１６から－２７ｋｃａｌ、例えば－１８から－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
【0092】
標的
本明細書で使用される「標的」という用語は、本明細書ではＣＡＲＤ９と呼ばれ、当該技術分野でＣＡＮＤＦ２；ｈＣＡＲＤ９としても知られている哺乳動物カスパーゼ動員ドメインファミリーメンバー９を指すために使用される。ＣＡＲＤ９、遺伝子ＩＤ番号６４１７０は、本明細書において配列番号１として例示するヒト染色体９：１３６３６３９５６．．１３６３７３６８１逆鎖（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２，ＮＣ＿０００００９．１２）にコードされている。ヒトＣＡＲＤ９タンパク質の例は、本明細書では配列番号３として提供される。本発明の文脈において、ＣＡＲＤ９エクソン１１によってコードされるアミノ酸配列を含むＣＡＲＤ９タンパク質は、ＷＴ ＣＡＲＤ９と呼ばれる。
本明細書で使用される「標的」という用語は、本明細書ではＣＡＲＤ９と呼ばれ、当該技術分野でＣＡＮＤＦ２；ｈＣＡＲＤ９としても知られている哺乳動物カスパーゼ動員ドメインファミリーメンバー９を指すために使用される。ＣＡＲＤ９、遺伝子ＩＤ番号６４１７０は、本明細書において配列番号１として例示するヒト染色体９：１３６３６３９５６．．１３６３７３６８１逆鎖（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２，ＮＣ＿０００００９．１２）にコードされている。ヒトＣＡＲＤ９タンパク質の例は、本明細書では配列番号３として提供される。本発明の文脈において、ＣＡＲＤ９エクソン１１によってコードされるアミノ酸配列を含むＣＡＲＤ９タンパク質は、ＷＴ ＣＡＲＤ９と呼ばれる。
【0093】
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＣＡＲＤ９、例えばヒトＣＡＲＤ９をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＣＡＲＤ９標的核酸と称され得る。インビトロ及びインビボ使用のために、好ましい標的核酸は、配列番号１によって例示されるＣＡＲＤ９をコードするプレｍＲＮＡ又はその天然に存在するバリアントである。
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＣＡＲＤ９、例えばヒトＣＡＲＤ９をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＣＡＲＤ９標的核酸と称され得る。インビトロ及びインビボ使用のために、好ましい標的核酸は、配列番号１によって例示されるＣＡＲＤ９をコードするプレｍＲＮＡ又はその天然に存在するバリアントである。
【0094】
ＷＴＣＡＲＤ９
ＷＴＣＡＲＤ９は、本明細書において、ＣＡＲＤ９のエクソン１１によってコードされるアミノ酸配列を含むＣＡＲＤ９タンパク質として定義される野生型ＣＡＲＤ９を指す。したがって、ＷＴＣＡＲＤ９タンパク質は、エクソン１１を含むＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質であるものとする。いくつかの実施形態では、ＷＴＣＡＲＤ９タンパク質は、エクソン１～１３（上記のエクソン表に提供される）を含むＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡによってコードされる。
ＷＴＣＡＲＤ９は、本明細書において、ＣＡＲＤ９のエクソン１１によってコードされるアミノ酸配列を含むＣＡＲＤ９タンパク質として定義される野生型ＣＡＲＤ９を指す。したがって、ＷＴＣＡＲＤ９タンパク質は、エクソン１１を含むＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質であるものとする。いくつかの実施形態では、ＷＴＣＡＲＤ９タンパク質は、エクソン１～１３（上記のエクソン表に提供される）を含むＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡによってコードされる。
【0095】
ＣＡＲＤ９Δ１１
ＣＡＲＤ９Δ１１は、ＣＡＲＤ９エクソン１１によってコードされる１つ又は複数のアミノ酸を欠くＣＡＲＤ９タンパク質（ＣＡＲＤ９Δ１１バリアント）であり、場合によっては、ＣＡＲＤ９エクソン１１によってコードされるアミノ酸の全部又は本質的に全部を欠く。例示のために、配列番号１のエクソン１１は、配列番号１０に示されるアミノ酸をコードする。Δ１１ ＣＡＲＤ９は、ＷＴＣＡＲＤ９ではない。Δ１１ＣＡＲＤ９及びＣＡＲＤ９Δ１１という用語は、本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質は、エクソン１１を欠くＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡによってコードされる。
ＣＡＲＤ９Δ１１は、ＣＡＲＤ９エクソン１１によってコードされる１つ又は複数のアミノ酸を欠くＣＡＲＤ９タンパク質（ＣＡＲＤ９Δ１１バリアント）であり、場合によっては、ＣＡＲＤ９エクソン１１によってコードされるアミノ酸の全部又は本質的に全部を欠く。例示のために、配列番号１のエクソン１１は、配列番号１０に示されるアミノ酸をコードする。Δ１１ ＣＡＲＤ９は、ＷＴＣＡＲＤ９ではない。Δ１１ＣＡＲＤ９及びＣＡＲＤ９Δ１１という用語は、本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質は、エクソン１１を欠くＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡによってコードされる。
【0096】
異なる転写産物（例えば、ＷＴＣＡＲＤ９対Δ１１ＣＡＲＤ９）の比の変化は、ｍＲＮＡレベル又は対応するタンパク質産物のレベルを比較することによって測定され得る。ＣＡＲＤ９に対して産生されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用して、ＣＡＲＤ９及びＣＡＲＤ９Δ１１のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る抗ＣＡＲＤ９抗体（例えば、Ａｂｃａｍｓから入手可能：ＣＡＲＤ９のＣ末端に対して産生されたＡｂ５５９５０若しくはＡｂ１３３５６０、又はＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＮｏｖｕｓによってそれぞれ販売されているポリクローナル抗体ＡＦ５２４８－ＳＰ及びＮＢＰ１－７６６７９）。例として、配列番号５に示されるＣＡＲＤ９Δ１１は、ウエスタンブロット分析システム、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ又は従来のウエスタンブロット分析を使用して、ＷＴ ＣＡＲＤ９（６２ｋＤａ、配列番号３）及び２つのアイソフォームよりもおよそ３ｋＤａ小さい質量を有する。
【0097】
標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表すことができる。
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表すことができる。
【0098】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６、７～９、１１～２８４、又は５５９～５６５からなる群から選択される標的配列に相補的である。
【0099】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0100】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0101】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号８に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0102】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号９に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0103】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５５９に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0104】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６０に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0105】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６１に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0106】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６２に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0107】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６３に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0108】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６４に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0109】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６５に示される配列を有する標的配列に相補的である。
【0110】
標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒトＣＡＲＤ９標的核酸を発現しているトランスジェニック動物細胞である。
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒトＣＡＲＤ９標的核酸を発現しているトランスジェニック動物細胞である。
【0111】
実験的評価のために、標的配列を含む核酸を発現する標的細胞が使用され得る。インビトロ評価のために、及びオリゴヌクレオチドがＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する能力をアッセイするために、例えば、標的細胞はＴＨＰ－１細胞であり得る。
【0112】
いくつかの実施形態では、標的細胞は骨髄細胞又は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態では、標的細胞は腸細胞である。
【0113】
典型的には、標的細胞は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡを発現し、それが細胞内で成熟ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡにプロセシングされて、ＣＡＲＤ９タンパク質（ＷＴＣＡＲＤ９）の発現をもたらす。有利には、本発明の化合物は、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節して、ＣＡＲＤ９エクソン１１（又はエクソン１１の一部）を欠く成熟ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡを産生し、ＣＡＲＤ９Δ１１バリアントの発現をもたらす。
【0114】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、又はその天然に存在するバリアントである。
【0115】
天然に存在するバリアント
用語「天然に存在するバリアント」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＣＡＲＤ９遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
用語「天然に存在するバリアント」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＣＡＲＤ９遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
【0116】
いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、配列番号１などの哺乳動物ＣＡＲＤ９標的核酸に対して少なくとも９５％、又はいくつかの実施形態では少なくとも９８％、又はいくつかの実施形態では少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＣＡＲＤ９標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。
【0117】
ＷＴＣＡＲＤ９の発現の阻害
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的細胞に存在する場合、ＷＴＣＡＲＤ９の発現を阻害する、すなわち減少させる。本明細書で使用される「発現の阻害」という用語は、標的細胞においてＷＴＣＡＲＤ９を阻害する、すなわちその量又は活性を減少させるオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。いくつかの実施形態では、量又は活性の減少は、対照細胞の減少と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％である。活性の阻害は、ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＷＴＣＡＲＤ９のレベル若しくは活性を測定することによって、測定することができる。したがって、発現の阻害をインビトロ又はインビボで決定することができる。スプライス調節は、細胞におけるＷＴＣＡＲＤ９の発現の阻害をもたらし得ることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的細胞に存在する場合、ＷＴＣＡＲＤ９の発現を阻害する、すなわち減少させる。本明細書で使用される「発現の阻害」という用語は、標的細胞においてＷＴＣＡＲＤ９を阻害する、すなわちその量又は活性を減少させるオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。いくつかの実施形態では、量又は活性の減少は、対照細胞の減少と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％である。活性の阻害は、ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＷＴＣＡＲＤ９のレベル若しくは活性を測定することによって、測定することができる。したがって、発現の阻害をインビトロ又はインビボで決定することができる。スプライス調節は、細胞におけるＷＴＣＡＲＤ９の発現の阻害をもたらし得ることが理解されよう。
【0118】
典型的には、発現の阻害は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に投与した後、コードされたタンパク質産物中に存在する標的核酸のレベル又はコードされたタンパク質産物の活性を決定し、そのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与せずに標的細胞から得られた参照レベル（対照実験）又は既知の参照レベル（例えば、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前の発現レベル、又は所定の若しくはその他の公知の発現レベル）と比較することによって決定される。
【0119】
ＣＡＲＤ９Δ１１／ＣＡＲＤ９Δ１１エンハンサーの発現増強
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、標的細胞に存在する場合、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡにおけるエクソン１１のスプライシングの調節を介して、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の発現を増強し得る。エクソン１１スプライシングの調節は、オリゴ処理細胞及び未処理対照細胞におけるＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量を測定することによって決定することができる。したがって、標的細胞中のＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量は、対照細胞中の量と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも１００％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも１５０％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも２００％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも２５０％である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、標的細胞に存在する場合、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡにおけるエクソン１１のスプライシングの調節を介して、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の発現を増強し得る。エクソン１１スプライシングの調節は、オリゴ処理細胞及び未処理対照細胞におけるＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量を測定することによって決定することができる。したがって、標的細胞中のＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量は、対照細胞中の量と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも１００％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも１５０％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも２００％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量の増加は、対照細胞の量と比較して少なくとも２５０％である。
【0120】
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、Δ１１ＣＡＲＤ９エンハンサー、すなわち、有効量のオリゴヌクレオチドを標的細胞に投与した後にΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現増加をもたらすオリゴヌクレオチドである。
【0121】
Δ１１ＣＡＲＤ９エンハンサーは、対照細胞と比較してΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ若しくはΔ１１ ＣＡＲＤ９タンパク質の発現増加を測定することによって、又はｍＲＮＡ若しくはタンパク質レベルでＷＴＣＡＲＤ９と比較してΔ１１ＣＡＲＤ９の発現増加比を測定することによって同定され得る。実施例に示すように、これは、Δ１１ＣＡＲＤ９エンハンサーで処理した細胞におけるΔ１１ＣＡＲＤ９／ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡの発現比を未処理細胞におけるΔ１１ＣＡＲＤ９／ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡの発現比と比較することによって決定することができる（未処理対照応答＝１）。比較は、処理細胞における比と未処理細胞の比との間の比を計算することによって行われ得る。例えば、この比は、以下のように計算することができる。
（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔ／ＣＡＲＤ９ＷＴＴ）／（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃ／ＣＡＲＤ９ＷＴＣ）
式中、
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＴは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＣは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔ／ＣＡＲＤ９ＷＴＴ）／（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃ／ＣＡＲＤ９ＷＴＣ）
式中、
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＴは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＣは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
【0122】
したがって、応答＞１は、有効なΔ１１ＣＡＲＤ９エンハンサーを示す。有利には、Δ１１ＣＡＲＤ９エンハンサーは、約１．５超、又は約２超、又は約２．５超の応答を誘発することができる。
【0123】
例えば、Δ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の増加を、ＴＨＰ－１細胞において決定することができる（例えば、実施例に示される）。したがって、ＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の増加があるかどうかを評価するために、オリゴ処理細胞及び未処理対照細胞を実施例のセクションに記載されるように培養することができる。
【0124】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ｉ）標的細胞中のＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡ又はＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の量を増加させること、及びｉｉ）標的細胞中のＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ及びＷＴＣＡＲＤ９タンパク質の量を減少させることの両方が可能である。
【0125】
対照細胞
適切な対照細胞の選択は、実験設定の日常的な部分である。例えば、対照細胞は、標的細胞に対応するが、本発明のオリゴヌクレオチドを含まない細胞、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞であり得る。例えば、対照細胞は、未処理のＴＨＰ－１細胞であり得る。対照細胞は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む標的細胞と等しい条件下で培養されることを理解されたい。
適切な対照細胞の選択は、実験設定の日常的な部分である。例えば、対照細胞は、標的細胞に対応するが、本発明のオリゴヌクレオチドを含まない細胞、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞であり得る。例えば、対照細胞は、未処理のＴＨＰ－１細胞であり得る。対照細胞は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む標的細胞と等しい条件下で培養されることを理解されたい。
【0126】
スプライス調節
スプライス調節を使用して、潜在的スプライシングを修正し、選択的スプライシングを調節し、オープンリーディングフレームを回復させ、タンパク質ノックダウンを誘導することができる。本発明との関連において、好ましい調節は、選択的スプライシングを調節してＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡを生成し、それによってＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の発現を増強することである。
スプライス調節を使用して、潜在的スプライシングを修正し、選択的スプライシングを調節し、オープンリーディングフレームを回復させ、タンパク質ノックダウンを誘導することができる。本発明との関連において、好ましい調節は、選択的スプライシングを調節してＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡを生成し、それによってＣＡＲＤ９Δ１１タンパク質の発現を増強することである。
【0127】
スプライス調節は、プレｍＲＮＡの異なるスプライス産物の定量的評価を可能にするＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）によってアッセイすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン１１を含む成熟ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ（ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ）のレベルを低下させ、エクソン１１を欠く成熟ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ（Δ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡ）のレベルの発現を増加させるように、ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する。
【0128】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、これは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２ｏＣ、場合によっては＋１．５～＋１０ｏＣ、他の場合では＋３～＋８ｏＣの融解温度の上昇をもたらし得る。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、これは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２ｏＣ、場合によっては＋１．５～＋１０ｏＣ、他の場合では＋３～＋８ｏＣの融解温度の上昇をもたらし得る。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
【0129】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して、糖部分が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して、糖部分が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【0130】
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。
【0131】
そのような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）又は二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にビラジカル架橋を有する）、又は典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。
【0132】
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。
【0133】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
【0134】
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、高められた結合親和性及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
【化1】
【0135】
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【0136】
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定されうる。
「ＬＮＡヌクレオシド」は、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定されうる。
【0137】
非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６、国際公開第００／６６６０４、国際公開第９８／０３９３５２、国際公開第２００４／０４６１６０、国際公開第００／０４７５９９、国際公開第２００７／１３４１８１、国際公開第２０１０／０７７５７８、国際公開第２０１０／０３６６９８、国際公開第２００７／０９００７１、国際公開第２００９／００６４７８、国際公開第２０１１／１５６２０２、国際公開第２００８／１５４４０１、国際公開第２００９／０６７６４７、国際公開第２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。
【0138】
さらなる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。
【化2】
【0139】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。
【0140】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡはβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
【0141】
モルホリノオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、モルホリノヌクレオシドを含むか、又はそれからなる（すなわち、モルホリノオリゴマーであり、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）として）。スプライス調節モルホリノオリゴヌクレオチドは、臨床使用が承認されており、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される、ＤＭＤのフレームシフト変異を標的とする３０ｎｔモルホリノオリゴヌクレオチドである、エテプリルセンを参照のこと。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の４つの連続するモルホリノヌクレオチドの説明に示されるように、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環など、リボースではなく６員のモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、モルホリノヌクレオシドを含むか、又はそれからなる（すなわち、モルホリノオリゴマーであり、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）として）。スプライス調節モルホリノオリゴヌクレオチドは、臨床使用が承認されており、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される、ＤＭＤのフレームシフト変異を標的とする３０ｎｔモルホリノオリゴヌクレオチドである、エテプリルセンを参照のこと。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の４つの連続するモルホリノヌクレオチドの説明に示されるように、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環など、リボースではなく６員のモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。
【化3】
【0142】
いくつかの実施形態では、本発明のモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、２０～４０モルホリノヌクレオチド長、例えば、２５～３５モルホリノヌクレオチド長であり得る。
【0143】
ＲＮａｓｅ Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮアーゼＨを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、少なくとも１０％、又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド、典型的には高親和性２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２－Ｏ－ＭＯＥ及び／又はＬＮＡを含む領域が５’及び３’に隣接するＤＮＡヌクレオシド（典型的には少なくとも５又は６個の連続するＤＮＡヌクレオシド）の領域を含むギャップマーオリゴヌクレオチドと同様に、ＲＮａｓｅＨを効果的に動員することが公知である。スプライシングの効果的な調節のために、プレｍＲＮＡの分解は望ましくなく、したがって、標的のＲＮａｓｅＨ分解を回避することが好ましい。したがって、本発明のスプライス調節オリゴヌクレオチドは、好ましくはギャップマーオリゴヌクレオチドではない。ＲＮａｓｅＨ動員は、オリゴヌクレオチド中の連続するＤＮＡヌクレオチドの数を制限することによって回避され得、したがって、効果的なスプライス調節のために、ミックスマー（ｍｉｍｘｅｒ）及びトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）設計が使用され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮアーゼＨを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、少なくとも１０％、又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド、典型的には高親和性２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２－Ｏ－ＭＯＥ及び／又はＬＮＡを含む領域が５’及び３’に隣接するＤＮＡヌクレオシド（典型的には少なくとも５又は６個の連続するＤＮＡヌクレオシド）の領域を含むギャップマーオリゴヌクレオチドと同様に、ＲＮａｓｅＨを効果的に動員することが公知である。スプライシングの効果的な調節のために、プレｍＲＮＡの分解は望ましくなく、したがって、標的のＲＮａｓｅＨ分解を回避することが好ましい。したがって、本発明のスプライス調節オリゴヌクレオチドは、好ましくはギャップマーオリゴヌクレオチドではない。ＲＮａｓｅＨ動員は、オリゴヌクレオチド中の連続するＤＮＡヌクレオチドの数を制限することによって回避され得、したがって、効果的なスプライス調節のために、ミックスマー（ｍｉｍｘｅｒ）及びトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）設計が使用され得る。
【0144】
ミックスマー（Ｍｉｘｍｅｒ）及びトータルマー（Ｔｏｔａｌｍｅｒ）
スプライス調節のために、ＲＮＡａｓｅＨを動員しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することがしばしば有利である。ＲＮａｓｅＨ活性はＤＮＡヌクレオチドの連続配列を必要とするので、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、３個を超える又は４個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって達成され得る。これは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドと、１、２若しくは３個のＤＮＡヌクレオシドなどのＤＮＡヌクレオシドの短い領域とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオシド領域をミックスマー設計で使用することによって達成され得る。ミックスマーは、本明細書において、ヌクレオシドが１個のＬＮＡヌクレオシドと１個のＤＮＡヌクレオシドとの間で交互である２個毎の設計（例えば５’及び３’末端がＬＮＡヌクレオシドであるＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＬ）、並びに、３個毎にヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドであるＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬなどの３個毎の設計によって例示される。
スプライス調節のために、ＲＮＡａｓｅＨを動員しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することがしばしば有利である。ＲＮａｓｅＨ活性はＤＮＡヌクレオチドの連続配列を必要とするので、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、３個を超える又は４個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって達成され得る。これは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドと、１、２若しくは３個のＤＮＡヌクレオシドなどのＤＮＡヌクレオシドの短い領域とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオシド領域をミックスマー設計で使用することによって達成され得る。ミックスマーは、本明細書において、ヌクレオシドが１個のＬＮＡヌクレオシドと１個のＤＮＡヌクレオシドとの間で交互である２個毎の設計（例えば５’及び３’末端がＬＮＡヌクレオシドであるＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＬ）、並びに、３個毎にヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドであるＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬなどの３個毎の設計によって例示される。
【0145】
トータルマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列であり、例えば、治療的使用のための効果的なスプライス調節因子であると報告されている完全ＭＯＥホスホロチオエート、例えばＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭ（Ｍ＝２’－Ｏ－ＭＯＥ）などの２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドのみを含んでもよい。あるいは、ミックスマーは、ＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬ（Ｌ＝ＬＮＡ及びＭ＝２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシド）などの修飾ヌクレオシドの混合物を含み得る。
【0146】
有利には、ミックスマー及びトータルマー中のヌクレオシド間ヌクレオシドはホスホロチオエートであってもよく、又はミックスマー中のヌクレオシド結合の大部分はホスホロチオエートであってもよい。ミックスマー及びトータルマーは、例として、ホスホジエステル又はホスホロジチオエートなどの他のヌクレオシド間結合を含み得る。
【0147】
オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏａｌｍｅｒ）、並びにさらに５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか、又はそれからなり得る。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このような更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏａｌｍｅｒ）、並びにさらに５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか、又はそれからなり得る。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このような更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。
【0148】
領域Ｄ’又はＤ’’の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔｏａｌｍｅｒ）をコンジュゲート部分又は別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連結に用いられる場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、若しくは合成又は製造を容易にするために使用されてもよい。
【0149】
領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、若しくはこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ’又はＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
【0150】
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）を構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
【0151】
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’又はＤ’’とミックスマー又はトータルマー領域との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【0152】
コンジュゲート
本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
【0153】
オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成については、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１及びＭａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３の包括的なレビューでも報告されている。
【0154】
いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）又はそれらの組合せからなる群から選択される。
【0155】
リンカー
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
【0156】
本発明の幾つかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含みうる。
【0157】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化又は還元条件、若しくは薬剤などの化学条件、並びに哺乳動物の細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも２つの連続するホスホジエステル結合を含むＤＮＡヌクレオシドなどの１～５個のヌクレオシドを含む。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号により詳細に記載されている。
【0158】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、鎖構造、又はエチレングリコール、アミノ酸単位若しくはアミノアルキル基などの繰返し単位のオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
【0159】
処置
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の処置、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の処置、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。
【発明を実施するための形態】
【0160】
発明の詳細な説明
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、哺乳動物ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングを調節するための１０～４０、例えば１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号１に対して少なくとも９０％の相補性、場合によっては１００％の相補性を有する少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、哺乳動物ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングを調節するための１０～４０、例えば１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号１に対して少なくとも９０％の相補性、場合によっては１００％の相補性を有する少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0161】
本発明は、哺乳動物ＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングを調節するための１０～４０、例えば１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号２に対して少なくとも９０％の相補性、場合によっては１００％の相補性を有する少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0162】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0163】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0164】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号８に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0165】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号９に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0166】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５５９に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0167】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６０に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0168】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６１に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0169】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６２に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0170】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６３に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0171】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６４に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0172】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６５に相補的であり、場合によっては完全に相補的である。
【0173】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号１１～２８４からなる群から選択される配列に対して相補的である。
【0174】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＡＲＤ９Δ１１の発現を増強することができる。
【0175】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＴＣＡＲＤ９の発現を低下させることができる。
【0176】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）であるか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）を含む。
【0177】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴヌクレオチドである。
【0178】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－ＭＯＥオリゴヌクレオチドであり、すなわち、１つ以上の２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。
【0179】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドであり、すなわち、１つ以上のＬＮＡヌクレオシドを含む。
【0180】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、１０～２５又は１０～２０ヌクレオチド長である。
【0181】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、ＣＧＧＣＧＧＧ、ＡＧＣＣＣＧＡ、ＣＡＧＣＣＣＵ、ＣＡＣＣＡＧＧ、ＡＧＣＡＧＧＵ、ＣＣＣＡＵＧＵ、ＧＧＣＵＧＣＣＵ、ＧＵＵＵＵＧＣＧ、ＡＡＣＣＣＣＣＡ、ＵＧＣＡＧＣ、ＵＧＣＡＣＣ及びＵＧＣＧＧＡからなる群から選択される配列に相補的である、例えば完全に相補的である１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む。これらの６～９ｎｔ配列が配列番号６（配列番号６のヌクレオチド２００～２８０）の有利な領域（標的部位配列）内に存在し、これらの配列のいくつかがこの標的部位配列内で重複することが理解されよう。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド２００～２８０に相補的、例えば完全に相補的である、１０～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド２００～２８０に相補的、例えば完全に相補的である、１２～２５ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み得る。連続ヌクレオチド配列の領域は、ＡＧＣＣＣＧＡ、ＣＡＧＣＣＣＵ、ＣＡＣＣＡＧＧ、ＡＧＣＡＧＧＵ、ＣＣＣＡＵＧＵ、ＧＧＣＵＧＣＣＵ、ＧＵＵＵＵＧＣＧ、ＡＡＣＣＣＣＣＡ、ＵＧＣＡＧＣ、ＵＧＣＡＣＣ及びＵＧＣＧＧＡからなる群から選択される配列の１つを超える相補体を含み得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＧＣＣＣＧＡ、ＣＡＧＣＣＣＵ、ＣＡＣＣＡＧＧ、ＡＧＣＡＧＧＵ、ＣＣＣＡＵＧＵ、ＧＧＣＵＧＣＣＵ、ＧＵＵＵＵＧＣＧ、ＡＡＣＣＣＣＣＡ、ＵＧＣＡＧＣ、ＵＧＣＡＣＣ及びＵＧＣＧＧＡからなる群から選択される配列の少なくとも２個又は少なくとも３個の完全相補体を含み得る。
【0182】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号２８５～５５８から選択される配列からなるか、又はそれを含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチド、例えば、化合物ＩＤ ＮＯ ＃２８５＿１～＃５５８＿１からなる群から選択される化合物からなるか、又はそれを含む（実施例の節の表を参照のこと）。
【0184】
いくつかの有利な実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬的に許容され得る塩、例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩の形態である。
【0185】
本発明はさらに、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。
【0186】
本発明はさらに、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲートを提供する。
【0187】
本発明はさらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート、並びに、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
【0188】
本発明は、ＣＡＲＤ９を発現している細胞（例えば、標的細胞）におけるＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は医薬組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む方法を提供する。本発明は、インビトロ方法又はインビボ方法であり得る。
【0189】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、ＣＡＲＤ９Δ１１バリアントの発現増強をもたらす。
【0190】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、ＷＴＣＡＲＤ９の発現低下をもたらす。
【0191】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、ＷＴＣＡＲＤ９の発現低下及びＣＡＲＤ９Δ１１バリアントの発現増強をもたらす。
【0192】
いくつかの実施形態では、標的細胞などの細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。
【0193】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９標的はヒトＣＡＲＤ９である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ９標的核酸は、配列番号１として例示されるヒトＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡである。
【0194】
本発明は、炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に、治療有効量又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患を処置又は予防する方法を提供する。
【0195】
本発明は、医薬として使用するための本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は医薬組成物を提供する。
【0196】
本発明は、炎症性腸疾患などの炎症性疾患の処置に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は医薬組成物を提供する。
【0197】
本発明は、炎症性腸疾患などの炎症性疾患を処置又は予防するための医薬の調製に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は医薬組成物の使用を提供する。
【0198】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域と、少なくとも９０％相補的であり、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。
【0199】
本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である場合、又はいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合に有利である。
【0200】
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸に対する結合親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。
【0201】
修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。
【0202】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。いくつかの例では、高親和性修飾ヌクレオシドが使用される。
【0203】
好適な修飾は、「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」、及びロックド核酸（ＬＮＡ）の「定義」セクションに記載されている。
【0204】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド（複数可）の１つ又は複数は、ロックド核酸（ＬＮＡ）であってもよい。
【0205】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好適なヌクレオシド間修飾は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドでは、連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列中のヌクレオチド間結合のすべてがホスホロチオエート結合である。
【0206】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、インビボ又はインビトロのいずれかで、ＣＡＲＤ９標的を発現している細胞（標的細胞）におけるＷＴＣＡＲＤ９標的の発現を阻害することができる。
【0207】
本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合に、任意に、ミスマッチを除いて、及び任意に、コンジュゲートなどの任意の官能基にオリゴヌクレオチドを連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ’’）を除いて、配列番号１などのＣＡＲＤ９標的核酸又はその標的配列（例えば、配列番号６、７、８、９、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４又は５６５からなる群から選択される配列）若しくは標的部位領域（例えば、配列番号１０～２８５からなる群から選択される配列）に相補的である。
【0208】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、配列番号２８５～５５８又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドから選択される配列に示される配列モチーフを含む。
【0209】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、配列番号２８５～５５８又はその少なくとも１２個の連続ヌクレオチドから選択される配列に示される配列モチーフを含む。
【0210】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、配列番号２８５～５５８又はその少なくとも１４個の連続ヌクレオチドから選択される配列に示される配列モチーフを含む。
【0211】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、配列番号２９０、２９４、２９５、２９７、３００、３０１、３０６、３０７、３０８、３１２、３１７、３１８、３１９、３２２、３２９、３３３、３３７、３４１、３５２、３５３、３５８、３７３、３７４、３７８、３７９、３８０、３８７、３９３、３９４、３９６、３９９、４００、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１１、４１３、４１３、４１４、４１４、４１４、４１５、４１５、４１５、４１６、４１７、４１７、４１７、４１８、４２２、４２４、４２５、４２６、４２９、４３０、４３１、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４７１、４７２、４９０、５１９、５３０、５３３、５４１、５４２、５４６、及び５４８又はその少なくとも１２個の連続ヌクレオチドから選択される配列に示される配列モチーフを含む。
【0212】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、配列番号３１９、３２２、３９６、４０５、４０８、４１３、４１４、４１４、４２９、４３１、４４０、４４２、４４６、４４８、４４９、４５０、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５９、４６０、及び４６１又はその少なくとも１２個の連続ヌクレオチドから選択される配列に示される配列モチーフを含む。
【0213】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、配列番号４１３、４１４、４４８、４４９、４５０、４５４、４５６、４５９、及び４６０又はその少なくとも１２個の連続ヌクレオチドから選択される配列に示される配列モチーフを含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２９０＿１、２９４＿１、２９５＿１、２９７＿１、３００＿１、３０１＿１、３０６＿１、３０７＿１、３０８＿１、３１２＿１、３１７＿１、３１８＿１、３１９＿１、３２２＿１、３２９＿１、３３３＿１、３３７＿１、３４１＿１、３５２＿１、３５３＿１、３５８＿１、３７３＿１、３７４＿１、３７８＿１、３７９＿１、３８０＿１、３８７＿１、３９３＿１、３９４＿１、３９６＿１、３９９＿１、４００＿１、４０５＿１、４０６＿１、４０７＿１、４０８＿１、４０９＿１、４１１＿１、４１３＿１、４１３＿２、４１４＿１、４１４＿２、４１４＿３、４１５＿１、４１５＿２、４１５＿３、４１６＿１、４１７＿１、４１７＿２、４１７＿３、４１８＿１、４２２＿１、４２４＿１、４２５＿１、４２６＿１、４２９＿１、４３０＿１、４３１＿１、４３３＿１、４３４＿１、４３５＿１、４３６＿１、４３９＿１、４４０＿１、４４１＿１、４４２＿１、４４３＿１、４４６＿１、４４７＿１、４４８＿１、４４９＿１、４５０＿１、４５２＿１、４５３＿１、４５４＿１、４５５＿１、４５６＿１、４５８＿１、４５９＿１、４６０＿１、４６１＿１、４６２＿１、４６４＿１、４７１＿１、４７２＿１、４９０＿１、５１９＿１、５３０＿１、５３３＿１、５４１＿１、５４２＿１、５４６＿１、及び５４８＿１からなる群から選択される。
【0215】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、３１９＿１、３２２＿１、３９６＿１、４０５＿１、４０８＿１、４１３＿２、４１４＿２、４１４＿３、４２９＿１、４３１＿１、４４０＿１、４４２＿１、４４６＿１、４４８＿１、４４９＿１、４５０＿１、４５２＿１、４５３＿１、４５４＿１、４５５＿１、４５６＿１、４５９＿１、４６０＿１、及び４６１＿１からなる群から選択される。
【0216】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、４１３＿２、４１４＿２、４４８＿１、４４９＿１、４５０＿１、４５４＿１、４５６＿１、４５９＿１、及び４６０＿１からなる群から選択される。
【0217】
薬学的に許容され得る塩
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩、例えば薬学的に許容され得るナトリウム塩又はカリウム塩を提供する。
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩、例えば薬学的に許容され得るナトリウム塩又はカリウム塩を提供する。
【0218】
製造方法
さらなる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１５４巻第２８７～３１３頁を参照のこと）。さらなる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
さらなる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１５４巻第２８７～３１３頁を参照のこと）。さらなる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
【0219】
医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される。
さらなる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される。
【0220】
用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防法のための研究試薬として利用され得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防法のための研究試薬として利用され得る。
【0221】
研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＣＡＲＤ９タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。
【0222】
本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
【0223】
本発明は、ＣＡＲＤ９を発現している標的細胞におけるＣＡＲＤ９発現の調節（例えばスプライス調節）のためのインビボ又はインビトロ方法を提供し、この方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを前記細胞に有効量で投与することを含む。
【0224】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物又はインビボ細胞であってよい。いくつかの実施形態では、標的細胞は骨髄細胞又は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腸組織中に存在するか、腸組織から単離されるか、又は腸組織に由来する。
【0225】
診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は同様の技術により、細胞及び組織におけるＣＡＲＤ９発現を検出及び定量することができる。
【0226】
治療のために、オリゴヌクレオチドは、ＣＡＲＤ９の発現を調節することによって処置することができる病気又は疾患を有することが疑われる動物又はヒトに投与することができる。そのような疾患又は障害には、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病が含まれる。
【0227】
本発明は、疾患又は障害、例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、膵炎、ＩｇＡ腎症、原発性硬化性胆管炎、心血管疾患、がん及び糖尿病からなる群から選択される疾患又は障害に罹患しているか又は罹患しやすい対象に、治療有効量又は予防有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を投与することを含む、疾患又は障害を処置又は予防する方法を提供する。
【0228】
本発明の方法は、好ましくは、ＣＡＲＤ９の異常なレベル及び／又は活性によって引き起こされる病気の処置又は予防法のために使用される。
【0229】
いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性疾患である。
【0230】
いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性腸疾患である。例えば、炎症性腸疾患はクローン病である。あるいは、炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎である。
【0231】
投与
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射若しくは注入を含む非経口経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射若しくは注入を含む非経口経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
【0232】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、経口投与又は直腸投与される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患の処置のために経口投与又は直腸投与される。
【0233】
併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療薬との併用処置で使用するためのものである。治療薬は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療薬であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療薬との併用処置で使用するためのものである。治療薬は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療薬であり得る。
【実施例】
【0234】
実施例１
オリゴヌクレオチド＃２８５＿１～＃５５８＿１を合成し、ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡと比較してΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡの比率を高めるためにＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するそれらの能力を評価した。具体的には、オリゴヌクレオチドが、未処理細胞におけるΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡのレベルと比較してΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡのレベルを増強するかどうかを評価した。
オリゴヌクレオチド＃２８５＿１～＃５５８＿１を合成し、ＷＴＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡと比較してΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡの比率を高めるためにＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するそれらの能力を評価した。具体的には、オリゴヌクレオチドが、未処理細胞におけるΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡのレベルと比較してΔ１１ＣＡＲＤ９ ｍＲＮＡのレベルを増強するかどうかを評価した。
【0235】
材料及び方法
細胞：５０．０００個のＴＨＰ－１細胞を９６ウェルプレートに播種し、オリゴ（表１）を添加してジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）取り込みを得た。培地中の最終オリゴ濃度は２５μＭであった。細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２で７日間インキュベートした。タイリングされたミックスマーによってカバーされた標的配列は、配列番号６を標的とするオリゴである。対照として、未処理のＴＨＰ－１細胞を使用した。
細胞：５０．０００個のＴＨＰ－１細胞を９６ウェルプレートに播種し、オリゴ（表１）を添加してジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）取り込みを得た。培地中の最終オリゴ濃度は２５μＭであった。細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２で７日間インキュベートした。タイリングされたミックスマーによってカバーされた標的配列は、配列番号６を標的とするオリゴである。対照として、未処理のＴＨＰ－１細胞を使用した。
【0236】
液滴デジタルＰＣＲを、以下のプライマー及びプローブを使用してＢｉｏＲａｄｓ ＱＸ２００液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲＴＭ）システムで行った：
ＲＮＡ投入のためのローディング対照：
Ｈｓ．ＰＴ．５８ｖ．４５６２１５７２－ＨＴＲＰ１のエクソン８～９を標的とする予め設計されたＨＥＸに基づくアッセイ。
ＲＮＡ投入のためのローディング対照：
Ｈｓ．ＰＴ．５８ｖ．４５６２１５７２－ＨＴＲＰ１のエクソン８～９を標的とする予め設計されたＨＥＸに基づくアッセイ。
【0237】
ＣＡＲＤ９Δ１１転写について：
Ｈｓ．ＣＡＲＤ９Δ１１プローブ ／５６－ＦＡＭ／ＣＴＣＡＧＡＣＡＡ／ＺＥＮ／ＡＧＧＡＣＧＣＡＧＧＣＣＴＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／
プライマー１ ＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＣ
プライマー２ ＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧ
Ｈｓ．ＣＡＲＤ９Δ１１プローブ ／５６－ＦＡＭ／ＣＴＣＡＧＡＣＡＡ／ＺＥＮ／ＡＧＧＡＣＧＣＡＧＧＣＣＴＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／
プライマー１ ＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＣ
プライマー２ ＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧ
【0238】
応答は以下の式によって計算した：
（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔ／ＣＡＲＤ９ＷＴＴ）／（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃ／ＣＡＲＤ９ＷＴＣ）
式中、
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＴは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＣは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔ／ＣＡＲＤ９ＷＴＴ）／（ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃ／ＣＡＲＤ９ＷＴＣ）
式中、
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｔは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＴは、オリゴ処理細胞において測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９Δ１１Ｃは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡのレベルである
● ＣＡＲＤ９ＷＴＣは、未処理細胞（対照）で測定されたＣＡＲＤ９ＷＴ ｍＲＮＡのレベルである
【0239】
応答を図１に示す（濃い灰色のバーを参照）。原則として、この応答は、未処理対照と比較したＣＡＲＤ９Δ１１ ｍＲＮＡの割合の増加を反映している。したがって、応答２は、未処理対照細胞と比較して２倍のＣＡＲＤ９ｄ１１ ｍＲＮＡが処理細胞に存在することを示し、応答３は未処理対照でのレベルの３倍である。言い換えれば、応答は、未処理細胞と比較した、オリゴ処理細胞のＣＡＲＤ９Δ１１スキップの増加を指す（ＴＨＰ－１細胞では、オリゴ処理なしで見られるいくつかのＣＡＲＤ９Δ１１事象がある）。
【0240】
化合物及びデータ表
オリゴヌクレオチド中の核酸塩基のモチーフを配列番号２８５～５５８として示す。化合物は、オリゴヌクレオチド構造（５’－３’）を有する化合物ＩＤ番号（＃）として命名され、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを指定し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを指定し、大文字Ｃは５－メチルシトシンβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを指定し、小文字ｃの前の上付き文字ｍは５－メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表し（例えば、配列番号２９４を参照）、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
オリゴヌクレオチド中の核酸塩基のモチーフを配列番号２８５～５５８として示す。化合物は、オリゴヌクレオチド構造（５’－３’）を有する化合物ＩＤ番号（＃）として命名され、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを指定し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを指定し、大文字Ｃは５－メチルシトシンβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを指定し、小文字ｃの前の上付き文字ｍは５－メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表し（例えば、配列番号２９４を参照）、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【表4-6】
【表4-7】
【表4-8】
【表4-9】
【0241】
データは、図１に例示されるように、驚くべきことに、エクソン１１配列内を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、例えば、隣接するイントロン配列又はイントロン／エクソン境界を標的とする場合と比較して、Δ１１ＣＡＲＤ９バリアントの産生を増強するためにＣＡＲＤ９プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するのに特に効果的であることを例示する。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】