(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-20
(54)【発明の名称】連続細胞培養による生細胞を適応進化させる方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20230613BHJP
C12M 3/02 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/14 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/16 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20230613BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20230613BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20230613BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20230613BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 D
C12M3/02
C12N1/14 B
C12N1/16 A
C12N1/20 A
C12N5/04
C12N5/071
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022571761
(86)(22)【出願日】2021-05-19
(85)【翻訳文提出日】2023-01-19
(86)【国際出願番号】 EP2021063352
(87)【国際公開番号】W WO2021234033
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】2005430
(32)【優先日】2020-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522454264
【氏名又は名称】アルター
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＴＡＲ
(74)【代理人】
【識別番号】100108143
【弁理士】
【氏名又は名称】嶋崎 英一郎
(72)【発明者】
【氏名】マルリエール，フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】パトルイ，ジュリアン
(72)【発明者】
【氏名】トランカール，シモン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA04
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4B065CA51
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生細胞の連続培養による、ヒト胚性幹細胞を除く生細胞を適応進化させる方法であって、ｎ個の培養容器（ＲＣｉ）が使用され、ｉが１～ｎの範囲であり、ｎ≧２であり、前記方法が、ａ）少なくとも１つの液体培地と生細胞を前記ｎ個の培養容器のそれぞれに導入する工程、
ｂ）前記ｎ個の培養容器のそれぞれにおいて、所与の選択的状況に基づいて、事前に規定された培養パラメータを使用して、前記ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、決定された成長段階に到達するまで前記生細胞を培養し、前記ｎ個の培養容器のそれぞれにおいて、前記液体培地中の生細胞の懸濁液を得る工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）からの生細胞の前記懸濁液の少なくとも一部を混ぜ合わせて、生細胞の混合懸濁液を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた生細胞の前記混合懸濁液を均質化して、混合生細胞の均質化懸濁液を得る工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた混合生細胞の前記均質化懸濁液の少なくとも一部を、少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）に分配する工程、
ｆ）工程ｂ）～ｅ）を繰り返す工程、
ｇ）前記ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、所望の表現型を獲得した生細胞を数サイクル培養した後に回収する工程、
を含むことを特徴とする、生細胞を適応進化させる方法。
【請求項2】
生細胞が、ヒト、動物、又は植物の真核細胞又は原核細胞から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程ｂ）の前記選択的状況が、ケモスタット、タービドスタット、培地スワップ、及び反復バッチから選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
工程ｂ）の前記事前に規定された培養パラメータが、温度、ｐＨ、細胞密度、培地組成、気体組成、特定の波長の電磁波への曝露、変異原性物質への曝露、又はそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
工程ｂ）で得られた少なくとも２つの培養容器（Ｒｉ）からの生細胞の前記懸濁液の少なくとも一部を混ぜ合わせることからなる工程ｃ）が、前記少なくとも２つの培養容器の１つを混合容器として使用する、又は前記少なくとも２つの培養容器から独立した混合容器で、前記の少なくとも２つの培養容器の内容物の全部又は一部を収容することを可能にすることで実行されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
工程ｃ）が混合容器を使用して実行され、工程ｂ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部が少なくとも２つの培養容器から少なくとも１つの混合容器に移送されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
均質化工程ｄ）が、機械的撹拌及び気体流の注入から選択される撹拌手段によって全体又は部分的に実施されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
工程ｅ）が、工程ｄ）で得られた混合生細胞の前記均質化懸濁液の少なくとも一部を少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）に移送することで構成されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
工程ｅ）で移送された前記懸濁液の少なくとも一部は、混合生細胞の前記均質化懸濁液の体積の１～１００％の間の画分に相当することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
工程ｂ）を繰り返す場合、培養サイクル中に使用される前記選択的状況及び／又は前記培養パラメータは、先行培養サイクルで使用されたものと同じであっても異なっていてもよいことを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ｎ個の培養容器（ＲＣｉ）が使用され、ｉは１～ｎの範囲であり、ｎは少なくとも２に等しく、また、少なくともｎ－１個の混合容器（ＲＭｊ）が使用され、ｊは１～ｎ－１の範囲であり、前記少なくともｎ－１個の混合容器がそれぞれ、少なくとも２つの培養容器の内容物を受け取るように配置された培養容器（ＲＣｉ）であり、工程ｃ）～ｅ）が、ｉ）工程ｂ）で得られた前記懸濁液の全部又は一部を、培養開始容器と呼ばれる培養容器（ＲＣｉ）から移送先容器と呼ばれる混合容器（ＲＭｊ）に移送することで、移送先への移送を実施すること、
ｉｉ）前記移送先容器（ＲＭｊ）で、前記培養開始容器（ＲＣｉ）の懸濁液を前記移送先容器（ＲＣｊ）の懸濁液と均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を得ること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部を前記移送先容器（ＲＭｊ）から前記開始培養容器（ＲＣｉ）に移送し、戻し移送を実施すること、
ｉｖ）ＲＣｉとＲＭｊを変化させながら、全ての懸濁液が少なくとも一度は二つ一組になって混ぜ合わされるように、先行工程ｉ）～ｉｉｉ）を繰り返すこと、
で実行されることをさらに特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記少なくとも１つの混合容器は、前記培養容器のセットから独立した単一の容器であり、前記ｎ個の培養容器の前記内容物を受け入れるように配置されていることを特徴とする、請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
ｎ個の培養容器（ＲＣｉ）が使用され、ｉは１～ｎの範囲であり、ｎは少なくとも２に等しく、また、少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）が使用され、前記少なくとも１つの混合容器が前記培養容器のセットから独立した単一の容器であり、前記ｎ個の培養容器の内容物を受け取るように配置されており、工程ｃ）～ｅ）が、ｃ）工程ｂ）で得られた生細胞の前記懸濁液の全部又は一部を、少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）から前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）に移送し、混合された生細胞の懸濁液を得ること、
ｄ）工程ｃ）で得られた生細胞の前記混合懸濁液を前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）で均質化して、混合生細胞の均質化懸濁液を得ること、
ｅ）工程ｄ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部を、前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）から前記少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）のそれぞれに移送すること、
で実行されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生細胞の連続細胞培養による生細胞を適応進化させる方法に関する。
【背景技術】
【0002】
生細胞はしばしば、例えば食品、動物飼料、香料、化粧品、燃料、化学物質、及び健康製品を生産するために使用される。微細藻類、菌類、酵母、及び細菌のような生細胞は、小さなセルサイズ、短い世代時間、及び比較的低廉な培養コストを含む、いくつかの有利な点を有している。しかしながら、製品の効率的な生産に必要な条件はしばしば、工業プロセスにおいて使用される、前記細胞の成長及び生存への最適条件とは異なる。
【0003】
製品の製造、分解、又はリサイクルには、人工的な条件下で得られる高性能な生細胞が必要であり、このことは生細胞の必要性と製品製造に必要な条件との間の妥協案を表している。生細胞の所望の性能を向上させるため、遺伝子組み換えが関連するアプローチを含む様々なアプローチが存在する。しかし、遺伝子組み換え生細胞及びその利用に関して、安全性及びヒトを含む他の生物への影響を含む、いくつかの異論があがっている。一方、どの遺伝子組み換えによって、所望の表現型を持つ生細胞が得られるかを完全に予測できるモデルは、現在は存在しない。
【0004】
したがって、別のアプローチがますます重要になっている。これらの代替アプローチは、例えば、遺伝子組み換え生物の使用を禁止する規制に基づきながら、所望の表現型を達成するために必要な変異の知識なしに産業上注目される変異体を得るため、微生物集団に自然に生じる遺伝子変異の可能性を利用し、非遺伝的に生細胞を改良することに基づく。
【0005】
遺伝的変異は、例えばランダム変異及び有性生殖によって、常に生成されている。したがって、集団中の生細胞は、所与の環境に対する適応の度合いが異なり、このことは選択の基礎となる。選択は、所与の細胞の集団において、時間の経過とともに有益な表現型形質が増加する傾向を指し、有益な表現型形質は、前記細胞の生存、交配、及び／又は繁殖の可能性を高める。同時に、前記細胞の生存、交配、及び／又は繁殖の可能性を低下させる表現型形質の頻度が低下する、又は集団から排除されることさえある。したがって、環境が変化しても、集団は、集団内に存在する遺伝的変異に基づき、有利な、つまり有益な表現型形質を蓄積し、有害な、つまり負の影響を持つ表現型形質を排除しながら、時間をかけてそれぞれの環境に適応できる。遺伝的変異の可能性は、例えば、製品の効率的及び商業的な生産など、意図した用途に望ましい表現型形質を選択することにより、人為選択の状況で利用される。しかし、効果的な人為選択の実施は困難である。
【0006】
特に、選択圧が高すぎると、自然突然変異によって出現する遺伝的多様性が制限される可能性があるため、人為選択では、目標とする表現型を効果的に達成するための最適な選択圧のパラメータを選択するという大きな課題に直面している。さらに、ほとんどの場合、成長速度の向上に関わる表現型形質、基準培地と比較して異なる組成の成長培地への適応、温度への適応、特定の濃度及び／又は栄養成分で存在する阻害剤への適応など、複数の表現型形質の選択が必要とされる。複数の表現型形質を順次選択していく、つまり表現型形質を次々と改良していくために、特定の表現型形質に特化した中間段階を通す必要があり、そこから他の形質へ人為選択することは困難、面倒、又は不可能である。人為選択によって、いくつかの表現型形質と並行して、つまり同時に改良することで、この障害を克服できる。
【0007】
低コスト及び／又は高収量の工業的生産に最適化された条件下で、所望する表現型、すなわち同時にいくつかの形質を獲得した懸濁状態にある生細胞を効率的かつ自動的に選択する代替解決策に対する必要性がある。
【0008】
ＵＳ２０１２／０２６３６９０には、とりわけ温度耐性、化学物質耐性、及び紫外線耐性から選択された単一の表現型形質を獲得した微生物を人工的に選択する方法が記載されている。
【0009】
国際出願ＷＯ２００９／１１２７３９には、一過性に酵素を分泌し、懸濁状態で増殖する所望の細胞を選択する方法であって、前記細胞は所望する酵素の分泌の決定要因であると知られている細胞密度値に維持される方法が記載されている。
【0010】
特許ＥＰ１１３５には、単一の選択的状況下、ケモスタット又はタービドスタットで細胞を増殖させる方法が記載されている。
【0011】
Ｍａｎｓらの論文（Ｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１８、ｖｏｌ ５０、ｐａｇｅｓ ４７～５６）には、酵母株の適応進化による燃料及び化学物質の生産量増加のための様々な方法が記載されている。酵母をある容器から別の容器に順次移送する方法、又は同じ容器で連続的に培養する方法がある。さらにこの論文では、適応進化は一般的に、選択された表現型形質と生物の他の生理学的側面の間のトレードオフを通じて起こり、一方で、非構成的な表現型形質、つまり選択圧によって誘導されたがその選択圧の適用がなくなると発現しなくなるものを選択してしまうリスクが残ることが指摘されている。これらの困難を回避するため、Ｍａｎｓらの論文で、生物を異なる選択的状況に曝露する動的な進化過程の必要性が強調されている。特に、ある容器から別の容器に移送する際に、培地を交互に入れる方策について説明されている。しかし、本方策には、選択的状況を順次交代させながら、一つの進化経路を探索することが含まれる。
【0012】
国際出願ＷＯ２０１８／１５２４４２は、プログラム可能な連続培養システムにおける微生物の液体培養の適応進化方法で、微生物培養を動的環境に曝露し、前記培養を培養適応度関数に重畳するストレスランプ関数に曝露した後、微生物培養の適応度の上昇に応答して微生物培養に加えるストレス量を増加させる方法を記載している。
【0013】
しかしながら、従来の提案されている方法は、多大な時間を必要とし、実行するのが面倒であり、とりわけ、いずれも所望の表現型、特にいくつかの表現型形質を同時に改良することを必要とする複雑な表現型を持つ微生物集団に迅速かつ効率的にアクセスすることはできない。
【0014】
それゆえ、所望する表現型を獲得した生細胞を迅速かつ効率的に得ることを可能にする、生細胞の適応進化のための新たな方法を開発することが必要であると思われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0015】
【特許文献1】国際公開第２０１８／１５２４４２号
【0016】
【非特許文献1】Ｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１８、ｖｏｌ ５０、ｐａｇｅｓ ４７～５６
【非特許文献2】Ｄｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１８、ｖｏｌ ７（９）、ｐａｇｅｓ ２０２９～２０３６
【発明の概要】
【0017】
本発明は、その目的として、ｎ個の培養容器（ＲＣｉ）での前記生細胞の連続培養により、ヒト胚性幹細胞を除く生細胞を適応進化させる方法であって、ｉが１～ｎの範囲であり、ｎ≧２であり、前記方法が、
ａ）少なくとも１つの液体培地と生細胞を前記ｎ個の培養容器のそれぞれに導入する工程、
ｂ）前記ｎ個の培養容器のそれぞれにおいて、所与の選択的状況に基づいて、事前に規定された培養パラメータを使用して、前記ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、決定された成長段階に到達するまで前記生細胞を培養し、前記ｎ個の培養容器のそれぞれにおいて、前記液体培地中の生細胞の懸濁液を得る工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）からの生細胞の前記懸濁液の少なくとも一部を混ぜ合わして、生細胞の混合懸濁液を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた生細胞の前記混合懸濁液を均質化して、混合生細胞の均質化懸濁液を得る工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた混合生細胞の前記均質化懸濁液の少なくとも一部を、少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）に分配する工程、
ｆ）工程ｂ）～ｅ）を繰り返す工程、
ｇ）前記ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、所望の表現型を獲得した生細胞を数サイクル培養した後に回収する工程、
を含むことを特徴とする、生細胞を適応進化させる方法である。
ａ）少なくとも１つの液体培地と生細胞を前記ｎ個の培養容器のそれぞれに導入する工程、
ｂ）前記ｎ個の培養容器のそれぞれにおいて、所与の選択的状況に基づいて、事前に規定された培養パラメータを使用して、前記ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、決定された成長段階に到達するまで前記生細胞を培養し、前記ｎ個の培養容器のそれぞれにおいて、前記液体培地中の生細胞の懸濁液を得る工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）からの生細胞の前記懸濁液の少なくとも一部を混ぜ合わして、生細胞の混合懸濁液を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた生細胞の前記混合懸濁液を均質化して、混合生細胞の均質化懸濁液を得る工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた混合生細胞の前記均質化懸濁液の少なくとも一部を、少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）に分配する工程、
ｆ）工程ｂ）～ｅ）を繰り返す工程、
ｇ）前記ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、所望の表現型を獲得した生細胞を数サイクル培養した後に回収する工程、
を含むことを特徴とする、生細胞を適応進化させる方法である。
【0018】
本発明者は、驚くべきことに、本発明方法で、選択的状況を並列的及び多重的に適用することにより、所望の表現型を持つ生細胞を選択及び収集できることを示した。本発明方法は、これらの選択的状況の単純又は連続的な使用と比較して時間を節約できるのが好ましい。特に、工程ｂ）からｅ）を繰り返すことで、少なくとも２つの異なる培養容器から採取した生細胞の懸濁液を連続的に混合し、新しい培養容器に再分配でき、培養サイクルの過程で適用した選択的状況に最も反応する生細胞を徐々に選択し、所望の表現型を獲得した生細胞の集団を達成することが促進される。したがって、本方法により、生細胞の懸濁液がとり得る進化経路の数が増加し、所望の表現型が出現する確率及び速度が向上する。
【0019】
本発明は、とりわけ、生細胞の効率的な進化に対する必要性に取り組んでおり、このことは特に懸濁培養条件によく適しており、製品の生産、分解、又はリサイクルに最適化されている。
【0020】
本発明は、特に、異なる選択的状況及び／又は培養パラメータに基づいて徐々に増加する選択圧の下で並行して培養される異なる培養容器からの生細胞懸濁液の画分を頻繁に混合することによって、目標条件によく適応した生細胞を得ることに基づく。
【0021】
本発明の目的では、「連続培養」とは、少なくとも１つの液体培地中で実行される生細胞の培養であり、生細胞を長期間成長させ続けるために、前記培地の一部が更新されることを意味する。有利には、生細胞は予め規定されない多数の世代にわたって維持され、有利には生細胞の２世代超、有利には３世代超、有利には４世代超、有利には５世代超、有利には６世代超、有利には７世代超、有利には８世代超、有利には９世代超、有利には１０世代超、有利には２０世代超、有利には３０世代超、有利には４０世代超、有利には５０世代超、有利には６０世代超、有利には７０世代超、有利には８０世代超、有利には９０世代超、有利には１００世代超、有利には１５０世代超、有利には２００世代超、有利には２５０世代超、有利には３００世代超、有利には１３０世代超、有利には４００世代超、有利には４５０世代超、有利には５００世代超、、有利には５５０世代超、有利には６００世代超、有利には６５０世代超、有利には７００世代超、有利には７５０世代超、有利には８００世代超、有利には８５０世代超、有利には９００世代超、有利には９５０世代超、有利には１０００世代超、有利には５０００世代超、有利には１００００世代超、有利には１５０００世代超、有利には２００００世代超、有利には２５０００世代超、有利には３００００世代超、有利には３５０００世代超、有利には４００００世代超、有利には４５０００世代超、有利には５００００世代超である。
【0022】
培地、又はその成分（希釈剤）の更新は、永久的、定期的、又は周期的に実行できる。前記培地は、その組成中の１つ以上の成分について更新、又はこれらの成分の混合物全体について更新できる。前記培地は、培養中の細胞の少なくとも０．０１％が保持されるように更新される。有利には、培養中の細胞の少なくとも０．１％が懸濁状態にあり、有利には少なくとも１％、有利には少なくとも２％、有利には少なくとも３％、有利には少なくとも４％、有利には少なくとも５％、有利には少なくとも６％、有利には少なくとも７％、有利には少なくとも８％、有利には少なくとも９％、有利には少なくとも１０％、有利には少なくとも１１％、有利には少なくとも１２％、有利には少なくとも１３％、有利には少なくとも１４％、有利には少なくとも１５％、有利には少なくとも１６％、有利には少なくとも１７％、有利には少なくとも１８％、有利には少なくとも１９％、有利には少なくとも２０％、有利には少なくとも２１％、有利には少なくとも２２％、有利には少なくとも２３％、有利には少なくとも２４％、有利には少なくとも２５％、有利には少なくとも２６％、有利には少なくとも２７％、有利には少なくとも２８％、有利には少なくとも２９％、有利には少なくとも３０％、有利には少なくとも３１％、有利には少なくとも３２％、有利には少なくとも３３％、有利には少なくとも３４％、有利には少なくとも３５％、有利には少なくとも３６％、有利には少なくとも３７％、有利には少なくとも３８％、有利には少なくとも３９％、有利には少なくとも４０％、有利には少なくとも４１％、有利には少なくとも４２％、有利には少なくとも４３％、有利には少なくとも４４％、有利には少なくとも４５％、有利には少なくとも４６％、有利には少なくとも４７％、有利には少なくとも４８％、有利には少なくとも４９％、有利には少なくとも５０％、有利には少なくとも５１％、有利には少なくとも５２％、有利には少なくとも５３％、有利には少なくとも５４％、有利には少なくとも５５％、有利には少なくとも５６％、有利には少なくとも５７％、有利には少なくとも５８％、有利には少なくとも５９％、有利には少なくとも６０％、有利には少なくとも６１％、有利には少なくとも６２％、有利には少なくとも６３％、有利には少なくとも６４％、有利には少なくとも６５％、有利には少なくとも６６％、有利には少なくとも６７％、有利には少なくとも６８％、有利には少なくとも６９％、有利には少なくとも７０％、有利には少なくとも７１％、有利には少なくとも７２％、有利には少なくとも７３％、有利には少なくとも７４％、有利には少なくとも７５％、有利には少なくとも７６％、有利には少なくとも７７％、有利には少なくとも７８％、有利には少なくとも７９％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８１％、有利には少なくとも８２％、有利には少なくとも８３％、有利には少なくとも８４％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも８６％、有利には少なくとも８７％、有利には少なくとも８８％、有利には少なくとも８９％、有利には少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、有利には少なくとも９２％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９４％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９６％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％の培養中の細胞が保存されるように、前記培地は更新される。
【0023】
本発明の目的では、「所望の表現型を獲得した生細胞」又は「細胞変異体」は、同一条件下で成長した親細胞と同一の生理的特性を持たない娘細胞を意味する。
【0024】
本発明の目的では、「適応進化させる方法」は、生細胞の集団が選択的状況に曝露され、有利な生理的変化を蓄積することで所望の表現型の獲得を促進する過程である。生理的変化は、遺伝子組み換え（点突然変異、遺伝物質の消失又は獲得）もしくはエピジェネティック修飾によって起こり、ストレス又は培養中の生細胞の挙動に永続的な影響を与え得る他の要因によってもたらされる可能性がある。
【0025】
本発明は、これらの生理的変化を事前に定めておく必要はない。それに対して、本発明の目的は、その表現型に至る遺伝的及び生理的修飾の事前知識なしに、所望の表現型を獲得した生細胞の出現を促進し、その後、所望の表現型を獲得した生細胞を回収することであり、前記表現型は、例えば、特にストレスに耐える、所与の条件下で成長する、所与の条件下でより速く成長し得る、培地をよりよく利用する、又は工業的基準を満たす他の特性を与えるなど、他の細胞に対して競争上の優位性を持つ。
【0026】
本発明の目的では、「選択圧」とは、可溶化又は気体化した毒性化合物によるストレス、可溶化又は気体化された必須化合物の不足によるストレス、温度上昇によるストレス、温度下降によるストレス、ｐＨ上昇によるストレス、ｐＨ低下によるストレス、特定の波長の電磁波への曝露、特に紫外線への曝露、赤外線への曝露、細胞にとって致死的な波長の電磁波への曝露、変異原性物質への曝露、又はこれらのストレスの組み合わせを意味し、これらのストレスは、例えば生細胞の倍加時間の増加による生産性の低下、例えば生細胞の生産量の減少による収率の低下、又は生細胞の消滅のいずれかにつながる。
【0027】
本発明の目的では、「細胞」又は「生細胞」又は「生細胞の集団」は、膜に囲まれた細胞質からなり、自律的に再生する能力を有する１つ以上の小さな生物学的実体を意味する。有利には、生細胞は、ヒト胚性幹細胞を除いて、真核生物又は原核生物、ヒト、動物、又は植物でありうる。微生物は細胞であると考えられている。有利には、生細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、微細藻類、植物細胞、真菌、及び微生物から選択される。本発明の目的では、「微細藻類」とは、単細胞の藻類を意味する。また、有利には、「生細胞」は、ヒト胚性幹細胞を除く、真核細胞又は原核細胞、ヒト、動物、又は植物で、ウイルス、ファージ、寄生虫に感染している可能性があり、及び／又は１つ以上の所望のプラスミドが組み込まれた細胞を意味する。
【0028】
本発明の目的では、「培養容器」又は「培養室」又は「培養槽」とは、所与の選択的状況に基づいて培地中で生細胞を培養する容器で、特に所与の培養パラメータに基づく操作規則に基づいて培養条件が設定される様式を、所与の成長段階に到達するまで確立することを意味する。特定の実施形態では、培養容器はリサイクル可能である。特定の実施形態では、培養容器は使い捨てである。
【0029】
本発明の目的では、「懸濁液」は、生細胞を含む液状培地を意味する。
【0030】
本発明によれば、工程ｂ）で得られた少なくとも２つの培養容器（Ｒｉ）からの生細胞の懸濁液の少なくとも一部を混ぜ合わせることからなる工程ｃ）が、前記少なくとも２つの培養容器の１つを混合容器として使用する、又は前記少なくとも２つの培養容器から独立した混合容器で、前記少なくとも２つの培養容器の内容物の全部又は一部を収容することを可能にする、ことで実行されうる。
【0031】
本発明の目的では、「混合容器」又は「混合槽」は、少なくとも２つの培養容器の内容物が混合される容器を意味する。したがって、混合容器には、少なくとも最初の培養容器からの懸濁液と２番目の培養容器からの懸濁液が含まれる。有利には、本発明方法は、培養容器と同数の混合容器を含んでもよい。有利には、混合容器の数は１～ｎの範囲で変更してよい。特定の実施形態では、混合容器の数は少なくとも２である。特に有利な実施形態では、混合容器の数は３に等しい。特に有利な別の実施形態では、混合容器の数は４に等しい。特に有利な別の実施形態では、混合容器の数は５に等しい。特に有利な別の実施形態では、混合容器の数は６に等しい。特に有利な別の実施形態では、混合容器の数は７に等しい。特に有利な別の実施形態では、混合容器の数は８に等しい。特に有利な別の実施形態では、混合容器の数は９に等しい。特に有利な別の実施形態では、混合容器の数は１０に等しい。
【0032】
特定の実施形態では、前記混合容器はリサイクル可能である。特定の実施形態では、前記混合容器は使い捨てである。
【0033】
工程ａ）において、少なくとも１容積の液体培地と特定量の生細胞を、ｎ個の培養容器の各々に導入する。有利には、特定量の生細胞は、少なくとも１個の生細胞、少なくとも１０個の生細胞、有利には少なくとも２０個の生細胞、有利には少なくとも３０個の生細胞、有利には少なくとも４０個の生細胞、有利には少なくとも５０個の生細胞、有利には少なくとも６０個の生細胞、有利には少なくとも７０個の生細胞、有利には少なくとも８０個の生細胞、有利には少なくとも９０個の生細胞、有利には少なくとも１００個の生細胞、有利には少なくとも２００個の生細胞、有利には少なくとも３００個の生細胞、有利には少なくとも４００個の生細胞、有利には少なくとも５００個の生細胞、有利には少なくとも６００個の生細胞、有利には少なくとも７００個の生細胞、有利には少なくとも８００個の生細胞、有利には少なくとも９００個の生細胞、有利には少なくとも１０００個の生細胞、有利には少なくとも１０４個の生細胞、有利には少なくとも１０５個の生細胞、有利には少なくとも１０６個の生細胞、有利には少なくとも１０７個の生細胞、有利には少なくとも１０８個の生細胞、有利には少なくとも１０９個の生細胞、有利には少なくとも１０１０個の生細胞、有利には少なくとも１０１１個の生細胞、有利には少なくとも１０１２個の生細胞を意味する。
【0034】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの培地は、生細胞の成長に必須の栄養素を含む。当業者は使用される生細胞のタイプに基づく少なくとも１つの培地、及び特にその組成の適応の仕方を知っているであろう。有利には、前記少なくとも１つの培地は、新鮮で無菌の培地である。
【0035】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの培地及び生細胞は、培地槽をｎ個の培養容器のそれぞれに接続することを可能にする供給手段、例えばラインによって接続されたポンプ及びバルブを介して、ｎ個の培養容器のそれぞれに導入される。
【0036】
工程ｂ）において、前記の決定された成長段階は、細胞密度、又はｐＨ、蛍光、放射能、生成された分子の濃度、栄養素などの消費された分子の濃度、毒性物質の存在、希釈率、ストレス培地の注入数、培地の２回の注入間の経過時間などの培地で測定可能な物理的／化学的指標に関連する、事前に定められた期間の終了時点で到達することが可能である。
【0037】
この「決定された成長段階」は、目標とする表現型に基づいてもよいし、実験的又は文献データから事前に確立された典型的な成長曲線に基づいてもよい。
【0038】
特定の実施形態では、細胞密度は光学測定により計測することができる。
【0039】
特に有利な実施形態では、測定可能な物理的／化学的指標の特定の値、例えば、細胞密度の閾値、特定の希釈率、ストレス培地の注入数、培地の２回の注入間の経過時間、特定のｐＨ、特定の温度、懸濁液を撹拌する特定の気体組成、特定の蛍光、特定の放射能、特定の強度及び周波数での電磁波又は放射性放射線、特定の生成分子濃度、特定の栄養素濃度、特定の成長因子濃度、特定の毒性物質濃度が設定されている。
【0040】
本方法において、培地の播種後に生細胞が設定値まで成長する。この臨界値に少なくとも１つの培養容器で到達し、培養物、つまり培地と生細胞からなる懸濁液の全部又は一部が少なくとも１つの混合容器に移送される。
【0041】
別の特定の実施形態では、前記の決定された成長段階は、事前に規定された持続期間に関連していてもよい。有利には、事前に規定された持続期間は、１分、有利には２分、有利には３分、有利には４分、有利には５分、有利には６分、有利には７分、有利には８分、有利には９分、有利には１０分、有利には１５分、有利には２０分、有利には２５分、有利には３０分、有利には３５分、有利には４０分、有利には４５分、有利には５０分、有利には５５分、有利には６０分、有利には６５分、有利には７０分、有利には７５分、有利には８０分、有利には８５分、有利には９０分、有利には９５分、有利には１００分、有利には１０５分、有利には１１０分、有利には１１５分、有利には１２０分後、有利には３時間、有利には４時間、有利には５時間、有利には６時間、有利には７時間の培養、有利には８時間、有利には９時間の培養、有利には１０時間、有利には１１時間の培養、有利には１２時間、有利には１３時間の培養、有利には１４時間、有利には１５時間の培養、有利には１６時間、有利には１７時間の培養、有利には１８時間、有利には１９時間の培養、有利には２０時間、有利には２１時間の培養、有利には２２時間、有利には２３時間の培養、有利には２４時間、に固定しうるが、このリストは限定的ではない。
【0042】
有利には、前記の決定された成長段階は、培養１分後、有利には２分後、有利には３分後、有利には４分後、有利には５分後、有利には６分後、有利には７分後、有利には８分後、有利には９分後、有利には１０分後、有利には１５分後、有利には２０分後、有利には２５分後、有利には３０分後、有利には３５分後、有利には４０分後、有利には４５分後、有利には５０分後、有利には５５分後、有利には６０分後、有利には６５分後、有利には７０分後、有利には７５分後、有利には８０分後、有利には８５分後、有利には９０分後、有利には９５分後、有利には１００分後、有利には１０５分後、有利には１１０分後、有利には１１５分後、有利には１２０分後、有利には３時間後、有利には４時間後、有利には５時間後、有利には６時間後、有利には７時間後、有利には８時間後、有利には９時間後、有利には１０時間後、有利には１１時間後、有利には１２時間後、有利には１３時間後、有利には１４時間後、有利には１５時間後、有利には１６時間後、有利には１７時間後、有利には１８時間後、有利には１９時間後、有利には２０時間後、有利には２１時間後、有利には２２時間後、有利には２３時間後、有利には２４時間後に達しうるが、このリストは限定的ではない。
【0043】
この場合、本方法において培地の播種後に、生細胞は事前に設定された期間成長する。この培養時間に到達すると、培養物、つまり培地と生細胞からなる懸濁液の全部又は一部が少なくとも１つの混合容器に移送される。
【0044】
本発明方法の特定の実施形態では、工程ｂ）において、選択的状況で生細胞が培養され、該選択的状況は、ケモスタット、タービドスタット、培地スワップ、及び反復バッチから選択される。
【0045】
本発明の目的では、「ケモスタット状況」又は「ケモスタット」は、細胞を希釈するために、限られた含有量で少なくとも１つの必須栄養素を含む単一の培地、好ましくは無菌のものを使用し、培地の流速が一定である細胞培養の一種を意味する。有利には、培地を所定の速度で連続的に、つまり中断せずに前記培養容器に供給し、前記容器の容積を一定に保ちながら細胞を希釈する。その代わりに、一定間隔で、前記培養容器に所定量の培地を送り、細胞を希釈する。
【0046】
本発明の目的では、「一定間隔」は、３０秒毎、有利には３５秒毎、有利には４０秒毎、有利には４５秒毎、有利には５０秒毎、有利には５５秒毎、有利には１分毎、有利には２分毎、有利には３分毎、有利には４分毎、有利には５分毎、有利には１０分毎、有利には１５分毎、有利には２０分毎、有利には２５分毎、有利には３０分毎を意味する。
【0047】
本発明の目的では、「タービドスタット状況」又は「タービドスタット」は、細胞を希釈するために、全ての必須栄養素を過剰に含む単一の培地、好ましくは無菌のものを使用し、培地の流速が一定である細胞培養の一種を意味する。有利には、培地を可変速度で連続的に、つまり中断せずに前記培養容器に供給し、前記容器の容積を一定に保ちながら細胞を希釈し、濁度を前記閾値に保つ。その代わりに、一定間隔で、少なくとも１つの培養容器において、培養細胞密度を測定し、前記閾値と比較する。測定された細胞密度が閾値より小さい場合、次の間隔が終了するまで培養が続けられる。測定された細胞密度が閾値より大きい場合、前記培養容器に所定量の培地が送られて細胞が希釈される。
【0048】
本発明の目的では、「培地スワップ」とは、細胞培養状況の一種で、許容培地と呼ばれる培地とストレス培地と呼ばれる、２種類の異なる、好ましくは無菌の培地を使用し、前記培養容器の容積を一定に保ち、半連続的に培地を追加して細胞を希釈することを意味する。その場合、一定間隔で、少なくとも１つの培養容器において、培養細胞密度を測定し、前記閾値と比較する。測定された細胞密度が閾値より小さい場合、事前に決定された量の許容培地が培養容器に送られる。測定された細胞密度が閾値より大きい場合、培養容器に所定量のストレス培地が送られる。培地スワップは、Ｄｏｒｉｎｇら（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１８、ｖｏｌ ７（９）、ｐａｇｅｓ ２０２９～２０３６）に記載されているように実施できる。
【0049】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの培地は、いわゆる「許容」培地、又はいわゆる「ストレス」培地であってもよい。「許容培地」は、細胞の成長に不可欠な栄養素や成長因子を含み、細胞成長阻害剤などの細胞死を引き起こす毒性物質を含まない、又は前記細胞にとって致死的ではない量で存在する、細胞の成長に完全に適合した培地である。「ストレス培地」は、細胞の成長に必須の栄養素を含み、細胞成長阻害剤のような細胞死を引き起こす量の毒性物質が存在する、又は細胞の成長に必須の成長因子が存在しない、又は毒性物質の量が無視できない割合で存在する、又は細胞の成長に必須の成長因子が欠落する、又は前記細胞の好ましい基質でない培地のことである。
【0050】
本発明の目的では、「反復バッチ」は、培地、好ましくは無菌のものを用いて細胞を希釈する、細胞培養状況の一種を意味する。この場合、細胞は、所定の細胞密度値に到達するまで、培地を希釈することなく少なくとも１つの培養容器内で成長する。細胞密度値に到達すると、懸濁液は所定の培養時間維持される。前記培養容器において細胞密度閾値に到達した後の時間が経過すると、前記培養容器に無菌培地を一定量で送る。代替の実施形態では、前記培養容器において細胞密度閾値に到達した後の時間が経過した場合、前記培養容器からの懸濁液の一部を、既に成長培地を含み、好ましくは無菌である少なくとも１つの異なる培養容器に送る。
【0051】
特定の実施形態では、工程ｂ）において、生細胞はケモスタット選択的状況で培養される。
【0052】
特定の実施形態では、工程ｂ）において、生細胞はタービドスタット選択的状況で培養される。
【0053】
特定の実施形態では、工程ｂ）において、生細胞は培地スワップ選択的状況で培養される。
【0054】
特定の実施形態では、工程ｂ）において、生細胞は反復バッチ選択的状況で培養される。
【0055】
特に有利な態様では、本発明方法の工程ｂ）で使用される選択的状況はｎ個の培養容器の全てに対して同一でもよい。
【0056】
特に有利な態様では、本発明方法の工程ｂ）で使用される選択的状況は、培養容器の各々で互いに異なってもよい。本発明の特定の態様においては、ｎ個の培養容器の間で、異なる選択的状況を培養工程ｂ）で使用することができる。有利には、ｎ個の培養容器の間で、２つの異なる選択的状況を使用することができ、有利には３つの選択的状況、有利には４つの選択的状況、有利には５つの選択的状況を使用することができる。
【0057】
本発明方法の特定の実施形態では、工程ｂ）において、生細胞を、事前に規定された培養パラメータを用いて、ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、決定された成長段階に到達するまで、上記で定義された選択的状況で培養し、懸濁液を得る。本発明方法の特定の実施形態では、工程ｂ）の前記事前に規定された培養パラメータは、希釈率、温度、ｐＨ、細胞密度、培地組成、気体流組成、特定の波長の電磁波への曝露、変異原性物質への曝露、又はそれらの組み合わせから選択される。
【0058】
本発明によれば、「異なる選択的状況」は、同じ性質であるが強度が異なる選択的状況、又はその強度に関わらず異なる性質の選択的状況のいずれかを意味する。したがって、例として、選択的状況がｐＨの場合、培養容器ごとに異なる値をとることがある。別の実施例によれば、所与の培養容器でも生細胞がｐＨの影響などの特定の選択的状況に曝露され、他の培養容器では生細胞が温度の影響などの別の特定の選択的状況に曝露される場合、選択的状況は異なる。
【0059】
本発明の目的では、「特定の波長の電磁波への曝露」とは、可視波長（４００ｎｍより長く８００ｎｍより短い）の電磁波への曝露、紫外線（４００ｎｍより短い）への曝露、赤外線（８００ｎｍより長い）への曝露、更には細胞を致死させる波長の電磁波への曝露を意味する。
【0060】
本発明の目的では、「変異原性物質」は、細胞のゲノムに挿入型、欠失型、又は置換型の変異を引き起こす化学物質を意味する。有利には、変異原性物質は、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－エチル尿素（Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ＥＮＵ）とも呼ばれる）又はメタンスルホン酸エチル（メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）とも呼ばれる）などのアルキル化剤、プロフラビンやアクリジンオレンジなどのインターカレート剤、フリーラジカル、酸素イオン、過酸化物などの活性酸素から選択できる。
【0061】
特に有利な実施形態では、本発明方法の工程ｂ）で使用される選択的状況は、ｎ個の培養容器の全てにおいて同一であってもよい。
【0062】
特に有利な実施形態では、本発明方法の工程ｂ）で使用される選択的状況は、 培養容器の各々で互いに異なってもよい。
【0063】
特に有利な実施形態では、本発明方法の工程ｂ）で使用される培養パラメータは、ｎ個の培養容器の全てにおいて同一であってもよい。
【0064】
特に有利な実施形態では、本発明方法の工程ｂ）で使用される培養パラメータは、培養容器の各々で互いに異なってもよい。
【0065】
有利には、本説明の残りに対して、全ての培養容器（ＲＣｉ）を以下のように表記する：
－ Ｔ０ｉ、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期温度、
－ ｐＨ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期ｐＨ、
－ ＤＯ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期細胞密度、
－ ＭＣ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した少なくとも１つの初期培地の組成、
－ Ｇ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期気体流の組成、
－ λ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した特定の初期波長の電磁波への曝露、
－ Ｔｄ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期希釈率、及び
－ ＡＭ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した変異原性物質への最初の曝露。
－ Ｔ０ｉ、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期温度、
－ ｐＨ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期ｐＨ、
－ ＤＯ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期細胞密度、
－ ＭＣ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した少なくとも１つの初期培地の組成、
－ Ｇ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期気体流の組成、
－ λ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した特定の初期波長の電磁波への曝露、
－ Ｔｄ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した初期希釈率、及び
－ ＡＭ（ｉ、ｋ）、培養容器ＲＣｉの工程ｂ）で使用した変異原性物質への最初の曝露。
【0066】
有利には、工程ｂ）において、細胞は、温度Ｔ０ｉ、ｐＨ（ｉ、ｋ）に等しいｐＨ、細胞密度ＤＯｋ（ｉ、ｋ）、組成ＭＣ（ｉ、ｋ）の少なくとも１つの培地中、希釈率Ｔｄ（ｉ、ｋ）、組成Ｇ（ｉ、ｋ）の気体存在下で、ｎ個の培養容器の全てについて培養される。
【0067】
特定の実施形態によれば、培養方法は、例えば培養容器に導入された通気ロッドの形態の気体供給装置によって、気体流が懸濁液に圧力下で注入されることを提供できる。この気体流の注入により、懸濁液の通気、懸濁液の均質化（バブリングによる撹拌）が可能になり、培養容器内の気体圧が一定に保たれる。本方法によれば、有利には無菌気体流が培養容器を通過する。この気体流は、空気、窒素（Ｎ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（Ｃ０２）、メタン（ＣＨ４）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、酸素（Ｏ２）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、水素（Ｈ２）、又はこれらの の混合物から選択される気体により構成されうる。
【0068】
特定の実施形態では、前記培養方法は、培養容器において懸濁液を機械的に撹拌する手段を提供してもよい。
【0069】
工程ｃ）において、工程ｂ）で決定された成長段階に到達するとすぐに、少なくとも１つの培養容器に含まれる懸濁液の全部又は一部を、少なくとも１つの他の培養容器に含まれる懸濁液の全部又は一部と混ぜ合わせる。前述のように、懸濁液の混ぜ合わせは、少なくとも２つの培養容器のうちの１つで、混合容器として機能し、そのときの前記培養容器の内部物は、少なくとも１つの他の培養容器から来る懸濁液の全部又は一部を収容するのに十分である、又は前記の少なくとも２つの培養容器の各懸濁液の全部又は一部を収容する内容積を有する少なくとも１つの独立した混合容器で実施できる。
【0070】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも３つの培養容器に含まれる懸濁液の全部又は一部、有利には少なくとも４つの培養容器に含まれる懸濁液の全部又は一部、有利には少なくともｎ個の培養容器に含まれる懸濁液の全部又は一部は、少なくとも１つの混合容器に移送される。
【0071】
本発明の特定の実施形態では、工程ｃ）において、少なくとも２つの培養容器に含まれる各々の懸濁液の一部のみが混ぜ合わされる。有利には、本発明の目的では、「懸濁液の一部」は、培養容器に含まれる懸濁液の少なくとも１％、有利には培養容器に含まれる懸濁液の少なくとも２％、有利には少なくとも３％、有利には少なくとも４％、有利には少なくとも５％、有利には少なくとも６％、有利には少なくとも７％、有利には少なくとも８％、有利には少なくとも９％、有利には少なくとも１０％、有利には少なくとも１１％、有利には少なくとも１２％、有利には少なくとも１３％、有利には少なくとも１４％、有利には少なくとも１５％、有利には少なくとも１６％、有利には少なくとも１７％、有利には少なくとも１８％、有利には少なくとも１９％、有利には少なくとも２０％、有利には少なくとも２１％、有利には少なくとも２２％、有利には少なくとも２３％、有利には少なくとも２４％、有利には少なくとも２５％、有利には少なくとも２６％、有利には少なくとも２７％、有利には少なくとも２８％、有利には少なくとも２９％、有利には少なくとも３０％、有利には少なくとも３１％、有利には少なくとも３２％、有利には少なくとも３３％、有利には少なくとも３４％、有利には少なくとも３５％、有利には少なくとも３６％、有利には少なくとも３７％、有利には少なくとも３８％、有利には少なくとも３９％、有利には少なくとも４０％、有利には少なくとも４１％、有利には少なくとも４２％、有利には少なくとも４３％、有利には少なくとも４４％、有利には少なくとも４５％、有利には少なくとも４６％、有利には少なくとも４７％、有利には少なくとも４８％、有利には少なくとも４９％、有利には少なくとも５０％、有利には少なくとも５１％、有利には少なくとも５２％、有利には少なくとも５３％、有利には少なくとも５４％、有利には少なくとも５５％、有利には少なくとも５６％、有利には少なくとも５７％、有利には少なくとも５８％、有利には少なくとも５９％、有利には少なくとも６０％、有利には少なくとも６１％、有利には少なくとも６２％、有利には少なくとも６３％、有利には少なくとも６４％、有利には少なくとも６５％、有利には少なくとも６６％、有利には少なくとも６７％、有利には少なくとも６８％、有利には少なくとも６９％、有利には少なくとも７０％、有利には少なくとも７１％、有利には少なくとも７２％、有利には少なくとも７３％、有利には少なくとも７４％、有利には少なくとも７５％、有利には少なくとも７６％、有利には少なくとも７７％、有利には少なくとも７８％、有利には少なくとも７９％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８１％、有利には少なくとも８２％、有利には少なくとも８３％、有利には少なくとも８４％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも８６％、有利には少なくとも８７％、有利には少なくとも８８％、有利には少なくとも８９％、有利には少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、有利には少なくとも９２％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９４％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９６％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％を意味すると理解される。
【0072】
本発明の別の実施形態では、工程ｃ）が混合容器を使用して実行され、工程ｂ）で得られた懸濁液の少なくとも一部が少なくとも２つの培養容器から少なくとも１つの混合容器に移送される。この実施形態では、各々の培養容器から少なくとも１つの混合容器に移送される前記懸濁液の画分は、同一でも異なってもよい。
【0073】
本発明の有利な実施形態では、少なくとも１つの混合容器は、配置された培養容器であり、その内容積は、少なくとも２つの培養容器の内容物を収容するのに十分である。有利には、少なくとも１つの混合容器は、少なくとも３つの培養容器、有利には少なくとも４つの培養容器、有利には少なくともｎ個の培養容器の内容物を受け入れるように配置された培養容器である。有利には、「少なくとも１つの培養容器の内容物」は、工程ｂ）で得られた懸濁液で、少なくとも１つの培養容器に存在するものを意味する。有利には、「少なくとも２つの培養容器の内容物」は、工程ｂ）で得られた懸濁液で、少なくとも２つの培養容器に含まれ存在するものを意味する。
【0074】
本発明の有利な実施形態では、少なくとも１つの混合容器は、単一の容器で、培養容器のセットから独立し、培養容器のセットの内容物を受け入れるように配置されている。
【0075】
本発明の特定の実施形態では、工程ｃ）が懸濁液を少なくとも１つの混合容器に移送する操作を含む場合、前記の少なくとも２つの培養容器から少なくとも１つの混合容器への懸濁液の各々の全部又は一部の移送は、移送手段によって実施され、前記移送手段は、特に、１つ以上のポンプ、１つ以上のバルブ、１つ以上の気体流の注入、１つ以上のピペットロボット、又はこれらの組み合わせで構成できる。
【0076】
有利には、前記ポンプは、機械的に駆動するか、又は有利には制御手段を使用して自動的に、電気的若しくは電子的に制御することができる。有利には、前記ポンプは、制御装置により駆動する、有利にはオートマトン又はコンピュータにより駆動するペリスタルティックポンプとすることができる。
【0077】
有利には、前記バルブは、機械的に駆動するか、又は有利には制御手段を使用して自動的に、電気的若しくは電子的に制御することができる。有利には、前記バルブは、制御装置により駆動する、有利にはオートマトン又はコンピュータにより駆動する電磁弁とすることができる。
【0078】
有利には、気体流の注入は、例えば培養容器に配置された気体供給装置、又は外部気体源から行うことができる。
【0079】
本発明の特定の実施形態では、工程ｃ）が移送する操作を含む場合、前記移送は、１つ以上のポンプ及び１つ以上のバルブを使用して実施される。
【0080】
本発明の別の特定の実施形態では、工程ｃ）が移送する操作を含む場合、前記移送は、１つ以上のバルブ及び１つ以上の気体流の注入、例えば圧力差によって生じた気体流の注入を使用して実施される。
【0081】
本発明の特定の実施形態では、工程ｃ）が移送する操作を含む場合、前記移送は、１つ以上のピペットロボットを使用して実施される。
【0082】
本方法の工程ｄ）は、工程ｃ）による少なくとも２つの培養容器からの生細胞の懸濁液の全部又は一部の混ぜ合わせから得られる混合物を均質化することから構成される。本発明によれば、均質化工程により、少なくとも２つの培養容器のそれぞれからの細胞の混合容器の体積における分布がランダムな生細胞の懸濁液が得られる。
【0083】
本発明の特定の実施形態では、均質化工程ｄ）は、特に機械的撹拌及び気体流の注入から選択される撹拌手段によって全体又は部分的に実施される。
【0084】
本発明の特定の実施形態では、均質化工程ｄ）は、気体流の注入によって全体又は部分的に実施され、前記気体流は圧力下で工程ｃ）の混合細胞懸濁液を含む前記容器に気体供給装置により注入される。この気体流の注入は、バブリングによる撹拌（例えばエアリフトの原理を用いて）により、懸濁液混合物の均質化を可能にする。有利には、この気体流は、選択した培養パラメータに応じて、空気、窒素（Ｎ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（Ｃ０２）、メタン（ＣＨ４）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、酸素（Ｏ２）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、水素（Ｈ２）、又はこれらの気体の混合物から選択される気体により構成されうる。
【0085】
好ましくは、本方法の工程ｅ）は、工程ｄ）で得られた、混合生細胞の前記均質化懸濁液の少なくとも一部を、少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）に移送することで構成される。
【0086】
本発明の特に有利な実施形態では、工程ｅ）で移送された前記懸濁液の少なくとも一部は、混合生細胞の前記均質化懸濁液の１～１００％の間の画分に相当する。
【0087】
有利には、工程ｅ）に移送された混合生細胞の前記均質化懸濁液の体積の画分は、前記均質化懸濁液の全体積の少なくとも１％、前記均質化懸濁液の全体積の有利には少なくとも２％、有利には少なくとも３％、有利には少なくとも４％、有利には少なくとも５％、有利には少なくとも６％、有利には少なくとも７％、有利には少なくとも８％、有利には少なくとも９％、有利には少なくとも１０％、有利には少なくとも１１％、有利には少なくとも１２％、有利には少なくとも１３％、有利には少なくとも１４％、有利には少なくとも１５％、有利には少なくとも１６％、有利には少なくとも１７％、有利には少なくとも１８％、有利には少なくとも１９％、有利には少なくとも２０％、有利には少なくとも２１％、有利には少なくとも２２％、有利には少なくとも２３％、有利には少なくとも２４％、有利には少なくとも２５％、有利には少なくとも２６％、有利には少なくとも２７％、有利には少なくとも２８％、有利には少なくとも２９％、有利には少なくとも３０％、有利には少なくとも３１％、有利には少なくとも３２％、有利には少なくとも３３％、有利には少なくとも３４％、有利には少なくとも３５％、有利には少なくとも３６％、有利には少なくとも３７％、有利には少なくとも３８％、有利には少なくとも３９％、有利には少なくとも４０％、有利には少なくとも４１％、有利には少なくとも４２％、有利には少なくとも４３％、有利には少なくとも４４％、有利には少なくとも４５％、有利には少なくとも４６％、有利には少なくとも４７％、有利には少なくとも４８％、有利には少なくとも４９％、有利には少なくとも５０％、有利には少なくとも５１％、有利には少なくとも５２％、有利には少なくとも５３％、有利には少なくとも５４％、有利には少なくとも５５％、有利には少なくとも５６％、有利には少なくとも５７％、有利には少なくとも５８％、有利には少なくとも５９％、有利には少なくとも６０％、有利には少なくとも６１％、有利には少なくとも６２％、有利には少なくとも６３％、有利には少なくとも６４％、有利には少なくとも６５％、有利には少なくとも６６％、有利には少なくとも６７％、有利には少なくとも６８％、有利には少なくとも６９％、有利には少なくとも７０％、有利には少なくとも７１％、有利には少なくとも７２％、有利には少なくとも７３％、有利には少なくとも７４％、有利には少なくとも７５％、有利には少なくとも７６％、有利には少なくとも７７％、有利には少なくとも７８％、有利には少なくとも７９％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８１％、有利には少なくとも８２％、有利には少なくとも８３％、有利には少なくとも８４％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも８６％、有利には少なくとも８７％、有利には少なくとも８８％、有利には少なくとも８９％、有利には少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、有利には少なくとも９２％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９４％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９６％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％、有利には１００％である。
【0088】
本発明方法の工程ｅ）のもう１つ実施形態では、工程ｄ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部をｎ個の培養容器に移送する場合、ｎ個の各々の培養容器に移送される混合生細胞の前記均質化懸濁液の画分は、同一でも異なってもよい。
【0089】
本発明の特定の実施形態では、本発明方法は、ｉは１～ｎの範囲であり、ｎは少なくとも２に等しいｎ個の培養容器（ＲＣｉ）、及びｊは１～ｎ－１の範囲であり、少なくともｎ－１個の混合容器（ＲＭｊ）を含み、前記少なくともｎ－１個の混合容器がそれぞれ、少なくとも２つの培養容器の内容物を受け取るように配置された培養容器（ＲＣｉ）であり、前記方法は工程ｃ）～ｅ）が、
ｉ）工程ｂ）で得られた前記懸濁液の全部又は一部を、培養開始容器と呼ばれる培養容器（ＲＣｉ）から移送先容器と呼ばれる混合容器（ＲＭｊ）に移送することで、移送先への移送を実施すること、
ｉｉ）前記移送先容器（ＲＭｊ）で、前記培養開始容器（ＲＣｉ）の懸濁液を前記移送先容器（ＲＣｊ）の懸濁液と均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を得ること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部を前記移送先容器（ＲＭｊ）から前記開始培養容器（ＲＣｉ）に移送し、戻し移送を実施すること、
ｉｖ）ＲＣｉとＲＭｊを変化させながら、全ての懸濁液が少なくとも一度は二つ一組になって混ぜ合わされるように、先行工程ｉ）～ｉｉｉ）を繰り返すこと、で実行されることをさらに特徴とする方法である。
ｉ）工程ｂ）で得られた前記懸濁液の全部又は一部を、培養開始容器と呼ばれる培養容器（ＲＣｉ）から移送先容器と呼ばれる混合容器（ＲＭｊ）に移送することで、移送先への移送を実施すること、
ｉｉ）前記移送先容器（ＲＭｊ）で、前記培養開始容器（ＲＣｉ）の懸濁液を前記移送先容器（ＲＣｊ）の懸濁液と均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を得ること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部を前記移送先容器（ＲＭｊ）から前記開始培養容器（ＲＣｉ）に移送し、戻し移送を実施すること、
ｉｖ）ＲＣｉとＲＭｊを変化させながら、全ての懸濁液が少なくとも一度は二つ一組になって混ぜ合わされるように、先行工程ｉ）～ｉｉｉ）を繰り返すこと、で実行されることをさらに特徴とする方法である。
【0090】
特に有利な実施形態では、ｎは３である。別の特に有利な実施形態では、ｎは４である。別の特に有利な実施形態では、ｎは５である。別の特に有利な実施形態では、ｎは６である。別の特に有利な実施形態では、ｎは７である。別の特に有利な実施形態では、ｎは８である。別の特に有利な実施形態では、ｎは９である。別の特に有利な実施形態では、ｎは１０である。
【0091】
有利には、本発明方法は、３つの培養容器、第１培養容器ＲＣ１、第２培養容器ＲＣ２、第３培養容器ＲＣ３を含み、３つの培養容器は連続的に混合容器ＲＭ１、ＲＭ２、及びＲＭ３として機能し、それぞれの培養容器は他の２つの培養容器の内容物を受け入れるように配置されており、前記方法は、工程ｃ）～ｅ）が、
ｉ）第１培養容器ＲＣ１から、第１混合容器ＲＭ１としても機能する第２培養容器ＲＣ２に生細胞の懸濁液を移送し、移送先への移送を実施すること、
ｉｉ）第１培養容器ＲＣ１と第２培養容器ＲＣ２からの懸濁液を、第１混合容器ＲＭ１として機能する第２培養容器ＲＣ２で均質化し（ＲＣ２＝ＲＭ１）、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｉｉｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第１混合容器ＲＭ１から第１培養容器ＲＣ１に移送し、戻し移送（return transfer）を実施すること、
ｉｖ）第３培養容器ＲＣ３から、第２混合容器ＲＭ２としても機能する第１培養容器ＲＣ１に懸濁液を移送し、移送先への移送を実施すること、
ｖ）第３培養容器ＲＣ３と第１培養容器ＲＣ１からの懸濁液を、第２混合容器ＲＭ２として機能する第１培養容器ＲＣ１で均質化し（ＲＣ１＝ＲＭ２）、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｖｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第２混合容器ＲＭ２から第３培養容器ＲＣ３に移送し、戻し移送を実施すること、
ｖｉｉ）第２培養容器ＲＣ２から、第３混合容器ＲＭ３としても機能する第３培養容器ＲＣ３に懸濁液を移送し、移送先への移送を実施すること、
ｖｉｉｉ）第２培養容器ＲＣ２と第３培養容器ＲＣ３からの懸濁液を、第３混合容器ＲＭ３として機能する第３培養容器ＲＣ３で均質化し（ＲＣ３＝ＲＭ３）、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｉｘ）前記懸濁液の少なくとも一部を第３混合容器ＲＭ３から第２培養容器ＲＣ２に移送し、戻し移送を実施すること、で実行されることを特徴としている。
ｉ）第１培養容器ＲＣ１から、第１混合容器ＲＭ１としても機能する第２培養容器ＲＣ２に生細胞の懸濁液を移送し、移送先への移送を実施すること、
ｉｉ）第１培養容器ＲＣ１と第２培養容器ＲＣ２からの懸濁液を、第１混合容器ＲＭ１として機能する第２培養容器ＲＣ２で均質化し（ＲＣ２＝ＲＭ１）、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｉｉｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第１混合容器ＲＭ１から第１培養容器ＲＣ１に移送し、戻し移送（return transfer）を実施すること、
ｉｖ）第３培養容器ＲＣ３から、第２混合容器ＲＭ２としても機能する第１培養容器ＲＣ１に懸濁液を移送し、移送先への移送を実施すること、
ｖ）第３培養容器ＲＣ３と第１培養容器ＲＣ１からの懸濁液を、第２混合容器ＲＭ２として機能する第１培養容器ＲＣ１で均質化し（ＲＣ１＝ＲＭ２）、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｖｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第２混合容器ＲＭ２から第３培養容器ＲＣ３に移送し、戻し移送を実施すること、
ｖｉｉ）第２培養容器ＲＣ２から、第３混合容器ＲＭ３としても機能する第３培養容器ＲＣ３に懸濁液を移送し、移送先への移送を実施すること、
ｖｉｉｉ）第２培養容器ＲＣ２と第３培養容器ＲＣ３からの懸濁液を、第３混合容器ＲＭ３として機能する第３培養容器ＲＣ３で均質化し（ＲＣ３＝ＲＭ３）、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｉｘ）前記懸濁液の少なくとも一部を第３混合容器ＲＭ３から第２培養容器ＲＣ２に移送し、戻し移送を実施すること、で実行されることを特徴としている。
【0092】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明方法は、ｉは１～ｎの範囲であり、ｎは少なくとも２に等しいｎ個の培養容器（ＲＣｉ）、及びｊは１～ｎ－１の範囲であり、少なくともｎ－１個の混合容器（ＲＭｊ）を含み、前記少なくともｎ－１個の混合容器はそれぞれ、少なくとも２つの培養容器の内容物を受け取るように配置された培養容器（ＲＣｉ）であり、前記工程ｃ）～ｅ）が、
ｉ）工程ｂ）で得られた生細胞の懸濁液の全部又は一部を、培養開始容器と呼ばれる培養容器（ＲＣｉ）から移送先容器と呼ばれる混合容器（ＲＭｊ）に移送することで、移送先への移送を実施すること、
ｉｉ）移送先容器（ＲＭｊ）で、培養開始容器（ＲＣｉ）の懸濁液を移送先容器（ＲＭｊ）の懸濁液と均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を得ること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた懸濁液の少なくとも一部を移送先容器（ＲＭｊ）から開始培養容器（ＲＣｉ）に移送し、戻し移送を実施すること、
ｉｖ）培養開始容器（ＲＣｉ）から移送先容器ＲＭｊ＋１へ懸濁液の全部又は一部を移送し、さらにｎ－（ｉ＋１）回の培養先移送とｎ－（ｉ＋１）回の戻し移送を実施するために、各繰り返しでｊを１単位増やしながら、前記工程ｉ）～ｉｉｉ）をｎ－（ｉ＋１）回繰り返し実施すること、
ｖ）工程ｖ）の終了ごとに培養開始容器がＲＣｉ＋１となるように、各繰り返しでｉを１ずつ増やしながら、工程ｉ）からｉｖ）をｎ－（ｉ＋１）回繰り返すこと、で実行されることを特徴とする。
ｉ）工程ｂ）で得られた生細胞の懸濁液の全部又は一部を、培養開始容器と呼ばれる培養容器（ＲＣｉ）から移送先容器と呼ばれる混合容器（ＲＭｊ）に移送することで、移送先への移送を実施すること、
ｉｉ）移送先容器（ＲＭｊ）で、培養開始容器（ＲＣｉ）の懸濁液を移送先容器（ＲＭｊ）の懸濁液と均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を得ること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた懸濁液の少なくとも一部を移送先容器（ＲＭｊ）から開始培養容器（ＲＣｉ）に移送し、戻し移送を実施すること、
ｉｖ）培養開始容器（ＲＣｉ）から移送先容器ＲＭｊ＋１へ懸濁液の全部又は一部を移送し、さらにｎ－（ｉ＋１）回の培養先移送とｎ－（ｉ＋１）回の戻し移送を実施するために、各繰り返しでｊを１単位増やしながら、前記工程ｉ）～ｉｉｉ）をｎ－（ｉ＋１）回繰り返し実施すること、
ｖ）工程ｖ）の終了ごとに培養開始容器がＲＣｉ＋１となるように、各繰り返しでｉを１ずつ増やしながら、工程ｉ）からｉｖ）をｎ－（ｉ＋１）回繰り返すこと、で実行されることを特徴とする。
【0093】
特に有利な実施形態では、ｎは３である。別の特に有利な実施形態では、ｎは４である。別の特に有利な実施形態では、ｎは５である。別の特に有利な実施形態では、ｎは６である。別の特に有利な実施形態では、ｎは７である。別の特に有利な実施形態では、ｎは８である。別の特に有利な実施形態では、ｎは９である。別の特に有利な実施形態では、ｎは１０である。
【0094】
有利には、本発明方法は、３つの培養容器、すなわち第１培養容器ＲＣ１、第２培養容器ＲＣ２、第３培養容器ＲＣ３を含み、第２及び第３培養容器（ＲＣ２及びＲＣ３）は連続的に混合容器ＲＭ１及びＲＭ２として機能し、それぞれの培養容器ＲＣ２及びＲＣ３は２つの培養容器の内容物を受け入れるように配置されており、前記方法は、前記工程ｃ）～ｅ）が、
ｉ）第１培養容器ＲＣ１から、第１混合容器ＲＭ１としても機能する第２培養容器ＲＣ２に、工程ｂ）で得られた生細胞の懸濁液を移送し、培養先移動を実施すること、
ｉｉ）第１培養容器ＲＣ１と第２培養容器ＲＣ２からの懸濁液を、第１混合容器ＲＭ１として機能する前記培養容器ＲＣ２で均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｉｉｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第１混合容器ＲＭ１から第１培養容器ＲＣ１に移送し、戻し移送を実施すること、
ｉｖ）第１培養容器ＲＣ１から、第２混合容器ＲＭ２としても機能する第３培養容器ＲＣ３に懸濁液を移送し、培養先移動を実施すること、
ｖ）第１培養容器ＲＣ１と第３培養容器ＲＣ３からの懸濁液を、第２混合容器ＲＭ２として機能する前記第３培養容器で均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｖｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第２混合容器ＲＭ２から第１培養容器ＲＣ１に移送し、戻し移送を実施すること、
ｖｉｉ）第２培養容器ＲＣ２から、第２混合容器ＲＭ２としても機能する第３培養容器ＲＣ３に懸濁液を移送し、培養先移動を実施すること、
ｖｉｉｉ）第２培養容器ＲＣ２と第３培養容器ＲＣ３からの懸濁液を、第２混合容器ＲＭ２として機能する前記第３培養容器ＲＣ３で均質化すること、
ｉｘ）前記懸濁液の少なくとも一部を第２混合容器ＲＭ２から第２培養容器ＲＣ２に移送し、戻し移送を実施すること、で実行されることを特徴とする。
ｉ）第１培養容器ＲＣ１から、第１混合容器ＲＭ１としても機能する第２培養容器ＲＣ２に、工程ｂ）で得られた生細胞の懸濁液を移送し、培養先移動を実施すること、
ｉｉ）第１培養容器ＲＣ１と第２培養容器ＲＣ２からの懸濁液を、第１混合容器ＲＭ１として機能する前記培養容器ＲＣ２で均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｉｉｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第１混合容器ＲＭ１から第１培養容器ＲＣ１に移送し、戻し移送を実施すること、
ｉｖ）第１培養容器ＲＣ１から、第２混合容器ＲＭ２としても機能する第３培養容器ＲＣ３に懸濁液を移送し、培養先移動を実施すること、
ｖ）第１培養容器ＲＣ１と第３培養容器ＲＣ３からの懸濁液を、第２混合容器ＲＭ２として機能する前記第３培養容器で均質化し、混合生細胞の均質化懸濁液を取得すること、
ｖｉ）前記懸濁液の少なくとも一部を第２混合容器ＲＭ２から第１培養容器ＲＣ１に移送し、戻し移送を実施すること、
ｖｉｉ）第２培養容器ＲＣ２から、第２混合容器ＲＭ２としても機能する第３培養容器ＲＣ３に懸濁液を移送し、培養先移動を実施すること、
ｖｉｉｉ）第２培養容器ＲＣ２と第３培養容器ＲＣ３からの懸濁液を、第２混合容器ＲＭ２として機能する前記第３培養容器ＲＣ３で均質化すること、
ｉｘ）前記懸濁液の少なくとも一部を第２混合容器ＲＭ２から第２培養容器ＲＣ２に移送し、戻し移送を実施すること、で実行されることを特徴とする。
【0095】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明方法は、ｎ個の培養容器（ＲＣｉ）が使用され、ｉは１～ｎの範囲であり、ｎは少なくとも２に等しく、また、少なくとも１つの混合容器が使用され、前記少なくとも１つの混合容器は前記培養容器のセットから独立した単一の容器であり、前記ｎ個の培養容器の内容物を受け取るように配置されており、工程ｃ）～ｅ）が、
ｃ）工程ｂ）で得られた生細胞の前記懸濁液の全部又は一部を、少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）から前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）に移送し、生細胞の混合懸濁液を得ること、
ｄ）工程ｃ）で得られた生細胞の前記混合懸濁液を前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）で均質化して、生細胞の均質化混合懸濁液を得ること、
ｅ）工程ｄ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部を、前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）から前記少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）のそれぞれに移送すること、で実行されることを特徴とする。
ｃ）工程ｂ）で得られた生細胞の前記懸濁液の全部又は一部を、少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）から前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）に移送し、生細胞の混合懸濁液を得ること、
ｄ）工程ｃ）で得られた生細胞の前記混合懸濁液を前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）で均質化して、生細胞の均質化混合懸濁液を得ること、
ｅ）工程ｄ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部を、前記少なくとも１つの混合容器（ＲＭ）から前記少なくとも２つの培養容器（ＲＣｉ）のそれぞれに移送すること、で実行されることを特徴とする。
【0096】
別の特に有利な実施形態では、ｎは３である。別の特に有利な実施形態では、ｎは４である。別の特に有利な実施形態では、ｎは５である。別の特に有利な実施形態では、ｎは６である。別の特に有利な実施形態では、ｎは７である。別の特に有利な実施形態では、ｎは８である。別の特に有利な実施形態では、ｎは９である。別の特に有利な実施形態では、ｎは１０である。
【0097】
前記培養容器のセットから独立し、前記ｎ個の培養容器の前記内容物を受け取るように配置された単一の容器の使用により、より簡単に実施でき、混合工程ｄ）の速度を速めることができる。
【0098】
本発明の特に有利な実施形態では、工程ｅ）で少なくとも２つの培養容器のそれぞれに移送された前記懸濁液の少なくとも一部は、混合生細胞の前記均質化懸濁液の体積の画分に相当し、前記画分は前記懸濁液の全体積の１～１００％の間である。
【0099】
有利には、工程ｅ）で移送された混合生細胞の前記均質化懸濁液の画分は、前記懸濁液の全体積の少なくとも１％、有利には少なくとも２％、有利には少なくとも３％、有利には少なくとも４％、有利には少なくとも５％、有利には少なくとも６％、有利には少なくとも７％、有利には少なくとも８％、有利には少なくとも９％、有利には少なくとも１０％、有利には少なくとも１１％、有利には少なくとも１２％、有利には少なくとも１３％、有利には少なくとも１４％、有利には少なくとも１５％、有利には少なくとも１６％、有利には少なくとも１７％、有利には少なくとも１８％、有利には少なくとも１９％、有利には少なくとも２０％、有利には少なくとも２１％、有利には少なくとも２２％、有利には少なくとも２３％、有利には少なくとも２４％、有利には少なくとも２５％、有利には少なくとも２６％、有利には少なくとも２７％、有利には少なくとも２８％、有利には少なくとも２９％、有利には少なくとも３０％、有利には少なくとも３１％、有利には少なくとも３２％、有利には少なくとも３３％、有利には少なくとも３４％、有利には少なくとも３５％、有利には少なくとも３６％、有利には少なくとも３７％、有利には少なくとも３８％、有利には少なくとも３９％、有利には少なくとも４０％、有利には少なくとも４１％、有利には少なくとも４２％、有利には少なくとも４３％、有利には少なくとも４４％、有利には少なくとも４５％、有利には少なくとも４６％、有利には少なくとも４７％、有利には少なくとも４８％、有利には少なくとも４９％、有利には少なくとも５０％、有利には少なくとも５１％、有利には少なくとも５２％、有利には少なくとも５３％、有利には少なくとも５４％、有利には少なくとも５５％、有利には少なくとも５６％、有利には少なくとも５７％、有利には少なくとも５８％、有利には少なくとも５９％、有利には少なくとも６０％、有利には少なくとも６１％、有利には少なくとも６２％、有利には少なくとも６３％、有利には少なくとも６４％、有利には少なくとも６５％、有利には少なくとも６５６％、有利には少なくとも６７％、有利には少なくとも６８％、有利には少なくとも６９％、有利には少なくとも７０％、有利には少なくとも７１％、有利には少なくとも７２％、有利には少なくとも７３％、有利には少なくとも７４％、有利には少なくとも７５％、有利には少なくとも７６％、有利には少なくとも７７％、有利には少なくとも７８％、有利には少なくとも７９％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８１％、有利には少なくとも８２％、有利には少なくとも８３％、有利には少なくとも８４％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも８６％、有利には少なくとも８７％、有利には少なくとも８８％、有利には少なくとも８９％、有利には少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、有利には少なくとも９２％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９４％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９６％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％、有利には１００％である。
【0100】
本発明方法の別の工程ｅ）の実施形態では、工程ｄ）で得られた前記懸濁液の少なくとも一部を、前記少なくとも１つの混合容器から前記ｎ個の培養容器に移送する場合、ｎ個の各々の培養容器に移送される混合生細胞の前記均質化懸濁液の画分は、同一でも異なってもよい。
【0101】
例として、４つの培養容器が使用される場合、移送工程ｅ）において、４つの培養容器の各々に、混合生細胞の前記均質化懸濁液の全体積の２５％の画分を分配することができる。
【0102】
例として、４つの培養容器が使用される場合、移送工程ｅ）において、第１培養容器に、前記混合容器に含まれる生細胞の前記均質化懸濁液の前記全体積の１０％、第２培養容器に前記全体積の２０％、第３培養容器に前記全体積の３０％及び第４培養容器に前記全体積の５％を移送することができる。
【0103】
例として、４つの培養容器が使用される場合、移送工程ｅ）において、第１培養容器に、前記混合容器に含まれる生細胞の前記均質化懸濁液の全体積の０％、第２培養容器に前記全体積の２０％、第３培養容器に前記全体積の３０％及び第４培養容器に前記全体積の５％を移送することができる。
【0104】
前記例は限定的ではなく、工程ｅ）を説明するためだけの役割を果たす。
【0105】
前記方法の工程ｆ）は、工程ｂ）～ｅ）を繰り返す工程からなる。本発明の目的では、「培養サイクル」は、本方法の工程ｂ）～ｅ）の繰り返しを意味する。
【0106】
本発明の特定の実施形態では、工程ｂ）を繰り返す場合、培養サイクル中に使用される前記選択的状況及び／又は前記培養パラメータは、先行培養サイクルで使用されたものと同じであっても、異なっていてもよい。有利には、使用される前記選択的状況及び／又は前記培養パラメータは、培養サイクルごとに同じであっても異なってもよい。
【0107】
本発明の特定の実施形態では、各培養容器に対して選択される前記選択的状況は、培養サイクルごとに同じであっても異なってもよい。有利には、前記選択的状況は、ケモスタット、タービドスタット、培地スワップ、及び反復バッチを含む群から選択されるが、このリストは非制限的である。
【0108】
本発明の特に有利な実施形態では、所与の培養容器における選択的状況は、互いのサイクルにおいて同じであってよい。例として、所与の培養容器において、ある培養サイクルの間にケモスタット選択的状況を適用し、次いで、同じ培養容器において、次の培養サイクルに対し、その同じ選択的状況を適用することができる。例として、所与の培養容器において、ある培養サイクルの間にタービドスタット選択的状況を適用し、次いで、同じ培養容器において、次の培養サイクルに対し、その同じ選択的状況を適用することができる。上記の例は限定的ではなく、全ての選択的状況に適用することができる。
【0109】
特に有利な別の実施形態では、所与の培養容器内の選択的状況は、１つのサイクルから別のサイクルへと変更されることがある。例えば、所与の培養容器において、ある培養サイクルではケモスタット選択的状況を適用し、次の培養サイクルでは同一の培養容器の選択的培養状況をタービドスタット選択的状況に変更可能である。例えば、所与の培養容器において、ある培養サイクルではケモスタット選択的状況を適用し、次の培養サイクルでは同一の培養容器の選択的培養状況をタービドスタット選択的状況に変更でき、次の培養サイクルでは同一の培養容器の選択的培養状況をケモスタット選択的状況に変更可能である。例えば、所与の培養容器において、ある培養サイクルではケモスタット選択的状況を適用し、次の培養サイクルでは同一の培養容器の選択的培養状況をタービドスタット選択的状況に変更でき、次の培養サイクルでは同一の培養容器の選択的培養状況を培地スワップ選択的状況に変更可能である。上記の例は限定的ではなく、全ての選択的培養状況に適用される。
【0110】
本発明の特定の実施形態では、工程ｂ）を繰り返す場合、使用する培養パラメータは、各培養容器に対して、ある培養サイクルから別の培養サイクルまで同じであっても異なっていてもよい。有利には、培養パラメータは、希釈率、温度、ｐＨ、培地の組成、気体流の組成、及びそれらの組み合わせの１つからなる群から選択され、前記パラメータは、あるサイクルから別のサイクルまで潜在的に同一である。有利には、培養パラメータは、希釈率、温度、ｐＨ、培地の組成、気体流の組成、及びそれらの組み合わせの１つからなる群から選択され、前記パラメータは、あるサイクルから別のサイクルまで潜在的に変更される。有利には、これらの培養パラメータのうち１つだけを変更することも可能、つまり、温度だけを変更したり、ｐＨだけを変更したり、培地の組成だけを変更したり、気体流の組成だけを変更したりすることも可能である。有利には、これらの培養パラメータを同時に変更可能である。有利には、少なくとも２つの培養パラメータ、少なくとも３つの培養パラメータ、少なくとも４つの培養パラメータを同時に変更可能である。
【0111】
本発明に基づく特に有利な実施形態では、第２培養サイクルにおいて、各培養容器ＲＣｉの初期温度Ｔ０ｉは、第１培養サイクルと比較して値ΔＴだけ上昇してもよく、その後、各新規培養サイクルにおいて、培養サイクルごとにΔＴの温度上昇分を受け取ってもよい。有利には、値ΔＴは、０．１℃、有利には０．２℃、有利には０．３℃、有利には０．４℃、有利には０．５℃、有利には０．６℃、有利には０．７℃、有利には０．８℃、有利には０．９℃、有利には１．０℃、有利には１．１℃、有利には１．２℃、有利には１．３℃、有利には１．４℃、有利には１．５℃、有利には１．６℃、有利には１．７℃、有利には１．８℃、有利には１．９℃、有利には２．０℃、有利には２．１℃、有利には２．２℃、有利には２．３℃、有利には２．４℃、有利には２．５℃、有利には２．６℃、有利には２．７℃、有利には２．８℃、有利には２．９℃、有利には３．０℃、有利には３．１℃、有利には３．２℃、有利には３．３℃、有利には３．４℃、有利には３．５℃、有利には３．６℃、有利には３．７℃、有利には３．８℃、有利には３．９℃、有利には４．０℃である。有利には、ΔＴ値は、各新規サイクルにおいて、同じであっても異なっていてもよい。
【0112】
本発明の特に有利な実施形態では、第２培養サイクルにおいて、各培養容器ＲＣｉの初期温度Ｔ０ｉは、第１培養サイクルと比較して値ΔＴだけ下降してもよく、その後、各新規培養サイクルにおいて、培養サイクルごとにΔＴの温度下降分を受け取ってもよい。有利には、値ΔＴは－０．１℃、有利には－０．２℃、有利には－０．３℃、有利には－０．４℃、有利には－０．５℃、有利には－０．６℃、有利には－０．７℃、有利には－０．８℃、有利には－０．９℃、有利には－１．０℃、有利には－１．１℃、有利には－１．２℃、有利には－１．３℃、有利には－１．４℃、有利には－１．５℃、有利には－１．６℃、有利には－１．７℃、有利には－１．８℃、有利には－１．９℃、有利には－２．０℃、有利には－２．１℃、有利には－２．２℃、有利には－２．３℃、有利には－２．４℃、有利には－２．５℃、有利には－２．６℃、有利には－２．７℃、有利には－２．８℃、有利には－２．９℃、有利には－３．０℃、有利には－３．１℃、有利には－３．２℃、有利には－３．３℃、有利には－３．４℃、有利には－３．５℃、有利には－３．６℃、有利には－３．７℃、有利には－３．８℃、有利には－３．９℃、有利には－４．０℃である。有利には、ΔＴ値は、各新規サイクルにおいて、同じであっても異なっていてもよい。
【0113】
本発明の別の特に有利な実施形態では、第２培養サイクルにおいて、初期ｐＨｐＨ（ｉ、ｋ）は、第１培養サイクルと比較して値ΔｐＨだけ上昇してもよく、その後、各新規培養サイクルにおいて、培養サイクルごとにΔｐＨの温度上昇分を受け取ってもよい。有利には、値ΔｐＨは、０．１ｐＨ単位、有利には０．２ｐＨ単位、有利には０．３ｐＨ単位、有利には０．４ｐＨ単位、有利には０．５ｐＨ単位である。有利には、ΔｐＨ値は、各新規サイクルにおいて、同じであっても異なっていてもよい。
【0114】
本発明の別の特に有利な実施形態では、第２培養サイクルにおいて、初期ｐＨｐＨ（ｉ、ｋ）は、第１培養サイクルと比較して値ΔｐＨだけ下降してもよく、その後、各新規培養サイクルにおいて、培養サイクルごとにΔｐＨの温度下降分を受け取ってもよい。有利には、値ΔｐＨは、－０．１ｐＨ単位、有利には－０．２ｐＨ単位、有利には－０．３ｐＨ単位、有利には－０．４ｐＨ単位、有利には－０．５ｐＨ単位である。有利には、ΔｐＨ値は、各新規サイクルにおいて、同じであっても異なっていてもよい。
【0115】
本発明に基づく特に有利な別の実施形態では、第２培養サイクルにおいて、初期培地ＭＣ（ｉ、ｋ）、又は培地ＭＣ（ｉ、ｋ）－許容、及びＭＣ（ｉ、ｋ）－ストレス、の組成を、培養容器ＲＣｉのそれぞれに対して、最初の培養サイクルと比較して変更し、その後、新規培養サイクルごとに更に変更可能である。有利には、１つ又は複数の培地の組成変更は、成長阻害剤などの毒性剤の含有量を増加させることからなる場合がある。有利には、培地の組成変更は、細胞成長に必須な成長因子の含有量の減少からなる場合がある。有利には、培地の組成変更は、１つの基質を別の基質で置き換えることからなる場合がある。有利には、培地の組成変更は、許容培地をストレス培地に置き換えることからなる場合がある。有利には、培地の組成変更は、豊富な培地を最小限の培地に置き換えることからなる場合がある。有利には、培地の組成変更は、最小限の培地を豊富な培地に置き換えることからなる場合がある。有利には、培地の組成変更は、合成培地（規定培地とも呼ばれる）を複合培地（非規定培地とも呼ばれる）に置き換えることからなる場合がある。有利には、培地の組成変更は、複合培地（非規定培地とも呼ばれる）を合成培地（規定培地とも呼ばれる）に置き換えることからなる場合がある。有利には、培地の組成は、新規サイクルごとに同じでも異なっていてもよい。
【0116】
本発明の特に有利な実施形態では、第２培養サイクルにおいて、各培養容器ＲＣｉの希釈率Ｔｄ（ｉ、ｋ）は、第１培養サイクルに比較して値ΔＴｄだけ上昇してもよく、その後、各新規培養サイクルにおいて、ΔＴｄの上昇分を受け取ってもよい。有利には、値ΔＴｄは０．０１ｈ－１、有利には０．０２ｈ－１、有利には０．０３ｈ－１、有利には０．０４ｈ－１、有利には０．０５ｈ－１、有利には０．０６ｈ－１、有利には０．０７ｈ－１有利には０．０８ｈ－１、有利には０．０９ｈ－１、有利には０．１０ｈ－１、有利には０．１５ｈ－１、有利には０．２０ｈ－１、有利には０．０２ｈ－１、有利には０．０２ｈ－１、有利には０．０２ｈ－１、有利には０．２５ｈ－１、有利には０．３０ｈ－１有利には０．３５ｈ－１、有利には０．４０ｈ－１、有利には０．４５ｈ－１、有利には０．５０ｈ－１、有利には０．５５ｈ－１、有利には０．６０ｈ－１、有利には０．６５ｈ－１、有利には０．７０ｈ－１、有利には０．７５ｈ－１、有利には０．８０ｈ－１有利には０．８５ｈ－１、有利には０．９０ｈ－１、有利には０．９５ｈ－１、有利には１．００ｈ－１、有利には１．０５ｈ－１、有利には１．１０ｈ－１、有利には１．１５ｈ－１、有利には１．２０ｈ－１、有利には１．２５ｈ－１、有利には１．３０ｈ－１有利には１．３５ｈ－１、有利には１．４０ｈ－１、有利には１．４５ｈ－１、有利には１．５０ｈ－１である。有利には、ΔＴｄ値は、各新規サイクルにおいて、同じであっても異なっていてもよい。
【0117】
本発明の別の特に有利な実施形態では、第２培養サイクルにおいて、各培養容器ＲＣｉの初期気体流Ｇｉの組成を、第１培養サイクルに比較して変更してもよく、その後、各新規培養サイクルにおいて、更に気体流組成を変更可能である。気体流組成の変更は、フローを構成する１つ又はいくつかの気体の含有量の増加又は減少からなる場合があり、前記気体は、空気、窒素（Ｎ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（Ｃ０２）、メタン（ＣＨ４）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、酸素（Ｏ２）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、水素（Ｈ２）、又はこれらの混合物から選択される。有利には、気体流組成は、各新規サイクルにおいて、同じであっても異なっていてもよい。
【0118】
本発明の別の特に有利な実施形態では、第２培養サイクルにおいて、各培養容器ＲＣｉの懸濁液は１つの培養サイクルに対し、温度Ｔ０＋ΔＴ及びｐＨ ｐＨｋ＋ΔｐＨで維持することができ、その後、各新規培養サイクルにおいて、培養サイクルごとに、ｎ個の培養容器のそれぞれに対し、ΔＴの温度上昇及びΔｐＨのｐＨ上昇を行うことができる。
【0119】
前記例示は、限定的ではなく、単一の培養パラメータの変更又はいくつかの培養パラメータの同時変更に対して等しく適用される。
【0120】
本発明の特定の実施形態では、工程ｂ）を繰り返す場合、使用する選択的状況及び／又は培養パラメータは、１つの培養サイクルから別の培養サイクルへ変更することができ、前記変更は、全てのｎ個の培養容器に適用される。いかなる変更がなされようとも、全てのｎ個の培養容器に適用される。
【0121】
本発明の別の特定の実施形態では、工程ｂ）を繰り返す場合、使用する選択的状況及び／又は培養パラメータは、１つの培養サイクルから別の培養サイクルへ変更でき、前記変更は、全てのｎ個の培養容器に適用されるわけではない。
【0122】
本発明の別の特定の実施形態では、工程ｂ）を繰り返す場合、選択的状況は、１つの培養サイクルから別の培養サイクルへ変更でき、前記変更は、全てのｎ個の培養容器に適用されるわけではない。
【0123】
例として、工程ｂ）において、１つの培養サイクルにおいて、培養容器ＲＣｉはケモスタット選択的状況を受けることができ、残りのｎ－１個の培養容器はタービドスタット選択的状況を受けることができ、その後、新規培養サイクルごとに選択的状況の変更が可能である。
【0124】
例として、工程ｂ）において、１つの培養サイクルにおいて、培養容器ＲＣ１はケモスタット選択的状況を受け、培養容器ＲＣ２はタービドスタット選択的状況を受け、残りのｎ－２個の培養容器は培地スワップ選択的状況を受けてよく、その後、新規培養サイクルごとに選択的状況の変更が可能である。
【0125】
上記例示は限定的ではなく、全ての選択的培養状況に当てはまる。
【0126】
本発明の特定の有利な実施形態では、工程ｂ）を繰り返す場合、使用する培養パラメータは、１つの培養サイクルから別の培養サイクルへ変更でき、前記変更は、全てのｎ個の培養容器に適用されるわけではない。
【0127】
例として、工程ｂ）において、１つの培養サイクルにおいて、培養容器ＲＣ１は温度Ｔ０＋０．１℃に維持することができ、残りのｎ－１個の培養容器は初期温度Ｔ０に維持することができ、その後、各新規培養サイクルにおいて、培養サイクルごとにｎ個の培養容器のそれぞれに対し、０．１℃の温度上昇を行うことができる。この場合、第２サイクルにおいて、培養容器ＲＣ１は温度Ｔ０＋０．２℃に維持され、残りのｎ－１個の培養容器は温度Ｔ０＋０．１℃に維持されるであろう。その後は同様である。
【0128】
他の例として、工程ｂ）において、１つの培養サイクルにおいて、培養容器ＲＣ１は温度Ｔ０＋０．２℃に維持することができ、培養容器ＲＣ２は温度Ｔ０＋０．１℃に維持することができ、残りのｎ－２個の培養容器は初期温度Ｔ０に維持することができ、その後、各新規培養サイクルにおいて、培養サイクルごとにｎ個の培養容器のそれぞれに対し、０．１℃の温度上昇を行うことができる。この場合、第２サイクルにおいて、培養容器ＲＣ１は温度Ｔ０＋０．３℃に維持され、培養容器ＲＣ２は温度Ｔ０＋０．２℃に維持され、残りのｎ－２個の培養容器は温度Ｔ０＋０．１℃に維持されるであろう。その後は同様である。
【0129】
上記例示は限定的ではなく、単一の培養パラメータの変更及びいくつかの培養パラメータの同時変更に等しく適用される。
【0130】
本発明の特定の実施形態では、所望の表現型を獲得した生細胞が出現するまで、 工程ｂ）からｅ）は必要なだけ繰り返される。
【0131】
本発明の特定の実施形態では、選択的状況及び／又は培養パラメータは、先行サイクルの培養に関する観察可能／測定可能な基準に応答して自動的に適合させることができる。例えば、細胞成長抑制分子の温度又は濃度などの選択圧基準は、先行サイクルで細胞成長率が所定の閾値より小さい／より大きい値であれば、現行サイクルでその値が変更される場合がある。あるいは、生細胞の懸濁液を阻害分子の目標濃度に適応させるために数サイクルの進化を実施した後（培地スワップモード）、細胞の成長速度を上げるために培養パラメータを変更できる（タービドスタットモード）。
【0132】
本方法の工程ｇ）は、前記ｎ個の培養容器の少なくとも１つにおいて、数サイクル培養した後に所望の表現型を獲得した生細胞を回収することからなる。
【0133】
有利には、所望の表現型は、進化的適応、特に生細胞による有益な突然変異の数世代にわたる蓄積によって獲得され、有益な突然変異は、例えば、紫外線への曝露後、１つ以上の変異原性物質への曝露後、又は生物の自然突然変異率より高い突然変異率をもたらす遺伝子組み換え後、自然発生的であるかに関わらず得られる。
【0134】
本発明の特定の実施形態では、回収工程ｇ）は、採取手段を用いて行われ、該採取手段は滅菌シリンジ、滅菌マイクロピペット、又は所望の表現型を獲得した生細胞をサンプリングする他のあらゆる手段から選択することができる。
【0135】
有利には、所望の表現型を獲得した生細胞は、２サイクル後、有利には３サイクル後、有利には４サイクル後、有利には５サイクル後、有利には６サイクル後、有利には７サイクル後、有利には８サイクル後、有利には９サイクル後、有利には１０サイクル後、有利には２０サイクル後、有利には３０サイクル後、有利には４０サイクル後、有利には５０サイクル後、有利には６０サイクル後、有利には７０サイクル後、有利には８０サイクル後、有利には９０サイクル後、有利には１００サイクル後、有利には１５０サイクル後、有利には２００サイクル後、有利には２５０サイクル後、有利には３００サイクル後、有利には３５０サイクル後、有利には４００サイクル後、有利には４５０サイクル後、有利には５００サイクル後、有利には５５０サイクル後、有利には６００サイクル後、有利には６５０サイクル後、有利には７００サイクル後、有利には７５０サイクル後、有利には８００サイクル後、有利には８５０サイクル後、有利には９００サイクル後、有利には９５０サイクル後、有利には１０００サイクル後、有利には５０００サイクル後、有利には１００００サイクル後、有利には１５０００サイクル後、有利には２００００サイクル後、有利には２５０００サイクル後、有利には３００００サイクル後、有利には３５０００サイクル後、有利には４００００サイクル後、有利には４５０００サイクル後、有利には５００００培養サイクル後に回収される。
【0136】
本発明の特定の実施形態では、本方法は更にｎ個の培養容器と少なくとも１つの混合容器に対する少なくとも１つの滅菌工程を任意に含めることができる。有利には、少なくとも１つの滅菌工程は、少なくとも１つの培養容器及び／又は少なくとも１つの混合容器が空になるとすぐに実施する。有利には、少なくとも１つの滅菌工程は、培養容器に対し、工程ｃ）の後に実施される。有利には、少なくとも１つの滅菌工程は、少なくとも１つの混合容器に対し、工程ｅ）の後に実施される。１つの特定の実施形態では、少なくとも１つの滅菌工程は、アンモニア等の弱塩基を含む溶液、苛性アルカリ（ＮａＯＨ）又はカリウム（ＫＯＨ）等の強塩基を含む溶液、硫酸、塩酸等の強酸を含む溶液、酢酸等の弱酸を含む溶液、過酸化水素及び次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤、エタノール及びイソプロパノール等の溶剤を含む溶液、又はこれらの組み合わせから選択される滅菌液を添加することにより実施される。有利には、上記溶液の組み合わせの場合、該溶液は同時に又は連続的に、すなわち順々に使用することができる。有利には、滅菌液は、苛性アルカリ溶液であり、好ましくは少なくとも０．１Ｍの苛性アルカリ溶液であり、さらに好ましくは１Ｍより大である。有利には、滅菌工程は例えば特許ＥＰ１１３５４６０に記載されているように、すなわち、一時的に、生細胞懸濁液の全体積を培養又は混合容器から貯蔵容器に移送し、次いで培養又は混合容器の全内部表面を滅菌液と接触させ、リンス液がそれに続くようにして、実施することができる。その後、生細胞懸濁液は滅菌された初期培養又は混合容器に戻される。
【0137】
有利には、前記滅菌工程は、一方ではバイオフィルムを除くことを可能とし、他方では少なくとも１つの培養容器及び少なくとも１つの混合容器を、それらの各初期状態に応じた名目上の滅菌状態に戻すことを可能とする。
【0138】
本発明の特定の実施形態では、本方法は、更にｎ個の培養容器と少なくとも１つの混合容器に対する少なくとも１つの洗浄工程を任意に含めることができる。有利には、少なくとも１つの洗浄工程は、少なくとも１つの滅菌工程の後に実施される。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄工程は、滅菌剤を中和することが可能な洗浄液を添加することにより実施される。有利には、洗浄液は、酢酸溶液や硫酸溶液等の酸性溶液及び清浄液、特に界面活性剤を含む溶液から選択される。
【0139】
本発明の特定の実施形態では、本方法は、更にｎ個の培養容器と少なくとも１つの混合容器に対する少なくとも１つのリンス工程を任意に含めることができる。
有利には、少なくとも１つのリンス工程は、少なくとも１つの洗浄工程の後に実施される。特定の実施形態では、少なくとも１つのリンス工程は、洗浄液の残りを除去することを可能にするリンス液を添加することにより実施される。有利には、リンス液は水であり、好ましくは滅菌水である。
有利には、少なくとも１つのリンス工程は、少なくとも１つの洗浄工程の後に実施される。特定の実施形態では、少なくとも１つのリンス工程は、洗浄液の残りを除去することを可能にするリンス液を添加することにより実施される。有利には、リンス液は水であり、好ましくは滅菌水である。
【0140】
本発明の特定の実施形態では、本方法は、更に少なくとも１つの紫外線への曝露工程及び／又は変異原性物質への曝露工程を任意に含めることができる。有利には、少なくとも１つの紫外線への曝露工程及び／又は変異原性物質への曝露工程は、本発明方法のいずれかの時点で行うことができる。本発明の特に有利な実施形態では、紫外線への曝露工程は、本発明方法の工程ｃ）と工程ｄ）の間で行われるか、又は本発明方法の工程ｄ）と工程ｅ）の間で行われる。
【0141】
本発明の別の特に有利な実施形態では、変異原性物質への曝露工程は、本発明方法の工程ｃ）と工程ｄ）の間で行われるか、又は本発明方法の工程ｄ）と工程ｅ）の間で行われる。有利には、変異原性物質は、Ｎ―ニトロソーＮ―エチルウレア（Ｎ―エチルーＮ―ニトロソウレア（ＥＮＵ）とも呼ばれる）又はエチルメタンスルホン酸（エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）とも呼ばれる）等のアルキル化剤、プロフラビンやアクリジンオレンジ等の挿入剤、及び活性酸素種、特にフリーラジカル、酸素イオン、及び過酸化物から選択することができる。
【0142】
本発明方法は、前記生細胞の進化的適応のために生細胞を連続培養する装置で実施することができ、前記装置は以下で構成される：
－ ｎ個の培養容器であり、各培養容器は、培地及び生細胞を受け入れるように配置されている、
－ 少なくとも１つの混合容器、及び
－ 少なくとも１つの培地槽を含む少なくとも１つの無菌流体供給装置で、前記無菌流体供給装置は、主供給ラインを介して前記ｎ個の培養容器及び前記少なくとも１個の混合容器に接続されている。
－ ｎ個の培養容器であり、各培養容器は、培地及び生細胞を受け入れるように配置されている、
－ 少なくとも１つの混合容器、及び
－ 少なくとも１つの培地槽を含む少なくとも１つの無菌流体供給装置で、前記無菌流体供給装置は、主供給ラインを介して前記ｎ個の培養容器及び前記少なくとも１個の混合容器に接続されている。
【0143】
有利には、前記無菌流体供給装置における流体の循環、すなわち、気体の循環、滅菌液、洗浄液、及びリンス液の循環、培地の循環は、ポンプ及びバルブの使用を通じて達成される。前記ポンプ及びバルブは、例えば機械的に操作することができ、電気的又は電子的に、有利には、示されていない制御手段を使用して自動的に制御することができる。
【0144】
特定の実施形態では、前記無菌流体供給装置は、少なくとも１つの外部気体源、少なくとも１つの滅菌液槽、少なくとも１つの洗浄液槽、少なくとも１つのリンス液槽、及び少なくとも１つの培地槽を含む。特定の実施形態では、前記無菌流体供給装置は更に、ｎ個の培養容器のそれぞれに生細胞を導入し、所望の表現型を獲得した生細胞の回収を可能にする、採取手段、有利にはシリンジを含む。代替の実施形態では、所望の表現型を獲得した生細胞は、他の分析装置への流体接続手段により回収される。
【0145】
有利には、ｎ個の培養容器の各々は更に、少なくとも１つの気体供給装置を含むことができる。少なくとも１つの気体供給装置は、加圧気体流を培養容器に注入することを可能にし、懸濁液の成長に必要な気体の供給及び該懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。有利には、少なくとも１つの気体供給装置は、移送流と呼ばれる加圧気体流を培養容器に注入することを可能にし、これにより前記培養容器内の圧力を上昇させて、シリンジのプランジャのように懸濁液を混合容器に押し出すことが可能となる。
【0146】
代替的に、少なくとも１つの気体供給装置に加えて、ｎ個の培養容器の各々は更に、少なくとも１つの移送気体供給装置を含むことができる。この場合、移送流は、単独で及び直接的に少なくとも１つの移送気体供給装置から来て、曝気流及び撹拌流は、単独で少なくとも１つの気体供給装置から来る。移送流の使用は、前記培養容器内の圧力を上昇させて、シリンジのプランジャのように懸濁液を混合容器に押し出す。
【0147】
有利には、ｎ個の培養容器の各々は更に、少なくとも１つの供給ラインを含むことができる。少なくとも１つの供給ラインは、培養容器を少なくとも１つの培地槽からの培地で充填し、また、培養容器を対応する槽からの滅菌液、洗浄液、及びリンス液で充填することを可能にする。
【0148】
供給ラインはまた、前記培養容器を加圧し、培養容器を空にすることにより、懸濁液の全部又は一部を培養容器から混合容器に移送することを可能にする。また少なくとも１つの供給ラインは、懸濁液の全部又は一部を混合容器から培養容器に移送する場合、培養容器の充填を可能にする。供給ラインはまた、滅菌、洗液、及びリンスの操作において、培養容器の内容物を廃棄物槽に流入させて空にすることを可能にする。
【0149】
供給バルブは、供給ラインへのアクセスを制御し、培養容器を充填すること又は空にすることを可能にする。
【0150】
有利には、ｎ個の培養容器の各々は更に、少なくとも１つの放出装置を含むことができ、それは培養容器の充填操作の間において、気体、１又は複数の培地、及び滅菌液、洗浄液、及びリンス液の放出だけでなく、培養の間にバブリングガスの放出を可能にする。
【0151】
有利には、ｎ個の培養容器の各々は更に、少なくとも１つのレベリングライン（leveling line）を含むことができる。少なくとも１つのレベリングラインは、培養容器内の懸濁液の体積を制御することを可能にする。有利には、レベリングバルブは、レベリングラインへのアクセスを制御する。有利には、レベリングラインは、前記培養容器の底面から前記培養容器の全高の半分以下の高さに配置される。
【0152】
より有利には、ｎ個の培養容器の各々は更に、以下を含むことができる：
－ 少なくとも１つの気体供給装置、
－ 少なくとも１つの放出装置、
－ 少なくとも１本のレベリングライン、及び
－ 少なくとも１つの供給ライン。
－ 少なくとも１つの気体供給装置、
－ 少なくとも１つの放出装置、
－ 少なくとも１本のレベリングライン、及び
－ 少なくとも１つの供給ライン。
【0153】
特定の実施形態では、ｎ個の培養容器の各々は、以下を含む：
－ 培養容器の下部にある少なくとも１つの気体供給装置、
－ 培養容器の上部にある少なくとも１つの放出装置、
－ 前記培養容器の底面から前記培養容器の全高の半分以下の高さにある少なくとも１本のレベリングライン、及び
－ 培養容器の下部にある少なくとも１つの供給ライン。
－ 培養容器の下部にある少なくとも１つの気体供給装置、
－ 培養容器の上部にある少なくとも１つの放出装置、
－ 前記培養容器の底面から前記培養容器の全高の半分以下の高さにある少なくとも１本のレベリングライン、及び
－ 培養容器の下部にある少なくとも１つの供給ライン。
【0154】
有利には、培養容器は閉鎖系培養容器である。培養容器は使い捨て又は再利用可能でありうる。特に有利には、培養容器は再利用可能である。
【0155】
特定の実施形態では、ｎ個の培養容器の各々は、培地内の生細胞を含む。有利には、前記装置の培養容器は空でない。
【0156】
特定の実施形態では、培養装置は、全てのｎ個の培養容器及び少なくとも１つの混合容器に対する単一の無菌流体供給装置を含む。
【0157】
別の特定の実施形態では、培養装置は、培養容器ごとに無菌流体供給装置を含む。有利には、ｎ個の培養容器の各々は、個別に及び独立して無菌流体供給装置に接続されている。無菌流体供給装置は供給バルブを介してその培養容器に接続されている。
【0158】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの混合容器は、少なくとも２つの培養容器の内容物を受け取るように配置された培養容器である。
【0159】
本発明の別の特定の実施形態では、少なくとも１つの混合容器は、単一の容器で、一組のｎ個の培養容器から独立しており、一組のｎ個の培養容器の内容物を受け取るように配置される。
【0160】
有利には、混合容器が、単一の容器で、一組の培養容器から独立している場合、前記混合容器には以下が含まれる：
－ 前記混合容器の上部にある気体供給装置、
－ 前記混合容器の上部にある放出装置、
－ 前記混合容器の下部にある供給ライン。
－ 前記混合容器の上部にある気体供給装置、
－ 前記混合容器の上部にある放出装置、
－ 前記混合容器の下部にある供給ライン。
【0161】
有利には、混合容器は閉鎖系培養容器である。混合容器は再利用可能な容器である。
【0162】
特定の実施形態では、混合容器は撹拌手段、有利には機械的撹拌機又はガス注入による撹拌手段を含む。
【0163】
特定の実施形態では、培養装置は更に、全ての異なる供給手段、特にポンプ及びバルブを作動させるように配置・構成される制御装置を含む。それは少なくとも１つの培養容器の内容物の少なくとも１つの混合容器への移送、及びその逆を可能にする。
【0164】
有利には、培養装置は、前記制御装置によって制御される。
【0165】
特定の実施形態では、培養装置は更に、各培養容器において細胞密度を含む物理的／化学的インジケータを測定、懸濁液の成長動態を測定、及びｎ個の混合容器における懸濁液混物の自動発動を制御させるように配置・構成される制御装置を含む。
【図面の簡単な説明】
【0166】
【0167】
【0168】
【0169】
【0170】
【0171】
【0172】
【0173】
【0174】
【0175】
【0176】
【0177】
【0178】
【発明を実施するための形態】
【0179】
【0180】
生細胞の連続培養装置は、図１ａから図２ｃに示されているように、３つの培養容器、第１培養容器ＲＣ１、第２培養容器ＲＣ２、及び第３培養容器ＲＣ３を含む。第１培養容器ＲＣ１は、第２培養容器ＲＣ２に隣接しており、これは第３培養容器ＲＣ３に隣接している。前記培養容器は生細胞と培地を含むようにして配置されており、そのため該細胞の培養が可能となる。
【0181】
図１ａを参照すると、培養装置には、外部気体源ＧＳ、滅菌液槽ＡＳ、洗浄液槽ＡＣ、リンス液槽ＡＲ、及び３つの培地槽Ｍ１、Ｍ２及びＭ３からなる無菌流体供給装置１０が含まれる。無菌流体供給装置１０における流体の循環、つまり、気体の循環、滅菌液、洗浄液及びリンス液の循環、並びに培地の循環は、ポンプ及びバルブなどを使用して実現される。ポンプ及びバルブは、例えば機械的に操作でき、電気的及び／又は電子的に、有利には図示されていない制御手段を用いて自動的に制御できる。無菌流体供給装置１０は、培養容器に細胞を導入し、所望の表現型を獲得した生細胞を採取するための採取手段、有利にはシリンジ１１を含む。簡単にするために、図１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３、及び４では、無菌流体供給装置１０をブロック又は四角形で示している。
【0182】
図１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃを参照すると、培養装置は、主供給ラインＣ１０と、主供給ラインＣ１０に接続された供給バルブ１、２、３、Ｖａ１、Ｖａ２、及びＶａ３を含む。前記供給ラインＣ１０及び前記バルブは、前記培養容器の底部に配置されている。無菌流体供給装置１０は、前記供給ラインＣ１０及び前記バルブを介して３つの培養容器に接続されている。それらにより気体、滅菌液、洗浄液、及びリンス液、培地及び生細胞を培養容器に入れることができる。また、それらは、例えば、懸濁液の全部又は一部を混合容器から培養容器に移送する際に、培養容器の内容物の移送を可能にし、懸濁液の全部又は一部を培養容器から混合容器に移送する際に、培養容器を空にすることを可能にする。供給バルブＶａ１により、培養容器ＲＣ１の充填又は空にすることが可能である。供給バルブＶａ２により、培養容器ＲＣ２の充填又は空にすることが可能である。供給バルブＶａ３により、培養容器ＲＣ３の充填又は空にすることが可能である。バルブ１、２、３、Ｖａ１、Ｖａ２、Ｖａ３は、非動作状態では通常閉じている。供給バルブＶａｉが開位置にある場合、培養容器ＲＣｉを充填又は空にすることができる。供給バルブＶａｉが閉位置にある場合、培養容器ＲＣｉを充填又は空にすることができない。
【0183】
前記培養装置は、３つの気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３を含む。それぞれの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３は、気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、又はＧ３に接続されており、これにより、加圧気体流を培養容器に注入し、懸濁液にガスを注入し、前記懸濁液を均質化（バブリング撹拌）し、必要に応じて培養容器を加圧することが可能である。それぞれの気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、又はＧ３は、前記培養容器の底面から前記培養容器の全高の約４分の１の高さで培養容器内に開口する気体供給ラインＣＧにより、その底部から培養容器に接続されている。
【0184】
前記培養装置は、３つの放出装置Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３を含む。培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれには、放出装置Ｗ１、Ｗ２、又はＷ３が接続され、培養中に懸濁液に注入された気体の排出、培養容器への充填作業中の、１つ又は複数の培地や滅菌液、洗浄液、及びリンス液からの気体排出を可能としている。前記放出装置は、培養容器の上部に設置されている。前記培養装置は、３つの放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、及びＶｄ３を含む。それぞれの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３には、それぞれ放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、又はＶｄ３が接続され、培養中に注入された気体の放出を制御すると共に、培養容器への充填作業中に、１つ又は複数の培地や滅菌液ＡＳ、洗浄液ＡＣ、及びリンス液ＡＲからも気体放出を制御するようになっている。放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、及びＶｄ３は、通常、非動作状態では開位置にある。放出バルブが開位置にある場合、培養容器は充填することができる。放出バルブが閉位置にある場合、培養容器に含まれる懸濁液の全部又は一部の混合容器への移送は、前記培養容器を加圧することで実行できる。
【0185】
図１ａ、１ｂ、１ｃを参照すると、前記培養装置は、３つのレベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、及びＶｔ３を含む。それぞれの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３は、それぞれレベリングラインＣＴを介してレベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、及びＶｔ３に接続されている。それぞれのレベリングラインＣＴは、培養容器の下部から前記培養容器の全高の半分以下の高さで培養容器内に開口している。それぞれのレベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、及びＶｔ３は、主ラインＣ１０にも接続されている。それぞれのレベリングバルブは、それぞれの各培養容器内の容積を制御し、培養液を加えても容積が一定に保たれる。レベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、及びＶｔ３は、通常、非動作状態では閉位置にある。レベリングバルブが開位置にある場合、レベリングラインの位置で規定される懸濁液量を超える量の懸濁液が、培養容器から供給ラインＣ１０に放出される。
【0186】
図１ａ、１ｂ、１ｃは、特定の第１実施形態を表し、本細胞培養方法を実施する間において、３つの培養容器はそれぞれ連続的に混合容器となるように配置される。
【0187】
図１ａ、１ｂ、及び１ｃにおいて示される前記培養装置が関連する、生細胞を連続細胞培養する方法が以下に述べられる。
【0188】
図１ａに基づき、３つの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３の各々は、培地中の生細胞を含む。それぞれの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３は、約半分の容量まで充填されている。生細胞は、３つの培養容器のそれぞれに生細胞の懸濁液を得るために、所与の成長段階に達するまで、定められた培養パラメータを用いて、所与の選択的状況に基づいて培養される。この目的で、気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、又はＧ３を介して３つの培養容器のそれぞれに加圧気体流を注入し、３つの培養容器のそれぞれの内部で気体の注入と懸濁液の均質化（バブリング撹拌）とを実行できる。バルブ１、２、３、４、レベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、及びＶｔ３、並びに供給バルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３は閉位置である。放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、及びＶｄ３だけが、開位置にある。
【0189】
次に、図１ｂは、工程ｂ）で得られた懸濁液全体を少なくとも１つの培養容器（ＲＣｉ）から少なくとも１つの混合容器に移送することで構成される本発明方法の工程ｃ）、及び少なくとも１つの混合容器内で工程ｃ）の懸濁液を混合することで構成される工程ｄ）を表している。
【0190】
図１ｂによれば、矢印ｆ１２で示すように、培養容器ＲＣ１内の懸濁液は全て培養容器ＲＣ２に移送される。供給バルブＶａ１、２、Ｖａ２は動作位置（図１ｂの黒）にあり、開口しているため、第１容器ＲＣ１から第２培養容器ＲＣ２への懸濁液は前記バルブを通って通過する。第１容器の放出バルブＶｄ１は動作位置（図１ｂの黒）にあり、閉口しているため、第１培養容器を加圧する。第２容器の放出バルブＶｄ２は、第２培養容器ＲＣ２への充填を可能にするため、非動作であり、開位置のままである。培養容器ＲＣ１を空にできるように、気体供給装置Ｇ１は、気体供給ラインＣＧを介して移送流と呼ばれる加圧気体流を注入して、培養容器ＲＣ１内の圧力を上昇させ、これにより、シリンジのプランジャのように懸濁液を押し出すことが可能となる。その後、培養容器ＲＣ２は混合容器となり、第２培養容器ＲＣ２に最初に含まれる懸濁液と第１培養容器ＲＣ１からの懸濁液の両方を含む。
【0191】
図示しない方法で、加圧気体流が第２培養容器ＲＣ２に気体供給装置Ｇ２を介して注入され、培養容器ＲＣ２内の懸濁液への気体注入及び細胞懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。
【0192】
第３培養容器ＲＣ３に関しては、前記培養工程は、培養容器ＲＣ３に加圧気体流を注入することにより、及び、バルブＶｄ３を開いたままにすることにより、維持される。
【0193】
培養容器ＲＣ１に関しては、バルブ１、Ｖａ１を開くことにより、滅菌、洗浄、及びリンス工程が実行される。最初に、滅菌液槽ＡＳから滅菌液を培養容器ＲＣ１に添加する滅菌工程を開始する。滅菌液を空にすることは、バルブＶａ１によって実行される。その後、洗浄液槽ＡＣから培養容器ＲＣ１へ洗浄液を加える。洗浄液を空にすることは、バルブＶａ１によって実行される。その後、リンス液槽ＡＲから培養容器ＲＣ１へリンス液を加える。リンス液を空にすることは、バルブＶａ１によって実行される。これらの工程は表現されていない。
【0194】
図１ｃによれば、矢印ｆ２１で示すように、培養容器ＲＣ２内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ１に移送される。レベリングバルブＶｔ２及び供給バルブＶａ１並びに２は動作位置（図１ｃの黒）にあり、開口しているため、第２容器ＲＣ２からの懸濁液の一部は、前記バルブを通って第１培養容器ＲＣ１に送られる。第２容器の放出バルブＶｄ２は動作位置（図１ｃの黒）にあり、閉口しているため、ＲＣ２が加圧され、懸濁液の半分がＲＣ１へ移送される。第１容器の放出バルブＶｄ１は、第１培養容器ＲＣ１への充填を可能にするため、非動作であり、開位置のままである。培養容器ＲＣ２を空にできるように、気体供給装置Ｇ２は、気体供給ラインＣＧを介して移送流と呼ばれる加圧気体流を注入し、これにより第２培養容器ＲＣ２内の圧力が上昇するため、移送ラインを介してシリンジのプランジャのように懸濁液を押し出すことが可能となる。
【0195】
図示しない方法で、加圧気体流が培養容器ＲＣ１及びＲＣ２それぞれに気体供給装置Ｇ１及びＧ２を介して注入され、培養容器ＲＣ１及びＲＣ２内の懸濁液への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。
【0196】
図１ｂによれば、矢印ｆ３１で示されるように、培養容器ＲＣ３内の懸濁液は全て培養容器ＲＣ１に移送される。供給バルブＶａ３、３、２、Ｖａ１は動作位置にあり、開口しているため、第３容器ＲＣ３から第１培養容器ＲＣ１への懸濁液は前記バルブを通って通過する。第３容器の放出バルブＶｄ３は動作位置にあり、閉口しているため、第３培養容器を加圧する。第１容器の放出バルブＶｄ１は、第１培養容器ＲＣ１への充填を可能にするため、非動作であり、開位置のままである。培養容器ＲＣ３を空にできるように、気体供給装置Ｇ３は、気体供給ラインＣＧを介して移送流と呼ばれる加圧気体流を注入して、これにより培養容器ＲＣ３内の圧力を上昇させ、シリンジのプランジャのように懸濁液を押し出すことが可能となる。その後、培養容器ＲＣ１は混合容器となり、第１培養容器ＲＣ１に最初に含まれる懸濁液と第３培養容器ＲＣ３からの懸濁液の両方を含む。
【0197】
図示しない方法で、加圧気体流は第１培養容器ＲＣ１に気体供給装置Ｇ１を介して注入され、懸濁液への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。
【0198】
第２培養容器ＲＣ２に関しては、前記培養工程は、加圧気体流を培養容器ＲＣ２に注入することにより、及び、バルブＶｄ２を開いたままにすることにより、維持される。
【0199】
培養容器ＲＣ３に関しては、バルブ１、２、３、及びＶａ３を開くことにより、滅菌、洗浄、及びリンス工程が実行される。最初に、滅菌液槽ＡＳから滅菌液を培養容器ＲＣ３に添加する滅菌工程を開始する。滅菌液を空にすることは、バルブＶａ３によって実行される。その後、洗浄液槽ＡＣから培養容器ＲＣ３へ洗浄液を加える。洗浄液を空にすることは、バルブＶａ３によって実行される。その後、リンス液槽ＡＲから培養容器ＲＣ３へリンス液を加える。リンス液を空にすることは、バルブＶａ３によって実行される。これらの工程は表現されていない。
【0200】
図１ｃによれば、矢印ｆ１３で示されるように、培養容器ＲＣ１内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ３に移送される。レベリングバルブＶｔ１及び供給バルブ２、３、並びにＶａ３は動作位置にあり、開口しているため、第１容器ＲＣ１からの懸濁液の一部は、前記バルブを通って第３培養容器ＲＣ３に送られる。第１容器の放出バルブＶｄ１は動作位置にあり、閉口しているため、ＲＣ１が加圧され、懸濁液の半分がＲＣ３へ移送される。第３容器の放出バルブＶｄ３は、第３培養容器ＲＣ３への充填を可能にするため、非動作であり、開位置のままである。培養容器ＲＣ１を空にできるように、気体供給装置Ｇ１は、気体供給ラインＣＧを介して移送流と呼ばれる加圧気体流を注入し、これにより第１培養容器ＲＣ１内の圧力が上昇するため、移送ラインを介してシリンジのプランジャのように懸濁液を押し出すことが可能となる。
【0201】
図示しない方法で、加圧気体流は培養容器ＲＣ１及びＲＣ３の両方それぞれに気体供給装置Ｇ１及びＧ３を介して注入され、培養容器ＲＣ１及びＲＣ３内の懸濁液への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。
【0202】
図１ｂによれば、矢印ｆ２３で示されるように、培養容器ＲＣ２内の全ての懸濁液が培養容器ＲＣ３に移送される。供給バルブＶａ２、３、Ｖａ３は動作位置にあり、開口しているため、第２容器ＲＣ２からの懸濁液は、前記バルブを通って第３培養容器ＲＣ３に送られる。第２容器の放出バルブＶｄ２は動作位置にあり、閉口しているため、第２培養容器が加圧される。第３容器の放出バルブＶｄ３は第３培養容器ＲＣ３への充填を可能にするため、非動作位置にあり、開口のままである。培養容器ＲＣ２を空にできるように、気体供給装置Ｇ２は、気体供給ラインＣＧを介して移送流と呼ばれる加圧気体流を注入し、これにより培養容器ＲＣ２内の圧力が上昇するため、シリンジのプランジャのように懸濁液を押し出すことが可能となる。その後、培養容器ＲＣ３は混合容器となり、当初第３培養容器ＲＣ３に含まれていた懸濁液と第２培養容器ＲＣ２からの懸濁液の両方を含む。
【0203】
図示しない方法で、加圧気体流は第３培養容器ＲＣ３に気体供給装置Ｇ３を介して注入され、培養容器ＲＣ３内の懸濁液への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。
【0204】
第１培養容器ＲＣ１に関しては、前記培養工程は、加圧気体流を培養容器ＲＣ１に注入することにより、及び、バルブＶｄ１を開いたままにすることにより、維持される。
【0205】
培養容器ＲＣ２に関しては、バルブ１、２、及びＶａ２を開くことにより、滅菌、洗浄、及びリンス工程が実行される。最初に、滅菌液槽ＡＳから滅菌液を培養容器ＲＣ２に添加する滅菌工程を開始する。滅菌液を空にすることは、バルブＶａ２によって実行される。その後、洗浄液槽ＡＣから培養容器ＲＣ２へ洗浄液を加える。洗浄液を空にすることは、バルブＶａ２によって実行される。その後、リンス液槽ＡＲから培養容器ＲＣ２へリンス液を加える。リンス液を空にすることは、バルブＶａ２によって実行される。これらの工程は表現されていない。
【0206】
図１ｃによれば、矢印ｆ３２で示されるように、培養容器ＲＣ３内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ２に移送される。レベリングバルブＶｔ３及び供給バルブＶａ２並びに３は動作位置にあり、開口しているため、第３容器ＲＣ３からの懸濁液の一部は、前記バルブを通って第２培養容器ＲＣ２に送られる。第３容器の放出バルブＶｄ３は動作位置にあり、閉口しているため、ＲＣ３が加圧され、懸濁液の半分がＲＣ２へ移送される。第２容器の放出バルブＶｄ２は、第２培養容器ＲＣ２への充填を可能にするため、非動作であり、開位置のままである。培養容器ＲＣ３を空にできるように、気体供給装置Ｇ３は、気体供給ラインＣＧを介して移送流と呼ばれる加圧気体流を注入し、これにより第３培養容器ＲＣ３内の圧力が上昇するため、移送ラインを介してシリンジのプランジャのように懸濁液を押し出すことが可能となる。
【0207】
図示しない方法で、加圧気体流は培養容器ＲＣ２及びＲＣ３の両方それぞれに気体供給装置Ｇ２及びＧ３を介して注入され、培養容器ＲＣ２及びＲＣ３内の懸濁液への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。
【0208】
加圧気体流は３つの培養容器のそれぞれに気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、又はＧ３それぞれを介して再び注入され、３つの培養容器のそれぞれ内の懸濁液への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。供給バルブ１、２、３、レベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、及びＶｔ３、及び供給バルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３は閉位置にある。放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、及びＶｄ３のみが開位置にある。
【0209】
所望の表現型を獲得した生細胞が得られるまで、先行する工程は必要なだけ繰り返される。
【0210】
細胞が所望する表現型を獲得したときに、回収工程が実施される。この工程は示されていない。また回収工程は数回の混合サイクル後に行うことができる。好ましくは、回収工程は、採取手段、特にはシリンジ１１を用いて行われる。
【0211】
回収工程が実行されると、放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、及びＶｄ３が閉じることにより、外部気体源ＧＳから加圧気体流が注入され、及び、供給バルブＶａ１、Ｖａ２、Ｖａ３、並びに２、３が開かれることにより、全ての培養容器が空になる。その後、バルブ１、Ｖａ１、Ｖｄ１、２、Ｖａ２、Ｖｄ２、３、Ｖａ３、Ｖｄ３を開くことにより、滅菌、洗浄、及びリンスの各工程が実行される。最初に、滅菌液槽ＡＳから滅菌液を培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれに添加する滅菌工程を開始する。滅菌液を空にすることは、それぞれのバルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３によって実行される。その後、洗浄液槽ＡＣから培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれへ洗浄液を加える。洗浄液を空にすることは、それぞれのバルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３によって実行される。その後、リンス液槽ＡＲから培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれへリンス液を加える。リンス液を空にすることは、それぞれのバルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３によって実行される。これらの工程は、図１ａ、図１ｂ、及び図１ｃに示されていない。
【0212】
図２ａ、２ｂ、２ｃは、前記培養装置が前記培養容器から独立した単一の混合容器を含み、該培養装置は全ての培養容器の内容物を受け入れるように配置されている第２実施形態を示す。
【0213】
図２ａの培養装置は、図１ａの培養装置との相違点のみを説明する。図２ａの培養装置は、さらに単一の混合容器ＲＭを含み、培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３から独立し、前記培養容器の内容物を受け入れるように配置される。前記培養装置は、前記混合容器ＲＭの最上部に接続された気体供給装置ＧＭを含む。気体供給装置ＧＭは、気体流を注入することで混合容器を加圧できる。前記装置は、気体供給装置ＧＭの気体供給を制御する気体供給バルブＶｇｍを含む。培養装置は、前記混合容器ＲＭの上部に接続された放出装置Ｗｍを含む。放出装置（Ｗｍ）により、混合中の気体を放出できる。この装置は、混合中の気体の放出を制御する放出バルブＶｄｍを含む。放出バルブＶｄｍは、通常、非動作状態では閉位置にある。放出バルブＶｄｍが開位置にある場合、混合容器への充填及び／又は混合中の気体の放出を実行できる。培養装置は、混合容器の充填と放出を制御する供給バルブＶａｍを含む。これは混合容器の下部に位置し、主供給ラインＣ１０に接続され、培養容器から混合容器に懸濁液の全部又は一部を移送する際に混合容器への充填を可能にし、混合容器から培養容器に懸濁液の全部又は一部を移送する際に混合容器を空にすることができる。供給バルブＶａｍは、通常、非動作状態では閉位置にある。供給バルブＶａｍが開位置にある場合、混合容器は充填又は空にすることができる。供給バルブＶａｍが閉位置にある場合、混合容器への充填又は排出はできない。
【0214】
前記培養装置が関連する、生細胞を連続細胞培養する方法は、図２ａ、２ｂ、２ｃにおいて開示されるであろう。
【0215】
図２ａによれば、３つの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３の各々は、培地内の生細胞を含む。それらは総容量の約７５％に充填されている。混合容器ＲＭは空であり、バルブＶｄｍ、Ｖａｍ、及びＶｇｍは閉位置にある。
【0216】
図２ｂによれば、培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３に含まれる懸濁液は、矢印ｆ１ｍ、ｆ２ｍ、ｆ３ｍ、及びｆｍｐで表されるように、混合容器ＲＭに移送される。この目的で、供給バルブＶａ１、２、３、Ｖａｍ、及び放出バルブＶｄｍを開くことにより、培養容器ＲＣ１から混合容器ＲＭへの懸濁液の移送が実行される。供給バルブＶａ２、３、Ｖａｍ、及び放出バルブＶｄｍを開くことにより、培養容器ＲＣ２から混合容器ＲＭへの懸濁液の移送が実行される。供給バルブＶａ３、Ｖａｍ、及び放出バルブＶｄｍを開くことにより、培養容器ＲＣ３から混合容器ＲＭへの懸濁液の移送が実行される。放出バルブＶｄｍを開くと、混合容器ＲＭの充填が可能になる。懸濁液の移送は、上述のように、気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３によって実現される。
【0217】
培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３からの全ての懸濁液で混合容器が充填されると、供給バルブＶａｍが閉位置に置かれる。
【0218】
培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３に関しては、バルブ１、Ｖａ１、Ｖｄ１、２、Ｖａ２、Ｖｄ２、３、Ｖａ３、Ｖｄ３を開くことにより、滅菌、洗浄、及びリンスの各工程が実行される。最初に、滅菌液槽ＡＳから滅菌液を培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれに添加する滅菌工程を開始する。滅菌液を空にすることは、バルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３によってそれぞれ実行される。その後、洗浄液槽ＡＣから培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれに洗浄液を加える。洗浄液を空にすることは、バルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３によってそれぞれ実行される。その後、リンス液槽ＡＲから培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれにリンス液を加える。リンス液を空にすることは、バルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３によってそれぞれ実行される。これらの工程は、図２ｂに示されていない。
【0219】
図２ｃによれば、矢印ｆｍｓ及びｆｍ１で示すように、混合容器ＲＭ内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ１に移送される。この目的で、バルブＶｇｍ、Ｖａｍ、３、２、Ｖａ１、及びＶｄ１を開くことで移送を実行する。バルブＶｄｍは閉位置に位置し、気体供給バルブＶｇｍの開口部を介して、加圧気体流が混合容器ＲＭに注入され、混合容器ＲＭを空にすることができる。放出バルブＶｄ１を開くと、培養容器ＲＣ１の充填が可能になる。バルブＶａ２、及びＶａ３は、閉位置にある。
【0220】
図２ｃによって示唆されるように、次に破線矢印ｆｍｓ及びｆｍ２で示されるように、混合容器ＲＭ内の一部の懸濁液が、第２培養容器ＲＣ２に移送される。この目的で、バルブＶｇｍ、Ｖａｍ、３、Ｖａ２、及びＶｄ２を開くことで移送を実行する。バルブＶｄｍは閉位置に位置し、気体供給バルブＶｇｍの開口部を介して、加圧気体流が混合容器ＲＭに注入され、混合容器ＲＭを空にすることができる。放出バルブＶｄ２を開くと、培養容器ＲＣ２の充填が可能になる。バルブＶａ１、及びＶａ３は、閉位置にある。
【0221】
図２ｃによって示唆されるように、次に破線矢印ｆｍｓ及びｆｍ３で示されるように、混合容器ＲＭ内の一部の懸濁液が、第３培養容器ＲＣ３に移送される。この目的で、バルブＶｇｍ、Ｖａｍ、Ｖａ３、及びＶｄ３を開くことで移送を実行する。バルブＶｄｍは閉位置に位置し、気体供給バルブＶｇｍの開口部を介して、加圧気体流が混合容器ＲＭに注入され、混合容器ＲＭを空にすることができる。放出バルブＶｄ３を開くと、培養容器ＲＣ３の充填が可能になる。バルブＶａ１、及びＶａ２は、閉位置にある。
【0222】
移送が完了し、混合容器が完全に空になった後、バルブ１、２、３、Ｖａｍ、及びＶｄｍを開いて、滅菌、洗浄、及びリンス工程が実行される。最初に、滅菌液槽ＡＳから滅菌液を培養容器ＲＭに添加する滅菌工程を開始する。滅菌液を空にすることは、バルブＶａｍによって実行される。その後、洗浄液槽ＡＣから混合容器ＲＭへ洗浄液を加える。洗浄液を空にすることは、バルブＶａｍによって実行される。その後、リンス液槽ＡＲから混合容器ＲＭへリンス液を加える。リンス液を空にすることは、バルブＶａｍによって実行される。これらの工程は、図２ａ～２ｃに示されていない。
【0223】
加圧気体流は３つの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、及びＲＣ３のそれぞれに気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、又はＧ３のそれぞれを介して再び注入され、前記３つの培養容器のそれぞれ内の懸濁液への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。供給バルブ１、２、３、レベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、及びＶｔ３、及び供給バルブＶａ１、Ｖａ２、及びＶａ３は閉位置にある。放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、及びＶｄ３のみが開位置にある。
【0224】
培養容器内で所望の表現型を獲得した生細胞の数回の培養サイクルの後に、回収工程がその後実施される。この工程は示されていない。
【0225】
前記回収工程が完了すると、第１実施形態と同様の方法にて全ての培養容器は空にされる。これらの工程は図２ａから２ｃに示されていない。
【0226】
【0227】
図３に示すように、生細胞を連続細胞培養する装置は、第１培養容器ＲＣ１、第２培養容器ＲＣ２、第３培養容器ＲＣ３、及び第４培養容器ＲＣ４の４つの培養容器を含む。この実施形態では、培養容器のセットは、細胞培養方法の間、それぞれ連続的に混合容器となるように配置されており、それぞれの混合容器は、少なくとも２つの培養容器の内容物を受け取るように配置されている。それぞれの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、ＲＣ３、及びＲＣ４は、上記の無菌流体供給装置１０に、個別に、及び互いに独立して接続されている。無菌流体供給装置（１０）は、供給バルブ１を介してその培養容器に接続されている。
【0228】
図３によれば、４つの培養容器のそれぞれは、培地内の生細胞を含む。生細胞は培養されて、懸濁液が得られる。例えば、加圧気体流は４つの培養容器のそれぞれに気体供給装置Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、又はＧ４のそれぞれを介して注入され、４つの培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、ＲＣ３、及びＲＣ４のそれぞれ内への気体注入及び懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。供給バルブ１、レベリングバルブＶｔ１、Ｖｔ２、Ｖｔ３及びＶｔ４、及び供給バルブＶａ１、Ｖａ２、Ｖａ３及びＶａ４は閉位置にある。放出バルブＶｄ１、Ｖｄ２、Ｖｄ３及びＶｄ４のみが開位置にある。
【0229】
前記培養装置は、前記４つの培養容器の相互接続を可能とするバルブＶ１０、Ｖ２０、Ｖ３０、及びＶ４０を含み、通常は非活動状態の閉位置にある。
【0230】
【0231】
最初に、矢印ｆ１２で示されるように、第１培養容器ＲＣ１内の全ての懸濁液が培養容器ＲＣ２に移送される。この目的で、バルブＶａ１、Ｖ１０、Ｖ２０、Ｖａ２、及びＶｄ２を開くことで移送を実行する。バルブＶｄ１は閉位置に位置し、上述のように、気体供給装置によって培養容器ＲＣ１を空にすることができる。放出バルブＶｄ２を開くと、培養容器ＲＣ２の充填が可能になる。その後、培養容器ＲＣ２は混合容器となり、培養容器ＲＣ２に最初に含まれる懸濁液と培養容器ＲＣ１からの懸濁液の両方を含む。加圧気体流が培養容器ＲＣ２に気体供給装置Ｇ２を介して注入され、培養容器ＲＣ２内の懸濁液への気体注入及び細胞懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を可能にする。培養容器ＲＣ３及びＲＣ４では、加圧気体流を培養容器ＲＣ３及びＲＣ４に注入し、バルブＶｄ３及びＶｄ４を開いた状態にすることで、培養工程が維持される。
【0232】
培養容器ＲＣ１では、その後、バルブ１、Ｖａ１、Ｖｄ１を開くことにより、滅菌、洗浄、及びリンス工程が実行される。最初に、滅菌液槽ＡＳから滅菌液を培養容器ＲＣ１に添加する滅菌工程を開始する。滅菌液を空にすることは、バルブＶａ１によって実行される。その後、洗浄液槽ＡＣから培養容器ＲＣ１へ洗浄液を加える。洗浄液を空にすることは、バルブＶａ１によって実行される。その後、リンス液槽ＡＲから培養容器ＲＣ１へリンス液を加える。リンス液を空にすることは、バルブＶａ１によって実行される。これらの工程は、図３に示されていない。
【0233】
次に、矢印ｆ２１で示すように、培養容器ＲＣ２内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ１に移送される。この目的で、バルブＶｔ２、Ｖ２０、Ｖ１０、Ｖａ１、及びＶｄ１を開くことで移送を実行する。バルブＶｄ２は閉位置に位置し、ＧＣ２から注入された気体を使用して懸濁液に圧力をかけることにより、培養容器ＲＣ２を空にすることができる。放出バルブＶｄ１を開くと、培養容器ＲＣ１の充填が可能になる。加圧気体流が培養容器ＲＣ１及びＲＣ２にそれぞれ注入され、気体供給装置Ｇ１及びＧ２を介して気体を懸濁液に注入し、培養容器ＲＣ１及びＲＣ２内の細胞懸濁液の均質化（バブリング撹拌）を実行できる。第３培養容器ＲＣ３及びＲＣ４では、加圧気体流を培養容器ＲＣ３及びＲＣ４に注入し、バルブＶｄ３及びＶｄ４を開いた状態にすることで、培養工程が維持される。
【0234】
その後、点線矢印ｆ１３で示唆されるように、培養容器ＲＣ３内の全ての懸濁液が第１培養容器ＲＣ１に移送される。この目的で、バルブＶａ１、Ｖ１０、Ｖ３０、Ｖａ３を開くこと、並びにバルブＶｄ３を閉じることで移送を実行する。その後、容器ＲＣ３の滅菌、洗浄、及びリンスを、上述の容器ＲＣ１に対してのように実施する。次に、混合後、矢印ｆ３１で示すように、培養容器ＲＣ１内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ３に移送される。この目的で、バルブＶｔ１、Ｖ３０、Ｖ１０、Ｖａ１を開くこと、並びにバルブＶｄ１を閉じることで移送を実行する。
【0235】
点線矢印ｆ１４で示唆されるように、培養容器ＲＣ１内の全ての懸濁液が第４培養容器ＲＣ４に移送される。この目的で、バルブＶａ１、Ｖ１０、Ｖ４０を開くこと、並びにバルブＶｄ１を閉じることで移送を実行する。次に、混合後、矢印ｆ４１で示すように、培養容器ＲＣ４内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ４に移送される。この目的で、バルブＶｔ４、Ｖ４０、Ｖ１０、Ｖａ１を開くこと、並びにバルブＶｄ４を閉じることで移送を実行する。
【0236】
その後、点線矢印ｆ２３で示唆されるように、培養容器ＲＣ２内の全ての懸濁液が第３培養容器ＲＣ３に移送される。この目的で、バルブＶａ２、Ｖ２０、Ｖ３０、Ｖａ３を開くこと、並びにバルブＶｄ２を閉じることで移送を実行する。その後、容器ＲＣ２の滅菌、洗浄、及びリンスを、上述の容器ＲＣ１に対してのように実施する。次に、混合後、矢印ｆ３２で示すように、培養容器ＲＣ３内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ２に移送される。この目的で、バルブＶｔ３、Ｖ３０、Ｖ２０、Ｖａ２を開くこと、並びにバルブＶｄ３を閉じることで移送を実行する。
【0237】
点線矢印ｆ２４で示唆されるように、培養容器ＲＣ４内の全ての懸濁液が第２培養容器ＲＣ２に移送される。この目的で、バルブＶａ２、Ｖ２０、Ｖ４０、Ｖａ４を開くこと、並びにバルブＶｄ４を閉じることで移送を実行する。その後、容器ＲＣ４の滅菌、洗浄、及びリンスを、上述の容器ＲＣ１に対してのように実施する。次に、混合後、矢印ｆ４２で示すように、培養容器ＲＣ２内の一部の懸濁液が培養容器ＲＣ４に移送される。この目的で、バルブＶｔ４、Ｖ４０、Ｖ２０、Ｖａ２を開くこと、並びにバルブＶｄ２を閉じることで移送を実行する。
【0238】
最後に、点線矢印ｆ３４で示唆されるように、培養容器ＲＣ３内の全ての懸濁液が第４培養容器ＲＣ４に移送される。この目的で、バルブＶａ３、Ｖ３０、Ｖ４０、Ｖａ４を開くこと、並びにバルブＶｄ３を閉じることで移送を実行する。次に、混合後、矢印ｆ４３で示すように、培養容器ＲＣ４内の一部の懸濁液が第３培養容器ＲＣ３に移送される。この目的で、バルブＶｔ４、Ｖ４０、Ｖ３０、Ｖａ３を開くこと、並びにバルブＶｄ４を閉じることで移送を実行する。
【0239】
図４の培養装置について、図３の培養装置と異なる観点からのみ記載されるであろう。図４は、４つの培養容器と該培養容器のセットから独立した単一の混合容器ＲＭとを含み、前記混合容器は、培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、ＲＣ３及びＲＣ４のセットの内容物を受け入れるように配置されている特定の第４実施形態を表す。培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、ＲＣ３及びＲＣ４のそれぞれは、個別に、及び互いに独立して、前述した無菌流体供給装置１０に接続される。無菌流体供給装置（１０）はその培養容器に供給バルブ１を介して接続される。
【0240】
【0241】
有利には、培養容器ＲＣ１、ＲＣ２、ＲＣ３及びＲＣ４に含まれる懸濁液は、混合容器ＲＭに移送される。
【0242】
その後、容器ＲＣ１、ＲＣ２、ＲＣ３及びＲＣ４の滅菌、洗浄、及びリンスの作業が実施される。
【0243】
前記混合工程が完了すると、混合容器ＲＭ内の一部の懸濁液が、第１培養容器ＲＣ１に移送される。その後、混合容器ＲＭ内の一部の懸濁液は、第２培養容器ＲＣ２に移送される。その後、混合容器ＲＭ内の一部の懸濁液は、第３培養容器ＲＣ３に移送される。その後、混合容器ＲＭ内の一部の懸濁液は、第４培養容器ＲＣ４に移送される。
【0244】
次に、混合容器ＲＭの滅菌、洗浄、及びリンスの操作が実施される。
【実施例】
【0245】
以下に説明する全ての実施例において、成長状況は、タービドスタットであり、希釈率（単位、時間－１）は、進化中に培養室内の微生物濃度を一定に保つための成長培地の流量と、培養室の容積との比として定義される。これらの実験では、希釈率が個体数の増加率と同等になるようにタービドスタットが導入された。
【0246】
実施例１：細菌株の３０℃への進化的適応
最適温度より低い準最適温度において、生物の成長速度は最適温度より低くなる。生物が最適温度より低い温度で使用されるよう意図されている場合、この生物を前記温度に適応させることが関係する。
最適温度より低い準最適温度において、生物の成長速度は最適温度より低くなる。生物が最適温度より低い温度で使用されるよう意図されている場合、この生物を前記温度に適応させることが関係する。
【0247】
以下の実験１及び２において、使用した菌株は、シュードモナス科の土壌細菌である。炭素源として２０ｇ／Ｌのスクロースを含む合成生育培地における本菌の比成長速度は、最適温度３５℃において０．３１５時間－１であった。
【0248】
２つの実験それぞれについて、この株を３０℃の温度に適応させることを目的とし、３０℃における成長速度が３５℃における出発株と同程度になることを目指す。
【0249】
この目的を達成するために、上記と同一の株を使用して、上記と同一の設定で、同一の参照培地を使用して、２回の適応進化実験を実施した。
【0250】
１/実験１：本発明に含まれない比較方法：目標温度３０℃のタービドスタット
実験１は、本発明によらない単純な進化プロトコルに基づいて、前述の細菌を進化的に適応させるもので、単一の培養容器でタービドスタット選択的状況のみを実施する。
実験１は、本発明によらない単純な進化プロトコルに基づいて、前述の細菌を進化的に適応させるもので、単一の培養容器でタービドスタット選択的状況のみを実施する。
【0251】
実験開始時に、培養容器に上記の菌株を植え付ける。
【0252】
実験中、温度は３０℃に固定され、保たれている。
【0253】
選択的状況は以下のように不連続に実施され、１０分ごとに、光学測定で測定された透明度を、任意に８０に設定された閾値と比較する。
・測定値が閾値を超えている場合、アクションは発生しない、
・測定値が閾値より小さい場合、懸濁液の希釈は、培養容器内に上記の成長培地を４ｍＬ加え、培養容器内に存在する懸濁液の体積を１３．５ｍＬで一定に保ち、培養容器内に存在する同じ体積Ｖを引き抜くことで実施される。
・測定値が閾値を超えている場合、アクションは発生しない、
・測定値が閾値より小さい場合、懸濁液の希釈は、培養容器内に上記の成長培地を４ｍＬ加え、培養容器内に存在する懸濁液の体積を１３．５ｍＬで一定に保ち、培養容器内に存在する同じ体積Ｖを引き抜くことで実施される。
【0254】
得られた結果を図５に示す。
【0255】
得られた結果
３０℃のタービドスタットで２０日間の適応進化を経て、理論上の希釈率又は成長速度０．３５８時間－１に相当する２９回の日次希釈回数に到達する
３０℃のタービドスタットで２０日間の適応進化を経て、理論上の希釈率又は成長速度０．３５８時間－１に相当する２９回の日次希釈回数に到達する
【0256】
２/実験２：２つの培養容器を使用する本発明方法
実験２は、本発明方法に基づいて、上記と同一の細菌を進化的に適応させ、２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２を異なる温度で実施した。このプロトコルは、実験１で使用したものと同一の装置で実施されている。
実験２は、本発明方法に基づいて、上記と同一の細菌を進化的に適応させ、２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２を異なる温度で実施した。このプロトコルは、実験１で使用したものと同一の装置で実施されている。
【0257】
実験開始時に、それぞれの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２に、実験１の開始時に植え付けたものと同じ上記の菌株を植え付け、初期温度は容器ＲＣ１及びＲＣ２とも３５℃である。
【0258】
２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２は、それぞれ選択的状況がタービドスタットで、実験１で使用したものと同一のパラメータで、実験１で述べたように不連続的に実施した：
・上記で定義した成長培地
・透明度の閾値＝８０
・培養容器内に成長培地を４ｍＬ加え、培養容器内に存在する懸濁液の体積を１３．５ｍＬで一定に保ち、培養容器内に存在する同じ体積Ｖを引き抜くことによる懸濁液の希釈。
・上記で定義した成長培地
・透明度の閾値＝８０
・培養容器内に成長培地を４ｍＬ加え、培養容器内に存在する懸濁液の体積を１３．５ｍＬで一定に保ち、培養容器内に存在する同じ体積Ｖを引き抜くことによる懸濁液の希釈。
【0259】
成長段階は任意に１２時間と定義され、その終了時に培養容器ＲＣ１の全内容を混合容器となる培養容器ＲＣ２に移送して工程ｃ）を実行する。したがって、１サイクルは１２時間で、１日２サイクルである。
【0260】
新規サイクルごとに、これら２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２のそれぞれの温度は、容器ＲＣ１内の平均希釈率の計算に基づいて自動的に調整され、直前に終了したサイクルの平均である容器ＲＣ１の希釈率が、３０℃のタービドスタットに２０日間置いた後の実験１で得られた０．３５８時間－１を任意に設定した閾値を超えた場合、すぐに培養温度を下げるように指示されている。
【0261】
以下の表１は、２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２のそれぞれで、連続サイクルで適用される温度を示し、実験７日目に１サイクルだけ実施されたことを考慮している。
【表1】
【0262】
得られた結果
得られた結果を図６及び７に示す。
得られた結果を図６及び７に示す。
【0263】
１８サイクル目の培養サイクルの間、つまり適応進化の１０日後、培養容器ＲＣ１内の温度は３０℃である。このサイクルの間、平均希釈率は０．３８７時間－１で、同一の装置で３０℃のタービドスタットで２０日間適応進化させた後に得られた平均希釈率よりも高い。
【0264】
成長率を比較するために、実験２の１サイクルにおける希釈率を実験１で測定したものと比較することは正当である。これは、各サイクルにおいて懸濁液が、同一のバッチプロトコルに基づいて、同一のパラメータで、同一の装置（実験２の培養容器ＲＣ１は実験１で使用したものと正確に同じ培養容器）において実施されるタービドスタット選択的状況に曝露されるからである。
【0265】
したがって、実験２の１０日目、１８サイクル目で成長した懸濁液は、タービドスタット実験１の２０日目に得られた３０℃における成長率よりもわずかに高い成長率を示している。
【0266】
結論
したがって、本発明方法に基づいて２つの培養容器に定期的に混合及び再分配される２つの部分集団の並行進化的適応を実施する実験２のプロトコルにおいて、単一の集団が単一の容器で成長する従来のタービドスタット状況に比べて、細菌を準最適温度に適応させる速度を２倍にすることが可能であった。
したがって、本発明方法に基づいて２つの培養容器に定期的に混合及び再分配される２つの部分集団の並行進化的適応を実施する実験２のプロトコルにおいて、単一の集団が単一の容器で成長する従来のタービドスタット状況に比べて、細菌を準最適温度に適応させる速度を２倍にすることが可能であった。
【0267】
実施例２：細菌株の２５℃への進化的適応。
いずれの実験でも、この株を２５℃の温度に適応させながら、成長速度を上げることが目的である。
いずれの実験でも、この株を２５℃の温度に適応させながら、成長速度を上げることが目的である。
【0268】
この目的を達成するため、実施例１と同一の株を使用して、同一の設定で、同一の参照培地を使用して、３５℃、希釈率０．３１５時間－１で初期進化させた２回の適応進化実験を実施した。
【0269】
１/実験３：本発明に含まれない比較方法：目標温度２５℃のタービドスタット
この実験は、上記の実施例１で示した実験１/と同一の条件で実行したが、温度は２５℃とした。
この実験は、上記の実施例１で示した実験１/と同一の条件で実行したが、温度は２５℃とした。
【0270】
実験は、容量１５ｍＬ又は８０ｍＬの単一の培養容器を使用して実施した。
【0271】
得られた結果
その結果を添付の図８に示す。この図では、希釈率（時間－１）は日数の関数である。実線の丸印で示した曲線は容量８０ｍＬで実施した実験に対応し、実線の四角形で示した曲線は容量１５ｍＬで実施した実験に対応する。
その結果を添付の図８に示す。この図では、希釈率（時間－１）は日数の関数である。実線の丸印で示した曲線は容量８０ｍＬで実施した実験に対応し、実線の四角形で示した曲線は容量１５ｍＬで実施した実験に対応する。
【0272】
容量１５ｍＬの培養容器でも容量８０ｍＬの培養容器でも、１８日間で２５℃における希釈率又は成長率０．２時間－１が得られることが確認され、培養容器の容量は微生物の進化に重要なパラメータではないことが示された。
【0273】
２/実験４：所定の希釈率０．２時間
－１
で、２つの培養容器を使用する本発明方法
実験４は、それぞれが容量１５ｍＬを有する２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２を使用して、実施例１の実験２に記載のプロトコルに基づいて、本発明方法に基づいて同一の細菌を進化適応させることで構成された。ただし、温度は３５℃から２５℃に変化させた。
実験４は、それぞれが容量１５ｍＬを有する２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２を使用して、実施例１の実験２に記載のプロトコルに基づいて、本発明方法に基づいて同一の細菌を進化適応させることで構成された。ただし、温度は３５℃から２５℃に変化させた。
【0274】
実験開始時に、それぞれの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２に実施例１と同じ菌株を植え付け、初期温度は両方の容器ＲＣ１及びＲＣ２とも３５℃である。
【0275】
新規サイクルごとに、これら２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２のそれぞれの温度は、容器内の平均希釈率の計算に基づいて自動的に調整され、直前に終了したサイクルの平均である、培養容器ＲＣ１の希釈率が、任意に０．２時間－１と設定した閾値、２５℃のタービドスタットに１８日間置いた後の実験３で得られた値を超えた場合、すぐに培養温度を下げるように指示されている。
【0276】
以下の表２は、２つの培養容器ＲＣ１及びＲＣ２のそれぞれで、連続サイクルで適用される温度を示している
【表2】
【0277】
得られた結果を添付された図９に示す。
【0278】
この図では、気温（℃）は日数の関数である。実線の菱形で示した曲線はＲＣ１で実施した実験に対応し、実線の四角形で示した曲線はＲＣ２で実施した実験に対応する。
【0279】
これらの結果は、２つの培養容器の内容物の反復混合を実施する本発明方法によれば、２５℃における希釈率又は成長率０．２時間－１の菌の適応が７日間で得られる、つまり、本発明によらない実験３の方法より２．６倍速く得られることを示している
【0280】
進化的適応法について観察された利点は、少なくとも２つの培養容器から来る懸濁液を定期的に組み合わせ、分離することからなる本発明方法によって実際にもたらされる。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】