特表 2023-526156 免疫療法のためのＴ細胞及びＴ細胞受容体を単一細胞解析により腫瘍から単離する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-21

(54)【発明の名称】免疫療法のためのＴ細胞及びＴ細胞受容体を単一細胞解析により腫瘍から単離する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20230614BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230614BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230614BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230614BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230614BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230614BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230614BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20230614BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

C12N15/12

C12N5/10

C07K14/725

A61K35/17

A61P31/12

A61P35/00

A61P31/20

A61K38/17

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022556459

(86)(22)【出願日】2021-03-19

(85)【翻訳文提出日】2022-11-14

(86)【国際出願番号】 US2021023240

(87)【国際公開番号】W WO2021188954

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】62/992,701

(32)【優先日】2020-03-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510002280

【氏名又は名称】アメリカ合衆国

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】クリシュナ、スリ

(72)【発明者】

【氏名】ロウリー、ザ サード、フランク ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】花田 賢一

(72)【発明者】

【氏名】ヤン、ジェームズ シー．

(72)【発明者】

【氏名】ローゼンバーグ、スティーヴン エー．

(72)【発明者】

【氏名】ロビンズ、ポール エフ．

(72)【発明者】

【氏名】ヨセフ、ラミ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ08

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ62

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR42

4B063QS03

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA93X

4B065AB10

4B065AC14

4B065AC20

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084CA18

4C084CA35

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製する方法が提供される。該方法は、患者の腫瘍試料からＴ細胞を単離すること；遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択すること；及び選択されたＴ細胞を選択されなかった細胞から分離することを含み得る。分離された、選択されたＴ細胞は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を提供する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を単離する方法、ＴＣＲを発現する細胞の集団を調製する方法、単離されたＴＣＲ、単離された細胞の集団、医薬組成物、及び哺乳動物における状態を治療又は予防する方法も提供される。
【選択図】図１２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製する方法であって：
患者の腫瘍試料からＴ細胞を単離すること；
遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択すること；及び
選択されたＴ細胞を選択されなかった細胞から分離し、分離された、選択されたＴ細胞は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を提供すること；
を含み、
標的抗原が、がん特異的変異によってコードされるネオ抗原か、がん抗原か、又はがん関連ウイルス抗原であり、遺伝子発現プロファイルが：
（ａ）（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の一方又は両方並びに（ｉｉ）ＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；
（ｂ）ＣＤ４^＋、並びにＢＡＴＦ^＋、ＣＤ２４７^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＮＰＨ１^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＧＹＰＣ^＋、ＩＦＩＴＭ１^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＰＯＣＫ２^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＣＣＬ５^－、ＣＤ５２^－、ＧＳＴＰ１^－、ＪＵＮ^－、ＬＧＡＬＳ１^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＰＬＰ２^－、ＲＧＣＣ^－、Ｓ１００Ａ１０^－、ＶＩＭ^－、及びＺＦＰ３６^－のうちの１以上；
（ｃ）ＣＤ８^＋、並びにＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＬＯＸ５ＡＰ^＋、ＡＲＨＧＡＰ９^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＡＲＤ１６^＋、ＣＤ３Ｇ^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＬＩＣ３^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＧＮ３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＧＡＥ^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＥＬＬ２^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＡＢ２７Ａ^＋、ＲＡＲＲＥＳ３^＋、ＲＢＰＪ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＡＮＸＡ１^－、ＥＥＦ１Ｂ２^－、ＥＭＰ３^－、ＩＬ７Ｒ^－、ＬＧＡＬＳ３^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、ＲＰＬ３６Ａ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；
（ｄ）ＣＤ８^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^－、ＣＤ８Ａ^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ４５ＲＡ^－、ＣＤ６２Ｌ^－及びＩＬ７Ｒ^－のうちの１以上；
（ｅ）ＡＢＩ３^＋、ＡＣ２４３９６０．１^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＤＧＲＧ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＳＢ２^＋、ＢＳＴ２^＋、ＣＡＲＳ^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２ＢＰ２^＋、ＣＤ８２^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＡＴＡ３^＋、ＧＰＲ２５^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＤＬＢＰ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＤ２^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＩＮＣ０１９４３^＋、ＭＩＳ１８ＢＰ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＣＦ４^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＣＥＤ１Ｂ^＋、ＰＤＣＤ１^＋、ＰＨＰＴ１^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＳＬＣ１Ａ４^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＲＡＦ３ＩＰ３^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；
（ｆ）ＣＤ４^＋、並びにＡＤＩ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＲＩＤ５Ｂ^＋、ＢＡＴＦ^＋、ＣＭＴＭ７^＋、ＣＰＭ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＹＴＨ１^＋、ＥＬＭＯ１^＋、ＥＴＶ７^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＦＢＬＮ７^＋、ＦＫＢＰ５^＋、ＧＲＡＭＤ１Ａ^＋、ＨＩＦ１Ａ^＋、ＩＬ６ＳＴ^＋、ＩＴＧＡ４^＋、ＩＴＫ^＋、ＪＡＫ３^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＥＦ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＭＡＦ^＋、ＭＡＬ^＋、ＭＩＲ４４３５－２ＨＧ^＋、ＭＹＬ６Ｂ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＰＡＳＫ^＋、ＰＧＭ２Ｌ１^＋、ＰＩＭ２^＋、ＰＰＰ１ＣＣ^＋、ＳＥＳＮ３^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＯＣＳ１^＋、ＳＴＡＴ１^＋、ＳＹＮＥ２^＋、ＴＢＣ１Ｄ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＬＫ１^＋、ＴＭＥＭ１２３^＋、ＴＭＥＭ７０^＋、ＴＮＩＫ^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＳＨＺ２^＋、ＵＣＰ２^＋、ＶＯＰＰ１^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；
（ｇ）ＣＤ８^＋、並びにＡＣ２４３８２９．４^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ^＋、ＣＣＬ３^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＣＬ４Ｌ２^＋、ＣＣＬ５^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＳＴ７^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＮＬＹ^＋、ＧＺＭＡ^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＧＺＭＨ^＋、ＧＺＭＫ^＋、ＨＡＶＣＲ２^＋、ＨＣＳＴ^＋、ＨＬＡ－ＤＭＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＦＮＧ^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＪＡＭＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＹＳＴ^＋、ＭＩＲ１５５ＨＧ^＋、ＮＫＧ７^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＧＳ１^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの１以上；
（ｈ）ＡＨＩ１＋、ＣＸＣＬ１３＋、ＦＡＢＰ５＋、ＮＡＰ１Ｌ４＋、ＯＲＭＤＬ３＋、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ＋、ＴＩＧＩＴ＋、及びＴＯＸ＋のうちの１以上；又は
（ｉ）ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの１以上
を含む、方法。

【請求項2】

標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合部分を単離する方法であって、
請求項１に記載の方法に従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製すること；
濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；
１以上の個別の単一Ｔ細胞試料においてＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を配列決定すること；
ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；
ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を宿主細胞に発現させること；
標的抗原に対する抗原特異性について、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現する宿主細胞をスクリーニングすること；並びに
標的抗原に対して抗原特異性を有する、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を選択すること
を含み、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分が単離される、方法。

【請求項3】

標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合部分を単離する方法であって：
患者の腫瘍試料からＴ細胞を単離すること；
濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；
個別の単一Ｔ細胞試料においてＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を配列決定すること；
遺伝子発現プロファイルを有する、個別の単一Ｔ細胞試料を選択すること；
ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、遺伝子発現プロファイルを有する個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；
ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を宿主細胞に発現させること；
標的抗原に対する抗原特異性について、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現する宿主細胞をスクリーニングすること；並びに
標的抗原に対して抗原特異性を有する、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を選択すること
を含み、
標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分が単離され、
標的抗原が、がん特異的変異によってコードされるネオ抗原か、がん抗原か、又はがん関連ウイルス抗原であり、遺伝子発現プロファイルが：
（ａ）（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の一方又は両方並びに（ｉｉ）ＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；
（ｂ）ＣＤ４^＋、並びにＢＡＴＦ^＋、ＣＤ２４７^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＮＰＨ１^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＧＹＰＣ^＋、ＩＦＩＴＭ１^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＰＯＣＫ２^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＣＣＬ５^－、ＣＤ５２^－、ＧＳＴＰ１^－、ＪＵＮ^－、ＬＧＡＬＳ１^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＰＬＰ２^－、ＲＧＣＣ^－、Ｓ１００Ａ１０^－、ＶＩＭ^－、及びＺＦＰ３６^－のうちの１以上；
（ｃ）ＣＤ８^＋、並びにＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＬＯＸ５ＡＰ^＋、ＡＲＨＧＡＰ９^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＡＲＤ１６^＋、ＣＤ３Ｇ^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＬＩＣ３^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＧＮ３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＧＡＥ^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＥＬＬ２^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＡＢ２７Ａ^＋、ＲＡＲＲＥＳ３^＋、ＲＢＰＪ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＡＮＸＡ１^－、ＥＥＦ１Ｂ２^－、ＥＭＰ３^－、ＩＬ７Ｒ^－、ＬＧＡＬＳ３^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、ＲＰＬ３６Ａ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；
（ｄ）ＣＤ８^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^－、ＣＤ８Ａ^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ４５ＲＡ^－、ＣＤ６２Ｌ^－及びＩＬ７Ｒ^－のうちの１以上；
（ｅ）ＡＢＩ３^＋、ＡＣ２４３９６０．１^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＤＧＲＧ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＳＢ２^＋、ＢＳＴ２^＋、ＣＡＲＳ^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２ＢＰ２^＋、ＣＤ８２^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＡＴＡ３^＋、ＧＰＲ２５^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＤＬＢＰ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＤ２^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＩＮＣ０１９４３^＋、ＭＩＳ１８ＢＰ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＣＦ４^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＣＥＤ１Ｂ^＋、ＰＤＣＤ１^＋、ＰＨＰＴ１^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＳＬＣ１Ａ４^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＲＡＦ３ＩＰ３^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；
（ｆ）ＣＤ４^＋、並びにＡＤＩ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＲＩＤ５Ｂ^＋、ＢＡＴＦ^＋、ＣＭＴＭ７^＋、ＣＰＭ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＹＴＨ１^＋、ＥＬＭＯ１^＋、ＥＴＶ７^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＦＢＬＮ７^＋、ＦＫＢＰ５^＋、ＧＲＡＭＤ１Ａ^＋、ＨＩＦ１Ａ^＋、ＩＬ６ＳＴ^＋、ＩＴＧＡ４^＋、ＩＴＫ^＋、ＪＡＫ３^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＥＦ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＭＡＦ^＋、ＭＡＬ^＋、ＭＩＲ４４３５－２ＨＧ^＋、ＭＹＬ６Ｂ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＰＡＳＫ^＋、ＰＧＭ２Ｌ１^＋、ＰＩＭ２^＋、ＰＰＰ１ＣＣ^＋、ＳＥＳＮ３^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＯＣＳ１^＋、ＳＴＡＴ１^＋、ＳＹＮＥ２^＋、ＴＢＣ１Ｄ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＬＫ１^＋、ＴＭＥＭ１２３^＋、ＴＭＥＭ７０^＋、ＴＮＩＫ^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＳＨＺ２^＋、ＵＣＰ２^＋、ＶＯＰＰ１^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；
（ｇ）ＣＤ８^＋、並びにＡＣ２４３８２９．４^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ^＋、ＣＣＬ３^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＣＬ４Ｌ２^＋、ＣＣＬ５^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＳＴ７^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＮＬＹ^＋、ＧＺＭＡ^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＧＺＭＨ^＋、ＧＺＭＫ^＋、ＨＡＶＣＲ２^＋、ＨＣＳＴ^＋、ＨＬＡ－ＤＭＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＦＮＧ^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＪＡＭＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＹＳＴ^＋、ＭＩＲ１５５ＨＧ^＋、ＮＫＧ７^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＧＳ１^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの１以上；
（ｈ）ＡＨＩ１＋、ＣＸＣＬ１３＋、ＦＡＢＰ５＋、ＮＡＰ１Ｌ４＋、ＯＲＭＤＬ３＋、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ＋、ＴＩＧＩＴ＋、及びＴＯＸ＋のうちの１以上；又は
（ｉ）ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの１以上
を含む、方法。

【請求項4】

遺伝子発現プロファイルがＴＩＧＩＴ^＋を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

遺伝子発現プロファイルがＣＸＣＬ１３^＋を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

遺伝子発現プロファイルがＣＤ８^＋及びＣＸＣＬ１３^＋を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

遺伝子発現プロファイルがＣＤ４^＋及びＣＸＣＬ１３^＋を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

遺伝子発現プロファイルが、ＣＤ８^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、並びにＣＤ３９^＋及びＰＤ－１^＋の一方又は両方を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

遺伝子発現プロファイルが、ＣＤ８^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

遺伝子発現プロファイルが、ＣＤ８^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの１以上を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

遺伝子発現プロファイルが、ＣＤ８^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^＋を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

遺伝子発現プロファイルが、ＣＤ４^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^－のうちの１以上を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

遺伝子発現プロファイルが、ＣＤ４^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^－を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することが：
（ｉ）遺伝子発現プロファイルの正に発現した遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の存在を検出すること；
（ｉｉ）遺伝子発現プロファイルにおいて発現が負である遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の不存在を検出すること；
（ｉｉｉ）遺伝子発現プロファイルにおいて発現が負である遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の量を測定すること；及び／又は
（ｉｖ）遺伝子発現プロファイルにおいて発現が正である遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の量を測定すること
を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することが：
（ｉ）遺伝子発現プロファイルの正に発現した遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの存在を検出すること；
（ｉｉ）遺伝子発現プロファイルにおいて発現が負である遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの不存在を検出すること；
（ｉｉｉ）遺伝子発現プロファイルにおいて発現が負である遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの量を測定すること；及び／又は
（ｉｖ）遺伝子発現プロファイルにおいて発現が正である遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの量を測定すること
を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することが、１以上の単一細胞次元削減法を実施することを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することが、配列決定によるトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ）解析を実施することを含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することが、単一細胞トランスクリプトーム解析を実施することを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することが、遺伝子発現プロファイルにおける１以上の遺伝子の細胞表面発現を検出することを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

（ｄ）の遺伝子発現プロファイルが、ＰＤ－１^＋及びＴＩＭ－３^＋の一方又は両方を更に含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

（ｅ）又は（ｇ）の遺伝子発現プロファイルがＬＡＧ３^＋を更に含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

がん関連ウイルス抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

標的抗原に対して抗原特異性を有する、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法であって：
請求項２～２２のいずれか１項に記載の方法に従って、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を単離すること、及び
単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に導入して、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞を得ること
を含む、方法。

【請求項24】

標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞のプールされた集団を調製する方法であって：
（ａ）請求項１及び４～２２のいずれか１項に記載の方法に従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製すること；
（ｂ）濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；
（ｃ）個別の単一Ｔ細胞試料において、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を配列決定すること；
（ｄ）ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；
（ｅ）ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に導入し、ＰＢＭＣにペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現させること；及び
（ｆ）（ａ）に従って調製された標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団の複数の個別の単一Ｔ細胞試料に対して（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を実施し、それにより標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞のプールされた集団を提供すること
を含む、方法。

【請求項25】

ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するＰＢＭＣの数を増幅することを更に含む、請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

請求項２～２２のいずれか１項に記載の方法に従って単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分。

【請求項27】

請求項１及び４～２２及び２３～２５のいずれか１項に記載の方法に従って調製された、単離された細胞の集団。

【請求項28】

請求項２７に記載の単離された細胞の集団及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。

【請求項29】

哺乳動物における状態の治療又は予防において用いるための、請求項２５に記載のＴＣＲ、請求項２６に記載の単離された細胞の集団、又は請求項２７に記載の医薬組成物であって、状態ががん又はウイルス状態である、ＴＣＲ、単離された細胞の集団、又は医薬組成物。

【請求項30】

状態の治療又は予防のための医薬を調製する方法であって、請求項１及び４～２２のいずれか１項に記載の方法に従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製すること；又は（ｉｉ）請求項２３～２５のいずれか１項に従って、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の単離された集団を調製することを含み、状態ががん又はウイルス状態である、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０２０年３月２０日に出願された米国仮特許出願番号第６２／９９２，７０１号（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。

【0002】

連邦政府支援の研究又は開発に関する陳述
本発明は、連邦政府の支援を受け、プロジェクト番号ＺＩＡ ＢＣ０１０９８４の下、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所によりなされた。本発明において、連邦政府は一定の権利を有する。

【0003】

電子的に提出された物件の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる：２０２１年３月１８日付けの「７５３０６７＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名前の５５３バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
がん特異的変異によってコードされるネオ抗原を標的とするＴ細胞を用いる養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部の患者において有益な臨床反応をもたらし得る。それにもかかわらず、がん及び他の状態の治療にＡＣＴを首尾よく用いるには、いくつかの障害が残っている。例えば、がん反応性Ｔ細胞を生成するために用いられる現在の方法では、相当の時間が必要となり、がん標的に結合する所望のＴ細胞受容体が容易に特定されない場合がある。従って、ＡＣＴ用の細胞の単離された集団を得る方法の改善についてのニーズがある。

【発明の概要】

【0005】

発明の要旨
本発明の一態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製する方法であって：患者の腫瘍試料からＴ細胞を単離すること；遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択すること；選択されたＴ細胞を選択されなかった細胞から分離し、分離された、選択されたＴ細胞は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を提供することを含み、
標的抗原が、がん特異的変異によってコードされるネオ抗原か、がん抗原か、又はがん関連ウイルス抗原であり、遺伝子発現プロファイルが：（ａ）（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の一方又は両方並びに（ｉｉ）ＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；（ｂ）ＣＤ４^＋、並びにＢＡＴＦ^＋、ＣＤ２４７^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＮＰＨ１^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＧＹＰＣ^＋、ＩＦＩＴＭ１^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＰＯＣＫ２^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＣＣＬ５^－、ＣＤ５２^－、ＧＳＴＰ１^－、ＪＵＮ^－、ＬＧＡＬＳ１^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＰＬＰ２^－、ＲＧＣＣ^－、Ｓ１００Ａ１０^－、ＶＩＭ^－、及びＺＦＰ３６^－のうちの１以上；（ｃ）ＣＤ８^＋、並びにＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＬＯＸ５ＡＰ^＋、ＡＲＨＧＡＰ９^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＡＲＤ１６^＋、ＣＤ３Ｇ^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＬＩＣ３^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＧＮ３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＧＡＥ^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＥＬＬ２^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＡＢ２７Ａ^＋、ＲＡＲＲＥＳ３^＋、ＲＢＰＪ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＡＮＸＡ１^－、ＥＥＦ１Ｂ２^－、ＥＭＰ３^－、ＩＬ７Ｒ^－、ＬＧＡＬＳ３^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、ＲＰＬ３６Ａ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；（ｄ）ＣＤ８^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^－、ＣＤ８Ａ^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ４５ＲＡ^－、ＣＤ６２Ｌ^－及びＩＬ７Ｒ^－のうちの１以上；（ｅ）ＡＢＩ３^＋、ＡＣ２４３９６０．１^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＤＧＲＧ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＳＢ２^＋、ＢＳＴ２^＋、ＣＡＲＳ^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２ＢＰ２^＋、ＣＤ８２^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＡＴＡ３^＋、ＧＰＲ２５^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＤＬＢＰ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＤ２^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＩＮＣ０１９４３^＋、ＭＩＳ１８ＢＰ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＣＦ４^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＣＥＤ１Ｂ^＋、ＰＤＣＤ１^＋、ＰＨＰＴ１^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＳＬＣ１Ａ４^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＲＡＦ３ＩＰ３^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；（ｆ）ＣＤ４^＋、並びにＡＤＩ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＲＩＤ５Ｂ^＋、ＢＡＴＦ^＋、ＣＭＴＭ７^＋、ＣＰＭ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＹＴＨ１^＋、ＥＬＭＯ１^＋、ＥＴＶ７^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＦＢＬＮ７^＋、ＦＫＢＰ５^＋、ＧＲＡＭＤ１Ａ^＋、ＨＩＦ１Ａ^＋、ＩＬ６ＳＴ^＋、ＩＴＧＡ４^＋、ＩＴＫ^＋、ＪＡＫ３^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＥＦ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＭＡＦ^＋、ＭＡＬ^＋、ＭＩＲ４４３５－２ＨＧ^＋、ＭＹＬ６Ｂ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＰＡＳＫ^＋、ＰＧＭ２Ｌ１^＋、ＰＩＭ２^＋、ＰＰＰ１ＣＣ^＋、ＳＥＳＮ３^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＯＣＳ１^＋、ＳＴＡＴ１^＋、ＳＹＮＥ２^＋、ＴＢＣ１Ｄ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＬＫ１^＋、ＴＭＥＭ１２３^＋、ＴＭＥＭ７０^＋、ＴＮＩＫ^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＳＨＺ２^＋、ＵＣＰ２^＋、ＶＯＰＰ１^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；（ｇ）ＣＤ８^＋、並びにＡＣ２４３８２９．４^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ^＋、ＣＣＬ３^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＣＬ４Ｌ２^＋、ＣＣＬ５^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＳＴ７^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＮＬＹ^＋、ＧＺＭＡ^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＧＺＭＨ^＋、ＧＺＭＫ^＋、ＨＡＶＣＲ２^＋、ＨＣＳＴ^＋、ＨＬＡ－ＤＭＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＦＮＧ^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＪＡＭＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＹＳＴ^＋、ＭＩＲ１５５ＨＧ^＋、ＮＫＧ７^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＧＳ１^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの１以上；（ｈ）ＡＨＩ１＋、ＣＸＣＬ１３＋、ＦＡＢＰ５＋、ＮＡＰ１Ｌ４＋、ＯＲＭＤＬ３＋、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ＋、ＴＩＧＩＴ＋、及びＴＯＸ＋；又は（ｉ）ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの１以上を含む、方法を提供する。

【0006】

本発明の別の態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合部分を単離する方法であって：本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるいずれかの方法に従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製すること；濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；１以上の個別の単一Ｔ細胞試料においてＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を配列決定すること；ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を宿主細胞に発現させること；標的抗原に対する抗原特異性について、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現する宿主細胞をスクリーニングすること；並びに標的抗原に対して抗原特異性を有する、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を選択することを含み、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分が単離される、方法を提供する。

【0007】

本発明の別の態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞のプールされた集団を調製する方法であって：（ａ）本発明の他の態様に関して本明細書に記載される記載の方法のいずれかに従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製すること；（ｂ）濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；（ｃ）個別の単一Ｔ細胞試料において、ＴＣＲ ＣＤＲ３を配列決定すること；（ｄ）ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；（ｅ）ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をＰＢＭＣに導入し、ＰＢＭＣにペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現させること；及び（ｆ）（ａ）に従って調製された標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団の複数の個別の単一Ｔ細胞試料に対して（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を実施し、それにより標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞のプールされた集団を提供することを含む、方法を提供する。

【0008】

本発明の別の態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を単離する方法であって：患者の腫瘍試料からＴ細胞を単離すること；濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；個別の単一Ｔ細胞試料においてＴＣＲ ＣＤＲ３を配列決定すること；遺伝子発現プロファイルを有する、個別の単一Ｔ細胞試料を選択すること；ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、遺伝子発現プロファイルを有する個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を宿主細胞に発現させること；標的抗原に対する抗原特異性について、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現する宿主細胞をスクリーニングすること；並びに標的抗原に対して抗原特異性を有する、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を選択することを含み、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分が単離され、遺伝子発現プロファイルが：（ａ）（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の一方又は両方並びに（ｉｉ）ＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；（ｂ）ＣＤ４^＋、並びにＢＡＴＦ^＋、ＣＤ２４７^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＮＰＨ１^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＧＹＰＣ^＋、ＩＦＩＴＭ１^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＰＯＣＫ２^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＣＣＬ５^－、ＣＤ５２^－、ＧＳＴＰ１^－、ＪＵＮ^－、ＬＧＡＬＳ１^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＰＬＰ２^－、ＲＧＣＣ^－、Ｓ１００Ａ１０^－、ＶＩＭ^－、及びＺＦＰ３６^－のうちの１以上；（ｃ）ＣＤ８^＋、並びにＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＬＯＸ５ＡＰ^＋、ＡＲＨＧＡＰ９^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＡＲＤ１６^＋、ＣＤ３Ｇ^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＬＩＣ３^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＧＮ３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＧＡＥ^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＥＬＬ２^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＡＢ２７Ａ^＋、ＲＡＲＲＥＳ３^＋、ＲＢＰＪ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＡＮＸＡ１^－、ＥＥＦ１Ｂ２^－、ＥＭＰ３^－、ＩＬ７Ｒ^－、ＬＧＡＬＳ３^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、ＲＰＬ３６Ａ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上；（ｄ）ＣＤ８^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^－、ＣＤ８Ａ^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ４５ＲＡ^－、ＣＤ６２Ｌ^－及びＩＬ７Ｒ^－のうちの１以上；（ｅ）ＡＢＩ３^＋、ＡＣ２４３９６０．１^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＤＧＲＧ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＳＢ２^＋、ＢＳＴ２^＋、ＣＡＲＳ^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２ＢＰ２^＋、ＣＤ８２^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＡＴＡ３^＋、ＧＰＲ２５^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＤＬＢＰ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＤ２^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＩＮＣ０１９４３^＋、ＭＩＳ１８ＢＰ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＣＦ４^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＣＥＤ１Ｂ^＋、ＰＤＣＤ１^＋、ＰＨＰＴ１^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＳＬＣ１Ａ４^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＲＡＦ３ＩＰ３^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；（ｆ）ＣＤ４^＋、並びにＡＤＩ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＲＩＤ５Ｂ^＋、ＢＡＴＦ^＋、ＣＭＴＭ７^＋、ＣＰＭ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＹＴＨ１^＋、ＥＬＭＯ１^＋、ＥＴＶ７^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＦＢＬＮ７^＋、ＦＫＢＰ５^＋、ＧＲＡＭＤ１Ａ^＋、ＨＩＦ１Ａ^＋、ＩＬ６ＳＴ^＋、ＩＴＧＡ４^＋、ＩＴＫ^＋、ＪＡＫ３^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＥＦ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＭＡＦ^＋、ＭＡＬ^＋、ＭＩＲ４４３５－２ＨＧ^＋、ＭＹＬ６Ｂ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＰＡＳＫ^＋、ＰＧＭ２Ｌ１^＋、ＰＩＭ２^＋、ＰＰＰ１ＣＣ^＋、ＳＥＳＮ３^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＯＣＳ１^＋、ＳＴＡＴ１^＋、ＳＹＮＥ２^＋、ＴＢＣ１Ｄ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＬＫ１^＋、ＴＭＥＭ１２３^＋、ＴＭＥＭ７０^＋、ＴＮＩＫ^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＳＨＺ２^＋、ＵＣＰ２^＋、ＶＯＰＰ１^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上；（ｇ）ＣＤ８^＋、並びにＡＣ２４３８２９．４^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ^＋、ＣＣＬ３^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＣＬ４Ｌ２^＋、ＣＣＬ５^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＳＴ７^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＮＬＹ^＋、ＧＺＭＡ^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＧＺＭＨ^＋、ＧＺＭＫ^＋、ＨＡＶＣＲ２^＋、ＨＣＳＴ^＋、ＨＬＡ－ＤＭＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＦＮＧ^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＪＡＭＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＹＳＴ^＋、ＭＩＲ１５５ＨＧ^＋、ＮＫＧ７^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＧＳ１^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの１以上；（ｈ）ＡＨＩ１＋、ＣＸＣＬ１３＋、ＦＡＢＰ５＋、ＮＡＰ１Ｌ４＋、ＯＲＭＤＬ３＋、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ＋、ＴＩＧＩＴ＋、及びＴＯＸ＋のうちの１以上；又は（ｉ）ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの１以上を含む、方法を提供する。

【0009】

本発明の更に別の態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有する、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法であって：本発明の他の態様に関して本明細書に記載される方法のいずれかに従って、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を単離すること、及び単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に導入して、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞を得ることを含む、方法を提供する。

【0010】

本発明の更なる態様は、本発明の方法のいずれかに従って調製された、関連のＴＣＲ又はその抗原結合部分、単離された細胞の集団、及び医薬組成物を提供する。

【0011】

本発明の更なる態様は、哺乳動物における状態を治療又は予防する関連の方法、及び哺乳動物における状態の治療又は予防のための医薬を調製する関連の方法であって、状態ががん又はウイルス状態である、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

図面のいくつかの観点の簡単な説明

【図1A】図１Ａは、結腸直腸がん患者４３２３由来のＴ細胞のｔ－ＳＮＥ分析の結果（ｔ－ＳＮＥマップ）を示す。クラスターには０～７の番号を付けている。

【図1B】図１Ｂは、図１Ａのｔ－ＳＮＥマップ上に投影した公知のネオ抗原反応性ＴＣＲを示す。公知のネオ抗原反応性ＴＣＲは、クラスター５（四角で囲まれた領域）に局在している。

【図1C】図１Ｃは、図１Ａのクラスター５中の４３２３Ｔ細胞による、選択した遺伝子の発現を示す。

【図2A】図２Ａは、患者４３２３のＴＩＬについてのｔ－ＳＮＥマップであり、クラスタートランスクリプトームプロファイルに基づいて前向きに再構築されたすべてのネオ抗原反応性ＴＣＲがクラスター５（四角で囲まれた領域）に位置することを示す。

【図2B】図２Ｂは、患者４３２３のＴＩＬについてのｔ－ＳＮＥマップであり、試験された非反応性ＴＣＲのすべてが、特異性を示す８のクラスターの全てに位置する（黒丸）ことを示す。

【図3A】図３Ａは、結腸直腸がん患者４３２４由来のＴ細胞のｔ－ＳＮＥ分析の結果（ｔ－ＳＮＥマップ）を示す。クラスターには０～６の番号を付けている。

【図3B】図３Ｂは、図３Ａのｔ－ＳＮＥマップ上に投影した公知のネオ抗原反応性ＴＣＲを示す。公知のネオ抗原反応性ＴＣＲは、クラスター６（四角で囲まれた領域）に局在している。

【図3C】図３Ｃは、図３Ａのクラスター６中の４３２４Ｔ細胞による、選択した遺伝子の発現を示す。

【図4A】図４Ａは、乳がん患者４３２２由来のＴ細胞のｔ－ＳＮＥ分析の結果（ｔ－ＳＮＥマップ）を示す。クラスターには０～８の番号を付けている。

【図4B】図４Ｂは、図４Ａのｔ－ＳＮＥマップ上に投影した公知のネオ抗原反応性ＴＣＲを示す。公知のネオ抗原反応性ＴＣＲは、クラスター３（四角で囲まれた領域）に局在している。

【図4C】図４Ｃは、図４Ａのクラスター３中の４３２２Ｔ細胞による、選択した遺伝子の発現を示す。

【図5A】図５Ａは、以前の結腸直腸がん患者４３２３並びに肺がん患者４２３４及び４２３７由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞の組み合わされた（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）ｔ－ＳＮＥ分析の結果（ｔ－ＳＮＥマップ）を示す。クラスターには０～６の番号を付けている。

【図5B】図５Ｂは、図５Ａのｔ－ＳＮＥマップ上に投影した公知のネオ抗原反応性ＴＣＲ、並びに４３２３ＣＤ８^＋クラスター（４２３４及び４２３７を含む）の再クラスター化を示す。公知のネオ抗原反応性ＴＣＲは、クラスター４（四角で囲まれた領域）に局在している。

【図5C】図５Ｃは、図５Ａのクラスター４中のＣＤ８^＋４３２３、４２３４、及び４２３７Ｔ細胞による、選択した遺伝子の発現を示す。

【図6】図６は、患者４３２３のネオ抗原反応性Ｔ細胞（ｎ＝２３６細胞）及び患者４３２３のネオ抗原反応性Ｔ細胞以外の細胞（ｎ＝２５９７）についてのＮｅｏＴＣＲシグネチャスコアを示すグラフである。

【図7A】図７Ａは、結腸直腸がん患者４２８３由来のＴ細胞のｔ－ＳＮＥ分析の結果（ｔ－ＳＮＥマップ）を示す。クラスターには０～４の番号を付けている。

【図7B】図７Ｂは、図７Ａのｔ－ＳＮＥマップ上に投影した公知のネオ抗原反応性ＴＣＲを示す。公知のＣＤ４^＋ネオ抗原反応性ＴＣＲは、クラスター２（四角で囲まれた領域）に局在している。

【図7C】図７Ｃは、図７Ａのクラスター２中の４２８３Ｔ細胞による、選択した遺伝子の発現を示す。

【図8A】図８Ａは、他の患者の原型のｔＳＮＥプロットに投影した、Ｐｔ．４３２３のＮｅｏＴＣＲクラスタートランスクリプトームプロファイルに由来するＮｅｏＴＣＲシグネチャの第９５パーセンタイルを発現する細胞（より暗い点）を示す。

【図8B】図８Ｂは、他の患者の原型のｔＳＮＥプロットに投影した、Ｐｔ．４３２２に由来するＮｅｏＴＣＲシグネチャの第９５パーセンタイルを発現する細胞（より暗い点）を示す。

【図8C】図８Ｃは、他の患者の原型のｔＳＮＥプロットに投影した、Ｐｔ．４３２３、４２３４、及び４２３７由来のＮｅｏＴＣＲシグネチャの第９５パーセンタイルを発現する細胞（より暗い点）を示す。

【図9】図９は、抗体ベースのｔＳＮＥ及びトランスクリプトームベースのｔＳＮＥによって分析されたＴ細胞のクラスタリングを比較するプロットを示す。Ｔ細胞は、３人のＮＳＣＬＣ患者（４２３４、４２３７、及び４３６９）由来の６のネオ抗原（ＤＯＰＥＹ２、Ｕ２ＡＦ１、ＳＬＦＮ１１、ＢＰＮＴ１、及びＭＬＬＴ４）に対して反応性であった。ネオ抗原反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞をより暗い点で表す。

【図10】図１０は、患者４２３４についてのｔＳＮＥプロットを示す。四角枠中の２のｔＳＮＥプロットは、患者４２３４のＴＩＬにおけるＣＤ８^＋細胞及びネオ抗原反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞のそれぞれの分布を示す。四角枠の外側の１０のｔＳＮＥプロットは、表示した、ネオ抗原反応性Ｔ細胞に関連する分子を発現する細胞の分布を示す。代表的な１０の分子の結果を示す。すべてのプロットにおいて、暗い点は各プロットの上に表示する特徴に関連する細胞を表す。

【図11】図１１Ａ～１１Ｄは、ＦＢＣ抗体によって検出される細胞表面タンパク質の発現を示す。患者４２３４のＴＩＬにおいて、黒色の点はネオ抗原反応性Ｔ細胞を表し、灰色の点は他の非抗原反応性Ｔ細胞を表す。図１１Ａ：ネオ抗原反応性Ｔ細胞上ではＣＤ８Ａ発現が低い（薄暗い）。図１１Ｂ：ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの両方の発現が低く、このことによりネオ抗原反応性細胞がエフェクターメモリーＴ細胞であることが示唆されている。図１１Ｃ：ネオ抗原反応性細胞は、ＣＤ１０３発現が低く（弱い陽性）、ＣＤ３９陽性である。図１１Ｄ：ネオ抗原反応性ＣＤ８ Ｔ細胞の大部分は、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３の両方を発現する。

【図12】図１２は、本発明の態様による単一細胞解析を用いる、腫瘍からの迅速なネオ抗原ＴＣＲ単離のためのワークフローを示す模式図である。本発明の態様は、例えば、免疫療法のための抗腫瘍変異特異的ネオ抗原反応性ＴＣＲを得る２の方法：（１）単一細胞ＲＮＡ配列決定及びその後の、ＴＣＲをインシリコ再構築するための、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子シグネチャの適用、及び（２）最小限のマーカーを用いてのフローサイトメトリーベースの分取とそれに続くＴＣＲ再構築による、腫瘍ネオ抗原反応性ＴＣＲの直接的単離、を提供し得る。

【図13】図１３は、ＤＭＳＯで処理した標的細胞（対照）（左パネル）又はＨＰＶ１６ Ｅ４を提示する標的細胞（右パネル）との共培養後の、４３９７ＴＣＲ１で形質導入したエフェクター細胞による４－１ＢＢ発現を示すＦＡＣＳデータを提示する。

【発明を実施するための形態】

【0013】

発明の詳細な説明
多くの腫瘍は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含有し得るが、これらの一部のみが、実際にがん変異がコードするネオ抗原と反応し得る。ある特定の腫瘍内に存在するＴＩＬの多くは、腫瘍の標的化免疫拒絶に直接関与しないバイスタンダーＴ細胞であり得る。混合集団から腫瘍を標的とするＴ細胞を濃縮するマーカーを同定する以前の取り組みは、成功の達成がまちまちであり、ほとんどコンセンサスがない。インビトロネオ抗原反応性に基づいて選択されたＴＩＬ断片培養物で患者を治療するこれまでの取り組みは、ＴＩＬの、進行した転移性がん患者における長期退縮を媒介する能力を示している。しかし、ＴＩＬ断片スクリーニングは、時間のかかる労働集約的なプロセスである場合があり、純粋な腫瘍反応性ＴＩＬ集団で患者を治療できない場合がある。むしろ、ＴＩＬ断片スクリーニングは、増幅のためのインビトロ反応性の程度が最も高いＴＩＬ断片を選択するのみであり得る。かかる技術は、腫瘍反応性ＴＩＬが腫瘍に無関係なコンペティターによって増殖し、反応性の低下した治療製品をもたらす可能性がある確率的方法であり得る。自己腫瘍反応性Ｔ細胞のマーカーについての検索により、ＰＤ－１及びＣＤ３９等の一部のマーカーが腫瘍反応性Ｔ細胞を濃縮できることが示されているが、かかる濃縮がＴ細胞療法のエンジニアリングに適用できるＴＣＲ配列の同定を可能にするのに十分であるのか明確ではない。がん関連ウイルス抗原に反応性のＴ細胞の同定に関して、同様の課題が存在する。

【0014】

本発明の方法は、抗原、例、治療のためにＴ細胞を改変するために用いられ得るがん特異的抗原及びがん関連ウイルス抗原、に対して反応性のＴ細胞のＴＣＲ配列を迅速に同定することによって、これら及び他の欠点を改善し得る。本発明の方法は、好都合なことに、より低い頻度のかかる細胞を含有する天然のＴＩＬ集団を発見し、増殖させ、投与することに関連する不確実性を回避し得る。

【0015】

複数の一般的な上皮がんに存在する、標的抗原に対して反応性の、以前に同定されたＴＣＲの大部分を包含する細胞集団が、腫瘍標本から単離されたＴ細胞の単一細胞解析により発見されることが見出された。この集団は、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルによって定義され得る。例えば、患者の腫瘍由来の、個別の固有の体細胞変異を標的とする、クローン的に明確なＴ細胞受容体を用いて、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルを有する細胞によって発現される新規な未知のＴＣＲが再構築され、がんネオ抗原反応性であることが判明した。本発明の態様は、がんネオ抗原反応性Ｔ細胞を選択及び同定する、遺伝子発現プロファイルのＣＩＴＥ－ｓｅｑ解析を用いる独立した方法も提供する。本発明の方法により、一般的ながんの細胞ベースの免疫療法のためのＴ細胞及びＴＣＲを迅速に単離するための潜在力が、増殖する腫瘍浸潤Ｔ細胞及び高価で時間のかかるスクリーニングを必要とせずに、劇的に増大する。本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルは、好都合なことに、がん関連ウイルス抗原に反応性のＴ細胞及びＴＣＲも同定し得る。

【0016】

また、複数の組織像の腫瘍においてがんネオ抗原反応性ＴＩＬの明確な集団が存在すること、及びこの集団のシグネチャが、混合集団からがんネオ抗原反応性ＴＩＬを前向きに同定するのに十分信頼性があることも発見された。本明細書に記載の本発明の方法によって同定された遺伝子発現プロファイルを利用して、腫瘍由来の単一Ｔ細胞を正確に分析し、ＴＣＲ情報を用いて、患者の治療のためにがんネオ抗原反応性ＴＣＲを前向きに合成することが可能である。

【0017】

本発明の一態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製する方法を提供する。語句「抗原特異的」及び「抗原特異性」は、本明細書で用いられる場合、Ｔ細胞が抗原又はそのエピトープに特異的に結合し、免疫学的に認識でき、該Ｔ細胞の該抗原またはそのエピトープへの結合は、免疫応答を誘発することを意味する。これに関して、本発明の方法によって得られたＴ細胞の集団は、本発明の方法によって得られているのではない細胞の集団と比較して、より高い割合の、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞を含み得る。

【0018】

本発明の一態様においては、標的抗原はがん抗原である。用語「がん抗原」は、本明細書で用いられる場合、該抗原が腫瘍又はがんに関連するように、腫瘍細胞又はがん細胞に専ら又は支配的に発現又は過剰発現する任意の分子（例、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物等）を指す。がん抗原は更に、正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん細胞に発現し得る。しかしながら、そのような場合、正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん細胞によるがん抗原の発現は、腫瘍細胞又はがん細胞による発現ほど強力ではない。これに関して、腫瘍細胞又はがん細胞は、該抗原を過剰発現するか、又は正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん細胞による該抗原の発現と比較して有意に高いレベルで該抗原を発現し得る。また、がん抗原は、生育又は成熟の異なる状態の細胞に更に発現し得る。例えば、がん抗原は、成体宿主においては通常見られない胚又は胎児期の細胞に更に発現し得る。或いは、がん抗原は、成体宿主においては通常見られない幹細胞又は前駆細胞に更に発現し得る。がん抗原は当該技術分野で公知であり、例えば、メソテリン、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＡＧ－３とも呼ばれる）、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３等が挙げられる。

【0019】

本発明の一態様においては、標的抗原は、がん特異的変異によってコードされるネオ抗原である。ネオ抗原は、発現タンパク質におけるがん特異的変異から生じる１群のがん抗原である。用語「ネオ抗原」は、正常（非がん性）細胞に発現する対応する野生型（非変異）ペプチド又はタンパク質と比較して、１以上のアミノ酸改変を含む、がん細胞に発現するペプチド又はタンパク質に関する。ネオ抗原は、患者固有のものであり得る。「がん特異的変異」は、腫瘍又はがん細胞の核酸に存在するが、対応する正常、即ち非腫瘍細胞や非がん性細胞の核酸には存在しない体細胞変異である。

【0020】

本発明の一態様においては、標的抗原はウイルス特異的抗原である。ウイルス特異的抗原は当該技術分野で公知であり、例えば、ウイルス感染細胞（ＡＰＣ）に発現するか又は提示され、ウイルスに感染していない細胞に発現しないし提示されない、任意のウイルスタンパク質又はペプチド、例、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｇｐ１２０、チミジンキナーゼ等が挙げられる。本発明の一態様においては、ウイルス特異的抗原は、がん関連ウイルス抗原、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ４、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ７等である。ウイルス特異的抗原は、例えば、ヘルペスウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、ヘパドナウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、アデノウイルス抗原、コロナウイルス抗原、オルソミクソウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、フラビウイルス抗原、及びカリシウイルス抗原であり得る。例えば、ウイルス特異的抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、インフルエンザウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、エプスタイン・バー（ＥＢＶ）ウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、水痘ウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、カリシウイルス抗原、アデノウイルス抗原、及びアリーナウイルス抗原からなる群から選択され得る。本発明の一態様においては、がん関連ウイルス抗原はＨＰＶ抗原である。

【0021】

前記方法は、患者の腫瘍試料からＴ細胞を単離することを含み得る。腫瘍試料は、例えば、原発性腫瘍からの組織又は転移性腫瘍の部位からの組織であり得る。従って、腫瘍試料は、吸引、生検、又は切除を含むがこれらに限定されない任意の好適な手段によって得られ得る。本発明の一態様においては、患者はがん患者である。本発明の別の態様においては、患者はウイルス状態に罹患している患者である。

【0022】

前記方法は、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することを更に含み得る。遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、Ｔ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること、及び１以上の単一Ｔ細胞による１以上の遺伝子の発現及び／又は非発現を個別に検出することを含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、単一細胞トランスクリプトーム解析を実施することを含む。

【0023】

１以上の単一Ｔ細胞による１以上の遺伝子の発現及び／又は非発現の検出は、例えば、ＣＨＲＯＭＩＵＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎシステム（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）（「ＣＨＲＯＭＩＵＭシステム」）を用いて実施され得る。ＣＨＲＯＭＩＵＭシステムは、細胞ごとにハイスループットのデジタル遺伝子発現により複雑な細胞集団の詳細なプロファイリングを実施する。ＣＨＲＯＭＩＵＭシステムは、５’転写解析又はＴＣＲ解析のために個々の細胞のｃＤＮＡをバーコード化する。例えば、試料は１０，０００の細胞のインプットで開始し得、平均約５００遺伝子／細胞で、約３０００細胞／試料に関するデータをもたらし得る。

【0024】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、配列決定によるトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ａｎｄ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ）解析を実施することを含む。ＣＩＴＥ－Ｓｅｑは、例えば、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（９）：８６５-８６８（２０１７）に記載されている。簡単に言えば、ＣＩＴＥ－ｓｅｑは、タンパク質マーカーの抗体ベースの検出と、多くの単一細胞に関するトランスクリプトームプロファイリングとを並行して組合せている。オリゴヌクレオチド標識抗体が、細胞タンパク質及びトランスクリプトームの測定を効率的な単一細胞の読み出し情報に統合するために用いられる。

【0025】

単一細胞トランスクリプトーム解析によってもたらされるデータの次元性が高いため（例、約３０００細胞／試料及び約５００遺伝子／細胞）、遺伝子発現データの解析のために次元削減が実施され得る。従って、本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、１以上の単一細胞次元削減方法（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を実施することを含む。単一細胞次元削減方法の例は、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ｔ－ＳＮＥ）分析である。ｔ－ＳＮＥは、各データポイントにマップ内の２次元又は３次元の位置を与えることにより、高次元データを視覚化する。ｔ－ＳＮＥは、例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｔｅｎ ａｎｄ Ｈｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｒｅｓ．，９：２５７９－２６０５（２００８）に記載されている。簡単に言うと、ｔ－ＳＮＥは２工程で実施される。工程１においては、高次元空間で確率分布が作成され、さまざまな近傍点間の関係が決まる。工程２においては、その確率分布に可能な限り従う低次元空間が作成し直される。ｔ－ＳＮＥにおける「ｔ」は、工程２において用いられる分布であるｔ分布に由来する。「Ｓ」及び「Ｎ」（「確率論的な」及び「近傍」）は、近傍点間の確率分布の使用に由来する。単一細胞次元削減方法の別の例は、均一マニホールド近似投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）である。

【0026】

遺伝子発現プロファイルは、（ｉ）１以上の遺伝子の正の発現、（ｉｉ）１以上の遺伝子の負の発現、又は（ｉｉｉ）１以上の遺伝子の負の発現と組み合わせた１以上の遺伝子の正の発現を含み得る。表示された遺伝子の発現に関する用語「正の」（「^＋」と省略される場合がある）は、本明細書で用いられる場合、Ｔ細胞が、患者の腫瘍試料中の他のＴ細胞と比較して、表示された遺伝子の発現をアップレギュレートすることを意味する。アップレギュレートされた発現は、例えば、約０．２、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、又は前述の任意の２つの範囲の値、又はそれ以上の平均対数倍数変化（２を底とする）だけの、表示された遺伝子の発現における量的増加を包含し得る。表示された遺伝子の発現に関する用語「負の」（「－」と省略される場合がある）は、本明細書で用いられる場合、Ｔ細胞が、患者の腫瘍試料中の他のＴ細胞と比較して、表示された遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを意味する。ダウンレギュレートされた発現は、例えば、約－０．２、約－０．５、約－１、約－２、約－３、約－４、約－５、約－６、約－７、約－８、約－９、約－１０、約－１１、約－１２、約－１３、約－１４、約－１５、約－１６、約－１７、約－１８、約－１９、約－２０、約－２１、約－２２、約－２３、約－２４、約－２５、約－２６、約－２７、約－２８、約－２９、約－３０、約－３１、約－３２、約－３３、約－３４、約－３５、又は前述の値の任意の２つの範囲、又はそれ以上の平均対数倍変化（２を底とする）だけの、表示された遺伝子の発現における定量的減少を包含し得る。ダウンレギュレートされた発現は、表示された遺伝子の発現の欠如を包含し得るが、ダウンレギュレーションはまた、患者の腫瘍試料中の他のＴ細胞と比較して低いレベルではあるが、表示された遺伝子の発現の存在も包含し得る。

【0027】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の一方又は両方並びに（ｉｉ）ＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上を含む。例えば、遺伝子発現プロファイルは、（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の一方又は両方、並びに（ｉｉ）ＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくはそれ以上（又は前述の値の任意の２つの間の範囲）を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の一方又は両方、並びに（ｉｉ）ＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、及びＳ１００Ａ１０^－の全てを含む。

【0028】

本発明の別の態様においては、遺伝子発現プロファイルは：ＣＤ４^＋、並びにＢＡＴＦ^＋、ＣＤ２４７^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＮＰＨ１^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＧＹＰＣ^＋、ＩＦＩＴＭ１^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＰＯＣＫ２^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＣＣＬ５^－、ＣＤ５２^－、ＧＳＴＰ１^－、ＪＵＮ^－、ＬＧＡＬＳ１^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＰＬＰ２^－、ＲＧＣＣ^－、Ｓ１００Ａ１０^－、ＶＩＭ^－、及びＺＦＰ３６^－のうちの１以上を含む。遺伝子発現プロファイルは、例えば、（ｉ）ＣＤ４^＋及びＣＸＣＬ１３^＋；（ｉｉ）ＣＤ４^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^－のうちの１以上；又は（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^－を含み得る。遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ４^＋及びＢＡＴＦ^＋、ＣＤ２４７^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＮＰＨ１^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＧＹＰＣ^＋、ＩＦＩＴＭ１^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＰＯＣＫ２^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＣＣＬ５^－、ＣＤ５２^－、ＧＳＴＰ１^－、ＪＵＮ^－、ＬＧＡＬＳ１^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＰＬＰ２^－、ＲＧＣＣ^－、Ｓ１００Ａ１０^－、ＶＩＭ^－、及びＺＦＰ３６^－のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくはそれ以上（又は前述の値の任意の２つの間の範囲）を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ４^＋、並びにＢＡＴＦ^＋、ＣＤ２４７^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＮＰＨ１^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＧＹＰＣ^＋、ＩＦＩＴＭ１^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＰＯＣＫ２^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＣＣＬ５^－、ＣＤ５２^－、ＧＳＴＰ１^－、ＪＵＮ^－、ＬＧＡＬＳ１^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＰＬＰ２^－、ＲＧＣＣ^－、Ｓ１００Ａ１０^－、ＶＩＭ^－、及びＺＦＰ３６^－の全てを含む。

【0029】

本発明の更に別の態様においては、遺伝子発現プロファイルは：ＣＤ８^＋、並びにＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＬＯＸ５ＡＰ^＋、ＡＲＨＧＡＰ９^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＡＲＤ１６^＋、ＣＤ３Ｇ^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＬＩＣ３^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＧＮ３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＧＡＥ^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＥＬＬ２^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＡＢ２７Ａ^＋、ＲＡＲＲＥＳ３^＋、ＲＢＰＪ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＡＮＸＡ１^－、ＥＥＦ１Ｂ２^－、ＥＭＰ３^－、ＩＬ７Ｒ^－、ＬＧＡＬＳ３^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、ＲＰＬ３６Ａ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの１以上を含む。遺伝子発現プロファイルは、例えば、（ｉ）ＣＤ８^＋及びＣＸＣＬ１３^＋；（ｉｉ）ＣＤ８^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、並びにＣＤ３９^＋及びＰＤ－１^＋の一方若しくは両方；（ｉｉｉ）ＣＤ８^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋；（ｉｖ）ＣＤ８^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの１以上；又は（ｖ）ＣＤ８^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＤ３９^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＰＤ－１^＋を含み得る。例えば、遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ８^＋、並びにＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＬＯＸ５ＡＰ^＋、ＡＲＨＧＡＰ９^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＡＲＤ１６^＋、ＣＤ３Ｇ^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＬＩＣ３^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＧＮ３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＧＡＥ^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＥＬＬ２^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＡＢ２７Ａ^＋、ＲＡＲＲＥＳ３^＋、ＲＢＰＪ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＡＮＸＡ１^－、ＥＥＦ１Ｂ２^－、ＥＭＰ３^－、ＩＬ７Ｒ^－、ＬＧＡＬＳ３^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、ＲＰＬ３６Ａ^－、及びＳ１００Ａ１０^－のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、若しくはそれ以上（又は前述の値の任意の２つの間の範囲）を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ８^＋、並びにＡＦＡＰ１ＩＬ２^＋、ＡＬＯＸ５ＡＰ^＋、ＡＲＨＧＡＰ９^＋、ＡＳＢ２^＋、ＣＡＲＤ１６^＋、ＣＤ３Ｇ^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＬＩＣ３^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＧＮ３^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＴＧＡＥ^＋、ＩＴＭ２Ａ^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＥＬＬ２^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＤＬＩＭ４^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＡＢ２７Ａ^＋、ＲＡＲＲＥＳ３^＋、ＲＢＰＪ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＡＮＸＡ１^－、ＥＥＦ１Ｂ２^－、ＥＭＰ３^－、ＩＬ７Ｒ^－、ＬＧＡＬＳ３^－、ＬＴＢ^－、ＬＹＡＲ^－、ＲＧＣＣ^－、ＲＰＬ３６Ａ^－及びＳ１００Ａ１０^－のすべてを含む。

【0030】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＡＢＩ３^＋、ＡＣ２４３９６０．１^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＤＧＲＧ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＳＢ２^＋、ＢＳＴ２^＋、ＣＡＲＳ^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２ＢＰ２^＋、ＣＤ８２^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＡＴＡ３^＋、ＧＰＲ２５^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＤＬＢＰ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＤ２^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＬＡＧ３^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＩＮＣ０１９４３^＋、ＭＩＳ１８ＢＰ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＣＦ４^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＣＥＤ１Ｂ^＋、ＰＤＣＤ１^＋、ＰＨＰＴ１^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＳＬＣ１Ａ４^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＲＡＦ３ＩＰ３^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上を含む。例えば、遺伝子発現プロファイルは、ＡＢＩ３^＋、ＡＣ２４３９６０．１^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＤＧＲＧ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＳＢ２^＋、ＢＳＴ２^＋、ＣＡＲＳ^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２ＢＰ２^＋、ＣＤ８２^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＡＴＡ３^＋、ＧＰＲ２５^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＤＬＢＰ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＤ２^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＬＡＧ３^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＩＮＣ０１９４３^＋、ＭＩＳ１８ＢＰ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＣＦ４^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＣＥＤ１Ｂ^＋、ＰＤＣＤ１^＋、ＰＨＰＴ１^＋、ＰＬＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＳＬＣ１Ａ４^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＲＡＦ３ＩＰ３^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又はそれ以上を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＡＢＩ３^＋、ＡＣ２４３９６０．１^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＤＧＲＧ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＳＢ２^＋、ＢＳＴ２^＋、ＣＡＲＳ^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２ＢＰ２^＋、ＣＤ８２^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＸＣＲ６^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＡＴＡ３^＋、ＧＰＲ２５^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＨＤＬＢＰ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＤ２^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＬＡＧ３^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＩＮＣ０１９４３^＋、ＭＩＳ１８ＢＰ１^＋、ＭＰＳＴ^＋、ＮＣＦ４^＋、ＮＳＭＣＥ１^＋、ＰＣＥＤ１Ｂ^＋、ＰＤＣＤ１^＋、ＰＨＰＴ１^＋、ＰＬＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＳＬＣ１Ａ４^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＮＦＲＳＦ１８^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＲＡＦ３ＩＰ３^＋、及びＹＰＥＬ２^＋の全てを含む。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルはＬＡＧ３^＋を更に含む。

【0031】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ４^＋、並びにＡＤＩ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＲＩＤ５Ｂ^＋、ＢＡＴＦ^＋、ＣＭＴＭ７^＋、ＣＰＭ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＹＴＨ１^＋、ＥＬＭＯ１^＋、ＥＴＶ７^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＦＢＬＮ７^＋、ＦＫＢＰ５^＋、ＧＲＡＭＤ１Ａ^＋、ＨＩＦ１Ａ^＋、ＩＬ６ＳＴ^＋、ＩＴＧＡ４^＋、ＩＴＫ^＋、ＪＡＫ３^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＥＦ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＭＡＦ^＋、ＭＡＬ^＋、ＭＩＲ４４３５－２ＨＧ^＋、ＭＹＬ６Ｂ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＰＡＳＫ^＋、ＰＧＭ２Ｌ１^＋、ＰＩＭ２^＋、ＰＰＰ１ＣＣ^＋、ＳＥＳＮ３^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＯＣＳ１^＋、ＳＴＡＴ１^＋、ＳＹＮＥ２^＋、ＴＢＣ１Ｄ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＬＫ１^＋、ＴＭＥＭ１２３^＋、ＴＭＥＭ７０^＋、ＴＮＩＫ^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＳＨＺ２^＋、ＵＣＰ２^＋、ＶＯＰＰ１^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの１以上を含む。例えば、遺伝子発現プロファイルは：ＡＤＩ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＲＩＤ５Ｂ^＋、ＢＡＴＦ^＋、ＣＭＴＭ７^＋、ＣＰＭ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＹＴＨ１^＋、ＥＬＭＯ１^＋、ＥＴＶ７^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＦＢＬＮ７^＋、ＦＫＢＰ５^＋、ＧＲＡＭＤ１Ａ^＋、ＨＩＦ１Ａ^＋、ＩＬ６ＳＴ^＋、ＩＴＧＡ４^＋、ＩＴＫ^＋、ＪＡＫ３^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＥＦ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＭＡＦ^＋、ＭＡＬ^＋、ＭＩＲ４４３５－２ＨＧ^＋、ＭＹＬ６Ｂ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＰＡＳＫ^＋、ＰＧＭ２Ｌ１^＋、ＰＩＭ２^＋、ＰＰＰ１ＣＣ^＋、ＳＥＳＮ３^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＯＣＳ１^＋、ＳＴＡＴ１^＋、ＳＹＮＥ２^＋、ＴＢＣ１Ｄ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＬＫ１^＋、ＴＭＥＭ１２３^＋、ＴＭＥＭ７０^＋、ＴＮＩＫ^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＳＨＺ２^＋、ＵＣＰ２^＋、ＶＯＰＰ１^＋、及びＹＰＥＬ２^＋のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又はそれ以上を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ４^＋、並びにＡＤＩ１^＋、ＡＨＩ１^＋、ＡＲＩＤ５Ｂ^＋、ＢＡＴＦ^＋、ＣＭＴＭ７^＋、ＣＰＭ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＣＹＴＨ１^＋、ＥＬＭＯ１^＋、ＥＴＶ７^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＦＢＬＮ７^＋、ＦＫＢＰ５^＋、ＧＲＡＭＤ１Ａ^＋、ＨＩＦ１Ａ^＋、ＩＬ６ＳＴ^＋、ＩＴＧＡ４^＋、ＩＴＫ^＋、ＪＡＫ３^＋、ＫＬＲＢ１^＋、ＬＥＦ１^＋、ＬＩＭＳ１^＋、ＭＡＦ^＋、ＭＡＬ^＋、ＭＩＲ４４３５－２ＨＧ^＋、ＭＹＬ６Ｂ^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＮＭＢ^＋、ＮＲ３Ｃ１^＋、ＰＡＳＫ^＋、ＰＧＭ２Ｌ１^＋、ＰＩＭ２^＋、ＰＰＰ１ＣＣ^＋、ＳＥＳＮ３^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＳＯＣＳ１^＋、ＳＴＡＴ１^＋、ＳＹＮＥ２^＋、ＴＢＣ１Ｄ４^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＴＬＫ１^＋、ＴＭＥＭ１２３^＋、ＴＭＥＭ７０^＋、ＴＮＩＫ^＋、ＴＯＸ^＋、ＴＳＨＺ２^＋、ＵＣＰ２^＋、ＶＯＰＰ１^＋、及びＹＰＥＬ２^＋の全てを含む。

【0032】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ８^＋、並びにＡＣ２４３８２９．４^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ^＋、ＣＣＬ３^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＣＬ４Ｌ２^＋、ＣＣＬ５^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＳＴ７^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＮＬＹ^＋、ＧＺＭＡ^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＧＺＭＨ^＋、ＧＺＭＫ^＋、ＨＡＶＣＲ２^＋、ＨＣＳＴ^＋、ＨＬＡ－ＤＭＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＦＮＧ^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＪＡＭＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＹＳＴ^＋、ＭＩＲ１５５ＨＧ^＋、ＮＫＧ７^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＧＳ１^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの１以上を含む。例えば、遺伝子発現プロファイルは：ＡＣ２４３８２９．４^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ^＋、ＣＣＬ３^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＣＬ４Ｌ２^＋、ＣＣＬ５^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＳＴ７^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＮＬＹ^＋、ＧＺＭＡ^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＧＺＭＨ^＋、ＧＺＭＫ^＋、ＨＡＶＣＲ２^＋、ＨＣＳＴ^＋、ＨＬＡ－ＤＭＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＦＮＧ^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＪＡＭＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＹＳＴ^＋、ＭＩＲ１５５ＨＧ^＋、ＮＫＧ７^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＧＳ１^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又はそれ以上を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＣＤ８^＋、並びにＡＣ２４３８２９．４^＋、ＡＣＰ５^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ^＋、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ^＋、ＣＣＬ３^＋、ＣＣＬ４^＋、ＣＣＬ４Ｌ２^＋、ＣＣＬ５^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ８Ａ^＋、ＣＤ８Ｂ^＋、ＣＳＴ７^＋、ＣＴＳＷ^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＤＵＳＰ４^＋、ＥＮＴＰＤ１^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＧＡＬＮＴ２^＋、ＧＮＬＹ^＋、ＧＺＭＡ^＋、ＧＺＭＢ^＋、ＧＺＭＨ^＋、ＧＺＭＫ^＋、ＨＡＶＣＲ２^＋、ＨＣＳＴ^＋、ＨＬＡ－ＤＭＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＡ^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲＢ５^＋、ＨＭＯＸ１^＋、ＩＦＮＧ^＋、ＩＧＦＬＲ１^＋、ＩＴＧＡＬ^＋、ＪＡＭＬ^＋、ＬＩＮＣ０１８７１^＋、ＬＹＳＴ^＋、ＭＩＲ１５５ＨＧ^＋、ＮＫＧ７^＋、ＰＬＥＫＨＦ１^＋、ＰＲＦ１^＋、ＰＴＭＳ^＋、ＲＧＳ１^＋、ＳＬＦ１^＋、ＳＭＣ４^＋、ＳＵＰＴ３Ｈ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のすべてを含む。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルはＬＡＧ３^＋を更に含む。

【0033】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＡＨＩ１^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＯＲＭＤＬ３^＋、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの１以上を含む。例えば、遺伝子発現プロファイルは：ＡＨＩ１^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＯＲＭＤＬ３^＋、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＡＨＩ１^＋、ＣＸＣＬ１３^＋、ＦＡＢＰ５^＋、ＮＡＰ１Ｌ４^＋、ＯＲＭＤＬ３^＋、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ^＋、ＳＨ２Ｄ１Ａ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、及びＴＯＸ^＋のすべてを含む。

【0034】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの１以上を含む。例えば、遺伝子発現プロファイルは：ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋のうちの任意の１、２、又はそれ以上を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ３９^＋、及びＰＤ－１^＋のすべてを含む。

【0035】

本発明の更に別の態様においては、遺伝子発現プロファイルは：ＣＤ８^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^－、ＣＤ８Ａ^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ４５ＲＡ^－、ＣＤ６２Ｌ^－及びＩＬ７Ｒ^－のうちの１以上を含む。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは、ＰＤ－１^＋及びＴＩＭ－３^＋の一方又は両方を更に含む。例えば、遺伝子発現プロファイルは：ＣＤ８^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^－、ＣＤ８Ａ^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ４５ＲＡ^－、ＣＤ６２Ｌ^－及びＩＬ７Ｒ^－のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２若しくはそれ以上（又は前述の値の任意の２つの間の範囲）を含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは：ＣＤ８^＋、並びにＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^－、ＣＤ８Ａ^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ４５ＲＡ^－、ＣＤ６２Ｌ^－及びＩＬ７Ｒ^－のすべてを含む。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは（腫瘍内の他のＣＤ８^＋Ｔ細胞と比較して）：ＣＤ８Ａ低、ＣＤ４５ＲＡ負、ＣＤ６２Ｌ負から非常に低、ＣＣＲ７負から非常に低、ＣＤ１６負から非常に低、及びＩＬ７Ｒ負から非常に低のうちの１以上を含む。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルは：ＣＤ８^＋、並びに細胞表面タンパク質ＣＤ３９^＋、ＣＤ７４^＋、ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１０６^＋、ＣＤ１３７^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＴＩＧＩＴ^＋、ＣＣＲ７^ｌｏ、ＣＤ８Ａ^ｌｏ、ＣＤ１６^ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ^ｌｏ、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ及びＩＬ７Ｒ^ｌｏのうちの１以上を含む。表示された遺伝子の発現に関して用語「低」（「ｌｏ」と省略される場合がある）は、本明細書で用いられる場合、表示された遺伝子の発現に関して正である他の細胞よりも、表示された発現遺伝子に関して、免疫組織化学的方法（例、ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー、免疫蛍光アッセイ及び顕微鏡法）を用いて明るく染色されない細胞の亜集団を指す。例えば、表示された遺伝子の発現レベルが「低い」細胞は、表示された遺伝子の発現について正である他の細胞の、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、若しくは約９５％、又は前述の値の任意の２つの範囲よりも、明るく染色されない場合がある。

【0036】

本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルはＴＩＧＩＴ^＋を含む。本発明の別の態様においては、遺伝子発現プロファイルはＣＸＣＬ１３^＋を含む。

【0037】

遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルにおける遺伝子（複数可）の発現産物（複数可）の存在若しくは非存在を検出すること、又はその量を測定することを含み得る。これに関して、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルの正に発現した遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の存在を検出することを含み得る。代替的に又は追加的に、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルにおいて発現について負である遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の不存在を検出することを含み得る。代替的に又は追加的に、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルにおける発現について負である遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の量を測定することを含み得る。代替的に又は追加的に、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルにおける発現について正である遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の量を測定することを含み得る。代替的に又は追加的に、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルの正に発現した遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの存在を検出することを含み得る。代替的に又は追加的に、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルにおける発現について負である遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの不存在を検出することを含み得る。代替的に又は追加的に、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルの正に発現した遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの量を測定することを含み得る。代替的に又は追加的に、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルの負に発現した遺伝子（複数可）によってコードされるＲＮＡの量を測定することを含み得る。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルにおける１以上の遺伝子の細胞表面発現の存在及び／又は不存在を検出することを含む。本発明の一態様においては、遺伝子発現プロファイルを有する単離されたＴ細胞を選択することは、遺伝子発現プロファイルにおける１以上の遺伝子の細胞表面発現の量を測定することを含む。細胞表面発現は、任意の好適な方法、例えばフローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））によって検出又は測定され得る。

【0038】

本発明の一態様においては、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製する方法は、Ｔ細胞の数を増幅することを含まない。Ｔ細胞の数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号；米国特許８，３８３，０９９号；米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）；及びＲｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９－２０１（１９９０）に記載されている通り、当該技術分野において公知の多くの方法のいずれかによって達成され得る。例えば、Ｔ細胞の数の増幅は、Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば、放射線照射同種異系ＰＢＭＣ）と共に培養することによって実施される。標的抗原に対して所望の特異性を有する希少及び／又は脆弱なＴ細胞は、Ｔ細胞の数の増幅中に失われる可能性がある。本発明の方法は、好都合なことに、本発明の方法を実施することによって、Ｔ細胞の数を増幅することなく、かかる希少及び／又は脆弱なＴ細胞を含む、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製し得る。

【0039】

前記方法は、選択されたＴ細胞を選択されなかった細胞から分離することを更に含み得、分離された選択されたＴ細胞は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を提供する。これに関して、選択された細胞は、選択されなかった細胞、即ち遺伝子発現プロファイルを有さない細胞から物理的に分離され得る。選択された細胞は、例えば、分取等の任意の好適な方法によって選択されなかった細胞から分離され得る。

【0040】

本発明の別の態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合部分を単離する方法を提供する。

【0041】

ＴＣＲの「抗原結合部分」は、本明細書で用いられる場合、抗原結合部分が、本発明の他の態様に関して本明細書中に記載される通り、標的抗原に特異的に結合するならば、それが一部であるＴＣＲの、連続するアミノ酸を含む任意の部分を指す。用語「抗原結合部分」は、本発明のＴＣＲの任意の一部又は断片（該一部又は断片は、それが一部であるＴＣＲ（親ＴＣＲ）の生物学的活性を保持する）を指す。抗原結合部分は、例えば、標的抗原に特異的に結合する能力、又は状態を検出、治療、若しくは予防する能力を、親ＴＣＲと比較して、類似程度、同程度、又はそれを上回る程度保持する、ＴＣＲの一部を包含する。親ＴＣＲに関して、機能的部分は、例えば、親ＴＣＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含み得る。

【0042】

抗原結合部分は、本発明のＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の１以上を含む部分等の、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖のいずれか又は両方の抗原結合部分を含み得る。本発明の一態様においては、抗原結合部分は、α鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１α）、α鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２α）、α鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３α）、β鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１β）、β鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２β）、β鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３β）のアミノ酸配列、又はそれらの任意の組合せを含み得る。好ましくは、抗原結合部分は、本発明のＴＣＲのＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、及びＣＤＲ３αのアミノ酸配列；ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βのアミノ酸配列；又は、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βのすべてのアミノ酸配列を含む。

【0043】

本発明の一態様においては、抗原結合部分は、例えば、上記のＣＤＲ領域の組み合わせを含む本発明のＴＣＲの可変領域を含み得る。これに関して、抗原結合部分は、α鎖の可変領域（Ｖα）のアミノ酸配列、β鎖の可変領域（Ｖβ）のアミノ酸配列、又は本発明のＴＣＲのＶα及びＶβの両方のアミノ酸配列を含み得る。

【0044】

本発明の一態様においては、抗原結合部分は、可変領域と定常領域との組み合わせを含み得る。これに関して、抗原結合部分は、本発明のＴＣＲのα鎖若しくはβ鎖の、又はα鎖とβ鎖の両方の全長を含み得る。

【0045】

前記方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される本発明の方法のいずれかに従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製することを含み得る。

【0046】

前記方法は、濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること、及び個別の単一Ｔ細胞試料の１以上においてＴＣＲα鎖ＣＤＲ３及びβ鎖ＣＤＲ３を配列決定することを含み得る。本発明の一態様においては、ＴＣＲα鎖ＣＤＲ３及びβ鎖ＣＤＲ３の配列決定は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される、遺伝子発現プロファイルを分析するために用いられる単一細胞トランスクリプトーム解析を用いて実施され得る。ＴＣＲα鎖ＣＤＲ３及びβ鎖ＣＤＲ３を配列決定するための他の技術は、例えば、米国特許出願公開第２０２０／００５６２３７号及び国際公開第２０１７／０４８６１４号に記載されている。

【0047】

前記方法は、ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすることを更に含み得る。これに関して、前記方法は、ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域とＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とのペアリングが機能的ＴＣＲをもたらすように、ＴＣＲを再構築することを含み得る。本発明の一態様においては、ＴＣＲはインシリコで再構築される。インシリコでＴＣＲを再構築し、ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングする方法は、例えば、米国特許出願公開第２０２０／００５６２３７号及び国際公開第２０１７／０４８６１４号に記載されている。

【0048】

前記方法は、選択されたＴ細胞から、ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を単離することを含み得、該ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、標的抗原に対して抗原特異性を有する。

【0049】

前記方法は、ペアリングしたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入すること、並びにペアリングしたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を宿主細胞に発現させることを含み得る。単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列（例、組換え発現ベクター）を宿主細胞へ導入することは、例、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；４ｔｈ Ｅｄ．（２０１２）に記載される通り、当該技術分野において公知の、種々の異なる方法のいずれかで実施され得る。ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するのに有用な技術の非限定的な例としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。

【0050】

本発明の一態様においては、前記方法は、ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、例、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，上記、に記載の通りの確立された分子クローニング技術を用いて、組換え発現ベクターにクローニングすることを含み得る。組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするために用いられ得る。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等の、増殖及び増幅のため、若しくは発現又は両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、トランスポゾン／トランスポザーゼ、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から成る群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９等のバクテリオファージベクターも用いられ得る。植物の発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物の発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクターは、ウイルスベクター（例、レトロウイルスベクター）である。他の態様においては、組換え発現ベクターはレンチウイルスベクター又はトランスポゾンである。

【0051】

宿主細胞（複数可）は、真核細胞、例、植物、動物、真菌、又は藻類であってもよく、原核細胞、例えば、細菌又は原生動物であってもよい。宿主細胞（複数可）は、培養細胞又は初代細胞、即ち、生物、例えばヒトから直接単離された細胞であり得る。宿主細胞（複数可）は、接着細胞又は懸濁細胞、即ち、懸濁液中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を増幅又は複製する目的のためには、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞、例、ＤＨ５α細胞である。組み換え体のＴＣＲを産生する目的のためには、宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。宿主細胞は、任意の細胞種であり得、任意の種類の組織に由来し得、任意の発生段階であり得るが、宿主細胞は、好ましくは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞である。

【0052】

本明細書における目的のために、Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例、初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、又は哺乳動物から得られたＴ細胞等の任意のＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞は、濃縮又は精製もされ得る。好ましくは、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であり得、任意の発生段階であり得、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、例、Ｔｈ_１及びＴｈ_２細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞（例、セントラルメモリＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞）、ナイーブＴ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0053】

前記方法は、標的抗原に対する抗原特異性について、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現する宿主細胞をスクリーニングすること、及び標的抗原に対して抗原特異性を有するペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を選択することを含み得、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分が単離される。抗原特異性について宿主細胞をスクリーニングすること、及び抗原特異性を有するペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を選択することは、例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２１８０４２号及び米国特許出願公開第２０１７／０２２４８００号に記載の通りの公知技術を用いて実施され得る。本発明の更なる態様は、例えば、単一細胞ＲＮＡ配列決定及びその後の、インシリコでのＴＣＲの再構築への遺伝子発現プロファイルの適用によって、標的抗原特異的ＴＣＲを得る方法を提供し得る。従って、本発明の一態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を単離する方法であって：患者の腫瘍試料からＴ細胞を単離すること；濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；個別の単一Ｔ細胞試料においてＴＣＲ ＣＤＲ３を配列決定すること；遺伝子発現プロファイルを有する分離された単一Ｔ細胞試料を選択すること；ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、遺伝子発現プロファイルを有する個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を宿主細胞に発現させること；標的抗原に対する抗原特異性について、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現する宿主細胞をスクリーニングすること；並びに標的抗原に対して抗原特異性を有する、ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を選択することを含み、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分が単離される、方法を提供する。Ｔ細胞の単離、Ｔ細胞の分取、ＴＣＲ ＣＤＲ３の配列決定、個別の単一Ｔ細胞試料の選択、アルファ鎖及びベータ鎖の可変領域のペアリング、宿主細胞へのヌクレオチド配列の導入、宿主細胞のスクリーニング、ペアリングされたアルファ鎖及びベータ鎖可変領域の選択、及び遺伝子発現プロファイルは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される遺伝子発現プロファイルのいずれかであり得る。

【0054】

本発明の方法によって単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分は、養子細胞療法のための細胞を調製するのに有用であり得る。これに関して、本発明の一態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法であって、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りＴＣＲ又は抗原結合部分を単離すること、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列をＰＢＭＣに導入して、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞を取得することを含む、方法を提供する。

【0055】

単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列（例、組換え発現ベクター）をＰＢＭＣへ導入することは、例、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．上記、に記載の通りの当該技術分野で公知の種々の異なる方法のいずれかで実施され得る。ヌクレオチド配列をＰＢＭＣに導入するのに有用な技術の非限定的な例としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。

【0056】

本発明の一態様においては、前記方法は、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、患者に対して自己であるＰＢＭＣに導入することを含む。これに関して、本発明の方法によって同定及び単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分は、各患者に対して個別化され得る。しかしながら、別の態様において、本発明の方法は、再発（「ホットスポット」とも称される）がん特異的変異によってコードされる変異アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を同定及び単離し得る。これに関して、前記方法は、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、患者に対して同種異系のＰＢＭＣに導入することを含み得る。例えば、前記方法は、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、腫瘍が同一ＭＨＣ分子の関連で同一変異を発現する別の患者のＰＢＭＣに導入することを含み得る。

【0057】

本発明の一態様においては、ＰＢＭＣはＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞、例えば、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。特定の理論やメカニズムには縛られないが、分化度の低い「より若い」Ｔ細胞は、分化度の高い「より老いた」Ｔ細胞と比較して、より高いインビボでの持続活性、増殖活性、及び抗腫瘍活性のいずれか１以上に関連し得ると考えられている。従って、本発明の方法は、好都合なことに、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を同定及び単離し得、該ＴＣＲ又はその抗原結合部分を、ＴＣＲ又はその抗原結合部分が単離され得る「より老いた」Ｔ細胞（例、患者の腫瘍におけるエフェクター細胞）と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで、より高い持続活性、増殖活性及び抗腫瘍活性のいずれか１以上を提供し得る「より若い」Ｔ細胞に導入し得る。

【0058】

本発明の方法は、例えば、単一細胞トランスクリプトミクスによって、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルを有すると同定されるＴＣＲの１超又はすべてを好都合に収集し、これらすべてのＴＣＲをプールし、及びそれらを臨床Ｔ細胞療法製品として組み合わせ得る。これに関して、本発明の別の態様は、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞のプールされた集団を調製する方法を提供する。該方法は、：（ａ）本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製すること；（ｂ）濃縮された集団中のＴ細胞を個別の単一Ｔ細胞試料に分取すること；（ｃ）個別の単一Ｔ細胞試料において、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を配列決定すること；（ｄ）ＣＤＲ３を含むアルファ鎖可変領域を、個別の単一Ｔ細胞試料の核酸によってコードされる、ＣＤＲ３を含むベータ鎖可変領域とペアリングすること；（ｅ）ペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に導入し、ＰＢＭＣにペアリングされたアルファ鎖可変領域及びベータ鎖可変領域を発現させること；及び本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従って調製された、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団の複数の個別の単一Ｔ細胞試料に対して、該ヌクレオチド配列の配列決定、ペアリング、及び導入を実施し、それにより標的抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞のプールされた集団を提供することを含み得る。該ヌクレオチド配列の分取、配列決定、ペアリング、及び導入は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに実施され得る。

【0059】

本発明の一態様においては、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法は、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するＰＢＭＣの数を増幅することを更に含む。ＰＢＭＣの数を増幅することは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに実施され得る。本発明の一態様においては、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法は、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するＰＢＭＣの数を増幅することを含むが、一方、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製する方法は、Ｔ細胞の数を増幅することを含まない。

【0060】

本発明の別の態様は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される方法のいずれかによって単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を提供する。本発明の一態様は、ＴＣＲのアルファ（α）鎖、ＴＣＲのベータ（β）鎖、ＴＣＲのガンマ（γ）鎖、ＴＣＲのデルタ（δ）鎖、又はそれらの組み合わせ等の、２ポリペプチド（即ち、ポリペプチド鎖）を含むＴＣＲを提供する。本発明の別の態様は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、ＴＣＲの、１以上のＣＤＲ領域、１以上の可変領域、又はα鎖及びβ鎖の一方若しくは両方を含む、ＴＣＲの抗原結合部分を提供する。本発明のＴＣＲ又はその抗原結合部分のポリペプチドは、ＴＣＲ又はその抗原結合部分が、標的抗原に対し抗原特異性を有するならば、任意のアミノ酸配列を含み得る。

【0061】

本発明の別の態様は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製された、単離された細胞の集団を提供する。細胞の集団は、少なくとも１の他の細胞（例、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現しない宿主細胞（例、ＰＢＭＣ）又はＴ細胞以外の細胞（例、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等）に加えて、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するＰＢＭＣを含む不均一集団であり得る。代替的に、細胞の集団は、集団が、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するＰＢＭＣを主に含む（例、実質的にそれからなる）、実質的に均一な集団であり得る。集団はまた、集団の全ての細胞が、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するように、集団の全ての細胞が、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する単一のＰＢＭＣのクローンである、細胞のクローン集団であり得る。本発明の一態様においては、細胞の集団は、本明細書に記載の単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するＰＢＭＣを含むクローン集団である。ＰＢＭＣに、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を導入することにより、本発明の方法は、好都合なことに、単離されたＴＣＲを発現し、標的抗原に対して抗原特異性を有するＰＢＭＣ細胞を高い割合で含む、細胞の集団を提供する。本発明の一態様においては、細胞の集団のうちの約１％～約１００％、例えば約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約１００％、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲が、単離されたＴＣＲを発現し、標的抗原に対して抗原特異性を有するＰＢＭＣ細胞を含む。特定の理論やメカニズムには縛られないが、単離されたＴＣＲを発現し、標的抗原に対して抗原特異性を有するＰＢＭＣ細胞を、高い割合で含む細胞の集団では、ＰＢＭＣの機能（例、ＰＢＭＣが、標的細胞の破壊を目的とする能力、及び／又は状態を治療若しくは予防する能力）を妨げ得る、不適切な細胞の割合が低いと考えられる。標的細胞としては、例えば、がん細胞又はウイルス感染細胞が挙げられ得る。

【0062】

本発明のＴＣＲ、又はその抗原結合部分、及び細胞の集団は、医薬組成物等の組成物へと製剤化され得る。これに関して、本発明は、本発明のＴＣＲ、若しくはその抗原結合部分、又は細胞の集団のいずれか及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明のＴＣＲ、若しくはその抗原結合部分、又は細胞の集団を、化学療法剤等、別の医薬的に活性な物質（複数可）又は薬剤（複数可）（例、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）など）と組み合わせて含み得る。

【0063】

好ましくは、担体は医薬的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、考慮中の、特定の本発明のＴＣＲ、若しくはその抗原結合部分、又は細胞の集団のために従来用いられているもののいずれかであり得る。かかる医薬的に許容可能な担体は、当業者に周知であり、公衆にとって容易に入手可能である。医薬的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。

【0064】

担体の選択は、特定の本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、又は細胞の集団によって、及び本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、又は細胞の集団を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度決定される。従って、多様な、本発明の医薬組成物の好適な製剤がある。好適な製剤としては、腫瘍内、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内及び腹腔内投与のための、いずれかの製剤が挙げられ得る。本発明のＴＣＲ又は細胞の集団を投与するために、１超の経路が用いられ得、特定の例においては、特定の経路が、別の経路よりも迅速且つ効果的な反応をもたらし得る。

【0065】

好ましくは、本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、又は細胞の集団は、注射により静脈内（例）に投与される。本発明の細胞の集団が投与される場合、注射用の細胞のための医薬的に許容可能な担体は、任意の等張性の担体、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％ ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液等が挙げられ得る。一態様においては、医薬的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミンが添加される。

【0066】

本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団及び医薬組成物は、状態を治療又は予防する方法において用いられ得ると考えられる。特定の理論やメカニズムには縛られないが、本発明のＴＣＲ又はその抗原結合部分は、ＴＣＲ又はその抗原結合部分が細胞に発現する場合、標的抗原を発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介することができるように、標的抗原に特異的に結合すると考えられる。これに関して、本発明は、（ｉ）標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製すること；哺乳動物における状態を治療又は予防するのに有効な量の細胞の集団を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における状態を治療又は予防する方法を提供する。

【0067】

用語「治療する」及び「予防する」並びにそれらの派生語は、本明細書で用いる場合、１００％の、又は完全な治療や予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、任意のレベルの任意の量の、哺乳動物における状態の治療又は予防を提供し得る。更に、本発明の方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防されている状態の１以上の兆候若しくは症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、状態の発症、又はその症状、兆候若しくは再発を遅延させることを包含し得る。

【0068】

本発明の目的のために、投与される本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団又は医薬組成物の量又は用量（例、本発明の細胞の集団が投与される場合、細胞の数）は、例えば、哺乳動物において、適切な期間にわたって治療的又は予防的反応をもたらすのに十分であるべきである。例えば、本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団又は医薬組成物の用量は、標的抗原と結合するのに、又は、投与時から約２時間以上、例えば、１２～２４時間又はそれ以上という期間で状態を検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。いくつかの態様においては、該期間はもっと長くなり得る。用量は、投与される特定の本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団又は医薬組成物の有効性、及び動物（例、ヒト）の状態、及び治療される動物（例、ヒト）の体重によって決定される。

【0069】

投与量を決定するための多くのアッセイが、当該技術分野において公知である。本発明の目的のために、それぞれ異なる用量のＴ細胞を与えられる哺乳動物の１群のうちのある哺乳動物への、ある特定の用量のかかるＴ細胞の投与の際、標的細胞が溶解される程度、又は、本発明のＴＣＲ若しくはその抗原結合部分を発現するＴ細胞によってＩＦＮ－γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが用いられ、哺乳動物に投与される開始用量が決定され得る。一定用量の投与の際の、標的細胞が溶解する程度、又はＩＦＮ－γが分泌される程度は、当該技術分野において公知の方法によりアッセイされ得る。

【0070】

本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団又は医薬組成物の用量はまた、本発明の特定のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団又は組成物の投与に伴い得る、任意の不都合な副作用の存在、性質及び程度によって決定される。典型的には、主治医は、年齢、体重、身体全体の健康、食事、性別、投与される本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団又は医薬組成物、投与経路、及び治療される状態の重症度等の種々の要因を考慮して、個々の患者のそれぞれを治療する、本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞の集団又は医薬組成物の投与量を決定する。

【0071】

本発明の細胞の集団が投与される態様においては、投与される注入当たりの細胞の数は、例えば、１００万～１０００億細胞の範囲で変動し得る；しかしながら、この例示的な範囲を下まわるか、又は上まわる量は、本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の１日用量は、約１００万～約１５００億細胞（例、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、約６００億細胞、約８００億細胞、約１０００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞、約１５００億細胞又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）、好ましくは約１０００万～約１３００億細胞（例、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）、より好ましくは約１億細胞～約１３００億細胞（例、約１億２０００万細胞、約２億５０００万細胞、約３億５０００万細胞、約４億５０００万細胞、約６億５０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞（又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）であり得る。

【0072】

細胞の集団が投与される、本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳動物に対して同種異系又は自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物に対して自己である。

【0073】

本発明の別の態様は、哺乳動物における状態の治療又は予防のための医薬を調製する方法であって、（ｉ）本発明の他の態様に関して本明細書に記載される方法のいずれかに従って、標的抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞の濃縮された集団を調製すること；又は（ｉｉ）本発明の他の態様に関して本明細書に記載される方法のいずれかに従って、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の単離された集団を調製することを含む、方法を提供する。

【0074】

本発明の一態様においては、状態はがんである。がんは、好都合には、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰のがん、胆管がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん（例、非小細胞肺がん）悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜、大網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん、膀胱がん、固形がん、液体がんのいずれかを含む、任意のがんである。好ましくは、がんは上皮がんである。一態様においては、がんは、胆管がん、黒色腫、結腸がん、肺がん、乳がん、又は直腸がんである。

【0075】

本発明の一態様においては、状態はウイルス状態である。本明細書の目的のために、「ウイルス状態」は、ヒトからヒトへ、又は生物から生物へ伝染し得、ウイルスによって引き起こされる状態を意味する。本発明の一態様においては、ウイルス状態は、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルス、及びカリシウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。例えば、ウイルス状態は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＨＰＶ、水痘ウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、及びアリーナウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされ得る。本発明の一態様においては、ウイルス状態は、本明細書に記載のウイルスのいずれかによって引き起こされる慢性ウイルス感染症であり得る。ウイルス状態は、例えば、インフルエンザ、肺炎、ヘルペス、肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性疲労症候群、突発性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、胃腸炎、腸炎、心臓炎、脳炎、細気管支炎、呼吸器乳頭腫症、髄膜炎、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＨＰＶ感染、及び単核球症であり得る。本発明の一実施形態においては、ウイルス状態は、がん関連ウイルスによって引き起こされるウイルス感染である。

【0076】

本発明の方法において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。用語「哺乳動物」は、本明細書で用いられる場合、マウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物、及びウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物が、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科の動物（イヌ）を含むネコ目由来であることが好ましい。好ましくは、哺乳動物は、ウシ科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科の動物（ウマ）を含むウマ目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）由来である。好ましくは、哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄｓ）目若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄｓ）目（サル）又は、類人（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）目（ヒト及び類人猿）である。より好ましい哺乳動物は、ヒトである。特に好ましい態様においては、哺乳動物は、標的抗原を発現する患者である。

【0077】

以下の実施例は、本発明を更に説明するが、当然、決してその範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【実施例】

【0078】

実施例
実施例１～１２に記載の実験においては、以下の材料及び方法を用いた。

【0079】

実験のセットアップ／試料の調製
１０×ゲノミクス５’単一細胞遺伝子発現プロファイリング及びＴＣＲ配列決定（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５’ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ ＴＣＲ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（１０×ｓｃＴＣＲ）／トランスクリプトーム解析のための試料を、一貫して以下の方法で調製した。単一細胞懸濁液をＴＩＬ採取物から作製し、凍結保存した。試料を解凍し、サイトカインを含まないＴＩＬ培地で一晩静置した。ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性の生細胞を、Ｓｏｎｙセルソーター（ＭＡ９００又はＳＨ８００）を用いて単離し、通常は全部で約３０，０００Ｔ細胞であった。試料を、１０×ｓｃＴＣＲ解析のためにＳｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＮＩＨ（ＳＣＡＦ）に提供した。ＳＣＡＦはバーコード化した遺伝子発現／ＴＣＲ原データを提供した。転写産物の原データを正規化した。クラスター深度の適切なレベルを決定するために、正規化したデータに対して品質管理（ＱＣ）手順を実施した。トランスクリプトームデータに対してＴ－ＳＮＥを実施した。ＴＣＲを、トランスクリプトームのｔ－ＳＮＥマップに投影した。

【0080】

ＣＩＴＥ－ｓｅｑ解析のために、凍結保存したＴＩＬを解凍し、サイトカインを含まないＴＩＬ培地中で静置した。翌日、Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて死細胞をＴＩＬから除去し、ＥＡＳＹＳＥＰ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いてＴ細胞を更に精製した。次に、Ｔ細胞を、蛍光色素標識抗ＣＤ３抗体並びに抗ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１０７ａ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、ＣＤ６９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２４４、ＣＤ２７２、ＣＤ３５７、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＣＤ２２３、ＣＤ３６６、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１８５及びＣＤ２７８を含むがこれらに限定されないフィーチャーバーコーディング（ｆｅａｔｕｒｅ－ｂａｒｃｏｄｉｎｇ）（ＦＢＣ）抗体で染色した。Ｓｏｎｙセルソーター（ＭＡ９００又はＳＨ８００）を用いてＣＤ３^＋細胞を単離し、約５０，０００のＴ細胞を１０×単一細胞ライブラリーの作製及びディープシーケンシングのためにＳＣＡＦに提供した。配列の原データを１０×Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒにより処理し、トランスクリプトーム、ＦＢＣ、及びＴＣＲ ＶＤＪのデータを１０×Ｌｏｕｐｅアプリケーション及びＰＡＲＴＥＫ ＦＬＯＷソフトウェアによりマージ及び分析した。

【0081】

実施例１
本実施例は、単一細胞トランスクリプトーム解析を用いて、ヒト直腸がんからネオ抗原反応性ＴＣＲを単離する方法を実例で示す。

【0082】

初めて、（変異抗原及びＴＣＲ配列の両方について分子的に定義された）自己ネオ抗原特異的Ｔ細胞を用いて、ネオ抗原反応性を有するＴ細胞のマーカーを検索した。これが、結腸がん及び肺がん等の一般的な上皮がん由来のＴＩＬを用いて行われたことは特に注目に値する。これは、トランスクリプトームアプローチ及びバーコード抗体技術（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）の両方により実施した。新鮮な腫瘍標本の酵素消化によって、単細胞懸濁液を作製した。肝臓転移がんを、直腸がん患者（患者４３２３）から採取した。この患者に関しては、以前に記載されたＴＩＬをスクリーニングするための技術（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ．，９（８）：１０２２－１０３５（２０１９））を用いて、４のネオ抗原反応性ＣＤ８^＋ＴＣＲが以前に同定された。これは合計で腫瘍内のすべてのＴＩＬの６．６％になる。フローサイトメトリーを用いて、腫瘍消化物からＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を単離した。１０ｘ ｓｃＴＣＲはＳＣＡＦで実施した。トランスクリプトームデータに対してＴ－ＳＮＥ実施した。ＴＣＲを、トランスクリプトームｔ－ＳＮＥマップに投影した。結果を図１Ａ～１Ｃに示す。

【0083】

図１Ａは、患者４３２３由来のＴ細胞のｔ－ＳＮＥ分析の結果を示す。図１Ａに示すように、得られた単一細胞トランスクリプトームデータのｔＳＮＥ表現型クラスタリングにより、分取したＴＩＬ内に７の異なる表現型クラスターが存在することが示された。（図１Ａ；０～７の番号が付けられたクラスター）。

【0084】

既知のネオ抗原反応性ＴＣＲを、図１Ａのｔ－ＳＮＥマップ上に投影した。結果を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、既知のネオ抗原反応性ＴＣＲをｔＳＮＥプロットに重ねると、ほぼすべての反応性ＴＣＲが単一のクラスター、即ちクラスター５に局在した。クラスター５は、ネオ抗原反応性ＴＣＲ（ＮｅｏＴＣＲ）クラスターと称された。

【0085】

このＮｅｏＴＣＲクラスターは、ＣＤ３９（ＥＮＴＰＤ１）、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ６９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２）、ＣＴＬＡ４、及びそれらの組み合わせを含む複数の活性化／阻害マーカーの存在によって示されるように、機能不全のＣＤ８^＋細胞表現型を表した。（図１Ｃ）。

【0086】

従って、このＮｅｏＴＣＲクラスター中の他の未試験のＴＣＲもネオ抗原反応性である可能性があるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、単一細胞ＴＣＲ配列決定データを用いて、ＮｅｏＴＣＲクラスター中の他の９のＴＣＲを、インシリコで前向きに再構築した。クラスター５内で、１９５の細胞が、既知のネオ抗原反応性ＴＣＲを発現しているか、又はインシリコで再構築できるＴＣＲを有していたかのいずれかだった。

【0087】

ＴＣＲをｐＭＳＧＶ１ベクターにクローニングし、健康なドナーＰＢＬ中で発現させ、（ｉ）該患者のネオ抗原をコードするＴＭＧとエレクトロポレーションしたか、又は（ｉｉ）該患者のネオ抗原コードするペプチドのプールでパルスした、患者４３２３の樹状細胞（ＤＣ）に対する反応性についてスクリーニングした。９の新規な未知のＴＣＲのうち７（７７．７７％）が、このスクリーニングにおいてネオ抗原反応性であった。

【0088】

全体で、クラスター５中の細胞の９７％がネオ抗原反応性であった（図２Ａ）。一部のＴＣＲは、配列決定によって１回しか確認されていないほど希少なものであった。対照的に、（この患者についてのネオ抗原反応性ＴＣＲを同定する本研究及び以前の試みから）非反応性クローンは、８のクラスターすべてで特定された（図２Ｂ）。

【0089】

実施例２
本実施例は、ネオ抗原反応性が、複数の活性化マーカーについて陽性の細胞集団内で濃縮されることを実証する。

【0090】

実施例１において患者４３２３から採取したＴＩＬを凍結保存した。細胞を解凍し、サイトカインなしで一晩静置した。生ＣＤ３細胞を、単一細胞ポリメラーゼ連鎖反応（ｓｃＰＣＲ）及びＰＤ－１（１９６ウェルプレート）、ＣＤ３９（１９６ウェルプレート）、ＴＩＧＩＴ（０．５プレート）、又はＬＡＧ３（０．５プレート）発現によるＴＣＲ再構築のためにプレートに分取した。マーカーの発現について正である分取した細胞のパーセンテージは次の通りであった：ＰＤ－１（６３．５％）、ＣＤ３９（２７．０％）、ＴＩＧＩＴ（３１．１％）、及びＬＡＧ３（０．７４％）。分取した細胞を、ＩＭＭＵＮＯＳＥＱアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって配列決定した。１２のネオ抗原反応性ＴＣＲはすべて、異なる集団間の頻度について分析できた。

【0091】

ＦＡＣＳ分取集団のアダプティブ配列決定（ａｄａｐｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の後ろ向き解析を実施した。表１は、各集団内のネオ抗原反応性ＴＣＲのパーセンテージを示す。後ろ向き解析により、複数の活性化マーカーについて、正の細胞集団内の、ネオ抗原反応性の濃縮が示された。

【0092】

【表1】

【0093】

実施例３
本実施例は、単一細胞トランスクリプトーム解析を用いて、ヒト結腸がんからネオ抗原反応性ＴＣＲを単離する方法を実例で示す。

【0094】

結腸がん患者（患者４３２４）から摘出されている肺転移がんから分取したＴＩＬに対して、単一細胞トランスクリプトーム解析及びＴＣＲ配列決定を実施した。結果を図３Ａ～３Ｃに示す。この患者については、以前に３のネオ抗原反応性ＣＤ８^＋ＴＣＲが同定されていた。これは合計で腫瘍内のすべてのＴＩＬの０．９８％になる。これら３のＴＣＲは、変異したＴＰ５３を認識した。

【0095】

患者４３２４由来のＴＩＬについては、すべての既知のネオ抗原反応性ＣＤ８^＋ＴＣＲが単一の表現型クラスター（即ち、クラスター６）内に濃縮されただけでなく（図３Ｂ）、該クラスターには試料４３２３において観察されたＮｅｏＴＣＲクラスターと多数のマーカー（即ち、表２に列記したＣＤ８^＋マーカー）も共有されていた。（図３Ｃ）。更に、ＮｅｏＴＣＲクラスターと同様の表現型を有するＣＤ４^＋ＴＩＬを含有する更なるクラスター（クラスター４）があった。

【0096】

４３２４のＮｅｏＴＣＲクラスター由来の４のＴＣＲの再構築により、変異ＴＰ５３に対する反応性を有するものがもたらされた。４のＴＣＲをＣＤ８^＋ＣＸＣＬ１３^＋クラスターから再構築し、変異体ＴＰ５３（変異をコードするアミノ酸を含有するロングペプチド及びタンデムミニ遺伝子）に対して試験した。１のＴＣＲ（つまり、ＴＣＲ番号５）が陽性であった。

【0097】

ＣＤ８^＋細胞由来のＴＣＲががん反応性であるか否かを予測するために、４３２３及び４３２４由来のＣＤ８^＋ＮｅｏＴＣＲクラスターに共通のマーカーを、単一細胞トランスクリプトームデータに適用できるＣＤ８^＋ＮｅｏＴＣＲシグネチャに編集する。ＣＤ４^＋ＮｅｏＴＣＲシグネチャで同様に試験する。

【0098】

１０の新規ＴＣＲを、ＣＤ８^＋クラスターから前向きに構築した。１５の新規ＴＣＲを、ＣＤ４^＋クラスターから前向きに構築した。これらがネオ抗原反応性であるか否かを試験することが目的である。

【0099】

実施例４
本実施例は、乳がん由来の既知のＣＤ４^＋ネオ抗原反応性ＴＩＬが、ＣＸＣＬ１３発現によって特徴付けられる表現型クラスターに自己集合することを実証する。

【0100】

ネオ抗原反応性ＴＣＲシグネチャがＣＤ４^＋ＴＩＬに当てはまるか否かを試験するために、６のＣＤ４^＋ネオ抗原反応性ＴＣＲが公知である乳がん転移試料（患者４３２２）由来のＴＩＬに対して単一細胞トランスクリプトーム配列決定及びＴＣＲ配列決定を実施した。結果を図４Ａ～４Ｃに示す。この試料においては、全ＴＩＬの２．４％が反応性であることが公知であった（図４Ａ）。

【0101】

公知のＣＤ４^＋ＮｅｏＡｇ反応性ＴＣＲを発現する細胞は、すべてある特定のクラスター（即ち、クラスター３）（図４Ｂの四角で囲まれた領域）において見出され、ＣＸＣＬ１３を含む、４３２３及び４３２４におけるＮｅｏＴＣＲクラスターと同様のマーカー（即ち、表２に列記したＣＤ４^＋マーカー）を発現した（図４Ｃ）。

【0102】

実施例５
本実施例は、肺がん由来のＣＤ８^＋ネオ抗原反応性ＴＩＬが、直腸がん由来のものと共クラスター化することを実証する。

【0103】

ＴＩＬスクリーニングが反応性ＴＣＲを示す、２の外科的に切除された非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）腫瘍から単離したＴＩＬに対して、以前に、単一細胞トランスクリプトーム／ＴＣＲ配列決定が実施されている（４２３４及び４２３７、図５Ａ）。

【0104】

これらのＮＳＣＬＣ試料を用いた４３２３ＣＤ８^＋クラスターの再クラスター化により、３試料からの反応性細胞がすべて同一クラスター中で濃縮されることが示された（図５Ｂ）。

【0105】

このＮｅｏＴＣＲ含有クラスターは、以前の試料において見られた、ＮｅｏＴＣＲと同一の活性化／枯渇／チェックポイントマーカーについて正であり（図５Ｃ）、このことにより、ＣＤ８^＋ＮｅｏＴＣＲシグネチャが、胃腸腫瘍内のＴＩＬに限定されず、より広く、浸潤性肺がんのＴＩＬに同様に適用できることが示された。

【0106】

実施例６
本実施例は、結腸がん由来の公知のＣＤ４^＋ネオ抗原反応性ＴＩＬが、ＣＸＣＬ１３発現によって特徴付けられる表現型クラスターに自己集合することを実証する。

【0107】

４のＣＤ４^＋ネオ抗原反応性ＴＣＲが公知である結腸がん（患者４２８３）の肺転移由来のＴＩＬに対して、単一細胞トランスクリプトーム配列決定及びＴＣＲ配列決定を実施した。１０×配列決定により、４細胞のうちの３が捕捉された（細胞は合計６のみ）。結果を図７Ａ～７Ｃに示す。

【0108】

公知のＣＤ４^＋ＮｅｏＡｇ反応性ＴＣＲを発現する細胞は、すべてＣＸＣＬ１３を発現するある特定のクラスター（即ち、クラスター２）中に見出された（図７Ｂ）。

【0109】

実施例７
本実施例は、表２に示されるマーカーを用いて、腫瘍消化物から高い信頼度で腫瘍変異反応性Ｔ細胞を同定できることを実証する。

【0110】

４３２３のＮｅｏＴＣＲクラスターにおいて高度に発現する遺伝子を用いて、「ＮｅｏＴＣＲシグネチャ」と称されるネオ抗原反応性ＴＣＲについてのトランスクリプトーム遺伝子発現プロファイルを開発した。４３２３由来のＴＩＬにこのシグネチャを単一細胞レベルで適用すると、公知のネオ抗原反応性Ｔ細胞と他の細胞を明確に区別することができた（Ｐ＜２ｘ１０^－１６、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）（図６）。従って、ＮｅｏＴＣＲシグネチャは、腫瘍由来の単一Ｔ細胞をスコア化するために、前向きに用いられ得る。高スコアのＮｅｏＴＣＲシグネチャに基づいて、ＴＣＲが合成され得、腫瘍反応性について試験され得る。

【0111】

Ｐｔ．４３２３に由来するＮｅｏＴＣＲシグネチャの第９５パーセンタイルを発現する細胞（図６）を他の患者の原型のｔＳＮＥプロット上で用いると、ＮｅｏＴＣＲシグネチャにより同一細胞クラスター及び同一細胞が高い信頼度で同定されることが示された（図３Ａ～３Ｃ－患者（Ｐｔ．）４３２４；図４Ａ～４Ｃ－Ｐｔ．４３２２；及び図５Ａ～５Ｃ－３の患者試料、即ち患者４３２３、４２３７、及び４２３４））。これらの結果を図８Ａ～８Ｃにまとめる（８Ａ－患者４３２４、８Ｂ－患者４３２２、並びに８Ｃ－患者４３２３、４２３７、及び４２３４）。

【0112】

【表2-1】

【0113】

【表2-2】

【0114】

従って、表２に示すＮｅｏＴＣＲシグネチャに列記したマーカーを用いて、腫瘍消化物から、高い信頼度で腫瘍変異反応性Ｔ細胞を同定できる。表２の第１列には、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ネオ抗原反応性細胞に共通するマーカーを列記する。表２の第２列には、ＣＤ４^＋ネオ抗原反応性細胞に共通するマーカーを列記する。表２の第３列には、ＣＤ８^＋ネオ抗原反応性細胞に共通するマーカーを列記する。表２において「（－）」が前に付いているマーカーは、ネオ抗原反応性と負の関連がある。表２において「（－）」が前に付いていないマーカーは、ネオ抗原反応性と正の関連がある。

【0115】

実施例８
本実施例は、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ（配列決定によるトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化）及び抗体を用いて、ヒト直腸がんからネオ抗原反応性ＴＣＲを単離する方法を実例で示す。

【0116】

ＣＩＴＥ－ｓｅｑは、抗体ベースの細胞表面分子検出並びにＴＣＲ遺伝子及びトランスクリプトーム解析を提供する単一細胞解析法である。ＣＩＴＥ－ｓｅｑを用いることにより、トランスクリプトーム単独の解析に比べて、より高感度且つ定量的な細胞表面分子発現データを得ることが可能である。例えば、ＣＩＴＥ－ｓｅｑアプローチは、腫瘍試料のＲＮＡの質が損なわれている場合に有用であり得る。

【0117】

ＣＩＴＥ－ｓｅｑ解析を、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）標本に由来する３の単細胞懸濁液に対して実施した。最初に、ＣＩＴＥ－ｓｅｑベースのｔＳＮＥとトランスクリプトームベースのｔＳＮＥによって得られたネオ抗原反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞のクラスタリングを比較した（図９）。図９に示す通り、大抵の場合、抗体ベースのｔＳＮＥプロットにより、ネオ抗原反応性Ｔ細胞のより良好なクラスタリングが得られた。

【0118】

次に、どの分子がネオ抗原反応性Ｔ細胞において特異的に発現するのかを調べた。結果を表３～８及び図１０に示す。

【0119】

【表3】

【0120】

【表4】

【0121】

【表5】

【0122】

【表6】

【0123】

【表7】

【0124】

【表8】

【0125】

これらの解析により、ネオ抗原反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ７４、ＣＤ１０３、ＣＤ１０６、ＣＤ１３７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３、及びＴＩＧＩＴ等の細胞表面分子のうちの１以上を発現することが示された。他の非ネオ抗原反応性ＣＤ８細胞と比較して、それらのＣＣＲ７、ＣＤ８Ａ、ＣＤ１６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、及びＩＬ７Ｒの細胞表面分子発現が低いことも特徴であった（図１１）。細胞内分子に関しては、実施例７に記載のＮｅｏＴＣＲシグネチャに含まれる遺伝子に加えて、ＡＦＡＰ１ＩＬ２、ＡＳＢ２、ＨＭＯＸ１、及びＰＤＬＩＭ４等の遺伝子が、ネオ抗原反応性細胞上で発現した。

【0126】

このｎｅｏＴＣＲシグネチャが、変異反応性である、これまで未知のＴＩＬ及びＴＣＲを同定できるという仮説を試験するために、ｎｅｏＴＣＲで定義されたクラスター内の高頻度クロノタイプを選択し、それらのＴＣＲ遺伝子を合成した。これらの遺伝子を、レトロウイルス形質導入によってＰＢＬに導入し、その後、自己腫瘍の次世代配列決定によって同定されているネオ抗原候補を提示する樹状細胞と共培養した（表９－１１）。

【0127】

【表9】

【0128】

患者４２３４については、調査したこれまで未知の５のＴＣＲクロノタイプのうち、４がネオ抗原反応性であった。驚くべきことに、それらはすべてＣＤ３^＋細胞中に１％未満しか存在せず、ＰＮＰＬＡ６の反応性はいかなる従来のＴＩＬスクリーニング法でも確認されていなかった。

【0129】

【表10】

【0130】

患者４２３７については、ＴＣＲのＦ１２及びＦ９が従来のＴＩＬスクリーニング法によって同定されたが、クラスター中で１番目及び４番目に順位付けされる高頻度クロノタイプである。ｎｅｏＴＣＲクラスタリングによって選択した他の未定義の５のＴＣＲクロノタイプのうちの３も、ＢＰＮＴ１ネオ抗原認識することを証明した。合計すると、ｎｅｏＴＣＲクラスターに存在する最も頻度の高い６のＴＣＲクロノタイプのうち５が、変異ＢＰＮＴ１に特異的に反応性であった。

【0131】

【表11】

【0132】

患者４３６９については、従来のＴＩＬスクリーニングによって最高頻度のクロノタイプが同定された。頻度によって選択した５の更なる未知のクロノタイプのうち、２が変異ＭＬＬＴ４に反応性であった。これら２の新規なＭＬＬＴ４反応性クロノタイプは、ＴＣＲ配列決定による総ＴＩＬ集団の０．１％未満で存在した。これにより、ネオ抗原反応性Ｔ細胞の選択における本方法の潜在力が示される。このクラスター内の他の高頻度クロノタイプが、抗原のがん生殖系列ファミリー等、まだ同定されていない他の腫瘍関連抗原を認識する可能性があり得る。

【0133】

実施例９
本実施例は、ＰＤ－１^＋／ＣＤ３９^＋／ＴＩＧＩＴ^＋細胞についての選別がネオ抗原反応性ＣＤ８^＋細胞を高度に濃縮できることを実証する。

【0134】

２プレートの患者４３２３由来の細胞を、ＦＡＣＳを用いてＣＤ８、ＰＤ－１、ＣＤ３９、及びＴＩＧＩＴの発現について選別した。細胞を生ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋を使ってゲートした。１４０の判読可能なＴＣＲベータ鎖配列のうち、１２３がネオ抗原反応性ＴＣＲであることが知られていた（８８％）（表１２）。

【0135】

【表12】

【0136】

実施例１０
本実施例は、ＣＸＣＬ１３^＋捕捉が、ＰＤ－１^＋／ＣＤ３９^＋／ＴＩＧＩＴ^＋と同様の、患者４３２３由来の公知のネオ抗原反応性ＣＤ８^＋細胞の濃縮をもたらすことを実証する。

【0137】

既製のＣＸＣＬ１３捕捉試薬は入手できなかったが、ＣＸＣＬ１３は、特異的な刺激／活性化なしでＥＬＩＳＡによってインビトロで検出可能であると報告されている。ビオチン化抗ＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体は、既製のＣＤ４５－ストレプトアビジンコンジュゲートに結合した。４３２３の腫瘍消化物を解凍し、ＣＤ４５－ストレプトアビジン：ＣＸＣＬ１３ビオチン自家製捕捉抗体と共に一晩又は４時間インキュベーションした。次いで、試料を洗浄し、ヤギＩｇＧ又は抗ＣＸＣＬ１３ヤギ二次抗体のいずれか、及び抗ヤギＩｇＧＰＥ結合検出抗体とインキュベーションした。試料を、セルソーター（Ｓｏｎｙ ＭＡ９００）でランした。ＣＤ８^＋ＣＸＣＬ１３^＋細胞（３３）をｓｃＰＣＲ ＴＣＲ配列決定のために分取した。分取した３３の細胞のうち、２８の判読可能なＣＤＲ３ベータ配列が同定された。２８の判読可能なＴＣＲベータ鎖配列のうち、８５．７％がネオ抗原反応性ＴＣＲであることが公知であった（表１３）。ＣＸＣＬ１３の発現に基づく分取により、ネオ抗原反応性ＣＤ４^＋細胞についての理想的な表面マーカーのセットがないという問題が回避され得る。

【0138】

【表13】

【0139】

実施例１１
本実施例は、ＣＸＣＬ１３発現アッセイがネオ抗原反応性を示す共発現マーカーを同定できることを実証する。

【0140】

患者４３９７は、転移性肛門がんＴＩＬ採取を受けた。腫瘍消化を行った。細胞を直ちにＣＤ４５：ＣＸＣＬ１３二重特異性抗体で一晩染色した。細胞を、ＣＸＣＬ１３並びにＰＤ－１、ＣＤ３９、及びＴＩＧＩＴについて染色し、生ＣＤ３^＋を使ってゲートした。ＣＤ４^＋ＣＸＣＬ１３^＋細胞は、ＣＤ３９^＋／ＴＩＧＩＴ^＋／ＰＤ－１^－細胞において頻度が最も高かった（表１４）。ＣＤ８^＋ＣＸＣＬ１３^＋は、ＣＤ３９^＋／ＴＩＧＩＴ^＋／ＰＤ－１^＋細胞において頻度が最も高かった（表１４）。

【0141】

【表14】

【0142】

実施例１２
本実施例は、単一細胞解析を用いる、腫瘍からの迅速なネオ抗原ＴＣＲ単離のためのワークフローを実例で示す。

【0143】

実施例１～１１に示すように、一般的な上皮がん（結腸直腸及び肺）由来のクローン的に定義されたＴ細胞を用いて、腫瘍関連変異抗原（ネオ抗原）を特異的に認識するＴ細胞のシグネチャを同定した。これは、単一細胞トランスクリプトームベースのアプローチ及びバーコード化された抗体を用いることの両方により行い（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）、多次元（ｔＳＮＥ）プロット上の狭く定義された空間内に、かかる細胞をクラスター化できた。

【0144】

このｎｅｏＴＣＲシグネチャを用いて、この、公知のネオ抗原反応性Ｔ細胞と共クラスター化した、同一表現型を有する他の細胞を調査し、やはり同一腫瘍由来のネオ抗原を認識する、これまで未知のＴ細胞クローンが非常に高頻度で含有されることを見出した。

【0145】

この技術により、既知のネオ抗原を認識するＴ細胞のレパートリーが拡大されただけでなく、他の従来のスクリーニング方法によって免疫原性として同定されない新規なネオ抗原に対して特異性を有するＴ細胞を同定することもできた。

【0146】

本アプローチの高い感度及び特異性、並びにそれが新鮮な腫瘍標本のＴＩＬから直接実施されるという特徴によって、それは、変異反応性Ｔ細胞を発見する従来の方法とは区別される。

【0147】

反応性ＴＣＲの配列を迅速に決定する能力は、治療のためにこの情報をＴＣＲ改変Ｔ細胞集団に変換する際にも非常に価値がある。実施例１～１１において概説した数人の患者から得られたデータを用いて、腫瘍の組織像に関係しない、ヒト腫瘍からの迅速なＴＣＲ単離のためにワークフローを設計した。このワークフローを図１２に概説する。

【0148】

実施例１３
本実施例は、新鮮な腫瘍の切除からのＨＰＶ１６反応性ＴＣＲの前向き単離を実例で示す。

【0149】

患者４３９７（肛門がん）由来のＴ細胞を、ＰＤ－１、ＣＤ３９、及びＴＩＧＩＴ共発現によって分取し、ＴＣＲ配列決定に供した。切除した腫瘍標本がＨＰＶ１６ Ｅ４の発現を示したため、この集団内で見られる上位１１のＴＣＲを患者のネオ抗原及びＨＰＶ１６抗原に対して試験した。表１５は、ＣＤ３９^＋ＰＤ１^＋ＴＩＧＩＴ^＋での分取集団内の上位１１のＴＣＲをまとめたもので、ＴＣＲ１が強調表示されている。表１５の数字は、集団全体内及び濃縮された集団内のパーセンテージを指す。

【0150】

【表15】

【0151】

ＨＰＶ１６由来ペプチドに対する、表１５の１１ＴＣＲのそれぞれのスクリーニングにより、ＴＣＲ ＩＤ１（ＴＣＲ１）によるＨＰＶ１６ Ｅ４に対する反応性が示された（図１３）。ＴＣＲ１の更なる試験により、ＨＬＡ－Ｂ^＊１３：０２によって提示されるＣＤ８拘束性ＨＰＶ１６ Ｅ４最小エピトープＬＱＳＳＬＨＬＴＡ（配列番号１）に対する反応性が示された。

【0152】

実施例１４
本実施例は、単一細胞トランスクリプトーム解析を用いてヒトがんからネオ抗原反応性ＴＣＲを単離する方法を実例で示す。

【0153】

ネオ抗原反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための遺伝子発現プロファイルを、以下のように更に改良した。実施例１に記載の通り、単一細胞トランスクリプトーム解析により、複数の腫瘍種類及び組織像にわたる、１３超の患者試料からの４５，０００超の腫瘍浸潤Ｔ細胞を分析した。遺伝子発現プロファイルを、これらの患者Ｔ細胞のすべてにおいて検証し、首尾よく整合性がとれた。一般的な遺伝子に加えて、ＣＤ４及びＣＤ８についてのネオ抗原反応性Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルを表１６に示す。

【0154】

【表16-1】

【0155】

【表16-2】

【0156】

【表16-3】

【0157】

ＮｅｏＴＣＲ遺伝子シグネチャを、盲検化した前向きの患者腫瘍試料における変異反応性Ｔ細胞の同定について更に評価した。単一細胞のトランスクリプトーム配列決定及びＮｅｏＴＣＲシグネチャの適用から再構築されたＴＣＲにより、新規のＣＤ４及びＣＤ８ ＮｅｏＴＣＲがもたらされた。全体として、本研究により、反応性が確認された１２／１２の患者の、配列決定されたＴＩＬにおいて、腫瘍特異的なＮｅｏＴＣＲの濃縮と検出が首尾よくもたらされた。ＮｅｏＴＣＲ遺伝子シグネチャは、関係性のないウイルス特異的Ｔ細胞とも異なるため、腫瘍と関係性のないＴ細胞を正確に識別できる。

【0158】

刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書に組込まれる。

【0159】

本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１」）は、本明細書に特記しないか又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項から選択された１の事項（Ａ若しくはＢ）又は列挙した事項のうち２以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「～を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書に個々に記述されているかのように本明細書に組込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。

【0160】

発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい態様が本明細書に記載される。これらの好ましい態様のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜用いることを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載の主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】