特表 2023-526159 ワクチンアジュバントとしてのハロゲン化キサンテン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-21

(54)【発明の名称】ワクチンアジュバントとしてのハロゲン化キサンテン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/39 20060101AFI20230614BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230614BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230614BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230614BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20230614BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20230614BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20230614BHJP

【ＦＩ】

A61K39/39

A61P37/04

A61P31/12

A61P31/04

A61P31/10

A61P33/00

A61P35/00

A61K39/02

A61K39/00 H

A61K31/352

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022558585

(86)(22)【出願日】2021-09-29

(85)【翻訳文提出日】2022-11-17

(86)【国際出願番号】 US2021052506

(87)【国際公開番号】W WO2022203718

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】17/212,723

(32)【優先日】2021-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510293969

【氏名又は名称】プロヴェクタス ファーマテック，インク．

(71)【出願人】

【識別番号】507132329

【氏名又は名称】ユーティーアイ リミテッド パートナーシップ

(74)【代理人】

【識別番号】100086368

【弁理士】

【氏名又は名称】萩原 誠

(72)【発明者】

【氏名】アル ナレンドラン

(72)【発明者】

【氏名】ドミニク ロドリゲス

(72)【発明者】

【氏名】エドワード ブイ． パーシング

(72)【発明者】

【氏名】ブルース ホロヴィッツ

【テーマコード（参考）】

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA01

4C085BB01

4C085CC07

4C085CC21

4C085DD86

4C085EE06

4C085FF12

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA08

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZB32

4C086ZB33

4C086ZB35

(57)【要約】

Ｉ型インターフェロン応答を誘導するのに有効な量の上述したハロゲン化キサンテンを投与することを備える、微生物感染症、がん性腫瘍、または悪性血液疾患を呈する対象哺乳動物におけるＩ型インターフェロン応答を誘導する方法。インビボのまたは哺乳動物細胞増殖支持性培地に存在する哺乳動物細胞を、アジュバント有効量のハロゲン化キサンテンおよび免疫原であってそれに対する応答が強化されるべきものと接触させることを備える、哺乳動物の免疫原特異的免疫応答を強化する方法。ワクチン有効量で存在する免疫原を、アジュバント有効量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物およびワクチン組成物の約０．００１重量％～１０重量％で存在する１つ以上の添加剤と共に、薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散して含有する、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物であって、薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散してワクチン有効量で存在する免疫原を、アジュバント有効量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸ化合物のアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸ化合物のアミド、前記ＨＸ化合物のＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸ化合物の芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体と、前記ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物の約０．００１重量％～約１０重量％と共に含有する、ワクチン組成物。

【請求項2】

前記芳香族誘導体は、ベンジルアルコールまたはベンジルアミン、フェニルアルコールまたはフェニルアミン、ピリジルアルコールまたはピリジルアミン、チエニルアルコールまたはチエニルアミン、フリルアルコールまたはフリルアミン、オキサゾリルアルコールまたはオキサゾリルアミン、チアゾリルアルコールまたはチアゾリルアミン、ナフチルアルコールまたはナフチルアミン、キノリルアルコールまたはキノリルアミン、キノキサリニルアルコールまたはキノキサリニルアミン、ベンゾフラニルアルコールまたはベンゾフラニルアミン、ベンゾ［ｂ］チエニルアルコールまたはベンゾ［ｂ］チエニルアミン、およびベンゾオキサジニルアルコールまたはベンゾオキサジニルアミンのうち１つ以上からなる群から選択されたアルコールまたは一置換アミンから形成されるエステルまたはアミドである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項3】

前記ワクチンは抗微生物ワクチンである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項4】

前記免疫原は、ａ）殺傷された微生物と、ｂ）生弱毒化微生物と、ｃ）１つ以上の免疫原性微生物タンパク質性配列と、ｄ）微生物サブユニット、組換え構造、多糖、または共役と、ｅ）トキソイドおよびウイルスベクターとからなる群から選択される、請求項３に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項5】

前記ワクチンは抗がんワクチンである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項6】

前記免疫原は、ａ）腫瘍アブレーション量のＨＣ化合物の投与により生じる免疫抗がん成分を含有する末梢血液、腫瘍組織、またはリンパ組織もしくはリンパ節組織のアリコート、またはｂ）このサブパラグラフａ）の前記アリコートをインビトロで培養して優先的に拡張することにより調製された濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物である、請求項５に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項7】

前記ＨＸはローズベンガル二ナトリウムである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項8】

前記免疫原および前記ＨＸ化合物の量は、前記ＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物が調製されるときに、所定量の薬学的に許容される希釈剤に溶解または分散し次第、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチンを提供するべく、ワクチン有効量の前記免疫原およびアジュバント有効量の前記ＨＸ化合物をそれぞれ提供するべく予め定められている、容器内に存在する請求項１のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物の濃縮プレワクチン組成物。

【請求項9】

前記免疫原および前記ＨＸ化合物はいずれも乾燥している、請求項８に記載の容器。

【請求項10】

前記ＨＸ化合物はローズベンガル二ナトリウムである、請求項８に記載の容器。

【請求項11】

薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散したワクチン有効量の所定の免疫原と約０．００１重量％～約１０重量％の１つ以上の添加剤とを含有する改良されたワクチン組成物であって、前記改良は、前記免疫原と共に前記薬学的に許容される希釈剤中にやはり溶解または分散した、アジュバント有効量の上述のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物を含む、改良されたワクチン組成物。

【請求項12】

前記ＨＸ化合物はローズベンガル二ナトリウムである、請求項１１に記載の改良されたワクチン組成物。

【請求項13】

微生物感染症を呈する対象哺乳動物においてＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を誘導する方法であって、ＳＴＩＮＧ二量体化誘導量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸのアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸのアミド、前記ＨＸのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸの芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体を投与することを備える、方法。

【請求項14】

前記ＨＸはローズベンガル二ナトリウムである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記哺乳動物はヒトである、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｃ_１－Ｃ_４アルキルエステルはＣ_２エステルである、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記微生物感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、および単一細胞寄生虫感染症のうち１つ以上である、請求項１３に記載の方法。

【請求項18】

がん性腫瘍または悪性血液疾患を有する対象哺乳動物においてＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を誘導する方法であって、ＳＴＩＮＧ二量体化誘導量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸのアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸのアミド、前記ＨＸのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸの芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体を全身投与することを備える、方法。

【請求項19】

前記ＨＸ化合物はローズベンガル二ナトリウムである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記対象哺乳動物はヒトである、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記Ｃ_１－Ｃ_４アルキルエステルはＣ_２エステルである、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

哺乳動物の免疫原特異的免疫応答を強化する方法であって、インビボで存在する哺乳動物細胞を、アジュバント有効量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸのアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸのアミド、前記ＨＸのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸの芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体、および免疫原であってそれに対する免疫応答が強化されるべきものと接触させることを備える、方法。

【請求項23】

前記ハロゲン化キサンテンはローズベンガル二ナトリウムである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記免疫原はウイルスタンパク質性ペプチド配列である、請求項２２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年３月２６日提出の米国特許出願第６３／０００２３１号の優先権を主張した２０２１年３月２５日に提出された米国特許出願第１７／２１２７２３号の一部継続出願である。

【0002】

背景技術
ヒトの免疫系は、自然免疫系および適応免疫系という２つの構成要素からなる。自然免疫系は、生物の生殖細胞系列にコードされており、哺乳動物における防御の第一線を構成するものであって、シグナル伝達カスケードの開始を通じて病原体および異常細胞に応答する。シグナル伝達カスケードは転写因子の活性化に繋がり、これが、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラー細胞を含む複数の細胞型の関与によって、サイトカインおよびケモカインの産生を誘発する［非特許文献１］。

【0003】

続く適応免疫系は、獲得されるものであって、免疫原提示ＤＣによって媒介される抗原特異的Ｔ細胞およびＢ細胞応答を伴う。適応免疫系は、病原体および異常細胞を中和するＴ細胞受容体および抗体の作用を通じて、より長期の防御を宿主に提供するのに役立つ［非特許文献１および非特許文献２］。

【0004】

腫瘍学とウイルス学とは、哺乳動物、特にヒトの自然免疫系および適応免疫系において交差する、関係の薄い分野である。疾病の病因学と兆候とは概して別個のものであるが、この交差は、一方の分野における発見を他方の分野に応用するための共通の基礎を提供する。ここでは、両分野に適用可能な新規のアプローチを、各分野において独立してなされた新発見を融合することによって統合し、新たなワクチン用アジュバントを提供する。

【0005】

現在のワクチンの欠点
ワクチンの発見および調製における最近の進歩は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスおよびそれが引き起こす疾病であるコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）疾病との闘いに成功するべく、素晴らしいことに、記録的短期間で展開されることができている。最近分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株は、より強毒性のようであるが、依然として現在利用可能なワクチンで概ね予防可能である。

【0006】

米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）の非特許文献３によれば、ワクチン接種完了した２，８７５人に関して、デルタ株以前の３２９，８６５人日にわたり、調整されたワクチン有効性は９１パーセントであると計算され、１０人がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に罹患した。デルタ株流行の時期には、ワクチン接種完了した２，３５２人のうち１１９，２１８人日にわたり、調整されたワクチン有効性は６６パーセントと計算され、２４人がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に罹患した。上記の報告では、ワクチン起源は分離されなかった。

【0007】

デルタ株の流行前には、ワクチン接種完了した２，８７５人中１０人しかＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に罹患しなかったが、その有病率（約０．３パーセント）は、全米の人口（約３億３３００万人）がワクチン接種したならば、約９９９，０００件に換算されるであろう。上記の記事のデルタ株後の有病数から引用した数［（２４／２３５２）×３３３，０００，０００］を用いると、件数はおよそ３４０万となろう。

【0008】

Ｂ型肝炎のワクチン接種に関しては、ＣＤＣは、９０パーセントを超える個人で抗体が作られるであろうと推定している。［非特許文献４］ＣＤＣは、季節性インフルエンザ（インフルエンザＡ型）に対するワクチンは、２００４年～２００５年から２０１９年～２０２０年までのシーズンでは１０パーセント～６０パーセント有効であったと報告している。［非特許文献５、２０２１年８月２６日最終査読。］

【0009】

麻疹・おたふく風邪・風疹（ＭＭＲ）三種ワクチンの結果は同様である。ＣＤＣは、ＭＭＲワクチンの１回投与は、麻疹に対しては９３パーセント有効、おたふく風邪に対しては７８パーセント有効、風疹に対しては９７パーセント有効であることを報告している。ＭＭＲワクチンの２回投与は、麻疹に対しては９７パーセント有効、おたふく風邪に対しては８８パーセント有効であり、２回投与後の風疹については報告がない。［非特許文献６、２０２１年１月２６日最終査読。］

【0010】

このように、多くの最新のワクチンは人口のほとんどに有効であるが、いずれも、特定の病気に対してワクチン接種したことはあってもそれらのワクチンが有効でないいくらかの被接種者を取りこぼしていることがわかる。したがって、救命のための改良がワクチンに対して行われる必要がある。

【0011】

通常使用されるＢ型肝炎ワクチンは、アルミニウム含有アジュバントを含んでいる。ある米国食品医薬品局（ＦＤＡ）認可のＢ型肝炎ワクチンは、専売アジュバントを使用して効能を改良する。そのワクチンは、Ｈｅｐｌｉｓａｖ－Ｂ（登録商標）という商品名で販売されており、ＣｐＧ１０１８と呼ばれるアジュバントを含む。Ｃ_ＰＧ１０１８は、ＴＬＲ９を標的とする２２ｍｅｒホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドであるらしく、抗体濃度の増加を生じると言われており、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞集団および細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞集団を刺激して、強いＴ細胞記憶応答およびＢ細胞記憶応答を生成する。

【0012】

アジュバントは、ワクチン被接種者により強い免疫応答を生み出す助けとなる。米国ＦＤＡによって認可されたいくつかのアジュバントは、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩（ＡＡＨＳ）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）などのアルミニウム塩を含有している。かつてＡＳ０４として販売されていたが現在は米国内では使用されていないモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、およびＡＳ０１_Ｂと呼ばれる別のＭＰＬは、細菌の表面から分離される。ＡＳ０１_Ｂは、チリ産のシャボンノキ（キラヤ・サポナリア・モリナ）から抽出される天然化合物であるＱＳ－２１も含む。目下米国ＦＤＡ認可の最後のアジュバントは、スクアレンからなる水中油型乳剤であり、ＭＦ５９という名称である。［非特許文献７、２０２０年８月１４日最終査読。］

【0013】

ウイルス感染に対する炎症反応
蔓延する向性宿主細胞のウイルス感染は、感染した細胞からの炎症シグナル伝達成分（例えばサイトカイン、ケモカイン、および自然免疫応答に関係するダメージ関連分子パターン［ＤＡＭＰ］、ならびにＴ細胞および適応免疫応答の他の機能性成分）の放出によって重症の局所的または全身的な炎症反応を引き出し、感染症の局所症状または全身症状をもたらし得る。患者が適切な抗ウイルス応答をマウントすることができるようになるまでは、そのような疾病兆候を治療するアプローチ、例えば重症肺炎症反応の低減などが、抗ウイルス薬療法および／または適応免疫応答を通じて、極めて重要な疾病管理を提供し得る。

【0014】

向性細胞のウイルス感染もしくは感染した向性細胞におけるウイルスの機能的活性の予防を通じた、またはウイルス感染の際の制御されない炎症反応の調節を通じたウイルス疾患の管理にメリットがあり得るいくつかの薬剤があるものの、抗ウイルス薬剤の新たなオプションが明らかに必要とされている。

【0015】

インターフェロン
インターフェロン（ＩＦＮ）とは、ウイルス、感染性微生物、および腫瘍細胞に対する細胞防御の中心となるシグナル伝達タンパク質のクラス（すなわちサイトカイン）である。［非特許文献８。］例えば、ウイルスに感染した宿主細胞は、ＩＦＮを放出して、付近の細胞に抗ウイルス防御を高めるようにシグナルを伝達する。インターフェロンは、細胞をウイルス感染から防御することによってウイルス複製を「妨害する（interfere）」能力に因んで名付けられた。［非特許文献９。］

【0016】

直接的な抗ウイルス効果に加え、ＩＦＮは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の発現を増大させることによって免疫細胞（例えばナチュラルキラー細胞およびマクロファージ）を活性化すると共に抗原提示をアップレギュレーションするのに役立つ。ＩＦＮは３つのグループに分類される。
・Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮ－α，ＩＦＮ－β，ＩＦＮ－ε，ＩＦＮ－κ，およびＩＦＮ－ωからなるもので、ウイルスに応答して産生され、細胞受容体に結合すると、ウイルスＲＮＡおよびウイルスＤＮＡの複製を阻害する。Ｉ型ＩＦＮには、がんに応答する免疫シグナル伝達と類似の役割がある。
・ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ－γ）はインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）によって活性化され、細胞傷害性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞によって放出される。
・ＩＩＩ型ＩＦＮは、いくつかのタイプのウイルス感染症および真菌感染症への免疫応答に関係する。

【0017】

ＳＴＩＮＧ活性化および免疫活性化
小胞体（ＥＲ）に局在する膜貫通型タンパク質であるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、自然免疫の重要なレギュレーターであり、非特許文献１０によって最初に報告された。非特許文献１０の著者らが見出したことには、ＳＴＩＮＧはＩ型ＩＦＮ応答を誘導し、発現に対して強力な抗ウイルス状態を発揮するのに対して、ＳＴＩＮＧの喪失は細胞をウイルス感染に対して極めて感受性にする。

【0018】

より具体的には、ＳＴＩＮＧは通常、ｃＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）などの環状ジヌクレオチドに結合することによって活性化され、これはｃＧＡＭＰシンターゼがサイトゾルＤＮＡを認識するときに細胞内セカンドメッセンジャーとして産生される。ｃＧＡＭＰへの結合はＳＴＩＮＧを二量体化させると共にＥＲからゴルジへとトランスロケーションさせる。リロケーションの後、ＳＴＩＮＧはセリン／トレオニンキナーゼ、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）をリクルートし、インターフェロン調節因子３［ＩＲ３］のリン酸化と、ＩＦＮ－βおよびＣＸＣＬ１０を含むＩ型ＩＦＮおよびＩＦＮ刺激遺伝子のアップレギュレーションとをもたらす。［非特許文献１１。］

【0019】

非特許文献１２は、マウスにおけるＳＴＩＮＧ欠損は、Ｉ型ＩＦＮ応答がうまくいかないことによって、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）感染症への致死感受性を生じることを示した。

【0020】

細胞が細胞内病原体に感染すると、ＳＴＩＮＧはＩ型ＩＦＮ産生を誘導し、これは感染した細胞および付近の細胞を、Ｉ型ＩＦＮを分泌するのと同じ細胞に結合すること（すなわち自己分泌シグナル伝達）および付近の細胞に結合すること（すなわち傍分泌シグナル伝達）によって、局所感染から防御する。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）応答は、ウイルス感染に対する効率的な防御を提供することにとって極めて重要であり得る。

【0021】

ＩＦＮ－Ｉ産生は、宿主センサによる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、例えばウイルス核酸などの認識によって、急速に誘発される。ＩＦＮ－Ｉ誘導シグナル伝達は転写因子で収束し、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）と呼ばれる数百の遺伝子の発現を急速に誘発する［非特許文献１３において概説］。この抗ウイルスシグナル伝達カスケードは、ＩＦＮ－Ｉに曝露されるほとんど全ての細胞型において起こる。

【0022】

ＩＳＧは、（炎症誘発性サイトカインを含む）ＩＦＮ－Ｉによって制御される他の下流分子と共に、ウイルス複製の直接阻害から種々の免疫細胞のリクルートおよび活性化にまで及ぶ、多様な機能を有している。よって通常は、強く、タイミングが良く、局所化されたＩＦＮ－Ｉ応答がウイルス感染に対する防御の第一線として必要とされる。なぜならそれは、ウイルスクリアランスを増進し、組織修復を誘導し、ウイルスに対する長期適応免疫応答を誘発するからである。［非特許文献１４。］

【0023】

非特許文献１５は、ＳＴＩＮＧの二量体化がこの自然免疫系シグナル伝達に極めて重要であることを示した。非特許文献１６は、防御機能には（二量体化を介した）急性ＳＴＩＮＧ活性化が必要である一方で、慢性活性化は反産生的な炎症反応および自己免疫疾患をもたらし得ることを示した。

【0024】

場合によっては、ＳＴＩＮＧは、宿主細胞核や感染病原体から漏出したものなど、外来ＤＮＡおよび内因性ＤＮＡの細胞内センサとして作用する。そのような内因性ＤＮＡは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）またはエカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）など、自己炎症性疾患の原因となり得る。［非特許文献１７。］興味深いことに、抗ウイルス活性に関する上記の非特許文献１６に記載されているように、防御機能には（二量体化を介した）急性ＳＴＩＮＧ活性化が必要である一方で、慢性活性化は免疫ダウンレギュレーションをもたらし得るようである。

【0025】

上記の非特許文献１７は、レトロウイルスとＲＮＡウイルスの複製とに対する同様の活性に言及している。よって、ＳＴＩＮＧの発現および二量体化は、全ての主要なウイルスクラスの感染症に対して極めて重要な細胞防御の役割を果たす。

【0026】

抗ウイルスの役割に加え、上記の非特許文献１７には、細菌感染に対抗する同様の機能も記載されている。その検証において、非特許文献１７は、著者らの研究は、微生物によって利用され得るバランスである、適切な免疫応答と炎症との間の微妙な平衡状態に光を当てるものであることに言及している。非特許文献１７はさらに、そうした知見は、ＳＴＩＮＧを標的とするアジュバントの開発および強くて長持ちする適応免疫応答を誘導することを意図されたワクチンの設計において、重要な意味を持ち得ることに言及している。

【0027】

こうした観察は、ＳＴＩＮＧの急性活性化が抗微生物活性（すなわち抗ウイルス、抗菌、抗真菌、または抗寄生虫）にとって欠かせないであろうことを示すものである。

【0028】

最近の研究は、ＳＴＩＮＧホモ二量体が細胞質ポリヌクレオチド、特にウイルス関連の一本鎖および二本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ）分子と複合することを示している。そのような二量体型ＳＴＩＮＧ含有複合体は、Ｉ型ＩＦＮに加え、多種多様な自然免疫遺伝子および炎症誘発性遺伝子のＨＳＶ－１媒介転写活性化にとって不可欠であることがわかった。［非特許文献１８。］

【0029】

ある特定の細胞型におけるＳＴＩＮＧ活性化は、アポトーシスおよびネクローシスを含め、細胞死を誘発する。この効果は、不必要または過度な炎症性イベントを予防することおよび宿主免疫ホメオスタシスを維持することにとって極めて重要であろう。Ｉ型ＩＦＮおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生によって表される標準的な免疫応答の他に、ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、様々な細胞型における細胞死イベントも誘導し得る。

【0030】

現在のところ、いくつかのＳＴＩＮＧアゴニストが難治性悪性腫瘍を治療するために開発されている。例えば、非特許文献１９における結合アミドベンゾイミダゾール（ＡＢＺＩ）系化合物の使用を参照されたい。

【0031】

非特許文献２０は、転写因子であるＩＦＮ調節因子３（ＩＲＦ３）によってＩ型ＩＦＮ応答を活性化することのできる小分子ＳＴＩＮＧアゴニストの同定を報告した。Ｇ１０とも称され構造式が下記に示されているその小分子は、ヒト線維芽細胞におけるＩＲＦ３／ＩＦＮ関連転写を誘発した。

【0032】

【化1】

【0033】

この分子に対する細胞応答のさらなる試験は、複数のＩＲＦ３依存性抗ウイルスエフェクター遺伝子ならびにＩ型およびＩＩＩ型ＩＦＮサブタイプの発現を明らかにした。これは、チクングニアウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、およびシンドビスウイルスを含むエマージングｓｓＲＮＡアルファウイルス種の複製を予防する細胞状態の確立に繋がった。非特許文献２０の著者らが報告したことには、Ｇ１０分子はＳＴＩＮＧに直接的に結合はせず、ヒトＳＴＩＮＧ依存性表現型の間接的な活性化因子として作用した。

【0034】

非特許文献２１は、その構造が下記に示される合成小分子である５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）が、

【0035】

【化2】

【0036】

ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達経路を活性化してマウスマクロファージにおけるＩ型ＩＦＮ優位のサイトカイン応答を誘導し、これが細胞質ウイルスヌクレオカプシドの量を低減させることによって培養マウス肝細胞およびマウスの肝臓におけるＨＢＶ複製を効率よく抑制することを報告した。ＤＭＸＡＡは先にマウスＳＴＩＮＧのアゴニストとして同定されていた。ヒトＳＴＩＮＧはＤＭＸＡＡに結合することまたはＤＭＸＡＡに応答してシグナル伝達することができなかった。［非特許文献２２。］このカスケードにおけるＳＴＩＮＧの直接的な効果はＤＣに対するものと見られ、これは自然免疫系と適応免疫系との間の仲介役として役に立つ。

【0037】

ＳＴＩＮＧは、ＴＢＫ１／ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢ経路ならびにそれに続くＩＦＮおよびＴＮＦ産生による免疫応答の活性化因子として認識されている。ＳＴＩＮＧは、炎症誘発性サイトカインの誘導を通じた宿主防御、自己免疫疾患、および腫瘍免疫において極めて重要な役割を果たすことが示唆される。がん免疫療法のためのＳＴＩＮＧ経路標的化の適用も試験されている。［非特許文献２３。］

【0038】

非特許文献２４は、がん治療におけるＳＴＩＮＧの活性を検証した。同文献は、抗がん免疫応答にはＳＴＩＮＧの活性およびＩ型ＩＦＮ産生の刺激が極めて重要であることを多数の研究が示していると報告している。

【0039】

非特許文献２４は、ＳＴＩＮＧがＩ型ＩＦＮに依存しない手法でも抗がん免疫を調節することを新たなエビデンスが示唆していることに言及している。例えば、ＳＴＩＮＧは、細胞死を誘導すると共にがん細胞抗原の放出を促進することが示されている。また、ＳＴＩＮＧ活性化は、がん抗原提示を強化し、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化に寄与し、腫瘍へのＴ細胞の輸送および浸潤を促進し、Ｔ細胞によるがん細胞の認識および殺傷を増進することが実証されている。

【0040】

非特許文献２４の著者らは、Ｉ型ＩＦＮがインビボおよびインビトロのいずれでも腫瘍の制御に寄与することも、多くの研究が明らかにしたと報告している。これらの研究は、Ｉ型ＩＦＮが抗腫瘍応答において中心的な役割を果たすことを示唆するものである。しかしながら、最近の研究は、Ｉ型ＩＦＮが、抗がん免疫を損なったり、がんに関して予期せぬ治療の失敗さえ引き起こしたりもし得ることを示唆している。例えば、ＩＦＮ－βは腫瘍細胞におけるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）およびプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）の産生を誘導することが示されており、これはがん細胞による免疫逃避に寄与し得る。

【0041】

非特許文献１７は、ウイルス学のそれと大部分が対応する、ＳＴＩＮＧ依存性自然免疫シグナル伝達の役割を検討した。ＳＴＩＮＧ活性化はＩ型ＩＦＮの活性化をもたらし、これには適応免疫系に対するプライミング効果がある（ＤＣによる腫瘍抗原の交差提示を通じた腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化）。マウスにおけるＳＴＩＮＧの抑止は悪性黒色腫へのＴ細胞応答ならびに免疫チェックポイント阻害薬の活性を抑止するものであり、非特許文献１７は、ウイルス学で観察されるように、慢性ＳＴＩＮＧ活性化は腫瘍形成の増進において役割を果たし得ることに言及している。

【0042】

非特許文献１７は、「ＳＴＩＮＧに抗腫瘍免疫応答の促進における鍵となる役割があることが明らかになってきている。また、腫瘍微小環境内でＳＴＩＮＧ活性を刺激することは、悪性疾患の治療の助けとなる新しい免疫治療的戦略を含み得る。」と言及して結論とした。［非特許文献２５］

【0043】

非特許文献２６に記載されているように、免疫機能は幼児期に急速に増加し、高齢の始まりまで成人期にわたって一定のままである。非特許文献２６の著者らは、免疫系は、人が年齢を重ねるにつれ、全面的な再構築を経て減退することに言及している。この免疫老化は、高齢者に対して急性のウイルス感染症および細菌感染症のリスクを高める傾向がある。

【0044】

年齢によるＳＴＩＮＧの発現および活性化の変化についての直接的なデータはほとんどないようであるが、特に自然抗ウイルス免疫の仲介におけるＳＴＩＮＧの中心的な役割を考えると、高齢の始まりによる（すなわち６０歳以上）自然免疫の全体的な減退という同じパターンを辿ると思われる。非特許文献２６の著者らは、がんの罹病率と年齢との並行した増加（すなわち、先進国におけるおよそ７０歳という発症の中央年齢）に言及しており、これも年齢増加に伴うＳＴＩＮＧの発現および活性化の減退に起因するものであろう。

【0045】

また、感染性疾患および腫瘍学における急性ＳＴＩＮＧ活性の生産的な成果と慢性ＳＴＩＮＧ活性の反生産的な結果との一貫した観察は、感染性疾患および腫瘍学的兆候の両方の治療における急性ＳＴＩＮＧ活性の中心的な役割を示している。

【0046】

本発明は、抗微生物活性と抗がん活性との間の関連を、微生物感染およびがん性増殖の両方についてのワクチンベースの治療を改良するための新しいアジュバントとして説明するものであり、ローズベンガルなどのハロゲン化キサンテンを選ばれたワクチンに添加するアジュバントとして使用する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0047】

【特許文献1】米国出願第１７／２１４５９０号

【特許文献2】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／０２４４９９号

【特許文献3】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２７７０２号

【特許文献4】米国特許第７，６４８，６９５号明細書

【特許文献5】米国特許第８，５５７，２９８号明細書

【特許文献6】米国特許第９，１０７，８７７号明細書

【特許文献7】米国特許第１０，１３０，６５８号明細書

【特許文献8】米国特許第１１，０５８，６６４号明細書

【特許文献9】米国特許第８，５３０，６７５号明細書

【特許文献10】米国特許第９，２７３，０２２号明細書

【特許文献11】米国特許第９，４２２，２６０号明細書

【特許文献12】米国特許第９，１０７，８８７号明細書

【特許文献13】米国特許第９，８０８，５２４号明細書

【特許文献14】米国特許第９，８３９，６８８号明細書

【特許文献15】米国特許第８，９７４，３６３号明細書

【特許文献16】米国特許第７，３９０，６８８号明細書

【特許文献17】米国特許第５，９９８，５９７号明細書

【特許文献18】米国特許第６，３３１，２８６号明細書

【特許文献19】米国特許第６，４９３，５７０号明細書

【特許文献20】米国特許第１０，４７１，１４４号明細書

【特許文献21】国際公開第２０２０／０２８５３２号

【特許文献22】米国特許第６，９４２，８６６号明細書

【特許文献23】米国特許第８，０１７，１２７号明細書

【特許文献24】米国特許第４，５９９，２３１号明細書

【特許文献25】米国特許第５，１８０，８０６号明細書

【特許文献26】米国特許第６，２３１，８４６号明細書

【特許文献27】米国特許第４，５４４，５００号明細書

【特許文献28】米国特許第４，６２５，０１５号明細書

【非特許文献】

【0048】

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【非特許文献4】CDC, Viral Hepatitis - Hepatitis B FAQs for the Public - Is the Hepatitis B Series Effective? May 23, 2016

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【非特許文献46】Berge, J. Pharm. Sci. 1977 68(1):1-19

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【非特許文献55】academic.oup.com/jid/article/217/5/827/4705967

【発明の概要】

【0049】

本発明は、ヒトなどの哺乳動物に投与するワクチンの免疫原へのアジュバントとしてのハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物の医学的利用を企図するものである。企図されるハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物は、単独で、あるいはその薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換であるアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されているアミド、Ｃ_１－Ｃ_４アルキルエステル、またはその芳香族誘導体（アミドもしくはエステル）として、用いることができる。芳香族誘導体は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである。ローズベンガルが好適なＨＸ化合物であり、その二ナトリウム塩であるローズベンガル二ナトリウムが最も好適なＨＸ化合物である。

【0050】

本発明の一実施形態は、水または０．９％生理食塩水などの薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散したワクチン有効量で存在する免疫原を、アジュバント有効量の上述したハロゲン化キサンテンと共に含有する、ワクチン組成物を企図する。ハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物のアジュバント有効量とは、例えば、がん細胞を殺傷するために使用されるであろう細胞傷害性量よりは少ない量であるが、ＳＴＩＮＧ二量体化を引き起こすのに十分な量である。

【0051】

別の企図される一実施形態は、免疫原と上述のＨＸ化合物とを含有する濃縮プレワクチン組成物を保持する、バイアル、ボトル、もしくは他の適当な手段などの容器またはコンテナである。２つの成分の量は、ワクチンが調製されるときに、所定量の薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散次第ワクチンを提供するべく、ワクチン有効量の免疫原およびアジュバント有効量のＨＸ化合物をそれぞれ提供するように予め定められている。

【0052】

ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物および対応する濃縮プレワクチン組成物は、１つ以上の添加剤も含有し得る。例示的な添加剤には、緩衝塩、組成物に所望の容積モル浸透圧濃度または重量モル浸透圧濃度をもたらすための浸透物質、および１つ以上の追加のアジュバントが含まれる。例示的で好適な追加のアジュバントには、１つ以上の通常使用されるアルミニウム含有ワクチンアジュバント、ならびに典型的にはＴ細胞ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞といったＴ細胞の産生を刺激する助けとなるモノクローナル抗体である１つ以上の所謂「チェックポイント阻害薬」が含まれる。そのような添加剤は、ワクチン関連の調剤において慣習となっているように、ワクチン組成物の重量に基づいて、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物の約０．００１重量％～１０重量％、好適には０．１～１０重量％の量で存在し得る。添加剤については以降で詳細に述べる。

【0053】

本発明のさらなる一実施形態は、薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散したワクチン有効量の所定の免疫原を含有する、改良されたワクチン組成物であり、その改良は、免疫原と共にその薬学的に許容される希釈剤中にやはり溶解または分散した、アジュバント有効量の上述のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物を含む。

【0054】

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、その冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

【0055】

本明細書で引用した特許、特許出願、および論文の各々は、参照により組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0056】

本開示の一部を構成する図面は、下記の通りである。

【0057】

【図1A】ローズベンガル（ＲＢ）と３０分、１時間、２時間、４時間、および２４時間接触させたＴＨＰ－１急性単球性白血病（ＡＭＬ）細胞のウェスタンブロットの注釈付き写真であり、特定の抗体によって検出される新しい７０ｋＤａのＳＴＩＮＧ二量体バンド（点線のボックス）の出現がもたらされた。

【図1B】ＲＢと２時間、４時間、６時間、および８時間接触させたＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞のウェスタンブロットの注釈付き写真であり、特定の抗体によって検出される新しい７０ｋＤａのＳＴＩＮＧ二量体バンド（点線のボックス）の出現がもたらされた。ＳＴＩＮＧ二量体の存在を強調するために、図１Ｂは図１Ａよりも長いフィルム露光を利用した。

【図1C】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1D】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1E】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1F】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1G】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1H】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1I】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1J】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1K】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1L】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1M】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1N】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1O】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1P】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1Q】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図1R】ＲＢがＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞と接触する前、その６時間後、２４時間後、および４８時間後の、記載されたサイトカインおよびケモカインのアッセイ量のグラフを提供する。

【図2】投与されたローズベンガル濃度（モル濃度）の対数に対して固形腫瘍治療の評価時点までの対象におけるＨＸ化合物の持続時間の対数をプロットする、いくつかの異なる研究のデータの両対数プロットであり、２０２１年３月２６日に提出された特許文献１にも以前の形式で提示されている。「病巣内投与」は非特許文献２７に提示されているデータを表す。「Ｓｗｉｆｔ ２０１８，２０１９」は非特許文献２８および非特許文献２９に由来する。「経口 Ａｐｃ^Ｍｉｎ」は特許文献２において報告された研究からのデータである。「経口 白血病」は２０２１年４月１６日に提出された特許文献３において述べられているデータである。

【図3】記載された３つの量のローズベンガル（ＲＢ）の各々の存在下または非存在下において、等しい数のＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞の存在下で、記載される３つの免疫原性ペプチド（下記）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質（ＨＢＣ）のうち１つを発現するＤＣと共培養されたＣＤ８細胞の、酵素結合免疫スポットプレート（ＥＬＩｓｐｏｔ；Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）の写真複写を示す。 図３、図４、および図５において、「Ｎｏ Ｐｅｐ」は「ペプチドなし」を意味する。Ｐｅｐ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペプチド「ＡＴＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）」である。Ｐｅｐ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のペプチド「ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）」である。Ｐｅｐ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のペプチド「ＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（ＨＬＡ－Ｂ＊５１）」である。ＰＬＣ／ＰＲＦ５は、Ｂ型肝炎粒子を発現および分泌するヒト肝がん細胞株である。「ＰＶ－１０」は、０．９％生理食塩水中の殺菌した１０％ローズベンガル（ＲＢ）溶液であり、図３～５で使用される濃度５μＭ、１０μＭ、および２０μＭは、使用されるＰＶ－１０溶液から提供されるＲＢの濃度を意味する。

【図4】ＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞なしで培養されたＣＤ８細胞から計数されるＩＦＮガンマＥＬＩｓｐｏｔ画像の数を対照培養についての数と共に示す、一連の棒グラフである。

【図5】記載した量のＲＢと共に、しかしＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞の非存在下において、記載した３つのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）免疫原性ペプチドのうち１つを発現するＤＣと共培養されたＣＤ８細胞のＥＬＩｓｐｏｔの写真複写を示す。

【発明を実施するための形態】

【0058】

発明の詳細な説明
本発明は、被治療哺乳動物において哺乳動物の免疫原に特異的な免疫応答を強化するワクチンおよび方法を企図するものである。その方法は、インビトロの培養プレートまたはインビボの哺乳動物の体内など哺乳動物細胞増殖支持培地に存在する哺乳動物細胞を、アジュバント有効量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物、先に述べた薬学的に許容される塩、アミド、エステル、または芳香族誘導体、および免疫原であってそれに対する免疫応答が強化されるべきものと接触させることを広く備える。

【0059】

本発明は、より具体的には、哺乳動物用ワクチンにおいて、がん性腫瘍または微生物感染症の治療時に注入によって非経口的に投与されるときに、免疫原と併せて、内因的に存在するＳＴＩＮＧからのＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）免疫応答を誘導するアジュバントとして、ハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物、特にローズベンガル二ナトリウムを使用することを企図するものである。２つ以上の薬剤（アジュバントおよび免疫原）は、好適には、通常生理食塩水のような単一の水性医薬組成物から注入によって非経口的に投与される。別々の水性医薬組成物注入液が作製されてもよく、好適には順次、または最大で互いに約４時間以内に注入が行われる。

【0060】

この免疫原性応答Ｉ型ＩＦＮは、ＲＢもしくは別のＨＸ化合物の腫瘍への病巣内注射によって、または特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８に示される悪性血液細胞のＲＢとの接触によって得られるもの、およびそのうち１つ以上の子孫とは異なる。上記の特許文献において接触されるがん性哺乳動物細胞は優先的にＲＢを取り込み、これががん細胞を殺傷し、その結果生じるアブレーション細胞片を、遠隔免疫応答を誘導するための自己ワクチンとして作用させる。この免疫原性応答においては、ＲＢなどのＨＸ化合物は、細胞を殺傷するようにではなく、ＳＴＩＮＧ応答を刺激するように作用する。ローズベンガル二ナトリウムが好適なＨＸ化合物である。

【0061】

免疫応答の強化は、インビボまたはインビトロ技術によるサイトカイン、ケモカイン、抗体、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞などの適切な免疫分子または細胞の比較によって判定することができる。そのような比較は、この分野において通常利用される、腫瘍の大きさやウイルス血症の範囲などの比較によって行うこともできる。

【0062】

もう１つの具体的な実施形態においては、本発明は、水または０．９％生理食塩水などの薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散してワクチン有効量で存在する免疫原を、アジュバント有効量の上述し以降でより詳細に述べるハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物と共に含有する、哺乳動物用ワクチン組成物を企図する。ハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物のアジュバント有効量とは、例えば、がん細胞を殺傷するために用いられるであろう細胞傷害性量よりは少ない量であるが、ワクチン接種した哺乳動物におけるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）二量体化およびＩ型ＩＦＮ免疫応答の付随的誘導を引き起こすのに十分な量である。この量についても以降でさらに述べる。企図されるワクチンは、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物の約０．００１重量％～１０重量％で存在する１つ以上の添加剤も含み得る。この段落に記載される免疫原とＨＸ化合物とを含有する哺乳動物用ワクチン組成物は、以降および特許請求の範囲においては、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチンと称される。

【0063】

本発明は、任意の哺乳動物用ワクチン、特にヒト用のワクチンに適用することを企図されている。好適には、ワクチン免疫原と、考えられる添加物であってＨＸ化合物アジュバントがそれと共に溶解または分散するものとは、投与されるときに液体状であり、より好適には、その液体は少なくとも８０重量パーセント水である。

【0064】

抗微生物哺乳動物用ワクチンであってＨＸ化合物アジュバントがそれと共に製剤化されるものには、６つの通常使用されるクラス（タイプまたはグループ）がある。

【0065】

第１のグループは、殺傷されたバージョンの微生物を免疫原として利用する「不活化ワクチン」である。実例には、Ａ型肝炎を予防するもの、季節性Ａ型インフルエンザを予防するもの、ソークポリオワクチン、および狂犬病ワクチンが含まれる。これらのワクチンは、典型的には注射（ショット）によって投与される。

【0066】

次のタイプは「生弱毒化」微生物を免疫原として利用し、麻疹、おたふく風邪、および風疹を予防するもの（ＭＭＲ混合ワクチン）、ロタウイルスを予防するもの、天然痘を予防するもの、水痘を予防するもの、および黄熱病を予防するものを含む。セービン経口投与ポリオワクチンも生弱毒化ウイルスワクチンである。

【0067】

第３のタイプは、現在利用されているＣＯＶＩＤ－１９ワクチン（例えばモデルナ社およびファイザー・ＢｉｏＮＴｅｃｈ社）のような１つ以上の免疫原性微生物タンパク質性配列をコードする「ｍＲＮＡワクチン」である。

【0068】

第４のグループは、「サブユニット、ＨＢｃＡｇタンパク質鎖の一部として抗熱帯熱マラリア原虫ハプテン配列をコードおよび発現するように遺伝子操作されたプラスミドＤＮＡなどの組換え構造物（後述する）、多糖、および共役」ワクチンであり、これらはタンパク質、糖、またはカプシドといった病原菌の特定の断片を免疫原として使用するもので、Ｈｉｂ（ヘモフィルス・インフルエンザｂ型）病、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、百日咳、肺炎球菌感染症、髄膜炎菌感染症、および帯状疱疹を予防するために用いられるワクチンによって例示される。

【0069】

第５のタイプは、病原菌自体の代わりに病原菌のうち疾病を引き起こす部分に対する免疫を作り出す「トキソイド」ワクチンである。１つの例示的なトキソイドワクチンはジフテリアを予防し、別の１つは破傷風を予防する。

【0070】

第６のタイプは「ウイルスベクター」ワクチンであり、現在のところ米国ではそのうち１つのみが緊急用に認可されていると理解される。そのワクチンとは、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎのＪａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ社によって開発されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ワクチンを発現する組換え複製不能アデノウイルス２６型である。

【0071】

Ｈｅｐｌｉｓａｖ－Ｂ（登録商標）抗Ｂ型肝炎ワクチン中に存在するアジュバントＣｐＧ１０１８は、製造業者の印刷物［非特許文献３０］によれば、「ＴＬＲ９発現抗原提示細胞によって取り込まれて強い免疫賦活性応答のカスケードを誘発する。これは、メモリーＴ細胞およびメモリーＢ細胞を生成するように、高度に特異的なヘルパーＴ細胞応答を誘導し得る。」

【0072】

ＴＬＲ９免疫応答シグナル伝達カスケードがＩ型ＩＦＮ応答の産生および炎症誘発性サイトカインの産生を含むことに注意するのは重要である。［非特許文献３１。］それらの炎症誘発性サイトカインはＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＴＮＦαを含み［非特許文献３２］、それらの炎症誘発性サイトカインは様々な疾患のサイトカインストームと関連している。非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、および非特許文献３６を参照されたい。

【0073】

サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と称されることもあるサイトカインストーム症候群（ＣＳＳ）は、制御されない免疫活性化に起因する過剰なサイトカイン放出から過剰炎症および多臓器疾患が生じる臨床状態の包括を指し、全世界の子供および大人の死亡率の原因となる伝染性、リウマチ性、腫瘍学的、および免疫療法の病因を含む。よって、放出されたサイトカインは、より多くのサイトカインをポジティブフィードバックループにおいて放出するように、より多くの白血球を絶え間なく活性化するべく白血球を誘導する［非特許文献３７］。

【0074】

重症のＣＯＶＩＤ－１９患者は、サイトカインストームなどの高炎症性症候群を経験すると共に二次性血球貪食性リンパ組織球症（ｓＨＬＨ）を発症するおそれがあり、これは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を引き起こす。ＡＲＤＳはこうした患者において約５０％の死亡率を引き起こす。サイトカインストームは、敗血症、非伝染性の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、および二次性血球貪食性リンパ組織球症において見られる。したがって、サイトカインストームは回避されるべきである。

【0075】

別の企図される一実施形態は、免疫原と上述のＨＸ化合物とを含有する濃縮プレワクチン組成物を保持するバイアルもしくはボトルなどの容器またはコンテナである。２つの成分の量は、ワクチンが調製されるときに、所定量の薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散し次第ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチンを提供するべく、ワクチン有効量の免疫原およびアジュバント有効量のＨＸ化合物をそれぞれ提供するように予め定められている。

【0076】

本実施形態においては、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチンの成分は、典型的には、成分のうちいくつかまたは全ての水溶液または水分散液をフリーズドライ（凍結乾燥）することによって得られる乾燥した粉末状態である。よって、例えば、免疫原がＨＢｓＡｇであるＢ型肝炎ウイルスの予防のための水性組成物のように、製剤化されるワクチンに水性組成物が使用される場合には、免疫原を産生するために用いられる組換えによって形質転換されたサッカロマイセス・セレビシエの増殖培地およびライセートからタンパク質性免疫原を得ることができ、それに続いて免疫原が精製されて、ＨＢｓＡｇ含有水性組成物が凍結乾燥される。１つ以上の水溶性緩衝物質、所望の容積モル浸透圧濃度を提供する物質、二ナトリウムローズベンガルのようなＨＸ化合物アジュバント組成物、および追加的な試薬が粉末状態で免疫原と混合されて、包装可能な、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチンを調製するために注射用の水の添加および原料の溶解または分散のための攪拌ができる状態のプレワクチンを提供する。

【0077】

本発明のさらなる一実施形態は、薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散したワクチン有効量の所定の免疫原を含有する、改良された、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物であり、その改良は、免疫原と共にその薬学的に許容される希釈剤中にやはり溶解または分散した、アジュバント有効量の前述および後述のハロゲン化キサンテン化合物を含む。上述してきた、および以降でさらに述べるワクチン添加剤も、企図される、改良された、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物中に存在し得る。

【0078】

別の一態様は、微生物感染症を呈するなど治療の必要が認識される対象哺乳動物、好適にはヒトにおけるＩ型インターフェロン応答を誘導する方法であって、そのＩ型インターフェロン応答を誘導するのに有効な量のハロゲン化キサンテン、上述した薬学的に許容される塩、アミド、エステル、または芳香族誘導体を投与することを備える方法を企図する。好適なハロゲン化キサンテンはローズベンガル二ナトリウムである。Ｃ_１－Ｃ_４アルキルエステルハロゲン化キサンテンが使用されるときには、それは好適にはＣ_２（エチル）エステルである。芳香族誘導体が使用されるときには、それは好適にはベンジル、フェニル、または２－，３－，もしくは４－ピリジル（ピリジル）エステルまたはアミドであるが、後述するように他の芳香族誘導体も企図される。

【0079】

さらなる一態様は、固形がん性腫瘍を治療するための、ＨＸ化合物をアジュバント添加した対象哺乳動物用ワクチンを企図する。この方法は、特許文献７に記載されている治療済み対象からの組成物を免疫原として利用し、それによって抗自己腫瘍ワクチンと称することができるものを作り出す。

【0080】

ここでは、免疫原とは、腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を含有する濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤調製物である。その組成物の成分は、宿主哺乳動物の１つ以上の固形がん性腫瘍内に、がん性細胞に接触し、がん性腫瘍をアブレーションし、腫瘍アブレーション細胞片抗原タンパク質を形成するように、腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテン化合物またはその薬学的に許容される塩を１回以上病巣内（ＩＬ）投与することによって誘発され、その成分は、１回以上のＩＬ投与から約１～約３６５日後に、宿主哺乳動物から収集される。

【0081】

ＩＬ投与前の量と比較すると、組成物は、末梢血単核（ＰＢＭ）細胞である免疫細胞と、ａ）ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＬＴ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－－γ、およびＨＭＧＢ１からなる群から選択されたリンパ可溶性サイトカイン、ｂ）末梢血単核（ＰＢＭ）細胞である免疫細胞、およびｃ）全腫瘍細胞に表示される抗原にまたはハロゲン化キサンテン腫瘍アブレーション細胞片抗原タンパク質に結合する抗体のうち１つまたはいずれか２つである、統計的に有意に強化された濃度のハロゲン化キサンテン誘導免疫抗がん成分とを含有する。末梢血単核（ＰＢＭ）細胞である免疫細胞は、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を形成するように培養されインビトロで優先的に拡張されている。企図されるＨＸアジュバント、その量、および企図されるその他のワクチン成分は、本明細書中の他の箇所に記載される。

【0082】

ハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物
本発明者らの以前の研究は、ハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物および特にローズベンガル［４，５，６，７－テトラクロロ－２′、４′，５′，７′－テトラヨードフルオレセイン］（ＲＢ）を、腫瘍内注射または局所適用後に強い活性を有する新規の治療薬として同定している。ローズベンガルは、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１に記載されている分子のＨＸ化合物クラスの原型メンバーである。

【0083】

これらの分子には、特許文献１２、特許文献１３、および特許文献１４に記載されている注射可能な抗悪性腫瘍薬としておよび特許文献１５に記載されている局所皮膚科用薬としての用途を含め、いくつかの医療用途がある。ＲＢはがんの免疫賦活療法として［非特許文献３８］および炎症性皮膚疾患の免疫調整療法として［非特許文献３９］の将来性をうかがわせるが、これらの分子に自然免疫の直接的活性化における提示的役割があったことはない。

【0084】

平衡透析を用いると、ＲＢの９９．８％よりも多くが血清アルブミンを欠くラットの血清中で結合し、いくつかのタンパク質が関与することを示している。正常ラットにおいては、ＲＢの７５～８０％がアルブミン分画から回復され、残りの２０～２５％は他のタンパク質分画にある［非特許文献４０および非特許文献４１］。本発明者らは、超遠心分離法を用いて、ＲＢがラットプラズマにおいて高度のプラズマタンパク質結合を示し、１μＭでは９９．０％、１０μＭでは９９．２％のプラズマタンパク質結合が観察されること、ならびにこの親和性はヒトにおいてはより高く、１μＭ～１０μＭでそれぞれ９９．８％～９９．９％のプラズマタンパク質結合が観察されることを確認している。

【0085】

この生体分子、とりわけ糖タンパク質に対する親和性は、両親媒性であるＨＸ化合物の固有の物理化学的性質の結果であるとみられる。例えば、ＲＢは、水中で少なくとも１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）、エタノール中で３％（３０ｍｇ／ｍＬ）、および２－メトキシエタノール中で６％（６０ｍｇ／ｍＬ）の溶解度を有している［非特許文献４２］。

【0086】

静脈内法（ＩＶ）を介してヒトに投与されると、ＨＸ化合物は、代謝無しでおよそ３０分の循環半減期で胆汁を介して排泄される。これは肝機能のＩＶ診断としての歴史的使用に繋がった。非特許文献４３による最初の臨床的実証に始まり、静脈内ＲＢは、示差的排泄に基づく肝障害の診断として日常的に使用されるようになった。１９５０年代における^１３１Ｉ放射性標識ＲＢの導入がイメージング剤としての使用を拡張し［非特許文献４４］、ガンマ線検出を介した肝臓の直接イメージングを可能にした。

【0087】

臨床的使用では、放射性ヨウ素化ＲＢが非放射性標識ＲＢで希釈されることが多かった。米国における既承認適応は、肝機能不全の判定における診断補助としての用途および肝臓イメージング用であり、肝スキャンにより多くの時間をとることができるように放射性標識生成物の排泄速度を遅らせるべく、最大で２５μＣｉの用量の^１３１Ｉ ＲＢ（およそ１２ｍｇのＲＢ）がブロック用量の非放射性標識ＲＢ（放射性標識生成物投薬の１０分前であれば１００ｍｇ）と共に使用された。本発明者らは非放射性標識ＲＢでこの処置を繰り返し、最新の臨床ツールおよび標準を用いて全身投与されるＲＢの安全性および薬物動態的特性を確認した。

【0088】

非特許文献４５は、蒸留水に溶解し３００ｍｇ／ｋｇ／日で若いオスのウィスター系ラットに経口投与されたローズベンガルの効果の研究を報告した。非特許文献４５の研究者たちは成長速度に対する影響は無かったと報告したが、ＲＢは相対肝重量の有意な減少を引き起こした。肝細胞核のＲＮＡまたはＲＮＡ含有量へのＨ^３－ＵＴＰ取り込みに対する影響については言及されなかった。同様の濃度のポンソー３ＲまたはアマランスがインビボでのＲＮＡ合成を刺激することが報告された。

【0089】

以下に列挙する同様に有用なハロゲン化キサンテン化合物およびそれらの薬学的に許容される塩は、互いに約３倍異なる分子量を有し得る（特許文献１６、第１５～１６欄の表３を参照）。使用される特定のＨＸ化合物の正確な量は、そのような各化合物の分子量またはＲＢの分子量に基づいて計算されるのが好適である。

【0090】

企図されるＨＸ化合物には、特に好適であるローズベンガル（４，５，６，７－テトラクロロ－２′，４′，５′，７′－テトラヨード－フルオレセイン；ＲＢ）、エリスロシンＢ、フロキシンＢ、４，５，６，７－テトラブロモ－２′，４′，５′，７′－テトラ－ヨードフルオレセイン、２′，４，５，６，７－ペンタクロロ－４′，５′，７′－トリヨードフルオレセイン、４，４′，５，６，７－ペンタクロロ－２′，５′，７′－トリヨードフルオレセイン、２′，４，５，６，７，７′－ヘキサクロロ－４′，５′－ジヨードフルオレセイン、４，４′，５，５′，６，７－ヘキサクロロ－２′，７′－ジヨードフルオレセイン、２′，４，５，５′，６，７－ヘキサクロロ－４′，７′－ジヨードフルオレセイン，４，５，６，７－テトラクロロ－２′，４′，５′－トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７－テトラクロロ－２′，４′，７′－トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７－テトラブロモ－２′，４′，５′－トリヨードフルオレセイン、および４，５，６，７－テトラブロモ－２′，４′，７′－トリヨードフルオレセインが含まれる。

【0091】

上記のハロゲン化キサンテンのような、医薬化合物と共に薬学的に許容される塩を形成する、一般的に使用される薬学的に許容される酸および塩基のリストに関して、読者は非特許文献４６を参照されたい。例示的なカチオンには、ナトリウム、カリウム、ならびにアンモニウムなどのアルカリ金属と、マグネシウムおよびカルシウムなどのアルカリ土類塩とが含まれる。ローズベンガルの二ナトリウム塩は特に好適である。

【0092】

上記のハロゲン化キサンテン化合物のうち１つのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルも使用することができ、Ｃ_２、すなわちエチルエステルが好適である。よって、ＲＢ、エチル－レッド３（エリスロシンエチルエステル；２′，４′，５′，７′－テトラヨード－フルオレセインエチルエステル）、４，５，６，７－テトラブロモ－２′，４′，５′，７′－テトラヨードフルオレセイン、およびエチル－フロキシンＢ（４，５，６，７－テトラクロロ－２′，４′，５′，７′－テトラブロモフルオレセインエチルエステル）の各々を用いたインビトロ実験は、ＣＣＬ－１４２腎腺がんに対して同様の抗腫瘍活性を示した。芳香族エステルが使用されるときには、それは好適にはベンジルまたはフェニルエステルである。

【0093】

ＨＸ化合物のカルボキシル基もアミド基を形成するために使用され得る。アミド窒素原子は、非置換［－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ_２］であってもよく、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル基で一置換［－Ｃ（Ｏ）－ＮＨＲ^１、ただしＲ^１はＣ_１－Ｃ_４アルキル］、または２つの独立して選択されたＣ_１－Ｃ_４アルキル基で二置換［－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^１Ｒ^２、ただしＲ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して同一のまたは異なるＣ_１－Ｃ_４アルキル基］されていてもよい。代替的には、Ｒ^１基およびＲ^２基がアミド窒素原子と共に５員環または６員環を形成する。

【0094】

さらに、ＨＸ化合物カルボキシル基は、エステルまたは一置換アミドである芳香族誘導体を形成し得る。そのような誘導体の芳香環は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する単一の５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系である。

【0095】

芳香環部がフェニル、ベンジル、または２－，３－，もしくは４－ピリジル（ピリジル）である芳香族誘導体が現在のところ好適である。しかしながら、他の芳香族単環および縮合環含有エステルならびにアミドが企図される。そのような芳香族エステルおよびアミド誘導体基の実例が以下に示され名前を挙げられている。ここで、ＺはＯまたはＮＨであり、線Ｚは環酸素または環窒素が環のいずれかの利用可能な炭素からのものであり得ることを示し、波線と交差するＺ線は図示されるアルコキシ基またはアミノ基が別の分子、エステル化またはアミド化されたＨＸ分子の一部であることを示す。

【0096】

【化3】

【0097】

特許文献９の図１ｓによって表される２，３，４，５－テトラクロロ－６－（６－ヒドロキシ－２，４，５－トリヨード－７－イソプロピル－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）安息香酸二ナトリウム［４，５，６，７－テトラクロロ－２′，４′，５′－トリヨード－７′－イソプロピルフルオレセイン］、および位置２，３，４，５，２′，４′，５′，または７′のうち１つ以上で１つ以上の脂肪族または芳香族部分の結合を介して形成される同様の脂肪族または芳香族誘導体など、上記のＨＸ化合物のうち１つの脂肪族または芳香族誘導体も使用することができる。

【0098】

ＲＢの好適な形態は、以下の構造式を有するローズベンガル二ナトリウムである。：

【0099】

【化4】

【0100】

上記したＨＸ化合物を含有する医薬組成物の医学的利用のさらなる詳細は、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献１６、特許文献４、特許文献１５、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献７、および特許文献２０に記載されている。これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0101】

企図されるＨＸ、上述したその薬学的に許容される塩またはエステルまたはアミドは、典型的にはＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用水性ワクチン組成物中にアジュバント量で溶解または分散されて使用される。先に述べたＨＸ分子、塩、エステル、またはアミド（化合物）のアジュバント量とは、Ｉ型ＩＦＮ免疫反応を誘発する量である。そのような量は、細胞傷害性量よりも少なく好適には細胞傷害性量の約７５％よりも少ないＨＸ化合物の量でもある。

【0102】

細胞傷害性量とは、腫瘍学適応（例えば神経芽腫、白血病、悪性黒色腫、または他の腫瘍）のＩＣ_５０値量であるが、感染性疾患については、細胞傷害性量は正常組織（例えば培養線維芽細胞、腎細胞など）のＩＣ_５０である。特許文献８の表１および２に示されるデータは、１３の小児固形腫瘍細胞株に対するインビボでのＲＢの使用に関するＩＣ_５０値が、処理後９６時間の曝露で約５０～約１００μＭ、中央値が約７０μＭであることを説明している。正常線維芽細胞細胞株および一次骨髄サンプルの同様の処理は、約７３～１４３μＭのＩＣ_５０値をもたらし、中央値は１０４μＭであった。同様のデータが、発明者らのうち一名と彼の研究グループによって、１１の小児白血病細胞株に関して報告されており、平均ＩＣ_５０値は９３μＭ、および３つの一次白血病サンプルの平均ＩＣ_５０値は１２２μＭである［非特許文献４７］。

【0103】

ＲＢ二ナトリウムの分子量が１，０１８ｇ／モルであることを考えると、上記の細胞傷害性ＩＣ_５０値では、１リットル当たり約５０～約１００ｍｇのＲＢが含まれる計算になる。これらの値はＩＣ_５０値に基づいておよそ１０^－４～約１０^－５モル濃度に換算される。よって、ＨＸ化合物としてＲＢを基にした、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物におけるＨＸ化合物の典型的なアジュバント有効量は、１リットル当たり約３５～約７５ｍｇ、または約７．５×１０^－５～約７．５×１０^－６モル濃度となる。

【0104】

ＨＸ化合物の短いヒト循環半減期（約３０分）は、急性ＳＴＩＮＧ活性化のためにこれらの分子の効果的な適用を促進し、自然免疫シグナル伝達の可能性を最大化し、その一方で反産生的な炎症反応、起こり得る自己免疫疾患、または腫瘍形成の増進をもたらし得る慢性活性化を回避する。図１Ｃ～１Ｒに示されるインビトロの結果からわかるように、サイトカイン産生を強化することに対するＲＢの効果は、１６のサイトカインの各々において、４８時間以内に生じた。

【0105】

免疫原
企図されるワクチンは免疫原を含有し、これはウイルス、細菌、真菌、または単一細胞寄生虫などの殺傷または無力化された感染因子であり得る。免疫原は、感染因子であってそれからの防御が求められるものに存在する、１つ以上のタンパク質またはペプチジルタンパク部分でもあり得る。免疫原はさらに、感染因子の糖類含有部分であり得る。全感染因子以外のこれらの免疫原は、ワクチンタイプの議論において前述したように、感染因子自体から得ること、合成化学を介して作製すること、または組換え技術によって作製することができる。

【0106】

免疫原はワクチン中にワクチン有効量で存在する。その量は、政府によって承認されたワクチン中に存在する免疫原の量であり得る。未承認のワクチンに関しては、その量は、ワクチンが投与される対象哺乳動物において所望の免疫応答を誘導するためにＨＸ化合物アジュバントの非存在下で必要とされる量である。よって、防御抗体および／またはＴ細胞は、ワクチン有効量の免疫原を含有するワクチンの投与の結果、形成される。

【0107】

例示的なウイルス感染因子（病原体）であってそれからの防御が求められるものには、インフルエンザや、肝炎ウイルスＡ，Ｂ，Ｃ，およびＤや、水痘帯状疱疹（水痘）、単純ヘルペス１型および２型（ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのヘルペスウイルスが含まれる。例示的なバクテリア病原体には、大腸菌、フェカリス菌、黄色ブドウ球菌などが含まれる。例示的な単細胞寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ネズミマラリア原虫、またはヨーエリマラリア原虫のマラリアスポロゾイトである。例示的な真菌感染性因子は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、およびカンジダ・クルーセイを含む。

【0108】

例示的なタンパク質性免疫原および疾患関連マーカ―分子ペプチドが、公開された情報源の引用と共に特許文献２１に開示されている。

【0109】

特許文献２２は次のペプチジルエピトープを含む。：
マラリアＢ細胞エピトープ
熱帯熱マラリア原虫
三日熱マラリア原虫
ネズミマラリア原虫
ヨーエリマラリア原虫

【0110】

マラリアユニバーサルＴ細胞エピトープ
熱帯熱マラリア原虫
三日熱マラリア原虫
ヨーエリマラリア原虫

【0111】

特許文献２３は次のペプチジルエピトープを含む。：
インフルエンザＡ型Ｍ２タンパク質Ｂ細胞エピトープ

【0112】

特許文献２３で言及されているように、Ｍ２タンパク質はインフルエンザＡ型株に感染した細胞において発現する。Ｍ２タンパク質のＮ末端残基１～２４は感染した細胞の膜を貫通して伸びる。タンパク質のその細胞外部分はＭ２ｅと称される。したがって、そのタンパク質のインフルエンザＡ型細胞外Ｍ２ｅ部分を免疫原の一部として使用することは、インフルエンザ株のすべてからの防御を提供し得る。よって、インフルエンザワクチン選択の毎年の変更を回避することができる。

【0113】

特許文献２４は次のペプチジルエピトープを含む。：
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原

【0114】

Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、Ｂ細胞ポリペプチドエピトープおよびＴ細胞ポリペプチドエピトープの両方を提供する。特許文献２４に開示されるいくつかの各エピトープタイプは、下で表中に、それらのペプチド名称、ならびにａｙｗ提供者（Ｐ４９）およびａｄｗ提供者（Ｐ７２およびＰ７３）のＤＮＡに基づいて同特許に記載されている括弧内のＮ末端からの配列位置と共に、提示されている。

【0115】

Ｂ細胞エピトープ
特許文献２５は次のペプチジルエピトープを含む。：
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）マーカーペプチド

【0116】

パピローマウイルスは、皮膚または粘膜上皮の良性、形成異常、および悪性の過剰増殖を誘導する。５０型（株）よりも多くのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が同定されている。ヒトにおいては、異なるパピローマウイルス型は異なる疾患を引き起こすことが知られている。例えば、ＨＰＶ１型および２型は尋常性疣贅を引き起こし、６型および１１型はコンジローマおよび性器扁平疣贅を引き起こす。対照的に、ＨＰＶ１６型、１８型、および３３型はほとんどの子宮頸がんに存在しており、通常のコンジローマは引き起こさないが、子宮頸部内皮に拡散して存続し、最小限の病変しか呈さない。子宮頸がんに関連するＨＰＶ型は、初感染後何年も子宮頸部内皮組織中に潜伏状態で維持され、その後、場合により進行して子宮頸がんを引き起こすと考えられる。

【0117】

特許文献２５は、担体に結合されると抗体の産生を誘導するいくつかのペプチド配列を開示している。１６型関連ＨＰＶ配列の例示的なペプチドマーカーが特許文献２５に開示されている。同特許は、１８型および３３型のペプチド配列、ならびにＨＰＶ６型、１１型、１８型、および３３型のＥ２ ＯＲＦによってコードされた配列も開示している。

【0118】

上記のペプチジルエピトープは、典型的にはそれら自体では免疫応答を誘導するのに有効ではなく、当該技術分野においてはハプテンと称される。それらはむしろ、それ自体免疫原性であるが感染因子であってそれからの防御が求められるものに必ずしも対抗しない担体分子、通常はタンパク質に結合されなければならない。そのような担体分子の実例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびＢ型肝炎コアタンパク質／粒子（ＨＢｃＡｇ）である。

【0119】

特許文献２６は、それ自体が所望の感染因子に対して免疫原性である構築物を産生するためにぺプチジルハプテンが結合可能なリジンなどの添加アミン含有アミノ酸残基で修飾されたＨＢｃＡｇの使用を教示している。Ｂ型肝炎コアタンパク質は自己組織化して一般に球形の粒子となり、これは約１８０の個々の同一のタンパク質を含む。同特許は、いくつかの感染因子について約７０のペプチジルハプテンも列挙している。いくつかの炭水化物ハプテンも、標的感染因子に対する各々の効能に関する文献または特許文献と併せて列挙されている。

【0120】

特許文献２７は、特にアミノ末端から１４１～１６０番目の、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＶＰ_１タンパク質の一部に対応するペプチジルハプテンの担体としてのＫＬＨの使用を教示している。ＫＬＨは、特許文献２８に記載されたインフルエンザウイルスＡ型（Ｈ３Ｎ２）のヘマグルチニンタンパク質の一部の配列を有するペプチドハプテンの担体でもあった。

【0121】

特許文献２２は、修飾されたＨＢｃＡｇ粒子として大腸菌中に発現した抗熱帯熱マラリア原虫免疫原を教示している。形質転換された大腸菌は、発現した各ＨＢｃＡｇタンパク質がハプテン配列を含有するように抗熱帯熱マラリア原虫ハプテン配列をＨＢｃＡｇタンパク質鎖の一部としてコードし発現させるように遺伝子操作されたプラスミドＤＮＡを含有していた。

【0122】

ワクチン組成物
企図されるＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物は、前述したように、免疫原およびＨＸ化合物アジュバントと、１つ以上の添加剤とを含有し得るものであり、通常は含有する。そのような組成物は、典型的にはＩＶ法による非経口投与を意図されているので、そのような組成物は電解質も含有するはずであり、好適にはおよそ生理的な重量モル浸透圧濃度およびｐＨ値を有する。

【0123】

薬学的に許容される水性媒体中の一価の電解質イオンの好適な濃度は、約０．５～約１．５％（ｗ／ｖ）、より好適には約０．８～約１．２％（ｗ／ｖ）であり、最も好適には約０．９％（ｗ／ｖ）の濃度である。約０．９％（ｗ／ｖ）の濃度は、ほぼ等張水溶液に相当するため、特に好適である。さらなる好適な一実施形態においては、企図される医薬組成物中の電解質は塩化ナトリウムである。

【0124】

そのようなレベルの電解質は、薬学的に許容される水性媒体の重量モル浸透圧濃度を高める。よって、電解質濃度の範囲を特定する代わりに、重量モル浸透圧濃度を用いて、組成物の電解質レベルをある程度特徴付けることができる。

【0125】

マンニトールやブドウ糖のような糖などの等張化剤（または張度調整剤）、プロピレングリコール、グリセロール、およびソルビトールなどのＣ_３－Ｃ_６ポリヒドロキシ化合物、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの等張塩、ならびに／またはリン酸塩、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、および他の食品酸およびそれらの塩などの緩衝剤を使用することができる。

【0126】

好適には組成物の重量モル浸透圧濃度は約１００ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、より好適には組成物の重量モル浸透圧濃度は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、最も好適には約３００～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇである。

【0127】

水性ビヒクルにおけるＨＸ化合物の溶解度を最大化し、生物組織との適合性を確保するためには、薬学的に許容される水性媒体のｐＨ値は約４～約９であるのが好適である。特に好適なｐＨ値は約５～約８であり、より好適には約６～約７．５の間である。最も好適には、ワクチン組成物のｐＨ値は７．３５～７．４５、またはより容易には、血漿のｐＨ値である７．４である［非特許文献４８］。これらのｐＨ値では、（エステル化もアミド化もしていない）遊離カルボキシル基を含有する化合物は、低いｐＨ値で形成される水不溶性のラクトンではなく、典型的には二塩基形態のままである。

【0128】

薬学的に許容される水性媒体のｐＨ値は、当業者に周知の任意の適当な手段によって調節または調整することができる。組成物は、酸または塩基などの追加によって、中和またはｐＨ値を調整することができる。ハロゲン化キサンテンまたはその生理的に許容される塩は弱酸であるから、ハロゲン化キサンテンの濃度および／または電解質の濃度によっては、組成物のｐＨ値はバッファーおよび／またはｐＨ修飾試薬の使用を要さないかもしれない。もっとも、組成物は、投与され次第生物環境に順応できるように、いかなるバッファーも含まない（無バッファーまたはバッファーフリーである）のが特に好適である。

【0129】

１つ以上の追加的なアジュバントが追加的な添加剤として存在していてもよい。アルミニウム含有化合物が米国で最も一般的に用いられているワクチンアジュバントである。

【0130】

免疫原（Ｉｍ）重量のアルミニウム（Ａｌ）重量に対する比は、広く約０．３～約２．７ｍｇ Ｉｍ／Ａｌに及ぶ。重量比は、オキシ水酸化アルミニウムが用いられるのか、アルミニウムヒドロキシホスフェートが用いられるのか、またはその両方が用いられるのかついて、免疫原によっても異なる［非特許文献４９］。

【0131】

ワクチンにおいて一般的に使用される２つのアルミニウムベースのアジュバント（ＡＢＡ）がある。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）はオキシ水酸化アルミニウム（ＡＨ）の半結晶形態であり、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）はアルミニウムヒドロキシホスフェート（ＡＰ）の非晶質塩である。後者の硫酸塩（ＡＡＨＳ）も、ＨＰＶに対するワクチン接種において使用されるアジュバント系の一構成要素として挙げられている。［非特許文献５０］

【0132】

アルミニウムをアジュバント添加したワクチンには、臨床的成功の長い歴史と、それに見合ったワクチン関連の有害事象の長い歴史とがある。ＡＢＡの安全性を実証することは必須要件ではないため、ワクチン接種後の有害事象は即座にＡＢＡの直接的または間接的な効果であると推測され得る［非特許文献５０］。

【0133】

いわゆる「免疫チェックポイント阻害薬」または「免疫チェックポイント様阻害薬」もアジュバントとして使用することができる。免疫チェックポイント阻害薬とは、Ｔ細胞などの免疫系細胞によって、および一部のがん細胞によっても作られる、特定のチェックポイントタンパク質に結合して当該タンパク質をブロックする薬剤である。それらのタンパク質は、ブロックされていないときには免疫応答を阻害し、Ｔ細胞ががん細胞を殺傷するのを妨げることなどによって、免疫応答を食い止めるのを助ける。それらの免疫チェックポイントタンパク質をブロックすることで、免疫系への「ブレーキ」が解除されてＴ細胞が活性化することができる。

【0134】

有用な免疫チェックポイント阻害薬は、好適には、投与されるとそうした特定のタンパク質の作用をブロックし、それによって免疫系ががん細胞を異物として認識すると共にそれらのがん細胞を体から排除するのを補助できるようにする、ヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体またはその結合部分（パラトープ）である。例示的な免疫チェックポイント阻害薬は抗ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）モノクローナル抗体であるイピリムマブおよびトレメリムマブを含み、これらは、ＣＴＬＡ－４活性をブロックすることによって免疫系のダウンレギュレーションに対抗し、ひいてはがんに対するＴ細胞の応答を増強するように設計されている。同様に、ピジリズマブ、ニボルマブ、ラムブロリズマブ、およびペムブロリズマブなどのモノクローナル抗体は、ＰＤ－１（プログラム死１）受容体に結合して免疫系のダウンレギュレーションに対抗し、がん細胞に対するＴ細胞の応答を増強する。ＰＤ－１受容体（ＰＤ－Ｌ１）の免疫チェックポイントタンパク質リガンド（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする３つの抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブである。ＰＤ－１受容体のリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対する抗体、例えばＰＤ－Ｌ１に対するＢＭＳ－９３６５５９やＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）などに関する初期研究も、免疫系のダウンレギュレーションの阻害およびがんに対するＴ細胞の応答の増強を示している。

【0135】

チェックポイント阻害薬様活性を有する抗体の別のグループは、細胞表面受容体ＯＸ４０（ＣＤ１３４）と免疫反応してメモリーＴリンパ球およびエフェクターＴリンパ球の増殖を刺激し、それによってＴ細胞媒介免疫応答を刺激する。例示的なそのようなヒト化抗ＯＸ４０モノクローナル抗体には現在文献中でｇｓｋ３１７４９９８（ＩｇＧ１）、ポガリズマブ（ＭＯＸＲ０９１６）、ＭＥＤ１０５６２と称されているものが含まれ、ヒト抗ＯＸ４０ ＩｇＧ２抗体にはＰＦ－０４５１８６００（ＰＦ－８６００）と名付けられたものが含まれる。

【0136】

チェックポイント阻害薬様活性を有する抗体のさらに別のグループは、免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞受容体（ＴＩＧＩＴ）と免疫反応するもので、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞および調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞、濾胞性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＮＫ細胞を含むリンパ球でのみ発現する［非特許文献５１］。例示的な抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体は、文献中でＥＯＳ－４４８（グラクソスミスクライン社）、ＡＧＥＮ１７７７（ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社）、ドムバナリマブ（ＡＢ１５４；ギリアド・サイエンシズ社）、およびチラゴルマブ（ロシュ社）として知られているものを含む。抗ＴＩＧＩＴ抗体はこれまでのところ、主にがん免疫療法において利用されてきている。

【0137】

無傷のモノクローナル抗体、ならびにそのパラトープ含有部分（結合部位含有部分）であるＦａｂ領域、Ｆａｂ′領域、Ｆ（ａｂ′）_２領域、およびＦｖ領域など、ならびに一本鎖ペプチド結合配列が、免疫チェックポイントタンパク質阻害薬して有用であろう。無傷のチェックポイント阻害モノクローナル抗体はヒトの体内で約１～３週間の半減期を有し［例えば、ヤーボイ（登録商標）（イピリムマブ）終末相ｔ_１／２＝１５．４日；添付文書１２／２０１３；キートルーダ（登録商標）（ペムブロリズマブ）終末相ｔ_１／２＝２３日；添付文書０３／２０１７］、一本鎖オリゴまたはポリペプチドはインビボにおいてより短い半減期を有する傾向がある。

【0138】

結果
ハロゲン化キサンテンはＳＴＩＮＧを活性化する
よく樹立された急性単球性白血病（ＡＭＬ）細胞株（ＴＨＰ－１）をインビトロでのＳＴＩＮＧ活性を研究するためのモデルとして用いて、ローズベンガル（ＲＢ）がＳＴＩＮＧ二量体化およびその結果生じるＩ型インターフェロン応答のプロモーターであることがわかった。細胞がＲＢで処理され、ＳＴＩＮＧの内因性誘導が、環状グアノシン－リン酸・アデノシン－リン酸（ｃＧＡＭＰ）をポジティブコントロールとして使用して、ウェスタンブロット解析により評価された。

【0139】

これらの研究は、ＲＢを１００μＭで、または約０．０１％ＲＢを使用して行われた。細胞培養培地へのＲＢの添加の前（０）、ならびに８時間後、２４時間後、および４８時間後に、サイトカインアッセイが行われた。

【0140】

ＲＢの存在下でＳＴＩＮＧに関連するタンパク質が免疫沈降によって精製され、質量分析法によって解析された（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）。ＲＢ処理された細胞からの培養上清が、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ（登録商標）多重ビーズベースアッセイシステム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）を用いて、４２の免疫サイトカインのパネルについて調査された。

【0141】

ＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞のＲＢへの曝露は、特定の抗体によって検出される新たな約７０ｋＤａのＳＴＩＮＧ二量体バンドの出現をもたらした。図１Ａおよび１Ｂ（写真のゲルの破線のボックス）。ｃＧＡＭＰコントロールと比較して、ＰＤＬ－１の誘導は認められなかった。これらの細胞におけるＳＴＩＮＧの免疫沈降物の質量分光分析は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６０，７０，および９０ならびに二量体化されたＳＴＩＮＧ複合体へのポリアデニル酸結合タンパク質１（ＰＡＢＰ１）の存在を示した。

【0142】

ケモカインアッセイは、別の一組の炎症誘発性および細胞傷害性Ｔ細胞リクルートサイトカインの特異的なアップレギュレーションを示した（図１Ｃ～１Ｒ）。よって、図示するように、単球走化性タンパク質－３（ＭＣＰ－３）およびＩＦＮガンマの誘導のピークが２４時間で見られ（＞２倍）、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびインターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ－１０）の各々ではおよそ１０倍の増加がＲＢへの曝露後２４時間で見られた。ＭＣＰ－１レベルの有意な増加も認められた。

【0143】

これらの結果は、急性炎症誘発性応答および免疫応答（すなわち２４～４８時間以内）に繋がるＲＢ誘導ＳＴＩＮＧ二量体化およびＨＳＰ会合を実証している。さらなるインビトロ研究により、ＲＢが溶液中でのＳＴＩＮＧ二量体化を誘導すること（すなわち、効果はがん細胞内での作用に依存しないこと）が確認された。

【0144】

ＡＭＬモデルおよびその後の調査は、例えばＲＢなどのＨＸ化合物が急性ＳＴＩＮＧ二量体化を誘導し得ることを示している。これには、ＳＴＩＮＧ媒介の免疫活性化が抗腫瘍療法での自然免疫系および適応免疫系の応答において、特許文献４に記載されている注射可能な抗悪性腫瘍薬によるもののような単剤免疫療法として、またはそのような薬剤が特許文献１２に記載されている他の薬剤との併用療法で用いられる場合に、中心的役割を果たし得るという、腫瘍学における重要な示唆がある。

【0145】

これらの結果がさらに示すことには、ＨＸ化合物に基づくＳＴＩＮＧ二量体化の誘導には、ＳＴＩＮＧ媒介免疫活性化が抗腫瘍療法での自然免疫系および適応免疫系の応答において、単剤抗ウイルス薬としてまたは他の抗ウイルス薬との併用療法で中心的役割を果たし得るという、ウイルス学における重要な示唆がある。前述したように、ＨＸ分子または塩（化合物）のアジュバント量とは、ＳＴＩＮＧ二量体化を誘導する量（すなわちＳＴＩＮＧ二量体化誘導量）であり、さらに、細胞傷害性量よりも少なく好適には細胞傷害性量の約７５％よりも少ないＨＸ化合物の量として定義される。細胞傷害性量とは、腫瘍学適応（例えば神経芽腫、白血病、悪性黒色腫、または他の腫瘍）のＩＣ_５０量であるが、感染性疾患については、細胞傷害性量は正常組織（例えば培養線維芽細胞、腎細胞など）のＩＣ_５０である。

【0146】

ＨＸ化合物の短いヒト循環半減期（約３０分）は、急性ＳＴＩＮＧ活性化のためにこれらの分子の効果的な適用を促進し、自然免疫シグナル伝達の可能性を最大化し、その一方で反産生的な炎症反応、起こり得る自己免疫疾患、または腫瘍形成の増進をもたらし得る慢性活性化を回避する。図１Ｃ～１Ｒに示されるインビトロの結果からわかるように、サイトカイン産生を強化することに対するＲＢの効果は、１６のサイトカインの各々において、４８時間以内に生じた。

【0147】

１回以上の全身用量の投与は、特に免疫能が低減した患者において、免疫応答を開始するのにとりわけ産生的であり得る。このアプローチは、後述するように、がんまたは微生物感染症の免疫アジュバントとしてのＨＸ化合物の使用に等しく適用可能である。

【0148】

投薬 － 図２
０．９％塩化ナトリウム含有水性媒体中の腫瘍細胞をＨＸ化合物に曝露すると、腫瘍リソソームにおいてＨＸ化合物の不可逆的蓄積が生じ、十分な濃度に到達次第、免疫原性腫瘍の自己融解を引き起こしてリソソーム完全性を不安定化する［非特許文献５２］。これは、こうした細胞死の免疫原性メカニズムが、（濃度）・（時間関数）に基づいて、ある範囲の曝露状態にわたり引き出され得ることを示唆しており、ここで、細胞傷害性はこれらの２つのパラメータの積に比例する［すなわち、細胞傷害性＝ｆ（［ＨＸ］・ｔ）、ただし「ｔ」は時間である］。

【0149】

例えば、ＲＢがある範囲の固形腫瘍（例えば悪性黒色腫、肝細胞がん、乳がん）に病巣内注射によってインビボで投与される場合、およそ２５～５０ｍｇ／ｇ腫瘍組織（２５～５０ｍＭ）の腫瘍内ＲＢ濃度では、およそ３０分以内に急性腫瘍細胞傷害性が明らかになる［非特許文献２７］。

【0150】

非特許文献２９は、およそ５０～１００μＭの濃度で９６時間にわたりＲＢとインビトロで接触後の難治性小児固形腫瘍（神経芽腫および神経上皮腫）の細胞傷害性を実証した。非特許文献２９の著者らは、３つの組織供給源体からのヒト上皮細胞に対する毒性も試験し、９３～１４３μＭというＩＣ_５０値を報告した。また、非特許文献２８は、等価曝露下で、追加の難治性小児固形腫瘍（ユーイング肉腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫）における細胞傷害性を示した。

【0151】

２０２１年３月２６日に提出された親出願である特許文献１に開示されているように、継続的な経口栄養供給下でのＲＢへの長期の曝露はマウスＡｐｃ^Ｍｉｎ大腸腫瘍モデルにおける大腸がんの形成を予防すること（予防活性）および大腸がんを阻止すること（治療活性）が示されている。治療用途では、飲料水中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で適宜ＲＢを受ける症候性マウスは、未処理マウスと比較して平均生存がおよそ４８％増加した（１２．３±０．５週に対して９．８±０．８週）。１日当たりの飲料水消費率をおよそ２ｍＬ／１０ｇ体重と仮定すると、これはおよそ２ｍｇ ＲＢ／１０ｇ（２００ｍｇ／ｋｇ）の消費に相当する。

【0152】

経口経路を介して水溶液で投与されるＲＢ二ナトリウムの生物学的利用能は、発明者らによって行われたマスバランス試験に基づくと限定的であると思われ、０．１～１パーセントと推定することができ、０．２～２ｍｇ／ｋｇという１日当たりの全身曝露に相当する。この量が血流を通じて分配され、その血液量が体重のおよそ１０パーセントを占めると仮定すると、これは２～２０μＭという血液中ＲＢの推定濃度に等しい。

【0153】

同じアプローチは、特許文献３の図１に示されるデータをプロットするのにも用いられた。特許文献３は、小児Ｂ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）腫瘍細胞株の樹立された異種移植片を持つＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの生存を示しており、週に２回、２週連続で強制飼養によりＲＢを受けた２つの治療群のマウスについて治療活性が観察された。この経口ＲＢの生物学的利用能を１％、腸通過時間を１回の投与当たり６時間、血液量を体重のおよそ１０パーセントとすると、２つの治療群は推定で１２５～２５０μＭという血液中ＲＢに相当する。

【0154】

これらのデータをプロットすると、本願の図２に図示されるように、仮定された関係（すなわち、細胞傷害性＝ｆ（［ＨＸ］・ｔ））が実験結果によって裏付けられることが確認される。

【0155】

より重要なことには、この関数関係により、全身投与およびアジュバントに基づいて抗腫瘍治療効果を達成するのに適切な用量レベルおよびスケジュールの予測が可能になる。Ａｐｃ^Ｍｉｎモデルで調査されたものと同等の長期全身療法スケジュールに関しては、低いマイクロモル濃度（すなわち約１０μＭ）の循環ＨＸ化合物がおよそ３か月の期間にわたってリソソーム蓄積および腫瘍細胞破壊を達成するのに十分であるのに対し、マイクロモルからサブマイクロモル濃度（すなわち約１μＭ）はおよそ１２か月の期間にわたって腫瘍細胞破壊を達成するのに十分である。

【0156】

逆に、経口白血病モデルにおいて使用されるような、より高い用量レベルでの短期間または断続的繰り返し全身投薬も、細胞傷害性および腫瘍破壊を達成した。

【0157】

白血病の小児患者の治療など、特定の適応症については、本願の図２の関係は、医薬開発の当業者によって日常的に用いられる標準的なアプローチが潜在的な安全性リスクを最小化しつつ治療効果を最大化する適切な用量レベルおよびスケジュールを選択するために適用できることを説明している。

【0158】

吸収の標準的な薬物動態試験によって処方の最適化を導くことができ、それによって用量レベルおよび処方が所望の服用スケジュール通りに必要な全身曝露を達成するように調整される（例えば、数日程度の短期間曝露では血流中に約１００μＭ、数か月程度の中期間曝露では約１～約１０μＭ、１年以上程度の長期曝露では約＜１μＭ以下）。

【0159】

ＨＸ化合物の二塩基塩形態は溶液中におよそ５よりも大きいｐＨを有して存在するが、＜５のｐＨ値ではＨＸ化合物はそのラクトン形態に自発的に変換する。二塩基塩形態は水性媒体で高度に溶性であるのに対し、ラクトン形態は水性媒体では不溶である。

【0160】

本明細書において提供されるデータは、いくつかの白血病細胞株に対するインビトロでのＲＢの使用に関するＩＣ_５０値が、１日から数日の曝露では約５０～約１００μＭであることを示す。ＲＢ二ナトリウムの分子量が１０１８ｇ／モルであることを考えると、上記のＩＣ_５０値では、１リットル当たり約５０～約１００ｍｇのＲＢが含まれる計算になる。

【0161】

ＨＸ化合物アジュバントに起因する細胞傷害性はここでは望ましくないので、本明細書においては細胞傷害性量よりも少ない量が使用される。図２のデータは上限を提供するために用いることができ、ハロゲン化キサンテンのアジュバント有効量はそれを下回って決定される。

【0162】

ＲＢを用いた肝機能の古典的な静脈内（ＩＶ）診断アッセイは、１回のＩＶ用量として１００ｍｇのＲＢを投与して行われた。ＰＶ－１０（登録商標）ＲＢ二ナトリウム水溶液の臨床試験では、ＩＶ送達で１５００ｍｇのＲＢが耐容されている。標準的な成人の血液量は、およそ５Ｌである。よって、血液中で１００ｍｇ／Ｌを達成するには、成人患者であれば、血流中のＩＣ_５０値を達成するためにおよそ５００ｍｇのＲＢをＩＶで受ける必要があろう。循環血液からのＲＢの迅速なクリアランス（ｔ_１／２は約３０分）により、ＩＶ投与では、循環中のＲＢのピークレベルを維持するために、継続的な注入が必要となり得る（すなわち、最大で数時間以上）。

【0163】

先に列挙した同様に有用なハロゲン化キサンテン化合物およびそれらの薬学的に許容される塩は、互いに約３倍異なる分子量を有し得る（特許文献１６、第１５～１６欄の表３を参照）。使用されるＲＢ以外のハロゲン化キサンテンの量は、そのような各化合物の公開されている分子量とＲＢまたはＲＢ二ナトリウムの分子量とに基づいて計算されるのが好適である。

【0164】

ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物が投与される対象哺乳動物は、ヒトなどの霊長類、チンパンジーまたはゴリラなどの類人猿、カニクイザルまたはマカクなどの猿、ラット、マウス、またはウサギなどの実験動物、犬、猫、馬などの伴侶動物、あるいは雌牛または去勢雄牛、羊、子羊、豚、ヤギ、ラマなどの食用動物であり得る。

【0165】

免疫原アジュバントとしてのハロゲン化キサンテン
ウイルス感染と闘うためのもう１つの一般的なアプローチが、抗ウイルスワクチンの使用である。これらの薬剤は伝統的に、感染症を介した生ウイルスへの曝露の前に、強度を減じたもしくは不活化されたウイルスまたはウイルス免疫原に患者の免疫系を曝露することに基づいている。この処置により、ウイルスへの曝露の際に向性組織の重篤な感染症を予防することのできる適応免疫応答を患者が生み出すことが可能になる。

【0166】

ウイルスゲノムの解明は、ウイルス構造（すなわち表面タンパク質）のモデル化に基づいて合成ワクチン開発を行うことを可能にし、新規の抗ウイルス戦略の同定または合成を導く［非特許文献５３］。特徴的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイク（Ｓ）糖タンパク質の構造の発表により、この種の集中的な開発にとって重要な標的が提示され［非特許文献５４］、現在使用されているワクチンの開発に繋がった。

【0167】

特に、ＲＢおよびそのＨＸ化合物類似体の糖タンパク質に対する極めて高い親和性により、ウイルスの向性細胞への結合を阻害すること、感染した細胞内でのウイルスのアンパッキングおよび複製を阻害すること、および免疫アジュバントとしてウイルスの免疫原性を高めることによってウイルス機能を無効にする可能性が、ウイルス表面の糖タンパク質構造と複合化する際に宿主免疫系に伝達される。高められた免疫原性は、広範囲の感染症の発症前に宿主の免疫応答を強めるべく、早期曝露の際に用いられ得る。

【0168】

アジュバント性に関するデータ
ローズベンガル二ナトリウムは悪性黒色腫および乳房のマウスモデルにおいて腫瘍特異的免疫を強化することが先に報告されている。ＲＢの病巣内注射後の腫瘍（悪性黒色腫）に対する強化された免疫がＤＣの活性化によるものであろうことも報告されている。本研究では、ＣＤ８媒介の免疫の強化におけるＲＢの役割をさらに調査するつもりであった。Ｂ型肝炎ウイルス感染症に関係するインビトロモデルを選択し、インターフェロンガンマＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いてＣＤ８Ｔ細胞の抗ウイルス活性に対するＲＢの効果を研究して、ＲＢのＩ型ＩＦＮ媒介アジュバント性の間接的な効果がもたらされた。

【0169】

方法
ＰＢＭＣが健康な提供者の血液から分離された。

【0170】

ＣＤ８細胞が、ＰＢＭＣから磁力により選別され、ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ＋ＩＬ－７中で培養された。

【0171】

残りの細胞は、ＤＣになるように誘導するべく、ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ＋ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４中で培養された。

【0172】

４～５日の培養後、ＤＣは、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）の様々な抗原領域を表すペプチドでパルスされた。本研究におけるペプチドは、これらのペプチドがＨＢＶに対抗するＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を増やす能力を持っていることを示す非特許文献５５の研究論文から選択された。

【0173】

ＤＣをペプチドで（一晩、約１８時間）パルスした後、パルスされたＤＣはＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ＋ＩＬ－２中で４～５日間、ＣＤ８細胞と共培養された。ＤＣ表面上の特定の抗原配列を認識するためのプライミング用のＤＣ：ＣＤ８細胞の比は１：１０であった。ローズベンガル（５～２０μＭ）が、ＤＣ－ＣＤ８の共培養の際にそれぞれのウェルに加えられた。

【0174】

適切なインキュベーション後、プライミングされたＣＤ８細胞は、ＩＦＮガンマＥＬＩｓｐｏｔプレート（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）においてＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ＋ＩＬ－７およびＩＬ－２中でＰＬＣ／ＰＲＦ５肝がん細胞と（１：１の比で）共培養され、一晩（約１８時間）インキュベーションされた。ＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞は、８日間の細胞培養後、細胞表面上にＨＢＶの蓄積によってＨＢＶ粒子を発現および分泌すると報告されている。

【0175】

結果
ＩＦＮガンマは、免疫細胞および標的組織に対する多様な、主に炎症誘発性の作用を有する、細胞媒介免疫の鍵となるモデレーターである。研究は、ＩＦＮガンマがＣＤ８Ｔ細胞の抗腫瘍効果および抗ウイルス効果を強化することを示した。

【0176】

ＥＬＩｓｐｏｔプレートは、翌日（約１８時間後）、製造業者によって提供されたプロトコルに従って処理され、生成されたスポットが正立顕微鏡を用いて撮影され、顕微鏡で観察され、手動で計数された。

【0177】

得られた画像は、３つ全てのペプチド条件のプライミングされたＣＤ８細胞が、ペプチドなしのコントロールと比較して、より多量のＩＦＮガンマを産生できたことを示している（図３）。

【0178】

結果は、ＣＤ８－ＤＣ共培養の際の５μＭのＲＢの処理が、３つ全てのペプチドに関して、ＩＦＮガンマ産生ＣＤ８細胞の数を有意に増加させることができたことを示している。ＩＦＮガンマスポットの数は濃度の高まりにつれて減少しているので（図３および４）、ＲＢの濃度を高めると細胞に対する悪影響があるようである。

【0179】

生成されたＩＦＮガンマスポットは、特定の抗原を認識するようにプライミングされたＣＤ８細胞間の特異的な相互作用の結果である。なぜなら、プライミングされたＣＤ８細胞のみが、これらの細胞にとってのチャレンジの不在を表すＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞なしで、ＥＬＩｓｐｏｔプレートでインキュベーションされた条件では、より少ない数のスポットが観察されるからである。これらの細胞は、標的細胞（図３のＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞）でチャレンジしたとき、より多量のＩＦＮガンマを生成することができた。５μＭのＰＶ－１０は、ＣＤ８細胞がその標的ＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞と共培養されるとき、ＣＤ８によってＩＦＮガンマのより高い産生を誘導するようである。

【0180】

前述の説明および例は、例示を目的としたものであり、限定として解釈されるべきではない。本発明の要旨および範囲内でさらに他の変更が可能であり、当業者にはそれらの変更が明らかであろう。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図1L】

【図1M】

【図1N】

【図1O】

【図1P】

【図1Q】

【図1R】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【手続補正書】

【提出日】2022-11-17

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物であって、薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散してワクチン有効量で存在する免疫原を、アジュバント有効量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸ化合物のアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸ化合物のアミド、前記ＨＸ化合物のＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸ化合物の芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体と、前記ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチン組成物の約０．００１重量％～約１０重量％と共に含有する、ワクチン組成物。

【請求項2】

前記芳香族誘導体は、ベンジルアルコールまたはベンジルアミン、フェニルアルコールまたはフェニルアミン、ピリジルアルコールまたはピリジルアミン、チエニルアルコールまたはチエニルアミン、フリルアルコールまたはフリルアミン、オキサゾリルアルコールまたはオキサゾリルアミン、チアゾリルアルコールまたはチアゾリルアミン、ナフチルアルコールまたはナフチルアミン、キノリルアルコールまたはキノリルアミン、キノキサリニルアルコールまたはキノキサリニルアミン、ベンゾフラニルアルコールまたはベンゾフラニルアミン、ベンゾ［ｂ］チエニルアルコールまたはベンゾ［ｂ］チエニルアミン、およびベンゾオキサジニルアルコールまたはベンゾオキサジニルアミンのうち１つ以上からなる群から選択されたアルコールまたは一置換アミンから形成されるエステルまたはアミドである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項3】

前記ワクチンは抗微生物ワクチンである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項4】

前記免疫原は、ａ）殺傷された微生物と、ｂ）生弱毒化微生物と、ｃ）１つ以上の免疫原性微生物タンパク質性配列と、ｄ）微生物サブユニット、組換え構造、多糖、または共役と、ｅ）トキソイドおよびウイルスベクターとからなる群から選択される、請求項３に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項5】

前記ワクチンは抗がんワクチンである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項6】

前記免疫原は、ａ）腫瘍アブレーション量のＨＣ化合物の投与により生じる免疫抗がん成分を含有する末梢血液、腫瘍組織、またはリンパ組織もしくはリンパ節組織のアリコート、またはｂ）このサブパラグラフａ）の前記アリコートをインビトロで培養して優先的に拡張することにより調製された濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物である、請求項５に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項7】

前記ＨＸはローズベンガル二ナトリウムである、請求項１に記載のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物。

【請求項8】

前記免疫原および前記ＨＸ化合物の量は、前記ＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物が調製されるときに、所定量の薬学的に許容される希釈剤に溶解または分散し次第、ＨＸ化合物をアジュバント添加した哺乳動物用ワクチンを提供するべく、ワクチン有効量の前記免疫原およびアジュバント有効量の前記ＨＸ化合物をそれぞれ提供するべく予め定められている、容器内に存在する請求項１のＨＸ化合物をアジュバント添加したワクチン組成物の濃縮プレワクチン組成物。

【請求項9】

前記免疫原および前記ＨＸ化合物はいずれも乾燥している、請求項８に記載の容器。

【請求項10】

前記ＨＸ化合物はローズベンガル二ナトリウムである、請求項８に記載の容器。

【請求項11】

薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散したワクチン有効量の所定の免疫原と約０．００１重量％～約１０重量％の１つ以上の添加剤とを含有する改良されたワクチン組成物であって、前記改良は、前記免疫原と共に前記薬学的に許容される希釈剤中にやはり溶解または分散した、アジュバント有効量の上述のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）化合物を含む、改良されたワクチン組成物。

【請求項12】

前記ＨＸ化合物はローズベンガル二ナトリウムである、請求項１１に記載の改良されたワクチン組成物。

【請求項13】

微生物感染症を呈する対象哺乳動物におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ＳＴＩＮＧ二量体化誘導量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸのアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸのアミド、前記ＨＸのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸの芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体を含む、医薬組成物。

【請求項14】

前記ＨＸはローズベンガル二ナトリウムである、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記哺乳動物はヒトである、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記Ｃ_１－Ｃ_４アルキルエステルはＣ_２エステルである、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記微生物感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、および単一細胞寄生虫感染症のうち１つ以上である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項18】

がん性腫瘍または悪性血液疾患を有する対象哺乳動物におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ＳＴＩＮＧ二量体化誘導量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸのアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸのアミド、前記ＨＸのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸの芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体を含み、全身投与される、医薬組成物。

【請求項19】

前記ＨＸ化合物はローズベンガル二ナトリウムである、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記対象哺乳動物はヒトである、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記Ｃ_１－Ｃ_４アルキルエステルはＣ_２エステルである、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項22】

哺乳動物の免疫原特異的免疫応答の強化に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、アジュバント有効量のハロゲン化キサンテン（ＨＸ）、薬学的に許容される塩、窒素原子が非置換である前記ＨＸのアミド、窒素原子が同一であるまたは異なるまたはアミド窒素原子と共に５員環もしくは６員環を形成する１つまたは２つのＣ_１－Ｃ_４アルキル基で置換されている前記ＨＸのアミド、前記ＨＸのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステル、前記ＨＸの芳香族誘導体であって独立して窒素、酸素、もしくは硫黄である０、１つ、もしくは２つのヘテロ環原子を含有する５員芳香環もしくは６員芳香環または５，６縮合芳香環系もしくは６，６縮合芳香環系を有するアルコールまたは一置換アミンから形成されたエステルまたはアミドである芳香族誘導体、および免疫原であってそれに対する免疫応答が強化されるべきものを含み、インビボで存在する哺乳動物細胞と接触させられる、医薬組成物。

【請求項23】

前記ハロゲン化キサンテンはローズベンガル二ナトリウムである、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記免疫原はウイルスタンパク質性ペプチド配列である、請求項２２に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】