▶ トランスレイト バイオ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20230614BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230614BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20230614BHJP
A61K 38/45 20060101ALN20230614BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61K9/127
A61K47/24
A61K47/26
A61K47/36
A61K47/10
A61K47/28
A61K47/44
A61K38/45
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022569038
(86)(22)【出願日】2021-05-14
(85)【翻訳文提出日】2023-01-06
(86)【国際出願番号】 US2021032513
(87)【国際公開番号】W WO2021231901
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】63/025,355
(32)【優先日】2020-05-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】517316797
【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】シュリラン・カルヴ
(72)【発明者】
【氏名】フランク・デロサ
(72)【発明者】
【氏名】ナタリア・ヴァルガス・モントヤ
(72)【発明者】
【氏名】アサド・カーンモハメド
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076DD51
4C076DD63
4C076DD67
4C076DD69
4C076DD70
4C076EE23
4C076EE30
4C084AA03
4C084BA44
4C084DC25
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA24
4C086NA10
(57)【要約】
本発明は、とりわけ、治療的使用におけるｍＲＮＡ送達のための、可燃性溶媒を使用しない、メッセンジャーＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入する方法、およびこれらの方法によって製造された組成物を提供する。本発明は、一部は、両親媒性ポリマーの存在下で、エタノール溶媒を使用しないで、ｍＲＮＡを高い効率で封入することができるという驚くべき発見に基づく。よって、本発明は、大規模製造プロセスから、ならびに治療用途のための低容量製剤においてＬＮＰ製剤を製造する安全で、費用対効果が高く、効率的な方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ溶液を（ｂ）１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む脂質溶液と混合する工程を含み、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は、両親媒性ポリマーの存在下で混合して、ＬＮＰ製剤溶液中でＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成することを含む、方法。
【請求項2】
両親媒性ポリマーは、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＰＥＧは、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＴＥＧ）、メトキシポリエチレングリコールｍＰＥＧ、テトラエチレングリコールモノメチルエーテル、ペンタエチレングリコールモノメチルエーテル、またはこれらの組合せから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＰＥＧはトリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＴＥＧ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は２５％体積／体積超の濃度のＰＥＧをもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約５０％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは６０％超の封入効率を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液はほぼ周囲温度である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
周囲温度は約３５℃未満、約３０℃未満、約２６℃未満、約２３℃未満、約２１℃未満、約２０℃未満、または約１８℃未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
周囲温度は約１８～３２℃、約２１～２６℃、または約２３～２５℃の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
ｍＲＮＡ溶液はトレハロースをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
混合工程の前にｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を加熱する工程を要さない、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液８Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液４Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．１２５ｍｇ／ｍＬ超、約０．２５ｍｇ／ｍＬ超、約０．５ｍｇ／ｍＬ超、または約１．０ｍｇ／ｍＬ超である、請求項１５に記載の方法。
【請求項20】
ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は２：１～６：１の間の比（ｖ／ｖ）で混合される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４：１の比（ｖ／ｖ）で混合される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ｍＲＮＡ溶液は３．０～５．０の間のｐＨを有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
ｍＲＮＡ溶液は約３．５、４．０、または４．５のｐＨを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
混合の工程は約３～１０ｍＬの間の総容量で行われる、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
混合の工程は約３ｍＬの総容量で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
アルコールを含まない、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程をさらに含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２１℃～６５℃の間の温度でインキュベートされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２６℃、約３０℃、または約６５℃の温度でインキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２０分間、約３０分間、約６０分間、約９０分間、または約１２０分間超インキュベートされる、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０分間インキュベートされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
脂質溶液はアルコールを含まない、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
脂質溶液は１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質をさらに含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰはタンジェンシャルフローフィルトレーションによって精製される、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、または４０ｎｍ未満の平均径を有する、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは４０～７０ｎｍの範囲の平均径を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
脂質ナノ粒子は約０．３未満、約０．２未満、約０．１８未満、約０．１５未満、約０．１未満のＰＤＩを有する、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超である、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは１～１０の間のＮ／Ｐ比を有する、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２～６の間のＮ／Ｐ比を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４のＮ／Ｐ比を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
ｍＲＮＡ ５ｇもしくはそれ以上、１０ｇもしくはそれ以上、２０ｇもしくはそれ以上、５０ｇもしくはそれ以上、１００ｇもしくはそれ以上、または１ｋｇもしくはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液はパルスレスフローポンプによって混合される、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
ポンプはギアポンプである、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
ポンプは遠心ポンプである、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
ｍＲＮＡ溶液は、約１５０～２５０ｍｌ／分、２５０～５００ｍｌ／分、５００～１０００ｍｌ／分、１０００～２０００ｍｌ／分、２０００～３０００ｍｌ／分、３０００～４０００ｍｌ／分、または４０００～５０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
ｍＲＮＡ溶液は、約８００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、または約１２０００ｍｌ／分の流量で混合される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
脂質溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
脂質溶液は、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分の流量で混合される、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より２倍、４倍、または６倍大きい、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
ｍＲＮＡは揮発性有機化合物を含まない方法で精製される、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
ｍＲＮＡはアルコールを含まない方法で精製される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
組成物であって、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法によって製造された脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む組成物。
【請求項54】
ｍＲＮＡ ５ｇもしくはそれ以上、１０ｇもしくはそれ以上、２０ｇもしくはそれ以上、５０ｇもしくはそれ以上、１００ｇもしくはそれ以上、または１ｋｇもしくはそれ以上を含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項55】
ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項56】
ｍＲＮＡは未修飾である、請求項５１または５２に記載の組成物。
【請求項57】
ｍＲＮＡは約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、８ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂまたは４０ｋｂ超である、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体を参照によって本明細書に組み入れる、２０２０年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２５，３５５号の利益および優先権を主張する。
本出願は、その開示全体を参照によって本明細書に組み入れる、２０２０年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２５，３５５号の利益および優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療は、様々な疾患を処置するためのますます重要なアプローチになっている。メッセンジャーＲＮＡ治療は、治療を必要とする患者の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するための、メッセンジャーＲＮＡの患者への投与を伴う。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物などの脂質に封入されたｍＲＮＡ製剤は、高程度の細胞取り込みおよびタンパク質発現を示す。脂質ナノ粒子製剤は、その後にｍＲＮＡ溶液と混合される脂質溶液用の溶媒としてエタノールを伝統的に使用する。
【0003】
しかしながら、エタノールなどの可燃性溶媒の使用は、安全上のリスクを高め、特に大規模用途において製造コストを増加させる。さらに、投薬により適しており、下流処理容量およびコストを減少させる低容量ＬＮＰ製剤はまた、溶媒としてエタノールを使用して得るのが現在困難である。低容量ＬＮＰ製剤はまた、他の投与経路、例えば、皮下または筋肉内を含むためのベッドサイド混合を可能にするので、望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
治療的使用における効率的な送達のための高いｍＲＮＡ封入効率を有する安定で、安全で、費用対効果が高いエタノールフリーＬＮＰ製剤が必要とされている。本発明は、とりわけ、治療用途におけるメッセンジャーＲＮＡ送達ための高い封入効率を有するＬＮＰをもたらす、可燃性溶媒を使用しない、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入する安定で、安全で、費用対効果が高い方法を提供する。一態様では、本発明は、大規模製造プロセスのためのより安全でより費用対効果が高い方法を提供する。別の態様では、本発明は、製造における下流処理を減少させるだけでなく、投薬ならびに皮下および筋肉内を含む複数の投与経路を容易にするベッドサイド混合にも適した低容量のＬＮＰ製剤を製造する方法を提供する。本発明は、両親媒性ポリマーの存在下でのｍＲＮＡ溶液と脂質溶液の混合により、ＬＮＰ製剤溶液中でＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）が形成されるという驚くべき発見に基づく。本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を含む組成物を製造する安全で、効率的で、費用対効果が高い方法を提供する。
【0005】
一態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ溶液を（ｂ）１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む脂質溶液と混合する工程を含み、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は、両親媒性ポリマーの存在下で混合して、ＬＮＰ製剤溶液中でＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、脂質溶液は３つの脂質成分を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は４つの脂質成分を含む。特定の実施形態では、脂質溶液の４つの脂質成分は、ＰＥＧ修飾脂質、カチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２またはＭＣ－３）、コレステロール、およびヘルパー（例えば、非カチオン性）脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）である。
【0006】
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの組合せを含む。したがって、一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはｐｌｕｒｏｎｉｃを含む。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリビニルピロリドンを含む。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールを含む。
【0007】
一部の実施形態では、ＰＥＧはトリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＴＥＧ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧはメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧはテトラエチレングリコールモノメチルエーテルである。一部の実施形態では、ＰＥＧはペンタエチレングリコールモノメチルエーテルである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、ｍＴＥＧ、ｍＰＥＧ、テトラエチレングリコールモノメチルエーテル、および／またはペンタエチレングリコールモノメチルエーテルの組合せである。
【0008】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は２５％体積／体積超の濃度のＰＥＧをもたらす。
【0009】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約５０％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約４５％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約４０％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約３５％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約３０％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約２５％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約２０％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約１５％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約１０％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約５％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する工程は約１％体積／体積の濃度のＰＥＧを含む。特定の実施形態では、ＰＥＧはｍＴＥＧである。ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤中のｍＴＥＧの特に適切な最終濃度は約５５～６５％体積／体積、例えば約５０％体積／体積である。実施例に示されるように、ｍＴＥＧのこの最終濃度は、ｍＲＮＡ溶解度および安定性を維持し、処理容量減少および大規模での製剤の容易な製造を可能にする。
【0010】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは６０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは７０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは８０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは９０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは９５％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは９９％超の封入効率を有する。
【0011】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液はほぼ周囲温度である。
【0012】
一部の実施形態では、周囲温度は約３５℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約３２℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約３０℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２８℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２６℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２５℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２４℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２３℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２２℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約１９℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約１８℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約１６℃未満である。
【0013】
一部の実施形態では、周囲温度は約１５～３５℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約１６～３２℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約１７～３０℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約１８～３０℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約１８～３２℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０～２８℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０～２６℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０～２５℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２３～２５℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１～２４℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１～２３℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１～２６℃の範囲である。
【0014】
一部の実施形態では、周囲温度は約１６℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約１８℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２２℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２３℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２４℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２５℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２６℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２７℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２８℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約３０℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約３１℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約３２℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約３５℃である。
【0015】
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）から選択される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はパルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はホスファチジルセリンである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はスフィンゴ脂質である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はセレブロシドである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はガングリオシドである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質は１６－Ｏ－モノメチルＰＥである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質は１６－Ｏ－ジメチルＰＥである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質は１８－１－トランスＰＥである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質はｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）である。
【0016】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液はトレハロースをさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は２０％トレハロースを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は１５％トレハロースを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は１０％トレハロースを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５％トレハロースを含む。
【0017】
一部の実施形態では、本方法は、混合工程の前にｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を加熱する工程を要さない。
【0018】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１０Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液８Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液６Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液４Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。
【0019】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．０５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．１２５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約１．０ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約１．５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約２．０ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの間である。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの間、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬまたは約０．３５ｍｇ／ｍＬである。
【0020】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は１：１～１０：１の間の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は２：１～６：１の間の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約２：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約３：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約５：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約６：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約２：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約３：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約５：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約６：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液（例えば、約１００％ ｍＴＥＧ脂質溶液）は１～８：１、例えば１～４：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液（例えば、約１００％ ｍＴＥＧ脂質溶液）は約１：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。実施例に示されるように、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液のこの比は、ｍＲＮＡ溶解度および安定性を維持し、処理容量減少および大規模での製剤の容易な製造を可能にする。
【0021】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は２．５～５．５の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は３．０～５．０の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は３．５～４．５の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約３．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約３．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約５．５のｐＨを有する。
【0022】
一部の実施形態では、混合の工程は約３～１０ｍＬの間の総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１～１０ｍＬの間の総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１～１５ｍＬの間の総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約２ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約３ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約４ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約５ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約６ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約７ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約８ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約９ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１０ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１２ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１３ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１４ｍＬの総容量で行われる。一部の実施形態では、混合の工程は約１５ｍＬの総容量で行われる。
【0023】
一部の実施形態では、本方法はアルコールを含まない。
【0024】
一部の実施形態では、本方法はｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は混合後にｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程をさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２１℃～６５℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２５℃～６０℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは３０℃～５５℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは３５℃～５０℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２６℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３１℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３２℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３５℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３６℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３８℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４２℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４５℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５５℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６５℃の温度でインキュベートされる。
【0025】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約７０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約８０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約９０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１００分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１２０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約７０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約８０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約９０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１００分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１２０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１５０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１８０分間インキュベートされる。
【0026】
一部の実施形態では、脂質溶液はアルコールを含まない。
【0027】
一部の実施形態では、脂質溶液は１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質をさらに含む。
【0028】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰはタンジェンシャルフローフィルトレーションによって精製される。
【0029】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２００ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは１５０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは１００ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは９５ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは９０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは８５ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは８０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは７５ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは７０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは６５ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは６０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは５５ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは５０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは４５ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは４０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは３５ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは３５ｎｍ～６５ｎｍの範囲の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは４０～７０ｎｍの範囲の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは４０ｎｍ～６０ｎｍの範囲の平均径を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは４５ｎｍ～５５ｎｍの範囲の平均径を有する。
【0030】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．３未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．２未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．１８未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．１５未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．１２未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．１０未満のＰＤＩを有する。
【0031】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約６０％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約６５％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約７０％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約７５％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約８０％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約８５％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約９０％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約９５％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約９６％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約９７％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約９８％超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約９９％超である。
【0032】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは１～１０の間のＮ／Ｐ比を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２～６の間のＮ／Ｐ比を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４のＮ／Ｐ比を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は１～１０の間のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は２～６の間のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約２のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約６のＮ／Ｐ比で混合される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４のＮ／Ｐ比で混合される。実施例に示されるように、このようなＮ／Ｐ比は治療的使用に適した径および封入効率のＬＮＰをもたらした。
【0033】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ３０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ４０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ７５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １００ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２００ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５００ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ７５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １ｋｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５ｋｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １０ｋｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。
【0034】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液はパルスレスフローポンプによって混合される。一部の実施形態では、ポンプはギアポンプである。一部の実施形態では、ポンプは遠心ポンプである。
【0035】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１５０～２５０ｍｌ／分、２５０～５００ｍｌ／分、５００～１０００ｍｌ／分、１０００～２０００ｍｌ／分、２０００～３０００ｍｌ／分、３０００～４０００ｍｌ／分、４０００～５０００ｍｌ／分、６０００～８０００ｍｌ／分、８０００～１００００ｍｌ／分または１００００～１２０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。
【0036】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１００ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、約２０００ｍｌ／分、約３０００ｍｌ／分、約４０００ｍｌ／分、約５０００ｍｌ／分、約６０００ｍｌ／分、約８０００ｍｌ／分、約１００００ｍｌ／分、約１２０００ｍｌ／分、または約１５０００ｍｌ／分の流量で混合される。
【0037】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約５００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約６００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約８００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１２００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１４００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１６００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１８００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２４００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約３０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約５０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約６０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約７０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約８０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約９０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１００００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１２０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１５０００ｍｌ／分の流れで混合される。
【0038】
一部の実施形態では、脂質溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、または約１５００ｍｌ／分の流量で混合される。
【0039】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量と同じである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より２倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より３倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より４倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より４．５倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より５倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より５．５倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より６倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より８倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より１０倍大きい。
【0040】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む組成物は本方法によって製造される。
【0041】
一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ２０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ２５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ５０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ７５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １００ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １２５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １５０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ２５０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ５００ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １ｋｇまたはそれ以上を含む。
【0042】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
【0043】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは未修飾である。
【0044】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約０．５ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約１ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約２ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約３ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約４ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約５ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約６ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約８ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約１０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約２０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約３０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約４０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約５０ｋｂ超である。
【0045】
一部の実施形態では、脂質溶液は４つの脂質成分を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、ＰＥＧ修飾脂質、カチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２またはＭＣ－３）、ヘルパー（例えば、非カチオン性）脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）、および場合によりコレステロールを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比は３５～５５：５～３５：２０～４０：１～１５である。特定の実施形態では、溶媒としてｍＴＥＧ（例えば、１００％ ｍＴＥＧ）を含む脂質溶液とｍＲＮＡの水溶液（例えば、クエン酸緩衝液）は１：１～４（例えば、約１：１）の容量比で混合され、ｍＲＮＡの最終濃度は約０．０５～０．５ｍｇ／ｍＬであり、ＬＮＰ中のカチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比は３５～５５：２５～３５：２０～４０：１～１５（例えば、約４０：３０：２５：５）であり、結果としてカチオン性脂質とｍＲＮＡのＮ／Ｐ比は約２～６（例えば、約４）である。実施例に示されるように、これらの製造は、適切なｍＲＮＡ－ＬＮＰ径および封入効率を確保するので、本発明の製剤に使用するのに特に適している。さらに、高い脂質およびｍＲＮＡ濃度を有するこのようなｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、処理容量を減少させ、それによって、製造における処理の容易さを増加させるのに有利である。
【0046】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少量の揮発性有機化合物を使用して、または揮発性有機化合物を使用しないで精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは揮発性有機化合物を含まない方法で精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはアルコールを含まない方法で精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはイソプロピルアルコールフリーの方法を使用して精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはベンジルアルコールフリーの方法を使用して精製される。
【0047】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは揮発性有機化合物を含まない方法で精製およびＬＮＰに封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはアルコールを含まない方法で精製およびＬＮＰに封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは揮発性有機化合物を含まない方法でＬＮＰに封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはアルコールを含まない方法でＬＮＰに封入される。
【0048】
本発明の他の機能、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲で明らかである。しかしながら、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示しているが、単なる例として与えられるものであって、限定として与えられるものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正が当業者に明らかになるだろう。
【0049】
以下の図面は例示目的のためのものにすぎず、限定のためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】エタノールフリー製剤（すなわち、ｍＴＥＧ）に封入された、またはエタノール含有製剤に封入されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ－ＬＮＰを投与されたマウスからの平均放射輝度ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒを示すグラフである。さらに、データはまた、高容量（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）または低容量（１：１脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）で製造された製剤から得られたデータを示す。
【図2】エタノールフリー製剤（すなわち、ｍＴＥＧ）に封入されたオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ） ｍＲＮＡ－ＬＮＰを投与されたマウスからの総タンパク質の総ＯＴＣ（ｎｇ／ｍｇ）を示すグラフである。データはまた、高容量（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）または低容量（１：１脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）で製造された製剤から得られたデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0051】
定義
本発明がより容易に理解されるようにするために、ある特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義は本明細書を通して示される。本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は参照によって本明細書に組み入れる。
本発明がより容易に理解されるようにするために、ある特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義は本明細書を通して示される。本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は参照によって本明細書に組み入れる。
【0052】
「またはそれ以上」、「少なくとも」、「超」などの用語、例えば「少なくとも１つ」は、それだけに限らないが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または言及される値超を含むと理解される。いずれのより大きな数またはその間の分数も含まれる。
【0053】
逆に、「以下」という用語は、言及される値未満の各値を含む。例えば、「１００ヌクレオチド以下」は、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、および０ヌクレオチドを含む。いずれのより小さな数またはその間の分数も含まれる。
【0054】
「複数」、「少なくとも２つ」、「２つまたはそれ以上」、「少なくとも第２の」などの用語は、それだけに限らないが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれ以上を含むと理解される。いずれのより大きな数またはその間の分数も含まれる。
【0055】
アミノ酸：本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、最も広義の意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸はｄ－アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸はｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般的に見られる２０種の標準ｌ－アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成的に製造されるか、天然の供給源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、それだけに限らないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換を含む化学修飾アミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ－および／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはその活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基による置換によって修飾される。アミノ酸はジスルフィド結合に参加することができる。アミノ酸は、１つまたはそれ以上の化学実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）との会合などの１つまたはそれ以上の翻訳後修飾を含むことができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指す。この用語が遊離アミノ酸を指すか、ペプチドの残基を指すかは、この用語が使用される文脈から明らかになる。
【0056】
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階のヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物は、それだけに限らないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫を含む。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、および／またはクローンである。
【0057】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、言及される参照値に類似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、言及される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、または０．００１％以内であることを指す。文脈から特に明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、「およそ」または「約」という用語によって修飾される。
【0058】
バッチ：本明細書で使用される場合、「バッチ」という用語は、例えば、同じ製造サイクル中に単一製造順序に従って精製される、一度に精製されるｍＲＮＡの含量または量を指す。バッチは、一反応で精製されるｍＲＮＡの量を指すことができる。
【0059】
生物学的に活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性」という句は、生物系において、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与されると、その生物に生物学的効果を及ぼす薬剤は生物学的に活性と考えられる。
【0060】
含む：本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、言及される要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の排除を意味するものではないと理解される。
【0061】
合わせる：本明細書で使用される場合、「合わせる」という用語は、混合するまたはブレンドすると互換的に使用される。合わせるは、別個の特性を有する離散的ＬＮＰ粒子を同じ溶液にまとめる、例えば、ｍＲＮＡ－ＬＮＰと空のＬＮＰを合わせて、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物を得ることを指す。一部の実施形態では、２つのＬＮＰを合わせることが、合わせられる成分の特定の比で実施される。一部の実施形態では、合わせることから得られた結果として生じる組成物は、その成分のいずれか一方または両方と異なる特性を有する。
【0062】
送達：本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、局所送達と全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて標的組織内に保持される状況（「局所分配」または「局所送達」とも呼ばれる）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、全身に分配され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分配」または「全身送達」とも呼ばれる）を包含する。一部の実施形態では、送達は、例えば噴霧を含む、肺送達である。
【0063】
ｄｓＲＮＡ：本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応中の相補的ＲＮＡ配列の産生を指す。相補的ＲＮＡ配列は、例えば、新生ＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズすることができる短い中断転写産物、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ非依存性ＲＮＡ転写のためのプライマーとして作用する短い中断転写産物、および考えられるＲＮＡポリメラーゼ鋳型反転を含む様々な理由のために産生される。
【0064】
効能：本明細書で使用される場合、「効能」という用語、または文法上同等物は、関連するタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡの送達に関連する、生物学的に関連するエンドポイントの改善を指す。
【0065】
封入：本明細書で使用される場合、「封入」という用語、またはその文法上同等物は、核酸分子をナノ粒子内に閉じ込めるプロセスを指す。
【0066】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡのポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）への翻訳、複数のポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のインタクトタンパク質（例えば、抗体）への組み立て、および／またはポリペプチドもしくは完全に組み立てられたタンパク質（例えば、抗体）の翻訳後修飾を指す。本出願において、「発現」および「産生」という用語、ならびに文法上同等物は互換的に使用される。
【0067】
機能的：本明細書で使用される場合、「機能的」生物学的分子は、それによって特徴付けられる特性および／または活性を示す形態の生物学的分子である。
【0068】
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」という用語、または文法上同等物は、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下の対照となる対象（または複数の対照となる対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照となる対象」は、処置される対象とほぼ同じ年齢の、処置される対象と同じ形態の疾患に罹患している対象である。
【0069】
不純物：本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、標的材料または化合物の化学組成とは異なる、限られた量の液体、気体、または固体内部の物質を指す。不純物は、「汚染物質」とも呼ばれる。
【0070】
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工的な環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養物等で起こるイベントを指す。
【0071】
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で起こるイベントを指す。細胞系の文脈においては、この用語は、生細胞内で起こるイベントを指すために使用される（例えば、インビトロ系と対照的に）。
【0072】
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）（天然および／または実験設定のいずれにせよ）最初に産生された際に会合していた成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって産生、製造、および／もしくは製作された、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超のこれらが最初に会合していた他の成分から分離される。一部の実施形態では、単離された薬剤が、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体のパーセント純度の計算は賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水等）を含むべきでない。
【0073】
リポソーム：本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、任意の層状、多層状、または固体ナノ粒子小胞を指す。典型的には、リポソームは、本明細書で使用される場合、１つもしくはそれ以上の脂質を混合することによって、または１つもしくはそれ以上の脂質とポリマーを混合することによって形成される。一部の実施形態では、本発明に適したリポソームは、カチオン性脂質および場合により非カチオン性脂質、場合によりコレステロール系脂質、および／または場合によりＰＥＧ修飾脂質を含有する。
【0074】
局所分配または送達：本明細書で使用される場合、「局所分配」、「局所送達」という用語、または文法上同等物は、組織特異的送達または分配を指す。典型的には、局所分配または送達は、ｍＲＮＡによってコードされるペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素）が、患者の循環系に入るのを回避する細胞内でまたは限られた分泌で翻訳および発現されることを要する。
【0075】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、本明細書で使用される場合、修飾ＲＮＡと未修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコード領域および非コード領域を含有する。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学的に合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、ｍＲＮＡは、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。ｍＲＮＡ配列は、特に指示しない限り、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、シュードウリジン、および５－メチルシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。
【0076】
ｍＲＮＡ完全性：本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ完全性」という用語は、一般的に、ｍＲＮＡの質を指す。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性は、精製プロセス後に分解されていないｍＲＮＡのパーセンテージを指す。ｍＲＮＡ完全性は、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動によって決定される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｅｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【0077】
Ｎ／Ｐ比：本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」という用語は、脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中の負に帯電した分子単位に対するその脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質中の正に帯電した分子単位のモル比を指す。よって、Ｎ／Ｐ比は、典型的には脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中のリン酸基のモルに対するその脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質中のアミン基のモルの比として計算される。例えば、ｍＲＮＡ １ｍｏｌ当たり４倍モル過剰のカチオン性脂質は約４の「Ｎ／Ｐ比」と呼ばれる。
【0078】
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、最も広義の意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる化合物および／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は本発明の範囲内にあると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重バージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＲＮＡはイントロンを含む。核酸は、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、核酸は、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に指示しない限り、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、本発明は、具体的には、送達を容易にするまたは達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「未修飾核酸」に関する。
【0079】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物を、例えば、実験、診断、予防、化粧、および／または治療目的で投与することができる任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳動物）が含まれる。一部の実施形態では、患者がヒトである。ヒトには、出生前および出生後形態が含まれる。
【0080】
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、信頼できる医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した物質を指す。
【0081】
薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１～１９において薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩には、適切な無機および有機酸ならびに塩基から誘導されるものが含まれる。薬学的に許容される、非毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸により、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸により、またはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。適切な塩基から誘導される塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１～４アルキル）４塩が含まれる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な場合、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、ならびにハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、サルフェート、ホスフェート、ニトレート、スルホネートおよびアリールスルホネートなどの対イオンを使用して形成されるアミンカチオンが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な求電子試薬、例えばハロゲン化アルキルを使用してアミンを四級化して、四級化アルキル化アミノ塩を形成することから形成される塩が含まれる。
【0082】
沈殿：本明細書で使用される場合、「沈殿」という用語（またはその任意の文法上同等物）は、溶液中での固体の形成を指す。ｍＲＮＡに関連して使用される場合、「沈殿」という用語は、液体中での不溶性または固体形態のｍＲＮＡの形成を指す。
【0083】
早期中断ＲＮＡ配列：「早期中断ＲＮＡ配列」、「短い中断ＲＮＡ種」、「ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）」、および「長い中断ＲＮＡ種」という用語は、本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ合成反応（例えば、インビトロ合成反応）の不完全な産物を指す。様々な理由のために、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鋳型の転写をいつも完了するとは限らない；例えば、ＲＮＡ合成が早期に終結する。ＲＮＡ合成の早期終結の考えられる原因としては、ＤＮＡ鋳型の質、鋳型中に存在する特定のポリメラーゼについてのポリメラーゼ終結配列、分解緩衝液、温度、リボヌクレオチドの枯渇、およびｍＲＮＡ二次構造が挙げられる。早期中断ＲＮＡ配列は、所望の転写産物の意図した長さより短い任意の長さである。例えば、早期中断ｍＲＮＡ配列は、１０００塩基未満、５００塩基未満、１００塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３０塩基未満、２０塩基未満、１５塩基未満、１０塩基未満またはそれ以下である。
【0084】
塩：本明細書で使用される場合、「塩」という用語は、酸と塩基との間の中和反応から生じるか、または生じることができるイオン性化合物を指す。
【0085】
全身分配または送達：本明細書で使用される場合、「全身分配」、「全身送達」という用語、または文法上同等物は、全身または生物全体に影響を及ぼす送達または分配の機序またはアプローチを指す。典型的には、全身分配または送達は、体の循環系、例えば血流を介して達成される。「局所分配または送達」の定義と比較されたい。
【0086】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。ヒトには、出生前および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は、疾患の診断または処置のために医療提供者にかかっているヒトを指す患者であることができる。「対象」という用語は、本明細書において、「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患することができるか、またはかかりやすいが、疾患または障害の症状を示していても、示していなくてもよい。
【0087】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全部または全部に近い程度または度合いを示す定量的状態を指す。生物分野の当業者であれば、生物および化学現象が、完了するおよび／または完了まで進行するまたは絶対的な結果を達成するもしくは回避することがあったとしてもまれであることを理解するだろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物および化学現象に固有の完全性の潜在的な欠如をとらえるために本明細書で使用される。
【0088】
実質的に含まない：本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、除去される物質（例えば、早期中断ＲＮＡ配列）が比較的わずかな量しかまたは全く存在しない状態を指す。例えば、「早期中断ＲＮＡ配列を実質的に含まない」は、早期中断ＲＮＡ配列がおよそ５％、４％、３％、２％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％未満またはそれ以下（ｗ／ｗ）の不純物のレベルで存在することを意味する。あるいは、「早期中断ＲＮＡ配列を実質的に含まない」は、早期中断ＲＮＡ配列が約１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、１０ｐｇ未満、またはそれ以下のレベルで存在することを意味する。
【0089】
標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、処置される疾患に罹患している任意の組織を指す。一部の実施形態では、標的組織は、疾患に関連する病態、症状、または機能を示す組織を含む。
【0090】
治療上有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療上有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたはかかりやすい対象に投与した場合に、疾患、障害、および／または状態の症状を処置する、診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。治療上有効量は、典型的には少なくとも１単位用量を含む投薬レジメンを介して投与されることが当業者によって認識されよう。
【0091】
処置すること：本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状または機能を部分的または完全に軽減する、改善する、緩和する、阻害する、予防する、その発症を遅延させる、その重症度を減少させる、および／またはその発生を減少させるために使用される任意の方法を指す。処置は、疾患に関連する病態を発症するリスクを減らす目的で、疾患の徴候を示していない、および／または疾患の早期徴候のみを示す対象に投与することができる。
【0092】
収率：本明細書で使用される場合、「収率」という用語は、出発物質としての全ｍＲＮＡと比較した封入後に回収されたｍＲＮＡのパーセンテージを指す。一部の実施形態では、「回収率」という用語が「収率」という用語と互換的に使用される。
【0093】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本出願が属する分野の当業者によって一般的に理解され、本出願が属する分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する；このような技術全体を参照によって組み入れる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【0094】
詳細な説明
本発明は、とりわけ、製剤にエタノールも他の可燃性の溶媒も使用しない、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む製剤のための方法および組成物を提供する。したがって、本開示は、治療的使用のための効率的なｍＲＮＡ送達のための高いｍＲＮＡ封入効率を有する安定で、安全で、費用対効果が高いエタノールフリーＬＮＰ製剤を作製および使用する方法を提供する。
本発明は、とりわけ、製剤にエタノールも他の可燃性の溶媒も使用しない、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む製剤のための方法および組成物を提供する。したがって、本開示は、治療的使用のための効率的なｍＲＮＡ送達のための高いｍＲＮＡ封入効率を有する安定で、安全で、費用対効果が高いエタノールフリーＬＮＰ製剤を作製および使用する方法を提供する。
【0095】
本発明の様々な態様を以下の節に詳細に説明する。節の使用は本発明を限定することを意図するものではない。各節を本発明の任意の態様に適用することができる。本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。
【0096】
ｍＲＮＡを封入したリポソーム（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）
本明細書に開示されるｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入する方法は、当技術分野で現在公知の様々な技術に適用することができる。様々な方法は、米国特許出願公開第２０１１／０２４４０２６号、米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号、米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号、米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号および２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，５９７号に記載されており、本発明を実施するために使用することができ、これらの全てを参照によって本明細書に組み入れる。ｍＲＮＡを封入する慣用的な方法は、方法Ａとしても知られる、米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号に記載される、脂質を脂質ナノ粒子に最初に事前形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合する工程を含む。あるいは、米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号に記載される、事前形成脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する別の方法は、方法Ｂとして知られている。
本明細書に開示されるｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入する方法は、当技術分野で現在公知の様々な技術に適用することができる。様々な方法は、米国特許出願公開第２０１１／０２４４０２６号、米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号、米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号、米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号および２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，５９７号に記載されており、本発明を実施するために使用することができ、これらの全てを参照によって本明細書に組み入れる。ｍＲＮＡを封入する慣用的な方法は、方法Ａとしても知られる、米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号に記載される、脂質を脂質ナノ粒子に最初に事前形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合する工程を含む。あるいは、米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号に記載される、事前形成脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する別の方法は、方法Ｂとして知られている。
【0097】
核酸を送達するために、高い封入効率を達成することが、原薬（例えば、ｍＲＮＡ）を保護し、インビボでの活性の喪失を減少させるために重要である。よって、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現およびその治療効果の増強はｍＲＮＡ封入効率と高度に相関している。
【0098】
方法Ａを使用して高い封入効率を達成するために、方法は、典型的には、１０ｍＭクエン酸緩衝液中溶液の１つまたはそれ以上を加熱するかまたはこれに熱を加えて、周囲温度より高い温度を達成するかまたはこれを維持することを含む。米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号に記載されるように、１つまたはそれ以上の溶液を加熱することにより、ｍＲＮＡ封入効率および回収率が増加する。さらに、方法Ａは、典型的には、ｍＲＮＡおよび／または脂質溶液中に緩衝剤として１０～１００ｍＭシトレートを含む。あるいは、ｍＲＮＡ溶液中低濃度のシトレート（すなわち、５ｍＭ以下）を使用することによって、混合前にｍＲＮＡおよび／または脂質溶液を加熱しない方法で、高い封入率を達成することができる。
【0099】
ｍＲＮＡ溶液
様々な方法を使用して本発明に適したｍＲＮＡ溶液を製造することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載される緩衝液に直接溶解することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する直前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは１．６ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは５．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１００ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度でｍＲＮＡを含有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの間の濃度で水中にｍＲＮＡを含有する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬまたは約０．３５ｍｇ／ｍＬの濃度で水中にｍＲＮＡを含有する。
様々な方法を使用して本発明に適したｍＲＮＡ溶液を製造することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載される緩衝液に直接溶解することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する直前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは１．６ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは５．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１００ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度でｍＲＮＡを含有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの間の濃度で水中にｍＲＮＡを含有する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬまたは約０．３５ｍｇ／ｍＬの濃度で水中にｍＲＮＡを含有する。
【0100】
典型的には、適切なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤および／または塩を含有することもできる。一般的に、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムを含むことができる。一部の実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲であることができる。一部の実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、２．０ｍＭ～４．０ｍＭの範囲であることができる。
【0101】
一部の実施形態では、緩衝液は約５ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約３ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約０．５ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約０．２５ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約０．１ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液はシトレートを含まない。
【0102】
例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムが含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の塩の適切な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲であることができる。適切なｍＲＮＡ溶液中の塩濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、もしくは１００ｍＭである、またはそれを超える。
【0103】
一部の実施形態では、緩衝液は約３００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１７５ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約７５ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約２５ｍＭ ＮａＣｌを含む。
【0104】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲のｐＨを有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．３、および６．５またはそれ以下のｐＨを有することができる。
【0105】
一部の実施形態は、緩衝液は約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．８のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．７のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．６のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．４のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．３のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．２のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．１のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．９のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．８のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．７のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．６のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．４のｐＨを有する。
【0106】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液はポンプを使用して緩衝液と混合される。例示的なポンプには、それだけに限らないが、パルスレスフローポンプ、ギアポンプ、蠕動ポンプおよび遠心ポンプが含まれる。
【0107】
典型的には、緩衝液は、ｍＲＮＡストック溶液の流量を超える流量で混合される。例えば、緩衝液は、ｍＲＮＡストック溶液の流量より少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍大きい流量で混合される。一部の実施形態では、緩衝液は、約１００～６０００ｍｌ／分（例えば、約１００～３００ｍｌ／分、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、４８００～６０００ｍｌ／分、または６０～４２０ｍｌ／分）の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、緩衝液は、約６０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、１４０ｍｌ／分、１８０ｍｌ／分、２２０ｍｌ／分、２６０ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、３４０ｍｌ／分、３８０ｍｌ／分、４２０ｍｌ／分、４８０ｍｌ／分、５４０ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、３６００ｍｌ／分、４８００ｍｌ／分、もしくは６０００ｍｌ／分またはそれを超える流量で混合される。
【0108】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～６００ｍｌ／分（例えば、約５～５０ｍｌ／分、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分）の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約５ｍｌ／分、１０ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、２０ｍｌ／分、２５ｍｌ／分、３０ｍｌ／分、３５ｍｌ／分、４０ｍｌ／分、４５ｍｌ／分、５０ｍｌ／分、６０ｍｌ／分、８０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、２００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、４００ｍｌ／分、５００ｍｌ／分、もしくは６００ｍｌ／分またはそれを超える流量で混合される。
【0109】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約２０ｍｌ／分、約４０ｍｌ／分、約６０ｍｌ／分、約８０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、または約６００ｍｌ／分の流量で混合される。
【0110】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は周囲温度である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２０～２５℃の温度である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２１～２３℃の温度である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は脂質溶液と混合する前に加熱されない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は周囲温度で維持される。
【0111】
脂質溶液
本発明によると、脂質溶液は、ｍＲＮＡを封入するための脂質ナノ粒子を形成するのに適した脂質の混合物を含有する。本発明によると、一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、エタノールも、イソプロパノールも、任意の他の可燃性有機溶媒も含有しない。
本発明によると、脂質溶液は、ｍＲＮＡを封入するための脂質ナノ粒子を形成するのに適した脂質の混合物を含有する。本発明によると、一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、エタノールも、イソプロパノールも、任意の他の可燃性有機溶媒も含有しない。
【0112】
適切な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。例えば、適切な脂質溶液は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、もしくは１００ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える総濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、約０．１～１００ｍｇ／ｍｌ、０．５～９０ｍｇ／ｍｌ、１．０～８０ｍｇ／ｍｌ、１．０～７０ｍｇ／ｍｌ、１．０～６０ｍｇ／ｍｌ、１．０～５０ｍｇ／ｍｌ、１．０～４０ｍｇ／ｍｌ、１．０～３０ｍｇ／ｍｌ、１．０～２０ｍｇ／ｍｌ、１．０～１５ｍｇ／ｍｌ、１．０～１０ｍｇ／ｍｌ、１．０～９ｍｇ／ｍｌ、１．０～８ｍｇ／ｍｌ、１．０～７ｍｇ／ｍｌ、１．０～６ｍｇ／ｍｌ、または１．０～５ｍｇ／ｍｌの範囲の総濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、最大約１００ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または１０ｍｇ／ｍｌの総濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。
【0113】
任意の所望の脂質を、ｍＲＮＡを封入するのに適した任意の比で混合することができる。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）、両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）および／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）および１つまたはそれ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。一部の実施形態では、脂質溶液は３つの脂質成分を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は４つの脂質成分を含む。特定の実施形態では、脂質溶液の３つまたは４つの脂質成分は、ＰＥＧ修飾脂質、カチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２またはＭＣ－３）、ヘルパー（例えば、非カチオン性）脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）、および場合によりコレステロールである。
【0114】
一部の実施形態では、脂質溶液は周囲温度である。一部の実施形態では、脂質溶液は約２０～２５℃の温度である。一部の実施形態では、脂質溶液は約２１～２３℃の温度である。一部の実施形態では、脂質溶液は脂質溶液と混合する前に加熱されない。一部の実施形態では、脂質溶液は周囲温度で維持される。
【0115】
ある特定の実施形態では、提供される組成物は、ｍＲＮＡがリポソームの両表面上に会合されており、同リポソーム内に封入されているリポソームを含む。例えば、本発明の組成物の製造中、カチオン性リポソームは、静電的相互作用を通してｍＲＮＡと会合することができる。
【0116】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法はリポソームに封入されたｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種は同じリポソームに封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種は異なるリポソームに封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、その脂質組成、脂質成分のモル比、径、電荷（ゼータ電位）、標的化リガンドおよび／またはこれらの組合せが異なる１つまたはそれ以上のリポソームに封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のリポソームは、ステロール系カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質および／またはこれらの組合せの異なる組成を有することができる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のリポソームは、リポソームを作製するために使用されるコレステロール系カチオン性脂質、中性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の異なるモル比を有することができる。
【0117】
封入方法
本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成する方法は、「ｍＲＮＡ封入」という用語またはその文法上同等物と互換的に使用される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ｍＲＮＡ溶液を脂質溶液と混合することによって形成され、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は混合する前に周囲温度で維持される。
本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成する方法は、「ｍＲＮＡ封入」という用語またはその文法上同等物と互換的に使用される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ｍＲＮＡ溶液を脂質溶液と混合することによって形成され、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は混合する前に周囲温度で維持される。
【0118】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入されるように、溶液に混合される。このような溶液は製剤または封入溶液とも呼ばれる。
【0119】
一部の実施形態では、例えば、本発明によるエタノールを含まないＬＮＰ製剤を、エタノールなどの溶媒を含む従来のエタノールＬＮＰ製剤または封入溶液と比較することができる。溶媒としてエタノールを使用した以前のＬＮＰ製剤では、製剤は約１０％～４０％容量でエタノールを含んでいた。他の以前のＬＮＰ製剤は、約１０％～約４０％容量で溶媒としてイソプロピルアルコールを使用した。対照的に、一部の実施形態では、本発明は、可燃性溶媒を含まないＬＮＰ封入方法を提供する。
【0120】
したがって、一部の実施形態では、本発明の適切な製剤または封入溶液は可燃性溶媒を含まない。一部の実施形態では、適切な製剤または封入溶液はエタノールを含まない。
【0121】
一部の実施形態では、適切な製剤または封入溶液は緩衝剤または塩も含有することができる。例示的な緩衝剤には、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムが含まれる。例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムが含まれる。
【0122】
一部の実施形態では、エタノール、クエン酸緩衝液、および他の不安定化剤はｍＲＮＡの添加中に存在せず、したがって、製剤はいずれのさらなる下流処理も要しない。一部の実施形態では、製剤溶液はトレハロースを含む。不安定化剤の欠如およびトレハロース溶液の安定性は、製剤の規模拡大およびｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の製造の容易さを増加させる。
【0123】
一部の実施形態では、脂質溶液は、１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ脂質を含有する。一部の実施形態では、脂質は１つまたはそれ以上のコレステロール脂質も含有する。
【0124】
一部の実施形態では、脂質溶液とｍＲＮＡ溶液はポンプシステムを使用して混合される。一部の実施形態では、ポンプシステムはパルスレスフローポンプを含む。一部の実施形態では、ポンプシステムはギアポンプである。一部の実施形態では、適切なポンプは臑動ポンプである。一部の実施形態では、適切なポンプは遠心ポンプである。一部の実施形態では、ポンプシステムを使用した方法は大規模で実施される。例えば、一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるポンプを使用して、ｍＲＮＡ少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、５０ｇ、もしくは１００ｇまたはそれ以上の溶液を脂質溶液と混合して、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを製造することを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する方法は、封入されたｍＲＮＡ少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、５０ｇ、もしくは１００ｇまたはそれ以上を含有する本発明による組成物を提供する。
【0125】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子が封入するｍＲＮＡを脂質溶液と合わせる工程はポンプシステムを使用して実施される。このような合わせる工程はポンプを使用して実施される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される。
【0126】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液を脂質溶液と混合する工程はポンプの非存在下で実施される。
【0127】
一部の実施形態では、本発明による方法は、脂質を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液および脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液の１つまたはそれ以上を周囲温度で維持する（すなわち、熱源からの熱を溶液に加えない）ことを含む。一部の実施形態では、本方法は、混合工程前に、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液の一方または両方を周囲温度で維持する工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、混合工程中に、脂質を含む溶液とｍＲＮＡを含む溶液の１つまたはそれ以上を周囲温度で維持することを含む。一部の実施形態では、本方法は、混合工程後に、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを周囲温度で維持する工程を含む。一部の実施形態では、溶液の１つまたはそれ以上を維持する周囲温度は、約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、もしくは１６℃またはそれ未満である。一部の実施形態では、溶液の１つまたはそれ以上を維持する周囲温度は、約１５～３５℃、約１５～３０℃、約１５～２５℃、約１５～２０℃、約２０～３５℃、約２５～３５℃、約３０～３５℃、約２０～３０℃、約２５～３０℃または約２０～２５℃の範囲である。一部の実施形態では、溶液の１つまたはそれ以上を維持する周囲温度は２０～２５℃である。
【0128】
一部の実施形態では、本発明による方法は、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合してｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を形成する工程を周囲温度で実施することを含む。
【0129】
一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超は、約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的に全ては、１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超は５０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的に全ては５０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超は８０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的に全ては８０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。
【0130】
一部の実施形態では、本発明による方法は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の封入率をもたらす。一部の実施形態では、本発明による方法は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超のｍＲＮＡの回収率をもたらす。
【0131】
一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率と同じである。
【0132】
一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＭＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも２％高い。一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも４％高い。一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも５％高い。一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも８％高い。一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも１０％高い。一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも１２％高い。一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも１５％高い。一部の実施形態では、本発明による製剤におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、エタノールＬＮＰ製剤と比較して少なくとも２０％高い。
【0133】
一部の実施形態では、本発明による方法は、混合後にｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程を含む。混合後にｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程は、２０１９年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８４７，８３７号に記載されており、本発明を実施するために使用することができ、その全てを参照によって本明細書に組み入れる。
【0134】
精製
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは精製および／または濃縮される。様々な精製方法を使用することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰはタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）法によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは重力式ノーマルフローフィルトレーション（ＮＦＦ）によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは任意の他の適切な濾過方法によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは遠心分離によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰはクロマトグラフィー法によって精製される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは精製および／または濃縮される。様々な精製方法を使用することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰはタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）法によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは重力式ノーマルフローフィルトレーション（ＮＦＦ）によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは任意の他の適切な濾過方法によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは遠心分離によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰはクロマトグラフィー法によって精製される。
【0135】
送達ビヒクル
本発明によると、本明細書に記載されるタンパク質またはペプチド（例えば、タンパク質またはペプチドの完全長、フラグメント、または一部）をコードするｍＲＮＡは、裸のＲＮＡ（非パッケージング）としてまたは送達ビヒクルを介して送達される。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「導入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語または文法上同等物は互換的に使用される。
本発明によると、本明細書に記載されるタンパク質またはペプチド（例えば、タンパク質またはペプチドの完全長、フラグメント、または一部）をコードするｍＲＮＡは、裸のＲＮＡ（非パッケージング）としてまたは送達ビヒクルを介して送達される。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「導入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語または文法上同等物は互換的に使用される。
【0136】
送達ビヒクルは、１つもしくはそれ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または適切な賦形剤と混合される薬理学的組成物に製剤化される。例えば、ｍＲＮＡを封入するリポソームは上記のように形成される。薬物を製剤化および投与するための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見られる。特定の送達ビヒクルは、標的細胞への核酸のトランスフェクションを容易にする能力に基づいて選択される。
【0137】
一部の実施形態では、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡは単一送達ビヒクルを介して送達される。一部の実施形態では、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡは、それぞれ異なる組成の１つまたはそれ以上の送達ビヒクルを介して送達される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡは同じ脂質ナノ粒子内に封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡは別々の脂質ナノ粒子内に封入される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は空である。
【0138】
様々な実施形態によると、適切な送達ビヒクルには、それだけに限らないが、ポリマー系担体、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然由来と合成由来の両方のエキソソーム、天然、合成および半合成ラメラ体、ナノ粒子、カルシウムケイ酸蛍光体ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ゾル－ゲル、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、マルチドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、ダイナミックポリコンジュゲート）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチドおよび他の方向性タグが含まれる。適切な導入ビヒクルとしてのバイオナノカプセルおよび他のウイルスカプシドタンパク質集合体の使用も企図される（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８年９月；１９（９）：８８７－９５）。
【0139】
リポソーム送達ビヒクル
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルはリポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、リポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子は、通常、１つまたはそれ以上の二重層の膜によって外側媒体から隔離された内部水空間を有する顕微鏡的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、典型的には空間的に分離された親水性ドメインおよび疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：３０７～３２１、１９９８）。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤によっても形成される（例えば、ポリマーソーム、ニオソーム等）。本発明の文脈において、リポソーム送達ビヒクルは、典型的には所望の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を標的細胞または組織に輸送するのに役立つ。一部の実施形態では、ナノ粒子送達ビヒクルはリポソームである。一部の実施形態では、リポソームは、１つもしくはそれ以上のカチオン性脂質、１つもしくはそれ以上の非カチオン性脂質、１つもしくはそれ以上のコレステロール系脂質、または１つもしくはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、リポソームは３つ以下の別個の脂質成分を含む。一部の実施形態では、１つの別個の脂質成分はステロール系カチオン性脂質である。
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルはリポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、リポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子は、通常、１つまたはそれ以上の二重層の膜によって外側媒体から隔離された内部水空間を有する顕微鏡的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、典型的には空間的に分離された親水性ドメインおよび疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：３０７～３２１、１９９８）。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤によっても形成される（例えば、ポリマーソーム、ニオソーム等）。本発明の文脈において、リポソーム送達ビヒクルは、典型的には所望の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を標的細胞または組織に輸送するのに役立つ。一部の実施形態では、ナノ粒子送達ビヒクルはリポソームである。一部の実施形態では、リポソームは、１つもしくはそれ以上のカチオン性脂質、１つもしくはそれ以上の非カチオン性脂質、１つもしくはそれ以上のコレステロール系脂質、または１つもしくはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、リポソームは３つ以下の別個の脂質成分を含む。一部の実施形態では、１つの別個の脂質成分はステロール系カチオン性脂質である。
【0140】
カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。
【0141】
本発明の組成物および方法に使用するのに適したカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１０／１４４７４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化1】
【0142】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１３／１４９１４０号に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
の１つのカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、Ｒ１およびＲ２は、水素、場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ１～Ｃ２０アルキルおよび場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ６～Ｃ２０アシルからなる群からそれぞれ独立に選択され；Ｌ１およびＬ２は、水素、場合により置換されたＣ１～Ｃ３０アルキル、場合により置換された、可変的に不飽和のＣ１～Ｃ３０アルケニル、および場合により置換されたＣ１～Ｃ３０アルキニルからなる群からそれぞれ独立に選択され；ｍおよびｏは０および任意の正の整数からなる群からそれぞれ独立に選択され（例えば、ｍは３である）；ｎは０または任意の正の整数である（例えば、ｎは１である））を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００１」）およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【0143】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１０／０５３５７２号にアミノアルコールリピドイドとして記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化6】
【0144】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１６／１１８７２５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化7】
【0145】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１６／１１８７２４号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化8】
【0146】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩が含まれる。
【0147】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、その各々を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１３／０６３４６８号および国際公開第２０１６／２０５６９１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、ＲＬの各例は独立に、場合により置換されたＣ６～Ｃ４０アルケニルである）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【0148】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１５／１８４２５６号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、各Ｘは独立に、ＯまたはＳであり；各Ｙは独立に、ＯまたはＳであり；各ｍは独立に、０～２０であり；各ｎは独立に、１～６であり；各ＲＡは独立に、水素、場合により置換されたＣ１～５０アルキル、場合により置換されたＣ２～５０アルケニル、場合により置換されたＣ２～５０アルキニル、場合により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、場合により置換された３～１４員ヘテロシクリル、場合により置換されたＣ６～１４アリール、場合により置換された５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンであり；各ＲＢは独立に、水素、場合により置換されたＣ１～５０アルキル、場合により置換されたＣ２～５０アルケニル、場合により置換されたＣ２～５０アルキニル、場合により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、場合により置換された３～１４員ヘテロシクリル、場合により置換されたＣ６～１４アリール、場合により置換された５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンである）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「標的２３」およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化14】
【化15】
【0149】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１６／００４２０２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。
【化16】
【化17】
【化18】
【0150】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、米国仮特許出願第６２／７５８，１７９号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、各Ｒ１およびＲ２は独立に、ＨまたはＣ１～Ｃ６脂肪族であり；各ｍは独立に、１～４の値を有する整数であり；各Ａは独立に、共有結合またはアリーレンであり；各Ｌ１は独立に、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり；各Ｌ２は独立に、Ｃ２～Ｃ１０脂肪族であり；各Ｘ１は独立に、ＨまたはＯＨであり；各Ｒ３は独立に、Ｃ６～Ｃ２０脂肪族である）を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【0151】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ、Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ、Ｃｅｌｌ ２０１０、１４１、２１０～２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化23】
【0152】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１５／１９９９５２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【化34】
【化35】
【化36】
【0153】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／００４１４３号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化37】
【化38】
【化39】
【化40】
【化41】
【化42】
【化43】
【化44】
【化45】
【化46】
【化47】
【化48】
【化49】
【化50】
【化51】
【化52】
【化53】
【0154】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／０７５５３１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、Ｌ１またはＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり；Ｌ１またはＬ２の他方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；Ｇ１およびＧ２はそれぞれ独立に、非置換Ｃ１～Ｃ１２アルキレンまたはＣ１～Ｃ１２アルケニレンであり；Ｇ３はＣ１～Ｃ２４アルキレン、Ｃ１～Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルケニレンであり；ＲａはＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６～Ｃ２４アルキルまたはＣ６～Ｃ２４アルケニルであり；Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；Ｒ４はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒ５はＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり；ｘは０、１または２である）を含む。
【化54】
【0155】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／１１７５２８号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化55】
【化56】
【化57】
【0156】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／０４９２４５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式：
の１つの化合物およびその薬学的に許容される塩を含む。これらの４つの式のいずれか１つについて、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから独立に選択され；Ｑは－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され；ｎは１、２、または３である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化58】
【化59】
【化60】
【化61】
【化62】
【0157】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、その各々を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／１７３０５４号および国際公開第２０１５／０９５３４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化63】
【化64】
【化65】
【化66】
【0158】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１２／１７０８８９号に記載される切断可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
のカチオン性脂質
（式中、Ｒ１はイミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、場合により置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され；Ｒ２は以下の２つの式：
の１つからなる群から選択され、Ｒ３およびＲ４は、場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ６～Ｃ２０アルキルおよび場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ６～Ｃ２０アシルからなる群からそれぞれ独立に選択され；ｎは０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００１」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００２」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００３」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００４」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、カチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化67】
（式中、Ｒ１はイミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、場合により置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され；Ｒ２は以下の２つの式：
【化68】
【化69】
【化70】
【化71】
【化72】
【化73】
【0159】
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２５２２号に記載され、参照によって本明細書に組み入れる、切断可能なカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２５２２号に記載される一般式のいずれかまたは構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）および（２２）～（２３７）のいずれかであるカチオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質
（式中、
ＲＸは独立に、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、または－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり；
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の各々は独立に、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４ＡおよびＬ５Ａは独立に、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４ＢおよびＬ５Ｂは独立に、Ｃ１～Ｃ２０アルキレン；Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン；またはＣ２～Ｃ２０アルキニレンであり；
各ＢおよびＢ’はＮＲ４Ｒ５または５～１０員窒素含有ヘテロアリールであり；
各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、Ｃ６～Ｃ３０アルキル、Ｃ６～Ｃ３０アルケニル、またはＣ６～Ｃ３０アルキニルであり；
各Ｒ４およびＲ５は独立に、水素、Ｃ１～Ｃ１０アルキル；Ｃ２～Ｃ１０アルケニル；またはＣ２～Ｃ１０アルキニルであり；
各ＲＬは独立に、水素、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ２～Ｃ２０アルケニル、またはＣ２～Ｃ２０アルキニルである）
を含む。
【化74】
ＲＸは独立に、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、または－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり；
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の各々は独立に、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４ＡおよびＬ５Ａは独立に、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４ＢおよびＬ５Ｂは独立に、Ｃ１～Ｃ２０アルキレン；Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン；またはＣ２～Ｃ２０アルキニレンであり；
各ＢおよびＢ’はＮＲ４Ｒ５または５～１０員窒素含有ヘテロアリールであり；
各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、Ｃ６～Ｃ３０アルキル、Ｃ６～Ｃ３０アルケニル、またはＣ６～Ｃ３０アルキニルであり；
各Ｒ４およびＲ５は独立に、水素、Ｃ１～Ｃ１０アルキル；Ｃ２～Ｃ１０アルケニル；またはＣ２～Ｃ１０アルキニルであり；
各ＲＬは独立に、水素、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ２～Ｃ２０アルケニル、またはＣ２～Ｃ２０アルキニルである）
を含む。
【0160】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
の化合物構造を有する、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２５２２の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む。
【化75】
【0161】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む（参照によって本明細書に組み入れる、Ｆｅｉｇｎｅｒら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法に適した他のカチオン性脂質には、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（「ＤＯＧＳ」）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６、６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が含まれる。
【0162】
本発明の組成物および方法に適した追加の例示的なカチオン性脂質には、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）；１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）；１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）；Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３－ジリノレオイルオキシ－Ν，Ν－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）；２－（（８－［（３Ｐ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，ｆｓｌ－ｄｉｍｅｔｈｙｈ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）；および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）（参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２～１７６（２０１０）参照）が含まれる（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６～２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３～１００７（２００５）；国際公開第２００５／１２１３４８号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質の１つまたはそれ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分の少なくとも１つを含む。
【0163】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質には、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）および／または４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）が含まれる。
【0164】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、重量によって測定される、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、ｍｏｌ％として測定される、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、重量によって測定される、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。
【0165】
非カチオン性／ヘルパー脂質
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有する。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という句は、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質には、それだけに限らないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が含まれる。
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有する。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という句は、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質には、それだけに限らないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が含まれる。
【0166】
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は中性脂質、すなわち、組成物が製剤化および／または投与される条件で正味の電荷を有さない脂質である。
【0167】
一部の実施形態では、このような非カチオン性脂質は単独で使用されるが、好ましくは他の脂質、例えばカチオン性脂質と組み合わせて使用される。
【0168】
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％のモル比（ｍｏｌ％）で存在することができる。一部の実施形態では、全非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％のモル比（ｍｏｌ％）で存在することができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％超、約１０ｍｏｌ％超、約２０ｍｏｌ％超、約３０ｍｏｌ％超、または約４０ｍｏｌ％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％超、約１０ｍｏｌ％超、約２０ｍｏｌ％超、約３０ｍｏｌ％超、または約４０ｍｏｌ％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％以下、約１０ｍｏｌ％以下、約２０ｍｏｌ％以下、約３０ｍｏｌ％以下、または約４０ｍｏｌ％以下である。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％以下、約１０ｍｏｌ％以下、約２０ｍｏｌ％以下、約３０ｍｏｌ％以下、または約４０ｍｏｌ％以下であることができる。
【0169】
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％の重量比（重量％）で存在することができる。一部の実施形態では、全非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％の重量比（重量％）で存在することができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％超、約１０重量％超、約２０重量％超、約３０重量％超、または約４０重量％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％超、約１０重量％超、約２０重量％超、約３０重量％超、または約４０重量％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％以下、約１０重量％以下、約２０重量％以下、約３０重量％以下、または約４０重量％以下である。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％以下、約１０重量％以下、約２０重量％以下、約３０重量％以下、または約４０重量％以下であることができる。
【0170】
コレステロール系脂質
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、適切なコレステロール系カチオン性脂質には、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９、２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆら ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、または以下の構造
を有するイミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）が含まれる。
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、適切なコレステロール系カチオン性脂質には、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９、２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆら ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、または以下の構造
【化76】
【0171】
一部の実施形態では、コレステロール系脂質はコレステロールである。
【0172】
一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約１％～約３０％、または約５％～約２０％のモル比（ｍｏｌ％）を構成することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％超、約１０ｍｏｌ％超、約２０ｍｏｌ％超、約３０ｍｏｌ％超、または約４０ｍｏｌ％超であることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％以下、約１０ｍｏｌ％以下、約２０ｍｏｌ％以下、約３０ｍｏｌ％以下、または約４０ｍｏｌ％以下であることができる。
【0173】
一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約１％～約３０％、または約５％～約２０％の重量比（重量％）で存在することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５重量％超、約１０重量％超、約２０重量％超、約３０重量％超、または約４０重量％超であることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５重量％以下、約１０重量％以下、約２０重量％以下、約３０重量％以下、または約４０重量％以下であることができる。
【0174】
ＰＥＧ修飾脂質
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上のＰＥＧ化脂質を含む。
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上のＰＥＧ化脂質を含む。
【0175】
例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む、誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および誘導体化脂質の使用も、単独でまたは好ましくは導入ビヒクルを含む他の脂質製剤と組み合わせて（例えば、脂質ナノ粒子）、本発明によって企図される。
【0176】
企図されるＰＥＧ修飾脂質には、それだけに限らないが、Ｃ６～Ｃ２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａ長のポリエチレングリコール鎖が含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質はＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。このような成分の添加は複雑な凝集を防ぎ、循環寿命を増加させ、脂質－核酸組成物の標的組織への送達を増加させる手段を提供することもできる（Ｋｌｉｂａｎｏｖら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２６８（１）：２３５～２３７）、またはこれらはインビボで製剤から迅速に交換するよう選択される（米国特許第５，８８５，６１３号参照）。特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。
【0177】
本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム導入ビヒクル中に存在する全脂質の約０％～約２０％、約０．５％～約２０％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、または約２％のモル比を構成することができる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で全脂質の約４％を構成する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で全脂質の約５％を構成する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で全脂質の約６％を構成する。
【0178】
両親媒性ブロックコポリマー
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含有する。様々な両親媒性ブロックコポリマーを使用して本発明を実施することができる。一部の実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは界面活性剤または非イオン性界面活性剤とも呼ばれる。一部の実施形態では、本発明に適した両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含有する。様々な両親媒性ブロックコポリマーを使用して本発明を実施することができる。一部の実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは界面活性剤または非イオン性界面活性剤とも呼ばれる。一部の実施形態では、本発明に適した両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
【0179】
ポロキサマー
一部の実施形態では、適切な両親媒性ポリマーはポロキサマーである。例えば、適切なポロキサマーは以下の構造：
（式中、ａは１０～１５０の間の整数であり、ｂは２０～６０の間の整数である）
のものである。例えば、ａは約１２であり、ｂは約２０である、またはａは約８０であり、ｂは約２７である、またはａは約６４であり、ｂは約３７である、またはａは約１４１であり、ｂは約４４である、またはａは約１０１であり、ｂは約５６である。
一部の実施形態では、適切な両親媒性ポリマーはポロキサマーである。例えば、適切なポロキサマーは以下の構造：
【化77】
のものである。例えば、ａは約１２であり、ｂは約２０である、またはａは約８０であり、ｂは約２７である、またはａは約６４であり、ｂは約３７である、またはａは約１４１であり、ｂは約４４である、またはａは約１０１であり、ｂは約５６である。
【0180】
一部の実施形態では、本発明に適したポロキサマーは、約１０～約１５０のエチレンオキシド単位を有する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１０～約１００のエチレンオキシド単位を有する。
【0181】
一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー８４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１０１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１０５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１０８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１２２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１２３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１２４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２１２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２１５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２１７である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３７である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２８２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２８４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２８８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３０４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０７である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはその組合せである。
【0182】
一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約４，０００ｇ／ｍｏｌ～約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約１，０００ｇ／ｍｏｌ～約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約１，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約２，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約３，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約４，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約５，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約６，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約７，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約８，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約９，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約２５，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約３０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約４０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。
【0183】
他の両親媒性ポリマー
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポロキサミン、例えばｔｅｔｒｏｎｉｃ ３０４またはｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０４である。
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポロキサミン、例えばｔｅｔｒｏｎｉｃ ３０４またはｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０４である。
【0184】
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、例えば３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰである。
【0185】
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポリソルベート、ソルビタン、およびこれらの誘導体である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリソルベート、例えばＰＳ２０である。
【0186】
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポロキサマー、ポリソルベート、ソルビタン、またはこれらの誘導体である。
【0187】
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールエーテルである。一部の実施形態では、適切なポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体
（式中、
ｔは１～１００の間の整数であり：
Ｒ１ＢＲＩＪは独立に、Ｃ１０～４０アルキル、Ｃ１０～４０アルケニル、またはＣ１０～４０アルキニルであり；場合によりＲ５ＰＥＧの１つまたはそれ以上のメチレン基は、Ｃ３～１０カルボシクリレン、４～１０員ヘテロシクリレン、Ｃ６～１０アリーレン、４～１０員ヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－ －Ｃ（Ｏ）Ｓ－ －ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲ）Ｎ（Ｒ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－ －ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）２－ －Ｓ（Ｏ）２Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－ －Ｓ（Ｏ）２－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－ －Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－ －ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で独立に置き換えられており；
ＲＮの各例は独立に、水素、Ｃ１～６アルキル、または窒素保護基である）
である。
【化78】
（式中、
ｔは１～１００の間の整数であり：
Ｒ１ＢＲＩＪは独立に、Ｃ１０～４０アルキル、Ｃ１０～４０アルケニル、またはＣ１０～４０アルキニルであり；場合によりＲ５ＰＥＧの１つまたはそれ以上のメチレン基は、Ｃ３～１０カルボシクリレン、４～１０員ヘテロシクリレン、Ｃ６～１０アリーレン、４～１０員ヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－ －Ｃ（Ｏ）Ｓ－ －ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲ）Ｎ（Ｒ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－ －ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）２－ －Ｓ（Ｏ）２Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－ －Ｓ（Ｏ）２－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－ －Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－ －ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で独立に置き換えられており；
ＲＮの各例は独立に、水素、Ｃ１～６アルキル、または窒素保護基である）
である。
【0188】
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪはＣはアルキルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉａ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体（式中、ｓは１～１００の間の整数である）である。
【化79】
【0189】
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪはＣはアルケニルである。例えば、適切なポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉｂ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体（式中、ｓは１～１００の間の整数である）である。
【化80】
【0190】
典型的には、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の量で製剤中に存在する。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣより約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％低い量で混合物中に存在する。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣより約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％低い量で混合物中に存在する。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣより約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％低い量で混合物中に存在する。
【0191】
一部の実施形態では、製剤中に存在する両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の元の量の約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％未満は除去時に残る。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の残留量は除去時に製剤中に残る。本明細書で使用される場合、残留量は、組成物中の物質（本明細書に記載される両親媒性ポリマー、例えばポロキサマー）の実質的に全部を除去した後に残っている量を意味する。残留量は、公知の技術を使用して定性的または定量的に検出可能である。残留量は、公知の技術を使用して検出可能でない場合もある。
【0192】
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは３％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは２．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは２％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは１．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは０．５％未満（例えば、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％未満）の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは残留量の両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。本明細書で使用される場合、残留量は、組成物中の物質（本明細書に記載される両親媒性ポリマー、例えばポロキサマー）の実質的に全部を除去した後に残っている量を意味する。残留量は、公知の技術を使用して定性的または定量的に検出可能である。残留量は、公知の技術を使用して検出可能でない場合もある。
【0193】
ポリマー
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは、担体としてのポリマーを単独で、または本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて使用して製剤化される。よって、一部の実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、本明細書で使用される場合、ポリマーを含むナノ粒子も包含する。適切なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれる。ＰＥＩが存在する場合、これは１０～４０ｋＤａの範囲の分子量の分枝ＰＥＩ、例えば２５ｋＤａ分枝ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ 番号４０８７２７）であることができる。
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは、担体としてのポリマーを単独で、または本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて使用して製剤化される。よって、一部の実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、本明細書で使用される場合、ポリマーを含むナノ粒子も包含する。適切なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれる。ＰＥＩが存在する場合、これは１０～４０ｋＤａの範囲の分子量の分枝ＰＥＩ、例えば２５ｋＤａ分枝ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ 番号４０８７２７）であることができる。
【0194】
様々な実施形態によると、脂質ナノ粒子を構成するカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、コレステロール系脂質、および／または両親媒性ブロックコポリマーの選択、ならびにこのような成分（脂質）の互いに対する相対モル比は、選択される脂質の特徴、意図した標的細胞の性質、送達される核酸の特徴に基づく。追加の考慮事項には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択される脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性および忍容性が含まれる。よって、それに応じてモル比を調整することができる。
【0195】
エタノールフリーＬＮＰ製剤における両親媒性ポリマーの使用
一部の実施形態では、本明細書の方法に使用される両親媒性ポリマーは、１つまたはそれ以上のｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、以下の１つまたはそれ以上から選択される：ＰＥＧトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００、またはこれらの組合せ。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはトリエチレングリコールである。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはテトラエチレングリコールである。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ２００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ４００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ６００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ１，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ１，５００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ２，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３，３５０である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ４，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ６，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ８，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ１０，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ２０，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３５，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ４０，０００である。
一部の実施形態では、本明細書の方法に使用される両親媒性ポリマーは、１つまたはそれ以上のｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、以下の１つまたはそれ以上から選択される：ＰＥＧトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００、またはこれらの組合せ。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはトリエチレングリコールである。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはテトラエチレングリコールである。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ２００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ４００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ６００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ１，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ１，５００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ２，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３，３５０である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ４，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ６，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ８，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ１０，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ２０，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ３５，０００である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧ４０，０００である。
【0196】
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、２つまたはそれ以上の種類の分子量のＰＥＧポリマーの混合物を含む。例えば、一部の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種の分子量のＰＥＧポリマーが両親媒性ポリマーを構成する。したがって、一部の実施形態では、ＰＥＧ溶液は１つまたはそれ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧポリマーの混合物は、別個の分子量を有するポリマーを含む。
【0197】
一部の実施形態では、脂質溶液は１つまたはそれ以上の両親媒性ポリマーを含む。一部の実施形態では、脂質溶液中の溶媒はＰＥＧポリマーを含む。様々な種類のＰＥＧポリマーが当技術分野で認識されており、そのうちの一部は別個の幾何学的構成を有する。本明細書の方法に適したＰＥＧポリマーには、例えば、直鎖、分枝、Ｙ状、またはマルチアーム構成を有するＰＥＧポリマーが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧは、別個の幾何学的構成の１つまたはそれ以上のＰＥＧを含む懸濁液中にある。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＰＥＧ－６０００を使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＰＥＧ－４００を使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてトリエチレングリコール（ＴＥＧ）を使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてトリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＴＥＧ）を使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてｔｅｒｔ－ブチル－ＴＥＧ－Ｏ－プロピオネートを使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＴＥＧ－ジメタクリレートを使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＴＥＧ－ジメチルエーテルを使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＴＥＧ－ジビニルエーテルを使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＴＥＧ－モノブチルエーテルを使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＴＥＧ－メチルエーテルメタクリレートを使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＴＥＧ－モノデシルエーテルを使用して達成される。一部の実施形態では、脂質溶液は、溶媒としてＴＥＧ－ジベンゾエートを使用して達成される。これらのＰＥＧまたはＴＥＧ系試薬のいずれか１つを、ＬＮＰ製剤中のｍＲＮＡ溶液と混合される脂質溶液の溶媒として使用することができる。これらの試薬の各々の構造を表１において以下に示す。
【0198】
【表1】
【0199】
一部の実施形態では、脂質溶液はＰＥＧポリマー溶媒を含み、ＰＥＧポリマーはＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＤＯＰＡ－ＰＥＧコンジュゲートである。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はポロキサマー－ＰＥＧコンジュゲートである。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＤＯＴＡＰを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はコレステロールを含む。
【0200】
一部の実施形態では、脂質溶液は両親媒性ポリマーを含む。一部の実施形態では、脂質溶液は上記ＰＥＧ試薬のいずれかを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０％～約１００％重量／体積濃度で懸濁液中にある。例えば、一部の実施形態では、ＰＥＧは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％重量／体積濃度、およびその間の任意の値で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約６％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約７％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約８％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約９％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１２％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１５％重量／体積で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１８％重量／体積で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約６０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約６５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約７０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約７５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約８０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約８５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約９０％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約９５％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１００％重量／体積濃度で懸濁液中に存在する。
【0201】
一部の実施形態では、製剤は、約０．１～約５．０のＰＥＧの総ｍＲＮＡ懸濁液容量に対する体積：体積比を含む。例えば、一部の実施形態では、ＰＥＧは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０の体積：体積比で製剤中に存在する。したがって、一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．１の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．２の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．３の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．４の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．６の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．７の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．８の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約０．９の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１．０の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１．２５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１．５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１．７５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２．０の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２．２５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２．５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２．７５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３．０の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３．２５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３．５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３．７５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４．０の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４．２５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４．５０の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４．７５の体積：体積比で製剤中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５．０の体積：体積比で製剤中に存在する。
【0202】
特定の実施形態では、ＰＥＧはｍＴＥＧ（例えば、約１００％または純粋なｍＴＥＧ）である。特定の実施形態では、脂質溶液は約１００％ ｍＴＥＧ－脂質である。ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤中のｍＴＥＧの特に適切な最終濃度は約５５～６５％重量／体積、例えば約５０％重量／体積である。実施例に示されるように、この濃度はｍＲＮＡ溶解度および安定性を維持し、処理容量減少および大規模での製剤の容易な製造を可能にする。
【0203】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液（例えば、約１００％ ｍＴＥＧ－脂質溶液）は１～８：１、例えば１～４：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液（例えば、約１００％ ｍＴＥＧ－脂質溶液）は約１：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。実施例に示されるように、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液のこの比はｍＲＮＡ溶解度および安定性を維持し、処理容量減少および大規模での製剤の容易な製造を可能にする。
【0204】
一部の実施形態では、製剤はアルコールフリーである。一部の実施形態では、製剤は、いずれの非水性溶媒（例えば、アルコール）も使用しないで製造される。一部の実施形態では、溶媒は可燃性薬剤を含まない。一部の実施形態では、溶媒はエタノールを含まない。一部の実施形態では、溶媒は、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、エタノール、メタノール、デナトニウム、およびこれらの組合せを含まない。一部の実施形態では、溶媒はアルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）を含まない。一部の実施形態では、溶媒はケトン溶媒（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、またはメチルイソブチルケトン）を含まない。一部の実施形態では、製剤は水性である。
【0205】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはエタノールの非存在下で封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはエタノールの非存在下で精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ精製、ｍＲＮＡ封入、または両プロセスはエタノールの非存在下である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ精製、ｍＲＮＡ封入、または両プロセスは可燃性薬剤を含まない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ精製、ｍＲＮＡ封入、または両プロセスは非水性溶媒を含まない。
【0206】
別個の脂質成分の比
本発明の適切なリポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ修飾脂質、両親媒性ブロックコポリマーおよび／または本明細書に記載されるポリマーのいずれかの１つまたはそれ以上を様々な比で含むことができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は５つおよび５つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は４つまたは４つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は３つまたは３つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。非限定的な例として、適切なリポソーム製剤は、ｃＫＫ－Ｅ１２（ＭＬ２としても知られる）、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから選択される組合せを含むことができる。
本発明の適切なリポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ修飾脂質、両親媒性ブロックコポリマーおよび／または本明細書に記載されるポリマーのいずれかの１つまたはそれ以上を様々な比で含むことができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は５つおよび５つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は４つまたは４つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は３つまたは３つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。非限定的な例として、適切なリポソーム製剤は、ｃＫＫ－Ｅ１２（ＭＬ２としても知られる）、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから選択される組合せを含むことができる。
【0207】
様々な実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）は、モル比でリポソームの約３０～６０％（例えば、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）のパーセンテージは、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、もしくは約６０％であるかまたはこれらを超える。
【0208】
一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれ約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５の間である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ５０：１０：３５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ６０：３５：０：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はおよそ５０：２５：２０：５である。
【0209】
本発明で使用するための脂質の例示的な混合物は、４つの脂質成分：カチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２またはＭＣ－３）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ，ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥまたはＤＥＰＥ）、コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）で構成される。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２またはＭＣ－３）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比はそれぞれ約３５～５５：５～３５：２０～４０：１～１５の間であることができる。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は３５～４５：２５～３５：２０～３０：１～１０である。特定の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は約４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質（例えば、ＭＣ－３）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は４５～５５：５～１５：３０～４０：１～１０である。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質（例えば、ＭＣ－３）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は約５０：１０：３５：５である。実施例に示されるように、これらの製造は、適切なｍＲＮＡ－ＬＮＰ径および封入効率を確保するので、本発明の製剤に使用するのに特に適している。
【0210】
一部の実施形態では、本発明で使用するための脂質の混合物は３つ以下の別個の脂質成分を含むことができる。一部の実施形態では、このような混合物中の１つの別個の脂質成分はコレステロール系またはイミダゾール系カチオン性脂質である。脂質の例示的な混合物は、３つの脂質成分：カチオン性脂質（例えば、コレステロール系またはイミダゾール系カチオン性脂質、例えばＩＣＥ、ＨＧＴ４００１またはＨＧＴ４００２）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥまたはＤＥＰＥ）およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）で構成される。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比はそれぞれ約５５～６５：３０～４０：１～１５の間である。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とＰＥＧ修飾脂質のモル比は５５～６５：３０～４０：１～１５である。特定の実施形態では、ＬＮＰ中のカチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）とＰＥＧ修飾脂質のモル比は６０：３５：５である。実施例に示されるように、これらの製造は、適切なｍＲＮＡ－ＬＮＰ径および封入効率を確保するので、本発明の製剤に使用するのに特に適している。
【0211】
一部の実施形態では、ｍＲＭＡ－ＬＮＰ中の脂質およびｍＲＮＡの濃度は、カチオン性脂質（例えば、ＭＬ－２またはＭＣ－３）とｍＲＮＡのＮ／Ｐ比が約２、３、４、５または６となるようなものである。実施例に示されるように、特に適切なＮ／Ｐ比は約４であり、効率的なＬＮＰ形成およびｍＲＮＡ封入効率を可能にする。
【0212】
脂質ナノ粒子が３つまたは３つ以下の別個の脂質の成分を含む実施形態では、全脂質含有量の比（すなわち、脂質成分（１）：脂質成分（２）：脂質成分（３）の比）をｘ：ｙ：ｚとして表すことができ、ここでは、
（ｙ＋ｚ）＝１００－ｘ
である。
（ｙ＋ｚ）＝１００－ｘ
である。
【0213】
一部の実施形態では、「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」の各々は脂質の３つの別個の成分のモルパーセンテージを表し、比はモル比である。
【0214】
一部の実施形態では、「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」の各々は脂質の３つの別個の成分の重量パーセンテージを表し、比は重量比である。
【0215】
一部の実施形態では、変数「ｘ」によって表される、脂質成分（１）はステロール系カチオン性脂質である。
【0216】
一部の実施形態では、変数「ｙ」によって表される、脂質成分（２）はヘルパー脂質である。
【0217】
一部の実施形態では、変数「ｚ」によって表される、脂質成分（３）はＰＥＧ脂質である。
【0218】
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。
【0219】
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％以下である。実施形態では、変数「ｘ」は約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％以下である。
【0220】
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約５０％であるが約９５％未満；少なくとも約５０％であるが約９０％未満；少なくとも約５０％であるが約８５％未満；少なくとも約５０％であるが約８０％未満；少なくとも約５０％であるが約７５％未満；少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。実施形態では、変数「ｘ」は少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。
【0221】
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。
【0222】
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％以下である。実施形態では、変数「ｘ」は約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％以下である。
【0223】
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は：少なくとも約５０％であるが約９５％未満；少なくとも約５０％であるが約９０％未満；少なくとも約５０％であるが約８５％未満；少なくとも約５０％であるが約８０％未満；少なくとも約５０％であるが約７５％未満；少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。実施形態では、変数「ｘ」は少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。
【0224】
一部の実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％以下である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約１％～約７．５％、約２．５％～約１０％、約２．５％～約７．５％、約２．５％～約５％、約５％～約７．５％、または約５％～約１０％である。
【0225】
一部の実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％以下である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約１％～約７．５％、約２．５％～約１０％、約２．５％～約７．５％、約２．５％～約５％、約５％～約７．５％、または約５％～約１０％である。
【0226】
３つおよび３つのみの別個の脂質の成分を有する組成物について、変数「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」は、３つの変数の和が合計して総脂質含有量の１００％になる限り、任意の組合せであることができる。
【0227】
ｍＲＮＡ合成
本発明によるｍＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかに従って合成することができる。様々な方法は米国特許出願公開第２０１８／０２５８４２３号に記載されており、これらの方法を使用して本発明を実施することができ、その全てを参照によって本明細書に組み入れる。例えば、本発明によるｍＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的にはプロモーターを含有する直鎖または環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含むことができる緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて実施される。正確な条件は具体的な用途によって変化する。
本発明によるｍＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかに従って合成することができる。様々な方法は米国特許出願公開第２０１８／０２５８４２３号に記載されており、これらの方法を使用して本発明を実施することができ、その全てを参照によって本明細書に組み入れる。例えば、本発明によるｍＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的にはプロモーターを含有する直鎖または環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含むことができる緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて実施される。正確な条件は具体的な用途によって変化する。
【0228】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒト細胞での効率的な発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は天然に存在する配列または野生型配列である。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、アミノ酸配列に１つまたはそれ以上の突然変異を含有するタンパク質またはペプチドをコードする。
【0229】
本発明を使用して様々な長さのｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、もしくは５０ｋｂ長のまたはこれを超えるインビトロ合成ｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、または約８～５０ｋｂ長の範囲のインビトロ合成ｍＲＮＡを送達することができる。
【0230】
一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡを製造するために、ＤＮＡ鋳型をインビトロで転写する。適切なＤＮＡ鋳型は、典型的にはインビトロ転写のためのプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター、引き続いて所望のＲＮＡのための所望のヌクレオチド配列および終結シグナルを有する。
【0231】
ヌクレオチド
様々な天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを使用して本発明によるｍＲＮＡを作製することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に存在するヌクレオシド（または未修飾ヌクレオチド；例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、シュードウリジン（例えば、Ｎ－１－メチルシュードウリジン）、２－チオウリジン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。
様々な天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを使用して本発明によるｍＲＮＡを作製することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に存在するヌクレオシド（または未修飾ヌクレオチド；例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、シュードウリジン（例えば、Ｎ－１－メチルシュードウリジン）、２－チオウリジン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。
【0232】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、骨格修飾、糖修飾および／または塩基修飾を含有することができる。例えば、修飾ヌクレオチドには、それだけに限らないが、修飾プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））、またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、およびプリンおよびピリミジンの修飾ヌクレオチド類似体または誘導体、例えば１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、シュードウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ベータ－Ｄ－マンノシル－キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、およびホスホロアミダイト、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシンおよびイノシンが含まれる。このような類似体の製造は、例えばその開示全体を参照によって組み入れる、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号および米国特許第５，７００，６４２号から当業者に公知である。
【0233】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含む。非標準ヌクレオチド残基には、例えば５－メチル－シチジン（「５ｍＣ」）、シュードウリジン（「ΨＵ」）、および／または２－チオ－ウリジン（「２ｓＵ」）が含まれる。このような残基およびこれらのｍＲＮＡへの組み込みの議論については、例えば米国特許第８，２７８，０３６号または国際公開第２０１１／０１２３１６号を参照されたい。ｍＲＮＡは、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンであるＲＮＡとして定義されるＲＮＡであることができる。ＲＮＡの使用についての教示は、共に全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号および国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示される。非標準ヌクレオチド残基の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが、標準残基のみを含有する対照ｍＲＮＡよりも安定におよび／またはあまり免疫原性ではなくすることができる。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾および他の核酸塩基修飾の組合せから選択される１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含むことができる。一部の実施形態は、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾をさらに含むことができる。追加の修飾には、例えば、糖修飾または置換（例えば、２’－Ｏ－アルキル修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）の１つまたはそれ以上）が含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡは追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体化またはハイブリダイズされる。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾である一部の実施形態では、このような修飾には、それだけに限らないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾および２’－デオキシ修飾が含まれる。一部の実施形態では、これらの修飾のいずれもヌクレオチドの０～１００％－例えば、個別にまたは組み合わせて構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％超または１００％で存在することができる。
【0234】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＲＮＡ骨格修飾を含有することができる。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含有されるヌクレオチドの骨格のリン酸エステルが化学修飾される修飾である。例示的な骨格修飾には、典型的には、それだけに限らないが、メチルホスホネート、メチルホスホロアミダイト、ホスホロアミダイト、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））、ボラノホスフェート、正に帯電したグアニジニウム基等からなる群の修飾が含まれる（他のアニオン性、カチオン性または中性基によってホスホジエステル結合に取って代わることによることを意味する）。
【0235】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは糖修飾を含有することができる。典型的な糖修飾は、それだけに限らないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン５’－三リン酸、２’－メチルウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）からなる群から選択される糖修飾を含む、ｍＲＮＡが含有するヌクレオチドの糖の化学修飾である。
【0236】
合成後プロセシング
典型的には、５’キャップおよび／または３’テールを合成後に付加することができる。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。
典型的には、５’キャップおよび／または３’テールを合成後に付加することができる。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。
【0237】
５’キャップは、典型的には以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去して、２つの末端リン酸エステルを残し；次いで、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸エステルに付加して、５’５’５三リン酸結合を生成し；次いで、グアニンの７－窒素をメチルトランスフェラーゼによってメチル化する。キャップ構造の例としては、それだけに限らないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。追加のキャップ構造は、参照によって本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号および米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号に記載されている。
【0238】
典型的には、テール構造はポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡまたはポリＣテールは、典型的にはそれぞれ少なくとも５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡまたはポリＣテールは、それぞれ約１０～８００個のアデノシンまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド）であることができる。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載される様々な長さのポリ（Ａ）テールとポリ（Ｃ）テールの組合せである。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
【0239】
本明細書に記載されるように、キャッピングおよび／またはテーリングがないと、早期中断ｍＲＮＡ転写産物のサイズがあまりに小さすぎて検出することができないために、５’キャップおよび／または３’テールの付加によって、インビトロ合成中に産生される中断転写産物の検出が容易になる。よって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを純度（ｍＲＮＡ中に存在する中断転写産物のレベル）について試験する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載されるように精製する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。他の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載されるように精製した後に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。
【0240】
合成されたｍＲＮＡは、さらに精製することなく本発明に使用することができる。特に、合成されたｍＲＮＡは、ショートマーを除去する工程なしに本発明によって使用することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡを本発明により使用するためにさらに精製することができる。様々な方法を使用して合成されたｍＲＮＡを精製することができる。例えば、遠心分離、濾過および／またはクロマトグラフィー法を使用して、ｍＲＮＡの精製を実施することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿もしくは濾過もしくはクロマトグラフィー、もしくはゲル精製または任意の他の適切な手段によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＨＰＬＣによって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、当業者に周知の、標準フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液中で抽出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはタンジェンシャルフローフィルトレーションを使用して精製される。適切な精製方法には、その全てを参照によって本明細書に組み入れ、本発明を実施するために使用することができる、米国特許出願公開第２０１６／００４０１５４号、米国特許出願公開第２０１５／０３７６２２０号、米国特許出願公開第２０１８／０２５１７５５号、米国特許出願公開第２０１８／０２５１７５４号、２０１８年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７５７，６１２号、および２０１９年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，７８１号に記載されるものが含まれる。
【0241】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング前に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング後に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリングの前と後の両方で精製される。
【0242】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、遠心分離によって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
【0243】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、濾過によって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
【0244】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
【0245】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、クロマトグラフィーによって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
【0246】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、エタノールもいずれの他の可燃性溶媒も使用しないで精製される。
【0247】
精製されたｍＲＮＡの特性評価
本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、短い中断ＲＮＡ種、長い中断ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む汚染物質を実質的に含まない。
本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、短い中断ＲＮＡ種、長い中断ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む汚染物質を実質的に含まない。
【0248】
本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、約６０％～約１００％の間の純度を有する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９１％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９２％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９３％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９４％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９６％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９７％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９８％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９９％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１００％の純度を有する。
【0249】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、および／または０．１％未満の完全長ｍＲＮＡ以外の不純物を有する。不純物には、ＩＶＴ汚染物質、例えばタンパク質、酵素、ＤＮＡ鋳型、遊離ヌクレオチド、残留溶媒、残留塩、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、早期中断ＲＮＡ配列（「ショートマー」または「短い中断ＲＮＡ種」）、および／または長い中断ＲＮＡ種が含まれる。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡはプロセス酵素を実質的に含まない。
【0250】
一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１ｐｇ／ｍｇ未満、約２ｐｇ／ｍｇ未満、約３ｐｇ／ｍｇ未満、約４ｐｇ／ｍｇ未満、約５ｐｇ／ｍｇ未満、約６ｐｇ／ｍｇ未満、約７ｐｇ／ｍｇ未満、約８ｐｇ／ｍｇ未満、約９ｐｇ／ｍｇ未満、約１０ｐｇ／ｍｇ未満、約１１ｐｇ／ｍｇ未満、または約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。したがって、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約２ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約３ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約４ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約５ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約６ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約７ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約８ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約９ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１０ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１１ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。
【0251】
一部の実施形態では、本発明による方法は、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超または実質的に全ての早期中断ＲＮＡ配列（「ショートマー」としても知られる）を除去する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は早期中断ＲＮＡ配列を実質的に含まない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）の早期中断ＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）の早期中断ＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ショルダーピークまたは別々のピーク）、臭化エチジウム、クーマシー染色、キャピラリー電気泳またはグリオキサールゲル電気泳動によって決定される、検出不能な早期中断ＲＮＡ配列（例えば、別々の低いバンドの存在）。本明細書で使用される場合、「ショートマー」、「短い中断ＲＮＡ種」、「早期中断ＲＮＡ配列」または「長い中断ＲＮＡ種」という用語は、完全長より短い任意の転写産物を指す。一部の実施形態では、「ショートマー」、「短い中断ＲＮＡ種」、または「早期中断ＲＮＡ配列」は、１００ヌクレオチド長未満、９０ヌクレオチド長未満、８０ヌクレオチド長未満、７０ヌクレオチド長未満、６０ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、４０ヌクレオチド長未満、３０ヌクレオチド長未満、２０ヌクレオチド長未満、または１０ヌクレオチド長未満である。一部の実施形態では、ショートマーは、５’キャップ、および／または３’ポリＡテールを付加した後に検出または定量化される。一部の実施形態では、早期中断ＲＮＡ転写産物は１５個未満の塩基（例えば、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、または３個未満の塩基）を含む。一部の実施形態では、早期中断ＲＮＡ転写産物は、約８～１５個、８～１４個、８～１３個、８～１２個、８～１１個、または８～１０個の塩基を含有する。
【0252】
一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは、それだけに限らないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含む、インビトロ合成に使用される酵素試薬を実質的に含まない。一部の実施形態では、本発明による精製されたｍＲＮＡは、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）のインビトロ合成に使用される酵素試薬を含有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）のインビトロ合成に使用される酵素試薬を含有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、例えば銀染色、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、および／またはキャピラリー電気泳動、臭化エチジウムおよび／またはクーマシー染色によって決定されるものを含む、インビトロ合成に使用される検出不能な酵素試薬を含有する。
【0253】
様々な実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは高い完全性の程度を維持する。本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ完全性」という用語は、一般的に精製後のｍＲＮＡの質を指す。ｍＲＮＡ完全性は、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動によって、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性は、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動のバンドパターンによって決定することができる。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動の参照バンドと比較してほとんどまたは全くバンドを示さない。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは、約９５％超（例えば、約９６％、９７％、９８％、９９％超またはそれ以上）の完全性を有する。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは９８％超の完全性を有する。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは９９％超の完全性を有する。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡはおよそ１００％の完全性を有する。
【0254】
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを以下の特徴：外観、同一性、量、濃度、不純物の存在、微生物学的評価、ｐＨレベルおよび活性のうちの１つまたはそれ以上について評価する。一部の実施形態では、許容される外観には、目に見える粒子を本質的に含まない、無色透明溶液が含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの同一性は、配列決定法によって評価される。一部の実施形態では、濃度は、ＵＶ分光光度法などの適切な方法によって評価される。一部の実施形態では、適切な濃度は約９０％～１１０％公称の間（０．９～１．１ｍｇ／ｍＬ）である。
【0255】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの純度の評価は、ｍＲＮＡ完全性の評価、残留プラスミドＤＮＡの評価、および残留溶媒の評価を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性の許容されるレベルは、アガロースゲル電気泳動によって評価される。ゲルを分析して、結合パターンおよび見かけのヌクレオチド長が分析参照標準と一致しているかどうかを決定する。ＲＮＡ完全性を評価する追加の方法には、例えば、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用した精製されたｍＲＮＡの評価が含まれる。一部の実施形態では、ＣＧＥによって決定される精製されたｍＲＮＡの許容される純度は、精製されたｍＲＮＡ組成物が約５５％以下の長い中断／分解された種を有することである。一部の実施形態では、残留プラスミドＤＮＡは、当技術分野の方法によって、例えば、ｑＰＣＲの使用によって評価される。一部の実施形態では、１０ｐｇ／ｍｇ未満（例えば、１０ｐｇ／ｍｇ未満、９ｐｇ／ｍｇ未満、８ｐｇ／ｍｇ未満、７ｐｇ／ｍｇ未満、６ｐｇ／ｍｇ未満、５ｐｇ／ｍｇ未満、４ｐｇ／ｍｇ未満、３ｐｇ／ｍｇ未満、２ｐｇ／ｍｇ未満、または１ｐｇ／ｍｇ未満）が残留プラスミドＤＮＡの許容されるレベルである。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは、１０，０００ｐｐｍ、９，０００ｐｐｍ、８，０００ｐｐｍ、７，０００ｐｐｍ、６，０００ｐｐｍ、５，０００ｐｐｍ、４，０００ｐｐｍ、３，０００ｐｐｍ、２，０００ｐｐｍ、１，０００ｐｐｍ以下である。したがって、一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは１０，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは９，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは８，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは７，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは６，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは５，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは４，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは３，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは２，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは１，０００ｐｐｍ以下である。
【0256】
一部の実施形態では、例えば、細菌内毒素の評価を含む微生物試験が精製されたｍＲＮＡに実施される。一部の実施形態では、細菌内毒素は、０．５ＥＵ／ｍＬ未満、０．４ＥＵ／ｍＬ未満、０．３ＥＵ／ｍＬ未満、０．２ＥＵ／ｍＬ未満または０．１ＥＵ／ｍＬ未満である。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．５ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．４ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．３ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．２ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．２ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．１ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／１０ｍＬ、１ＣＦＵ／２５ｍＬ、１ＣＦＵ／５０ｍＬ、１ＣＦＵ／７５ｍＬ以下、または１ＣＦＵ／１００ｍＬ以下を有する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／１０ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／２５ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／５０ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／７５ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／１００ｍＬを有する。
【0257】
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡのｐＨを評価する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容されるｐＨは５～８の間である。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約５のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８のｐＨを有する。
【0258】
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの翻訳忠実度を評価する。翻訳忠実度は、様々な方法によって評価することができ、例えば、トランスフェクションおよびウエスタンブロット分析を含むことができる。精製されたｍＲＮＡの許容される特徴には、参照標準と同様の分子量で移動するウエスタンブロットでのバンドパターンが含まれる。
【0259】
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡをコンダクタンスについて評価する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容される特徴には、参照標準の約５０％～約１５０％の間のコンダクタンスが含まれる。
【0260】
精製されたｍＲＮＡをキャップパーセンテージおよびポリＡテール長についても評価する。一部の実施形態では、許容されるキャップパーセンテージには、キャップ１、％面積：ＮＬＴ９０が含まれる。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は、約１００～１５００ヌクレオチド（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、および１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００ヌクレオチド）である。
【0261】
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを残留ＰＥＧについても評価する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ～１０００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇの間未満を有する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約２５０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約５００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７５０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１０００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。
【0262】
ｍＲＮＡ純度を検出および定量化する様々な方法は当技術分野で公知である。例えば、このような方法には、ブロット法、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、もしくはＵＰＬＣ、またはこれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、ゲル電気泳動（「グリオキサールゲル電気泳動」）の前にまずグリオキサール色素によって変性させる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングまたはテーリング前に特性評価する。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングおよびテーリング後に特性評価する。
【0263】
組成物の治療的使用
インビボでのｍＲＮＡの発現を容易にするために、リポソームなどの送達ビヒクルを、１つもしくはそれ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または適切な賦形剤と混合される薬理学的組成物に製剤化することができる。薬物を製剤化および投与するための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見られる。
インビボでのｍＲＮＡの発現を容易にするために、リポソームなどの送達ビヒクルを、１つもしくはそれ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または適切な賦形剤と混合される薬理学的組成物に製剤化することができる。薬物を製剤化および投与するための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見られる。
【0264】
一部の実施形態では、組成物は、送達ビヒクルにより封入されたまたは送達ビヒクルと複合体化したｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、リポソーム、脂質ナノ粒子、固体－脂質ナノ粒子、ポリマー、ウイルス、ゾル－ゲル、およびナノゲルからなる群から選択される。
【0265】
提供されるｍＲＮＡ搭載ナノ粒子、および同ナノ粒子を含有する組成物は、対象の臨床状態、投与の部位および方法、投与のスケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当業者の医師に関連する他の因子を考慮して、現在の医療行為に従って投与および投薬することができる。本明細書における目的のための「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床および医学分野の当業者に公知であるような関連する考慮事項によって決定することができる。一部の実施形態では、投与される量は、症状の少なくとも一部の安定化、改善または排除および当業者によって、疾患の進行、退行または改善の適切な尺度として選択されるような他の指標を達成するのに有効である。例えば、適切な量および投薬レジメンは、少なくとも一過的なタンパク質（例えば、酵素）産生を引き起こすものである。
【0266】
本発明は、インビボタンパク質産生のためにｍＲＮＡを送達する方法であって、ｍＲＮＡを、送達を必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内送達、皮下送達、経口送達、真皮下送達、眼送達、気管内注射肺送達（例えば、噴霧または点滴注入）、筋肉内送達、髄腔内送達、または関節内送達からなる群から選択される送達経路を介して投与される。したがって、一部の実施形態では、本発明は、静脈内送達を含む、インビボタンパク質産生のためにｍＲＮＡを送達する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、筋肉内送達を含む、インビボタンパク質産生のためにｍＲＮＡを送達する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、気管内注射肺送達を含む、インビボタンパク質産生のためにｍＲＮＡを送達する方法を提供する。
【0267】
エタノールフリーＬＮＰ製剤の開発によって、火災安全性への懸念が大いに減少する、および／または排除され、投薬により適しているであろう１：１のシトレート－ｍＲＮＡと溶媒－脂質の比を有する低容量製剤の製造をもたらすベッドサイド混合も可能になる。したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤は、例えばベッドサイド混合、病院現場での混合、および薬局現場での混合を含む、様々な設定での製造および投与に適している。
【0268】
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、膣、経粘膜、気管内もしくは吸入を含む肺、または腸投与；真皮内、経皮（局所）、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内を含む非経口送達が含まれる。一部の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋および心筋からなる群から選択される筋肉に対するものである。一部の実施形態では、投与によってｍＲＮＡが筋細胞に送達される。一部の実施形態では、投与によってｍＲＮＡが肝細胞（すなわち、肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与によってｍＲＮＡが筋細胞に送達される。
【0269】
肺送達および噴霧の追加の教示は、その各々全体を参照によって組み入れる、米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号および米国特許出願公開第２０１８／０３３３４５７号に記載されている。
【0270】
あるいはまたはさらに、本発明のｍＲＮＡ搭載ナノ粒子および組成物は、例えば、好ましくは徐放性製剤での、医薬組成物の標的組織への直接の注射を介して、全身的ではなく局所的に投与される。局所送達は、標的化される組織に応じて、様々な方法で行うことができる。例えば、本発明の組成物を含有するエアロゾルを吸入することができ（経鼻、気管、もしくは気管支送達のため）；本発明の組成物を、例えば、傷害、疾患顕在化、もしくは疼痛の部位に注射することができ；組成物を経口、気管、もしくは食道施用のためにロゼンジで提供することができ；胃もしくは腸への投与のために液体、錠剤もしくはカプセル剤形態で供給することができ；直腸もしくは膣施用のために坐剤形態で供給することができ；またはクリーム、液滴、もしくはさらには注射の使用によって眼に送達することさえできる。治療用分子またはリガンドと複合体化した提供される組成物を含有する製剤を、例えば、ポリマーまたは組成物が埋込部位から周囲の細胞に拡散するのを可能にすることができる他の構造もしくは物質と合わせて、外科的に投与することさえできる。あるいは、これらを、ポリマーも支持体も使用することなく外科的に施用することができる。
【0271】
本発明の提供される方法は、治療上有効量の本明細書に記載される治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）の単回ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態の性質、重症度および程度に応じて、一定の間隔で投与することができる。一部の実施形態では、治療上有効量の本発明の治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）を一定の間隔で定期的に（例えば、１年に１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月で（２か月に１回）、毎月（１か月に１回）、隔週で（２週間に１回）、１か月に２回、３０日に１回、２８日に１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、１週間に２回、毎日、または連続的に）髄腔内投与することができる。
【0272】
一部の実施形態では、提供されるリポソームおよび／または組成物は、その中に含有されるｍＲＮＡの延長放出に適するように製剤化される。このような延長放出組成物は、延長された投薬間隔で対象に都合よく投与される。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、毎日、または１日おきに対象に投与される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１週間に２回、１週間に１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回、３０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、またはより好ましくは４週間に１回、１か月に１回、１か月に２回、６週間に１回、８週間に１回、隔月１回、３か月に１回、４か月に１回、６か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、または毎年、対象に投与される。長期間にわたって治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）を送達または放出するデポー投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）のために製剤化された組成物およびリポソームも企図される。好ましくは、使用される延長放出手段は、安定性を増強するためにｍＲＮＡになされる修飾と組み合わせられる。
【0273】
本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という用語は、主として、本発明の医薬組成物中に含有される治療剤の総量に基づいて決定される。一般的に、治療上有効量は、対象に対する意味のある利益（例えば、疾患または障害を処置する、調節する、治癒する、予防する、および／または改善する）を達成するのに十分である。例えば、治療上有効量は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量である。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）の量は、対象の特徴に依存する。このような特徴には、対象の状態、疾患重症度、健康全般、年齢、性別および体重が含まれる。当業者であれば、これらのおよび他の関連する因子に応じて適切な投薬量を容易に決定することができるだろう。さらに、客観的アッセイと主観的アッセイの両方を場合により使用して最適な投薬量範囲を同定することができる。
【0274】
治療上有効量は、複数単位用量を含むことができる投薬レジメンで一般的に投与される。特定の治療用タンパク質について、治療上有効量（および／または有効投薬レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬品との組合せに応じて変化する。また、特定の患者のための具体的な治療上有効量（および／または単位用量）は、処置される障害および障害の重症度；使用される具体的な医薬品の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、健康全般、性別および食事；投与時間、投与経路、および／または使用される具体的なタンパク質の排泄もしくは代謝率；処置の持続時間；ならびに医学分野で周知である同様の因子を含む様々な因子に依存する。
【0275】
一部の実施形態では、治療上有効用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【0276】
一部の実施形態では、治療上有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重超、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重超、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３ｍｇ／ｋｇ体重超、約５ｍｇ／ｋｇ体重超、約１０ｍｇ／ｋｇ体重超、約１５ｍｇ／ｋｇ体重超、約２０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３０ｍｇ／ｋｇ体重超、約４０ｍｇ／ｋｇ体重超、約５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約６０ｍｇ／ｋｇ体重超、約７０ｍｇ／ｋｇ体重超、約８０ｍｇ／ｋｇ体重超、約９０ｍｇ／ｋｇ体重超、約１００ｍｇ／ｋｇ体重超、約１５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約２００ｍｇ／ｋｇ体重超、約２５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３００ｍｇ／ｋｇ体重超、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約４００ｍｇ／ｋｇ体重超、約４５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約５００ｍｇ／ｋｇ体重超である。特定の実施形態では、治療上有効用量は１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇの治療上有効用量が筋肉内または静脈内投与される。
【0277】
本明細書では、本明細書に開示されるリポソームの１つまたはそれ以上を含む凍結乾燥医薬組成物および例えば、その教示全体を参照によって本明細書に組み入れる、２０１１年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４９４，８８２号に開示されるこのような組成物を使用するための関連する方法も企図される。例えば、本発明による凍結乾燥医薬組成物は、投与前に再構成することができる、またはインビボで再構成することができる。例えば、凍結乾燥医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッドまたは膜などの真皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってインビボで時間とともに再水和されるように投与される。
【0278】
提供されるリポソームおよび組成物は任意の所望の組織に投与される。一部の実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達されるｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織で発現される。一部の実施形態では、送達されたｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現される。送達されたｍＲＮＡが送達および／または発現される例示的な組織には、それだけに限らないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が含まれる。
【0279】
一部の実施形態では、提供される組成物の投与が、処置前のベースライン発現レベルと比較して、対象由来の生物学的サンプルにおいて上昇したｍＲＮＡ発現レベルをもたらす。典型的には、ベースラインレベルは処置直前に測定される。生物学的サンプルには、例えば、全血、血清、血漿、尿および組織サンプル（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物の投与によって、処置直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇したｍＲＮＡ発現レベルが得られる。一部の実施形態では、提供される組成物の投与によって、処置されていない対象のｍＲＮＡ発現レベルと比較して上昇したｍＲＮＡ発現レベルが得られる。
【0280】
様々な実施形態によると、送達されたｍＲＮＡの発現のタイミングを、特定の医療ニーズに適するように調整することができる。一部の実施形態では、送達されたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソームおよび／または組成物の投与１、２、３、６、１２、２４、４８、７２、および／または９６時間後に検出可能である。一部の実施形態では、送達されたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、投与１週間、２週間、および／または１か月後に検出可能である。
【0281】
本発明はまた、対象、例えばヒト対象またはヒト対象の細胞または処置され、ヒト対象に送達される細胞の処置に使用するための目的のペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する組成物の送達を提供する。
【実施例】
【0282】
本発明のある特定の化合物、組成物および方法をある特定の実施形態によって具体的に説明してきたが、以下の実施例は本発明を単に例示するのに役立ち、これを限定することを意図するものではない。
【実施例1】
【0283】
エタノールの代わりに溶媒としてポリマーを使用したエタノールフリー脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の封入効率
この実施例は、エタノールフリーＬＮＰ製剤の製造において、ＭＬ－２およびＩＣＥを含む様々なカチオン性脂質の溶解に例示的な溶媒としてトリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＴＥＧ）を使用することによって達成される封入効率を例示する。エタノールフリーＬＮＰ製剤の開発は、火災安全性への懸念を大いに減少させるおよび／または排除し、投薬により適するような１：１シトレート－ｍＲＮＡと溶媒－脂質の比を有する低容量製剤の製造をもたらすベッドサイド混合を可能にするだろう。このような低容量製剤は、溶媒としてエタノールを使用して得ることが現在困難である。
この実施例は、エタノールフリーＬＮＰ製剤の製造において、ＭＬ－２およびＩＣＥを含む様々なカチオン性脂質の溶解に例示的な溶媒としてトリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＴＥＧ）を使用することによって達成される封入効率を例示する。エタノールフリーＬＮＰ製剤の開発は、火災安全性への懸念を大いに減少させるおよび／または排除し、投薬により適するような１：１シトレート－ｍＲＮＡと溶媒－脂質の比を有する低容量製剤の製造をもたらすベッドサイド混合を可能にするだろう。このような低容量製剤は、溶媒としてエタノールを使用して得ることが現在困難である。
【0284】
例示的なＬＮＰ製剤を、水溶液中のｍＲＮＡを、両親媒性ポリマー溶液に溶解した脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質）と混合して、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成することによって製造した。この実施例では、脂質をエタノールフリーｍＴＥＧ溶液またはエタノール系溶液中で製造した。２つの異なるカチオン性脂質、ＭＬ－２およびＩＣＥを評価し、エタノールフリーポリマー混合物とエタノール含有混合物の両方で各カチオン性脂質についてＰＥＧ：カチオン性脂質：コレステロール：非カチオン性脂質の同じ比を使用した（表２参照）。エタノールフリーポリマー混合物およびエタノール含有混合物からのＬＮＰの粒径、多分散指数および封入効率を評価した。
【0285】
【表2】
【0286】
表２に見られるように、ｍＴＥＧ製造製剤は、エタノール製造ＬＮＰ製剤と比較して同等のまたは改善された封入効率を有する同等の径のＬＮＰをもたらした。多分散指数は、エタノール製剤と比較してｍＴＥＧ製剤でわずかに高いことが観察された。
【0287】
結果は、ｍＴＥＧを使用して脂質を溶解し、同等のまたは改善された封入効率を有するエタノールフリーＬＮＰ製剤の安全な製造を可能にすることができることを示した。
【実施例2】
【0288】
脂質用のエタノール溶媒を使用した場合と比較した脂質用のポリマー溶媒を使用して製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率
この実施例は、脂質用のエタノール溶媒を使用して製剤化されたＬＮＰ製剤と比較した脂質用のポリマー溶媒を使用して製剤化されたＬＮＰ製剤で得られた平均粒径、多分散指数（「ＰＤＩ」）および封入効率を例示している。ポリマー溶媒（ｍＴＥＧ）またはエタノールを使用して製剤化されたＬＮＰは、ＰＥＧ修飾脂質、ＭＬ－２またはＭＣ３のいずれかのカチオン性脂質、コレステロールおよびヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）で構成されていた。
この実施例は、脂質用のエタノール溶媒を使用して製剤化されたＬＮＰ製剤と比較した脂質用のポリマー溶媒を使用して製剤化されたＬＮＰ製剤で得られた平均粒径、多分散指数（「ＰＤＩ」）および封入効率を例示している。ポリマー溶媒（ｍＴＥＧ）またはエタノールを使用して製剤化されたＬＮＰは、ＰＥＧ修飾脂質、ＭＬ－２またはＭＣ３のいずれかのカチオン性脂質、コレステロールおよびヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）で構成されていた。
【0289】
ＬＮＰ用の脂質を１００％ ｍＴＥＧ溶液または１００％エタノール溶液に溶解することによって、例示的なｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を製造した。脂質は、カチオン性脂質としてのＭＬ－２またはＭＣ－３のいずれか、ＰＥＧ修飾脂質、コレステロールおよびヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）を含んでいた。ｍＴＥＧ－脂質またはエタノール－脂質溶液を、それぞれ１対４（ｍＴＥＧ－脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液またはエタノール－脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）の容量比でｍＲＮＡの水溶液（クエン酸緩衝液中）と混合した。混合前に、水溶液中のｍＲＮＡは０．０８ｍｇ／ｍＬの濃度であり、脂質溶液中の脂質は、４のカチオン性脂質（ＭＬ－２またはＭＣ－３）とｍＲＮＡのＮ／Ｐ比を提供するのに必要な濃度であった。ＰＥＧ修飾脂質、コレステロールおよびヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）濃度は、表３に提供される標的比（カチオン性脂質に対する）に従って製造した。得られたｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒径、多分散指数および封入効率を分析した（表３）。
【0290】
【表3】
【0291】
表３に示されるように、ＭＣ－３がカチオン性脂質であるｍＴＥＧ製造製剤およびエタノール製造製剤において、同等の径のｍＲＮＡ－ＬＮＰが得られた。カチオン性脂質としてＭＬ－２を有する製剤については、ｍＲＮＡ－ＬＮＰがエタノール製造脂質に対してｍＴＥＧ製造脂質から得られたもので大きかった。対応するエタノール製造ＭＣ－３ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で得られた９０％の封入効率と比較して、ｍＴＥＧ製造ＭＣ－３ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で９７％の高い封入効率が得られた。カチオン性脂質としてＭＬ－２を有する製剤については、封入効率がエタノール製造脂質に対してｍＴＥＧ製造脂質から得られたｍＲＮＡ－ＬＮＰで同等であった。エタノール製造ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤と比較してｍＴＥＧ製造ＭＣ－３ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で多分散指数が増加した。
【0292】
これらの結果は、ポリマー製造ＬＮＰ製剤、特にｍＴＥＧ製造ＬＮＰ製剤が、エタノール製造ＬＮＰ製剤と比較して同等のＬＮＰ径および潜在的に高い封入効率を提供することを示した。エタノールフリーｍＴＥＧ製剤はエタノール系製剤と比較して安全に大規模で製造することができ、脂質組成物に使用される溶媒を除去する後の処理をあまり要さないので、エタノールの代わりにｍＴＥＧを使用してｍＲＮＡ封入ＬＮＰを調製することは有利である。
【実施例3】
【0293】
エタノールフリー製剤は低容量混合を要する
この実施例は、特に例えば投薬のための、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の製造において必要とされる容量を低下させることに関して、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの製造において脂質用にエタノール溶媒に対してｍＴＥＧ溶媒を使用することの有意な利点を示している。特に、１：１（ｖ／ｖ）比で脂質を含む１００％エタノール溶液を、ｍＲＮＡを含む水溶液と混合することによって、得られた混合物中の高濃度（５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールにより、不安定なｍＲＮＡ溶解度がもたらされ、場合によっては、ｍＲＮＡ沈殿がもたらされる。したがって、本発明の前に、この問題に対処するためのアプローチは、得られた混合物中のより低いエタノール濃度をもたらし、それによって、ｍＲＮＡ不安定性およびｍＲＮＡ沈殿の可能性を回避するために、エタノール－脂質溶液中のエタノール成分を希釈すること（これは脂質溶解度に影響を及ぼすおそれがある）および／またはｍＲＮＡ水溶液の容量を増加させることおよび／または第３の水溶液流を添加することを含んでいた。例えば、１：４（ｖ／ｖ）の比でエタノール－脂質溶液（１００％エタノールを有する）をｍＲＮＡ水溶液と混合することによって、得られた混合物中のエタノールの量が低くなり（２０％ｖ／ｖ）、それによって、エタノールによって引き起こされるｍＲＮＡ不安定性および沈殿を回避するのが助けられる。不幸なことに、これらのアプローチは全て、典型的にはそれぞれの溶液で実質的に希釈された量の脂質およびｍＲＮＡを用いた、必要とされるよりも大容量（例えば、最低溶解濃度および所望のＮ／Ｐ比によって要求される）の混合を要し、これは大規模処理レベルでは、時間およびコストを有意に増加させると同時に、エタノール除去工程に加えて、その後の濃縮工程を要し、これにより時間および費用がさらに増加する。
この実施例は、特に例えば投薬のための、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の製造において必要とされる容量を低下させることに関して、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの製造において脂質用にエタノール溶媒に対してｍＴＥＧ溶媒を使用することの有意な利点を示している。特に、１：１（ｖ／ｖ）比で脂質を含む１００％エタノール溶液を、ｍＲＮＡを含む水溶液と混合することによって、得られた混合物中の高濃度（５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールにより、不安定なｍＲＮＡ溶解度がもたらされ、場合によっては、ｍＲＮＡ沈殿がもたらされる。したがって、本発明の前に、この問題に対処するためのアプローチは、得られた混合物中のより低いエタノール濃度をもたらし、それによって、ｍＲＮＡ不安定性およびｍＲＮＡ沈殿の可能性を回避するために、エタノール－脂質溶液中のエタノール成分を希釈すること（これは脂質溶解度に影響を及ぼすおそれがある）および／またはｍＲＮＡ水溶液の容量を増加させることおよび／または第３の水溶液流を添加することを含んでいた。例えば、１：４（ｖ／ｖ）の比でエタノール－脂質溶液（１００％エタノールを有する）をｍＲＮＡ水溶液と混合することによって、得られた混合物中のエタノールの量が低くなり（２０％ｖ／ｖ）、それによって、エタノールによって引き起こされるｍＲＮＡ不安定性および沈殿を回避するのが助けられる。不幸なことに、これらのアプローチは全て、典型的にはそれぞれの溶液で実質的に希釈された量の脂質およびｍＲＮＡを用いた、必要とされるよりも大容量（例えば、最低溶解濃度および所望のＮ／Ｐ比によって要求される）の混合を要し、これは大規模処理レベルでは、時間およびコストを有意に増加させると同時に、エタノール除去工程に加えて、その後の濃縮工程を要し、これにより時間および費用がさらに増加する。
【0294】
しかしながら、脂質を含む１００％ ｍＴＥＧ溶液を、ｍＲＮＡを含む水溶液と１：１（ｖ／ｖ）比で混合してｍＲＮＡ－ＬＮＰを作製する場合、得られた混合物中の高濃度のｍＴＥＧ（５０％ｖ／ｖ）は、ｍＲＮＡ不安定性も沈殿ももたらさないように見える。最適化された低容量の、すなわち、それぞれ高い脂質濃度およびｍＲＮＡ濃度を有する、脂質を含むｍＴＥＧ溶液およびｍＲＮＡを含む水溶液を使用して大規模で製造されたこのようなｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、処理容量を減少させ、それによって、製造における処理の容易さを増加させるのに有利である。
【0295】
脂質用のエタノール溶媒に対して脂質用のｍＴＥＧ溶媒がｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤に使用される容量を最適化する能力を評価するために、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を、脂質を含む脂質容量を１００％ ｍＴＥＧまたは１００％エタノールのいずれかに溶解して、低容量比（１：１の脂質容量対ｍＲＮＡ容量）および高容量比（１：４の脂質容量対ｍＲＮＡ容量）で製造した。溶解した脂質は、ＰＥＧ修飾脂質、ＭＬ－２またはＭＣ３のいずれかのカチオン性脂質、コレステロールおよびヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）を含んでいた。各プロセスで同じ総量のｍＲＮＡを混合するように、混合する前に、低容量混合用のｍＲＮＡ水溶液は、高容量混合用のｍＲＮＡ水溶液の０．０８ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度の４倍である０．３３ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度を有していた。脂質溶液中、脂質（１００％ ｍＴＥＧまたは１００％エタノール溶液のいずれか）は、表４に提供される（カチオン性脂質に対する）標的比に従って製造されたＰＥＧ修飾脂質、コレステロールおよびヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）濃度により、４のカチオン性脂質（ＭＬ－２またはＭＣ－３）とｍＲＮＡのＮ／Ｐ比を提供するのに必要な濃度であった。各製造を低容量（１：１脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）または高容量（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）の容量で混合し、得られたｍＲＮＡ－ＬＮＰを径、多分散度（ＰＤＩ）およびｍＲＮＡの封入パーセント（％ＥＥ）について評価した。
【0296】
カチオン性脂質としてＭＬ－２を含み、ｍＴＥＧに溶解した脂質を使用して製造された低容量（１：１）ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は６９％の封入効率を達成した。対照的に、カチオン性脂質としてＭＬ－２を含み、エタノールに溶解した脂質を使用して製造された低容量（１：１）ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、安定的に低容量製剤に製造することができず、混合後に沈殿を示した。
【0297】
カチオン性脂質としてＭＣ－３を含み、ｍＴＥＧに溶解した脂質を使用して製造された低容量（１：１）ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は９９％の封入効率を達成した一方で、カチオン性脂質としてＭＣ－３を含み、エタノールに溶解した脂質を使用して製造された低容量（１：１）ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は９５％の封入を示した。
【0298】
【表4】
【0299】
結果は、ｍＴＥＧが低容量エタノールフリーｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤に使用するのに適しており、エタノール製造ＬＮＰ製剤と比較して混合後の改善されたｍＲＮＡ安定性および潜在的に改善された封入効率を提供することを示した。
【実施例4】
【0300】
様々なポリマーおよび脂質を使用したエタノールフリー製剤の試験
この実施例は、様々なポリマーおよび脂質を使用したエタノールフリーＬＮＰ製剤を試験する。
この実施例は、様々なポリマーおよび脂質を使用したエタノールフリーＬＮＰ製剤を試験する。
【0301】
それだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｍＰＥＧ、テトラエチレングリコールモノメチルエーテルおよびペンタエチレングリコールモノメチルエーテルを含む様々な両親媒性ポリマーを使用してＬＮＰ製剤を製造する。
【0302】
ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、および１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）を含む１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質を使用してＬＮＰ製剤を製造する。
【0303】
分解を示さない成分を使用したＬＮＰ製剤を、実施例２に記載されるように封入効率、ＬＮＰ径および多分散指数についてさらに分析する。
【0304】
好ましい封入効率を示すＬＮＰ製剤を、実施例３に記載されるように低容量製剤で試験する。
【0305】
上記の工程に従うことによって、安全で、費用対効果が高い、低容量エタノールフリーＬＮＰ製剤がｍＲＮＡ送達用に製造される。
【実施例5】
【0306】
インビボでのエタノールフリーＬＮＰ製剤におけるｍＲＮＡ送達の試験
この実施例は、エタノールフリーＬＮＰ製剤のインビボ効能の測定を例示する。
この実施例は、エタノールフリーＬＮＰ製剤のインビボ効能の測定を例示する。
【0307】
エタノールフリーＬＮＰ製剤およびエタノールＬＮＰ製剤を実施例１に記載されるようにｍＲＮＡ送達用に製造した。
【0308】
エタノールフリー製剤のインビボ効能を試験するために、ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを含むエタノールフリーＬＮＰ製剤およびエタノールＬＮＰ製剤を、０．１～１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の様々な用量、例えば０．５ｍｇ／ｋｇマウス体重で、尾静脈注射を介してマウスに静脈内（ＩＶ）または気管内送達した。
【0309】
様々な器官中でのＬＮＰ生体内分布を、生物発光試験によって、ならびにｍＲＮＡおよびタンパク質発現の定量的測定によって評価した。エタノールフリーＬＮＰ製剤で得られた生体分布、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現結果を、エタノールＬＮＰ製剤で得られた生体分布、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現と比較した。
【0310】
肺送達
マウスに、エタノールフリー封入プロセスまたはエタノール含有封入プロセスのいずれかを使用して製造されたＬＮＰに封入されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡを投与した。これらのインビボ試験のために、マウスに、カテーテルを介してｍＲＮＡ含有ＬＮＰを気管内投与し、投与約２４時間後にＦＦＬタンパク質発現について評価した。
マウスに、エタノールフリー封入プロセスまたはエタノール含有封入プロセスのいずれかを使用して製造されたＬＮＰに封入されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡを投与した。これらのインビボ試験のために、マウスに、カテーテルを介してｍＲＮＡ含有ＬＮＰを気管内投与し、投与約２４時間後にＦＦＬタンパク質発現について評価した。
【0311】
マウスに投与したＦＦＬ ｍＲＮＡ ＬＮＰの特徴を以下の表５に示す。表５に要約されるように、エタノールフリー条件（例えば、エタノールの代わりにｍＴＥＧを使用）で封入された、またはエタノール含有条件で封入された、低容量（１：１脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）または高容量（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）製剤をこの試験に使用した。
【0312】
【表5】
【0313】
表５は、エタノールフリーｍＲＮＡ条件を使用したｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤の封入が、エタノール含有ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液；高容量条件）と同様の、またはエタノール含有ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤（１：１脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液；低容量条件）より優れた封入および径パラメータを有していたことを示している。
【0314】
インビボ肺送達試験の結果を図１に要約する。図１は、エタノールフリー封入プロセス（例えば、ｍＴＥＧ）を使用して高容量条件（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）を使用して封入されたｍＲＮＡ ＬＮＰを投与されたマウスが、高容量（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）エタノール含有封入プロセスを使用して封入されたｍＲＮＡ ＬＮＰを受けた動物と比較して、動物内でより多量のタンパク質が発現されたことを示している。
【0315】
結果は、インビボでのｍＲＮＡ送達におけるエタノールフリーＬＮＰ製剤の効能および実行可能性を示した。
【0316】
静脈内送達
マウスに、エタノールフリー封入プロセスを使用して製造されたＬＮＰに封入されたオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡを投与した。これらのインビボ試験のために、マウスにｍＲＮＡ含有ＬＮＰを尾静脈注射を介して静脈内投与し、その後、投与２４時間後に血清および肝臓でのＯＴＣタンパク質発現について評価した。
マウスに、エタノールフリー封入プロセスを使用して製造されたＬＮＰに封入されたオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡを投与した。これらのインビボ試験のために、マウスにｍＲＮＡ含有ＬＮＰを尾静脈注射を介して静脈内投与し、その後、投与２４時間後に血清および肝臓でのＯＴＣタンパク質発現について評価した。
【0317】
マウスに投与したＯＴＣ ｍＲＮＡ ＬＮＰの特徴を以下の表６に示す。表６に要約されるように、エタノールフリー条件で封入された低容量（１：１脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）または高容量（１：４脂質溶液対ｍＲＮＡ溶液）製剤をこの試験に使用した。この試験の対照として、ＭＣ－３およびＤＯＰＥを使用して製剤化されたＯＴＣ ｍＲＮＡ ＬＮＰを使用した。
【0318】
【表6】
【0319】
これらの試験からのデータを図２に提示する。データは、以下のｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：（ＭＣ－３）１：１ ｍＴＥＧ；（ＭＬ－２）１：４ ｍＴＥＧ；および（ＭＬ－２）１：１ ｍＴＥＧの使用において、ＯＴＣの発現が血清および肝臓に存在していたことを示している。結果は、インビボでのｍＲＮＡ送達におけるエタノールフリーＬＮＰ製剤の効能および実行可能性を示した。
【0320】
数時間および数日間にわたる測定を行うことによって、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現のさらなる安定性試験をエタノールフリーＬＮＰ製剤およびエタノールＬＮＰ製剤で比較する。
【0321】
等価物および範囲
当業者であれば、日常的な実験でしかないものを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の明細書に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に示される通りである。
当業者であれば、日常的な実験でしかないものを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の明細書に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に示される通りである。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】