特表 2023-526309 パラミクソビルスウイルスベクターに基づくＣＯＶＩＤ－１９に対する組換えワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-21

(54)【発明の名称】パラミクソビルスウイルスベクターに基づくＣＯＶＩＤ－１９に対する組換えワクチン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20230614BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230614BHJP

   A61K 39/17 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 39/155 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230614BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20230614BHJP

   C12N 7/04 20060101ALI20230614BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230614BHJP

   C12N 15/50 20060101ALN20230614BHJP

   C07K 14/165 20060101ALN20230614BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z

A61P31/14 ZNA

A61K35/76

A61K39/17

A61K39/155

A61K31/7088

A61K9/08

A61K9/107

C12N7/04

C12N7/01

C12N15/50

C07K14/165

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022569263

(86)(22)【出願日】2021-02-22

(85)【翻訳文提出日】2023-01-10

(86)【国際出願番号】 IB2021051491

(87)【国際公開番号】W WO2021229311

(87)【国際公開日】2021-11-18

(31)【優先権主張番号】PCT/IB2020/054545

(32)【優先日】2020-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】511121849

【氏名又は名称】ラボラトリオ アヴィメキシコ エスエー ディーイー シーヴィー

【氏名又は名称原語表記】ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯ ＡＶＩ－ＭＥＸ， Ｓ．Ａ． ＤＥ Ｃ．Ｖ．

(71)【出願人】

【識別番号】517099708

【氏名又は名称】アイカーン スクール オブ メディスン アット マウント サイナイ

【氏名又は名称原語表記】ＩＣＡＨＮ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＴ ＭＯＵＮＴ ＳＩＮＡＩ

【住所又は居所原語表記】１５０ Ｅａｓｔ ４２ｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ， ２ｎｄ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １００１７ （ＵＳ）．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181847

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 かおり

(72)【発明者】

【氏名】ベルナルド ロザノ デュべナード

(72)【発明者】

【氏名】アーネスト ソト プリアンテ

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド サルファティ ミズラヒ

(72)【発明者】

【氏名】フェリパ カストロ ペラルタ

(72)【発明者】

【氏名】ジョルジーナ パス デ ラ ローザ

(72)【発明者】

【氏名】ピーター パレス

(72)【発明者】

【氏名】アドルフォ ガルシア サストレ

(72)【発明者】

【氏名】フロリアン クラマー

(72)【発明者】

【氏名】ウィーナ サン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA45

4C076AA11

4C076AA17

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB25

4C076CC35

4C076FF11

4C076FF68

4C085AA03

4C085DD01

4C085EE01

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA55

4C086MA59

4C086NA14

4C086ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA13

4C087MA17

4C087MA22

4C087MA55

4C087MA59

4C087NA14

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

ニューカッスル病ウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤を含み、前記ウイルスベクターが、挿入された外因性SARS－CoV－２ヌクレオチド配列を有し、かつ、細胞性免疫応答を生成することができるウイルスであることを特徴とする、COVID－１９に対する活性化または不活性化組換えワクチンが記載されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞性免疫応答を発生させることができるウイルスベクターであって、
ウイルスベクターが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の抗原性部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を含み、かつニワトリ胚において少なくとも３回連続継代後に前記ウイルスベクターおよび抗原性部位に安定性を与えるように改変された、パラミクソウイルスである、ウイルスベクター。

【請求項2】

使用される前記ウイルスベクターが、活性化形態または不活性化形態で使用される、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項3】

１１７位のフェニルアラニンおよび病原性を生じるQ１１４位に近い位置の塩基性アミノ酸が前記パラミクソウイルスから除去されている、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項4】

前記パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルスおよびセンダイウイルスから選択される、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項5】

前記パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス（NDV）である、請求項４に記載のウイルスベクター。

【請求項6】

前記NDVがLaSota、B１、QV４、Ulster、RoakinおよびKomarov株から選択される、請求項５に記載のウイルスベクター。

【請求項7】

前記NDVが配列番号６または配列番号１４を含む、請求項６に記載のウイルスベクター。

【請求項8】

前記外因性ヌクレオチド配列が、前記SARS－CoV－２のスパイク糖タンパク質Sをコードする配列、またはそれに由来する配列をコードする配列から選択される、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項9】

前記外因性ヌクレオチド配列は、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットをコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS2サブユニットをコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットとS2サブユニットの２つをコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1またはS2サブユニットの少なくとも１つの断片をコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS2サブユニットをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1およびS2サブユニットの２つをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1またはS2サブユニットの少なくとも１つのフラグメントをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットとS2サブユニットの２つをコードする配列であって、S1の配列のアミノ酸1から460に対応するヌクレオチド間に位置する少なくとも１つのエピトープを欠いている配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットをコードする配列であって、S1の配列のアミノ酸1から460に対応するヌクレオチド間に位置する少なくとも１つのエピトープを欠いている配列、または、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1およびS2サブユニットの２つをコードする配列であって、S2サブユニットにプロリンの少なくとも２つの置換を含めることにより、融合前の形で安定化されている配列、
から選択される、請求項８に記載のウイルスベクター。

【請求項10】

前記外因性ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５のいずれかの配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される、または、配列番号１１、配列番号１２、もしくは配列番号１３のいずれかのアミノ酸配列に翻訳するいずれかの配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される、請求項９に記載のウイルスベクター。

【請求項11】

S１の配列のアミノ酸１～４６０に対応するヌクレオチド間に位置するエピトープが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列から選択される、請求項９に記載のウイルスベクター。

【請求項12】

コロナウイルス疾患２０１９（COVID－１９）に対するワクチンであって、
ニワトリ胚において少なくとも３回連続継代後に前記ウイルスベクターおよび抗原性部位に安定性を与えるように改変された、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の抗原性部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を含むパラミクソウイルスベクターと、
薬学的に許容される担体、アジュバント、および／または賦形剤と、
を含む、ワクチン。

【請求項13】

前記パラミクソウイルスが生きている、または、不活化されている、請求項１２に記載のワクチン。

【請求項14】

パラミクソウイルスに病原性を与える１１７位のフェニルアラニンおよびQ１１４位に近い位置の塩基性アミノ酸がパラミクソウイルスから除去されている、請求項１２に記載のワクチン。

【請求項15】

前記パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルスおよびセンダイウイルスから選択される、請求項１３に記載のワクチン。

【請求項16】

前記パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス（NDV）である、請求項１３に記載のワクチン。

【請求項17】

前記NDVが、LaSota、B１、QV４、Ulster、RoakinおよびKomarov株から選択される、請求項１６に記載のワクチン。

【請求項18】

前記NDVが、配列番号６または配列番号１４から選択される、請求項１６に記載のワクチン。

【請求項19】

前記外因性ヌクレオチド配列が、前記SARS－CoV－２スパイクタンパク質Sをコードする配列、または、これに由来する配列をコードする配列から選択される、請求項１２に記載のワクチン。

【請求項20】

前記外因性ヌクレオチド配列は、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットをコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS2サブユニットをコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットとS2サブユニットの２つをコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1またはS2サブユニットの少なくとも１つの断片をコードする配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS2サブユニットをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1およびS2サブユニットの２つをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1またはS2サブユニットの少なくとも１つのフラグメントをコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットとS2サブユニットの２つをコードする配列であって、S1の配列のアミノ酸1から460に対応するヌクレオチド間に位置する少なくとも１つのエピトープを欠いている配列、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1サブユニットをコードする配列であって、S1の配列のアミノ酸1から460に対応するヌクレオチド間に位置する少なくとも１つのエピトープを欠いている配列、または、
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS1およびS2サブユニットの２つをコードする配列であって、S2サブユニットにプロリンの少なくとも２つの置換を含めることにより、融合前の形で安定化されている配列、
から選択される、請求項１９記載のワクチン。

【請求項21】

前記外因性ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のいずれかの配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される、または、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のいずれかのアミノ酸配列に翻訳するいずれかの配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される、請求項１９に記載のワクチン。

【請求項22】

S１の配列のアミノ酸１～４６０に対応するヌクレオチドの間に位置するエピトープが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列から選択される、請求項１９に記載のワクチン。

【請求項23】

前記薬学的に許容可能な担体が、好ましくは水溶液またはエマルジョンである、請求項１２に記載のワクチン。

【請求項24】

前記薬学的に許容可能な担体が、水－油、油－水および水－油－水エマルジョンから選択される、請求項２３に記載のワクチン。

【請求項25】

前記薬学的に許容可能な担体が、水－油－水エマルジョンである、請求項２４に記載のワクチン。

【請求項26】

投与経路に従って決定される、１０^6.0 ～１０^10.0 CEID50%／mL／体積用量の濃度の前記ウイルスを含む、請求項１２に記載のワクチン。

【請求項27】

抗原反応を達成するのに必要とされる、活性化したウイルスの濃度が、用量当たり１０^6.0 ～１０^8.5 CEID５０％／mLである、請求項２６に記載のワクチン。

【請求項28】

用量当たりの容量が０．２～２mLである、請求項２６に記載のワクチン。

【請求項29】

筋肉内投与、鼻腔内投与、皮下投与、スプレー投与、または、噴霧投与に適合されている、請求項１２に記載のワクチン。

【請求項30】

筋肉内投与または鼻腔内投与に適合されている、請求項２９に記載のワクチン。

【請求項31】

コロナウイルスによって引き起こされるCOVID－１９疾患の治療または予防に使用するための、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む、パラミクソウイルス。

【請求項32】

０．２～２mLの容量で１０^6.0 ～１０^10.0 CEID５０％／mLの用量での投与に適合されている、請求項３１に記載のパラミクソウイルス。

【請求項33】

１０^6.5 から１０^8.5 CEID５０％／mLの間の用量での投与に適合されている、請求項３２に記載のパラミクソウイルス。

【請求項34】

筋肉内投与、鼻腔内投与、皮下投与、スプレー投与、または、噴霧投与に適合されている、請求項３３に記載のパラミクソウイルス。

【請求項35】

１０^7.5～１０^8.5 CEID５０％／mLの用量での鼻腔内投与に適合されている、請求項３３に記載のパラミクソウイルス。

【請求項36】

１０^7.0 ～１０^8.5 CEID５０％／mLの用量での筋肉内投与に適合されている、請求項３３に記載のパラミクソウイルス。

【請求項37】

２つの用量での投与に適合されている、請求項３４～３６のいずれかに記載のパラミクソウイルス。

【請求項38】

第１の用量と第２の用量との間隔が７～３５日である投与に適合されている、請求項３７に記載のパラミクソウイルス。

【請求項39】

第１の用量と第２の用量との間隔が２１～２８日である投与に適合されている、請求項３８に記載のパラミクソウイルス。

【請求項40】

鼻腔内経路による第１の用量での投与、および筋肉内経路による第２の用量での投与に適合されている、請求項３７に記載のパラミクソウイルス。

【請求項41】

SARS－CoV－２による感染に対する粘膜免疫を生成するように適合されている、請求項３１に記載のパラミクソウイルス。

【請求項42】

コロナウイルスによって引き起こされるCOVID－１９疾患のためのワクチンを調製するための、急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を含むパラミクソウイルスの使用。

【請求項43】

０．２～２mLの容量で１０^6.0 ～１０^10.0 CEID５０％／mLの用量で投与される、請求項４２に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項44】

１０^6.5 ～１０^8.5 CEID５０％／mLの用量で投与される、請求項４３に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項45】

筋肉内、鼻腔内、皮下、スプレーにより、または、噴霧により投与される、請求項４３に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項46】

１０^7.5 から１０^8.5 CEID５０％／mLの用量で鼻腔内投与される、請求項４４に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項47】

１０^7.0 から１０^8.5 CEID５０％／mLの用量で筋肉内投与される、請求項４４に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項48】

２つの用量で投与される、請求項４５～４７のいずれか一項に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項49】

第１の用量と第２の用量との間隔が７～３５日で投与される、請求項４８に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項50】

第１の用量と第２の用量との間隔が２１～２８日で投与される、請求項４９に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項51】

第１の用量が鼻腔内に投与され、第２の用量が筋肉内に投与される、請求項４８に記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項52】

パラミクソウイルスがSARS－CoV－２感染に対する粘膜免疫を生成する、請求項４２記載のパラミクソウイルスの使用。

【請求項53】

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の抗原部位を含む活性化ウイルスであって、SARS－CoV－２抗原の鼻腔内経路による第１の用量、続いての筋肉内経路による第２の用量において、コロナウイルスによって引き起こされるCOVID－１９疾患の治療または予防に使用されるように適合されている、活性化ウイルス。

【請求項54】

第２の用量の抗原が、第１の用量の活性化ウイルスと同じである、請求項５３に記載の活性化ウイルス。

【請求項55】

第２の用量の抗原が不活性化形態である、請求項５４に記載の活性化ウイルス。

【請求項56】

SARS－CoV－２抗原の鼻腔内経路による第１の用量、続いての筋肉内経路による第２の用量の投与における、コロナウイルスによって引き起こされるCOVID－１９疾患の治療または予防のためのワクチンを調製するための、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の抗原部位を含む活性化ウイルスの使用。

【請求項57】

第２の用量の抗原が、第１の用量の活性化ウイルスと同じである、請求項５６に記載の使用。

【請求項58】

第２の用量の抗原が不活性化形態である、請求項５７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コロナウイルス疾患２０１９（COVID－１９）の予防および制御に使用される技術に関し、より詳細には、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）に対する抗原活性を有するタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列を挿入した組換えウイルスベクターワクチン、および薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤に関する。

【背景技術】

【0002】

コロナウイルス（CoV）は、感冒および中東呼吸器症候群（MERS－CoV）や重症急性呼吸器症候群（SARS－CoV）などの重篤な疾患を引き起こすウイルスのファミリーである。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型（SARS－CoV－２）は、２０１９年１２月に中国の武漢で始まったコロナウイルス疾患２０１９（COVID－１９）の流行の病原体である。２０２０年３月１１日、世界保健機関（WHO）はCOVID－１９をパンデミックと宣言した。

【0003】

現在、COVID－１９を治療するために利用可能な薬物またはワクチンはなく、主に併存疾患を有する高齢患者においてかなりの数の死亡が報告されている。２０２０年５月４日までに全世界で３４０万件以上の症例が２３９０００件以上の死亡とともに報告され、主に高齢者人口の大半が感染した国である欧米で増加が続いている。これまでのところ、COVID－１９の蔓延に対抗する唯一の効果的な対策は、集団を分離し、感染者を隔離し、商業活動および事業の大半を停止させ、重度の症状を呈する患者に対する集中的な臨床療法を行うことである。しかしながら、このような封じ込め措置の適用は、今日このパンデミックと闘っているすべての国の経済に劇的な影響を与えている。

【0004】

この新興感染症に対する解決策を見つける方法において、ベクター化ワクチンは、病原体全体を含まない活性（生）ワクチンのアプローチを提供する。世界保健機関（https://www.who.int/blueprint/priority-diseases/key-action/novel-coronavirus-landscape-ncov.pdf、２０２０年５月４日に相談された）によると、ヒトアデノウイルス、MVA、VSV、麻疹などのベクターをベースにCOVID－１９に対する組換えワクチンを開発している施設や製薬企業もある。この点に関して、以前にSARS－CoVウイルスの場合、これらのベクターを用いていくつかのベクター化ワクチンが記載された。しかしながら、あるグループは、MVA／SARS－CoVワクチンで免疫化したフェレットが肝炎を発症したことを見出した（CZUB, Markus, et al. Evaluation of modified vaccinia virus Ankara based recombinant SARS vaccine in ferrets, Vaccine, 2005, vol. 23, no. 17-18, p. 2273-2279）。SARS－CoVの部分的または完成スパイク糖タンパク質Sを発現する欠陥５型ヒトアデノウイルスの複製に基づくSARS－CoVに対するワクチン構築物について、ラットおよびサルにおけるその免疫原性が評価された（LIU, Ran-Yi, et al., Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS-CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats. Virus Research, 2005, vol. 112, no. 1-2, p. 24-31; および GAO, Wentao, et al., “Effects of a SARS-associated coronavirus vaccine in monkeys”. The Lancet, 2003, vol. 362, no. 9399, p. 1895-1896）が、予防接種は高用量のワクチンに依存し、安全性および予防効果は実証されていない。また、SARS－CoVスパイク糖タンパク質を発現するための一般的な小児呼吸器病原体である３型ヒトパラインフルエンザウイルスの弱毒化バージョンが記載されており、これにより、単回の鼻腔内および気管内接種がハムスターおよびアフリカミドリザルにおける課題においてSARS－CoVに対して免疫原性および保護的であることが実証された（BISHT, Himani, et al., Severe acute syndrome respiratory coronavirus spike protein Expressed by attenuated vaccinia virus protectively immunizes mice, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2004 vol. 101, no. 17, p. 6641-6646）。しかしながら、一般的な病原体に基づく任意のベクターについての懸念は、ウイルスベクターの感染および複製を制限し、その免疫原性を低下させるであろう以前の暴露に直面する重大な免疫を成人集団がが有することである。実際、ワクシニアウイルスでベクター化されたワクチンと、げっ歯類、非ヒト霊長類、およびヒトにおける５型ヒトアデノウイルスを有するベクターの免疫原性の比較から、ベクターに対する既存の免疫は、これらのワクチンの免疫原性を大幅に低下させることが示された（KANESA-THASAN, Niranjan, et al. Safety and immunogenicity of NYVAC-JEV and ALVAC-JEV attenuated recombinant Japanese encephalitis virus -poxvirus vaccines in vaccinia-nonimmune and vaccinia-immune humans. Vaccine, 2000, vol. 19, no. 4-5 , p. 483-491; SHARPE, Sally, et al. Induction of simian immunodeficiency virus (SIV) -specific CTL in rhesus macaques by vaccination with modified vaccinia virus Ankara expressing SIV transgenes: influence of pre-existing anti-vector immunity. Journal of General Virology, 2001, vol. 82, no. 9, p. 2215-2223; および ZHI, Yan, et al. Efficacy of severe acute respiratory syndrome vaccine based on a nonhuman primate adenovirus in the presence of immunity against human adenovirus. Human gene therapy, 2006, vol. 17, no. 5, p. 500-506）。

【0005】

一方、ニューカッスル病ウイルス（NDV）は、例えば特許文献WO2011059334、US9476033またはUS10308913において、ヒトのためのワクチンベクターを開発するために潜在的に使用することができるベクターとして記載されている。NDVは、パラミクソウイルス科の未分節のマイナス鎖RNAウイルスであり、その自然宿主は鳥であり、これにより一般的なヒト病原体とは抗原的に異なる。DiNapoli et al.,2007（DINAPOLI, Joshua M., et al., Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, vol. 104, no. 23, p. 9788-9793)のグループは、SARS-CoV複製のピーク時に剖検によって収集された鼻および肺組織の直接分析によるSARS-CoVを標的病原体として、呼吸器ワクチンの局所ベクターとして、呼吸器ワクチンの局所ベクターとしてSARS－CoVスパイク糖タンパク質Sを発現するNDVを評価した。このワクチンを２回接種して呼吸器から免疫したアフリカミドリザルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとは異なる実験用ワクチンで免疫され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶで攻撃された動物動物で観察された二次反応に匹敵するＳＡＲＳ－ＣｏＶの中和抗体価を発現することがわかった。スパイク糖タンパク質Sを発現するNDVで免疫した動物に高用量のSARS－CoVをチャレンジしたところ、ウイルス複製のピーク時に剖検により採取した肺組織の直接ウイルス分析では、対照動物と比較してSARS－CoVの肺力価が平均２３６または１１０２倍の低下を示した。

【0006】

上記にもかかわらず、SARS－CoVスパイク糖タンパク質SはSARS－CoV－２のそれとと重要な差異がある（WALLS, Alexandra C., et al. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell, 2020）。コロナウイルスのスパイク糖タンパク質（S）は細胞への侵入を促進し、抗体の主要な標的となる。Wall, et al.2020によれば、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sは、S１／S２サブユニット間の境界にフリン切断部位を有し、これはバイオジェネシス中に処理され、このウイルスをSARS－CoVおよびSARS関連コロナウイルスと有意に鑑別する。プロテアーゼに対する多塩基切断部位を有するコロナウイルスが初めて記載された。加えて、スパイク糖タンパク質Sは、高度に安定な溶融後コンホメーションになる準安定なプレフュージョンコンホメーションを有し、これは膜の溶融を促進するが、組換え生産が非常に困難になる。このようにして、NDVまたはいくつかの他のウイルスに基づくCOVID－１９に対する組換えベクター化ワクチンが、COVID－１９の治療または予防に有効であるかどうか、およびSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sを含むウイルスベクターの構築物が安定であるかどうか、すなわち、工業規模でのワクチンの製造に適したウイルス力価を達成するために、細胞株において数回の連続継代後に複製する能力を失わないかどうかを知るか、または推定することはできない。

【発明の概要】

【0007】

さらに、組換えワクチンについては、組換えワクチンは、SARS－CoV－２遺伝子を挿入してパンデミックの制御を可能にする免疫応答を生成する最も効果的な方法は決定されておらず、ニューカッスル ウイルス ベクターではなおさらである。

【0008】

したがって、現在のパンデミックを効果的に制御するために十分なレベルの防御を提供するCOVID－１９に対するワクチンを開発することは絶対に必要である。

【0009】

本発明の目的
先行技術の欠点を考慮すると、本発明の目的は、効果的であるコロナウイルス疾患２０１９（COVID－１９）に対する組換えパラミキソウイルスのウイルスベクターワクチンを提供することである。

【0010】

本発明の別の目的は、COVID－１９を制御するための組換えパラミキソウイルスベクターワクチンの使用を提供することである。

【0011】

本発明のさらなる目的は、急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）に対する抗原活性を有するタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列を挿入したパラミクソウイルスベクターの構築物であって、細胞株において連続的に継代された後に安定である、構築物を提供することである。

【0012】

これらおよび他の目的は、本発明によるCOVID－１９に対する組換えパラミクソウイルスベクターワクチンによって達成される。

【0013】

本発明の簡単な説明
このために、細胞性免疫応答を生成することができる重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の外因性ヌクレオチド配列、および薬学的に許容される担体、補助剤、および／または賦形剤を挿入したニューカッスル病ウイルスに基づくウイルスベクターを含む組換えワクチンが発明されている。

【発明を実施するための形態】

【0014】

発明の詳細な説明
本発明の開発中、急性呼吸器疾患コロナウイルス２（SARS－CoV－２）の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、細胞性免疫応答を生成することができるパラミクソウイルスベクターと、薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤とを含む組換えワクチンが、コロナウイルス疾患２０１９（COVID－１９）に対して適切な保護を提供することが予想外に見出された。

【0015】

使用されるウイルスベクターは、活性化（生）したものであり得、または、ウイルスベクターとして機能し、SARS－CoV－２の抗原部位をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスが複製の特性を失っていると理解されることにより、不活性化（不活化）であり得る。不活性化は、当該技術でよく知られている物理的または化学的手順、好ましくはホルムアルデキシドまたはベータプロピオラクトンによる化学的不活性化によって達成される（Office International des Epizooties 2008, Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Office International des Epizooties, France, p. 576-589）。一方、活性型あるいは生きたウイルスは、その複製能力を維持していると理解されている。

【0016】

好ましくは、使用されるウイルスベクターは、長潜伏期性（lentogenic）、亜病原性（mesogenic）および短潜伏期性（velogenic）ウイルスを含む任意の血清型、遺伝子型または遺伝子クラスを含む任意のパラミクソウイルスから選択されるパラミクソウイルスである。同様に、１１７位のフェニルアラニンおよびパラミクソウイルスに病原性を与えるQ１１４位に近い位置の塩基性アミノ酸、またはニューカッスル病ウイルス（NDV）またはセンダイウイルスなどの鳥類に感染するアブラウイルス属に含まれるパラミクソウイルスを除去するために、逆遺伝学的手法を実施し得る、パラミクソウイルスを用いることが好ましい。より好ましくは、ウイルスベクターはNDVであり、前記ウイルスベクターは、好ましくは、LaSota、B１、QV４、Ulster、Roakin、Komarov株などの長潜伏期性株または亜病原性株から選択される。好ましくは、組換えウイルスはLaSota株由来である。さらにより好ましくは、NDVウイルスベクターは配列番号６または配列番号１４を含む。

【0017】

SARS－CoV－２の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列に関して、本発明の場合、使用されるヌクレオチド配列は、好ましくは、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sをコードする配列またはその由来の配列をコードする配列から選択される。SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sは、宿主細胞受容体（S１サブユニット）への結合およびウイルス膜と細胞膜の融合（S２サブユニット）を担う２つの機能的サブユニットを含む。本発明の好ましい実施形態において、SARS－CoV－２の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列は、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットをコードする配列、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS２サブユニットをコードする配列、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットおよびS２サブユニットの２つをコードする配列、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットまたはS２サブユニットの少なくとも１つをコードする配列、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットをコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS２サブユニットをコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットおよびS２サブユニットの２つをコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットまたはS２サブユニットの少なくとも１つのフラグメントをコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列、S１の配列のアミノ酸１～４６０に対応するヌクレオチドの間に位置する少なくとも１つのエピトープを欠くSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットおよびS２サブユニットの２つをコードする配列、S１の配列のアミノ酸１～４６０に対応するヌクレオチドの間に位置する少なくとも１つのエピトープを欠くSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットをコードする配列、またはSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１サブユニットおよびS２サブユニットの２つをコードする配列であって、S２サブユニットにプロリンの少なくとも２つの置換を含めることによってそのプレ融合形態で安定化されたものから選択される。好ましい態様において、S１の配列のアミノ酸１～４６０に対応するヌクレオチド間に位置するエピトープは、アミノ酸配列配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０から選択される。他の好ましい実施形態において、SARS－CoV－２の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のいずれかの配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される。さらに好ましい態様において、S２サブユニットにプロリンの少なくとも２つの置換を含めることによってそのプレ融合形態で安定化されたSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質SのS１およびS２サブユニットの２つをコードする配列は、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のいずれかのアミノ酸配列に翻訳する任意の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される。

【0018】

本発明のワクチンのSARS－CoV－２の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列は、関心のあるヌクレオチド配列の化学合成によって調製することができ、その結果、NDVウイルスベクターに挿入することができる。外来性ヌクレオチド配列の挿入は、分子生物学の標準的クローニング技術を用いて行われ、NDVゲノムの任意の遺伝子間領域に挿入することができる。こうして産生された感染性クローンを細胞培養にトランスフェクトし、組換えウイルスまたは親ウイルスを作製する。

【0019】

ウイルスは、SPFニワトリ胚、市販細胞株、またはウイルスの増殖のために明示的に設計された細胞株など、増殖に適した任意のシステムにおいて、抗原反応を達成するのに必要なウイルスの濃度、好ましくは１０^6.0 ～１０^10.0 CEID５０％（ニワトリ胚感染用量５０％）／mLに達するまで、連続継代により複製する。このウイルスは、細胞培養物から一旦救出された成長のために使用されるシステムにおいて、少なくとも３回連続して継代された後に安定であり、その結果、工業的規模で安定した生産が達成されることが好ましい。ウイルス単離のために、ウイルスは増殖に適したシステムから除去され、典型的には、濾過、限外濾過、勾配遠心分離、限外遠心分離、およびカラムクロマトグラフィーなどの周知の清澄化手順によって、細胞または他の成分から分離され、そして、例えばプラークアッセイなどの周知の手順を用いて所望に応じてさらに精製され得る。

【0020】

ワクチンがアクティブである（活性化）態様において、それは天然レントゲンアクティブワクチンウイルスであるか、または当技術分野で既知の方法によって弱毒化されたものである。一方、ワクチンを不活化すると、抗原応答を達成するのに必要なウイルス濃度に達したときに、ウイルスを不活化する。好ましくは、不活化は、当技術分野で周知の物理的または化学的手法により、好ましくはホルムアルデヒド、ベータプロピオラクトンまたはバイナリーエチレンイミンによる化学的不活化により行われる。

【0021】

本発明のワクチンの薬学的に許容可能な担体は、好ましくは水溶液またはエマルジョンである。より詳細には、活性化ウイルスワクチンの場合には水溶液が好ましく、不活化ワクチンの場合には、使用される担体は、不活化ワクチンに対する免疫応答を増強するために使用される免疫アジュバントと適合性であることが好ましい。ワクチンが不活化されるさらなる実施形態において、ワクチンは、好ましくは、薬学的に許容されるアジュバント（補助剤）を伴う。アジュバントが使用される実施形態においては、スクアレンに基づくアジュバントが好ましく、好ましくは、MF－５９（登録商標）もしくはAddaVax（登録商標）もしくはAS０３（登録商標）、TLR－９受容体アゴニスト、例えばCpG－１０１８、またはカチオン性脂質、例えばR－DOTAPと呼ばれるものが好ましい。

【0022】

ワクチンの投与については、活性化ワクチンか不活化ワクチンかに応じて、それぞれの場合に適切な手段および形態を用いて、筋肉内、鼻腔内、皮下、スプレー、または、噴霧により投与することができる。好ましくは、ワクチン投与は、少なくとも１回、筋肉内および／または鼻腔内に行われる。

【0023】

特に好ましい態様において、ワクチンは、選択された投与経路に従って適用されるワクチンの容量に応じて、投与経路を維持するか、または投与経路を変更することによって、好ましくは１用量当たり１０^6.0 ～１０^8.5 CEID５０％／mLの間のウイルス濃度で、より高い免疫反応を生じさせるために少なくとも２回投与される。好ましくは、ワクチンは、活性型または不活性型のいずれかで２回筋肉内投与され、その活性型で２回鼻腔内投与され、または１回鼻腔内投与され、続いて筋肉内投与される。２回投与される実施形態におけるワクチンの投与は、１回目と２回目の投与の間の７～３５日の期間内、好ましくは１回目と２回目の投与の間の１４～２８日の期間内に行うことができ、より好ましくは、１回目はその活性形態の鼻腔内経路により、２回目はその活性形態または不活性形態の筋肉内経路により投与する。

【0024】

本発明の別の態様において、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS－CoV－２）、好ましくは本発明の組換えパラミクソウイルスの抗原部位を含む活性化ウイルスの用量を鼻腔内投与し、続いてSARS－CoV－２抗原の第２の筋肉内用量を投与することが可能であり、非常に効率的な免疫反応を達成することが見出された。好ましくは、２回目の投与量の抗原は、１回目の投与量の同じ活性化ウイルスであるが、免疫化が鼻腔内経路によって実施されると、当業者は、任意の他のSARS－CoV－２抗原を筋肉内に送達することが可能であると推測することができる。さらにより好ましくは、第２用量の抗原は、その不活性形態における第１用量の同じウイルスである。

【0025】

好ましくは、本発明のワクチンは、その筋肉内適用に対応するウイルス濃度を、その活性型または不活性型のいずれかで含有する、用量当たり０．５mLの体積で製剤化される。投与経路が鼻腔内である実施形態では、投与量当たりの好ましい体積は０．２mLである。

【0026】

本発明の原理によるワクチンは、さらに、哺乳動物において有害事象を引き起こさない。

【0027】

本発明は、本発明の好ましい実施形態の完全な理解を可能にするために例示の目的でのみ提示される以下の実施例からより良く理解され、上記の詳細な説明に基づいて実施され得る他の図示されていない実施形態が存在しないことを意味するものではない。

【0028】

実施例１
NDV LaSotaベクターの生成
NDV株LaSotaのRNAゲノムをクローニングし、したがって、pLS11801140（配列番号６）と呼ばれるプラスミドDNAの形態のウイルスベクターを作製するために、まず、NDV株LaSotaからの全ウイルスRNAの抽出をトリアゾール法により行った。精製RNAから、ウイルスゲノムのcDNA（相補DNA）の合成を、以前に精製した全RNAをテンプレートとして用いて行った。NDVゲノムの全遺伝子（１５，１８３塩基対（bp））をクローニングするために、「オーバーラップ」末端と付着制限（cohesive restriction）部位を有する７フラグメントをPCRで増幅した。フラグメント１（F１）はヌクレオチド（nt）1-1755から、F２はnt 1-3321から、F３はnt 1755-6580から、F４は6151-10,210から、F５はnt7381-11,351から、F６は11,351-14,995から、F７はnt 14,701-15,186からなる。７つの断片は、標準的な連結技術を用いてpLS11801140（配列番号６）と呼ばれるクローニングベクター内で組み立てられ、これによりNDV LaSotaゲノムを再構築することが可能になり、クローニング後、P遺伝子とM遺伝子との間にユニークなSacII制限部位を含み、これはベクターのこのウイルス領域において関心のある任意の遺伝子のクローニングに役立つ。さらに、pLS11801140＿L289Aと呼ばれる別のベクター（SEQ ID NO:１４）が生成され、その中でpLS11801140について上述したものと同じプロセスが続いたが、NDVゲノムのF遺伝子にアミノ酸L289Aが含まれている。

【0029】

実施例２
ベクターpNDVLS11801140のSacII部位におけるSARS－CoV－２の各種外因性ヌクレオチド配列のクローニング
SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sに由来する各種外因性ヌクレオチド配列をクローニングするために、以下の６つのバージョンのSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質S遺伝子を、Wuhan－Hu－１株（受託番号NC＿０４５５１２．２）に基づいて、ソフトウェアVector NTi（登録商標）を用いて、in silicoで組み立てた：
スパイクS１／S２SARS－CoV－２：SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質S（S１およびS２サブユニットを有する）修飾なし（配列番号１）。
スパイクS１SARS－CoV－２／TMCyto：NDVのF遺伝子の膜貫通および細胞質配列（TMCyto）に融合したSARS－CoV－２スパイク糖蛋白SのS１サブユニットの配列（配列番号２）。
スパイクS１／S２SARS－CoV－２／TMCyto：NDVのF遺伝子の膜貫通および細胞質配列（TMCyto）に融合したSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sのエクトドメインの配列（配列番号３）。
スパイクS１／S２SARS－CoV－２／PreF：NDVのF遺伝子の膜貫通および細胞質配列（TMCyto）に融合したSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sのエクトドメインの配列、NDVタンパクFが融合前のコンホメーションを獲得するように改変。スパイク糖タンパク質Ｓの切断部位をＲＲＡＲからＡに突然変異させ、プロリンの２つの突然変異をアミノ酸Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ（配列番号４）に導入した。
スパイクS１／S２SARS－CoV－２／PreF／－ADE：NDVのF遺伝子の膜貫通および細胞質配列（TMCyto）に融合したSARS－CoV－２スパイク糖蛋白Sのエクトドメインの配列、NDVタンパク質Fが融合前の立体構造を獲得し、抗体依存性感染（ADE）増幅を回避するように改変。スパイク糖タンパク質Sの切断部位をRRARからAに変え、プロラインの２個の変異をアミノ酸K９８６PとV９８７Pに導入し、ポジション３６３～３６８に位置するアミノ酸に対応するエピトープの削除を合成導入した(SEQ ID NO:５）。
スパイクS１／S２SARS－CoV－２／Hexapro：SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sのエクトドメインの配列は、そのプレ（前）融合形態で安定化され、合成遺伝子中に分布する４つの追加プロリンが、NDV（配列番号１１）によって発現されるスパイクタンパク質に対してより大きな安定性を与える。

【0030】

上記の配列を、最初は独立にpUCベクターにクローン化した。次いで、標準的な遺伝子工学技術により、プラスミドpLS１１８０１１４０（配列番号６）に含まれるNDV LaSotaのゲノムのP遺伝子とM遺伝子の間に位置するユニークな制限部位SacIIにpUCインサートをサブクローニングした。プラスミドpLS１１８０１１４０（配列番号６）はまた、５つのバージョンの遺伝子の各々が転写および翻訳され、したがって６つの異なるバージョンのSARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sを生成することができるように、すべての転写および翻訳シグナル配列を含有する。クローン化プロセスの結果、６つのNDV DNA_c （相補的DNA）クローンがそれぞれ生成され、以下のように参照される：
pNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2.
pNDVLS/Spike S1 SARS-CoV-2/TMCyto.
pNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/TMCyto.
pNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/PreF.
pNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/PreF/-ADE.
pNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/Hexapro.

【0031】

作成したプラスミドのそれぞれをPCRにより特徴付け、SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sの各バージョンの存在を検出した。それらは制限酵素消化によっても特徴づけられ、期待される制限パターンが得られた。SARS－CoV－２スパイク糖タンパク質Sの各バージョンのPCR産物の安定性および配列を配列決定により確認した。

【0032】

実施例４
組換えウイルスの生成
上記の実施例で生成したプラスミドはそれぞれ化学的方法で形質転換され、その後、３７℃で連続撹拌下で１６時間、E.coli（大腸菌）中で独立して増殖させた。各クローンのDNAを標準的な分子生物学的手法により精製した。Hep２およびA－５４９細胞においてリポフェクトアミンを用いるトランスフェクション実験では、精製DNAの１０マイクログラム（μg）を用いた。トランスフェクションの４８時間後に、６つのトランスフェクションから生成された各組換えウイルスを上清から回収し、その後のワクチン調製のための特異的病原体フリー（SPF）胚化ニワトリ卵におけるウイルス増殖アッセイに使用した。

【0033】

実施例５
組換えウイルスの伝搬
SPF胚発育鶏卵に生産種子を接種し、前実施例で調製した組換えウイルスのそれぞれを事前に測定した感染用量を加えた。胚を３７℃で４８時間インキュベートし、死亡率を毎日確認した。この期間の後、生きた胚を１日から次の日まで、好ましくは２４時間冷蔵し、羊水－尿膜液（FAA）を無菌条件下で採取し、遠心分離により清澄化した。P遺伝子とM遺伝子の間に位置する配列を増幅する特異的プライマーを用いて、大腸菌細胞培養からレスキューされた組換えウイルスの生成を赤血球凝集により、および、RT－PCRにより、FAAが特徴づけに使用され、回収された組換えウイルスのそれぞれにクローニングされた様々なバージョンのSARS－CoV－２スパイク糖タンパクSの存在を実証した。RT－PCRによって同一性が確立されると、種々のインサートの安定性は、それらの各々を配列決定することによって確立された。SPFニワトリ胚形成卵におけるトランスフェクションおよび増殖アッセイから、以下の６つの組換えウイルスを作製した：
rNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2.
rNDVLS/Spike S1 SARS-CoV-2/TMCyto.
rNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/TMCyto.
rNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/PreF.
rNDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/PreF/-ADE.
r NDVLS/Spike S1/S2 SARS-CoV-2/Hexapro.

【0034】

実施例６
COVID－１９に対する活性ワクチンおよび不活化ワクチンの製造
前例で調製したウイルスは、当該技術分野で以前に記載されたようにFAAから精製された（SANTRY, Lisa A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2018, vol. 9, p. 181-191; およびNESTOLA, Piergiuseppe, et al. Improved virus purification processes for vaccines and gene therapy. Biotechnology and Bioengineering, 2015, vol. 112, no. 5, p. 843-857.）。

【0035】

活性ワクチンは、水溶液中で筋肉内および鼻腔内経路により投与するように調製した。このため、FAAと安定化液（TPG）を混合し、ワクチンの接種に必要な容量に応じて４種類の濃度で３種類のワクチンを得た。すなわち、１回当たり最低１０^7.0 のCEID５０％／mLを提供し、１回当たり最低１０^7.5 のCEID５０％／mLを提供し、１回当たり最低１０^8.0 のCEID５０％／mLを提供し、１回当たり最低１０^8.5 のCEID５０％／mLを提供した。
TPG安定化液１Lの組成を表１に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

同様に、活性ワクチンと同じ方法で精製したウイルスを、PBS中の１０％ホルムアルデヒド溶液を滴下し、化学的不活化により不活化し、水－オイル－水型乳化をアジュバントとして作り、豚を対象とした試験を行った。油相は製剤の２５％、内部水相は製剤の２５％、外部水相は製剤の５０％に相当する。水相の調製には、滅菌精製水とSpan８０およびTween８０型界面活性剤を使用した。油相の調製には、鉱油とSpan８０およびTween８０型界面活性剤を使用した。したがって、４種類の異なった濃度の４種類のワクチンが得られた：最低１０^7.0 CEID５０％／mL／用量を提供し、最低１０^7.5 CEID５０％／mL／用量を提供し、最低１０^8.0 のCEID５０％／mL／用量を提供し、最低１０^8.5 のCEID５０％／mL／用量を提供した。エマルジョンを作製するために、水相を、一定の撹拌下で油相にゆっくりと添加した。特定の粒径を達成するために、ホモジナイザーを使用した。

【0038】

実施例７
連続継代における構造物の安定性試験
実施例７A－２つのプロリンによるタンパク質S（スパイク）の安定化
実施例５に従って作製された構築物のうちの２つを、このような実施例５に記載されたようにSPF胚において連続継代し、回収されたウイルスを、それらの安定性および同一性、特に、得られたウイルス力価および挿入されたSARS－CoV－２抗原の恒久性および完全性に関して確認するために試験した。

【0039】

rNDVLS／Spike S１／S２ SARS－CoV－２／PreFと呼ばれる実施例５の構築物は、遺伝子エクトドメイン（ectodomain）を含み、これは、ニューカッスルウイルスのF（融合）遺伝子の膜貫通領域および細胞質領域（TMCまたはTMCyto）に融合される。この融合により、このキメラ遺伝子（Ectodomain +TMCyto）によってコードされるSpike（スパイク）タンパク質が確実にNewcastleカプシドに取り込まれ、主要抗原としてウイルス表面に露出する。このバージョンのキメラ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒト用に最適化されたコドン利用法を有している。Furin（F）の切断部位を除去し、２つのプロリンを配列に導入して、最終タンパク質の予備溶融構造を確実にした。

【0040】

SARS－CoVウイルスに基づく文献および以前の研究によれば、２つのプロリンを有するこの構造は、SARS－CoV－２ウイルスを中和するための正しい立体配座を有する抗体を生成するためのスパイクタンパク質の構造を安定化することができる。

【0041】

いったん作製した後、得られた親ウイルスをRT－PCRにより特徴付け、NDVゲノム内のクローン化Spike遺伝子の存在を確認した。Newcastleゲノム内のSpike遺伝子の同一性と安定性も配列決定により確認した。また、親ウイルスが発現するSpikeタンパク質の発現を免疫ペルオキシダーゼ法でも確認した。

【0042】

この親ウイルスを、力価を増加させ、マスターシードを生成するために、１０日齢のSPFニワトリ胚において２連続継代により増殖させ、そしてニワトリ胚においてさらに１継代を行い、実験ワクチンを処方したProduction Seed（産生シード）を生成した。

【0043】

マスターシードのRT－PCRによる特性評価試験、種子生産および実験用ワクチンの作成により、挿入されたSpike遺伝子に対応するバンドが増幅され陽性をもたらした。しかしながら、各継代の組換えウイルスの配列を決定したところ、Spike遺伝子の３つの変異が同定された。転写終止コドンはサブユニット２のコード配列に位置し、カルボキシ末端領域にはさらに２つの変異があった。

【0044】

マスターシード、生産種子および実験ワクチンにおけるSpikeタンパク質の発現を検出するための免疫ペルオキシダーゼ分析では、発現の漸減が観察された。継代数が多いほど、抗スパイク抗体によって検出されたタンパク質の量は少なくなり、実験的ワクチンはスパイクタンパク質の割合がほぼゼロになる程度になった。これらの結果は、Spike遺伝子がRT‐PCRにより検出され、ベクターに挿入されたままである可能性を示したが、ニワトリ胚の各継代に伴い、遺伝子の安定性は破壊された。

【0045】

それでもマスターシードは免疫ペルオキシダーゼによるSpike発現の結果が良好であったため、この材料を用いてブタを用いた前臨床試験で使用されたワクチンを製剤化した。

【0046】

しかしながら、０日齢および２１日齢のワクチン接種豚の血清の分析から、実施例５のrNDVLS/Spike S１／S２ SARS－CoV－２／PreF版の組換えウイルスによって発現されたSpikeタンパク質は、特異的IgG抗体も、SARS－CoV－２に対する特異的中和抗体も誘導しないことが示された。

【0047】

この結果は、配列中の２つのプロリンを用いて設計された構造にもかかわらず、Spikeタンパク質の生成が損なわれ、予期されたものとは逆に、中和抗体の誘導に適さない３次元構造を有するSpikeタンパク質の発現をもたらしたことを明らかに示す。

【0048】

実施例７B－６つのプロリンによるタンパク質S（スパイク）の安定化
rNDVLS／Spike S１／S２ SARS－CoV－２／HexaproバージョンのSpike遺伝子は、ニューカッスルウイルスのF（Fusion）遺伝子のTransmembrane and Cytoplasmic region（膜貫通－細胞質領域）（TMCまたはTMCyto）に融合したSpike遺伝子の外部ドメインを保存している。キメラ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒト用に最適化されたコドン利用を有する。Furin（F）の切断部位を除去し、６つのプロリンを配列に導入して、最終タンパク質のHexa‐pro構造を確保した。

【0049】

Hexa－pro親ウイルスおよびその後のマスターシード、生産種子および実験的ワクチンを作製するために、同じ処理法を適用した。この設計では、実施例７A、RT－PCR、配列決定、免疫ペルオキシダーゼおよびSDS-PAGE（クーマシー）に従って行われた同じ試験は、そのような実施例７Aの構築物とは異なる、キメラSpike Hexa－Proタンパク質の同一性および安定性に関して陽性を示した。

【0050】

実施例５由来の組換えウイルスrNDVLS/Spike S１／S２ SARS－CoV－２／HexaproはSPF豚を対象とした前臨床試験で使用され、IgG抗体の検出およびSARS－CoV－２に対する中和抗体の陽性結果が得られた。

【0051】

実施例８
COVID－１９に対する活性ワクチンにより豚で産生される安全性および免疫原性レベルを検討する試験
SPF豚における本発明の原理に従ったワクチンの安全性および免疫原性を検討するための研究を実施した。

【0052】

本研究では、実施例２～６で述べたプロセスに従い、実施例１で発生したプラスミドpLS１１８０１１４０＿L２８９A（配列番号１４）を用いて、Spike S１／S２ SARS－CoV－２／Hexaproバージョンでウイルスを設計した。

【0053】

このワクチンは、１０^7.0 CEID５０％／mL、１０^7.5 CEID５０％／mL、１０^8.0 CEID５０％／mL、１０^8.5 CEID５０％／mLの生ウイルスまたは活性化ウイルスの４用量で、投与経路（経口、筋肉内およびその組合せ）を変えて、用量の２回の適用で製剤化した。安全性レベルは、ワクチン接種後の副作用の有無を測定することにより判定した。免疫原性は、SARS－CoV－２（２８dpv）のRBDタンパク質に対する中和抗体（GenScript）を検出するためのELISA検査により、ワクチンの２回接種の適用後に生じた免疫反応を比較することにより評価した。テーブル３に試験デザインを示す。

【0054】

【表2】

【0055】

異なる実験群で、同年齢／体重（３～４週齢）の合計６２匹のSPF豚を試験に用いた。動物は、その体重に従って隔離室に無作為に配置した。いずれの動物においても、関連する副作用は認められなかった。

【0056】

試験期間を通じて、動物の臨床徴候を観察した。モニターした臨床徴候は、毎朝の異常呼吸、異常行動、直腸温であった。動物福祉上の理由から、動物は１日に１回以上観察された。

【0057】

第１０群（不活化ワクチン）のみの臨床報告では、子豚の１頭がワクチン接種３０秒後に副反応を呈し、唾液分泌、抑うつ、筋肉の震えを示した。子豚は直ちに処置し、冷水で湿らせ、反応を評価した。副反応の５分後、豚は重篤な臨床症状を示さず、１時間うつ状態を維持し、正常に戻った。２回目のワクチン接種では、この豚はワクチン接種後の副反応を示さなかった。

【0058】

いずれの群の子豚も、試験期間を通じて毎日の確認で明らかな臨床症状は認められなかった。これは、タイトルや投与経路が異なっている、使用されたワクチンは、安全であり、安全性試験に適合していることを示している。

【0059】

ウイルス量（ロード／load）を測定するため、検体（ワクチン０日目接種前、１回目接種１日後、２回目接種１日後の鼻腔スワブ）を採取し、ワクチンウイルスの遺伝物質の量に基づいてワクチンの有無を評価した。また、ベクターウイルス（NDV）に対するRT－PCRtrqにより肺組織検体を屠殺し、同一ベクター内にSARS－CoV－２Spikeタンパク質をコードするインサートを検出した後、遺伝子量を評価した。

【0060】

ベクターウイルス（NDV）に対する遺伝物質の検出については、基準のサンプリングでも、初回ワクチン接種から２４時間後でも、すべてのサンプルが陰性であった。

【0061】

SARS－CoV－２スパイクに対する抗体の評価のために、米国食品医薬品局により認可された市販のELISAキット（GenScript）が使用され、SARS－CoV－２ウイルスのRBDに対する非機能的な方法で中和抗体を検出した。

【0062】

ワクチン接種により誘導される免疫原性の程度は、SARS－CoV－２のRBDタンパク質に対する中和抗体（GenScript cPass）の産生により評価した。最初のワクチン接種後０、２１、２８日目に血清学的試料を採取した。１回目接種３５日後における各群の結果は下記テーブル４のとおりであった。

【0063】

【表3】

【0064】

これらの結果を比較するために、SARS－CoV－に感染し、同時に検査を行った患者の血清が含まれ、Cx（+）として同定され、いくつかの群については、平均力価が回復期患者よりもさらに高いことが観察されたことに留意すべきである。

【0065】

また、２種類の鼻腔内ワクチンを受領したグループ１については、局所免疫の可能性を検出するため、経口液を用いて同一の試験を実施したが、その相乗効果は鼻腔内経路で１回目、筋肉内経路で２回目を受領したグループ９において観察された。この点については、比較可能な結果は得られていないものの、２８日目および３５日目のグループ１について陽性の経口輸液中の抗体レベルから、２回の鼻腔内投与では、初感染経路（上気道粘膜）のSARS－CoV－２ウイルスによる感染予防の可能性が示唆されている。

【0066】

同様に、２回目の適用から１４日後、１回目のワクチン接種から３５日後に、全生存動物を人道的に屠殺し、肺、リンパ節、肝臓、腎臓および脾臓のサンプルを採取し、RT－PCRtrqによるワクチンウイルスの存在を調べるとともに、可能性のある肺病変の組織病理学的評価のために、面積測定技術を用いた、肺の肉眼的および顕微鏡的変化、鼻腔内経路について肺における存在、および筋肉内適用の領域における存在、を調べた。

【0067】

ブタの人道的屠殺および剖検後、すべての動物の肺がウイルス感染を示唆する病変を示さず、したがって使用された活性ワクチン由来であった。筋肉内ワクチン適用面積では、活動性または慢性の炎症過程は検出されず、線維症または膿瘍の面積の存在も認められなかったことから、鼻腔内または筋肉内経路によるワクチンの適用は、ワクチン適用面積における肺レベルまたは組織レベルの病変を発生させなかったことが示された。

【0068】

この例から、本発明の原理によれば、哺乳動物モデルにおいて、活性型または不活性型の種々の投与経路により安全性および免疫原性を示すことができる、大規模工業生産のための安定な組換えウイルスを得ることが可能であることが分かる。

【0069】

この同じ実施例では、実施例８で試験した実施形態のように、SARS－CoV－２の抗原部位を含む活性化ウイルスの用量を鼻腔内経路で投与し、続いて同じ組換えウイルスの筋肉内経路で２回目の用量を投与することが可能であることが証明される。この実験から、当業者は、筋肉内経路によって他の任意のSARS－CoV－２抗原を投与して防御を得ることが可能であることを推測することができる。なぜならば、最初の用量の鼻腔内経路によるワクチンの適用は、筋肉内経路によってウイルス抗原に対する全身応答を刺激するのに十分であり、これは、異なるワクチンを投与することによって達成され得ることが示されたからである。

【0070】

したがって、本発明の特定の実施形態を例示し、説明した場合でも、ウイルスベクターとして使用されるウイルス、および使用される外因性のウイルス配列のような、多数の修正が可能であることを強調すべきである。したがって、本発明は、先行技術および添付の特許請求の範囲によって要求される場合を除き、制限されるものと解釈されるべきではない。

【配列表】

2023526309000001.app

【国際調査報告】