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▶ シャンハイ ポラリス バイオロジー カンパニー， リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】マイクロビーズおよびその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20230614BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230614BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20230614BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20230614BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20230614BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230614BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230614BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20230614BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230614BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 525E
G01N33/543 525U
G01N33/543 525C
G01N33/53 D
G01N33/53 P
G01N33/53 M
G01N27/62 V
G01N27/62 G
C12N15/10 110Z
C12Q1/68
C12N15/11 Z
C12P21/08
C07K14/00
C07K16/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022569495
(86)(22)【出願日】2021-05-18
(85)【翻訳文提出日】2023-01-11
(86)【国際出願番号】 CN2021094398
(87)【国際公開番号】W WO2021233303
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/090905
(32)【優先日】2020-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521497372
【氏名又は名称】シャンハイ ポラリス バイオロジー カンパニー， リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ， ラン
(72)【発明者】
【氏名】スン， シュアンウー
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ユーチョン
(72)【発明者】
【氏名】ゲ， ジヤン
【テーマコード（参考）】
2G041
4B063
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041DA14
2G041FA06
2G041FA10
2G041FA12
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR83
4B063QS36
4B063QS39
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA13
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA50
(57)【要約】
マイクロビーズおよびそれを調製するための方法を提供する。併せて、元素分析を使用することによって試料中の生体分子を検出および分析するための方法も提供される。本発明は、例えば、マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含むマイクロビーズであって、前記複数の前記官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化することができるキレート基に結合され、前記複数の前記官能基の第２のサブセットが標的分子に結合することができる親和性部分と結合される、マイクロビーズを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含むマイクロビーズであって、前記複数の前記官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化することができるキレート基に結合され、前記複数の前記官能基の第２のサブセットが標的分子に結合することができる親和性部分と結合される、マイクロビーズ。
【請求項2】
前記マイクロビーズ基材が、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスチレン－メタクリル酸（ＰＳＭＡＡ）、ポリスチレン－ジビニルベンゼン（Ｐ［Ｓ／ＤＶＢ］）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリマーによって形成される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項3】
前記マイクロビーズ基材がポリスチレン（ＰＳ）によって形成される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項4】
前記マイクロビーズが５０ｎｍ～１０μｍの直径を有する、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項5】
前記マイクロビーズが１～３μｍの直径を有する、請求項４に記載のマイクロビーズ。
【請求項6】
前記官能基が、カルボキシル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、マレイミド、アジド、アルキニル、ビオチンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項7】
前記官能基がカルボキシルである、請求項６に記載のマイクロビーズ。
【請求項8】
前記マイクロビーズがその表面に１０４～１０１０個の官能基を含む、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項9】
前記マイクロビーズがその表面に１０６～１０９個の官能基を含む、請求項８に記載のマイクロビーズ。
【請求項10】
前記マイクロビーズが、前記官能基に結合した１０４～１０１０個のキレート基を含む、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項11】
前記マイクロビーズが、前記官能基に結合した１０６～１０９個のキレート基を含む、請求項１０に記載のマイクロビーズ。
【請求項12】
前記マイクロビーズが、前記官能基と結合した１０４～１０１０個の親和性部分を含む、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項13】
前記マイクロビーズが、前記官能基と結合した１０５～１０６個の親和性部分を含む、請求項１２に記載のマイクロビーズ。
【請求項14】
前記親和性部分が、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項15】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント、軽鎖、重鎖、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントからなる群より選択される、請求項１４に記載のマイクロビーズ。
【請求項16】
前記親和性部分が前記官能基と直接結合される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項17】
前記親和性部分がスペーサーを介して前記官能基と結合される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項18】
前記スペーサーが少なくとも２つの異なるスペーサーを含む、請求項１７に記載のマイクロビーズ。
【請求項19】
前記スペーサーが、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される、請求項１７または１８に記載のマイクロビーズ。
【請求項20】
前記キレート基が、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＣＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項21】
前記キレート基が前記官能基に直接結合される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項22】
前記キレート基がスペーサーを介して前記官能基に結合される、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項23】
前記スペーサーが少なくとも２つの異なるスペーサーを含む、請求項２２に記載のマイクロビーズ。
【請求項24】
前記スペーサーが、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される、請求項２２または２３に記載のマイクロビーズ。
【請求項25】
前記マイクロビーズの前記キレート基が、元素タグとさらにキレート化する、請求項１に記載のマイクロビーズ。
【請求項26】
前記元素タグが元素または元素の組み合わせを含む、請求項２５に記載のマイクロビーズ。
【請求項27】
元素の前記組み合わせが、２またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項２６に記載のマイクロビーズ。
【請求項28】
元素の前記組み合わせが、３またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項２７に記載のマイクロビーズ。
【請求項29】
前記元素が金属またはその同位体である、請求項２６に記載のマイクロビーズ。
【請求項30】
前記金属が、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇからなる群から選択される、請求項２９に記載のマイクロビーズ。
【請求項31】
前記同位体が、Ｙ－８９、Ｒｈ１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｃｅ－１４２、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４４、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４８、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５０、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５４、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６０、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６４、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７０、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、Ｌｕ－１７５、Ｌｕ－１７６、およびＢｉ－２０９からなる群から選択される、請求項２９に記載のマイクロビーズ。
【請求項32】
組み合わせ標識マイクロビーズを調製するための方法であって、（ａ）ポリマーマイクロビーズ基材を用意すること、
（ｂ）前記ポリマーマイクロビーズ基材を官能基化して、前記ポリマーマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を設けること、
（ｃ）キレート基が（ｂ）の前記ポリマーマイクロビーズ基材の表面上の前記官能基の第１のサブセットに結合するように、前記キレート基を前記ポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、および
（ｄ）親和性部分が（ｂ）の前記ポリマーマイクロビーズ基材の表面上の前記官能基の第２のサブセットと結合するように、前記親和性部分を前記ポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、を含む、方法。
【請求項33】
元素タグを前記キレート基にキレート化することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記元素タグが元素または元素の組み合わせを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
元素の前記組み合わせが、２またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
元素の前記組み合わせが、３またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
前記元素が金属またはその同位体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項38】
前記ポリマーマイクロビーズ基材が、スチレン、スチレン－メタクリル酸（ＳＭＡＡ）、スチレン－ジビニルベンゼン（Ｓ／ＤＶＢ）およびメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の重合によって得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項39】
１０４～１０１０個の前記官能基が前記ポリマーマイクロビーズ基材の前記表面上に設けられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項40】
１０６～１０９個の前記官能基が前記ポリマーマイクロビーズ基材の前記表面上に設けられる、請求項３８に記載の方法。
【請求項41】
前記ポリマーマイクロビーズの前記表面上に設けられる前記官能基が、カルボキシル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、マレイミド、アジド、アルキニル、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項42】
前記ポリマーマイクロビーズの前記表面上に設けられる前記官能基がカルボキシルである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記キレート基がスペーサーを介して前記官能基に結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項44】
前記スペーサーが、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記キレート基が、前記キレート基のアミンを介して前記官能基に結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項46】
前記アミンが第一級アミンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記キレート基がカルボジイミド架橋を介して前記官能基に結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項48】
前記カルボジイミド架橋が、前記キレート基を前記官能基に結合させる前に、カルボジイミド化合物によって前記官能基を活性化することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記カルボジイミド化合物が、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記カルボジイミド架橋が、前記キレート基を前記官能基に結合させる前にＮＨＳ－エステル中間体を形成することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項51】
前記ＮＨＳ－エステル中間体が、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）またはスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミド）によって形成される、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記親和性部分がスペーサーを介して前記官能基と結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項53】
前記スペーサーが、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記親和性部分が、前記親和性分子のアミンを介して前記官能基と結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項55】
前記アミンが第一級アミンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記親和性部分が、カルボジイミド架橋を介して前記官能基と結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項57】
前記カルボジイミド架橋が、前記親和性部分を前記官能基とカップリングさせる前に、カルボジイミド化合物によって前記官能基を活性化することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記カルボジイミド化合物が、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記カルボジイミド架橋が、前記親和性部分を前記官能基とカップリングさせる前にＮＨＳ－エステル中間体を形成することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項60】
前記ＮＨＳ－エステル中間体が、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）またはスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミド）によって形成される、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記親和性部分が、前記キレート基を前記官能基に結合させる前に前記官能基と結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項62】
前記親和性部分が、前記キレート基を前記官能基に結合させた後に前記官能基と結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項63】
前記親和性部分が、前記元素タグを前記キレート基にキレート化する前に前記官能基と結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項64】
前記親和性部分が、前記元素タグをキレート基にキレート化した後に前記官能基と結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項65】
マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団であって、少なくとも１つの前記マイクロビーズが、マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、前記複数の前記官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、前記複数の前記官能基の第２のサブセットが標的分子に結合することができる親和性部分と結合され、前記マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が前記マイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、前記マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が前記マイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む、マイクロビーズの集団。
【請求項66】
前記元素タグが元素の組み合わせである、請求項６５に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項67】
元素の前記組み合わせが、２またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項６６に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項68】
元素の前記組み合わせが、３またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項６６に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項69】
前記元素が金属またはその同位体である、請求項６５に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項70】
前記マイクロビーズの各亜集団の前記元素タグが、元素タグの前記亜集団を他の亜集団から識別する、請求項６５に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項71】
前記元素分析がＭＳである、請求項７０に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項72】
前記ＭＳが、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳおよびマスサイトメトリーからなる群から選択される、請求項７１に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項73】
１０％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する、請求項６５に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項74】
５％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する、請求項７３に記載のマイクロビーズの集団。
【請求項75】
試料中の分析物を検出するための方法であって、（ａ）前記試料をマイクロビーズと接触させることであって、前記マイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、前記複数の前記官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、前記複数の前記官能基の第２のサブセットが前記分析物に結合することができる親和性部分と結合される、接触させること、（ｂ）前記分析物に結合した前記マイクロビーズを、前記分析物に結合していない前記マイクロビーズから識別すること、および
（ｃ）前記試料中の前記分析物を決定すること、を含む、方法。
【請求項76】
前記識別することが、前記マイクロビーズを固定試薬と共にインキュベートすることを含み、前記固定試薬が前記分析物に特異的に結合し、前記分析物に結合した前記マイクロビーズを固定する、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記分析物に結合した前記マイクロビーズを単離することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
前記識別することが、前記マイクロビーズを検出試薬とインキュベートすることを含み、前記検出試薬が前記分析物に特異的に結合し、前記分析物に結合した前記マイクロビーズの検出を可能にする、請求項７５に記載の方法。
【請求項79】
前記試料から前記マイクロビーズを単離することをさらに含む、請求項７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
前記検出試薬が、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項81】
前記検出試薬が抗体である、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記検出試薬が検出元素タグで標識される、請求項７８～８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項83】
前記検出元素タグが金属またはその同位体である、請求項８２に記載の方法。
【請求項84】
前記金属が、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇからなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
前記同位体が、Ｙ－８９、Ｒｈ１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５からなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項86】
前記分析物を前記決定することが、前記試料中の前記分析物の実体を明らかにすることを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項87】
前記分析物の前記実体を前記明らかにすることが、前記元素タグの実体を分析することによって行われる、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記分析物を前記決定することが、前記試料中の前記分析物の量を定量することを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項89】
前記分析物の量を前記定量することが、前記検出元素タグを分析することによって行われる、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記分析物を前記決定することが、元素分析によって行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項91】
前記元素分析がＭＳである、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記ＭＳが、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳおよびマスサイトメトリーからなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記試料が対象から得られる、請求項７５に記載の方法。
【請求項94】
前記試料が体液である、請求項９３に記載の方法。
【請求項95】
前記体液が、全血、血漿、血清、尿、滲出液、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、羊水、胃腸分泌物、痰を含む気管支分泌物、乳汁および分泌物からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記分析物が、疾患を予測または診断するための１またはそれを超えるバイオマーカーである、請求項７５に記載の方法。
【請求項97】
前記バイオマーカーが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物からなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
試料中の２またはそれを超える分析物の多重分析を実施する方法であって、（ａ）マイクロビーズの集団を前記試料と接触させることであって、少なくとも１つの前記マイクロビーズが前記マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、前記複数の前記官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、前記複数の前記官能基の第２のサブセットが前記２またはそれを超える分析物のうちの１つの分析物に結合することができる親和性部分と結合され、前記マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が前記マイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる前記元素タグを含み、前記マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が前記マイクロビーズの別の亜集団とは異なる前記親和性部分を含む、接触させること、
（ｂ）前記マイクロビーズの前記集団を２またはそれを超える検出試薬とインキュベートすることであって、前記検出試薬の各々が分析物に結合したマイクロビーズの検出を可能にする、インキュベートすること、および
（ｃ）前記試料中の前記２またはそれを超える分析物を同時に分析すること、を含む、方法。
【請求項99】
前記元素タグが元素の組み合わせである、請求項９８に記載の方法。
【請求項100】
元素の前記組み合わせが、２またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
元素の前記組み合わせが、３またはそれを超える元素の組み合わせである、請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
前記試料から前記マイクロビーズを単離することをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項103】
前記検出試薬が検出元素タグで標識される、請求項９８に記載の方法。
【請求項104】
前記２またはそれを超える分析物を前記分析することは、前記試料中の前記２またはそれを超える分析物の実体を明らかにすることを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項105】
前記２またはそれを超える分析物の前記実体を前記明らかにすることが、前記元素タグの実体を分析することによって行われる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項106】
前記２またはそれを超える分析物を前記分析することが、前記試料中の前記２またはそれを超える分析物の量を定量することを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項107】
前記２またはそれを超える分析物の量を前記定量することが、前記検出元素タグを分析することによって行われる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項108】
前記２またはそれを超える分析物を前記分析することが、元素分析によって行われる、請求項９８に記載の方法。
【請求項109】
前記元素分析がＭＳである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項110】
前記ＭＳが、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳおよびマスサイトメトリーからなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項111】
前記試料が対象から得られる、請求項９８に記載の方法。
【請求項112】
前記試料が体液である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項113】
前記体液が、全血、血漿、血清、尿、滲出液、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、羊水、胃腸分泌物、痰を含む気管支分泌物、乳汁および分泌物からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
前記２またはそれを超える分析物のそれぞれが、疾患を予測または診断するためのバイオマーカーである、請求項９８に記載の方法。
【請求項115】
前記バイオマーカーが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物からなる群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項116】
キットであって、（１）前記キットを使用して２またはそれを超える分析物の多重分析を実施するための指示と、
（２）マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含む前記マイクロビーズの集団であって、少なくとも１つの前記マイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上の複数の官能基を含み、前記複数の前記官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、前記複数の前記官能基の第２のサブセットが標的分子に結合することができる親和性部分と結合され、前記マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が前記マイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、前記マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が前記マイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む、マイクロビーズの集団と、
（３）２またはそれを超える検出試薬であって、前記検出試薬のそれぞれが検出元素タグを含み、前記２またはそれを超える分析物のうち１つの分析物に特異的に結合する、検出試薬と、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
背景
マスサイトメトリーは、細胞の定量に用いられている元素分析に基づく質量分析技術である。このアプローチでは、抗体などの細胞親和性分子を元素とコンジュゲートさせ、さらにこれらの細胞親和性分子を使用して標的細胞を標識し、さらにその元素のシグナルに基づいてマスサイトメトリーおよび分析を行う。従来のフローサイトメトリーと比較して、このアプローチは、蛍光の代わりに元素または同位体をレポーター系として利用し、その高い精度および感度を維持しながらより広いスペクトルを提供する。
マスサイトメトリーは、細胞の定量に用いられている元素分析に基づく質量分析技術である。このアプローチでは、抗体などの細胞親和性分子を元素とコンジュゲートさせ、さらにこれらの細胞親和性分子を使用して標的細胞を標識し、さらにその元素のシグナルに基づいてマスサイトメトリーおよび分析を行う。従来のフローサイトメトリーと比較して、このアプローチは、蛍光の代わりに元素または同位体をレポーター系として利用し、その高い精度および感度を維持しながらより広いスペクトルを提供する。
【0002】
生体分子の検出および／または同定は、診断、毒物学、および病理学を含む医療分野において不可欠である。生体分子を検出および分析する技術の開発は、健康、疾患および処置のメカニズムの理解において前例のない進歩をもたらした。しかしながら、これらの技術の欠点は、主に、感度、精度、選択性、ならびに多分析物の量を同時に決定する能力の限界に関連している。より正確で費用対効果が高く、高スループットで生体分子を検出するための方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
概要
本明細書で認識されているのは、複数の生体分子を同時に正確に、費用対効果が高く、ハイスループットで検出するための方法および組成物の必要性である。本発明は、この必要性に対処し、さらに関連する利点を提供する。
本明細書で認識されているのは、複数の生体分子を同時に正確に、費用対効果が高く、ハイスループットで検出するための方法および組成物の必要性である。本発明は、この必要性に対処し、さらに関連する利点を提供する。
【0004】
一態様では、マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含むマイクロビーズが提供され、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化することができるキレート基に結合され、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合される。いくつかの実施形態では、マイクロビーズ基材は、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスチレン－メタクリル酸（ＰＳＭＡＡ）、ポリスチレン－ジビニルベンゼン（Ｐ［Ｓ／ＤＶＢ］）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリマーによって形成される。いくつかの実施形態では、マイクロビーズ基材はポリスチレン（ＰＳ）によって形成される。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは５０ｎｍ～１０μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは１～３μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、官能基は、カルボキシル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、マレイミド、アジド、アルキニル、ビオチンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、官能基はカルボキシルである。
【0005】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０４～１０１０個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０６～１０９個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、官能基に結合した１０４～１０１０個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、官能基に結合した１０６～１０９個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、官能基に結合した１０４～１０１０個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、官能基に結合した１０５～１０６個の親和性部分を含む。
【0006】
いくつかの実施形態では、親和性部分は、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント、軽鎖、重鎖、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、官能基と直接結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、スペーサーを介して官能基と結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは少なくとも２つの異なるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される。いくつかの実施形態では、キレート基は、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＣＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キレート基は官能基に直接結合される。いくつかの実施形態では、キレート基は、スペーサーを介して官能基に結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは少なくとも２つの異なるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される。
【0007】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズのキレート基は、さらに元素タグとキレート化する。いくつかの実施形態では、元素タグは、１つの元素または元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、２またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、３またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素は金属またはその同位体である。いくつかの実施形態では、金属は、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、同位体は、Ｙ－８９、Ｒｈ１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｃｅ－１４２、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４４、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４８、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５０、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５４、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６０、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６４、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７０、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、Ｌｕ－１７５、Ｌｕ－１７６、およびＢｉ－２０９からなる群から選択される。
【0008】
別の態様では、組み合わせ標識マイクロビーズを調製するための方法であって、（ａ）ポリマーマイクロビーズ基材を用意すること、（ｂ）ポリマーマイクロビーズ基材を官能基化して、ポリマーマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を設けること、（ｃ）キレート基が（ｂ）のポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第１のサブセットに結合するように、キレート基をポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、および（ｄ）親和性部分が（ｂ）のポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第２のサブセットと結合するように、親和性部分をポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、元素タグをキレート基にキレート化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、元素タグは、１つの元素または元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、２またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、３またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素は金属またはその同位体である。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズ基材は、スチレン、スチレン－メタクリル酸（ＳＭＡＡ）、スチレン－ジビニルベンゼン（Ｓ／ＤＶＢ）およびメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の重合によって得られる。
【0009】
いくつかの実施形態では、１０４～１０１０個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０９個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズの表面上に設けられる官能基は、カルボキシル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、マレイミド、アジド、アルキニル、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズの表面上に設けられる官能基はカルボキシルである。
【0010】
いくつかの実施形態では、キレート基は、スペーサーを介して官能基に結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される。いくつかの実施形態では、キレート基は、キレート基のアミンを介して官能基に結合される。いくつかの実施形態では、アミンは第一級アミンである。いくつかの実施形態では、キレート基は、カルボジイミド架橋を介して官能基に結合される。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、キレート基を官能基に結合させる前に、カルボジイミド化合物によって官能基を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、カルボジイミド化合物は、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）から選択される。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、キレート基を官能基に結合させる前にＮＨＳ－エステル中間体を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＨＳ－エステル中間体は、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）またはスルホ－ＮＨＳ（Sulfo-NHS）（Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミド）によって形成される。
【0011】
いくつかの実施形態では、親和性部分は、スペーサーを介して官能基と結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）またはＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドから選択される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、親和性分子のアミンを介して官能基と結合される。いくつかの実施形態では、アミンは第一級アミンである。いくつかの実施形態では、親和性部分は、カルボジイミド架橋を介して官能基と結合される。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、親和性部分を官能基とカップリングさせる前に、カルボジイミド化合物によって官能基を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、カルボジイミド化合物は、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）から選択される。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、親和性部分を官能基とカップリングさせる前に、ＮＨＳ－エステル中間体を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＨＳ－エステル中間体は、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）またはスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミド）によって形成される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、キレート基を官能基に結合させる前に官能基と結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、キレート基を官能基に結合させた後に官能基と結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、元素タグをキレート基にキレートする前に官能基と結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、元素タグをキレート基にキレート化した後に官能基と結合される。
【0012】
別の態様では、マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、少なくとも１つのマイクロビーズは、マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合され、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合され、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が、マイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が、マイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、元素タグは元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、２またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、３またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素は金属またはその同位体である。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの各亜集団の元素タグは、元素分析においてマイクロビーズの親和性部分のバーコードとして機能する。
【0014】
いくつかの実施形態では、元素分析はＭＳである。いくつかの実施形態では、ＭＳは、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳおよびマスサイトメトリーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、１０％未満である直径の可変係数（variable coefficient of diameter）（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、５％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。
【0015】
別の態様では、試料中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）試料をマイクロビーズと接触させることであって、マイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、複数の官能基の第２のサブセットが分析物に結合することができる親和性部分と結合される、接触させること、（ｂ）分析物に結合したマイクロビーズを、分析物に結合していないマイクロビーズから識別すること、（ｃ）試料中の分析物を決定すること、を含む、方法が提供される。
（ａ）試料をマイクロビーズと接触させることであって、マイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、複数の官能基の第２のサブセットが分析物に結合することができる親和性部分と結合される、接触させること、（ｂ）分析物に結合したマイクロビーズを、分析物に結合していないマイクロビーズから識別すること、（ｃ）試料中の分析物を決定すること、を含む、方法が提供される。
【0016】
いくつかの実施形態では、識別することは、マイクロビーズを固定試薬とインキュベートすることを含み、固定試薬は分析物に特異的に結合し、分析物に結合したマイクロビーズを固定する。いくつかの実施形態では、本方法は、分析物に結合したマイクロビーズを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、識別することは、マイクロビーズを検出試薬とインキュベートすることを含み、検出試薬は分析物に特異的に結合し、分析物に結合したマイクロビーズの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、本方法は、試料からマイクロビーズを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出試薬は抗体である。
【0017】
いくつかの実施形態では、検出試薬は検出元素タグで標識される。いくつかの実施形態では、検出元素タグは金属またはその同位体である。いくつかの実施形態では、金属は、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、同位体は、Ｙ－８９、Ｒｈ１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｃｅ－１４２、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４４、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４８、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５０、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５４、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６０、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６４、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７０、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、Ｌｕ－１７５、Ｌｕ－１７６、およびＢｉ－２０９からなる群から選択される。
【0018】
いくつかの実施形態では、分析物を決定することは、試料中の分析物の実体を明らかにすることを含む。いくつかの実施形態では、分析物の実体を明らかにすることは、元素タグの実体を分析することによって行われる。いくつかの実施形態では、分析物を決定することは、試料中の分析物の量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、分析物の量を定量することは、検出元素タグを分析することによって行われる。いくつかの実施形態では、分析物を決定することは、元素分析によって行われる。いくつかの実施形態では、元素分析はＭＳである。いくつかの実施形態では、ＭＳは、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳおよびマスサイトメトリーからなる群から選択される。
【0019】
いくつかの実施形態では、試料は対象から取得される。いくつかの実施形態では、試料は体液である。いくつかの実施形態では、体液は、全血、血漿、血清、尿、滲出液、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、羊水、胃腸分泌物、痰を含む気管支分泌物、乳汁および分泌物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、分析物は、疾患を予測または診断するための１またはそれを超えるバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物からなる群から選択される。
【0020】
別の態様では、試料中の２またはそれを超える分析物の多重分析を実施する方法であって、（ａ）マイクロビーズの集団を試料と接触させることであって、少なくとも１つのマイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、複数の官能基の第２のサブセットが２またはそれを超える分析物のうちの１つの分析物に結合することができる親和性部分と結合され、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む、接触させること、（ｂ）マイクロビーズの集団を２またはそれを超える検出試薬とインキュベートすることであって、検出試薬の各々が分析物に結合したマイクロビーズの検出を可能にする、インキュベートすること、および（ｃ）試料中の２またはそれを超える分析物を同時に分析すること、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、元素タグ（he element tag）は元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、２またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、元素の組み合わせは、３またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、本方法は、試料からマイクロビーズを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は検出元素タグで標識される。
【0021】
いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物を分析することは、試料中の２またはそれを超える分析物の実体を明らかにすることを含む。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物の実体を明らかにすることは、元素タグの実体を分析することによって行われる。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物を分析することは、試料中の２またはそれを超える分析物の量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物の量を定量することは、検出元素タグを分析することによって行われる。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物を分析することは、元素分析によって行われる。いくつかの実施形態では、元素分析はＭＳである。いくつかの実施形態では、ＭＳは、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳおよびマスサイトメトリーからなる群から選択される。
【0022】
いくつかの実施形態では、試料は対象から取得される。いくつかの実施形態では、試料は体液である。いくつかの実施形態では、体液は、全血、血漿、血清、尿、滲出液、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、羊水、胃腸分泌物、痰を含む気管支分泌物、乳汁および分泌物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物のそれぞれは、疾患を予測または診断するためのバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物からなる群から選択される。
【0023】
別の態様では、キットであって、（１）キットを使用して２またはそれを超える分析物の多重分析を実施するための指示と、（２）マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団であって、少なくとも１つのマイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上の複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合され、複数の官能基の第２のサブセットが標的分子に結合することができる親和性部分と結合され、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む、マイクロビーズの集団と、（３）２またはそれを超える検出試薬であって、検出試薬のそれぞれが検出元素タグを含み、２またはそれを超える分析物に特異的に結合する、検出試薬と、を含む、キットが提供される。
【0024】
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0025】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載、および添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【0027】
【図2A】図２Ａは、親和性部分をマイクロビーズの表面上の官能基とカップリングさせるための例示的なプロセスを示す。図２Ｂは、マイクロビーズの表面上の官能基にキレート基を結合させるための例示的なプロセスを示す。図２Ｃは、マイクロビーズの表面上の官能基に親和性部分をコンジュゲートさせるために使用することができる例示的なスペーサーを示す。
【図2B】同上。
【図2C】同上。
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【0034】
詳細な説明
本発明の実施形態を記載する前に、かかる実施形態は例としてのみ提示され、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明の実施において使用され得ることを理解されたい。本発明から逸脱することなく、当業者は多数の変形、変更、および置換に想到する。
本発明の実施形態を記載する前に、かかる実施形態は例としてのみ提示され、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明の実施において使用され得ることを理解されたい。本発明から逸脱することなく、当業者は多数の変形、変更、および置換に想到する。
【0035】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本発明から逸脱することなく、当業者は多数の変形、変更、および置換に想到する。
【0036】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｇｒｏｕｐ（基）」への言及は複数のかかる基を含み、「ａ ｍｏｎｏｍｅｒ（モノマー）」への言及は複数のかかるモノマーを含み、「ｔｈｅ ｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ（ペンダント部分）」への言及は１またはそれを超えるペンダント部分（または複数のペンダント部分）および当業者に公知のその均等物などへの言及を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｇｒｏｕｐ（基）」への言及は複数のかかる基を含み、「ａ ｍｏｎｏｍｅｒ（モノマー）」への言及は複数のかかるモノマーを含み、「ｔｈｅ ｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ（ペンダント部分）」への言及は１またはそれを超えるペンダント部分（または複数のペンダント部分）および当業者に公知のその均等物などへの言及を含む。
【0037】
本明細書における「約（about）」または「およそ（approximately）」という用語は、当業者によって求められる特定の値の許容され得る誤差範囲内を意味し、値がどのように測定または決定されるか、すなわち一つには測定系の限界に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、標準偏差が１以内または標準偏差が１を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」または「およそ」という用語は、特定の値の許容され得る誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
【0038】
本明細書において、範囲が、直径などの物理的特性、または官能基などの化学的特性のために使用される場合、範囲およびその中の特定の実施形態のすべての組み合わせおよび部分的組み合わせが含まれることが意図される。値の範囲が示される場合、文脈が明らかに別のことを示していない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載された範囲における任意の他の記載された値または介在値が本明細書で提示される本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲における任意の具体的に除外された限界を条件として、本開示内に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本明細書で提示される本開示に含まれる。
【0039】
本明細書で使用される「および／または」という用語は、２つの単語または表現が一緒にまたは個別に解釈されるべきであることを示す機能語である。例えば、Ａおよび／またはＢは、Ａ単独、Ｂ単独、ならびにＡおよびＢを一緒に包含する。
【0040】
「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの関連する用語）は、他の実施形態において、例えば、本明細書に記載される物質、組成物、方法またはプロセスなどの任意の組成物の実施形態が、記載された特徴「からなり（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」得るまたは「から本質的になり（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」得ることを排除することを意図しない。
【0041】
本明細書で使用される「マイクロビーズ」という用語は、有機ポリマーからなるマイクロメートルサイズの単分散粒子を指す。それは、元素分析において、元素タグおよび分析される標的分子の両方の担体として機能する。１０ｎｍ～１ｍｍの範囲のサイズを有する任意の適切な粒子を、本開示のマイクロビーズとして利用することができる。例えば、本開示のマイクロビーズは、１０ｎｍ～１ｍｍ、１０ｎｍ～１００μｍ、０．１μｍ～－１０μｍ、またはそれらの間の任意の範囲のサイズの粒子であり得る。
【0042】
本明細書で互換的に使用される「官能基」、「反応性基」および「反応性部分」という用語は、それらの分子の特徴的な化学反応を担う分子内の特定の置換基または部分を指す。同じ官能基は、それが分子の一部であるその分子のサイズにかかわらず、同じまたは類似の化学反応（複数可）を起こす。
【0043】
本明細書で使用される「キレート基」という用語は、原子またはイオンに結合することができ、本開示のマイクロビーズの表面上の官能基に結合することができる官能部分を含む分子成分を指す。キレート基の官能部分の例としては、２－アミノメチルピリジン、イミノ酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０四酢酸（ＤＯＴＡ）、カルボニルイミノ二酢酸、メチレンイミノ酢酸、メチレンイミノ二酢酸、エチレンチオエチレンイミノ酢酸、エチレンチオエチレンイミノ二酢酸、ＴＭＴ、テルピリジニル基、テルピリジル基およびカルボキシメチルアミノ基を含むキレート剤、または前記の酸のいずれかの塩が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいキレート基は、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ－ＢＭＡ、ＤＰＤＰ、ＴＭＴ、ＤＯＴＡおよびＨＰＤＯ３Ａである。
【0044】
本明細書で使用される「元素」という用語は、マイクロビーズの表面上のキレート基とキレート化することができる任意の化学元素または同位体を指す。元素の例としては、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、Ｏｇ、またはこれらの同位体が挙げられるが、これらに限定されない。同位体の例としては、Ｙ－８９、Ｒｈ１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｃｅ－１４２、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４４、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４８、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５０、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５４、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６０、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６４、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７０、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、Ｌｕ－１７５、Ｌｕ－１７６、およびＢｉ－２０９が挙げられるが、これらに限定されない。ランタニド金属は、環境中に存在量が少ないため好ましい。いくつかの実施形態では、金属はランタニド金属であり、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、またはそれらの同位体から選択される。
【0045】
本明細書で使用される「タグ」という用語は、標的分子を同定および／または定量するための分子またはその部分を指す。タグは、標的分子に直接または間接的に結合され得る。タグは、リンカーまたは本明細書のマイクロビーズを介して標的分子に結合され得る。タグは、本明細書に開示されるマイクロビーズに直接または間接的に結合され得る。タグは、本明細書に開示される官能基を介してマイクロビーズに結合され得る。本開示のタグは、それが結合している標的分子の同定、認識、および／または定量を可能にする元素または元素の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、タグは、蛍光指示薬、例えば、蛍光色素などの他の指示薬をさらに含み得る。標的分子またはマイクロビーズにタグを結合させるプロセスは、本明細書では「タグ付け」と呼ばれることがあり、タグ付けを受けるかまたはタグを含む分子またはマイクロビーズは「タグ付けされた」（例えば、「タグ付けされたマイクロビーズ」）と呼ばれる。本開示のタグが、試料中の複数の標的分子を同時に検出する際に使用するために元素の組み合わせによって構成される場合、タグは「バーコード」とも呼ばれ得る。
【0046】
本明細書で使用される「バーコード」という用語は、２つ以上の分析物を同時に同定することを可能にする複数の元素タグの組み合わせを含むタグを指す。元素タグの所定の組み合わせと、１またはそれを超える特定の元素タグの有無とを使用して、特定の分析物の有無を確認することができる。分析物と結び付けられた各元素タグの相対的存在量を使用して、分析物の絶対的または相対的存在量を求めることもできる。いくつかの実施形態では、特定のバーコードを使用して、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの亜集団を差別的に標識する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの亜集団を標識するためのバーコードは、マイクロビーズの別の亜集団の少なくとも別のバーコードとは異なる。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団の中のマイクロビーズの各亜集団のバーコードは互いに異なり得る。
【0047】
本明細書で使用される「親和性部分」という用語は、マイクロビーズの表面上の官能基と結合することができ、標的分子を試料から捕捉するように標的分子に結合することができる任意の分子成分を指す。親和性部分の例としては、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0048】
本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、親和性部分またはキレート基をマイクロビーズの表面上の官能基とコンジュゲートさせるために使用することができる分子断片を指す。いくつかの実施形態では、スペーサーは、抗体などの親和性部分とマイクロビーズとの間の立体障害を克服し、親和性部分の活性に対する影響を低減するように、それらの間に適切な距離を設けることができる。
【0049】
用語「ＭＳ」（質量分析）は、化学種をイオン化し、それらの質量電荷比に基づいてイオンを選別する分析技術である。本開示では、限定するものではないが、飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を備えたマトリックス支援レーザー脱離／イオン化源、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）、加速器質量分析（ＡＭＳ）、原子吸光分光法（ＡＡＳ）、熱イオン化質量分析（ＴＩＭＳ）、四重極質量分析計、イオントラップ分析計、オービトラップ分析計、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ）、フーリエ変換質量分析（例えば、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、およびスパークソース質量分析（ＳＳＭＳ）、ならびにマスサイトメトリーを含む様々なタイプのＭＳを使用することができる。
【0050】
「ＩＣＰ－ＭＳ」（誘導結合プラズマ質量分析）は、干渉されていない低バックグラウンド同位体上で１０１５分の１（千兆分の１、ｐｐｑ）という低い濃度で金属および非金属などの元素を検出することができる質量分析の一種である。これは、誘導結合プラズマで試料をイオン化し、次いで質量分析計を使用してそれらのイオンを分離および定量することによって達成される。
【0051】
「ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳ」（飛行時間型誘導結合プラズマ質量分析）はまた、高精度で信頼性の高い元素トレース分析検出を提供する。この方法の検出限界は、１００万分の１（ｐｐｍ）（工業生産用途のための日常的な分析）から、研究開発目的の１０億分の１（ｐｐｂ）または１兆分の１（ｐｐｔ）のレベルまでの範囲である。これは微量の汚染および未知の化学物質を同定することもできる。
【0052】
「マスサイトメトリー」は、元素質量分析を利用して、単一細胞上の目的の抗原に細胞内または細胞外で結合した元素コンジュゲート抗体を検出する次世代フローサイトメトリープラットフォームである。マスサイトメトリーは、チャネルの重なりなしに異なる原子質量の金属および同位体などの元素を正確に区別することができ、これは複雑な補償マトリックスの必要性を改善し、蛍光フローサイトメトリーよりもはるかに多数の細胞の特徴を同時に分析することを可能にする。
【0053】
本明細書で使用される「標的分子」という用語は、分析される様々な生物学的分子のいずれかを指す。標的分子の例としては、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾または誘導体化ヌクレオチド、酵素、受容体、受容体リガンド（ホルモンなど）、抗体、抗原および毒素、ならびに血液細胞および組織細胞を含む細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0054】
本明細書で使用される「分析物」という用語は、試料中に存在する目的の物質を指す。本発明において検出可能な分析物は、本開示のマイクロビーズの親和性部分によって捕捉され得る分析物である。分析物の例としては、サイトカイン、ホルモン、成長因子、タンパク質、ペプチド、ＣＤ抗原、ウイルス抗原、抗体、ニューロトロフィン、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0055】
本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、生物学的変化と定量的または定性的に関連する分子を指す。臨床的には、バイオマーカーは、疾患を予測する、診断する、または治療的介入に対する応答を評価するために使用することができる。本開示のバイオマーカーの例としては、サイトカイン、ホルモン、成長因子、タンパク質、ペプチド、ＣＤ抗原、ウイルス抗原、抗体、ニューロトロフィン、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
「予防」または「予防すること」、「処置」または「処置すること」または「緩和すること」または「改善すること」という用語は、本明細書では互換的に使用することができ、限定するものではないが、治療上の利益および／または予防的利益などの有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益は、処置されている根本的な障害の根絶または改善を指す。いくつかの実施形態では、治療上の利益は、対象が依然として根本的な障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、根本的な障害に関連する生理学的症状の１またはそれを超える根絶または改善によって達成される。いくつかの実施形態では、予防的利益を達成するために、本組成物は、疾患を発症するリスクがある対象、または疾患の診断がなされていなくてもこの疾患の１またはそれを超える生理学的症状を報告する対象に投与され得る。
【0057】
本明細書で使用される「対象」、「個体」または「患者」という用語は、限定するものではないが、ヒト、霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの、本開示で使用され得る任意の動物を指す。
【0058】
本明細書で使用される「インビボ」という用語は、対象の体内で起こるイベントを指す。
【0059】
本明細書で使用される「インビトロ」という用語は、対象の体外で起こるイベントを指す。いくつかの実施形態では、インビトロアッセイは、対象アッセイ以外で行われる任意のアッセイを包含する。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞が使用される細胞ベースのアッセイを包含する。インビトロアッセイはまた、無傷細胞が使用されない無細胞アッセイを包含する。
【0060】
マイクロビーズ
１回のアッセイで複数の生体分子を同時に検出および定量することは、生物学的分析の効率を有意に改善することができる。しかしながら、検出の重大な課題は、少量の試料から十分な分析物を捕捉すること、および分析物を高感度および高精度の手法で検出することを含む。
１回のアッセイで複数の生体分子を同時に検出および定量することは、生物学的分析の効率を有意に改善することができる。しかしながら、検出の重大な課題は、少量の試料から十分な分析物を捕捉すること、および分析物を高感度および高精度の手法で検出することを含む。
【0061】
一態様では、試料中の分析物または標的分子を検出および定量するためのマイクロビーズが本明細書で提供される。マイクロビーズの構造は、試料中の分析物または標的分子の正確で費用効果の高いハイスループットの検出および定量を可能にする。
【0062】
いくつかの実施形態では、本開示のマイクロビーズは、マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化することができるキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合している。マイクロビーズの親和性部分は、分析される標的分子の捕捉を可能にする一方で、マイクロビーズのキレート基は、元素分析のための元素タグのマイクロビーズとのキレート化を可能にする。
【0063】
任意の適切なポリマーを使用して、本開示のマイクロビーズの基材を形成することができる。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの基材を形成するために使用することができるポリマーはホモポリマーである。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの基材を形成するために使用することができるポリマーはコポリマーである。マイクロビーズの基材に使用できるポリマーの例としては、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスチレン－メタクリル酸（ＰＳＭＡＡ）、ポリスチレン－ジビニルベンゼン（Ｐ［Ｓ／ＤＶＢ］）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの基材はポリスチレン（ＰＳ）の重合によって形成される。
【0064】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの基材は、官能化に供する前に予め製造されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、マイクロビーズの基材は、商業的供給業者から入手することができる。
【0065】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの形状は、不規則、または実質的に球形、立方体、菱形、四角形、十二面体、卵形、円筒形などであり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの形状は実質的に球形である。
【0066】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１０ｎｍ～１ｍｍの範囲、またはその間の任意の範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５０ｎｍ～１００μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５０ｎｍ～１０μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～１０μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～１０μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～１０μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～５μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～５μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～５μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～３μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～３μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～３μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～３μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～１０μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～５μｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５μｍ～１０μｍの範囲のサイズを有し得る。
【0067】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１０ｎｍ～１ｍｍの範囲、またはその間の任意の範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５０ｎｍ～１００μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５０ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～５μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～５μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～５μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～３μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～３μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～３μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～３μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～１０μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～５μｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５μｍ～１０μｍの範囲の直径を有し得る。
【0068】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１０ｎｍ～１ｍｍまたはその間の任意の範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５０ｎｍ～１００μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５０ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～５μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～５μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～５μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１００ｎｍ～３μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、３００ｎｍ～３μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５００ｎｍ～３μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～３μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～１０μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、１μｍ～５μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、５μｍ～１０μｍの範囲の直径を有する実質的に球形であり得る。
【0069】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは表面に複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０４～１０１０個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０５～１０１０個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０６～１０１０個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０７～１０１０個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０８～１０１０個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０９～１０１０個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０４～１０９個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０４～１０８個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０４～１０７個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０４～１０６個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０５～１０９個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０６～１０９個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０７～１０９個の官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、その表面に１０６～１０８個の官能基を含む。
【0070】
マイクロビーズの表面上の官能基は、キレート基に結合し、親和性部分および／またはスペーサーとカップリングすることができる任意の適切な官能基であり得る。いくつかの実施形態では、官能基の例としては、カルボキシル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、マレイミド、アジド、アルキニル、ビオチンおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面に使用される官能基はカルボキシルである。
【0071】
いくつかの実施形態では、本開示のマイクロビーズは、ポリスチレンによって形成された実質的に球形であり、マイクロビーズの表面上の官能基として１０４～１０１０個のカルボキシル基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、ポリスチレンによって形成された実質的に球形であり、マイクロビーズの表面上の官能基として１０６～１０９個のカルボキシル基を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面上の複数の官能基の第１のサブセットは、キレート基に結合している。マイクロビーズの表面上の官能基に結合したキレート基は、元素タグとキレート化することができる任意の適切なキレート基であり得る。いくつかの実施形態では、キレート基の例としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＰＤＣＡ（２，６－ピリジンジカルボン酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＣＴＡ（ジアミノシクロヘキサン四酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０四酢酸）、ＴＥＴＡ（Ｎ，Ｎ’－ビス（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン）、ＮＯＴＡ（１，４，７トリアザシクロノナン－Ｎ，Ｎ’、Ｎ’’－三酢酸）およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０１０個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０５～１０１０個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０６～１０１０個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０７～１０１０個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０８～１０１０個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０９～１０１０個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０９個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０８個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０７個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０６個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０５～１０９個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０６～１０９個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０７～１０９個のキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０６～１０８個のキレート基を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面上の官能基に結合したキレート基は、同じキレート基であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面上の官能基に結合したキレート基は、異なるキレート基の組み合わせ、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＰＤＣＡ（２，６－ピリジンジカルボン酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＣＴＡ（ジアミノシクロヘキサン四酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０四酢酸）、ＴＥＴＡ（Ｎ，Ｎ’－ビス（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン）およびＮＯＴＡ（１，４，７トリアザシクロノナン－Ｎ，Ｎ’、Ｎ’’－三酢酸）のうちの２つ、３つまたはそれを超えるものの任意の組み合わせであり得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０１０個のＤＯＴＡを含む。マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０６～１０９個のＤＯＴＡを含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０１０個のＥＤＴＡを含む。マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０６～１０９個のＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０４～１０１０個のＤＴＰＡを含む。マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基に結合した１０６～１０９個のＤＴＰＡを含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上に１０４～１０１０個の組み合わせキレート基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上に１０６～１０９個の組み合わせキレート基を含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、キレート基は、マイクロビーズの表面上の官能基に直接結合している。いくつかの実施形態では、キレート基は、スペーサーを介してマイクロビーズの表面上の官能基に結合している。キレート基を官能基に連結するために、任意の適切なスペーサーを使用することができる。キレート基を官能基に連結するスペーサーの例としては、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、ＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミド、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超えるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超える同じスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２またはそれを超える異なるスペーサーを含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズのキレート基は、さらに元素タグとキレート化する。本開示のマイクロビーズのキレート基とのキレート化には、元素分析に適した任意の元素タグを使用することができる。いくつかの実施形態では、元素は金属またはその同位体である。
【0078】
本開示で使用することができる金属の例としては、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【0079】
本開示で使用することができる同位体の例としては、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５が挙げられるが、これらに限定されない。
【0080】
いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、２またはそれを超える元素またはその同位体の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、２つの元素またはその同位体の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、３つの元素またはその同位体の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、４つの元素またはその同位体の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、５つの元素またはその同位体の組み合わせを含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、Ｏｇから選択される２つの金属の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５から選択される２つの同位体の組み合わせを含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、Ｏｇから選択される３つの金属の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５から選択される３つの同位体の組み合わせを含む。
【0083】
いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、Ｏｇから選択される４つの金属の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示の元素タグは、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５から選択される４つの同位体の組み合わせを含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面上の複数の官能基の第２のサブセットは、親和性部分と結合している。親和性部分は、標的分子に結合することができる任意の適切な部分であり得る。親和性部分の例としては、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、親和性部分は抗体であり、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片、軽鎖、重鎖、免疫グロブリン、および免疫グロブリン断片から選択することができる。
【0085】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した親和性部分は、同じ親和性部分であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した親和性部分は、異なる親和性部分の組み合わせ、例えば、２、３またはそれを超える異なる親和性部分の組み合わせであり得る。
【0086】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０４～１０１０個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０１０個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０６～１０１０個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０７～１０１０個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０８～１０１０個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０４～１０９個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０９個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０６～１０９個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０８個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０６～１０８個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０７～１０８個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０７個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０６～１０７個の親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０６個の親和性部分を含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０４～１０１０個の抗体を含む。マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０６個の抗体を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０４～１０１０個の抗体を含む。マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０６個の抗体を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０４～１０１０個の抗体を含む。マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０６個の抗体を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０４～１０１０個の組み合わせ抗体を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、マイクロビーズの表面上の官能基と結合した１０５～１０６個の組み合わせ抗体を含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、親和性部分は、マイクロビーズの表面上の官能基と直接結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、スペーサーを介してマイクロビーズの表面上の官能基と結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、抗体などの親和性部分とマイクロビーズとの間の立体障害を克服し、親和性部分の活性に対する影響を低減するように、それらの間に適切な距離を設ける。
【0089】
親和性部分を官能基に連結するために、任意の適切なスペーサーを使用することができる。親和性部分を官能基に連結するために使用することができるスペーサーの例としては、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、ＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミド、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0090】
いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超えるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超える同じスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２またはそれを超える異なるスペーサーを含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、ポリスチレンによって形成された実質的に球形であり、マイクロビーズの表面上の官能基として１０４～１０１０個のカルボキシル基を含み、カルボキシル基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化することができるキレート基に結合しており、カルボキシル基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合している。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、ポリスチレンによって形成された実質的に球形であり、マイクロビーズの表面上の官能基として１０４～１０１０個のカルボキシル基を含み、カルボキシル基の第１のサブセットは、元素の組み合わせを含む元素タグとキレート化するキレート基に結合しており、カルボキシル基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合している。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、ポリスチレンによって形成された実質的に球形であり、マイクロビーズの表面上の官能基として１０４～１０１０個のカルボキシル基を含み、カルボキシル基の第１のサブセットは、３つの元素の組み合わせを含む元素タグとキレート化するキレート基に結合しており、カルボキシル基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合している。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、ポリスチレンによって形成された実質的に球形であり、マイクロビーズの表面上の官能基として１０４～１０１０個のカルボキシル基を含み、カルボキシル基の第１のサブセットは、３つの元素の組み合わせを含む元素タグとキレート化するキレート基に結合しており、カルボキシル基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる抗体と結合している。
【0092】
別の態様では、マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が本明細書で提供され、少なくとも１つのマイクロビーズは、マイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が、マイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団が、マイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む。マイクロビーズの各亜集団は、対応する標的分子を捕捉することができ、これにより、マイクロビーズの集団は、１回のアッセイで試料の多標的分子を同時に検出することができる。
【0093】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの１つの亜集団の親和性部分は、マイクロビーズの別の亜集団の親和性部分とは異なる標的分子に結合する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの１つの亜集団の親和性部分は、マイクロビーズの別の亜集団の親和性部分とは異なるエピトープに結合する。
【0094】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの各亜集団の元素タグは元素の組み合わせを含み、元素は金属またはその同位体であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの元素タグは、２つの元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの元素タグは、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇから選択される２つの元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの元素タグは、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５から選択される２つの元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの元素タグは、３つの元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの元素タグは、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇから選択される３つの元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの元素タグは、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５から選択される３つの元素の組み合わせを含む。
【0095】
元素の組み合わせは、元素分析を使用することによってマイクロビーズの集団中のマイクロビーズの亜集団の鑑別同定を可能にするバーコードとして機能することができる。このような元素の組み合わせをマイクロビーズの亜集団のバーコードとして使用することによって、マイクロビーズの集団に対して限られた数の元素を使用してより多様なタグを得ることが可能になる。例えば、マイクロビーズの集団に対して１０個の異なる元素を使用し、１０個の異なる元素から３個をバーコードとして選択することにより、マイクロビーズの集団の最大１２０個の亜集団に対して１２０個の異なるバーコードを生成することができる。組み合わせ元素を使用する戦略は、１回の元素分析で試料中の多数の分析物を同時に多重分析することを可能にし、これは有意に費用効果が高く、時間を節約する。
【0096】
いくつかの実施形態では、２つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、３つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、４つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、５つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、６つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、７つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、８つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、９つの異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。いくつかの実施形態では、１０個の異なる元素の組み合わせを使用して、マイクロビーズの亜集団のためのバーコードとして機能する。
【0097】
いくつかの実施形態では、２つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、３つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、４つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、５つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、６つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、７つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、８つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、９つの異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１０個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１１個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１２個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１３個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１４個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１５個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１６個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１７個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１８個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１９個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、２０個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、５０個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。いくつかの実施形態では、１００個の異なる元素を使用して、マイクロビーズの集団に対する多様なバーコードを生成する。
【0098】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの複数の亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる親和性部分を含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも別の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの３またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の２つの亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの４またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの５またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの１０またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの２０またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの５０またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの１００またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの２００またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの５００またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの１０００またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団が提供され、マイクロビーズの各々は表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットは、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットは、標的分子に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの１つの亜集団は、そのバーコードとして元素の固有の組み合わせを有する元素タグを含み、マイクロビーズの他の亜集団の親和性部分とは異なる親和性部分を含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、１０％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、９％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、８％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、７％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、６％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、５％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、４％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、３％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、２％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は、１％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。
【0101】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、１０％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、９％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、８％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、７％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、６％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、５％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、４％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、３％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、２％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団は実質的に球形であり、１％未満である直径の可変係数（ＣＶｄ）を有する。
【0102】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団の複数の親和性部分は、試料中の複数の標的分子を同時に捕捉するために使用することができ、親和性部分のバーコードとして機能するマイクロビーズの元素タグは、元素分析において親和性部分を確認するために使用することができ、その結果、複数の標的分子の分析が同時に可能になる。マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの各亜集団の親和性部分の例としては、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団中のマイクロビーズの各亜集団の親和性部分は抗体である。
【0103】
いくつかの実施形態では、標的分子を捕捉した後、本開示のマイクロビーズまたはマイクロビーズの集団を元素分析に供することができる。本開示の元素分析として、元素や同位体を分析可能な任意の手法を用いることができる。いくつかの実施形態では、元素分析は質量分析（ＭＳ）である。元素分析のために用いることができるＭＳの例としては、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳ、マスサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0104】
調製方法
別の態様では、本開示のマイクロビーズを調製するための方法であって、ポリマーマイクロビーズ基材を用意すること、ポリマーマイクロビーズ基材を官能基化して、ポリマーマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を設けること、キレート基が（ｂ）のポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第１のサブセットに結合するように、キレート基をポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、および親和性部分が（ｂ）のポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第２のサブセットと結合するように、親和性部分をポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、を含む方法が提供される。
別の態様では、本開示のマイクロビーズを調製するための方法であって、ポリマーマイクロビーズ基材を用意すること、ポリマーマイクロビーズ基材を官能基化して、ポリマーマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を設けること、キレート基が（ｂ）のポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第１のサブセットに結合するように、キレート基をポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、および親和性部分が（ｂ）のポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第２のサブセットと結合するように、親和性部分をポリマーマイクロビーズ基材と反応させること、を含む方法が提供される。
【0105】
マイクロビーズのポリマーマイクロビーズ基材は、任意の基材の重合によって形成することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズ基材は、スチレン、スチレン－メタクリル酸（ＳＭＡＡ）、スチレン－ジビニルベンゼン（Ｓ／ＤＶＢ）およびメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、またはそれらの任意の組み合わせの重合によって得られる。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズ基材は、スチレンの重合によって得られるポリスチレン（ＰＳ）である。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズ基材は、スチレン－メタクリル酸（ＳＭＡＡ）の重合によって得られるポリスチレン－メタクリル酸（ＰＳＭＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズ基材は、スチレン－ジビニルベンゼン（Ｓ／ＤＶＢ）の重合によって得られるポリスチレン－ジビニルベンゼン（Ｐ［Ｓ／ＤＶＢ］）である。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズ基材は、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）の重合によって得られるポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）である。
【0106】
いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロビーズ基材は、ポリマーマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を設けるように官能化される。ポリマーマイクロビーズ基材を官能化するために使用することができる官能基の例としては、カルボキシル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、マレイミド、アジド、アルキニル、ビオチン、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0107】
いくつかの実施形態では、１０４～１０１０個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０５～１０１０個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０１０個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０７～１０１０個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０８～１０１０個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０９～１０１０個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０９個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０８個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０７個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０６個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０５～１０９個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０９個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０７～１０９個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０８個の官能基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。
【0108】
いくつかの実施形態では、１０４～１０１０個のカルボキシル基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０９個のカルボキシル基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０１０個のスルフヒドリル基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０９個のスルフヒドリル基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０１０個のカルボキシル基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０９個のカルボキシル基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０１０個のアジド基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０９個のアジド基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０４～１０１０個のビオチン基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。いくつかの実施形態では、１０６～１０９個のビオチン基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上に設けられる。
【0109】
いくつかの実施形態では、本開示のマイクロビーズを調製するための方法は、キレート基がポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第１のサブセットに結合するように、キレート基をポリマーマイクロビーズ基材と反応させることを含む。元素タグをキレート化することができる任意の適切なキレート基を使用して、マイクロビーズの表面上の官能基に結合することができる。キレート基の例としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＣＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡおよびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0110】
いくつかの実施形態では、キレート基は、キレート基のアミンを介して官能基に結合される。いくつかの実施形態では、アミンは第一級アミンである。いくつかの実施形態では、キレート基は、カルボジイミド架橋を介して官能基に結合される。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、キレート基を官能基に結合させる前に、カルボジイミド化合物によって官能基を活性化することを含む。カルボジイミド化合物の例としては、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、キレート基を官能基に結合させる前にＮＨＳ－エステル中間体を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＨＳ－エステル中間体は、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）によって形成される。いくつかの実施形態では、ＮＨＳ－エステル中間体は、スルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミド）によって形成される。
【0111】
いくつかの実施形態では、キレート基は、スペーサーを介して官能基に結合される。キレート基を官能基に接続するために使用することができるスペーサーの例としては、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）およびＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超えるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超える同じスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２またはそれを超える異なるスペーサーを含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、本方法は、元素タグをキレート基にキレート化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、元素タグは１つの元素を含む。いくつかの実施形態では、元素は金属またはその同位体である。
【0113】
本開示で使用することができる金属の例としては、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【0114】
本開示で使用することができる同位体の例としては、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５が挙げられるが、これらに限定されない。
【0115】
いくつかの実施形態では、元素タグは元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、元素タグは、２またはそれを超える元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、元素タグは、３またはそれを超える元素の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、組み合わせの元素は、一定の比率でキレート基にキレート化される。いくつかの実施形態では、組み合わせの元素は、ランダムな比率でキレート基にキレート化される。いくつかの実施形態では、組み合わせの元素は、等しい比率でキレート基にキレート化される。いくつかの実施形態では、組み合わせの元素は、等しくない比率でキレート基にキレート化される。
【0116】
いくつかの実施形態では、本方法は、親和性部分がポリマーマイクロビーズ基材の表面上の官能基の第２のサブセットと結合するように、親和性部分をポリマーマイクロビーズ基材と反応させることを含む。標的分子に結合することができる任意の適切な親和性部分を使用して、マイクロビーズの表面上の官能基と結合させることができる。親和性部分の例としては、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント、軽鎖、重鎖、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0117】
いくつかの実施形態では、親和性部分は、親和性部分のアミンを介して官能基と結合される。いくつかの実施形態では、アミンは第一級アミンである。いくつかの実施形態では、親和性部分は、カルボジイミド架橋を介して官能基と結合される。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、キレート基を官能基に結合させる前に、カルボジイミド化合物によって官能基を活性化することを含む。カルボジイミド化合物の例としては、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）、およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カルボジイミド架橋は、親和性部分を官能基とカップリングさせる前に、ＮＨＳ－エステル中間体を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＨＳ－エステル中間体は、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）によって形成される。いくつかの実施形態では、ＮＨＳ－エステル中間体は、スルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミド）によって形成される。
【0118】
いくつかの実施形態では、親和性部分は、スペーサーを介して官能基と結合される。親和性部分を官能基に接続するために使用することができるスペーサーの例としては、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）およびＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超えるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは２またはそれを超える同じスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２またはそれを超える異なるスペーサーを含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、親和性部分は、キレート基を官能基に結合させる前に官能基と結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、キレート基を官能基に結合させた後に官能基と結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、元素タグをキレート基にキレート化する前に官能基と結合される。いくつかの実施形態では、親和性部分は、元素タグをキレート基にキレート化した後に官能基と結合される。
【0120】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団を調製するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団を調製するための方法は、最初に固有の元素バーコードおよび親和性部分を含むマイクロビーズの各亜集団を調製し、次いで、マイクロビーズのすべての亜集団を一緒に混合してマイクロビーズの集団を形成することを含む。
【0121】
使用方法
別の態様では、試料中の分析物を検出するための方法であって、試料をマイクロビーズと接触させることであって、マイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットが、分析物に結合することができる親和性部分と結合している、接触させること、分析物に結合したマイクロビーズを、分析物に結合していないマイクロビーズから識別すること、試料中の分析物を決定すること、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、分析物は、マイクロビーズの元素タグに基づいて決定される。
別の態様では、試料中の分析物を検出するための方法であって、試料をマイクロビーズと接触させることであって、マイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットが、分析物に結合することができる親和性部分と結合している、接触させること、分析物に結合したマイクロビーズを、分析物に結合していないマイクロビーズから識別すること、試料中の分析物を決定すること、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、分析物は、マイクロビーズの元素タグに基づいて決定される。
【0122】
いくつかの実施形態では、識別することは、マイクロビーズを固定試薬とインキュベートすることを含み、固定試薬は分析物に特異的に結合し、分析物に結合したマイクロビーズを固定する。分析物に特異的に結合することができる任意の適切な固定試薬を使用して、分析物に結合したマイクロビーズを識別することができる。いくつかの実施形態では、固定試薬は、分析物に特異的に結合することができる表面にコンジュゲートされた親和性成分を含む表面である。表面の例としては、分析物に特異的に結合することができる表面にコンジュゲートされた親和性成分を含む、基材、マトリックス、粒子、ビーズ、プレート、チップの表面が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、親和性成分は、本開示のマイクロビーズの親和性部分とは異なる分析物の分子表面に結合する。いくつかの実施形態では、親和性成分は、本開示のマイクロビーズの親和性部分とは異なる分析物のエピトープに結合する。
【0123】
いくつかの実施形態では、本方法は、元素分析によって分析物を決定する前に、分析物に結合したマイクロビーズを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、分析物に結合したマイクロビーズは上記のように表面によって固定され、分析物に結合していないマイクロビーズを洗い流して、結合していないマイクロビーズから分析物に結合したマイクロビーズを単離することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、元素分析によって分析物を決定する前に、表面によって固定されたマイクロビーズを取り外すことをさらに含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、識別することは、マイクロビーズを検出試薬とインキュベートすることを含み、検出試薬は分析物に特異的に結合し、分析物に結合したマイクロビーズの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、本方法は、試料からマイクロビーズを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、遠心分離によって試料から単離される。
【0125】
検出用試薬の例としては、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出試薬は抗体である。いくつかの実施形態では、検出抗体は、本開示のマイクロビーズの親和性部分とは異なる分析物の分子表面に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、検出抗体は、本開示のマイクロビーズの親和性部分とは異なる分析物のエピトープに特異的に結合する。
【0126】
いくつかの実施形態では、検出試薬は、分析物に結合したマイクロビーズの検出を可能にする検出タグで標識される。検出タグは、マイクロビーズの識別を可能にする任意の適切なタグであり得る。いくつかの実施形態では、検出タグは検出元素タグである。いくつかの実施形態では、検出元素タグは金属またはその同位体である。
【0127】
検出元素タグに用いることができる金属の例としては、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【0128】
検出元素タグに用いることができる同位体の例としては、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５が挙げられるが、これらに限定されない。
【0129】
いくつかの実施形態では、試料中の分析物を検出するための方法は、試料を本開示のマイクロビーズと接触させることであって、マイクロビーズの複数の官能基が、元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、マイクロビーズの複数の官能基が、分析物に結合することができる親和性部分と結合している、接触させること、および、分析物に特異的に結合することができる検出試薬を用いて、分析物に結合したマイクロビーズを分析物に結合していないマイクロビーズから識別することであって、検出試薬が分析物に結合したマイクロビーズの元素分析による検出を可能にする検出元素タグを含む、識別すること、を含む。
【0130】
いくつかの実施形態では、元素分析は質量分析（ＭＳ）である。元素分析のために用いることができるＭＳの例としては、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳ、マスサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0131】
いくつかの実施形態では、分析物を検出するための方法は、試料中の分析物を決定することを含む。いくつかの実施形態では、分析物を決定ことは、試料中の分析物の実体を明らかにすることを含む。いくつかの実施形態では、分析物の実体を明らかにすることは、元素タグの実体を分析することによって行われる。いくつかの実施形態では、分析物を決定することは、検出元素タグによって分析物に結合されたマイクロビーズを分析し、マイクロビーズの元素タグによって試料中の分析物の実体を分析することによって行われる。
【0132】
いくつかの実施形態では、分析物を決定することは、試料中の分析物の量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、分析物の量を定量することは、検出元素タグを分析することによって行われる。いくつかの実施形態では、分析物の量を定量することは、検出元素タグの相対量によって行われる。いくつかの実施形態では、分析物の量を定量することは、検出元素タグの絶対量によって行われる。
【0133】
いくつかの実施形態では、本方法を使用して、対象から得られた試料を分析することができる。いくつかの実施形態では、試料は対象の体液である。体液の例としては、全血、血漿、血清、尿、滲出液、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、羊水、胃腸分泌物、痰を含む気管支分泌物、乳汁および分泌物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0134】
いくつかの実施形態では、上記の方法を使用して、試料中の１またはそれを超えるバイオマーカーを分析することができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーを使用して、疾患を予測または診断することができる。バイオマーカーの例としては、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、タンパク質、ペプチド、ＣＤ抗原、ウイルス抗原、抗体、ニューロトロフィン、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0135】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して、液体または固体基質の状態の試料の中の核酸を分析することができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して、細胞試料、ＲＮＡ試料、ＤＮＡ試料またはそれらの任意の組み合わせの中の核酸を分析することができる。異なる試料を分析するために、追加の酵素を適用することができる。例えば、細胞または無細胞試料中の核酸を分析するために、Ｔａｑ酵素、他のＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体を使用することができる。
【0136】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６からＩＬ－３６）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、成長因子（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦ）、および受容体リガンド（例えばＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0137】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって分析することができるサイトカインの例としては、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＥＰＯ、Ｇ－ＣＳＦ、ＰＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＮＴ－２、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリ、ＳＣＤＧＦ、アンフィレグリン、ＨＢ－ＥＧＦ、４－１ＢＢ、アディポネクチン、ＡＩＴＲＬ、ＡＩＦ１、アンジオポエチン、アポリポタンパク質、Ｂ－細胞活性化因子、ベータデフェンシン、ベータセルリン、骨形態形成タンパク質、ＢＳＴ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、カルジオトロフィン、ＣＴＬＡ４、ＥＢＩ３、エンドグリン、エピレグリン、ＦＡＳ、Ｆｌｔ３リガンド、フォリスタチン、ヘッジホッグタンパク質、インターフェロン、インターロイキン、オトラプリン、レジスチン、血清アミロイドＡ、ＴＰＯ、トレフォイル因子、ＴＳＬＰ、腫瘍壊死因子、ウテログロビン、ビスファチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0138】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって分析することができるケモカインの例としては、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０Ａ、ＣＣＲ１０Ｂ、ＣＣＲ１１、ＥＣＲＦ－３、ＥＢＩ－１（ＥＢＶ誘導遺伝子－１）、ＵＳ２８、ＭＣＰ－４、ＭＩＰ－４、Ｉ－３０９、ＴＥＣＫ、ＧＣＰ－２、Ｍｉｇ、リンホタクチン、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、エオタキシン－１、ＭＣＩＦ、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＭＰＩＦ－２（エオタキシン－２）、ＳＤＦ－１、およびフラクタルカイン（ニューロタクチン）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0139】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって分析することができる可溶性ＣＤ抗原の例としては、ｓＣＤ４、ｓＣＤ８、ｓＣＤ２３、ｓＣＤ２５、ｓＣＤ２７、ｓＣＤ３０、ｓＣＤ５２などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0140】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって分析することができる成長因子の例としては、アクチビン、ＣＳＦ、ＣＴＧＦ、エピゲン、エリスロポエチン 線維芽細胞成長因子、ガレクチン、ＨＤＧＦ、肝細胞成長因子、ＩＧＦＢＰインスリン様成長因子、インスリン、ケラチノサイト成長因子、レプチン、マクロファージ遊走阻害因子、メラノーマ阻害活性ミオスタチン、ノギン、ＮＯＶ、オメンチン、オンコスタチン－Ｍ、オステオポンチン、オステオプロテゲリン、ＰＤＧＦ、ペリオスチン、胎盤成長因子、胎盤ラクトゲン、プロラクチンＰＲＬ ＲＡＮＫリガンド、レチノール結合タンパク質、幹細胞因子、トランスフォーミング成長因子、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＴＧＦ、エリスロポエチン（Erythropieitn）、ＴＰＯ、ＢＭＰ、ＨＧＦ、ＧＤＦ、ニューロトロフィン、ＭＳＦ、ＳＧＦ、ＧＤＦなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0141】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって分析することができるホルモンの例としては、エンドセリン、エキセンジン、ＦＳＨ、ＧＨＲＰ、ＧＬＰ、グルカゴン、ＨＣＧ、インヒビンＡ、ＬＨＲＨ、ＡＣＴＨ、アラレリン、アンチド、アトシバン、ブセレリン、セトロレリクス、ＤＤＡＶＰ、デスロレリン、エルカトニン、ガニレリクス、ＧＨＲＬタンパク質、ゴセレリン、ヘキサレリン、ヒストレリン、ランレオチド、ロイプロレリンヒト、リプレシン、メラノタン－Ｉ、メラノタン－ＩＩ、ＮＡＦ、ＰＭＳＧ、プラムリンチド、セクレチン、シンカリド、ソマトスタチン、テルリプレシン、チモペンチン、プロカルシトニン、ＰＴＨ、スタニオカルシン、チモシン、トリプトレリンアセタート、チロスチムリン、ＴＳＨ、バソプレシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0142】
別の態様では、試料中の２またはそれを超える分析物の多重分析を実施する方法であって、（ａ）マイクロビーズの集団を試料と接触させることであって、マイクロビーズの各々がマイクロビーズ基材の表面上に複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合しており、複数の官能基の第２のサブセットが２またはそれを超える分析物のうちの１つの分析物に結合することができる親和性部分と結合しており、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む、接触させること、（ｂ）マイクロビーズの集団を２またはそれを超える検出試薬とインキュベートすることであって、検出試薬の各々が分析物に結合したマイクロビーズの検出を可能にする、インキュベートすること、および（ｃ）試料中の２またはそれを超える分析物を同時に分析すること、を含む方法が提供される。
【0143】
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団の各マイクロビーズの元素タグは元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、それは２またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、それは３またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、それは４またはそれを超える元素の組み合わせである。いくつかの実施形態では、それは５またはそれを超える元素の組み合わせである。このような元素の組み合わせを用いることで、限られた数の元素を用いることによってより多様なタグを得ることが可能となる。例えば、１０個の異なる元素から３個を選択することにより、１２０個の異なる元素の組み合わせ、すなわち１２０個の異なる元素タグを生成することができる。組み合わせ元素を使用する戦略は、１回の元素分析で試料中の多数の分析物を同時に多重分析することを可能にし、これは有意に費用効果が高く、時間を節約する。
【0144】
検出用試薬の例としては、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、酵素、炭水化物、核酸、デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、リボ核酸脂質、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出試薬は抗体である。いくつかの実施形態では、検出抗体は、本開示のマイクロビーズの親和性部分とは異なる分析物の分子表面に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、検出抗体は、本開示のマイクロビーズの親和性部分とは異なる分析物のエピトープに特異的に結合する。
【0145】
いくつかの実施形態では、検出試薬は検出元素タグで標識される。検出元素タグは、分析物に結合したマイクロビーズと、分析物に結合していないマイクロビーズとを識別することを可能にする。いくつかの実施形態では、検出元素タグは金属またはその同位体である。
【0146】
検出元素タグに用いることができる金属の例としては、Ｙ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂａ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｒｎ、Ｆｒ、Ｒａ、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ、Ｌｒ、Ｒｆ、Ｄｂ、Ｓｇ、Ｂｈ、Ｈｓ、Ｍｔ、Ｄｓ、Ｒｇ、Ｃｎ、Ｎｈ、Ｆｌ、Ｍｃ、Ｌｖ、Ｔｓ、およびＯｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【0147】
検出元素タグに用いることができる同位体の例としては、Ｙ－８９、Ｒｈ－１０３、Ｐｄ－１０２、Ｐｄ－１０４、Ｐｄ－１０５、Ｐｄ－１０６、Ｐｄ－１０８、Ｐｄ－１１０、Ｃｄ－１０６、Ｃｄ－１０８、Ｃｄ－１１０、Ｃｄ－１１１、Ｃｄ－１１２、Ｃｄ－１１３、Ｃｄ－１１４、Ｃｄ－１１６、Ｉｎ－１１５、Ｌａ－１３９、Ｃｅ－１４０、Ｐｒ－１４１、Ｎｄ－１４２、Ｎｄ－１４３、Ｎｄ－１４４、Ｎｄ－１４５、Ｎｄ－１４６、Ｎｄ－１４８、Ｎｄ－１５０、Ｓｍ－１４７、Ｓｍ－１４９、Ｓｍ－１５２、Ｓｍ－１５４、Ｅｕ－１５１、Ｅｕ－１５３、Ｇｄ－１５５、Ｇｄ－１５６、Ｇｄ－１５７、Ｇｄ－１５８、Ｇｄ－１６０、Ｔｂ－１５９、Ｄｙ－１６１、Ｄｙ－１６２、Ｄｙ－１６３、Ｄｙ－１６４、Ｈｏ－１６５、Ｅｒ－１６６、Ｅｒ－１６７、Ｅｒ－１６８、Ｅｒ－１７０、Ｔｍ－１６９、Ｙｂ－１７１、Ｙｂ－１７２、Ｙｂ－１７３、Ｙｂ－１７４、Ｙｂ－１７６、およびＬｕ－１７５が挙げられるが、これらに限定されない。
【0148】
いくつかの実施形態では、多重分析のための元素分析は、質量分析（ＭＳ）であり得る。ＭＳの例としては、ＩＣＰ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳおよびマスサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0149】
いくつかの実施形態では、多重分析は、試料中の２またはそれを超える分析物の実体を明らかにすることを含む。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物の本質は、マイクロビーズの元素タグを分析することによって明らかにされる。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える分析物の本質は、マイクロビーズの元素タグおよび検出元素タグを分析することによって明らかにされる。いくつかの実施形態では、多重分析は、試料中の２またはそれを超える分析物の量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、定量は、検出元素タグを分析することによって決定される。
【0150】
いくつかの実施形態では、多重分析を実施するための方法は、試料からマイクロビーズを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離は遠心分離機によって行われる。
【0151】
いくつかの実施形態では、多重分析を使用して、対象から得られた試料を分析することができる。いくつかの実施形態では、試料は対象の体液である。体液の例としては、全血、血漿、血清、尿、滲出液、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、羊水、胃腸分泌物、痰を含む気管支分泌物、乳汁および分泌物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0152】
いくつかの実施形態では、上記の多重分析を使用して、試料中の複数のバイオマーカーを同時に分析することができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、疾患を予測する、診断する、または治療的介入に対する応答を評価するために使用することができる。バイオマーカーの例としては、サイトカイン、ホルモン、成長因子、タンパク質、ペプチド、ＣＤ抗原、ウイルス抗原、抗体、ニューロトロフィン、核酸、オリゴヌクレオチド、および代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６からＩＬ－３６）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、成長因子（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦ）、および受容体リガンド（例えばＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0153】
本開示の多重分析によって分析することができるサイトカインの例としては、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＥＰＯ、Ｇ－ＣＳＦ、ＰＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＮＴ－２、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリ、ＳＣＤＧＦ、アンフィレグリン、ＨＢ－ＥＧＦ、４－１ＢＢ、アディポネクチン、ＡＩＴＲＬ、ＡＩＦ１、アンジオポエチン、アポリポタンパク質、Ｂ－細胞活性化因子、ベータデフェンシン、ベータセルリン、骨形態形成タンパク質、ＢＳＴ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、カルジオトロフィン、ＣＴＬＡ４、ＥＢＩ３、エンドグリン、エピレグリン、ＦＡＳ、Ｆｌｔ３リガンド、フォリスタチン、ヘッジホッグタンパク質、インターフェロン、インターロイキン、オトラプリン、レジスチン、血清アミロイドＡ、ＴＰＯ、トレフォイル因子、ＴＳＬＰ、腫瘍壊死因子、ウテログロビン、ビスファチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0154】
本開示の多重分析によって分析することができるケモカインの例としては、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０Ａ、ＣＣＲ１０Ｂ、ＣＣＲ１１、ＥＣＲＦ－３、ＥＢＩ－１（ＥＢＶ誘導遺伝子－１）、ＵＳ２８、ＭＣＰ－４、ＭＩＰ－４、Ｉ－３０９、ＴＥＣＫ、ＧＣＰ－２、Ｍｉｇ、リンホタクチン、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、エオタキシン－１、ＭＣＩＦ、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＭＰＩＦ－２（エオタキシン－２）、ＳＤＦ－１、およびフラクタルカイン（ニューロタクチン）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0155】
本開示の多重解析によって解析することができる成長因子の例としては、アクチビン、ＣＳＦ、ＣＴＧＦ、エピゲン、エリスロポエチン 線維芽細胞成長因子、ガレクチン、ＨＤＧＦ、肝細胞成長因子、ＩＧＦＢＰインスリン様成長因子、インスリン、ケラチノサイト成長因子、レプチン、マクロファージ遊走阻害因子、メラノーマ阻害活性ミオスタチン、ノギン、ＮＯＶ、オメンチン、オンコスタチン－Ｍ、オステオポンチン、オステオプロテゲリン、ＰＤＧＦ、ペリオスチン、胎盤成長因子、胎盤ラクトゲン、プロラクチンＰＲＬ ＲＡＮＫリガンド、レチノール結合タンパク質、幹細胞因子、トランスフォーミング成長因子、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＴＧＦ、エリスロポエチン、ＴＰＯ、ＢＭＰ、ＨＧＦ、ＧＤＦ、ニューロトロフィン、ＭＳＦ、ＳＧＦ、ＧＤＦなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0156】
本開示の多重分析によって分析することができるホルモンの例としては、エンドセリン、エキセンジン、ＦＳＨ、ＧＨＲＰ、ＧＬＰ、グルカゴン、ＨＣＧ、インヒビンＡ、ＬＨＲＨ、ＡＣＴＨ、アラレリン、アンチド、アトシバン、ブセレリン、セトロレリクス、ＤＤＡＶＰ、デスロレリン、エルカトニン、ガニレリクス、ＧＨＲＬタンパク質、ゴセレリン、ヘキサレリン、ヒストレリン、ランレオチド、ロイプロレリンヒト、リプレシン、メラノタン－Ｉ、メラノタン－ＩＩ、ＮＡＦ、ＰＭＳＧ、プラムリンチド、セクレチン、シンカリド、ソマトスタチン、テルリプレシン、チモペンチン、プロカルシトニン、ＰＴＨ、スタニオカルシン、チモシン、トリプトレリンアセタート、チロスチムリン、ＴＳＨ、バソプレシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0157】
キット
別の態様では、キットであって、キットを使用して２またはそれを超える分析物の多重分析を実施するための指示と、マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団であって、少なくとも１つのマイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上の複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合されており、複数の官能基の第２のサブセットが標的分子に結合することができる親和性部分と結合されており、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む、マイクロビーズの集団と、２またはそれを超える検出試薬であって、検出試薬のそれぞれが検出元素タグを含み、２またはそれを超える分析物に特異的に結合する、検出試薬と、を含むキットが提供される。
別の態様では、キットであって、キットを使用して２またはそれを超える分析物の多重分析を実施するための指示と、マイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含むマイクロビーズの集団であって、少なくとも１つのマイクロビーズがマイクロビーズ基材の表面上の複数の官能基を含み、複数の官能基の第１のサブセットが元素タグとキレート化したキレート基に結合されており、複数の官能基の第２のサブセットが標的分子に結合することができる親和性部分と結合されており、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの少なくとも別の亜集団とは異なる元素タグを含み、マイクロビーズの少なくとも１つの亜集団がマイクロビーズの別の亜集団とは異なる親和性部分を含む、マイクロビーズの集団と、２またはそれを超える検出試薬であって、検出試薬のそれぞれが検出元素タグを含み、２またはそれを超える分析物に特異的に結合する、検出試薬と、を含むキットが提供される。
【0158】
いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の２またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの２またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の３またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの３またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の４またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの４またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の５またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの５またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の１０またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの１０またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の２０またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの２０またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の５０またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの５０またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の１００個の分析物を捕捉するためのマイクロビーズの１００またはそれを超える亜集団を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、試料中の２００またはそれを超える分析物を捕捉するためのマイクロビーズの２００またはそれを超える亜集団を含む。
【0159】
いくつかの実施形態では、本キットは、２またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、３またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、４またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、５またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、１０またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、２０またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、５０またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、１００またはそれを超える検出試薬を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、２００またはそれを超える検出試薬を含む。
【0160】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、分析を実施するための医薬賦形剤をさらに含む。賦形剤の例としては、安定剤、バッファー、保存剤、等張化剤および酸化防止剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0161】
いくつかの実施形態では、本開示のキットに含めることができるバッファーの例としては、ホウ酸バッファー、クエン酸バッファー、酒石酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファーおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびＨＣｌを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【0162】
実施例
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し記載してきたが、かかる実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく、当業者は多数の変形、変更、および置換に想到する。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し記載してきたが、かかる実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく、当業者は多数の変形、変更、および置換に想到する。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【0163】
実施例１：マイクロビーズの調製
マイクロビーズ基材をポリスチレン（ＰＳ）の重合によって調製して、平均直径約１．９μｍの球状マイクロビーズ基材を得た。マイクロビーズ基材の表面を、カルボキシル基（マイクロビーズ当たりおよそ１０９個のカルボキシル基）でさらに官能化した。次いで、カルボキシル基をさらに反応させた。
マイクロビーズ基材をポリスチレン（ＰＳ）の重合によって調製して、平均直径約１．９μｍの球状マイクロビーズ基材を得た。マイクロビーズ基材の表面を、カルボキシル基（マイクロビーズ当たりおよそ１０９個のカルボキシル基）でさらに官能化した。次いで、カルボキシル基をさらに反応させた。
【0164】
図１は、マイクロビーズを調製するためのプロセスを示す。このプロセスでは、マイクロビーズ基材［１］をポリスチレン（ＰＳ）の重合によって調製し、マイクロビーズ基材の表面を複数のカルボキシル基で官能化し［２］、次いで、元素タグとキレート化することができるキレート基［３］をカルボキシル基の第１のサブセットに結合させ、標的分子に結合することができる親和性部分［４］をカルボキシル基の第２のサブセットと結合させた。
【0165】
図２Ａは、親和性部分をマイクロビーズの表面上の官能基とカップリングさせるための例示的なプロセスを示す。これらのプロセスにおいて、カルボジイミド化合物ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）［６］を用いて、マイクロビーズ［５］の表面のカルボキシル基を活性化し、親和性部分の第一級アミンと反応し得る反応性中間体［７］を形成した。この反応性中間体［７］を親和性部分［８］とさらに反応させて、親和性部分と結合したマイクロビーズ［９］を得た。
【0166】
代替のプロセスでは、ＥＤＣを用いて反応性中間体［７］を形成した後、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）［１０］を添加して、親和性部分の第一級アミンと反応することができるＮＨＳ－エステル中間体［１１］を形成した。ＮＨＳ－エステル中間体［１１］を親和性部分［８］とさらに反応させて、親和性部分と結合したマイクロビーズ［９］を得た。
【0167】
別のプロセスでは、ＥＤＣを用いて反応性中間体［７］を形成した後、スルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミド）［１２］を添加して、親和性部分の第一級アミンと反応することができるスルホ－ＮＨＳ－エステル中間体［１３］を形成した。スルホ－ＮＨＳ－エステル中間体［１３］を親和性部分［８］とさらに反応させて、親和性部分と結合したマイクロビーズ［９］を得た。
【0168】
図２Ｂは、マイクロビーズの表面上の官能基にキレート基を結合させるための例示的なプロセスを示す。二官能性キレート剤［１４］をキレート基として使用した。当該二官能性キレート剤は、マイクロビーズの表面のカルボキシ基と結合するためのアミノ基と、Ｌｎ３＋カチオンまたは元素の組み合わせ［１５］などの元素タグに結合することができるカチオンキレート基とを含む。このプロセスでは、まず二官能キレート剤をＬｎ３＋と反応させて金属カチオンと結合したキレート剤［１６］を形成し［１６］、次いで金属カチオンと結合したキレート剤をマイクロビーズ表面のカルボキシル基とキレート剤のアミノ基を介して反応させ、キレート基を有するマイクロビーズ［１７］を得た。あるいは、二官能性キレート剤［１４］を最初にマイクロビーズの表面のカルボキシル基と反応させ、次いでＬｎ３＋カチオンまたは元素の組み合わせ［１５］などの元素タグと反応させて、キレート基を有するマイクロビーズ［１７］を得ることができる。
【0169】
図２Ｃは、マイクロビーズの表面上の官能基に親和性部分をコンジュゲートさせるために使用することができる例示的なスペーサーを示す。スペーサー［２０］は、マイクロビーズ［１８］と親和性部分［１９］との間に共有結合を形成することができる。このスペーサーは、生体分子などの親和性部分とマイクロビーズとの間の立体障害を克服し、親和性部分の活性に対する影響を低減するように、それらの間に適切な距離を設けることができる。スペーサーは、化合物ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）［２１］、または官能性オリゴマーＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－マレイミド［２２］であり得る。［２１］および［２２］は、いずれもマイクロビーズのカルボキシルとコンジュゲートするアミノ基と、生体高分子（抗体）のスルフヒドリル基とコンジュゲートするマレイミド基とを有する。
【0170】
実施例２：ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳを用いることによる組み合わせ元素タグを有するマイクロビーズの分析
元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識されたカルボキシル修飾マイクロビーズを、親和性部分とのカップリングなしで、実施例１に記載のプロセスによって調製した。調製したマイクロビーズの特徴は表１に示す通りである。
元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識されたカルボキシル修飾マイクロビーズを、親和性部分とのカップリングなしで、実施例１に記載のプロセスによって調製した。調製したマイクロビーズの特徴は表１に示す通りである。
【表1】
【0171】
上記で調製したマイクロビーズを１×１０６ビーズ／ｍＬの濃度で蒸留水に再懸濁した後、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳで分析した。マススペクトルの結果は図３に示す通りであり、１秒間の累積で１３０から１７６の質量範囲（ＡＭＵ）であった。各元素のピークは、表２に示すように、１秒間の累積での各ピークの積分によってさらに定量した。
【表2】
【0172】
実施例３：マスサイトメトリーによる、組み合わせ元素タグおよびマウスＩｇＧを有するマイクロビーズの分析
実施例１に記載のプロセスにより、元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識されたカルボキシル修飾マイクロビーズを調製し、さらにそのマイクロビーズをマウスＩｇＧと結合させた。次いで、マイクロビーズをビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体および１６９Ｔｍ標識ストレプトアビジンとインキュベートして、検出元素タグ１６９Ｔｍを有する抗マウスＩｇＧに結合したマイクロビーズを得た。次いで、上記マイクロビーズ（図４の下部パネル）を、対照としてのマウスＩｇＧとのカップリングなしで組み合わせ元素タグのみを有する実施例２で調製したマイクロビーズ（図４の上部パネル）と共に、マスサイトメトリーに供した。
実施例１に記載のプロセスにより、元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識されたカルボキシル修飾マイクロビーズを調製し、さらにそのマイクロビーズをマウスＩｇＧと結合させた。次いで、マイクロビーズをビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体および１６９Ｔｍ標識ストレプトアビジンとインキュベートして、検出元素タグ１６９Ｔｍを有する抗マウスＩｇＧに結合したマイクロビーズを得た。次いで、上記マイクロビーズ（図４の下部パネル）を、対照としてのマウスＩｇＧとのカップリングなしで組み合わせ元素タグのみを有する実施例２で調製したマイクロビーズ（図４の上部パネル）と共に、マスサイトメトリーに供した。
【0173】
図４は、マスサイトメトリーの結果を示す。図４から分かるように、マウスＩｇＧと結合し、検出元素タグ１６９Ｔｍを有する抗マウスＩｇＧとインキュベートしたマイクロビーズは、検出元素タグ１６９Ｔｍを介してマウスＩｇＧを含まないマイクロビーズから識別することができ、これは、分析物に結合したマイクロビーズを分析物に結合していないマイクロビーズから識別することにおける検出元素タグの機能を裏付ける。
【0174】
【0175】
実施例４：親和性部分とマイクロビーズとのカップリング効率
元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識され、マウスＩｇＧと結合したカルボキシル修飾マイクロビーズを上記のように調製した。次いで、このマイクロビーズを、それぞれ１６９Ｔｍ標識抗マウスＩｇＧ抗体の勾配濃度（２、４および８μｇ／ｍＬ）でインキュベートした。インキュベーション後、マイクロビーズをさらに１×１０６ビーズ／ｍＬで蒸留水に再懸濁し、マスサイトメトリーに供した。異なる濃度（０、０．０６７、０．１３、０．２５、０．５、２、４、８μｇ／ｍＬ）の１６９Ｔｍ標識抗マウスＩｇＧを陽性対照として使用した。マウスＩｇＧを含まないマイクロビーズを陰性対照として使用した（データは示さず）。結果は図５Ａに示す通りである。
元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識され、マウスＩｇＧと結合したカルボキシル修飾マイクロビーズを上記のように調製した。次いで、このマイクロビーズを、それぞれ１６９Ｔｍ標識抗マウスＩｇＧ抗体の勾配濃度（２、４および８μｇ／ｍＬ）でインキュベートした。インキュベーション後、マイクロビーズをさらに１×１０６ビーズ／ｍＬで蒸留水に再懸濁し、マスサイトメトリーに供した。異なる濃度（０、０．０６７、０．１３、０．２５、０．５、２、４、８μｇ／ｍＬ）の１６９Ｔｍ標識抗マウスＩｇＧを陽性対照として使用した。マウスＩｇＧを含まないマイクロビーズを陰性対照として使用した（データは示さず）。結果は図５Ａに示す通りである。
【0176】
【0177】
実施例５：本開示の方法を使用することによるヒトＴＮＦαの分析
元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識され、抗ヒトＴＮＦα抗体と結合したカルボキシル修飾マイクロビーズを実施例１に記載したように調製した。次いで、このマイクロビーズを、勾配濃度（０、３．１３、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０ｎｇ／ｍＬ）のヒトＴＮＦαを含む試料とインキュベートした。ビオチン標識抗ヒトＴＮＦα抗体および（検出元素タグとしての）１６９Ｔｍ標識ストレプトアビジンをマイクロビーズの懸濁物にさらに添加した。次いで、マイクロビーズをマスサイトメトリー分析に供した。図６Ａは、マスサイトメトリーを用いることによるヒトＴＮＦαの分析を示す。図６Ａから分かるように、本出願の方法は、試料中のヒトＴＮＦαを３．１３ｎｇ／ｍＬという低い濃度まで検出することができ、これは、本出願の方法の高い感度を証明している。
元素（１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ）の組み合わせを含む元素タグで標識され、抗ヒトＴＮＦα抗体と結合したカルボキシル修飾マイクロビーズを実施例１に記載したように調製した。次いで、このマイクロビーズを、勾配濃度（０、３．１３、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０ｎｇ／ｍＬ）のヒトＴＮＦαを含む試料とインキュベートした。ビオチン標識抗ヒトＴＮＦα抗体および（検出元素タグとしての）１６９Ｔｍ標識ストレプトアビジンをマイクロビーズの懸濁物にさらに添加した。次いで、マイクロビーズをマスサイトメトリー分析に供した。図６Ａは、マスサイトメトリーを用いることによるヒトＴＮＦαの分析を示す。図６Ａから分かるように、本出願の方法は、試料中のヒトＴＮＦαを３．１３ｎｇ／ｍＬという低い濃度まで検出することができ、これは、本出願の方法の高い感度を証明している。
【0178】
【0179】
実施例６：本開示の方法を用いることによる核酸の分析
１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ、および１６９Ｔｍから選択される元素の組み合わせを含む元素タグを、実施例１に記載のとおりカルボキシル修飾マイクロビーズと結合させた。次いで、１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６９Ｔｍで標識されたマイクロビーズを、ＴＡＧがＴ塩基、Ａ塩基およびＧ塩基からなる特異的核酸配列である、ＣＤ３を標的化するためのＮＨ２－ＴＡＧ－ＣＤ３プライマーＦとさらに結合させた。１４１Ｐｒ、１６５Ｈｏ、１６９Ｔｍで標識したマイクロビーズを、ＣＤ４を標的化するためにＮＨ２－ＴＡＧ－ＣＤ４プライマーＦとさらに結合させた。１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏで標識したマイクロビーズを、ＣＤ１９を標的化するためにＮＨ２－ＴＡＧ－ＣＤ１９プライマーＦとさらに結合させた。
１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ、および１６９Ｔｍから選択される元素の組み合わせを含む元素タグを、実施例１に記載のとおりカルボキシル修飾マイクロビーズと結合させた。次いで、１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６９Ｔｍで標識されたマイクロビーズを、ＴＡＧがＴ塩基、Ａ塩基およびＧ塩基からなる特異的核酸配列である、ＣＤ３を標的化するためのＮＨ２－ＴＡＧ－ＣＤ３プライマーＦとさらに結合させた。１４１Ｐｒ、１６５Ｈｏ、１６９Ｔｍで標識したマイクロビーズを、ＣＤ４を標的化するためにＮＨ２－ＴＡＧ－ＣＤ４プライマーＦとさらに結合させた。１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏで標識したマイクロビーズを、ＣＤ１９を標的化するためにＮＨ２－ＴＡＧ－ＣＤ１９プライマーＦとさらに結合させた。
【0180】
上記３種類のマイクロビーズにおける１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏ、１６９Ｔｍの元素シグナルを、図７に示すように、マスサイトメーターで定量した。図７において、黄色の矢印は、１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６９Ｔｍの組み合わせの元素タグ（１６５Ｈｏなし）を有し、ＣＤ３プライマーと結合したマイクロビーズのシグナルを示し、赤色の矢印は、１４１Ｐｒ、１６５Ｈｏ、１６９Ｔｍの組み合わせの元素タグ（１５９Ｔｂなし）を有し、ＣＤ４プライマーと結合したマイクロビーズのシグナルを示し、緑色の矢印は、１４１Ｐｒ、１５９Ｔｂ、１６５Ｈｏの組み合わせの元素タグ（１６９Ｔｍなし）を有し、ＣＤ１９プライマーと結合したマイクロビーズのシグナルを示す。図７から、元素の異なる組み合わせを有し、異なる遺伝子を標的とするプライマーと結合されたマイクロビーズは、マスサイトメトリー分析によって区別できることが分かる。
【0181】
次いで、異なる組み合わせ元素およびプライマーを含む上記３種類のマイクロビーズの混合物を、それぞれＨ２Ｏ（対照）、ＨＥＫ２９３Ｔ ＲＮＡおよび末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ＲＮＡを含む試料と共に、ＰＣＲ反応のためのビオチン－プライマーＲ、ｄＮＴＰ、バッファー、酵素、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ非含有水を含有するＰＣＲミックスＡと共にインキュベートした。別法として、プライマーＲ、ビオチン－ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、バッファー、酵素、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ非含有水を含有するＰＣＲミックスＢを反応に使用することもできる。
【0182】
ＰＣＲの後、試料中のマイクロビーズを０．２５μｍカラムによって精製し、次いで再懸濁し、ＳＡ－Ｅｕ１５１検出元素タグを含有するバッファー中でさらに数分間インキュベートし、続いてマスサイトメーターによって分析した。
【0183】
図８Ａ～図８Ｃは、Ｈ２Ｏ、ＨＥＫ２９３Ｔ ＲＮＡ、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ＲＮＡを含む試料からマスサイトメトリー分析によって検出されたＥｕ１５１の中央値を示す。Ｅｕ１５１の中央値を、表４に示すようにさらに定量した。
【表4】
【0184】
図８Ａ～図８Ｃおよび表４は、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ１９がいずれもＰＢＭＣにおいて高度に発現されたが、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ１９の発現レベルはいずれも比較的低かったことを示す。これらの知見は、これらの細胞の既知の特徴と一致し、核酸試料を定量する際の本出願の方法の精度および感度を示した。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】