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特表2023-526355マウスＴＣＲ遺伝子のコピー数を決定するためのキット及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】マウスＴＣＲ遺伝子のコピー数を決定するためのキット及び方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20230614BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20230614BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20230614BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230614BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6851 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022570176
(86)(22)【出願日】2021-05-17
(85)【翻訳文提出日】2023-01-06
(86)【国際出願番号】 US2021032744
(87)【国際公開番号】W WO2021236508
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】202010423994.3
(32)【優先日】2020-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520370577
【氏名又は名称】シャンハイ・セルラー・バイオファーマシューティカル・グループ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】フアン，ジアチー
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ，イーホン
(72)【発明者】
【氏名】グオ，リン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ジャーシュ
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ，シン
(72)【発明者】
【氏名】チュー，シーグイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，フェイ
(72)【発明者】
【氏名】ウ，ジュンフェン
(72)【発明者】
【氏名】ルー，ジシュン
(72)【発明者】
【氏名】レン，ジャーチャン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，リ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS32
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
本開示は、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するためのシステム、キット及び方法を提供する。プライマーは、マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域に特異的である。プライマー／プローブは、良好な増幅効率を提供し、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を迅速かつ正確に決定することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するためのシステムであって、前記システムが、第１のプライマー対、第２のプライマー対、第３のプライマー対、及び第４のプライマー対から選択される１つ以上のプライマー対を含み、前記第１のプライマー対が、（ｉ）配列番号１に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号２に示される核酸配列を含むプライマーを含み、前記第２のプライマー対が、（ｉ）配列番号４に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号５に示される核酸配列を含むプライマーを含み、前記第３のプライマー対が、（ｉ）配列番号７に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号８に示される核酸配列を含むプライマーを含み、前記第４のプライマー対が、（ｉ）配列番号１０に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号１１に示される核酸配列を含むプライマーを含む、システム。
【請求項2】
第１のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブ、及び第４のプローブから選択される１つ以上のプローブを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記第１のプローブが、配列番号３に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブであり、前記第２のプローブが、配列番号６に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブであり、前記第３のプローブが、配列番号９に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブであり、前記第４のプローブが、配列番号１２に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブである、請求項２に記載のシステム。
【請求項4】
前記システムが、前記第１のプライマー対及び前記第１のプローブを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項5】
マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するためのキットであって、前記キットが、第１のプライマー対、第２のプライマー対、第３のプライマー対、及び第４のプライマー対から選択される１つ以上のプライマー対を含み、前記第１のプライマー対が、（ｉ）配列番号１に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号２に示される核酸配列を含むプライマーを含み、前記第２のプライマー対が、（ｉ）配列番号４に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号５に示される核酸配列を含み、前記第３のプライマー対が、（ｉ）配列番号７に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号８に示される核酸配列を含むプライマーを含み、前記第４のプライマー対が、（ｉ）配列番号１０に示される核酸配列を含むプライマー、及び（ｉｉ）配列番号１１に示される核酸配列を含むプライマーを含む、キット。
【請求項6】
第１のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブ、及び第４のプローブから選択される１つ以上のプローブを更に含む、請求項５に記載のキット。
【請求項7】
前記第１のプローブが、配列番号３に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブであり、前記第２のプローブが、配列番号６に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブであり、前記第３のプローブが、配列番号９に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブであり、前記第４のプローブが、配列番号１２に示される核酸配列を含むＴａｑＭａｎプローブである、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記キットが、前記第１のプライマー対及び前記第１のプローブを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項9】
サンプル中のマウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するための方法であって、前記方法が、（ａ）サンプルを請求項１～４のいずれか一項に記載のシステムと接触させること、及び
（ｂ）核酸増幅反応を行うことを含む、方法。
【請求項10】
前記マウスＴＣＲ遺伝子が導入遺伝子である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１８日に出願された中国特許出願第２０２０１０４２３９９４３号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月１８日に出願された中国特許出願第２０２０１０４２３９９４３号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子データで提出された配列表を包含し、その全体が参照により本明細書に援用される。２０２１年５月１７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１１２９９－００９９４０－ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、サイズは４ＫＢである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子データで提出された配列表を包含し、その全体が参照により本明細書に援用される。２０２１年５月１７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１１２９９－００９９４０－ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、サイズは４ＫＢである。
【0003】
本開示は、配列分析及びバイオインフォマティクスの分野に関し、具体的には、マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するためのキット及び方法に関する。
【背景技術】
【0004】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原ペプチド－ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）複合体を特異的に認識して結合する、Ｔ細胞の表面上のタンパク質複合体である。ＴＣＲは、一般的には、ＣＤ３分子との複合体の形態で存在する。一部のＴＣＲはα及びβペプチド鎖で構成され、一方、一部はγ及びδペプチド鎖で構成される。
【0005】
ヒト腫瘍特異的抗原を使用してＨＬＡトランスジェニックマウスを免疫すると、ヒト腫瘍特異的抗原を認識できる高親和性マウスＴＣＲを発見できる。これは、治療上の価値を有するＴＣＲをスクリーニングするための重要な方法である。
【0006】
ＴＣＲ－Ｔ療法は、固形腫瘍の治療において幅広い展望を示している。しかし、遺伝子操作された細胞の生物学的安全性を考慮して、ＦＤＡは、遺伝子操作された細胞では、導入遺伝子が細胞当たり５コピーを超えることはできないと規定している。これは、ＴＣＲ－Ｔの品質モニタリング及び生産において、導入遺伝子のコピー数を迅速かつ正確に決定する必要があることを示している。ＴＣＲ－Ｔの動物実験では、動物サンプル（組織又は血液）中のヒトＴＣＲ遺伝子のコピー数は、試験動物におけるＴＣＲ－Ｔの増幅及び増殖状態を反映することが可能である。ＴＣＲ－Ｔの臨床試験では、試験サンプル（組織又は血液）中の外因性ＴＣＲ遺伝子のコピー数を決定することで、被験体のＴＣＲ－Ｔの増幅及び増殖状態を反映することができ、これを、ＴＣＲ－Ｔ治療のための主要な薬物動態（ＰＫ）指標として使用することができる。
【0007】
現在、ＴＣＲ遺伝子コピーの検出についての関連する報告は存在していない。したがって、マウスＴＣＲスクリーニングの普及と臨床製品の開発とを用いて、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を迅速かつ正確に決定できる方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するためのシステム又はキットを提供する。このシステム又はキットは、第１のプライマー対、第２のプライマー対、第３のプライマー対及び第４のプライマー対から選択される１つ以上のプライマー対を含み得る。
【0009】
第１のプライマー対は、（ｉ）配列番号１に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号２に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0010】
第２のプライマー対は、（ｉ）配列番号４に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号５に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0011】
第３のプライマー対は、（ｉ）配列番号７に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号８に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0012】
第４のプライマー対は、（ｉ）配列番号１０に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号１１に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0013】
システム又はキットは、第１のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブ、及び第４のプローブから選択される１つ以上のプローブを更に含み得る。
【0014】
第１のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブ、又は第４のプローブは、ＴａｑＭａｎプローブであり得る。
【0015】
第１のプローブは、配列番号３に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0016】
第２のプローブは、配列番号６に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0017】
第３のプローブは、配列番号９に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0018】
第４のプローブは、配列番号１２に示される核酸配列と約８０％～約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0019】
特定の実施形態において、システム又はキットは、以下のプライマー／プローブセットのうちの１つ以上を含んでもよい：第１のプライマー対及び第１のプローブ、第２のプライマー対及び第２のプローブ、第３のプライマー対及び第３のプローブ、並びに第４のプライマー対及び第４のプローブ。
【0020】
特定の実施形態において、システム又はキットは、第１のプライマー対及び第１のプローブを含み得る。
【0021】
本開示は、サンプル中のマウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）サンプルを本システム又はキットと接触させること、及び（ｂ）核酸増幅反応を行うことを含み得る。
【0022】
特定の実施形態において、マウスＴＣＲ遺伝子は導入遺伝子である。
【0023】
特定の実施形態において、核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
【0024】
本開示の目的は、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を迅速かつ正確に決定することができるマウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するための試薬を提供することである。
【0025】
本開示の第１の態様では、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するためのキットが提供される。このキットは、マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域についてのプライマー対とＴａｑＭａｎプローブとを含み、プライマーは以下からなる群から選択される：
（ｉ）配列番号１に示される配列を有するプライマーと、配列番号２に示される配列を有するプライマーとを含む第１のプライマー対（Ｄ１）、
（ｉｉ）配列番号４に示される配列を有するプライマーと、配列番号５に示される配列を有するプライマーとを含む第２のプライマー対（Ａ１）、及び
（ｉｉｉ）第１のプライマー対と第２のプライマー対との組み合わせ。
（ｉ）配列番号１に示される配列を有するプライマーと、配列番号２に示される配列を有するプライマーとを含む第１のプライマー対（Ｄ１）、
（ｉｉ）配列番号４に示される配列を有するプライマーと、配列番号５に示される配列を有するプライマーとを含む第２のプライマー対（Ａ１）、及び
（ｉｉｉ）第１のプライマー対と第２のプライマー対との組み合わせ。
【0026】
特定の実施形態において、プライマー対は第１のプライマー対であり、キットは、配列番号３に示される配列を含む第１のＴａｑＭａｎプローブを更に含む。
【0027】
特定の実施形態において、プライマー対は第２のプライマー対であり、キットは、配列番号６に示される配列を含む第２のＴａｑＭａｎプローブを更に含む。
【0028】
特定の実施形態において、キットは、以下からなる群から選択されるプライマー対を更に含む：
（ｉｉｉ）配列番号７に示される配列を有するプライマーと、配列番号８に示される配列を有するプライマーとを含む第３のプライマー対（Ｂ１）、及び
（ｉｖ）配列番号１０に示される配列を有するプライマーと、配列番号１１に示される配列を有するプライマーとを含む、第４のプライマー対（Ｃ１）。
（ｉｉｉ）配列番号７に示される配列を有するプライマーと、配列番号８に示される配列を有するプライマーとを含む第３のプライマー対（Ｂ１）、及び
（ｉｖ）配列番号１０に示される配列を有するプライマーと、配列番号１１に示される配列を有するプライマーとを含む、第４のプライマー対（Ｃ１）。
【0029】
特定の実施形態において、プライマー対は第３のプライマー対であり、キットは、配列番号９に示される配列を含む第３のＴａｑＭａｎプローブを更に含む。
【0030】
特定の実施形態において、プライマー対は第４のプライマー対であり、キットは、配列番号１２に示される配列を含む第４のＴａｑＭａｎプローブを更に含む。
【0031】
特定の実施形態において、ＴａｑＭａｎプローブの５’末端は蛍光レポーターで標識され、３’末端は蛍光クエンチャーで標識される。あるいは、ＴａｑＭａｎプローブの３’末端は蛍光レポーターで標識され、ＴａｑＭａｎプローブの５’末端は蛍光クエンチャーで標識される。
【0032】
特定の実施形態において、蛍光レポーターはＦＡＭ及びＶＩＣであってもよく、一方、クエンチャーはＭＧＢ及びＴＡＭＲＡであってもよい。
【0033】
特定の実施形態において、蛍光レポーターはＦＡＭであり、一方、クエンチャーはＭＧＢである。
【0034】
本開示の第２の態様では、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するための試薬の組み合わせが提供される。試薬の組み合わせは、第１のプライマー対及び第１のＴａｑＭａｎプローブを含み、第１のプライマー対は、配列番号１に示される配列を有するプライマー及び配列番号２に示される配列を有するプライマーを含み、第１のＴａｑＭａｎプローブの配列は、配列番号３に示される通りである。
【0035】
本開示の第３の態様では、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するための試薬の組み合わせが提供される。試薬の組み合わせは、第２のプライマー対及び第２のＴａｑＭａｎプローブを含み、第２のプライマー対は、配列番号４に示される配列を有するプライマーと、配列番号５に示される配列を有するプライマーとを含み、第２のＴａｑＭａｎプローブの配列は、配列番号６に示される通りである。
【0036】
本開示の第４の態様では、本開示の第１の態様によるキット又は本開示の第２若しくは第３の態様による試薬の組み合わせの使用が提供される。キット又は試薬の組み合わせは、マウスＴＣＲの品質管理用の試験製品を調製するために使用される。
【0037】
本開示の第５の態様では、マウスＴＣＲのインビトロ品質管理のための方法が提供される。この方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）試験されるサンプルを提供する工程、
（ｂ）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域のプライマー対及びＴａｑＭａｎプローブを使用して、試験されるサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実行し、それによって、ＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定する工程、並びに
（ｃ）ＴＣＲ導入遺伝子の決定されたコピー数に基づいて、試験されるサンプルの品質を評価する工程。
（ａ）試験されるサンプルを提供する工程、
（ｂ）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域のプライマー対及びＴａｑＭａｎプローブを使用して、試験されるサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実行し、それによって、ＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定する工程、並びに
（ｃ）ＴＣＲ導入遺伝子の決定されたコピー数に基づいて、試験されるサンプルの品質を評価する工程。
【0038】
特定の実施形態において、プライマー濃度は０．４５μＭであり、プローブ濃度は０．１２５μＭである。
【0039】
特定の実施形態において、標準製品のコピーの最小数は１０であり、又は最小コピー数ポイントは１０コピーである。
【0040】
特定の実施形態において、この方法は非診断的かつ非治療的である。
【0041】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、第１のプライマー対及び第１のＴａｑＭａｎプローブが使用される。
【0042】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、（Ｙ１）第１のプライマー対及び第１のＴａｑＭａｎプローブ、並びに（Ｙ３）ＲＮａｓｅ Ｐ参照遺伝子プライマー／プローブが同時に使用される。
【0043】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、一重又は多重（例えばデュプレックス）ＰＣＲ増幅が使用される。
【0044】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、第２のプライマー対及び第２のＴａｑＭａｎプローブが使用される。
【0045】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、第３のプライマー対及び第３のＴａｑＭａｎプローブが使用される。
【0046】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、第４のプライマー対及び第４のＴａｑＭａｎプローブが使用される。
【0047】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、（Ｙ１）第１のプライマー対及び第１のＴａｑＭａｎプローブ、並びに（Ｙ２）第２のプライマー対及び第２のＴａｑＭａｎプローブが、ＰＣＲ増幅のために同時に又は連続して使用される。
【0048】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、Ｃｔ（閾値サイクル）値を比較することにより、ＴＣＲ導入遺伝子のコピー数が決定される。
【0049】
特定の実施形態において、工程（ｂ）において、試験されるサンプルのＣｔ値を標準値又は検量線と比較して、ＴＣＲ導入遺伝子のコピーを決定する。
【0050】
特定の実施形態において、試験されるサンプルには、核酸サンプルが含まれる。
【0051】
特定の実施形態において、核酸サンプルは、Ｍ個の細胞から抽出された全核酸であり、Ｍは正の整数である。例えば、Ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。
【0052】
特定の実施形態において、工程（ｂ）は、以下の工程を含む：
Ｓ１）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域を標的遺伝子断片として選択する工程、
Ｓ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準原液とし、段階希釈して一連の標準物質を得る工程、
Ｓ３）標準物質及び試験されるサンプルの遺伝子に対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、並びに
Ｓ４）試験されるサンプルのＣｔ値を工程Ｓ３）の検量線の計算式に当てはめ、試験されるサンプルの遺伝子コピーを得る工程。
Ｓ１）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域を標的遺伝子断片として選択する工程、
Ｓ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準原液とし、段階希釈して一連の標準物質を得る工程、
Ｓ３）標準物質及び試験されるサンプルの遺伝子に対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、並びに
Ｓ４）試験されるサンプルのＣｔ値を工程Ｓ３）の検量線の計算式に当てはめ、試験されるサンプルの遺伝子コピーを得る工程。
【0053】
特定の実施形態において、工程（ｂ）は、以下の工程を含む：
Ｒ１）標的遺伝子断片としてのマウスＴＣＲ遺伝子の保存領域、及び既知の配列を有する参照遺伝子を選択する工程、
Ｒ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準ストック溶液として使用し、次いで段階希釈を行って一連の標準物質を得る工程、
Ｒ３）本開示の第１の態様に係る試薬を使用して、標準物質の遺伝子及び試験されるサンプルに対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、一連の標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、
Ｒ４）参照遺伝子（例えば、ＲＮａｓｅＰ遺伝子）のＣｔ値を使用して、各サンプルのキャリブレーション係数を計算する工程、並びに
Ｒ５）ゲノム１μｇ当たりの参照遺伝子のコピー数と比較することにより、試験されるサンプル中のゲノム１μｇ当たりのＴＣＲ遺伝子のコピー数を得る工程。
Ｒ１）標的遺伝子断片としてのマウスＴＣＲ遺伝子の保存領域、及び既知の配列を有する参照遺伝子を選択する工程、
Ｒ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準ストック溶液として使用し、次いで段階希釈を行って一連の標準物質を得る工程、
Ｒ３）本開示の第１の態様に係る試薬を使用して、標準物質の遺伝子及び試験されるサンプルに対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、一連の標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、
Ｒ４）参照遺伝子（例えば、ＲＮａｓｅＰ遺伝子）のＣｔ値を使用して、各サンプルのキャリブレーション係数を計算する工程、並びに
Ｒ５）ゲノム１μｇ当たりの参照遺伝子のコピー数と比較することにより、試験されるサンプル中のゲノム１μｇ当たりのＴＣＲ遺伝子のコピー数を得る工程。
【0054】
特定の実施形態において、工程（ｂ）は、ヒトバックグラウンドＤＮＡを追加する工程を更に含む。
【0055】
特定の実施形態において、ヒトバックグラウンドＤＮＡは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のゲノムＤＮＡである。
【0056】
特定の実施形態において、ヒトバックグラウンドＤＮＡの量は５０ｎｇである。
【0057】
本開示の範囲内で、本開示の前述の技術的特徴及び以下で詳細に説明する技術的特徴（例えば、実施形態）を互いに組み合わせて、新しい又は好ましい技術的解決法を形成できることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域の配列に従って設計された４セットのプライマー／プローブを示す。
【図2-1A】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図2-1B】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図2-1C】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図2-1D】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図2-2A】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図2-2B】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図2-2C】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図2-2D】４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応の検量線を示す。図２－１Ａ、２－１Ｂ、２－１Ｃ、及び２－１Ｄは、バックグラウンドのゲノムＤＮＡの非存在下での曲線を示す。図２－２Ａ、２－２Ｂ、２－２Ｃ、及び２－２Ｄは、バックグラウンドゲノムＤＮＡの存在下での曲線を示す。
【図3A】デュプレックス反応における４組のプライマー／プローブの検量線を示す。
【図3B】デュプレックス反応における４組のプライマー／プローブの検量線を示す。
【図3C】デュプレックス反応における４組のプライマー／プローブの検量線を示す。
【図3D】デュプレックス反応における４組のプライマー／プローブの検量線を示す。
【図4-1】検量線のコピー数の点が最も少ない選択を示す。図４－１は、検量線上の点の増幅曲線を示す。図４－２は、１０コピーを最低点として使用した検量線であり、図４－３は、１０コピーを最低点として削除した後の検量線である。
【図4-2】検量線のコピー数の点が最も少ない選択を示す。図４－１は、検量線上の点の増幅曲線を示す。図４－２は、１０コピーを最低点として使用した検量線であり、図４－３は、１０コピーを最低点として削除した後の検量線である。
【図4-3】検量線のコピー数の点が最も少ない選択を示す。図４－１は、検量線上の点の増幅曲線を示す。図４－２は、１０コピーを最低点として使用した検量線であり、図４－３は、１０コピーを最低点として削除した後の検量線である。
【図5-1】Ｄ１プライマー／プローブについて異なる濃度でのデュプレックス反応試験を示す。図５－１は、１ｘプライマー濃度（０．９μＭプライマー、０．２５μＭプローブ）での試験を示す。図５－２は、０．５ｘ濃度（０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブ）での試験を示す。図５－３は、２×プライマー濃度（１．８μＭプライマー、０．５μＭプローブ）での試験を示す。
【図5-2】Ｄ１プライマー／プローブについて異なる濃度でのデュプレックス反応試験を示す。図５－１は、１ｘプライマー濃度（０．９μＭプライマー、０．２５μＭプローブ）での試験を示す。図５－２は、０．５ｘ濃度（０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブ）での試験を示す。図５－３は、２×プライマー濃度（１．８μＭプライマー、０．５μＭプローブ）での試験を示す。
【図5-3】Ｄ１プライマー／プローブについて異なる濃度でのデュプレックス反応試験を示す。図５－１は、１ｘプライマー濃度（０．９μＭプライマー、０．２５μＭプローブ）での試験を示す。図５－２は、０．５ｘ濃度（０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブ）での試験を示す。図５－３は、２×プライマー濃度（１．８μＭプライマー、０．５μＭプローブ）での試験を示す。
【図6-1】バックグラウンドｇＤＮＡの異なる濃度でのＤ１プライマー／プローブのデュプレックス反応試験を示す。図６－１は、１００ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。図６－２は、５０ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。図６－３は、２５ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。
【図6-2】バックグラウンドｇＤＮＡの異なる濃度でのＤ１プライマー／プローブのデュプレックス反応試験を示す。図６－１は、１００ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。図６－２は、５０ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。図６－３は、２５ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。
【図6-3】バックグラウンドｇＤＮＡの異なる濃度でのＤ１プライマー／プローブのデュプレックス反応試験を示す。図６－１は、１００ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。図６－２は、５０ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。図６－３は、２５ｎｇ ｇＤＮＡを用いた試験を示す。
【図7A】５０ｎｇのバックグラウンド下で、０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブを用いたＤ１プライマー／プローブについての複数回反復デュプレックス反応試験を示す。
【図7B】５０ｎｇのバックグラウンド下で、０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブを用いたＤ１プライマー／プローブについての複数回反復デュプレックス反応試験を示す。
【図7C】５０ｎｇのバックグラウンド下で、０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブを用いたＤ１プライマー／プローブについての複数回反復デュプレックス反応試験を示す。
【図7D】５０ｎｇのバックグラウンド下で、０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブを用いたＤ１プライマー／プローブについての複数回反復デュプレックス反応試験を示す。
【図8】マウスＴＣＲ－Ｔ細胞療法を受けている患者の血液サンプル中のＴＣＲ遺伝子コピー数の決定を示す。
【発明を実施するための形態】
【0059】
本システム及び方法は、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を迅速かつ正確に決定することができる。これは、臨床試験及び生産中にＴ細胞中のマウスＴＣＲ遺伝子のコピー数を決定するための信頼できるアプローチを提供する。
【0060】
本開示は、マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域に特異的な４セットのプライマー／ＴａｑＭａｎプローブを提供する。本方法において、ヒトバックグラウンドＤＮＡの存在下又は非存在下での標的遺伝子のシングルプレックス反応を行うことができる。ヒトバックグラウンドＤＮＡの存在下又は非存在下での標的遺伝子及び参照遺伝子のデュプレックス反応を行うことができる。
【0061】
本開示は、マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するためのシステム又はキットを提供する。このシステム又はキットは、第１のプライマー対、第２のプライマー対、第３のプライマー対及び第４のプライマー対から選択される１つ以上のプライマー対を含み得る。
【0062】
第１のプライマー対は、配列番号１に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号２に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はこの核酸配列を有する、又は本質的にこの核酸配列からなる、又はこの核酸配列からなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0063】
第２のプライマー対は、配列番号４に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号５に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はこの核酸配列を有する、又は本質的にこの核酸配列からなる、又はこの核酸配列からなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0064】
第３のプライマー対は、配列番号７に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号８に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はこの核酸配列を有する、又は本質的にこの核酸配列からなる、又はこの核酸配列からなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0065】
第４のプライマー対は、配列番号１０に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）プライマー、及び（ｉｉ）配列番号１１に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はこの核酸配列を有する、又は本質的にこの核酸配列からなる、又はこの核酸配列からなる）プライマーを含む（又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0066】
システム又はキットは、第１のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブ、及び第４のプローブから選択される１つ以上のプローブを更に含み得る。
【0067】
第１のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブ、又は第４のプローブは、ＴａｑＭａｎプローブであり得る。
【0068】
第１のプローブは、配列番号３に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0069】
第２のプローブは、配列番号６に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0070】
第３のプローブは、配列番号９に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0071】
第４のプローブは、配列番号１２に示される核酸配列に対して、約８０％～約１００％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は約１００％同一である核酸配列を含む（又はそれを有する、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる）ことができる。
【0072】
特定の実施形態において、このシステム又はキットは、第１のプライマー対及び第１のプローブ、第２のプライマー対及び第２のプローブ、第３のプライマー対及び第３のプローブ、第４のプライマー対及び第４のプローブの１つ以上のプライマー／プローブセットを含み得る。
【0073】
特定の実施形態において、このシステム又はキットは、第１のプライマー対及び第１のプローブを含み得る。
【0074】
本開示は、サンプル中のマウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピー数を決定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）サンプルを本発明のシステム又はキットと接触させること、及び（ｂ）核酸増幅反応を行うことを含み得る。
【0075】
特定の実施形態において、マウスＴＣＲ遺伝子は導入遺伝子である。
【0076】
特定の実施形態において、核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
【0077】
プライマーは、核酸とハイブリダイズ（又はアニーリング）することができ、適切な条件下（例えば、適切な緩衝液中及び適切な温度で）でヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）重合のための開始部位として機能することができるオリゴヌクレオチドであり得る。プライマーは、標的遺伝子（又は鋳型）に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドであり得、鋳型、ポリメラーゼ及び適切な緩衝液及び試薬の存在下で、伸長してプライマー伸長産物を形成することができる。いくつかの実施形態において、プライマーは検出可能な部分で標識される。いくつかの実施形態において、プライマーは標識されていない。
【0078】
プローブは、相補配列の標的核酸に結合できるオリゴヌクレオチドであり得る。プローブを検出可能な標識で標識して、プローブの容易な検出を可能にすることができる。しかしながら、代替的に、プローブは標識されていなくてもよいが、標識されたリガンドとの特異的結合によって直接的又は間接的に検出可能であり得る。プライマーはプローブとしても機能し得る。いくつかの実施形態において、プローブはＦＲＥＴプローブである。いくつかの実施形態において、プローブは、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、又はＳｃｏｒｐｉｏｎプローブである。いくつかの実施形態において、プローブは検出可能な部分で標識される。本明細書で使用される検出可能な部分には、蛍光色素などの直接検出可能な部分、及び結合対のメンバーなどの間接的に検出可能な部分の両方が含まれる。検出可能な部分が結合対のメンバーである場合、いくつかの実施形態において、結合対の第２のメンバーに結合した検出可能な標識とともにプローブをインキュベートすることによって、プローブを検出可能にすることができる。いくつかの実施形態において、プローブが、例えば、マイクロアレイ又はビーズ上の捕捉プローブである場合などでは、プローブは標識されない。いくつかの実施形態において、プローブは、例えば、ポリメラーゼによって伸長可能ではない。いくつかの実施形態において、プローブは伸長可能である。
【0079】
いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的遺伝子からの配列の少なくとも又は約８個、少なくとも又は約９個、少なくとも又は約１０個、少なくとも又は約１１個、少なくとも又は約１２個、少なくとも又は１３個、少なくとも又は約１４個、少なくとも又は約１５個、少なくとも又は約１６個、少なくとも又は約１７個、少なくとも又は約１８個、少なくとも又は約１９個、少なくとも又は約２０個、少なくとも又は約２１個、少なくとも又は約２２個、少なくとも又は約２３個、少なくとも又は約２４個、少なくとも又は約２５個、少なくとも又は約２６個、少なくとも又は約２７個、少なくとも又は約２８個、少なくとも又は約２９個、又は少なくとも又は約３０個の連続するヌクレオチドに対して、同一であるか又は相補的である。いくつかの実施形態において、プライマーはまた、標的遺伝子に対して同一でないか又は相補的でない部分又は領域を含み得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子に対して同一であるか又は相補的であるプライマーの領域は、標的遺伝子に対して同一でないか又は相補的でないプライマーのいかなる領域も同一であるか又は相補的である領域を破壊しないように、隣接している。プライマー又はプローブは、標的分子に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補的であり得る。特定の実施形態において、プライマー又はプローブは、少なくとも又は約７ヌクレオチドの配列にわたって、１０－３０ヌクレオチドの範囲の配列にわたって、少なくとも１４－２５ヌクレオチドの配列にわたって、標的核酸配列に対して少なくとも６５％相補的であり得る。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、少なくとも又は約８個、少なくとも又は約９個、少なくとも又は約１０個、少なくとも又は約１１個、少なくとも又は約１２個、少なくとも又は約１３個、少なくとも又は約１４個、少なくとも又は約１５個、少なくとも又は約１６個、少なくとも又は約１７個、少なくとも又は約１８個、少なくとも又は約１９個、少なくとも又は約２０個、少なくとも又は約２１個、少なくとも又は約２２個、少なくとも又は約２３個、少なくとも又は約２４個、少なくとも又は約２５個、少なくとも又は約２６個、少なくとも又は約２７個、少なくとも又は約２８個、少なくとも又は約２９個、あるいは少なくとも又は約３０個の連続する標的分子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）のヌクレオチドの配列に対して相補的である領域を含む。プライマー又はプローブが「標的分子の少なくともｘ個の連続するヌクレオチドに対して相補的」である領域を含む場合、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくともｘ個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９５％相補的であり得る。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補的である。
【0080】
プライマー又はプローブは、１０～３０ヌクレオチド、１５～３０ヌクレオチド、１５～２５ヌクレオチド、１７～２４ヌクレオチド、３０～５０ヌクレオチド、７～１５ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、少なくとも２０、３０、又は４０ヌクレオチド、あるいは少なくとも又は約５０、６０、７０、８０、又は９０ヌクレオチドを含み得る。プライマー又はプローブは、少なくとも又は約７ヌクレオチド、少なくとも又は約８ヌクレオチド、少なくとも又は約９ヌクレオチド、少なくとも又は約１０ヌクレオチド、少なくとも又は約１１ヌクレオチド、少なくとも又は約１２ヌクレオチド、又は約１３ヌクレオチド、少なくとも又は約１４ヌクレオチド、少なくとも又は約１５ヌクレオチド、少なくとも又は約１６ヌクレオチド、少なくとも又は約１７ヌクレオチド、少なくとも又は約１８ヌクレオチド、少なくとも又は約１９ヌクレオチド、少なくとも又は約２０ヌクレオチド、少なくとも又は約２１ヌクレオチド、少なくとも又は約２２ヌクレオチド、少なくとも又は約２３ヌクレオチド、少なくとも又は約２４ヌクレオチド、又は少なくとも又は約２５ヌクレオチド、少なくとも又は約２６ヌクレオチド、少なくとも又は約２７ヌクレオチド、少なくとも又は約２８ヌクレオチド、少なくとも又は約２９ヌクレオチド、あるいは少なくとも又は約３０ヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的遺伝子又は配列中の配列と比較した場合に、１、２又は３塩基のミスマッチを伴う配列を有する。
【0081】
いくつかの実施形態において、プライマー対が提供される。プライマー対は、増幅反応において使用される場合に、プライマー対が核酸の複数のコピーを生成するならば、核酸を増幅できると言われる。これらの複数のコピーは、増幅反応において追加される追加のヌクレオチド配列を含むことができる。
【0082】
いくつかの実施形態において、リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンプローブ、及びスコーピオンプローブを含むがこれらに限定されないＦＲＥＴプローブを使用して実施され得る。いくつかの実施形態において、リアルタイムＰＣＲ検出及び定量は、ＴａｑＭａｎプローブ、例えば、ＤＮＡの一端に共有結合した蛍光色素／標識及びＤＮＡの他端に共有結合したクエンチャー分子を典型的に有する線状プローブを用いて実施される。ＦＲＥＴプローブは、ＦＲＥＴプローブが標的遺伝子又は標的遺伝子のアンプリコンにハイブリダイズするとき、色素蛍光がクエンチされるように、かつ標的遺伝子又は標的遺伝子のアンプリコンが増幅される間にプローブが消化されるとき、色素がプローブから放出され、蛍光シグナルが生成されるように、標的遺伝子の領域に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、サンプル中の標的遺伝子の存在が検出される。
【0083】
いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴプローブに対して使用できる標識／色素には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬなどのＢＯＤＩＰＹ色素、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン並びに７－アミノ－４－メチルクマリン、アミノクマリン及びヒドロキシクマリンなどのその誘導体、Ｃｙ３及びＣｙ５などのシアニン色素、エオシン及びエリスロシン、フルオレセイン及びフルオレセインイソチオシアネートなどのその誘導体、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｙｅ（商標）などのランタニドイオンの大環状キレート、マリーナブルー、オレゴングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、及びローダミン６Ｇなどのローダミン色素、テキサスレッド、チアゾールオレンジ－エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー転移色素、並びにＴＯＴＡＢなどの比色及び蛍光色素が含まれる。標識／色素の特定の例にはまた、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０；ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、及びＢＯＤＩＰＹ－ＴＲなどのアミン反応性ＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６－ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２’，４’，５’，７’－テトラブロモスルホンフルオレセイン、並びにＴＥＴも含まれるが、これらに限定されない。色素／クエンチャーの対（すなわち、ドナー／アクセプターの対）の例には、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ダブシル、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ７又はＱＳＹ９色素が含まれるが、これらに限定されない。ドナー及びアクセプターが同じである場合、いくつかの実施形態において、蛍光脱分極によってＦＲＥＴを検出することができる。色素／クエンチャー対（すなわち、ドナー／アクセプター対）の特定の例には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０／ＱＳＹ３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０／ダブシル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／ＱＳＹ３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／ダブシル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８／ＱＳＹ７又はＱＳＹ９、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５／ＱＳＹ７又はＱＳＹ９、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８／ＱＳＹ７又はＱＳＹ９、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８／ＱＳＹ２１、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４／ＱＳＹ２１、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７／ＱＳＹ２１が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法における使用のためのリアルタイムＰＣＲプローブの調製に有用な蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの例には、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－１’－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８－５－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８－５－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ－１４－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２－５－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６－１４－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８－５－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－１２－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４－５－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５－１４－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８－７－ＯＢＥＡ－ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６－１６－ＯＢＥＡ－ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４－７－ＯＢＥＡ－ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－１２－ＯＢＥＡ－ｄＣＴＰが含まれる。
【0084】
核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ハイパーブランチＲＣＡ（ＨＲＣＡ）、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、ライゲーションに続くＱレプリカーゼ増幅、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、超分岐鎖置換増幅、複数置換増幅（ＭＤＡ）、２段階マルチプレックス増幅などであり得る。核酸増幅反応はまた、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（組み合わせ連鎖反応－ＣＣＲとしても知られる）などでもあり得る。核酸増幅反応は、マルチプレックスＰＣＲ、例えばマルチプレックスリアルタイムＰＣＲによって実行され得る。このような技術の説明は、他のソースの中でも、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ，Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）；Ｍｓｕｉｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１－０７（１９９６）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００２）；Ａｂｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３年２月；４（１）：４１－７において見出され得る。
【0085】
「ｑＰＣＲ」という用語は、「リアルタイムＰＣＲ」又は「動的ポリメラーゼ連鎖反応」としても知られる定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を指すために本明細書で使用される。
【0086】
核酸を含むサンプルは、当技術分野で知られている従来の方法を使用して生物源から得ることができる。特に、本明細書に記載の方法において有用なＤＮＡ又はＲＮＡは、細菌、原生動物、真菌（例えば、酵母）、ウイルス、オルガネラ、並びに植物又は動物などの高等生物、特に、哺乳動物、より特に、ヒトを含む任意の供給源から抽出及び／又は増幅することができる。核酸は、細胞、体液（例えば、血液、血液分画、尿、羊水など）、又は組織サンプルから、様々な標準技術のいずれかによって抽出又は増幅することができる。例示的なサンプルには、血漿、血清、血液、脊髄液、リンパ液、腹水、胸膜液、口腔液、絨毛膜絨毛、及び皮膚の外部セクションのサンプル、呼吸器、腸、生殖器、及び尿路からのサンプル、涙液、唾液、血液細胞、幹細胞、又はがん細胞若しくは組織（例えば、腫瘍）のサンプルが含まれる。例えば、胎児ＤＮＡのサンプルは、胚から（例えば、１つ又はいくつかの胚細胞又は胎児細胞から）、又は母体の血液から得ることができる。サンプルは、生きている生物若しくは死んだ生物から、又はインビトロ培養から得ることができる。例示的なサンプルには、単一細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプル、及び針生検を含むことができる。本明細書に記載の方法において有用な核酸はまた、ｃＤＮＡ、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、Ｐ１、ＰＡＣライブラリーなどを含む１つ以上の核酸ライブラリーに由来することができる。
【0087】
特定の実施形態において、コピー数は、ある量のゲノムＤＮＡ（例えば、１μｇ、５０ｎｇなど、ゲノムＤＮＡ）中の遺伝子のコピーであり得る。特定の実施形態において、コピー数は、あるサンプル中の遺伝子のコピーであり得る。特定の実施形態において、コピー数は、細胞当たり又は細胞集団中の遺伝子のコピーであり得る。特定の実施形態において、コピー数は、細胞集団中の遺伝子の平均コピー数であり得る。
【0088】
特定の実施形態において、コピー数は、ＤＮＡサンプル中の参照ポリヌクレオチド／遺伝子のコピー数に対する標的ポリヌクレオチド／遺伝子のコピー数の比として表され得る遺伝子の（ゲノム当たりの）相対的コピー数であり得る。参照ポリヌクレオチド／遺伝子は、単一コピーの参照ポリヌクレオチド／遺伝子であり得る（コピー数は１であり得る）。ポリヌクレオチド／遺伝子の相対的コピー数（ゲノム当たり）は、ＤＮＡサンプル中の参照ポリヌクレオチド／遺伝子のコピー数に対する標的ポリヌクレオチド／遺伝子のコピー数の比として表すことができる。参照配列のゲノムコピー数は既知である。このように、標的ポリヌクレオチドのコピー数は、標的ポリヌクレオチド／遺伝子の相対的コピー数を決定するために、参照ポリヌクレオチド／遺伝子に対して分析することができる。例えば、ＲＮａｓｅＰ遺伝子は単一コピー遺伝子であり、コピー数アッセイにおいて参照遺伝子として使用され得る。例証のために、他の有用な参照配列には、ベータ－アクチン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢＳ）、ベータ－アクチン、及び／又はベータ－グロビンが含まれるが、しかしながら、本発明は特定の参照配列に限定されないことが理解される。
【0089】
２つの遺伝子（標的ポリヌクレオチド／遺伝子及び参照ポリヌクレオチド／遺伝子）について２つの異なる標識（例えば、蛍光色素）を用いて同じ反応中又は同じ装置上で２つのアッセイを使用することにより、本明細書に記載の方法は、同じＤＮＡサンプル中で両方の遺伝子を同時に定量化するために、同時に使用することができる。あるいは、標的遺伝子を１つの反応で増幅し、参照遺伝子を別の反応でアッセイし、データを比較することができる。これらの２つの遺伝子の比率は、ＤＮＡサンプル中の標的ポリヌクレオチド配列又は目的の遺伝子の相対的コピー数である。
【0090】
システムは組成物であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は水性組成物である。いくつかの実施形態において、水性組成物は、リン酸、ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなどの緩衝成分、及び／又は以下に議論するような追加の成分を含む。いくつかの実施形態において、組成物は乾燥しており、例えば、凍結乾燥されており、流体の添加による再構成のために適している。乾燥組成物は、１つ以上の緩衝成分及び／又は追加の成分を含み得る。
【0091】
いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上の追加の成分を更に含む。追加の成分には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＭｇＣｌ２などの塩、Ｔａｑなどの熱安定性ポリメラーゼを含むポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等、β－メルカプトエタノールなどの還元剤、ＥＤＴＡ等が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、組成物の意図される用途に応じて、適切な組成物成分を選択することができる。
【0092】
キット
いくつかの実施形態において、キットは本発明のシステムを含む。いくつかの実施形態において、キットは、上記に議論した少なくとも１つのプライマー対及び／又はプローブを含む。いくつかの実施形態において、キットは、熱安定性ポリメラーゼなどの少なくとも１つのポリメラーゼを更に含む。いくつかの実施形態において、キットは更なるｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のリアルタイムＰＣＲ法における使用のためのキットは、１つ以上の標的遺伝子特異的ＦＲＥＴプローブ及び／又は標的遺伝子の増幅のための１つ以上のプライマーを含む。
いくつかの実施形態において、キットは本発明のシステムを含む。いくつかの実施形態において、キットは、上記に議論した少なくとも１つのプライマー対及び／又はプローブを含む。いくつかの実施形態において、キットは、熱安定性ポリメラーゼなどの少なくとも１つのポリメラーゼを更に含む。いくつかの実施形態において、キットは更なるｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のリアルタイムＰＣＲ法における使用のためのキットは、１つ以上の標的遺伝子特異的ＦＲＥＴプローブ及び／又は標的遺伝子の増幅のための１つ以上のプライマーを含む。
【0093】
いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも１セット、少なくとも２セット、少なくとも３セット、又は少なくとも４セットのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、キットは、参照ポリヌクレオチド／遺伝子を増幅するための少なくとも１セットのプライマーを更に含む。
【0094】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるリアルタイムＰＣＲ法における使用のためのキットは、増幅反応における使用のための試薬を更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を含む。いくつかの実施形態において、キットは、増幅における使用のためのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、プローブ及びプライマーの特異的なハイブリダイゼーションのために最適化された緩衝液を含む。
【0095】
本開示におけるキットは、マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域のためのプライマー対及びＴａｑＭａｎプローブを含んでもよく、プライマーは、（ｉ）配列番号１に示される配列を有するプライマー及び配列番号２に示される配列を有するプライマーを含む第１のプライマー対（Ｄ１）、（ｉｉ）配列番号４に示される配列を有するプライマー及び配列番号５に示される配列を有するプライマーを含む第２のプライマー対（Ａ１）、並びに（ｉｉｉ）第１のプライマー対と第２のプライマー対との組み合わせからなる群から選択される。
【0096】
特定の実施形態において、プライマー対は第１のプライマー対であり、キットは、配列番号３に示される配列を有する第１のＴａｑＭａｎプローブを更に含む。
【0097】
特定の実施形態において、プライマー対は第２のプライマー対であり、キットは、配列番号６に示される配列を有する第２のＴａｑＭａｎプローブを更に含む。
【0098】
場合により、前述のキットは、（ｉ）配列番号７に示される配列を有するプライマー及び配列番号８に示される配列を有するプライマーを含む第３のプライマー対（Ｂ１）、並びに（ｉｉ）配列番号１０に示される配列を有するプライマー及び配列番号１１に示される配列を有するプライマーを含む第４のプライマー対（Ｃ１）からなる群から選択されるプライマー対を更に含む。
【0099】
特定の実施形態において、プライマー対は第３のプライマー対であり、キットは、配列番号９に示される配列を有する第３のＴａｑｍａｎプローブを更に含む。
【0100】
特定の実施形態において、プライマー対は第４のプライマー対であり、キットは、配列番号１２に示される配列を有する第４のＴａｑｍａｎプローブを更に含む。
【0101】
特定の実施形態において、本開示において、Ｔａｑｍａｎプローブの５’末端は蛍光レポーター（例えば、ＦＡＭ又はＶＩＣ）で標識され、３’末端は蛍光クエンチャー（例えば、ＭＧＢ又はＴＡＭＲＡ）で標識される。あるいは、Ｔａｑｍａｎプローブの３’末端は蛍光レポーター（例えば、ＦＡＭ又はＶＩＣ）で標識され、５’末端は蛍光クエンチャー（例えば、ＭＧＢ又はＴＡＭＲＡ）で標識される。
【0102】
本開示におけるキットは、１つ以上の容器を更に含んでもよく、上記のプライマー対及びＴａｑＭａｎプローブは、異なる容器に入れるか、又は同じ容器に組み合わせることができる。
【0103】
試薬の組み合わせ
本開示における試薬は、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するための試薬の組み合わせを指し得る。
本開示における試薬は、マウスＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するための試薬の組み合わせを指し得る。
【0104】
本開示における試薬は、第１のプライマー対及び第１のＴａｑＭａｎプローブを含み得、ここで、第１のプライマー対は、配列番号１に示される配列を有するプライマー及び配列番号２に示される配列を有するプライマーを含み、第１のＴａｑＭａｎプローブの配列は、配列番号３に示される通りであり、並びに／又は第２のプライマー対及び第２のＴａｑＭａｎプローブを含み得、ここで、第２のプライマー対は、配列番号４に示される配列を有するプライマー及び配列番号５に示される配列を有するプライマーを含み、第２のＴａｑＭａｎプローブの配列は、配列番号６に示される通りであり、並びに／又はＲＮａｓｅ Ｐ参照遺伝子プライマー／プローブを含み得る。
【0105】
マウスＴＣＲ遺伝子コピー数を決定するための方法
本方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）試験するサンプルを提供する工程、
（ｂ）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域についてのプライマー対及びＴａｑＭａｎプローブを使用して、試験対象のサンプルに対してＰＣＲ増幅を実施し、それによってＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定する工程、及び
（ｃ）決定されたＴＣＲ導入遺伝子のコピー数に基づいて、試験されるサンプルの品質を評価する工程。
本方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）試験するサンプルを提供する工程、
（ｂ）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域についてのプライマー対及びＴａｑＭａｎプローブを使用して、試験対象のサンプルに対してＰＣＲ増幅を実施し、それによってＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定する工程、及び
（ｃ）決定されたＴＣＲ導入遺伝子のコピー数に基づいて、試験されるサンプルの品質を評価する工程。
【0106】
工程（ｂ）において、第１のプライマー対及び第１のＴａｑＭａｎプローブを使用することができ、場合により、ＲＮａｓｅ Ｐ参照遺伝子プライマー／プローブセットが使用される。
【0107】
工程（ｂ）において、シングルプレックス又はマルチプレックスＰＣＲ増幅が使用され得る。
【0108】
工程（ｂ）において、第２のプライマー対及び第２のＴａｑＭａｎプローブが使用され得る。
【0109】
工程（ｂ）において、第３のプライマー対及び第３のＴａｑＭａｎプローブが使用され得る。
【0110】
工程（ｂ）において、第４のプライマー対及び第４のＴａｑＭａｎプローブが使用され得る。
【0111】
工程（ｂ）において、（Ｙ１）第１のプライマー対及び第１のＴａｑＭａｎプローブ、並びに（Ｙ２）第２のプライマー対及び第２のＴａｑＭａｎプローブが、ＰＣＲ増幅のために同時に又は連続的に使用され得る。
【0112】
工程（ｂ）において、Ｃｔ値を比較することにより、ＴＣＲ導入遺伝子のコピー数が決定され得る。
【0113】
工程（ｂ）において、試験されるサンプルのＣｔ値は、ＴＣＲ導入遺伝子のコピー数を決定するために標準値又は検量線と比較され得る。
【0114】
試験されるサンプルは、核酸サンプルを含み得る。
【0115】
核酸サンプルは、Ｍ個の細胞から抽出された全核酸であってもよく、ここでＭは正の整数である。例えば、Ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってよい。
【0116】
工程（ｂ）は、以下の工程を含み得る：
Ｓ１）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域を標的遺伝子断片として選択する工程、
Ｓ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準ストック溶液として使用し、次いで段階希釈を行って一連の標準製品を得る工程、
Ｓ３）標準物質及び試験されるサンプルの遺伝子に対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、一連の標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、
Ｓ４）試験されるサンプルのＣｔ値を工程Ｓ３）の検量線の計算式に当てはめ、試験されるサンプルの遺伝子コピー数を得る工程。
Ｓ１）マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域を標的遺伝子断片として選択する工程、
Ｓ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準ストック溶液として使用し、次いで段階希釈を行って一連の標準製品を得る工程、
Ｓ３）標準物質及び試験されるサンプルの遺伝子に対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、一連の標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、
Ｓ４）試験されるサンプルのＣｔ値を工程Ｓ３）の検量線の計算式に当てはめ、試験されるサンプルの遺伝子コピー数を得る工程。
【0117】
工程（ｂ）は、以下の工程を含み得る：
Ｒ１）標的遺伝子断片としてのマウスＴＣＲ遺伝子の保存領域、及び既知の配列を有する参照遺伝子を選択する工程、
Ｒ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準ストック溶液として使用し、次いで段階希釈を行って一連の標準物質を得る工程、
Ｒ３）請求項１に記載の試薬を使用して、標準物質の遺伝子及び試験されるサンプルに対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、一連の標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、
Ｒ４）参照遺伝子ＲＮａｓｅＰのＣｔ値を使用して、各サンプルのキャリブレーション係数を計算する工程、
Ｒ５）ゲノム１μｇ当たりの参照遺伝子のコピー数と比較することにより、試験されるサンプル中のゲノム１μｇ当たりのＴＣＲ遺伝子のコピー数を得る工程。
Ｒ１）標的遺伝子断片としてのマウスＴＣＲ遺伝子の保存領域、及び既知の配列を有する参照遺伝子を選択する工程、
Ｒ２）標的遺伝子断片をベクターに挿入して標準プラスミドを構築し、これを標準ストック溶液として使用し、次いで段階希釈を行って一連の標準物質を得る工程、
Ｒ３）請求項１に記載の試薬を使用して、標準物質の遺伝子及び試験されるサンプルに対してリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、一連の標準物質のＣｔ値及びコピー数に基づいて検量線を作成し、計算式を得る工程、
Ｒ４）参照遺伝子ＲＮａｓｅＰのＣｔ値を使用して、各サンプルのキャリブレーション係数を計算する工程、
Ｒ５）ゲノム１μｇ当たりの参照遺伝子のコピー数と比較することにより、試験されるサンプル中のゲノム１μｇ当たりのＴＣＲ遺伝子のコピー数を得る工程。
【0118】
工程（ｂ）は、ヒトバックグラウンドＤＮＡを追加する工程を更に含み得る。
【0119】
ヒトのバックグラウンドＤＮＡは、ＰＢＭＣのゲノムＤＮＡであり得る。
【0120】
一実施形態において、ヒトバックグラウンドＤＮＡの量は５０ｎｇである。
【0121】
一実施形態において、プライマー濃度は０．４５μＭであり、プローブ濃度は０．１２５μＭである。
【0122】
一実施形態において、標準物質の最小コピー数は１０であり、又は最小コピー数ポイントは１０コピーである。
【0123】
本発明の主な利点：
１．本開示により提供される検出方法における検量線の直線決定係数（Ｒ２）は、０．９９４～０．９９９の範囲であった。増幅効率は９２．３％～１０１．６％であった。検量線における各濃度点の実行内精度は、０．０９％～１．５５％の範囲であった。実行間精度は、１．０９％～３．０７％の範囲であった。参照遺伝子ＲＮａｓｅＰの実行内精度は０．５８％～２．３０％の範囲で、実行間精度は１．１８％であった。したがって、本開示は、良好な線形関係、増幅効率及び精度を有する。
１．本開示により提供される検出方法における検量線の直線決定係数（Ｒ２）は、０．９９４～０．９９９の範囲であった。増幅効率は９２．３％～１０１．６％であった。検量線における各濃度点の実行内精度は、０．０９％～１．５５％の範囲であった。実行間精度は、１．０９％～３．０７％の範囲であった。参照遺伝子ＲＮａｓｅＰの実行内精度は０．５８％～２．３０％の範囲で、実行間精度は１．１８％であった。したがって、本開示は、良好な線形関係、増幅効率及び精度を有する。
【0124】
２．本開示のプライマー／プローブセットは、臨床試験及び製品リリースの間にＴ細胞におけるマウスＴＣＲ遺伝子のコピー数を決定するための迅速かつ信頼性の高い検出方法を提供する。
【0125】
３．本開示におけるデュプレックス反応法は、反応において標的遺伝子及び参照遺伝子の同時検出を達成することができ、参照遺伝子の誤った追加検出の可能性を低減する。
【0126】
本発明は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例証するために提示される以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良好に理解され得る。それらは、決して本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、特定の実施形態に関連して更に説明される。これらの実施形態は、本開示を説明することのみを意図しており、本開示の範囲を限定することを意図していないことが理解されるべきである。特定の条件が示されない限り、以下の実施形態における実験方法は、通常、従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている条件などを採用するか、又は製造業者によって推奨される条件を採用する。別段の言及がない限り、パーセンテージ及び部は重量パーセンテージ及び重量部である。
【0127】
材料及び一般的な方法
Ｉ．実験材料
１．機器：
Ｉ．実験材料
１．機器：
【表1】
【表2】
【0128】
【0129】
２．２ プライマープローブの配列の情報：
プライマー及びプローブは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒに発注した。
プライマー及びプローブは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒに発注した。
【表3】
【0130】
３．プラスミドの合成及びパッケージング
３．１標準プラスミド（ｐＵＣ５７－ＰＣ２５Ｊ）の設計、合成及びパッケージング
標準プラスミドは、ＴａｑＭａｎプライマープローブによって検出される標的断片に従って設計される。具体的には、マウスＴＣＲ遺伝子の２つの保存領域がｐＵＣ５７ベクター上に構築される。マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域の配列は次の通りである。
ｇａｃｃｔｇｃｇｃａａｔｇｔｇａｃｃｃｃｃｃｃｔａａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｔｃｇａｇｃｃｔｔｃｔａａｇｇｃｃｇａｇａｔｃｇｃｃａａｃａａｇａｇｇａａｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｇｃａａｇｇｇｇｃｔｔｃｔｔｔｃｃａｇａｔｃａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇｔｃｃｔｇｇｔｇｇｇｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｇｔｇｃａｃｔｃｔｇｇｃｇｔｇａｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｃａｇｇｃｃｔａｃａａｇｇａｇｔｃｃａａｃｔａｔｔｃｔｔａｃｔｇｃｃｔｇｔｃｔａｇｃｃｇｇｃｔｇａｇａｇｔｇａｇｃｇｃｃａｃｃｔｔｔｔｇｇｃａｃａａｃｃｃｃａｇｇａａｔｃａｃｔｔｃｃｇｃｔｇｔｃａｇｇｔｇｃａｇｔｔｔｃａｃｇｇｃｃｔｇｔｃｃｇａｇｇａｇｇａｔａａｇｔｇｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｔｃｔｃｃｃａａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｃａｇａａｃａｔｃａｇｃｇｃｃｇａｇｇｃａｔｇｇｇｇａａｇｇｇｃａｇａｃｔｇｔｇｇｃａｔｃａｃｃａｇｃｇｃｃｔｃｃｔａｔｃａｇｃａｇｇｇｃｇｔｇｃｔｇａｇｃｇｃｃａｃａａｔｃｃｔｇｔａｃｇａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｇｇｃａａｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｔａｔｇｃｔｇｔｇｃｔｇｇｔｇｔｃａａｃｔｃｔｇｇｔｇｇｔｃａｔｇｇｃｔａｔｇｇｔｇａａａｃｇｇａａａａａｃｔｃｃａｔｃｃａｇａａｔｃｃａｇａｇｃｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｃａｇｃｔｇａａｇｇａｃｃｃａｃｇｇａｇｃｃａｇｇａｔａｇｃａｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇｔｔｃａｃｃｇａｃｔｔｔｇａｔａｇｃｃａｇａｔｃａａｔｇｔｇｃｃｔａａｇａｃａａｔｇｇａｇｔｃｃｇｇｃａｃｃｔｔｔａｔｃａｃａｇａｃａａｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｔａｔｇａａｇｇｃｃａｔｇｇａｃａｇｃａａｇｔｃｃａａｃｇｇｃｇｃｃａｔｃｇｃｃｔｇｇｔｃｔａａｔｃａｇａｃａａｇｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｃａｇｇａｔａｔｃｔｔｔａａｇｇａｇａｃａａａｃｇｃｃａｃｃｔａｃｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｃｇｔｇｃｃｃｔｇｔｇａｔｇｃｃａｃｃｃｔｇａｃａｇａｇａａｇａｇｃｔｔｃｇａｇａｃａｇａｃａｔｇａａｃｃｔｇａａｔｔｔｔｃａｇａａｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｔｇｇｇｃｃｔｇａｇａａｔｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇａａｇｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｔｃａａｔｃｔｇｃｔｇａｔｇａｃａｃｔｇｃｇｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃｔｃｔ（配列番号１３）
３．１標準プラスミド（ｐＵＣ５７－ＰＣ２５Ｊ）の設計、合成及びパッケージング
標準プラスミドは、ＴａｑＭａｎプライマープローブによって検出される標的断片に従って設計される。具体的には、マウスＴＣＲ遺伝子の２つの保存領域がｐＵＣ５７ベクター上に構築される。マウスＴＣＲ遺伝子の保存領域の配列は次の通りである。
ｇａｃｃｔｇｃｇｃａａｔｇｔｇａｃｃｃｃｃｃｃｔａａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｔｃｇａｇｃｃｔｔｃｔａａｇｇｃｃｇａｇａｔｃｇｃｃａａｃａａｇａｇｇａａｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｇｃａａｇｇｇｇｃｔｔｃｔｔｔｃｃａｇａｔｃａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇｔｃｃｔｇｇｔｇｇｇｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｇｔｇｃａｃｔｃｔｇｇｃｇｔｇａｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｃａｇｇｃｃｔａｃａａｇｇａｇｔｃｃａａｃｔａｔｔｃｔｔａｃｔｇｃｃｔｇｔｃｔａｇｃｃｇｇｃｔｇａｇａｇｔｇａｇｃｇｃｃａｃｃｔｔｔｔｇｇｃａｃａａｃｃｃｃａｇｇａａｔｃａｃｔｔｃｃｇｃｔｇｔｃａｇｇｔｇｃａｇｔｔｔｃａｃｇｇｃｃｔｇｔｃｃｇａｇｇａｇｇａｔａａｇｔｇｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｔｃｔｃｃｃａａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｃａｇａａｃａｔｃａｇｃｇｃｃｇａｇｇｃａｔｇｇｇｇａａｇｇｇｃａｇａｃｔｇｔｇｇｃａｔｃａｃｃａｇｃｇｃｃｔｃｃｔａｔｃａｇｃａｇｇｇｃｇｔｇｃｔｇａｇｃｇｃｃａｃａａｔｃｃｔｇｔａｃｇａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｇｇｃａａｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｔａｔｇｃｔｇｔｇｃｔｇｇｔｇｔｃａａｃｔｃｔｇｇｔｇｇｔｃａｔｇｇｃｔａｔｇｇｔｇａａａｃｇｇａａａａａｃｔｃｃａｔｃｃａｇａａｔｃｃａｇａｇｃｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｃａｇｃｔｇａａｇｇａｃｃｃａｃｇｇａｇｃｃａｇｇａｔａｇｃａｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇｔｔｃａｃｃｇａｃｔｔｔｇａｔａｇｃｃａｇａｔｃａａｔｇｔｇｃｃｔａａｇａｃａａｔｇｇａｇｔｃｃｇｇｃａｃｃｔｔｔａｔｃａｃａｇａｃａａｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｔａｔｇａａｇｇｃｃａｔｇｇａｃａｇｃａａｇｔｃｃａａｃｇｇｃｇｃｃａｔｃｇｃｃｔｇｇｔｃｔａａｔｃａｇａｃａａｇｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｃａｇｇａｔａｔｃｔｔｔａａｇｇａｇａｃａａａｃｇｃｃａｃｃｔａｃｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｃｇｔｇｃｃｃｔｇｔｇａｔｇｃｃａｃｃｃｔｇａｃａｇａｇａａｇａｇｃｔｔｃｇａｇａｃａｇａｃａｔｇａａｃｃｔｇａａｔｔｔｔｃａｇａａｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｔｇｇｇｃｃｔｇａｇａａｔｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇａａｇｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｔｃａａｔｃｔｇｃｔｇａｔｇａｃａｃｔｇｃｇｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃｔｃｔ（配列番号１３）
【0131】
３．２ ｐＵＣ５７空のプラスミド
ｐＵＣ５７は標的遺伝子を含まない空のプラスミドである。
ｐＵＣ５７は標的遺伝子を含まない空のプラスミドである。
【0132】
４．ネガティブコントロール
ネガティブコントロール（ＮＣ）は、ヒトＰＢＭＣのゲノムＤＮＡである。
ネガティブコントロール（ＮＣ）は、ヒトＰＢＭＣのゲノムＤＮＡである。
【0133】
５．ポジティブコントロール
ポジティブコントロール（ＰＣ）は、ＴＣＲ陽性細胞のゲノムＤＮＡに由来する。
ポジティブコントロール（ＰＣ）は、ＴＣＲ陽性細胞のゲノムＤＮＡに由来する。
【表4】
【0134】
６．シングルプレックス反応実験：
標準プライマープローブの濃度（ＴＣＲプライマー０．９μＭ、プローブ０．２５μＭ）
標準プライマープローブの濃度（ＴＣＲプライマー０．９μＭ、プローブ０．２５μＭ）
【表5】
【0135】
７．デュプレックス反応実験：
標準プライマープローブの濃度（ＴＣＲプライマー０．９μＭ、プローブ０．２５μＭ）
標準プライマープローブの濃度（ＴＣＲプライマー０．９μＭ、プローブ０．２５μＭ）
【表6】
【0136】
デュプレックスプライマープローブ濃度（ＴＣＲプライマー１．８μＭ、プローブ０．５μＭ）
【表7】
【0137】
低プライマープローブ濃度（ＴＣＲプライマー０．４５μＭ、プローブ０．１２５μＭ）
【表8】
【0138】
ｑＰＣＲ検出は、機械で実施された。反応は標準的な条件下で実行された：
ポリメラーゼ活性化：９５℃で１０分
ＰＣＲ：４０サイクル
変性：９５℃で１５秒
アニール／伸長：６０℃で６０秒
ポリメラーゼ活性化：９５℃で１０分
ＰＣＲ：４０サイクル
変性：９５℃で１５秒
アニール／伸長：６０℃で６０秒
【0139】
８．実験結果の処理：
反応終了後、ソフトウェアは各サンプルのＣｔ値、並びに各反応のネガティブコントロール及びポジティブコントロールのＴＣＲ遺伝子コピー数を自動的に出力する。ＲＮａｓｅＰ遺伝子のＣｔ値に基づいて、各サンプルのキャリブレーション係数（ＣＦ）を以下のように計算した：ＣＦ１＝２－（ＣｔＲＮａｓｅＰ（ＮＣ）－ＣｔＲＮａｓｅＰ（ＰＣ））。ＣＦ２＝Ｃｔ（ＰＣ）／平均Ｃｔ（ＰＣ）、ここで、平均Ｃｔ（ＰＣ）は、以前のエラーのない決定におけるポジティブコントロールのＣｔ値の平均値である。１μｇのＰＣゲノム中のＴＣＲ遺伝子コピー数は次のように計算された。
ＴＣＲ遺伝子のコピー数＝コピー数／各反応で加えたＤＮＡ量（ｎｇ）×ＣＦ１×ＣＦ２×１０００ｎｇ
反応終了後、ソフトウェアは各サンプルのＣｔ値、並びに各反応のネガティブコントロール及びポジティブコントロールのＴＣＲ遺伝子コピー数を自動的に出力する。ＲＮａｓｅＰ遺伝子のＣｔ値に基づいて、各サンプルのキャリブレーション係数（ＣＦ）を以下のように計算した：ＣＦ１＝２－（ＣｔＲＮａｓｅＰ（ＮＣ）－ＣｔＲＮａｓｅＰ（ＰＣ））。ＣＦ２＝Ｃｔ（ＰＣ）／平均Ｃｔ（ＰＣ）、ここで、平均Ｃｔ（ＰＣ）は、以前のエラーのない決定におけるポジティブコントロールのＣｔ値の平均値である。１μｇのＰＣゲノム中のＴＣＲ遺伝子コピー数は次のように計算された。
ＴＣＲ遺伝子のコピー数＝コピー数／各反応で加えたＤＮＡ量（ｎｇ）×ＣＦ１×ＣＦ２×１０００ｎｇ
【0140】
９．データ分析：
検量線のＲ２は≧０．９９であるべきであり、増幅効率は９０％から１１０％の範囲である。ＴＣＲ遺伝子検出のＣｔ閾値は０．１であり、これは、実験プロトコルの最適化の間に群間の比較を容易にする。実際の試験の間に、閾値を「自動」に設定できる。ＲＮａｓｅＰ参照遺伝子の検出のＣｔ閾値は、自動閾値に設定される。ＮＴＣ及びＮＣコントロールのＣｔ値は、なし又は≧３９であるべきである。
検量線のＲ２は≧０．９９であるべきであり、増幅効率は９０％から１１０％の範囲である。ＴＣＲ遺伝子検出のＣｔ閾値は０．１であり、これは、実験プロトコルの最適化の間に群間の比較を容易にする。実際の試験の間に、閾値を「自動」に設定できる。ＲＮａｓｅＰ参照遺伝子の検出のＣｔ閾値は、自動閾値に設定される。ＮＴＣ及びＮＣコントロールのＣｔ値は、なし又は≧３９であるべきである。
【0141】
実施例１シングルプレックスＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ
この実験では、ＤＮＡバックグラウンドがある場合とない場合の４セットのプライマー－プローブ試薬の増幅結果を試験した。
この実験では、ＤＮＡバックグラウンドがある場合とない場合の４セットのプライマー－プローブ試薬の増幅結果を試験した。
【0142】
方法は以下の通りである。ＴＣＲプライマー／プローブの存在下で、参照遺伝子ＲＮａｓｅＰプライマー／プローブの非存在下で、ヒトバックグラウンドｇＤＮＡの有無にかかわらず、ＴＣＲプライマー／プローブの４セットの検量線パラメータを試験した。
【0143】
４セットのプライマープローブの検量線は、図２－１Ａ～２－１Ｄ及び２－２Ａ～２－２Ｄに示す通りであり、四角記号は標準サンプルを表し、丸記号は試験サンプルを表す。
【0144】
バックグラウンドｇＤＮＡを用いない４セットのプライマー／プローブのシングルプレックス反応パラメータは次の通りである。
【表9】
【0145】
バックグラウンドｇＤＮＡを有する４セットのプライマープローブのシングルプレックス反応パラメータは次の通りである。
【表10】
【0146】
結果は次のことを示している。
（ａ）４セットのプライマー／プローブのＲ２及び増幅効率は、バックグラウンドのヒトｇＤＮＡの存在下又は非存在下でのシングルプレックス反応で標準に達した。
（ａ）４セットのプライマー／プローブのＲ２及び増幅効率は、バックグラウンドのヒトｇＤＮＡの存在下又は非存在下でのシングルプレックス反応で標準に達した。
【0147】
（ｂ）バックグラウンドのヒトｇＤＮＡの存在下で、Ａ１及びＤ１は、シングルプレックス反応試験において、より高い増幅効率、より高い感度、及び優れた信頼性を示した。
【0148】
（ｃ）最小１０コピーから最大１０７コピーの範囲で、バックグラウンドのヒトｇＤＮＡの存在下又は非存在下で、４セットのプライマー／プローブは全て、必要な産物を効果的に増幅できた。具体的には、Ａ１及びＤ１はより良好な増幅特異性を示し、バックグラウンドのヒトｇＤＮＡの干渉はほとんどなかったが、バックグラウンドのヒトｇＤＮＡはＢ１に干渉した。
【0149】
実施例２デュプレックスＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ
ＴＣＲプライマー／プローブ及び参照遺伝子ＲＮａｓｅＰプライマー／プローブの存在下で、４セットのＴＣＲプライマー／プローブの検量線パラメータを、ヒトバックグラウンドｇＤＮＡの存在下で測定した。
ＴＣＲプライマー／プローブ及び参照遺伝子ＲＮａｓｅＰプライマー／プローブの存在下で、４セットのＴＣＲプライマー／プローブの検量線パラメータを、ヒトバックグラウンドｇＤＮＡの存在下で測定した。
【0150】
デュプレックス反応では、患者の血液サンプルをシミュレートしたヒト単球ゲノムＤＮＡに加えて、参照遺伝子ＲＮａｓｅＰを検出するためのプライマー／プローブもまた反応系に追加さした。標的ＴＣＲ遺伝子を検出すると同時に、参照遺伝子ＲＮａｓｅＰも検出した。結果は、ヒトｇＤＮＡシミュレーションバックグラウンドをデュプレックス反応に追加すると、４セットのプライマーのＲ２及び増幅効率が大幅に低下し、標準に達していなかったことを示す。他の３セットのプライマー／プローブと比較して、Ｄ１プライマーセットは、標準に近いデュプレックス反応でより良好なデータを生成した。その後、プライマーＤ１のための実験条件を最適化した。
【0151】
４セットのプライマー／プローブの検量線を図３Ａ～３Ｄに示し、四角は標準サンプルを表し、丸は試験サンプルを表す。
【0152】
バックグラウンドｇＤＮＡを用いた４セットのプライマー／プローブのデュプレックス反応パラメータは次の通りである。
【表11】
【0153】
実施例３検量線の最低コピーポイントの選択
上記の実験結果は、図４－１の２つの矢印の長さで示されているように、検量線のコピー数が少ない場合の反応時の誤差が比較的大きいことを示す。理論的には、２つの矢印の長さは等しくなければならない。ただし、コピー数が少ない領域では、増幅効率が大幅に低下する。そこで、最小コピー数を増やすことを検討した。
上記の実験結果は、図４－１の２つの矢印の長さで示されているように、検量線のコピー数が少ない場合の反応時の誤差が比較的大きいことを示す。理論的には、２つの矢印の長さは等しくなければならない。ただし、コピー数が少ない領域では、増幅効率が大幅に低下する。そこで、最小コピー数を増やすことを検討した。
【0154】
【0155】
コピー数のデータは、Ｒ２及び検量線全体の増幅効率に影響する。１０コピーポイントのデータを削除すると、検量線の増幅効率は良好であった。その後、最小コピーポイントを１０コピーから５０コピーに引き上げることを検討した。
【0156】
実施例４異なるプライマー濃度下でのＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによるＤ１プライマープローブ試験
実験において、プライマーは０．９μＭ、プローブは０．２５μＭであった。プライマー及び／又はプローブ（例えば、Ｄ１）の濃度を変えることで増幅効率を最適化できるかどうかを試験した。異なる濃度でのプライマーＤ１の実験データを図５－１、５－２、及び５－３に示す。
実験において、プライマーは０．９μＭ、プローブは０．２５μＭであった。プライマー及び／又はプローブ（例えば、Ｄ１）の濃度を変えることで増幅効率を最適化できるかどうかを試験した。異なる濃度でのプライマーＤ１の実験データを図５－１、５－２、及び５－３に示す。
【0157】
異なる濃度で設定されたＤ１プライマー／プローブのパラメータを以下に示す。
【表13】
【0158】
Ｒ２は、異なる濃度のＤ１プライマー／プローブを用いて良好であった。しかし、増幅効率は、プライマー／プローブの濃度が低い場合にのみ良好であった。
【0159】
実施例５低濃度のＤ１プライマー／プローブを用いた異なる濃度のバックグラウンドｇＤＮＡの効果
低濃度のプライマー／プローブを使用した場合、増幅効率は高かった。プライマー濃度に加えて、実験においてＲＮａｓｅＰの効果が存在する。バックグラウンドｇＤＮＡの量を減らすと、反応の増幅効率を改善することができる。低濃度のプライマー／プローブを使用して、反応に対する様々な濃度のバックグラウンドｇＤＮＡの影響を調べ、検量線を図６－１、６－２、及び６－３に示す。異なるバックグラウンドｇＤＮＡ濃度を有するＤ１プライマー／プローブのパラメータを以下に示す。
低濃度のプライマー／プローブを使用した場合、増幅効率は高かった。プライマー濃度に加えて、実験においてＲＮａｓｅＰの効果が存在する。バックグラウンドｇＤＮＡの量を減らすと、反応の増幅効率を改善することができる。低濃度のプライマー／プローブを使用して、反応に対する様々な濃度のバックグラウンドｇＤＮＡの影響を調べ、検量線を図６－１、６－２、及び６－３に示す。異なるバックグラウンドｇＤＮＡ濃度を有するＤ１プライマー／プローブのパラメータを以下に示す。
【表14】
【0160】
したがって、５０ｎｇのバックグラウンドｇＤＮＡを用いて、Ｄ１プライマー／プローブ濃度を半分にすると（０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブにすると）、Ｒ２及び増幅効率は良好であった。
【0161】
実施例６検証実験
１．検量線の検証
実験結果は、５０ｎｇのバックグラウンドｇＤＮＡと組み合わせた低濃度のＤ１プライマー／プローブが、デュプレックス反応において優れた検量線パラメータを生成したことを示す。したがって、実験のランダムエラーを排除するために、この条件は実験的に複数回検証した。実験結果を図７Ａ～７Ｄに示す。
１．検量線の検証
実験結果は、５０ｎｇのバックグラウンドｇＤＮＡと組み合わせた低濃度のＤ１プライマー／プローブが、デュプレックス反応において優れた検量線パラメータを生成したことを示す。したがって、実験のランダムエラーを排除するために、この条件は実験的に複数回検証した。実験結果を図７Ａ～７Ｄに示す。
【0162】
半分の量のＤＮＡ（０．４５μＭプライマー、０．１２５μＭプローブ）で５０ｎｇのバックグラウンドｇＤＮＡを用いたＤ１プライマー／プローブの４回の反復実験のデータは次の通りである。
【表15】
【0163】
４回の反復実験では、検量線パラメータは全て要件を満たし、比較的安定していた。
【0164】
２．正確さの検証
上記の実験データから、検量線が確立されると、ＴａｑＭａｎ検出法の線形パラメータが実験要件を満たすことができることを知ることができる。実験計画の検出正確さを更に検証するために、異なるコピーで事前に準備された品質管理製品を検出し、測定値と理論値との差を比較して、この検出計画の正確さを検証し、一方で、検出の正確さ範囲を決定した。
上記の実験データから、検量線が確立されると、ＴａｑＭａｎ検出法の線形パラメータが実験要件を満たすことができることを知ることができる。実験計画の検出正確さを更に検証するために、異なるコピーで事前に準備された品質管理製品を検出し、測定値と理論値との差を比較して、この検出計画の正確さを検証し、一方で、検出の正確さ範囲を決定した。
【0165】
品質管理製品のコピー数の範囲は、実際に検出されたコピー数に応じて決定され、これは、定量上限（ＨＬＯＱ）、高品質管理（ＨＱＣ）、中高品質管理（ＭＨＱＣ）、中品質管理（ＭＱＣ）、低品質管理（ＬＱＣ）、及び定量下限（ＬＬＯＱ）を含む。対応する品質管理製品のコピー数は、５０ｎｇのｇＤＮＡで、それぞれ、３．５×１０４、１．７５×１０４、３５００、７００、１４０、及び２８であった。品質管理製品の調製方法を以下に示す。
【表16】
【0166】
調製された品質管理製品は均一に包装され、品質管理製品の一貫性及び各試験実験の独立性を確保するために試験時に採取された。
【0167】
正確さ検証実験は独立して５回行った。実験結果は、表１～表５の通りである。
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【0168】
標準ＴＣＲプラスミドの希釈範囲は、最初は１０～１×１０７に設計した。デュプレックス反応の参照遺伝子の影響により、感度はわずかに低下した。一方で、最初の正確さ試験実験において、最低点は１×１０２であるべきと判断された。したがって、標準ＴＣＲプラスミドは、１×１０２～１×１０７コピー／反応の範囲で希釈された。Ｒ２は０．９９４から０．９９９の範囲で、増幅効率は９２．３％～１０１．６％であった。検量線上の各濃度点の実行内精度は０．０９％～１．５５％であった。実行間精度は１．０９％～３．０７％であった。参照遺伝子ＲＮａｓｅＰの実行内精度は０．５８％～２．３０％、実行間精度は１．１８％であった。直線性及び精度は良好であり、方法論的検証の要件を満たしていた。
【0169】
ＴＣＲのＨＬＯＱ、ＨＱＣ、ＭＨＱＣ、ＭＱＣ、ＬＱＣ、及びＬＬＯＱの実行内正確さは、それぞれ、８５．０％～１０７．６％、９６．８％～１１９．７％、１１３．２％～１３３．０％、１０５．０％～１４７．８％、７５．５％～９９．４％、２２．７％～１１２．２％であった。ＨＬＯＱ、ＨＱＣ、ＭＨＱＣ、ＭＱＣ、ＬＱＣ、及びＬＬＯＱの実行間正確さは、それぞれ、９５．６％、１０７．６％、１２３．０％、１２３．１％、８９．９％、及び６４．８％であった。
【0170】
コピー数に基づいて計算すると、ＴＣＲのＨＬＯＱ、ＨＱＣ、ＭＨＱＣ、ＭＱＣ、ＬＱＣ、及びＬＬＯＱの実行内精度は、それぞれ、１．５％～６．８％、２．０％～２．４％、２．９％～５．４％、４．５％～１６．２％、１２．３％から２７％、及び３２．１％から９６．６％であり、実行間精度は、それぞれ、９．４％、９．２％、７．４％、１６．１％、２６．０％、及び６２．２％であった。
【0171】
実施例７患者の血液サンプルにおけるＴＣＲ遺伝子コピー数の決定
対象は、臨床試験ＮＣＴ０３９７１７４７の肝臓がん患者であった。ベースライン期間の基準点として使用される抗ＡＦＰ ＴＣＲ（マウス）自己Ｔ細胞注入を患者が受けてから１３日目に血液サンプルを採取した。細胞注入の日、並びに細胞注入後４、７、１０、１４、２１及び２８日目に試験のために血液サンプルを採取した。各サンプリングポイントからの血液サンプル中のＰＢＭＣゲノムＤＮＡに伴うマウスＴＣＲのコピー数は、患者の様々な時点でのＡＦＰ ＴＣＲ－Ｔ細胞の動的増幅を反映している可能性がある。臨床試験において、この方法を使用して、Ｔ ＴＣＲ（マウス）自己Ｔ細胞療法を受けている患者の血液サンプル中のＴＣＲ遺伝子コピー数を定量的に決定し、ＴＣＲ－Ｔ細胞の増幅を間接的に測定した。
対象は、臨床試験ＮＣＴ０３９７１７４７の肝臓がん患者であった。ベースライン期間の基準点として使用される抗ＡＦＰ ＴＣＲ（マウス）自己Ｔ細胞注入を患者が受けてから１３日目に血液サンプルを採取した。細胞注入の日、並びに細胞注入後４、７、１０、１４、２１及び２８日目に試験のために血液サンプルを採取した。各サンプリングポイントからの血液サンプル中のＰＢＭＣゲノムＤＮＡに伴うマウスＴＣＲのコピー数は、患者の様々な時点でのＡＦＰ ＴＣＲ－Ｔ細胞の動的増幅を反映している可能性がある。臨床試験において、この方法を使用して、Ｔ ＴＣＲ（マウス）自己Ｔ細胞療法を受けている患者の血液サンプル中のＴＣＲ遺伝子コピー数を定量的に決定し、ＴＣＲ－Ｔ細胞の増幅を間接的に測定した。
【0172】
【0173】
結果は、患者が低用量のＡＦＰ ＴＣＲ－Ｔ細胞の静脈内注入を受けた後、体内のＴＣＲ－Ｔ細胞の増殖が検出できたことを示す。この方法では、比較的低いレベルのシグナルを検出できる。この結果は、臨床試験において低用量の改変Ｔ細胞を投与した場合、Ｔ細胞の増幅レベルが低かったことを示す。また、この検出方法は比較的感度が高いことも示す。
【0174】
実施例８担がんマウスの腫瘍におけるＴＣＲコピー数の決定
本発明者らはまた、この検出方法を使用して、ＡＦＰ ＴＣＲ（マウス）－Ｔ細胞を注射した担がんマウスの腫瘍組織をアッセイした。実験用マウスは、ＢｉｏｃｙｔｏｇｅｎのＢ－ＮＤＧ系統から選択され、腫瘍モデルは、ＨｅｐＧ２細胞の皮下注射によって確立され、その後５日間増殖させた。ＡＦＰ ＴＣＲ－Ｔ細胞注射後２８日目に、実験マウスにおける腫瘍組織を取り出し、ゲノムＤＮＡのマウスＴＣＲ遺伝子をアッセイした。
本発明者らはまた、この検出方法を使用して、ＡＦＰ ＴＣＲ（マウス）－Ｔ細胞を注射した担がんマウスの腫瘍組織をアッセイした。実験用マウスは、ＢｉｏｃｙｔｏｇｅｎのＢ－ＮＤＧ系統から選択され、腫瘍モデルは、ＨｅｐＧ２細胞の皮下注射によって確立され、その後５日間増殖させた。ＡＦＰ ＴＣＲ－Ｔ細胞注射後２８日目に、実験マウスにおける腫瘍組織を取り出し、ゲノムＤＮＡのマウスＴＣＲ遺伝子をアッセイした。
【0175】
実験結果は表７の通りである。
【表23】
【0176】
実験結果は、注射後２８日目に、ブランク、低用量及び中用量群でシグナルが検出されなかったことを示す。マウスＴＣＲのコピー数は、高用量群で決定された。これは、注射後の改変Ｔ細胞が標的固形腫瘍組織に浸潤し効果を発揮できることを示す。
【0177】
概要
ＴＣＲ遺伝子のコピー数がＴａｑＭａｎ法によって検出される場合、Ｄ１プライマー／プローブセットを使用して検量線が作成され得る。ＲＮａｓｅＰデュプレックス反応については、１０、５０、又は１００コピーが検量線の最小コピー数ポイントとして使用され得る。これは、試験結果に基づいて決定され得る。
ＴＣＲ遺伝子のコピー数がＴａｑＭａｎ法によって検出される場合、Ｄ１プライマー／プローブセットを使用して検量線が作成され得る。ＲＮａｓｅＰデュプレックス反応については、１０、５０、又は１００コピーが検量線の最小コピー数ポイントとして使用され得る。これは、試験結果に基づいて決定され得る。
【0178】
特定の実施形態において、バックグラウンドｇＤＮＡの量が５０ｎｇである場合、Ｄ１プライマー／プローブセットについては、プライマー濃度は０．４５μＭであり、プローブ濃度は０．１２５μＭである。
【0179】
更に、この方法は、臨床的に使用でき、感度が高い。
【0180】
本開示の範囲は、上記に具体的に示され記載されたものによって限定されない。当業者は、示された材料、構成、構造及び寸法の例に対する好適な代替物があることを認識する。特許及び様々な刊行物を含む多数の参考文献が、本発明の記載において引用及び議論されている。そのような参考文献の引用及び考察は、単に本開示の記載を明確にするだけのために提供されており、いかなる参考文献も本明細書に記載された発明に対する先行技術であることを承認するものではない。本明細書において引用され議論された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されたものの変更、修正及び他の実施は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく当業者には想到される。本開示の特定の実施形態を示し記載してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく変更及び修正を行い得ることは当業者には明らかとなる。前述の説明で述べた事項及び添付の図面は、例示としてのみ提供され、限定としては提供されるのではない。
【図1】
【図2-1A】
【図2-1B】
【図2-1C】
【図2-1D】
【図2-2A】
【図2-2B】
【図2-2C】
【図2-2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】