(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】新規のヌクレオリン－結合ペプチド及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20230614BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230614BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230614BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230614BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20230614BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
A61P35/00
A61P35/02
A61K45/00
A61K47/64
A61K47/60
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022570596
(86)(22)【出願日】2021-05-18
(85)【翻訳文提出日】2022-11-17
(86)【国際出願番号】 IB2021054235
(87)【国際公開番号】W WO2021234550
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】10-2020-0059487
(32)【優先日】2020-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522450897
【氏名又は名称】アニゲン カンパニー、リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジェイル
(72)【発明者】
【氏名】ナム、ジョン － ソク
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジェ － ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】リュウ、ジェ － ハ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA17
4C076AA22
4C076AA24
4C076AA29
4C076AA31
4C076AA36
4C076AA53
4C076AA54
4C076AA56
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB31
4C076CC27
4C076EE23
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA17
4C084AA27
4C084MA05
4C084MA13
4C084MA17
4C084MA22
4C084MA23
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA41
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA10
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4H045BA15
4H045BA40
4H045BA57
4H045BA72
4H045EA20
4H045EA51
4H045FA10
(57)【要約】
本発明は、ヌクレオリンに特異的に結合する新規のペプチドに関し、より詳細には、特定のアミノ酸配列で表されるペプチド、前記ペプチド及び抗癌剤を含む接合体、前記ペプチド及び細胞透過性ペプチドを含む融合ペプチド、前記ペプチドを含む癌診断用組成物、及び前記ペプチド又は接合体を含む癌予防又は治療用組成物に関する。本発明では、ＭＡＰ合成方法及びＯＢＯＣ組み合わせ方法を使用してスクリーニングしたペプチドリガンドＡＧＭペプチド及びその変異体が癌細胞に特異的に結合し、抗癌剤との接合体が癌成長を抑制することを確認した（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ）。よって、ＮＣＬ－標的化ＡＧＭペプチドは、癌治療法で診断及び標的薬物伝達に有用に利用可能である。
【選択図】図１４
【選択図】図１４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とするヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）に特異的に結合するＡＧＭペプチド：（ａ）配列番号１乃至配列番号８のうちいずれか一つで表されるアミノ酸配列；及び
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、下記の群から選ばれる一つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列：
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン残基の置換；
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン残基の置換；及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン又はリシン残基の挿入。
【請求項2】
前記（ｂ）のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列は、配列番号９乃至配列番号１５及び配列番号２０で構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のＡＧＭペプチド。
【請求項3】
請求項１に記載のＡＧＭペプチドとポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）鎖とが接合されたＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体。
【請求項4】
前記ポリエチレングリコール鎖は、２個乃至２４個のエチレングリコール基を含むことを特徴とする、請求項３に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体。
【請求項5】
前記ＡＧＭペプチドとポリエチレングリコール鎖はリンカーを介して連結されることを特徴とする、請求項３に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体。
【請求項6】
請求項３に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体及び薬物を含むＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体。
【請求項7】
前記薬物は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）又はドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）などのタキソール（ｔａｘｏｌ）及びタキサン、マイタンシノイド、アウリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルハイドラザイド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、α－アマニチン、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ピロロベンゾジアゼピン、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロレリン酢酸塩（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルベリン、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、クルクミン、アブラキサン、フォルフィリノックス、オキサリプラチン、ゼローダ及びインドールカルボキサミド、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、チューブリシン、光減作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、タラミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素、及び細菌や動植物由来の毒素からなる群から選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項６に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体。
【請求項8】
前記ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体と薬物はリンカーを介して連結されることを特徴とする、請求項６に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体。
【請求項9】
請求項３に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体を２個以上含む多量体。
【請求項10】
２個乃至８個のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体を含むことを特徴とする、請求項９に記載の多量体。
【請求項11】
前記２個以上のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体がリンカーによって互いに連結されることを特徴とする、請求項９に記載の多量体。
【請求項12】
請求項９に記載の多量体及び薬物を含む多量体－薬物接合体。
【請求項13】
前記薬物は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）又はドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）などのタキソール（ｔａｘｏｌ）及びタキサン、マイタンシノイド、アウリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルハイドラザイド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、α－アマニチン、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ピロロベンゾジアゼピン、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロレリン酢酸塩（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルベリン、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、クルクミン、アブラキサン、フォルフィリノックス、オキサリプラチン、ゼローダ及びインドールカルボキサミド、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、チューブリシン、光減作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、タラミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素、及び細菌や動植物由来の毒素からなる群から選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の多量体－薬物接合体。
【請求項14】
前記多量体と薬物はリンカーを介して連結されることを特徴とする、請求項１３に記載の多量体－薬物接合体。
【請求項15】
請求項３に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体と、細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合されたＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド。
【請求項16】
前記細胞透過性ペプチドは、配列番号３１乃至配列番号８０のアミノ酸配列で構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項１５に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド。
【請求項17】
前記ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体と細胞透過性ペプチドはリンカーを介して連結されることを特徴とする、請求項１５に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド。
【請求項18】
請求項９に記載の多量体と、細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合された多量体－ＣＰＰ融合ペプチド。
【請求項19】
請求項１～３に記載のＡＧＭペプチド、請求項４～５に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、請求項６～８に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、請求項９～１１に記載の多量体、請求項１２～１４に記載の多量体－薬物接合体、請求項１５～１７に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は請求項１８に記載の多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを含む癌診断用組成物。
【請求項20】
請求項１～３に記載のＡＧＭペプチド、請求項４～５に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、請求項６～８に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、請求項９～１１に記載の多量体、請求項１２～１４に記載の多量体－薬物接合体、請求項１５～１７に記載のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は請求項１８に記載の多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを含む癌予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヌクレオリンに特異的に結合する新規のペプチドに関し、より詳細には、特定のアミノ酸配列で表示されるペプチド、前記ペプチド及び抗癌剤を含む接合体、前記ペプチド及び細胞透過性ペプチドを含む融合ペプチド、前記ペプチドを含む癌診断用組成物、及び前記ペプチド又は接合体を含む癌予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
癌－特異的リガンドを薬学的担体として用いることは、従来の薬物によって達成されることに比べて相対的に化学療法製剤の組織又は細胞特異的伝達を可能にし、全身毒性を減少させる（Ａｌｌｅｎ ＴＭ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００２；２：７５０－６３）。癌－特異的リガンドのうちナノ粒子及び抗体は、臨床癌診断及び治療で広く研究されてきた（Ｙａｏ ＶＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１６；２４０：２６７－８６）。初期段階で個別患者の癌を感知及びモニタリングし、治療効果を高めるために長期間にわたって抗癌剤を伝達できるので、同時に診断及び治療できる（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃ）ナノ粒子及び抗体は、個人オーダーメード型医薬品分野で大きな可能性を示している（Ｐａｌｍｉｅｒｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５；１１２：９４１８－２３）。ナノ粒子は、有望な薬物運搬体システムであるが、循環不安定性、不適切な組織分布及び細胞毒性のため、実際の適用に限界を示す（Ｓｕｋｈａｎｏｖａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ Ｌｅｔｔ．２０１８；１３：４４）。また、治療用抗体は、大きいサイズを有するので、腫瘍組織への伝達及び拡散が遅いという限界を有する（Ｅｐｅｎｅｔｏｓ ＡＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８６；４６：３１８３－９１）。
【0003】
古典的な診断及び治療方法に対する代案として、治療効率を高め、ナノ粒子及び抗体癌治療法と関連した副作用を減少させるために、癌－特異ペプチドが使用され得る（Ｍｏｒｉ Ｔ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００４；１０：２３３５－４３）。ペプチドリガンドは、容易な大量合成、低い免疫原性、無毒性代謝産物の生成及び高いｉｎ ｖｉｖｏ生体適合性を含めて、多くの長所を有している（ＭｃＧｒｅｇｏｒ ＤＰ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８；８：６１６－９）。ペプチドを発掘する多くの方法のうち、ＯＢＯＣ（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）組み合わせ方法は、ペプチドリガンドをスクリーニングする強力な方法の一つである（Ｌａｍ ＫＳ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．１９９７；９７：４１１－４８）。ＯＢＯＣ組み合わせライブラリに基づいたペプチドスクリーニング接近法は、癌及び他の疾病での細胞標的化のための新規のペプチドリガンドの発見を促進させた（Ｍｉｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００４；３：１３２９－３４）。多数の癌－特異的ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＢＯＣ組み合わせスクリーニング又は他の方法を使用して分離されたが、いくつかの課題が残っている。特に、ペプチドを薬物として使用する際の主要な短所としては、他のペプチダーゼ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）による非常に速い切断による非常に短い半減期を挙げることができる（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ＴＲ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．１９９７；２７：２３５－５６）。本発明者等は、多重－抗原ペプチド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＭＡＰ）デンドリマー形態（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）の生活性ペプチドを合成する専用接近法を開発することによって、前記記載の各問題を克服しようとした。デンドリマー形態の単量体ペプチドの合成は、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）及びペプチダーゼ活性に対する獲得抵抗性によって安定性を増加させることができる（ＭｃＧｕｉｒｅ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：４４８０）。
【0004】
そこで、本発明者等は、ＯＢＯＣ組み合わせスクリーニングとＭＡＰ合成とを結合し、ヒト乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）及び結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）細胞に特異的に結合するＡＧＭ又はＡＧＭペプチドと命名された各ペプチドリガンドシリーズを発明した。Ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング試験を通じて、各ＡＧＭシリーズが正常組織よりは腫瘍に遥かに多く分布されていることを立証した。また、パクリタキセル（ＰＴＸ）－接合ＡＧＭを処理すると、癌細胞でＰＴＸ蓄積を改善させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＴＸ単独処理に比べて乳癌及び結腸直腸癌細胞をさらに効果的に抑制した。また、ＰＴＸ－接合ＡＧＭ処理は、腫瘍組織でＰＴＸの特異的局所化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を促進し、乳癌の異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルで細胞毒性を増加させ、薬物蓄積及び抗癌効能を向上させた。さらに、プルダウン（ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ）分析及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳを通じて、ヌクレオリン（ＮＣＬ）がＡＧＭの標的タンパク質であることを確認した。ＮＣＬは、核小体（ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ)に最も多く存在するタンパク質である。本発明では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗－ＮＣＬ抗体を用いて癌細胞増殖を抑制させ、細胞死滅率（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｅｓ）を増加させることによって、癌細胞膜ＮＣＬの過剰発現及び細胞膜ＮＣＬの中和を確認した。発癌性役割及び癌細胞膜での発現により、ＮＣＬは、癌治療のための魅力的な標的である。以上の内容をまとめると、前記各結果は、各ＡＧＭシリーズが癌診断及び治療のための新規の腫瘍－標的化ペプチドであることを示す。
【0005】
本背景技術部分に記載の前記情報は、本発明の背景に対する理解を向上させるためのものに過ぎないので、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）に特異的に結合するペプチドを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ペプチド及び抗癌剤を含む接合体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチドを含む２個以上の多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記多量体及び抗癌剤を含む接合体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチドと細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合された融合ペプチド、及び前記多量体と細胞透過性ペプチドとが結合された融合ペプチドを提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチド又は多量体を含む癌診断用組成物、癌診断方法、癌診断のための前記ペプチド又は多量体の用途、及び癌診断用薬剤製造のための前記ペプチド又は多量体の使用を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチド、前記接合体又は多量体を含む癌予防又は治療用組成物、癌予防又は治療方法、癌予防又は治療のための前記ペプチド、接合体又は多量体の用途、及び癌予防又は治療用薬剤製造のための前記ペプチド、接合体又は多量体の使用を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ペプチド及び抗癌剤を含む接合体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチドを含む２個以上の多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記多量体及び抗癌剤を含む接合体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチドと細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合された融合ペプチド、及び前記多量体と細胞透過性ペプチドとが結合された融合ペプチドを提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチド又は多量体を含む癌診断用組成物、癌診断方法、癌診断のための前記ペプチド又は多量体の用途、及び癌診断用薬剤製造のための前記ペプチド又は多量体の使用を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ペプチド、前記接合体又は多量体を含む癌予防又は治療用組成物、癌予防又は治療方法、癌予防又は治療のための前記ペプチド、接合体又は多量体の用途、及び癌予防又は治療用薬剤製造のための前記ペプチド、接合体又は多量体の使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記目的を達成するために、本発明は、
（ａ）配列番号１乃至配列番号８のうちいずれか一つで表されるアミノ酸配列；及び
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン残基の置換、
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン残基の置換、及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン又はリシン残基の挿入
で構成された群から選ばれる一つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列；
で構成された群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とするヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）に特異的に結合するペプチドを提供する。
また、本発明は、前記ペプチド及び抗癌剤を含む接合体を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを含む多量体を提供する。
また、本発明は、前記多量体及び抗癌剤を含む接合体を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドと細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合された融合ペプチドを提供する。
また、本発明は、前記多量体と細胞透過性ペプチドとが結合された融合ペプチドを提供する。
また、本発明は、前記ペプチド又は多量体を含む癌診断用組成物、癌診断方法、癌診断のための前記ペプチド又は多量体の用途、及び癌診断用薬剤製造のための前記ペプチド又は多量体の使用を提供する。
また、本発明は、前記ペプチド、前記接合体又は多量体を含む癌予防又は治療用組成物、癌予防又は治療方法、癌予防又は治療のための前記ペプチド、接合体又は多量体の用途、及び癌予防又は治療用薬剤製造のための前記ペプチド、接合体又は多量体の使用を提供する。
（ａ）配列番号１乃至配列番号８のうちいずれか一つで表されるアミノ酸配列；及び
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン残基の置換、
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン残基の置換、及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン又はリシン残基の挿入
で構成された群から選ばれる一つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列；
で構成された群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とするヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）に特異的に結合するペプチドを提供する。
また、本発明は、前記ペプチド及び抗癌剤を含む接合体を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを含む多量体を提供する。
また、本発明は、前記多量体及び抗癌剤を含む接合体を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドと細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合された融合ペプチドを提供する。
また、本発明は、前記多量体と細胞透過性ペプチドとが結合された融合ペプチドを提供する。
また、本発明は、前記ペプチド又は多量体を含む癌診断用組成物、癌診断方法、癌診断のための前記ペプチド又は多量体の用途、及び癌診断用薬剤製造のための前記ペプチド又は多量体の使用を提供する。
また、本発明は、前記ペプチド、前記接合体又は多量体を含む癌予防又は治療用組成物、癌予防又は治療方法、癌予防又は治療のための前記ペプチド、接合体又は多量体の用途、及び癌予防又は治療用薬剤製造のための前記ペプチド、接合体又は多量体の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１は、本発明に係るＡＧＭ－３３０とＰＥＧとが接合された接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の単量体（ＡＧＭ－３３０ｍ）、二量体（ＡＧＭ－３３０ｄ）、及び四量体（ＡＧＭ－３３０ｔ）の構造を示した図である。
【図2】図２は、本発明に係るＡＧＭ－３３０－ＰＥＧ接合体と細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合されたＡＧＭ－３３０－ＣＰＰ融合ペプチドの構造を示した図である。
【図3】図３は、ペプチドライブラリ合成及びスクリーニング段階を表現した模式図である：１．Ｓｐｌｉｔ－ｍｉｘ合成方法を行い、組み合わせＯＢＯＣライブラリを構築する。；２．約２，６００，０００個のライブラリ合成；３．ＯＢＯＣライブラリをＣＯ２インキュベーターで癌細胞と共に培養する。；４．細胞表面分子に対する親和性を有するリガンドを運搬するビードは細胞で覆われる。；５．ポジティブビードを倒立顕微鏡下でピペットを用いて採取する。；６．ポジティブビードの配列をエドマンマイクロシーケンシング（Ｅｄｍａｎ ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で測定する。；７．ＯＢＯＣ組み合わせペプチドライブラリスクリーニングから確認された癌－特異的ペプチドリガンド候補。
【図4】図４は、癌－特異的リガンドに対するＯＢＯＣライブラリのスクリーニング及びＭＡＰ合成を示した図である。 図４Ａは、癌細胞株及び正常細胞に対するペプチドの結合特異性を示した図で、図４Ｂは、選択された８個のビードの細胞結合特異性を示す全体－細胞結合分析結果であって、多数の乳癌及び結腸直腸癌細胞と正常の乳房及び結腸直腸細胞を１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに再懸濁させ、ビードと共に培養した。全ての実験を３回繰り返し、スケールバー（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ）は２００μｍである。図４Ｃは、ＦＩＴＣ－標識された（ｌａｂｅｌｅｄ）ＡＧＭ－３３０、ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２の免疫蛍光の共焦点イメージングによって決定された結合特異性を示した図で、核は、ＤＡＰ（ｂｌｕｅ）で染色され、スケールバーは５０μｍである。図４Ｄは、ＡＧＭ－３３０の結合特異性を示した図で、ＡＧＭ－３３０の細胞結合を決定するために全体－細胞結合分析を行い、スケールバーは２００μｍである。図４Ｅは、ＡＧＭ－３３０の合成手順を示した図で、試薬及び条件は次の通りである：（ｉ）Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ、ピペリジン、ＤＭＦ；（ｉｉ）Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ、ピペリジン、ＤＭＦ；（ｉｉｉ）ＲＨＧＡＭＶＹＬＫ－ＯＨ、ピペリジン；（ｉｖ）ピペリジン、ＤＭＦ．Ｆｍｏｃ＝９－フルオレニルメトキシカルボニル、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド。図４Ｆは、多数の乳癌及び結腸直腸癌細胞と正常な乳房及び結腸直腸細胞のうち癌細胞に対するＡＧＭ－３３０の特異性を示すＦＡＣＳ分析結果であって、棒グラフは平均±ＳＤを示し、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）で統計分析を行った。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【図5】図５は、ＡＧＭ－３３０（ＡＧＭ－３３０ｍ、ＡＧＭ－３３０ｄ、ＡＧＭ－３３０ｔ）によるペプチドｉｎ ｖｉｖｏ安定性評価結果である。ＡＧＭ－３３０ ２ｍｇ／ｋｇをマウスの尾静脈を介して注入した後、０、０．１６７、１、２、４、６、８、１２、２４及び４８時間ごとにヘパリンがコーティングされた管を用いて目から血液を採取した。４℃での血液凝固を許容した後、４℃で１０分間５０００ｒｐｍで遠心分離することによって血清を収集した。残っている血清内のペプチド部分は、抗－ＡＧＭ－３３０抗体を通じてＥＬＩＳＡプレートに直ぐ固定させた。吸光度は、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍの波長で測定され、薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）はｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ８．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）プログラムで分析した。
【図6】図６は、ＡＧＭ－３３０ｔ又はＡＧＭ－３３０ｄ処理時の細胞生存力分析結果である。癌細胞及び正常細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ウェルプレートにシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２４時間にわたって培養した後、細胞を、血清の濃度を異ならせて、４８時間にわたって増加する濃度のＡＧＭ－３３０ｔ又はＡＧＭ－３３０ｄで処理した。細胞生存力は、製造社の指示に従ってＣｅｌｌＶｉａ ＷＳＴ－１アッセイ（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）によって評価され、生存細胞の数は、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍの波長で測定された。
【図7】図７は、ＡＧＭ－３３０の分子標的及び特性を確認した結果を示した図である。 図７Ａは、ビオチンプルダウン（ｂｉｏｔｉｎ ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ）分析、質量分析及びウェスタンブロットの模式図である。図７Ｂは、１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離後、親和性カラムから溶出されたタンパク質のクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）染色結果であって、Ｌａｎｅ １：タンパク質マーカー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ）；Ｌａｎｅ ２：ビオチンプルダウンアッセイ前の総ライセート（ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ ｂｅｆｏｒｅ ｂｉｏｔｉｎ ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）；Ｌａｎｅ ３：ＡＧＭ－３３０－ビオチンでのインキュベート後のフロースルー（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡＧＭ－３３０－ｂｉｏｔｉｎ）；Ｌａｎｅ ４－６：ビード洗浄分画（ｂｅａｄ ｗａｓｈｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎ）；Ｌａｎｅ ７－８：ＡＧＭ－３３０結合タンパク質の溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＡＧＭ－３３０ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）である。＊赤色の星印は、タンパク質バンドがゲル内分解のために切断された後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析が行われたことを示す。図７Ｃは、ＭＳで検出されたペプチドのタンパク質データベース検索であって、ＡＧＭ－３３０結合パートナーとしてのＮＣＬを確認した結果である。図７Ｄは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析から得た遺伝子リストであって、信頼スコア（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｓｃｏｒｅ）は、識別されたタンパク質のマスコットスコア（ｍａｓｃｏｔ ｓｃｏｒｅ）を示す。図７Ｅは、抗－ＮＣＬ抗体を使用したビオチンプルダウンから溶出されたタンパク質の免疫ブロッティング分析結果であって、矢印は、ＮＣＬの存在を意味する。図７Ｆは、ＡＧＭ－３３０に結合するＮＣＬドメインの分析結果であって、相違するＧＦＰ－ＮＣＬ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質注入させ、ＡＧＭ－３３０－ビオチンをストレプトアビジンビードに結合されたＮＣＬ残基１－７１０、残基１－３２２又は残基３２３－７１０に添加し、ビード上のタンパク質を抗－ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロッティングで分析した。
【図8】図８は、組換えＮＣＬに対するＡＧＭ－３３０の親和度をＳＰＲによって評価した結果であって、Ｋｄで表示された。表示されたＳＰＲセンサーグラムは、類似する結果を有する互いに異なるセンサーチップを使用する３つの個別実験セットを代表する実験の結果である。組換えＮＣＬは、ＣＭ５センサーチップに固定された。多様な濃度のＡＧＭ－３３０（２０ｎＭ－２．５μＭ）を、固定されたＮＣＬと共に培養し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００装置で分析した。
【図9】図９は、ビオチンプルダウン分析によるＡＧＭ－３３０と精製されたＮＣＬとの間の直接的な相互作用分析結果であって、溶出されたタンパク質の免疫ブロッティング分析は、抗－ＮＣＬ抗体を使用してビオチンプルダウンを形成する。Ｌａｎｅ １：タンパク質マーカー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ）；Ｌａｎｅ ２：精製されたＮＣＬの入力（ｉｎｐｕｔ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＣＬ）；Ｌａｎｅ ３：ＡＧＭ－３３０－ビオチンでのインキュベート後のフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＡＧＭ－３３０－ｂｉｏｔｉｎ）；Ｌａｎｅ ４－６：ビード洗浄分画（ｂｅａｄ ｗａｓｈｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎ）；Ｌａｎｅ ７－８：ＡＧＭ－３３０結合タンパク質の溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＡＧＭ－３３０ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。矢印は、ＮＣＬの存在を意味する。
【図10】図１０は、ＡＧＭ－３３０と各変異体のＥＬＩＳＡに対する親和度試験である。癌細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ウェルプレートにシーディングし、２４時間にわたって培養した後、細胞を、２時間にわたって増加する濃度のビオチンが連結された１３種のペプチドで処理した。その後、高親和性アビジン－ビオチン相互作用を通じてアビジン－ＨＲＰを付着させ、ＨＲＰ酵素を通じてＴＭＢ基質を青色に転換させた。そして、酸を添加することによって反応を終決させ、４５０ｍｍでウェルを判読し、１３種の親和度をＥＬＩＳＡで評価した。
【図11】図１１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ ＡＧＭ－３３０の結合特異性を示した図である。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、多数の癌及び正常細胞の蛍光共焦点顕微鏡観察結果であって、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図１１Ａ）又はＣＣＤ－１８Ｃｏ、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６（図１１Ｂ）細胞を３７℃で３０分間５μｍｏｌ／ｌ ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣと共に培養し、ＮＣＬは、１次抗－ＮＣＬ抗体で染色され、ＡＧＭ－３３０とＮＣＬとの結合は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４に連結された抗－マウス２次抗体を使用して明らかになっており、細胞は、４％のパラホルムアルデヒドで固定され、核はＤＡＰＩで染色された。マージ（Ｍｅｒｇｅ）は、ＤＡＰＩによるＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣ、ＮＣＬ及び核染色を示し、ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣは、ＦＩＴＣ－接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＡＧＭ－３３０で、スケールバーは２０μｍである。図１１Ｃは、多様な準細胞分画でのＮＣＬ分布をＭＣＦ－１０Ａ、ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で分析した結果であって、抗－ＮＣＬ抗体を使用して血漿膜、細胞基質及び核ＮＣＬを免疫ブロッティングした。図１１Ｄは、ｓｉＲＮＡを用いたＮＣＬのノックダウンによって細胞膜に対するＡＧＭ－３３０の結合が抑制されることを示した図であって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４８時間にわたって形質注入させた後、５μｍｏｌ／ｌのＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣを２時間にわたって添加し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定させた。蛍光共焦点顕微鏡を使用して蛍光を観察し、ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣは、ＦＩＴＣ－接合ＡＧＭ－３３０で、スケールバーは２０μｍである。図１１Ｅは、多様な準細胞分画でのＮＣＬ分布をｓｉＮＣＬ１処理した後、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で分析した結果であって、血漿膜、細胞基質及び核ＮＣＬを抗－ＮＣＬ抗体を使用して免疫ブロッティングした。図１１Ｆは、実験プロトコルの模式図であって、麻酔された６週齢の雄ＮＰＧＴＭマウスの乳腺脂肪パッドにマトリゲルと１×１０６ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞の１：１混合物を接種し、腫瘍細胞の接種後、腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に到逹したとき、ｆｒｅｅ Ａｌｅｘａ６８０又はＡＧＭ－３３０－Ａｌｅｘａ６８０を尾静脈に注射した。図１１Ｇ及び図１１Ｈは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ担腫瘍（ｔｕｍｏｒ－ｂｅａｒｉｎｇ）マウスで１０ｎｍｏｌのｆｒｅｅ Ａｌｅｘａ６８０（図１１Ｇ）又は１０ｎｍｏｌのＡＧＭ－３３０－Ａｌｅｘａ６８０（図１１Ｈ）の静脈注射後、３０分、１時間、６時間及び２４時間のｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージを示した図であって、心臓、脾臓、肺、脳、肝、腎臓及び腫瘍を含む主要器官の蛍光イメージは、相違する処理でマウスから除去され、ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣは、ＦＩＴＣ－接合ＡＧＭ－３３０である。図１１Ｉ及び図１１Ｊは、腫瘍（図１１Ｉ）及び他の器官（図１１Ｊ）で３匹の動物のライブイメージングからＡｌｅｘａ６８０－連関蛍光の平均輻射効率を示したグラフであって、棒グラフは平均±ＳＤを示し、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）で統計分析を行った。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【図12】図１２は、膜及び細胞質抽出物でＮＣＬ発現を確認した結果である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を非－標的スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ）又はＮＣＬ標的ｓｉＮＣＬ１、ｓｉＮＣＬ２又はｓｉＮＣＬ３で形質感染させ、２４時間後、遺伝子沈黙効率は、リアルタイムＰＣＲによって決定された。ｍＲＮＡレベルに基づいたとき、ｓｉＮＣＬ１は、標的遺伝子ノックダウンで著しい効率を示したので、追加実験のために選択された。棒グラフは平均±ＳＤを示し、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）で統計分析を行った。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【図13】図１３は、乳癌及び結腸直腸癌でのＮＣＬの発現プロファイル及び機能的研究結果を示した図である。 図１３Ａは、Ｃｕｒｔｉｓデータセット及びＡｌｏｎデータセットで観察された腫瘍発生乳癌腫又は結腸直腸腺癌腫の患者とＮＣＬ ｍＲＮＡ発現レベルとの間の有意な相関関係を示した図であって、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータリポジトリ（ｄａｔａｓｅｔ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）を用いた。図１３Ｂは、２個の独立的なコホート（ｃｏｈｏｒｔｓ）（Ｂｅｒｔｕｃｃｉ ａｎｄ Ｓｖｅｅｎ）でＮＣＬ発現に基づいた乳癌及び結腸直腸癌の患者で行われたカプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）生存分析結果である。図１３Ｃ及び図１３Ｄは、正常組織（図１３Ｃ）及び癌組織（図１３Ｄ）でのＮＣＬに対する免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）分析結果であって、スケールバーは１００μｍである。図１３Ｅ－図１３Ｈは、癌細胞及び正常細胞を２４時間にわたって無血清培地で指示された量の抗－ＮＣＬ抗体又はＩｇＧで処理した後の細胞生存力を示した結果であって、ＭＣＦ－１０Ａ（図１３Ｅ）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図１３Ｆ）、ＣＣＤ－１８Ｃｏ（図１３Ｇ）及びＨＣＴ－１１６（図１３Ｈ）の細胞生存力をＷＳＴ分析で測定し、死滅細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）は、アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ＋細胞を染色することによって可視化された。細胞を抗－ＮＣＬ抗体で中和させ、２４時間にわたって無血清培地で培養し、死滅細胞は、ＦＡＣＳ分析によって測定された（図１３Ｉ）。棒グラフは平均±ＳＤを示し、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）で統計分析を行った。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【図14】図１４は、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍抑制効能を示した図である。 図１４Ａは、多数の乳癌及び結腸直腸癌細胞と正常細胞でＷＳＴ検定によって４８時間にわたって決定された、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ処理による増殖抑制結果を示した図である。図１４Ｂは、実験プロトコルの模式図であって、麻酔された６週齢の雄ＮＰＧマウスの乳腺脂肪パッドにマトリゲルと１×１０６ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞の１：１混合物を接種し、原発性腫瘍（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ）の体積が約１００ｍｍ３に到逹すると、腫瘍－保有マウスをビヒクル（ＰＢＳ）、ＡＧＭ－３３０ｔ（１６．６８ｍｇ／ｋｇ）、ＰＴＸ（それぞれ２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ（１９．０５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６／グループ）で処理した。図１４Ｃ－図１４Ｅは、乳癌異種移植モデルで評価されたＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ処理効果を示した結果であって、図１４Ｃは、犠牲日まで週に２回測定された原発性腫瘍の体積を示した図で、体積（ｍｍ３）＝（長さ（ｍｍ））×（幅（ｍｍ））２×０．５の計算式によって計算された。図１４Ｄは、犠牲当日、全ての原発性腫瘍を分離したことを示した図で、図１４Ｅは、原発性腫瘍の重量を評価した結果である。図１４Ｆ－図１４Ｉは、Ｋｉ－６７（図１４Ｆ、図１４Ｈ）及びＴＵＮＥＬ（図１４Ｇ、図１４Ｉ）染色を用いた代表的な腫瘍の免疫組織化学セクションを示した図であって、核は、ＤＡＰＩ（ｂｌｕｅ）で染色され、スケールバーは５０μｍである。棒グラフは平均±ＳＤを示し、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）で統計分析を行った。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【図15】図１５は、ＡＧＭ－３３０ｔの癌特異性によるＰＴＸの効能向上を確認した結果である。心臓穿孔によるイソフルラン誘導深麻酔下で異種移植されたマウスから血液を収集し、４℃での血液凝固を許容した後、４℃で１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離することによって血清を収集した。血清でのＡＬＢ（図１５Ａ）、ＧＯＴ（図１５Ｂ）、ＧＰＴ（図１５Ｃ）、ＴＰ－ＰＳ（図１５Ｄ）及びＵＡ（図１５Ｅ）レベルの分析は、製造社のプロトコルによって獣医血液学アナライザー（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｆｕｊｉ ＤＲＩ－Ｃｈｅｍ ３５００ ｓ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して行われた。ＡＬＢ：アルブミン；ＧＯＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＧＴＰ：グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ；ＴＰ－ＰＳ：総タンパク質／タンパク質スキャン；ＵＡ：尿酸。図１５Ｆは、３週間の相違する処理後、異種移植マウスの体重変化を示した図である。棒グラフは平均±ＳＤを示し、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）で統計分析を行った。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【図16】図１６は、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸを用いた抗癌効果確認結果であって、図１６Ａは、ＰＴＸ接合ＡＧＭ－３３０ｄの構造を示した図である。図１６Ｂは、実験プロトコルの模式図であって、麻酔された６週齢の雄ＮＰＧマウスの乳腺脂肪パッドにマトリゲルと１×１０６ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞の１：１混合物を接種し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞腫瘍を有するマウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）、ＡＧＭ－３３０ｄ（８．３４ｍｇ／ｋｇ）、ＰＴＸ（それぞれ２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ（１０．７１ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６／グループ）で処理された。図１６Ｃ及び図１６Ｄは、全身生物発光イメージング（ｗｈｏｌｅ－ｂｏｄｙ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を通じた腫瘍成長モニタリング結果であって、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現する増殖（ｇｒｏｗｉｎｇ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をマウスの乳腺脂肪パッドに注射した。ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸの治療効果は、生物発光イメージング（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）によって評価され（図１６Ｃ）、５個の相違するマウスグループで５日ごとの生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）強度を示した（図１６Ｄ）。図１６Ｅ－図１６Ｇは、乳癌異種移植モデルにおいてＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ処理の治療効果を評価した結果であって、犠牲当日、全ての原発性腫瘍を分離し、体積を評価しており（図１６Ｅ－図１６Ｆ）、原発性腫瘍の重量は、犠牲日まで週に２回測定された（図１６Ｇ）。原発性腫瘍の体積は、次の公式で計算された：体積（ｍｍ３）＝（長さ（ｍｍ））×（幅（ｍｍ））２×０．５。図１６Ｈは、異種移植マウスで指示された３週間の相違する処理後の体重変化を示したグラフである。棒グラフは平均±ＳＤを示し、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ） で統計分析を行い、＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
別の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
【0010】
本発明の一観点では、
（ａ）配列番号１乃至配列番号８のうちいずれか一つで表されるアミノ酸配列；及び
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン残基の置換；
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン残基の置換；及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン又はリシン残基の挿入；
で構成された群から選ばれる一つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列；
で構成された群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とするヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）に特異的に結合するペプチドに関する。
（ａ）配列番号１乃至配列番号８のうちいずれか一つで表されるアミノ酸配列；及び
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン残基の置換；
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン残基の置換；及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン又はリシン残基の挿入；
で構成された群から選ばれる一つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列；
で構成された群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とするヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）に特異的に結合するペプチドに関する。
【0011】
機能的且つ具体的に腫瘍を標的とし得るペプチドリガンドの発見は、癌の診断及び治療に新しい機会を提供する。しかし、ペプチドリガンドの使用は、それらの短い生物学的半減期のために大きく制限されてきた。
【0012】
本発明では、多重－抗原－ペプチド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｅｐｔｉｄｅ；ＭＡＰ）合成方法と共に、ＯＢＯＣ（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）組み合わせ方法を使用して２，６００，０００個のペプチドライブラリを合成した後、これから表１に記載のアミノ酸配列を有する新しい癌－特異的ペプチドリガンドであるＡＧＭ－３３０、ＡＧＭ－３３１、ＡＧＭ－３３２、ＡＧＭ－３３３、ＡＧＭ－３３４、ＡＧＭ－３３５、ＡＧＭ－３３６、ＡＧＭ－３３７を同定し（図３参照）、細胞結合分析、フローサイトメトリー及び蛍光共焦点顕微鏡を用いて試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で前記各ペプチドリガンドが癌細胞に特異的に結合することを確認した。
【0013】
また、プルダウン分析及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を通じて、膜ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）がＡＧＭ－３３０、ＡＧＭ－３３１、ＡＧＭ－３３２、ＡＧＭ－３３３、ＡＧＭ－３３４、ＡＧＭ－３３５、ＡＧＭ－３３６、ＡＧＭ－３３７の標的タンパク質であることを確認し、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；ＰＴＸ）と前記ＡＧＭ－３３０などの接合体を処理する場合、ＰＴＸ単独処理に比べて癌の成長を劇的に抑制させることを確認した。
【表1】
【0014】
前記８個のペプチドのうち３個（ＡＧＭ－３３０、ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２）は、乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対して強く且つ特異的であり、優先的な結合を示しており、ヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ－１０Ａ）には結合しないか、弱く結合した（図４Ａ及び図４Ｂ参照）。
【0015】
また、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡＧＭ－３３０において一部のアミノ酸残基の変異を有する場合にも、依然として、ヌクレオリンに対する強く且つ特異的な結合特性を維持することを確認した。
【0016】
具体的には、本発明において、前記アミノ酸変異は、配列番号１のアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン残基の置換；
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン残基の置換；及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン又はリシン残基の挿入；
で構成された群から選ばれた一つ以上の変異であり得るが、これに限定されない。
好ましくは、前記アミノ酸変異は、配列番号１のアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）残基のロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）又はノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）への置換；
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）への置換；及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）及びリシン残基の挿入；
で構成された群から選ばれた一つ以上の変異であり得るが、これに限定されない。
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン残基の置換；
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン残基の置換；及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン又はリシン残基の挿入；
で構成された群から選ばれた一つ以上の変異であり得るが、これに限定されない。
好ましくは、前記アミノ酸変異は、配列番号１のアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｎ－末端から５番目のメチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）残基のロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）又はノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）への置換；
（ｉｉ）Ｎ－末端から７番目のチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）への置換；及び
（ｉｉｉ）Ｃ－末端へのロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）及びリシン残基の挿入；
で構成された群から選ばれた一つ以上の変異であり得るが、これに限定されない。
【0017】
本発明において、前記変異を含むアミノ酸配列は、配列番号９乃至配列番号１５及び配列番号２０で構成された群から選ばれることを特徴とすることができるが、これに制限されない（表２）。
【表2】
【0018】
前記配列番号１３のアミノ酸配列において、「Ｎｌｅ」は、ノルロイシンを意味する。
【0019】
本発明において、「ＡＧＭ」、「ＡＧＭペプチド」又は「ＡＧＭペプチドリガンド」は、前記配列番号１乃至配列番号２０で構成された群から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチドを通称したり、そのうち一つ以上のペプチドを意味する。
【0020】
本発明において、前記ＡＧＭペプチドは、ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ；ＮＣＬ）に特異的に結合することを特徴とすることができる。
【0021】
以前の研究によると、ＮＣＬは、主に正常細胞の核に局部的に存在するにもかかわらず、相違する類型の癌細胞で膜ＮＣＬの強い過剰発現を示した（Ｓｈｅｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４；５：５４９４－５０９）。これらの研究と共に、本発明では、ＮＣＬが活発に増殖する癌細胞の膜では過剰発現されるが、正常細胞では過剰発現されないことを立証した。したがって、ＮＣＬを標的とする分子は、副作用を最小化しながら薬物を腫瘍に選択的に伝達するための効果的な接近法を提供することができる（Ｌｉ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８：１３９０）。また、本発明では、特定の抗体への中和を通じて癌細胞に対する膜ＮＣＬの役割を立証した。予想通り、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）速度が増加した後、抗体－媒介ＮＣＬ中和が続いた（図１３Ｊ）。結論的に、ＮＣＬは、癌治療のための理想的な治療的マーカーであり、ＮＣＬ－標的ＡＧＭ－３３０は、広範囲なヒト癌の診断及び治療のための道具として大きな潜在力を有している。
【0022】
本発明の一実施例において、ＡＧＭペプチド、具体的にＡＧＭ－３３０は、癌細胞に特異的に結合するが、正常乳房及び結腸直腸細胞には弱く結合されたり、又は全く結合されなかった。このような結果は、ＡＧＭペプチドが癌に特異的であることを示唆し、癌－標的化ペプチドの開発のための主要候補になるようにする。特に、マウス異種移植研究において、ＡＧＭペプチド処理は、心臓、脾臓、肺又は脳より腫瘍でさらに多くの蓄積を示した。癌細胞に対するＡＧＭペプチドの特異的標的化能力は、癌診断のための潜在的な分子道具になり得ることを意味する。
【0023】
また、本発明は、前記ＡＧＭペプチドと、－[ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ]－の構造を有するエチレングリコール基（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｇｒｏｕｐ）を２個以上含むポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）鎖とが接合されたＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体に関する。
【0024】
本発明において、ポリエチレングリコール鎖は、化学式１の構造を有する一般的なポリエチレングリコール鎖のみならず、その誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を全て含む概念で使用され、ポリエチレングリコール鎖の誘導体としては、化学式２の構造を有するアミノポリエチレングリコールカルボン酸（ａｍｉｎｏ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）が例示され得るが、これに限定されない。
【化1】
【0025】
ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）とのコンジュゲーション（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、治療用タンパク質の薬理学的特性を改善するために広く使用されてきた（Ｇｕｐｔａ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ．２０１９；１３：３１９－３０）。本発明において、立体障害を減少させ、親水性を増加させるためにＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）を使用した。しかし、ＰＥＧは、免疫原性のため、治療分子に否定的な臨床的影響を及ぼす（Ｍｏｒｅｎｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１９；２６：６３４－４４．ｅ３）。以前の研究は、ＰＥＧ化された分子に対する抗－ＰＥＧ免疫反応がＰＥＧ化の程度の免疫原性及びＰＥＧの分子量に依存することを提案した（Ｗａｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１７；５２：１８３－９１）。
【0026】
本発明において、前記ポリエチレングリコール鎖は、２個乃至２４個のエチレングリコール単位を有することを特徴とすることができ、好ましくは４個乃至２０個、さらに好ましくは６個乃至１８個、最も好ましくは６個乃至１２個のエチレングリコール単位を有することを特徴とすることができるが、これに限定されない。
【0027】
前記ポリエチレングリコール鎖は、ＡＧＭペプチドとリンカーを介して連結されることを特徴とすることができる。これによって、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体は、次の構造式１の形態を有し得るが、これに制限されない。
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ（構造式１）
前記構造式１において、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール鎖を意味し、Ｌ１は、リンカーを意味する。
前記リンカーＬ１は、好ましくは単一結合（直接結合）、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、－Ｓ－、－ＮＨ－及び－Ｏ－で構成された群から選ばれ得るが、これに限定さなく、ＡＧＭペプチドのＣ－末端アミノ酸のカルボキシ基と共に、－ＣＯＮＨ－の形態をなすペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）を含み得るが、これに限定されない。
また、前記構造式１のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体のうちＡＧＭと結合しているＰＥＧに、他側末端には他の物質、好ましくは薬物（ｄｒｕｇ）を接合させるための官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）が導入され得る。このような官能基には、カルボキシル（ＣＯＯＨ）、アミン（ＮＨ２）及びチオール（ｔｈｉｏｌ）基などが例示され得るが、これに限定されない。
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ（構造式１）
前記構造式１において、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール鎖を意味し、Ｌ１は、リンカーを意味する。
前記リンカーＬ１は、好ましくは単一結合（直接結合）、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、－Ｓ－、－ＮＨ－及び－Ｏ－で構成された群から選ばれ得るが、これに限定さなく、ＡＧＭペプチドのＣ－末端アミノ酸のカルボキシ基と共に、－ＣＯＮＨ－の形態をなすペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）を含み得るが、これに限定されない。
また、前記構造式１のＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体のうちＡＧＭと結合しているＰＥＧに、他側末端には他の物質、好ましくは薬物（ｄｒｕｇ）を接合させるための官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）が導入され得る。このような官能基には、カルボキシル（ＣＯＯＨ）、アミン（ＮＨ２）及びチオール（ｔｈｉｏｌ）基などが例示され得るが、これに限定されない。
【0028】
例示的に、構造式２乃至構造式４のように、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体のうちＡＧＭペプチドと結合しているＰＥＧの他側末端にアミン（ＮＨ２）を有するリシン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）及び／又はチオール基を有するシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃ）が接合された形態であり得るが、これに限定されない。
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｋ（構造式２）
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｃ（構造式３）
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｋ－Ｃ（構造式４）
例示的に、本発明の一実施例において、ＡＧＭペプチドのうちＡＧＭ－３００とＰＥＧの接合体であるＡＧＭ－３３０－ＰＥＧ接合体のＡＧＭと結合しているＰＥＧの他側末端にリシン及びシステインが導入されたＡＧＭ－３３０単量体（ＡＧＭｍ）は、構造式５のような形態であり得る。
ＲＨＧＡＭＶＹＬＫ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｋ－Ｃ（構造式５）
前記構造式５において、ＰＥＧは、Ｃ末端のリシン（Ｋ）のカルボキシ基とアミンとの縮合反応を通じて構造式６のような形態のペプチド結合を含むリンカー（Ｌ１）によってＡＧＭ－３３０のＣ末端に連結された形態であり得るが、これに限定されない。
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｋ（構造式２）
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｃ（構造式３）
ＡＧＭ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｋ－Ｃ（構造式４）
例示的に、本発明の一実施例において、ＡＧＭペプチドのうちＡＧＭ－３００とＰＥＧの接合体であるＡＧＭ－３３０－ＰＥＧ接合体のＡＧＭと結合しているＰＥＧの他側末端にリシン及びシステインが導入されたＡＧＭ－３３０単量体（ＡＧＭｍ）は、構造式５のような形態であり得る。
ＲＨＧＡＭＶＹＬＫ－Ｌ１－ＰＥＧ－Ｋ－Ｃ（構造式５）
前記構造式５において、ＰＥＧは、Ｃ末端のリシン（Ｋ）のカルボキシ基とアミンとの縮合反応を通じて構造式６のような形態のペプチド結合を含むリンカー（Ｌ１）によってＡＧＭ－３３０のＣ末端に連結された形態であり得るが、これに限定されない。
【化2】
【0029】
本発明は、他の観点において、前記ＡＧＭペプチド又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体及び薬物を含むＡＧＭペプチド－薬物接合体又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体に関する。
【0030】
本発明において、前記薬物は、薬理学的効果を示す製剤であって、具体的には、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は放射性同位元素であり得る。前記化学療法剤は、例えば、細胞毒性製剤又は免疫抑制剤であり得る。具体的には、前記化学療法剤は、マイクロチューブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、又はＤＮＡインターカレーターとして機能し得る化学療法剤を含むことができ、また、免疫調節化合物、抗癌剤及び抗ウイルス剤、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【0031】
好ましくは、前記薬物は、抗癌剤（ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ）であってもよく、前記抗癌剤は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）又はドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）などのタキソール（ｔａｘｏｌ）及びタキサン、マイタンシノイド、アウリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルハイドラザイド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、α－アマニチン、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ピロロベンゾジアゼピン、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシン Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロレリン酢酸塩（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルベリン、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、クルクミン、アブラキサン、フォルフィリノックス、オキサリプラチン、ゼローダ及びインドールカルボキサミド、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、チューブリシン、減作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、タラミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素、及び細菌や動植物由来の毒素からなる群から選ばれた一つ以上であることを特徴とすることができるが、これに制限されない。
【0032】
本発明の一実施例において、ヒト乳癌異種移植マウスモデルでＡＧＭ－３３０－ＰＴＸ（ＡＧＭ－３３０－ＰＥＧ接合体とパクリタキセル（ＰＴＸ）とを接合させた接合体）を処理した場合、ＰＴＸ－処理群と比較して腫瘍の体積及び重量の６０％及び４６％の減少を示した（図１４Ｃ乃至図１４Ｅ参照）。癌細胞及び組織に対するＡＧＭ－３３０の効率的な標的化能力は、癌治療のための抗癌剤伝達において有望な方法を提供する。
【0033】
パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；ＰＴＸ）は、最も有望な癌化学療法薬物のうち一つと見なされ、多くの相違するヒト悪性腫瘍に対してテストされた（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ Ｓ，Ｂｅｌａｎｉ ＣＰ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２００４；５：１７７１－８０）。しかし、ＰＴＸで治療する際には、ＰＴＸの高い疎水性及びその剤形と関連した困難さによって制限がある。また、ＰＴＸ治療と関連した多くの副作用は、製剤化に使用される希釈溶媒に起因する（Ｈｅｎｎｅｎｆｅｎｔ ＫＬ，Ｇｏｖｉｎｄａｎ Ｒ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２００６；１７：７３５－４９）。しかし、ＰＴＸと異なり、ＡＧＭペプチド、特に、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体と接合されたＰＴＸは、非常に親水性である特性を示す。このような親水性は、薬物動力学的プロファイルを改善させ、少量の毒性希釈バッファーの使用を可能にし、化学療法の一般的な毒性をさらに減少させることができる。ＡＧＭペプチドを用いて標的化された伝達を通じて、毒性などの副作用を減少できるだけでなく、治療効果を著しく改善できるという長所がある。
【0034】
本発明において、前記ＡＧＭペプチド又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体は、薬物、好ましくは抗癌剤とリンカー（Ｌｄ）を介して連結されたり、又は直接連結されることを特徴とすることができる。
【0035】
前記リンカー（Ｌｄ）は切断性（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）であり得る。前記切断性リンカー（Ｌｄ）は、細胞内の条件で切断可能な形態、すなわち、細胞内の環境で抗体から薬物がリンカーの切断を通じて放出できるようにする。
【0036】
前記リンカー（Ｌｄ）は、細胞内の環境、例えば、リソソーム又はエンドソームに存在する切断剤によって切断されてもよく、例えば、細胞内のペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼによって切断され得るペプチドリンカーであってもよい。一般に、ペプチドリンカーは、少なくとも２個以上のアミノ酸の長さを有する。前記切断剤は、カテプシンＢ、カテプシンＤ、及びプラスミンを含むことができ、ペプチドを加水分解し、薬物を標的細胞内に放出できるようにする。
【0037】
前記ペプチドリンカーは、チオール依存性プロテアーゼカテプシン－Ｂによって切断されてもよく、これは、癌組織で過剰発現され、例えば、Ｐｈｅ－Ｌｅｕ又はＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙリンカーであってもよい。また、前記ペプチドリンカーは、例えば、細胞内のプロテアーゼによって切断され得るものであって、Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカー又はＰｈｅ－Ｌｙｓリンカーであり得る。
【0038】
一つの実施例において、前記切断性リンカーはｐＨ敏感性であって、特定のｐＨ値で加水分解に敏感になり得る。一般に、ｐＨ敏感性リンカーは、酸性条件で加水分解され得ることを示す。例えば、リソソームで加水分解され得る酸性不安定リンカーは、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シース－アコニットアミド（ｃｉｓ－ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、ケタールなどであり得る。
【0039】
他の実施例において、前記リンカーは、還元条件で切断されてもよく、例えば、二硫化リンカーがこれに該当し得る。ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオ酢酸）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）酪酸）及びＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）を使用して多様な二硫化結合が形成され得る。
【0040】
また、前記リンカーは、例えば、非切断性リンカーであってもよく、抗体加水分解段階のみを通じて薬物が放出され、例えば、アミノ酸－リンカー－薬物接合体を生産する。このような類型のリンカーは、チオエーテル基又はマレイミドカプロイル基（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）であってもよく、これによって血液内の安定性を維持することができる。
【0041】
場合によって、前記ＡＧＭペプチド、又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧの接合体は、薬物、好ましくは、抗癌剤と非共有性結合又は共有性結合を通じて直接連結されることを特徴とすることができるが、これに制限されない。
【0042】
前記非共有性結合は、例えば、水素結合、静電気的相互作用、疎水性相互作用、バンデルバルス相互作用、π－π相互作用及びカチオン－π相互作用からなる群から選ばれた１種以上であり得る。
【0043】
本発明は、他の観点において、前記ＡＧＭペプチド、又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体を２個以上含む多量体に関する。
【0044】
本発明において、前記多量体は、２個乃至８個のＡＧＭペプチド、又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体を含むことができ、好ましくは２個乃至６個、さらに好ましくは２個乃至４個のＡＧＭペプチド、又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体を含むことを特徴とすることができるが、これに制限されない。
【0045】
例示的に、本発明において、前記多量体のうち二量体（ｄｉｍｅｒ）は、２個のＡＧＭペプチド、又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体がリンカー（Ｌ２）によって互いに連結されることを特徴とすることができ、多量体のうち四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）は、前記二量体が追加的なリンカー（Ｌ３）によって互いに連結されることを特徴とすることができるが、これに制限されない。さらに、六量体（ｈｅｘａｍｅｒ）や八量体（ｏｃｔａｍｅｒ）、及びそれ以上の多量体も類似する形態で連結され得ることは、通常の技術者にとって自明である。
【0046】
例示的に、本発明に係るＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体の二量体及び四量体は、構造式７及び構造式８のような形態を有し得るが、これに限定されない。
【化3】
【化4】
【0047】
前記リンカーＬ２及びＬ３は、互いに同一又は異なってもよく、独立的に切断性（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）又は非切断性（ｎｏｎ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ）であってもよい。
【0048】
前記リンカーＬ２及びＬ３は、独立的に単一結合（直接結合）、アミノ酸又はその誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、－Ｓ－、－ＮＨ－及び－Ｏ－で構成された群から選ばれ得るが、これに限定されなく、好ましくは、アミノ酸又はその誘導体、さらに好ましくは、２以上のアミン基を有するリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）又はアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）であり得るが、これに限定されない。
【0049】
最も好ましくは、前記リンカーＬ２及びＬ３としてリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）が使用されてもよく、前記リシンのアミングループ（ＮＨ２）が－Ｃ－ＣＯＮＨ－などのペプチド結合と類似する形態でＰＥＧと連結され得るが、これに限定されない。
【0050】
また、前記ＡＧＭペプチド、又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体のリンカーの一末端には、他の物質、好ましくは薬物を接合させるための官能基が導入され得る。例えば、前記構造式７でのＬ２、構造式８でのＬ３に薬物を接合させるための官能基が導入され得る。
【0051】
このような官能基には、アミン（ＮＨ２）及びチオール（ｔｈｉｏｌ）基などが例示され得るが、これに限定されなく、例示的に、アミン（ＮＨ２）を有するリシン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）及び／又はチオール基を有するシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃ）が導入された形態であり得るが、これに限定されない。
【0052】
例示的に、本発明の一実施例において、ＡＧＭ－３３０二量体（ＡＧＭ－３３０ｄ）及びＡＧＭ－３３０四量体（ＡＧＭ－３３０ｔ）は、下記の表３のような構造を有し得るが、これに限定されない。
【表3】
【0053】
本発明の一実施例において、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸを使用して抗癌効能を試験した（図１６Ａ）。その結果、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ－処理マウスは、ＰＴＸ－処理マウスと比較してルシフェラーゼ活性の劇的な減少を示した（図１６Ｃ－Ｄ）。また、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ処理は、ＰＴＸ－処理群と比較して、腫瘍の体積及び重量が著しく減少した（図１６Ｅ－Ｇ）。ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸと同様に、マウスの体重は、ビヒクル（ＰＢＳ）投与と比較して、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ投与によって影響を受けなかった（図１６Ｈ）。ＡＧＭ－３３０ｄの癌特異性は、ＰＴＸの効能を向上させ、腫瘍組織で治療薬物の濃度を増加させることができる。
【0054】
本発明は、更に他の観点において、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体を２個以上含む多量体と薬物、好ましくは抗癌剤を含む多量体－薬物接合体に関する。
【0055】
本発明において、多量体－薬物接合体には、ＡＧＭペプチド－薬物接合体又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体に関する説明が準用されてもよく、これによって、各リンカーや薬物などは、上述したＡＧＭペプチド－薬物接合体又はＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体での定義と同一に解釈される。
【0056】
本発明は、更に他の観点において、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体と細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合されたＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチドに関する。
【0057】
本発明において、用語「細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）」は、一種の信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）であって、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの高分子物質を細胞内に伝達しようとする目的で使用される特定のアミノ酸配列の組み合わせであるペプチドである。現在まで、多様な低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの高分子物質の細胞内伝達のために用いられている。細胞透過性ペプチドは、ほとんどがタンパク質－透過ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）や膜－移動シーケンス（ｍｅｍｂｒａｎｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から誘導されており、一般的な外部物質の細胞内流入経路とは異なり、細胞膜に損傷を与えない状態で細胞内に移動し、細胞膜を通過できないものとして知られているＤＮＡやタンパク質も細胞内に伝達できる画期的な役割をするものとして期待されている。
【0058】
本発明の融合ペプチドとしては、細胞透過性ペプチドを用いており、前記細胞透過性ペプチドは、細胞内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）メカニズムによって細胞内に入り込む特徴を有しているものであれば特に制限されないが、好ましくは、下記の表４に羅列された細胞透過性ペプチド又はその変異体で構成された群から選んで使用することができる。
【表4】
【0059】
さらに好ましくは、前記細胞透過性ペプチドは、下記の表５に羅列された細胞透過性ペプチド又はその変異体で構成された群から選ばれることを特徴とすることができ、下記の表５のペプチドの製造及び特性は、韓国登録特許第１０－１１６９０３０号を参照することができる。最も好ましくは、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むことを特徴とすることができる。
【表5-1】
【表5-2】
【0060】
本発明の一実施例では、前記表５のＤＳ４－３ペプチドで表された配列番号４８の細胞透過性ペプチドを選択して実験を行っており、前記実際に使用した細胞透過性ペプチド以外の他の細胞透過性ペプチドを本発明のペプチドと融合させた場合にも、本発明と類似する効果が表れることは当業者にとって自明であろう。
【0061】
本発明において、前記ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体と細胞透過性ペプチドは、リンカーを介して連結されることを特徴とすることができる。好ましくは、マレイミド－カルボキシ二官能性リンカー（ｃａｒｂｏｘｙ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結されることを特徴とすることができるが、これに制限されない。
【0062】
本発明は、更に他の観点において、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体を２個以上含む多量体と細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）とが結合された多量体－ＣＰＰ融合ペプチドに関する。
【0063】
本発明において、多量体－ＣＰＰ融合ペプチドには、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチドに関する説明が準用されてもよく、これによって各リンカーや細胞透過性ペプチドなどは、上述したＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチドでの定義と同一に解釈される。
【0064】
本発明は、更に他の観点において、前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを含む癌診断用組成物に関する。
【0065】
本発明は、更に他の観点において、前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを用いた癌診断方法に関する。
【0066】
本発明は、更に他の観点において、癌診断のための前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドの用途に関する。
【0067】
本発明は、更に他の観点において、癌診断用薬剤の製造のための前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドの使用に関する。
【0068】
本発明の診断用組成物を用いて発病の有無又は発病可能性を予測できる癌は、白血病、骨髓増殖性疾患、リンパ種、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、胃腺癌、子宮癌、膀胱癌、甲状腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、造血癌、腎臓癌及び頭頸部癌などであり得るが、これに制限されない。
【0069】
本明細書において、用語「診断」は、特定の疾病又は疾患に対する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、対象が特定の疾病又は疾患を現在有しているのか否かを判定すること、特定の疾病又は疾患にかかった対象の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）（例えば、前－転移性又は転移性癌状態の同定、癌の段階決定又は治療に対する癌の反応性決定）を判定すること、又は、テラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に対する情報を提供するために客体の状態をモニタリングすること）を含む。本発明の目的上、前記診断は、上記の疾患の発病有無又は発病可能性（危険性）を確認することである。
【0070】
本発明は、更に他の観点において、前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを含む癌予防又は治療用組成物に関する。
【0071】
本発明は、更に他の観点において、前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを対象体に投与する段階を含む癌予防又は治療方法に関する。
【0072】
本発明は、更に他の観点において、癌予防又は治療のための前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドの用途に関する。
【0073】
本発明は、更に他の観点において、癌予防又は治療用薬剤の製造のための前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドの使用に関する。
【0074】
本発明の組成物で治療できる癌又は癌腫は、特に制限されなく、固形癌及び白血病などのヌクレオリンと関連した癌であり得る。このような癌の例は、白血病、骨髓増殖性疾患、リンパ種、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、胃腺癌、子宮癌、膀胱癌、甲状腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、造血癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ）、腎臓癌又は頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒｓ）などであり得るが、これに制限されない。
【0075】
本発明において、「癌」と「腫瘍」は、同一の意味で使用されており、典型的に調節されていない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を称したり意味する。
【0076】
本発明において、用語「予防」は、前記ペプチド又は接合体を含む組成物の投与で癌を抑制又は遅延させる全ての行為を意味する。また、用語「治療」は、前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを含む組成物の投与で癌の症状が好転又は完治する全ての行為を意味する。
【0077】
本発明に係る癌予防又は治療用組成物は、薬学的に有効な量の前記ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドを単独で含んだり、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができる。上記で薬学的に有効な量は、癌の症状を予防、改善及び治療するのに十分な量を言う。
【0078】
前記「薬学的に許容される」は、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常、胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応又はこれと類似する反応を起こさないことを意味する。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウムカルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。また、前記組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含むことができる。適切な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【0079】
また、本発明の組成物は、ＡＧＭペプチド、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－薬物接合体、多量体、多量体－薬物接合体、ＡＧＭペプチド－ＰＥＧ－ＣＰＰ融合ペプチド又は多量体－ＣＰＰ融合ペプチドと共に、癌治療効果を有する公知の有効成分を１種以上含むことができる。
【0080】
本発明の組成物は、ヒトを除外した哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続又は遅延された放出を提供できるように当業界に公知となった方法を使用して剤形化され得る。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質又は硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であり得る。
【0081】
本発明の組成物は、経口、経皮、皮下、静脈又は筋肉を含む多くの経路を介して投与することができ、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度などの多くの因子によって適宜選択され得る。また、本発明に係る癌予防又は治療用組成物は、癌の症状を予防、改善又は治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。
【実施例】
【0082】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0083】
実施例１：材料及び方法
実施例１－１：ＯＢＯＣライブラリ合成
ＯＢＯＣライブラリを固相（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ）ＴｅｎｔａＧｅｌ ＭＢ ＮＨ２レジン（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。「ｓｐｌｉｔ－ｍｉｘ」合成方法を行い、それぞれ数百万個のビード／リガンドのランダムライブラリを含有する組み合わせＯＢＯＣライブラリを構築した。約２，６００，０００個のＯＢＯＣライブラリを合成するために、５ｇのＴｅｎｔａｇｅｌ ＭＢ ＮＨ２レジン（２００μｍ、５２０，０００ｂｅａｄｓ／ｇ）が使用された。ビードの表面上のリガンドは、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ケミストリー及びＮ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）／Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）カップリングを用いた標準固相ペプチド合成技術によって合成された。カップリングの完了は、ニンヒドリン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）テストで確認した。ビードは、使用前まで４℃で７０％のエタノールに貯蔵された。
実施例１－１：ＯＢＯＣライブラリ合成
ＯＢＯＣライブラリを固相（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ）ＴｅｎｔａＧｅｌ ＭＢ ＮＨ２レジン（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。「ｓｐｌｉｔ－ｍｉｘ」合成方法を行い、それぞれ数百万個のビード／リガンドのランダムライブラリを含有する組み合わせＯＢＯＣライブラリを構築した。約２，６００，０００個のＯＢＯＣライブラリを合成するために、５ｇのＴｅｎｔａｇｅｌ ＭＢ ＮＨ２レジン（２００μｍ、５２０，０００ｂｅａｄｓ／ｇ）が使用された。ビードの表面上のリガンドは、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ケミストリー及びＮ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）／Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）カップリングを用いた標準固相ペプチド合成技術によって合成された。カップリングの完了は、ニンヒドリン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）テストで確認した。ビードは、使用前まで４℃で７０％のエタノールに貯蔵された。
【0084】
実施例１－２：倫理及び細胞培養
ヒト組織と関連した全ての研究は、光州科学技術院（Ｇｗａｎｇｊｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の研究倫理審議委員会（ＩＲＢ）によって事前に承認された（＃２０１９１００８－ＢＲ－４８－０３－０２）。全ての動物実験は、光州科学技術院の実験動物運営委員会（ＩＡＣＵＣ）の指針に従って行われた（ＧＩＳＴ－２０１９－０４０）。全ての培養物を９５％エア／５％ＣＯ２と共に、３７℃で維持される加湿インキュベーターで成長させた。正常ヒト乳房細胞株ＭＣＦ－１０Ａは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、ＢＰＥ（ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が補充されたＭＥＧＭ完全成長培地（ＭＥＧＭ、Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に増殖させた。正常ヒト結腸直腸細胞株ＣＣＤ－１８Ｃｏは、韓国細胞株銀行（Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で入手した。ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６を含むヒト乳癌及び結腸直腸癌細胞株は、韓国細胞株銀行で入手した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞も韓国細胞株銀行で入手した。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）－発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞株は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。それぞれの癌細胞株は、１０％加熱不活性化（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）及びＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で成長させた。
ヒト組織と関連した全ての研究は、光州科学技術院（Ｇｗａｎｇｊｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の研究倫理審議委員会（ＩＲＢ）によって事前に承認された（＃２０１９１００８－ＢＲ－４８－０３－０２）。全ての動物実験は、光州科学技術院の実験動物運営委員会（ＩＡＣＵＣ）の指針に従って行われた（ＧＩＳＴ－２０１９－０４０）。全ての培養物を９５％エア／５％ＣＯ２と共に、３７℃で維持される加湿インキュベーターで成長させた。正常ヒト乳房細胞株ＭＣＦ－１０Ａは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、ＢＰＥ（ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が補充されたＭＥＧＭ完全成長培地（ＭＥＧＭ、Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に増殖させた。正常ヒト結腸直腸細胞株ＣＣＤ－１８Ｃｏは、韓国細胞株銀行（Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で入手した。ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６を含むヒト乳癌及び結腸直腸癌細胞株は、韓国細胞株銀行で入手した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞も韓国細胞株銀行で入手した。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）－発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞株は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。それぞれの癌細胞株は、１０％加熱不活性化（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）及びＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で成長させた。
【0085】
実施例１－３：癌－特異的リガンドに対するＯＢＯＣライブラリスクリーニング
スクリーニング前に、ビードを二重蒸留水及びリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で広範囲に洗浄した。トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて癌細胞及び正常細胞を培養皿から分離し、相応する培養培地で洗浄した後、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再懸濁させ、ペトリ皿のＯＢＯＣビードと３７℃加湿ＣＯ２インキュベーターで振盪しながら（６０ｒｐｍ）培養した。細胞によって結合されたビードは、顕微鏡下で一つ以上の細胞層で覆われた中心ビードを有するロゼット状（ｒｏｓｅｔｔｅｓ）として表れた。倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下でポジティブビードをピペットで選び出し、グアニジン－ＨＣＬ（８Ｍ、２０ｍｉｎ）で処理し、ビードの表面の細胞及びタンパク質を除去し、正常乳腺上皮細胞で２次スクリーニングを行い、偽陽性結合を除去した。両ラウンドで細胞結合を有するビードのみを選別し、ペプチドシーケンシングを行った。
スクリーニング前に、ビードを二重蒸留水及びリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で広範囲に洗浄した。トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて癌細胞及び正常細胞を培養皿から分離し、相応する培養培地で洗浄した後、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再懸濁させ、ペトリ皿のＯＢＯＣビードと３７℃加湿ＣＯ２インキュベーターで振盪しながら（６０ｒｐｍ）培養した。細胞によって結合されたビードは、顕微鏡下で一つ以上の細胞層で覆われた中心ビードを有するロゼット状（ｒｏｓｅｔｔｅｓ）として表れた。倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下でポジティブビードをピペットで選び出し、グアニジン－ＨＣＬ（８Ｍ、２０ｍｉｎ）で処理し、ビードの表面の細胞及びタンパク質を除去し、正常乳腺上皮細胞で２次スクリーニングを行い、偽陽性結合を除去した。両ラウンドで細胞結合を有するビードのみを選別し、ペプチドシーケンシングを行った。
【0086】
実施例１－４：ペプチド及び２’－マレイミド－ＰＴＸの化学的合成
全てのペプチド及び２’－マレイミド－ＰＴＸは、それぞれ固相ペプチド合成（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）及びシュテークリヒエステル化（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いてＡｎｙＧｅｎ（Ｇｗａｎｇｊｕ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）によって合成された。ペプチド及び２’－マレイミド－ＰＴＸの純度及び分子量は、それぞれＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して決定された（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）。
全てのペプチド及び２’－マレイミド－ＰＴＸは、それぞれ固相ペプチド合成（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）及びシュテークリヒエステル化（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いてＡｎｙＧｅｎ（Ｇｗａｎｇｊｕ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）によって合成された。ペプチド及び２’－マレイミド－ＰＴＸの純度及び分子量は、それぞれＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して決定された（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）。
【0087】
実施例１－５：ＡＧＭ－３３０－ＰＴＸの合成
ペプチド分岐－チオール中間体（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｔｈｉｏｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）をＤＭＦ（５００μＭ）（Ｄｕｋｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）に溶解させ、ＤＭＦ（５ｍＭ）（１０Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）及び０．１％ｖ／ｖ ＤＩＰＥＡ（Ｄｕｋｓａｎ）で２’－マレイミド－ＰＴＸ溶液と混合させた。反応物を室温で３０分間撹拌した後、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で精製した。ＨＰＬＣで精製した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用してＡＧＭ－３３０－ＰＴＸの分子量を測定した。
ペプチド分岐－チオール中間体（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｔｈｉｏｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）をＤＭＦ（５００μＭ）（Ｄｕｋｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）に溶解させ、ＤＭＦ（５ｍＭ）（１０Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）及び０．１％ｖ／ｖ ＤＩＰＥＡ（Ｄｕｋｓａｎ）で２’－マレイミド－ＰＴＸ溶液と混合させた。反応物を室温で３０分間撹拌した後、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で精製した。ＨＰＬＣで精製した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用してＡＧＭ－３３０－ＰＴＸの分子量を測定した。
【0088】
実施例１－６：血清安定性試験
予熱された１００％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてペプチドの貯蔵溶液（１００μＭ）を１０倍希釈し、３７℃で０時間、３時間、６時間、９時間及び２４時間にわたって培養した。ＰＢＳでのペプチドが対照群として含まれた。４℃で１０分間３Ｍの最終濃度で尿素（ｕｒｅａ）を用いて血清タンパク質を変性させた後、最終濃度７％（ｖ／ｖ）（４℃、１０分）でトリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で血清タンパク質を沈澱させ、遠心分離（１７，０００×ｇ、１０分）することによって反応を停止させた。それぞれのサンプルの上澄み液を回収し、溶媒Ａ（０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ）で５％～６５％溶媒Ｂ（アセトニトリル９０％（ｖ／ｖ）と０．０４５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ）の線形勾配を使用して２１５ｎｍでモニタリングしながら１ｍｌ／ｍｉｎの流速で２５分にわたって分析カラム（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｌｕｍｎ）を行った。各ペプチドの溶出プロファイルは、０時点からＰＢＳサンプルによって確認された。血清－処理されたサンプルに残っているペプチドの百分率は、各時点で収得されたペプチドピークの高さと０時点で収得されたペプチドピークの高さとを比較することによって決定した。各実験は３回行われた。
予熱された１００％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてペプチドの貯蔵溶液（１００μＭ）を１０倍希釈し、３７℃で０時間、３時間、６時間、９時間及び２４時間にわたって培養した。ＰＢＳでのペプチドが対照群として含まれた。４℃で１０分間３Ｍの最終濃度で尿素（ｕｒｅａ）を用いて血清タンパク質を変性させた後、最終濃度７％（ｖ／ｖ）（４℃、１０分）でトリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で血清タンパク質を沈澱させ、遠心分離（１７，０００×ｇ、１０分）することによって反応を停止させた。それぞれのサンプルの上澄み液を回収し、溶媒Ａ（０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ）で５％～６５％溶媒Ｂ（アセトニトリル９０％（ｖ／ｖ）と０．０４５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ）の線形勾配を使用して２１５ｎｍでモニタリングしながら１ｍｌ／ｍｉｎの流速で２５分にわたって分析カラム（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｌｕｍｎ）を行った。各ペプチドの溶出プロファイルは、０時点からＰＢＳサンプルによって確認された。血清－処理されたサンプルに残っているペプチドの百分率は、各時点で収得されたペプチドピークの高さと０時点で収得されたペプチドピークの高さとを比較することによって決定した。各実験は３回行われた。
【0089】
実施例１－７：フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ－ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を使用してＦＩＴＣ－ペプチドの結合を確認した。ＦＩＴＣ－ペプチド用貯蔵溶液（１００μＭ）は、ペプチドをＰＢＳに溶解させて製造した。ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＣＣＤ－１８Ｃｏ、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６細胞を３ｍｌ培地を含有する６－ウェルプレートに１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでシーディングし、プレートを３７℃で一晩中培養した。翌日、ＦＩＴＣ－標識されたペプチド（１μＭ）を含有する新しいＦＢＳ－フリー培地（１ｍｌ）に培地を交替し、３７℃で３０分間さらに培養した。その後、培地を除去し、細胞が冷たいＰＢＳで洗浄し、任意の残留ペプチドを除去した。適切なトリプシン／ＥＤＴＡを各ウェルに添加した後、３７℃で３分～５分間培養した。培地を添加することによってトリプシン／ＥＤＴＡを直ぐ中和させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移した。細胞を分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。対照群細胞も、ペプチドを除いては、類似する方式で処理された。製造された細胞をＦＡＣＳｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で分析した。ＦＡＣＳデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析された。
ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ－ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を使用してＦＩＴＣ－ペプチドの結合を確認した。ＦＩＴＣ－ペプチド用貯蔵溶液（１００μＭ）は、ペプチドをＰＢＳに溶解させて製造した。ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＣＣＤ－１８Ｃｏ、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６細胞を３ｍｌ培地を含有する６－ウェルプレートに１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでシーディングし、プレートを３７℃で一晩中培養した。翌日、ＦＩＴＣ－標識されたペプチド（１μＭ）を含有する新しいＦＢＳ－フリー培地（１ｍｌ）に培地を交替し、３７℃で３０分間さらに培養した。その後、培地を除去し、細胞が冷たいＰＢＳで洗浄し、任意の残留ペプチドを除去した。適切なトリプシン／ＥＤＴＡを各ウェルに添加した後、３７℃で３分～５分間培養した。培地を添加することによってトリプシン／ＥＤＴＡを直ぐ中和させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移した。細胞を分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。対照群細胞も、ペプチドを除いては、類似する方式で処理された。製造された細胞をＦＡＣＳｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で分析した。ＦＡＣＳデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析された。
【0090】
実施例１－８：ビオチンプルダウン分析
細胞溶解物（５００μｇ／ｍｌ）をビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ＡＧＭ－３３０（５００ｎｇ／ｍｌ）と共に、４℃で１２時間にわたって培養した後、ストレプトアビジンビード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって１時間にわたって室温でプルダウンさせた。培養後、ビードを洗浄バッファーで３回洗浄した。溶出バッファーをビードに添加し、ビードからタンパク質を抽出した後、最終的にＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ビオチンプルダウン分析で由来したタンパク質を識別して特徴付けるために、ＰｒｏｔｅｏｍｅＴｅｃｈ（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）でＬＣ－結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
細胞溶解物（５００μｇ／ｍｌ）をビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ＡＧＭ－３３０（５００ｎｇ／ｍｌ）と共に、４℃で１２時間にわたって培養した後、ストレプトアビジンビード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって１時間にわたって室温でプルダウンさせた。培養後、ビードを洗浄バッファーで３回洗浄した。溶出バッファーをビードに添加し、ビードからタンパク質を抽出した後、最終的にＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ビオチンプルダウン分析で由来したタンパク質を識別して特徴付けるために、ＰｒｏｔｅｏｍｅＴｅｃｈ（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）でＬＣ－結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0091】
実施例１－９：ＡＧＭ－３３０結合ドメイン識別
ヒトＮＣＬ ｃＤＮＡクローン（Ａｄｄｇｅｎｅ）からＧＦＰ－ＮＣＬ（残基１－７１０）、ＧＦＰ－△Ｎ－ＮＣＬ（残基３２２－７１０）及びＧＦＰ－△Ｃ－ＮＣＬ（残基１－３２１）を含むＮＣＬ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を作り、ｐＥＧＦＰ－Ｃ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩサイトにサブクローニングさせた。これらのベクターは、製造社の勧告によってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。ビオチン化ＡＧＭ－３３０ペプチドをストレプトアビジンビード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、混合物を室温で１時間にわたって振盪しながら培養した。ビードは、洗浄バッファーで３回洗浄された。洗浄後、ＧＦＰ－タグ付き（ｔａｇｇｅｄ）ＮＣＬタンパク質を含有する形質注入された細胞溶解物から製造された溶解物（３００μｌ）にビードを添加した。反応混合物を４℃で１２時間にわたって培養し、ＡＧＭ－３３０とＧＦＰ－タグ付きＮＣＬタンパク質とが結合されるようにした。続いて、ビードを洗浄バッファーで洗浄した。同一の体積の２×電気泳動サンプルバッファーをビードに添加し、９５℃で５分間加熱することによってビードからタンパク質を抽出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロット分析でタンパク質を最終的に分析した。
ヒトＮＣＬ ｃＤＮＡクローン（Ａｄｄｇｅｎｅ）からＧＦＰ－ＮＣＬ（残基１－７１０）、ＧＦＰ－△Ｎ－ＮＣＬ（残基３２２－７１０）及びＧＦＰ－△Ｃ－ＮＣＬ（残基１－３２１）を含むＮＣＬ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を作り、ｐＥＧＦＰ－Ｃ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩサイトにサブクローニングさせた。これらのベクターは、製造社の勧告によってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。ビオチン化ＡＧＭ－３３０ペプチドをストレプトアビジンビード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、混合物を室温で１時間にわたって振盪しながら培養した。ビードは、洗浄バッファーで３回洗浄された。洗浄後、ＧＦＰ－タグ付き（ｔａｇｇｅｄ）ＮＣＬタンパク質を含有する形質注入された細胞溶解物から製造された溶解物（３００μｌ）にビードを添加した。反応混合物を４℃で１２時間にわたって培養し、ＡＧＭ－３３０とＧＦＰ－タグ付きＮＣＬタンパク質とが結合されるようにした。続いて、ビードを洗浄バッファーで洗浄した。同一の体積の２×電気泳動サンプルバッファーをビードに添加し、９５℃で５分間加熱することによってビードからタンパク質を抽出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロット分析でタンパク質を最終的に分析した。
【0092】
実施例１－１０：Ｊｕｒｋａｔ細胞からのＮＣＬの精製
２５ｍｌの２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ－１００、１ｍＭマリマスタット（ＡｄｏｏＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）で１．０Ｘ１０９ Ｊｕｒｋａｔ細胞を４℃で１時間にわたって溶解させ、ＮＣＬを製造した。ｖ）トリトンＸ－１００、１ｍＭのマリマスタット（ＡｄｏｏＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）。核を１２００×ｇで５分間遠心分離することによってペレット化した後、上澄み液を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、－８０℃で貯蔵した。核のない（ｎｕｃｌｅｕｓ－ｆｒｅｅ）抽出物からＮＣＬを精製するために、速い２段階クロマトグラフィー手順を使用した。全ての段階は、１ｍＭマリスタット及び完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下で氷冷（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ）バッファー及びカラムを使用して４℃で行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞（２５ｍｌ）の細胞質抽出物をｐＨ７．０、２０ｍＭリン酸ナトリウムで１０倍希釈し、５ｍｌのＭｏｎｏ Ｑ５／５０ＧＬカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に通過させた。ｐＨ７．０、１５０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムでカラムを洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌを含有する同一のバッファーの１０ｍｌで吸着したタンパク質を溶出させた。溶出液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ β－メルカプトエタノール（バッファーＡ）で１０倍希釈し、同一のバッファーで平衡させた１ｍｌ ＨｉＦｉＱヘパリンＨＰカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｋ、ＵＫ）にローディングした。０．２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する２０ｍｌのバッファーＡでゲルを洗浄し、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを含有した２ｍｌのバッファーＡでタンパク質を５０μｌ分画に溶出させた。ＮＣＬを集め、４℃で２時間にわたって１ｍＭマリマスタットを含有するＰＢＳに透析した後、－８０℃で貯蔵した。クマシーブルーで染色された１０％ ＳＤＳアクリルアミドゲルに対する追加制御により、単一１０５ｋＤａタンパク質バンドとして精製されたＮＣＬの存在を確認した。ＮＣＬの部分分解産物に該当する２個の７０及び５０ｋＤａタンパク質バンドが全体のタンパク質の１０％未満の量で観察された。
２５ｍｌの２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ－１００、１ｍＭマリマスタット（ＡｄｏｏＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）で１．０Ｘ１０９ Ｊｕｒｋａｔ細胞を４℃で１時間にわたって溶解させ、ＮＣＬを製造した。ｖ）トリトンＸ－１００、１ｍＭのマリマスタット（ＡｄｏｏＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）。核を１２００×ｇで５分間遠心分離することによってペレット化した後、上澄み液を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、－８０℃で貯蔵した。核のない（ｎｕｃｌｅｕｓ－ｆｒｅｅ）抽出物からＮＣＬを精製するために、速い２段階クロマトグラフィー手順を使用した。全ての段階は、１ｍＭマリスタット及び完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下で氷冷（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ）バッファー及びカラムを使用して４℃で行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞（２５ｍｌ）の細胞質抽出物をｐＨ７．０、２０ｍＭリン酸ナトリウムで１０倍希釈し、５ｍｌのＭｏｎｏ Ｑ５／５０ＧＬカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に通過させた。ｐＨ７．０、１５０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムでカラムを洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌを含有する同一のバッファーの１０ｍｌで吸着したタンパク質を溶出させた。溶出液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ β－メルカプトエタノール（バッファーＡ）で１０倍希釈し、同一のバッファーで平衡させた１ｍｌ ＨｉＦｉＱヘパリンＨＰカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｋ、ＵＫ）にローディングした。０．２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する２０ｍｌのバッファーＡでゲルを洗浄し、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを含有した２ｍｌのバッファーＡでタンパク質を５０μｌ分画に溶出させた。ＮＣＬを集め、４℃で２時間にわたって１ｍＭマリマスタットを含有するＰＢＳに透析した後、－８０℃で貯蔵した。クマシーブルーで染色された１０％ ＳＤＳアクリルアミドゲルに対する追加制御により、単一１０５ｋＤａタンパク質バンドとして精製されたＮＣＬの存在を確認した。ＮＣＬの部分分解産物に該当する２個の７０及び５０ｋＤａタンパク質バンドが全体のタンパク質の１０％未満の量で観察された。
【0093】
実施例１－１１：結合親和度
結合親和度は、ＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光法（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００）によってテストされた。組換えヌクレオリンタンパク質をＣＭ５センサーチップに固定した後、ＡＧＭ－３３０を濃度別に（２０ｎＭ～２．５μＭ）処理し、それぞれに対するセンサーグラムを分析し、ＫＤ値を決定した。
結合親和度は、ＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光法（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００）によってテストされた。組換えヌクレオリンタンパク質をＣＭ５センサーチップに固定した後、ＡＧＭ－３３０を濃度別に（２０ｎＭ～２．５μＭ）処理し、それぞれに対するセンサーグラムを分析し、ＫＤ値を決定した。
【0094】
実施例１－１２：タンパク質分離及びウェスタンブロット分析
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有するＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ－１００）に細胞を溶解させた。製造社のプロトコルによって、タンパク質分析キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてタンパク質の濃度を測定した。総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用し、ポリフッ化ビニリデン膜に移動させた。ブロットは、ＮＣＬ（Ａｂｃａｍ）及びＧＦＰ（Ａｂｃａｍ）に対する１次抗体でプローブされた。ローディング対照群として、抗－β－アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗－Ｐ－カドヘリン（Ａｂｃａｍ）及び抗－ラミンＡ／Ｃ（Ａｂｃａｍ）が使用された。続いて、ブロットをＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．２５％ツイン－２０）で洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ－接合２次抗体と共に培養した。強化された化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して標的タンパク質の存在を探知した。
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有するＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ－１００）に細胞を溶解させた。製造社のプロトコルによって、タンパク質分析キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてタンパク質の濃度を測定した。総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用し、ポリフッ化ビニリデン膜に移動させた。ブロットは、ＮＣＬ（Ａｂｃａｍ）及びＧＦＰ（Ａｂｃａｍ）に対する１次抗体でプローブされた。ローディング対照群として、抗－β－アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗－Ｐ－カドヘリン（Ａｂｃａｍ）及び抗－ラミンＡ／Ｃ（Ａｂｃａｍ）が使用された。続いて、ブロットをＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．２５％ツイン－２０）で洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ－接合２次抗体と共に培養した。強化された化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して標的タンパク質の存在を探知した。
【0095】
実施例１－１３：免疫蛍光染色
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ異種移植組織には、免疫蛍光染色のためにホルマリン－固定及びパラフィン－包埋が行われた。細胞をポリ－Ｌ－リシン及びコラーゲンＩ－コートカバーガラス（ｃｏａｔｅｄ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓｅｓ）にシーディングし、４％ホルマリンで固定させた。組織スライド及び細胞を、０．１％トリトンＸ－１００で透過性を有するように作り、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロッキングした。１次抗－ＮＣ（１：２００）、抗－ＴＵＮＥＬ（１：２００）及び抗－Ｋｉ－６７（１：５００）抗体を使用し、上述したように染色を行った。全ての核は、ＤＡＰＩで対照染色された。免疫蛍光イメージをＨ＆Ｅ－染色イメージとマッチングさせた。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ異種移植組織には、免疫蛍光染色のためにホルマリン－固定及びパラフィン－包埋が行われた。細胞をポリ－Ｌ－リシン及びコラーゲンＩ－コートカバーガラス（ｃｏａｔｅｄ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓｅｓ）にシーディングし、４％ホルマリンで固定させた。組織スライド及び細胞を、０．１％トリトンＸ－１００で透過性を有するように作り、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロッキングした。１次抗－ＮＣ（１：２００）、抗－ＴＵＮＥＬ（１：２００）及び抗－Ｋｉ－６７（１：５００）抗体を使用し、上述したように染色を行った。全ての核は、ＤＡＰＩで対照染色された。免疫蛍光イメージをＨ＆Ｅ－染色イメージとマッチングさせた。
【0096】
実施例１－１４：ｓｉＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）－媒介ノックダウン
ＮＣＬを標的とするｓｉＲＮＡ（ＮＭ＿００５３８１．３ ｉｎ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ） は、Ｂｉｏｎｅｅｒ（Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）から購入した。効率的なＮＣＬ形質注入のために、製造社のプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｓｉＲＮＡ形質注入を行った。３個の相違するｓｉＲＮＡ配列が使用され、これらの効率性はリアルタイムＰＣＲによって評価された。
ＮＣＬを標的とするｓｉＲＮＡ（ＮＭ＿００５３８１．３ ｉｎ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ） は、Ｂｉｏｎｅｅｒ（Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）から購入した。効率的なＮＣＬ形質注入のために、製造社のプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｓｉＲＮＡ形質注入を行った。３個の相違するｓｉＲＮＡ配列が使用され、これらの効率性はリアルタイムＰＣＲによって評価された。
【0097】
ｓｉＮＣＬ１：（センス）５’－ＧＡＧＣＵＡＡＣＣＣＵＵＡＵＣＵＧＵＡ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２１）
（アンチセンス）５’－ＵＡＣＡＧＡＵＡＡＧＧＧＵＵＡＧＣＵＣ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２２）
ｓｉＮＣＬ２：（センス）５’－ＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＡ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２３）
（アンチセンス）５’－ＵＵＣＧＵＣＵＵＣＵＵＵＣＣＵＵＧＵＧ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２４）
ｓｉＮＣＬ３：（センス）５’－ＧＡＣＧＡＡＧＵＵＵＧＡＡＵＡＧＣＵＵ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２５）
（アンチセンス）５’－ＡＡＧＣＵＡＵＵＣＡＡＡＣＵＵＣＧＵＣ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２６）
（アンチセンス）５’－ＵＡＣＡＧＡＵＡＡＧＧＧＵＵＡＧＣＵＣ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２２）
ｓｉＮＣＬ２：（センス）５’－ＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＡ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２３）
（アンチセンス）５’－ＵＵＣＧＵＣＵＵＣＵＵＵＣＣＵＵＧＵＧ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２４）
ｓｉＮＣＬ３：（センス）５’－ＧＡＣＧＡＡＧＵＵＵＧＡＡＵＡＧＣＵＵ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２５）
（アンチセンス）５’－ＡＡＧＣＵＡＵＵＣＡＡＡＣＵＵＣＧＵＣ（ｄＴｄＴ）－３’（配列番号２６）
【0098】
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって決定されたｍＲＮＡレベルに基づいて最も効果的なｓｉＲＮＡを選択し、生成されたタンパク質レベルをウェスタンブロット分析で検証した。
【0099】
実施例１－１５：リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用して全体のＲＮＡを抽出し、２６０／２８０吸光度比率を測定することによってＲＮＡ純度を検証した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（Ｔａｋａｒａ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲマスターミックス（Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、各ＰＣＲ混合物に１０分の１のｃＤＮＡを使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。選択された遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現をβ－アクチンの発現に標準化し、ｄｄＣｔ方法を使用して定量化した。ＰＣＲプライマーの配列を下記の表６に羅列した。
ＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用して全体のＲＮＡを抽出し、２６０／２８０吸光度比率を測定することによってＲＮＡ純度を検証した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（Ｔａｋａｒａ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲマスターミックス（Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、各ＰＣＲ混合物に１０分の１のｃＤＮＡを使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。選択された遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現をβ－アクチンの発現に標準化し、ｄｄＣｔ方法を使用して定量化した。ＰＣＲプライマーの配列を下記の表６に羅列した。
【表6】
【0100】
実施例１－１６：抗体中和分析
１００μｌの培地を含有する９６－ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで癌及び正常細胞株をシーディングし、プレートを３７℃で一晩中培養した。一晩中培養した後、細胞を３７℃で一晩中抗－ＮＣＬ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）の不在又は存在下で２４時間にわたって培養した。培養後、製造社の指示に従ってＣｅｌｌＶｉａ ＷＳＴ－１アッセイ（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で細胞生存力を評価した。
１００μｌの培地を含有する９６－ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで癌及び正常細胞株をシーディングし、プレートを３７℃で一晩中培養した。一晩中培養した後、細胞を３７℃で一晩中抗－ＮＣＬ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）の不在又は存在下で２４時間にわたって培養した。培養後、製造社の指示に従ってＣｅｌｌＶｉａ ＷＳＴ－１アッセイ（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で細胞生存力を評価した。
【0101】
実施例１－１７：アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）分析（アネキシンＶ）
アポトーシス細胞の定量的評価は、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）アポトーシス検出キットＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して行われた。細胞を収集し、冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、結合バッファー（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に再懸濁させた。次に、１００μｌの懸濁液をチューブに移し、５μｌのＦＩＴＣアネキシンＶ及びＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）と混合した。続いて、混合物を穏やかにボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、暗室において１５分間室温で培養した。培養後、４００μｌの１×結合バッファーを添加し、細胞に対してフローサイトメトリーで分析した。
アポトーシス細胞の定量的評価は、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）アポトーシス検出キットＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して行われた。細胞を収集し、冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、結合バッファー（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に再懸濁させた。次に、１００μｌの懸濁液をチューブに移し、５μｌのＦＩＴＣアネキシンＶ及びＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）と混合した。続いて、混合物を穏やかにボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、暗室において１５分間室温で培養した。培養後、４００μｌの１×結合バッファーを添加し、細胞に対してフローサイトメトリーで分析した。
【0102】
実施例１－１８：細胞増殖分析
癌細胞及び正常細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ウェルプレートにシーディングした。２４時間にわたって培養した後、細胞を、増加する濃度のＡＧＭ－３３０、ＰＴＸ及びＡＧＭ－３３０－ＰＴＸで４８時間にわたって処理した。細胞生存力は、製造社の指示に従ってＣｅｌｌＶｉａ ＷＳＴ－１アッセイ（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）で評価した。生存細胞の数は、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍの波長で測定された。
癌細胞及び正常細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ウェルプレートにシーディングした。２４時間にわたって培養した後、細胞を、増加する濃度のＡＧＭ－３３０、ＰＴＸ及びＡＧＭ－３３０－ＰＴＸで４８時間にわたって処理した。細胞生存力は、製造社の指示に従ってＣｅｌｌＶｉａ ＷＳＴ－１アッセイ（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）で評価した。生存細胞の数は、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍの波長で測定された。
【0103】
実施例１－１９：腫瘍形成（Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）実験
全ての動物実験は、ＩＡＣＵＣ指針に従って行われた（ＧＩＳＴ－２０１９－０４０）。腫瘍形成実験のために、麻酔された６週齢の雌ＮＯＤ－ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ－／－マウス（ＮＰＧＴＭ、ＶＩＴＡＬＳＴＡＲ）を１００μｌ体積の１×１０６ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞がある乳腺脂肪パッドに接種した（ｎ＝５～６ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ）。腫瘍細胞の接種後、腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に到逹したとき、マウスを下記の５個の群に無作為に分けた：（ｉ）対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（ｉｉ）低用量のパクリタキセル（ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（２ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉｉ）高用量のパクリタキセル（ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｖ）ＡＧＭ－３３０（１６．６８ｍｇ／ｋｇ又は８．３４ｍｇ／ｋｇ）、及び（ｖ）ＡＧＭ－３３０－ＰＴＸ（１９．０５ｍｇ／ｋｇ又は１０．７１ｍｇ／ｋｇ）。週に二回腫瘍の大きさを測定し、次の式を用いて腫瘍の体積を計算した：
体積（ｍｍ３）＝（長さ（ｍｍ））×（幅（ｍｍ））２×０．５
生物発光イメージング実験のために、Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をそれぞれのマウスの腹腔内に注射し、ＩＶＩＳ １００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を生物発光モニタリングに使用した。気体イソフルラン（ＢＫ Ｐｈａｒｍ、Ｉｌｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）でマウスを麻酔させ、イメージングチャンバーに配置した。１０分後、各動物を１分の露出時間でイメージングした。全ての生物発光イメージデータは、リビングイメージソフトウェア（バージョン４．５．２、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって提供された。腫瘍から検出された光子は、平均光度（ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）に変換された。平均光度値は、強度領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＲＯＩ）で得た定量的データであり、各マウスの全身に割り当てられた直四角形の領域で生物発光細胞によって放出された光子を含む。
全ての動物実験は、ＩＡＣＵＣ指針に従って行われた（ＧＩＳＴ－２０１９－０４０）。腫瘍形成実験のために、麻酔された６週齢の雌ＮＯＤ－ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ－／－マウス（ＮＰＧＴＭ、ＶＩＴＡＬＳＴＡＲ）を１００μｌ体積の１×１０６ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞がある乳腺脂肪パッドに接種した（ｎ＝５～６ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ）。腫瘍細胞の接種後、腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に到逹したとき、マウスを下記の５個の群に無作為に分けた：（ｉ）対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（ｉｉ）低用量のパクリタキセル（ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（２ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉｉ）高用量のパクリタキセル（ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｖ）ＡＧＭ－３３０（１６．６８ｍｇ／ｋｇ又は８．３４ｍｇ／ｋｇ）、及び（ｖ）ＡＧＭ－３３０－ＰＴＸ（１９．０５ｍｇ／ｋｇ又は１０．７１ｍｇ／ｋｇ）。週に二回腫瘍の大きさを測定し、次の式を用いて腫瘍の体積を計算した：
体積（ｍｍ３）＝（長さ（ｍｍ））×（幅（ｍｍ））２×０．５
生物発光イメージング実験のために、Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をそれぞれのマウスの腹腔内に注射し、ＩＶＩＳ １００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を生物発光モニタリングに使用した。気体イソフルラン（ＢＫ Ｐｈａｒｍ、Ｉｌｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）でマウスを麻酔させ、イメージングチャンバーに配置した。１０分後、各動物を１分の露出時間でイメージングした。全ての生物発光イメージデータは、リビングイメージソフトウェア（バージョン４．５．２、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって提供された。腫瘍から検出された光子は、平均光度（ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）に変換された。平均光度値は、強度領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＲＯＩ）で得た定量的データであり、各マウスの全身に割り当てられた直四角形の領域で生物発光細胞によって放出された光子を含む。
【0104】
実施例１－２０：生物情報学
Ｏｎｃｏｍｉｎｅ癌マイクロアレイデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ／）を使用し、正常乳房及び結腸直腸組織と乳癌腫及び結腸直腸腺癌腫組織でＮＣＬの発現レベルを分析した。これらの遺伝子発現データはｌｏｇ２変換され、中央値中心であった。全てのグラフィック及び統計値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム５．０を用いて分析し、Ｐ－値は、スチューデントの両側ｔ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）（Ｐ＜０．０５）によって計算された。Ｒ２プラットホームを使用し、カプランマイヤープロットを生成し、乳房腫瘍及び結腸直腸腫瘍でのＮＣＬ発現レベルによって患者をグループ化した。
Ｏｎｃｏｍｉｎｅ癌マイクロアレイデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ／）を使用し、正常乳房及び結腸直腸組織と乳癌腫及び結腸直腸腺癌腫組織でＮＣＬの発現レベルを分析した。これらの遺伝子発現データはｌｏｇ２変換され、中央値中心であった。全てのグラフィック及び統計値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム５．０を用いて分析し、Ｐ－値は、スチューデントの両側ｔ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）（Ｐ＜０．０５）によって計算された。Ｒ２プラットホームを使用し、カプランマイヤープロットを生成し、乳房腫瘍及び結腸直腸腫瘍でのＮＣＬ発現レベルによって患者をグループ化した。
【0105】
実施例１－２１：統計分析
全ての統計データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表示された。二つのグループの間の統計的比較は、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）によって決定され、多くのグループの間の比較は、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）によって決定された。ｉｎ ｖｉｖｏ実験の場合、マウスの数は各凡例に表示された。ログランク検定は、カプランマイヤー分析に使用された。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
全ての統計データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表示された。二つのグループの間の統計的比較は、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）によって決定され、多くのグループの間の比較は、一元配置分散分析とダネットの多重比較（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）によって決定された。ｉｎ ｖｉｖｏ実験の場合、マウスの数は各凡例に表示された。ログランク検定は、カプランマイヤー分析に使用された。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を示す。
【0106】
実施例２：ＯＢＯＣ組み合わせスクリーニング及びＭＡＰ合成方法による癌－標的化ペプチドリガンドの同定及び特性確認
新しい癌－特異的ペプチドリガンドを同定するために、５ｇのＴｅｎｔａｇｅｌ ＭＢＮＨ２レジン（２００μｍ、５２０，０００ｂｅａｄｓ／ｇ、図３）を使用して２，６００，０００個のライブラリを合成した。ビードに羅列されたペプチドライブラリ（一度に５０，０００個～１００，０００個のビードが使用される）をヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）と混合した。合計～１，０００，０００個のビードをスクリーニングし、８個のポジティブビードを検出し、マイクロシーケンシングのために分離した。これらの８個のペプチドのうち３個（ＡＧＭ－３３０、ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２）は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対して強い優先的な結合を示しており、ヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ－１０Ａ）には結合しないか、弱く結合した（図４Ａ、図４Ｂ）。その次に、これらの３個のペプチドをＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に結合できるか否かを確認した。ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２と比較するとき、ＡＧＭ－３３０で最も強い蛍光信号が検出された（図４Ｃ）。細胞成長ビード分析（ｃｅｌｌ－ｇｒｏｗｔｈ－ｏｎ－ｂｅａｄ ａｓｓａｙ）及び蛍光イメージングからスクリーニング結果を確認するために、ＡＧＭ－３３０をＴｅｎｔａｇｅｌ ＭＢ ＮＨ２レジンで再合成した。細胞成長ビードの分析結果、ＡＧＭ－３３０ビードは、１５分内にヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）とヒト結腸直腸癌細胞株（ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６）によって完全に覆われた（図４Ｄ）。一方、ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２は、相対的に非特異的であり、ヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ－１０Ａ）及びヒト正常結腸直腸細胞株（ＣＣＤ－１８Ｃｏ）に結合した。また、ＡＧＭ－３３０は、ＭＣＦ－１０Ａ又はＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞に非常に弱く結合したり、全く結合しなかったので、イメージング及び治療的標的化製剤の全てに対する優秀な候補になり得る。
新しい癌－特異的ペプチドリガンドを同定するために、５ｇのＴｅｎｔａｇｅｌ ＭＢＮＨ２レジン（２００μｍ、５２０，０００ｂｅａｄｓ／ｇ、図３）を使用して２，６００，０００個のライブラリを合成した。ビードに羅列されたペプチドライブラリ（一度に５０，０００個～１００，０００個のビードが使用される）をヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）と混合した。合計～１，０００，０００個のビードをスクリーニングし、８個のポジティブビードを検出し、マイクロシーケンシングのために分離した。これらの８個のペプチドのうち３個（ＡＧＭ－３３０、ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２）は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対して強い優先的な結合を示しており、ヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ－１０Ａ）には結合しないか、弱く結合した（図４Ａ、図４Ｂ）。その次に、これらの３個のペプチドをＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に結合できるか否かを確認した。ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２と比較するとき、ＡＧＭ－３３０で最も強い蛍光信号が検出された（図４Ｃ）。細胞成長ビード分析（ｃｅｌｌ－ｇｒｏｗｔｈ－ｏｎ－ｂｅａｄ ａｓｓａｙ）及び蛍光イメージングからスクリーニング結果を確認するために、ＡＧＭ－３３０をＴｅｎｔａｇｅｌ ＭＢ ＮＨ２レジンで再合成した。細胞成長ビードの分析結果、ＡＧＭ－３３０ビードは、１５分内にヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）とヒト結腸直腸癌細胞株（ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６）によって完全に覆われた（図４Ｄ）。一方、ＡＧＭ－３３１及びＡＧＭ－３３２は、相対的に非特異的であり、ヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ－１０Ａ）及びヒト正常結腸直腸細胞株（ＣＣＤ－１８Ｃｏ）に結合した。また、ＡＧＭ－３３０は、ＭＣＦ－１０Ａ又はＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞に非常に弱く結合したり、全く結合しなかったので、イメージング及び治療的標的化製剤の全てに対する優秀な候補になり得る。
【0107】
現在、安定性が低いので、治療剤としてのペプチドの使用は大きく制限されてきた：ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで主にプロテアーゼ及びペプチダーゼによって分解される（Ｂｏｔｔｇｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２：ｅ０１７８９４３）。本発明では、ペプチドリガンドの安定性を改善するために、ＭＡＰデンドリマー形態のＡＧＭ－３３０を合成し、これは、プロテアーゼ及びペプチダーゼ活性に対して獲得された抵抗性によって増加した安定性を示すことができる。ＡＧＭ－３３０の合成（図４Ｅ）は、リシンコア－接合（ｌｙｓｉｎｅ ｃｏｒｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）Ｗａｎｇレジン（２、３）を作るために、２０％ピペリジン及びＤＭＦの存在下でＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｗａｎｇレジン（１）及びＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨで開示される。続いて、２０％ピペリジンの存在下でＲＨＧＡＭＶＹＬＫ－ＰＥＧ１２－ＯＨで処理し、Ｆｍｏｃ－及びＴｒｔ－保護されたＡＧＭ－３３０（４）を製造した。ＡＧＭ－３３０（４）のＦｍｏｃ－及びＴｒｔ－保護基は、ＤＭＦのピペリジンによって迅速に除去され、ＡＧＭ－３３０（５）が製造された。
【0108】
選定されたペプチドリガンドＡＧＭ－３３０の生体内の安定性及び結合力の増進のために、ＭＡＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）合成法を通じて二量体及び四量体の形態で合成した。
【0109】
ペプチド安定性の増進有無を評価するために、ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を分析した。ＡＧＭ－３３０ｍ、ＡＧＭ－３３０ｄ、ＡＧＭ－３３０ｔ ２ｍｇ／ｋｇをＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈を通じて注入し、残っている血清内のペプチド部分は、抗－ＡＧＭ－３３０抗体を通じてＥＬＩＳＡプレートに直ぐ固定させた。吸光度は、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍの波長で測定され、薬物動態（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、フェニックスＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ８．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）プログラムで分析した。分析の結果、ＡＧＭ－３３０ｍ、ＡＧＭ－３３０ｄ、ＡＧＭ－３３０ｔの半減期（Ｔ１／２）は、それぞれ０．４２±０．３３時間、１．８２±０．３６時間、９．４３±１．２１時間で、血中最大集中時間（Ｔｍａｘ）は、いずれも０．１６７時間であった。血中最大濃度（Ｃｍａｘ）は、それぞれ１．２７±０．１２μｇ／ｍＬ、１．７１±０．１１μｇ／ｍＬ、１．８７５±０．６７μｇ／ｍＬで、曲線下の面積（ＡＵＣ）は、それぞれ０．６４±０．０９μｇ／ｈ／ｍＬ、１．７７±０．１２μｇ／ｈ／ｍＬ、２１．４２±０．８１μｇ／ｈ／ｍＬであった（図５）。結果的に、四量体ＡＧＭ－３３０（ＡＧＭ－３３０ｔ）は、単量体又は二量体ペプチドより高い安定性を有することが確認された。
【0110】
次に、ＭＡＰリガンドが癌細胞に選択的に結合できるか否かを調査するために、ＦＩＴＣ－標識されたＡＧＭ－３３０（ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣ）で処理された癌細胞を非処理細胞と比較した。ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣを無血清培地で３７℃、２時間にわたって細胞（１×１０５）と培養し、接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を完全に維持させた。その次に、固有蛍光ペプチド－処理された細胞を、非処理細胞に対して、平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）の変化に基づいて比較・測定した（図４Ｆ）。その結果、ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣは、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６に対する有意な癌細胞結合を示しており、これは、非処理細胞に比べて処理細胞のＭＦＩが相対的に増加したことによって立証された通りである。対照的には、２時間培養した後、接合体は、ＭＣＦ－１０Ａ及びＣＣＤ－１８Ｃｏを含む正常細胞に対して著しく減少した結合を示した一方で、癌細胞に対しては強い優先的結合を示した。
【0111】
ＡＧＭ－３３０が細胞毒性を示すか否かを調査するために、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９、及びＨＣＴ－１１６を含む多くの癌細胞と、ＭＣＦ－１０Ａ及びＣＣＤ－１８Ｃｏを含む各正常細胞でＩＣ５０値を評価した。ＡＧＭ－３３０ｔ及びＡＧＭ－３３０ｄのＩＣ５０値は、血清の濃度と関係なく、全ての細胞株で１００μＭより大きかった（図６）。これは、ＡＧＭ－３３０が癌又は正常細胞株の細胞生存力に著しく影響を及ぼさないことを意味する。以上の内容をまとめると、前記各データは、ＡＧＭ－３３０が標的細胞生存力に影響を及ぼさない状態で癌細胞の標的化に利用可能であることを示唆する。
【0112】
実施例３：ＡＧＭ－３３０の潜在的標的である癌細胞成長の強力な調節因子ＮＣＬ
ＡＧＭ－３３０の未知の標的タンパク質を確認するために、親和性カラムクロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及び質量分析法ベースのプロテオミクス接近方式を使用し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞溶解物からＡＧＭ－３３０－相互作用タンパク質を確認した（図７Ａ）。親和性カラムクロマトグラフィーを行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を通じて溶出分画にのみ存在する様々な別個のタンパク質バンド（５５－１００ｋＤａ）を確認した（図７Ｂ）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を使用して６個のタンパク質を確認し、これらの切除されたバンドのペプチド識別は、１００ｋＤａで主要なタンパク質バンドのうち一つがヌクレオリン（ＮＣＬ）として特性化されたことを示した。ＮＣＬは７１０個のアミノ酸で構成され、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって識別された２２個の他のペプチド断片は、ＮＣＬのアミノ酸配列と一致した（ＮＣＢＩデータベースのヒトＮＣＬ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ｇｉ１８９３０６）に対する総スコア（ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ）８８１及び２４％のシーケンスカバレッジ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ））（図７Ｃ－Ｄ）。また、抗－ＮＣＬ抗体を使用した免疫ブロット分析を通じて、ＡＧＭ－３３０親和性カラムでの溶出物でＮＣＬの濃縮をさらに確認した（図７Ｅ）。よって、プロテオミクス研究は、ＮＣＬがＡＧＭ－３３０－相互作用タンパク質であることを示唆する。
ＡＧＭ－３３０の未知の標的タンパク質を確認するために、親和性カラムクロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及び質量分析法ベースのプロテオミクス接近方式を使用し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞溶解物からＡＧＭ－３３０－相互作用タンパク質を確認した（図７Ａ）。親和性カラムクロマトグラフィーを行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を通じて溶出分画にのみ存在する様々な別個のタンパク質バンド（５５－１００ｋＤａ）を確認した（図７Ｂ）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を使用して６個のタンパク質を確認し、これらの切除されたバンドのペプチド識別は、１００ｋＤａで主要なタンパク質バンドのうち一つがヌクレオリン（ＮＣＬ）として特性化されたことを示した。ＮＣＬは７１０個のアミノ酸で構成され、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって識別された２２個の他のペプチド断片は、ＮＣＬのアミノ酸配列と一致した（ＮＣＢＩデータベースのヒトＮＣＬ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ｇｉ１８９３０６）に対する総スコア（ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ）８８１及び２４％のシーケンスカバレッジ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ））（図７Ｃ－Ｄ）。また、抗－ＮＣＬ抗体を使用した免疫ブロット分析を通じて、ＡＧＭ－３３０親和性カラムでの溶出物でＮＣＬの濃縮をさらに確認した（図７Ｅ）。よって、プロテオミクス研究は、ＮＣＬがＡＧＭ－３３０－相互作用タンパク質であることを示唆する。
【0113】
ＡＧＭ－３３０のＮＣＬに対する結合親和度を確認するために、ＡＧＭ－３３０を使用してＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）検定を行った。図８に示したように、Ｋｄ値が約５７．７ｎＭであって、ＮＣＬに対して非常に高い結合親和度を示すことを確認した。
【0114】
ＡＧＭ－３３０とＮＣＬとの間の相互作用に関与するドメインを調査するために、ビオチンプルダウン分析を使用した。ビオチン化ＡＧＭ－３３０（ＡＧＭ－３３０－ビオチン）を餌（ｂａｉｔ）として使用し、ＮＣＬ突然変異体をプルダウンさせた。ＮＣＬのいくつかの欠失突然変異体が生成された。これらは、いずれもＧＦＰに融合された野生型及び多様なＮＣＬ突然変異体、ＮＣＬ１（１－７１０）、ＮＣＬ２（３２３－７１０）及びＮＣＬ３（１－３２２）をコーディングする発現ベクターで形質注入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から細胞抽出物を製造した。ＡＧＭ－３３０－ビオチンは、野生型ＮＣＬ１（１－７１０）及びＮＣＬ３（１－３２２）をプルダウンさせたが、ＮＣＬ２（３２３－７１０）はプルダウンさせなかった（図７Ｆ）。このような結果は、ＮＣＬのＮ－末端領域（１－３２２）がＡＧＭ－３３０の結合に重要であることを示す。ＡＧＭ－３３０とＮＣＬとの間の直接的な相互作用をさらに確認するために、精製されたＮＣＬ及びＡＧＭ－３３０－ビオチンをビオチンプルダウン分析に使用した。抗－ＮＣＬ抗体を使用した免疫ブロット分析を通じて、溶出分画でＮＣＬの濃縮を確認した（図９）。
【0115】
以上の内容をまとめると、ＡＧＭ－３３０がＮＣＬと直接相互作用することを意味する。
【0116】
実施例４：ＡＧＭ－３３０とＮＣＬとの相互作用に必須的なアミノ酸残基の確認
癌細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ウェルプレートに２４時間にわたって培養した。ＡＧＭ－３３０及びＰＥＧ化させた前記表２の１２種のペプチドをビオチン連結させ、細胞を、２時間にわたって増加する濃度の前記１３種のペプチドで処理した。
癌細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ウェルプレートに２４時間にわたって培養した。ＡＧＭ－３３０及びＰＥＧ化させた前記表２の１２種のペプチドをビオチン連結させ、細胞を、２時間にわたって増加する濃度の前記１３種のペプチドで処理した。
【0117】
その後、高親和性アビジン－ビオチン相互作用を通じてアビジン－ＨＲＰを付着させ、ＨＲＰ酵素を通じてＴＭＢ基質を青色に転換させた。その後、酸を添加することによって反応を終決させ、４５０ｍｍでウェルを判読し、１３種の親和度をＥＬＩＳＡで評価した。
【0118】
ＰＥＧ化された１３種のペプチドの吸光度を図１０に示した。配列番号９、１０、１１、１４の４種のペプチドは、ＡＧＭ－３３０と類似する吸光度を示した。また、配列番号１２、１３、１５、２０の４種のペプチドは、ＡＧＭ－３３０より増進した吸光度を示した。５番のメチオニン（Ｍ５）残基のロイシン又はノルロイシンへの置換、７番のチロシン（Ｙ７）残基のフェニルアラニンへの置換、及びＣ－末端への反復的なロイシン（Ｌ）及びリシン（Ｋ）残基の挿入が結合力を増進させた。よって、Ｍ５及びＹ７残基の疎水性アミノ酸への置換又はＣ－末端へのＬ及びＫの挿入が結合力を向上できることを示唆する。
【0119】
しかし、配列番号１６乃至配列番号１９のペプチドは、ＡＧＭ－３３０より減少した吸光度を示した。１番のアルギニン（Ｒ１）と２番のヒスチジン（Ｈ２）残基の欠失、Ｎ－末端への反復的なアルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）残基の挿入、及び反転配列は結合力を減少させた。よって、Ｒ１及びＨ２を含めて、配列の方向性が保存されなければならないことを示唆する。
【0120】
実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞に特異的に結合するＡＧＭ－３３０
蛍光顕微鏡を使用して他の細胞株に対する細胞結合分析でＮＣＬに対するＡＧＭ－３３０の特異性を評価した。実験は、多数の癌細胞株、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６と、正常細胞株、ＭＣＦ－１０Ａ及びＣＣＤ－１８Ｃｏを用いて行った。５μｍｏｌ／Ｌ ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣで細胞を１時間にわたって培養した後、共焦点イメージングによって結合特異性を確認した。細胞をＤＡＰＩと共に培養し、核（青色蛍光）を対照染色した。ＮＣＬのＮ－末端ドメインに結合する抗－ＮＣＬ抗体及びＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣでの二重－免疫蛍光染色を通じて、ＡＧＭ－３３０がＮＣＬに結合することを示すＮＣＬとＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣとの間の重畳を確認した（図１１Ａ－Ｂ）。
蛍光顕微鏡を使用して他の細胞株に対する細胞結合分析でＮＣＬに対するＡＧＭ－３３０の特異性を評価した。実験は、多数の癌細胞株、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６と、正常細胞株、ＭＣＦ－１０Ａ及びＣＣＤ－１８Ｃｏを用いて行った。５μｍｏｌ／Ｌ ＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣで細胞を１時間にわたって培養した後、共焦点イメージングによって結合特異性を確認した。細胞をＤＡＰＩと共に培養し、核（青色蛍光）を対照染色した。ＮＣＬのＮ－末端ドメインに結合する抗－ＮＣＬ抗体及びＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣでの二重－免疫蛍光染色を通じて、ＡＧＭ－３３０がＮＣＬに結合することを示すＮＣＬとＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣとの間の重畳を確認した（図１１Ａ－Ｂ）。
【0121】
次に、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－１０Ａ細胞でＮＣＬの相対的な量及び細胞内の位置を確認し、ＮＣＬの発現レベル又は位置の差が癌細胞に対するＡＧＭ－３３０の感受性と関連しているか否かを確認した。細胞の準細胞分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分離し、ウェスタンブロッティングによって細胞内の総ＮＣＬのみならず、細胞基質（ｃｙｔｏｓｏｌ）、核及び細胞膜抽出物でのＮＣＬの発現を分析した。その結果、ＮＣＬ発現は、ＭＣＦ－１０Ａ及びＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞と比較して、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６細胞の膜及び細胞質抽出物で上昇した（図１１Ｃ、図１２Ａ）。全ての細胞株において、ＮＣＬの核レベルの有意な差は観察されなかった。
【0122】
膜－発現ＮＣＬが癌細胞に対するＡＧＭ－３３０結合に決定的であるか否かを調査しようとした。ＮＣＬをノックダウンさせるために、特異的に標的化するｓｉＲＮＡを使用した。ＮＣＬを標的とする３個のｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＣＬ１、ｓｉＮＣＬ２及びｓｉＮＣＬ３）がＮＣＬ－ノックダウン細胞で相違する効能を示すことを確認した。ｓｉＮＣＬ１がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で最も高いノックダウン効能を示したので、追加実験のために選択した（図１２Ｂ）。その次に、ｓｉＮＣＬ１処理後、癌細胞膜でＮＣＬ発現が減少するか否かを確認するために、ｓｉＮＣＬ１処理された細胞の準細胞分画を分離し、ウェスタンブロッティングを通じて細胞基質、核及び細胞膜抽出物でＮＣＬの発現を分析した。その結果、ｓｉＮＣＬ１処理は、細胞基質及び細胞膜分画でＮＣＬの基底発現を強力に抑制した（図１１Ｄ）。ＮＣＬの発現レベル研究結果により、本発明者等は、膜ＮＣＬの発現減少がＡＧＭ－３３０結合に影響を及ぼすことを確認した。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡ－処理細胞は、対照群と類似する蛍光信号を示した。しかし、減少したＡＧＭ－３３０結合により、ｓｉＮＣＬ１－処理群で蛍光信号がほとんど又は全く検出されなかった（図１１Ｅ）。蛍光イメージングは、癌細胞の膜に結合する抗－ＮＣＬ抗体とＡＧＭ－３３０－ＦＩＴＣが抗－ＮＣＬ抗体蛍光と共に共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）されることを示した（図１１Ａ－Ｂ）。また、突然変異分析を通じて、ＮＣＬのＮ－末端ドメインがＮＣＬとＡＧＭ－３３０との間の相互作用を担当することを確認した（図７Ｆ）。前記各結果は、ＡＧＭ－３３０が癌細胞膜で発現されるＮＣＬと直接相互作用することを示唆する。
【0123】
次に、ヒト乳癌の異種移植モデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングを通じてＡＧＭ－３３０の癌－標的化特性を評価した（図１１Ｆ）。ＡＧＭ－３３０がｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞を選択的に標的化できるか否かを調査するために、Ａｌｅｘａ６８０で標識されたＡＧＭ－３３０（ＡＧＭ－３３０－Ａｌｅｘａ６８０）が処理された腫瘍－保有マウス（ｔｕｍｏｒ－ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ）をＡｌｅａｘ６８０単独処理されたマウスと比較した。１時間後、ＡＧＭ－３３０－Ａｌｅｘａ６８０分画腫瘍の近赤外線蛍光（ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ；ＮＩＲＦ）強度は、対照群の腫瘍より有意に高かった：（対照群）３．０４×１０７±１．３８ １０６（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）／（μＷ／ｃｍ２）に比べて、（ＡＧＭ－３３０－Ａｌｅｘａ６８０）１．１９×１０９±１．９０ １０７（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）／（μＷ／ｃｍ２）、ｎ＝３、Ｐ＜０．００１（図１１Ｇ－Ｉ）。また、２時間目に腫瘍及び他の主要臓器でＡＧＭ－３３０－Ａｌｅｘａ６８０とＡｌｅｘａ６８０単独の注射容量百分率を分析し、接合蛍光（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）分布に対するＡＧＭ－３３０の効果を定量的に調査した。腎臓と肝を除いては、腫瘍組織で各器官のグラム当たりのＮＩＲＦ光子の総数は、他の器官の場合よりも遥かに高く、これは、ＡＧＭ－３３０の腫瘍－標的化特性が対照群の場合よりも遥かに高いことを示す決定的な証拠である（図１１Ｊ）。以上の内容をまとめると、ＮＩＲＦイメージは、ＡＧＭ－３３０がｉｎ ｖｉｖｏで正常な器官でない腫瘍組織の全体に主に蓄積されることを示す。
【0124】
実施例６：ＮＣＬと癌進行との間の正の相関関係及び抗－ＮＣＬ抗体の膜ＮＣＬ中和を通じた細胞増殖抑制効果の確認
前記各実施例に基づいて、癌細胞株でＮＣＬ発現パターンを確認した。ヒト癌組織でのＮＣＬ発現を調査するために、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータセットレポジトリ（ｄａｔａｓｅｔ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）を使用して、利用可能な乳癌及び結腸直腸癌データセットを分析した。１４４個の１次乳房組織に比べて、６７個の乳癌腫でＮＣＬが相対的に発現することをＣｕｒｔｉｓデータセットで分析した。ＮＣＬ ｍＲＮＡ発現は、正常乳房組織と比較して乳癌腫で有意に上向き調節された（Ｐ＜０．００１、図１３Ａ）。また、Ａｌｏｎデータセットにおいて、ＮＣＬ ｍＲＮＡの発現は、結腸直腸腺癌腫で正常組織より有意に高かった（Ｐ＜０．０１、図１３Ａ）。その次に、本発明者等は、乳癌と結腸直腸癌の患者において、高いＮＣＬ発現が、疾病のない低い生存率などの不良な予後と関連していることを確認した（Ｂｅｒｔｕｃｃｉ ａｎｄ Ｓｖｅｅｎ ｄａｔａｓｅｔ ｆｒｏｍ ‘Ｒ２：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｈｔｔｐ：／／ｒ２．ａｍｃ．ｎｌ）’）（図１３Ｂ）。これは、乳癌及び結腸直腸癌の患者において、高いＮＣＬ発現が、不良な予後マーカーとしての役割をするという以前の報告書と一致する（ｖａｎ Ｌｏｎｇ ＦＮ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒｓ．２０１８；１０：３９０）。ヒト癌及び正常組織でのＮＣＬ発現分布を決定するために、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）分析でＮＣＬ発現を分析した。ＩＨＣ分析を通じて、ＮＣＬが正常乳房及び結腸直腸組織と比較してヒト乳癌及び結腸直腸癌組織の膜及び細胞質領域で増加したことが明らかになり（図１３Ｃ－Ｄ）、これは、免疫蛍光イメージング（図１１Ａ－Ｂ）及びウェスタンブロッティング（図１１Ｃ）の結果と一致する。また、以前の報告書によると、上向き調節された膜ＮＣＬが、癌増殖及びアポトーシスの抑制に関与するリガンドに対する受容体として相互作用することが明らかになった（Ｃｈｅｎ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５；６：１６２５３－７０）。これによって、膜発現ＮＣＬが癌細胞での機能調節に必須的であるか否かを調査するために、本発明者等は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＨＣＴ－１１６細胞及びＭＣＦ－１０ＡとＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞で単一クローン抗－ＮＣＬ抗体を使用して膜発現ＮＣＬを中和させた。まず、２４時間にわたって相違する濃度で抗体で処理された正常及び癌細胞において細胞生存力を評価した。ＮＣＬ抗体（５０μｇ／ｍｌ）の処理時、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ－１１６細胞で細胞生存率がそれぞれ３５％と３２％減少したが、対照群及びＩｇＧ処理群と比較して、正常細胞では有意な減少が観察されなかった（ＭＣＦ－１０Ａ及びＣＣＤ－１８Ｃｏ）（図１３Ｅ－Ｈ）。また、癌細胞に対する抗－ＮＣＬ抗体の細胞毒性効果の原因を調査するためにアポトーシス分析を行った。２４時間にわたって相違する濃度で抗体で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ－１１６細胞は、アネキシンＶ及びＰＩを使用して染色した。フローサイトメトリーによると、初期及び後期アポトーシス段階で癌細胞の百分率が抗－ＮＣＬ抗体濃度－依存的方式で増加した（図１３Ｉ）。
前記各実施例に基づいて、癌細胞株でＮＣＬ発現パターンを確認した。ヒト癌組織でのＮＣＬ発現を調査するために、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータセットレポジトリ（ｄａｔａｓｅｔ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）を使用して、利用可能な乳癌及び結腸直腸癌データセットを分析した。１４４個の１次乳房組織に比べて、６７個の乳癌腫でＮＣＬが相対的に発現することをＣｕｒｔｉｓデータセットで分析した。ＮＣＬ ｍＲＮＡ発現は、正常乳房組織と比較して乳癌腫で有意に上向き調節された（Ｐ＜０．００１、図１３Ａ）。また、Ａｌｏｎデータセットにおいて、ＮＣＬ ｍＲＮＡの発現は、結腸直腸腺癌腫で正常組織より有意に高かった（Ｐ＜０．０１、図１３Ａ）。その次に、本発明者等は、乳癌と結腸直腸癌の患者において、高いＮＣＬ発現が、疾病のない低い生存率などの不良な予後と関連していることを確認した（Ｂｅｒｔｕｃｃｉ ａｎｄ Ｓｖｅｅｎ ｄａｔａｓｅｔ ｆｒｏｍ ‘Ｒ２：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｈｔｔｐ：／／ｒ２．ａｍｃ．ｎｌ）’）（図１３Ｂ）。これは、乳癌及び結腸直腸癌の患者において、高いＮＣＬ発現が、不良な予後マーカーとしての役割をするという以前の報告書と一致する（ｖａｎ Ｌｏｎｇ ＦＮ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒｓ．２０１８；１０：３９０）。ヒト癌及び正常組織でのＮＣＬ発現分布を決定するために、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）分析でＮＣＬ発現を分析した。ＩＨＣ分析を通じて、ＮＣＬが正常乳房及び結腸直腸組織と比較してヒト乳癌及び結腸直腸癌組織の膜及び細胞質領域で増加したことが明らかになり（図１３Ｃ－Ｄ）、これは、免疫蛍光イメージング（図１１Ａ－Ｂ）及びウェスタンブロッティング（図１１Ｃ）の結果と一致する。また、以前の報告書によると、上向き調節された膜ＮＣＬが、癌増殖及びアポトーシスの抑制に関与するリガンドに対する受容体として相互作用することが明らかになった（Ｃｈｅｎ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５；６：１６２５３－７０）。これによって、膜発現ＮＣＬが癌細胞での機能調節に必須的であるか否かを調査するために、本発明者等は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＨＣＴ－１１６細胞及びＭＣＦ－１０ＡとＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞で単一クローン抗－ＮＣＬ抗体を使用して膜発現ＮＣＬを中和させた。まず、２４時間にわたって相違する濃度で抗体で処理された正常及び癌細胞において細胞生存力を評価した。ＮＣＬ抗体（５０μｇ／ｍｌ）の処理時、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ－１１６細胞で細胞生存率がそれぞれ３５％と３２％減少したが、対照群及びＩｇＧ処理群と比較して、正常細胞では有意な減少が観察されなかった（ＭＣＦ－１０Ａ及びＣＣＤ－１８Ｃｏ）（図１３Ｅ－Ｈ）。また、癌細胞に対する抗－ＮＣＬ抗体の細胞毒性効果の原因を調査するためにアポトーシス分析を行った。２４時間にわたって相違する濃度で抗体で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ－１１６細胞は、アネキシンＶ及びＰＩを使用して染色した。フローサイトメトリーによると、初期及び後期アポトーシス段階で癌細胞の百分率が抗－ＮＣＬ抗体濃度－依存的方式で増加した（図１３Ｉ）。
【0125】
本発明者等は、多様な類型の癌の膜と細胞質でＮＣＬが過剰発現され、ＮＣＬの過剰発現が癌患者の不良な予後生存と関連していることを確認した。前記各結果は、特に癌細胞増殖及びアポトーシスの制御側面で、癌細胞でのＮＣＬ膜部分に対する重要な役割を説明する。以上の内容をまとめると、前記各結果は、ＮＣＬが癌成長に重要な役割をし、膜ＮＣＬ標的化が、化学療法薬物を用いた癌治療と関連して有望なバイオマーカーになり得ることを示唆する。
【0126】
実施例７：パクリタキセル－接合ＡＧＭ－３３０のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びマウス異種移植モデルでの効果的な癌成長抑制効果の確認
パクリタキセル（ＰＴＸ）をＡＧＭ－３３０と接合させ、よく確立された化学療法剤に連結された癌－標的リガンド（ＡＧＭ－３３０－ＰＴＸ）を得た。ＰＴＸは、マレイミド－カルボキシ二官能性リンカーと直交接合（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された。ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸが癌細胞増殖を抑制するか否かを調査するために、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６を含む多くの癌細胞株でＩＣ５０値を評価した（図１４Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、ＰＴＸ単独及びＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸに対するＩＣ５０値は、それぞれ６．８μＭ及び３．６μＭであった。結果は、３つの癌細胞株の全てにおいて類似していた（ＭＣＦ－７、ＨＣＴ－１１６及びＨＴ－２９）。しかし、ＭＣＦ－１０Ａ細胞において、ＰＴＸ単独及びＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸに対するＩＣ５０値は、それぞれ２２．１μＭ及び３５．３μＭであった。
パクリタキセル（ＰＴＸ）をＡＧＭ－３３０と接合させ、よく確立された化学療法剤に連結された癌－標的リガンド（ＡＧＭ－３３０－ＰＴＸ）を得た。ＰＴＸは、マレイミド－カルボキシ二官能性リンカーと直交接合（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された。ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸが癌細胞増殖を抑制するか否かを調査するために、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６を含む多くの癌細胞株でＩＣ５０値を評価した（図１４Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、ＰＴＸ単独及びＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸに対するＩＣ５０値は、それぞれ６．８μＭ及び３．６μＭであった。結果は、３つの癌細胞株の全てにおいて類似していた（ＭＣＦ－７、ＨＣＴ－１１６及びＨＴ－２９）。しかし、ＭＣＦ－１０Ａ細胞において、ＰＴＸ単独及びＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸに対するＩＣ５０値は、それぞれ２２．１μＭ及び３５．３μＭであった。
【0127】
癌細胞株でのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖分析により、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸが潜在的なｉｎ ｖｉｖｏ治療剤になり得るか否かを調査した。ＮＰＧマウスの乳腺脂肪パッドにＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞を接種した。皮下腫瘍が１００ｍｍ３に成長した後、尾静脈注射で週に２回それぞれビヒクル（ＰＢＳ）、ＡＧＭ－３３０ｔ（１６．６８ｍｇ／ｋｇ）、ＰＴＸ（それぞれ２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ（１９．０５ｍｇ／ｋｇ）を処理した５個の群（ｎ＝５／グループ）に動物を分け、比較効能研究を行った（図１４Ｂ）。３週にわたってキャリバールール（ｃａｌｉｂｅｒ ｒｕｌｅ）で週に２回体積を測定することによって、腫瘍成長をモニタリングした。ビヒクル（ＰＢＳ）－処理マウス及びＡＧＭ－３３０－処理マウスは、腫瘍の平均体積で有意な差を示しておらず、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と一致する。しかし、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ（８０７±９０ｍｍ３ ｆｏｒ １９．０５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）処理マウスの腫瘍の平均体積は、同一の容量のＰＴＸ（１６７１±１９９ｍｍ３ ｆｏｒ ２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５、Ｐ＜０．００１）処理動物に比べて約５２％減少した。また、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ－処理マウスは、ｄａｙ ２１にＰＴＸ－処理マウスの５倍増加した容量と比較して向上した薬物効能を示した（９８８±７８ｍｍ３ ｆｏｒ １０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）（図１４Ｃ－Ｄ）。前記結果と一致して、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ（１．３±０．１ｇ ｆｏｒ １９．０５ｍｇ／ｋｇ）処理マウスの腫瘍の最終平均重さは、ＰＴＸ（それぞれ２．１±０．４ｇ ｆｏｒ ２ｍｇ／ｋｇ及び１．５±０．１ｇ ｆｏｒ １０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）に比べて著しく減少した（図１４Ｅ）。
【0128】
また、切除された腫瘍の組織学的染色を行い、独立的な病理学者がスライドを評価した。それぞれＨ＆Ｅ染色、Ｋｉ－６７及びＴＮＥＬ分析によって立証されたように、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ－処理マウスから切除された中間腫瘍は、癌性細胞数の減少及びアポトーシス細胞核の増加を示した（図１４Ｆ－Ｉ）。対照的に、ビヒクル（ＰＢＳ）－及びＡＧＭ－３３０ｔ－処理腫瘍は、さらに多くの数の腫瘍細胞を含有しており、アポトーシスの兆候はほとんどなかった。また、マウスの体重は、ビヒクル（ＰＢＳ）投与と比較してＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ投与によって影響を受けておらず、血液化学分析は、ＡＧＭ－３３０ｔ－ＰＴＸ－処理マウスで毒性の有害な兆候を示さなかった（図１５Ａ－Ｆ）。よって、このような発見は、ＡＧＭ－３３０の腫瘍特異性が、検出可能な副作用なしでＰＴＸの効能を向上できることを示唆する。結果的に、本発明に係るＡＧＭ－３３０は、癌治療に対する潜在的な治療薬物伝達体になり得ることを示唆する。
さらに、ＰＥＧ化免疫原性の影響を減少させるために、ＡＧＭ－３３０ｔよりＰＥＧ化程度の低いＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸを使用して抗癌効能を試験した（図１６Ａ）。その結果、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ－処理マウスは、ＰＴＸ－処理マウスと比較してルシフェラーゼ活性の劇的な減少を示した（図１６Ｃ－Ｄ）。また、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ処理によると、ＰＴＸ－処理群と比較して腫瘍の体積及び重量が著しく減少した（図１６Ｅ－Ｇ）。ＡＧＭ－３３０－ＰＴＸと同様に、マウスの体重は、ビヒクル（ＰＢＳ）投与と比較してＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ投与によって影響を受けなかった（図１６Ｈ）。ＡＧＭ－３３０ｄの癌特異性は、ＰＴＸの効能を向上させ、腫瘍組織で治療薬物の濃度を増加させることができる。
さらに、ＰＥＧ化免疫原性の影響を減少させるために、ＡＧＭ－３３０ｔよりＰＥＧ化程度の低いＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸを使用して抗癌効能を試験した（図１６Ａ）。その結果、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ－処理マウスは、ＰＴＸ－処理マウスと比較してルシフェラーゼ活性の劇的な減少を示した（図１６Ｃ－Ｄ）。また、ＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ処理によると、ＰＴＸ－処理群と比較して腫瘍の体積及び重量が著しく減少した（図１６Ｅ－Ｇ）。ＡＧＭ－３３０－ＰＴＸと同様に、マウスの体重は、ビヒクル（ＰＢＳ）投与と比較してＡＧＭ－３３０ｄ－ＰＴＸ投与によって影響を受けなかった（図１６Ｈ）。ＡＧＭ－３３０ｄの癌特異性は、ＰＴＸの効能を向上させ、腫瘍組織で治療薬物の濃度を増加させることができる。
【0129】
実施例８：ＡＧＭ－３３０とＣＰＰとが結合された融合ペプチドの合成
ＡＧＭ－３３０の細胞透過性を増加させるために、細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）を結合させ、融合ペプチドを製作した。
ＡＧＭ－３３０ｔにマレイミドと結合したＣＰＰ（ＲＩＭＲＩＬＲＩＬＫＬＡＲ；配列番号４８）をｐＨ７．０～７．５で反応させると、ＡＧＭ－３３０ｔの官能基であるチオール基とチオール－マレイミド反応によって結合され、ＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドが合成される（図１７）。
ＡＧＭ－３３０の細胞透過性を増加させるために、細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）を結合させ、融合ペプチドを製作した。
ＡＧＭ－３３０ｔにマレイミドと結合したＣＰＰ（ＲＩＭＲＩＬＲＩＬＫＬＡＲ；配列番号４８）をｐＨ７．０～７．５で反応させると、ＡＧＭ－３３０ｔの官能基であるチオール基とチオール－マレイミド反応によって結合され、ＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドが合成される（図１７）。
【0130】
製作されたＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドのＨＰＬＣ及びＭＳ分析結果、保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）２３．２分及び分子量７８７６Ｄａであることを確認し、ＡＧＭ－３３０ｔ、マレイミド－ｍＣＰＰの分析結果と共に図１８に示した。
【0131】
実施例９：ＡＧＭ－３３０とＣＰＰとが結合された融合ペプチドの細胞毒性の確認
実施例８で製作されたＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドの細胞毒性を調査するために、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６及びＰＡＮＣ－１を含む多くの癌細胞とＣＣＤ－１８Ｃｏの正常細胞でＩＣ５０値を評価した（表７）。
実施例８で製作されたＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドの細胞毒性を調査するために、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６及びＰＡＮＣ－１を含む多くの癌細胞とＣＣＤ－１８Ｃｏの正常細胞でＩＣ５０値を評価した（表７）。
【表7】
【0132】
ＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドのＩＣ５０値は、大腸癌細胞株ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６に対してそれぞれ７．８２９μＭ及び４．７１４μＭ、乳癌細胞株ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対してそれぞれ７.１７３μＭ及び２０μＭ以上を示した（図１９）。これは、ＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドが癌細胞特異的な抑制効果を有することを意味する。
【0133】
実施例１０：ＡＧＭ－３３０とＣＰＰとが結合された融合ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ癌細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導効果の確認
実施例８で製作されたＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドの癌細胞アポトーシス誘導効果を調査するために、４８時間にわたってＣＰＰ、ＡＧＭ－３３０ｔ及びＡＧＭ－３３０ｔ－ＣＰＰで処理したＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９及びＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞をアネキシンＶ及びＰＩを使用して染色した。その結果、癌細胞特異的アポトーシス誘導効果を確認し（図２０）、ＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰの濃度別の実験結果、濃度－依存的方式でアポトーシス促進タンパク質が増加することを確認した（図２１）。
実施例８で製作されたＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰ融合ペプチドの癌細胞アポトーシス誘導効果を調査するために、４８時間にわたってＣＰＰ、ＡＧＭ－３３０ｔ及びＡＧＭ－３３０ｔ－ＣＰＰで処理したＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９及びＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞をアネキシンＶ及びＰＩを使用して染色した。その結果、癌細胞特異的アポトーシス誘導効果を確認し（図２０）、ＡＧＭ－３３０ｔ－ｍＣＰＰの濃度別の実験結果、濃度－依存的方式でアポトーシス促進タンパク質が増加することを確認した（図２１）。
【0134】
実施例１１：ＡＧＭ－３３０及びＡＧＭ－３３０－ＣＰＰ併用効果の確認
実施例８のような方法によって製作されたＡＧＭ－３３０ｍ－ｍＣＰＰ、ＡＧＭ－３３０ｄ－ｄＣＰＰ及びＡＧＭ－３３０ｔ－ｔＣＰＰ融合ペプチドのそれぞれとこれらの組み合わせの細胞毒性を調査するために、ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１でＩＣ５０値を評価した。
実施例８のような方法によって製作されたＡＧＭ－３３０ｍ－ｍＣＰＰ、ＡＧＭ－３３０ｄ－ｄＣＰＰ及びＡＧＭ－３３０ｔ－ｔＣＰＰ融合ペプチドのそれぞれとこれらの組み合わせの細胞毒性を調査するために、ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１でＩＣ５０値を評価した。
【0135】
ＡＧＭ－３３０ｍ－ｍＣＰＰ、ＡＧＭ－３３０ｄ－ｄＣＰＰ及びＡＧＭ－３３０ｔ－ｔＣＰＰ融合ペプチドのＩＣ５０値は、大腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６に対してそれぞれ２３．３μＭ、５．４７μＭ及び３．７９μＭを示し、ＨＴ－２９に対してそれぞれ２０．６７μＭ、３．７５μＭ及び３．３μＭを示す一方で、乳癌細胞株ＭＣＦ－７に対してそれぞれ＞２０μＭ、４．２０８μＭ及び３．８０２μＭを示し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対してそれぞれ＞２０μＭ、３．８４３μＭ及び３．４９７μＭを示した（図２２）。結果的に、ＡＧＭ－３３０－ＣＰＰ融合ペプチドが癌細胞特異的抑制効果を有することを確認することができる。
【0136】
ＡＧＭ－３３０ｍ及びＡＧＭ－３３０ｍ－ｍＣＰＰ、ＡＭＧ－３３０ｄ及びＡＧＭ－３３０ｄ－ｄＣＰＰ、そして、ＡＧＭ－３３０ｔ及びＡＧＭ－３３０ｔ－ｔＣＰＰ融合ペプチドの併用時、ＩＣ５０値は、大腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６に対してそれぞれ１４．３μＭ、４．２５μＭ及び３．１５μＭを示し、ＨＴ－２９に対してそれぞれ１４．２μＭ、４．７６μＭ及び３．０５μＭを示す一方で、乳癌細胞株ＭＣＦ－７に対してそれぞれ１８．７μＭ、３．４１６μＭ及び３．３０９μＭを示し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対してそれぞれ１４．７μＭ、３．６６２μＭ及び３．２５８μＭを示した（図２３）。結果的に、ＡＧＭ－３３０及びＡＧＭ－３３０－ＣＰＰの併用時にも、癌細胞特異的抑制効果を示すことを確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【0137】
本発明では、ＭＡＰ合成方法及びＯＢＯＣ組み合わせ方法を使用してスクリーニングしたＡＧＭペプチドリガンド及びその変異体が癌細胞に特異的に結合し、抗癌剤との接合体が癌成長を抑制することを確認した（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ）。よって、ＮＣＬ－標的化ＡＧＭは、癌治療法で診断及び標的薬物伝達に有用に利用可能である。
【0138】
以上では、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【国際調査報告】