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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】成分を特徴付けるための装置に関する又は関連する改良
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20230614BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230614BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230614BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230614BHJP
G01N 35/10 20060101ALI20230614BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20230614BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230614BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230614BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20230614BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 597
G01N33/68
G01N33/50 P
G01N33/50 Z
G01N33/53 D
G01N35/10 A
G01N37/00 101
C12M1/00 A
C12M1/34 F
C12M1/34 Z
C12Q1/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022571765
(86)(22)【出願日】2021-05-21
(85)【翻訳文提出日】2023-01-23
(86)【国際出願番号】 GB2021051244
(87)【国際公開番号】W WO2021234411
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】2007690.7
(32)【優先日】2020-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518296506
【氏名又は名称】フルイディック・アナリティクス・リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】508311226
【氏名又は名称】ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100106080
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 晶子
(72)【発明者】
【氏名】デベニッシュ，ショーン
(72)【発明者】
【氏名】ノウルズ，ツォーマス
(72)【発明者】
【氏名】コスモリアプトシス，バシリス
(72)【発明者】
【氏名】マイスル，ゲオルク
(72)【発明者】
【氏名】プリディ，アシュリー
(72)【発明者】
【氏名】シャイト，トム
(72)【発明者】
【氏名】シュナイダー，マティアス
(72)【発明者】
【氏名】シュウ，キャサリン
【テーマコード（参考）】
2G045
2G058
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA26
2G045DA13
2G045DA30
2G045DA36
2G058AA09
2G058CC09
2G058DA02
2G058EA19
4B029AA07
4B029BB15
4B029BB20
4B029CC01
4B029FA12
4B029FA15
4B029GA08
4B029GB04
4B029GB06
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
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4B063QQ52
4B063QQ67
4B063QQ79
4B063QR66
4B063QS15
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
生体分子を特徴付けるための装置を提供する。該装置は、生体分子を含むサンプル流体を装置に導入するように構成されたサンプル入口チャネルと；補助流体を装置に導入するように構成された補助入口チャネルと；サンプル入口チャネル及び補助入口チャネルと流体連通している分配チャネル（前記分配チャネルは生体分子の分配を生ずるように適応されている）と；生体分子のシグネチャプロファイルを検出して、検出生体分子の測定データセットを取得するように構成された測定モジュールと；測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所と；そして格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュール（前記分析モジュールはさらに、相関値を使用して生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定するように構成されている）とを含む。生体分子を特徴付けるための方法も提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体分子を特徴付けるための装置であって、前記装置は、生体分子を含むサンプル流体を装置に導入するように構成されたサンプル入口チャネルと；
補助流体を装置に導入するように構成された補助入口チャネルと；
サンプル入口チャネル及び補助入口チャネルと流体連通している分配チャネル（前記分配チャネルは生体分子の分配を生ずるように適応されている）と；
生体分子のシグネチャプロファイルを検出して、検出生体分子の測定データセットを取得するように構成された測定モジュールと；
測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所と；そして
格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュール（前記分析モジュールはさらに、相関値を使用して生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定するように構成されている）と
を含む装置。
【請求項2】
前記装置が、格納場所から格納データセットを受け取り、分析モジュールから測定データセットを受け取って、測定データセットと関連する一つ又は複数のパラメーターをさらに調整するように構成されたコントローラーと；そしてオペレーターに更なる測定サイクルを指示する通知を出し、その結果、得られた更なる測定が、生体分子の決定された特徴に、予め決められた信頼水準を提供するように構成された、コントローラーと関連付けられた出力モジュールとをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項3】
前記分配チャネルが生体分子の横方向分配を生じるように適応されている、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項4】
前記装置が、分配チャネルの流体を二つ以上の流れに分割するために少なくとも二つの出口チャネルをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項5】
前記分析モジュールが、各生体分子の濃度及びアフィニティーを検出及び決定するように構成されている、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項6】
前記分析モジュールが、各生体分子の濃度及びアビディティーを検出及び決定するように構成されている、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項7】
前記分析モジュールがさらに、各生体分子の化学量論を検出及び決定するように構成されている、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項8】
前記分配チャネルがＴ－センサーである、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項9】
生体分子が、フルオロフォア、量子ドット又はナノ粒子で標識されている、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項10】
生体分子を標識するために選択されるフルオロフォアが遠赤色スペクトル領域にある、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項11】
電極を分配チャネルの上流に設け、電極を分配チャネルの下流に設けて、分配チャネルを横切る電界を印加するように構成されている、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項12】
生体分子が、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は多糖である、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項13】
生体分子が、抗体又はその抗体フラグメントである、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項14】
抗体がアロ抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項15】
生体分子が多生体分子混合物である、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項16】
多生体分子混合物が抗体と抗原を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項17】
抗原が標識される、請求項１６に記載の装置。
【請求項18】
サンプル流体が生体分子を含むヒト血清である、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項19】
生体分子を特徴付けるための方法であって、該方法は、サンプル流体のフローをサンプル入口チャネルに導入し；
補助流体のフローを補助入口チャネルに導入し；
サンプル流体のフローと補助流体のフローを分配チャネルで接触させて流体の層流を作り出し；
接触しているサンプルと補助流体との間で生体分子の分配を生成し；
測定モジュールを用いて生体分子のシグネチャプロファイルを検出して、検出生体分子の測定データセットを取得し；
測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所を提供し；
格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュールを提供し；そして
相関値を利用して、生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定する
工程を含む方法。
【請求項20】
格納場所から格納データセットを受け取り、分析モジュールから測定データセットを受け取って、測定データセットと関連する一つ又は複数のパラメーターをさらに調整するように構成されたコントローラーを提供し；そしてオペレーターに、コントローラーと関連付けられた出力モジュールを用いて、更なる測定サイクルを指示する通知を出し、その結果、得られた更なる測定が、生体分子の決定された特徴に、予め決められた信頼水準を提供する
工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
横方向分配が拡散によって作り出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
横方向分配が電界の印加を通じて電気泳動的に作り出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
生体分子の測定がマイクロ流体拡散サイジングによって決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項24】
横方向分配が熱泳動によって作り出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項25】
前記分析モジュールが、各生体分子の濃度及びアフィニティー又はアビディティーを検出及び決定するように構成されている、請求項１９～２４に記載の方法。
【請求項26】
前記分析モジュールが、各生体分子の化学量論を検出及び決定するようにさらに構成されている、請求項１９～２５に記載の方法。
【請求項27】
蛍光分光法を用いて生体分子を検出する工程をさらに含む、請求項１９～２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、液体サンプル内に存在する生体分子などの成分を特徴付けるための装置に関する。特に、本発明は、成分の少なくとも二つの特徴を同時に決定するように構成された装置に関する。
【0002】
本発明につながる研究は、欧州連合第７次フレームワークプログラム(European Union’s Seventh Framework Programme)（ＦＰ７／２００７－２０１３）よりＥＲＣ助成契約第３３７９６９号の下、及び欧州連合ホライズン２０２０研究とイノベーションプログラム(European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme)より助成契約第７６６９７２号の下、資金提供を受けた。
【背景技術】
【0003】
タンパク質間の相互作用は、タンパク質自己集合；タンパク質凝集；抗体－抗原認識；筋収縮、及び細胞間コミュニケーションを含む多くの生物学的及び生理学的関連プロセスの基礎を形成する。それにもかかわらず、タンパク質間相互作用の研究は、特に複雑な媒体中の生理学的条件下では今も困難なままである。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ビーズベースのマルチプレックスアッセイ、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法などの現行技術は、一方の結合パートナーの固定を必要とする。これらの技術は、偽陽性結果を招きうる表面との非特異的相互作用の可能性や偽陰性結果を引き起こすＨｏｏｋ／Ｐｒｏｚｏｎｅ効果を含むため、半定量的な分析しかすることができない。
【0004】
ヒト血清中に豊富に含まれている４５００を超えるタンパク質の多くが有望なバイオマーカーと考えられている。そのようなバイオマーカーは、がん、心臓血管疾患、タンパク質ミスフォールディング病、２型糖尿病、精神障害、及び治験の検証を含む多くの疾患の診断に有用なツールであるばかりでなく、自己免疫疾患及び移植片拒絶の重要な指標となることも提案されている。バイオマーカーレベルの評価は、特に長期評価の場合、絶対的定量のために定量的かつ再現可能な手順が必要となる。特異的な生体分子の絶対的存在量と結合特性は、特定の疾患の罹患率と相関したり、潜在的な免疫学的リスクの証明として機能したりする。ヒトサンプルの絶対的定量は、診断のための新規バイオマーカーの発見を効率化するばかりか、濃度とアフィニティーの免疫応答の発生に対する相関を可能にすることを通じて有害プロセスの理解を得ることにも役立つ。
【0005】
臨床的意義を有するバイオマーカーの例として、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）（ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）としても知られる）に対する抗体の結合挙動は、多数の研究に適したバイオマーカーとして認定されている。ＨＬＡの特徴的でユニークな構造により、多数の病原体の認識が容易になる。従って、ＨＬＡは、自己と外来物又は悪性物、例えば病原体又は外来の細胞及び組織との間の区別に関与している。ＨＬＡは、外来臓器の認識に極めて重要で、同種移植の拒絶反応に関連しているため、臓器移植前の組織適合性スクリーニングは必須である。
【0006】
現在、臨床的なタンパク質の検出及び定量のための公知手法はいずれも、例えばＥＬＩＳＡアッセイの場合のように、表面固定又はビーズ固定を必要とするアッセイを含む。ＥＬＩＳＡアッセイは、比較的高感度（通常、およそ１００μＬ中ｆｍｏｌ単位の感度で、１０，０００～１００，０００分子に十分相当する）を達成できるが、生理学的に関連するプロセスは溶液中で起こるのに、溶液中での結合相互作用を説明する生物物理学的パラメーターを決定することはできない。
【0007】
最近、タンパク質分子を検出するために抗体ペアを使用したり、相対強度を読み出すためにフローサイトメトリー用に開発された装置を使用するなど、増強された感度を達成するための代替戦略が出現している。しかしながら、これらのアッセイもやはりビーズの表面上で実施されるため、上述の表面ベース技術に通常見られる不利益に遭遇する。
【0008】
そこで、体液中のバイオマーカーとそれらの特異的標的との間の相互作用についての具体的濃度、アフィニティー、及び正確な相互作用化学量論を完全に定量的に検出及び決定するために使用できる溶液内プラットフォームを提供することが求められている。
【0009】
本発明が生じたのは、そのような背景に対してである。
【発明の概要】
【0010】
本発明の側面に従って、生体分子を特徴付けるための装置を提供し、該装置は、
生体分子を含むサンプル流体を装置に導入するように構成されたサンプル入口チャネルと；
補助流体を装置に導入するように構成された補助入口チャネルと；
サンプル入口チャネル及び補助入口チャネルと流体連通している分配チャネル（前記分配チャネルは生体分子の分配を生ずるように適応されている）と；
生体分子のシグネチャプロファイル(signature profile)を検出して、検出生体分子の測定データセットを取得するように構成された測定モジュールと；
測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所と；そして
格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュール（前記分析モジュールはさらに、相関値を使用して生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定するように構成されている）と
を含む。
生体分子を含むサンプル流体を装置に導入するように構成されたサンプル入口チャネルと；
補助流体を装置に導入するように構成された補助入口チャネルと；
サンプル入口チャネル及び補助入口チャネルと流体連通している分配チャネル（前記分配チャネルは生体分子の分配を生ずるように適応されている）と；
生体分子のシグネチャプロファイル(signature profile)を検出して、検出生体分子の測定データセットを取得するように構成された測定モジュールと；
測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所と；そして
格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュール（前記分析モジュールはさらに、相関値を使用して生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定するように構成されている）と
を含む。
【0011】
本発明の装置は、ヒト血清サンプルなどのヒトサンプルにおける生物物理学的結合パラメーターの決定を可能にする。本明細書中に開示されている技術は、解離定数又はアフィニティーＫｄ、サンプル中に存在する抗体の絶対濃度、ならびに相互作用の化学量論の決定を可能にする。
【0012】
血清濃度ならびに標識抗原濃度を様々に変化させるグローバル分析を使用することにより、特徴付け(characterisation)をベイズ分析を用いて精密化(refine)ことが可能になる。
【0013】
一部の場合において、各生体分子の二つの特徴を同時に検出及び測定することは、ＥＬＩＳＡなどの公知測定技術からは得られない生体分子の特性に関する更なる詳細情報を提供することになるので非常に有益でありうる。例えば、本装置は、生体分子の濃度とアフィニティーを同時に検出及び決定するために使用することができる。さらに又はあるいは、本装置は生体分子の濃度とアビディティーを同時に検出及び決定するために使用することができる。
【0014】
本発明の装置は、溶液中で生体分子とその結合パートナーの検出及び決定を可能にしうる。一部の態様においては、生体分子間相互作用が本発明の装置を用いて特徴付けできる。一部の態様において、本装置は、結合及び／又は非結合生体分子を検出及び決定するために使用できる。生体分子とその結合パートナー双方の相対濃度を変えることができる。生体分子が表面に結合されている場合、ユーザーは結合生体分子の濃度を自由に変えることができない。
【0015】
さらに、表面に固定された生体分子は、それらの自然な状態(native state)を真に反映しているとは言えない。なぜならば、表面に固定するために化学リンカーなどの固定化スピシーズが生体分子に結合されることが多いからである。このことは、表面に固定された生体分子の自然な状態又は機能的活性に影響を及ぼしうる。本発明に記載の装置は、例えば結合相互作用などを研究するために、生体分子を表面に固定する技術を必要としない。従って、生体分子間の相互作用が、溶液中でそれらの自然な状態で決定及び検出できる。
【0016】
一部の態様において、本装置は、生体分子が、タンパク質、ペプチド、エクソソーム、抗体又はその抗体フラグメント、ＤＮＡ又はＤＮＡ断片、ＲＮＡ又はｍＲＮＡなどのヌクレオチド、又は多糖である生体分子などの成分を特徴付けるために使用できる。
【0017】
一部の態様において、生体分子は、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は多糖である。一部の態様において、生体分子は、抗体又はその抗体フラグメントである。一部の態様において、抗体は、アロ抗体、自己抗体、又は外部抗原に対して生じた抗体である。本文脈における用語“アロ抗体（同種抗体）”は、臓器移植の分野で、ＨＬＡなどの外来分子を認識する抗体を指すのに使用される。
【0018】
一部の態様において、生体分子は、多生体分子混合物(multi-biomolecule mixture)である。一部の態様において、生体分子は、抗体、シングルドメイン抗体又はアプタマーなどのアフィニティー試薬でありうる。一部の態様において、多生体分子混合物は、抗体及び抗原を含む。一部の態様において、多生体分子混合物中の一つの生体分子を標識できる又は少なくとも二つ以上の生体分子を標識できる。一部の態様において、目的とする他の生体分子を検出するために抗体を標識できる。一部の場合、目的抗体はサンプル中で他の抗体と混合されているかもしれないという事実のため、抗原を標識することが好ましい。
【0019】
一部の態様において、サンプル流体は、任意のタイプのヒト体液又はサンプルでありうる。一部の態様において、サンプル流体は、生体分子を含むヒト血清でありうる。
ベイズ分析は、ヒト血清サンプルなどのサンプルのアフィニティーと抗体濃度の両方を同時に、極めて正確にそして安定的に(robust manner)定量するのに使用できるため有益でありうる。
ベイズ分析は、ヒト血清サンプルなどのサンプルのアフィニティーと抗体濃度の両方を同時に、極めて正確にそして安定的に(robust manner)定量するのに使用できるため有益でありうる。
【0020】
一部の態様において、測定データセットは以下の一つ又は複数を含みうる。例えば、自己蛍光バックグラウンド測定、フロープロファイル、標識血清サンプルなどの標識サンプルの濃度、化学量論相互作用、相互作用している生体分子の分子量、全リガンド濃度、結合部位、サイズ、電荷、翻訳後修飾などの修飾、例えばメチル化、及び／又は流体力学的半径などであるが、これらに限定されない。
【0021】
一部の態様において、体液中の分子を絶対的に検出及び定量できる溶液内技術としてマイクロ流体プラットフォームが使用できる。さらに詳しくは、該プラットフォームは、ヒト血清中の抗体の存在量とアフィニティーを定量するように構成されている。それによって、抗体が反応する抗原を外から添加し、複合体の流体力学的半径の変化を血清濃度の関数としてモニターする。
【0022】
一部の態様において、本装置はさらに、格納場所から格納データセットを受け取り、分析モジュールから測定データセットを受け取って、測定データセットと関連する一つ又は複数のパラメーターをさらに調整するように構成されたコントローラーと；オペレーターに更なる測定サイクルを指示する通知を出し、その結果、得られた更なる測定が、生体分子の決定された特徴に、ユーザーによって設定された予め決められた信頼水準を提供するように構成された、コントローラーと関連付けられた出力モジュールとを含む。
【0023】
信頼水準は得られた測定に関連する統計誤差分析を含みうる。信頼水準は、予め決められた閾値としてユーザーが設定できる。初期測定セットの結果として閾値又は水準に到達しなかったら、更なるデータセットを取得して、ユーザーによって設定された予め決められた閾値又はレベルに到達するまで信頼水準を上げる。一部の態様において、信頼水準は、サンプル内の生体分子間の相互作用、例えばヒト血清サンプル中の抗体と抗原間の相互作用などを考慮に入れることができる。
【0024】
本発明の装置と方法は、反復プロセスを提供する。（時間的に）前の測定は、測定データセットと関連する一つ又は複数のパラメーターを最適化するためにコントローラーにフィードバックできる。コントローラーは出力モジュールと関連付けられているので、出力モジュールはオペレーターに更なる測定サイクルの指示を通知できる。これにより、データセットの最も情報豊富な部分において測定を実施することが可能になる。ひいては、アフィニティー及び濃度などの生体分子の決定された特徴において信頼水準の向上が提供される。これにより、生体分子のアフィニティー及び濃度の更なる測定値を得るために必要な時間が短縮される。
【0025】
一部の態様において、信頼水準は、予め決められた閾値を設定するために統計分析を用いて決定することができる。一部の態様において、信頼水準値は、許容可能な統計範囲及び／又は標準偏差内になるようにユーザーが設定することができる。
【0026】
一部の態様において、本装置はさらに、患者血清中のヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）とアロ特異的抗体との間の相互作用の量を決定及び分析するために、さらに詳しくは、同種移植片（アログラフト）拒絶反応のリスクを評価するために、マイクロ流体拡散分析（ＭＤＳ）の使用を含みうる。この手法を用いると、解離定数、Ｋｄ、アロ特異的抗体の絶対濃度、及び相互作用の化学量論を同時に決定することが可能である。
【0027】
一部の態様において、本発明の装置を用いて特徴付けできる分子の濃度は未知であり、その濃度は、ベイズ分析のような異なるデータフィッティング法を使用して、測定値を得るために必要な血清の画分(fraction)とＨＬＡの濃度を決定し、これらの測定値を分析することを通じて決定することができる。
【0028】
さらに、本明細書中に記載の装置と方法は、より広く適用可能であり、例えば自己免疫疾患において異なる抗体を検出できることにより、患者の免疫状態をプロファイリングできる手段と評することができる。
【0029】
一部の態様において、分配チャネルは、生体分子の横方向分配を生じるように適応されている。分配チャネルは、拡散による横方向分配を可能にする十分な長さ／幅でありうる。一部の態様において、分配チャネルは、２ｍｍ～１００ｍｍ、例えば２０ｍｍの長さを有しうる。一部の態様において、分配チャネルは、２、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０ｍｍより長い長さを有しうることも、又は１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｍｍより短いこともある。分配チャネルは、３０ミクロン～３，０００ミクロン、例えば２０～２５００ミクロン、２０～２０００ミクロン、２０～１５００ミクロン、２０～１０００ミクロン、２０～７５０ミクロン、２０～５００ミクロン、２０～４００ミクロン、又は２０～３００ミクロンの幅を有しうる。一部の態様において、分配チャネルの幅は、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、２５０、又は２８０ミクロンを超過しうることも、又は３００、２８０、２５０、２２０、２００、１８０、１５０、１２０、１００、８０、６０、又は４０ミクロンより小さいこともある。例えば、分配チャネルは、４０×４０ミクロンの幅と２３ｍｍの長さを有しうる。更なる例において、分配チャネルは、５０×７０ミクロンの幅と１０ｍｍの長さを有しうる。
【0030】
あるいは、分配チャネルは、それにまたがる電界を有することによって電気泳動による成分の分配を可能にするように“適応”されてもよい。あるいは、分配チャネルは、生体分子を分配するために熱泳動を可能にするように構成された熱源を提供するように適応されてもよい。
【0031】
一部の態様において、生体分子の横方向(lateral)分配は、分配チャネルに沿った流体の流れに垂直である。
一部の態様において、分配チャネルは、生体分子の長手方向(longitudinal)分配を生じるように適応されてもよい。そのような態様においては、生体分子の分配は、分配チャネルを通る流れに平行（すなわち流れの方向）である。生体分子の分配は、定常状態条件下、又は反対にフロー条件下で起こりうる。
一部の態様において、分配チャネルは、生体分子の長手方向(longitudinal)分配を生じるように適応されてもよい。そのような態様においては、生体分子の分配は、分配チャネルを通る流れに平行（すなわち流れの方向）である。生体分子の分配は、定常状態条件下、又は反対にフロー条件下で起こりうる。
【0032】
一部の態様において、本装置はさらに、分配チャネルの流体を二つ以上の流れに分割するために少なくとも二つの出口チャネルを含みうる。出口チャネルの少なくとも一つは、測定モジュールが生体分子の一つ又は複数のシグネチャプロファイルを検出及び測定できる測定ゾーンを含みうる。
【0033】
一部の態様において、分析モジュールは、各生体分子の濃度及びアフィニティーを検出及び決定するように構成することができる。濃度及びアフィニティーの測定は、生体分子が個別に、又は例えばタンパク質間相互作用において他の成分と複合して、どのように挙動するかについての有用な情報を提供できる。
【0034】
一部の態様において、分析モジュールは、各生体分子の濃度及びアビディティーを検出及び決定するように構成されてもよい。本明細書に開示されているように、そして別に定義されない限り、用語“アビディティー”は、結合部位が二つ以上ある場合の生体分子などの成分間の相互作用の総結合強度を指す。一例として、抗体と抗原間の相互作用の結合強度が決定できる。一部の態様において、抗体－ＨＬＡ相互作用の総結合強度が決定できる。用語“アビディティー”は、多数の結合部位を有する多価生体分子の結合の定量に適用できる。アビディティーの測定は、すべての利用可能な結合部位における相互作用を考慮する。一例として、ＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＥのような少なくとも二つの結合部位を有する生体分子のアビディティーが定量できる。
【0035】
本明細書に開示されているように、そして別に定義されない限り、用語“アフィニティー”は、一つの結合部位における生体分子などの成分の結合測定値を指す。
任意に、分析モジュールは、以下の一つ又は複数を決定するように構成することができる。すなわち、フロープロファイル、標識血清サンプルなどの標識サンプルの濃度、化学量論相互作用、相互作用している生体分子の分子量、全リガンド濃度、結合部位、サイズ、電荷、翻訳後修飾などの修飾、例えばメチル化、及び／又は流体力学的半径。
任意に、分析モジュールは、以下の一つ又は複数を決定するように構成することができる。すなわち、フロープロファイル、標識血清サンプルなどの標識サンプルの濃度、化学量論相互作用、相互作用している生体分子の分子量、全リガンド濃度、結合部位、サイズ、電荷、翻訳後修飾などの修飾、例えばメチル化、及び／又は流体力学的半径。
【0036】
一部の態様において、分析モジュールはさらに、各生体分子の化学量論を検出及び決定するように構成することができる。
本発明に開示されているような装置を使用することにより、体液中のバイオマーカーとそれらの特異的標的との間の相互作用についての具体的濃度、アフィニティー、及び正確な相互作用化学量論を完全に定量的に検出することができる。
本発明に開示されているような装置を使用することにより、体液中のバイオマーカーとそれらの特異的標的との間の相互作用についての具体的濃度、アフィニティー、及び正確な相互作用化学量論を完全に定量的に検出することができる。
【0037】
一部の態様において、分配チャネルはＴ－センサーでありうる。一部の態様において、分配チャネルは、サンプル入口チャネル、補助入口チャネル、及び出口チャネルと一緒になってＨ－フィルターを形成しうる。本明細書の文脈において、用語Ｔ－センサーは、正確に二つの入口を有する分配チャネルを説明するために使用され、用語Ｈ－フィルターは正確に二つの入口と正確に二つの出口を有する分配チャネルである。一部のＴ－センサー及びＨ－フィルターはそれらの入口の間が１８０°であるが、これは必須ではない。
【0038】
一部の態様において、生体分子は、フルオロフォア（発蛍光団）、量子ドット又はナノ粒子などの標識を含む。一部の態様において、生体分子はフルオロフォアで標識される。フルオロフォアは、ユーザーが目的の生体分子を視覚的に検出することを可能にする。フルオロフォアの例は、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアである。適切なフルオロフォアの他の例は、これらに限定されないが、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ、ＡＴＴＯ、ＤｙＬｉｇｈｔ、又はその他のファミリーなどで、ＤｙＬｉｇｈｔ ３５０、ＡＴＴＯ ４８８、ＤＹ－４８９ＸＬ、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ６４７又はＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ７００などの個別色素によって例示されるが、これらに限定されない。色素は可視波長の蛍光に限定されず、スペクトルのＵＶ、可視又はＩＲ領域で活性でもよい。
【0039】
選択される標識は、蛍光検出のために信頼できる安定な標識戦略を提供できる。
一部の態様において、標識戦略は、ＨＬＡを特異的に標識するため及び抗体－ＨＬＡ相互作用の化学量論を制御するために展開できる。一部の態様において、ＨＬＡは、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７などの蛍光色素で共有結合的に標識できる。これにより、タンパク質の自己蛍光（トリプトファン蛍光）が検出を妨害しなことが確保される。というのも、サンプルからの自己蛍光の複雑さは、血清中に豊富な異なるタンパク質間の区別を困難にしうるからである。
一部の態様において、標識戦略は、ＨＬＡを特異的に標識するため及び抗体－ＨＬＡ相互作用の化学量論を制御するために展開できる。一部の態様において、ＨＬＡは、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７などの蛍光色素で共有結合的に標識できる。これにより、タンパク質の自己蛍光（トリプトファン蛍光）が検出を妨害しなことが確保される。というのも、サンプルからの自己蛍光の複雑さは、血清中に豊富な異なるタンパク質間の区別を困難にしうるからである。
【0040】
一部の態様において、ヒト血清では自己蛍光の補正が必要になりうる。血清のバックグラウンド寄与は、測定強度からバックグラウンド強度を差し引くことによって補正できるので、測定におけるすべての結合曲線の補正が可能になる。従って、蛍光バックグラウンドの標準曲線は各サンプルについて必要になりうる。
【0041】
一部の態様において、生体分子を標識するために選択されるフルオロフォアは、遠赤色スペクトル領域にあるものである。
遠赤色スペクトル領域のフルオロフォアは、およそλｅｍ，ｍａｘ＝６６５ｎｍの波長であるのが有益でありうる。なぜならば、この領域ではヒト血清の自己蛍光の減退があるからである。つまり、生体分子の検出にバックグラウンド妨害が少ないことを意味する。
遠赤色スペクトル領域のフルオロフォアは、およそλｅｍ，ｍａｘ＝６６５ｎｍの波長であるのが有益でありうる。なぜならば、この領域ではヒト血清の自己蛍光の減退があるからである。つまり、生体分子の検出にバックグラウンド妨害が少ないことを意味する。
【0042】
一部の態様において、電極を分配チャネルの上流に設け、電極を分配チャネルの下流に設けることにより、これらの電極は一緒になって、分配チャネルに沿った流れの方向に垂直に、分配チャネルを横切る電界を印加する。そのような態様においては、成分の分配はフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）によって起こりうる。
【0043】
電界の提供は、成分、例えば生体分子の分離／分配が、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ，capillary isoelectric focusing）、キャピラリー等速電気泳動及びミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）などの動電学的分離技術によって、又は濃縮法もしくは血液溶解法を通じて起こることを可能にする。
【0044】
本発明の別の側面において、生体分子を特徴付けるための方法を提供し、該方法は、
サンプル流体のフローをサンプル入口チャネルに導入し；
補助流体のフローを補助入口チャネルに導入し；
サンプル流体のフローと補助流体のフローを分配チャネルで接触させて流体の層流を作り出し；
接触しているサンプルと補助流体との間で生体分子の分配を生成し；
測定モジュールを用いて生体分子のシグネチャプロファイルを検出して、検出生体分子の測定データセットを取得し；
測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所を提供し；
格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュールを提供し；そして
相関値を利用して、生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定する
工程を含む。
サンプル流体のフローをサンプル入口チャネルに導入し；
補助流体のフローを補助入口チャネルに導入し；
サンプル流体のフローと補助流体のフローを分配チャネルで接触させて流体の層流を作り出し；
接触しているサンプルと補助流体との間で生体分子の分配を生成し；
測定モジュールを用いて生体分子のシグネチャプロファイルを検出して、検出生体分子の測定データセットを取得し；
測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所を提供し；
格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュールを提供し；そして
相関値を利用して、生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定する
工程を含む。
【0045】
一部の態様において、該方法はさらに、
格納場所から格納データセットを受け取り、分析モジュールから測定データセットを受け取って、測定データセットと関連する一つ又は複数のパラメーターをさらに調整するように構成されたコントローラーを提供し；そして
オペレーターに、コントローラーと関連付けられた出力モジュールを用いて、更なる測定サイクルを指示する通知を出し、その結果、得られた更なる測定が、生体分子の決定された特徴に、予め決められた信頼水準を提供する
工程を含む。
格納場所から格納データセットを受け取り、分析モジュールから測定データセットを受け取って、測定データセットと関連する一つ又は複数のパラメーターをさらに調整するように構成されたコントローラーを提供し；そして
オペレーターに、コントローラーと関連付けられた出力モジュールを用いて、更なる測定サイクルを指示する通知を出し、その結果、得られた更なる測定が、生体分子の決定された特徴に、予め決められた信頼水準を提供する
工程を含む。
【0046】
出力モジュールは、リーダー装置でありうるか、又はオペレーターにデータを表示することができる任意のその他の装置でありうる。
一部の態様において、横方向分配は拡散によって作り出される。さらに又はあるいは、横方向分配は電界の印加を通じて電気泳動的に作り出される。
一部の態様において、横方向分配は拡散によって作り出される。さらに又はあるいは、横方向分配は電界の印加を通じて電気泳動的に作り出される。
【0047】
さらに又はあるいは、生体分子の測定はマイクロ流体拡散サイジング（ＭＤＳ）によって決定される。これは、流体フロー内でのそれらの拡散度合に基づいて生体分子のサイズを測定するために使用される方法である。一部の態様において、本発明に開示されている装置及び方法は、ＭＤＳに頼ることができる。ＭＤＳは、体液中の相互作用の濃度、アフィニティー、及び化学量論を決定できるので、臨床的評価のためにそうした生物物理学的特性の関連性に光を当てることができる。
【0048】
ＭＤＳプラットフォームの感度は高いので、すなわち良好なシグナル対ノイズ比を提供するので、低いｎＭ範囲の濃度でサンプル中の生体分子相互作用を特徴付けるのに適した技術である。
【0049】
ＭＤＳは、マイクロ流体チャネル内の層流下で蛍光標識タンパク質の空間的及び時間的進化を追跡することによって測定されたその流体力学的半径Ｒｈを利用することにより、結合パラメーターの決定に使用することもできる。さらに、ＭＤＳは、自然な溶液条件下でのヒト血清中の被検体を定量するための先進技術として使用できるので、さらに臨床的意味のある生理学的関連性の高い結果がもたらされる。
【0050】
さらに、体液へのＭＤＳの使用は、洗浄工程の必要性が回避されるので、本発明に記載の装置及び方法は、サンプルロスを回避でき、偽陰性の影響を削減することができる。このことは、洗浄工程を行う必要があるがゆえにサンプルロスと偽陰性の影響を招きうる表面アッセイとは対照的である。
【0051】
さらに又はあるいは、横方向分配は、熱の印加によって熱泳動によって作り出すこともできる。そのような態様においては、装置はさらに熱源を含みうる。
一部の態様において、分析モジュールは、各生体分子の濃度及びアフィニティー及び／又はアビディティーを検出及び決定するように構成されうる。
一部の態様において、分析モジュールは、各生体分子の濃度及びアフィニティー及び／又はアビディティーを検出及び決定するように構成されうる。
【0052】
一部の態様において、分析モジュールは、各生体分子の化学量論を検出及び決定するように構成されうる。
一部の態様において、本方法はさらに、蛍光分光法を用いて生体分子を検出する工程を含みうる。
一部の態様において、本方法はさらに、蛍光分光法を用いて生体分子を検出する工程を含みうる。
【0053】
次に、本発明を、ほんの一例として、添付の図面を参照しながら、さらにより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図3】図３Ａは、ヒト血清中の抗体に対するＨＬＡの結合曲線を示す。図３Ｂは、ヒト血清中の抗体に対するＨＬＡの結合曲線を示す。図３Ｃは、ヒト血清中の抗体に対するＨＬＡの結合曲線を示す。図３Ｄは、ヒト血清中の抗体に対するＨＬＡの結合曲線を示す。
【図4】図４Ａは、異なるＨＬＡバリアントに対するヒト患者血清の試験についてのデータを示す。図４Ｂは、異なるＨＬＡバリアントに対するヒト患者血清の試験についてのデータを示す。図４Ｃは、異なるＨＬＡバリアントに対するヒト患者血清の試験についてのデータを示す。図４Ｄは、異なるＨＬＡバリアントに対するヒト患者血清の試験についてのデータを示す。
【図8】図８Ａは、本発明による共有結合標識のデータを示す。図８Ｂは、本発明による共有結合標識のデータを示す。図８Ｃは、本発明による共有結合標識のデータを示す。図８Ｄは、本発明による共有結合標識のデータを示す。図８Ｅは、本発明による共有結合標識のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0055】
本発明に従って、生体分子を特徴付けるための装置を提供し、一部の場合において、本装置は、抗体－抗原相互作用などの生体分子の相互作用を特徴付けるために使用できる。本装置は、生体分子を含むサンプル流体を装置に導入するように構成されたサンプル入口チャネルと、補助流体を装置に導入するように構成された補助入口チャネルと、そしてサンプル入口チャネル及び補助入口チャネルと流体連通している分配チャネルとを含む。分配チャネルは、横方向拡散などの拡散を通じて、及び／又は電界の印加による電気泳動を通じて、又は熱の印加による熱泳動を通じて、生体分子の分配を生じるように適応されている。さらに又はあるいは、分配チャネル内での生体分子の分配は、マイクロ流体拡散サイジング（ＭＤＳ）によって生成させることもできる。
【0056】
溶液中の分子の絶対的定量と特徴付けのためにＭＤＳアッセイを利用する場合、ヒト血清中で流体力学的半径Ｒｈを決定できるため、ヒト血清中で測定された生体分子の相互作用を特徴付けることができる。なぜならば、ＭＤＳは、マイクロ流体チャネル内の層流下で蛍光標識タンパク質の空間的及び時間的進化を追跡することによって測定されたその流体力学的半径Ｒｈを利用することにより、結合パラメーターの決定を可能にすることが示されているからである。
【0057】
本装置はさらに、生体分子のシグネチャプロファイルを検出して、検出生体分子の測定データセットを取得するように構成された測定モジュールと；測定モジュールから得られた測定データセットと関連する複数のパラメーターを含む格納データセットを格納及び維持するように構成された格納場所と；そして格納場所から格納データセットを受け取り、その格納データセットを測定モジュールからの測定データセットと相関させて、相関値を提供するように構成された分析モジュールとを含む。分析モジュールはさらに、相関値を使用して生体分子の少なくとも二つの特徴をベイズ分析を用いて同時に決定するように構成されている。
【0058】
図１を参照すると、本発明の装置と方法を示す概略図が提供されている。ヒト血清サンプルをヒト患者などの患者から採取し、次いでそれを標識ＨＬＡとインキュベートする。次にサンプルを装置１００に導入する。装置１００は、ヒト血清サンプルを装置にロードするためのサンプル入口チャネル１０２を含み、またブランク流体のフローを導入するための補助入口チャネル１０４も含む。サンプル流体のフローと補助流体のフローは、拡散チャネル１１０に導入され、分配チャネル１１０内で層流を生じる。生体分子でありうる成分（一つ又は複数）は、分配チャネル１１０内でサンプルフローと補助フローとの間で分配される。生体分子の分配は、拡散、電気泳動又は熱泳動の一つ又は複数によって起こる。
【0059】
装置１００はさらに、分配チャネル１１０の下流に配置された少なくとも二つの出口チャネル１２０、１２２を含む。そこで分配チャネル１１０中のサンプルフローと補助フローを含む流体フローは二つの出口フローに分割され、一つのフローがそれぞれの出口チャネル１２０、１２２に入る。図１に示されているように、分配チャネル１１０は、サンプル入口チャネル１０２、補助入口チャネル１０４及び出口チャネル１２０、１２２と一緒になって、Ｈ－フィルターを形成する。
【0060】
検出器を含む測定モジュールは、目的の生体分子を検出するために出口チャネルに配置されうる。出口チャネル１２０、１２２のそれぞれで蛍光が測定できる。両出口における蛍光間の比率からタンパク質の流体力学的半径Ｒｈが決定できる。一部の場合において、測定モジュールは、目的の生体分子のシグネチャプロファイルを検出及び／又は同定して、検出生体分子の測定データセットを得ることができる。測定データセットはその後分析モジュールに伝送することができる。
【0061】
複合体のサイズはその後、マイクロ流体拡散サイジングによって決定され、その解離定数Ｋｄと抗体濃度がベイズ分析を用いて評価される。
ＭＤＳは、図１に示されているように、マイクロ流体チャネル内の層流下で蛍光標識タンパク質の空間的及び時間的進化を追跡することによって測定されたその流体力学的半径Ｒｈを利用することにより、結合パラメーターの決定を可能にすることが示されている。
ＭＤＳは、図１に示されているように、マイクロ流体チャネル内の層流下で蛍光標識タンパク質の空間的及び時間的進化を追跡することによって測定されたその流体力学的半径Ｒｈを利用することにより、結合パラメーターの決定を可能にすることが示されている。
【0062】
図２Ａ～Ｃを参照する。図２Ａに、拡散サイジングを用いたＨＬＡ Ａ＊０３：０１の結合実験が示されている。各バーは３回測定の平均を示す。流体力学的半径の有意な変化は、ＨＬＡ Ａ＊０３：０１とＷ６／３２との間の正の結合事象を示す。これに対し、ＨＬＡとＯＵＷ４Ｆ１１又はＢＳＡとの間には結合は観察できない。図２Ｂを参照すると、流体力学的半径と残基の数との相関が示されている。遊離ＨＬＡ及び抗体Ｗ６／３２に結合されたＨＬＡについて決定された半径は、折り畳みタンパク質の仮定とよく一致している。
【0063】
図２Ｃを参照すると、２５ｎＭのＨＬＡ Ａ＊０３：０１と様々な濃度の抗体Ｗ６／３２との結合曲線が示されている。点は、非結合及び非結合状態の割合が様々な標識ＨＬＡスピシーズについて測定されたサイズを示し、少なくとも３回繰り返されたデータの平均である。曲線は非線形結合方程式への最小二乗フィッティング(least-square fit)である。このフィッティングから、解離定数Ｋｄ＝９６１．３±１１５．９ｐＭ及び結合部位濃度Ｂ０＝１２．９８±１．００ｎＭが決定でき、２分子のＨＬＡに対して１抗体の化学量論が得られる。
【0064】
図３Ａを参照すると、ヒト血清（赤）及びＰＢＳ（青）中の抗体ＳＮ２３ＯＧ６に対する５ｎＭのＨＬＡ Ａ＊０２：０１の結合曲線が示されている。フィッティングから、血清中でＫｄ＝３．８３±１．２６ｎＭ及びＰＢＳ中でＫｄ＝３．６４±０．４３ｎＭが決定され、互いに完全に一致している。さらに、１抗体あたり２抗原の結合について結合比１対２が得られる。挿入されたグラフは、特異的抗体ＳＮ２３ＯＧ６を添加したときのＨＬＡ Ａ＊０２：０１のストークス半径（Ｒｈ）の増加を示している。
【0065】
図３Ｂを参照すると、ヒト血清（赤）及びＰＢＳ（青）中の抗体ＯＵＷ４Ｆ１１に対する１．２ｎＭのＨＬＡ Ｂ＊０８：０１の結合曲線が示されている。フィッティングから、血清中でＫｄ＝５０．７４±８．０９ｎＭ及びＰＢＳ中でＫｄ＝５７．３８±７．１９ｎＭ、結合比ｎ＝１／２が決定され、一致を示している。挿入されたグラフは、特異的抗体ＯＵＷ４Ｆ１１を添加したときのＨＬＡ Ｂ＊０８：０１のストークス半径の増加を示している。
【0066】
【0067】
複雑な媒体中での分子の絶対的定量と特徴付けにＭＤＳアッセイが有用であることを示すために、よく特徴付けされた相互作用をヒト血清中で測定した。まず、様々な濃度の抗体ＳＮ２３ＯＧ６及びＯＵＷ４Ｆ１１をブランクのヒト血清に加え、それぞれＨＬＡ Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ Ｂ＊０８：０１とのそれらの相互作用を測定した。第一段階として、両抗原の流体力学的半径を決定する。ヒト血清中で得られた純ＨＬＡの半径は、理論値ならびに、図３Ｃに示されているように、緩衝液中で得られた半径と一致し、ＭＤＳアッセイをヒト血清に適用できる可能性を示唆している。
【0068】
これはまた、ヒト血清が、調査抗原に結合することによって測定を撹乱しうる何らかのその他のタンパク質を含有していないことも示している。これら二つの抗原／抗体ペアの場合、決定された解離定数は使用された緩衝液条件に無関係である。さらに詳しくは、ＨＬＡ Ａ＊０２：０１に対する抗体ＳＮ２３ＯＧ６の相互作用の場合、ヒト血清中の解離定数Ｋｄ＝３．８３±１．２６ｎＭはＰＢＳ中のＫｄ＝３．６４±０．４３ｎＭとよく一致している（図３Ａ参照）。同様のことがＨＬＡ Ｂ＊０８：０１に対する抗体ＯＵＷ４Ｆ１１でも観察でき、Ｋｄ＝５０．７４±８．０９ｎＭはＰＢＳ中のＫｄ＝５７．３８±７．１９ｎＭと類似している（図３Ｂ参照）。異なる媒体条件下での異なる飽和レベルは誤差範囲内にあり、おそらくは個々の抗原間のわずかな立体配座の変化が原因である。
【0069】
図４Ａ～４Ｄを参照すると、異なるＨＬＡバリアントに対するヒト患者血清の試験についてのデータが示されている。例として、ＨＬＡ Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ Ａ＊２４：０２両方のサイズ増加は、タンパク質相互作用の指標になりうる。
【0070】
測定スピシーズの流体力学的半径Ｒｈは生体分子の分子量（Ｍｗ）と相関させることができる。次にこれを用いて合計し(sum)、観測されたＲｈ値が意味をなすかどうかを調べる。Ｒｈは体積測定であって分子量のおよそ３分の１乗に対応するので足すことができないからである。
【0071】
図４Ａを参照すると、患者血清中のＨＬＡ特異的抗体とＨＬＡ Ａ＊０２：０１との結合相互作用のベイズ分析が示されている。これからナノモル範囲の抗体濃度が決定でき、最大確率値は６．０２±２．６６ｎＭである。Ｋｄはよく限定されないが(not well constrained)、上限Ｋｄ≦３０ｎＭを有する。
【0072】
図４Ｂを参照すると、同じ患者の血清中のＨＬＡ特異的抗体とＨＬＡ Ａ＊２４：０２との相互作用のベイズ分析が示されている。ここでは、約１５．２７±０．２４ｎＭの抗体濃度が見出され、Ｋｄについては、Ｋｄ≦３ｎＭの上限のみである。
【0073】
一部の態様においては、異なる血清濃度でＨＬＡ Ａ＊０２：０１及びＡ＊２４：０１に対する患者血清の平均蛍光強度を示すことができる。
図４Ｃに示されているように、患者血清の１０倍希釈の抗体のＨＬＡ Ａ＊０２：０１に対する結合相互作用のベイズ分析を示す。
図４Ｃに示されているように、患者血清の１０倍希釈の抗体のＨＬＡ Ａ＊０２：０１に対する結合相互作用のベイズ分析を示す。
【0074】
図４Ｄに示されているように、患者血清の１０倍希釈の抗体のＨＬＡ Ａ＊２４：０２に対する結合相互作用のベイズ分析を示す。
続いて、患者血清へのこのプラットフォームの適用可能性について、本明細書中でさらに説明する。この目的のために、ＨＬＡ Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ Ａ＊２４：０２の二つと、同じ患者血清との相互作用を取り上げる。患者は二つのＨＬＡ型に高感作可能で、ＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームでＨＬＡ Ａ＊２４：０２に対してより高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図４Ａに示されているように、所与の条件下でサイズの増加が観測でき、結合の発生を示している。
続いて、患者血清へのこのプラットフォームの適用可能性について、本明細書中でさらに説明する。この目的のために、ＨＬＡ Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ Ａ＊２４：０２の二つと、同じ患者血清との相互作用を取り上げる。患者は二つのＨＬＡ型に高感作可能で、ＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームでＨＬＡ Ａ＊２４：０２に対してより高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図４Ａに示されているように、所与の条件下でサイズの増加が観測でき、結合の発生を示している。
【0075】
ベイズ分析を使用することにより、アフィニティーと抗体濃度の両方が定量できる。血清アロ抗体とＨＬＡ Ａ＊０２：０１との相互作用の場合、抗体濃度は６．０２±２．６６ｎＭに限定され(constrained)、Ｋｄ≦３０ｎＭ、１対２の結合比が仮定される。同様に、同じ患者血清について、ＨＬＡ Ａ＊２４：０２への抗体結合が調べられ、ＨＬＡ Ａ＊０２：０１より高いＬｕｍｉｎｅｘシグナルが示された。抗体濃度は１５．２６±３．１７ｎＭと決定でき、アフィニティーは上限Ｋｄ≦３ｎＭで示すことができる。
【0076】
図５Ａ及び５Ｂに示されているように、目的の生体分子の標識戦略を示す。図５Ａは反応スキームを示し、図５Ｂは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅカラムでのクロマトグラムを示す（流速０．５ｍＬ／分、溶離緩衝液としてＰＢＳ）。シグナルを目的の蛍光とバックグラウンド寄与にデコンボリューションすることが可能である。
【0077】
図６Ａ及び図６Ｂを参照すると、サンプルの自己蛍光の分析が示されている。図６Ａに示されているように、蛍光強度は、予想通り、血清濃度の増加とともに直線的に増加している。絶対蛍光強度は、従って、異なる患者間で異なる。図６Ｂに示されているように、血清の蛍光強度は１２日間にわたって増加しているが、血清中の標識生体分子の半径は同じ期間不変である。
【0078】
本発明に開示されている装置及び方法を使用すると、ヒト血清中の流体力学的半径Ｒｈを決定することができる。６００ｎｍより上でヒト血清の自己蛍光は減少しているように見えるが、シグナルはマイクロ流体プラットフォームで検出可能である。
【0079】
図７を参照すると、ＨＬＡ Ａ＊０２：０１に対するＳＮ２３ＯＧ６間の相互作用の結合曲線が示されている。二つの場合の解離定数は一致し、どちらも１対２という等しい化学量論を有している。抗体をドープした血清における化学量論と解離定数を緩衝液条件と矛盾なく決定することが可能である。
【0080】
図８Ａ～８Ｅには、本明細書に開示されている共有結合標識戦略の概略図が示されている。図８Ａに、タンパク質上のアミンをアミド結合を用いてＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に連結させる反応機構を示す。図８ＢにはＨＬＡ Ａ＊０２：０１の精製のクロマトグラムを示す。図８Ｃには標識後のＨＬＡ Ａ＊０３：０１、図８Ｄには標識後のＨＬＡ Ｂ＊０８：０１が示されており、一つの画分にＨＬＡの溶出を示している。図８Ｅには市販のストレプトアビジン混合物の精製のクロマトグラムを示す。
【0081】
図９Ａはヒト血清中、図９Ｂは緩衝液中での様々な濃度のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の吸光度の測定を示し、ヒト血清で６６３ｎｍ付近の吸光度が増加していないことを示している。図９Ｃはヒト血清中、図９ＤはＰＢＳ中でのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の蛍光発光を示す。図９Ｅは、ヒト血清とＰＢＳの両方の蛍光発光の比較を示しており、差異がないことを示している。図９Ｆは、ヒト血清中及びＰＢＳ中でのシグナル対ノイズのアスペクト比を示す。シグナル対ノイズ比はＰＢＳに比べてヒト血清中でわずかに低下する。
【0082】
図１０はビリルビンの構造を示す。矢印は、ビリルビンとＨＳＡ（ヒト血清の蛍光源である可能性）との複合体化によって妨害される回転を示す。
図１１Ａ～１１Ｂを参照すると、陰性対照実験が示されている。図１１Ａには、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたＢＳＡの、純粋な場合及び異なる抗体とインキュベーション後の流体力学的半径の比較を示す。この図は、ＨＬＡ特異的抗体はフルオロフォアを認識しないので、決定されるどの結合相互作用も特異的であると仮定できることを示している。図１１Ｂは、純粋に決定された又は２００ｎＭのＩｇＧ（ａｂ２０５１９８）とインキュベーション後に決定された異なるＨＬＡバリアントの流体力学的半径を示しているが、サイズ増加が示されていないので、これらのＨＬＡバリアントと特異的アロ抗体との間の選択的相互作用を示唆している。
図１１Ａ～１１Ｂを参照すると、陰性対照実験が示されている。図１１Ａには、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたＢＳＡの、純粋な場合及び異なる抗体とインキュベーション後の流体力学的半径の比較を示す。この図は、ＨＬＡ特異的抗体はフルオロフォアを認識しないので、決定されるどの結合相互作用も特異的であると仮定できることを示している。図１１Ｂは、純粋に決定された又は２００ｎＭのＩｇＧ（ａｂ２０５１９８）とインキュベーション後に決定された異なるＨＬＡバリアントの流体力学的半径を示しているが、サイズ増加が示されていないので、これらのＨＬＡバリアントと特異的アロ抗体との間の選択的相互作用を示唆している。
【0083】
図１２に別の陰性対照実験を提供する。図１２に示されているのは、２５ｎＭのＨＬＡ Ａ＊０３：０１と様々な濃度の抗体Ｗ６／３２との結合曲線である。青点は、３回繰り返して測定されたデータに対する平均である。赤線は、Ｈｉｌｌｓ式によるフィッティングである。このデータから、Ｈｉｌｌｓ係数ｈ＝１．０１±０．１５が決定できる。
【0084】
図１３Ａ～１３Ｂを参照すると、結合曲線のグローバルフィットが示されている。図１３Ａには、２５ｎＭ及び５００ｐＭのＨＬＡ Ａ＊０３：０１と抗体Ｗ６／３２間の相互作用の結合曲線のグローバルフィットが示されている。このフィッティングから、Ｋｄ＝４６６．０±１４９．４ｐＭが決定できる。図１３Ｂには、５ｎＭ、１ｎＭ及び８２ｐＭのＨＬＡ Ａ＊０２：０１とＳＮ２３ＯＧ６間の相互作用のグローバルフィットが示されている。これにより、Ｋｄ＝５．２７±０．４９ｎＭが得られる。
【0085】
図１４Ａを参照すると、１ｎＭのＨＬＡ Ａ＊０２：０１に対する盲検ヒト血清の結合曲線が示されている。抗体濃度［ＡＢ］ｃａｌ＝１３８．７±４７．９及びＫｄ＝９６１．３±１１５．７ｐＭが得られた。分析後、盲検血清は１１０ｎＭの特異的抗体を有していたことが明らかになり、［ＡＢ］ｃａｌの決定の有効性を示した。盲検ヒト血清のベイズ分析を図１４Ｂに示す。ベイズプロットは、抗体濃度とＫｄ間の比率がよく限定される(constrained)ことを示している。非線形フィット及びベイズ分析を用いた結合曲線が測定できる。
【0086】
ＭＤＳデータの分析
抗体と抗原間の結合平衡を確立するためのＭＤＳデータの分析を以下に示す。１：１の結合を仮定すると、次の平衡が得られる。
抗体と抗原間の結合平衡を確立するためのＭＤＳデータの分析を以下に示す。１：１の結合を仮定すると、次の平衡が得られる。
【0087】
【数1】
【0088】
ここで、ＡｂＨは、結合された抗体－ＨＬＡ複合体を示す。
【0089】
【数2】
【0090】
抗体とＨＬＡの総濃度をそれぞれ［Ａｂ］０及び［Ｈ］０と表すと：
【0091】
【数3】
【0092】
【数4】
【0093】
これを解いて：
【0094】
【数5】
【0095】
マイクロ流体拡散サイジング法では、我々の反応混合物の測定流体力学的半径は、‘拡散’及び‘非拡散’チャネルの総蛍光強度（それぞれＩｄ及びＩｕとする）を記録することによって計算される。
【0096】
測定された半径は、遊離及び結合標識ＨＬＡの濃度と線形的に相関していないので、データの歪を回避するために、‘拡散’チャネルに到達する標識ＨＬＡの割合Ｉｄ／Ｉｄ＋Ｉｕが観測及び使用できる。観測された量を予測結合濃度［ＡｂＨ］に関連付けるために、‘拡散’チャネルで検出される遊離及び結合ＨＬＡの割合として、それぞれρｆ及びρｂを導入する。以下に示すように下記式が得られる。
【0097】
【数6】
【0098】
【数7】
【0099】
式中、κは、ＨＬＡの濃度を観測された蛍光強度に関連付ける定数である。従って、拡散チャネルに到達する予測割合ｆｄは、
【0100】
【数8】
【0101】
となる。［ＡｂＨ］は上記式で決定されたとおりである。従って、拡散チャネルに到達する予測割合は、ρｆ、ρｂ、Ｋｄならびに抗体及びＨＬＡの総濃度の関数となり、これをｆｄ（ρｆ，ρｂ，Ｋｄ，［Ａｂ］０，［Ｈ］０）と表す。
【0102】
ｆｄを観測可能量として用いると、ρｆ、ρｂ、及びＫｄは、以下にさらに詳細を開示するベイズ推論によって未知パラメーターとして決定することができる。抗体：ＨＬＡの実際の１：２の非協同的結合の化学量論を説明するために、一重及び二重に結合された抗体の半径は等しいと仮定する。なぜならば、それらのサイズは実験法の予期される誤差範囲内にあるからである。従って、［Ａｂ］は単に、抗体濃度ではなく抗体結合部位の濃度を表すために使用され、従ってＫｄは結合部位に関する解離定数となる。各ＩｇＧ抗体は二つの結合部位を含有しているので、［Ａｂ］を得るためには抗体濃度を単に２倍すればよい。
【0103】
未知抗体濃度の決定
患者血清サンプルにおいては血清中の抗体濃度は未知である。所与のサンプル中のＨＬＡ反応性の抗体結合部位の濃度［Ａｂ］０は、
患者血清サンプルにおいては血清中の抗体濃度は未知である。所与のサンプル中のＨＬＡ反応性の抗体結合部位の濃度［Ａｂ］０は、
【0104】
【数9】
【0105】
によって、元の血清中の結合部位の濃度［Ａｂ］ｔｏｔと、この特定サンプルで使用された血清の割合αに関連付けられる。上記式中、０≦α＜１である。
これを上記式５に代入し、更新後の式を以下に示す。
これを上記式５に代入し、更新後の式を以下に示す。
【0106】
【数10】
【0107】
血清の自己蛍光
この式を式８に用いると、拡散チャネルに到達する予測割合についての新たな式が得られるｆｄ（ρｆ，ρｂ，Ｋｄ，［Ａｂ］ｔｏｔ，α，［Ｈ］０）。
この式を式８に用いると、拡散チャネルに到達する予測割合についての新たな式が得られるｆｄ（ρｆ，ρｂ，Ｋｄ，［Ａｂ］ｔｏｔ，α，［Ｈ］０）。
【0108】
ヒト血清中の測定の実施をさらに複雑にするのは血清の自己蛍光で、データの前処理を必要とする。原料チャネルの蛍光強度は測定されるので、このバックグラウンド蛍光は補正できる。ＨＬＡ不在下で各チャネルにおける血清割合と強度の較正を実施することにより、各チャネルの蛍光強度と血清割合αとの間に直線関係が得られる。
【0109】
【数11】
【0110】
【数12】
【0111】
式中、Ｉｄ，ｓ及びＩｕ，ｓは、それぞれ、血清から生じた‘拡散’及び‘非拡散’チャネルにおける強度であり、Ｓｄ及びＳｕは、線形回帰によって得られた定数である。
従って、データポイントｙは、前処理中に、
従って、データポイントｙは、前処理中に、
【0112】
【数13】
【0113】
によって計算される。
従って、データは、ベイズ推論により、ρｆ、ρｂ、Ｋｄ、及び［Ａｂ］ｔｏｔを未知パラメーターとして用いて分析することができ、それによって、マイクロ流体拡散サイジングによる結合測定により、Ｋｄ、及び［Ａｂ］ｔｏｔ両方の値が得られる。
従って、データは、ベイズ推論により、ρｆ、ρｂ、Ｋｄ、及び［Ａｂ］ｔｏｔを未知パラメーターとして用いて分析することができ、それによって、マイクロ流体拡散サイジングによる結合測定により、Ｋｄ、及び［Ａｂ］ｔｏｔ両方の値が得られる。
【0114】
ベイズ推論
ベイズ推論分析法はベイズの定理を利用するもので、観測データが与えられると、以下の式により、未知パラメーターの確率分布が決定できる。
ベイズ推論分析法はベイズの定理を利用するもので、観測データが与えられると、以下の式により、未知パラメーターの確率分布が決定できる。
【0115】
【数14】
【0116】
式中、Ｐ（パラメーター｜データ）は、事後確率として、Ｐ（パラメーター）は事前確率として、そしてＰ（データ｜パラメーター）は尤度として知られている。事前確率分布は、何らかの測定データが取得できる前のシステムに関する情報の式である。ρｆ及びρｂについては、事前確率では線形空間でフラットと仮定されるが、Ｋｄ及び抗体の総濃度については、問題のスケール不変性を反映するためには、対数空間でフラットとする事前確率がより適切である。
【0117】
本明細書中に記載されている実験測定データは、真の値の周辺に正規分布するので、尤度関数は、理論的測定値を中心とするガウス分布である。
【0118】
【数15】
【0119】
式中、ｆｄは式８に定義され、［ＡｂＨ］は式１０に定義され、αｉ及び［Ｈ］ｉは、それぞれｉ番目の測定における血清及び抗体の濃度であり、ｙｉはｉ番目の測定で得られた前処理データポイントである。各データセットについて適切な標準偏差σを定義するために、各測定の反復の標準偏差が計算され、これらの値の最大値がそのデータセットのグローバルな標準偏差として使用される。
【0120】
各実験で得られる情報を最大化するために、目的の量、例えば抗体濃度及びアフィニティーの事後分布のエントロピーが使用される。分布のエントロピーは単に、あるパラメーターが特定の値を有することを我々がどれほど確信するかの尺度と解釈することができ、エントロピーが低いほど、より確かである。従って、測定がエントロピーを下げるほど、より多くの情報が含有される。特定の血清及び抗原濃度で追加の測定が記録できると、エントロピー変化が予測又は推定できる。これは期待エントロピーと呼ばれる。
【0121】
実験によって課せられる限界内で、すべての可能な測定、すなわち血清及び抗原の濃度のすべての組合せについて期待エントロピーを計算することにより、エントロピーの最大の期待減少と関連する測定ポイントを見つけることができる。これは反復的に実施できる。すなわち、第一の測定を行った後、期待エントロピーを計算し、最善の次の測定を提案する。この測定が記録されたら、期待エントロピーは更新され、新しい最善の次の測定が提案される。このプロセスは所望の信頼水準及び精度が得られるまで繰り返される。
【0122】
図１５を参照すると、ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する血清抗体反応性のマイクロ流体抗体アフィニティープロファイリング（ＭＡＡＰ）を示すプロットが提供されている。ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清が発症後２８日目及び９０日目に検査されている。無症状患者から集中治療室に入院した患者まで、全範囲のＣＯＶＩＤ－１９重症度の患者が検査された。ＭＡＡＰ分析によれば、抗ＲＢＤ抗体のアフィニティー（ＫＤ）は、両時点で２桁に及ぶことが示され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する体液性免疫のスペクトルが明らかになった。さらに、ＭＡＡＰ分析は、検査した患者の大部分でこの時間枠内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体応答の強化を示しており（１ヶ月時点と比べて３ヶ月時点でＫＤの減少）、ＣＯＶＩＤ－１９から回復した患者のアフィニティー成熟の直接的な証拠を提供している。図１５に示されているデータは、ＭＡＡＰ分析が、患者血清で直接、体液性応答の大きさ及び進化の評価を可能にし、ウイルス感染後の免疫応答の質への更なる洞察を可能にすることを示している。
【実施例】
【0123】
実施例－実験の詳細
ヒト血清中の自己蛍光の決定
ヒト血清（特異的抗ＨＬＡ抗体を含まない）に、ＰＢＳ（ｐＨ７．３、Ｏｘｏｉｄ錠、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、米国ウォルサム；ＮａＮ３（０．０２％（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）が補充されている）と蛍光標識Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、米国ウォルサム）を補充し、血清中１０ｐＭ～１μＭのフルオロフォア濃度を得る。比較のために緩衝液中にも同様のフルオロフォア希釈を調製する。続いて、二つの波長λｅｘ，１＝４８１ｎｍ及びλｅｘ，２＝６３２ｎｍで励起して吸収スペクトルと発光スペクトルをプレートリーダー（Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、ドイツ・オルテンベルク）に記録する。
ヒト血清中の自己蛍光の決定
ヒト血清（特異的抗ＨＬＡ抗体を含まない）に、ＰＢＳ（ｐＨ７．３、Ｏｘｏｉｄ錠、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、米国ウォルサム；ＮａＮ３（０．０２％（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）が補充されている）と蛍光標識Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、米国ウォルサム）を補充し、血清中１０ｐＭ～１μＭのフルオロフォア濃度を得る。比較のために緩衝液中にも同様のフルオロフォア希釈を調製する。続いて、二つの波長λｅｘ，１＝４８１ｎｍ及びλｅｘ，２＝６３２ｎｍで励起して吸収スペクトルと発光スペクトルをプレートリーダー（Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、ドイツ・オルテンベルク）に記録する。
【0124】
Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアによるＨＬＡの標識
ＨＬＡ（Ｅｍｏｒｙ由来の異なるバリアント、米国アトランタ；ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）中０．８９ｎｍｏｌ、１当量）を標識するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中３当量）をＨＬＡ含有混合物に加える。反応混合物を約２０℃で１時間、遮光してインキュベートする。サンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国シカゴ）で、流速およそ０．５ｍＬ／分及び溶離緩衝液としてＰＢＳ（ｐＨ７．３、ＮａＮ３（０．０２％（ｗ／ｖ）が補充されている）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、標識ＨＬＡを得る（３７０ｎＭ、バリアントにより０．３３～２．２５のＤＯＬ）。次に、コンジュゲートされたＨＬＡは次なる使用まで４℃で保管される。
ＨＬＡ（Ｅｍｏｒｙ由来の異なるバリアント、米国アトランタ；ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）中０．８９ｎｍｏｌ、１当量）を標識するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中３当量）をＨＬＡ含有混合物に加える。反応混合物を約２０℃で１時間、遮光してインキュベートする。サンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国シカゴ）で、流速およそ０．５ｍＬ／分及び溶離緩衝液としてＰＢＳ（ｐＨ７．３、ＮａＮ３（０．０２％（ｗ／ｖ）が補充されている）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、標識ＨＬＡを得る（３７０ｎＭ、バリアントにより０．３３～２．２５のＤＯＬ）。次に、コンジュゲートされたＨＬＡは次なる使用まで４℃で保管される。
【0125】
マイクロ流体拡散サイジング（ＭＤＳ）
すべてのＭＤＳ実験は、Ｆｌｕｉｄｉｔｙ Ｏｎｅ Ｗ（Ｆｌｕｉｄｉｃ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社、英国ケンブリッジ）を用いて実施した。ＭＤＳの基本原理は他の場所で説明されている。手短に述べると、標識タンパク質を一方の側から拡散チャンバに流入させ、補助緩衝液を他方の側から流入させる。チャネルサイズが小さいため、層流が仮定できる。つまり、粒子は拡散によってのみ緩衝液流に移動でき、その場合の速度は分子複合体のサイズに依存する。拡散チャネル又はチャンバの終端で流れは再度分割され、チャンバの両側で蛍光が測定される。両チャンバの蛍光間の比率から、タンパク質の流体力学的半径Ｒｈを決定することができる。
すべてのＭＤＳ実験は、Ｆｌｕｉｄｉｔｙ Ｏｎｅ Ｗ（Ｆｌｕｉｄｉｃ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社、英国ケンブリッジ）を用いて実施した。ＭＤＳの基本原理は他の場所で説明されている。手短に述べると、標識タンパク質を一方の側から拡散チャンバに流入させ、補助緩衝液を他方の側から流入させる。チャネルサイズが小さいため、層流が仮定できる。つまり、粒子は拡散によってのみ緩衝液流に移動でき、その場合の速度は分子複合体のサイズに依存する。拡散チャネル又はチャンバの終端で流れは再度分割され、チャンバの両側で蛍光が測定される。両チャンバの蛍光間の比率から、タンパク質の流体力学的半径Ｒｈを決定することができる。
【0126】
結合の検証
標識されたＨＬＡ Ａ＊０３：０１、Ａ＊０２：０１、及びＢ＊０８：０１をそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．３、ＮａＮ３（０．０２％（ｗ／ｖ）が補充されている）中に希釈して、５ｎＭ溶液を得る。ＨＬＡコンジュゲートのサイズはＭＤＳによって決定できる。同様に、標識されたＨＬＡバリアントと各抗体を混合し、１μＭ抗体入り５ｎＭ濃度のＨＬＡを得る。これらのコンジュゲートを４℃でおよそ１時間インキュベートした後、加熱して５分間室温にし、ＭＤＳによってサイジングした。
標識されたＨＬＡ Ａ＊０３：０１、Ａ＊０２：０１、及びＢ＊０８：０１をそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．３、ＮａＮ３（０．０２％（ｗ／ｖ）が補充されている）中に希釈して、５ｎＭ溶液を得る。ＨＬＡコンジュゲートのサイズはＭＤＳによって決定できる。同様に、標識されたＨＬＡバリアントと各抗体を混合し、１μＭ抗体入り５ｎＭ濃度のＨＬＡを得る。これらのコンジュゲートを４℃でおよそ１時間インキュベートした後、加熱して５分間室温にし、ＭＤＳによってサイジングした。
【0127】
陰性対照実験
標識されたＨＬＡバリアントを、ヒトＩｇＧ ａｂ２０５１９８（ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ・セントルイス）と混合し、５ｎＭのＨＬＡバリアントと１μＭの抗体の濃度を得た。これらのコンジュゲートを４℃で１時間インキュベートした後、加熱して５分間室温にし、ＭＤＳによってサイジングした。同様に、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたＢＳＡをＰＢＳ中に希釈し、５ｎＭの標識ＢＳＡ、ならびに２５０当量の抗体の溶液を得、抗体とフルオロフォアとの間に非特異的相互作用がないことを示した。
標識されたＨＬＡバリアントを、ヒトＩｇＧ ａｂ２０５１９８（ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ・セントルイス）と混合し、５ｎＭのＨＬＡバリアントと１μＭの抗体の濃度を得た。これらのコンジュゲートを４℃で１時間インキュベートした後、加熱して５分間室温にし、ＭＤＳによってサイジングした。同様に、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたＢＳＡをＰＢＳ中に希釈し、５ｎＭの標識ＢＳＡ、ならびに２５０当量の抗体の溶液を得、抗体とフルオロフォアとの間に非特異的相互作用がないことを示した。
【0128】
ＰＢＳ中での測定
特定バリアントの標識ＨＬＡを、様々な濃度の目的抗体と一緒にＰＢＳに加え、希釈した。サンプルを４℃でおよそ１時間、又は室温でおよそ３０分間インキュベートする。続いて、サイズをＭＤＳによって決定した。データを、非線形結合方程式（式１６）に従ってフィッティングする。この式は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．２）を用いて、測定された流体力学的半径Ｒｈ，ｍを、抗体の総濃度［Ａｂ］０、結合部位濃度［Ｂ］０、解離定数Ｋｄ、化学量論比ｎ、流体力学的半径の全増加ΔＲｈ，ｔｏｔ、及び非結合抗原の流体力学的半径Ｒｈ，０と関連付けるものである。
特定バリアントの標識ＨＬＡを、様々な濃度の目的抗体と一緒にＰＢＳに加え、希釈した。サンプルを４℃でおよそ１時間、又は室温でおよそ３０分間インキュベートする。続いて、サイズをＭＤＳによって決定した。データを、非線形結合方程式（式１６）に従ってフィッティングする。この式は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．２）を用いて、測定された流体力学的半径Ｒｈ，ｍを、抗体の総濃度［Ａｂ］０、結合部位濃度［Ｂ］０、解離定数Ｋｄ、化学量論比ｎ、流体力学的半径の全増加ΔＲｈ，ｔｏｔ、及び非結合抗原の流体力学的半径Ｒｈ，０と関連付けるものである。
【0129】
【数16】
【0130】
データをＨｉｌｌの式にフィッティングさせる場合、以下に示すように、１７が使用される。
【0131】
【数17】
【0132】
実験的に、抗体結合へのＨＬＡの非協同性が立証されたので、２対１の結合の場合、ｎ＝１／２の結合比が式１６でさらに使用された。
ヒト血清における結合測定
様々な濃度の特異的抗体を補充されたヒト血清に様々なＨＬＡ型を添加する。サンプルを室温（ｒ．ｔ．）で３０分間インキュベートした後、ＭＤＳによってサイズを測定する。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．２）を用いて、式１８に従ってフィッティングされる。
ヒト血清における結合測定
様々な濃度の特異的抗体を補充されたヒト血清に様々なＨＬＡ型を添加する。サンプルを室温（ｒ．ｔ．）で３０分間インキュベートした後、ＭＤＳによってサイズを測定する。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．２）を用いて、式１８に従ってフィッティングされる。
【0133】
【数18】
【0134】
ベイズ分析
遊離スピシーズの半径ｒｆ、及び結合スピシーズの半径ｒｂに使用される事前確率は、線形空間でフラットであるが、Ｋｄ及び結合部位濃度についてはフラットな対数空間の事前確率が使用される。つまり、Ｋｄが１ｎＭ～１０ｎＭにある確率は、１０ｎＭ～１００ｎＭにある確率と等しい。フラットな対数空間は、桁数の限定を容易にすることができる。
遊離スピシーズの半径ｒｆ、及び結合スピシーズの半径ｒｂに使用される事前確率は、線形空間でフラットであるが、Ｋｄ及び結合部位濃度についてはフラットな対数空間の事前確率が使用される。つまり、Ｋｄが１ｎＭ～１０ｎＭにある確率は、１０ｎＭ～１００ｎＭにある確率と等しい。フラットな対数空間は、桁数の限定を容易にすることができる。
【0135】
本発明の様々なさらなる側面及び態様は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
“及び／又は”は、本明細書中で使用されている場合、二つの特定の特徴又は成分の各々（他方の有無は問わない）の具体的開示と見なされるものとする。例えば、“Ａ及び／又はＢ”は、各々が本明細書中で個別に示されているかのごとく、（ｉ）Ａ、（ii）Ｂ、ならびに（iii）Ａ及びＢのそれぞれの具体的開示と見なされるものとする。
“及び／又は”は、本明細書中で使用されている場合、二つの特定の特徴又は成分の各々（他方の有無は問わない）の具体的開示と見なされるものとする。例えば、“Ａ及び／又はＢ”は、各々が本明細書中で個別に示されているかのごとく、（ｉ）Ａ、（ii）Ｂ、ならびに（iii）Ａ及びＢのそれぞれの具体的開示と見なされるものとする。
【0136】
文脈上別段の指示がない限り、上に示された特徴の説明及び定義は、本発明のいずれかの特定の側面又は態様に限定されず、記載されているすべての側面及び態様に等しく適用される。
【0137】
さらに、例としていくつかの態様を参照しながら本発明を記載してきたが、本発明は開示された態様に限定されず、代替の態様は、添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲から逸脱することなく構築できることは当業者には理解されるであろう。
【符号の説明】
【0138】
１００ 装置
１０２ サンプル入口チャネル
１０４ 補助入口チャネル
１１０ 分配チャネル
１２０ 出口チャネル
１２２ 出口チャネル
１０２ サンプル入口チャネル
１０４ 補助入口チャネル
１１０ 分配チャネル
１２０ 出口チャネル
１２２ 出口チャネル
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】