▶ ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】ＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/22 20060101AFI20230614BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230614BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230614BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230614BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230614BHJP
【ＦＩ】
A61K38/22
A61P1/00
A61K9/08
A61K47/26
A61K47/68
A61K39/395 Y
A61K47/12
A61K47/22
A61K47/02
A61K47/34
A61K47/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022571830
(86)(22)【出願日】2021-05-24
(85)【翻訳文提出日】2022-12-13
(86)【国際出願番号】 KR2021006455
(87)【国際公開番号】W WO2021235913
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】10-2020-0061878
(32)【優先日】2020-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515022445
【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ホン スン ヒ
(72)【発明者】
【氏名】キム サン ユン
(72)【発明者】
【氏名】キム ミン ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ベ スン ミン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB11
4C076CC16
4C076CC41
4C076DD09F
4C076DD09Q
4C076DD15Z
4C076DD38
4C076DD41Z
4C076DD43Z
4C076DD51Q
4C076DD55Q
4C076DD60Q
4C076DD60Z
4C076DD67
4C076EE23F
4C076EE23Q
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF63
4C076GG41
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084BA44
4C084DB35
4C084MA66
4C084NA03
4C084ZA66
4C085AA35
4C085BB36
4C085BB42
4C085DD61
4C085EE01
(57)【要約】
本発明は、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）の持続型結合体の液状製剤及びその製造方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式（１）で表されるＧＬＰ－２の持続型結合体を１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬで含み、１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及びｐＨを４．５～６．５の範囲で維持するための分量の緩衝物質を含む安定化剤を含むＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤：
【化1】
Ｘは、天然型ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２誘導体であり；
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す。
【請求項2】
前記ＧＬＰ－２誘導体は、天然型ＧＬＰ－２配列で少なくとも一つのアミノ酸において置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択された変形が起こったものである、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項3】
前記Ｘは、下記一般式１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤：[一般式１]
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号９）
ここで、
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は存在しないか、リシン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、６－アジドリシン、又はシステインである。
【請求項4】
前記Ｘは（１）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（２）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（３）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（４）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34が６－アジドリシンであるか、
（５）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（６）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、又は
（７）Ｘ1がヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインである、請求項３に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項5】
前記Ｘは下記一般式２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤：[一般式２]
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号１０）
ここで、
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はカルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は一つ以上の任意のアミノ酸又は変形が起こった一つ以上の任意のアミノ酸である。
【請求項6】
前記ＧＬＰ－２誘導体は、配列番号２～８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項7】
前記免疫グロブリンＦｃ切片は、非グリコシル化されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項8】
前記Ｆは、２個のポリペプチド鎖からなる二量体であり、Ｌの一方の末端が前記２個のポリペプチド鎖中の一つのポリペプチド鎖のみに連結されている、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項9】
前記Ｌは、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項10】
前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部位の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にある、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項11】
前記免疫グロブリンＦｃ切片が配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項12】
前記液状製剤のｐＨは４．８～６．０である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項13】
前記安定化剤は、非イオン性界面活性剤及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含む、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項14】
前記緩衝物質は、クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項15】
前記緩衝物質の濃度は、５～１００ｍＭである、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項16】
前記糖アルコールは、マンニトール及びソルビトールで構成される群から選択される一つ以上である、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項17】
前記糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項18】
前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー、ポリソルベート、又はそれらの組み合わせである、請求項１３に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項19】
前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項20】
前記非イオン性界面活性剤は、液状製剤内に０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１３に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項21】
前記アミノ酸は、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項22】
前記アミノ酸は、液状製剤内に０．０１～１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１３に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項23】
前記液状製剤は、１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭの緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５である、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項24】
前記液状製剤は、１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭのクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）のグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）のポロキサマー、ポリソルベート及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのメチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５である、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項25】
前記液状製剤は、１８６～２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
１０～４０ｍＭの酢酸とその塩、又はクエン酸とその塩の緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）のスクロース、マンニトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせ；
０．００２～０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート；及び
０．０２～０．５ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含み、
ｐＨ４．８～６．０である、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項26】
前記液状製剤は、多価アルコールをさらに含む、請求項１に記載のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤。
【請求項27】
（ｉ）グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、ＧＬＰ－２の持続型結合体と（ｉｉ）糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含む安定化剤を互いに混合する段階を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の液状製剤を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はグルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）の持続型結合体の液状製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）は摂取された栄養分に反応し、小腸のＬ－細胞から生成される３３個のアミノ酸で構成されたペプチドであり、腸疾患、腸損傷及び胃疾患の治療剤として有望な可能性を示してきた。
【0003】
ところが、ＧＬＰ－２を薬物として商用化するためには、先に解決しなければならない問題がある。ＧＬＰ－２のようなペプチドは一般に安定性が低いため変性しやすく、体内のタンパク質加水分解酵素により分解されてその活性を失い、また相対的に大きさが小さく腎臓を通じて簡単に除去されるため、薬理成分としてペプチドを含む医薬品の血中濃度及び力価を維持するためにはペプチド薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、ペプチド薬物はほとんど注射剤の形態で患者に投与され、したがって、生理活性ペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射するようになるが、これは、患者に大きな苦痛を引き起こす。特に、ＧＬＰ－２は生理活性半減期が７分以下と非常に短い。これはジペプチジルペプチダーゼIV（以下、ＤＰＰIV）によるＧＬＰ－２のアミノ酸の２番（Ａｌａ）と３番（Ａｓｐ）の間の切断によるＧＬＰ－２の力価喪失に起因する（Ｂｏｌｅｔｔｅ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ２０００， ８５（８）：２８８４－２８８８）。このようなＧＬＰ－２の生理活性半減期を増加させるために、本発明者らはＧＬＰ－２の持続型結合体を開発した（韓国公開公報第１０－２０１０－０１０４３８２）。
【0004】
ただし、ＧＬＰ－２の持続型結合体を長時間保管できる安定した液状製剤の開発が依然として要求される。具体的には、ＧＬＰ－２の持続型結合体が含まれた薬物を製品として供給するためには、保存運送の過程で光、熱、又は添加剤内の不純物により誘導された劣化による変性、凝集、吸着又は加水分解などの物理化学的な変化を抑制しながら生体内効力を維持させることが必須である。液状製剤の温度、ｐＨ、添加剤などが分解産物の生成速度に影響を及ぼすが、現在まで全てのタンパク質を安定化させて臨床に適用できるようにする組成はまだ知られておらず、特定タンパク質で安定化効果を奏する液状組成が他のタンパク質の安定化には適用されない場合が多い。目的のタンパク質の液状における安定性を極大化させるために、タンパク質の特異分解産物の生成速度を最小化させる因子及び添加剤の選定及びそれらの組み合わせが広範囲に先行される必要があることが当業界に知られている。
【0005】
特に、生体内持続性及び安定性を高めたＧＬＰ－２の持続型結合体の場合、生理活性ペプチドであるＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片が結合した形態であるため、分子量及び体積がＧＬＰ－２より非常に増加し、タンパク質を安定化するための特別な組成が要求される。また、生理活性ペプチドであるＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片は、それぞれ物理化学的特性が異なるペプチド又はタンパク質であるため、生理活性ペプチドであるＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片を同時に安定化しなければならない。しかし、相違するペプチド又はタンパク質は、それらの物理化学的差異により、保存中に相違する比率及び相違する条件の下で漸進的に非活性化され、それぞれのペプチド又はタンパク質に適した安定化剤を併用する場合、相互間の競争作用及び副作用により目的としたところと異なる逆効果をもたらすことがある。また、保存中に保存されたタンパク質の本質が変化したり濃度が変化するため、相違する効果を示することがある。従って、ＧＬＰ－２の持続型結合体の場合、生理活性ペプチドであるＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片を同時に安定化する安定化剤の組成を見出すことに多くの困難がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】韓国公開公報第１０－２０１０－０１０４３８２
【特許文献2】韓国公開特許第１０－２０１９－００３７１８１号公報
【特許文献3】国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号明細書
【特許文献4】国際特許公開第９６／３２４７８号明細書
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Bolette H. et al., The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2000, 85(8):2884-2888
【非特許文献2】H.Neurath、R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）の持続型結合体の液状製剤を提供することである。
【0009】
本発明の他の目的は、前記液状製剤を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明を具現する一つの様態はグルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）の持続型結合体の液状製剤である。
【0011】
一つの具体例として、本発明はＧＬＰ－２及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、ＧＬＰ－２の持続型結合体を薬理学的有効量として含み、
糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含む安定化剤を含む、ＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤に関する。
糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含む安定化剤を含む、ＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤に関する。
【0012】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ＧＬＰ－２の持続型結合体は下記化学式（１）で表されることを特徴とする。
【0013】
Ｘ － Ｌａ － Ｆ・・・（１）
【0014】
ここで、
Ｘは、天然型ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２誘導体であり；
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す。
Ｘは、天然型ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２誘導体であり；
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す。
【0015】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記化学式（１）で表されるＧＬＰ－２の持続型結合体を１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬで含み、
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及びｐＨを４．５～６．５の範囲で維持するための分量の緩衝物質を含む安定化剤を含むことを特徴とする。
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及びｐＨを４．５～６．５の範囲で維持するための分量の緩衝物質を含む安定化剤を含むことを特徴とする。
【0016】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ＧＬＰ－２誘導体は天然型ＧＬＰ－２配列で少なくとも一つのアミノ酸において置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択された変形が起こったことを特徴とする。
【0017】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｘは、下記一般式１で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0018】
[一般式１]
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号９）
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号９）
【0019】
ここで、
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は存在しないか、リシン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、６－アジドリシン、又はシステインである。
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は存在しないか、リシン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、６－アジドリシン、又はシステインである。
【0020】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｘは
（１）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（２）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（３）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（４）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34が６－アジドリシンであるか、
（５）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（６）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、又は
（７）Ｘ1がヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであることを特徴とする。
（１）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（２）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（３）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（４）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34が６－アジドリシンであるか、
（５）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（６）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、又は
（７）Ｘ1がヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであることを特徴とする。
【0021】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｘは、下記一般式２で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0022】
[一般式２]
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号１０）
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号１０）
【0023】
ここで、
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は一つ以上の任意のアミノ酸又は変形が起こった一つ以上の任意のアミノ酸である。
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は一つ以上の任意のアミノ酸又は変形が起こった一つ以上の任意のアミノ酸である。
【0024】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ＧＬＰ－２誘導体は配列番号２～８からなる群から選択されたアミノ酸配列であることを特徴とする。
【0025】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【0026】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｆは、２個のポリペプチド鎖からなる二量体であり、Ｌの一方の末端が前記２個のポリペプチド鎖中の一つのポリペプチド鎖のみに連結されていることを特徴とする。
【0027】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｌはポリエチレングリコールであることを特徴とする。
【0028】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部位（ｍｏｉｅｔｙ）の化学式量は１～１００ｋＤａの範囲にあることを特徴とする。
【0029】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片が配列番号３２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0030】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記安定化剤は非イオン性界面活性剤及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含むことを特徴とする。
【0031】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記安定化剤は、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；非イオン性界面活性剤；及びアミノ酸を含むことを特徴とする。
【0032】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は等張化剤を含まないか、又は含むものであってもよい。
【0033】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記緩衝物質は、クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【0034】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤のｐＨは４．８～６．０であることを特徴とする。
【0035】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記糖アルコールはマンニトール及びソルビトールで構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする。
【0036】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記糖はグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする。
【0037】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー、ポリソルベート、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする。
【0038】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【0039】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記非イオン性界面活性剤は、製剤内に０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在することを特徴とする。
【0040】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記アミノ酸は、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【0041】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記アミノ酸は液状製剤内に０．０１～１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする。
【0042】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は
１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭのクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）のグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）のポロキサマー、ポリソルベート及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのメチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であることを特徴とする。
１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭのクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）のグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）のポロキサマー、ポリソルベート及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのメチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であることを特徴とする。
【0043】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は
１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬの持続型結合体；
５～１００ｍＭの緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であることを特徴とする。
１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬの持続型結合体；
５～１００ｍＭの緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であることを特徴とする。
【0044】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は
１８６～２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
１０～４０ｍＭの酢酸とその塩、又はクエン酸とその塩の緩衝物質；
２～１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、マンニトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせ；
０．００２～０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート；及び
０．０２～０．５ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含み、
ｐＨ４．８～６．０であることを特徴とする。
１８６～２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
１０～４０ｍＭの酢酸とその塩、又はクエン酸とその塩の緩衝物質；
２～１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、マンニトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせ；
０．００２～０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート；及び
０．０２～０．５ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含み、
ｐＨ４．８～６．０であることを特徴とする。
【0045】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は多価アルコールをさらに含むことを特徴とする。
【0046】
本発明を具現する他の一態様は、前記液状製剤の製造方法である。
【0047】
一つの具体例として、本発明は（ｉ）ＧＬＰ－２及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、ＧＬＰ－２の持続型結合体と（ｉｉ）糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含む安定化剤を互いに混合する段階を含む、前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤を製造する方法に関する。
【発明の効果】
【0048】
本発明による液状製剤は簡単な剤形で分子量が大きい本発明の結合体に保存安定性を提供し、経済的な提供が可能な利点がある。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】緩衝物質の種類とｐＨによるＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の安定性を確認した結果である（ＩＥＸ（％）：表３のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）、ＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の残存率）。
【図2】安定化剤の種類とｐＨによるＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の安定性を確認した結果である（ＩＥＸ（％）：表５のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）、ＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の残存率）。
【発明を実施するための形態】
【0050】
本発明を実施するための具体的な内容を説明すれば、次の通りである。
【0051】
なお、本願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【0052】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。また、このような等価物は本発明に含まれることが意図される。
【0053】
本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソブチル酸；２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、AZＫ（６－ａｚｉｄｏｌｙｓｉｎｅ）などの他のアミノ酸に対して一般に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
【0054】
アラニン Ａｌａ，Ａ アルギニン Ａｒｇ，Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ，Ｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ，Ｄ
システイン Ｃｙｓ，Ｃ グルタミン酸 Ｇｌｕ，Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ，Ｑ グリシンＧｌｙ，Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ，Ｈ イソロイシン Ｉｌｅ，Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ，Ｌ リシン Ｌｙｓ，Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ，Ｍ フェニルアラニン Ｐｈｅ，Ｆ
プロリン Ｐｒｏ，Ｐ セリン Ｓｅｒ，Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ，Ｔ トリプトファン Ｔｒｐ，Ｗ
チロシン Ｔｙｒ，Ｙ バリン Ｖａｌ，Ｖ
アスパラギン Ａｓｎ，Ｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ，Ｄ
システイン Ｃｙｓ，Ｃ グルタミン酸 Ｇｌｕ，Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ，Ｑ グリシンＧｌｙ，Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ，Ｈ イソロイシン Ｉｌｅ，Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ，Ｌ リシン Ｌｙｓ，Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ，Ｍ フェニルアラニン Ｐｈｅ，Ｆ
プロリン Ｐｒｏ，Ｐ セリン Ｓｅｒ，Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ，Ｔ トリプトファン Ｔｒｐ，Ｗ
チロシン Ｔｙｒ，Ｙ バリン Ｖａｌ，Ｖ
【0055】
本発明を具現する一つの様態は、グルカゴン様ペプチド－２（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－２；ＧＬＰ－２）の持続型結合体の液状製剤を提供する。
【0056】
具体的には、本発明は、ＧＬＰ－２及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、ＧＬＰ－２の持続型結合体を薬理学的有効量として含み、
【0057】
糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含む安定化剤を含む、ＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤を提供する。
【0058】
本発明において用語「液状製剤」は、医薬品の形態を液状に製剤化した薬物を意味し、これは液状の内用製剤及び外用製剤をいずれも含む。
【0059】
本発明の液状製剤は、薬理効果を奏するＧＬＰ－２の持続型結合体及び前記薬理効果を奏する物質が液状に製剤化される時、これを一定期間安定に維持及び／又は保存させる物質を含む。前記液状製剤の薬理効果を奏するＧＬＰ－２の持続型結合体以外に含まれる成分は安定化剤と混用され得る。
【0060】
本発明のＧＬＰ－２の持続型結合体の液状製剤において、保存安定性は正確な投与量を保障するために重要である。
【0061】
本発明の液状製剤は、ＧＬＰ－２の持続型結合体と安定化剤を含む。
【0062】
本発明において用語、「安定化剤」とは、製剤において有効成分などの構成成分を一定期間安定に維持させる物質をいう。
【0063】
本発明の安定化剤はアルブミン非含有安定化剤であってもよいが、これに限定されない。タンパク質の安定化剤として用いられ得るヒト血清アルブミンは人体の血液から製造され、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染の可能性が存在し、ゼラチンやウシ血清アルブミンは疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を誘発する可能性がある。前記アルブミン非含有安定化剤は、ヒトや動物由来の血清アルブミン又は精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないためウイルス感染のおそれが少ない。
【0064】
本発明において前記安定化剤は、特にＧＬＰ－２の持続型結合体が安定に保存され得るようにする物質を意味する。ＧＬＰ－２の持続型結合体において、保存安定性は正確な投与量を保障するためだけでなく、ＧＬＰ－２の持続型結合体に対する抗原性物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。
【0065】
前記安定化剤は、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含んでもよい。このような液状製剤はＧＬＰ－２の持続型結合体を安定的に保存できる溶液剤形であってもよい。
【0066】
本発明の安定化剤に含まれる緩衝物質は、ＧＬＰ－２の持続型結合体が安定するように液状製剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持させることができる。
【0067】
前記緩衝物質は、リン酸とその共役塩基であるアルカリ塩（例えば、リン酸塩：リン酸ナトリウム、リン酸カリウム又はこれらの水素又は二水素塩）、クエン酸とその塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、酢酸とその塩（例えば、酢酸ナトリウム）、ヒスチジンとその塩をはじめとするｐＨ緩衝物質であってもよく、これら緩衝物質の混合物も用いられるが、これに制限されない。
【0068】
本発明の液状製剤は、前記緩衝物質を含む緩衝溶液を液状製剤の溶媒として含み得、具体的には、前記緩衝溶液は、クエン酸緩衝溶液（例えば、クエン酸ナトリウム緩衝溶液）、酢酸緩衝溶液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝溶液）、リン酸緩衝溶液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝溶液）、ヒスチジン緩衝溶液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。より具体的には、前記緩衝溶液は、クエン酸緩衝溶液（例えば、クエン酸ナトリウム緩衝溶液）、酢酸緩衝溶液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝溶液）、ヒスチジン緩衝溶液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよく、より一層具体的には、前記緩衝溶液は、クエン酸緩衝溶液（例えば、クエン酸ナトリウム緩衝溶液）、酢酸緩衝溶液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝溶液）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよいが、これに制限されない。
【0069】
前記緩衝溶液又は液状製剤内の緩衝物質（クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、又はそれらの組み合わせ）は目標とする液状製剤のｐＨを維持するのに十分な分量の濃度で含まれてもよい。具体的には、前記緩衝物質の濃度は約２ｍＭ～約２００ｍＭであってもよく、よりも具体的には、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約８０ｍＭ、約５ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭであってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【0070】
前記緩衝溶液又は液状製剤のｐＨは、ｐＨ約４．０～ｐＨ約７．０、具体的には、ｐＨ約４．０～ｐＨ約６．８、ｐＨ約４．２～ｐＨ約６．６、ｐＨ約４．３～ｐＨ約６．５、さらに具体的には、ｐＨ約４．５～ｐＨ約６．５、ｐＨ約４．５～ｐＨ約６．３、ｐＨ約４．５～ｐＨ約６．０、ｐＨ約４．８～ｐＨ約６．５、ｐＨ約４．８～約ｐＨ ６．０、ｐＨ約５．１～ｐＨ約６．０、又はｐＨ約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、又は７．０であってもよいが、これに限定されない。
【0071】
本発明の全般において用語、「約」は±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などを全て含む範囲であり、約という用語の後に出る数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに限定されない。
【0072】
一方、液状製剤の製造において、成分を水（例えば、ＷＦＩ）に溶かし、ＨＣｌ及び／又はＮａＯＨなどを用いて緩衝溶液又は製剤のｐＨを目的とするｐＨに調整することができ、これは当業界に既に通常用いられる方法である。従って、請求項にｐＨ調節子に関する別途の言及がなくても、このような方法を通じて製剤が調整されたｐＨを有することができるということは、当業者が理解することができる。
【0073】
本発明の安定化剤に含まれる糖アルコールは多数の水酸基を含む物質であり、糖のアルデヒド基及び／又はケトン基などがアルコール基で置換された物質の総称であり、ＧＬＰ－２の持続型結合体の安定性を増大させることができる。例えば、前記糖アルコールはマンニトール及びソルビトールからなる群から選択される一つ以上であってもよいが、これに制限されない。
【0074】
本発明の安定化剤に含まれる糖（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、単糖類、二糖類、多糖類、オリゴ糖類などを言い、ＧＬＰ－２の持続型結合体の安定性を増大させることができる。具体的な例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコース及びキシロースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、及びスクロースなどの二糖類；ラフィノース及びデキストランなどの多糖類などを挙げることができるが、これに制限されない。
【0075】
前記糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせは、全体溶液比約１～約２０％（ｗ／ｖ）、約１～約１５％（ｗ／ｖ）、約２～約１５％（ｗ／ｖ）、約２～約１２％（ｗ／ｖ）、約２～約１０％（ｗ／ｖ）、約３～約１０％（ｗ／ｖ）、約４～約１０％（ｗ／ｖ）、約４～約９％（ｗ／ｖ）、約５～約９％（ｗ／ｖ）、約５～約８％（ｗ／ｖ）、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、又は約８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在してもよいが、特にこれに限定されない。
【0076】
また、本発明の安定化剤は、非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含んでもよいが、これに制限されない。従って、前記安定化剤は、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質で必須で構成されてもよいが、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；及び非イオン性界面活性剤、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；及びアミノ酸、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；非イオン性界面活性剤；及びアミノ酸で必須で構成されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0077】
ここで、安定化剤を構成する各成分の種類及び濃度あるいはｐＨに対しては、前記あるいは下記の内容がいずれも適用されることは明確である。
【0078】
特にこれに制限されないが、前記非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を下げて疎水性表面にタンパク質が吸着又は凝集することを防止することができる。
【0079】
本発明に用いられる非イオン性界面活性剤の具体的な例としてはポリソルベート又はポロキサマーを挙げることができ、これらが一つ又は二つ以上の組み合わせの形態でも用いられる。
【0080】
具体的には、前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０、ポリソルベート２０、又はポロキサマー１８８であってもよく、これらが組み合わせられて用いられてもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【0081】
本発明において前記非イオン性界面活性剤は高濃度で含まれないことが好ましく、具体的には、本発明の製剤に約０．２％（ｗ／ｖ）以下の濃度、例えば、約０．００１～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．００１～約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．００５～約０．０８％（ｗ／ｖ）、約０．００２～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．００５～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０１～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０１～約０．０４％（ｗ／ｖ）、約０．０１～約０．０３％（ｗ／ｖ）、又は約０．０２％（ｗ／ｖ）で含まれてもよいが、特にこれに限定されない。
【0082】
前記アミノ酸は、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせであってもよく、具体的にはメチオニンであってもよい。また、前記メチオニンはＬ－メチオニンであってもよいが、特にこれに限定されない。
【0083】
前記アミノ酸はタンパク質の酸化反応などにより生じ得る不純物の生成を抑制させることができるが、特にこれに限定されるものではない。
【0084】
前記アミノ酸は製剤内に約０．０１～約１ｍｇ／ｍＬの濃度、具体的には、約０．０１～約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．０１～約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．０２～約０．５ｍｇ／ｍＬ、又は約０．０２～約０．４ｍｇ／ｍＬで存在してもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0085】
一方、本発明の液状製剤はさらに多価アルコールを含んでもよいが、特にこれに限定されない。
【0086】
例えば、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含む安定化剤だけでなく、多価アルコールを含んでもよい。具体的には、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；及び非イオン性界面活性剤、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；及びアミノ酸、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；非イオン性界面活性剤；及びアミノ酸で必須で構成される安定化剤に多価アルコールをさらに含んでもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【0087】
本発明の製剤にさらに含まれてもよい多価アルコールの好ましい例としては、プロピレングリコール及び低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコールなどを挙げることができ、これらの一つ又は二つ以上の組み合わせの形態で用いられる。また、本発明の多価アルコールから糖アルコールが除外されてもよいが、これに制限されない。
【0088】
一方、本発明の液状製剤には前記説明した糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；緩衝物質；アミノ酸；及び非イオン性界面活性剤の以外に、本発明の効果を損傷させない範囲内で当業界に公知となっているその他の成分乃至物質が選択的にさらに含まれてもよい。
【0089】
一方、本発明の液状製剤の一つの具体例は等張化剤を含んでも含まなくてもよい。前記等張化剤は浸透圧の調節を示す物質をいう。前記等張化剤は本発明による液状製剤を体内に投与する場合、浸透圧を適宜維持する役割をすることができる。
【0090】
このような等張化剤の代表的な例としては、水溶性無機塩として塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、又はクエン酸ナトリウムなどを挙げることができ、具体的には塩化ナトリウムを挙げることができるが、特にこれに制限されるものではない。このような無機塩は、上述した安定化剤にさらに含まれる選択的な成分であってもよく、特にこれに制限されない。これと併せて上述した安定化制も等張化剤として役割を果たすことができる。
【0091】
本発明による製剤において前記等張化剤の濃度は０～２００ｍＭ、０～１５０ｍＭ、０～１００ｍＭ、１０～２００ｍＭ、１０～１５０ｍＭ、１０～１００ｍＭ、１０～５０ｍＭ、２０～１００ｍＭ、２０～８０ｍＭ、２０～５０ｍＭ、２０～３０ｍＭ、又は４０～５０ｍＭであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0092】
本発明において用語「ＧＬＰ－２の持続型結合体」は、本発明の液状製剤に含まれる有効成分であり、薬理学的有効量で製剤に含まれてもよく、その例としてＧＬＰ－２の持続型結合体の濃度が、約１８～約１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１４９０４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約９３１５ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約７４５２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約５５８９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約４６５８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１８６３ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１４９１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１２１１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約９３２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約７４６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約５５９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約３７３ｎｍｏｌ／ｍＬ、約３７～約５５８９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約９３～約２２３６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１４９～約１４９１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６～約２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６～約１１１８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約９３～約１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６～約９３１５ｎｍｏｌ／ｍＬ、約２７９～約５５８９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約３７２～約４６５８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約４６５～約３７２６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５８～約２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１４９１０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約９３２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約７４６０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約５５９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約４６６０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１８７０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１２２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約９４０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約７５０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約５６０ｎｍｏｌ／ｍＬ、又は約１８～約３８０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約３７～約５５９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約９３～約２２４０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１４９～約１５００ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６～約２９９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６～約１１２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６～約９３２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約２７９～約５５９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約３７２～約４６６０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約４６５～約３７３０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５８～約２９９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８６．３ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８７ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１１１７ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１１１７．８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１１１８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５８．９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１４９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１４９０．４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１４９１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約２９８０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約２９８０．８ｎｍｏｌ／ｍＬ、又は約２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬであってもよいが、これに限定されない。
【0093】
具体的には、持続型結合体はＧＬＰ－２に免疫グロブリンＦｃ切片が連結された形態であってもよい。前記結合体は免疫グロブリンＦｃ切片が結合していないＧＬＰ－２に比べて増加した効力の持続性を示すことができ、本発明では、このような結合体を「持続型結合体」と称する。本発明において持続型結合体は結合体と混用される。
【0094】
一方、このような結合体は、非自然発生の（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。
【0095】
また、ＧＬＰ－２の持続型結合体においてＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片の連結は、物理又は化学結合であるか、非共有又は共有結合であってもよく、具体的に共有結合であってもよいが、これに制限されない。
【0096】
また、ＧＬＰ－２の持続型結合体はＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片の連結方法は特に制限されないが、リンカーを通じてＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結されたものであってもよい。
【0097】
また、ＧＬＰ－２の持続型結合体に関する韓国公開特許第１０－２０１９－００３７１８１号は参照として本願に含まれる。
【0098】
一つの具体的な実施形態において、本発明のＧＬＰ－２の持続型結合体は下記化学式（１）の構造を有する。
【0099】
Ｘ － Ｌａ － Ｆ・・・（１）
【0100】
ここで、
Ｘは、ＧＬＰ－２であり、
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
前記「－」は非共有結合あるいは共有結合など如何なる化学的結合であってもよい。
Ｘは、ＧＬＰ－２であり、
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
前記「－」は非共有結合あるいは共有結合など如何なる化学的結合であってもよい。
【0101】
一つの具体的な実施形態において、本発明の液状製剤は、前記化学式（１）で表されるＧＬＰ－２の持続型結合体を１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬで含み、
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及びｐＨを４．５～６．５の範囲で維持するための分量の緩衝物質を含む安定化剤を含んでもよい。
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及びｐＨを４．５～６．５の範囲で維持するための分量の緩衝物質を含む安定化剤を含んでもよい。
【0102】
本明細書においてＦｃ切片といえば、免疫グロブリンのパパインの消化から得る天然型配列だけでなく、その誘導体、例えば、天然配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組み合わせにより変換され、天然型と相異なった配列まで網羅して含まれる。
【0103】
本発明において用語「グルカゴン様ペプチド－２（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－２、ＧＬＰ－２）」は、腸損傷、腸疾患、及び胃疾患などの予防、治療及び改善機能を有するペプチド（化学式（１）においてＸに該当）であり、天然型ＧＬＰ－２だけでなく、そのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）及び誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）なども含む。
【0104】
前記天然型ＧＬＰ－２のアミノ酸配列は下記の通りである。
ＧＬＰ－２（１－３３）
ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ（配列番号１）
ＧＬＰ－２（１－３３）
ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ（配列番号１）
【0105】
本発明において「ＧＬＰ－２受容体アゴニスト」は、生体内ＧＬＰ－２受容体と結合して天然型ＧＬＰ－２と同一のあるいは類似の生理活性を引き起こす物質をいう。例えば、ＧＬＰ－２アゴニストには天然型ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２誘導体が含まれてもよい。
【0106】
本発明において「ＧＬＰ－２誘導体」は、天然型ＧＬＰ－２において少なくとも一つ以上のアミノ酸において置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択された変形が起こったものであってもよく、天然型ＧＬＰ－２のように腸損傷、腸疾患又は胃疾患などの予防、治療及び／又は改善機能を有する天然型ＧＬＰ－２の模倣体を含む。追加されるアミノ酸は、非天然型アミノ酸（例；Ｄ型アミノ酸）も可能であり、天然型アミノ酸以外に非天然型アミノ酸の置換も可能である。前記追加されるアミノ酸配列は天然型ＧＬＰ－２に由来したものであってもよいが、これに限定されない。また、本発明においてアミノ酸の変形は、少なくとも一つのアミノ酸の置換、追加、除去、又はそれらの組み合わせと共に；又はこれと独立に、アミノ酸残基の一部のグループが化学的に置換（例；ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ａｌｐｈａ－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ、ａｚｉｄｏ基で置換）、除去（例；ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）及び／又は修飾（例；Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）されたことを意味してもよいが、これに制限されるものではない。
【0107】
一つの具体的な実施形態において、本発明のＧＬＰ－２の誘導体は、天然型ＧＬＰ－２とアミノ酸配列で少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を示すものであってもよく／示したり、ＧＬＰ－２のアミノ酸の一つの残基の一部のグループが化学的に置換（例；ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ａｌｐｈａ－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ、ａｚｉｄｏ基で置換）、除去（例；ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）及び／又は修飾（例；Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）された形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0108】
具体的には、天然型ＧＬＰ－２のアゴニスト及び誘導体は、これに制限されないが、腸損傷、腸疾患及び胃疾患などの予防、治療及び改善機能を有することができる。
【0109】
一つの具体的な実施形態において本発明のＧＬＰ－２は、Ｎ末端アミノ基が置換、除去、又は修飾されてもよいが、これに制限されない。本発明のＧＬＰ－２は、持続型結合体の製造時にＧＬＰ－２の生体内活性に重要な部位であるＮ末端に結合が起こることを防止するために、Ｎ末端ヒスチジンのアルファアミノ基を除去する方法、Ｎ末端アミノ基をヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）基又はカルボキシル（ｃａｒｂｏｘｙｌ）基で置換して合成する方法、Ｎ末端ヒスチジンのアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基を除去してイミダゾ－アセチル（ｉｍｉｄａｚｏ－ａｃｅｔｙｌ）作用基のみを残す方法、Ｎ末端アミノ基を二個のメチル基で修飾する方法などを通じて製造されてもよい。
【0110】
具体的には、ＧＬＰ－２は、ＧＬＰ－２のＮ末端の第一のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基が除去されたイミダゾアセチルデスヒスチジルＧＬＰ－２（ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ－ｄｅｓｈｉｓｔｉｄｙｌ－ＧＬＰ－２、ＣＡ－ＧＬＰ－２）、ＧＬＰ－２のＮ末端アミノ基が除去されたデスアミノヒスチジルＧＬＰ－２（ｄｅｓａｍｉｎｏｈｉｓｔｉｄｙｌ ＧＬＰ－２、ＤＡ－ＧＬＰ－２）、ＧＬＰ－２のＮ末端アミノ基がヒドロキシル基で置換されたβ－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジルＧＬＰ－２（β－ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌｄｅｓｈｉｓｔｉｄｙｌ ＧＬＰ－２、ＨＹ－ＧＬＰ－２）、ＧＬＰ－２のＮ末端アミノ基が二個のメチル基で修飾されたＮ－ジメチルヒスチジルＧＬＰ－２（Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｙｌ ＧＬＰ－２、ＤＭ－ＧＬＰ－２）、又はＧＬＰ－２のＮ末端アミノ基がカルボキシル基で置換されたβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジル－ＧＬＰ－２（β－ｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ｄｅｓｈｉｓｔｉｄｙｌ ＧＬＰ－２、ＣＸ－ＧＬＰ－２）であってもよいが、これに限定されない。一つの非制限的な例示としてＧＬＰ－２誘導体の製造に用いられた物質構造は下記の通りである。
【0111】
【0112】
本願においてイミダゾアセチルデスヒスチジル（ジン）、デスアミノヒスチジル（ジン）、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジル（ジン）、Ｎ－ジメチルヒスチジル（ジン）、及びβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジル（ジン）は、それぞれイミダゾアセチル、デス－アミノ－ヒスチジル、β－ヒドロキシ－イミダゾプロピオニル、ジメチル－ヒスチジル、β－カルボキシル－イミダゾプロピオニルと同様の意味で用いられる。
【0113】
一つの具体的な実施形態において、ＧＬＰ－２誘導体は、配列番号１において１番、２番、３０番及び３３番のアミノ酸中の少なくとも一つのアミノ酸における変形を含んでもよいが、これに制限されない。具体的には、本発明においてアミノ酸の変形は、少なくとも一つのアミノ酸の置換、追加、除去、修飾及びこれらの組み合わせからなる群から選択された変形であってもよく、この時に追加されるアミノ酸は非天然型アミノ酸（例；Ｄ型アミノ酸）も可能であり、天然型アミノ酸以外に非天然型アミノ酸の置換も可能である。前記追加されるアミノ酸配列は天然型ＧＬＰ－２に由来したものであってもよいが、これに限定されない。また、本発明においてアミノ酸の変形は、少なくとも一つのアミノ酸の置換、追加、除去、又はこれらの組み合わせと共に；又はこれと独立に、アミノ酸残基の一部のグループが化学的に置換（例；ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ａｌｐｈａ－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ、ａｚｉｄｏ基で置換）、除去（例；ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）及び／又は修飾（例；Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）されたことを意味し得るが、これに限定されるものではない。
【0114】
一つの具体的な実施形態において、ＧＬＰ－２は下記一般式１のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されない：
【0115】
[一般式１]
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号９）
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号９）
【0116】
ここで、
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は存在しないか、リシン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、６－アジドリシン、又はシステインである。
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は存在しないか、リシン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、６－アジドリシン、又はシステインである。
【0117】
一つの具体的な実施形態において、ＧＬＰ－２は下記一般式２のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されない：
【0118】
[一般式２]
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号１０）
Ｘ1Ｘ2ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＸ30ＩＴＤＸ34（配列番号１０）
【0119】
ここで、
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は一つ以上の任意のアミノ酸又は変形が起こった一つ以上の任意のアミノ酸である。
Ｘ1はヒスチジン、イミダゾアセチルデスヒスチジン、デスアミノヒスチジン、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジン、Ｎ－ジメチルヒスチジン、又はβ－カルボキシイミダゾプロピオニルデスヒスチジンであり；
Ｘ2はアラニン、グリシン、又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ30はリシン又はアルギニンであり；
Ｘ34は一つ以上の任意のアミノ酸又は変形が起こった一つ以上の任意のアミノ酸である。
【0120】
具体的には、前記アミノ酸は天然型アミノ酸又は非天然型アミノ酸であってもよく、前記アミノ酸の変形は前述した通りである。
【0121】
また、前記一般式１又は２のアミノ酸配列の中で配列番号１と同一の配列は除いてもよいが、これに制限されない。
【0122】
具体的には、本発明のＧＬＰ－２誘導体は、天然型ＧＬＰ－２の２番目のアミノ酸であるアラニンのグリシン又はＡｉｂ（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）への置換、３０番目のアミノ酸であるリシンのアルギニンへの置換、又はこれらの組み合わせを有してもよいが、これに制限されない。また、前記ＧＬＰ－２誘導体はＣ末端（例えば、３３番目のアミノ酸）にチオール基（例えば、システイン）、アミノ基（例えば、リシン、アルギニン、グルタミン又はヒスチジン）、又はアジド基（例えば、６－アジドリシン）が導入されてもよいが、これに制限されない。
【0123】
ＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の製造時に前記導入されたグループで結合が起こるため、これを用いて結合位置が選択的に調節されたＧＬＰ－２結合体を製造できる。具体的には、ＧＬＰ－２誘導体のヒドロキシル基、チオール基、アミノ基又はアジド基にリンカーの一方の末端が結合し、リンカーの他方の末端に生体内半減期を増加させる物質（例えば、免疫グロブリンＦｃ切片）が結合されてもよい。前記チオール基、アミノ基又はアジド基はＧＬＰ－２にアミノ酸を追加して導入させることができるが、これに制限されない。前記チオール基はＧＬＰ－２にシステイン（Ｃ）を追加して導入され；アミノ基はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）を追加して導入され；アジド基は６－アジドリシン（６－ａｚｉｄｏｌｙｓｉｎｅ，ＡＺＫ）を追加して導入されてもよいが、これに制限されない。
【0124】
具体的には、ＧＬＰ－２誘導体は少なくとも一つの残基がシステイン、リシン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン又は６－アジドリシンであってもよいが、これに制限されない。
【0125】
具体的には、本発明のＧＬＰ－２誘導体は天然型ＧＬＰ－２の２番目のアミノ酸であるアラニンのグリシンへの置換及びＣ末端にチオール基（例えば、システイン）の導入を含み、さらに具体的には、Ｎ末端の第一のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基が除去されたイミダゾアセチルデスヒスチジンを含んでもよく、その例として配列番号２のアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。
【0126】
具体的には、本発明のＧＬＰ－２誘導体は天然型ＧＬＰ－２の２番目のアミノ酸であるアラニンのグリシンへの置換及びＣ末端にアミノ基（例えば、リシン）の導入を含み、さらに具体的には、Ｎ末端の第一のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基が除去されたイミダゾアセチルデスヒスチジンを含んでもよく、その例として配列番号３のアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。
【0127】
具体的には、本発明のＧＬＰ－２誘導体は天然型ＧＬＰ－２の２番目のアミノ酸であるアラニンのグリシンへの置換、天然型ＧＬＰ－２の３０番目のアミノ酸であるリシンのアルギニンへの置換及びＣ末端にアミノ基（例えば、リシン）の導入を含み、さらに具体的には、Ｎ末端の第一のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基が除去されたイミダゾアセチルデスヒスチジンを含んでもよく、その例として配列番号４のアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。
【0128】
具体的には、本発明のＧＬＰ－２誘導体は天然型ＧＬＰ－２の２番目のアミノ酸であるアラニンのグリシンへの置換及びＣ末端にアジド基（例えば、６－アジドリシン）の導入を含み、さらに具体的には、Ｎ末端の第一のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基が除去されたイミダゾアセチルデスヒスチジンを含んでもよく、その例として配列番号５のアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。
【0129】
具体的には、本発明のＧＬＰ－２誘導体は天然型ＧＬＰ－２の２番目のアミノ酸であるアラニンのグリシンへの置換、天然型ＧＬＰ－２の３０番目のアミノ酸であるリシンのアルギニンへの置換及びＣ末端にチオール基（例えば、システイン）の導入を含み、さらに具体的には、Ｎ末端の第一のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基が除去されたイミダゾアセチルデスヒスチジンを含んでもよく、その例として配列番号６のアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。
【0130】
具体的には、本発明のＧＬＰ－２誘導体は天然型ＧＬＰ－２の２番目のアミノ酸であるアラニンの２－アミノイソ酪酸への置換及びＣ末端にチオール基（例えば、システイン）の導入を含み、その例として配列番号８のアミノ酸配列を有することができ、さらに具体的には、Ｎ末端の第一のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素及びアルファ炭素に結合したＮ末端アミノ基が除去されたイミダゾアセチルデスヒスチジンを含んでもよく、その例として配列番号７のアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。前記配列番号２～８のＧＬＰ－２誘導体を下記表１に示した。
【0131】
【表1】
【0132】
前記表１においてcaＨはヒスチジンの代わりにイミダゾアセチルデスヒスチジンで置換されたことを、Ａｉｂは２アミノイソ酪酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）を、AZＫは６－アジド－Ｌ－リシン（６－ａｚｉｄｏ－Ｌ－ｌｙｓｙｉｎｅ）を指す。
【0133】
本発明によるＧＬＰ－２は、前記の特定配列を含むペプチド、前記の特定配列で構成された（又は必須で構成された）ペプチドであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0134】
一方、本願において「特定配列番号で構成される（からなる）」ペプチド又はＧＬＰ－２と記載されているとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチド又はＧＬＰ－２と同一又は相当する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加又は自然に発生し得る突然変異、あるいはこのサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くものではなく、このような配列の付加あるいは突然変異を有する場合にも、本願の範囲内に属することが自明である。
【0135】
具体的には、ＧＬＰ－２誘導体は一般式１又は一般式２において（１）Ｘ2がグリシン又はＡｉｂであるか、（２）Ｘ30がリシン又はアルギニンであるか、又は（３）Ｘ2がグリシン又はＡｉｂであり、Ｘ30がリシン又はアルギニンであってもよいが、これに限定されない。
【0136】
具体的には、ＧＬＰ－２誘導体は一般式１又は一般式２において、
（１）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（２）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（３）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（４）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34が６－アジドリシンであるか、
（５）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（６）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、又は
（７）Ｘ1がヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであってもよいが、これに限定されない。
（１）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（２）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（３）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がリシンであるか、
（４）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34が６－アジドリシンであるか、
（５）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がグリシンであり、Ｘ30がアルギニンであり、Ｘ34がシステインであるか、
（６）Ｘ1がイミダゾアセチルデスヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであるか、又は
（７）Ｘ1がヒスチジンであり、Ｘ2がＡｉｂであり、Ｘ30がリシンであり、Ｘ34がシステインであってもよいが、これに限定されない。
【0137】
本発明において、前記ＧＬＰ－２誘導体は生体内のタンパク質切断酵素から保護し、安定性を増加させるために、そのＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾されたり有機基で保護されたり、又はＧＬＰ－２の末端などにアミノ酸が追加されて変形された形態であってもよい。
【0138】
特に、化学的に合成したペプチドの場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているため、このような電荷を除去するために、Ｎ末端をアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及び／又は－末端のアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）を行ってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。具体的には、本発明において、ＧＬＰ－２誘導体はそのＣ末端が変形されないか、アミド化したものであってもよいが、これに限定されない。
【0139】
本発明のＧＬＰ－２は、Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ合成法を通じて合成されることができ、組換え方法でも生産可能であり、商業的に依頼して製造できる。
【0140】
前記化学式（１）において共有化学結合、非共有化学結合又はそれらの組み合わせによりＬを通じてＦとＸとが互いに結合されてもよい。
【0141】
より具体的には、ＸとＬ、及びＬとＦは共有結合で互いに連結されてもよく、その時、前記結合体は化学式（１）の順に、Ｘ、Ｌ、及びＦが共有結合を通じてそれぞれ連結された結合体であってもよい。
【0142】
また、前記ＦはＸと直接的に連結されたり（即ち、前記化学式（１）においてａが０であったり）、又はリンカー（Ｌ）を通じて連結されたものであってもよい。
【0143】
一つの具体例として、前記化学式（１）の持続型結合体の一構成要素であるＬａはエチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカー、例えば、ポリエチレングリコールであってもよく、また、当該分野に既に知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【0144】
前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであるＬは、結合体で構成される以前は結合体の製造に用いられる作用基を末端に含むものであってもよい。本発明による持続型結合体は前記作用基を通じてＸとＦが連結された形態であってもよいが、これに制限されない。本発明において、前記エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーは２個、又は３個以上の作用基を含めてもよく、各作用基は同一又は相異してもよいが、これに制限されない。
【0145】
具体的には、前記リンカーは下記化学式（４）で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよいが、これに限定されるものではない：
【0146】
【化1】
【0147】
ここで、ｎ＝１０～２４００、ｎ＝１０～４８０、又はｎ＝５０～２５０であるが、これに限定されない。
【0148】
前記持続型結合体においてＰＥＧの一部は、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－構造だけでなく、連結要素と、その－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－との間に介在する酸素原子も含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0149】
また、一つの具体的な実施形態において前記結合体はＧＬＰ－２と免疫グロブリンＦｃ切片（Ｆ）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーにより共有結合で連結された構造であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0150】
前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコール同種重合体、ＰＥＧ共重合体、又はモノメチル置換されたＰＥＧ重合体（ｍＰＥＧ）の形態をいずれも包括する用語であるが、特にこれに制限されるものではない。
【0151】
一つの具体例として前記エチレングリコール繰り返し単位はその例として、［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎで表すことができ、ｎ値は自然数で前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が０超～約１００ｋＤａになるように定められてもよいが、これに限定されない。もう一つの例として、前記ｎ値は自然数で前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が約１～約１００ｋＤａ、約１～約８０ｋＤａ、約１～約５０ｋＤａ、約１～約３０ｋＤａ、約１～約２５ｋＤａ、約１～約２０ｋＤａ、約１～約１５ｋＤａ、約１～約１３ｋＤａ、約１～約１１ｋＤａ、約１～約１０ｋＤａ、約１～約８ｋＤａ、約１～約５ｋＤａ、約１～約３．４ｋＤａ、約３～約３０ｋＤａ、約３～約２７ｋＤａ、約３～約２５ｋＤａ、約３～約２２ｋＤａ、約３～約２０ｋＤａ、約３～約１８ｋＤａ、約３～約１６ｋＤａ、約３～約１５ｋＤａ、約３～約１３ｋＤａ、約３～約１１ｋＤａ、約３～約１０ｋＤａ、約３～約８ｋＤａ、約３～約５ｋＤａ、約３～約３．４ｋＤａ、約８～約３０ｋＤａ、約８～約２７ｋＤａ、約８～約２５ｋＤａ、約８～約２２ｋＤａ、約８～約２０ｋＤａ、約８～約１８ｋＤａ、約８～約１６ｋＤａ、約８～約１５ｋＤａ、約８～約１３ｋＤａ、約８～約１１ｋＤａ、約８～約１０ｋＤａ、約９～約１５ｋＤａ、約９～約１４ｋＤａ、約９～約１３ｋＤａ、約９～約１２ｋＤａ、約９～約１１ｋＤａ、約９．５～約１０．５ｋＤａ、約３．４ｋＤａ又は約１０ｋＤａであってもよいが、これに限定されない。
【0152】
一つの具体的な実施形態において前記リンカーの両末端は免疫グロブリンＦｃ切片のチオール基、アミノ基、ヒドロキシル基及びＧＬＰ－２のチオール基、アミノ基、アジド基、ヒドロキシル基に結合してもよいが、これに制限されない。
【0153】
具体的には、前記リンカーは両末端にそれぞれ免疫グロブリンＦｅ及びＧＬＰ－２と結合され得る反応基、具体的には免疫グロブリンＦｃ切片のシステインのチオール基；Ｎ－末端、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンに位置したアミノ基；及び／又はＣ末端に位置したヒドロキシル基と結合し、ＧＬＰ－２のシステインのチオール基；リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンのアミノ基；アジドリシンのアジド基；及び／又はヒドロキシル基と結合され得る反応基を含んでもよいが、これに制限されない。
【0154】
より具体的には、前記反応基は、アルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される一つ以上であってもよいが、これに制限されない。
【0155】
前記において、アルデヒドグループとしてプロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを例として挙げることができるが、これに制限されない。
【0156】
前記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタン酸、スクシンイミジルメチルプロピオン酸、スクシンイミジルブタン酸、スクシンイミジルプロピオン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよいが、これに限定されない。
【0157】
前記リンカーは、前記のような反応基を通じて免疫グロブリンＦｃ切片であるＦ及びＧＬＰ－２であるＸに連結され、リンカー連結部に転換されることができる。
【0158】
また、アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものより遥かに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えば、ｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成できる。
【0159】
本発明のリンカーの末端反応基は互いに同一又は異なってもよい。前記リンカーは、末端にアルデヒドグループ反応基を有するものであってもよく、また、前記リンカーは、末端にそれぞれアルデヒドグループ及びマレイミド反応基を有してもよく、又は末端にそれぞれアルデヒドグループ及びスクシンイミド反応基を有してもよいが、これに制限されない。
【0160】
例えば、一方の末端にはマレイミドグループを、他方の末端にはアルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを有することができる。また、一つの例として、一方の末端にはスクシンイミジルグループを、他方の末端にはプロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを有することができる。
【0161】
プロピオン側の末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールをリンカーとして用いる場合には、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前記多様な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明の結合体を製造できる。
【0162】
一つの具体的な実施形態において前記リンカーの反応基がＧＬＰ－２のシステイン残基、より具体的には、システインの－ＳＨ基に連結されるものであってもよいが、これに制限されない。
【0163】
もし、マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを用いる場合、マレイミド基はＧＬＰ－２誘導体の－ＳＨ基とチオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）結合で連結し、アルデヒド基は免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ2基と還元的アルキル化反応を通じて連結できるが、これに制限されず、これは一例に該当する。
【0164】
このような還元的アルキル化を通じてＰＥＧの一方の末端に位置した酸素原子に免疫グロブリンＦｃ切片のＮ末端アミノ基が－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－の構造を有するリンカー作用基を通じて互いに連結され、－ＰＥＧ－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ－免疫グロブリンＦｃのような構造を形成でき、チオエーテル結合を通じてＰＥＧの一方の末端がＧＬＰ－２のシステインに位置した硫黄原子に連結された構造を形成できる。上述したチオエーテル結合は
の構造を含んでもよい。
【0165】
しかし、上述した例に特に制限されるものではなく、これは一例に該当する。
【0166】
また、前記結合体において、リンカーの反応基が免疫グロブリンＦｃ切片のＮ末端に位置した－ＮＨ2と連結されたものであってもよいが、これは一例に該当する。
【0167】
また、前記結合体において、ＧＬＰ－２は反応基を有するリンカーとＣ末端を通じて連結されてもよいが、これは一例に該当する。
【0168】
本発明において「Ｃ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端を意味することであり、本発明の目的上、リンカーと結合できる位置をいう。その例として、これに制限されないが、Ｃ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｃ末端周囲のアミノ酸残基をいずれも含んでもよく、具体的には最末端から１番目～２０番目のアミノ酸残基を含んでもよい。
【0169】
一つの具体例として、前記化学式（１）の結合体は下記化学式（２）又は（３）の構造を有することができる。
【0170】
【0171】
【0172】
前記化学式（２）又は（３）において、Ｘは、前記で説明した化学式（１）のペプチドであり；
Ｆは免疫グロブリンＦｃ切片であり；
ｎは自然数であってもよい。その時、ｎに関する説明は、前述の通りである。
Ｆは免疫グロブリンＦｃ切片であり；
ｎは自然数であってもよい。その時、ｎに関する説明は、前述の通りである。
【0173】
一つの具体例として、前記化学式（２）の持続型結合体は、ＧＬＰ－２のＸと免疫グロブリンＦｃ切片Ｆがエチレングリコール繰り返し部を介在して共有結合で連結された構造であり、それぞれＸは化学式（２）のスクシンイミド環に、Ｆは化学式（２）のオキシプロピレン基に連結された形態であってもよい。また、前記化学式（３）の持続型結合体は、ＧＬＰ－２のＸと免疫グロブリンＦｃ切片Ｆがエチレングリコール繰り返し部を介在して共有結合で連結された構造であり、それぞれＸは化学式（３）のオキシプロピレン基に、Ｆは化学式（３）の他のオキシプロピレン基に連結された形態であってもよい。
【0174】
前記化学式（２）又は（３）において、前記ｎの値は、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］n部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１～１００ｋＤａ、又は１～２０ｋＤａ又は１０ｋＤａになるように定められるものであってもよいが、これに限定されない。
【0175】
一つの実施形態において化学式（２）のスクシンイミド環又は化学式（２）のスクシンイミド環にＸが連結される部位はＸのＣ末端システインの硫黄原子であってもよい。また、化学式（３）のオキシプロピレン基又は化学式（３）のオキシプロピレン基にＸが連結される部位はＸのＣ末端システインの硫黄原子であってもよい。
【0176】
Ｆ内において化学式（２）又は化学式（３）のオキシプロピレン基に連結される部位は、特に限定されない。本発明の一つの実施形態において前記オキシプロピレン基に連結されるＦの部位は、Ｎ－末端窒素又はＦ内部残基の窒素原子（例えば、リシンのイプシロン窒素）であってもよい。本発明の一つの具体的な実施形態において、Ｆが化学式（２）又は化学式（３）のオキシプロピレン基に連結される部位は、ＦのＮ－末端プロリンであってもよいが、これに制限されない。
【0177】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ切片」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖定常領域を意味する。具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ切片は重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）の部分を含むものであってもよく、より具体的には、ヒンジ領域（ヒンジ領域全体又は一部を意味する。）をさらに含むものであってもよい。本発明において免疫グロブリンＦｃ切片は、免疫グロブリンＦｃ領域と混用され得る。
【0178】
本明細書においてＦｃ切片といえば、免疫グロブリンのパパインの消化から得る天然型配列だけでなく、その誘導体、置換体、例えば、天然配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組み合わせにより変換され、天然型と相異なった配列など変形体まで網羅して含まれる。前記誘導体、置換体、変形体はＦｃＲｎに結合する能力を有することを前提とする。
【0179】
前記免疫グロブリンＦｃ切片は、本発明の化学式（１）の結合体の一部をなす一構成であり、具体的には、前記化学式（１）～（３）においてＦに該当し得る。
【0180】
前記Ｆは、二つのポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖中の一鎖の窒素原子を通じてのみ連結されている構造であってもよいが、これに制限されない。前記窒素原子を通じての連結はリシンのイプシロンアミノ原子やＮ末端アミノ基に還元的アミノ化を通じて連結されてもよい。
【0181】
還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（即ち、還元的アミノ化が可能な作用基）と反応してアミンを生成した後、還元反応によりアミン結合の形成させる反応を意味し、当該技術分野に広く知られている有機合成反応である。
【0182】
一つの具体例として、前記Ｆは、そのＮ末端プロリンの窒素原子を通じて連結されたものであってもよい。
【0183】
このような免疫グロブリンＦｃ切片は、重鎖定常領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0184】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ切片は、Ｎ末端に特定ヒンジ配列を含んでもよい。
【0185】
本発明において、「ヒンジ配列」とは、重鎖に位置してジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を通じて免疫グロブリンＦｃ切片の二量体を形成する部位を意味する。
【0186】
本発明において、前記ヒンジ配列は、下記アミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失して一つのシステイン残基のみを有するように変異されたものであってもよいが、これに制限されない：
【0187】
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号１１）。
【0188】
前記ヒンジ配列は、配列番号１１のヒンジ配列中の８番目又は１１番目のシステイン残基が欠失して一つのシステイン残基のみを含むものであってもよい。本発明のヒンジ配列は、一つのシステイン残基のみを含む、３～１２個のアミノ酸で構成されたものであってもよいが、これに限定されない。より具体的には、本発明のヒンジ配列は、次のような配列を有することができる：Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号１２）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号１３）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号１４）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号１５）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号１６）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号１７）、Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号１８）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号１９）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２０）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２１）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２２）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２３）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２４）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号２５）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２６）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２７）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号２８）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号２９）、Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号３０）。
【0189】
さらに具体的には、前記ヒンジ配列は、配列番号３０（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）又は配列番号２１（Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに限定されない。
【0190】
本発明のＧＬＰ－２誘導体持続型結合体の一つのさらに具体的な形態において、前記結合体内の前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端はプロリンであり、この結合体は、前記プロリンの窒素原子を通じてＦｃ領域がリンカーに連結されたものである。
【0191】
一つの具体的な実施形態において、免疫グロブリンＦｃ切片は、ヒンジ配列の存在により免疫グロブリンＦｃ鎖の二分子がホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）やヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒ）の二量体を形成した形態であってもよく、また、本発明の結合体はリンカーの一方の末端が二量体の免疫グロブリンＦｃ切片の一鎖に連結された形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0192】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ切片は、ヒンジ配列をＮ末端に含んでもよいが、これに制限されない。
【0193】
本発明において、「Ｎ末端」はタンパク質又はポリペプチドのアミノ末端を意味するものであり、アミノ末端の最末端、又は最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個以上のアミノ酸まで含むものであってもよい。
【0194】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ切片は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を奏する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部又は全体の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ切片であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
【0195】
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ切片は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の一個又は二個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、又は６）重鎖定常領域各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0196】
また、一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ切片は二量体形態（ｄｉｍｅｒｉｃｆｏｒｍ）であってもよく、二量体形態の一つのＦｃ切片にＸの一分子が共有結合的に連結されてもよく、その時、前記免疫グロブリンＦｃとＸはリンカーにより互いに連結されてもよい。一方、二量体形態の一つのＦｃ切片にＸの二分子が対称的に結合することも可能である。その時、前記免疫グロブリンＦｃとＸはリンカーにより互いに連結されてもよい。しかし、前記例に制限されるものではない。
【0197】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ切片は天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組み合わせにより相違する配列を有することを意味する。
【0198】
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２又は３２７～３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられてもよい。
【0199】
また、ジスルフィド結合を形成できる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクタ機能をなくすために補体結合部位、例えば、Ｃｌｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ切片の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第９６／３２４７８号などに開示されている。
【0200】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知となっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も通常生じる交換はアミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及びアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されることもできる。
【0201】
前記Ｆｃ誘導体は、本発明のＦｃ切片と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ切片の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
【0202】
また、このようなＦｃ切片は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット又はモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組換え型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は全体免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して獲得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離できる。さらに具体的な実施形態においてはヒト由来のＦｃ切片を微生物から得た組換え型免疫グロブリンＦｃ切片である。
【0203】
また、免疫グロブリンＦｃ切片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ切片は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が減少又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、薬物のキャリアとしての本来の目的に、より符合する形態は糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ切片であるといえる。
【0204】
本発明において「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ切片をいい、非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）とは、原核動物、さらに具体的な実施形態においては大腸菌で生産してグリコシル化していないＦｃ切片を意味する。
【0205】
一方、免疫グロブリンＦｃ切片は、ヒト又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、さらに具体的な実施形態においてはヒト起源である。
【0206】
また、免疫グロブリンＦｃ切片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来又はそれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又はそれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ切片であってもよい。さらに具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来のものであり、より具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来のものである。より一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ切片はＩｇＧ４ Ｆｃ切片であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ切片はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ切片であるが、これに制限されるものではない。
【0207】
また、一つの具体例として、免疫グロブリンＦｃ切片はヒトＩｇＧ４ Ｆｃの断片であり、各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ－ｃｈａｉｎ形態）を通じて二個の単量体が連結されたホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）であってもよく、その時、ホモ二量体は各単量体において３５番及び９５番のシステイン間及び１４１番及び１９９番のシステイン間に内部のジスルフィド結合、即ち二個のジスルフィド結合（ｉｎｔｒａ－ｃｈａｉｎ形態）を有したり／有し、各単量体のアミノ酸の数は２２１個であってもよく、ホモ二量体を形成するアミノ酸は全体４４２個のアミノ酸であってもよいが、これに制限されない。具体的には、免疫グロブリンＦｃ切片は配列番号３２のアミノ酸配列（４４２個のアミノ酸で構成される）を含むホモ二量体（ここで、配列番号３１のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸で構成される）を有する単量体二個が各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体内の単量体は、それぞれ独立に３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成する）であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0208】
一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ切片をコードするポリペプチドが相違する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧＦｃ、ＩｇＡＦｃ、ＩｇＭＦｃ、ＩｇＤＦｃ及びＩｇＥのＦｃ切片からなるグループから選択された２個以上の切片から二量体又は多量体の製造が可能である。
【0209】
本発明において「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、単鎖の免疫グロブリン定常領域内に２個以上の相違する起源の免疫グロブリンＦｃ切片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、種々の形態のハイブリッドが可能である。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなるグループより１個～４個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含めてもよい。
【0210】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明ではそれらの組み合わせ又はこれらのハイブリダイゼーションも可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、最も具体的には補体依存的毒性（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のようなエフェクタ機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ切片である。
【0211】
一方、ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２の持続型結合体はペプチドそのもの、その塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容可能な塩）、又はその溶媒和物の形態をいずれも含む。
【0212】
また、ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２の持続型結合体は薬学的に許容される任意の形態であってもよい。
【0213】
前記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全で効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに制限されるものではない。
【0214】
前記用語、「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、又はアレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。
【0215】
本発明において用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、又は塩基から誘導された塩を含む。適した酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適した塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含んでもよい。
【0216】
また、本発明で用いられた用語「溶媒和物」とは、本発明によるペプチド、化合物又はこの塩が溶媒分子と複合体を形成したことをいう。
【0217】
具体的な例として、本発明の液状製剤は、
ＧＬＰ－２の持続型結合体；
クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝物質；
グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール又はそれらの組み合わせ；
ポロキサマー、ポリソルベート及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤；及び
メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であってもよいが、これに限定されない。
ＧＬＰ－２の持続型結合体；
クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝物質；
グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール又はそれらの組み合わせ；
ポロキサマー、ポリソルベート及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤；及び
メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であってもよいが、これに限定されない。
【0218】
具体的な例として、本発明の液状製剤は、
薬理学的有効量（例えば、１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬ）のＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭの緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であってもよいが、これに限定されない。
薬理学的有効量（例えば、１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬ）のＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭの緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのアミノ酸を含み、
ｐＨ４．５～６．５であってもよいが、これに限定されない。
【0219】
具体的な例として、本発明の液状製剤は、
１８～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭの酢酸とその塩、又はクエン酸とその塩の緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）のスクロース、マンニトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含み、
ｐＨ４．５～６．５であってもよいが、これに限定されない。
１８～１８６３０ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
５～１００ｍＭの酢酸とその塩、又はクエン酸とその塩の緩衝物質；
１～２０％（ｗ／ｖ）のスクロース、マンニトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせ；
０．００１～０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート；及び
０．０１～１ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含み、
ｐＨ４．５～６．５であってもよいが、これに限定されない。
【0220】
具体的な例として、本発明の液状製剤は、
１８６～２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
１０～４０ｍＭの酢酸とその塩、又はクエン酸とその塩の緩衝物質；
２～１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、マンニトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせ；
０．００２～０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート；及び
０．０２～０．５ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含み、
ｐＨ４．８～６．０であってもよいが、これに限定されない。
１８６～２９８１ｎｍｏｌ／ｍＬのＧＬＰ－２の持続型結合体；
１０～４０ｍＭの酢酸とその塩、又はクエン酸とその塩の緩衝物質；
２～１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、マンニトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせ；
０．００２～０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート；及び
０．０２～０．５ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含み、
ｐＨ４．８～６．０であってもよいが、これに限定されない。
【0221】
本発明を具現するもう一つの様態は、前記液状製剤の製造方法を提供する。
【0222】
具体的には、前記製造方法は（ｉ）ＧＬＰ－２及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、ＧＬＰ－２の持続型結合体と（ｉｉ）糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質を含む安定化剤を互いに混合する段階を含んでもよい。
【0223】
前記ＧＬＰ－２の持続型結合体、緩衝物質、糖アルコール、糖、安定化剤及び液状製剤については、前述の通りである。
【0224】
本発明の治療方法は、液状製剤を薬学的（治療的）有効量で投与することを含んでもよい。適した総１日使用量は、正しい医学的判断の範囲内で処置医により決定され、１回又は数回に分けて投与できる。しかし、本発明の目的上、特定患者に関する具体的な薬学的（治療的）有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって異なる製剤が用いられるかどうかをはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に用いられたり同時に用いられる薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子により異なって適用することが好ましい。
【0225】
以下、本発明を下記実施例により、より詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらだけに限定されるものではない。
【0226】
実施例１．ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃ結合体又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣ－ＰＥＧ（１０Ｋ）免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
１０ｋＤａ ＭＡＬ－ＡＬＤ ＰＥＧ（両末端の水素がそれぞれ３－[３－（Ｎ－マレイミジル）プロパノール]アミノプロピル基と３－オキソプロピル基（プロピルアルデヒド基）で改質された分子量１０ｋＤａのポリエチレングリコールであるマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド、日本ＮＯＦ社）をＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣ（ＣＰＣ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ、中国）の３４番のシステイン残基にペギル化させるためにＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣとＰＥＧのモル比を１：１～２、ペプチド濃度を１～３ｍｇ／ｍｌにして１～３時間反応させた。その時、反応は５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．５とイソプロパノールの混合溶媒で行われた。反応液は、クエン酸ナトリウムｐＨ２．０、エタノールが含まれたバッファと塩化カリウム濃度勾配を用いたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ，米国）カラムを用いてモノペギル化された（ｍｏｎｏ－ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はモノペギル化されたＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣを精製した。
１０ｋＤａ ＭＡＬ－ＡＬＤ ＰＥＧ（両末端の水素がそれぞれ３－[３－（Ｎ－マレイミジル）プロパノール]アミノプロピル基と３－オキソプロピル基（プロピルアルデヒド基）で改質された分子量１０ｋＤａのポリエチレングリコールであるマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド、日本ＮＯＦ社）をＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣ（ＣＰＣ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ、中国）の３４番のシステイン残基にペギル化させるためにＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣとＰＥＧのモル比を１：１～２、ペプチド濃度を１～３ｍｇ／ｍｌにして１～３時間反応させた。その時、反応は５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．５とイソプロパノールの混合溶媒で行われた。反応液は、クエン酸ナトリウムｐＨ２．０、エタノールが含まれたバッファと塩化カリウム濃度勾配を用いたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ，米国）カラムを用いてモノペギル化された（ｍｏｎｏ－ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はモノペギル化されたＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣを精製した。
【0227】
次に、前記精製されたモノペギル化されたＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はモノペギル化されたＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣと配列番号３２の免疫グロブリンＦｃ切片のモル比が１：２～１：６になるようにし、全体タンパク質濃度を３０～３５ｍｇ／ｍＬにして２～８℃で１２～２０時間反応させた。その時、反応液は１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）とイソプロパノールに還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム［ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ（ＮａＣＮＢＨ３）］を添加した。
【0228】
反応が終結した後、反応液はビス－トリス（ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）ｐＨ６．５バッファと塩化ナトリウム濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ（ＧＥ，米国）カラムに適用し、硫酸アンモニウムとクエン酸ナトリウムｐＨ５．０～５．２の濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（ＧＥ、米国）に適用し、免疫グロブリンＦｃにＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣがＰＥＧにより共有結合で連結された結合体であるＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ（１０Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＣ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃとＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣ（１０Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＣ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃを精製した。ＨＰＬＣ逆相分析結果、結合体の純度は、それぞれ９２．９％、９５．６％であった。
【0229】
実施例２．ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ－ＰＥＧ（３．４Ｋ又は１０Ｋ）免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
３．４ｋＤａ又は１０ｋＤａ ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端の水素が３－オキソプロピル基（プロピルアルデヒド基）で改質された、分子量３．４ｋＤａ又は１０ｋＤａのポリエチレングリコールであるアルデヒド－ＰＥＧ－アルデヒド、日本ＮＯＦ社）をＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ（ＣＰＣ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，中国）の３４番のリシン残基にペギル化させるためにＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫとＰＥＧのモル比を１：５～１：２０、ペプチド濃度を５～１０ｍｇ／ｍＬにして２～８℃で４～１６時間反応させた。その時、反応は２０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５とエタノールで行われ、還元剤である２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムボロヒドリドを添加して反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウムｐＨ２．０、エタノールが含まれた緩衝溶液と塩化カリウム濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（ＧＥ，米国）カラムを用いてモノペギル化されたＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫを精製した。
３．４ｋＤａ又は１０ｋＤａ ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端の水素が３－オキソプロピル基（プロピルアルデヒド基）で改質された、分子量３．４ｋＤａ又は１０ｋＤａのポリエチレングリコールであるアルデヒド－ＰＥＧ－アルデヒド、日本ＮＯＦ社）をＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ（ＣＰＣ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，中国）の３４番のリシン残基にペギル化させるためにＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫとＰＥＧのモル比を１：５～１：２０、ペプチド濃度を５～１０ｍｇ／ｍＬにして２～８℃で４～１６時間反応させた。その時、反応は２０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５とエタノールで行われ、還元剤である２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムボロヒドリドを添加して反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウムｐＨ２．０、エタノールが含まれた緩衝溶液と塩化カリウム濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（ＧＥ，米国）カラムを用いてモノペギル化されたＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫを精製した。
【0230】
次に、前記精製されたモノペギル化されたＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫと配列番号３２の免疫グロブリンＦｃ切片の結合体を前記実施例１と同様な反応及び精製条件に応じて、製造及び精製した。ＨＰＬＣ逆相分析結果、免疫グロブリンＦｃ切片にＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫがＰＥＧにより共有結合で連結された結合体であるＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ（３．４Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ－ＰＥＧ（３．４Ｋ）－免疫グロブリンＦｃとＣＡ ＧＬＰ－２ＲＫ（１０Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃの純度は、それぞれ９４．３％、９２．６％であった。
【0231】
実施例３．ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＫ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃ結合体及びＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫAZＫ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
実施例２の方法によりＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＫ及びＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫAZＫを用いて、配列番号３２の免疫グロブリンＦｃ切片にＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＫ又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫAZＫがＰＥＧにより共有結合で連結された結合体であるＣＡ ＧＬＰ－２ ＫＫ（１０Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＫ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃとＣＡ ＧＬＰ－２ ＫAZＫ（１０Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫAZＫ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃを製造及び精製した。
実施例２の方法によりＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＫ及びＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫAZＫを用いて、配列番号３２の免疫グロブリンＦｃ切片にＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＫ又はＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫAZＫがＰＥＧにより共有結合で連結された結合体であるＣＡ ＧＬＰ－２ ＫＫ（１０Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫＫ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃとＣＡ ＧＬＰ－２ ＫAZＫ（１０Ｋ ＰＥＧ）誘導体の持続型結合体ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＫAZＫ－ＰＥＧ（１０Ｋ）－免疫グロブリンＦｃを製造及び精製した。
【0232】
実施例４：緩衝物質の種類とｐＨによるＧＬＰ－２誘導体ペプチドの持続型結合体の安定性評価
緩衝物質、界面活性剤としてポリソルベート２０、糖アルコール、そしてメチオニンからなる液状製剤に基づいて緩衝物質の種類とｐＨの下でＧＬＰ－２誘導体ペプチド（以下、「ＧＬＰ－２誘導体」と命名）の持続型結合体の安定性を比較した。
緩衝物質、界面活性剤としてポリソルベート２０、糖アルコール、そしてメチオニンからなる液状製剤に基づいて緩衝物質の種類とｐＨの下でＧＬＰ－２誘導体ペプチド（以下、「ＧＬＰ－２誘導体」と命名）の持続型結合体の安定性を比較した。
【0233】
下記表２のような組成をそれぞれＧＬＰ－２誘導体（ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ（３．４Ｋ ＰＥＧ））の持続型結合体（液状製剤内の濃度：約１８６．３ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤として用いて２５℃で５週間保管後、イオン交換クロマトグラフィ法（Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＥ－ＨＰＬＣ）、逆相クロマトグラフィ法（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ－Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＲＰ－ＨＰＬＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィ法（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥ－ＨＰＬＣ）を用いて分析した。
【0234】
表３のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）、ＲＰ－ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ－ＨＰＬＣ（％）はＡｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％（％）であり、初期結果値に比べたＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の残存率を示す。
【0235】
【表2】
【0236】
【表3】
【0237】
前記結果から見られるように、クエン酸ナトリウムと酢酸ナトリウム緩衝液の存在下でｐＨにより安定性の変化を有することを確認した。
【0238】
実施例５：安定化剤の種類とｐＨによるＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の安定性評価
前記液状製剤の組成（酢酸ナトリウム、ポリソルベート２０及びメチオニン）に基づいて安定化剤の種類及びｐＨによるＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の安定性を比較した。
前記液状製剤の組成（酢酸ナトリウム、ポリソルベート２０及びメチオニン）に基づいて安定化剤の種類及びｐＨによるＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の安定性を比較した。
【0239】
安定化剤の場合、前記実施例１で確認されたマンニトールを含めてソルビトールとスクロースを追加し、ｐＨは５．１と６．０を比較してＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の安定性を比較した。
【0240】
その時、マンニトール、ソルビトール及びスクロースの濃度は、市販の剤形及び許可機関で勧める最大許容の範囲を考慮した。
【0241】
下記表４のような組成をそれぞれＧＬＰ－２誘導体（ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ（３．４Ｋ ＰＥＧ））の持続型結合体（液状製剤内の濃度：約１１１７．８ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤として用いて２５℃で４週間保管後、ＩＥ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣを用いて分析した。
【0242】
表５のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）、ＲＰ－ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ－ＨＰＬＣ（％）はＡｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％（％）であり、初期結果値に比べたＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の残存率を示す。
【0243】
【表4】
【0244】
【表5】
【0245】
前記結果から見られるように、本願発明の液状製剤においてＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体は安定した。
【0246】
実施例６：最終剤形組成を用いたＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の高濃度液状剤形の長期保存安定性試験
前述の実施例を通じて最終選択したｐＨ６．０の酢酸ナトリウム、スクロース、ポリソルベート２０及びメチオニンを含む液状製剤を用いて、ＧＬＰ－２誘導体（ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ（３．４Ｋ ＰＥＧ））の持続型結合体三つの濃度別高濃度液状剤形の長期保存安定性を分析した。表６は５±３℃で１２カ月保管された高濃度液状剤形の長期保存安定性結果を示し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ－ＨＰＬＣ（％）はＡｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％（％）であり、初期結果値に比べたＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の残存率を示す。
前述の実施例を通じて最終選択したｐＨ６．０の酢酸ナトリウム、スクロース、ポリソルベート２０及びメチオニンを含む液状製剤を用いて、ＧＬＰ－２誘導体（ＣＡ－ＧＬＰ－２ ＲＫ（３．４Ｋ ＰＥＧ））の持続型結合体三つの濃度別高濃度液状剤形の長期保存安定性を分析した。表６は５±３℃で１２カ月保管された高濃度液状剤形の長期保存安定性結果を示し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ－ＨＰＬＣ（％）はＡｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％（％）であり、初期結果値に比べたＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体の残存率を示す。
【0247】
【表6】
【0248】
長期保存安定性試験の結果、三つの高濃度のＧＬＰ－２誘導体の持続型結合体は、本発明の液状製剤において９カ月以上安定していることを確認した。
【0249】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】