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特表2023-526552グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の液状製剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の液状製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/26 20060101AFI20230614BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20230614BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230614BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230614BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230614BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230614BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20230614BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230614BHJP
C07K 14/605 20060101ALI20230614BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230614BHJP
【ＦＩ】
A61K38/26
A61P3/00
A61K9/08
A61K47/26
A61K47/68
A61K39/395 Y
A61K47/12
A61K47/22
A61K47/02
A61K47/10
A61K47/18
A61P3/04
A61P3/10
C07K14/605 ZNA
C07K16/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022571835
(86)(22)【出願日】2021-05-24
(85)【翻訳文提出日】2022-12-13
(86)【国際出願番号】 KR2021006462
(87)【国際公開番号】W WO2021235916
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】10-2020-0061875
(32)【優先日】2020-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515022445
【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】リム ヒュン キュ
(72)【発明者】
【氏名】キム サン ユン
(72)【発明者】
【氏名】ベ スン ミン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076CC21
4C076DD07F
4C076DD09F
4C076DD26Z
4C076DD38
4C076DD41Z
4C076DD43Z
4C076DD51Q
4C076DD60Z
4C076DD67
4C076EE23F
4C076EE41
4C076EE49F
4C076EE59
4C076FF14
4C076FF16
4C076FF36
4C076FF43
4C076FF61
4C076FF63
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA19
4C084BA23
4C084CA59
4C084DB35
4C084MA16
4C084NA14
4C084ZA701
4C084ZA702
4C084ZC211
4C084ZC212
4C084ZC351
4C084ZC352
4C085AA25
4C085AA33
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC22
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA18
4H045CA40
4H045DA30
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の液状製剤及びその製造方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
持続型結合体の液状製剤であって、前記液状製剤は１８～９２０ｎｍｏｌ／ｍＬの下記化学式（１）の持続型結合体；
前記液状製剤のｐＨを５．０～７．０の範囲で維持するための分量の緩衝物質；と
０．５～１０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；を含む液状製剤：
【化1】
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す：
[一般式１]
Ｘａａ１－Ａｉｂ－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１、配列番号４７）
前記一般式１において、
下線を引いたＮ末端から１６番であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び２０番であるリシン（Ｌｙｓ）残基の間でラクタム環が形成され、
Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）、又はチロシンであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘａａ１０はチロシン、又はシステインであり、
Ｘａａ１２はリシン、又はイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、又はシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、又はメチオニンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン、又はリシンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、又はシステインであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２８はアラニン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン、又はヒスチジンであるか、存在せず、
Ｒ１はシステイン、ｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４８）、又はｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４９）であるか、又は存在せず、
ここで、
ｍはＣｙｓ、又はＰｒｏであり、
ｎはＣｙｓ、又はＧｌｙ、であるか、又は存在しない。
【請求項2】
前記ペプチドは、配列番号１～４６から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項3】
前記ペプチドは、配列番号１、２、９、１９、２１～２７、３０～３２、又は４０～４６から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項4】
前記ペプチドは、配列番号９、３０～３２、又は４２～４６から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項5】
前記ペプチドは、配列番号９である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項6】
前記Ｒ１は、システイン、Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５０）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５１）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号５２）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５３）、又はＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号５４）であるか、存在しない、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項7】
Ｑは、そのＣ末端がアミド化している、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項8】
Ｑは、システインの硫黄原子を通じて連結されている、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項9】
前記免疫グロブリンＦｃ切片は、ＩｇＧ４由来である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項10】
Ｚは、２個のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖中の一鎖の窒素原子を通じてのみ連結されている、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項11】
Ｚは、配列番号７６のアミノ酸配列のホモ二量体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の液状製剤。
【請求項12】
Ｚは、そのＮ末端プロリンの窒素原子を通じて連結されている、請求項１１に記載の液状製剤。
【請求項13】
前記免疫グロブリンＦｃ切片とＱがグリコシル化されていない、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項14】
前記Ｌは、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項15】
前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部位の化学式量は１～１００ｋＤａの範囲にある、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項16】
前記緩衝物質は、クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択する、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項17】
前記緩衝物質は、酢酸とその塩である、請求項１４に記載の液状製剤。
【請求項18】
前記液状製剤のｐＨは、５．０～５．５である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項19】
前記液状製剤のｐＨは、５．０～６．５である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項20】
前記液状製剤のｐＨは、５．１～６．０である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項21】
前記液状製剤のｐＨは、５．１～５．５である、請求項２０に記載の液状製剤。
【請求項22】
前記緩衝物質の濃度は、液状製剤のｐＨを５．０～７．０の範囲で維持するための５～１００ｍＭである、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項23】
前記糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項24】
前記糖は、スクロースである、請求項２３に記載の液状製剤。
【請求項25】
前記糖アルコールは、マンニトール及びソルビトールで構成される群から選択される一つ以上である、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項26】
前記液状製剤は、非イオン性界面活性剤及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含む、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項27】
等張化剤をさらに含む、請求項２６に記載の液状製剤。
【請求項28】
前記非イオン性界面活性剤は、液状製剤内に０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項２６に記載の液状製剤。
【請求項29】
前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー、ポリソルベート、又はそれらの組み合わせである、請求項２６に記載の液状製剤。
【請求項30】
前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０及びそれらの組み合わせからなる群から選択する、請求項２９に記載の液状製剤。
【請求項31】
前記アミノ酸は、アルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する安定化剤をさらに含む、請求項２６に記載の液状製剤。
【請求項32】
前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；
前記液状製剤のｐＨが５．０～６．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；
１～１０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び
ポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；と
アルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の液状製剤。
【請求項33】
前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；
前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；
４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及び
ポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；と
アルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の液状製剤。
【請求項34】
前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；
前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；及び
４～１０％（ｗ／ｖ）の糖を含有する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の液状製剤。
【請求項35】
前記液状製剤はアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤をさらに含有する、請求項３４に記載の液状製剤。
【請求項36】
前記液状製剤はポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項３４に記載の液状製剤。
【請求項37】
前記液状製剤はポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項３５に記載の液状製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の液状製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
肥満と２型糖尿病を含む糖尿病は、現代社会に入って発生する代表的な代謝疾患の一つであり、世界的な健康脅威要素として認識されており、疾病の発症に伴う経済的費用も急増する傾向にある。
【0003】
ＧＬＰ－１、ＧＩＰは代表的な胃腸ホルモンで、神経ホルモンであり、食物摂取に伴う血中糖濃度の調節に関与する物質である。グルカゴンは、膵臓から分泌されるペプチドホルモンであり、前記の二つの物質と共に血中糖濃度調節作用に関与する。
【0004】
ＧＬＰ－１は、飲食物の摂取に刺激を受け、小腸から分泌されるホルモンであり、血糖濃度依存的に膵臓におけるインスリン分泌を促進し、グルカゴンの分泌を抑制して血糖濃度を下げる作用を助ける。また、満腹因子として作用して胃腸の消化作用を遅らせ、飲食消化物の胃腸通過時間を遅らせて飲食物の摂取を減らす役割を有する。さらに、ラットに投与すると、飲食の摂取抑制と体重減少効果があることが報告されており、このような効果は、正常状態と肥満状態の両方で同様に示されることが確認され、肥満治療剤としての可能性を示した。
【0005】
ＧＬＰ－１とともに飲食の摂取に刺激を受けて分泌される胃腸ホルモンの一つであるＧＩＰは、小腸のＫ細胞から分泌される４２個のアミノ酸で構成されたホルモンであり、血糖濃度に依存的に膵臓におけるインスリン分泌を促進し、血糖濃度を下げるのを助ける機能を果たし、ＧＬＰ－１の活性増加効果、抗炎症効果などが報告された。
【0006】
グルカゴンは、薬物治療又は疾病、ホルモンや酵素欠乏などの原因で血糖が低下し始めると膵臓で産生される。グルカゴンは、肝臓にシグナルを伝達してグリコーゲンを分解してグルコースを放出するように誘導し、血糖レベルを正常レベルまで高める役割をする。それだけでなく、グルカゴンは、血糖上昇効果に加え、動物やヒトにおける食欲抑制及び脂肪細胞のホルモン感受性リパーゼ（ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｌｉｐａｓｅ）を活性化させ、脂肪分解を促進及びエネルギー代謝（ｅｎｅｒｇｙ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ）を促進して抗肥満効果を奏することが報告された。
【0007】
そこで、ＧＬＰ－１の血糖調節及び体重減少効果を利用して糖尿病と肥満の治療剤として開発しようとする研究が活発に進められており、ＧＬＰ－１と約５０％レベルのアミノ酸配列類似性を有するトカゲ毒（ｌｉｚａｒｄ ｖｅｎｏｍ）から作られるエキセンジン－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）も同種疾患に対する治療剤としての開発が進行中である。しかし、現在まで報告されているところによると、ＧＬＰ－１とエキセンジン－４を用いた治療剤の場合、副作用として嘔吐と吐き気を伴うという問題が発生することが知られている。（Ｓｙｅｄ ＹＹ．， Ｄｒｕｇｓ．， ２０１５ Ｊｕｌ；７５（１０）：１１４１－１１５２）。
【0008】
よって、血糖調節、体重減少効果を有しながら嘔吐や吐き気などの副作用が発生せず、ＧＬＰ－１とＧＩＰ、そしてグルカゴン受容体を高く活性化させる新規な物質が開発されている。また、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、グルカゴン受容体に対する活性化の比率が多様な物質、例えば、血糖強化のためにＧＬＰ－１及びＧＩＰの活性は高いが、比較的グルカゴンの活性は低いため、体重減少効力もあるが、血糖調節能力がより高い物質や、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、及びグルカゴンのいずれも活性が高いため、体重減少効果の高い物質が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号
【特許文献2】国際特許公開第９６／３２４７８号
【特許文献3】国際公開特許ＷＯ２００７／０２１１２９
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Syed YY., Drugs., 2015 Jul;75(10):1141-1152
【非特許文献2】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
開発されたグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体すべてに対して活性を有するペプチドの持続型結合体をウイルス汚染の懸念なしに長時間保管可能な安定な液状製剤の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の液状製剤を提供することである。
【0013】
本発明の他の目的は、前記液状製剤の製造方法を提供することである。
【発明の効果】
【0014】
本発明による液状製剤は、簡単な剤形で分子量の大きい本発明の結合体に保存安定性を提供し、経済的な提供が可能な利点がある。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1a-1b】実施例３の液状製剤（クエン酸ナトリウム、ｐＨ ５．５、マンニトール、ポリソルベート２０、メチオニン）に基づいて、緩衝物質の種類に応じたグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を確認した結果である。具体的には、表９のような組成をそれぞれグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の液状製剤として用いて２５℃で６週保管後に安定性結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明を具現する一つの様態は、グルカゴン、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）及びＧＩＰ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｏｎｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）三重活性体の持続型結合体の液状製剤である。前記持続型結合体は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドが免疫グロブリンＦｃ切片にリンカ一により共有結合されている物質を意味する。
【0017】
一つの具体例として、本発明は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体を薬理学的有効量として含み、ｉ）緩衝物質及びｉｉ）糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせを含むアルブミン非含有安定化剤を含む、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体の液状製剤に関する。前記持続型結合体は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドが免疫グロブリンＦｃ切片に共有結合されている物質を意味する。
【0018】
一つの具体例として、前記液状製剤は、下記化学式（１）の持続型結合体；緩衝物質；及び糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせを含む持続型結合体の液状製剤であることを特徴とする：：
【0019】
Ｑ － Ｌａ － Ｚ・・・（１）
【0020】
前記化学式（１）において、Ｑは、下記一般式１のペプチドであり、
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す：
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す：
【0021】
[一般式１]
Ｘａａ１－Ａｉｂ－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１、配列番号４７）
Ｘａａ１－Ａｉｂ－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１、配列番号４７）
【0022】
前記一般式１において、
下線を引いたＮ末端から１６番であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び２０番であるリシン（Ｌｙｓ）残基の間でラクタム環が形成され、
Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）、又はチロシンであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘａａ１０はチロシン、又はシステインであり、
Ｘａａ１２はリシン、又はイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、又はシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、又はメチオニンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン、又はリシンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、又はシステインであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２８はアラニン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン、又はヒスチジンであるか、存在せず、
Ｒ１はシステイン、ｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４８）、又はｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４９）であるか、又は存在せず、
ここで、
ｍはＣｙｓ、又はＰｒｏであり、
ｎはＣｙｓ、又はＧｌｙ、であるか、又は存在しなくてもよい。前記Ａｉｂはアミノイソ酪酸を意味する。
下線を引いたＮ末端から１６番であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び２０番であるリシン（Ｌｙｓ）残基の間でラクタム環が形成され、
Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）、又はチロシンであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘａａ１０はチロシン、又はシステインであり、
Ｘａａ１２はリシン、又はイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、又はシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、又はメチオニンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン、又はリシンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、又はシステインであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２８はアラニン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン、又はヒスチジンであるか、存在せず、
Ｒ１はシステイン、ｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４８）、又はｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４９）であるか、又は存在せず、
ここで、
ｍはＣｙｓ、又はＰｒｏであり、
ｎはＣｙｓ、又はＧｌｙ、であるか、又は存在しなくてもよい。前記Ａｉｂはアミノイソ酪酸を意味する。
【0023】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は１８～９２０ｎｍｏｌ／ｍＬの前記化学式（１）の持続型結合体；前記液状製剤のｐＨを５．０～７．０の範囲で維持するための分量の緩衝物質；及び０．５～１０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；を含む持続型結合体の液状製剤であることを特徴とする。
【0024】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は等張化剤、非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含むことを特徴とする。
【0025】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は等張化剤を含まないことを特徴とする。
【0026】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は、非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含まないことを特徴とする。
【0027】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ペプチドは配列番号１～４６から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0028】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ペプチドは配列番号１、２、９、１９、２１～２７、３０～３２、又は４０～４６から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0029】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ペプチドは配列番号９、３０～３２、又は４２～４６から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0030】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0031】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｒ１はシステイン、Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５０）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５１）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号５２）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５３）、又はＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号５４）であるか、又は存在しないことを特徴とする。
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｌはポリエチレングリコールであることを特徴とする。
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｌはポリエチレングリコールであることを特徴とする。
【0032】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部位の化学式量は１～１００ｋＤａの範囲にあることを特徴とする。
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記化学式（１）の構造は下記化学式（２）の構造であることを特徴とする：
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記化学式（１）の構造は下記化学式（２）の構造であることを特徴とする：
【0033】
【0034】
ここで、Ｑ及びＺは化学式（１）で定義した通りである。
【0035】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記エチレングリコール繰り返し単位は［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎであり、ｎは自然数で、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１～１００ｋＤａになるように定められることを特徴とする。
【0036】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ｎの値は、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１０ｋＤａになるように定められることを特徴とする。
【0037】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ＱはそのＣ末端がアミド化したことを特徴とする。
【0038】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｑはペプチド内のシステインの硫黄原子を通じて連結されたことを特徴とする。
【0039】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片はＩｇＧ４由来であることを特徴とする。
【0040】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｚは２個のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖中の一鎖の窒素原子を通じてのみ連結されたことを特徴とする。
【0041】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｚは配列番号７６のアミノ酸配列である単量体を含むことを特徴とする。
【0042】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記Ｚは配列番号７６のアミノ酸配列の単量体のホモ二量体であることを特徴とする。
【0043】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記ＺはそのＮ－末端プロリンの窒素原子を通じて連結されたことを特徴とする。
【0044】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片であるＺとＱがグリコシル化されていないことを特徴とする。
【0045】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記緩衝物質は、クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【0046】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記緩衝物質はクエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、ヒスチジン緩衝溶液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【0047】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記緩衝物質は、酢酸とその塩であることを特徴とする。
【0048】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤のｐＨは５．０～５．５であることを特徴とする。
【0049】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤のｐＨは５．０～６．５であることを特徴とする。
【0050】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤のｐＨは５．１～６．０であることを特徴とする。
【0051】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤のｐＨは５．１～５．５であることを特徴とする。
【0052】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記緩衝物質の濃度は液状製剤のｐＨを５．０～７．０の範囲で維持するための５～１００ｍＭであることを特徴とする。
【0053】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記糖又は糖アルコールはスクロース、マンニトール、及びソルビトールで構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする。
【0054】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記糖又は糖アルコールは製剤内に１～２０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在することを特徴とする。前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記持続型結合体は製剤内に１８～２７５７ｎｍｏｌ／ｍＬ、１８～９２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、１８～９１９ｎｍｏｌ／ｍＬ、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬ、１５０～６００ｎｍｏｌ／ｍＬ、１８３～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬ、４００～５５０ｎｍｏｌ／ｍＬ、又は１５０～２００ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする。
【0055】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記糖はグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする。
【0056】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記糖はスクロースであることを特徴とする。
【0057】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記糖アルコールはマンニトール及びソルビトールで構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする。
【0058】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は、非イオン性界面活性剤及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含むことを特徴とする。
【0059】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は等張化剤をさらに含むことを特徴とする。
【0060】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記等張化剤は塩化ナトリウムであることを特徴とする。
【0061】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする。
【0062】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー、ポリソルベート、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする。
【0063】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【0064】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤はアルギニン、グリシン、メチオニン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を安定化剤としてさらに含むことを特徴とする。
【0065】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～６．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；１～１０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；とアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有することを特徴とする。
【0066】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；とアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有することを特徴とする。
【0067】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．１～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有することを特徴とする。
【0068】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．１～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；及び４～１０％（ｗ／ｖ）の糖を含有することを特徴とする。
【0069】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；及び４～１０％（ｗ／ｖ）の糖を含有することを特徴とする。
【0070】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有することを特徴とする。
【0071】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする。
【0072】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；アルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする。
【0073】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記アミノ酸は、メチオニンであることを特徴とする。
【0074】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記メチオニンは製剤内に０．０１～１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする。
【0075】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記アミノ酸は、メチオニン又はアルギニンであることを特徴とする。
【0076】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記メチオニン又はアルギニンは製剤内に０．０１～１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする。
【0077】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記液状製剤は苛酷試験条件である４０±２℃及び相対湿度７５±５％の条件で１週間保管時に性状が透明であることを特徴とする。
【0078】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ切片であることを特徴とする。
【0079】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片は（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の一個又は二個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ；及び（ｆ）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体で構成された群から選択されることを特徴とする。
【0080】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片のそれぞれのドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来した相違する起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
【0081】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片は、同一の起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された、二量体又は多量体の形態であることを特徴とする。
【0082】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片がＩｇＧ４ Ｆｃ切片であることを特徴とする。
【0083】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ切片であることを特徴とする。
【0084】
前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤であって、前記免疫グロブリンＦｃ切片は、ジスルフィド結合を形成できる部位が除去される変形、天然型ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が除去される変形、天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加される変形、補体結合部位が除去される変形、又はＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ） 部位が除去される変形を含むか、前記変形の組み合わせを含む、天然型Ｆｃの誘導体であることを特徴とする。
【0085】
本発明を具現する他の一態様は、前記液状製剤の製造方法である。
【0086】
一つの具体例として、本発明は（ａ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体と（ｂ）ｉ）緩衝物質及びｉｉ）糖又は糖アルコールを混合する段階を含む前述の具体例のいずれか一つによる液状製剤である、持続型結合体の液状製剤の製造方法に関する。
【0087】
前述の具体例のいずれか一つによる方法であって、前記液状製剤は等張化剤、非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含むことを特徴とする。
【0088】
本発明を実施するための具体的な内容を説明すれば、次の通りである。
【0089】
なお、本願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【0090】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。また、このような等価物は本発明に含まれることが意図される。
【0091】
本明細書の全般を通じて、天然的に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（２－アミノイソ酪酸、２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、α－メチルグルタミン酸（α－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）などの他のアミノ酸に対して一般に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
【0092】
アラニン Ａｌａ、Ａ アルギニン Ａｒｇ、Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ、Ｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ、Ｄ
システインＣｙｓ、Ｃ グルタミン酸 Ｇｌｕ、Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ、Ｑ グリシンＧｌｙ、Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ、Ｈ イソロイシン Ｉｌｅ、Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ、Ｌ リシン Ｌｙｓ、Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ、Ｍ フェニルアラニン Ｐｈｅ、Ｆ
プロリン Ｐｒｏ、Ｐ セリン Ｓｅｒ、Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ、Ｔ トリプトファン Ｔｒｐ、Ｗ
チロシン Ｔｙｒ、Ｙ バリン Ｖａｌ、Ｖ
アスパラギン Ａｓｎ、Ｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ、Ｄ
システインＣｙｓ、Ｃ グルタミン酸 Ｇｌｕ、Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ、Ｑ グリシンＧｌｙ、Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ、Ｈ イソロイシン Ｉｌｅ、Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ、Ｌ リシン Ｌｙｓ、Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ、Ｍ フェニルアラニン Ｐｈｅ、Ｆ
プロリン Ｐｒｏ、Ｐ セリン Ｓｅｒ、Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ、Ｔ トリプトファン Ｔｒｐ、Ｗ
チロシン Ｔｙｒ、Ｙ バリン Ｖａｌ、Ｖ
【0093】
本発明を具現する一つの様態は、グルカゴン、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）及びＧＩＰ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｏｎｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）三重活性体の持続型結合体の液状製剤を提供する。
【0094】
具体的には、本発明はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体を薬理学的有効量として含み、緩衝物質及び糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせを含む、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体の液状製剤に関する。
【0095】
具体的には、本発明は下記化学式（１）の持続型結合体；緩衝物質；及び糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；を含む液状製剤を提供する：
【0096】
Ｑ － Ｌａ － Ｚ・・・（１）
【0097】
前記化学式（１）において、Ｑは、下記一般式１のペプチドであり、
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す：
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す：
【0098】
[一般式１]
Ｘａａ１－Ａｉｂ－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１、配列番号４７）
Ｘａａ１－Ａｉｂ－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１、配列番号４７）
【0099】
前記一般式１において、
下線を引いたＮ末端から１６番であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び２０番であるリシン（Ｌｙｓ）残基の間でラクタム環が形成され、
Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）、又はチロシンであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘａａ１０はチロシン、又はシステインであり、
Ｘａａ１２はリシン、又はイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、又はシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、又はメチオニンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン、又はリシンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、又はシステインであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２８はアラニン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン、又はヒスチジンであるか、存在せず、
Ｒ１はシステイン、ｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４８）、又はｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４９）であるか、又は存在せず、
ここで、
ｍはＣｙｓ、又はＰｒｏであり、
ｎはＣｙｓ、又はＧｌｙ、であるか、又は存在しない。
下線を引いたＮ末端から１６番であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び２０番であるリシン（Ｌｙｓ）残基の間でラクタム環が形成され、
Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）、又はチロシンであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘａａ１０はチロシン、又はシステインであり、
Ｘａａ１２はリシン、又はイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、又はシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、又はメチオニンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン、又はリシンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、又はシステインであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２８はアラニン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン、又はヒスチジンであるか、存在せず、
Ｒ１はシステイン、ｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４８）、又はｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４９）であるか、又は存在せず、
ここで、
ｍはＣｙｓ、又はＰｒｏであり、
ｎはＣｙｓ、又はＧｌｙ、であるか、又は存在しない。
【0100】
本発明において用語「液状製剤」は、医薬品の形態を液状に製剤化した薬物を意味し、これは、液状の内用製剤及び外用製剤をいずれも含む。
【0101】
本発明の液状製剤は、薬理効果を奏する化学式（１）の持続型結合体及び前記薬理効果を奏する物質が液状に製剤化される時、これを一定期間安定に維持及び／又は保存させる物質を含む。前記液状製剤の薬理効果を奏する化学式（１）の持続型結合体以外に含まれる成分は安定化剤と混用され得る。
【0102】
本発明の化学式（１）の持続型結合体の液状製剤において、保存安定性は正確な投与量を保障するために重要である。
【0103】
本発明は、薬理効果を奏する物質である化学式（１）の持続型結合体の特定濃度；ｐＨを５．０～７．０の範囲で維持するための分量の緩衝物質；及び０．５～１０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖又はそれらの組み合わせ；を含む場合、化学式（１）の持続型結合体の長期間保管時においても安定することを確認し、本発明の新たな剤形を提供するようになった。
本発明の液状製剤に含まれる前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体の濃度は１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８４０ｎｍｏｌ／ｍＬであってもよいが、これに限定されない。
本発明の液状製剤に含まれる前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体の濃度は１８ｎｍｏｌ／ｍＬ～１８４０ｎｍｏｌ／ｍＬであってもよいが、これに限定されない。
【0104】
一つの具体例として、前記持続型結合体の濃度は１８～９２０ｎｍｏｌ／ｍＬであってもよいが、これに限定されない。
【0105】
本発明において用語、「安定化剤」とは、製剤において有効成分などの構成成分を一定期間安定に維持させる物質をいう。本発明の前記安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として用いられ得るヒト血清アルブミンは人体の血液から製造され、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染の可能性が存在し、ゼラチンやウシ血清アルブミンは疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を誘発する可能性がある。本発明のアルブミン非含有安定化剤は、ヒトや動物由来の血清アルブミン又は精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないため、ウイルス感染のおそれが少ない。
【0106】
本発明において前記安定化剤は、特にグルカゴンＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体が安定に保存されるようにする物質を意味する。グルカゴンＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体において、保存安定性は正確な投与量を保障するためだけでなく、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体結合体に対する抗原性物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。
【0107】
本発明の液状製剤に含まれる一構成要素である緩衝物質は、化学式（１）の持続型結合体が安定になるように液状製剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持させることができる。前記緩衝物質は緩衝系（ｂｕｆｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）とも呼ばれ、前記緩衝物質又は緩衝系は液状製剤のｐＨを維持させる役割をする。目的とする安定化対象物質である化学式（１）の持続型結合体を安定化させることができるｐＨを維持させる緩衝物質は制限なく用いられてもよい。
【0108】
前記緩衝物質は、リン酸とその共役塩基であるアルカリ塩（例えば、リン酸塩：リン酸ナトリウム、リン酸カリウム又はこれらの水素又は二水素塩）、クエン酸とその塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、酢酸とその塩（例えば、酢酸ナトリウム）、ヒスチジンとその塩をはじめとするｐＨ緩衝物質であってもよく、これら緩衝物質の混合物も用いられるが、これに限定されない。
【0109】
本発明の液状製剤は、前記緩衝物質を含む緩衝溶液を液状製剤の溶媒として含み、具体的には、前記緩衝溶液は、クエン酸緩衝溶液（例えば、クエン酸ナトリウム緩衝溶液）、酢酸緩衝溶液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝溶液）、リン酸緩衝溶液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝溶液）、ヒスチジン緩衝溶液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよく、前記緩衝溶液又は液状製剤内の緩衝物質（クエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩、又はそれらの組み合わせ）は、目標とする液状製剤のｐＨを維持するのに十分な分量の濃度で含まれてもよい。
【0110】
前記液状製剤のｐＨは、約５．０～ｐＨ約７．０、例えば、ｐＨ約５．０～ｐＨ約６．８、ｐＨ約５．０～約６．７、ｐＨ約５．０～約６．６、ｐＨ約５．０～ｐＨ約６．５、ｐＨ約５．０～約６．４、ｐＨ約５．０～約６．３、ｐＨ約５．０～約６．２、ｐＨ約５．０～約６．１、ｐＨ約５．０～６．０、ｐＨ約５．０～約５．９、ｐＨ約５．０～５．８、ｐＨ約５．０～約５．７、ｐＨ約５．０～約５．６、ｐＨ約５．０～約５．５、ｐＨ約５．０～約５．４、ｐＨ約５．０～約５．３、ｐＨ約５．０～約５．２、約５．１～ｐＨ約７．０、例えば、ｐＨ約５．１～ｐＨ約６．８、ｐＨ約５．１～約６．７、ｐＨ約５．１～約６．６、ｐＨ約５．１～ｐＨ約６．５、ｐＨ約５．１～約６．４、ｐＨ約５．１～約６．３、ｐＨ約５．１～約６．２、ｐＨ約５．１～約６．１、ｐＨ約５．１～６．０、ｐＨ約５．１～約５．９、ｐＨ約５．１～５．８、ｐＨ約５．１～約５．７、ｐＨ約５．１～約５．６、ｐＨ約５．１～約５．５、ｐＨ約５．１～約５．４、ｐＨ約５．１～約５．３、ｐＨ約５．１～約５．２、又はｐＨ約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、又は７．０であってもよいが、特にこれに限定されない。
【0111】
前記目標とするｐＨになり得るようにする液状製剤の濃度は、約１ｍＭ～約２００ｍＭであってもよく、よりも具体的には、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約８０ｍＭ、約５ｍＭ～約４０ｍＭ、約８ｍＭ～約４０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１８ｍＭ～約２４ｍＭ、約１８ｍＭ～約２２ｍＭ、又は約２０ｍＭであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0112】
一つの具体例として、前記緩衝物質は、酢酸とその塩であってもよいが、これに限定されない。
【0113】
もう一つの具体例として、前記緩衝溶液は酢酸緩衝溶液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝溶液）又はクエン酸緩衝溶液（例えば、クエン酸ナトリウム緩衝溶液）であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0114】
一方、製剤の製造において、成分を水（例えば、ＷＦＩ）に溶かし、ＨＣｌ及び／又はＮａＯＨなどを用いて緩衝溶液又は製剤のｐＨを目的とするｐＨに調整することができ、これは当業界に既に通常用いられる方法である。従って、請求項にｐＨ調節子に関する別途の言及がなくても、このような方法を通じて製剤が調整されたｐＨを有することができるということは、当業者が理解することができる。
【0115】
本発明の安定化剤に含まれる一構成要素である糖アルコールは多数の水酸基を含む物質をいい、糖のアルデヒド基及び／又はケトン基などがアルコール基で置換された物質を含み、多重水酸基を含む糖類なども含む。前記糖又は糖アルコールは、グルカゴンＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を増大させることができる。例えば、前記糖アルコールは、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される一つ以上であってもよいが、これに制限されない。
【0116】
本発明の液状製剤に含まれる一構成要素である糖（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、単糖類、二糖類、多糖類、オリゴ糖類などをいい、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体の安定性を増大させることができる。具体的な例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコース及びキシロースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類；ラフィノース及びデキストランなどの多糖類などを挙げることができるが、これに制限されない。
【0117】
一つの具体例として前記糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、又はそれらの組み合わせであってもよいが、これに制限されない。
【0118】
例えば、前記糖はスクロースであってもよいが、特にこれに限定されない。
【0119】
前記糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせは、液状製剤の全体溶液比約０．５～約２０％（ｗ／ｖ）、約０．５～約１０％（ｗ／ｖ）、約０．５～約６ ％（ｗ／ｖ）、約１～約２０％（ｗ／ｖ）、約１～１５％（ｗ／ｖ）、約２～約１５％（ｗ／ｖ）、約２～約１２％（ｗ／ｖ）、約２～約１２％（ｗ／ｖ）、約３～約１０％（ｗ／ｖ）、約４～約１０％（ｗ／ｖ）、約４～約６％（ｗ／ｖ）、約５～約１０％（ｗ／ｖ）、約６～約１０％（ｗ／ｖ）、約７～約１０％（ｗ／ｖ）、約７～約９％（ｗ／ｖ）、約８～約９％（ｗ／ｖ）、又は約１．０ ％（ｗ／ｖ）、約３．０ ％（ｗ／ｖ）、約５．０ ％（ｗ／ｖ）、又は約８．０ ％（ｗ／ｖ）の濃度で存在してもよいが、特にこれに限定されない。
【0120】
また、特にこれに制限されないが、前記液状製剤は、等張化剤、非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含んでもよい。
【0121】
従って、前記液状製剤の安定化剤は、ｉ）緩衝物質及びｉｉ）糖又は糖アルコールとして必須で構成されてもよいが、ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、及びｉｉｉ）非イオン性界面活性剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、及びｉｉｉ）等張化剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）アミノ酸；及びｉｖ）非イオン性界面活性剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、及びｉｉｉ）アミノ酸；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤、及びｉｖ）等張化剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤、及びｉｖ）アミノ酸；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）等張化剤、及びｉｖ）アミノ酸；又はｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤、ｉｖ）等張化剤、及びｖ）アミノ酸で必須で構成されるものであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。ここで、安定化剤を構成する各成分の種類及び濃度あるいはｐＨについては、前記あるいは下記の内容が全て適用されることは明確である。
【0122】
特にこれに制限されないが、前記液状製剤に含まれる一構成要素である非イオン性界面活性剤はタンパク質溶液の表面張力を下げて疎水性表面にタンパク質が吸着又は凝集することを防止することができる。
【0123】
本発明に用いられる非イオン性界面活性剤の具体的な例としては、ポリソルベート類（例えば、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート）；前記ポリオキシエチレンの後の数値（２０）は、オキシエチレン基（－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－）の総数を意味する）、ポロキサマー（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ共重合体；ＰＥＯ：ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、ＰＰＯ：ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ））、ポリエチレン－ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化合物（例えば、ポリオキシエチレン－ステアレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（アルキル：Ｃ１－Ｃ３０）、ポリオキシエチレンモノアリルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンコポリマー（アルキル：Ｃ１－Ｃ３０）など）、ソジウムドデシルサルフェート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ、ＳＤＳ）などであってもよく、又はポリソルベート又はポロキサマーを挙げることができ、これらが一つ又は二つ以上の組み合わせの形態でも用いられる。
【0124】
具体的には、前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０、ポリソルベート２０、又はポロキサマー１８８であってもよく、これらが組み合わせられて用いられてもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0125】
本発明において前記非イオン性界面活性剤は高濃度で含まれないことが好ましく、具体的には、本発明の製剤に約０．２％（ｗ／ｖ）以下の濃度、例えば、約０．００１～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．００１～約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．００５～約０．０８％（ｗ／ｖ）、約０．００２～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．００５～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０１～約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０１～約０．０４％（ｗ／ｖ）、約０．０１～約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０１～約０．１％（ｗ／ｖ）、又は約０．０２％（ｗ／ｖ）で含まれてもよいが、特にこれに限定されない。
【0126】
前記液状製剤に追加され得る選択的構成要素としての安定化剤の一種であるアミノ酸は、メチオニン、アルギニン、グリシン、又はそれらの組み合わせであってもよいが、これに限定されない。また、前記アミノ酸はＬ－形態であってもよいが、特にこれに限定されない。前記アミノ酸は、メチオニン又はアルギニンであってもよい。また、前記メチオニンはＬ－メチオニンであり、前記アルギニンはＬ－アルギニンであってもよいが、特にこれに限定されない。
【0127】
前記アミノ酸はタンパク質の酸化反応などにより起こり得る不純物の生成を抑制させることができるが、特にこれに限定されるものではない。
【0128】
前記アミノ酸は製剤内に約０．０１～約１ｍｇ／ｍＬの濃度、約０．０１～約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．０１～約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．０２～約０．５ｍｇ／ｍＬ、又は約０．０２～約０．４ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬで存在してもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0129】
一つの具体例として、緩衝物質及び糖又は糖アルコールを含む前記液状製剤は、等張化剤を含むか、又は含まないか、非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含まなくてもよいが、これに制限されない。
【0130】
前記等張化剤は、浸透圧の調節を示す物質をいう。前記等張化剤は、本発明による液状製剤を体内に投与する場合、浸透圧を適宜維持する役割をすることができる。
【0131】
このような等張化剤の代表的な例としては、水溶性無機塩として塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、又はクエン酸ナトリウムを挙げることができ、具体的には、塩化ナトリウムを挙げることができるが、特にこれに制限されるものではない。このような無機塩は、上述した安定化剤にさらに含まれる選択的な成分であってもよく、特にこれに制限されない。これと併せて上述した安定化制も等張化剤として役割をすることができる。
【0132】
本発明による製剤において前記等張化剤の濃度は、０～約２００ｍＭ、０～約１５０ｍＭ、０～約１００ｍＭ、約１０～約２００ｍＭ、約１０～約１５０ｍＭ、約１０～約１００ｍＭ、約１０～約５０ｍＭ、約２０～約１００ｍＭ、約４０～約１１０ｍＭ、約２０～約８０ｍＭ、約２０～約５０ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、又は約４０～約５０ｍＭ、約４０～約６０ｍＭ、約９０～約１１０ｍＭであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0133】
一方、本発明の液状製剤には前記の液状製剤の必須の構成要素である糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及び緩衝物質以外に選択的構成要素である非イオン性界面活性剤及びアミノ酸以外に本発明の効果を損傷させない範囲内で当業界に公知となっているその他の成分乃至物質が選択的にさらに含まれてもよいが、これに制限されない。
【0134】
前記製剤はさらに多価アルコールを含んでもよいが、特にこれに制限されない。
【0135】
例えば、ｉ）緩衝物質及びｉｉ）糖又は糖アルコールだけでなく、多価アルコールを含むことができ、ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、及びｉｉｉ）非イオン性界面活性剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、及びｉｉｉ）等張化剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）アミノ酸；及びｉｖ）非イオン性界面活性剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、及びｉｉｉ）アミノ酸；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤、及びｉｖ）等張化剤；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤、及びｉｖ）アミノ酸；ｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）等張化剤、及びｉｖ）アミノ酸；又はｉ）緩衝物質、ｉｉ）糖又は糖アルコール、ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤、ｉｖ）等張化剤、及びｖ）アミノ酸で必須で構成される安定化剤に多価アルコールをさらに含んでもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0136】
本発明の製剤にさらに含まれてもよい多価アルコールの例としては、プロピレングリコール及び低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコールなどを挙げることができ、これらの一つ又は二つ以上の組み合わせの形態で用いられてもよいが、これに制限されない。
【0137】
本発明において化学式（１）の持続型結合体は、本発明の液状製剤に含まれる有効成分であり、薬理学的有効量で製剤に含まれてもよい。その例として前記持続型結合体の濃度は、製剤内に約１８～約２８００ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約２７５７ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約２５７６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約２３９２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約２２０８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約２０２４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１８４０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１６５６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１４７２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１２８８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１１０４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約９２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約９１９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約８２８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約７４０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約７３６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約６４４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約５５２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約４６０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約３６８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約２７６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約１８４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８～約９２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約９０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約６００ｎｍｏｌ／ｍＬ、約４５０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約６００ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５００ｎｍｏｌ／ｍＬ、約６００ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５３０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５８０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３．８ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約２７６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約３８６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約４６０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約５５２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約５６０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約６４４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約７３６ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１８３～約７４０ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５１ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５２ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５１．３７ｎｍｏｌ／ｍＬ、約５５１．４ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１５０～約２００ｎｍｏｌ／ｍＬ、約１７０～約２００ｎｍｏｌ／ｍＬであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0138】
本発明において用語、「約」は±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、±０．０１などを全て含む範囲であり、約という用語の後に出る数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに限定されない。
【0139】
前記液状製剤は、一つの具体例として、化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する緩衝物質；糖；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する非イオン性界面活性剤；とアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する安定化剤を含有する液状製剤であってもよい。
【0140】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～６．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；１～１０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；とアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有する液状製剤であってもよい。
【0141】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤；とアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有する液状製剤であってもよい。
【0142】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．１～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有する液状製剤であってもよい。
【0143】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．１～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；及び４～１０％（ｗ／ｖ）の糖を含有する液状製剤であってもよい。
【0144】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；及び４～１０％（ｗ／ｖ）の糖を含有する液状製剤であってもよい。
【0145】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びアルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤を含有する液状製剤であってもよい。
【0146】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含有する液状製剤であってもよい。
【0147】
前記液状製剤は、一つの具体例として、９０～５５２ｎｍｏｌ／ｍＬの化学式（１）のペプチド結合体；前記液状製剤のｐＨが５．０～５．５になるようにクエン酸とその塩、酢酸とその塩、ヒスチジンとその塩、リン酸とその塩及びそれらの組み合わせから選択する５～２５ｍＭの緩衝物質；４～１０％（ｗ／ｖ）の糖；アルギニン、グリシン、メチオニン及びそれらの組み合わせからなる群から選択する０．０１～１ｍｇ／ｍＬの安定化剤；及びポロキサマー、ポリソルベート又はそれらの組み合わせから選択する０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含有する液状製剤であってもよい。
【0148】
前記液状製剤は、苛酷試験条件である４０±２℃及び相対湿度７５±５％の条件で１週間保管時に性状が透明なものであってもよい。
【0149】
本発明において用語「苛酷試験（ｓｔｒｅｓｓ ｔｅｓｔｉｎｇ）」とは、医薬品の安定性に対する根本的特性を究明しようとする試験を意味する。医薬品の開発過程で行われ、加速試験よりも苛酷な条件で行われ、医薬品の予想分解産物と物理的変化を究明するのに役立つ。
【0150】
一方、下記では本発明の液状製剤に含まれる有効成分であるグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体についてより具体的に説明する。
【0151】
本発明において用語、「グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体」は、本発明の液状製剤に含まれる有効成分であり、薬理学的有効量で製剤に含まれてもよい。前記持続型結合体は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドに免疫グロブリンＦｃ切片が連結された形態であってもよい。
【0152】
前記結合体は、免疫グロブリンＦｃ切片が結合していない前記ペプチドに比べて増加した効力の持続性を示すことができ、本発明において前記一般式１のペプチドの化学式（１）による結合体は「持続型結合体」と称し、「持続型三重活性体結合体」、「ペプチド結合体」又は「化学式（１）の持続型結合体」と混用され得る。
【0153】
一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ切片とＱは糖鎖化されていなくてもよいが、これに限定されない。
【0154】
一方、このような結合体は、非自然発生の（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。
【0155】
本願の持続型結合体は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドと免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された形態であってもよく、その連結方法は特に制限されないが、リンカーを通じて前記ペプチドと免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結されたものであってもよい。
【0156】
一つの具体例として、本発明の持続型結合体は、下記化学式（１）の構造を有する。
【0157】
Ｑ － Ｌａ － Ｚ・・・（１）
【0158】
前記化学式（１）において、Ｑは、下記一般式１のペプチドであり、
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す。
Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり；
ａは、０又は自然数であり、ただし、ａが２以上である時、それぞれのＬは互いに独立しており；
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
－は、共有結合を示す。
【0159】
前記化学式（１）の持続型結合体のＱは、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドであってもよい。「グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド」は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して有意な水準の活性を有する多様な物質、例えば、多様なペプチドを含む。
【0160】
特にこれに制限されるものではないが、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して有意な水準の活性を有するペプチドとして、本願において「三重活性体」と混用され得る。
【0161】
より具体的には、前記化学式（１）のＱはグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは下記一般式１の配列を含む、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドである：
【0162】
[一般式１]
Ｘａａ１－Ａｉｂ－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１、配列番号４７）
Ｘａａ１－Ａｉｂ－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１、配列番号４７）
【0163】
前記一般式１において、
下線を引いたＮ末端から１６番であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び２０番であるリシン（Ｌｙｓ）残基の間でラクタム環が形成され、
Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）、又はチロシンであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘａａ１０はチロシン、又はシステインであり、
Ｘａａ１２はリシン、又はイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、又はシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、又はメチオニンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン、又はリシンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、又はシステインであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２８はアラニン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン、又はヒスチジンであるか、存在せず、
Ｒ１はシステイン、ｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４８）、又はｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４９）であるか、又は存在せず、
ここで、
ｍはＣｙｓ、又はＰｒｏであり、
ｎはＣｙｓ、又はＧｌｙ、であるか、又は存在しない。
下線を引いたＮ末端から１６番であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び２０番であるリシン（Ｌｙｓ）残基の間でラクタム環が形成され、
Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）、又はチロシンであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘａａ１０はチロシン、又はシステインであり、
Ｘａａ１２はリシン、又はイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、又はシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、又はメチオニンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン、又はリシンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、又はシステインであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２８はアラニン、アスパラギン、又はアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、又はヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン、又はヒスチジンであるか、存在せず、
Ｒ１はシステイン、ｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４８）、又はｍ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ｎ（配列番号４９）であるか、又は存在せず、
ここで、
ｍはＣｙｓ、又はＰｒｏであり、
ｎはＣｙｓ、又はＧｌｙ、であるか、又は存在しない。
【0164】
前記一般式１のＡｉｂはアミノイソ酪酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）を意味する。
【0165】
本明細書において「Ａｉｂ」は「２－アミノイソ酪酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）」又は「アミノイソ酪酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）」と混用され、２－アミノイソ酪酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）とアミノイソ酪酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）は混用され得る。
【0166】
前記ペプチドは、配列番号１～４６から選択されたアミノ酸配列を含むもの、配列番号１～４６からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0167】
このようなペプチドの例として、配列番号：１、２、９、１９、２１～２７、３０～３２、又は４０～４６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、これで（必須で）構成されたペプチドを挙げることができるが、特にこれに限定されるものではない。もう一つの例として、前記ペプチドは配列番号９、３０～３２、又は４２～４６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、これで（必須で）構成されたペプチドであってもよく、又は配列番号９のアミノ酸配列を含むか、これで（必須で）構成されたペプチドであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0168】
また、前記一般式１において、Ｒ１はシステイン、Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５０）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５１）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号５２）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５３）、又はＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号５４）であるか、存在しなくてもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0169】
また、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは分子内架橋（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｉｄｇｅ）を含むことを特徴とする。例えば、共有結合的架橋又は非共有結合的架橋であってもよく、具体的には、環を含む形態であってもよい。前記一般式１の下線を引いたアミノ酸残基である１６番目のアミノ酸であるグルタミン酸と２０番目のアミノ酸であるリシン間に環を形成するものであってもよいが、特にこれに制限されない。前記環の非制限的な例としてラクタム架橋（又はラクタム環）を含んでもよい。
【0170】
また、本発明によるペプチドはペプチドそのもの、その塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容可能な塩）、又はこの溶媒和物の形態をいずれも含む。また、ペプチドは薬学的に許容される任意の形態であってもよい。
【0171】
前記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全で効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに制限されるものではない。
【0172】
前記用語、「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、又はアレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。
【0173】
本発明において用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、又は塩基から誘導された塩を含む。適した酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適した塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含んでもよい。
【0174】
また、本発明で用いられた用語「溶媒和物」は、本発明によるペプチド又はこの塩が溶媒分子と複合体を形成したことをいう。
【0175】
また、本願において「特定配列番号で構成されるペプチド」と記載されているとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一又は相当する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加又は自然に発生し得る突然変異、あるいはこの潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くものではなく、このような配列の付加あるいは突然変異を有する場合にも、本願の範囲内に属することが自明である。
【0176】
一方、このようなペプチドは非自然発生の（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。
【0177】
前記ペプチドのＣ末端はアミド化されるか、又は自由カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有するペプチドであるか、又はＣ末端が変形されていないペプチドを含むものであってもよいが、これに限定されない。
【0178】
一つの具体例として、前記ＱはＣ末端がアミド化しているものであってもよいが、これに限定されない。
【0179】
一つの具体例として、前記Ｑは非糖鎖化されたものであってもよいが、これに限定されない。
【0180】
前記一般式１のペプチドはＳｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ合成法を通じて合成されてもよい、組換え方法でも生産可能であり、商業的に依頼して製造できるが、これに限定されない。
【0181】
本発明において用語「化学式（１）の持続型結合体」は本発明の液状製剤に含まれる有効成分であり、薬理学的有効量で液状製剤に含まれてもよい。具体的には、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が互いにリンカーで連結された形態であり、前記結合体は免疫グロブリンＦｃ領域が結合していないグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドに比べて増加した効力の持続性を示すことができる。
【0182】
また、化学式（１）の持続型結合体においてグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドであるＱと免疫グロブリンＦｃ切片の連結は、物理又は化学結合であるか、非共有又は共有結合であってもよく、具体的には共有結合であってもよいが、これに限定されない。
【0183】
また、化学式（１）のペプチド結合体はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドであるＱと免疫グロブリンＦｃ切片の連結方法は特に制限されないが、リンカーを通じてグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドと免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結されたものであってもよい。
【0184】
具体的には、本願の液状製剤に含まれる持続型結合体は前記化学式（１）で表されるものであってもよい。
【0185】
前記化学式（１）において共有結合によりＬを通じてＱとＺが互いに結合されてもよい。
【0186】
より具体的には、ＱとＬ、及びＬとＺは共有結合で互いに連結されてもよく、その時、前記結合体は化学式（１）の順にＱ、Ｌ、及びＺが共有結合を通じてそれぞれ連結された結合体であってもよい。
【0187】
また、前記Ｑは、Ｚが直接的に連結されたり（即ち、前記化学式においてａが０であったり）、又はリンカー（Ｌ）を通じて連結されたものであってもよい。
【0188】
一つの具体例として、前記化学式（１）の持続型結合体の一構成要素であるＬａはエチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであり、例えば、ポリエチレングリコールであってもよく、また、当該分野に既に知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【0189】
前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであるＬは、結合体で構成される以前は、結合体の製造に用いられる作用基を末端に含むものであってもよい。本発明による持続型結合体は、前記作用基を通じてＱとＺが連結された形態であってもよいが、これに制限されない。本発明において、前記エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーは２個、又は３個以上の作用基を含めてもよく、各作用基は同一又は相異してもよいが、これに制限されない。
【0190】
具体的には、前記リンカーは下記化学式（３）で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよいが、これに限定されるものではない：
【0191】
【0192】
ここで、ｎ＝１０～２４００、ｎ＝１０～４８０、又はｎ＝５０～２５０であるが、これに限定されない。
前記持続型結合体においてＰＥＧの一部は、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－構造だけでなく、連結要素と、この－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－の間に介在する酸素原子も含めてもよいが、これに制限されるものではない。
前記持続型結合体においてＰＥＧの一部は、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－構造だけでなく、連結要素と、この－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－の間に介在する酸素原子も含めてもよいが、これに制限されるものではない。
【0193】
前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコール同種重合体、ＰＥＧ共重合体、又はモノメチル置換されたＰＥＧ重合体（ｍＰＥＧ）の形態をいずれも包括する用語であるが、特にこれに限定されるものではない。
【0194】
一つの具体例として前記エチレングリコール繰り返し単位は、その例として、［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎで表されることができ、ｎ値は自然数で前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が０超～約１００ｋＤａになるように定められることができるが、これに限定されない。もう一つの例として、前記ｎ値は自然数で前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が約１～約１００ｋＤａ、約１～約８０ｋＤａ、約１～約５０ｋＤａ、約１～約３０ｋＤａ、約１～約２５ｋＤａ、約１～約２０ｋＤａ、約１～約１５ｋＤａ、約１～約１３ｋＤａ、約１～約１１ｋＤａ、約１～約１０ｋＤａ、約１～約８ｋＤａ、約１～約５ｋＤａ、約１～約３．４ｋＤａ、約３～約３０ｋＤａ、約３～約２７ｋＤａ、約３～約２５ｋＤａ、約３～約２２ｋＤａ、約３～約２０ｋＤａ、約３～約１８ｋＤａ、約３～約１６ｋＤａ、約３～約１５ｋＤａ、約３～約１３ｋＤａ、約３～約１１ｋＤａ、約３～約１０ｋＤａ、約３～約８ｋＤａ、約３～約５ｋＤａ、約３～約３．４ｋＤａ、約８～約３０ｋＤａ、約８～約２７ｋＤａ、約８～約２５ｋＤａ、約８～約２２ｋＤａ、約８～約２０ｋＤａ、約８～約１８ｋＤａ、約８～約１６ｋＤａ、約８～約１５ｋＤａ、約８～約１３ｋＤａ、約８～約１１ｋＤａ、約８～約１０ｋＤａ、約９～約１５ｋＤａ、約９～約１４ｋＤａ、約９～約１３ｋＤａ、約９～約１２ｋＤａ、約９～約１１ｋＤａ、約９．５～約１０．５ｋＤａ、又は約１０ｋＤａであってもよいが、これに限定されない。
【0195】
一つの具体例として、前記リンカーの両末端は免疫グロブリンＦｃ切片のチオール基、アミノ基、ヒドロキシル基及び一般式１のペプチドのチオール基、アミノ基、アジド基、ヒドロキシル基に結合してもよいが、これに限定されない。
【0196】
具体的には、前記リンカーは両末端にそれぞれ免疫グロブリンＦｃ及び一般式１のペプチド結合され得る反応基、具体的には、免疫グロブリンＦｃ切片のシステインのチオール基；Ｎ末端、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンに位置したアミノ基；及び／又はＣ末端に位置したヒドロキシル基と結合し、一般式１のペプチドのシステインのチオール基；リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンのアミノ基；アジドリシンのアジド基；及び／又はヒドロキシル基結合され得る反応基を含んでもよいが、これに限定されない。
【0197】
より具体的には、前記リンカーの反応基はアルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される一つ以上であってもよいが、これに限定されない。
【0198】
前記において、アルデヒドグループにおいてプロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを例として挙げることができるが、これに限定されない。
【0199】
前記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタン酸、スクシンイミジルメチルプロピオン酸、スクシンイミジルブタン酸、スクシンイミジルプロピオン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよいが、これに限定されない。
【0200】
前記リンカーは、前記のような反応基を通じて免疫グロブリンＦｃ切片であるＺ及び一般式１のペプチドであるＱに連結され、リンカー連結部に転換されてもよい。
【0201】
また、アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものより遥かに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えば、ｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成できるが、これに制限されない。
【0202】
本発明のリンカーの末端反応基は互いに同一又は異なってもよい。前記リンカーは、末端にアルデヒドグループ反応基を有するものであってもよく、また、前記リンカーは、末端にそれぞれアルデヒドグループ及びマレイミド反応基を有してもよく、又は末端にそれぞれアルデヒドグループ及びスクシンイミド反応基を有してもよいが、これに制限されない。
【0203】
例えば、一方の末端にはマレイミドグループを、他方の末端にはアルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを有することができる。また、一つの例として、一方の末端にはスクシンイミジルグループを、他方の末端にはプロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを有することができる。
【0204】
プロピオン側の末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールをリンカーとして用いる場合には、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前記多様な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明の結合体を製造できる。
【0205】
一つの具体的な実施形態において前記リンカーの反応基が一般式１のペプチドのシステイン残基、より具体的には、システインの－ＳＨ基に連結されるものであってもよいが、これに制限されない。
【0206】
もし、マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを用いる場合、マレイミド基は一般式１のペプチドの－ＳＨ基とチオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）結合で連結し、アルデヒド基は免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ2基と還元的アルキル化反応を通じて連結できるが、これに制限されず、これは一例に該当する。
【0207】
このような還元的アルキル化を通じてＰＥＧの一方の末端に位置した酸素原子に免疫グロブリンＦｃ切片のＮ末端アミノ基が－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－の構造を有するリンカー作用基を通じて互いに連結され、－ＰＥＧ－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ－免疫グロブリンＦｃのような構造を形成でき、チオエーテル結合を通じてＰＥＧの一方の末端が一般式１のペプチドのシステインに位置した硫黄原子に連結された構造を形成できる。上述したチオエーテル結合は
の構造を含んでもよい。
【0208】
しかし、上述した例に特に制限されるものではなく、これは一例に該当する。
【0209】
また、前記結合体において、リンカーの反応基が免疫グロブリンＦｃ切片のＮ－末端に位置した－ＮＨ2と連結されたものであってもよいが、これは一例に該当する。
【0210】
また、前記結合体において、一般式１のペプチドは反応基を有するリンカーとＣ末端を通じて連結され得るが、これは一例に該当する。
【0211】
本発明において「Ｃ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端を意味することであり、本発明の目的上、リンカーと結合できる位置をいう。その例として、これに制限されないが、Ｃ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｃ末端周囲のアミノ酸残基をいずれも含んでもよく、具体的には最末端から１番目～２０番目のアミノ酸残基を含んでもよいが、これに限定されない。
【0212】
一つの具体例として、前記化学式（１）の結合体は下記化学式（２）の構造を有することができる。
【0213】
前記化学式（２）においてＱは前記で説明した一般式１のペプチドであり、
Ｚは、免疫グロブリンＦｃ切片であり、
ｎは自然数であってもよい。その時、ｎに関する説明は、前述の通りである。
【0214】
一つの具体例として、前記化学式（２）の持続型結合体は配列番号４７の一般式１のペプチドＱと免疫グロブリンＦｃ切片Ｚがエチレングリコール繰り返し部を介在して共有結合で連結された構造として、それぞれＱは化学式（２）のスクシンイミド環に、Ｚは化学式（２）のオキシプロピレン基に連結される形態であってもよい。
【0215】
前記化学式（２）において、前記ｎの値は、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１～１００ｋＤａ、又は１～２０ｋＤａ又は１０ｋＤａになるように定められるものであってもよいが、これに限定されない。
【0216】
前記ペプチド結合体のＱはグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドであってもよい。
【0217】
一実施形態において化学式（２）のスクシンイミド環にＱが連結される部位はＱのＣ－末端システインの硫黄原子であってもよい。
【0218】
前記化学式（１）又は（２）のＺは免疫グロブリンＦｃ切片であり、本明細書において免疫グロブリンＦｃ切片といえば、免疫グロブリンのパパインの消化から得る天然型配列だけでなく、その誘導体、置換体、例えば、天然配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組み合わせにより変換され、天然型と相異なった配列など、変形体まで網羅して含まれる。前記誘導体、置換体、変形体はＦｃＲｎに結合する能力を有することを前提とする。
【0219】
Ｚ内において前記オキシプロピレン基に連結される部位は特に限定されない。本発明の一実施形態において前記オキシプロピレン基に連結されるＺの部位はＮ末端窒素又はＺ内部残基の窒素原子（例えば、リシンのイプシロン窒素）であってもよい。本発明の一具体的な実施形態において、Ｚが化学式（１）のオキシプロピレン基に連結される部位はＺのＮ末端プロリンであってもよいが、これに制限されない。
【0220】
前記Ｚは２個のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖中の一鎖の窒素原子を通じてのみ連結されている構造であってもよいが、これに制限されない。前記窒素原子を通じての連結はリシンのイプシロンアミノ原子やＮ末端アミノ基に還元的アミノ化を通じて連結されてもよいが、これに制限されない。
【0221】
還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（即ち、還元的アミノ化が可能な作用基）と反応してアミンを生成した後、還元反応によりアミン結合を形成させる反応を意味し、当該技術分野に広く知られている有機合成反応である。
【0222】
一つの具体例として、前記ＺはそのＮ末端プロリンの窒素原子を通じて連結されたものであってもよいが、これに限定されない。
【0223】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ切片」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖定常領域を意味する。具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ切片は重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）の部分を含むものであってもよく、より具体的には、ヒンジ領域（ヒンジ領域全体又は一部を意味する）をさらに含むものであってもよい。
【0224】
前記免疫グロブリンＦｃ切片は本発明の化学式（１）のペプチド結合体の一部をなす一構成であり、具体的には、前記化学式（１）においてＺに該当することができる。
【0225】
このような免疫グロブリンＦｃ切片は重鎖定常領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含めてもよいが、これに限定されるものではない。
【0226】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ切片はＮ末端に特定ヒンジ配列を含んでもよい。
本発明の用語、「ヒンジ配列」とは、重鎖に位置してジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を通じて免疫グロブリンＦｃ切片の二量体を形成する部位を意味する。
本発明の用語、「ヒンジ配列」とは、重鎖に位置してジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を通じて免疫グロブリンＦｃ切片の二量体を形成する部位を意味する。
【0227】
本発明において、前記ヒンジ配列は、下記アミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失して一つのシステイン残基のみを有するように変異されたものであってもよいが、これに制限されない：
【0228】
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５５）。
【0229】
前記ヒンジ配列は、配列番号５５のヒンジ配列中の８番目又は１１番目のシステイン残基が欠失して一つのシステイン残基のみを含むものであってもよい。本発明のヒンジ配列は一つのシステイン残基のみを含む、３～１２個のアミノ酸で構成されたものであってもよいが、これに限定されない。より具体的には、本発明のヒンジ配列は次のような配列を有することができる：Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５６）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号５７）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５８）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号５９）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号６０）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６１）、Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６２）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６３）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６４）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６５）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６６）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６７）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６８）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６９）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号７０）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号７１）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号７２）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号７３）、Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号７４）。より具体的には、前記ヒンジ配列は配列番号７４（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）又は配列番号６５（Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに限定されない。
【0230】
本発明の免疫グロブリンＦｃ切片はヒンジ配列の存在により免疫グロブリンＦｃ鎖の２分子が二量体を形成した形態であってもよく、また、本発明の化学式（１）の持続型結合体はリンカーの一方の末端が二量体の免疫グロブリンＦｃ切片の一鎖に連結された形態であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0231】
本発明の用語、「Ｎ末端」とは、タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端を意味することであり、アミノ末端の最末端、又は最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個以上のアミノ酸まで含むものであってもよい。本発明の免疫グロブリンＦｃ切片はヒンジ配列をＮ末端に含んでもよいが、これに限定されない。
【0232】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を奏する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部又は全体の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
【0233】
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ切片は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の１個又は２個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、又は６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【0234】
また、一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ切片は二量体形態（ｄｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）であってもよく、二量体形態の一つのＦｃ領域に一般式１のペプチドの一分子が共有結合的に連結されてもよく、その時、前記免疫グロブリンＦｃと一般式１のペプチドはエチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーにより互いに連結されてもよい。一方、二量体形態の一つのＦｃ領域に一般式１のペプチドの二分子が対称的に結合することも可能である。その時、前記免疫グロブリンＦｃと一般式１のペプチドはエチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーにより互いに連結されてもよい。しかし、前記例に制限されるものではない。
【0235】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ切片は天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組み合わせにより相違する配列を有することを意味する。
【0236】
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２又は３２７～３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられ得る。
【0237】
また、ジスルフィド結合を形成できる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもできるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクタ機能をなくすために補体結合部位、例えば、Ｃｌｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ切片の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第９６／３２４７８号などに開示されている。
【0238】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知となっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も通常生じる交換はアミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ 間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及びアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
【0239】
前記Ｆｃ誘導体は本発明のＦｃ切片と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
【0240】
また、このようなＦｃ切片は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット又はモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組換え型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は全体免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して獲得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離できる。さらに具体的な実施形態においてはヒト由来のＦｃ領域を微生物から得た組換え型免疫グロブリンＦｃ切片である。
【0241】
また、免疫グロブリンＦｃ切片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような常法が用いられ得る。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ切片は補体（ｃ１ｑ）との結合力が顕著に低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が減少又は除去されるため、生体内において不要な免疫反応を誘発しない。このような点で薬物のキャリアとしての本来の目的に、より符合する形態は糖鎖が除去されたり非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ切片であるといえる。
【0242】
本発明において「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は酵素で糖を除去したＦｃ切片をいい、非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は原核動物、さらに具体的な実施形態では大腸菌で生産してグリコシル化されていないＦｃ切片を意味する。
【0243】
一方、免疫グロブリンＦｃ切片は、ヒト又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、さらに具体的な実施形態においてはヒト起源である。
【0244】
また、免疫グロブリンＦｃ切片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来又はそれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又はこれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ切片であってもよい。さらに具体的な実施形態ではヒトの血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であり、より具体的な実施形態ではリガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来である。より一層具体的な実施形態において前記免疫グロブリンＦｃ切片はＩｇＧ４ Ｆｃ切片であり、最も具体的な実施形態において前記免疫グロブリンＦｃ切片はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ切片であるが、これに限定されるものではない。
【0245】
また、一つの具体的な実施形態において、免疫グロブリンＦｃ切片はヒトＩｇＧ４ Ｆｃの断片であり、各単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ－ｃｈａｉｎ 形態）を通じて２個の単量体が連結されたホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）の形態であってもよく、その時、ホモ二量体の各単量体は独立に３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合、即ち、２個の内部のジスルフィド結合（ｉｎｔｒａ－ｃｈａｉｎ 形態）を有したり／有することができる。各単量体のアミノ酸の数は２２１個のアミノ酸で構成されてもよく、ホモ二量体を形成するアミノ酸は計４４２個のアミノ酸からなってもよいが、これに限定されない。具体的には、免疫グロブリンＦｃ切片は配列番号７６のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸で構成される）を有する単量体２個が各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間にジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体の単量体は、それぞれ独立に３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成するものであってもよいが、これに限定されない。
【0246】
前記化学式（１）のＺは配列番号７６のアミノ酸配列である単量体を含むものであってもよく、前記Ｚは配列番号７６のアミノ酸配列の単量体のホモ二量体であってもよいが、これに限定されない。
【0247】
一つの例として、免疫グロブリンＦｃ切片は、配列番号７５のアミノ酸配列（４４２個のアミノ酸で構成される）を含むホモ二量体であってもよいが、これに限定されない。
一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体又は多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ切片をコードするポリペプチドが相違する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成するものを意味する。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２個以上の断片から二量体又は多量体の製造が可能である。
一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体又は多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ切片をコードするポリペプチドが相違する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成するものを意味する。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２個以上の断片から二量体又は多量体の製造が可能である。
【0248】
本発明において「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、単鎖の免疫グロブリン定常領域内に２個以上の相違する起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、種々の形態のハイブリッドが可能である。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなるグループから１個～４個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含めてもよい。
【0249】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明ではそれらの組み合わせ又はこれらのハイブリダイゼーションも可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、最も具体的には補体依存的傷害（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のようなエフェクタ機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ切片である。
【0250】
一方、前記液状製剤は、メタボリックシンドロームの予防又は治療のためのものであってもよい。
【0251】
本発明において用語「予防」とは、前記結合体又はこれを含む製剤の投与でメタボリックシンドロームの発病を抑制又は遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、前記結合体又はこれを含む製剤の投与でメタボリックシンドロームの症状が好転したり有益になる全ての行為を意味する。
【0252】
本発明において用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれに制限されないが、前記組成物が生体内の標的に到達できる任意の一般的な経路を通じて投与されてもよく、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、又は直腸内投与などが挙げられる。
【0253】
本発明を具現するもう一つの様態は、前記液状製剤の製造方法を提供する。
【0254】
具体的には、前記製造方法は、（ａ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド及び免疫グロブリンＦｃ切片が互いに連結された、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの持続型結合体と（ｂ）ｉ）緩衝物質及びｉｉ）糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせを含む安定化剤を互いに混合する段階を含むものであってもよい。
【0255】
一方、前記安定化剤は、等張化剤、非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸からなる群から選択される一つ以上の成分をさらに含んでもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【0256】
前記持続型結合体、緩衝物質、糖アルコール、糖、又はそれらの組み合わせ、等張化剤、非イオン性界面活性剤、アミノ酸、及び安定化剤については、前述の通りである。
【0257】
本発明を具現するもう一つの様態は、前記液状製剤をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、メタボリックシンドロームの予防又は治療方法を提供する。
【0258】
前記液状製剤、メタボリックシンドローム、予防、及び治療については、前述の通りである。
【0259】
前記個体は、本発明の製剤の投与が必要な個体であり、本発明の液状製剤で治療可能な個体は制限なく含み、具体的には、ヒト又はラット、家畜などを含む哺乳動物を含む。
【0260】
本発明の治療方法は、液状製剤を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。適した総１日使用量は、正しい医学的判断の範囲内で処置医により決定され、１回又は数回に分けて投与できる。しかし、本発明の目的上、特定患者に関する具体的な治療的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合によって異なる製剤が用いられるかどうかをはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に用いられたり同時に用いられる薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子により異なって適用することが好ましい。
【0261】
本発明を具現するもう一つの様態は、メタボリックシンドロームの予防又は治療用薬剤の製造において、前記液状製剤の用途である。
【0262】
前記液状製剤、メタボリックシンドローム、予防、及び治療については、前述の通りである。
【0263】
本発明を具現するもう一つの様態は、メタボリックシンドロームの予防又は治療に用いるための前記液状製剤の用途である。
【0264】
前記液状製剤、メタボリックシンドローム、予防、及び治療については、前述の通りである。
【0265】
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【0266】
製造例：グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の製造
グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体を次のような方法で製造した。
１－１：グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の製造
ＧＬＰ－１受容体、ＧＩＰ受容体及びグルカゴン受容体にいずれも活性を示す三重活性体を製造し、下記表１にその配列を示した。
グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体を次のような方法で製造した。
１－１：グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の製造
ＧＬＰ－１受容体、ＧＩＰ受容体及びグルカゴン受容体にいずれも活性を示す三重活性体を製造し、下記表１にその配列を示した。
【0267】
【表1】
【0268】
前記表１に記載された配列において、Ｘで表記されたアミノ酸は非天然型アミノ酸であるＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり、下線で表示されたアミノ酸は下線で表示されたアミノ酸が互いに環を形成することを意味する。また、前記表１においてＣＡは４－イミダゾアセチル（４－ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ）を、Ｙはチロシンを意味する。
【0269】
１－２：三重活性体のｉｎ ｖｉｔｒｏ 活性の測定
前記１－１で製造された三重活性体の活性を測定するためにＧＬＰ－１受容体、グルカゴン（ＧＣＧ）受容体、及びＧＩＰ受容体がそれぞれ形質転換された細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞活性を測定する方法を用いた。
前記１－１で製造された三重活性体の活性を測定するためにＧＬＰ－１受容体、グルカゴン（ＧＣＧ）受容体、及びＧＩＰ受容体がそれぞれ形質転換された細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞活性を測定する方法を用いた。
【0270】
前記各細胞株は、ＣＨＯ（ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）にヒトＧＬＰ－１受容体、ヒトＧＣＧ受容体及びヒトＧＩＰ受容体遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、ＧＬＰ－１、ＧＣＧ及びＧＩＰの活性を測定するのに適している。従って、各部分に対する活性をそれぞれの形質転換細胞株を用いて測定した。
【0271】
前記１－１で製造された三重活性体のＧＬＰ－１活性測定のためにヒトＧＬＰ－１を５０ｎＭから４倍ずつ０．００００４８ｎＭまで連続的に希釈し、前記１－１で製造された三重活性体を４００ｎＭから４倍ずつ０．０００３８ｎＭまで連続的に希釈した。前記培養されたヒトＧＬＰ－１受容体が発現されたＣＨＯ細胞から培養液を除去し、連続的に希釈された各物質を５μｌずつ前記細胞に添加した後、ｃＡＭＰ抗体が含まれた緩衝液を５μｌずつ追加した後、１５分間常温で培養した。その後、細胞溶解緩衝液（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）が含まれたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘを１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、９０分間常温で反応させた。前記反応が完了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）に適用して蓄積されたｃＡＭＰを通じてＥＣ50値を算出した後、互いに比較した。ヒトＧＬＰ－１比相対力価は下記表２に示した。
【0272】
前記１－１で製造された三重活性体のＧＣＧ活性測定のためにヒトＧＣＧを５０ｎＭから４倍ずつ０．００００４８ｎＭまで連続的に希釈し、前記１－１で製造された三重活性体を４００ｎＭから４倍ずつ０．０００３８ｎＭまで連続的に希釈した。前記培養されたヒトＧＣＧ受容体が発現されたＣＨＯ細胞から培養液を除去し、連続的に希釈された各物質を５μｌずつ前記細胞に添加した後、ｃＡＭＰ抗体が含まれた緩衝液を５μｌずつ追加した後、１５分間常温で培養した。その後、細胞溶解緩衝液（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）が含まれたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘを１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、９０分間常温で反応させた。前記反応が完了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）に適用して蓄積されたｃＡＭＰを通じてＥＣ50値を算出した後、互いに比較した。ヒトＧＣＧ比相対力価は下記表２に示した。
【0273】
前記１－１で製造された三重活性体のＧＩＰ活性測定のためにヒトＧＩＰを５０ｎＭから４倍ずつ０．００００４８ｎＭまで連続的に希釈し、前記１－１で製造された三重活性体を４００ｎＭから４倍ずつ０．０００３８ｎＭまで連続的に希釈した。前記培養されたヒトＧＩＰ受容体が発現されたＣＨＯ細胞から培養液を除去し、連続的に希釈された各物質を５μｌずつ前記細胞に添加した後、ｃＡＭＰ抗体が含まれた緩衝液を５μｌずつ追加した後、１５分間常温で培養した。その後、細胞溶解緩衝液（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）が含まれたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘを１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、９０分間常温で反応させた。前記反応が完了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）に適用して蓄積されたｃＡＭＰを通じてＥＣ50値を算出した後、互いに比較した。ヒトＧＩＰ比相対力価は下記表２に示した。
【0274】
【表2】
【0275】
前記で製造した三重活性体はＧＬＰ－１、ＧＩＰ及びグルカゴン受容体にいずれも優れた効果を奏することを確認した。
【0276】
１－３：三重活性体の持続型結合体の製造
代表的な三重活性体として配列番号９番のペプチドを用いて持続型結合体を製造した。三重活性体とポリエチレングリコールリンカーの連結体を製造するために両末端の水素がそれぞれ３－（３－マレイミドプロピオンアミド）プロピル基及び３－オキソプロピル基（プロピオンアルデヒド基）で置換された分子量１０ｋＤａの線状改質ポリエチレングリコールであるマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド（日本ＮＯＦ社）を前記三重活性体のシステイン残基に反応させることにより三重活性体をマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのマレイミド側の末端にペギル化させた。具体的には、三重活性体とマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのモル比を１：１～３、タンパク質の濃度を１～５ｍｇ／ｍｌにして低温で０．５～３時間反応させた。その時、反応は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に２０～６０％のイソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液をＳＰセファロースＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に適用してシステインにモノペギル化された三重活性体を精製した。
代表的な三重活性体として配列番号９番のペプチドを用いて持続型結合体を製造した。三重活性体とポリエチレングリコールリンカーの連結体を製造するために両末端の水素がそれぞれ３－（３－マレイミドプロピオンアミド）プロピル基及び３－オキソプロピル基（プロピオンアルデヒド基）で置換された分子量１０ｋＤａの線状改質ポリエチレングリコールであるマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド（日本ＮＯＦ社）を前記三重活性体のシステイン残基に反応させることにより三重活性体をマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのマレイミド側の末端にペギル化させた。具体的には、三重活性体とマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのモル比を１：１～３、タンパク質の濃度を１～５ｍｇ／ｍｌにして低温で０．５～３時間反応させた。その時、反応は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に２０～６０％のイソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液をＳＰセファロースＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に適用してシステインにモノペギル化された三重活性体を精製した。
【0277】
免疫グロブリンＦｃ切片は、Ｎ末端にＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ配列のヒンジ領域を有する免疫グロブリンＦｃ切片（４９．８ｋＤａ、配列番号７６の二鎖がジスルフィド結合で連結されたホモ二量体）を用いて国際公開特許ＷＯ２００７／０２１１２９に記載された方法で製造した。
【0278】
次に、前記精製されたモノペギル化された三重活性体と免疫グロブリンＦｃをモル比を１：１～５、タンパク質の濃度を１０～５０ｍｇ／ｍＬにして４～８℃で１２～１８時間反応させた。反応は１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である１０～５０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムボロヒドリドと１０～３０％のイソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液をブチルセファロースＦＦ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）とＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に適用し、前記モノペギル化された三重活性体のアルデヒド側ポリエチレングリコール末端が免疫グロブリンＦｃホモ二量体の二鎖中の一鎖のＮ末端プロリン窒素に連結された三重活性体の持続型結合体を精製した。
【0279】
製造後に逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィで分析した純度は９５％以上であった。
【0280】
ここで、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体及び免疫グロブリンＦｃ切片がＰＥＧを通じて連結された結合体を、「グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体」と命名した。
【0281】
実施例１：ｐＨによるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性の評価
緩衝物質、糖アルコールとしてマンニトール、界面活性剤としてポリソルベート２０、そしてメチオニンからなる液状製剤に基づいて多様なｐＨ下でグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。比較例として、ｐＨ４．５の製剤を用いた。
緩衝物質、糖アルコールとしてマンニトール、界面活性剤としてポリソルベート２０、そしてメチオニンからなる液状製剤に基づいて多様なｐＨ下でグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。比較例として、ｐＨ４．５の製剤を用いた。
【0282】
前記製造例で得た三重活性体の持続型結合体を下記表３のような組成（持続型結合体の濃度は１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤に製造して２５℃で６週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィ法（Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＥ－ＨＰＬＣ）と逆相クロマトグラフィ法（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ－Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて安定性を分析した。
【0283】
表４のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（％）は、測定時点における面積％値を保存試験初期面積％値で除した比（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）の百分率数値であり、三重活性体の持続型結合体の初期濃度（１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ濃度）からの残存率を示す。
【0284】
【表3】
【0285】
【表4】
【0286】
前記結果から見られるように、クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０の組成を有する製剤（＃１）、クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５の組成を有する製剤（＃２）において、２５℃で６週間高い安定性を示した。ｐＨ６．０の組成を有する製剤（＃３）及びｐＨ６．５の組成を有する製剤（＃４）も６週間安定性を示した。比較例であるｐＨ４．５の組成の場合には、６週間で沈殿が起こったことを確認することができた。
【0287】
実施例２：糖又は糖アルコールの種類によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性の評価
グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の保存安定性を増大させるためにさらに含み得る糖又は糖アルコールの例としては、マンノース、グルコース、フコース及びキシロースなどの単糖類とラクトース、マルトース、スクロース、ソルビトール、ラフィノース及びデキストランなどの多糖類を挙げることができる。そのうち、前記実施例１で確認されたマンニトール及びスクロースとソルビトールによるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。そのとき、マンニトール、スクロース及びソルビトールの濃度は、市販中の剤形及び許可機関で勧める最大許容範囲を考慮した。
グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の保存安定性を増大させるためにさらに含み得る糖又は糖アルコールの例としては、マンノース、グルコース、フコース及びキシロースなどの単糖類とラクトース、マルトース、スクロース、ソルビトール、ラフィノース及びデキストランなどの多糖類を挙げることができる。そのうち、前記実施例１で確認されたマンニトール及びスクロースとソルビトールによるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。そのとき、マンニトール、スクロース及びソルビトールの濃度は、市販中の剤形及び許可機関で勧める最大許容範囲を考慮した。
【0288】
前記製造例で得た三重活性体の持続型結合体を下記表５のような組成（持続型結合体の濃度は１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤に製造して２５℃で６週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィ法と逆相クロマトグラフィ法を用いて分析した。
【0289】
表６のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（％）は、測定時点における面積％値を保存試験初期面積％値で除した比（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）の百分率数値であり、三重活性体の持続型結合体の初期濃度（１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ濃度）からの残存率を示す。
【0290】
【表5】
【0291】
【表6】
【0292】
前記結果から見られるように、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の保存安定性を増大させるために含まれる糖又は糖アルコールであるマンニトール、ソルビトール、そしてスクロースをそれぞれ５％、５％、及び８％で含む場合、類似の安定性を示した。
【0293】
実施例３：糖又は糖アルコール濃度によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性の評価
前記実施例１又は実施例２で確認された液状製剤の組成（クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、マンニトール、ポリソルベート２０、及びメチオニン）に基づいて糖又は糖アルコール濃度によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。そのとき、共に追加された等張化剤の濃度は、市販中の剤形の許容範囲と正常血漿浸透圧を考慮して等張化剤の濃度を選定した。
前記実施例１又は実施例２で確認された液状製剤の組成（クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、マンニトール、ポリソルベート２０、及びメチオニン）に基づいて糖又は糖アルコール濃度によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。そのとき、共に追加された等張化剤の濃度は、市販中の剤形の許容範囲と正常血漿浸透圧を考慮して等張化剤の濃度を選定した。
【0294】
前記製造例で得た三重活性体の持続型結合体を下記表７のような組成（持続型結合体の濃度は１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤に製造して２５℃で６週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィ法と逆相クロマトグラフィ法を用いて分析した。
【0295】
表８のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（％）は、測定時点における面積％値を保存試験初期面積％値で除した比（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）の百分率数値であり、三重活性体の持続型結合体の初期濃度（１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ濃度）からの残存率を示す。
【0296】
【表7】
【0297】
【表8】
【0298】
前記結果から見られるように、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の製剤に糖アルコール濃度が１％～５％含まれた場合、類似の安定性を示した。
【0299】
実施例４：緩衝物質の種類によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性の評価
前記液状製剤の組成（クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、マンニトール、ポリソルベート２０、及びメチオニン）に基づいて緩衝物質の種類によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。
前記液状製剤の組成（クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、マンニトール、ポリソルベート２０、及びメチオニン）に基づいて緩衝物質の種類によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。
【0300】
前記製造例で得た三重活性体の持続型結合体を下記表９のような組成（持続型結合体の濃度は１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤に製造して２５℃で６週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィ法と逆相クロマトグラフィ法を用いて分析した。
【0301】
表１０のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（％）は、測定時点における面積百分率値を保存試験初期面積百分率値で除した比（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）の百分率数値であり、三重活性体の持続型結合体の初期濃度（１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ濃度）からの残存率を示す。
【0302】
【表9】
【0303】
【表10】
【0304】
前記結果から見られるように、緩衝物質がクエン酸ナトリウム（＃１）及び酢酸ナトリウム（＃２）であるとき、２５℃で６週間高い安定性を示した。また、緩衝物質がヒスチジン（＃３）である時も良好な安定性を示すことを確認した。（図１ａ及びｂ）。
【0305】
実施例５：非イオン性界面活性剤の種類によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性の評価
酢酸ナトリウム、スクロース及びメチオニン組成の液状製剤において非イオン性界面活性剤の種類によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。
酢酸ナトリウム、スクロース及びメチオニン組成の液状製剤において非イオン性界面活性剤の種類によるグルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。
【0306】
そのとき、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８の濃度は市販中の剤形を考慮した。
【0307】
前記製造例で得た三重活性体の持続型結合体を下記表１１のような組成（持続型結合体の濃度は１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤に製造して２５℃で６週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィ法と逆相クロマトグラフィ法を用いて分析した。
【0308】
表１２のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（％）は、測定時点における面積百分率値を保存試験初期面積百分率値で除した比（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）の百分率数値であり、三重活性体の持続型結合体の初期濃度（１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ濃度）からの残存率を示す。
【0309】
【表11】
【0310】
【表12】
【0311】
非イオン性界面活性剤としてポリソルベート２０（＃１）、ポリソルベート８０（＃２）及びポロキサマー１８８（＃３）をそれぞれ含む製剤の場合、類似の安定性を示した。
【0312】
実施例６：非イオン性界面活性剤及びアミノ酸を含むか否かによる持続型グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体結合体の安定性の評価
液状製剤が非イオン性界面活性剤又はアミノ酸の安定化剤を含む又は含まないとき、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。
液状製剤が非イオン性界面活性剤又はアミノ酸の安定化剤を含む又は含まないとき、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体の持続型結合体の安定性を比較した。
【0313】
前記製造例で得た三重活性体の持続型結合体を下記表１３のような組成（持続型結合体の濃度は１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ）の液状製剤に製造して２５℃で６週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィ法と逆相クロマトグラフィ法を用いて分析した。
【0314】
表１４のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（％）は、測定時点における面積百分率値を保存試験初期面積百分率値で除した比（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）の百分率数値であり、三重活性体の持続型結合体の初期濃度（１８３．７９ｎｍｏｌ／ｍＬ濃度）からの残存率を示す。
【0315】
【表13】
【0316】
【表14】
【0317】
前記結果から見られるように、非イオン性界面活性剤及びアミノ酸を含む製剤とこれを含まない製剤は互いに類似の安定性を示した。
【0318】
実施例７：濃度による持続型グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体結合体の安定性の評価
前記実施例６のｐＨ５．１の酢酸ナトリウム、スクロース、ポリソルベート２０、そしてメチオニンからなる液状製剤の高濃度の適用のために表１５のような濃度で長期保存及び加速安定性を確認した。
前記実施例６のｐＨ５．１の酢酸ナトリウム、スクロース、ポリソルベート２０、そしてメチオニンからなる液状製剤の高濃度の適用のために表１５のような濃度で長期保存及び加速安定性を確認した。
【0319】
そのため、５±３℃及び２５±２℃で保管した後、イオン交換クロマトグラフィ法、逆相クロマトグラフィ法及びサイズ排除クロマトグラフィ法を用いて分析した。表１６及び表１７のＩＥ－ＨＰＬＣ（％）、ＲＰ－ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ－ＨＰＬＣ（％）は、測定時点における面積百分率値を保存試験初期面積百分率値で除した比の百分率数値であり、三重活性体の持続型結合体の残存率を示す。
【0320】
【表15】
【0321】
【表16】
【0322】
【表17】
【0323】
前記結果から見られるように、長期保存安定性試験の結果、１８３．７９～５５１．３７ｎｍｏｌ／ｍＬタンパク質濃度で持続型グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体結合体は、本発明の液状製剤において類似に安定したことを確認した。即ち、このような結果は、多様な濃度の持続型グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ三重活性体結合体が本発明の液状製剤の組成で安定性を有していることを示唆するものである。
【0324】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図1a】
【図1b】
【配列表】
【国際調査報告】