特表 2023-526630 ＩＧ様分子の製造のための方法および手段

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-22

(54)【発明の名称】ＩＧ様分子の製造のための方法および手段

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230615BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230615BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230615BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230615BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230615BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230615BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230615BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230615BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/46 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 D

A61K39/395 M

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022570465

(86)(22)【出願日】2021-05-20

(85)【翻訳文提出日】2023-01-16

(86)【国際出願番号】 NL2021050322

(87)【国際公開番号】W WO2021235936

(87)【国際公開日】2021-11-25

(31)【優先権主張番号】20175903.2

(32)【優先日】2020-05-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510340757

【氏名又は名称】メルス ナムローゼ フェンノートシャップ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】デ クライフ，コルネリス

(72)【発明者】

【氏名】ヘンドリクス，リンダ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA13

4C085BB31

4C085DD61

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ヒト疾患の処置に有用なヘテロ二量体タンパク質、ならびにそれらの産生方法および収集方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含む単離ヘテロ二量体タンパク質であって、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドが、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドが、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、かつ前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドが、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にアミノ酸変異をさらに含む、単離ヘテロ二量体タンパク質。

【請求項2】

ａ） 位置３６４のアミノ酸が、バリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり；および／または
ｂ）位置４０９のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり；および／または
ｃ) 位置３６０のアミノ酸がアスパラギン酸である、
請求項１に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。

【請求項3】

ヘテロ二量体タンパク質が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３領域を含む、請求項１または２に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。

【請求項4】

ヘテロ二量体タンパク質がヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含み、要すればヒト免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。

【請求項5】

ａ） 第１のＣＨ３含有ポリペプチドが抗体重鎖であり；および／または
ｂ） 第２のＣＨ３含有ポリペプチドが抗体重鎖であり；および／または
ｃ） ヘテロ二量体タンパク質が、１以上の抗体軽鎖をさらに含み；および／または
ｄ） 抗体軽鎖が一般的な抗体軽鎖である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項7】

請求項１から５のいずれか一項に記載の第１および第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドをコードする単離核酸。

【請求項8】

請求項７に記載の単離核酸を含む組換え宿主細胞。

【請求項9】

第１および第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項８に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質の製造方法。

【請求項10】

アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含む第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチド、およびアミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含む第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含む、ヘテロ二量体タンパク質の安定性を改善する方法であって、ここで、該方法が、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にアミノ酸変異を導入することを含む、方法。

【請求項11】

アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含む第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含む、ホモ二量体タンパク質の安定性を低下させる方法であって、ここで、該方法が、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にアミノ酸変異を導入することを含む、方法。

【請求項12】

第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質の収量を改善する方法であって、ここで、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドが、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、かつ前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドが、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、そして該方法が、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にアミノ酸変異を導入することを含む、方法。

【請求項13】

第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質の純度を高める方法であって、ここで、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドが、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、かつ前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドが、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、そして該方法が、（ａ）第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にアミノ酸変異を導入し；そして（ｂ）ヘテロ二量体タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに付すことを含む、方法。

【請求項14】

ａ） 位置３６４のアミノ酸が、バリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり；および／または
ｂ） 位置４０９のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり；および／または
ｃ) 位置３６０のアミノ酸がアスパラギン酸である、
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

請求項９に記載の方法によって産生されるヘテロ二量体タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子生物学、医学および生物学的治療の分野に関する。特に、様々な疾患の処置のための治療用抗体の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
過去１０年間、二重特異性抗体は、２つの抗体の組合せの使用に代わるものとして発表された。同様に、３つ以上の同じかまたは異なる抗原またはエピトープに結合できる多価多量体が、発展途上の技術分野として発表された。２つの抗体の組合せは、同じかまたは異なる標的上の異なるエピトープに結合する２つの異なる免疫グロブリンの混合物であるが、二重特異性抗体では、これは単一の免疫グロブリンによって達成される。多価多量体では、同じかまたは異なる標的上の３つ以上の異なるエピトープへの結合が達成され得る。

【0003】

同じかまたは異なる標的上の２つのエピトープに結合することにより、二重特異性抗体は、同じエピトープに結合する２つの抗体の組合せと比較して、同様の効果または優れた効果を有し得る。これは、３つ以上の標的に結合できる多価多量体の生成にも適用できる。さらに、ＩｇＧ型の二重特異性抗体は２つの異なる一価結合領域を単一分子に結合し、２つのＩｇＧ抗体の混合物は２つの異なる二価結合分子を単一調製物に結合し、多価多量体は３つ以上の結合領域を結合し得るため、これらのフォーマットの種々の効果も同様に観察されている。技術的および規制上の観点から、これらの二重特異性または多価多量体を実質的に純粋な方法で効率的に生成および分離できる場合、単一の二重特異性抗体または多価多量体の開発の複雑さが軽減され、これは、製造、前臨床治験および臨床治験に単一分子が関与するためである。したがって、単一の二重特異性抗体または多価多量体に基づく治療は、より効果的な抗体治療を提供しながら、複雑さを低減しかつ対コスト効果の高い医薬品開発プロセスによって促進される。

【0004】

２つの重鎖および２つの軽鎖からなるＩｇＧフォーマットに基づく二重特異性抗体は、さまざまな方法で生成されている。例えば、二重特異性抗体は、２つの抗体分泌細胞株を融合させて新しい細胞株を作成するか、組換えＤＮＡ技術を用いて単一細胞で２つの抗体を発現させることによって生成できる。これらのアプローチは、各抗体のそれぞれの重鎖が、同じ特異性を有する２つの同一の対になった重鎖を含む単一特異性二量体（ホモ二量体とも称される）、および異なる特異性を有する２つの異なる対になった重鎖を含む二重特異性二量体（ヘテロ二量体とも称される）を形成し、かつハーフボディ（half body）と呼ばれる対になっていない重鎖または軽鎖が細胞産物の混合物になり得るため、複数の抗体種を得ることができる。さらに、各抗体の軽鎖および重鎖が無作為に対になって非機能性の組合せを形成することもある。重鎖および軽鎖のミス対形成として知られるこの問題は、二重特異性として発現させるために、共通の軽鎖を共有する抗体を選択することで対処できる。最近、出願人は、重鎖または軽鎖のいずれかであるが、好ましくは軽鎖が共通鎖である、３つ以上の重鎖および３つ以上の軽鎖を含む多価多量体を生成し得ることを示した。

【0005】

しかし、共通の軽鎖が用いられているときでも、ヘテロ二量体形成を促進する変異を含む２以上の重鎖および単一細胞内の１つの共通の軽鎖の発現により、３つの異なる抗体種およびハーフボディ不純物が生じ得る。Ｆｃ中の操作された残基変異を有する重鎖の発現は、ヘテロ二量体形成を促進する可能性があるが、依然として残りのハーフボディ、ホモ二量体を生成するか、または操作された変異のために安定性が低いヘテロ二量体を生成する可能性がある。二重特異性抗体の発現により、２つの単一特異性“親”抗体、および一致するＦｃ領域を含む二重特異性抗体が発現される場合もある。ハーフボディおよび／または単一特異性抗体の形成に従って、細胞発現システムの全体的な効率が低下し、目的の二重特異性抗体または多価多量体を分離するために、よりコストおよび時間がかかるプロセスを要することなり得る。したがって、単一の二重特異性抗体または多価多量体生成物が望まれる場合、目的の二重特異性抗体または多価多量体は、得られた混合物から精製される必要がある。

【0006】

二重特異性抗体または多価多量体を回収する必要性は、前臨床、臨床および商業生産の分野において重要である。親抗体および二重特異性抗体の混合物中の二重特異性抗体の割合をさらに増加させ、ミス対形成の重鎖および軽鎖の割合を減少させる技術が用いられてきたが、上記の欠点のいくつかを排除または最小化し、かつ生成される標的部分の量を増加させる二重特異性形態および多価多量体形態の必要性が残っている。二重特異性または多価多量体のヘテロ二量体化対形成の割合を向上させるための技術が当技術分野で以前に報告されているが、発現産物の混合物中に望ましくない不純物が残る可能性がある。さらに、二重特異性抗体または多価多量体であるヘテロ二量体化産物の分離は、分離手段および目的の標的部分の組成に応じて変わり、困難で、効率が悪く、またコストがかかる可能性がある。

【0007】

したがって、生物学的治療薬を生産および精製するための改善された技術および／または代替技術が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

開示の概要
本発明は、Ｉｇ様分子、二重特異性抗体および多価多量体などの生物学的治療薬を産生および精製するための新規手段を提供する。これは、例えば単一細胞によって生成された混合物中に複数のＣＨ３ドメインが存在するとき、目的の少なくとも２つのＣＨ３ドメイン間の相互作用を改善するための新規手段を提供する(例えば、ＷＯ２０１３１５７９５４およびＷＯ２０１３１５７９５３を参照のこと)。

【0009】

第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含む単離されたヘテロ二量体タンパク質が本明細書において提供され、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、かつ第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にさらなるアミノ酸変異体を含む。

【0010】

好適には、位置３６４のアミノ酸は、バリン、イソロイシン、トレオニン、グルタミンまたはロイシンであり得る。

【0011】

好適には、位置４０９のアミノ酸は、イソロイシン、ロイシンまたはグルタメートであり得る。

【0012】

好適には、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸であり得る。

【0013】

好適には、ヘテロ二量体タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＣＨ３領域を含み得る。

【0014】

好適には、ヘテロ二量体タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含み得る。要すれば、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含み得る。

【0015】

好適には、第１のＣＨ３含有ポリペプチドは抗体重鎖であり得る。

【0016】

好適には、第２のＣＨ３含有ポリペプチドは抗体重鎖であり得る。

【0017】

好適には、ヘテロ二量体タンパク質は、１以上の抗体軽鎖をさらに含み得る。

【0018】

好適には、抗体軽鎖は、共通の抗体軽鎖であり得る。

【0019】

本明細書に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物も提供される。

【0020】

本明細書に記載の第１および第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドをコードする単離核酸も提供される。

【0021】

本明細書に記載の単離核酸を含む組換え宿主細胞も提供される。

【0022】

第１および第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質を産生する方法もまた提供される。

【0023】

アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含む第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチド、およびアミノ酸変異体Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含む第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質の安定性を改善するための方法も提供され、ここで、該方法は、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０で第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドにアミノ酸変異体を導入することを含む。

【0024】

アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含む第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質の安定性を低下させる方法も提供され、この方法は、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０でアミノ酸変異を第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドに導入することを含む。

【0025】

第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質の収量を改善するための方法もまた提供され、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドはアミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０で第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドにアミノ酸変異を導入することを含む。

【0026】

第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質の純度を高めるための方法もまた提供され、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドはアミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドはアミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、該方法は、（ａ）位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０で第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドにアミノ酸変異を導入する工程；（ｂ）ヘテロ二量体タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに供する工程を含む。

【0027】

好適には、イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換クロマトグラフィーであり得る。

【0028】

好適には、位置３６４のアミノ酸は、バリン、イソロイシン、トレオニン、グルタミンまたはロイシンであり得る。

【0029】

好適には、位置４０９のアミノ酸は、イソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり得る。

【0030】

好適には、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸であり得る。

【0031】

好適には、ヘテロ二量体タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３領域を含み得る。

【0032】

好適には、ヘテロ二量体タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含み得る。場合により、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含み得る。

【0033】

好適には、第１のＣＨ３含有ポリペプチドは抗体重鎖であり得る。

【0034】

好適には、第２のＣＨ３含有ポリペプチドは抗体重鎖であり得る。

【0035】

好適には、ヘテロ二量体タンパク質は、１以上の抗体軽鎖をさらに含み得る。

【0036】

好適には、抗体軽鎖は、共通の抗体軽鎖であり得る。

【0037】

本明細書に記載の方法によって産生されるヘテロ二量体タンパク質も提供される。

【0038】

本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、用語“含む”および“含有する”、およびそれらの変形は、“含むが、これらに限定されない”ことを意味し、他の部分、添加剤、成分、数（integer）または工程を除外することを意図しない。

【0039】

本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈上別段の要求がない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、明細書は、単数だけでなく複数も考慮していると理解されるべきである。

【0040】

本発明の特定の面、態様または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学部分または基は、それらと両立しない場合を除き、本明細書に記載される何れかの他の面、態様または例に適用可能であると理解されるべきである。

【0041】

本発明の様々な面を以下でさらに詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0042】

図面の簡単な説明
以下の議論では、文字の後に数字が続く場合、これはＥＵ番号付けによる一次アミノ酸配列の残基番号の位置のアミノ酸を示す。たとえば、Ｋ３５１は位置３５１のリシンを示す。文字の後に数字が続き、別の文字が続く場合、これはＥＵ番号付けによる残基の本来の位置（例えば、野生型ヒトＦｃ）のアミノ酸と、その位置に操作される残基を示す（例えば、Ｋ４０９Ｓは、リシンが野生型Ｆｃの位置４０９に存在する場合、操作されたバリエーションはセリンであることを示す）。

【0043】

本発明の態様は、添付の図面を参照して以下にさらに説明される。

【0044】

【図1】図１：重鎖バリアントの発現に用いられるベクターマップ。

【図2】図２：Ｋ３６０バリアントのシングル（Ａ）およびダブル（Ｂ）トランスフェクションのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果。縮小されていないＳＤＳ－Ｐａｇｅに見られるバンドサイズは、１５０ＫＤａ （ＩｇＧ）に対応する。７５ＫＤａ（ハーフボディ）；５０ＫＤａ（重鎖）および２５ＫＤａ（軽鎖)。

【図3】図３：Ｓ３６４バリアントのシングル（Ａ）およびダブル（Ｂ）トランスフェクションのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果。縮小されていないＳＤＳ－Ｐａｇｅに見られるバンドサイズは、１５０ＫＤａ（ＩｇＧ）に対応する。７５ＫＤａ（半身）；５０ＫＤａ（重鎖）および２５ＫＤａ（軽鎖）。

【図4】図４：Ｋ４０９バリアントのシングルおよびダブルトランスフェクションのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果。縮小されていないＳＤＳ－Ｐａｇｅに見られるバンドサイズは、１５０ＫＤａ（ＩｇＧ）；７５ＫＤａ（ハーフボディ）；５０ＫＤａ（重鎖）および２５ＫＤａ（軽鎖）に対応する。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本明細書で引用される特許、科学文献および技術文献は、出願時に当業者が利用可能であった知識を確立する。発行済み特許、公開済みおよび係属中の特許出願、ならびに本明細書で引用されている他の刊行物の開示内容全体は、それぞれが引用により包含されることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、引用により本明細書に包含される。矛盾がある場合は、本明細書の記載が優先される。

【0046】

本発明を多様な観点から、以下にさらに詳細に説明する。

【0047】

詳細な説明
本発明は、二重特異性抗体または多価多量体などのヘテロ二量体ポリペプチドを製造する方法を提供する。また、単一細胞から生成されたＣＨ３ドメインポリペプチドの混合物からヘテロ二量体分子を生成するための改善された方法も提供する。対応するヘテロ二量体タンパク質、組成物、核酸および宿主細胞も本明細書で提供される。本発明は、高収量を有する主に（および特定の態様では、ほぼ独占的に）ヘテロ二量体ポリペプチドの生成、およびハーフボディまたはホモ二量体などの望ましくない種の低減を可能にする。本発明の方法は、ヘテロ二量体ポリペプチドのＣＨ３界面における変異に基づいて、ヘテロ二量体の安定性を高め、ホモ二量体形成を減少させる。方法および組成物の詳細は、本明細書に提供される。

【0048】

用語“ヘテロ二量体”、“ヘテロ二量体複合体”または“ヘテロ二量体分子”とは、本明細書中、互換的に用いられ、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子を意味し、ここで、第２のポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基が第１のポリペプチド由来のアミノ酸配列とは異なる。ヘテロ二量体は、第１および第２のポリペプチドによって形成される“ヘテロ二量体”を含み得るか、または第１および第２のポリペプチドに加えてポリペプチド類が存在する高次の三次構造を形成し得る。

【0049】

本明細書中に別段の記載がある場合を除き、用語“第１”ポリペプチドおよび“第２”ポリペプチド、ならびにそれらのバリエーションは、単に一般的な識別子であり、本発明のヘテロ二量体の特定の（a specific or a particular）ポリペプチドまたは成分を識別するものと解釈されるべきではない。

【0050】

目的の特定の抗体の形成を促進し、それによって得られる混合物中の望ましくない抗体または副産物の含有量を減少させるために、当技術分野では多様なアプローチが記載されている。

【0051】

抗体の場合、ＣＨ３－ＣＨ３相互作用がＦｃ二量体化の主要な推進要因であることはよく知られている（Ellerson JR., et al., J. Immunol 1976 (116) 510-517; Deisenhofer J. biochemistry 1981 (20) 2361-2370）。さらに、２つのＣＨ３ドメインが互いに相互作用するとき、“接触”残基（接触アミノ酸、界面残基または界面アミノ酸とも呼ばれる）を含むタンパク質－タンパク質界面で会合することがよく知られている。第１のＣＨ３ドメインの接触アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインの１以上の接触アミノ酸と相互作用する。接触アミノ酸は、一般的には、抗体の三次元構造において互いに５．５Å以内（好ましくは４．５Å以内）にある。１つのＣＨ３ドメイン由来の接触残基および別のＣＨ３ドメイン由来の接触残基の間の相互作用は、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、水介在水素結合、塩架橋またはその他の静電力、芳香族側鎖間の引力相互作用によるもの、ジスルフィド結合、または当業者に知られている他の力であり得る。ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン界面の接触アミノ酸側鎖の約３分の１が、ドメインの折り畳みおよび会合への寄与の大部分を占め得ることが以前に示された。他の（隣接する）アミノ酸残基がタンパク質－タンパク質界面における相互作用に影響を与え得ることがさらに想定され得る。

【0052】

抗体重鎖の二量体化を妨害するアプローチが、当技術分野で用いられてきた。ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利になるようにＣＨ３ドメインを操作する多くの手段が、当技術分野で記載されている。目的の特定の二重特異性抗体の生産のためのアプローチは、ＣＨ３－ＣＨ３界面内の接触残基の静電工学に基づいている。

【0053】

例えば、ＣＨ３－ＣＨ３界面内の接触残基の静電操作に基づく所定の二重特異性抗体または目的の多価多量体の産生のためのアプローチは、米国特許第９，２４８，１８２号；同第９，３５８，２８６号；同第９，２４８，１８２号；および、同第９，７５８，８０５号に記載されている。コンピューター計算モデリングおよび反復試験検証戦略を組み合わせて使用し、“ＤＥＫＫ”と呼ばれる新しい電荷対電荷（charge-to-charge）対形成構築物を特定し、電荷によるホモ二量体化を減らしながら、ヘテロ二量体形成を促進する静電相互作用を支持するために変更された電荷極性を導入することにより、接触残基を特定した。特に、Ｌ３５１Ｄ／Ｔ３６６Ｋペアでは、ヘテロ二量体が効率的に形成され、ホモ二量体はほとんど形成されなかった。さらなるコンピューター計算解析を用いて、ヘテロ二量体ＣＨ３界面のコアに追加の静電相互作用を導入し、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３６８Ｅ／Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６ＫバリアントまたはＤＥＫＫを生成し、高収率のヘテロ二量体形成を示した。さらに、凝集、アンフォールディング、およびインビボ半減期のレベルは、天然抗体のレベルと同様であった。ＤＥＫＫ二重特異性抗体の構造解析により、予想外の相互作用が明らかになった。コンピューター計算モデリングによって予測されるように、残基Ａｓｐ－３５１およびＧｌｕ－３６８は、反対側のＣＨ３ドメインの残基Ｌｙｓ－３６６と相互作用した。しかしながら、安定化塩橋相互作用を形成するＩｇＧ骨格の局所シフトの結果として、残基Ｌｙｓ－３５１は予想どおりＡｓｐ－３５１と相互作用しなかったが、残基Ｐｒｏ－３５２、Ｓｅｒ－３５４およびＧｌｕ－３５７との相互作用を形成した。これらの相互作用は、ヘテロ二量体分子の安定性を説明する可能性があり、新規の二重特異性抗体の開発にとって非常に魅力的なプラットフォームとなる。

【0054】

本発明は、二重特異性抗体または多価多量体のＣＨ３界面内に変異アミノ酸残基を含むヘテロ二量体二重特異性抗体または多価多量体に基づいており、これは、以前に記載されたＤＥＫＫ変異アミノ酸残基と組み合わせて、またはノブインホール（knob-in-hole）もしくはＦｃ（ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）の電荷操作などの、当技術分野で以前に説明されているヘテロ二量体化を促進する他の手段と組み合わせて使用できる。例えば、上記のＤＥＫＫ技術を使用し、ＤＥ変異ならびにＫ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９の位置にさらなるアミノ酸残基変異を含む重鎖内に含めることにより、ヘテロ二量体対合が生成される効率をホモ二量体対合（例えば、ＤＥＤＥ ＣＨ３対形成）と比較してさらに改善することが可能である。

【0055】

さらに、所望のヘテロ二量体を含む２つの重鎖アームのうち１つの過剰発現の条件では、これにより、そのようなアームのホモ二量体が生成され得る。たとえば、条件によっては、ＤＥＫＫヘテロ二量体操作が用いられるとき、ＫＫ鎖の量に対するＤＥ鎖の過剰発現により、ＤＥＤＥホモ二量体が生成され得る。位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９（本明細書に記載）での変異の使用により、ホモ二量体の不安定化が可能になり、ハーフボディまたは単一の重鎖アーム（例えば、ＤＥＤＥホモ二量体ではなくＤＥ鎖）が生成され、より単純で効率的な精製工程、および二重特異性抗体または多価多量体との混合物に存在するとき、その分子をテストするアッセイでの干渉が少なくなる。

【0056】

さらに、ハーフボディの生成は、ホモ二量体とは対照的に、ゲル濾過による試験に用いられるタンパク質バッチでより容易に分離されるため、ホモ二量体よりも好まれる。さらに、ハーフボディは、ホモ二量体およびヘテロ二量体のピークと比較して、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）でのピークの分離が大きくなる傾向があり、純粋な二重特異性または多価多量体に関連する保持の選択が容易になる。

【0057】

本明細書に記載のアミノ酸変異の１以上の別の特徴は、そのような変異がヘテロ二量体の形成、安定性を促進し、および／またはホモ二量体を不安定化し、それによって発現システムの全体的な効率を高めることである。

【0058】

一面では、本明細書に記載の発明は、２つのＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体分子（例えば、二重特異性抗体または多価多量体）を作製する方法を提供し、ここで、１つのＣＨ３ドメインは、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９にＣＨ３変異体残基を含み、前記方法は、宿主細胞中に以下を提供することを含む：
第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第１の核酸、および
第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第２の核酸、
ここで、第１の核酸は、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９でＣＨ３ドメインバリアント残基の１以上をコードし、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸の発現を可能にし、培養物から前記ヘテロ二量体分子を回収する工程をさらに含む。

【0059】

別の面では、本明細書に記載の発明は、単一の宿主細胞から少なくとも２つの異なるＩｇ様分子を含むヘテロ二量体分子（例えば、二重特異性抗体または多価多量体）を産生する方法を提供し、前記２つのＩｇ様分子のそれぞれは、界面を形成できる２つのＣＨ３ドメインを含み、各ヘテロ二量体分子のＣＨ３ドメインは、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９にＣＨ３ドメイン変異体残基の１以上を含み、前記方法は宿主細胞中に以下を提供することを含む：
ａ）第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第１の核酸、
ｂ）第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第２の核酸、
ｃ）第３のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第３の核酸、および
ｄ）第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第４の核酸、
ここで、前記核酸の少なくとも２つは、前記第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインとの優先的な対合のための手段を備え、前記第１のＣＨ３ドメインをコードする核酸は、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９にＣＨ３ドメイン変異残基を含み、前記第３のＣＨ３ドメインをコードする核酸は、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９に１以上のＣＨ３ドメイン変異残基を含み、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記少なくとも４つの核酸の発現を可能にし、前記培養物から前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子を回収する工程をさらに含む。

【0060】

別の面は、前記第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的な対合の手段が、前記第３および第４のＣＨ３ドメインの優先的な対合の手段と異なる、上記の発明を含む。

【0061】

別の面では、本明細書に記載の発明は、位置３５１および位置３６８にそれぞれＤＥをさらに含む、第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第１の核酸、および、位置３５１および位置３６６にＫＫを含む、第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を提供し、ここで、前記の位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９のＣＨ３ドメイン変異残基の１以上が、第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖上に存在し、位置３５１および位置３６８にＤＥをさらに含む。

【0062】

別の面では、本明細書に記載の発明は、ヘテロ二量体化を促進する相補的変異を含む第２の核酸によってコードされる第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する変異を含む、第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を提供し、ここで、前記第１の核酸は、１以上のＣＨ３ドメイン変異体残基（位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９）をさらにコードする。

【0063】

“陽イオン交換樹脂”という語句は、負に帯電し、固相上または固相を通過する水溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有する固相を意味する。電荷は、１以上の荷電リガンドを固相に結合することによって、例えば共有結合によって提供できる。あるいは、またはさらに、電荷は、（例えば、全体的に負電荷を有するシリカの場合のように）固相の固有の特性であり得る。

【0064】

本明細書で用いる用語“宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）”とは、抗体産生源、つまり宿主細胞に由来するタンパク質である、ヘテロ二量体ポリペプチド（例えば、二重特異性抗体または多価多量体）などの組換え細胞産物とは異なるタンパク質を意味する。治療薬として使用できる二重特異性抗体の場合、元の抗体剤からＨＣＰを除去することが好ましい。本明細書で用いる表現“除去される宿主細胞タンパク質”とは、目的の産物または標的分子、例えば、精製される二重特異性抗体または多価多量体を除くすべての不純物を含むことを意味し、宿主細胞タンパク質自体に加えて、宿主細胞由来のＤＮＡおよび細胞増殖因子を含むことを意味する。したがって、宿主細胞のタンパク質を除去すると、標的分子の純度を顕著に高めることができる。

【0065】

例えば、疾患プロセスに関与する複数の生物学的経路または病原体の侵入、複製および／または拡散をより効率的に妨害するために、複数のヘテロ二量体タンパク質を産生することがしばしば望まれる。

【0066】

複数のヘテロ二量体タンパク質の混合物もまた、特定の疾患の処置に特に有用である。たとえば、腫瘍細胞は、抗体または低分子薬による処置中に耐性を発達させるために、さまざまな戦略を用いる。耐性には、複数の細胞表面受容体および可溶性分子が関与している可能性があり、そのような疾患および回避に関連する複数のメカニズムに同時に対処する、癌に対する抗体ベースの治療法を開発することは有益であると考えられている。そのような疾患および回避に関連するメカニズムが２つ以上関与している場合、ヘテロ二量体タンパク質の二重特異性多価多量体または混合物は、革新的で魅力的な治療形式を提供し得る。好ましくは、ヘテロ二量体タンパク質のそのような混合物は、単一細胞によって産生されて、規制の観点からより複雑ではなく、医薬品製造および臨床開発の観点から対費用効果が高く、実現可能な医薬品開発プロセスを促進する。単一細胞ベースのアプローチでは、二重特異性抗体の制御された効率的な産生を可能にする方法を使用することが望ましく、したがって、二重特異性ＩｇＧポリペプチドの所望の混合物を望ましくない単一特異性ＩｇＧポリペプチドから分離する必要性を低減または完全に排除することもある。先行技術では、単一特異性および二重特異性抗体の混合物が単一細胞によって産生されてきたが（ＷＯ２００４／００９６１８）、これらの混合物は、いくつかの異なる二重特異性抗体および単一特異性抗体種の複雑な混合を表す。本発明のさらなる目的は、単一細胞においてヘテロ二量体タンパク質（例えば、二重特異性抗体）の定義された混合物を産生するための手段および方法を提供することである。好ましくは、単量体副産物の量に関係なく、二量体ＩｇＧポリペプチドの少なくとも９５％、少なくとも９７％または９９％を超える割合の（二重特異性）抗体の混合物をもたらす方法が提供される（本明細書を参照のこと）。一般的には、複数の無傷のＩｇＧポリペプチドが産生される細胞では、当技術分野で知られているサイズ排除クロマトグラフィーによって簡単に除去できるハーフポリペプチド（単量体副産物）が存在し得る。

【0067】

一態様では、本発明は、目的の単一の（二重特異性）抗体の代わりに、定義されたヘテロ二量体ポリペプチド（例えば、二重特異性抗体または多価多量体）または少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の混合物を単一細胞で産生する方法を提供する。他の望ましくない二量体抗体種の形成が減少するか、または存在しない場合、好ましくは発現産物のハイスループットスクリーニングを使用する状況において、ＣＩＥＸ精製の使用が非現実的であり、ハーフボディとは対照的にホモ二量体の存在が、実験プロトコールを大幅に混乱させ、実験結果をゆがめ得る。ホモ二量体の軽減または除去は、ＣＨ３界面（Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９の位置）に変異を導入することによって達成される。これは、ＣＨ３ドメインのようなドメインの反発を高め、異なるＣＨ３ドメインの引力を増加させ得る。

【0068】

これらの変異は、ＤＥＫＫ ＣＨ３技術を用いて、ＤＥ鎖に導入され得る。あるいは、これらの変異は、例えばＦｃ（例えば、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）のノブインホール（knob-in-hole）または電荷工学など、同一の重鎖のペアリング（ホモ二量体形成）よりも異なる重鎖の優先的なペアリング（ヘテロ二量体形成）を促進する他のヘテロ二量体化技術で導入できる。得られた混合物は明確に定義されており、その組成はＣＨ３ドメイン変異の設計によって制御されている。

【0069】

さらに、発現レベルおよび／または発現に用いられる異なるトランスフェクション比の調節は、混合物の組成に影響を与える。本発明による方法では、第１の核酸は、第２の核酸によってコードされるＣＨ３ドメインと優先的に対合するＣＨ３ドメインをコードするか、または第１の核酸は、第２の核酸によってコードされるＣＨ３ドメインと優先的に対合するＣＨ３ドメインをコードし、そして第３の核酸は、第４の核酸によってコードされるＣＨ３ドメインと優先的に対合するＣＨ３ドメインをコードする。本発明はまた、本発明の方法によって得られる少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の混合物を提供する。

【0070】

本明細書で用いる用語“前記第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的な対形成”とは、第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドおよび／または第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドを含む得られる二量体が、１つの第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドと対合した１つの第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドからなる二量体であり、別の第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドと対合した第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドおよび別の第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドと対合した第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドとを含む二量体の形成が制限されている、二量体を得ることを意味する。同様に、用語“第３および第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的な対形成”とは、第３のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドおよび／または第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドを含む得られる二量体が、１つの第4のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドと対合した１つの第３のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドからなる二量体であって、別の第３のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドと対合した第３のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド、および別の第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドと対合した第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドを含む二量体の形成が制限されている、二量体を得ることを意味する。その結果、４つの異なる（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を単一細胞に導入すると、１０の異なるＩｇ様二量体（ＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＣＣ、ＣＤおよびＤＤ）の混合物の代わりに、主に２つの二重特異性Ｉｇ様分子の混合物が生成される。本明細書に記載された変異形を用いる当業者は、この技術を用いて他の所望の組合せも生成できることを理解し得る。

【0071】

本発明による方法において、上記のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖のそれぞれは、好ましくは、標的エピトープを認識する可変領域、または２以上の可変領域をさらに含む。ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖の一部である可変領域は、好ましくは共有され、共通の軽鎖と対になる。その場合、可変領域のＶＨのみが異なる一方、すべての可変領域のＶＬは本質的に同じである。したがって、一面では、共通軽鎖をコードする核酸を前記宿主細胞に提供することをさらに含む、本発明による方法が提供される。一態様では、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖の各可変領域は、異なる標的エピトープを認識する。一態様では、ポリペプチド鎖を含む４つのＣＨ３ドメインの前記４つの可変領域のそれぞれが、異なる標的エピトープを認識する。例えば、第１の核酸が、抗原Ａに対する特異性を有する可変ドメインをさらに含む重鎖をコードする場合、第２の核酸は、抗原Ｂに対する特異性を有する可変ドメインをさらに含む重鎖をコードし、第３の核酸は、抗原Ｃに対する特異性を有する可変ドメインをさらに含む重鎖をコードし、第４の核酸は、抗原Ｄに対して特異性を有する可変ドメインをさらに含む重鎖をコードし、そして、ＡＢに特異的な二重特異性Ｉｇ様分子およびＣＤに特異的な二重特異性Ｉｇ様分子を含む混合物が生成される。単一特異性抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣまたはＤＤ特異性を有する）あるいはＡＣ、ＡＤ、ＢＣまたはＢＤに対する特異性を有する二重特異性抗体の形成は、前記第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドおよび前記第３および第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドを含むドメインの優先的な対形成のための手段により、低下するかまたは存在しないことさえある。これは、第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド、ならびに第３および第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドに対して異なるヘテロ二量体化操作が用いられる場合に生じる。もちろん、２つ以上の異なるＩｇ様分子（例えば、ＡＢおよびＣＤ）を含む定義された混合物を生成するために、例えば第５および第６のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドをコードするさらなる核酸を使用することも可能である。

【0072】

あるいは、前記の抗原ＡおよびＢに対する特異性を有する可変ドメインを含む重鎖は、リンカーを介して結合され、それによって多価多量体を形成する、抗原ＣまたはＤに対する特異性を有する追加の可変ドメインを含み得、ここで、重鎖ＡおよびＢは、ＤＥＫＫなどのヘテロ二量体化操作を介して二量体化し得、ホモ二量体は、１つの重鎖に上記の変異を含めることで低減され、ホモ二量体形成を不安定化し、ハーフボディを生成する。

【0073】

注目すべきことに、本発明による方法で用いる核酸の比率は１：１：１：１である必要はなく、発現される得られたＩｇ様分子の比率は１：１である必要はない。最適化された比率で抗体の混合物を生成するために、当技術分野で知られている手段を用いることが可能である。例えば、核酸の発現レベル、したがって産生される結果として生じるＩｇ様分子の比率は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどのさまざまな遺伝要素を使用することによって、または抗体をコードするＤＮＡ構築物のコピー数のゲノム統合部位を制御することによって調節できる。好ましくは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅならびに変異残基を位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０に含む、発現される第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの量は、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋ第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの量よりも高い。好ましくは、第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドに対する第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドの重量比は、１：１～１０：１である。より好ましくは、ＤＥ含有ポリペプチドの量は、１：１と５：１の間、より好ましくは１．１と３：１の間、または１：１と２：１の間である。

【0074】

本発明の一面は、本発明による方法を提供し、ここで、前記第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的対合のための前記手段は、前記第３および第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的対合のための前記手段とは異なる。“異なる”とは、ポリペプチドを含む第１および第２のＣＨ３ドメインの優先的な対合のための手段が、第１および第２の鎖の優先的な対合が有利になるように設計されることを意味する。設計は、ポリペプチド鎖を含む第１および第３および／または第４のＣＨ３ドメイン間の相互作用が本質的に起こらないようなものである。換言すれば、ポリペプチドを含む前記第１のＣＨ３ドメインと前記第３または第４のポリペプチドとの間の二量体化は、本質的にゼロまで減少するなどである。第３および第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドは、野生型であってもよく、または第１および第２のＣＨ３ドメインの優先的な対合のための手段とは異なる優先的な対合のための手段を含んでもよい。

【0075】

本発明は、混合物中の二重特異性抗体の割合が高い、Ｉｇ様分子の明確に定義された混合物の効率的かつ制御された産生のための方法を提供する。少なくとも９５％、少なくとも９７％、またはそれ以上の割合の（２つの）二重特異性が、２つの二重特異性が望まれる系で得られる。これは、最大でも５％、最大でも３％以下の単一特異性二価副産物しか得られないことを意味する。これらの半分子（half-molecule）はサイズの違いを利用して二量体から容易に分離され、たとえば受容体を架橋できないため、単量体の副生成物である半分子の量はそれほど重要ではないことが特記される。したがって、本明細書に記載の発明は、二重特異性抗体の発現時に、二重特異性抗体の安定性を維持しながらハーフボディを支持してホモ二量体の産生を軽減し、二重特異性の精製を容易にし、かつ所望の二重特異性抗体のハイスループットスクリーニングおよびアッセイと干渉するホモ二量体を軽減する、重鎖アームにおけるＣＨ３変異体の使用を提供する。好ましくは、ＣＨ３ドメインで提供される本発明の変異体は、ホモ二量体副産物の量を軽減し、ヘテロ二量体標的分子の形成を増強し、産生されるハーフボディの量を低減し、それによって発現系の全体的な効率を高め、ＨＣＰからの標的分子の下流の分離を容易にする。

【0076】

別の態様では、ポリペプチド鎖を含む第１および第２のＣＨ３ドメインの可変領域は、異なる標的エピトープを認識するが、ポリペプチド鎖を含む第３および第４のＣＨ３ドメインの可変領域は、同じ標的エピトープを認識する。これにより、１種の二重特異性Ｉｇ様分子および１種の単一特異性Ｉｇ様分子が主に産生される。例えば、ポリペプチド鎖を含む第１および第２のＣＨ３ドメインの可変領域が異なる標的エピトープを認識する場合、およびポリペプチド鎖を含む第３および第４のＣＨ３ドメインの可変領域が両方とも、第１および第２のＣＨ３ドメインによって認識される標的エピトープとは異なる同じ標的エピトープを認識する場合、ＡＢまたはＣＣに対する特異性を有するＩｇ様分子の混合物が形成される。したがって、ポリペプチド鎖を含む第３および第４のＣＨ３ドメインの可変領域によって認識される標的エピトープが同じであるが、ポリペプチド鎖を含む第１または第２のＣＨ３ドメインの可変領域によって認識される標的エピトープとは異なる、本発明による方法がさらに提供される。

【0077】

あるいは、ポリペプチド鎖を含む第１および第２のＣＨ３ドメインの可変領域が異なる標的エピトープを認識するとき、およびポリペプチド鎖を含む第３および第４のＣＨ３ドメインの可変領域が両方ともポリペプチド鎖を含む第１または第２のＣＨ３ポリペプチドと同じエピトープを認識するとき、ＡＢおよびＡＡ、またはＡＢおよびＢＢに対する特異性を有するＩｇ様分子の混合物が形成される。したがって、ポリペプチド鎖を含む第３および第４のＣＨ３ドメインの可変領域によって認識される標的エピトープが、ポリペプチド鎖を含む第１または第２のＣＨ３ドメインの可変領域によって認識される標的エピトープと同じである、本発明による方法が、本明細書でも提供される。

【0078】

いくつかの態様では、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドは、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ポリペプチドである。本明細書で用いる用語“Ｉｇ様ポリペプチド”とは、少なくとも１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを有するタンパク質部分を意味する。前記Ｉｇ様ポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンＣＨ３ドメインの機能を含む配列を含み、好ましくは、配列はＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。少なくともＣＨ３ドメインを有するタンパク質部分は、特異的結合部分をさらに備え得る。したがって、優先的対合のための手段を含む本発明のＣＨ３ドメインは、所望のヘテロ二量体結合分子または結合分子の混合物を設計するために、タンパク質部分を含む２つのＣＨ３ドメインの優先的対合に使用できる。タンパク質部分を含むＣＨ３ドメインに操作できる結合部分は、単鎖Ｆｖ、単鎖またはタンデムダイアボディ(TandAb(登録商標))、ＶＨＨ、Anticalins(登録商標)、Nanobodies(登録商標)、ＢｉＴＥ(登録商標)、Ｆａｂ、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ(登録商標)、Avimers(登録商標)、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Adnectins(登録商標)、Affilins(登録商標)、Trans-bodies(登録商標)、Affibodies(登録商標)、TrimerX(登録商標)、MicroProteins、Fynomers(登録商標)、Centyrins(登録商標)またはＫＡＬＢＩＴＯＲ(登録商標)を含むが、これに限定されない、何れかの結合剤であり得る。一態様では、結合部分は抗体可変領域（ＶＨ／ＶＬの組合せ）である。ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖の一部である可変領域は、共通の軽鎖を共有することが好ましい。その場合、可変領域のＶＨのみが異なるが、すべての可変領域のＶＬは本質的に同じである。

【0079】

あるいは、またはそれに加えて、サイトカイン、ホルモン、可溶性リガンド、受容体および／またはペプチドを含む他のポリペプチドを本発明のＣＨ３ドメインに対して操作できる。

【0080】

一態様では、前記Ｉｇ様ポリペプチドは、全長Ｆｃ骨格を含む。別の態様では、Ｉｇ様ポリペプチドは抗体である。これらの抗体の可変領域は、共通の軽鎖を共有することが好ましいが、ＶＨ領域が異なっていてもよい。本明細書で用いる用語“抗体”とは、免疫グロブリンクラスのタンパク質に属するタンパク質分子を意味し、抗原上のエピトープに結合する１以上のドメインを含み、そのようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか、またはそれと配列相同性を共有する。抗体は当技術分野で知られており、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭなどのいくつかのアイソタイプが含まれる。本発明による抗体は、これらのアイソタイプのいずれか、またはこれらの機能的誘導体および／またはフラグメントであり得る。一態様では、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＥアイソタイプの抗体であるＩｇ様分子が産生される。一態様では、ＩｇＧ抗体は、例えば、他のアイソタイプの抗体と比較してより長い半減期を有するため、ＩｇＧアイソタイプの抗体であるＩｇ様分子が産生される。

【0081】

本発明による方法で産生される抗体は、マウス、ニワトリなどの鳥類、およびヒトの配列を含む何れかの起源の配列を有し得る。抗体は、完全ヒト抗体のように１つの起源のみからの配列で構成される場合もあれば、２以上の起源の配列を有する場合もあり、たとえばキメラ抗体またはヒト化抗体になる。抗体の結合は、特異性および親和性で表すことができる。特異性は、どの抗原またはそのエピトープが結合ドメインによって結合されるかを決定する。親和性は、特定の抗原またはエピトープへの結合の強さの尺度である。本明細書において用いる用語“抗原”とは、抗体の抗原結合部位によって結合され得る物質または分子を意味する。また、抗原の混合物は“抗原”と見なすことができる。当業者は、腫瘍細胞の溶解物またはウイルス粒子が“抗原”として示され得ることを理解し得るが、そのような腫瘍細胞溶解物またはウイルス粒子調製物には、多くの抗原決定基が存在する。抗原は、少なくとも１つ、しばしばそれ以上のエピトープを含む。本明細書で用いる用語“エピトープ”とは、免疫系、特に抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞によって認識される抗原の一部を意味する。

【0082】

用語“ＣＨ３ドメイン”とは、当技術分野で周知である。ＩｇＧ構造には、２つの軽鎖および２つの重鎖の４つの鎖があり、各軽鎖には可変軽鎖および定常軽鎖（ＶＬおよびＣＬ）の２つのドメインを有し、各重鎖には可変重鎖（ＶＨ）および３つの定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）の４つのドメインを有する。重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン領域は、Ｆｃ（結晶化可能フラグメント）部分、Ｆｃフラグメント、Ｆｃ骨格または単にＦｃと呼ばれる。ＩｇＧ分子は、ヒンジ領域でジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）によって結合された２つの重鎖、および－Ｓ－Ｓ－ジスルフィド結合を介して重鎖に結合した２つの軽鎖を有するヘテロ四量体である。重鎖は、ＣＨ３－ＣＨ３ドメイン界面での相互作用およびヒンジ領域での相互作用などを介して二量体化する。ヒンジジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのサブクラスによって異なる（Papadea and Check 1989）。免疫グロブリン分子のＦｃフラグメントは、重鎖の２つのＣ末端定常領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの二量体である。その生理学的機能には、補体系との相互作用、およびさまざまな細胞の表面にある特定の受容体との相互作用がある。２つの個々の重鎖のＣＨ３ドメイン間の相互作用は、重鎖の二量体化を促進する上で重要な役割を果たすことが知られている。したがって、ＣＨ３ドメインは、抗体重鎖の結合を指示する（Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370; Miller S., J. Mol. Biol. 1990(216)965-973; Padlan, Advances in Protein Chemistry 1996 (49) 57-133）。したがって、本発明のＣＨ３変異体を他の抗体ドメインと組み合わせて用いて、二重特異性または単一特異性のいずれかである完全長抗体を生成できる。ＶＨ／ＶＬの組合せによって定義される抗体の特異性は、通常、ＣＨ３ドメインによって駆動される重鎖の二量体化挙動には影響しない。

【0083】

ＣＨ３－ＣＨ３界面内の接触残基は、荷電しているアミノ酸か、または生理学的条件で中性であるアミノ酸残基の何れかである。本明細書で用いる用語“荷電アミノ酸残基”または“荷電残基”とは、荷電側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。これらは、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）およびリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）に存在する可能性のある正に帯電した側鎖、またはアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）に存在する可能性のある負に帯電した側鎖の何れかである。本明細書で用いる用語“中性アミノ酸残基”または中性残基とは、荷電側鎖を持たない他のすべてのアミノ酸を意味する。これらの中性残基には、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｕ、Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｔ）が含まれる。

【0084】

用語“ＣＨ３－ＣＨ３ドメインインターフェース”、または“ＣＨ３インターフェース”、“ＣＨ３－ＣＨ３対合”、“ドメインインターフェース”、または単に“インターフェース”とは、本明細書で用いられるとき、別個のＣＨ３ドメインの２つのＣＨ３ドメイン間の関連を意味する。第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸および第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸との間の少なくとも１つの相互作用を含む、アミノ酸残基の相互作用の結果であるポリペプチドを含む。このような相互作用は、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、水介在水素結合、塩橋または他の静電気力、芳香族側鎖間の引力相互作用、ジスルフィド結合の形成、または当業者に知られている他の力によるものである。

【0085】

本発明はさらに、少なくとも２つの異なるＩｇ様ポリペプチドを産生するための宿主細胞を作製する方法を提供し、この方法は、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸配列を前記宿主細胞に導入する工程を含み、ここで、前記核酸配列の少なくとも２つが、前記第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的な対合のための手段を備え、前記核酸配列が連続的または同時に導入される。同様に、宿主細胞は、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を前記宿主細胞に既に導入している場合があり、ここで、可変領域をコードする核酸は、宿主細胞が異なるヘテロ二量体分子の産生のための異なる可変領域の組み込みのためのマスター細胞として使用できるように、ＣＨ３ドメインをコードする核酸に隣接して組み込まれており、ここで、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメインをコードする前記核酸配列の少なくとも２つは、前記第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的な対形成の手段を提供する。

【0086】

本発明のさらなる面は、ヘテロ二量体ポリペプチドを産生するための宿主細胞を作製する方法を提供することであり、この方法は、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を前記宿主細胞に導入する工程を含み、ここで、前記第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、正に帯電したアミノ酸残基を含み、野生型ＣＨ３は、一般的にはその位置に中性アミノ酸残基を有し、前記第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、負に帯電したアミノ酸を含み、ここで、野生型ＣＨ３は一般的にはその位置に中性アミノ酸残基を有し、前記核酸配列は連続的または同時に導入される。前記宿主細胞を作製する前記方法は、好ましくは、共通軽鎖をコードする核酸配列を前記宿主細胞に導入する工程をさらに含むか、あるいは、前記方法は、前記核酸配列を、共通の軽鎖をコードする核酸配列を既に有する宿主細胞に一過性に組み込む工程、しかし好ましくは安定して宿主細胞に組み込む工程をさらに含む。

【0087】

ポリペプチド鎖を含む少なくとも第１、第２、第３および第４のＣＨ３ドメインをコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞も本明細書にて提供され、前記核酸の少なくとも２つは、第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドならびに前記第３および第４のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドの優先的な対合のための手段を備えている。

【0088】

本発明はさらに、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞を提供し、ここで、前記第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、野生型ＣＨ３が通常その位置に中性アミノ酸残基を有する正電荷アミノ酸残基を含み、前記第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、野生型ＣＨ３が通常その位置に中性アミノ酸残基を有する負電荷アミノ酸残基を含む。

【0089】

本発明による組換え宿主細胞は、共通の軽鎖をコードする核酸をさらに含み得る。

【0090】

本発明による“宿主細胞”は、組換えＤＮＡ分子を発現可能な何れかの宿主細胞であってよく、例えば、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）、エンテロバクター、サルモネラ、バチルス、シュードモナス、ストレプトミセスなどの細菌、出芽酵母、乳糖資化性酵母（K.lactis）、ピキア酵母（P.pastoris）、カンジダ（Candida）または油糧酵母（Yarrowia）などの酵母、アカパンカビ（Neurospora）、ニホンコウジカビ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニデュランスおよびアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌、Spodoptera frugiperda ＳＦ－９またはＳＦ－２１細胞などの昆虫細胞、および好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ－０ミエローマ細胞を含むマウス細胞、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞などの霊長動物細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ ３ Ａ細胞、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化初代細胞など細胞、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０などのヒト細胞、またはＰＥＲ. Ｃ６などの胚性網膜細胞であり得る。多くの場合、最適な発現系には、抗体が適切にグリコシル化され得るように、哺乳動物細胞発現ベクターおよび宿主が含まれ得る。ヒト細胞株を用いて、完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体を得ることができる。細胞の成長または増殖の条件（例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)を参照）と組換え産物の発現の条件は多少異なる場合があり、プロセスの最適化は通常、当業者に一般的に知られている方法に従って、互いに対する細胞の比率および／または増殖を増やすために行われる。一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、および実用的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler編、IRL Press、1991年）に記載されている。組換え宿主細胞における抗体の発現は、当技術分野で広く発表されている。軽鎖および重鎖をコードする核酸は、染色体外コピーとして存在し、および／または宿主細胞の染色体に安定に組み込まれ得る。

【0091】

本発明のさらなる面は、本発明による組換え宿主細胞の培養物、または本発明による方法によって取得可能または取得された組換え宿主細胞の培養物を提供することであり、前記培養物は、１以上のヘテロ二量体ポリペプチドを産生する。

【0092】

ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るために、そのような発現を駆動できる配列を、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結できることが当業者に周知である。機能的に連結されているとは、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドまたはその前駆体をコードする核酸配列が、発現を駆動できる配列に連結され、これらの配列がＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドまたはその前駆体の発現を駆動できるようにすることを意味する。有用な発現ベクターは、当技術分野で入手可能であり、例えば、InvitrogenのｐｃＤＮＡベクターシリーズである。目的のポリペプチドをコードする配列が、コードされたポリペプチドの転写および翻訳を支配する配列に関して適切に組み込まれる場合、得られる発現カセットは、発現と呼ばれる目的のポリペプチドを生成するのに有用である。発現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、およびそれらの組合せが含まれ得る。これらは宿主細胞内で機能できなければならず、それによってそれらに機能的に連結された核酸配列の発現を駆動する。プロモーターは構成的または調節的であり、ウイルス、原核生物または真核生物の供給源を含むさまざまな供給源から取得するか、または人工的に設計できる。目的の核酸の発現は、天然のプロモーターまたはその誘導体から、または完全に異種のプロモーターからであり得る。真核細胞における発現のためのいくつかのよく知られており、多く使用されているプロモーターは、アデノウイルスなどのウイルスに由来するプロモーター、例えばＥ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーターなど、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などである。適切なプロモーターは、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１ａ（ＥＦ－１ａ）プロモーター、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどの真核細胞に由来してもよい。宿主細胞において目的の配列の発現を駆動できる何れかのプロモーターまたはエンハンサー／プロモーターが、本発明において適切である。一態様では、発現を駆動できる配列は、ＣＭＶプロモーター由来の領域、好ましくはＣＭＶ前初期遺伝子エンハンサー／プロモーターのヌクレオチド－７３５～＋９５を含む領域を含む。当業者は、本発明で用いる発現配列が、インスレーター（insulator）、マトリックス結合領域、ＳＴＡＲ要素（ＷＯ０３／００４７０４）などの発現を安定化または増強できる要素と適切に組み合わされ得ることを認識し得る。これにより、発現の安定性および／またはレベルが向上し得る。

【0093】

組換え宿主細胞におけるタンパク質産生は、例えば、Current Protocols in Protein Science, 1995, Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8; Bendig, 1988に広く記載されている。細胞の培養は、細胞が代謝および／または増殖および／または分裂および／または目的の組換えタンパク質を産生できるようにするために行われる。これは、当業者に周知の方法によって達成でき、細胞に栄養素を提供することを含むが、これに限定されない。この方法は、表面に付着する増殖、懸濁液中での増殖、またはそれらの組合せを含む。タンパク質産生収量を最適化するために、当技術分野で周知の方法によっていくつかの培養条件を最適化できる。培養は、バッチ、流加、連続システム、中空繊維などを用いて、例えば皿、フラスコ、ローラーボトルまたはバイオリアクターで行うことができる。細胞培養による組換えタンパク質の大規模（連続的）生産を達成するために、懸濁液中で増殖できる細胞が用いられ、細胞は、動物由来またはヒト由来の血清または動物由来またはヒト由来の血清成分の不存在下で培養できる。したがって、培養培地に由来する追加の動物またはヒトタンパク質が存在しないため、精製が容易で安全性が向上し、また、合成培地は再現性が最も優れているため、システムの信頼性も非常に高くなる。

【0094】

免疫グロブリン様ポリペプチドは、宿主細胞で発現され、当業者に一般的に知られている方法によって、細胞から、または好ましくは細胞培養培地から採取される。採取後、これらのＩｇ様ポリペプチドは、当技術分野で知られている方法を用いて分離され得る。そのような方法には、沈殿、遠心分離、濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが含まれ得る。ＩｇＧポリペプチドを含む抗体の混合物については、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを適切に使用できる（例えば、米国特許第４，８０１，６８７号および同第５，１５１，５０４号を参照のこと）。

【0095】

アフィニティークロマトグラフィーを用いた捕捉に次いで、ホモ二量体、電荷変異体、ＨＣＰおよびＤＮＡを含む可能性のある残りのプロセス関連不純物を除去するために、直交的精製(orthogonal polishing)工程が用いられる。一般に、分離された二重特異性抗体または多価多量体を得るには、宿主細胞の培養、収穫の清澄化、その後のタンパク質の捕捉、宿主細胞のＤＮＡの除去を含む、陰イオン交換クロマトグラフィー、その後ＣＩＥＸを使用した宿主細胞タンパク質、浸出されたプロテインＡおよび潜在的な凝集体の除去などの手順が行われ、続いて、ウイルスろ過などの追加の手順が行われる。当業者は、そのような工程の順序が変更され得るか、または個々の工程が置換または除去され得ることを承知している。例えば、第２の精製（polishing）工程の代替法には、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーが含まれる。

【0096】

本発明による方法で産生される免疫グロブリン様ポリペプチドおよび／またはその混合物は、好ましくは共通の軽鎖を有する。したがって、共通軽鎖をコードする核酸を前記宿主細胞に提供することをさらに含む、本発明による方法がさらに提供される。これは、少なくとも２つの異なる重鎖と対合でき、それによって機能的な抗原結合ドメインを形成できる軽鎖である。機能的抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合できる。一態様では、本発明による方法で生成されたすべての重鎖と対合できる共通の軽鎖が用いられ、それによって機能的な抗原結合ドメインが形成されるため、不一致の重鎖および軽鎖のミスペアリングが回避される。一面では、１つの同一のアミノ酸配列を有する共通の軽鎖のみが用いられる。あるいは、当業者は、“共通”が、アミノ酸配列が同一でない軽鎖の機能的等価体も意味することを認識し得る。機能的結合領域の形成に実質的に影響を及ぼさない突然変異（欠失、置換、付加）が存在する、前記軽鎖の多くの変異体が存在する。したがって、そのような変異体は、異なる重鎖に結合し、機能的な抗原結合ドメインを形成することもできる。したがって、本明細書で用いる用語“共通軽鎖”とは、重鎖との対合後に生じる抗体の結合特異性を保持しながら、同一であるか、またはいくつかのアミノ酸配列の相違を有し得る軽鎖を意味する。例えば、保存的アミノ酸変異、および／または重鎖と対になるなど結合特異性に寄与しないか部分的にしか寄与しない領域におけるアミノ酸変異を導入し、かつ試験することにより、同一ではないが機能的に等価である軽鎖を調製または発見することが可能である。特定の共通軽鎖およびそのような機能的に等価な変異体の組合せは、用語“共通軽鎖”に包含される。共通軽鎖の使用の詳細な説明については、ＷＯ２００４／００９６１８を参照のこと。好ましくは、生殖細胞系様軽鎖、より好ましくは生殖細胞系軽鎖、好ましくは再構成された生殖細胞系ヒトκ軽鎖、最も好ましくは再構成された生殖細胞系ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／ＪκまたはＩＧＶκ３－２０／Ｊκのいずれかである共通軽鎖が本発明で用いられる。共通軽鎖は、好ましくは、０～５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを伴う、上記の軽鎖可変領域を含む。別の好ましい共通軽鎖は、ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／ＩＧＪκ５である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／ＩＧＪκ５の可変領域を含む。さらに好ましい共通軽鎖は、ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ３－１５／ＩＧＪκ１である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ３－１５／ＩＧＪκ１の可変領域を含む。さらに好ましい共通軽鎖は、ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ３－２０／ＩＧＪκ１である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ３－２０／ＩＧＪκ１の可変領域を含む。さらに好ましい共通軽鎖は、ヒトλ軽鎖ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトκ軽鎖ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３の可変領域を含む。

【0097】

あるいは、当業者は、共通軽鎖を使用する代わりに、また一致しない重鎖および軽鎖のミスペアリングを回避するために、例えばＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２および／またはＷＯ２００９／０８０２５３に記載されるような、重鎖および軽鎖の強制的なペアリングのための手段を選択できる。

【0098】

本発明者らは、野生型ＣＨ３がその位置に中性アミノ酸残基を有する荷電残基を有するＣＨ３アミノ酸の発現を以前に記載しており、２つのＣＨ３ドメインの代替電荷が安定した相互作用を引き起こす（例えば、位置３５１および位置３６６に正に帯電した残基を有する第１のＣＨ３、ならびに位置３５１および位置３６８に負に帯電した残基を有する第２のＣＨ３）。本発明のバリエーションおよび修飾された重鎖は、ヘテロ二量体化を促進する上記の手段、または当業者に知られている他の手段と共に組み入れられ得る。本明細書に記載の発明は、ＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進するさらなる能力を提供し、ＣＨ３界面でのアミノ酸残基変異体に基づいて、ヘテロ二量体化の安定性を増加させるか、またはホモ二量体の安定性を低下させることもあり、好ましくは、上記の利点の組合せを有し得る。

【0099】

本発明のヘテロ二量体は、野生型二量体（野生型二量体は、そのホモ二量体（ＡＡまたはＢＢ）とは対照的に、ＣＨ３操作のない二重特異性ＩｇＧ（ＡＢ）として定義される）と比較してより安定であり、混合物および不純物からより分離されやすい。驚くべきことに、混合物中の目的の１以上のＩｇ様ポリペプチドの割合をさらに増加させることが可能となった。ヘテロ二量体（例えば、二重特異性抗体）の優先的産生のための当技術分野で知られている方法は、一般的には、いくつかの望ましくない二量体副産物の産生を伴う。例えば、当業者に知られているノブ・イン・ホール（knob-into-hole）技術を用いた目的の二重特異性抗体の割合は、せいぜい８７％であると報告されているのに対し、帯電した接触アミノ酸が反対のアミノ酸で置換される静電工学アプローチもまた、報告によると最大９６％の割合になる。本発明者らは、目的のヘテロ二量体ポリペプチドの比率をさらに高める変異を導入することに成功した。

【0100】

本発明は、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９に少なくとも１つの変異残基を含むＣＨ３ドメインに関する。これらの変異残基は、以下により詳細に記載されている。文字の後に数字が続き、別の文字が続く場合、これはＥＵ番号付けによる残基の本来の位置（例えば、野生型ヒトＦｃ）のアミノ酸と、その位置に操作された残基を示す（例えば、Ｋ４０９Ｓは、リシンが野生型Ｆｃの４０９位に存在することを示す。操作された変異はセリンである）。ＥＵ番号付けについては、http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.htmlを参照のこと。

【0101】

本発明の一態様は、単一細胞からヘテロ二量体ポリペプチドを産生する方法を提供し、ここで、前記ヘテロ二量体ポリペプチドは、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９にアミノ酸変異を含み、前記方法は、前記細胞に以下を提供することを含む：
ａ．第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第１の核酸、
ｂ．第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第２の核酸、
ここで、第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドは、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９に変異を含み、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸の発現を可能にし、そして前記培養物から前記ヘテロ二量体Ｉｇ様ポリペプチドを回収する工程をさらに含む。

【0102】

したがって、本発明の一態様は、ヘテロ二量体ポリペプチドを提供し、ここで、前記ヘテロ二量体ポリペプチドは、２つのＣＨ３ドメインを含み、該第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、ＤＥアミノ酸変異を含み、該第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、ＫＫアミノ酸変異を含み、ここで、前記第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖中の１以上の位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９における１以上の残基は、ヒト野生型残基と比較して変異体である。

【0103】

本発明の一態様は、単一細胞にヘテロ二量体ポリペプチドを提供することを含む、単一細胞からヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法を提供し、前記方法は、該細胞中に以下を提供することを含む：
ａ．第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第１の核酸、
ｂ．第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第２の核酸、
ここで、第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９にＤＥおよびさらなるアミノ酸変異を含み、
ここで、第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖はＫＫを含み、
前記方法は、該宿主細胞を培養し、該２つの核酸の発現を可能にし、そして該培養物から該ヘテロ二量体Ｉｇ様ポリペプチドを回収する工程をさらに含む。

【0104】

別の態様では、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９の変異残基は、例えば、knob-into-hole、ＣＨ３領域での逆電荷置換、または当業者に公知の他の技術を含む、他のヘテロ二量体化バリエーションと組み合わされる。

【0105】

一態様では、この方法は、上記宿主細胞に共通軽鎖をコードする核酸を提供する工程をさらに含み、これは、本明細書で上記に概説した利点を有する。

【0106】

本明細書の他の箇所に記載のように、第１のＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質が記載されており、ここで、前記第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にさらなるアミノ酸変異を含む。要すれば、第１および第２のＣＨ３ポリペプチドはヒト由来である。

【0107】

例えば、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖアミノ酸を含み得る。

【0108】

あるいは、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉアミノ酸を含み得る。

【0109】

別の例では、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔアミノ酸を含み得る。

【0110】

さらなる例において、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑアミノ酸を含み得る。

【0111】

あるいは、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌアミノ酸を含み得る。

【0112】

本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌなど）の代わりとして、またはそれに加えて、位置Ｋ４０９にアミノ酸変異を含んでもよい。

【0113】

したがって、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、必要に応じて位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記で詳述した、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）に加えて、Ｋ４０９Ｉアミノ酸を含んでもよい。

【0114】

あるいは、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、必要に応じて位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記で詳述した、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）に加えて、Ｋ４０９Ｌアミノ酸を含んでもよい。

【0115】

さらなる例では、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、必要に応じて位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記で詳述した、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）に加えて、Ｋ４０９Ｅアミノ酸を含んでもよい。

【0116】

本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌなど）および／または位置Ｋ４０９の変異（例えば、上記に詳述するように、Ｋ４０９Ｉ、Ｋ４０９ＬまたはＫ４０９Ｅ）の代わりとして、またはそれに加えて、位置Ｋ３６０にアミノ酸変異を含み得る。

【0117】

したがって、本明細書に記載の第１のＣＨ３含有ポリペプチドは、必要に応じて位置Ｓ３６４（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）のアミノ酸変異に加えて、および／または必要に応じて位置Ｋ４０９（例えば、上記に詳述するように、Ｋ４０９Ｉ、Ｋ４０９ＬまたはＫ４０９Ｅ）のアミノ酸変異に加えて、Ｋ３６０Ｄアミノ酸を含んでもよい。

【0118】

一例では、ヘテロ二量体タンパク質は、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含み、ここで、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にさらなるアミノ酸変異を含む。要すれば、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドはアミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅをさらに含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドはアミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含む。

【0119】

例えば、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖアミノ酸を含み得る。

【0120】

あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉアミノ酸を含み得る。

【0121】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔアミノ酸を含み得る。

【0122】

さらなる例において、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑアミノ酸を含み得る。

【0123】

あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌアミノ酸を含み得る。

【0124】

本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）の代わりに、またはそれに加えて、位置Ｋ４０９にアミノ酸変異を含んでもよい。

【0125】

したがって、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、必要に応じて位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）に加えて、Ｋ４０９Ｉアミノ酸を含んでもよい。

【0126】

あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、必要に応じて位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）に加えて、Ｋ４０９Ｌアミノ酸を含んでもよい。

【0127】

さらなる例において、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、要すれば、位置Ｓ３６４のアミノ酸変異体（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）に加えて、Ｋ４０９Ｅアミノ酸を含んでもよい。

【0128】

本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４のアミノ酸変異（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）および／または位置Ｋ４０９の変異（例えば、上記に詳述するように、Ｋ４０９Ｉ、Ｋ４０９ＬまたはＫ４０９Ｅ）の代わりに、またはそれに加えて、位置Ｋ３６０にアミノ酸変異を含み得る。

【0129】

したがって、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、要すれば、位置Ｓ３６４でのアミノ酸変異（例えば、上記に詳述するように、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｔ、Ｓ３６４ＱまたはＳ３６４Ｌ）および／または要すれば位置Ｋ４０９でのアミノ酸変異（例えば、上記で詳述した、Ｋ４０９Ｉ、Ｋ４０９ＬまたはＫ４０９Ｅ）に加えて、Ｋ３６０Ｄアミノ酸を含んでもよい。

【0130】

一例において、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質が記載され、ここで、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅならびに前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、かつ第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９および／またはＫ３６０にさらにアミノ酸変異を含む。

【0131】

したがって、一態様では、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、ここで、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、かつ第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４にさらなるアミノ酸変異を含む。

【0132】

特定の例において、位置３６４のアミノ酸はバリン、イソロイシン、トレオニン、グルタミンまたはロイシンである。

【0133】

一態様では、位置３６４のアミノ酸はバリンである。

【0134】

一態様では、位置３６４のアミノ酸はイソロイシンである。

【0135】

一態様では、位置３６４のアミノ酸はトレオニンである。

【0136】

一態様では、位置３６４のアミノ酸はグルタミンである。

【0137】

一態様では、位置３６４のアミノ酸はロイシンである。

【0138】

別の態様において、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、かつ第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｋ４０９にさらなるアミノ酸変異を含む。

【0139】

特定の例において、位置４０９のアミノ酸はイソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸である。

【0140】

一態様では、位置４０９のアミノ酸はイソロイシンである。

【0141】

一態様では、位置４０９のアミノ酸はロイシンである。

【0142】

一態様では、位置４０９のアミノ酸はグルタミン酸である。

【0143】

別の態様において、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、かつ第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｋ３６０にさらなるアミノ酸変異を含む。

【0144】

特定の例において、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸である。

【0145】

本明細書に記載のアミノ酸変異は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の“ＤＥ”アーム内の位置Ｓ３６４、位置Ｋ４０９、または位置Ｋ３６０における単一の変異を意味し得る。本発明のさらなる態様では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｓ３６４、Ｋ４０９またはＫ３６０から選択される位置に少なくとも２つの変異を有する。本発明のさらなる態様では、ヘテロ二量体タンパク質は、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９およびＫ３６０に少なくとも３つのさらなる変異を有する。

【0146】

したがって、一態様では、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、かつ第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４およびＫ４０９にさらなるアミノ酸変異を含み、
ここで、位置３６４のアミノ酸はバリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり、位置４０９のアミノ酸はイソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸である。

【0147】

例えば、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖアミノ酸およびＫ４０９Ｉアミノ酸を含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖアミノ酸およびＫ４０９Ｌアミノ酸を含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖアミノ酸およびＫ４０９Ｅアミノ酸を含み得る。

【0148】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉアミノ酸およびＫ４０９Ｉアミノ酸を含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉアミノ酸およびＫ４０９Ｌアミノ酸を含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉアミノ酸およびＫ４０９Ｅアミノ酸を含み得る。

【0149】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔアミノ酸およびＫ４０９Ｉアミノ酸を含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔアミノ酸およびＫ４０９Ｌアミノ酸を含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔアミノ酸およびＫ４０９Ｅアミノ酸を含み得る。

【0150】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑアミノ酸およびＫ４０９Ｉアミノ酸を含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑアミノ酸およびＫ４０９Ｌアミノ酸を含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑアミノ酸およびＫ４０９Ｅアミノ酸を含み得る。

【0151】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌアミノ酸およびＫ４０９Ｉアミノ酸を含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌアミノ酸およびＫ４０９Ｌアミノ酸を含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌアミノ酸およびＫ４０９Ｅアミノ酸を含み得る。

【0152】

別の態様では、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、ここで、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドはアミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドはアミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、ここで、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは位置Ｓ３６４およびＫ３６０にさらなるアミノ酸変異を含み、ここで位置３６４のアミノ酸は、バリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸である。

【0153】

例えば、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0154】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0155】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0156】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0157】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0158】

別の態様では、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、ここで、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｋ４０９およびＫ３６０にさらなるアミノ酸変異を含み、位置４０９のアミノ酸はイソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸である。

【0159】

例えば、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｉアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0160】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｌアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0161】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｅアミノ酸およびＫ３６０Ｄアミノ酸を含み得る。

【0162】

別の態様では、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドおよび第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、前記第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、ここで、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、位置Ｓ３６４、Ｋ４０９およびＫ３６０にさらなるアミノ酸変異を含み、位置３６４のアミノ酸は、バリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり、位置４０９のアミノ酸はイソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり、かつ位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸である。

【0163】

例えば、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖ、Ｋ４０９ＩおよびＫ３６０Ｄを含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖ、Ｋ４０９ＬおよびＫ３６０Ｄを含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｖ、Ｋ４０９ＥおよびＫ３６０Ｄを含み得る。

【0164】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉ、Ｋ４０９ＩおよびＫ３６０Ｄを含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉ、Ｋ４０９ＬおよびＫ３６０Ｄを含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｉ、Ｋ４０９ＥおよびＫ３６０Ｄを含み得る。

【0165】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔ、Ｋ４０９ＩおよびＫ３６０Ｄを含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔ、Ｋ４０９ＬおよびＫ３６０Ｄを含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｔ、Ｋ４０９ＥおよびＫ３６０Ｄを含み得る。

【0166】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑ、Ｋ４０９ＩおよびＫ３６０Ｄを含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑ、Ｋ４０９ＬおよびＫ３６０Ｄを含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｑ、Ｋ４０９ＥおよびＫ３６０Ｄを含み得る。

【0167】

別の例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌ、Ｋ４０９ＩおよびＫ３６０Ｄを含み得る。あるいは、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌ、Ｋ４０９ＬおよびＫ３６０Ｄを含み得る。一例では、本明細書に記載の第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３含有ポリペプチドは、Ｓ３６４Ｌ、Ｋ４０９ＥおよびＫ３６０Ｄを含み得る。

【0168】

特定の態様において、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸であり、位置３６４のアミノ酸はイソロイシンである。

【0169】

別の態様では、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸であり、位置３６４のアミノ酸はスレオニンである。

【0170】

さらなる態様において、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸であり、位置３６４のアミノ酸はバリンである。

【0171】

さらに別の態様では、位置３６０のアミノ酸はアスパラギン酸であり、位置４０９のアミノ酸はグルタミン酸である。

【0172】

さらなる態様において、位置３６４のアミノ酸はロイシンであり、位置４０９のアミノ酸はロイシンである。

【0173】

さらに別の態様では、位置３６４のアミノ酸はスレオニンであり、位置４０９のアミノ酸はグルタミン酸である。

【0174】

変異ポリペプチドは、当技術分野で知られている何れかの適切な手段によって作成できる。本明細書に記載の変異体は、ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインに基づいていてもよいが、１以上の親アミノ酸（位置３６０、３６４および／または４０９）が、本明細書に記載のヒトＩｇＧ ＣＨ３アミノ酸の対応する位置で変異している。

【0175】

ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインの配列は、当技術分野で周知である。ポリペプチドの１以上のアミノ酸を変化させることにより、それらの位置の側鎖が変更される。本明細書に記載のアミノ酸変異は、分子生物学を用いる遺伝的手段を含む種々の手段により、または酵素的もしくは化学的手段により、ＣＨ３ドメインをコードする核酸またはＣＨ３ドメイン自体に導入され得る。本明細書に記載の変異体を生成するための適切な方法は、当技術分野で周知である。例えば、変異核酸は、変異配列をコードする核酸合成を介してデノボ（de novo）で生成され、多数のプロバイダーを通じて注文され得る。同様に、変異核酸は、当技術分野で周知の突然変異誘発技術によって生成できる。変異体ポリペプチドをコードするそのような核酸は、要すれば、宿主細胞にクローニングし、発現させ、そしてアッセイできる。これらの実施は、よく知られている手順を用いて行われ、使用できるさまざまな方法が、Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)に記載されており、これらの内容全体は引用により包含される。変異体をコードする核酸は、タンパク質を発現させるために発現ベクターに組み込まれ得る。発現ベクターは、一般的には、制御配列または調節配列、選択可能マーカー、何れかの融合パートナーおよび／または追加の要素と連結したプロモーターを含む。変異体は、タンパク質の発現を誘導または引き起こす適切な条件下で、変異体をコードする核酸を含む核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって産生され得る。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞および酵母を含むがこれらに限定されない、多種多様な適切な宿主細胞を使用できる。例えば、用途が見出される様々な細胞株は、ＡＴＣＣ細胞株カタログに記載されており、American Type Culture Collectionから入手可能であり、引用により内容全体が包含されている。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、使用する宿主細胞によって異なる。

【0176】

本発明の一面では、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖のそれぞれが、異なる標的エピトープを認識する可変領域をさらに含み、標的エピトープが同一分子上に位置する、少なくとも２種のＩｇ様分子を作製するための、またはヘテロ二量体のＩｇ様分子を作製するための本発明による方法を提供する。これはしばしば、１つのエピトープのみが標的とされる状況と比較して、前記標的分子の（生物学的）機能のより効率的な反作用を可能にする。例えば、ヘテロ二量体の免疫グロブリン様分子は、例えば増殖因子受容体または腫瘍細胞の増殖に重要な可溶性分子に存在する２つのエピトープに同時に結合し、それによって制御されない増殖をもたらす幾つかの独立したシグナル伝達経路を効果的に阻止し、少なくとも２つのＩｇ様分子は、そのような増殖因子受容体または可溶性分子上に存在する２つ、さらには３つまたは４つのエピトープに同時に結合できる。

【0177】

一態様では、標的分子は可溶性分子である。別の態様では、標的分子は膜結合分子である。

【0178】

本発明の別の面では、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖のそれぞれが、標的エピトープを認識する可変領域をさらに含み、標的エピトープが異なる分子上に位置する、１以上のヘテロ二量体免疫グロブリン様分子を作製するための本発明の方法を提供する。この場合、異なる標的分子のそれぞれは、可溶性分子または膜結合分子のいずれかであり得る。一態様では、異なる標的分子は可溶性分子である。あるいは、一方の標的分子は可溶性分子であり、他方の標的分子は膜結合分子である。さらに別の態様では、両方の標的分子が膜結合分子である。一態様では、異なる標的分子が同じ細胞で発現されるが、他の態様では、異なる標的分子が異なる細胞で発現される。限定されない例として、何れかのヘテロ二量体免疫グロブリン様分子または少なくとも２つの免疫グロブリン様分子の何れかの組合せは、複数の膜結合受容体を同時に阻止し、サイトカインまたは腫瘍細胞の増殖因子などの複数の可溶性分子を中和し、または異なるウイルス血清型もしくはウイルス株を中和するために適し得る。

【0179】

一態様は、前記標的エピトープの少なくとも１つが腫瘍細胞上に位置する、１以上のヘテロ二量体免疫グロブリン様分子を産生するための本発明による方法を提供する。あるいは、またはこれに加えて、前記標的エピトープの少なくとも１つは、エフェクター細胞の表面上に位置する。これは、例えば、腫瘍細胞を殺すためのＴ細胞またはＮＫ細胞の動員に適している。例えば、少なくとも１つのＩｇ様分子は、免疫エフェクター細胞上に位置する標的分子に特異的に結合することにより、免疫エフェクター細胞、好ましくはヒト免疫エフェクター細胞を動員できる本発明による方法で産生される。さらなる態様では、前記免疫エフェクター細胞は、免疫グロブリン様分子が標的分子に結合すると活性化される。エフェクター機構の動員は、例えば、Ｔ細胞受容体またはＦｃγ受容体などの細胞毒性誘発分子に結合でき、それによって下流の免疫エフェクター経路を活性化し得る、本発明による方法によって産生された免疫グロブリン様分子を投与することによる、免疫調節細胞毒性の切り換え（redirection)を包含し得る。本明細書で用いる用語“免疫エフェクター細胞”または“エフェクター細胞”とは、活性化されて標的細胞の生存率に影響を与えることができる、哺乳動物免疫系の細胞の天然レパートリー内の細胞を意味する。免疫エフェクター細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞、またはＢ細胞などのリンパ系の細胞が含まれるが、骨髄系の細胞も、単球またはマクロファージ、樹状細胞および好中球顆粒球などの免疫エフェクター細胞もまた含まれる。したがって、前記エフェクター細胞は、好ましくはＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または好中球顆粒球である。

【0180】

したがって、一面では、本発明は、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖のそれぞれが、標的エピトープを認識する可変領域をさらに含む、ヘテロ二量体免疫グロブリン様ポリペプチドを産生するための本発明による方法を提供する。一態様では、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖の２つの可変領域のそれぞれが、同じ標的エピトープを認識するが、異なる親和性を有する。別の態様では、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖の２つの可変領域のそれぞれが、異なる標的エピトープを認識する。別の態様において、異なる標的エピトープは、膜結合分子または可溶性分子のいずれかであり得る、同じ標的分子上に位置する。別の態様では、異なる標的エピトープは異なる標的分子上に位置し、同じ細胞または異なる細胞上で見出され得る。あるいは、異なる標的分子が可溶性分子であり得るか、または一方の標的分子が可溶性分子であり、他方の標的分子が膜結合分子であり得る。一態様において、ヘテロ二量体免疫グロブリン様ポリペプチドの標的分子の少なくとも１つは、腫瘍細胞上に位置する。さらに別の態様では、ヘテロ二量体Ｉｇ様ポリペプチドの標的分子の少なくとも１つは、エフェクター細胞上に位置する。

【0181】

一態様では、１以上のヘテロ二量体免疫グロブリン様ポリペプチドを産生するための本発明による方法を提供し、前記ポリペプチドは抗体である。一態様では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭアイソタイプ抗体である。一態様では、抗体はＩｇＧアイソタイプ抗体である。別の態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。

【0182】

本発明による方法によって得られる、ヘテロ二量体免疫グロブリン様ポリペプチド、または少なくとも２つのＩｇ様ポリペプチドの混合物がさらに提供される。前記ヘテロ二量体ポリペプチドまたはポリペプチドの混合物は、２つのＣＨ３ドメインを含み、ここで、前記２つのＣＨ３ドメインの一方は、アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、前記２つのＣＨ３ドメインの他方は、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、これらは、ヘテロ二量体化を増強し、および／またはホモ二量体形成を不安定化する野生型ＣＨ３配列に対する１以上の変異を含み、好ましくはこれらの利点の組合せを達成する、ＥＵ番号付けに従い位置３６０、３６４および４０９における変異を含む。

【0183】

これらのアミノ酸変異は、上記のように、前記２つのＣＨ３ドメインの優先的な対形成を引き起こす。前記２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅ、ならびに前記２つのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋは、本明細書ではまとめてＤＥＫＫと呼ばれる。アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを有するＣＨ３ドメインは、“ＤＥ側鎖”、“ＤＥアーム”または“ＤＥ”とも呼ばれ、アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを有するＣＨ３ドメインは“ＫＫ側鎖”、“ＫＫアーム”または“ＫＫ”とも呼ばれる。本明細書に記載のアミノ酸変異（位置Ｋ３６０、Ｓ３６４および／またはＫ４０９）は、単独で、または好ましくはヘテロ二量体化を促進するために他の変異と共に、より好ましくはＤＥＫＫ骨格上に、より好ましくはＤＥ側鎖に導入され得る。一方、アミノ酸位置３６０、３６４および４０９の変異は、ヘテロ二量体の安定性を強化し、および/またはホモ二量体を不安定化できる。

【0184】

また、ヘテロ二量体免疫グロブリン様ポリペプチド、または本発明による何れかの方法によって得ることができる少なくとも２つのポリペプチドの混合物を含む医薬組成物も提供する。一態様では、ヘテロ二量体ポリペプチドは、抗体（複数可）または多価多量体である。該医薬組成物は、ヘテロ二量体免疫グロブリン様ポリペプチド、または単一特異性もしくは二重特異性Ｉｇ様分子を含む少なくとも２つのポリペプチドの混合物、または単一特異性および二重特異性Ｉｇ様ポリペプチドの組合せを含み得る。さらに、本発明による医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる“薬学的に許容される担体”としては、生理的に適合する溶媒、塩、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。投与経路（例えば、静脈内、皮下、関節内など）に応じて、Ｉｇ様ポリペプチドは、酸の作用およびＩｇ様ポリペプチドを不活性化し得る他の自然条件からＩｇ様ポリペプチドを保護する材料でコーティングされ得る。

【0185】

一態様では、本発明は、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３領域を有する第１の重鎖、および第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３領域とは異なる第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３領域を有する第２の重鎖を含むヘテロ二量体抗体を提供し、ここで、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３領域は、ＩｇＧ ＣＨ３アミノ酸変異Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、第２のヒトＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ ＣＨ３アミノ酸変異Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを含み、ここで、第１のヒトＩｇＧ ＣＨ３領域は、位置Ｋ３６０、Ｓ３６４またはＫ４０９にさらなるアミノ酸変異を含む。ヘテロ二量体抗体は、好ましくは、１以上の抗体軽鎖を含む。第１および第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３領域は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４領域である。第１および第２のヒトＩｇＧ ＣＨ３領域は、好ましくはＩｇＧ１ ＣＨ３領域である。第１の重鎖は、第２の重鎖の重鎖可変領域とは異なる重鎖可変領域を含み得る。適切な軽鎖に関連する異なる重鎖可変領域を含む抗体可変ドメインは、異なるエピトープおよび／または抗原に結合し得る。第１の重鎖および／または第２の重鎖は、２以上の可変領域を含み得る。２以上の可変領域を有する１つまたは２つの重鎖を含むヘテロ二量体抗体は、適切な相補的可変領域と共に３つ以上の可変ドメインを形成できる。異なるエピトープおよび／または抗原に結合する２つ以上の可変ドメインを有するヘテロ二量体抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体などとも称される。このような抗体は、まとめて多重特異性抗体とも称される。

【0186】

明瞭かつ簡潔な説明のために、特徴は、同一または別個の態様の一部として本明細書に記載されているが、本発明の範囲は、記載された特徴のすべてまたは一部の組み合わせを有する態様を含み得ることが理解され得る。

【0187】

本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は本発明を限定するものでは決してなく、単に本発明を明確に記載するものである。

【0188】

本明細書で特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。また、本明細書で用いられるとき、単数の用語“ａ”、“ａｎ”は、複数の意味を含む。特に他に記載のない限り、核酸は左から右へ５’から３’の向きで記載され、アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシの方向で左から右に記載される。本発明は、記載された特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されるものではなく、これらは当業者によって使用される状況に応じて、変化し得るものであることが理解され得る。

【0189】

本発明の詳細は、以下の限定されない実施例によって支持される。

【実施例】

【0190】

実施例
実施例１：インシリコ（In silico）予測
ＤＥＫＫ（Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３６８Ｅ／Ｌ’３５１Ｋ、Ｔ’３６６ Ｋ）を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ変異体を開始モデルとして用いた。ＷＯ２０１３／１５７９５４；De Nardis et al, J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706－14717。ＣＨ３ ＤＥＫＫ／ＤＥＤＥ界面の重要な接触残基を特定するために、インシリコで構造検討が行われた。これらの残基は、High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing（ＨＡＤＤＯＣＫ；タンパク質または核酸などの生体分子複合体のドッキングをモデル化する情報駆動型ドッキング アプローチ）を用いて分析し、ＤＥＤＥホモ二量体の形成を大幅に減少させる変異を特定したが、有意ではなかった。ＤＥＫＫ界面の安定性に悪影響を及ぼしたり、安定性を向上させたりする。合計１８個のヒトＩｇＧ ＣＨ３変異体がインビトロ分析用に選択され、すべてＤＥＫＫ骨格であった。１８個の変異体の各々は、ヒトＩｇＧ ＤＥ ＣＨ３ドメイン内の以下の位置：Ｋ３６０、Ｓ３５４、Ｓ３６４またはＫ４０９、の１つに異なるアミノ酸変異を有していた。

【0191】

実施例２：インビトロ（In vitro）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試験
Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３６８Ｅ （ＤＥ）変異に加えて、ＣＨ３にすべての提案された変異を含むＩｇＧベクターを産生した。この目的のために、１８個の構築物が作製された。産生は、単一のＤＥ＊重鎖、およびＤＥ＊およびＫＫ重鎖を組み合わせたトランスフェクションを用いて実施された（ここで、＊は、上記の１８個の変異体の１つを示す）。ＢｓｐＥＩおよびＡｆｌＩＩ制限酵素を用いて、構築物をＭＧ１１２２Ｃ１７０８（図１）にクローニングした。すべての変異体を取得するために、ライゲーション産物に対してコロニー／シーケンスＰＣＲを実施した。確認されたすべての変異体はミニプレップされ、次いで配列決定が行われ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＶＨの同一性が確認された。単一のＤＥ＊構築物（ＰＧｘｘｘｘ ＩｇＧと標識）および異なるＶＨを有するＫＫ構築物（ＰＢｘｘｘｘｘ二重特異性ＩｇＧと標識）と組み合わせたＤＥ＊構築物の２９３ＦＦ細胞へのトランスフェクションを実施した。７日間のインキュベーション（３７℃、８％ ＣＯ_２、１５５ｒｐｍ）後、細胞上清を回収し、プロテインＡ精製（酸性溶出）およびＰＢＳ ｐＨ７．４へのバッファー交換を行った。その結果、サンプルのＩｇＧ濃度をＯｃｔｅｔによって測定した。

【0192】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
産生および精製されたすべてのＩｇＧを、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。各産生プレートについて、同量のＩｇＧサンプルを各ウェルに、通常は１μｇを添加した（これが不可能な場合は、量が最も低い濃度のサンプルに調整した）。これにより、サンプル間で直接比較を行うことができた。ゲルは、それらの完全なＩｇＧおよびハーフボディ含有量について肉眼で検査した。Chemidoc MP Imagerソフトウェアを用いて、各ゲルの完全なＩｇＧおよびハーフボディの相対量を定量することもできる。
シングル（ＰＧｘｘｘｘ）トランスフェクションでのハーフボディの量が多いことは、バリアント ホモ二量体が不安定であることを示した。二重トランスフェクション（ＰＢｘｘｘｘｘ）のＩｇＧバンドは、ヘテロ二量体が形成されていることを確認した。

【0193】

単一トランスフェクションで大部分がハーフボディ形成を示し（ＫＫ ＣＨ３領域を含むＭＧ４５３９Ｃ１４５２対照サンプルと同等）、二重特異性トランスフェクションで大部分が完全なＩｇＧを形成したＤＥ＊－ＣＨ３変異体を選択して、フォローアップ試験（図２～４および表１）でさらに特徴付けを行った。インシリコで同定された４つの位置のうち合計３つが、対照サンプル（Ｋ３６０、Ｓ３６４およびＫ４０９）と比較して、インビトロで改善された特性を示した。さらなる研究のために合計９つの変異体が選択された。

【0194】

【表1】

【0195】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ実験に続いて、さらにインシリコ ＨＡＤＤＯＣＫ分析を実施して、対照と比較してさらに改善できる潜在的に有望な二重変異体（表２、行１０～１５）を特定した。

【表2】

【0196】

まとめると、合計１８個の変異体がＣＨ３のＤＥアームの３つの位置で作成された。ホモ二量体を取得するために単一のトランスフェクションを実施し、二重特異性ＩｇＧを取得するために共通ＫＫアームを用いた二重トランスフェクションを実施した。SDS-PAGE分析は、５つのＤＥＫＫ変異体が、ＤＥＫＫ対照サンプルよりも単一アーム製品でより多くのハーフボディ混入物（コンタミネーション）を示した。二重トランスフェクション試験における二重特異性ＩｇＧの結果のために、異常なＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果が単一生産であったにもかかわらず、さらに３つの変異体が選択された。ＨＡＤＤＯＣＫを用いて、パフォーマンスの高い変異の組合せを分析し、そこから６つのさらなる組合せを選択して、さらに分析した。

【0197】

実施例３：インビトロでの安定性の結果および生物物理学的特性
選択された１５の個の変異体は、ＤＥ：ＫＫ比１：１および３：１を含む二重特異性（ＣＤ１３７（ＭＦ６７４４ －米国公開番号２０２０／００１７５９５Ａ１；米国公開番号２０１９／００３５２４０１Ａ２で以前に公開された) ｘフィブリノーゲン（ＭＦ１１２２）)として産生され、ここで、ＤＥアームを過剰発現させてそのホモ二量体形成を試験した。

【0198】

ＩｇＧは、ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣ（陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー）、ＨＰ－ＳＥＣ（高性能サイズ排除クロマトグラフィー）およびｎＭＳ（天然質量分析）技術を用いてさらに特徴付けられた。さらに、融解および凝集温度ＴｍおよびＴａｇｇを分析する安定性分析を行った。ホモ二量体形成を有意に減少させ、高いＴｍ／Ｔａｇｇによって示されるように良好なＦｃ安定性を示した変異体を、より大規模なタンパク質生産のために選択した。

【0199】

用いたＶＨは重量が異なり（モノクローナルＩｇＧ ＭＦ１１２２の重量は１４４９０５ｋＤａ、ＭＦ６７４４の重量は１４５９３２ｋＤａ）、したがってホモ二量体とヘテロ二量体はｎＭＳで分離できる。それらはＣＩＥＸ ＲＴ（１３．３分および９．７分）が異なるため、特にＫＫおよびＤＥとそれぞれ結合されるため、ホモ二量体およびヘテロ二量体をＣＩＥＸで分離できる。Ｆａｂは高いＴｍを有している。高Ｔｍ Ｆａｂにより、変異ＣＨ３の融解温度（Ｔｍ）を特定できた。

【0200】

生成されたＤＮＡ比１：１のＩｇＧを、ＵＮｃｌｅ装置（UNchained Labs製品コード２００－１０３７）を使用したＴｍ／Ｔａｇｇ分析で分析した。融解温度（Ｔｍ）は、温度上昇時のアミノ酸の固有蛍光の変化を追跡することによって決定される（スペクトル範囲２５０～７２０ｎＭ）。凝集温度（Ｔａｇｇ）は、２６６ｎｍおよび４７３ｎｍの波長のレーザーを用いて、９０°の角度で散乱光を検出して、Ｔｍの測定と同時に静的光散乱（ＳＬＳ）を測定することによって決定される。ＤＬＳ（動的光散乱）分析は、蛍光およびＳＬＳ取得(Blue&UV、露光時間1000 ms、UV266:フィルター4、Blue473:フィルター3)により、Ｔｍ／タグの決定のため、０．３℃／分の速度で２５℃～９５℃の温度勾配を用いた。

【0201】

これにより、ストレスのないサンプルのＴｍ／ＴａｇｇをＫＫ：ＤＥ比１：１で決定できた。表４に示すように、すべてのサンプルは３００μｇ／ｍＬであった。

【0202】

ストレステスト
修飾ＩｇＧにストレスを与えることにより、少量の安定性アッセイを行った。これらのアッセイはすべてＰＢＳ中で行った。
各サンプルの３つの１００μＬアリコートを３００μｇ／ｍＬで生成した(表３を参照)。

【0203】

以下のストレスがサンプルに適用された。
－ ５ｘＦＴ（凍結融解）（サンプルを－８０℃で少なくとも１時間繰り返し保存した後、室温で完全に解凍）；
－ ５０℃で２日間（サンプルを５０℃のウォーターバスまたはインキュベーターに入れ、２日間インキュベート）；
・４℃保存（ノンストレス対照として)。

【0204】

続いて、ストレスを加えたサンプルをＤＬＳで分析し、ストレスを加えていないサンプル（４℃に保持）と直接比較して、サンプル中の凝集体の存在を確認した。

【0205】

バリアントのＴｍ／Ｔａｇｇにいくつかの違いが観察されたが、それらはすべて安定した分子と見なされた（表３および４）。

【表3】

【0206】

【表4】

【0207】

ＨＰ－ＳＥＣ
生成されたＩｇＧを、当技術分野で知られている標準的な方法に従ってＨＰ－ＳＥＣで分析した。Agilent 1260シリーズＨＰＬＣシステム、Tosoh TSK-gel G3000SWxl カタログ番号８０８５４１、Tosoh TSKガードカラムSWXL カタログ番号８０８５４３、泳動バッファー：２００ｍＭ ＮａＰＯ_４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、２０μｇのサンプルを添加。ＨＰ－ＳＥＣ分析を、ＤＬＳ分析(表５)と比較して小さい凝集体を検出するために実施し、－８０℃で保存された後に試験で通常用いられるサンプルを表すために、１ｘ Ｆ／Ｔサイクル後に実施した。

【0208】

【表5】

【0209】

ストレステストは、ＤＥＫＫ変異体がとても安定していることを示しており、激しいストレスの後にのみ凝集を示す。

【表6】

【0210】

【表7】

【0211】

【表8】

【0212】

ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣ
生成されたＩｇＧをＣＩＥＸ－ＨＰＬＣで分析した。Agilent 1260シリーズHPLCシステム、Tosoh TSKgel SP-STATカラム、カタログ番号２１９６４、用いたバッファー：Ａ） ２５ｍＭ ＮａＰＯ_４、ｐＨ６．０およびＢ) ２５ｍＭ ＮａＰＯ_４、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
、０～３０％バッファーＢの線形勾配による分析（１ｍＬあたり２％ Ｂの増加)、０．５ｍＬ／分、１０μｇのサンプルを添加。生成されたプロファイルを、ピーク形状、保持時間、二重特異性／汚染物質の比率、および二重特異性物質と混入物質の分離について分析した（３：１トランスフェクトサンプルで最も顕著であった）。ｗｔ ＰＧ１１２２およびｗｔ ＰＧ６７４４の間の分離は約３．７分で、ＫＫ／ＤＥおよびその他の変異体によって増加する。ＷＴ ＤＥＫＫ 対照（ctrl.）は、予想どおり、１０．２５分(biclonic)および７．８分（ＤＥＤＥホモ二量体）にピークを示した。比率が１：１または１：３のいずれの製品でも、保持時間（ＲＴ）値はほぼ同じである。

【0213】

一部のサンプルでは、一方または両方の生成物でＤＥＤＥホモ二量体からなる早期溶出種が見られたが、他のサンプルには検出可能な早期溶出種はなかった。

【0214】

最も顕著なのは、Ｓ３５４Ｑ変異体（両方の生成物）、Ｓ３６４Ｔ変異体およびＷＴ （３：１生産）で大量の早期溶出種が観察されたが、他のすべてのサンプルでは１０％未満であった。

【0215】

すべてのサンプルがプレピークを示した。メインピークの高さと比較して、１：１生産で観察されたピークよりも約３倍大きい、１：３生産でより大きなプレピークが観察された。理論はともかく、本発明者らは、ＤＥ＊ハーフボディ種がカラムに結合せず、“プレピーク”（カラムのデッドボリューム）で溶出したのは、ある変異体に存在する追加の負電荷のためであると考える。

【0216】

多くの変異体は、ホモ二量体形成の防止に非常に成功しており、早期に溶出するピークがないことからも明らかである。

【0217】

まとめると、生成された１８個のＩｇＧのうち１５個について、（修飾された）ＤＥアームの３：１過剰発現においてさえ、ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣによると非常に少量のＤＥＤＥホモ二量体が形成されるか、またはほとんど存在しなかった。これは、ＤＥＫＫ対照と比較して、追加の変異体のほとんどがホモ二量体形成の防止または低減に成功していることを示す（表９）。

【0218】

【表9】

【0219】

ＬａｂＣＨＩＰ
Biclonic製品のサンプル中のＩｇＧ（ＤＥＫＫ＋ＤＥＤＥ）およびハーフボディの量を決定するために、LabChipを使用した。Perkin Elmer LabCihp GXII Touch HT、Protein Clear HR Reagent キット（カタログ番号ＣＬＳ９６００１４）およびProtein Express Assay LabChip （カタログ番号７６０４９９）を用いｙｒ、製造者の指示に従って、サンプル濃度０．３μｇ／μＬで分析した。ＤＥハーフボディの形成は変異体間で大きく異なることが観察され、予想どおり、３：１の生産にはより多くのＤＥハーフボディが含まれていることが観察された(表１０)。

【0220】

【表10】

【0221】

ｎＭＳ
生成されたすべてのＩｇＧについて、１００μｇ／サンプルをｎＭＳ分析で分析した(Rosati et al, Anal Chem. 2012 Aug 21;84(16):7227-32の方法論を参照)。さまざまな種（二重特異性、ホモ二量体、ハーフボディ）間の相対比率を調べた。

【0222】

１６個のサンプルすべてを正常に分析し、この手法によってＩｇＧ種を特定できた。対照ＤＥＤＥサンプルでは、１：１の生産で９５％の二重特異性が得られた。１：１生産におけるＤＥＫＫ変異体ヘテロ二量体形成の割合は、７４％から１００％まで変化した。合計１２個のサンプルには、９０％以上のＤＥＫＫヘテロ二量体が含まれていた。ホモ二量体形成は、ＤＥＫＫ対照と比較して、１４個のサンプルで大幅に減少した。８つのサンプルで、２％以下のＤＥＤＥホモ二量体が３：１生産で形成された。

【0223】

まとめると、１４個の変異体は３：１生産でホモ二量体形成を有意に減少させ（ＤＥＫＫ対照と比較して）、８つの変異体ではホモ二量体はほとんど形成されなかった（表１１）。

【0224】

【表11】

【0225】

結果のまとめ
ハーフボディの検出には、ＬａｂＣｈｉｐ、ＨＰ－ＳＥＣおよびｎＭＳなどの様々な方法が用いられた。得られた値は絶対的に異なり、ｎＭＳは他の方法よりも少ないハーフボディを検出するが、ＤＥＤＥホモ二量体形成の減少における変異体の有用性に関する最終的な結論は一貫していた（表１２）。ＤＥＫＫ、ＩｇＧ由来混入物（contaminant）および凝集体の存在についてサンプルを特徴付けるためにさまざまな手法が用いられ、数値は厳密には異なるが、得られたデータから一貫した結論を導き出すことができた（表１３～１５）。

【0226】

【表12】

【0227】

【表13】

【0228】

【表14】

【0229】

【表15】

【0230】

まとめると、本明細書で提供される変異体は、ヘテロ二量体ポリペプチドのＣＨ３界面での変化に基づいて、ヘテロ二量体の安定性を高め、ホモ二量体形成を減少させる。

【0231】

実施例４：
収量、純度およびＤＥ混入物の形成に関して、表１６に示された変異体のＤＥＫＫヘテロ二量体形成への影響をさらに調査した。この特定の例では、ＤＥ重鎖に変異を有する二重特異性タンパク質を、上記のようにさまざまなＤＥ：ＫＫ比でＫＫを含む重鎖とともに生成し、プロテインＡを用いて精製し、ＣＩＥＸで分析し、ＬａｂＣｈｉｐ／ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。

【0232】

クローニング：
ＤＥ側の抗ＴＴおよびＫＫ側の抗ＣＤ３のＶＨ配列を、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩを用いて、以下の変異体を含むベクターにクローニングした：Ｋ３６０Ｄ＿Ｋ４０９Ｅ（配列番号１２）、Ｓ３６４Ｌ＿Ｋ４０９Ｌ（配列番号１４）、Ｓ３６４Ｌ（配列番号２）およびＳ３６４Ｔ＿Ｋ４０９Ｅ（配列番号１３）。すべての変異体を取得するために、ライゲーション産物に対してコロニー／シーケンスＰＣＲを実施した。確認されたすべての変異体をミニプレップし、次いで配列決定した。ＩｇＧは、２９３ＦＦ細胞への様々なＤＥ：ＫＫ比（表１６）での単一のＤＥ＊構築物（ＰＧｘｘｘｘ ＩｇＧと標識される）およびＫＫ構築物と組み合わせたＤＥ＊構築物（ＰＢｘｘｘｘｘ二重特異性ＩｇＧと標識される)のトランスフェクションによって産生された。７日間のインキュベーション（３７℃、８％ ＣＯ_２、１５５ｒｐｍ）後、細胞上清を回収し、プロテインＡ精製（酸性溶出）およびＰＢＳ ｐＨ７.４へのバッファー交換を行った。サンプルのＩｇＧ濃度を測定した。その後、タンパク質を、ＨＰ－ＳＥＣ、ＣＩＥＸおよびＬａｂ－Ｃｈｉｐ／ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって特徴付けた。

【0233】

【表16】

【0234】

ＨＰ－ＳＥＣ：
実施例３に記載のプロトコールに従って、単一アーム生成物をＨＰ－ＳＥＣによって分析した。同量の各ＩｇＧを用いたが、１０μｇ以上を用いた。すべての変異体について、ＤＥアームは、自然条件下で、７５％を超えるハーフボディ、約１０～２０％のホモ二量体、およびいくつかの凝集体として実行される（表１７）。

【0235】

【表17】

【0236】

ＣＩＥＸ分析：
ＩｇＧタンパク質をＣＩＥＸ（実施例３に記載のプロトコール）によって分析した。対照として、二重特異性サンプルで検出されたピークを割り当てることができるように、単一アームの生成物を分析した。注入されたタンパク質の量は、すべてのサンプルで調整された。単一アームを含むサンプルのタンパク質量は、各サンプルで５μｇに調整された。濃度が低すぎる場合は、可能な最大量（１００μＬ）を注入した。抗ＴＴ重鎖（ＶＨ；配列番号１６）を有するＷＴ－ＤＥホモ二量体の予測保持時間（ＲＴ）は１３分である。抗ＣＤ３重鎖（ＶＨ；配列番号１７）を有するＫＫハーフボディのＲＴは２６分である。ＫＫ－ＫＫ二量体の保持時間は、溶出が遅すぎて検出できない。サンプル中の成分の定量化では、プレピークは考慮しなかった。同じ種（ＰＢ、ＤＥまたはＫＫ）に属するピークを合計し、１つの値として追加した。ＣＩＥＸカラムから溶出するサンプルの組成は、各ピークの面積のパーセンテージに基づいている。

【0237】

ヘテロ二量体の純度は、同じ比率を比較したとき、試験条件下で調べたすべての変異体で改善された（表１８）。ＤＥ：ＫＫ比を変えることの効果は、ＫＫ ＤＮＡの増加、それによるＫＫポリペプチドの翻訳の増加が、ＤＥ混入物の減少をもたらすようなものであった。

【0238】

【表18】

【0239】

単一アームの生産では、変異体のＤＥＤＥホモ二量体が減少し、ＤＥハーフボディが増加した（表１９）。結果は、ＨＰ－ＳＥＣを用いて生成されたデータと一致している。

【0240】

【表19】

【0241】

純度に対する変異の影響
各サンプルに存在する二重特異性タンパク質の量を、ＣＩＥＸの結果を用いて推定し、二重特異性タンパク質の純度に関して考察した。ヘテロ二量体ＰＢタンパク質の純度は、プロテインＡ精製を含むこの実施例で改善される。ＤＥ：ＫＫ比を大きくすることで純度が向上する（表２０）。

【0242】

【表20】

【0243】

用いた配列：

＞MV1708_DE_S364V [配列番号１]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCGTCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞MV1708_DE_S364L [配列番号２]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCCTCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞MV1708_DE_S364I [配列番号３]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCATCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞MV1708_DE_S364T [配列番号４]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCACACTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞MV1708_DE_S364Q [配列番号５]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCCAGCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

【0244】

＞MV1708_DE_K409I [配列番号６]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCATCCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞MV1708_DE_K409L [配列番号７]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCCTGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞MV1708_DE_K409E [配列番号８]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCGAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞CH2-3_DE_K360D-S364I [配列番号９]
Tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccgacaaccaggtcatcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag

＞CH2-3_DE_K360D-S364T [配列番号１０]
Tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcctcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcctgctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag

【0245】

＞CH2-3_DE_K360D-S364V [配列番号１１]
Tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcctcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcctgctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag

＞CH2-3_DE_K360D-K409E [配列番号１２]
Ccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccgacaaccaggtcagcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag

＞CH2-3_DE_S364T-K409E [配列番号１３]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcacactgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag

＞CH2-3_DE_S364L-K409L [配列番号１４]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcctcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcctgctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag

＞MV1708_DE_K360D [配列番号１５]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCGACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG

＞抗ＴＴ ＦａｂのＶＨ配列 [配列番号１６]
EVQLVETGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSQYAMHWVRQAPGKGLEWVAIISHDERNKYYVDSGMGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRSEDTAVYYCARDMRKGGYYYGFDVWGQGTTVTVSS

＞抗ＣＤ３ ＦａｂのＶＨ配列 [配列番号１７]
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYSGSKKNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS

【0246】

読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時またはそれ以前に提出され、本明細書と共に公衆の閲覧に供されているすべての文書および文献に向けられており、これらの文書および文献の内容は引用により本明細書に包含される。

【0247】

本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された全ての特徴、および／またはそのように開示された何れかの方法もしくはプロセスの全ての工程は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、何れかの組み合わせで組み合わせることができる。

【0248】

本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された各特徴は、特に明記されていない限り、同一、同等または類似の目的を果たす別個の特徴によって置き換えることができる。従って、特に明記されていない限り、開示された各特徴は、一連の同等または類似の特徴の一般的な一例にすぎない。

【0249】

本発明は、何れかの上記の態様の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された特徴の何れかの新規なもの、または何れかの新規な組み合わせ、あるいはそのように開示された何れかの方法またはプロセス工程の何れかの新規なもの、または何れかの新規な組み合わせに及ぶ。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2023526630000001.app

【国際調査報告】