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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-22
(54)【発明の名称】トマト果実を増大させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230615BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20230615BHJP
A01H 5/08 20180101ALI20230615BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20230615BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230615BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/29 ZNA
A01H5/08
A01H6/82
C12N15/63 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023500253
(86)(22)【出願日】2020-12-30
(85)【翻訳文提出日】2023-01-04
(86)【国際出願番号】 CN2020141384
(87)【国際公開番号】W WO2022052381
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】202010953359.6
(32)【優先日】2020-09-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520465253
【氏名又は名称】浙江師範大学
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８８ Ｙｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ， Ｗｕｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｊｉｎｈｕａ， Ｚｅｊｉａｎｇ ３２１００４ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】陳 析豊
(72)【発明者】
【氏名】馬 伯軍
(72)【発明者】
【氏名】沈 淑容
(72)【発明者】
【氏名】許 以霊
(72)【発明者】
【氏名】李 敏
(72)【発明者】
【氏名】陳 浩天
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD07
2B030AD14
2B030CA11
2B030CA17
2B030CB02
(57)【要約】
本発明は、トマト果実の増大における遺伝子の使用を提供する。トマト中でＩＦＷ１遺伝子をノックアウトすることでその果実の大きさを増大させ、収量を向上させることができる。遺伝子ＩＦＷ１でコードされるヌクレオチド配列は配列番号１に示される配列である。ＩＦＷ１遺伝子の２つのノックアウト株はｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２である。ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２植物体におけるＩＦＷ１遺伝子変異配列はいずれも配列番号２に示される配列である。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トマト果実の増大における遺伝子の使用であって、トマト中でＩＦＷ１遺伝子をノックアウトすることによりトマト果実の大きさを増大させ、収量を向上させ、
前記遺伝子ＩＦＷ１でコードされるヌクレオチド配列は配列番号１に示される配列であることを特徴とする、使用。
【請求項2】
ＩＦＷ１遺伝子の２つのノックアウト株はｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２であり、ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２植物体中のＩＦＷ１遺伝子の変異配列は、いずれも配列番号２に示される配列であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トマト果実の増大を促進する遺伝子およびその使用に関し、作物分子遺伝分野に属する。
【背景技術】
【0002】
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）は、重要な園芸植物および経済作物として、世界中で広く栽培され、世界的な野菜および果物になっており、見た目の美しさ、味の良さ、栄養価の高さから、消費者に大変人気がある。トマトの果実の大きさと重量は、トマトの外観と収量に影響を与える重要な農業形質である。果実の直径と重量を大きくすることにより、トマトの収量が増加するだけでなく、視覚的な美学が向上し、果実の栄養含有量が増加し、市場価値と経済価値が高まる。そのため、新しい機能遺伝子を開発し、遺伝子編集技術を利用して大きいトマトの新品種を選別することは、比較的早く便利な方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明が解決しようとする技術的課題は、トマト果実の大きさを効果的に増大させ、果実の収量を向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
上述の技術的問題を解決するために、本発明は、トマトの遺伝子ＩＦＷ１（ｉｎｃｒｅａｓｅ ｆｒｕｉｔ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ １）を提供し、それコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列である。
【0005】
本発明は、上記遺伝子の使用をさらに提供する。トマト中でＩＦＷ１遺伝子をノックアウトすることでその果実の大きさを効果的に増大（顕著に増大）させ、収量を向上させることができる。
【0006】
本発明のトマト果実の増大におけるＩＦＷ１遺伝子の使用の改良：
ＩＦＷ１遺伝子の２つのノックアウト株は、ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２であり、ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２植物体中のＩＦＷ１遺伝子変異配列はいずれも配列番号２に示される配列である。
ＩＦＷ１遺伝子の２つのノックアウト株は、ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２であり、ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２植物体中のＩＦＷ１遺伝子変異配列はいずれも配列番号２に示される配列である。
【0007】
本発明は、トマト中でＩＦＷ１遺伝子をノックアウトする方法をさらに提供する。この方法は、以下のステップを含む。
１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により、遺伝子編集される標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧ－３’を設計する。
２）ステップ１）で得られた配列を用いてプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターに構築する。
３）ステップ２）で得られたベクターを野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに遺伝的変換し、対応する遺伝子組換え植物体を得る。前記遺伝子組換えトマト植物体からＩＦＷ１遺伝子がノックアウトされた植物体を同定する。
１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により、遺伝子編集される標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧ－３’を設計する。
２）ステップ１）で得られた配列を用いてプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターに構築する。
３）ステップ２）で得られたベクターを野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに遺伝的変換し、対応する遺伝子組換え植物体を得る。前記遺伝子組換えトマト植物体からＩＦＷ１遺伝子がノックアウトされた植物体を同定する。
【0008】
本発明の技術的解決策は、以下の通りである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、ＩＦＷ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）に基づいてＩＦＷ１遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡ配列を合成し、対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに遺伝的変換し、ゲノム中のＩＦＷ１遺伝子を特異的に編集し、遺伝子組換え植物体を取得し、遺伝子組換え植物体中のＩＦＷ１遺伝子に対してＰＣＲ増幅およびシーケンシングを行い、ＩＦＷ１遺伝子が得られた異なるノックアウト株ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２を同定する（図１）。ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２植物体におけるＩＦＷ１遺伝子の変異配列は、いずれも配列番号２である。果形を比較した結果、ＩＦＷ１遺伝子ノックアウト植物体の成熟果実の大きさ（図２、図３）および重量は、いずれも野生型対照品種（図４）よりも顕著に高く、トマト中でＩＦＷ１遺伝子をノックアウトすることにより果実中の生物量の合成の増加を効果的に促進でき、重要な育種価値を有する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、ＩＦＷ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）に基づいてＩＦＷ１遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡ配列を合成し、対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに遺伝的変換し、ゲノム中のＩＦＷ１遺伝子を特異的に編集し、遺伝子組換え植物体を取得し、遺伝子組換え植物体中のＩＦＷ１遺伝子に対してＰＣＲ増幅およびシーケンシングを行い、ＩＦＷ１遺伝子が得られた異なるノックアウト株ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２を同定する（図１）。ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２植物体におけるＩＦＷ１遺伝子の変異配列は、いずれも配列番号２である。果形を比較した結果、ＩＦＷ１遺伝子ノックアウト植物体の成熟果実の大きさ（図２、図３）および重量は、いずれも野生型対照品種（図４）よりも顕著に高く、トマト中でＩＦＷ１遺伝子をノックアウトすることにより果実中の生物量の合成の増加を効果的に促進でき、重要な育種価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施形態をさらに詳しく説明する。
【図1】トマトＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位およびシーケンシング結果である。
【図2】トマトＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株と野生型対照ＭｉｃｒｏＴｏｍの果形との比較図である。
【図3】トマトＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株と野生型対照ＭｉｃｒｏＴｏｍの果実の大きさの測定である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
ステップ１：トマトＩＦＷ１遺伝子がノックアウトされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築
オンラインプロフェッショナルソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により、ＩＦＷ１遺伝子のコード配列（配列番号：１）においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集される標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧ－３’を設計し、バイオテクノロジー企業で対応するプライマー配列：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧ－３’および５’－ＡＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＡ－３’を合成した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ，Ｃｈｉｎａ）により対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築した。構築は製品マニュアルに従って操作した。
オンラインプロフェッショナルソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により、ＩＦＷ１遺伝子のコード配列（配列番号：１）においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集される標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧ－３’を設計し、バイオテクノロジー企業で対応するプライマー配列：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧ－３’および５’－ＡＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＡ－３’を合成した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ，Ｃｈｉｎａ）により対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築した。構築は製品マニュアルに従って操作した。
【0011】
ステップ２：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターで構築されたトマト遺伝的変換
Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ，ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ，２００８）により、ステップ１で構築されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをトマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに遺伝的変換し、遺伝子組換えトマト植物体を得た。
Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ，ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ，２００８）により、ステップ１で構築されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをトマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに遺伝的変換し、遺伝子組換えトマト植物体を得た。
【0012】
ステップ３：遺伝子組換えトマト中のＩＦＷ１遺伝子のシーケンシング分析
遺伝子組換えトマト植物体の葉を０．１ｇとり、液体窒素で粉砕した後、６００μｌ抽出液（１５．７６ｇＴｒｉｓ－ｃｌ，２９．２２ｇＮａＣｌ，１５．０ｇＳＤＳ粉末に超純水を１Ｌまで加え、ｐＨ＝８．０に調整）を加え、６５℃で６０ｍｉｎインキュベートした。２００μｌの５Ｍ ＫＡＣを加え、均一に混合した後、氷浴で１０ｍｉｎ冷却した後、５００μｌクロロホルムを加え、均一に混合し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、５００μｌイソプロパノールを加え、均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、７５％エタノールで沈殿を洗浄し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、逆さまにしてＤＮＡを１５分間乾燥させた後、３０μｌ純水を加えてＤＮＡを溶解した。
遺伝子組換えトマト植物体の葉を０．１ｇとり、液体窒素で粉砕した後、６００μｌ抽出液（１５．７６ｇＴｒｉｓ－ｃｌ，２９．２２ｇＮａＣｌ，１５．０ｇＳＤＳ粉末に超純水を１Ｌまで加え、ｐＨ＝８．０に調整）を加え、６５℃で６０ｍｉｎインキュベートした。２００μｌの５Ｍ ＫＡＣを加え、均一に混合した後、氷浴で１０ｍｉｎ冷却した後、５００μｌクロロホルムを加え、均一に混合し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、５００μｌイソプロパノールを加え、均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、７５％エタノールで沈殿を洗浄し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、逆さまにしてＤＮＡを１５分間乾燥させた後、３０μｌ純水を加えてＤＮＡを溶解した。
【0013】
ＩＦＷ１遺伝子ＰＣＲ増幅用の上流プライマー５’－ＡＡＣＧＴＴＣＡＡＣＧＧＡＣＡＡＴＣ－３’および下流プライマー５’－ＣＡＡＴＡＡＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＡＴ－３’を合成し、遺伝子組換えトマト植物体およびその対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＩＡＮＧＥＮ社）を用いてＩＦＷ１遺伝子に対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅系は、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μｌ、上流プライマーおよび下流プライマー（１０μＭ）それぞれ１μｌ、テンプレートＤＮＡ １μｌ（＜１μｇ）、無菌水７μｌ（合計２０μｌ）であった。ＰＣＲ増幅プログラムは、予備変性：９４℃、５分間；変性：９４℃、３０秒；アニーリング：５５℃、３０秒；伸長：７２℃、３５秒；３５×サイクル；伸長：７２℃、１０分間であった。
【0014】
ＰＣＲ生成物に対してシーケンシング分析を行った後、ＩＦＷ１遺伝子が成功にノックアウトされた２つの株ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２を同定した。この２つの株の植物体におけるＩＦＷ１遺伝子コード領域にはいずれも２つの塩基が欠失することで（図１）、ＩＦＷ１遺伝子にフレームシフト変異が発生し、この遺伝子機能の喪失が引き起こされた。ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２株植物体におけるＩＦＷ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２に示される配列である。
【0015】
ステップ４：トマト果実の大きさの測定
同定されたＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株ｉｆｗ１－１、ｉｆｗ１－２および野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを温室（２５℃、照明１６時間、暗所８時間）で植え付けた。トマト果実が熟した後、各品種からランダムに３株を選択し、各株から３つの熟した果実を取って果柄を除去した。ノギスを用いて各トマト果実の最大直径（ｃｍ）を測定し、各品種果実の直径の平均値を計算し、測定結果についてｔ検定によりｉｆｗ１－１（またはｉｆｗ１－２）ノックアウト株と野生型対照との間の有意性を分析した。得られた結果として、ＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２の果実の直径はいずれも野生型対照よりも顕著に大きく（図２、３）、それぞれ対照品種よりも２３．２％および２５．９％増大した。
同定されたＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株ｉｆｗ１－１、ｉｆｗ１－２および野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを温室（２５℃、照明１６時間、暗所８時間）で植え付けた。トマト果実が熟した後、各品種からランダムに３株を選択し、各株から３つの熟した果実を取って果柄を除去した。ノギスを用いて各トマト果実の最大直径（ｃｍ）を測定し、各品種果実の直径の平均値を計算し、測定結果についてｔ検定によりｉｆｗ１－１（またはｉｆｗ１－２）ノックアウト株と野生型対照との間の有意性を分析した。得られた結果として、ＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２の果実の直径はいずれも野生型対照よりも顕著に大きく（図２、３）、それぞれ対照品種よりも２３．２％および２５．９％増大した。
【0016】
ステップ５：トマト果実の重量測定
ステップ４で培養したトマト果実を取り、電子天秤で各トマト果実の重量（ｇ）を秤量し、各品種の果実重量の平均値を計算した。測定結果について、ｔ検定によりｉｆｗ１－１（またはｉｆｗ１－２）ノックアウト株と野生型対照との間の有意差を分析した。得られた結果として、ＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２果実の重量はいずれも野生型対照よりも顕著に大きく（図４）、それぞれ対照品種よりも５１．７％および５７．４％増大した。
ステップ４で培養したトマト果実を取り、電子天秤で各トマト果実の重量（ｇ）を秤量し、各品種の果実重量の平均値を計算した。測定結果について、ｔ検定によりｉｆｗ１－１（またはｉｆｗ１－２）ノックアウト株と野生型対照との間の有意差を分析した。得られた結果として、ＩＦＷ１遺伝子ノックアウト株ｉｆｗ１－１およびｉｆｗ１－２果実の重量はいずれも野生型対照よりも顕著に大きく（図４）、それぞれ対照品種よりも５１．７％および５７．４％増大した。
【0017】
以上の説明は、本発明のいくつかの具体的な実施例に過ぎない。本発明は、以上の実施例に限定されず、たくさんの変形例を含む。当業者が本発明の開示内容から直接導出または想到できる全ての変形は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トマト果実を増大させる方法であって、トマト中でＩＦＷ１遺伝子をノックアウトすることによりトマト果実の大きさを増大させ、収量を向上させる工程を含み、
前記ＩＦＷ１遺伝子でコードされるヌクレオチド配列は配列番号１に示される配列であることを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記ノックアウトにより得られるトマトＩＦＷ１遺伝子の変異配列が、配列番号２に示される配列であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。【国際調査報告】