特表 2023-526770 三量体を形成する新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルス感染症２０１９）の組換えスパイクタンパク質および植物における上記組換えスパイクタンパク質の大量生産方法と、これを基盤とするワクチン組成物の製造方法（植物における新型コロナウイルスの三量体スパイクタンパク質の生産方法およびワクチン接種のための使用）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-23

(54)【発明の名称】三量体を形成する新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルス感染症２０１９）の組換えスパイクタンパク質および植物における上記組換えスパイクタンパク質の大量生産方法と、これを基盤とするワクチン組成物の製造方法（植物における新型コロナウイルスの三量体スパイクタンパク質の生産方法およびワクチン接種のための使用）

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/82 20060101AFI20230616BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230616BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20230616BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230616BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230616BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230616BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230616BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230616BHJP

   A01H 5/12 20180101ALI20230616BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20230616BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20230616BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230616BHJP

   A01H 6/82 20180101ALN20230616BHJP

【ＦＩ】

C12N15/82 120Z

C12N15/12 ZNA

C12N15/50

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/62 Z

A01H5/12

A01H5/00 A

A61K39/215

A61P31/14

A01H6/82

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022564531

(86)(22)【出願日】2021-04-22

(85)【翻訳文提出日】2022-12-15

(86)【国際出願番号】 KR2021005124

(87)【国際公開番号】W WO2021215857

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】10-2020-0048980

(32)【優先日】2020-04-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520355529

【氏名又は名称】ポステック・リサーチ・アンド・ビジネス・ディヴェロップメント・ファウンデイション

【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】（ＪＩＧＯＫ‐ＤＯＮＧ）， ７７， ＣＨＥＯＮＧＡＭ‐ＲＯ，ＮＡＭ‐ＧＵ， ＰＯＨＡＮＧ‐ＳＩ， ＧＹＥＯＮＧＳＡＮＢＵＫ‐ＤＯ ３７６７３，ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ

(71)【出願人】

【識別番号】522413146

【氏名又は名称】コリア ナショナル インスティテュート オブ ヘルス

(71)【出願人】

【識別番号】519142114

【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】ファン，イン ファン

(72)【発明者】

【氏名】ソン，シジェン

(72)【発明者】

【氏名】エムディー，リザウル イスラム カーン

(72)【発明者】

【氏名】ディアオ，ハイピン

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ウン ジュ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ボ ファ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，チャン フン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ウ ニョン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ヨン ジェ

【テーマコード（参考）】

2B030

4B065

4C085

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB03

2B030AD09

2B030CA17

2B030CB02

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA88Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD18

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA71

4C085BB11

4C085CC01

(57)【要約】

本発明は、三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質および植物における上記組換えスパイクタンパク質を大量生産する方法に関するもので、詳しくは免疫原性の増進および効果的な抗原伝達のための目的で三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を発現する組換え遺伝子をデザインする方法および植物における上記組換えスパイク組換えタンパク質を大量生産する方法に関するものである。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸配列が欠如したタンパク質；
コロナウイルススパイクタンパク質のＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までのアミノ酸配列を含むタンパク質；またはコロナウイルススパイクタンパク質のサブユニット２における膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸配列が欠如したタンパク質；をコードする遺伝子；および
（ｉｉ）コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子；を含む、三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項2】

前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－コロナウイルス）、ＭＥＲＳ（ＭＥＲＳ－コロナウイルス）および新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－コロナウイルス－２）からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項3】

前記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸配列が欠如したタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項4】

前記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸配列が欠如したタンパク質をコードする遺伝子は配列番号１の塩基配列を含む、請求項２に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項5】

前記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質のＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までを含むタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項6】

前記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質のＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までを含むタンパク質をコードする遺伝子は配列番号３の塩基配列を含む、請求項３に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項7】

前記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質は配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項8】

前記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子は配列番号５の塩基配列を含む、請求項１に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項9】

前記ベクターは、バイナリーベクターである、請求項１に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項10】

前記組換えベクターは、カリフラワーモザイクウイルスから由来した３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスから由来した１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、Ｍａｃプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーターおよびユビキチンタンパク質プロモーターからなる群から選択されるいずれかのプロモーターを追加して含む、請求項１に記載の三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクター。

【請求項11】

請求項１に記載の組換えベクターに形質転換された、形質転換生物。

【請求項12】

請求項１１において、前記形質転換された形質転換生物が、原核生物または真核生物である、形質転換体。

【請求項13】

（ａ）請求項１に記載の組換えベクターを製造する段階；
（ｂ）前記組換えベクターを生物に導入して形質転換生物を製造する段階；
（ｃ）前記形質転換生物を培養する段階；
（ｄ）前記培養物を植物に浸潤する段階；および
（ｅ）前記植物を粉砕して三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を得る段階を含む、
植物から三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産する方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の植物から三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産する方法により製造された、組換えタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質および植物における上記組換えスパイクタンパク質を大量生産する方法に関するもので、詳しくは免疫原性の増進および効果的な抗原伝達を目的として三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を発現する組換え遺伝子をデザインする方法および植物における上記組換えスパイクタンパク質を大量生産する方法に関するものである。そして、植物から生産された三量体スパイクタンパク質（三量体スパイクタンパク質）を用いて新型コロナウイルスに対して効果的なワクチン物質を提供するものである。

【背景技術】

【0002】

最近、植物から組換えタンパク質を低コストで生産できる可能性が提案され、様々な試みが進められている（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇほか研究陣、２００３；Ｈｏｌｔｚほか研究陣、２０１５；Ｍａｒｕｓｉｃほか研究陣、２０１６）。特に、多様な医療用タンパク質の生産の可能性などを確認する研究が進められている。植物から組替えタンパク質を生産する場合、様々なメリットがあるが、その一つは大腸菌など微生物に存在する内毒素のように毒素がほとんど存在しないということと人体に感染しうる病原体がないということである。またプリオンのような有害なタンパク質もないことが知られており、動物細胞や微生物に比べて安全な組換えタンパク質を生産できるということである。また、製造単価においても動物細胞よりは非常に安価であり、植物の栽培方法によって大規模な生産においては大腸菌などの微生物よりも経済的である。このような可能性を実現するためには、いくつかの必須技術の開発が必要である。その中で最も重要な技術は、植物における遺伝子の高発現を誘導するための発現ベクターの開発である（Ｓｔａｕｂほか研究陣、２０００；Ｒｅｇｎａｒｄほか研究陣、２０１０）。植物では、様々な方法を通じて遺伝子の発現を誘導することができる。組換え遺伝子を植物体のゲノムに導入させる方法、葉緑体ゲノムに導入させる方法、アグロバクテリウムを用いて一過性のある遺伝子を発現させる方法など様々な方法が可能である（Ａｒｚｏｌａほか研究陣、２０１１；Ｗｅｒｎｅｒほか研究陣、２０１１）。核ゲノムや葉緑体ゲノムに組換え遺伝子を導入させる方法は、基本的に形質転換体を確保する過程を通じて植物からタンパク質を生産することになる。一方、アグロバクテリウムを植物組織に浸透させ、遺伝子の一過性発現を誘導してタンパク質を生産する場合、形質転換体の製造過程が含まれないためタンパク質の生産期間が短く、概ね形質転換体によるタンパク質の生産に比べてタンパク質の生産水準が著しく高いメリットがある（Ａｒｚｏｌａほか研究陣、２０１１）。また、植物の持つ異なる遺伝子の発現抑制機構を、遺伝子沈黙抑制因子を共同－湿潤させて抑制することができるため、タンパク質の発現水準をさらに高く誘導することができる（Ｇａｒａｂａｇｉほか研究陣、２０１１）。しかし、一過性発現をしようとするたびに目的遺伝子を含むバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムの培養と、ｐ３８遺伝子沈黙抑制因子を発現するバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムの培養を別々に作り、これを適切な割合で混ぜて共同－湿潤させる過程を遂行しなければならない短所がある。特に、二種類のアグロバクテリウムを培養する場合、時間や経済的な面で限界がある。

【0003】

コロナウイルスは、アデノウイルス、ライノウイルスとともに人に風邪を引き起こす三大ウイルスの一つで、人と様々な感染がありうる遺伝子サイズ２７～３２ｋｂのＲＮＡウイルスである。電子顕微鏡で見ると、ウイルス粒子の表面が突起のように飛び出ているが、この形がまるで王冠のようだとして、ラテン語で王冠を意味する「コロナ」から派生して名づけられた。主に寒い冬に発生する成人の風邪の１０～３０を占め、頭痛や咽喉痛、咳を伴う鼻風邪を主な症状とする。コロナウイルスは、１９３０年代に鶏から初めて発見されて以来、犬、豚、鳥類などの動物から発見され、１９６０年代には人からも発見された。コロナウイルスは、動物と人の両方から発見され、人の活動領域が広範囲になるにつれて、動物の間だけで流行していたウイルスが生存のために遺伝子変異を起こして人に移ることもある。例えば、ＳＡＲＳ（コウモリとジャコウネコ）、ＭＥＲＳ（コウモリとラクダ）、新型コロナウイルス（コウモリと推定）がこれに該当する。これまでに発見されたコロナウイルスは、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタの４属に分類される。ここでアルファは、再び１ａ型と１ｂ型に分かれ、ベータは２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ型に分かれる。このうちアルファとベータは、人と動物に感染し、ガンマとデルタは動物に感染する。現在までに確認された人体伝染コロナウイルスは７種であり、ＨＣｏＶ ２２９Ｅ、ＨＣｏＶ ＮＬ６３、ＨＣｏＶ ＯＣ４３、ＨＣｏＶ ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がこれに該当する。このうち４種（２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１）は、風邪に似た軽い症状だけを起こす。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群）とＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群）、新型コロナウイルス感染症（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２）は、重症肺炎など深刻な呼吸器疾患を引き起こす可能性があり、多くの死者を発生させる。

【0004】

新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）は、２０１９年１２月に中国武漢で初めて発生して以来、中国全域と世界中に広まった、新しいタイプのコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。新型コロナウイルスは、非常に高い伝播率を示し、特に伝染性が高い。新型コロナウイルスに感染すると、約２～１４日（推定）の潜伏期を経た後、発熱（３７．５度）、咳、呼吸困難などの呼吸器症状、肺炎が主な症状として現れるが、無症状感染事例も珍しくない。新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）のスパイク（Ｓ）タンパク質は、非常に大きなエクトドメイン領域、単一膜貫通（膜貫通ドメイン；ＴＭＤ）および短い細胞質の尾を含むタイプ１の膜糖タンパク質である。上記スパイクタンパク質は、他のコロナウイルスのスパイク（スパイク；Ｓ）タンパク質と同様にウイルスの表面に三量体として存在し、ウイルスの宿主細胞への侵入に必要な受容体結合領域と、細胞への侵入時にウイルス膜と細胞小器官膜の間の融合を誘導する融合ペプチドを持っており、自然宿主において、上記スパイクタンパク質に対する中和された抗体を誘導するなどの役割をするとされている。上記コロナスパイクタンパク質は、ウイルス膜の表面に三量体として存在する。したがって、三量体型のスパイクタンパク質が抗原として作用すると考えられ、中和抗体の誘導にも三量体が重要であると考えられる。同様にインフルエンザウイルスの場合も、ＨＡタンパク質がウイルスの表面に三量体として存在し、この三量体の形成は抗原性が高いとされている。

【0005】

組換えタンパク質は、安全性では優れているが、生ウイルスに比べると免疫原性が低く、生産単価が高い点が短所である。したがって、この安全性に優れた組換えタンパク質を用いて効率的に予防するためには、様々な免疫反応を誘導することができ、高い免疫反応を誘導できる高免疫原性の組換えタンパク質ワクチンを製造することが必須であり、また、効果的な伝達ができるように製造された組換えタンパク質が必要である。

【0006】

新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を用いてワクチンを開発しようとした。スパイクタンパク質は、新型コロナウイルスが感染する間、Ｓ１とＳ２の二つのサブユニットで過程が起こり、感染に必要な受容体に結合する領域はＳ１に存在し、Ｓ２は融合ペプチドを持つことになる。したがって、抗原としてＳ１、Ｓ２、または全長を使用した場合、防御的な免疫効果においてどのような効果を与えるか予測することは容易ではない。Ｓ１は、ＲＢＤを持っているので、ＲＢＤに結合する抗体を誘導することができ、このような抗体の結合を通じて受容体の結合を妨害してウイルスの感染を防ぐことができるだろう。一方、Ｓ１は最も多くの突然変異が導入される部分を含んでいるため、多様な変種をカバーできない可能性も存在する。また、Ｓ２の場合には、誘導される抗体がウイルスが受容体に結合するのを防ぐことはできないが、融合段階を妨害する抗体を生成することもできると予測できる。全長の場合、二つの部分をすべて含むので、受容体にウイルスの結合を妨害する抗体と融合過程を妨害する抗体を誘導することもできるだろう。しかし、抗原として使用されるタンパク質の生産において、Ｓ１とＳ２に比べてより難しいこともある。

【0007】

このような様々な考慮を基に、スパイクタンパク質を植物から抗原として生産するために、組換え遺伝子を構築しようとした。組換えタンパク質の大量生産のために、ＴＭＤと細胞質ドメインを除いた全長エクトドメインを用いて組換えタンパク質を作ろうとした。特に、スパイクタンパク質がウイルスの表面に存在する形態であるエクトドメインのみを用いて三量体を作り、抗原性を高めようとした。このために、新型コロナウイルスのスパイク（スパイク；（ｓ））において１６番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計１１９８個の残基を含む切片（ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）と命名）を用いた。また、コロナウイルスのスパイクタンパク質において、リーダー配列のないＮ末端（１６番目のアミノ酸）からサブドメイン２（ＳＤ２）（６８１番目のアミノ酸）までを含むＳ１サブユニット（Ｓ１ｓと命名）；スパイクタンパク質の中で突然変異が起こりにくいとされるＳ２サブユニットのＣ末端領域に存在するＴＭＤと細胞質テール領域のない切片（６８２番目のアミノ酸からまで１２１３番目のアミノ酸までを含む部位で、計５３２個の残基、［Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）］と命名）を用いて植物から発現システムを構築しようとした。植物から生産されたこれら２種類の組換えタンパク質を作り、これらを抗原物質として活用してワクチンとして開発しようとした。スパイクタンパク質の全長は、ウイルスの表面に存在するときに三量体を形成するが、スパイクタンパク質をコードする遺伝子のうちＴＭＤおよび細胞質領域のないエクトドメインやＴＭＤと細胞質ドメインのないＳ２をコードする部分を用いて組換えタンパク質を作れば、上記組換えタンパク質は三量体を形成しにくいと推定した。ワクチンの目的で使用するために、これら二種類の組換えタンパク質を植物から三量体の形態で生産する技術を開発しようとした。このように製造された組換えスパイクタンパク質を発現できるベクターを植物から高発現させるバイナリーベクターを構築した。

【0008】

また、本発明は、植物細胞に作られたこれらタンパク質を純粋分離精製し、ワクチンの組成を提供することを目的とする。植物細胞に作られたタンパク質の収率を高めるためには、適切なバッファーの組成が重要である。これらタンパク質は、大きさが大きく高度に糖化されたタンパク質であるため、可溶化のために様々なバッファー組成を比較分析して最適なバッファー組成を確保しなければならない。そして、タンパク質の分離精製は、Ｃ末端に存在するＨｉｓタグを用いてＮｉ２＋－ＮＴＡ親和性カラムクロマトグラフィーおよびサイズ排除ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより純粋分離精製しようとした。

【0009】

そして、このように生産されたスパイクタンパク質の三量体形態の様々なタンパク質を利用してマウスとハムスターに免疫注射を通じて抗体誘導の程度を確認することができ、このように誘導された抗体がどの程度の防御能力（ＰＲＮＴ５０）を持つか確認することができる。また、ハムスターの場合、新型コロナウイルスに対してある程度感受性を持っているため、実際に新型コロナウイルスの攻撃接種を通じてウイルスの増殖に対する抑制の程度を確認することができる。このような過程を通じて最適なワクチン候補物質を選抜することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、上記の問題を解決するためのもので、本発明の目的は（ｉ）コロナウイルスの全長スパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したタンパク質（ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）；またはコロナウイルスのスパイクタンパク質においてリーダー配列を除いたＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までを含むＳ１サブユニットタンパク質（Ｓ１ｓ）；またはコロナウイルスのスパイクタンパク質のＳ２サブユニットにおいて膜貫通ドメインからＣ末端までが欠如したタンパク質Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）；をコードする遺伝子および（ｉｉ）マウスコロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコートする遺伝子；分離精製のために５つのヒスチジン残基をコードする遺伝子；そして植物の小胞体に蓄積されるようにするＥＲ保留モチーフであるＨＤＥＬをコードする遺伝子；を含む、三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓｆｕｌｌ－ｔと命名）、Ｓ１：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ１ｓ－ｔと命名）またはＳ２Δ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ２ｓ－ｔと命名）タンパク質を生産するための組換えベクターを提供することである。そして、対照群としてｍＣｏｒを持たないＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓｆｕｌｌ－ｍと命名）、Ｓ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ１ｓ－ｍと命名）またはＳ２Δ（ＴＭＤ－ＣＴ）：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ２ｓ－ｍと命名）タンパク質を生産するための組換えベクターを提供することである。

【0011】

本発明の他の目的は、下記の段階を含む植物から三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産する方法を提供することである：
（ａ）上記組換えベクターを製造する段階；
（ｂ）上記組換えベクターを生物に導入して形質転換生物を製造する段階；
（ｃ）上記形質転換生物を培養する段階；
（ｄ）上記培養物を植物に浸潤する段階；および

【0012】

（ｅ）上記植物を粉砕して三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を得る段階。

【0013】

本発明の他の目的の一つは、スパイクタンパク質由来の組換えタンパク質であるＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓｆｕｌｌ－ｔと命名）、Ｓ１ｓ：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ１ｓ－ｔと命名）またはＳ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ２ｓ－ｔと命名）を植物細胞から発現した後、植物抽出物から高効率で分離精製するための条件を提供することである。

【0014】

本発明の他の目的は、これら複数のｓｐｉｋｅ由来の組換えタンパク質のうち２種類のＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬとＳ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬを用いて新型コロナウイルスを効果的に防御するワクチン組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明は、（ｉ）コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したタンパク質ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）；またはコロナウイルスのスパイクタンパク質のＳ１サブユニットを含むタンパク質（Ｓ１ｓ）；またはコロナウイルスのスパイクタンパク質のＳ２サブユニットにおいてＴＭＤからＣ末端まで欠如したタンパク質Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）；をコードする遺伝子、および（ｉｉ）コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子；分離精製のために５つのヒスチジン残基をコードする遺伝子；そして植物の小胞体に蓄積されるようにするＥＲ保留モチーフであるＨＤＥＬをコードする遺伝子；を含む三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質Ｓｆｕｌｌ－ｔまたはＳ２ｓ－ｔを生産するための組換えベクターを提供する。

【0016】

上記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－コロナウイルス）、ＭＥＲＳ（ＭＥＲＳ－コロナウイルス）および新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－コロナウイルス－２）からなる群から選択されるいずれかである。

【0017】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含めることができる。

【0018】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列を含めることができる。

【0019】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＳ１サブユニット、「１６番目のアミノ酸から６８１番目のアミノ酸までを含むタンパク質」（Ｓ１ｓ）は、配列番号４のアミノ酸配列を含めることができる。

【0020】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＳ１サブユニット、「１６番目のアミノ酸から６８１番目のアミノ酸までを含むタンパク質」をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を含めることができる。

【0021】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＳ２サブユニットの６８２番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸までを含むタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含めることができる。

【0022】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＳ２サブユニットの６８２番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸までを含むタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号５の塩基配列を含めることができる。

【0023】

上記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含めることができる。

【0024】

上記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号７の塩基配列を含めることができる。

【0025】

上記５’－ＵＴＲのコードする遺伝子は、配列番号１４の塩基配列を含めることができる。

【0026】

また、本発明は、上記組換えベクターにＨｉｓｘ５タグのタンパク質をコードする遺伝子を追加で含む三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクターを提供することができる。

【0027】

また、本発明は、上記組換えベクターにＨＤＥＬモチーフのタンパク質をコードする遺伝子を追加で含む三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクターを提供することができる。

【0028】

上記ＨＤＥＬモチーフのタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含めることができる。

【0029】

上記ＨＤＥＬモチーフドメインのタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１２の塩基配列を含めることができる。

【0030】

上記組換えベクターは、カリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスに由来する１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、Ｍａｃプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーターおよびユビキチンタンパク質プロモーターからなる群から選択されるいずれかのプロモーターを追加して含めることができる。

【0031】

また、本発明は、上記組換えベクターに形質転換された形質転換生物を提供することができる。

【0032】

上記形質転換された形質転換生物は、原核生物または真核生物であり得る。

【0033】

本発明は、下記の段階を含む植物から三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産する方法を提供することができる：
（ａ）上記組換えベクターを製造する段階；
（ｂ）上記組換えベクターを生物に導入して形質転換生物を製造する段階；
（ｃ）上記形質転換生物を培養する段階；
（ｄ）上記培養物を植物に浸潤する段階；および
（ｅ）上記植物を粉砕して三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を得る段階。

【0034】

本発明は、植物抽出物からＳｆｕｌｌ－ｔとＳ２ｓ－ｔタンパク質などをＮｉ２＋－ＮＴＡ親和性カラムクロマトグラフィーとサイズ排除カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製する過程を通じてワクチン候補物質の生産方法を提供することができる。

【0035】

本発明の他の目的は、これら２種類のスパイクタンパク質であるＳｆｕｌｌ－ｔとＳ２ｓ－ｔを用いて新型コロナウイルスを効果的に防御するワクチン組成物を提供することである。これらタンパク質を補助剤と一緒に、または補助剤なしで単独でワクチン組成物を提供することができ、タンパク質の量は１マイクログラムから３０マイクログラムに至る。

【発明の効果】

【0036】

本発明の三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質は、新型コロナウイルスのスパイクタンパク質の膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したスパイクタンパク質のエクトドメイン（エクトドメイン；１６番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計１１９８個の残基）で構成されたＳｅタンパク質、またはコロナウイルスのスパイクタンパク質においてＳ１サブユニットの「１６番目のアミノ酸から６８１番目のアミノ酸までを含むタンパク質」（計６６６個の残基）、またはコロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したＳ２サブユニットの６８２番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸までを含むタンパク質（計５３２個の残基）；をコードする遺伝子、マウスのコロニン１の三量体モチーフで三量体を形成して免疫性が増加し、Ｃ末端にＨＤＥＬを含めて植物の小胞体でタンパク質が蓄積されるようになっており、植物から多量に製造することができ、ＨｉｓタグドメインをＣ末端部位に含めてタンパク質の分離精製を容易にするようになっている組換えタンパク質を構成する。

【0037】

このように植物から生産された新型コロナウイルスのＳタンパク質のＳｆｕｌｌ－ｔ、またはＳ２ｓ－ｔ組換えタンパク質で構成されたワクチン組成物を含む。このワクチン組成物は、植物生産タンパク質だけでも構成することができ、アラム（ａｌｕｍ）などの補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含めることもできる。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】本発明で使用した複数の組換えベクターの構成を示した図面である。

【図2】Ｈｉｓタグ、ＨＤＥＬを持つＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）、Ｓ１ｓとＳ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）タンパク質とこれら３種類のタンパク質が追加的にｍＣｏｒ１を含むタンパク質を発現するニコチアナベンタミアナの総抽出物をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離した後、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット分析およびクマシーブリリアントブルーに染色した結果を示したものである。

【図3】ニコチアナベンタミアナ抽出物からＮｉ２＋－ＮＴＡ親和カラムクロマトグラフィーを用いてＳｆｕｌｌ－ｔとＳ２ｓ－ｔを純水分離精製し、これをＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開した後、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットで分析した後、膜を再びクマシーブリリアントブルーに染色した結果を示したものである。

【図4】ニコチアナベンタミアナ抽出物からＮｉ２＋－ＮＴＡ親和カラムクロマトグラフィーを用いて分離したＳｆｕｌｌ－ｔをサイズ排除カラムクロマトグラフィーで切片化し、これら分画をＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開した後、クマシーブリリアントブルーに染色した結果を示したものである。

【図5】ニコチアナベンタミアナ抽出物からＮｉ２＋－ＮＴＡ親和カラムクロマトグラフィーを用いて分離したＳｆｕｌｌ－ｔとＳｆｕｌｌ－ｍを純水分離精製し、これらをサイズ排除カラムクロマトグラフィーで切片化した後、これら切片を、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット分析した結果と分離精製したＳｆｕｌｌ－ｔを陰性染色した後、このタンパク質を、電子顕微鏡を用いてタンパク質の形態を確認した結果、三量体を形成することを確認した結果である。

【図6】ニコチアナベンタミアナ抽出物からＮｉ２＋－ＮＴＡ親和カラムクロマトグラフィーを用いて分離したＳ２ｓ－ｔをサイズ排除カラムクロマトグラフィーで切片化し、これら分画をＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開した後、クマシーブリリアントブルーに染色した結果を示したものである。

【図7】新型コロナウイルス植物ワクチン候補物質の実験動物（マウス、Ｂａｌｂ／ｃ）における免疫原性評価の結果を示したものである。このために、体液性免疫反応分析（図７Ｂ）、中和抗体誘導分析（図７Ｃ、Ｄ）および細胞媒介免疫反応分析（図７Ｅ）を行った後、その結果を示した。

【図8】新型コロナウイルス植物ワクチン候補物質の実験動物（ＴＧマウス）における保護効能評価を行った実験で、各免疫抗原は筋肉内の経路に２週間おきに計２回免疫し、免疫抗原に対する抗体の生成を確認するために、免疫前、１次免疫、２次免疫の２週間後に採血を行い、血清における抗体（ＩｇＧｓ）の生成および中和抗体の生成などの免疫原性評価を実施した結果を示し（図８Ａ）、植物ワクチン免疫による抗体誘導分析（図８Ｂ）、植物ワクチン免疫によるハムスターの攻撃接種による生存率および組織の力価を分析（図８Ｃ、Ｄ、Ｅ）した結果を示した。

【発明を実施するための形態】

【0039】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0040】

新型コロナウイルスの膜タンパク質として、細胞への浸透に重要とされるスパイクタンパク質は、新型コロナウイルスの感染を予防できるワクチン候補群と考えられる。本発明では、このスパイクタンパク質に基づいて多様な組換えタンパク質を作り、これらを活用してワクチンとして開発しようとした。スパイクタンパク質の全長は、ウイルスの表面に存在するとき、三量体を形成するが、スパイク遺伝子のうち全体または一部のエクトドメインのみをコードする部分を用いて組換えタンパク質を作れば、上記組換えタンパク質は三量体を形成しないと推定した。したがって、これら組換えタンパク質を用いてワクチンとして活用するためには、このタンパク質がウイルスの表面に存在するときのように三量体を形成することが重要であると考え、これらが可溶性形態で存在するときも、三量体を維持する技術を開発しようとした。本発明では、スパイクタンパク質のエクトドメインの全体［ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）］、Ｓ１ｓ、またはＴＭＤとＣ末端がないＳ２部位［Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）］の組換えタンパク質を植物から発現および生産するとき、三量体を形成するよう誘導する技術を開発しようとした。このため、大量生産できる新型コロナウイルのスパイク膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したスパイクタンパク質のエクトドメイン（Ｓｅ；１６番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計１１９８個の残基）、Ｎ末端からＳＤ２ドメインまでを含む部位（Ｓ１ｓ；１６番目のアミノ酸から６８１番目のアミノ酸まで、計６６６個の残基）、またはＳ２サブユニットでＴＭＤとＣ末端がない部位（Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）；６８２番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計５３２個の残基）を三量体構造を形成するマウスコロニン１の三量体モチーフに融合し、追加的にＨｉｓｘ５とＨＤＥＬをコードする部位に連結する構造体を構築した。これら組換えタンパク質に対する対照群としてｍＣｏｒ１がない構造体を構築した。上記の多様なスパイクタンパク質を含む組換え遺伝子を植物から高発現できるバイナリーベクターを構築した。

【0041】

本発明は、（ｉ）コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸配列が欠如したタンパク質（ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ））；またはコロナウイルスのスパイクタンパク質においてＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までを含むＳ１サブユニットタンパク質（Ｓ１ｓ）；またはコロナウイルススパイクタンパク質のＳ２サブユニットにおいて膜貫通ドメインとＣ末端までのアミノ酸配列が欠如したタンパク質、（Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ））；をコードする遺伝子；および（ｉｉ）コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子；を含む三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産するための組換えベクターを提供することができる。

【0042】

新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を用いてワクチンを開発するために、膜貫通ドメインからＣ末端までをなくしたスパイクタンパク質のエクトドメイン（Ｓの全長エクトドメイン；１６番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計１１９８個の残基）、またはＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までを含む部位（１６番目のアミノ酸から６８１番目のアミノ酸まで、計６６６個の残基）、またはＳ２のエクトドメイン（６８２番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計５３２個の残基）を用いて組換えタンパク質を作り、これを用いてワクチンとして開発しようとした。スパイクタンパク質の全長は、ウイルス表面に存在するときに三量体を形成するが、スパイクタンパク質をコードする遺伝子のうち、全体または一部のエクトドメイン部分を用いて発現させて組換えタンパク質を発現すれば、三量体を形成しにくいと予想し、上記三量体の未形成により免疫原性が低いと予想した。したがって、本発明では、本来スパイク全長タンパク質がウイルスの表面に存在するものと同じ三量体形態のスパイクタンパク質の全体、またはＮ末端からＳＤ２ドメインまでのＳ１ｃエクトドメイン、またはＳ２のエクトドメインの組換えタンパク質を作ろうとした。このために、本発明では、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）を選択し、マウスコロニン１（ｍＣｏｒ１）の１２２番目のアミノ酸から１５３番目のアミノ酸までの３２個の残基を、１２個のアミノ酸残基を持つリンカーを用いて融合させ、構造体を構築した。

【0043】

続いて、組換えタンパク質の分離精製のために５つのＨｉｓ残基を持つＨｉｓタグを融合させ、最後にＥＲに蓄積するためにＨＤＥＬモチーフを融合させて構造体を完成した（ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ、Ｓ１ｓ：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ、Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ、図１）。そして、上記３種類のスパイク組換えタンパク質においてｍＣｏｒ１がない構造体を構築して対照群として使用した。

【0044】

上記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－コロナウイルス）、ＭＥＲＳ（ＭＥＲＳ－コロナウイルス）および新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－コロナウイルス－２）からなる群から選択されるいずれかである。

【0045】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含めることができる。

【0046】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質において膜貫通ドメインからＣ末端まで欠如したタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【0047】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までを含むＳ１ｓタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含めることができる。

【0048】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＮ末端からサブドメイン２（ＳＤ２）までを含むＳ１ｓタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号３の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【0049】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＳ２タンパク質は、配列番号ｘのアミノ酸配列を含めることができる。

【0050】

上記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含めることができる。

【0051】

上記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号５の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号５の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【0052】

上記組換え遺伝子を、植物体発現ベクターであるｐＴＥＸ１に導入して植物発現ベクターを作った。新型コロナウイルスのスパイク遺伝子から６種類のエクトドメインの組換えタンパク質遺伝子を構築し（図１）、これらを植物（ニコチアナベンタミアナ）に導入して組換えタンパク質の発現を誘導した。これらの遺伝子を導入したニコチアナベンタミアナの葉抽出物におけるタンパク質の発現を確認するために、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。図２のとおりＳｆｕｌｌが約１８０ｋＤの位置で確認された。スパイクタンパク質のＮ－糖化を形成するため、計算上のタンパク質の位置より大きいと判断した。Ｓ１とＳ２は、それぞれ１００ｋＤと７５ｋＤの位置から出ており、これら二つのタンパク質も計算上の大きさよりも大きいので、これもＮ－糖化すると判断された（図２）。

【0053】

そして、これら２種類のタンパク質を純粋分離するために、ニコチアナベンタミアナの総抽出物を作り、これからＮｉ２＋－ＮＴＡ親和カラムクロマトグラフィーを用いて純粋分離精製した後、これをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離精製し、クマシーブリリアントブルーに染色した。これにより、２種類のスパイクタンパク質の組換えタンパク質を純粋分離精製できることを確認した（図３）。

【0054】

上記組換えベクターは、カリフラワーモザイクウイルスから由来した３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスから由来した１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、Ｍａｃプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーターおよびユビキチンタンパク質プロモーターからなる群から選択されるいずれかのプロモーターを追加して含めることができ、望ましくはＭａｃプロモーターであり得、より望ましくはＭａｃＴプロモーターであり得る。

【0055】

上記ＭａｃＴプロモーターは、Ｍａｃプロモーター塩基配列の３’末端塩基であるＡをＴに置き換えたプロモーターであり得、上記ＭａｃＴプロモーターは配列番号１７の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号１７の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましい場合は８０％以上、さらに望ましい場合は９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【0056】

上記組換えベクターは、ＲＤ２９Ｂ－ｔの終結部位を追加して含めることができ、上記ＲＤ２９Ｂ－ｔの終結部位は配列番号１８の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号１８の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【0057】

組換えタンパク質の遺伝子のＮ末端とＣ末端にそれぞれＢｉＰのシグナル配列とＥＲ保留シグナルであるＨＤＥＬを含むことで、ＥＲ（小胞体）に高濃度に蓄積を誘導する効果を得ることができる。上記組換えベクターは、ＢｉＰ（シャペロン結合タンパク質）およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドからなる群から選択されるいずれかを追加して含めることができ、上記ＢｉＰ（シャペロン結合タンパク質）は配列番号１２の塩基配列を含めることができ、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）は配列番号１０の塩基配列を含めることができる。

【0058】

上記組換えは、細胞が異種の核酸を複製したり、上記核酸を発現したり、またはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸によって暗号化されたタンパク質を発現する細胞を指すものである。組換え細胞は、上記細胞の天然形態では発見されない遺伝子または遺伝子の切片をセンスまたはアンチセンス形態で発現することができる。また、組換え細胞は、天然状態の細胞から発見される遺伝子を発現することができ、しかし、上記遺伝子は変形したものであり、人為的な手段によって細胞内に再導入されたものである。

【0059】

用語「組換え発現ベクター」は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルスまたは異なるベクターを意味する。概ね、任意のプラスミドおよびベクターは、宿主内で複製および安定化すれば使用できる。上記発現ベクターの重要な特性は、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御要素を有することである。上記組換え発現ベクターおよび適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターは、当業者に周知された方法により構築することができる。上記の方法は、試験管内組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術および生体内組換え技術などを含む。

【0060】

本発明の組換えベクターの望ましい例は、適当な宿主に存在するとき、それ自体の一部、いわゆるＴ－領域を植物細胞に転移させることができるＴｉプラスミドベクターである。異なるタイプのＴｉプラスミドベクターは、現在、植物細胞、または雑種ＤＮＡを植物のゲノム内に適当に挿入させる新しい植物が生産される原形質体で雑種ＤＮＡ配列を転移させるのに利用されている。Ｔｉプラスミドベクターの特に望ましい形態は、ＥＰ０１２０５１６Ｂ１号および米国特許第４，９４０，８３８号に請求されたような、いわゆるバイナリーベクターである。本発明に伴うＤＮＡを植物宿主に導入するのに利用され得る他の適合するベクターは、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）および一本鎖ウイルス、ジェミニウイルスなどに由来し得るようなウイルスベクター、例えば不完全性植物ウイルスベクターから選択することができる。そのようなベクターの使用は、特に植物宿主を適当に形質転換することが困難なときに有利である。

【0061】

また、本発明は、上記組換えベクターに形質転換された形質転換生物を提供することができる。

【0062】

上記の形質転換された形質転換生物は、原核生物または真核生物であり得、その例として、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）、大腸菌などの菌類、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（チャイニーズハムスターの卵巣）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株）および植物細胞などが利用され、望ましくはアグロバクテリウムになり得る。昆虫細胞、ヒト細胞などの場合、三量体を形成する組換えスパイクタンパク質をコードする遺伝子を、これら各種動物細胞の発現に必要な発現ベクターを用いて発現することができる。

【0063】

本発明のベクターを宿主細胞内に運ぶ方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２法、ハナハン法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７－５８０（１９８３））および電気穿孔法などにより実施することができる。また、宿主細胞が真核細胞である場合、微細注入法、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔法、リポソーム媒介形質感染法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、および遺伝子バームバードメントなどによりベクターを宿主細胞内に注入することができる。

【0064】

本発明は、下記の段階を含む植物から三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を生産する方法を提供することができる：
（ａ）上記組換えベクターを製造する段階；
（ｂ）上記組換えベクターを生物に導入して形質転換生物を製造する段階；
（ｃ）上記形質転換生物を培養する段階；
（ｄ）上記培養物を植物に浸潤する段階；および
（ｅ）上記植物を粉砕して三量体を形成するコロナウイルスの組換えスパイクタンパク質を得る段階。

【0065】

上記植物に湿潤する方法は、化学セル法、真空または注射器浸潤法があり、最も望ましいのは注射器浸潤法であるが、これに限られるわけではない。

【0066】

上記植物は、稲、小麦、麦、トウモロコシ、豆、ジャガイモ、小麦、小豆、エンバク、モロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、ニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、綿、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、アブラナを含む特用作物類；リンゴ、ナシ、ナツメ、桃、ブドウ、みかん、柿、スモモ、アンズ、バナナを含む果樹類；バラ、カーネーション、菊、ユリ、チューリップを含む花卉類から選択され得る。

【0067】

このように植物から生産した新型コロナウイルスのスパイクタンパク質をＣ末端のＨｉｓタグを用いてＮｉ２＋－ＮＴＡ親和性カラムクロマトグラフィーで分離精製することができる。そして、このように分離されたタンパク質は、純度を高めるために、再びサイズ排除ゲルクロマトグラフィーを用いて追加的に分離することができる。

【0068】

本発明のもう一つの目的は、これら植物生産コロナ－１９のスパイクタンパク質を用いてワクチン組成物を提供することである。スパイクタンパク質の三量体のＳｆｕｌｌ－ｔやＳ２ｓ－ｔをアラムと一緒にまたはアラムなしでワクチン組成物を構成することができる。

【0069】

以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を示す。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記の実施例により本発明の内容が限られるわけではない。
（実施例１）
三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質をコードする遺伝子の設計
新型コロナウイルス表面タンパク質由来ｓｐｉｋｅ（Ｓ）をＥＲルーメンに可溶性形態で発現するよう誘導するために、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）からＣ末端までをなくしたスパイクタンパク質のエクトドメイン（エクトドメイン；１６番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計１１９８個の残基、ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ））、Ｎ末端からＳＤ２ドメインまでを含むＳ１サブユニット部位（１６番目のアミノ酸から６８１番目のアミノ酸まで、計６６６個の残基）、またはＳ２のエクトドメイン部位（６８２番目のアミノ酸から１２１３番目のアミノ酸まで、計５６２個の残基）を確保した。上記新型コロナウイルスのスパイク遺伝子の５’末端にシロイヌナズナのタンパク質であるＢｉＰから確保したＥＲ標的化シグナルを融合させてＥＲターゲティングできるようにした。そして、このように作られた組換えスパイクタンパク質の三量体の形成を誘導するために、マウスのｍコロニン１というタンパク質から同種の三量体の形成を誘導するモチーフをリンカーによってこれらスパイクタンパク質のＣ末端に融合し、Ｈｉｓｘ５タグおよびＥＲ保留モチーフであるＨＤＥＬをスパイクタンパク質の精製およびＥＲにおける高蓄積のために、ｍＣｏｒ１のＣ末端に順次融合させて構造体を構築した。発現のためにｍａｃＴを使用し、Ｒｄ２９ｂの末端を転写終結因子として使用した。上記の転写終結因子は、以前の研究の結果、高い転写効率を示すことが確認された。実験に使用される塩基配列は、下記表１のとおりである（図１）。

【0070】

そして、これらの構造体をｐＴＥＸに導入し、最終的な植物発現ｖｅｃｔｏｒ９種を構築した。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

（実施例２）
三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質をコードする遺伝子の発現および確認

【0071】

図１に表示された６種類の構造体［ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓｆｕｌｌ－ｔ）、ＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓｆｕｌｌ－ｍ）、Ｓ１ｓ：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ１ｓ－ｔ）、Ｓ１ｓ：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ１ｓ－ｍ）、Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：ｍＣｏｒ１：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬ（Ｓ２ｓ－ｔ）、Ｓ２ｓΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）：Ｈｉｓｘ５：ＨＥＤＬ（Ｓ２ｓ－ｍ）］を真空湿潤法を用いて４－５週齢のニコチアナベンタミアナ植物の葉から一過性発現を通じて発現を誘導した。浸潤した葉を５日後（ｄｐｉ）に収穫し，液体窒素で完全に粉砕し、３容積の緩衝液に溶解させた。浸潤した葉抽出物からの総可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開した後、これをウェスタンブロット分析を行った。スパイク（Ｓ）組換えタンパク質は、抗Ｈｉｓ抗体によってＳｆｕｌｌ－ｔとＳｆｕｌｌ－ｍが約１８０ｋＤの位置で確認され、Ｓ１ｓ－ｔとＳ１ｓ－ｍは１００ｋＤの位置で確認された。そして、Ｓ２ｓ－ｔとＳ２ｓ－ｍは、７５ｋＤの位置で確認された。ｍＣｏｒを持たない構造体とｍＣｏｒ１を持つタンパク質の位置を比較すると、ｍＣｏｒ１を持たないものよりも、やや小さく出ていることから、これらの違いはｍＣｏｒ１によるものと考えられる。また、これら６種の組換えタンパク質は、すべて計算上の大きさよりも大きいので、これはＮ－糖化のためと判断された（図２）。そして、同じメンブレンをクマシーブリリアントブルーに染色してバンドを確認したとき、ここでも観察された。これら組換えタンパク質の発現水準をバンドの強度から判断すると、浸潤した葉で２０－５０μｇ／ｇ生重量程度と推定された。
（実施例３）
三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質の分離精製

【0072】

２種類の新型コロナウイルスＳタンパク質の組換えタンパク質であるＳｆｕｌｌ－ｔとＳ２ｓ－ｔをニコチアナベンタミアナで発現させ、これらをＮｉ２＋－ＮＴＡ親和性カラムで分離精製し、これらをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより展開した後、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットを行い分離精製を確認した。そして、続いて膜をクマシーブリリアントブルーに染色した。これを通じて、２種類のスパイクタンパク質由来の組換えタンパク質を純粋分離精製できることを確認した（図３）。
（実施例４）
三量体を形成するＳｆｕｌｌ－ｔの組換えタンパク質のサイズ排除カラムクロマトグラフィーによる分離精製

【0073】

Ｎｉ２＋－ＮＴＡ親和性カラムで分離精製したＳｆｕｌｌ－ｔの組換えタンパク質を濃縮し、これらを再びサイズ排除カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製した。カラムで確保した切片を７番から２０番までをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより展開し、これを抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットを行い、Ｓｅの組換えタンパク質の位置と溶出した量を確認した。そして、その後、膜をクマシーブリリアントブルーに染色して他のタンパク質バンドの汚染を確認した（図４）。
（実施例５）
新型コロナウイルスのＳｆΔ（ＴＭＤ－ＣＴ）のｍＣｏｒ１があるものと、ないものの組換えタンパク質のサイズ排除カラムによる切片化における差の確認およびｍＣｏｒ１によるＳｆｕｌｌ－ｔ組換えタンパク質の三量体の形成

【0074】

Ｓｆｕｌｌ－ｔとＳｆｕｌｌ－ｍそれぞれを発現するニコチアナベンタミアナ葉抽出物からＮｉ２＋－ＮＴＡ親和性カラムでタンパク質を分離精製した後（図５Ａ、Ｂ）、これらタンパク質をサイズ排除カラムクロマトグラフィーを用いて切片化した後（図６Ｃ）、これら切片をＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いて精製した後、これら抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットｔｉｎｇして分析した（図５Ｄ）。分離したＳｆｕｌｌ－ｔタンパク質を陰性染色した後、電子顕微鏡でタンパク質の形態を観察して三量体の形成を確認した（図５Ｅ）。
（実施例６）
三量体を形成するＳ２ｅの組換えタンパク質のサイズ排除カラムクロマトグラフィーによる分離精製

【0075】

Ｎｉ２＋－ＮＴＡ親和性カラムで分離精製したＳ２ｓ－ｔの組換えタンパク質を濃縮し、これらを再びサイズ排除カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製した。カラムで確保した切片を７番から２０番までをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより展開し、これを抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットを行い、Ｓ２ｓ－ｔの組換えタンパク質の位置と溶出した量を確認した（図６）。
（実施例７）
新型コロナウイルス植物ワクチン候補物質の実験動物における免疫原性評価

【0076】

（１）新型コロナウイルス植物ワクチン候補物質の実験動物（マウス、Ｂａｌｂ／ｃ）における免疫原性評価
製造された植物ワクチンの免疫原性を評価するための動物実験は、６週齢の雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を使用し、実験群当たり５匹ずつ、免疫は４種類の用量（１、５、１５、３０μｇ）で実施した。各免疫抗原（Ｓｆｕｌｌ－ｔ）は、筋肉内の経路に２週間おきに計３回免疫し、免疫抗原に対する抗体の生成を確認するために、免疫前、１次免疫、２次免疫、３次免疫の２週間後に採血を実施して血清における抗体（ＩｇＧｓ）の生成および中和抗体の生成などの免疫原性評価を実施した。このとき、陰性対照群はＰＢＳを免疫した。

【0077】

１）体液性免疫反応分析
製造された植物ワクチンの免疫原性評価は、血清内で抗原の特異的な抗体が生成されるかをＥＬＩＳＡを通じて確認した。計２回または３回マウス免疫後に、十分なＩｇＧ力価が現れるのを確認し、本ワクチンによってＳ抗原のサブドメインであるＳ１、そしてＳ２の特異抗体がすべて生成されることを確認し、特にＳ２に対する力価が高く生成されることを確認することができた。また、免疫補助剤（水酸化アルミニウム）を同時に免疫したグループが同時投与しなかったグループに比べてＩｇＧの力価と中和抗体の力価が多少高いことが確認された。

【0078】

２）中和抗体誘導分析
製造された植物ワクチンで免疫されたマウスの血液から血清を分離した後、一般的にウイルス中和抗体を測定する方法のうち、「最適標準」として知られるプラーク減少中和抗体測定（ＰＲＮＴ）法を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の中和能を確認した。中和抗体の力価を分析するために、国家病原体資源銀行から分譲を受けたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＢｅｔａＣｏＶ／韓国／ＫＣＤＣ０３／２０２０）を用いて、ウイルスにマウスの血清（抗体）を処理した後、感染率の変化を確認した。また、最近報告されたイギリス変異株（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ変異株（Ｂ．１．３５１）に対する交差反応分析も実施した。

【0079】

中和抗体の誘導は、ＩｇＧの生成結果と同様に免疫抗原単独で注入した集団より、免疫補助剤を同時に免疫した集団においてより高い中和抗体の力価を示し、低い濃度で免疫した血清でより高い濃度で免疫した後、採取した血清でより高い中華抗体価を示すことを確認した。また、陰性対照群であるＰＢＳグループでは、中和抗体が誘導されていないことが確認できた（図７Ｃ）。また、最近問題となっているイギリス、そして南アフリカ変異株に対しても交差反応が見られることを確認した（図７Ｄ）。

【0080】

３）細胞媒介免疫反応分析
植物ワクチン免疫による細胞媒介免疫反応は、ＥＬＩＳＰＯＴ試験法によって分析した。ＥＬＩＳＰＯＳＴ分析は、商用ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴキットを使用した。細胞媒介免疫反応は、対照群（ＰＢＳグループ）に比べ、植物ワクチンで免疫したグループにおいてＩＦＮ－γを分泌する脾臓細胞の数が増加し、抗原量とは有意に比例しないことが確認できた。そして、免疫補助剤による増加効果は現れなかった。結論として、植物ワクチン免疫により体液性免疫と共に細胞性免疫反応が一緒に誘導されることが確認できた（図７Ｅ）。
（実施例８）
新型コロナウイルス植物ワクチン候補物質の実験動物（ＴＧマウス）における保護効能評価

【0081】

本発明により製造された植物ワクチンの保護効能を評価するための動物実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヒト受容体ＡＣＥ２が発現する６週齢形質転換マウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｉｍｎ／Ｊ）を使用し、実験群当たり１４匹ずつ（対照群１２匹）、免疫は２種類の用量（１５、３０μｇ）で実施した。各免疫抗原は、筋肉内の経路に２週間おきに計２回免疫し、免疫抗原に対する抗体の生成を確認するために、免疫前、１次免疫、２次免疫の２週間後に採血を行い、血清における抗体（Ｉｇｓ）の生成および中和抗体の生成などの免疫原性評価を実施した。このとき、陰性対照群はＰＢＳを免疫した。ウイルス攻撃接種は、最初の免疫から２８日後、２ｘ１０４ｐｆｕ／マウスの濃度で鼻腔感染を実施した後、生存率と組織の力価を測定した（図８Ａ）。

【0082】

１）植物ワクチン免疫による抗体誘導分析
製造された植物ワクチンで免疫されたマウスの血液から血清を分離した後、血清内で抗原の特異な抗体が生成されるかＥＬＩＳＡによって確認した。計２回の免疫後に十分なＩｇ力価が現れることを確認し、本ワクチンによってＳ抗原のサブドメインであるＳ１、そしてＳ２の特異抗体がすべて生成されることを確認し、免疫補助剤（水酸化アルミニウム）を同時に免疫したグループが同時投与しなかったグループに比べＩｇ力価が高いことが確認された（図８Ｂ）。

【0083】

２）植物ワクチン免疫によるハムスターの攻撃接種による生存率および組織力価分析
最初の免疫から２８日後、免疫原性が確認された形質転換マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に対する保護能を確認するために、ウイルスを鼻腔内に感染させ、感染後１４日間、体重、体温測定および臨床症状を観察した（図８Ｃ）。感染後、２週間、体重変化を測定した結果、植物ワクチンで免疫したハムスターにおいて陰性対照群であるＰＢＳグループに比べ少ない体重減少を示した。植物ワクチン免疫グループの生存率分析の結果、１５と３０μｇ免疫グループは１００％生存し、１５と３０μｇと免疫補助剤の同時投与集団は８０％の生存率を示した。そして、対照群（ＰＢＳ）免疫集団の生存率は、３匹のうち１匹生存（３３％）と確認された（図８Ｄ）。ウイルス攻撃接種に伴う肺組織内のウイルスの増殖様相および組織病理の所見を確認するために、感染後３、５、７日に解剖を行い、解剖した肺組織内のウイルス力価を測定した。植物ワクチン免疫グループにおいて対照群に比べ投与用量に比例してウイルス増殖の抑制が確認され、７日目に３０μｇと免疫補助剤の同時投与集団からはウイルスが検出されなかった（図８Ｅ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

2023526770000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-01-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0049】

上記新型コロナウイルスのスパイクタンパク質においてＳ２タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含めることができる。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0050】

上記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含めることができる。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0051】

上記コロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号７の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号７の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0055】

上記ＭａｃＴプロモーターは、Ｍａｃプロモーター塩基配列の３’末端塩基であるＡをＴに置き換えたプロモーターであり得、上記ＭａｃＴプロモーターは配列番号１５の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号１５の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましい場合は８０％以上、さらに望ましい場合は９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0056】

上記組換えベクターは、ＲＤ２９Ｂ－ｔの終結部位を追加して含めることができ、上記ＲＤ２９Ｂ－ｔの終結部位は配列番号１６の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号１６の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べ、追加または削除（すなわちギャップ）を含めることができる。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0057】

組換えタンパク質の遺伝子のＮ末端とＣ末端にそれぞれＢｉＰのシグナル配列とＥＲ保留シグナルであるＨＤＥＬを含むことで、ＥＲ（小胞体）に高濃度に蓄積を誘導する効果を得ることができる。上記組換えベクターは、ＢｉＰ（シャペロン結合タンパク質）およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドからなる群から選択されるいずれかを追加して含めることができ、上記ＢｉＰ（シャペロン結合タンパク質）は配列番号１１の塩基配列を含めることができ、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）は配列番号１２の塩基配列を含めることができる。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0070】

そして、これらの構造体をｐＴＥＸに導入し、最終的な植物発現ｖｅｃｔｏｒ９種を構築した。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

（実施例２）
三量体を形成する新型コロナウイルスの組換えスパイクタンパク質をコードする遺伝子の発現および確認

【国際調査報告】