特表 2023-526857 Ｔ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-23

(54)【発明の名称】Ｔ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20230616BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230616BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230616BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230616BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

A61K35/17

A61P35/00

A61P31/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022571181

(86)(22)【出願日】2021-05-13

(85)【翻訳文提出日】2023-01-16

(86)【国際出願番号】 PT2021050013

(87)【国際公開番号】W WO2021235959

(87)【国際公開日】2021-11-25

(31)【優先権主張番号】2007321.9

(32)【優先日】2020-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511115734

【氏名又は名称】インスティテュート デ メディシナ モレキュラー ジョアオ ロボ アントゥネス

【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ

【住所又は居所原語表記】Ｆａｃｕｌｄａｄｅ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ ｄｅ Ｌｉｓｂｏａ， Ａｖｅｎｉｄａ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｅｇａｓ Ｍｏｎｉｚ，１６４９－０２８ Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100187540

【弁理士】

【氏名又は名称】國枝 由紀子

(72)【発明者】

【氏名】ダ・コンセイソン・バランダス・フェレイラ，クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェルデホーエン，マルク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AA94X

4B065BB04

4B065BB19

4B065BD25

4B065BD39

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB64

4C087DA32

4C087NA05

4C087ZB26

4C087ZB31

(57)【要約】

本発明は、Ｔ細胞、および組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）を生産する方法に関する。本発明は、本発明の方法から得られた組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）自体、これらのＴ_ＲＭ細胞を含む組成物、ならびに癌の治療のための免疫療法などの治療における、これらのＴ_ＲＭ細胞および組成物の使用に関する。
【選択図】図１９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）の存在下でリンパ球を培養する工程、および／またはリンパ球を制御性Ｔ細胞と共培養する工程を含む、組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）を生産する方法。

【請求項2】

リンパ球がＴＧＦβの存在下で培養され、好ましくはリンパ球が制御性Ｔ細胞と共培養されない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

リンパ球がナイーブ、エフェクターまたは記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ＴＧＦβが０．０１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

リンパ球が、ヒトまたは非ヒト動物の組織から得られたものであり、任意選択で、組織が、血液、脾臓、リンパ節、肺、胃腸管、皮膚、前立腺乳腺組織、肝臓、骨髄および膵臓からなる群から選択され得る、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

Ｔ_ＲＭが、分化クラスター８（ＣＤ８）、分化クラスター６９（ＣＤ６９）、Ｈｏｂｉｔ、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）および／または分化クラスター１０３（ＣＤ１０３）の発現により特徴付けられる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

Ｔ_ＲＭが、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー（ＫＬＲＧ１）および／またはエオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）の発現の不在によって特徴付けられる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１の存在下でリンパ球を培養する工程を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の存在下でリンパ球を培養する工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

インターロイキン３３（ＩＬ－３３）の存在下でリンパ球を培養する工程をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

インターロイキン７（ＩＬ－７）の存在下でリンパ球を培養する工程を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

インターロイキン２（ＩＬ－２）の存在下でリンパ球を培養する工程を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

少なくとも１つのインターロイキン１ファミリーメンバーの存在下でリンパ球を培養する工程をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

少なくとも１つのインターロイキン１ファミリーメンバーがＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂおよび／またはＩＬ－１８である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

リンパ球が、少なくとも１つのアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドを含む培地中で培養される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

ＡｈＲリガンドが、ハロゲン化芳香族炭化水素、多環式芳香族炭化水素、食物由来アリール炭化水素、ヘム代謝産物、インジゴイド、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１およびトリプトファン代謝産物から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

リンパ球が、少なくとも１つの脂質を含む培地中で培養される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

リンパ球が、抗原を含む培養培地で培養され、任意選択で、抗原が腫瘍抗原である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

制御性Ｔ細胞が、Ｆｏｘｐ３の発現によって特徴付けられるか、または存在しない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

樹状細胞とともにリンパ球を培養する工程をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）の集団を増殖する工程をさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１の存在下でＴ_ＲＭ細胞を培養する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、または得ることができる、組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）。

【請求項24】

治療に使用するための、請求項２３に記載の組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）、任意選択で、その増殖集団。

【請求項25】

Ｔ細胞療法に使用するための、請求項２３に記載の組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）、任意選択で、その増殖集団。

【請求項26】

癌または感染症の予防、治療または改善に使用するための、請求項２３に記載の組織常在性記憶Ｔ細胞。

【請求項27】

請求項２３に記載の組織常在性記憶Ｔ細胞、任意選択で、その増殖集団、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。

【請求項28】

請求項２７に記載の医薬組成物を製造する方法であって、治療有効量の請求項２３に記載の組織常在性記憶Ｔ細胞、任意選択で、その増殖集団を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせる工程を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｔ細胞に関し、特に、排他的ではないが、組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）を産生する方法、本発明の方法から得られた組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）自体、これらのＴ_ＲＭ細胞を含む組成物、および癌を治療するための免疫療法などの治療におけるこれらのＴ_ＲＭ細胞および組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＰＤ－１やＣＴＬＡ－４に対する抗体を遮断するなど、免疫チェックポイント阻害剤を使用した免疫療法は、無癌生存率を著しく向上させた。重要なことには、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞［１］、一般的な腫瘍検出デルタ－ワンγδＴ細胞（ＤＯＴ）［２、３］、またはＭＲ－１拘束性Ｔ細胞［４］などの養子移入が非常に有望な結果を達成している。しかし、持続的な奏効が得られるのは一部の患者に限られ、これらのアプローチが乳癌などの固形腫瘍に対して十分に有効であるかどうかについては疑問が残る。特に固形腫瘍におけるＴ細胞免疫療法の成功は、腫瘍組織内にＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞傷害活性を持つ腫瘍特異的リンパ球を送達し、活性化することにかかっている。

【0003】

組織免疫のブレークスルーにより、組織に深く浸透できる組織常在性記憶ＣＤ８＋Ｔ（Ｔ_ＲＭ）細胞の存在が明らかになった［５、６］。近年、マーカーＣＤ１０３の発現によって識別される腫瘍内のＴ_ＲＭ細胞の存在と、患者の陽性予後との間に強い相関関係があることが示されている。Ｔ_ＲＭ細胞は、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌などの固形腫瘍において、全ＣＤ８＋Ｔ細胞数よりも、全生存期間の延長および無病状態の期間の延長と強く相関している［７～１５］。実際、Ｔ_ＲＭ細胞は、ヒト固形腫瘍における強化された細胞傷害性Ｔ細胞応答に直接関連している［１６、１７］。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

したがって、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を組織の奥深くに生成して送達することに重点を置いて、免疫療法の改善されたメカニズムを探ることは非常に重要であり、固形腫瘍に対する細胞ベースの癌免疫療法を成功させるために不可欠なステップ変更である。

【0005】

本発明者らは、制御性Ｔ（Ｔ_ＲＥＧ）細胞が、組織に深く浸透することができ、固形腫瘍に対して非常に効果的なＴ細胞の生成において重要であると仮定した。本発明者らは、組織浸透特性を有する抗腫瘍Ｔ細胞を生成する目的で、インビトロでＴ_ＲＭ細胞の生成を可能にするために、Ｔ_ＲＭ細胞の生成に必要な因子を解明および同定することができた。

【0006】

したがって、本発明の第１の態様では、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）の存在下でリンパ球を培養することおよび／またはリンパ球を制御性Ｔ細胞と共培養することを含む、組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）を産生する方法が提供される。

【0007】

有利なことに、実施例に記載されるように、本発明者らは、組織浸透性Ｔ細胞、すなわち組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）の成長に必要なインビトロ要件を確立し、細胞療法に用いるＴ細胞を生成するプロトコルを開発した。このような細胞の産生は、腫瘍組織や転移腫瘍などの疾患組織内での細胞傷害活性を持つ疾患特異的リンパ球の送達と活性化を可能にするＴ_ＲＭ細胞の産生をもたらし、それによってＴ細胞ベースの治療用ツールキットを大幅に広げる。さらに、実施例に記載されるように、本発明者らは、培養物中にＴ_ＲＥＧ細胞を含まずに、細胞治療に使用するためのＴ_ＲＭ細胞を生成するための新規プロトコルを開発した。

【0008】

好ましくは、本方法はエクスビボまたはインビトロで実施される。
好ましくは、本方法は、ＴＧＦβの存在下でリンパ球を培養することを含む。好ましくは、いくつかの実施形態では、本方法は、制御性Ｔ細胞の存在下でリンパ球を培養することを含まない。

【0009】

好ましくは、ＴＧＦβは生理活性である（すなわち活性化されている）。好ましくは、ＴＧＦβは哺乳動物のものである。ＴＧＦβは、げっ歯類、イヌ、ウマ、またはブタのＴＧＦβであり得る。げっ歯類は、ラットまたはマウスであり得る。最も好ましくは、ＴＧＦβはヒトＴＧＦβである。

【0010】

一実施形態では、ＴＧＦβは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：７０４０によって表されるＴＧＦβ_１であってもよく、以下のように、配列番号１として本明細書に提供される：
ＭＰＰＳＧＬＲＬＬＰＬＬＬＰＬＬＷＬＬＶＬＴＰＧＲＰＡＡＧＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＥＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＥＴＨＮＥＩＹＤＫＦＫＱＳＴＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＥＬＲＥＡＶＰＥＰＶＬＬＳＲＡＥＬＲＬＬＲＬＫＬＫＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲＹＬＳＮＲＬＬＡＰＳＤＳＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＳＲＧＧＥＩＥＧＦＲＬＳＡＨＣＳＣＤＳＲＤＮＴＬＱＶＤＩＮＧＦＴＴＧＲＲＧＤＬＡＴＩＨＧＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＱＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ
［配列番号１］
したがって、好ましくは、ＴＧＦβは、配列番号１に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0011】

一実施形態では、ＴＧＦβは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：７０４２によって表されるＴＧＦβ_２であってもよく、以下のように、配列番号１４として本明細書に提供される：
ＭＨＹＣＶＬＳＡＦＬＩＬＨＬＶＴＶＡＬＳＬＳＴＣＳＴＬＤＭＤＱＦＭＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＫＬＴＳＰＰＥＤＹＰＥＰＥＥＶＰＰＥＶＩＳＩＹＮＳＴＲＤＬＬＱＥＫＡＳＲＲＡＡＡＣＥＲＥＲＳＤＥＥＹＹＡＫＥＶＹＫＩＤＭＰＰＦＦＰＳＥＮＡＩＰＰＴＦＹＲＰＹＦＲＩＶＲＦＤＶＳＡＭＥＫＮＡＳＮＬＶＫＡＥＦＲＶＦＲＬＱＮＰＫＡＲＶＰＥＱＲＩＥＬＹＱＩＬＫＳＫＤＬＴＳＰＴＱＲＹＩＤＳＫＶＶＫＴＲＡＥＧＥＷＬＳＦＤＶＴＤＡＶＨＥＷＬＨＨＫＤＲＮＬＧＦＫＩＳＬＨＣＰＣＣＴＦＶＰＳＮＮＹＩＩＰＮＫＳＥＥＬＥＡＲＦＡＧＩＤＧＴＳＴＹＴＳＧＤＱＫＴＩＫＳＴＲＫＫＮＳＧＫＴＰＨＬＬＬＭＬＬＰＳＹＲＬＥＳＱＱＴＮＲＲＫＫＲＡＬＤＡＡＹＣＦＲＮＶＱＤＮＣＣＬＲＰＬＹＩＤＦＫＲＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＮＡＮＦＣＡＧＡＣＰＹＬＷＳＳＤＴＱＨＳＲＶＬＳＬＹＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＳＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＱＬＳＮＭＩＶＫＳＣＫＣＳ
［配列番号１４］
したがって、好ましくは、ＴＧＦβは、配列番号１４に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0012】

一実施形態では、ＴＧＦβは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：７０４３によって表されるＴＧＦβ_３であってもよく、以下のように、配列番号１６として本明細書に提供される：
ＭＫＭＨＬＱＲＡＬＶＶＬＡＬＬＮＦＡＴＶＳＬＳＬＳＴＣＴＴＬＤＦＧＨＩＫＫＫＲＶＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＴＳＰＰＥＰＴＶＭＴＨＶＰＹＱＶＬＡＬＹＮＳＴＲＥＬＬＥＥＭＨＧＥＲＥＥＧＣＴＱＥＮＴＥＳＥＹＹＡＫＥＩＨＫＦＤＭＩＱＧＬＡＥＨＮＥＬＡＶＣＰＫＧＩＴＳＫＶＦＲＦＮＶＳＳＶＥＫＮＲＴＮＬＦＲＡＥＦＲＶＬＲＶＰＮＰＳＳＫＲＮＥＱＲＩＥＬＦＱＩＬＲＰＤＥＨＩＡＫＱＲＹＩＧＧＫＮＬＰＴＲＧＴＡＥＷＬＳＦＤＶＴＤＴＶＲＥＷＬＬＲＲＥＳＮＬＧＬＥＩＳＩＨＣＰＣＨＴＦＱＰＮＧＤＩＬＥＮＩＨＥＶＭＥＩＫＦＫＧＶＤＮＥＤＤＨＧＲＧＤＬＧＲＬＫＫＱＫＤＨＨＮＰＨＬＩＬＭＭＩＰＰＨＲＬＤＮＰＧＱＧＧＱＲＫＫＲＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＶＶＫＳＣＫＣＳ
［配列番号１６］
したがって、好ましくは、ＴＧＦβは、配列番号１６に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0013】

好ましくは、ＴＧＦβは、０．０１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。より好ましくは、ＴＧＦβは、０．１ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、または０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＴＧＦβは、０．２５ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。

【0014】

好ましくは、リンパ球は、ナイーブ、エフェクターまたは記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。
好ましくは、リンパ球はナイーブまたはエフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球である。

【0015】

好ましくは、リンパ球はナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球である。リンパ球がヒトの場合、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４５アイソフォームＲＡ（ＣＤ４５ＲＡ＋）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７＋）、および／または分化クラスター２７（ＣＤ２７＋）の発現によって定義される。ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球はさらに、分化クラスター４５アイソフォームＲＯ（ＣＤ４５ＲＯ－）の発現の欠如によって特徴付けられる場合がある。

【0016】

リンパ球がネズミ、好ましくはマウスである場合、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター６７アイソフォームＬ（ＣＤ６７Ｌ＋）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７＋）、分化クラスター１２７（ＣＤ１２７＋）および／または分化クラスター２７（ＣＤ２７＋）の発現によって定義され得る。ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４４（ＣＤ４４＋）の低レベルの発現によってさらに定義され得る。

【0017】

好ましくは、リンパ球はエフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球である。リンパ球がヒトである場合、エフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４５アイソフォームＲＡ（ＣＤ４５ＲＡ＋）および／または分化クラスター４５アイソフォームＲＯ（ＣＤ４５ＲＯ＋）の発現によって特徴付けられ得る。エフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球は、Ｃ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７－）の発現の欠如によってさらに特徴付けられ得る。

【0018】

リンパ球がネズミ、好ましくはマウスである場合、エフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４４（ＣＤ４４＋）の高レベルの発現および／または分化クラスター６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ）の発現の欠如によって特徴付けられ得る。

【0019】

好ましくは、リンパ球は記憶ＣＤ８＋リンパ球である。記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、中央記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球またはエフェクター記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球であり得る。
リンパ球がヒトである場合、中央記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４５アイソフォームＲＯ（ＣＤ４５ＲＯ＋）の発現によって特徴付けられ得る。中央記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球はさらに、分化クラスター４５アイソフォームＲＡ（ＣＤ４５ＲＡ－）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７－）分化クラスター２７（ＣＤ２７－）および／または分化クラスター６２Ｌ（ＣＤ６２Ｌ－）の発現の欠如によって特徴付けられる場合がある。

【0020】

リンパ球がネズミ、好ましくはマウスである場合、中央記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４４（ＣＤ４４＋）の高レベルの発現および／または分化クラスター６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ）の発現によって特徴付けられ得る。

【0021】

リンパ球がヒトである場合、エフェクター記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４５アイソフォームＲＯ（ＣＤ４５ＲＯ＋）の発現によって特徴付けられ得る。エフェクター記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球はさらに、分化クラスター４５アイソフォームＲＡ（ＣＤ４５ＲＡ－）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７－）分化クラスター２７（ＣＤ２７－）および／または分化クラスター６２Ｌの発現の欠如によって特徴付けられ得る。（ＣＤ６２Ｌ－）。

【0022】

リンパ球がネズミ、好ましくはマウスである場合、エフェクター記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、分化クラスター４４（ＣＤ４４＋）の高レベルの発現および／または分化クラスター６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ）の無発現によって特徴付けられ得る。

【0023】

一実施形態では、ＣＤ４５ＲＡは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：５７８８によって表すことができ、以下のように、配列番号１８として本明細書に提供される：
ＭＴＭＹＬＷＬＫＬＬＡＦＧＦＡＦＬＤＴＥＶＦＶＴＧＱＳＰＴＰＳＰＴＧＬＴＴＡＫＭＰＳＶＰＬＳＳＤＰＬＰＴＨＴＴＡＦＳＰＡＳＴＦＥＲＥＮＤＦＳＥＴＴＴＳＬＳＰＤＮＴＳＴＱＶＳＰＤＳＬＤＮＡＳＡＦＮＴＴＧＶＳＳＶＱＴＰＨＬＰＴＨＡＤＳＱＴＰＳＡＧＴＤＴＱＴＦＳＧＳＡＡＮＡＫＬＮＰＴＰＧＳＮＡＩＳＤＶＰＧＥＲＳＴＡＳＴＦＰＴＤＰＶＳＰＬＴＴＴＬＳＬＡＨＨＳＳＡＡＬＰＡＲＴＳＮＴＴＩＴＡＮＴＳＤＡＹＬＮＡＳＥＴＴＴＬＳＰＳＧＳＡＶＩＳＴＴＴＩＡＴＴＰＳＫＰＴＣＤＥＫＹＡＮＩＴＶＤＹＬＹＮＫＥＴＫＬＦＴＡＫＬＮＶＮＥＮＶＥＣＧＮＮＴＣＴＮＮＥＶＨＮＬＴＥＣＫＮＡＳＶＳＩＳＨＮＳＣＴＡＰＤＫＴＬＩＬＤＶＰＰＧＶＥＫＦＱＬＨＤＣＴＱＶＥＫＡＤＴＴＩＣＬＫＷＫＮＩＥＴＦＴＣＤＴＱＮＩＴＹＲＦＱＣＧＮＭＩＦＤＮＫＥＩＫＬＥＮＬＥＰＥＨＥＹＫＣＤＳＥＩＬＹＮＮＨＫＦＴＮＡＳＫＩＩＫＴＤＦＧＳＰＧＥＰＱＩＩＦＣＲＳＥＡＡＨＱＧＶＩＴＷＮＰＰＱＲＳＦＨＮＦＴＬＣＹＩＫＥＴＥＫＤＣＬＮＬＤＫＮＬＩＫＹＤＬＱＮＬＫＰＹＴＫＹＶＬＳＬＨＡＹＩＩＡＫＶＱＲＮＧＳＡＡＭＣＨＦＴＴＫＳＡＰＰＳＱＶＷＮＭＴＶＳＭＴＳＤＮＳＭＨＶＫＣＲＰＰＲＤＲＮＧＰＨＥＲＹＨＬＥＶＥＡＧＮＴＬＶＲＮＥＳＨＫＮＣＤＦＲＶＫＤＬＱＹＳＴＤＹＴＦＫＡＹＦＨＮＧＤＹＰＧＥＰＦＩＬＨＨＳＴＳＹＮＳＫＡＬＩＡＦＬＡＦＬＩＩＶＴＳＩＡＬＬＶＶＬＹＫＩＹＤＬＨＫＫＲＳＣＮＬＤＥＱＱＥＬＶＥＲＤＤＥＫＱＬＭＮＶＥＰＩＨＡＤＩＬＬＥＴＹＫＲＫＩＡＤＥＧＲＬＦＬＡＥＦＱＳＩＰＲＶＦＳＫＦＰＩＫＥＡＲＫＰＦＮＱＮＫＮＲＹＶＤＩＬＰＹＤＹＮＲＶＥＬＳＥＩＮＧＤＡＧＳＮＹＩＮＡＳＹＩＤＧＦＫＥＰＲＫＹＩＡＡＱＧＰＲＤＥＴＶＤＤＦＷＲＭＩＷＥＱＫＡＴＶＩＶＭＶＴＲＣＥＥＧＮＲＮＫＣＡＥＹＷＰＳＭＥＥＧＴＲＡＦＧＤＶＶＶＫＩＮＱＨＫＲＣＰＤＹＩＩＱＫＬＮＩＶＮＫＫＥＫＡＴＧＲＥＶＴＨＩＱＦＴＳＷＰＤＨＧＶＰＥＤＰＨＬＬＬＫＬＲＲＲＶＮＡＦＳＮＦＦＳＧＰＩＶＶＨＣＳＡＧＶＧＲＴＧＴＹＩＧＩＤＡＭＬＥＧＬＥＡＥＮＫＶＤＶＹＧＹＶＶＫＬＲＲＱＲＣＬＭＶＱＶＥＡＱＹＩＬＩＨＱＡＬＶＥＹＮＱＦＧＥＴＥＶＮＬＳＥＬＨＰＹＬＨＮＭＫＫＲＤＰＰＳＥＰＳＰＬＥＡＥＦＱＲＬＰＳＹＲＳＷＲＴＱＨＩＧＮＱＥＥＮＫＳＫＮＲＮＳＮＶＩＰＹＤＹＮＲＶＰＬＫＨＥＬＥＭＳＫＥＳＥＨＤＳＤＥＳＳＤＤＤＳＤＳＥＥＰＳＫＹＩＮＡＳＦＩＭＳＹＷＫＰＥＶＭＩＡＡＱＧＰＬＫＥＴＩＧＤＦＷＱＭＩＦＱＲＫＶＫＶＩＶＭＬＴＥＬＫＨＧＤＱＥＩＣＡＱＹＷＧＥＧＫＱＴＹＧＤＩＥＶＤＬＫＤＴＤＫＳＳＴＹＴＬＲＶＦＥＬＲＨＳＫＲＫＤＳＲＴＶＹＱＹＱＹＴＮＷＳＶＥＱＬＰＡＥＰＫＥＬＩＳＭＩＱＶＶＫＱＫＬＰＱＫＮＳＳＥＧＮＫＨＨＫＳＴＰＬＬＩＨＣＲＤＧＳＱＱＴＧＩＦＣＡＬＬＮＬＬＥＳＡＥＴＥＥＶＶＤＩＦＱＶＶＫＡＬＲＫＡＲＰＧＭＶＳＴＦＥＱＹＱＦＬＹＤＶＩＡＳＴＹＰＡＱＮＧＱＶＫＫＮＮＨＱＥＤＫＩＥＦＤＮＥＶＤＫＶＫＱＤＡＮＣＶＮＰＬＧＡＰＥＫＬＰＥＡＫＥＱＡＥＧＳＥＰＴＳＧＴＥＧＰＥＨＳＶＮＧＰＡＳＰＡＬＮＱＧＳ
［配列番号１８］
したがって、好ましくは、ＣＤ４５ＲＡは、配列番号１８に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0024】

一実施形態では、ＣＤ４５ＲＯは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：５７８８によって表すことができ、以下のように、配列番号１９として本明細書に提供される：
ＭＴＭＹＬＷＬＫＬＬＡＦＧＦＡＦＬＤＴＥＶＦＶＴＧＱＳＰＴＰＳＰＴＤＡＹＬＮＡＳＥＴＴＴＬＳＰＳＧＳＡＶＩＳＴＴＴＩＡＴＴＰＳＫＰＴＣＤＥＫＹＡＮＩＴＶＤＹＬＹＮＫＥＴＫＬＦＴＡＫＬＮＶＮＥＮＶＥＣＧＮＮＴＣＴＮＮＥＶＨＮＬＴＥＣＫＮＡＳＶＳＩＳＨＮＳＣＴＡＰＤＫＴＬＩＬＤＶＰＰＧＶＥＫＦＱＬＨＤＣＴＱＶＥＫＡＤＴＴＩＣＬＫＷＫＮＩＥＴＦＴＣＤＴＱＮＩＴＹＲＦＱＣＧＮＭＩＦＤＮＫＥＩＫＬＥＮＬＥＰＥＨＥＹＫＣＤＳＥＩＬＹＮＮＨＫＦＴＮＡＳＫＩＩＫＴＤＦＧＳＰＧＥＰＱＩＩＦＣＲＳＥＡＡＨＱＧＶＩＴＷＮＰＰＱＲＳＦＨＮＦＴＬＣＹＩＫＥＴＥＫＤＣＬＮＬＤＫＮＬＩＫＹＤＬＱＮＬＫＰＹＴＫＹＶＬＳＬＨＡＹＩＩＡＫＶＱＲＮＧＳＡＡＭＣＨＦＴＴＫＳＡＰＰＳＱＶＷＮＭＴＶＳＭＴＳＤＮＳＭＨＶＫＣＲＰＰＲＤＲＮＧＰＨＥＲＹＨＬＥＶＥＡＧＮＴＬＶＲＮＥＳＨＫＮＣＤＦＲＶＫＤＬＱＹＳＴＤＹＴＦＫＡＹＦＨＮＧＤＹＰＧＥＰＦＩＬＨＨＳＴＳＹＮＳＫＡＬＩＡＦＬＡＦＬＩＩＶＴＳＩＡＬＬＶＶＬＹＫＩＹＤＬＨＫＫＲＳＣＮＬＤＥＱＱＥＬＶＥＲＤＤＥＫＱＬＭＮＶＥＰＩＨＡＤＩＬＬＥＴＹＫＲＫＩＡＤＥＧＲＬＦＬＡＥＦＱＳＩＰＲＶＦＳＫＦＰＩＫＥＡＲＫＰＦＮＱＮＫＮＲＹＶＤＩＬＰＹＤＹＮＲＶＥＬＳＥＩＮＧＤＡＧＳＮＹＩＮＡＳＹＩＤＧＦＫＥＰＲＫＹＩＡＡＱＧＰＲＤＥＴＶＤＤＦＷＲＭＩＷＥＱＫＡＴＶＩＶＭＶＴＲＣＥＥＧＮＲＮＫＣＡＥＹＷＰＳＭＥＥＧＴＲＡＦＧＤＶＶＶＫＩＮＱＨＫＲＣＰＤＹＩＩＱＫＬＮＩＶＮＫＫＥＫＡＴＧＲＥＶＴＨＩＱＦＴＳＷＰＤＨＧＶＰＥＤＰＨＬＬＬＫＬＲＲＲＶＮＡＦＳＮＦＦＳＧＰＩＶＶＨＣＳＡＧＶＧＲＴＧＴＹＩＧＩＤＡＭＬＥＧＬＥＡＥＮＫＶＤＶＹＧＹＶＶＫＬＲＲＱＲＣＬＭＶＱＶＥＡＱＹＩＬＩＨＱＡＬＶＥＹＮＱＦＧＥＴＥＶＮＬＳＥＬＨＰＹＬＨＮＭＫＫＲＤＰＰＳＥＰＳＰＬＥＡＥＦＱＲＬＰＳＹＲＳＷＲＴＱＨＩＧＮＱＥＥＮＫＳＫＮＲＮＳＮＶＩＰＹＤＹＮＲＶＰＬＫＨＥＬＥＭＳＫＥＳＥＨＤＳＤＥＳＳＤＤＤＳＤＳＥＥＰＳＫＹＩＮＡＳＦＩＭＳＹＷＫＰＥＶＭＩＡＡＱＧＰＬＫＥＴＩＧＤＦＷＱＭＩＦＱＲＫＶＫＶＩＶＭＬＴＥＬＫＨＧＤＱＥＩＣＡＱＹＷＧＥＧＫＱＴＹＧＤＩＥＶＤＬＫＤＴＤＫＳＳＴＹＴＬＲＶＦＥＬＲＨＳＫＲＫＤＳＲＴＶＹＱＹＱＹＴＮＷＳＶＥＱＬＰＡＥＰＫＥＬＩＳＭＩＱＶＶＫＱＫＬＰＱＫＮＳＳＥＧＮＫＨＨＫＳＴＰＬＬＩＨＣＲＤＧＳＱＱＴＧＩＦＣＡＬＬＮＬＬＥＳＡＥＴＥＥＶＶＤＩＦＱＶＶＫＡＬＲＫＡＲＰＧＭＶＳＴＦＥＱＹＱＦＬＹＤＶＩＡＳＴＹＰＡＱＮＧＱＶＫＫＮＮＨＱＥＤＫＩＥＦＤＮＥＶＤＫＶＫＱＤＡＮＣＶＮＰＬＧＡＰＥＫＬＰＥＡＫＥＱＡＥＧＳＥＰＴＳＧＴＥＧＰＥＨＳＶＮＧＰＡＳＰＡＬＮＱＧＳ
［配列番号１９］
したがって、好ましくは、ＣＤ４５ＲＯは、配列番号１９に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0025】

一実施形態では、ＣＣＲ７は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：１２３６によって表すことができ、以下のように、配列番号２０として本明細書に提供される：
ＭＤＬＧＫＰＭＫＳＶＬＶＶＡＬＬＶＩＦＱＶＣＬＣＱＤＥＶＴＤＤＹＩＧＤＮＴＴＶＤＹＴＬＦＥＳＬＣＳＫＫＤＶＲＮＦＫＡＷＦＬＰＩＭＹＳＩＩＣＦＶＧＬＬＧＮＧＬＶＶＬＴＹＩＹＦＫＲＬＫＴＭＴＤＴＹＬＬＮＬＡＶＡＤＩＬＦＬＬＴＬＰＦＷＡＹＳＡＡＫＳＷＶＦＧＶＨＦＣＫＬＩＦＡＩＹＫＭＳＦＦＳＧＭＬＬＬＬＣＩＳＩＤＲＹＶＡＩＶＱＡＶＳＡＨＲＨＲＡＲＶＬＬＩＳＫＬＳＣＶＧＩＷＩＬＡＴＶＬＳＩＰＥＬＬＹＳＤＬＱＲＳＳＳＥＱＡＭＲＣＳＬＩＴＥＨＶＥＡＦＩＴＩＱＶＡＱＭＶＩＧＦＬＶＰＬＬＡＭＳＦＣＹＬＶＩＩＲＴＬＬＱＡＲＮＦＥＲＮＫＡＩＫＶＩＩＡＶＶＶＶＦＩＶＦＱＬＰＹＮＧＶＶＬＡＱＴＶＡＮＦＮＩＴＳＳＴＣＥＬＳＫＱＬＮＩＡＹＤＶＴＹＳＬＡＣＶＲＣＣＶＮＰＦＬＹＡＦＩＧＶＫＦＲＮＤＬＦＫＬＦＫＤＬＧＣＬＳＱＥＱＬＲＱＷＳＳＣＲＨＩＲＲＳＳＭＳＶＥＡＥＴＴＴＴＦＳＰ
［配列番号２０］
したがって、好ましくは、ＣＣＲ７は、配列番号２０に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0026】

一実施形態では、ＣＤ２７は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：９３９によって表すことができ、以下のように、配列番号２１として本明細書に提供される：
ＭＡＲＰＨＰＷＷＬＣＶＬＧＴＬＶＧＬＳＡＴＰＡＰＫＳＣＰＥＲＨＹＷＡＱＧＫＬＣＣＱＭＣＥＰＧＴＦＬＶＫＤＣＤＱＨＲＫＡＡＱＣＤＰＣＩＰＧＶＳＦＳＰＤＨＨＴＲＰＨＣＥＳＣＲＨＣＮＳＧＬＬＶＲＮＣＴＩＴＡＮＡＥＣＡＣＲＮＧＷＱＣＲＤＫＥＣＴＥＣＤＰＬＰＮＰＳＬＴＡＲＳＳＱＡＬＳＰＨＰＱＰＴＨＬＰＹＶＳＥＭＬＥＡＲＴＡＧＨＭＱＴＬＡＤＦＲＱＬＰＡＲＴＬＳＴＨＷＰＰＱＲＳＬＣＳＳＤＦＩＲＩＬＶＩＦＳＧＭＦＬＶＦＴＬＡＧＡＬＦＬＨＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ
［配列番号２１］
したがって、好ましくは、ＣＤ２７は、配列番号２１に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0027】

一実施形態では、ＣＤ６２Ｌは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：６４０２によって表すことができ、以下のように、配列番号２２として本明細書に提供される：
ＭＧＣＲＲＴＲＥＧＰＳＫＡＭＩＦＰＷＫＣＱＳＴＱＲＤＬＷＮＩＦＫＬＷＧＷＴＭＬＣＣＤＦＬＡＨＨＧＴＤＣＷＴＹＨＹＳＥＫＰＭＮＷＱＲＡＲＲＦＣＲＤＮＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫＡＥＩＥＹＬＥＫＴＬＰＦＳＲＳＹＹＷＩＧＩＲＫＩＧＧＩＷＴＷＶＧＴＮＫＳＬＴＥＥＡＥＮＷＧＤＧＥＰＮＮＫＫＮＫＥＤＣＶＥＩＹＩＫＲＮＫＤＡＧＫＷＮＤＤＡＣＨＫＬＫＡＡＬＣＹＴＡＳＣＱＰＷＳＣＳＧＨＧＥＣＶＥＩＩＮＮＹＴＣＮＣＤＶＧＹＹＧＰＱＣＱＦＶＩＱＣＥＰＬＥＡＰＥＬＧＴＭＤＣＴＨＰＬＧＮＦＳＦＳＳＱＣＡＦＳＣＳＥＧＴＮＬＴＧＩＥＥＴＴＣＧＰＦＧＮＷＳＳＰＥＰＴＣＱＶＩＱＣＥＰＬＳＡＰＤＬＧＩＭＮＣＳＨＰＬＡＳＦＳＦＴＳＡＣＴＦＩＣＳＥＧＴＥＬＩＧＫＫＫＴＩＣＥＳＳＧＩＷＳＮＰＳＰＩＣＱＫＬＤＫＳＦＳＭＩＫＥＧＤＹＮＰＬＦＩＰＶＡＶＭＶＴＡＦＳＧＬＡＦＩＩＷＬＡＲＲＬＫＫＧＫＫＳＫＲＳＭＮＤＰＹ
［配列番号２２］
したがって、好ましくは、ＣＤ６２Ｌは、配列番号２２に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0028】

好ましくは、リンパ球は、ヒトまたは非ヒト動物の組織から得られたものである。好ましくは、非ヒト動物は哺乳動物である。非ヒト動物は、げっ歯類、イヌ、ウマ、またはブタであり得る。げっ歯類は、ラットまたはマウスであり得る。好ましくは、リンパ球はヒトの組織から得られたものである。組織は、血液、脾臓、リンパ節、肺、胃腸管、皮膚、前立腺乳腺組織、肝臓、骨髄、および膵臓からなる群から選択され得る。好ましくは、組織は血液または骨髄である。

【0029】

本方法は、ヒトまたは非ヒト動物から得られた組織からリンパ球を得ることを含むことができる。リンパ球は、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって取得してもよい。そのような方法には、バフィーコートまたは密度勾配、蛍光活性化細胞選別および／または磁気活性化細胞選別が含まれる。これらの方法は当業者に知られているだろう。

【0030】

好ましくは、本発明の方法によって産生される組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）は、組織常在性記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞である。好ましくは、複数の組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）が、本方法を使用して産生される。

【0031】

組織常在性記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞は、分化クラスター８（ＣＤ８）、分化クラスター６９（ＣＤ６９）、ジンクフィンガータンパク質６８３（ＺＮＦ６８３／ＨＯＢＩＴ）、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）および／または分化クラスター１０３（ＣＤ１０３）の発現によって特徴付けられ得る。組織常在性記憶ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞は、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー（ＫＬＲＧ１）および／またはエメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）の非存在によってさらに特徴付けられ得る。

【0032】

好ましくは、組織常在性記憶ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ６９、Ｈｏｂｉｔ、ＡｈＲおよびＣＤ１０３の発現によって特徴付けられ得る。好ましくは、組織常在性記憶ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ６９、Ｈｏｂｉｔ、ＡｈＲ、ＣＤ１０３の発現、およびＫＬＲＧ１およびＥｏｍｅｓ発現の非存在によって特徴付けられ得る。

【0033】

一実施形態では、ＣＤ８は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：９２５によって表すことができ、以下のように、配列番号２として本明細書に提供される：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶＫＳＧＤＫＰＳＬＳＡＲＹＶ
［配列番号２］
したがって、好ましくは、ＣＤ８は、配列番号２に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0034】

一実施形態では、ＣＤ６９は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：９６９によって表すことができ、これは、以下のように、配列番号３として本明細書に提供される：
ＭＳＳＥＮＣＦＶＡＥＮＳＳＬＨＰＥＳＧＱＥＮＤＡＴＳＰＨＦＳＴＲＨＥＧＳＦＱＶＰＶＬＣＡＶＭＮＶＶＦＩＴＩＬＩＩＡＬＩＡＬＳＶＧＱＹＮＣＰＧＱＹＴＦＳＭＰＳＤＳＨＶＳＳＣＳＥＤＷＶＧＹＱＲＫＣＹＦＩＳＴＶＫＲＳＷＴＳＡＱＮＡＣＳＥＨＧＡＴＬＡＶＩＤＳＥＫＤＭＮＦＬＫＲＹＡＧＲＥＥＨＷＶＧＬＫＫＥＰＧＨＰＷＫＷＳＮＧＫＥＦＮＮＷＦＮＶＴＧＳＤＫＣＶＦＬＫＮＴＥＶＳＳＭＥＣＥＫＮＬＹＷＩＣＮＫＰＹＫ
［配列番号３］
したがって、好ましくは、ＣＤ６９は、配列番号３に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0035】

一実施形態では、ＣＤ１０３は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３６８２によって表すことができ、以下のように、配列番号４として本明細書に提供される：
ＭＷＬＦＨＴＬＬＣＩＡＳＬＡＬＬＡＡＦＮＶＤＶＡＲＰＷＬＴＰＫＧＧＡＰＦＶＬＳＳＬＬＨＱＤＰＳＴＮＱＴＷＬＬＶＴＳＰＲＴＫＲＴＰＧＰＬＨＲＣＳＬＶＱＤＥＩＬＣＨＰＶＥＨＶＰＩＰＫＧＲＨＲＧＶＴＶＶＲＳＨＨＧＶＬＩＣＩＱＶＬＶＲＲＰＨＳＬＳＳＥＬＴＧＴＣＳＬＬＧＰＤＬＲＰＱＡＱＡＮＦＦＤＬＥＮＬＬＤＰＤＡＲＶＤＴＧＤＣＹＳＮＫＥＧＧＧＥＤＤＶＮＴＡＲＱＲＲＡＬＥＫＥＥＥＥＤＫＥＥＥＥＤＥＥＥＥＥＡＧＴＥＩＡＩＩＬＤＧＳＧＳＩＤＰＰＤＦＱＲＡＫＤＦＩＳＮＭＭＲＮＦＹＥＫＣＦＥＣＮＦＡＬＶＱＹＧＧＶＩＱＴＥＦＤＬＲＤＳＱＤＶＭＡＳＬＡＲＶＱＮＩＴＱＶＧＳＶＴＫＴＡＳＡＭＱＨＶＬＤＳＩＦＴＳＳＨＧＳＲＲＫＡＳＫＶＭＶＶＬＴＤＧＧＩＦＥＤＰＬＮＬＴＴＶＩＮＳＰＫＭＱＧＶＥＲＦＡＩＧＶＧＥＥＦＫＳＡＲＴＡＲＥＬＮＬＩＡＳＤＰＤＥＴＨＡＦＫＶＴＮＹＭＡＬＤＧＬＬＳＫＬＲＹＮＩＩＳＭＥＧＴＶＧＤＡＬＨＹＱＬＡＱＩＧＦＳＡＱＩＬＤＥＲＱＶＬＬＧＡＶＧＡＦＤＷＳＧＧＡＬＬＹＤＴＲＳＲＲＧＲＦＬＮＱＴＡＡＡＡＡＤＡＥＡＡＱＹＳＹＬＧＹＡＶＡＶＬＨＫＴＣＳＬＳＹＩＡＧＡＰＲＹＫＨＨＧＡＶＦＥＬＱＫＥＧＲＥＡＳＦＬＰＶＬＥＧＥＱＭＧＳＹＦＧＳＥＬＣＰＶＤＩＤＭＤＧＳＴＤＦＬＬＶＡＡＰＦＹＨＶＨＧＥＥＧＲＶＹＶＹＲＬＳＥＱＤＧＳＦＳＬＡＲＩＬＳＧＨＰＧＦＴＮＡＲＦＧＦＡＭＡＡＭＧＤＬＳＱＤＫＬＴＤＶＡＩＧＡＰＬＥＧＦＧＡＤＤＧＡＳＦＧＳＶＹＩＹＮＧＨＷＤＧＬＳＡＳＰＳＱＲＩＲＡＳＴＶＡＰＧＬＱＹＦＧＭＳＭＡＧＧＦＤＩＳＧＤＧＬＡＤＩＴＶＧＴＬＧＱＡＶＶＦＲＳＲＰＶＶＲＬＫＶＳＭＡＦＴＰＳＡＬＰＩＧＦＮＧＶＶＮＶＲＬＣＦＥＩＳＳＶＴＴＡＳＥＳＧＬＲＥＡＬＬＮＦＴＬＤＶＤＶＧＫＱＲＲＲＬＱＣＳＤＶＲＳＣＬＧＣＬＲＥＷＳＳＧＳＱＬＣＥＤＬＬＬＭＰＴＥＧＥＬＣＥＥＤＣＦＳＮＡＳＶＫＶＳＹＱＬＱＴＰＥＧＱＴＤＨＰＱＰＩＬＤＲＹＴＥＰＦＡＩＦＱＬＰＹＥＫＡＣＫＮＫＬＦＣＶＡＥＬＱＬＡＴＴＶＳＱＱＥＬＶＶＧＬＴＫＥＬＴＬＮＩＮＬＴＮＳＧＥＤＳＹＭＴＳＭＡＬＮＹＰＲＮＬＱＬＫＲＭＱＫＰＰＳＰＮＩＱＣＤＤＰＱＰＶＡＳＶＬＩＭＮＣＲＩＧＨＰＶＬＫＲＳＳＡＨＶＳＶＶＷＱＬＥＥＮＡＦＰＮＲＴＡＤＩＴＶＴＶＴＮＳＮＥＲＲＳＬＡＮＥＴＨＴＬＱＦＲＨＧＦＶＡＶＬＳＫＰＳＩＭＹＶＮＴＧＱＧＬＳＨＨＫＥＦＬＦＨＶＨＧＥＮＬＦＧＡＥＹＱＬＱＩＣＶＰＴＫＬＲＧＬＱＶＶＡＶＫＫＬＴＲＴＱＡＳＴＶＣＴＷＳＱＥＲＡＣＡＹＳＳＶＱＨＶＥＥＷＨＳＶＳＣＶＩＡＳＤＫＥＮＶＴＶＡＡＥＩＳＷＤＨＳＥＥＬＬＫＤＶＴＥＬＱＩＬＧＥＩＳＦＮＫＳＬＹＥＧＬＮＡＥＮＨＲＴＫＩＴＶＶＦＬＫＤＥＫＹＨＳＬＰＩＩＩＫＧＳＶＧＧＬＬＶＬＩＶＩＬＶＩＬＦＫＣＧＦＦＫＲＫＹＱＱＬＮＬＥＳＩＲＫＡＱＬＫＳＥＮＬＬＥＥＥＮ
［配列番号４］
したがって、好ましくは、ＣＤ１０３は、配列番号４に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0036】

一実施形態では、ＫＬＲＧ１は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：１０２１９によって表すことができ、以下のように、配列番号５として本明細書に提供される：
ＭＴＤＳＶＩＹＳＭＬＥＬＰＴＡＴＱＡＱＮＤＹＧＰＱＱＫＳＳＳＳＲＰＳＣＳＣＬＶＡＩＡＬＧＬＬＴＡＶＬＬＳＶＬＬＹＱＷＩＬＣＱＧＳＮＹＳＴＣＡＳＣＰＳＣＰＤＲＷＭＫＹＧＮＨＣＹＹＦＳＶＥＥＫＤＷＮＳＳＬＥＦＣＬＡＲＤＳＨＬＬＶＩＴＤＮＱＥＭＳＬＬＱＶＦＬＳＥＡＦＣＷＩＧＬＲＮＮＳＧＷＲＷＥＤＧＳＰＬＮＦＳＲＩＳＳＮＳＦＶＱＴＣＧＡＩＮＫＮＧＬＱＡＳＳＣＥＶＰＬＨＷＶＣＫＫＣＰＦＡＤＱＡＬＦ
［配列番号５］
したがって、好ましくは、ＫＬＲＧ１は、配列番号５に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0037】

一実施形態では、Ｅｏｍｅｓは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：８３２０によって表すことができ、以下のように、配列番号６として本明細書に提供される：
ＭＱＬＧＥＱＬＬＶＳＳＶＮＬＰＧＡＨＦＹＰＬＥＳＡＲＧＧＳＧＧＳＡＧＨＬＰＳＡＡＰＳＰＱＫＬＤＬＤＫＡＳＫＫＦＳＧＳＬＳＣＥＡＶＳＧＥＰＡＡＡＳＡＧＡＰＡＡＭＬＳＤＴＤＡＧＤＡＦＡＳＡＡＡＶＡＫＰＧＰＰＤＧＲＫＧＳＰＣＧＥＥＥＬＰＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＲＹＳＭＤＳＬＳＳＥＲＹＹＬＱＳＰＧＰＱＧＳＥＬＡＡＰＣＳＬＦＰＹＱＡＡＡＧＡＰＨＧＰＶＹＰＡＰＮＧＡＲＹＰＹＧＳＭＬＰＰＧＧＦＰＡＡＶＣＰＰＧＲＡＱＦＧＰＧＡＧＡＧＳＧＡＧＧＳＳＧＧＧＧＧＰＧＴＹＱＹＳＱＧＡＰＬＹＧＰＹＰＧＡＡＡＡＧＳＣＧＧＬＧＧＬＧＶＰＧＳＧＦＲＡＨＶＹＬＣＮＲＰＬＷＬＫＦＨＲＨＱＴＥＭＩＩＴＫＱＧＲＲＭＦＰＦＬＳＦＮＩＮＧＬＮＰＴＡＨＹＮＶＦＶＥＶＶＬＡＤＰＮＨＷＲＦＱＧＧＫＷＶＴＣＧＫＡＤＮＮＭＱＧＮＫＭＹＶＨＰＥＳＰＮＴＧＳＨＷＭＲＱＥＩＳＦＧＫＬＫＬＴＮＮＫＧＡＮＮＮＮＴＱＭＩＶＬＱＳＬＨＫＹＱＰＲＬＨＩＶＥＶＴＥＤＧＶＥＤＬＮＥＰＳＫＴＱＴＦＴＦＳＥＴＱＦＩＡＶＴＡＹＱＮＴＤＩＴＱＬＫＩＤＨＮＰＦＡＫＧＦＲＤＮＹＤＳＳＨＱＩＶＰＧＧＲＹＧＶＱＳＦＦＰＥＰＦＶＮＴＬＰＱＡＲＹＹＮＧＥＲＴＶＰＱＴＮＧＬＬＳＰＱＱＳＥＥＶＡＮＰＰＱＲＷＬＶＴＰＶＱＱＰＧＴＮＫＬＤＩＳＳＹＥＳＥＹＴＳＳＴＬＬＰＹＧＩＫＳＬＰＬＱＴＳＨＡＬＧＹＹＰＤＰＴＦＰＡＭＡＧＷＧＧＲＧＳＹＱＲＫＭＡＡＧＬＰＷＴＳＲＴＳＰＴＶＦＳＥＤＱＬＳＫＥＫＶＫＥＥＩＧＳＳＷＩＥＴＰＰＳＩＫＳＬＤＳＮＤＳＧＶＹＴＳＡＣＫＲＲＲＬＳＰＳＮＳＳＮＥＮＳＰＳＩＫＣＥＤＩＮＡＥＥＹＳＫＤＴＳＫＧＭＧＧＹＹＡＦＹＴＴＰ
［配列番号６］
したがって、好ましくは、Ｅｏｍｅｓは、配列番号６に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0038】

一実施形態では、Ｈｏｂｉｔは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：２５７１０１によって表すことができ、以下のように、配列番号９として本明細書に提供される。
ＭＫＥＥＳＡＡＱＬＧＣＣＨＲＰＭＡＬＧＧＴＧＧＳＬＳＰＳＬＤＦＱＬＦＲＧＤＱＶＦＳＡＣＲＰＬＰＤＭＶＤＡＨＧＰＳＣＡＳＷＬＣＰＬＰＬＡＰＧＲＳＡＬＬＡＣＬＱＤＬＤＬＮＬＣＴＰＱＰＡＰＬＧＴＤＬＱＧＬＱＥＤＡＬＳＭＫＨＥＰＰＧＬＱＡＳＳＴＤＤＫＫＦＴＶＫＹＰＱＮＫＤＫＬＧＫＱＰＥＲＡＧＥＧＡＰＣＰＡＦＳＳＨＮＳＳＳＰＰＰＬＱＮＲＫＳＰＳＰＬＡＦＣＰＣＰＰＶＮＳＩＳＫＥＬＰＦＬＬＨＡＦＹＰＧＹＰＬＬＬＰＰＰＨＬＦＴＹＧＡＬＰＳＤＱＣＰＨＬＬＭＬＰＱＤＰＳＹＰＴＭＡＭＰＳＬＬＭＭＶＮＥＬＧＨＰＳＡＲＷＥＴＬＬＰＹＰＧＡＦＱＡＳＧＱＡＬＰＳＱＡＲＮＰＧＡＧＡＡＰＴＤＳＰＧＬＥＲＧＧＭＡＳＰＡＫＲＶＰＬＳＳＱＴＧＴＡＡＬＰＹＰＬＫＫＫＮＧＫＩＬＹＥＣＮＩＣＧＫＳＦＧＱＬＳＮＬＫＶＨＬＲＶＨＳＧＥＲＰＦＱＣＡＬＣＱＫＳＦＴＱＬＡＨＬＱＫＨＨＬＶＨＴＧＥＲＰＨＫＣＳＩＰＷＶＰＧＲＮＨＷＫＳＦＱＡＷＲＥＲＥＶＣＨＫＲＦＳＳＳＳＮＬＫＴＨＬＲＬＨＳＧＡＲＰＦＱＣＳＶＣＲＳＲＦＴＱＨＩＨＬＫＬＨＨＲＬＨＡＰＱＰＣＧＬＶＨＴＱＬＰＬＡＳＬＡＣＬＡＱＷＨＱＧＡＬＤＬＭＡＶＡＳＥＫＨＭＧＹＤＩＤＥＶＫＶＳＳＴＳＱＧＫＡＲＡＶＳＬＳＳＡＧＴＰＬＶＭＧＱＤＱＮＮ
［配列番号９］
したがって、好ましくは、Ｈｏｂｉｔは、配列番号９に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0039】

一実施形態では、Ａｈｒは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：１９６によって表すことができ、以下のように、配列番号１０として本明細書に提供される。
ＭＮＳＳＳＡＮＩＴＹＡＳＲＫＲＲＫＰＶＱＫＴＶＫＰＩＰＡＥＧＩＫＳＮＰＳＫＲＨＲＤＲＬＮＴＥＬＤＲＬＡＳＬＬＰＦＰＱＤＶＩＮＫＬＤＫＬＳＶＬＲＬＳＶＳＹＬＲＡＫＳＦＦＤＶＡＬＫＳＳＰＴＥＲＮＧＧＱＤＮＣＲＡＡＮＦＲＥＧＬＮＬＱＥＧＥＦＬＬＱＡＬＮＧＦＶＬＶＶＴＴＤＡＬＶＦＹＡＳＳＴＩＱＤＹＬＧＦＱＱＳＤＶＩＨＱＳＶＹＥＬＩＨＴＥＤＲＡＥＦＱＲＱＬＨＷＡＬＮＰＳＱＣＴＥＳＧＱＧＩＥＥＡＴＧＬＰＱＴＶＶＣＹＮＰＤＱＩＰＰＥＮＳＰＬＭＥＲＣＦＩＣＲＬＲＣＬＬＤＮＳＳＧＦＬＡＭＮＦＱＧＫＬＫＹＬＨＧＱＫＫＫＧＫＤＧＳＩＬＰＰＱＬＡＬＦＡＩＡＴＰＬＱＰＰＳＩＬＥＩＲＴＫＮＦＩＦＲＴＫＨＫＬＤＦＴＰＩＧＣＤＡＫＧＲＩＶＬＧＹＴＥＡＥＬＣＴＲＧＳＧＹＱＦＩＨＡＡＤＭＬＹＣＡＥＳＨＩＲＭＩＫＴＧＥＳＧＭＩＶＦＲＬＬＴＫＮＮＲＷＴＷＶＱＳＮＡＲＬＬＹＫＮＧＲＰＤＹＩＩＶＴＱＲＰＬＴＤＥＥＧＴＥＨＬＲＫＲＮＴＫＬＰＦＭＦＴＴＧＥＡＶＬＹＥＡＴＮＰＦＰＡＩＭＤＰＬＰＬＲＴＫＮＧＴＳＧＫＤＳＡＴＴＳＴＬＳＫＤＳＬＮＰＳＳＬＬＡＡＭＭＱＱＤＥＳＩＹＬＹＰＡＳＳＴＳＳＴＡＰＦＥＮＮＦＦＮＥＳＭＮＥＣＲＮＷＱＤＮＴＡＰＭＧＮＤＴＩＬＫＨＥＱＩＤＱＰＱＤＶＮＳＦＡＧＧＨＰＧＬＦＱＤＳＫＮＳＤＬＹＳＩＭＫＮＬＧＩＤＦＥＤＩＲＨＭＱＮＥＫＦＦＲＮＤＦＳＧＥＶＤＦＲＤＩＤＬＴＤＥＩＬＴＹＶＱＤＳＬＳＫＳＰＦＩＰＳＤＹＱＱＱＱＳＬＡＬＮＳＳＣＭＶＱＥＨＬＨＬＥＱＱＱＱＨＨＱＫＱＶＶＶＥＰＱＱＱＬＣＱＫＭＫＨＭＱＶＮＧＭＦＥＮＷＮＳＮＱＦＶＰＦＮＣＰＱＱＤＰＱＱＹＮＶＦＴＤＬＨＧＩＳＱＥＦＰＹＫＳＥＭＤＳＭＰＹＴＱＮＦＩＳＣＮＱＰＶＬＰＱＨＳＫＣＴＥＬＤＹＰＭＧＳＦＥＰＳＰＹＰＴＴＳＳＬＥＤＦＶＴＣＬＱＬＰＥＮＱＫＨＧＬＮＰＱＳＡＩＩＴＰＱＴＣＹＡＧＡＶＳＭＹＱＣＱＰＥＰＱＨＴＨＶＧＱＭＱＹＮＰＶＬＰＧＱＱＡＦＬＮＫＦＱＮＧＶＬＮＥＴＹＰＡＥＬＮＮＩＮＮＴＱＴＴＴＨＬＱＰＬＨＨＰＳＥＡＲＰＦＰＤＬＴＳＳＧＦＬ
［配列番号１０］
したがって、好ましくは、Ａｈｒは、配列番号１０に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0040】

好ましくは、本方法は、インターロイキン２、４、７、１２、１５および／または２１（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１）の存在下でリンパ球を培養することを含む。

【0041】

インターロイキンは、好ましくは哺乳動物のものであり、最も好ましくはヒトのインターロイキンである。
好ましくは、本方法は、インターロイキン７（ＩＬ－７）の存在下でリンパ球を培養することを含む。

【0042】

好ましくは、ＩＬ－７は哺乳動物のものである。最も好ましくは、ＩＬ－７はヒトＩＬ－７である。一実施形態では、ＩＬ－７は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３５７４によって表すことができ、以下のように、配列番号２８として本明細書に提供される：
ＭＦＨＶＳＦＲＹＩＦＧＬＰＰＬＩＬＶＬＬＰＶＡＳＳＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨ ＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨ
［配列番号２８］
したがって、好ましくは、ＩＬ－７は、配列番号２８に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0043】

好ましくは、ＩＬ－７は、０．１ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－７は、２ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－７は１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0044】

好ましくは、本方法は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の存在下でリンパ球を培養することをさらに含む。
好ましくは、ＩＬ－１５は哺乳動物のものである。最も好ましくは、ＩＬ－１５はヒトＩＬ－１５である。一実施形態では、ＩＬ－１５は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３６００によって表すことができ、以下のように、配列番号７として本明細書に提供される：
ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
［配列番号７］
したがって、好ましくは、ＩＬ－１５は、配列番号７に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0045】

好ましくは、ＩＬ－１５は、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－１５は、５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－１５は、１０ｎｇ／ｍｌ～２５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0046】

好ましくは、本方法は、インターロイキン３３（ＩＬ－３３）の存在下で培養することをさらに含む。好ましくは、ＩＬ－３３は哺乳動物のものである。最も好ましくは、ＩＬ－３３はヒトＩＬ－３３である。一実施形態では、ＩＬ－３３は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：９０８６５によって表すことができ、以下のように、配列番号８として本明細書に提供される：
ＭＫＰＫＭＫＹＳＴＮＫＩＳＴＡＫＷＫＮＴＡＳＫＡＬＣＦＫＬＧＫＳＱＱＫＡＫＥＶＣＰＭＹＦＭＫＬＲＳＧＬＭＩＫＫＥＡＣＹＦＲＲＥＴＴＫＲＰＳＬＫＴＧＲＫＨＫＲＨＬＶＬＡＡＣＱＱＱＳＴＶＥＣＦＡＦＧＩＳＧＶＱＫＹＴＲＡＬＨＤＳＳＩＴＧＩＳＰＩＴＥＹＬＡＳＬＳＴＹＮＤＱＳＩＴＦＡＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶＥＤＬＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫＭＬＭＶＴＬＳＰＴＫＤＦＷＬＨＡＮＮＫＥＨＳＶＥＬＨＫＣＥＫＰＬＰＤＱＡＦＦＶＬＨＮＭＨＳＮＣＶＳＦＥＣＫＴＤＰＧＶＦＩＧＶＫＤＮＨＬＡＬＩＫＶＤＳＳＥＮＬＣＴＥＮＩＬＦＫＬＳＥＴ
［配列番号８］
したがって、好ましくは、ＩＬ－３３は、配列番号８に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0047】

好ましくは、ＩＬ－３３は、０．５ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－３３は、２ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－３３は、１０ｎｇ／ｍｌ～２５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0048】

好ましくは、本方法は、インターロイキン２（ＩＬ－２）の存在下でリンパ球を培養することを含む。
したがって、一実施形態では、ＴＧＦβの存在下でナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球を培養することを含む、組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）を産生する方法が提供される。

【0049】

別の実施形態では、ＴＧＦβ、ＩＬ－１５およびＩＬ－３３の存在下でナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球を培養することを含む、組織常在性記憶Ｔ細胞を産生する方法が提供される。

【0050】

したがって、一実施形態では、ＴＧＦβ、ＩＬ－１５およびＩＬ－３３の存在下でナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球を培養することを含む、組織常在性記憶ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞を産生する方法が提供される。

【0051】

好ましくは、本方法は、少なくとも１つのインターロイキン１ファミリーメンバー、例えばＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよび／またはＩＬ－１８の存在下で培養することをさらに含む。

【0052】

好ましくは、インターロイキン１ファミリーメンバーは哺乳動物である。最も好ましくは、インターロイキン１ファミリーメンバーはヒトである。
一実施形態では、ＩＬ－１αは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３５５２によって表すことができ、以下のように、配列番号１１として本明細書に提供される：
ＭＡＫＶＰＤＭＦＥＤＬＫＮＣＹＳＥＮＥＥＤＳＳＳＩＤＨＬＳＬＮＱＫＳＦＹＨＶＳＹＧＰＬＨＥＧＣＭＤＱＳＶＳＬＳＩＳＥＴＳＫＴＳＫＬＴＦＫＥＳＭＶＶＶＡＴＮＧＫＶＬＫＫＲＲＬＳＬＳＱＳＩＴＤＤＤＬＥＡＩＡＮＤＳＥＥＥＩＩＫＰＲＳＡＰＦＳＦＬＳＮＶＫＹＮＦＭＲＩＩＫＹＥＦＩＬＮＤＡＬＮＱＳＩＩＲＡＮＤＱＹＬＴＡＡＡＬＨＮＬＤＥＡＶＫＦＤＭＧＡＹＫＳＳＫＤＤＡＫＩＴＶＩＬＲＩＳＫＴＱＬＹＶＴＡＱＤＥＤＱＰＶＬＬＫＥＭＰＥＩＰＫＴＩＴＧＳＥＴＮＬＬＦＦＷＥＴＨＧＴＫＮＹＦＴＳＶＡＨＰＮＬＦＩＡＴＫＱＤＹＷＶＣＬＡＧＧＰＰＳＩＴＤＦＱＩＬＥＮＱＡ
［配列番号１１］
したがって、好ましくは、ＩＬ－１αは、配列番号１１に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0053】

好ましくは、ＩＬ－１αは０．１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－１αは、１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－１αは、５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0054】

一実施形態では、ＩＬ－１βは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３５５３によって表すことができ、以下のように、配列番号１２として本明細書に提供される：
ＭＡＥＶＰＥＬＡＳＥＭＭＡＹＹＳＧＮＥＤＤＬＦＦＥＡＤＧＰＫＱＭＫＣＳＦＱＤＬＤＬＣＰＬＤＧＧＩＱＬＲＩＳＤＨＨＹＳＫＧＦＲＱＡＡＳＶＶＶＡＭＤＫＬＲＫＭＬＶＰＣＰＱＴＦＱＥＮＤＬＳＴＦＦＰＦＩＦＥＥＥＰＩＦＦＤＴＷＤＮＥＡＹＶＨＤＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳ
［配列番号１２］
したがって、好ましくは、ＩＬ－１βは、実質的に配列番号１２に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0055】

好ましくは、ＩＬ－１βは０．１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－１βは、１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－１βは５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0056】

一実施形態では、ＩＬ－１８は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３６０６によって表すことができ、以下のように、配列番号１３として本明細書に提供される：
ＭＡＡＥＰＶＥＤＮＣＩＮＦＶＡＭＫＦＩＤＮＴＬＹＦＩＡＥＤＤＥＮＬＥＳＤＹＦＧＫＬＥＳＫＬＳＶＩＲＮＬＮＤＱＶＬＦＩＤＱＧＮＲＰＬＦＥＤＭＴＤＳＤＣＲＤＮＡＰＲＴＩＦＩＩＳＭＹＫＤＳＱＰＲＧＭＡＶＴＩＳＶＫＣＥＫＩＳＴＬＳＣＥＮＫＩＩＳＦＫＥＭＮＰＰＤＮＩＫＤＴＫＳＤＩＩＦＦＱＲＳＶＰＧＨＤＮＫＭＱＦＥＳＳＳＹＥＧＹＦＬＡＣＥＫＥＲＤＬＦＫＬＩＬＫＫＥＤＥＬＧＤＲＳＩＭＦＴＶＱＮＥＤ
［配列番号１３］
したがって、好ましくは、ＩＬ－１８は、配列番号１３に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0057】

好ましくは、ＩＬ－１８は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－１８は、１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－１８は５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0058】

リンパ球は、少なくとも１つのアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドを含む培養培地で培養することができる。ＡｈＲリガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。好ましくは、ＡｈＲリガンドはアゴニストである。好ましくは、ＡｈＲリガンドはアンタゴニストである。

【0059】

ＡｈＲリガンドは、ハロゲン化芳香族炭化水素、多環式芳香族炭化水素、食物由来のアリール炭化水素、ヘム代謝産物、インジゴイド、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１およびトリプトファン代謝産物からなる群から選択されてもよい。

【0060】

ハロゲン化芳香族炭化水素は、テトラクロロジベンゾ－ｐ－ダイオキシン（ＴＣＤＤ）であってもよい。多環式芳香族炭化水素は、３－メチルコラントレンであってもよい。トリプトファン代謝産物は、６－ホルミルインドロ［３，２－ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）であってもよい。食物由来のアリール炭化水素は、フラボンおよび／またはインドール誘導体であってもよい。インドール誘導体は、インドール－３－カルビノール（Ｉ３Ｃ）および／またはその生成物ジインドリルメタン（ＤＩＭ）であってもよい。

【0061】

リンパ球は、少なくとも１つの脂質を含む培養培地で培養することができる。好ましくは、脂質はコレステロールおよび／または中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）である。ＭＣＦＡはオレイン酸であってもよい。

【0062】

リンパ球は、抗原とともにさらに培養することができる。抗原の具体的なタイプは、Ｔ_ＲＭ細胞が使用される治療用途によって異なる。例えば、リンパ球を腫瘍抗原とともに培養することができる。

【0063】

好ましくは、いくつかの実施形態では、本方法は、制御性Ｔ細胞または１型制御性Ｔ細胞の存在下でリンパ球を培養することを含む。
したがって、本発明の別の態様では、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）の存在下でリンパ球を培養することおよび／またはリンパ球を１型制御性Ｔ細胞と共培養することを含む、組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）を産生する方法が提供される。

【0064】

当業者は、「制御性Ｔ細胞」がＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットとして末梢免疫に関与するＴ細胞であることを理解するであろう。好ましくは、制御性Ｔ細胞は、転写因子であるフォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）の発現によって特徴付けられる。他の実施形態では、本方法は、制御性Ｔ細胞の存在下でリンパ球を培養することを含まない。

【0065】

当業者は、「１型制御性Ｔ細胞」が、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットとして末梢免疫に関与する制御性Ｔ細胞のクラスであることを理解するであろう。好ましくは、１型制御性Ｔ細胞は、転写因子、フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）、Ｔボックス転写因子２１（Ｔｂｅｔ）、および／または表面分子Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）の発現によって特徴付けられる。他の実施形態では、本方法は、１型制御性Ｔ細胞の存在下でリンパ球を培養することを含まない。

【0066】

一実施形態では、Ｆｏｘｐ３は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：５０９４３によって表すことができ、以下のように、配列番号２３として本明細書に提供される：
ＭＰＮＰＲＰＧＫＰＳＡＰＳＬＡＬＧＰＳＰＧＡＳＰＳＷＲＡＡＰＫＡＳＤＬＬＧＡＲＧＰＧＧＴＦＱＧＲＤＬＲＧＧＡＨＡＳＳＳＳＬＮＰＭＰＰＳＱＬＱＬＰＴＬＰＬＶＭＶＡＰＳＧＡＲＬＧＰＬＰＨＬＱＡＬＬＱＤＲＰＨＦＭＨＱＬＳＴＶＤＡＨＡＲＴＰＶＬＱＶＨＰＬＥＳＰＡＭＩＳＬＴＰＰＴＴＡＴＧＶＦＳＬＫＡＲＰＧＬＰＰＧＩＮＶＡＳＬＥＷＶＳＲＥＰＡＬＬＣＴＦＰＮＰＳＡＰＲＫＤＳＴＬＳＡＶＰＱＳＳＹＰＬＬＡＮＧＶＣＫＷＰＧＣＥＫＶＦＥＥＰＥＤＦＬＫＨＣＱＡＤＨＬＬＤＥＫＧＲＡＱＣＬＬＱＲＥＭＶＱＳＬＥＱＱＬＶＬＥＫＥＫＬＳＡＭＱＡＨＬＡＧＫＭＡＬＴＫＡＳＳＶＡＳＳＤＫＧＳＣＣＩＶＡＡＧＳＱＧＰＶＶＰＡＷＳＧＰＲＥＡＰＤＳＬＦＡＶＲＲＨＬＷＧＳＨＧＮＳＴＦＰＥＦＬＨＮＭＤＹＦＫＦＨＮＭＲＰＰＦＴＹＡＴＬＩＲＷＡＩＬＥＡＰＥＫＱＲＴＬＮＥＩＹＨＷＦＴＲＭＦＡＦＦＲＮＨＰＡＴＷＫＮＡＩＲＨＮＬＳＬＨＫＣＦＶＲＶＥＳＥＫＧＡＶＷＴＶＤＥＬＥＦＲＫＫＲＳＱＲＰＳＲＣＳＮＰＴＰＧＰ
［配列番号２３］
したがって、好ましくは、Ｆｏｘｐ３は、配列番号２３に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0067】

一実施形態では、Ｔｂｅｔは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３０００９によって表すことができ、以下のように、配列番号２４として本明細書に提供される：
ＭＧＩＶＥＰＧＣＧＤＭＬＴＧＴＥＰＭＰＧＳＤＥＧＲＡＰＧＡＤＰＱＨＲＹＦＹＰＥＰＧＡＱＤＡＤＥＲＲＧＧＧＳＬＧＳＰＹＰＧＧＡＬＶＰＡＰＰＳＲＦＬＧＡＹＡＹＰＰＲＰＱＡＡＧＦＰＧＡＧＥＳＦＰＰＰＡＤＡＥＧＹＱＰＧＥＧＹＡＡＰＤＰＲＡＧＬＹＰＧＰＲＥＤＹＡＬＰＡＧＬＥＶＳＧＫＬＲＶＡＬＮＮＨＬＬＷＳＫＦＮＱＨＱＴＥＭＩＩＴＫＱＧＲＲＭＦＰＦＬＳＦＴＶＡＧＬＥＰＴＳＨＹＲＭＦＶＤＶＶＬＶＤＱＨＨＷＲＹＱＳＧＫＷＶＱＣＧＫＡＥＧＳＭＰＧＮＲＬＹＶＨＰＤＳＰＮＴＧＡＨＷＭＲＱＥＶＳＦＧＫＬＫＬＴＮＮＫＧＡＳＮＮＶＴＱＭＩＶＬＱＳＬＨＫＹＱＰＲＬＨＩＶＥＶＮＤＧＥＰＥＡＡＣＮＡＳＮＴＨＩＦＴＦＱＥＴＱＦＩＡＶＴＡＹＱＮＡＥＩＴＱＬＫＩＤＮＮＰＦＡＫＧＦＲＥＮＦＥＳＭＹＴＳＶＤＴＳＩＰＳＰＰＧＰＮＣＱＦＬＧＧＤＨＹＳＰＬＬＰＮＱＹＰＶＰＳＲＦＹＰＤＬＰＧＱＡＫＤＶＶＰＱＡＹＷＬＧＡＰＲＤＨＳＹＥＡＥＦＲＡＶＳＭＫＰＡＦＬＰＳＡＰＧＰＴＭＳＹＹＲＧＱＥＶＬＡＰＧＡＧＷＰＶＡＰＱＹＰＰＫＭＧＰＡＳＷＦＲＰＭＲＴＬＰＭＥＰＧＰＧＧＳＥＧＲＧＰＥＤＱＧＰＰＬＶＷＴＥＩＡＰＩＲＰＥＳＳＤＳＧＬＧＥＧＤＳＫＲＲＲＶＳＰＹＰＳＳＧＤＳＳＳＰＡＧＡＰＳＰＦＤＫＥＡＥＧＱＦＹＮＹＦＰＮ
［配列番号２４］
したがって、好ましくは、Ｔｂｅｔは、配列番号２４に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0068】

一実施形態では、ＣＸＣＲ３は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：２８３３によって表すことができ、以下のように、配列番号２５として本明細書に提供される：
ＭＥＬＲＫＹＧＰＧＲＬＡＧＴＶＩＧＧＡＡＱＳＫＳＱＴＫＳＤＳＩＴＫＥＦＬＰＧＬＹＴＡＰＳＳＰＦＰＰＳＱＶＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥＶＡＡＬＬＥＮＦＳＳＳＹＤＹＧＥＮＥＳＤＳＣＣＴＳＰＰＣＰＱＤＦＳＬＮＦＤＲＡＦＬＰＡＬＹＳＬＬＦＬＬＧＬＬＧＮＧＡＶＡＡＶＬＬＳＲＲＴＡＬＳＳＴＤＴＦＬＬＨＬＡＶＡＤＴＬＬＶＬＴＬＰＬＷＡＶＤＡＡＶＱＷＶＦＧＳＧＬＣＫＶＡＧＡＬＦＮＩＮＦＹＡＧＡＬＬＬＡＣＩＳＦＤＲＹＬＮＩＶＨＡＴＱＬＹＲＲＧＰＰＡＲＶＴＬＴＣＬＡＶＷＧＬＣＬＬＦＡＬＰＤＦＩＦＬＳＡＨＨＤＥＲＬＮＡＴＨＣＱＹＮＦＰＱＶＧＲＴＡＬＲＶＬＱＬＶＡＧＦＬＬＰＬＬＶＭＡＹＣＹＡＨＩＬＡＶＬＬＶＳＲＧＱＲＲＬＲＡＭＲＬＶＶＶＶＶＶＡＦＡＬＣＷＴＰＹＨＬＶＶＬＶＤＩＬＭＤＬＧＡＬＡＲＮＣＧＲＥＳＲＶＤＶＡＫＳＶＴＳＧＬＧＹＭＨＣＣＬＮＰＬＬＹＡＦＶＧＶＫＦＲＥＲＭＷＭＬＬＬＲＬＧＣＰＮＱＲＧＬＱＲＱＰＳＳＳＲＲＤＳＳＷＳＥＴＳＥＡＳＹＳＧＬ
［配列番号２５］
したがって、好ましくは、ＣＸＣＲ３は、配列番号２５に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0069】

好ましくは、制御性Ｔ細胞（好ましくは１型制御性Ｔ細胞）は、インテグリンアルファＶベータ８（αｖβ８）を発現する。当業者は、αｖβ８がインテグリンサブユニット（Ｉｔｇβ８）およびインテグリンサブユニットアルファＶ（Ｉｔｇａｖ）の二量体であることを理解するであろう。したがって、好ましくは、制御性Ｔ細胞（好ましくは１型制御性Ｔ細胞）は、Ｉｔｇβ８およびＩｔｇａｖを発現する。

【0070】

一実施形態では、Ｉｔｇβ８は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３６９６によって表すことができ、以下のように、配列番号２６として本明細書に提供される：
ＭＣＧＳＡＬＡＦＦＴＡＡＦＶＣＬＱＮＤＲＲＧＰＡＳＦＬＷＡＡＷＶＦＳＬＶＬＧＬＧＱＧＥＤＮＲＣＡＳＳＮＡＡＳＣＡＲＣＬＡＬＧＰＥＣＧＷＣＶＱＥＤＦＩＳＧＧＳＲＳＥＲＣＤＩＶＳＮＬＩＳＫＧＣＳＶＤＳＩＥＹＰＳＶＨＶＩＩＰＴＥＮＥＩＮＴＱＶＴＰＧＥＶＳＩＱＬＲＰＧＡＥＡＮＦＭＬＫＶＨＰＬＫＫＹＰＶＤＬＹＹＬＶＤＶＳＡＳＭＨＮＮＩＥＫＬＮＳＶＧＮＤＬＳＲＫＭＡＦＦＳＲＤＦＲＬＧＦＧＳＹＶＤＫＴＶＳＰＹＩＳＩＨＰＥＲＩＨＮＱＣＳＤＹＮＬＤＣＭＰＰＨＧＹＩＨＶＬＳＬＴＥＮＩＴＥＦＥＫＡＶＨＲＱＫＩＳＧＮＩＤＴＰＥＧＧＦＤＡＭＬＱＡＡＶＣＥＳＨＩＧＷＲＫＥＡＫＲＬＬＬＶＭＴＤＱＴＳＨＬＡＬＤＳＫＬＡＧＩＶＶＰＮＤＧＮＣＨＬＫＮＮＶＹＶＫＳＴＴＭＥＨＰＳＬＧＱＬＳＥＫＬＩＤＮＮＩＮＶＩＦＡＶＱＧＫＱＦＨＷＹＫＤＬＬＰＬＬＰＧＴＩＡＧＥＩＥＳＫＡＡＮＬＮＮＬＶＶＥＡＹＱＫＬＩＳＥＶＫＶＱＶＥＮＱＶＱＧＩＹＦＮＩＴＡＩＣＰＤＧＳＲＫＰＧＭＥＧＣＲＮＶＴＳＮＤＥＶＬＦＮＶＴＶＴＭＫＫＣＤＶＴＧＧＫＮＹＡＩＩＫＰＩＧＦＮＥＴＡＫＩＨＩＨＲＮＣＳＣＱＣＥＤＮＲＧＰＫＧＫＣＶＤＥＴＦＬＤＳＫＣＦＱＣＤＥＮＫＣＨＦＤＥＤＱＦＳＳＥＳＣＫＳＨＫＤＱＰＶＣＳＧＲＧＶＣＶＣＧＫＣＳＣＨＫＩＫＬＧＫＶＹＧＫＹＣＥＫＤＤＦＳＣＰＹＨＨＧＮＬＣＡＧＨＧＥＣＥＡＧＲＣＱＣＦＳＧＷＥＧＤＲＣＱＣＰＳＡＡＡＱＨＣＶＮＳＫＧＱＶＣＳＧＲＧＴＣＶＣＧＲＣＥＣＴＤＰＲＳＩＧＲＦＣＥＨＣＰＴＣＹＴＡＣＫＥＮＷＮＣＭＱＣＬＨＰＨＮＬＳＱＡＩＬＤＱＣＫＴＳＣＡＬＭＥＱＱＨＹＶＤＱＴＳＥＣＦＳＳＰＳＹＬＲＩＦＦＩＩＦＩＶＴＦＬＩＧＬＬＫＶＬＩＩＲＱＶＩＬＱＷＮＳＮＫＩＫＳＳＳＤＹＲＶＳＡＳＫＫＤＫＬＩＬＱＳＶＣＴＲＡＶＴＹＲＲＥＫＰＥＥＩＫＭＤＩＳＫＬＮＡＨＥＴＦＲＣＮＦ
［配列番号２６］
したがって、好ましくは、Ｉｔｇβ８は、配列番号２６に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0071】

一実施形態では、Ｉｔｇａｖは、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３６８５によって表すことができ、以下のように、配列番号２７として本明細書に提供される：
ＭＡＦＰＰＲＲＲＬＲＬＧＰＲＧＬＰＬＬＬＳＧＬＬＬＰＬＣＲＡＦＮＬＤＶＤＳＰＡＥＹＳＧＰＥＧＳＹＦＧＦＡＶＤＦＦＶＰＳＡＳＳＲＭＦＬＬＶＧＡＰＫＡＮＴＴＱＰＧＩＶＥＧＧＱＶＬＫＣＤＷＳＳＴＲＲＣＱＰＩＥＦＤＡＴＧＮＲＤＹＡＫＤＤＰＬＥＦＫＳＨＱＷＦＧＡＳＶＲＳＫＱＤＫＩＬＡＣＡＰＬＹＨＷＲＴＥＭＫＱＥＲＥＰＶＧＴＣＦＬＱＤＧＴＫＴＶＥＹＡＰＣＲＳＱＤＩＤＡＤＧＱＧＦＣＱＧＧＦＳＩＤＦＴＫＡＤＲＶＬＬＧＧＰＧＳＦＹＷＱＧＱＬＩＳＤＱＶＡＥＩＶＳＫＹＤＰＮＶＹＳＩＫＹＮＮＱＬＡＴＲＴＡＱＡＩＦＤＤＳＹＬＧＹＳＶＡＶＧＤＦＮＧＤＧＩＤＤＦＶＳＧＶＰＲＡＡＲＴＬＧＭＶＹＩＹＤＧＫＮＭＳＳＬＹＮＦＴＧＥＱＭＡＡＹＦＧＦＳＶＡＡＴＤＩＮＧＤＤＹＡＤＶＦＩＧＡＰＬＦＭＤＲＧＳＤＧＫＬＱＥＶＧＱＶＳＶＳＬＱＲＡＳＧＤＦＱＴＴＫＬＮＧＦＥＶＦＡＲＦＧＳＡＩＡＰＬＧＤＬＤＱＤＧＦＮＤＩＡＩＡＡＰＹＧＧＥＤＫＫＧＩＶＹＩＦＮＧＲＳＴＧＬＮＡＶＰＳＱＩＬＥＧＱＷＡＡＲＳＭＰＰＳＦＧＹＳＭＫＧＡＴＤＩＤＫＮＧＹＰＤＬＩＶＧＡＦＧＶＤＲＡＩＬＹＲＡＲＰＶＩＴＶＮＡＧＬＥＶＹＰＳＩＬＮＱＤＮＫＴＣＳＬＰＧＴＡＬＫＶＳＣＦＮＶＲＦＣＬＫＡＤＧＫＧＶＬＰＲＫＬＮＦＱＶＥＬＬＬＤＫＬＫＱＫＧＡＩＲＲＡＬＦＬＹＳＲＳＰＳＨＳＫＮＭＴＩＳＲＧＧＬＭＱＣＥＥＬＩＡＹＬＲＤＥＳＥＦＲＤＫＬＴＰＩＴＩＦＭＥＹＲＬＤＹＲＴＡＡＤＴＴＧＬＱＰＩＬＮＱＦＴＰＡＮＩＳＲＱＡＨＩＬＬＤＣＧＥＤＮＶＣＫＰＫＬＥＶＳＶＤＳＤＱＫＫＩＹＩＧＤＤＮＰＬＴＬＩＶＫＡＱＮＱＧＥＧＡＹＥＡＥＬＩＶＳＩＰＬＱＡＤＦＩＧＶＶＲＮＮＥＡＬＡＲＬＳＣＡＦＫＴＥＮＱＴＲＱＶＶＣＤＬＧＮＰＭＫＡＧＴＱＬＬＡＧＬＲＦＳＶＨＱＱＳＥＭＤＴＳＶＫＦＤＬＱＩＱＳＳＮＬＦＤＫＶＳＰＶＶＳＨＫＶＤＬＡＶＬＡＡＶＥＩＲＧＶＳＳＰＤＨＶＦＬＰＩＰＮＷＥＨＫＥＮＰＥＴＥＥＤＶＧＰＶＶＱＨＩＹＥＬＲＮＮＧＰＳＳＦＳＫＡＭＬＨＬＱＷＰＹＫＹＮＮＮＴＬＬＹＩＬＨＹＤＩＤＧＰＭＮＣＴＳＤＭＥＩＮＰＬＲＩＫＩＳＳＬＱＴＴＥＫＮＤＴＶＡＧＱＧＥＲＤＨＬＩＴＫＲＤＬＡＬＳＥＧＤＩＨＴＬＧＣＧＶＡＱＣＬＫＩＶＣＱＶＧＲＬＤＲＧＫＳＡＩＬＹＶＫＳＬＬＷＴＥＴＦＭＮＫＥＮＱＮＨＳＹＳＬＫＳＳＡＳＦＮＶＩＥＦＰＹＫＮＬＰＩＥＤＩＴＮＳＴＬＶＴＴＮＶＴＷＧＩＱＰＡＰＭＰＶＰＶＷＶＩＩＬＡＶＬＡＧＬＬＬＬＡＶＬＶＦＶＭＹＲＭＧＦＦＫＲＶＲＰＰＱＥＥＱＥＲＥＱＬＱＰＨＥＮＧＥＧＮＳＥＴ
［配列番号２７］
したがって、好ましくは、Ｉｔｇａｖは、実質的に配列番号２７に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0072】

一実施形態では、１型制御性Ｔ細胞（好ましくは１型制御性Ｔ細胞）は、好ましくは抗ＣＤ３抗体などの抗ＣＤ３分子および／またはＩＬ－２によって活性化され得る。
αｖβ８の発現は、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｇｅｒｕｌｉｎ）によって制御性Ｔ細胞（好ましくは１型制御性Ｔ細胞）で増強され得る。したがって、本方法は、制御性Ｔ細胞（好ましくは１型制御性Ｔ細胞）をアンフィレグリンと接触させることをさらに含んでもよい。

【0073】

本方法は、リンパ球を樹状細胞とともに培養することをさらに含んでもよい。
好ましくは、リンパ球は、１００Ｅ＋０３細胞／ｃｍ^２から２０００Ｅ＋０３細胞／ｃｍ^２の間で培養される。より好ましくは、リンパ球は、２５０Ｅ＋０３細胞／ｃｍ^２から１０００Ｅ＋０３細胞／ｃｍ^２の間で培養される。最も好ましくは、リンパ球は、２５０Ｅ＋０３細胞／ｃｍ^２から１０００Ｅ＋０３細胞／ｃｍ^２の間で培養される。

【0074】

一実施形態では、本方法は、培養物からＴ_ＲＭ細胞を精製することをさらに含む。
当業者は、本明細書に記載されるサイトカインなどの任意の因子が哺乳動物のものであり得ることを理解するであろう。哺乳動物は、げっ歯類、イヌ、ウマまたはブタであり得る。げっ歯類は、ラットまたはマウスであり得る。しかし、好ましくは、本明細書に記載の因子はヒトのものである。

【0075】

第２の態様では、組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）の集団を増殖する方法が提供され、本方法は、第１の態様で定義された組織常在性記憶Ｔ細胞の集団を培養することを含む。
組織常在性記憶Ｔ細胞は、第１の態様で定義された通りであり得る。

【0076】

第１または第２の態様の方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１の存在下で組織常在性記憶Ｔ細胞を培養することをさらに含み得る。

【0077】

好ましくは、ＩＬ－２は哺乳動物のものである。最も好ましくは、ＩＬ－２はヒトＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：３５５８によって表すことができ、以下のように、配列番号１７として本明細書に提供される：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
［配列番号１７］
したがって、好ましくは、ＩＬ－２は、配列番号１７に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0078】

好ましくは、ＩＬ－２は、０．１ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－２は、２ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－２は１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0079】

好ましくは、ＩＬ－２１は哺乳動物のものである。最も好ましくは、ＩＬ－２１はヒトＩＬ－２１である。一実施形態では、ＩＬ－２１は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：５９０６７によって表すことができ、以下のように、配列番号１５として本明細書に提供される：
ＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶＨＫＳＳＳＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤＩＶＤＱＬＫＮＹＶＮＤＬＶＰＥＦＬＰＡＰＥＤＶＥＴＮＣＥＷＳＡＦＳＣＦＱＫＡＱＬＫＳＡＮＴＧＮＮＥＲＩＩＮＶＳＩＫＫＬＫＲＫＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥＫＫＰＰＫＥＦＬＥＲＦＫＳＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳＳＲＴＨＧＳＥＤＳ
［配列番号１５］
したがって、好ましくは、ＩＬ－２１は、配列番号１５に実質的に示される配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、またはそれからなる。

【0080】

好ましくは、ＩＬ－２１は、０．１ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。より好ましくは、ＩＬ－２１は、５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。最も好ましくは、ＩＬ－２１は、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

【0081】

第３の態様では、第１の態様による方法によって得られる、または得ることができる組織常在性記憶Ｔ細胞が提供される。
本発明の方法によって産生された組織常在性記憶Ｔ細胞は、治療用途において特に有用である。

【0082】

Ｔ細胞は、腫瘍を根絶するための強力なツールであることが示されている。Ｔ細胞、特に腫瘍組織内の組織常在性記憶Ｔ細胞の存在は、陽性な癌の予後と相関することが知られる^９４。いくつかの研究では、固形腫瘍において、ＣＤ１０３の発現によって特定されるＴ_ＲＭ細胞の存在が、癌の進行期であっても高い生存率と全体的な陽性の予後と特に関連付けられている^{９５、９６}。さらに、Ｔ_ＲＭ細胞は、他の既知の免疫療法との併用療法で癌患者の生存率を大幅に改善することが示されている^９７。しかし、天然に存在するＴ_ＲＭ細胞の数は通常、有意な治療効果が観察されるためには、他のタイプのＴ細胞と比較して少ない。そのため、Ｔ_ＲＭ細胞の属性、およびＣＤ１０３、ＣＤ６９、ＣＴＬＡ－４の発現など、Ｔ細胞が腫瘍に浸透できるようになる遊走および組織ホーミング属性を備えた抗腫瘍療法用のＴ細胞をインビトロで生成すると、単剤療法または併用療法として非常に価値があると思われる。

【0083】

したがって、好ましくは、本発明のＴ_ＲＭ細胞はＣＤ１０３を発現する。好ましくは、本発明のＴ_ＲＭ細胞はＣＤ６９を発現する。好ましくは、本発明のＴ_ＲＭ細胞はＣＴＬＡ－４を発現する。

【0084】

したがって、本発明の第４の態様では、治療に使用するための、第３の態様による組織常在性記憶Ｔ細胞、場合によってはその増殖された集団が提供される。
本発明の第５の態様では、Ｔ細胞療法で使用するための、第３の態様による組織常在性記憶Ｔ細胞、場合によってはその増殖された集団が提供される。

【0085】

組織常在性記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）の増殖された集団は、治療、特にＴ細胞療法において特に有用であることが理解されるであろう。
Ｔ細胞療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法であってもよい。Ｔ細胞療法は、ガンマデルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞またはナチュラルキラーＴ細胞ベースの療法などの先天性Ｔ細胞療法であり得る。

【0086】

本発明の第６の態様では、癌または感染症の予防、治療または改善の使用のための、第３の態様による組織常在性記憶Ｔ細胞、場合によりその増殖された集団が提供される。
本発明の第７の態様では、そのような治療を必要とする対象に、第３の態様による治療有効量の組織常在性記憶Ｔ細胞、場合によりその増殖された集団を投与すること、または投与させることを含む、対象における癌または感染症を治療する方法が提供される。

【0087】

Ｔ_ＲＭ細胞は、抗原提示細胞、インターロイキン（ＩＬ）－１５およびＴＧＦβの存在下で、以前に活性化されたＴ細胞のインビトロ培養によって生成されてもよい。ＩＬ－２または特にＩＬ－７の添加は、好ましくは、マウスモデルにおける分化クラスター（ＣＤ）６９、ＣＤ１０３、および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の発現などのＴ_ＲＭ細胞遊走特性および養子移入時の末梢器官からの細胞回収を向上させる。

【0088】

本発明に従って産生された組織常在性記憶Ｔ細胞は、単剤療法（すなわち、（ｉ）組織常在性記憶Ｔ細胞、または（ｉｉ）組織常在性記憶Ｔ細胞を含む治療組成物の単独使用）において使用され得ることが理解される。あるいは、本発明による組織常在性記憶Ｔ細胞は、疾患、例えば癌を治療、改善、または予防するための既知の療法の補助として、または併用して使用することができる。

【0089】

本発明による組織常在性記憶Ｔ細胞は、特に組成物が使用される方法に応じて、多くの異なる形態を有する組成物に組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療が必要な人または動物に投与することができる任意の他の適切な形態であってもよい。本発明による薬剤のビヒクルは、それが投与される対象によって十分に許容されるものであるべきであることは理解されるであろう。

【0090】

本発明の組織常在性記憶Ｔ細胞は、多くの方法で使用され得る。例えば、経口投与が必要とされる場合があり、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセルまたは液体の形態で経口摂取することができる組成物の内に含有してもよい。本発明の抗生物質組成物および製剤は、吸入によって（例えば、鼻腔内に）投与されてもよい。組成物は、局所使用のために製剤化することもできる。例えば、クリームや軟膏を皮膚に適用してもよい。

【0091】

本発明による組織常在性記憶Ｔ細胞組成物および製剤はまた、徐放または遅延放出デバイス内に組み込まれてもよい。このようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下の特定の組織位置に挿入することができ、薬剤は、数時間、数日、数週間、さらには数カ月にわたって放出され得る。デバイスは、治療部位に少なくとも隣接して位置され得る。そのようなデバイスは、本発明に従って使用される薬剤での長期治療が必要であり、通常は頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の投与）が必要となる場合に特に有利であり得る。

【0092】

好ましい実施形態では、本発明による組織常在性記憶Ｔ細胞は、血流への注射によって、または治療を必要とする部位へ直接、注射することによって対象に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）または皮下（ボーラスまたは注入）、または皮内（ボーラスまたは注入）、または筋肉内であり得る。好ましくは、本発明の組織常在性記憶Ｔ細胞は、末梢血を介して投与される。好ましくは、本発明の組織常在性記憶Ｔ細胞は静脈内投与される。

【0093】

必要とされる組織常在性記憶Ｔ細胞の量は、その生物学的活性およびバイオアベイラビリティによって決定されるが、これは投与様式、組織常在性記憶Ｔ細胞の生理化学的特性、およびそれらが単独療法として使用されるか、併用療法として使用されるかによっても依存している。投与の頻度はまた、治療される対象内の組織常在性記憶Ｔ細胞の半減期によっても影響を受ける。投与される最適投与量は、当業者によって決定することができ、使用される特定の組成物および製剤、医薬組成物の強度、投与様式、および治療される特定の疾患の進行によって変化する。対象の年齢、体重、性別、食事、投与時期など、治療される特定の対象に依存する追加の要因により、投与量を調整する必要がある。

【0094】

一般に、本発明によるＴ_ＲＭ細胞または製剤の０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量を、使用される組成物または製剤に応じて使用することができる。より好ましくは、１日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重の間であり、より好ましくは、０．１μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ体重の間であり、最も好ましくは、およそ０．１μｇ／ｋｇから１０μｇ／ｋｇ体重の間である。一般に、本発明の１０＾５Ｔ_ＲＭ細胞から１０＾７Ｔ_ＲＭ細胞の間の１日用量を使用することができる。好ましくは、本発明の１０＾５Ｔ_ＲＭ細胞から１０＾６Ｔ_ＲＭ細胞の間の１日用量を使用することができる。

【0095】

組成物または製剤は、治療する疾患の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。１日用量は、１回の投与（例えば、１日１回の注射）として与えることができる。あるいは、組織常在性記憶Ｔ細胞は、１日に２回以上の投与が必要となる場合がある。例として、組織常在性記憶Ｔ細胞は、１０＾５Ｔ_ＲＭ細胞から１０＾７Ｔ_ＲＭ細胞の間の２回（または治療される疾患の重症度に応じてそれ以上）の１日用量として投与してもよい（すなわち、体重を７０ｋｇと仮定する）。治療を受けている患者は、起床時に最初の用量を服用し、その後、夕方（２回の用量レジメンの場合）またはその後３時間または４時間の間隔で第２の用量を服用することができる。あるいは、反復用量を投与する必要なく、本発明による濃度の最適用量を患者に提供するため徐放デバイスを使用してもよい。

【0096】

製薬業界で従来から採用されているような既知の手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など）を使用して、本発明による特定の製剤および正確な治療レジメン（組織常在性記憶Ｔ細胞の１日用量、投与頻度など）を形成することができる。

【0097】

第８の態様では、第３の態様による組織常在性記憶Ｔ細胞、任意選択でその増殖集団、および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
本発明はまた、第９の態様において、治療有効量の第３の態様による組織常在性記憶Ｔ細胞、任意選択でその増殖集団を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせることを含む、第８の態様による医薬組成物の製造方法を提供する。

【0098】

「対象」は、脊椎動物、哺乳類、または家畜であり得る。したがって、本発明による薬剤は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペットの治療に使用することができるし、他の獣医学的用途にも使用することができる。最も好ましくは、対象はヒトである。

【0099】

組織常在性記憶Ｔ細胞の「治療有効量」は、対象に投与された場合に、所望の効果を生成するために必要な量である任意の量である。
薬剤の量は、約１０＾５ Ｔ_ＲＭ細胞から約１０＾７ Ｔ_ＲＭ細胞までの量であってもよく、最も好ましくは、約１０＾５ Ｔ_ＲＭ細胞から約１０＾６ Ｔ_ＲＭ細胞までの量であってもよい。

【0100】

本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物、特にはＴ細胞ベースの治療のための製剤を製剤化するのに有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または任意の既知の化合物の組み合わせである。

【0101】

一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。固体薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、色素、増量剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、防腐剤、染料、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１つまたは複数の物質を含むことができる。ビヒクルは封入材料であってもよい。粉末では、ビヒクルは、本発明による微粉化された活性剤と混合された微粉化された固体である。錠剤では、活性剤を必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な比率で混合して、所望の形状およびサイズに圧縮することができる。粉末および錠剤は、好ましくは活性剤を９９％まで含む。適切な固体ビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が含まれる。別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリームのような形態であってもよい。

【0102】

しかし、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、薬学的組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル、および加圧組成物の調製に使用される。本発明による活性剤は、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁されてもよい。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁剤、増粘剤、色素、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の適切な医薬品添加物を含むことができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例としては、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液を部分的に含む）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画されたココナッツ油および落花生油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルはオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルでもあり得る。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。

【0103】

滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内および特に皮下注射によって利用することができる。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁させることができる滅菌固体組成物として調製することができる。

【0104】

本発明の薬剤および組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびエチレンオキシドと共重合したその無水物）などを含む滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与することができる。本発明に従って使用される薬剤は、液体または固体の組成物の形態で経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、および粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル、および懸濁液などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン、および懸濁液が含まれる。

【0105】

本発明は、その変異体または断片を含む、本明細書で言及される任意の配列のアミノ酸配列または核酸配列を実質的に含む、任意の核酸もしくはペプチド、またはその変異体、誘導体またはアナログにおよぶことが理解されよう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」および「断片」という用語は、本明細書で言及する配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であることができ、例えば、配列番号１～２８などとして識別される配列と４０％の同一性を有する。

【0106】

参照される配列のいずれかと６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらにより好ましくは７５％を超える、なおより好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書に言及された配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらによりより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。

【0107】

当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性を計算する方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性を計算するためには、まず２つの配列のアラインメントを準備し、続いて配列同一性値を計算する必要がある。２つの配列のパーセンテージ同一性は、次の条件に応じて異なる値をとる可能性がある：－（ｉ）配列のアラインメントに使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装）、または３Ｄ比較からの構造アラインメント；ならびに（ｉｉ）アラインメント方法で使用されるパラメータ、例えば、ローカルアラインメント対グローバルアラインメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ、例えば関数型および定数。

【0108】

アラインメントを作成すると、２つの配列間のパーセンテージ同一性を計算するさまざまな方法がある。例えば、同一性の数を以下のものにより割ることができる：（ｉ）最短配列の長さ；（ｉｉ）アラインメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長；（ｉｖ）非ギャップ位置の数；または（ｖ）オーバーハングを除く同等の位置の数。さらに、パーセンテージ同一性もまた、長さに強く依存することが理解されるであろう。したがって、配列のペアが短いほど、偶然に発生すると予想される配列同一性が高くなる。

【0109】

したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的な多重アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、４６７３～４６８０頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４８７６～４８８２頁）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡの多重アラインメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに適したパラメータは以下の通りである：ＤＮＡアラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ拡張ペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝アイデンティティ。タンパク質アラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ拡張ペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝ゴネット。ＤＮＡおよびタンパク質アラインメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アラインメントのためにこれらおよび他のパラメータを変えることが必要である場合があることに気付くであろう。

【0110】

好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性の計算は、（Ｎ／Ｔ）×１００のようなアラインメントから計算することができ、ここで、Ｎは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔはギャップを含み、オーバーハングを含むか含まないかのいずれかで比較された位置の総数である。好ましくは、オーバーハングが計算に含まれる。したがって、２つの配列間のパーセンテージ同一性を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば上記のようなパラメータの適切なセットを使用し、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを準備するステップ；ならびに（ｉｉ）ＮおよびＴの値を式：－配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００、に挿入するステップを含む。

【0111】

類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に知られている。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはその相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。本発明者らは、ストリンジェントな条件とは、約４５℃で３ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡにヌクレオチドがハイブリダイズし、続いて約２０～６５℃で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで少なくとも１回洗浄することを意味している。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列である配列番号１～２８のものにおいて示される配列とは、少なくとも１個であって、５、１０、２０、５０または１００個未満のアミノ酸だけ異なり得る。

【0112】

遺伝コードの縮重により、本明細書に記載の任意の核酸配列を、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変化または変更して、その機能的変異体を提供し得ることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変され、その結果、サイレント（同義）変化を生じる配列を有するものである。他の適切な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、配列の全てまたは一部からなるものであり、置換するアミノ酸と生物物理学的特性が類似した側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により改変されて、保存的変化を生じるものである。例えば、小さい非極性疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸を類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換えることができるかが理解され、当業者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知るであろう。

【0113】

本明細書に記載された全ての特徴（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはこのように開示された任意の方法もしくはプロセスの全てのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることが可能である。

【0114】

本発明をよりよく理解するために、また、同様の実施形態がどのように実行され得るかを示すために、例として添付の図面を参照する：

【図面の簡単な説明】

【0115】

【図1】Ｆｏｘｐ３依存性のＴｂｘ２１切除が、１型Ｔｒｅｇ細胞数の減少をもたらすことを示す図である。（ａ）フローサイトメトリー分析によってＴ－ｂｅｔについて染色された腸Ｔ_ＲＭまたは脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の割パーセンテージ（ｎ＝４～７）。示された器官におけるＦｏｘｐ３ＷＴおよびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスのＴ細胞集団のエクスビボフローサイトメトリー分析。（ｂ、ｆ）（ａ）Ｆｏｘｐ３ＷＴまたは（ｆ）Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスでＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６またはＳＴ２のいずれかを発現する脾臓、腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）または粘膜固有層（ＬＰＬ）におけるＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）の割合（ｎ＝４～１２）。（ｃ、ｄ）（ｃ）脾臓または（ｄ）胸腺のＣＤ４＋、ＣＤ８α＋およびＴｒｅｇ細胞で発現したＣＸＣＲ３のパーセンテージ（ｎ＝５）。（ｅ）脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ３発現の代表的なフローサイトメトリープロット。（ｇ－ｊ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白丸）およびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウス（黒三角）における（ｇ）ＣＤ４４、（ｈ）Ｈｅｌｉｏｓ、（ｉ）Ｎｒｐｌ１または（ｊ）ＫＬＲＧ１を発現するＴｒｅｇ細胞の割合（ｎ＝４～９）。バーは平均を表し、エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析には、マン・ホイットニーＵ検定、または多重ｔ検定（ｇ－ｊ）が使用された。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図2】Ｆｏｘｐ３依存性Ｔｂｘ２１切除がＣＤ８Ｔ細胞５２１集団の変化をもたらすことを示す図である。（ａ、ｂ）脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞集団のフローサイトメトリー分析。（ａ）Ｆｏｘｐ３ＷＴマウス（白いバー）ｎ＝８、Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウス（黒いバー）ｎ＝４、Ｆｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓマウス（灰色のバー）（ｎ＝４）の脾臓におけるナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）、中央記憶（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ）、およびエフェクター記憶（ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４４ｈｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（ｂ）指定されたマウス系統の脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４発現の代表的なフローサイトメトリープロット。（ｃ－ｅ）腸区画におけるＴ細胞集団、ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３＋、およびＣＤ８α＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析；（ｃ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白色記号）またはＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒色記号）マウスの上皮内リンパ球（ＩＥＬ）、（ｄ）（ｃ）で説明される同じマウスのＩＥＬの示された亜集団の数、および（ｅ）粘膜固有層（ＬＰＬ）（ｎ＝８～９）。（ｆ、ｇ）Ｆｏｘｐ３ＷＴおよび（ｆ）Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１または（ｇ）Ｆｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓ（ｎ＝４～１２）の示された器官におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－およびＣＤ８＋Ｔ細胞の比率。（ｈ）示されたマウス系統のＩＥＬ（上のパネル）またはＬＰＬ（下のパネル）ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１０３およびＣＤ６９発現を示す代表的なドットプロット。（ｉ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白いバー）、Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒いバー）およびＦｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓ（灰色のバー）マウス系統の空腸ＬＰＬにおける総ＣＤ８＋およびＣＤ８＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の細胞数（ｎ＝５～１１）。（ｊ）示されたマウス系統のＬＰＬに見られるＣＤ８＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞に対する総ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率。（ｎ＝６～１３）。バーは平均を表し、エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析には、多重ｔ検定が使用された。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図3】１型Ｔｒｅｇ細胞の非存在下でＴ_ＲＭ細胞の成長の減少を示す図である。（ａ－ｄ）粘膜固有層リンパ球は、Ｆｏｘｐ３ＷＴマウス（白いバー）、Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウス（黒いバー）、およびＦｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓマウス（灰色のバー）の示された小腸切片から分離され、フローサイトメトリーにより分析された。（ａ、ｂ）細胞をＴＣＲβ＋ＣＤ８α＋でゲートし、ＫＬＲＧ１発現を分析した（ｎ＝４～８）。（ｃ、ｄ）示されたマウス系統のＴＣＲβ＋ＣＤ４－ＣＤ８α＋ＬＰＬにおける（ｃ）ＣＤ１０３およびＫＬＲＧ１発現、または（ｄ）ＥｏｍｅｓおよびＫＬＲＧ１発現を示す代表的なフローサイトメトリープロット。（ｅ－ｈ）示されたマウス系統（ｆ）の肝臓および肺においてＫＬＲＧ１を発現するＴＣＲβ＋ＣＤ４－ＣＤ８α＋細胞の割合、（ｇ）肝臓（ＣＤ６９＋Ｅｏｍｅｓ－ＫＬＲＧ１－）および（ｈ）肺（ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＫＬＲＧ１－）におけるＴ_ＲＭ細胞の割合を示す代表的なプロット（ｅ）および累積データ（ｆ－ｈ）を示す図である（ｎ＝７～１１）。バーは平均を表し、エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析には、マン・ホイットニーＵ検定または多重ｔ検定（ｆ－ｈ）が使用された。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図4】Ｔ_ＲＭ細胞成長の低下が、感染に対する感受性の上昇をもたらすことを示す図である。（ａ－ｂ）Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスのＴＣＲβ＋ＣＤ８α＋粘膜固有層リンパ球、ＥｏｍｅｓｈｉまたはＥｏｍｅｓｌｏを、２５μｇの抗ＣＤ３ｉ．ｐ．で刺激してから４８時間後にフローサイトメトリーで、（ａ）ＰＤ－１および（ｂ）ＧｒｚｍＢ発現について分析した（ｎ＝８～９）。（ｃ－ｈ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白色記号）、（ｃ、ｅ、ｇ）Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒色記号）または（ｄ、ｆ、ｈ）Ｆｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓ（灰色記号）マウスに１０００個のＥ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓオーシストを経口感染させた。（ｃ、ｄ）５日目から１８日目までの個々のマウスの糞便から収集されたオーシストの累積数。（ｅ、ｆ）個々のマウスあたり１日あたりに流されたオーシストの数。（ｇ、ｈ）Ｅ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓ感染の経過中の体重変化（実験ごとにｎ＝３～４、２回の生物学的反復）。バーは平均を表し、エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析には、多重ｔ検定またはウィルコクソン検定（ａ、ｂ）が使用された。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図5】１型Ｔｒｅｇ細胞の動員がＴ_ＲＭ細胞の分化を決定することを示す図である。（ａ－ｂ）Ｒａｇ２欠損マウスは、Ｃｔｒｌ（ＣＤ４５．１）またはＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（ＣＤ４５．２）マウスの骨髄で再構成された。各ドナーの寄与は、脾臓およびＴ_ＲＭ（ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋ＫＬＲＧ１－）ＬＰＬ集団の総ＣＤ８Ｔ細胞について評価された；（ａ）代表的なドットプロット、（ｂ）評価された個々のマウスの概要（ｎ＝８）。（ｃ）養子移入モデルの説明；Ｆｏｘｐ３ＷＴまたはＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスは、Ｅ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓでの経口感染の１日前に、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＣＤ４５．１＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞を静脈内投与された。感染回復後、接種後３～４週目に、粘膜固有層リンパ球（ＬＰＬ）を小腸から分離し、フローサイトメトリーで分析した。（ｄ）（ｃ）で説明したように脾臓Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１由来ＣＤ８Ｔ細胞を移入し、その後Ｅ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓチャレンジしたＣＤ４５．１宿主マウスのＬＰＬにおける総ＣＤ８Ｔ細胞の割合としてのＴ_ＲＭ細胞成長（ｎ＝６）。（ｅ）示されたマウス系統においてＣＤ４５．１でプレゲーティングし、続いてＴＣＲβおよびＣＤ８αでゲーティングし、ＣＤ１０３およびＥｏｍｅｓの発現について分析したリンパ球の代表的なドットプロット。（ｆ－ｇ）感染後（ｂ）３週目または（ｃ）９週目に小腸から得られた総ＣＤ８α＋ＬＰＬおよびＣＤ１０３＋Ｅｏｍｅｓ－ＣＤ８α＋ＬＰＬの細胞数。ゲーティングは（ａ）に記載されるように実行された（ｎ＝５～７）。（ｈ）Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスへの野生型Ｔｒｅｇ細胞の存在または非存在における野生型ＣＤ４５．１＋ＣＤ８α＋ Ｔ細胞の移入およびＥ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓチャレンジ後、発現するＣＤ１０３を回収されたＣＤ８α＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞の割合。（ｉ）１型（８５細胞）、２型（３５細胞）、３型（２８細胞）または他の未定義のＴｒｅｇ細胞によって編成されたＴｒｅｇ細胞サブタイプの単一細胞ＲＮＡシーケンス分析。バーは平均を表し、エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析には、マン・ホイットニーのＵ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ.ｓ.＝有意なし。

【図6】１型Ｔｒｅｇ細胞がＴＧＦβの利用可能性を介してＴ_ＲＭ細胞の成長を促進することを示す図である。（ａ、ｂ）Ｆｏｘｐ３ＷＴまたはＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスは、エルシニア・シュードツベルクロシスによる経口感染の１日前に、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＣＤ４５．１＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞を静脈内投与された。２～３週間後、粘膜固有層リンパ球（ＬＰＬ）を小腸から単離し、フローサイトメトリーで分析した。（ａ）発現するＣＤ１０３を回収されたＣＤ８α＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞の割合（ｎ＝７～９）。（ｂ）示されたマウス系統においてＣＤ４５．１でプレゲーティングし、続いてＴＣＲβおよびＣＤ８αでゲーティングし、ＣＤ１０３およびＥｏｍｅｓの発現について分析したリンパ球の代表的なドットプロット。（ｃ－ｄ）回腸ＬＰＬ Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白色記号）またはＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒色記号）マウスを、定常状態（丸）またはＥ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓ（Ｅｖ）感染の１０日後（四角）に、（５９１ ｃ）Ｔｒｅｇの数について、（ｄ）ＣＸＣＲ３を発現するＴｒｅｇの数（ｎ＝４～９）について分析した。（ｅ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＥ．３ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓに感染させたか、させなかった；１０日目に回腸でＨｐｒｔを超えるＣｘｃｌ１０ｍＲＮＡレベルを評価した（２ ５９４の生物学的反復ｎ＝５～８）。（ｆ－ｋ）Ｅ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓでの経口感染の１日前に、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＣＤ４５．１＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞をＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスに静脈内投与した。感染後３週目に、小腸からＬＰＬを分離し、ＣＤ１０３の発現をフローサイトメトリーで分析した。ＣＤ８ＣＤ４５．１細胞に加えて、野生型Ｔｒｅｇ細胞または（ｆ）ＣＸＣＲ３、（ｈ）ＩＬ－１０、（ｉ）ＩＬ－３５、（ｊ）インテグリンβ８または（ｋ）ＴＧＦβ１が欠損したＴｒｅｇ細胞を同時移入した。野生型Ｔ_ＲＥＧ細胞を投与したマウスを蓄積し、パネルに使用した（ｆ、ｈ－ｋ）。（ｇ）Ｅ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓでの経口感染の１日前に、示されたマウス系統にＣＤ４５．１＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞を静脈内投与した。感染１０日後に、小腸をＣＤ４５．１（緑）、Ｄａｐｉ（青）、Ｆｏｘｐ３（赤）で染色した。代表的な免疫組織化学写真（対物４０倍、ズーム１．５倍）は、オーシストを有する領域から示されている（ｎ＝４）。白い矢印は、ＣＤ８Ｔ細胞とＴ_ＲＥＧが近接していることを示す。バーは平均を表し、エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析には、マン・ホイットニーのＵ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。

【図7】Ｆｏｘｐ３依存性のＴｂｘ２１条件付き欠失が、１型Ｔｒｅｇ細胞の数の減少をもたらすことを示す図である。エクスビボフローサイトメトリー解析細胞；ａ）Ｃ５７ＢＬ／６脾臓または腸Ｔ_ＲＭ集団におけるＣＤ８細胞の細胞内染色によるＴｂｅｔおよびＥｏｍｅｓ発現を示す代表的なプロット、ｂ）Ｆｏｘｐ３およびＴｂｅｔについて染色されたＣＤ４Ｔ細胞の代表的なプロットを示す図である。ｃ－ｅ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白いバー）およびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ ２１（黒いバー）マウスの胸腺および脾臓におけるＴｒｅｇ、ＣＤ４、およびＣＤ８Ｔ細胞の数ｎ＝９。ｆ－ｈ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白いバー）およびＦｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓ（灰色のバー）マウスにおけるＴｒｅｇ、ＣＤ４Ｔ細胞、およびＣＤ８Ｔ細胞の数；ｉ－ｊ）ｉ）脾臓またはｊ）胸腺におけるＣＤ４ＣＤ８αおよびＴｒｅｇ細胞におけるＣＸＣＲ３発現の割合。ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、またはＳＴ２を発現する脾臓、腸間膜リンパ節ｍＬＮおよび粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞の割合のフローサイトメトリー分析における脾臓ＣＤ４Ｔ細胞でのＣＸＣＲ３発現の代表的なフローサイトメトリープロット（ｎ≧４白色記号Ｆｏｘｐ３ΔＷＴ黒色Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１エラーバーは±ＳＥＭを表す；統計分析には、マン・ホイットニーのＵ検定または多重ｔ検定ｈ－ｍ）が使用されたＰ＜０．０５ Ｐ＜０．０１ Ｐ＜０．００１ Ｐ＜０．０００１。

【図8】ＴｒｅｇのＴｂｅｔまたはＥｏｍｅｓ欠損が小腸のＴ細胞表現型の変化と関連していることを示す図である。粘膜固有層リンパ球（ＬＰＬ）をＦｏｘｐ３ＷＴ、Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１、およびＦｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓマウスから分離し、フローサイトメトリーにより分析した。ａ－ｄ）（ａ）十二指腸（ｎ＝８～１１）、（ｂ）空腸（ｎ＝１０～１４）、（ｃ）回腸（ｎ＝９～１３）および（ｄ）結腸（ｎ＝４～７）のＬＰＬ画分の細胞数は、ＴＣＲβ＋細胞をゲーティングした後、ＣＤ４＋ＣＤ８α＿ＹＦＰ－（ＣＤ４＋）、ＣＤ４＋ＣＤ８α＿ＹＦＰ＋（Ｔｒｅｇ）、およびＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋）をゲーティングすることによって決定した。ｅ－ｆ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白丸）およびｅ）Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒三角）または（ｆ）Ｆｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓ（黒菱形）からの個々の動物におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－Ｔ細胞とＣＤ４＋ＹＦＰ＋Ｔ細胞との間の比（ｎ＝８）。ｇ）示されたマウス系統のＣＤ４＋ＹＦＰ－（上のパネル）またはＣＤ８＋（下のパネル）ＬＰＬ細胞のＣＤ１０３およびＣＤ６９染色を示す代表的フローサイトメトリードットプロット。ｈ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白色バー）、Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒色バー）およびＦｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓ（灰色バー）マウス系統の粘膜固有層における総ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１０３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（ｎ＝５～１１）。ｉ）示されたマウス系統のＬＰＬに見られるＦｏｘｐ３－ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８α＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の比率（ｎ＝６～１３）。エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析には、マン・ホイットニーのＵ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図9】１型Ｔｒｅｇの非存在は、Ｔ_ＲＭ細胞の減少をもたらすことを示す図である。Ｆｏｘｐ３ＷＴ、Ｆｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓおよびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスから粘膜固有層リンパ球を分離し、フローサイトメトリーで調べた。ａ）示されたマウス系統におけるＣＤ１０３対ＥｏｍｅｓおよびＫＬＲＧ１対ＣＤ６９を示す代表的なフローサイトメトリードットプロット。ｂ）ＫＬＲＧ１対Ｂｃｌ２タンパク質発現を示す代表的なフローサイトメトリードットプロット。ｃ）ＣＤ１０３対ＴＬテトラマーを示す代表的なフローサイトメトリードットプロット（ＣＤ８αα染色）（ｎ＝４）。ｄ）血液およびＬＰＬコンパートメントにおけるＣＤ８αのインビボ染色を示す代表的なフローサイトメトリードットプロットとｅ概要グラフ（ｎ＝５）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図10】Ｔ_ＲＭ細胞成長の低下が感染感受性を高めることを示す図である。粘膜固有層リンパ球（ＬＰＬ）または脾臓ＣＤ８Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ε抗体を腹腔内注射した４８時間後にＦｏｘｐ３ＷＴおよびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスから分離し、フローサイトメトリーで調べた。ａ－ｃ）（ａ）ＰＤ１または（ｂ）ＬＰＬにおけるグランザイムＢ対Ｅｏｍｅｓタンパク質の発現を示す代表的なフローサイトメトリードットプロット（ｎ＝４）ｂ）ａ）と同様であるが、脾臓の累積データを示す（ｎ＝６）。ｄ－ｉ）Ｃ５７ＢＬ／６（対照）または（ｇ－ｉ）ＩＬ１５Ｒマウスの（ｄ－ｆ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｒａｇ２^－／－に１０００個のＥ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓオーシストを経口感染させた（ｇ）示された日数についての個々のマウスあたりの毎日の糞オーシスト数、ｅ、ｈ）累積オーシスト数（６～１７日目ｆ、ｉ）Ｅ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓ感染中の体重の変化（ｎ＝５～９、２回の生物学的反復）。エラーバーは±ＳＥＭを表す。統計分析については、マン・ホイットニーＵ検定（ｅ、ｈ）多重ｔ検定（ｄ、ｆ、ｇ、ｆ）またはウィルコクソン（ｂ）を使用した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図11】免疫活性化時のＴｂｅｔ発現とＴ_ＲＭ細胞の成長を示す図である（ａ－ｄ）示されたＴ細胞を、定常状態下またはインビボ抗ＣＤ３刺激の２４時間後に細胞内フローサイトメトリー染色によって評価した。ａ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白色記号）およびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒色記号）脾臓ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞におけるＴｂｅｔ発現の概要。ｂ）脾臓ＣＤ８ナイーブＴ細胞および記憶Ｔ細胞、ならびにＬＰＬ供給Ｔ_ＲＭ細胞の細胞内染色によるＴｂｅｔ発現分析（ｎ＝１１ １２）。活性化の２４時間後に（ｃ）Ｅｏｍｅｓまたは（ｄ）Ｔｂｅｔについて染色されたＦｏｘｐ３ＷＴおよびＦｏｘｐ３ΔＥｏｍｅｓマウスからの脾臓ＣＤ８Ｔ細胞の代表的なプロット（ｎ＝３ ５）。ｅ－ｈ）Ｆｏｘｐ３ＷＴ（白色記号）およびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１（黒色記号）マウスにＣＤ８ＣＤ４５．１Ｔ細胞を養子移入し、１日後にマウスにＥ.ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓをチャレンジさせた。感染のピーク時に、１０日目のＬＰＬを分離し、ＣＤ４５．１を、（ｅ）Ｔ_ＲＭ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋Ｅｏｍｅｓ－）の割合、および（ｆ）総ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞（ｎ＝６ ７）についてフローサイトメトリーで分析した。（ｇ）ｅ）に基づいて、ＣＤ４５．２＋Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスを宿主として使用し、追加のＣＤ４５．１＋ＷｔＴｒｅｇ細胞を移入し、ＬＰＬ、内因性（ＣＤ４５．２＋）および移入（ＣＤ４５．１＋）ＣＤ４およびＣＸＣＲ３を発現するＴｒｅｇ細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ｈ） ｆ－ｇ）に基づいて移入されたＴｒｅｇ細胞のＣＸＣＲ３割合の概要。統計分析には、マン・ホイットニーのＵ検定を使用した。

【図12】選択したマウス系統におけるＴ_ＲＭ細胞の成長を示す図である。ａ、ｂ）定常状態（丸）またはＥ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓの１０日後（四角）のＦｏｘｐ３ＷＴおよびＦｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスから回腸の粘膜固有層ＣＤ４Ｆｏｘｐ３を分離・計数した（ｎ＝５～８）。ｃ）示されたマウス系統は、Ｅｖの経口感染の１日前にＣＤ４５．１＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞を静脈内投与した。感染後１０日目に、小腸をＣＤ４５．１（緑）Ｄａｐｉ（青）とＦｏｘｐ３（赤）で染色した。代表的な免疫組織化学写真（対物レンズ２０ｘズーム１５ｘ、スケールバー５０μｍ）、示された領域を拡大した。オーシストは、＊で示された部分など、特徴的な丸い未染色領域である。比較のためオーシストのない領域を示す（３番目のパネル）。ｆ）脾臓ＣＸＣＲ３の相対的発現レベル。またはＣＸＣＲ３＋Ｔｒｅｇ細胞（ｎ＝４）。ＬＰＬは、ｄ、ｅ）Ｃ５７ＢＬ６（対照）またはＩＬ１０欠損マウス、ｇ、ｊ）またはＣ５７ＢＬ６マウスまたはｇ、ｈ）ＩＬ－３５欠損マウスで生成された骨髄キメラマウス、ｇ、ｉ）Ｆｏｘｐ３ΔＩｔｇβ８マウス、ｇ、ｊ Ｆｏｘｐ３Δｔｇｆβ１マウスから分離された。代表的なフローサイトメトリープロットを示し（ｆ）、ＣＤ１０３発現細胞の累積割合（ｈ－ｊ）（ｎ＝７～１０）を示す。バーは平均を表す。統計分析には、マン・ホイットニー検定を使用した＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図13】フローサイトメトリー解析のゲーティング戦略を示す図である。ａ）リンパ球ゲーティング、ダブレット排除、および死細胞排除、その後ｅＹＦＰおよびｔｄＲＦＰ検出に基づくＣＤ４選択およびＴｒｅｇ選択を示すＣ５７ＢＬ／６ Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスの脾臓からの代表的なフローサイトメトリープロット。ｂ）リンパ球ゲーティング、ダブレット排除、死細胞排除、その後、ＴＣＲβ＋ＣＤ６９＋およびＣＤ８α＋を含むことを示すＣ５７ＢＬ／６ Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスのＬＰＬから得られた代表的なフローサイトメトリープロット。ＬＰＬでは、Ｔ_ＲＭはＣＤ１０３＋と定義されている。

【図14】Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスにおけるＲＦＰ検出を示す図である。ａ－ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６ Ｆｏｘｐ３ΔＴｂｘ２１マウスの脾臓からの代表的なフローサイトメトリープロット；図１３ａのように、ａ）ＣＤ４ライフゲート、ｂ）ＣＤ４Ｆｏｘｐ３ＹＦＰ集団、およびｃ）ＣＤ８集団におけるｅＹＦＰおよびｔｄＲＦＰ検出。２匹の個々のマウスの２つの代表的なプロットを示す。

【図15】マウスからの最初の細胞抽出からＦＡＣＳマシンを介する細胞集団の選別までのＴ_ＲＭ細胞の生産と試験の詳細を示す実験レイアウトを示す図である。

【図16】骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）がＣＤ８Ｔ細胞においてＣＤ６９発現を維持することを示す図である。エフェクターＣＤ８Ｔ細胞をＩＬ－１５およびＴＧＦβ単独（丸）またはＢＭＤＣ（四角）の存在下で抗ＣＤ３とともに培養すると、Ｔ_ＲＭ細胞において重要に発現するＣＤ６９マーカーは、ＢＭＤＣの存在下で発現を維持するが、ＢＭＤＣの非存在で失われる。

【図17】ＩＬ－７がＴ_ＲＭにおいてＣＴＬＡ－４発現を誘導することを示す図である。２つの独立した二重実験は、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞をＩＬ－７の非存在下（黒）とＩＬ－７の添加（灰色）とともに培養した場合のＣＴＬＡ－４発現の違いを示す。

【図18】ＩＬ－２が、Ｔ_ＲＭでＣＴＬＡ－４発現もまた誘導することを示す図である。データは、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞をＩＬ－７およびＩＬ－２の非存在下（黒）、ＩＬ－７添加（明るい灰色）、ＩＬ－２添加（暗い灰色）とともに培養したときのＣＴＬＡ４の発現を示している。ＩＬ－７またはＩＬ－２とともに培養した場合、ＣＤ８Ｔ細胞は同程度の割合でＣＴＬＡ－４を発現するが、ＣＴＬＡ－４の発現レベルは、ＩＬ－２を含む培養よりもＩＬ－７を含む培養の方が平均してより堅牢である。

【図19】Ｔ_ＲＭ細胞の生産と試験、およびインビボチャレンジと、チャレンジ後のマウスの器官で実行されたエクスビボ分析を詳述する実験レイアウトを示す図である。本発明者は、インビトロで生産されたＴ_ＲＭ細胞の特徴および表現型が器官へのインビボ播種と相関するかを確認したかった。

【図20】インビボチャレンジで使用されるさまざまなＴ細胞培養物についてのマーカーＣＤ６９、ＣＤ１０３およびＣＴＬＡ－４の発現プロファイルを示す図である。チャレンジに使用されたＴ細胞は、次の条件またはグループで培養された：グループ１：ＣＤ８＋ＢＭＤＣ＋ａＣＤ３＋ＴＧＦｂ＋ＩＬ－１５＝Ｔ_ＲＭ；グループ２：ＣＤ８＋ＢＭＤＣ＋ａＣＤ３＋ＴＧＦｂ＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－７＝Ｔ_ＲＭ＋ＩＬ－７；グループ３：ＣＤ８＋ＢＭＤＣ＋ａＣＤ３＋ＩＬ－１５＝エフェクター；およびグループ４：ＣＤ８＋ＢＭＤＣ＋ａＣＤ３＋ＴＧＦｂ＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－２＝Ｔ_ＲＭ＋ＩＬ－２。

【図21】４０日間にわたってチャレンジしたマウスの脾臓に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す図である。エフェクターＣＤ８Ｔ細胞を図２０に示す条件下で培養し、完全なＣ５７ＢＬ６／Ｊ宿主に移入した。指示された時点で、脾臓における移入細胞（ＣＤ４５．１）の存在が評価された。グラフは、プールされた２つの実験を示す。実験１（黒色記号）にはグループ４は含まれず、分析は時点１１～１４でのみ実行された。実験２（灰色記号）にはグループ４が含まれ、分析はいくつかの時点で行われ、細胞が遅い時点で回収された６匹のマウスのうち２匹のみが示されている。データは、ＩＬ－７なしで培養したＴ_ＲＭ細胞と比較して、ＩＬ－７培養Ｔ_ＲＭ細胞（グループ２）がかなりの数で見出されたことを示している。

【図22】４０日間にわたってチャレンジしたマウスの腸の粘膜固有層に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す図である。エフェクターＣＤ８Ｔ細胞を図２０に示す条件下で培養し、完全なＣ５７ＢＬ６／Ｊ宿主に移入した。指示された時点で、腸の粘膜固有層における移入細胞（ＣＤ４５．１）の存在が評価された。グラフは、プールされた２つの実験を示す。実験１（黒色記号）にはグループ４は含まれず、分析は時点１１～１４でのみ実行された。実験２（灰色記号）にはグループ４が含まれ、分析はいくつかの時点で行われ、細胞が遅い時点で回収された６匹のマウスのうち２匹のみが示されている。データは、ＩＬ－７なしで培養したＴ_ＲＭ細胞と比較して、ＩＬ－７培養Ｔ_ＲＭ細胞（グループ２）がかなりの数で見出されたことを示している。

【図23】３２日間にわたってチャレンジしたマウスの肺および腸のＩＥＬコンパートメントに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す図である。エフェクターＣＤ８Ｔ細胞を図２０に示す条件下で培養し、完全なＣ５７ＢＬ６／Ｊ宿主に移入した。指示された時点で、肺および腸のＩＥＬコンパートメントで移入細胞（ＣＤ４５．１）の存在が評価された。グラフは、３つのグループを示す両方の器官における実験（実験１－黒色記号、実験２－灰色記号）を示し、分析はいくつかの時点で実行された。データは、ＩＬ－７なしで培養したＴ_ＲＭ細胞と比較して、ＩＬ－７培養Ｔ_ＲＭ細胞（グループ２）がかなりの数で見出されたことを示している。

【図24】４０日間にわたってチャレンジしたマウスの腸の粘膜固有層および脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の比較数を示す図である。エフェクターＣＤ８Ｔ細胞を図２０に示す条件下で培養し、完全なＣ５７ＢＬ６／Ｊ宿主に移入した。指示された時点で、脾臓および腸の粘膜固有層で移入細胞（ＣＤ４５．１）の存在が評価された。データは、ＩＬ－７なしで培養したＴ_ＲＭ細胞と比較して、ＩＬ－７培養Ｔ_ＲＭ細胞（グループ２）がかなりの数で見出されたことを示している。

【発明を実施するための形態】

【0116】

【実施例】

【0117】

本発明者らは、Ｔ_ＲＥＧ細胞が、組織に深く浸透することができ、固形腫瘍に対して非常に効果的なＴ細胞、Ｔ_ＲＭ細胞の生成において重要であると仮定した。本発明者らは、Ｔ_ＲＭ細胞の生成に必要な因子を決定し、インビトロ内でのＴ_ＲＭ細胞の生成を可能にすることを最終目的とし、現在の培養プロトコルを適応して抗腫瘍Ｔ細胞を生成し、これらに組織浸透特性を提供して原発腫瘍の両方を標的とし、原発腫瘍から離れた組織に移動した転移に向けられた重要な器官全体の免疫サーベイランスを提供することを最終的な目的としている。本発明者らはまた、図１５に詳述されるように、培地中でＴ_ＲＭ細胞の生成がＴ_ＲＥＧ細胞の非存在下で可能であったかどうかを評価することを目的とした。さらに、本発明者らは、図１９に詳細に示すように、インビトロで産生された細胞が治療特性、特にインビボで組織内を移動し生存する能力を維持しているかどうかを評価した。

【0118】

材料および方法
マウス
：Ｃ５７Ｂｌ／６ＪおよびＣ５７Ｂｌ／６Ｊ ＣＤ４５．１マウスは、フランスのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した。Ｔｂｘ２１^ｆ／ｆ（Ｔｂｘ２１^{ｔｍ２Ｓｒｎｒ}）とＥｏｍｅｓ^{ｆｌ／ｆｌ}（Ｅｏｍｅｓ^{ｔｍ１Ｓｒｎｒ}）はＲｅｉｎｅｒ博士の好意により提供された^{１４、８２}、Ｆｏｘｐ３^{ｅＹＦＰ－Ｃｒｅ}（Ｆｏｘｐ３^{ｔｍ４（ＹＦＰ／ｉｃｒｅ）Ａｙｒ}）はＲｕｄｅｎｓｋｙ博士^８３から提供され、Ｒｏｓａ２６－ｔｄＲＦＰはＦｅｈｌｉｎｇ博士^８４、Ｒａｇ２^－／－、ＩＬ１５Ｒ^－／－（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）の好意により提供された。マウスは、ポルトガルのリスボンにあるＩｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒで飼育された。８～１８週齢のオスとメスの、年齢と性別を一致させたマウスを使用した。動物は、１２時間の明／暗サイクルの下で温度制御された条件の飲料水と食物に自由にアクセスできるＩＶＣケージに収容された。全てのマウスは、特定の病原体を含まない状態で維持された。Ｆｏｘｐ３^{ｅＹＦＰ－Ｃｒｅ}Ｒｏｓａ２６－ｔｄＲＦＰ系統の全てのマウスは、ＰＣＲによって厳密に遺伝子型を同定し、ノックアウト対立遺伝子が検出されたマウスは破棄し（～２０％）、適切なＴｂｘ２１の存在は、ＣＸＣＲ３発現するＣＤ４Ｔ細胞の血液型判定によって確認された。さらに、ｅＹＦＰに関連するＲＦＰの不適切な発現について、マウスをカウンタースクリーニングした（～１０％を破棄）（図１３～１４）。骨髄キメラは、Ｒａｇ２欠損マウスの致死量未満の照射（４５０ラド）に続いて、得られた骨髄細胞の静脈内注射によって生成された。ＣＸＣＲ３^－／－（Ｃｘｃｒ３^{ｔｍ１Ｄｇｅｎ}）^８５は、ドイツのハイデルベルクにあるドイツ癌研究センター（ＤＫＦＺ）で飼育された；ＩＬ－１０^{－／－８６}はＩｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｇｕｌｂｅｎｋｉａｎ ｄｅ Ｃｉｅｎｃｉａ、リスボンで飼育され、Ｅｂｉ３^{－／－８７}はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍａｉｎｚ、ドイツで飼育され、Ｆｏｘｐ３ｙｆｐ－Ｃｒｅと交配したＩｔｇｂ８ｆ／ｆ８８およびＴｇｆｂ１ｆ／ｆ８９は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｌｙｏｎ、フランスで飼育された。全ての動物実験は、Ｄｉｒｅｃａｏ－Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ａｌｉｍｅｎｔａｃａｏ ｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ Ｐｏｒｔｕｇａｌおよび現地の倫理審査委員会およびガイドラインの規制に準拠していた。

【0119】

細胞の単離：腸細胞を前述のように単離した９０。腸をＰＢＳで洗浄して内容物を除去し、縦方向に開いた。１ｃｍの切片に切断した後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌポリミキシンＢ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳで、３０分間３７℃でＩＥＬｓを解放するために振盪しながらインキュベートした。ＩＥＬ単細胞懸濁液は、３７．５％等張Ｐｅｒｃｏｌｌを使用してさらに精製された。ＬＰＬを単離するために、その後、腸組織を０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）および０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＩＭＤＭ培地中で、３７℃で２５分間、振盪しながら消化した。肝臓リンパ球は、７０μｍフィルターを介して臓器をすりつぶして分離し、続いて３７．５％等張Ｐｅｒｃｏｌｌで細胞を精製した。肺をハサミで細断し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤを含むＰＢＳで、３７℃で３０分間消化した。リンパ球を含む細胞懸濁液は、５０μｍのセルストレーナーを通過させた後に得られた。

【0120】

養子細胞移入：ＣＤ８α^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ２５^＋細胞（Ｔｒｅｇ）を、脾臓およびリンパ節の単一細胞懸濁液から精製した。簡単に説明すると、細胞を抗ＣＤ８ａ－ＡＰＣまたは抗ＣＤ２５－ＡＰＣ抗体で標識し、抗ＡＰＣ ＭＡＣＳマイクロビーズを用い、取扱説明書に従って選択した。計数後、フローサイトメトリーにより純度を決定し、細胞数を調整した。移入された集団で幅広いＴＣＲ多様性を確保するために、最低２ｘ１０^６のＣＤ８Ｔ細胞を使用した。一部のレシピエントマウスには、０．４～１ｘ１０^６個のＴｒｅｇ細胞を追加で投与した。感染は、細胞移入の１日後（０日目）に行った。

【0121】

感染チャレンジ：動物をＥｉｍｅｒｉａ ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓ（Ｅｖ）で、以前報告したように^９１、感染させた。簡単に説明すると、オーシストを脱イオン水で３回洗浄し、次亜塩素酸ナトリウムに浮かせ、Ｆｕｃｈｓ－Ｒｏｓｅｎｔｈａｌチャンバーを使用して計数した。Ｅ．ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓの５００個のオーシストを１００μｌの水中で強制経口投与によりマウスに投与し、感染が解消された後（３ｐ．ｉ週目から）分析した。感染の負荷を決定するために、動物を個別にケージに入れ、オーシストが検出されなくなるまで糞便を毎日収集した。動物は、前述のように^５８、Ｔ． Ｂｅｒｇｓｂａｋｅｎ博士の好意により提供をされたエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｐｔｂ）に感染させた。動物は、１００μｌの水中で強制経口投与により１０^６のＹｐｔｂに感染した。組織の分析は、１５～１９日目に行った。

【0122】

フローサイトメトリー：合意された基準^９２に従って、示されたゲーティング戦略を用い、脾臓、リンパ節、腸、肺、および肝臓からの単一細胞懸濁液を調製し、抗体（リストを参照）染色した（図１３）。インビボ染色は、３μｇのＣＤ８ａ－ＡＰＣ抗体を静脈注射することにより行い、５分後にマウスを犠牲にした。ＴＬ－テトラマーは、ＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙの好意により提供された。サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０サイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。

【0123】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ：Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用してＲＮＡを単離し、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキットを使用して、ｃＤＮＡを生成した。増幅は、ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙｓ Ｍｍ＿Ｃｘｃｌ１０＿１＿ＳＧ、Ｍｍ＿Ｔｇｆｂ１＿１＿ＳＧ、Ｍｍ＿Ｉｔｇｂ８＿１＿ＳＧ、Ｍｍ＿Ｈｐｒｔ＿１＿ＳＧ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。

【0124】

免疫組織化学および顕微鏡観察：腸組織を「スイスロール」に丸め、１０％ホルマリンで固定し、３０％グルコースで再水和し、ＯＣＴ培地中に凍結した。組織を１０μｍに切断し、切片を４％パラホルムアルデヒドで処理した。ブロッキングは１０％ＢＳＡを使用して行い、以下の抗体を検出に使用した：ＣＤ４５．１（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦＯＸＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０顕微鏡を使用して画像化した。分析は、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して行った。

【0125】

ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ解析：オリジナルデータは^５５で作成および解析された。最初のデータセットから、Ｔ_ＲＥＧ細胞をＦｏｘｐ３に基づいて、Ｔｍｅｍｓ、ストレスを受けた細胞、および低品質の細胞を除外して選択した。このサブセットを分析するために、ＲパッケージＳｅｕｒａｔ^９３を使用して、^５５と同様のアプローチに従った。「ＬｏｇＮｏｒｍａｌｉｚｅ」メソッド使用した、および１０^５の倍率を使用したデータの正規化；負の二項モデルに基づき、ＵＭＩを使用したデータのスケーリング。Ｔ_ＲＥＧのサブタイプは、以下の基準を使用して定義された：
１型（Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１およびＣｘｃｒ３遺伝子に割り当てられた生カウントを持つ細胞）；
２型（Ｇａｔａ３、Ｓｔａｔ６、およびＩｌ１ｒｌ１遺伝子に割り当てられた生カウントを持つ細胞）；
３型（Ｒｏｒｃ、Ｓｔａｔ３、およびＣｃｒ６遺伝子に割り当てられた生カウントを持つ細胞）；
その他（Ｔｂｘ２１、Ｇａｔａ３、およびＲｏｒｃ遺伝子に割り当てられた生カウントのない細胞）。

【0126】

インビトロ培養：
エフェクターＣＤ８Ｔ細胞は、予め２５μｇの抗ＣＤ３εを腹腔内注射したＣ５７ＢＬ６／ＪまたはＣＤ４５．１Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから得た。細胞をＡｕｔｏＭＡＣＳビーズ選択によって分離し、ＩＭＤＭ培地中に平底９６ウェルプレートあたり２００，０００細胞で培養した。ＧＭ－ＣＳＦを使用した標準プロトコルを介して培養された１００，０００ ＢＭＤＣを、示された条件で加えた。細胞を、０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ε、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５、および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβで、示されている場合は１０～２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２またはＩＬ－７で再刺激した。組織ホーミングを試験するために、分析または完全Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスへの養子移入の前に３日間細胞を増殖させた。Ｔ_ＲＭマーカーＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＫＬＲＧ－１非存在、およびＣＴＬＡ－４発現について、細胞を評価した。

【0127】

インビトロ分化した細胞は、静脈内注射によってマウスに移入された。示された時点で、動物を犠牲にし、脾臓、肺、および小腸からのリンパ球（ＩＥＬおよびＬＰＬ画分の両方）を標準的な方法に従って分離した。細胞集団は、フローサイトメトリーによって分析された。移入細胞は、コンジェニックマーカーＣＤ４５．１の発現によって内因性細胞と区別され、細胞計数は、フローサイトメトリー計数ビーズを使用して行った。

【0128】

実施例１
結果
ＦｏｘＰ３^＋細胞でＴｂｘ２１を削除すると、１型Ｔ_ＲＥＧ細胞が減少する。

【0129】

Ｔ_ＲＭ細胞はＴ－ｂｅｔを発現するが、Ｅｏｍｅｓは発現しない（図１ａ、図７ａ）^３７。Ｔ_ＲＥＧ細胞は、免疫タイプ１、２、および３の特徴を持つ、さまざまな組織で系統関連ケモカイン受容体を発現する（図１ｂ）。Ｔ－ｂｅｔまたはＥｏｍｅｓを発現するＴ_ＲＥＧ細胞が、Ｔ_ＲＭ細胞に影響を与えるかどうかを試験するために、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３^{ｅＹＦＰ－Ｃｒｅ}Ｔｂｘ２１^{ｆｌ／ｆｌ}Ｒｏｓａ２６^{ｔｄＲＦＰ／ｔｄＲＦＰ}およびＦｏｘｐ３^{ｅＹＦＰ－Ｃｒｅ}Ｅｏｍｅｓ^{ｆｌ／ｆｌ}Ｒｏｓａ２６^{ｔｄＲＦＰ／ｔｄＲＦＰ}マウス系統（それぞれＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}およびＦｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}と呼ばれる）および対照Ｆｏｘｐ３^{ｅＹＦＰ－Ｃｒｅ}Ｒｏｓａ２６^{ｔｄＲＦＰ／ｔｄＲＦＰ}系統（Ｆｏｘｐ３^ＷＴ）（方法、図１４）を利用した。Ｔ－ｂｅｔとＥｏｍｅｓは、Ｔ－ｂｅｔ^３８によってトランス活性化されるケモカイン受容体ＣＸＣＲ３など、１型免疫応答に重要な遺伝子の転写を活性化する。Ｔ_ＲＥＧ細胞におけるＴ－ｂｅｔの非存在下での強化された１型炎症と一致して^{３５、３９}（図７ｂ）、胸腺ではなく脾臓が、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスにおいてＣＸＣＲ３^＋ＣＤ４^＋およびＣＸＣＲ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比例増加を示した（図１ｃ－ｄ）。胸腺または脾臓のＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－またはＴ_ＲＥＧ（ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋）細胞の数は類似していたが（図７ｃ－ｈ）、脾臓のＣＤ８^＋Ｔ細胞はＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物の増加傾向を示した（図７ｅ）^{２９、３５、３９}。生後３か月までのマウスでは、自己免疫の兆候は観察されなかった。

【0130】

本発明者らは、Ｆｏｘｐ３特異的ターゲティング、ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^＋Ｆｏｘｐ３^＋ではなく、ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^＋Ｆｏｘｐ３^－Ｔ細胞が、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスに存在することを確認した（図１ｃ－ｅ）が、Ｆｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}マウスの末梢リンパ器官においてＣＸＣＲ３^＋Ｔ_ＲＥＧ細胞の割合と数の増加が観察された（図７ｉ－ｋ）。Ｔ_ＲＥＧ細胞におけるＴ－ｂｅｔの切除は、３型Ｔ_ＲＥＧ細胞の増加とともに、Ｔ_ＲＥＧサブセットの数ではなく、分布の変化をもたらした（図１ｆ、図７ｌ－ｎ）。ＬＰＬのＴ_ＲＥＧ細胞集団は、二次リンパ器官（ＳＬＯ）に存在するものと比較して、より活性化された表現型を示し、より高いレベルのＣＤ４４を発現した（図１ｇ）。Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（Ｎｒｐｌ－１）および転写因子Ｈｅｌｉｏｓは、主にＳＬＯ Ｔ_ＲＥＧ細胞に存在していたが、腸では減少していた。Ｔ_ＲＥＧ細胞は、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ対照マウスと比較して、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}において同様の表現型を示し（図１ｈ－ｉ）^２９、エフェクターＴ細胞およびＴ_ＥＭ細胞で発現された、共抑制受容体キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）が^{４０、４１}、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ対照マウスと比較して、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}からのＴ_ＲＥＧ細胞で増加する（図１ｊ）。まとめると、これらのデータは、Ｔ－ｂｅｔ発現Ｔ_ＲＥＧ細胞の非存在下で、Ｔ_ＲＥＧ細胞の数とその表現型は類似したままであるが、Ｔ_ＲＥＧサブセットの割合が変化していることを示している。

【0131】

Ｔ_ＲＥＧ細胞におけるＴｂｘ２１またはＥｏｍｅｓの切除は、ＣＤ８Ｔ細胞の分布を変化させる。
Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスの脾臓ＣＤ８^＋Ｔ細胞コンパートメントは、エフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）／Ｔ_ＥＭＴ細胞の増加を示す（図２ａ－ｂ）。しかしながら、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスの腸上皮内画分は、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ対照と比較してＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の減少を示している（図２ｃ）。ＣＤ８ＩＥＬ集団内では、誘導されたＣＤ８αβ^＋内でＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスの顕著な減少が観察されるが、天然のＣＤ８αα^＋ＩＥＬ集団内では観察されない（図２ｄ）。Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスの粘膜固有層（ＬＰ）コンパートメントは、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ対照と比較して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の減少を示すが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の減少は示さない（図２ｅ）。この違いは、結腸を除く全ての腸切片で明らかであり（図８ａ－ｄ）、ＣＸＣＲ３とＴ_ＲＥＧ細胞のＴ－ｂｅｔ発現はバラバラである^４２。

【0132】

ＬＰＬコンパートメント内のＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－Ｔ細胞およびＴ_ＲＥＧ細胞の数の変化にもかかわらず、およびＴｂｘ２１またはＥｏｍｅｓのＦｏｘｐ３依存性切除に関係なく、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＴ_ＲＥＧ細胞の割合は安定を維持している（図８ｅ－ｆ）。しかしながら、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物のＴ細胞集団は、ＣＤ８Ｔ細胞への顕著な比例偏りを示す（図２ｆ）が、Ｆｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}動物では特に近位腸で逆が観察される（図２ｇ）。これらのデータは、Ｔ_ＲＥＧ細胞にＴ－ｂｅｔまたはＥｏｍｅｓが存在しない場合、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋とＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－Ｔ細胞の間の比例分布は変化しないが、小腸におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットの割合への顕著な影響があることを示している。

【0133】

Ｔｂｘ２１^＋およびＥｏｍｅｓ^＋Ｔ_ＲＥＧ細胞はＣＤ８Ｔ細胞記憶コンパートメントに影響を与える。
Ｔ－ｂｅｔが十分なＴ_ＲＥＧ細胞の非存在下での腸内のＴ_ＲＭ細胞の減少および循環エフェクター／Ｔ_ＥＭ細胞の割合の増加は、Ｔ_ＲＭ細胞の生成または維持におけるこれらの細胞の潜在的役割を示唆した。ＩＥＬ数の減少はあるものの（図２ｃ－ｄ）、全てのＣＤ８^＋ＩＥＬは、Ｔ_ＲＭ細胞マーカーＣＤ１０３およびＣＤ６９を発現している（図２ｈ）。Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}、Ｆｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}およびＦｏｘｐ３^ＷＴマウスのＬＰＬコンパートメントは、高レベルのＣＤ６９を発現し、約半分がＣＤ１０３を共発現するＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－Ｔ細胞に関して類似していた（図８ｇ）。本発明者らは、ＣＤ４Ｔ_ＲＭ細胞の表現型の違いを観察しなかったが、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物は、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－Ｔ細胞およびＣＤ４^＋ＣＤ１０３^＋細胞数の減少において全体的な傾向を示した（図８ｈ）。

【0134】

Ｆｏｘｐ３^ＷＴおよびＦｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}動物のＬＰＬコンパートメントでは、ほとんどのＣＤ８Ｔ細胞がＴ_ＲＭマーカーＣＤ６９およびＣＤ１０３を発現する（図２ｈ－ｉ）。対照的に、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の半分以上がＣＤ１０３を発現していない（図２ｈ－ｉ）。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数が類似しているにもかかわらず、Ｔ－ｂｅｔ発現Ｔ_ＲＥＧ細胞の非存在下で、ＣＤ８＋Ｔ_ＲＭ細胞の数はこれらの動物の腸内で減少し、Ｔ_ＲＭ細胞に対してエフェクターの割合の寄与は高く（図２ｉ－ｊ）、３つのマウス系統全てでＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ_ＲＭ細胞の比率は一定になった（図８ｉ）。これらのデータは、腸の免疫ネットワークは微調整されており、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物で観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞比率の増加は、Ｔ_ＲＭ細胞に成長しないＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の蓄積に起因すると考えられることを示している。

【0135】

Ｔｂｘ２１^＋Ｔ_ＲＥＧ細胞は、複数の組織でＴ_ＲＭ細胞の成長に影響する。
皮膚感染の際、ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ１０３^－ＣＤ８^＋のエフェクターＴ細胞が、後期でも、表皮でもではなく、初期の真皮で報告されている^１９。定常状態のＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物の小腸で観察されたＣＤ１０３^－ＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団と一致して、小腸の全ての切片で、全ＣＤ８Ｔ細胞集団の約２０％であるＫＬＲＧ１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の顕著な集団が観察された（図３ａ）。対照的に、増加したＣＸＣＲ３^＋Ｔ_ＲＥＧ細胞を保有するＦｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}動物（図７ｈ）は、近位腸でＫＬＲＧ１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞数の減少を示した（図３ｂ）。

【0136】

ＣＤ１０３との共染色により、ＫＬＲＧ１タンパク質がＣＤ１０３と相互排他的な形式で発現し^{１９、２６、４３}、主にＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスに存在することが確認された（図３ｃ）。Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物に存在するＣＤ１０３^－ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ８Ｔ細胞は、高レベルのＥｏｍｅｓを発現したが、Ｆｏｘｐ３^ＷＴではほとんど見られず、Ｆｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}動物ではさらに少なかった（図３ｄ、図９ａ）。それらのエフェクター状態と一致して、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物のＫＬＲＧ１^＋Ｅｏｍｅｓ^＋ＣＤ８Ｔ細胞は、生存促進タンパク質Ｂｃｌ－２の発現レベルが低く、Ｔ_ＲＭ細胞成熟中にアップレギュレートされた^{４４、４５}（図９ｂ）。さらに、ＣＤ８αβヘテロ二量体とともに発現し、上皮記憶ＣＤ８Ｔ細胞^４６に特徴的なＣＤ８ααホモ二量体を発現する細胞の割合は、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ対照と比較してＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物で減少した（図９ｃ）。最後に、インビボ染色により、ＬＰＬコンパートメントから分離された細胞の大部分が最近循環していないことが確認された（図９ｄ、ｅ）。まとめると、特定の理論に縛られることを望まないが、これらのデータは、Ｔ_ＲＥＧ細胞を発現するＴ－ｂｅｔが存在しない場合、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞が腸バリアに蓄積し、Ｔ_ＲＭ細胞に向かって進行しないことを示している。

【0137】

Ｔ_ＲＭ細胞の存在は多くの組織で報告されている^４。腸での結果と一致して、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスの肝臓と肺は、Ｆｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}およびＦｏｘｐ３^ＷＴ動物と比較して、高レベルのＫＬＲＧ１およびＥｏｍｅｓを発現するエフェクターＣＤ８Ｔ細胞の割合が増加していた（図３ｅ－ｆ）。ＣＤ１０３発現は肝臓におけるＴ_ＲＭ細胞の十分なマーカーとは考えられないため、本発明者らは、ＫＬＲＧ１およびＥｏｍｅｓについて陰性であるＣＤ８^＋ＣＤ６９^＋細胞の割合を評価した。Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスは、Ｆｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}およびＦｏｘｐ３^ΔＷＴマウスと比較して、評価された非リンパ組織において、より少ないＴ_ＲＭ細胞を含んでいた（図３ｇ－ｈ）。特定の理論に縛られることを望まないが、これらのデータは、１型Ｔ_ＲＥＧ細胞が、複数の組織におけるＴ_ＲＭ細胞の生成において重要であることを示唆している。

【0138】

Ｔ_ＲＭ細胞コンパートメントが損なわれると、病原体の侵入に対する保護が低下する。
本発明者らは、Ｔ_ＲＭ細胞のバイスタンダー媒介活性化が病原体の侵入を制限する重要な防御メカニズムであることから、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスにおけるＴ_ＲＭ細胞数の減少が、新しい感染に対する保護を低下させる可能性があるという仮説を立てた^{４７、４８、４９}。２日後にＬＰＬ Ｔ細胞応答を評価した抗ＣＤ３抗体を投与することにより、腸のＣＤ８＋Ｔ細胞の急性応答をテストした。Ｅｏｍｅｓ^＋ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｅｏｍｅｓ^－ＣＤ８Ｔ細胞と比較して活性プロファイルの低下を示し、ＰＤ－１の発現が増加し、グランザイムＢが減少した（図４ａ、ｂ、図１０ａ－ｃ）^５０。

【0139】

次に、本発明者らは、ネズミの小腸上皮細胞に感染する細胞内原生動物寄生虫Ｅｉｍｅｒｉａ ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓ（Ｅｖ）でマウスをチャレンジした。この感染モデルでは、リンパ球が寄生虫の負担を軽減し（図１０ｄ－ｆ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＩＦＮγがクリアランスにおいて重要な役割を果たしている^{１０、５１、５２}。Ｔ細胞性免疫の増強につながると期待し得る１型Ｔ_ＲＥＧ細胞は存在しないものの^５３、事実、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスは、Ｆｏｘｐ３^ＷＴおよびＦｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}動物に比べ、Ｅｖ感染の抑制が損なわれていた（図４ｃ－ｆ）。リンパ球を欠くマウスとは対照的であるが（図１０ｄ－ｅ）、Ｔ_ＲＭ細胞の生存に必要なＩＬ－１５Ｒα欠損マウス^２６と同様に、エフェクター細胞がより多く存在するが、疲弊した表現型であるＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスは、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ、Ｆｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}、およびＲａｇ２^－／－の動物と比較して体重が減少した（図４ｇ－ｈ、図１０ｆ）。これらのデータは、Ｔ_ＲＭ細胞が肝臓のアピコンプレックス寄生虫マラリア原虫^４９と皮膚のウイルス^２６に対する保護を提供していることと一致している。

【0140】

１型Ｔ_ＲＥＧ細胞はＴ_ＲＭの成長を促進する。
Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}またはＦｏｘｐ３^{ΔＥｏｍｅｓ}マウスからのＴ細胞は、定常状態、活性化時またはＴ_ＲＭ細胞確立時で、ＴｂｅｔまたはＥｏｍｅｓの発現に関して、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ対照と区別できなかった（図１１ａ－ｄ）。Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物の組織におけるエフェクターＴ細胞の蓄積とＴ_ＲＭ細胞の減少（Ｆｏｘｐ３^ＷＴと比較して）がＣＤ８Ｔ細胞固有であるかどうかを評価するために、我々はＣＤ４５．１対照とＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスとの混合骨髄キメラを生成した。見つかったＴ_ＲＭ細胞は、両方のドナーから同様の寄与を示した（図５ａ－ｂ）。さらに、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウス（ＣＤ４５．２）から供給されたＣＤ８Ｔ細胞を対照ＣＤ４５．１動物に移入した。１日後、マウスにＥｖをチャレンジすると、２週間後に解消する^５４。ＣＤ８^{ＣＤ４５．１}ＣＤ１０３^＋Ｔ_ＲＭ細胞の成長は、寄生虫解消の１週間後、Ｔ_ｅｆｆ細胞が減少したときに評価された（図５ｃ）。移入されたＣＤ４５．２^＋集団内で、Ｔ_ＲＭ細胞が高効率で発生した（図５ｄ）。まとめると、これらの結果は、Ｔ_ＲＭ細胞の生成を阻害するＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスのＣＤ８Ｔ細胞外因性欠陥を示唆している。これを確証するために、ＣＤ４５．１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８^{ＣＤ４５．１}）をＣＤ４５．２^＋Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}またはＦｏｘｐ３^ＷＴ動物に移入した。感染ピーク時（１０日目）に、Ｔ_ＲＭ細胞およびエフェクターＴ細胞がＬＰＬに存在する（図１１ｅ、ｆ）。Ｆｏｘｐ３^ＷＴ宿主では、移入されたＣＤ８^{ＣＤ４５．１}細胞の大部分が、Ｅｏｍｅｓレベルが低いＣＤ１０３発現の特徴的なＴ_ＲＭ細胞プロファイルを示した（図５ｅ）。対照的に、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}宿主に移入されたＣＤ８^{ＣＤ４５．１}Ｔ細胞は、Ｅｏｍｅｓを発現し、ＣＤ１０３を欠く、細胞の大部分がエフェクター表現型である、部分的Ｔ_ＲＭ細胞形成を示した（図５ｅ）。移入されたＣＤ８^{ＣＤ４５．１}Ｔ細胞の累積数は、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ宿主と比較してＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}宿主で類似しており、前者ではＴ_ＲＭ細胞が減少していた（図５ｆ）。Ｅｖ感染の９週間後のマウスの分析により、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物全体で、検出可能な移入ＣＤ８^{ＣＤ４５．１}Ｔ細胞の数が減少したことが示された（図５ｇ）。これらのデータにより、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物で観察されたＣＤ８^＋Ｔ_ＲＭ細胞分化の障害が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団にとって外因性であることが確認される。本発明者の移入システムにより、Ｔ_ＲＥＧ細胞が、ＣＤ８^{ＣＤ４５．１}Ｔ細胞およびＴ_ＲＥＧ ^ＷＴ細胞のＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物への同時移入を介してＴ_ＲＭ細胞の成長を促進するという仮説を試験することが可能になった。（図１１ｇ）。仮説が支持されることに、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物におけるＴ_ＲＭ細胞の生成は、対照Ｔ_ＲＥＧ細胞の存在下、Ｆｏｘｐ３^ＷＴ対照で観察されたレベルに回復した（図５ｈ）。

【0141】

Ｔ－ｂｅｔ発現Ｔ_ＲＥＧ細胞が、Ｔ_ＲＭの成長における役割を説明できる特定の機能的属性を有するかどうかを理解するために、本発明者らは、最近公開された単一のＴ_ＲＥＧ細胞配列決定データのセットを利用した^５５。以前の報告^{４２、５６}と一致して、小さな傾向は存在するかもしれないが、本発明者らは、特徴的な系統転写因子Ｔｂｘ２１、Ｇａｔａ３またはＲｏｒｃの存在によって定義されるＴ_ＲＥＧ細胞サブセットにわたって、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦβ、ＣＤ２５、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ－４などのＴ_ＲＥＧ細胞エフェクター分子の有意差を発見しなかった（図５ｉ）。さらに、Ｔ－ｂｅｔ欠損Ｔ_ＲＥＧ細胞は、対照Ｔ_ＲＥＧ細胞と同様の抑制能を示すことが報告されている^{３５、５７}。

【0142】

Ｔ_ＲＭの成長は、Ｔ_ＲＥＧの動員に依存して、局所的にＴＧＦβを生物学的に利用可能にする。
発明者の観察は、特定の無病原体条件下での微生物の存在と、非常に局所的な応答を誘発する細胞内小腸寄生虫Ｅｖに依存していた。本発明者らは、我々のＣＤ８^{ＣＤ４５．１}Ｔ細胞移入システム（図５ｃ）を利用して細菌エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｐｔｂ）でマウスをチャレンジし、Ｔ_ＲＭ細胞を誘導することを報告した^{５８、５９}。Ｅｖを使用して得られた結果と一致して、ＹｐｔｂチャレンジはＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物で著しく減少したＦｏｘｐ３^ＷＴ動物で効率的なＴ_ＲＭ細胞成長をもたらした（図６ａ、ｂ）。

【0143】

ＣＤ８^{ＣＤ４５．１}Ｔ細胞のＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスへの移入モデルにより、発明者は、Ｔ_ＲＭ細胞の成長を促進するためにＴ_ＲＥＧ細胞が行う寄与を調査することができた。Ｔ－ｂｅｔの非存在下で、Ｔ_ＲＥＧ細胞は同程度のレベルのＣＤ１０３、ＣＣＲ６、およびＰ－セレクチン^３５を発現するが、非リンパ組織の感染領域へのＴ細胞の局在化に重要なＣＸＣＲ３を発現できない^{７、３５、３９、６０}。局所炎症環境は、Ｔ_ＲＭ前駆細胞^{５８、６１}、およびＴ_ＲＥＧ細胞の動員を制御する（図６ｃ）。重要なことに、Ｅｖ感染時に動員されたＴ_ＲＥＧ細胞は、主にＣＸＣＲ３を発現するタイプ１表現型を示す（図６ｄ、図１１ｇ－ｈ）。ＣＸＣＲ３の発現がＴ－ｂｅｔ依存的でないＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスの結腸におけるエフェクターおよびＴ_ＲＭ細胞における変化の欠如を考慮して、本発明者らは、Ｔ_ＲＥＧ細胞の亜集団におけるＴ－ｂｅｔ発現が、これらの細胞の感染部位への動員を促進し、Ｔ_ＲＭ前駆細胞と近接させると仮定した。これを確認すると、Ｔｂｘ２１のＦｏｘｐ３依存性切除により、Ｅｖ感染時のＴ_ＲＥＧ細胞の動員の減少がもたらされたが（図６ｃ）、これは主にＣＸＣＲ３を発現するものが原因であった（図６ｄ）。１型Ｔ_ＲＥＧ細胞の動員と一致して、本発明者らは、Ｅｖ感染時に腸組織においてＣＸＣＲ３リガンド、ＣＸＣＬ１０の発現が増加することを見出した（図６ｅ）。ＣＤ４Ｔ細胞数は、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスのＬＰＬコンパートメントの定常状態で減少し（図１ｅ）、Ｔ_ＲＭ細胞の生成に追加の役割を果たし得る。しかしながら、Ｅｖ感染は、優勢なＴヘルパー１表現型を持つＬＰＬコンパートメントへのＣＤ４Ｔ細胞の堅牢な動員をもたらした（図１２ａ、ｂ）。移入システムを利用して（図５ａ）、ＣＤ８^{ＣＤ４５．１}細胞を同時に移入すると、ＣＸＣＲ３欠損Ｔ_ＲＥＧ細胞は、ＣＸＣＲ３が十分な対照と比較して、Ｔ_ＲＭ細胞の効率的な成長を支援できなかった。（図６ｆ）。

【0144】

ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の凝集体は、Ｂ細胞は伴わないが、マクロファージや樹状細胞などの他の免疫細胞と一緒に、微生物の侵入領域において一般的に観察される^{５８、６２、６３、６４、６５}。ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋Ｔ細胞間の相互作用は、Ｔ細胞の維持には必要ないが^５９、Ｔ_ＲＭ分化をサポートする可能性のある異なる微小環境を構成する可能性がある。一致して、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３^ＷＴマウスのＦｏｘｐ３発現Ｔ_ＲＥＧ細胞に近接した移入ＣＤ８^{ＣＤ４５．１}Ｔ細胞が頻繁に観察されたが、これはＣＤ８Ｔ細胞浸潤が同様であるにもかかわらずＦｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}動物では容易に観察されなかった（図６ｇ、図１２ｃ参照）。

【0145】

Ｔ_ＲＭの成長を促進するためのＣＸＣＲ３の要件は、Ｔ_ＲＥＧが短距離作用または細胞結合エフェクター分子を提供することを示唆している。ＩＬ－１２のような１型サイトカインは、高レベルのＴ－ｂｅｔおよびＥｏｍｅｓを維持できるため、Ｔ_ＲＭ細胞の分化とＣＤ１０３の発現を防ぐ。ＩＬ１２Ｒβ２欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ１０３を発現する細胞の割合が増加しており、Ｔ細胞クラスターは高いＴＧＦβ転写物を有する^５９。ＩＬ－１０はＩＬ－１２の発現と樹状細胞の成熟を低下させる可能性がある^６６。しかしながら、ＩＬ－１０欠損Ｔ_ＲＥＧ細胞は、Ｔ_ＲＭ細胞の効率的な成長を助けることができ（図６ｈ）、ＩＬ－１０欠損動物はＴ_ＲＭ細胞コンパートメントの減少を示さなかった（図１２ｄ、ｅ）。さらに、ＩＬ－３５を生成できないＥＢＩ３欠損Ｔ_ＲＥＧ細胞は、Ｔ_ＲＭ細胞の生成を同様に促進し（図６ｉ）、ＥＢＩ３欠損骨髄キメラ動物では、Ｔ_ＲＭ細胞コンパートメントが減少しなかった（図１２ｇ、ｈ）。

【0146】

多くの細胞、特に粘膜バリアでは、ＴＧＦβを作ることができる^６７。しかし、ＴＧＦβは不活性な前駆体として生産され、潜伏関連ペプチドからの切断が必要である。ＴＧＦ－βは強力な細胞調節活性を有し、多数の免疫および非免疫細胞型に作用するため、その利用可能性は局所的な微小環境で厳密に調節されている。最近、Ｔ_ＲＥＧ細胞がインテグリンαｖβ８を介してＴＧＦβを活性化できること、このタンパク質が活性化／エフェクターＴ_ＲＥＧ細胞でアップレギュレートされ、それによって局所生物活性ＴＧＦβが減少することが示され^６８、本発明者らは、定常状態ではＴＧＦβ１やＩｔｇｂ８に対して差次的発現を示さないＣＸＣＲ３発現Ｔ_ＲＥＧ細胞のエフェクターＣＤ８Ｔ細胞の部位への特異的な動員（図５ｆ、図１２ｆ）^４２が、ＴＧＦβの局所放出を可能にすると仮定した。Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスと同様に、Ｆｏｘｐ３^{ΔＩｔｇβ８}マウスから生成された骨髄キメラは、Ｔ_ＲＭ細胞の減少とＫＬＲＧ１発現エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示した（図１２ｇ、ｉ）。重要なことに、Ｔ_ＲＥＧ細胞のみＩｔｇβ８が存在しない場合、Ｔ_ＲＭ細胞生成の非効率的な促進があった（図６ｊ）。Ｔ_ＲＥＧ由来のＴＧＦβが決定論的な役割を果たすかどうかを理解するために、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｇｆβ１}マウスを使用した。Ｆｏｘｐ３^{ΔＩｔｇβ８}マウスと一致して、Ｔ_ＲＥＧ細胞からのＴＧＦβ１の非存在下では、エフェクターＴ細胞の増加とＴ_ＲＭ細胞の割合の減少をもたらしたのみであった（図１２ｇ、ｊ）。養子移入では、ＴＧＦβ１の供給が不足しているＴ_ＲＥＧ細胞は、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスのＴ_ＲＭ細胞の成長をレスキューすることができなかった（図６ｋ）。まとめると、特定の理論に縛られることを望まないが、データは、Ｔ_ＲＥＧ細胞がＣＸＣＲ３のＴ－ｂｅｔ誘導性発現を介して動員され、ＴＧＦβ１を生成し、αｖβ８インテグリンの発現を介して局所的な生物利用を可能にし、炎症組織におけるＴ_ＲＭ細胞の成長を促進させることを示している。

【0147】

考察
非リンパ組織における長期間の細胞性免疫の誘導は、再感染を防ぐために重要であり、ワクチン設計の主要な目的でもある。本発明者のデータは、エフェクター細胞または記憶細胞前駆体としてＣＤ８＋Ｔ細胞が組織にホーミングし、その後、ローカルキューを受け取るとＴ_ＲＭ細胞に分化するモデルを支持する^６９。ＳＬＯにおけるＴ細胞の活性化は、活性化Ｔ細胞を非リンパ組織に誘導する多種多様な組織ホーミング受容体の発現を誘導し、エフェクターＴ細胞がほとんどの末梢組織を検査できるようにする^{６９、７０}。Ｔ_ＲＭ細胞のユニークなプロファイルは、組織の微小環境の因子がエフェクター細胞のＴ_ＲＭ細胞への分化を指示することを示唆する。

【0148】

本発明者のデータは、局所感染モデルおよびポリクローナルＴＣＲレパートリーに基づいている。局所的な微小環境における炎症媒介輸送および同種抗原は、最適なＴ_ＲＭ細胞の成長に必要であるが、維持には必要ないことが、局所感染モデルを使用して示されている^{６１、７１、７２}。これは、ＩＥＬ数が安定したままである全身性ウイルス感染を使用した観察とは対照的であるが^６９、発明者の観察は、以前に報告された小腸感染^５８と一致しており、これが局所炎症の特徴であることが示唆される。動員されたエフェクターＴ細胞または記憶前駆Ｔ細胞からのＴ_ＲＭ細胞の分化には、サイトカインや二次抗原との遭遇などの局所的な手がかりが必要になる場合がある。発明者のデータは、本モデルを支持し、Ｔ_ＲＥＧ細胞を炎症部位に動員する必要性と、エフェクターから記憶への成長を促進する生物活性ＴＧＦβレベルを上昇させるそれらの能力により本モデルを拡張する。全Ｔ_ＲＥＧ細胞が枯渇すると、中枢神経系のＴ_ＲＭ細胞の数がウイルス感染で減少し^７３、Ｔ_ＲＭ細胞の成長または維持におけるＴ_ＲＥＧ細胞の役割が示唆された。本発明者らは、１型Ｔ_ＲＥＧ細胞の局所動員が重要であり、その際、Ｉｔｇβ８の発現がＴ_ＲＭの成長を促進し、局所的に供給されるＴＧＦβおよびその生物学的利用可能性に大きく依存することを示すことにより、この観察を拡張する^{２３、２６、５９}。局所抗原は、感染細胞との安定な接触を形成する組織内のＣＤ８＋Ｔ細胞を保持することができ、その際、ＣＸＣＲ３発現を必要とするプロセスであるＣＤ６９が再発現される^７４。非炎症組織では、本発明者らはＣＤ４およびＴ_ＲＥＧ細胞の減少を報告しているが、ＣＤ４Ｔ細胞は炎症時に動員される。Ｔ_ＲＥＧ細胞の補給はＴ_ＲＭ細胞の成長を向上するのに十分であるが、これはＣＤ４Ｔ細胞の支援的役割を排除するものではない。本発明者らは、ヒトにおける１型Ｔ_ＲＥＧ細胞も同定するＣＸＣＲ３発現が^７５、Ｔ_ＲＥＧ細胞を上流転写因子Ｔ－ｂｅｔの必要性の合理性を提供する炎症部位に動員するために必要であることを示す。ＣＸＣＲ３非存在下で、Ｔ_ＲＥＧ細胞組織の動員は制限され、１型免疫および免疫病理学の向上をもたらす^{４２、７６}。Ｔ_ＲＥＧ細胞の欠如は免疫応答を向上し、滅菌的な免疫さえもたらすことができるが、その後の免疫の喪失が報告されている^５３。発明者らはここで、１型Ｔ_ＲＥＧ細胞がＴＧＦβを提供し、αｖβ８インテグリンの発現により局所的に利用可能にすることにより、Ｔ_ＲＭ細胞の成長を促進し、生涯にわたる免疫監視を支援し、侵入微生物に対する組織保護を強化することを示す。

【0149】

本発明者らは、Ｔ－ｂｅｔ発現Ｔ_ＲＥＧ細胞の非存在下で評価されたいくつかの組織においてＴ_ＲＭ分化の減少を観察した。これは、特定の組織微小環境がＴ_ＲＭ細胞の成長または１型Ｔ_ＲＥＧ細胞の動員において重要な役割を果たしていないことを強調している。それにもかかわらず、組織の特定の違いは、Ｔ_ＲＭの成長またはそれらの表現型の振幅を変える可能性がある。Ｔ_ＲＭ細胞は腸内で主にＩＦＮγを生産することが知られているが、表皮では微生物チャレンジ後にＩＬ－１７を産生できることが示されている。さらに、追加の組織傷害は表皮のＴ_ＲＭ細胞機能を変化させることがあり、創傷の修復に寄与している^{７７、７８}。結腸は、１型Ｔ_ＲＥＧ細胞の非存在下で、本発明者がＴ_ＲＭまたはエフェクター細胞の変化を発見せず、Ｔ細胞サブセットの比率も変化しなかった注目すべき例外であった。Ｔ_ＲＥＧ細胞はＣＸＣＲ３を発現し、炎症部位に動員されるためにＴ－ｂｅｔを必要とするが、Ｔ－ｂｅｔは結腸でＣＸＣＲ３発現を調節していないようである^４２。結腸におけるＴ－ｂｅｔとＣＸＣＲ３の分離は、微生物の最大含有量を保有する器官における代替免疫調節を示唆している。

【0150】

ＴＧＦβは、インビトロおよびインビボでＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１０３発現を強力に促進し^２２、ＫＬＲＧ１発現を減少させることが示されている^４３。さらに、Ｔ_ＲＭ細胞の成長に対する炎症の軽減の重要性が、慢性感染時のＣＤ１０３発現の減少によって示唆されている^{２３、７９}。さらに、ＴＧＦβＲＩＩ欠損ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｔ_ＲＭ細胞になれないか、またはＴ_ＲＭ細胞に留まらない^{１９、５８}。ＣＤ１０３^＋Ｔ_ＲＭ細胞に加えて、ＣＤ１０３^－Ｔ_ＲＭ細胞集団が報告されている^{２２、５８、６２}。この集団の安定性は、組織の種類と抗原の持続性に依存する場合がある。対照マウスにおける本発明者のモデルにおいて、特定の無病原体条件下での定常状態、ならびにＥｖチャレンジ後の状態を見ると、ＣＤ１０３^－Ｔ細胞は少数集団であった。代わりに、Ｆｏｘｐ３^{ΔＴｂｘ２１}マウスで観察されたＣＤ１０３^－Ｔ細胞は、ＣＤ１０３を発現しＥｏｍｅｓをスイッチオフする移行期のＴ細胞の特徴であるＫＬＲＧ１および高レベルのＥｏｍｅｓを発現していた^８０。特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明者のデータは、Ｔ_ＲＭ細胞の成長における１型Ｔ_ＲＥＧ細胞の重要な役割を明らかにしているが、より小さなＴ_ＲＭ細胞集団が依然として生成される可能性があることから、他の細胞がＴＧＦβの放出にさらなる貢献をする可能性が示唆される。Ｔ_ＲＭ細胞の維持に重要な間質上皮細胞を含む、生物活性ＴＧＦβの代替的な生成源が報告されている^８１。

【0151】

Ｔ_ＲＥＧ細胞は、過剰な免疫応答を弱め、それによって自己免疫および免疫病理学を防ぐことに重要であり、血液中で測定される感染およびワクチン接種時の応答の振幅を減少させると考えられている。しかしながら、本発明者のデータは、エフェクターまたは記憶前駆体から、さもなければ枯渇してしまう組織常在性記憶Ｔ細胞を効率的に生成する際における、それらの重要な役割を強調している。そのことにより、Ｔ_ＲＥＧ細胞は、組織内の免疫監視に重要な数のＴ細胞が利用できるように確証して、再感染を防止または軽減し、新たな感染による病原体負荷を軽減する。

【0152】

実施例２
結果
本発明者らは、図１５に詳述するように、培地中にＴ_ＲＥＧ細胞の非存在下で、Ｔ_ＲＭ細胞の生成が可能であるかどうかを評価した。

【0153】

図１６を参照すると、ＩＬ－１５、抗原提示細胞（ＢＭＤＣ）、および以前に活性化されたＣＤ８Ｔ細胞を含む培養物へのＴＧＦβの添加は、追加のＴ_ＲＥＧ細胞の非存在下で、ＣＤ６９およびＣＤ１０３の継続的発現などのＴ_ＲＭ機能を確立するのに十分であることが示されている。

【0154】

図１７を参照すると、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、抗原提示細胞、および以前に活性化されたＣＤ８Ｔ細胞とＩＬ－７の添加との組み合わせが、それらのＣＴＬＡ－４発現プロファイルに基づいて、生成されたＴ_ＲＭ細胞の遊走能力を増強できることが示されている。（Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１８年１１月２７日；Ｂｒｕｎｎｅｒ－ＷｅｉｎｚｉｅｒｌおよびＲｕｄｄ；Ｋｉｅｋｅら、ＰＬＯＳ Ｏｎｅ、２７／５／０９）
図１８を参照すると、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、抗原提示細胞、および以前に活性化されたＣＤ８Ｔ細胞とＩＬ－２の添加との組み合わせが、それらのＣＴＬＡ－４発現プロファイルに基づいて生成されたＴ_ＲＭ細胞の遊走能力を増強できることが示されているが、これは、細胞あたりの量または生物学的反復について、ＩＬ－７の添加ほど一貫していない。

【0155】

さらに、本発明者らは、インビトロで生産された細胞が、それらの治療特性、特に、図１９に実験設定が詳述される、組織内インビボで遊走および生存する能力を維持しているかどうかを評価した。

【0156】

本発明者らは、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）からなるインビトロ設定においてインビボ条件を再現した。Ｔ細胞はインビトロで刺激され、Ｔ細胞療法のために大量の細胞を生産するのと同様の方法で増殖させることができる。本発明者らは、生物活性ＴＧＦβの添加が、Ｔ_ＲＭ細胞に似たＴ細胞の成長におけるＴ_ＲＥＧ細胞の役割を置き換え、マーカーならびに組織保持因子ＣＤ６９およびＣＤ１０３の発現を継続できることを示している（図２０）。ＣＤ６９は通常、Ｔ細胞活性化の際に、一過性に発現する活性化マーカーである。ＣＤ６９はＣ型レクチンであり、固形腫瘍を含む非リンパ組織におけるＴ_ＲＭ細胞の保持に関与している可能性が最も高い^９８。ＣＤ６９はスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）１と複合体を形成し、それにより、Ｔ細胞の組織外への放出を引き起こすＳ１Ｐ受容体への結合を阻害することが可能である。さらに、データは、ＩＬ－７およびＩＬ－２の添加が強力なＣＴＬＡ－４発現を誘導することを示しており（図１７および１８）、これは増強されたＴ細胞遊走と関連している^{９９、１００、１０１}。ＣＴＬＡ－４の発現はＩＬ－２の添加でより強くなるように見えるが、再現実験では、ＩＬ－２の添加よりもＩＬ－７の添加の方がより一貫性があることが示された。さらに、ＩＬ－７を添加すると、個々の細胞でＣＴＬＡ－４の発現がより強くなることが示された。

【0157】

インビトロで生成され増殖したＴ細胞をインビボに移入することから得られたデータは、ＴＧＦβの非存在下で生成されたエフェクター細胞が組織中に実質的な数で見出されないことを示している（図２１、２２、２３および２４）。一方、Ｔ_ＲＭ細胞は、特にＩＬ－７で刺激した場合、肺、肝臓、粘膜固有層および小腸上皮内コンパートメントなど、試験した全ての臓器を含めて、移入後４０日で容易に検出される（図２１、２２、２３および２４）。

【0158】

要約
要約すると、本発明者らは、腫瘍（および特に固形腫瘍）に深く浸透して、腫瘍または感染症に対するＴ細胞療法の段階的な変化に寄与することができるＴ細胞（Ｔ_ＲＭ細胞として知られる）を生成するための非常に新規で革新的なプロトコルを開発した。本発明者のプロトコルは、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ６９およびＣＤ１０３の発現に基づいて、遊走性および組織浸透性細胞の表現型を有するインビトロで生成され増殖された細胞をもたらす。それらの表現型に適合し、エフェクターＴ細胞とは対照的に、生成された細胞は、完全マウス宿主への養子移入の少なくとも４０日後に、さまざまなリンパ組織および非リンパ組織に容易に見出される。発明者らの研究は、臓器感染症の効果的な治療や、治療がはるかに困難な固形腫瘍に罹患した癌患者にとって重要な進歩を遂げるものであろう。しかしながら、本発明者らは、Ｔ_ＲＭ細胞の組織浸透能力は、感染症または原発腫瘍の標的化のみならず、アクセスしにくいことがよくある原発腫瘍から離れた組織に移動した転移に対して向けられた臓器全体の重要な免疫監視を提供し得ると考えている。

【0159】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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【国際調査報告】