特表 2023-526976 多重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-26

(54)【発明の名称】多重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230619BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230619BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230619BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230619BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230619BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230619BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230619BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230619BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230619BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/46 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P29/00

A61P37/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022571782

(86)(22)【出願日】2021-05-28

(85)【翻訳文提出日】2023-01-20

(86)【国際出願番号】 EP2021064427

(87)【国際公開番号】W WO2021239987

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】20177337.1

(32)【優先日】2020-05-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515310984

【氏名又は名称】ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ペーター リヒトレン

(72)【発明者】

【氏名】ダービド ウレッヒ

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン ヘス

(72)【発明者】

【氏名】テア グンデ

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドル シモナン

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン バルムート

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス ブロック

(72)【発明者】

【氏名】ビティー チャタジー

(72)【発明者】

【氏名】マリーア ヨハンソン

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル スナル

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、メソテリンに特異的に結合する２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と；ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）含む多重特異性抗体に関するものであり；この多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まず、前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれは、ＳＰＲによって測定するとき０．５～２０ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する。本発明はさらに、前記多重特異性抗体をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクター、前記核酸配列または前記ベクターを含む宿主細胞、および前記多重特異性抗体を作製する方法に関する。それに加え、本発明は、前記多重特異性抗体を含む医薬組成物と、それを利用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多重特異性抗体であって、
ａ）メソテリンに特異的に結合する、２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する、少なくとも１つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）を含み、
ここで前記多重特異性抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まず、および前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれが、ＳＰＲによって測定するとき０．５～２０ｎＭの範囲、特に０．６～１０ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する、多重特異性抗体。

【請求項2】

前記ＭＳＬＮ－ＢＤが、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２（または１０）、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ配列番号４、５、および６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；またはそれぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；および
（ｉｉ）ＶＨ３またはＶＨ４ドメインのフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；特にＶＨ３ドメインのフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；および
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、特にＶκ１またはＶκ３ＦＲ１～ＦＲ３、特にＶκ１ ＦＲ１～ＦＲ３と、Ｖκ ＦＲ４とＶλ ＦＲ４から選択され、特に配列番号１３２～配列番号１３９のいずれかと少なくとも７０、８０、または９０パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より詳細には配列番号１３２～配列番号１３９のいずれかから選択されるＶλ ＦＲ４、特に配列番号１３２または１３９に従うＶλ ＦＲ４である、フレームワークＦＲ４を含む、ＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン、
を含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項3】

前記ＭＳＬＮ－ＢＤが、
ａ．１）それぞれ配列番号１、２（または１０）、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．１）それぞれ配列番号４、５、および６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．１）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨ配列、および
ｄ．１）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＬ配列；
または
ａ．２）それぞれ配列番号１、２（または１０）、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．２）それぞれ配列番号４、５、および６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨ配列、および
ｄ．２）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＬ配列；
または
ａ．３）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．３）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．３）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨ配列、および
ｄ．３）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＬ配列；
または
ａ．４）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．４）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．４）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨ配列、および
ｄ．４）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＬ配列；
または
ａ．５）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．５）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．５）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨ配列、および
ｄ．５）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＬ配列；
または
ａ．６）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．６）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．６）配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨ配列、および
ｄ．６）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＬ配列；
または
ａ．７）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．７）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．７）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨ配列、および
ｄ．７）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するＶＬ配列、
を含む、請求項１または２に記載の多重特異性抗体。

【請求項4】

前記ＣＤ３－ＢＤがＣＤ３εに結合している、請求項１～３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【請求項5】

１つのＣＤ３－ＢＤを含み、このＣＤ３－ＢＤが、ＳＰＲによって測定したとき０．５～５０ｎＭ、特に１～４０ｎＭ、特に２～３５ｎＭの１価Ｋ_ＤでＣＤ３εに結合する、請求項１～４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【請求項6】

前記ＣＤ３－ＢＤが、
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークの中のそれぞれ配列番号４５、４６、および４７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号４８、４９、および５０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、ここで前記ＶＬフレームワークが、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、特にＶκ１フレームワークと、Ｖκ ＦＲ４とＶλフレームワーク４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む、
を含み、
特に前記ＣＤ３－ＢＤが、
（ｉ）配列番号５１、１４０、１４１、または１４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
を含む、請求項４または５に記載の多重特異性抗体。

【請求項7】

前記抗体は、少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）、特に１つのｈＳＡ－ＢＤをさらに含み、特にこのｈＳＡ－ＢＤは、
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークの中のそれぞれ配列番号５３、５４、および５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号５６、５７、および５８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、ここで前記ＶＬフレームワークが、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、特にＶκ１フレームワークと、Ｖκ ＦＲ４、特にＶκ１ ＦＲ４とＶλフレームワーク４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む；
または
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークの中のそれぞれ配列番号６３、６４、および６５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号６６、６７、および６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、ここで前記ＶＬフレームワークが、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、特にＶκ１フレームワークと、Ｖκ ＦＲ４、特にＶκ１ ＦＲ４とＶλフレームワーク４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む；
または
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークの中のそれぞれ配列番号７３、７４、および７５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号７６、７７、および７８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、ここで前記ＶＬフレームワークが、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、特にＶκ１フレームワークと、Ｖκ ＦＲ４、特にＶκ１ ＦＲ４とＶλフレームワーク４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む；
を含み、
特に前記ｈＳＡ－ＢＤが、
（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
または
（ｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
（ｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
または
（ｉ）配列番号７９または１４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
（ｉｉ）配列番号８０または１４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
または
（ｉ）配列番号８１または１４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
（ｉｉ）配列番号８２または１４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【請求項8】

ＣＨ１領域および／またはＣＬ領域を含まない、請求項１～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【請求項9】

前記第１の一本鎖タンパク質が配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０１のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０２のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０９のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が配列番号１１０のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１０のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が配列番号１１１のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１１のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が配列番号１１２のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１２のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が配列番号１１９のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１９のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２０のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２１のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が配列番号１２２のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２２のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が配列番号１２３のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２３のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が配列番号１２４のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２４のアミノ酸配列からなる、
請求項１～８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体をコードする１つの核酸配列または２つの核酸配列。

【請求項11】

請求項１０に記載の１つの核酸配列または２つの核酸配列を含む、１つのベクターまたは２つのベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載の１つのベクターまたは２つのベクターを含む、１つの宿主細胞または複数の宿主細胞。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１０に記載の１つの核酸配列または２つの核酸配列、または請求項１１に記載の１つのベクターまたは２つのベクターを提供し、前記１つの核酸配列または２つの核酸配列、または前記１つのベクターまたは２つのベクターを発現させ、発現系から前記多重特異性抗体を回収すること、または（ｉｉ）請求項１２に記載の１つの宿主細胞または複数の宿主細胞を提供し、前記１つの宿主細胞または複数の宿主細胞を培養し；および細胞培養物から前記多重特異性抗体を回収すること、
を含む、方法。

【請求項14】

請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体と、医薬として許容可能な担体とを含む、医薬組成物。

【請求項15】

疾患、特にヒト疾患、より詳細には、がん、特に中皮腫、膵臓がん、および卵巣がんから選択されるがん、炎症性疾患、および自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するためのものであり、
特に、
３つまたは４つの結合ドメインを含む一本鎖タンパク質、または
３つまたは４つの結合ドメインを含むヘテロ二量体タンパク質、のいずれかである、
請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メソテリンに特異的に結合する２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と；ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）含む多重特異性抗体に関するものであり；この多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まず、前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれは、ＳＰＲによって測定するとき０．５～２０ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する。本発明はさらに、前記多重特異性抗体をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクター、前記核酸配列または前記ベクターを含む宿主細胞、および前記多重特異性抗体を作製する方法に関する。それに加え、本発明は、前記多重特異性抗体を含む医薬組成物と、それを利用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景
がんの治療はかなり進歩したにもかかわらず、がんは主要な未解決の医療ニーズであり続けている。近年のがん治療においてなされた最大の実質的な進歩のいくつかは、さまざまなクラスの分子の免疫療法の登場（その非限定的な例に含まれるのは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、組み換えタンパク質、およびキメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法である）によってもたらされた。このような療法は、ａ）免疫エフェクター細胞を腫瘍常在細胞に積極的に向かわせること、および／またはｂ）免疫エフェクター細胞を刺激すること、および／またはｃ）腫瘍を媒介とする免疫抑制を緩和することによって抗腫瘍免疫を誘導する。これらの免疫療法は一般に、その薬理活性を腫瘍外遺伝子座よりも腫瘍に向けるのに、腫瘍常在細胞（例えば悪性細胞、腫瘍血管系の細胞、間質細胞、免疫細胞など）による特定の抗原の過剰発現を利用している。これらの抗原のうちで腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、悪性細胞が選択的に過剰発現する細胞表面タンパク質を含む。ＴＡＡに高い親和性で結合することにより、免疫療法は、その免疫調節活性をある程度腫瘍細胞と免疫エフェクター細胞の間の免疫シナプスに限定することができる。

【0003】

一般的な１つのクラスのＴＡＡ結合免疫療法は、腫瘍細胞をオプソニン化し、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を発現している細胞（主にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）によって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を始動させることによって抗腫瘍免疫を誘導するｍＡｂである。他のＴＡＡ結合免疫療法は、悪性細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞など）を狙った枯渇を誘導する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のほか、同時にＴ細胞抗原ＣＤ３を関与させるｂｓＡｂ（ＴＡＡ／ＣＤ３ ｂｓＡｂ）を活用している。

【0004】

ＴＡＡ－（リ）ダイレクトＣＴＬと従来のＴＡＡ／ＣＤ３ ｂｓＡｂの治療上の有用性は臨床で検証されたが、用量制限毒性（ＤＬＴ）が、最大有効量（ＭＥＤ）での投与を阻んだり、治療の中断へとつながったりして、その結果として有効性が制限されることがしばしばある。

【0005】

ＤＬＴの１つの理由は、従来のＴＡＡ／ＣＤ３ ｂｓＡｂが一般にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）とも関係していることであり、それは抗ＣＤ３ドメインの過剰な活性によると推定される。免疫療法の腫瘍外活性の結果として健康な組織で炎症促進性サイトカインが分泌され、その結果として望ましくない安全性プロファイルになる可能性がある。さらに、ＴＡＡ／ＣＤ３ ｂｓＡｂは、ＴＡＡを過剰発現している細胞を強力に枯渇させる一方で、そのような細胞が腫瘍－抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（すなわち腫瘍反応性Ｔ細胞）を発現しているかどうかに関係なく、ＣＴＬをリクルートして刺激することによってそうする。したがってＴＡＡ／ＣＤ３ ｂｓＡｂは、宿主の天然の抗腫瘍免疫を刺激または再活性化するというよりもＣＴＬをいくらか無差別に刺激するため、潜在的に安全性のリスクがある。

【0006】

このようなＤＬＴが生じる正確な経路はさまざまである可能性があるが、免疫療法関連毒性のリスクは、薬理活性の腫瘍局在化を増強することにより最少にすること、またはなくすことができる。

【0007】

ほぼがん細胞の表面でだけ発現するＴＡＡ（腫瘍胎児抗原など）はクリーンなＴＡＡと呼ばれる。正常な非がん細胞の表面でも発現するＴＡＡ-典型的にはがん細胞と比べてより低いレベル-は、クリーンでないＴＡＡであると見なされる。ＴＡＡ／ＣＤ３ ｂｓＡｂアプローチの非常に大きな効力のため、クリーンでないＴＡＡは、ＴＡＡも発現している非腫瘍細胞にダメージを与えるという理由で難題である。メソテリン（ＭＳＬＮ）はクリーンでないＴＡＡの一例である；これは、腫瘍細胞の表面だけでなく、より低いレベルだが他のさまざまな組織でも発現する。したがってクリーンでないＴＡＡを標的とするときには、腫瘍組織に対するＴＡＡ／ＣＤ３ ｂｓＡｂアプローチの選択性を改善し、腫瘍外／オンターゲット効果を最小にする新たな療法が必要とされている。これは特にＭＳＬＮ／ＣＤ３ ｂｓＡｂアプローチに当てはまる。

【0008】

ＭＳＬＮ^＋固形がん（中皮腫など）を治療するための標的にできる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として、メソテリン（ＭＳＬＮ）が提案されてきた。他の多くのタイプのがんもＭＳＬＮ^＋であり、その中には、ある種の形態の卵巣がんと膵臓がんのほか、トリプルネガティブ乳がんが含まれる。中皮腫の現在の標準治療に含まれるのは、腫瘍切除、化学療法、および放射線療法のほか、緩和的措置（体液除去や疼痛管理など）である。増殖を続ける腫瘍のための免疫療法に含まれるのは、免疫系を刺激するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ブロッカー（ペムブロリズマブやニボルマブなど）または抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブなど）の使用のほか、血管新生を阻止するＶＥＧＦ阻害剤（ベバシズマブなど）の使用である。これらの療法は、臨床での成功を実現している一方で、全身副作用のより大きなリスクを伴っている。したがってＭＳＬＮを標的とする特別なアプローチの必要性が存在する。

【0009】

多数の臨床前研究と初期段階臨床研究が、いくつかの異なるアプローチ（その中に抗体に基づく薬とＣＡＲ－Ｔ細胞が含まれる）によってＭＳＬＮを標的とすることの実現可能性を評価するためにこれまで実施されてきた、または実施されつつある。抗体に基づく薬に含まれるのは、化学療法剤（ペメトレキセドやシスプラチンなど）とともに用いるか、ＰＥ３８にカップルさせて用いる抗ＭＳＬＮ断片ＳＳ１Ｐ免疫毒素；ＡＤＣＣを誘導するキメラモノクローナル抗体であるアマツキシマブ；腫瘍増殖を阻害する抗体薬物複合体であるアネツマブ・ラブタンシン（ＢＡＹ ９４－９３４３：抗ＭＳＬＮ＋チューブリン阻害剤ＤＭ４）またはＤＭＯＴ４０３９Ａ（抗ＭＳＬＮ＋抗有糸分裂モノメチルアウリスタチンＥ）などであり、ＭＳＬＮを発現している細胞を標的とする。改善された半減期を持つ多重特異性エンゲージャ（抗ＭＳＬＮ＋抗ＣＤ３＋抗アルブミン）であるＨＰＮ５３６は、Ｔ細胞をリダイレクトしてＭＳＬＮを発現している標的をインビトロと生体内で殺傷しており、カニクイザルによってよく忍容されるように見える。いくつかの抗ＭＳＬＮキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ療法もよく忍容されており、その中には、一過性にｍＲＮＡをトランスフェクトされたＣＡＲ－Ｔ（ＲＮＡ ＣＡＲＴｍｅｓｏ）と、操作されて自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ９ｍ２８ｚ）を持つＣＡＲ－Ｔが含まれる。大半の抗ＭＳＬＮ療法に対するこれまでの応答はあまりよくなく、これは固形腫瘍の治療に伴う困難を示す。

【0010】

抗ＭＳＬＮ療法では、この問題は、ＭＳＬＮががん患者の血清の中に流入するという事実によってさらに複雑化している（ＭＳＬＮは血清中では可溶性メソテリン関連タンパク質（ＳＭＲＰ）と呼ばれる）。ＭＳＬＮに対して高親和性の抗体はＳＭＲＰにも強く結合してその活性を顕著に低下させ、がん細胞に対して有効な用量を減らす。

【0011】

したがって、腫瘍に有効に局在化させ、ＳＭＲＰの存在下でＴ細胞応答を促進することのできる新規な分子が必要とされている。

【0012】

少なくとも３つの結合ドメイン（そのうちの２つ（ＭＳＬＮ－ＢＤ）はメソテリンに特異的に結合し、１つはＣＤ３（ＣＤ３－ＢＤ）に特異的に結合し、それら２つのＭＳＬＮ－ＢＤの親和性はよくバランスのとれた範囲にある）を持つ多重特異性抗体は、理論的には安全性と有効性に関する上記の制限の多くに対処できると考えられる。このような多重特異性抗体は、理論的には腫瘍への高局在化と改善された選択性を誘導できるため、多彩ながんに対してより安全でより有効な療法を提供できる可能性がある。それに加え、このような分子は、患者の応答を促進するための追加の免疫療法を同時投与する必要性をさらに限定すると考えられるため、容易な開発と治療コストの最小化をサポートする。しかし治療用の多重特異性抗体の実現は、その分子アーキテクチャ、その構成要素である抗原結合ドメインの特性、その製造可能性、および／または乏しい生物物理学的特性に関する課題が理由で複雑化している。まとめると、腫瘍細胞への局在化が増加し、忍容できる毒性プロファイルで有効なＴ細胞活性化を誘導するとともに、医薬開発に適しているようにする生物物理学的特性を持つ新規な多重特異性抗体への明確な必要性が残されたままにされている。

【0013】

それに加え、ＭＳＬＮおよび／またはＣＤ３に対して特異的な多数の抗体がすでに存在するという事実にもかかわらず、そのような多重特異性抗体に対する複雑で特別な要求が、目的に適う特性を有する新規な抗体ドメインの開発を必要としている。

【0014】

そのためがんに苦しむ患者にとって多数の治療の選択肢があるにもかかわらず、有効かつ安全な治療剤の必要性と、標的をより明確にしたその好ましい利用の必要性が残されたままにされている。免疫調節生物製剤はその作用様式を理由としてがんの治療における有望なアプローチを提供するが、全体的免疫刺激と、病理学的に関連する細胞と部位に対するこの免疫調節のあらゆる制限の欠如が、多くの副作用と顕著な毒性を引き起こし、それが潜在的に患者の罹患率と死亡率の上昇につながっている可能性がある。したがって増殖性疾患（特にがん）の治療を改善する薬を提供することが、本発明の１つの目的である。

【発明の概要】

【0015】

本発明の概要
増殖性疾患（特にがん）の治療を改善する薬を提供することが、本発明の１つの目的である。特に、オンターゲットの有効性が増大した薬を提供し、そのことによって毒物学的プロファイルを改善することが本発明の１つの目的であった。

【0016】

第１の態様では、本発明は、
ａ）メソテリンに特異的に結合する２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まず、前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれが、ＳＰＲによって測定するとき０．５～２０ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する多重特異性抗体に関する。

【0017】

第２の態様では、本発明は、特異的ＭＳＬＮ結合ドメインに関する。

【0018】

第３の態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体または特異的ＭＳＬＮ結合ドメインをコードする１つの核酸配列または２つの核酸配列に関する。

【0019】

第４の態様では、本発明は、本発明の前記１つの核酸配列または前記２つの核酸配列を含む１つのベクターまたは２つのベクターに関する。

【0020】

第５の態様では、本発明は、本発明の前記１つのベクターまたは前記２つのベクターを含む１つの宿主細胞または複数の宿主細胞に関する。

【0021】

第６の態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体または特異的結合ドメインを作製する方法に関するものであり、この方法は、（ｉ）本発明の１つの核酸配列または２つの核酸配列、または本発明の１つのベクターまたは２つのベクターを用意し、前記１つの核酸配列または２つの核酸配列、または前記１つのベクターまたは２つのベクターを発現させ、発現系から前記多重特異性抗体を回収すること、または（ｉｉ）本発明の１つの宿主細胞または複数の宿主細胞を用意し、前記１つの宿主細胞または複数の宿主細胞を培養し；細胞培養物から前記多重特異性抗体を回収することを含む。

【0022】

第７の態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。

【0023】

第８の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より詳細には、がん、炎症性疾患、および自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に用いられ、３つまたは４つの結合ドメインを含む多重特異性抗体に関する。

【0024】

第９の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より詳細には、がん、炎症性疾患、および自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に用いられ、３つまたは４つの結合ドメインを含むヘテロ二量体タンパク質である多重特異性抗体に関する。

【0025】

第１０の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より詳細には、がん、炎症性疾患、および自己免疫疾患から選択されるヒト疾患を治療する方法に関するものであり、この方法は、３つまたは４つの結合ドメインを含む本発明の上記の一本鎖多重特異性抗体を投与する工程を含む。

【0026】

第１１の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より詳細には、がん、炎症性疾患、および自己免疫疾患から選択されるヒト疾患を治療する方法に関するものであり、この方法は、３つまたは４つの結合ドメインを含む本発明の上記のヘテロ二量体多重特異性抗体を投与する工程を含む。

【0027】

以下の項目にまとめられている本発明の態様、有利な特徴、および好ましい実施形態は、それぞれ単独で、または組み合わせて本発明の目的を解決するのに寄与する：
１．ａ）メソテリンに特異的に結合する２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まず、前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれが、ＳＰＲによって測定するとき０．５～２０ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する多重特異性抗体。

２．フローサイトメトリーによって測定するときＭｅＴ－５Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）よりも６～８倍高いＭＳＬＮ発現レベルを持つ標的細胞の殺傷に関するＥＣ_５０が、前記標的細胞に対するＴ細胞駆動細胞毒性アッセイで求めるとき、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、特に少なくとも３００ｎｇ／ｍｌ、特に少なくとも４００ｎｇ／ｍｌ、特に少なくとも５００ｎｇ／ｍｌの可溶性メソテリンの存在下で２５倍超に増加することがない、項１の多重特異性抗体。

３．フローサイトメトリーによって測定するときＭｅＴ－５Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）よりも６～８倍高いＭＳＬＮ発現レベルを持つ標的細胞を殺傷することができ、前記標的細胞と前記ＭｅＴ－５Ａ細胞に対するＴ細胞駆動細胞毒性アッセイで求めるとき、前記ＭｅＴ－５Ａ細胞の殺傷に関するＥＣ_５０よりも少なくとも１０倍、特に少なくとも２０倍、特に少なくとも２５倍小さいＥＣ_５０を持つ、項１の多重特異性抗体。

４．前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれが、ＳＰＲによって測定するとき、０．５～１５ｎＭの範囲、特に０．６～１０ｎＭの範囲、特に０．７～５ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する、項１～３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

５．ａ）メソテリンに特異的に結合する２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まず、前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれが、ＳＰＲによって測定するとき０．１～５ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する多重特異性抗体。

６．フローサイトメトリーによって測定するときＭｅＴ－５Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）よりも６～８倍高いＭＳＬＮ発現レベルを持つ標的細胞の殺傷に関するＥＣ_５０が、前記標的細胞に対するＴ細胞駆動細胞毒性アッセイで求めるとき、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、特に少なくとも３００ｎｇ／ｍｌ、特に少なくとも４００ｎｇ／ｍｌ、特に少なくとも５００ｎｇ／ｍｌの可溶性メソテリンの存在下で５０倍超に増加することがない、項５の多重特異性抗体。

７．前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれが、ＳＰＲによって測定するとき０．１～３ｎＭの範囲、特に０．１５～２ｎＭの範囲、特に０．２～１ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する、項５または６に記載の多重特異性抗体。

８．前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれがヒトメソテリンに特異的に結合する、項１～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

９．ＭＳＬＮの領域Ｉ、領域ＩＩ、および／または領域ＩＩＩ、好ましくはＭＳＬＮの領域Ｉおよび／または領域ＩＩ、特にＭＳＬＮの領域Ｉに結合する、項１～８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１０．前記２つのＭＳＬＮ－ＢＤがＭＳＬＮ上の同じエピトープに結合する、項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１１．前記ＭＳＬＮ－ＢＤが、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２（または１０）、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ配列番号４、５、および６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；またはそれぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；および
（ｉｉ）ＶＨ３ドメインまたはＶＨ４ドメインのフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；特にＶＨ３ドメインのフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；および
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３（特にＶκ１またはＶκ３のＦＲ１～ＦＲ３、特にＶκ１ ＦＲ１～ＦＲ３）と、フレームワークＦＲ４（Ｖκ ＦＲ４とＶλ ＦＲ４から選択され、特に配列番号１３２～配列番号１３９のいずれかと少なくとも７０、８０、または９０パーセント一致するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より詳細には配列番号１３２～配列番号１３９のいずれかから選択されるＶλ ＦＲ４、特に配列番号１３２または１３９に従うＶλ ＦＲ４）を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメインを含む、項１～４と８～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１２．前記ＭＳＬＮ－ＢＤが、
ａ．１）それぞれ配列番号１、２（または１０）、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．１）それぞれ配列番号４、５、および６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．１）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．１）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．２）それぞれ配列番号１、２（または１０）、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．２）それぞれ配列番号４、５、および６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．２）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．３）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．３）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．３）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．３）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．４）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．４）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．４）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．４）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．５）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．５）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．５）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．５）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．６）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．６）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．６）配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．６）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．７）それぞれ配列番号１１、１２、および１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．７）それぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．７）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．７）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む、項１～４と８～１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１３．前記ＭＳＬＮ－ＢＤが、
（ｉ）それぞれ配列番号２５、２６、および２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ配列番号２８、２９、および３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；および
（ｉｉ）ＶＨ３ドメインまたはＶＨ４ドメインのフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；特にＶＨ３ドメインのフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；および
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３（特にＶκ１またはＶκ３のＦＲ１～ＦＲ３、特にＶκ１ ＦＲ１～ＦＲ３）と、フレームワークＦＲ４（Ｖκ ＦＲ４とＶλ ＦＲ４から選択され、特に配列番号１３２～配列番号１３９のいずれかと少なくとも７０、８０、または９０パーセント一致するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より詳細には配列番号１３２～配列番号１３９のいずれかから選択されるＶλ ＦＲ４、特に配列番号１３２または１３９に従うＶλ ＦＲ４）を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメインを含む、項５～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１４．前記ＭＳＬＮ－ＢＤが、
ａ．１）それぞれ配列番号２５、２６、および２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．１）それぞれ配列番号２８、２９、および３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．１）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．１）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．２）それぞれ配列番号２５、２６、および２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．２）それぞれ配列番号２８、２９、および３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．２）配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．２）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．３）それぞれ配列番号２５、２６、および２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．３）それぞれ配列番号２８、２９、および３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．３）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．３）配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む；
または
ａ．４）それぞれ配列番号２５、２６、および２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、
ｂ．４）それぞれ配列番号２８、２９、および３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
ｃ．４）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＨ配列、および
ｄ．４）配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント一致するＶＬ配列を含む、項５～１０と１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１５．前記ＶＨドメインがＣ５１アミノ酸残基（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬドメインがＣ１４１アミノ酸残基（ＡＨｏ番号付け）を含む、項１１～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１６．前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれがマカカ・ファスキクラリス（カニクイザル）ＭＳＬＮと交差反応し、特にカニクイザルＭＳＬＮに、ＳＰＲによって測定するとき０．２～７５ｎＭの範囲、特に０．３～６０ｎＭの範囲、特に０．４～５０ｎＭの範囲、特に０．５～４０ｎＭの範囲の１価Ｋ_Ｄで結合する、項８～１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１７．前記ＣＤ３－ＢＤがＣＤ３εに結合している、項１～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１８．１つまたは２つのＣＤ３－ＢＤ、特に１つのＣＤ３－ＢＤを含む、項１～１７に記載のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

１９．前記ＣＤ３－ＢＤがＣＤ３εに、ＳＰＲによって測定するとき５０ｎＭ未満の１価Ｋ_Ｄ、特に０．５～５０ｎＭの１価Ｋ_Ｄ、特に１～４０ｎＭ、特に２～３０ｎＭの１価Ｋ_Ｄで結合する、項１～１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

２０．前記ＣＤ３－ＢＤが、
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク（特にＶＨ３フレームワーク）の中のそれぞれ配列番号４５、４６、および４７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号４８、４９、および５０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬフレームワークは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３（特にＶκ１フレームワーク）と、フレームワークＦＲ４（Ｖκ ＦＲ４とＶλフレームワーク４から選択される）を含む、項１～１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

２１．前記ＣＤ３－ＢＤが、
（ｉ）配列番号５１、１４０、１４１、または１４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；と
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、項２０の多重特異性抗体。

２２．少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）、特に１つのｈＳＡ－ＢＤをさらに含む、項１～２１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

２３．前記ｈＳＡ－ＢＤが、
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク（特にＶＨ３フレームワーク）の中のそれぞれ配列番号５３、５４、および５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号５６、５７、および５８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬフレームワークは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３（特にＶκ１フレームワーク）と、フレームワークＦＲ４（Ｖκ ＦＲ４（特にＶκ１ ＦＲ４）とＶλフレームワーク４から選択される）を含む
または
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク（特にＶＨ３フレームワーク）の中のそれぞれ配列番号６３、６４、および６５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号６６、６７、および６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬフレームワークは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３（特にＶκ１フレームワーク）と、フレームワークＦＲ４（Ｖκ ＦＲ４（特にＶκ１ ＦＲ４）とＶλフレームワーク４から選択される）を含む
または
（ｉ）ヒト抗体ＶＨフレームワーク（特にＶＨ３フレームワーク）の中のそれぞれ配列番号６３、６４、および６５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、
（ｉｉ）ヒト抗体ＶＬフレームワークの中のそれぞれ配列番号６６、６７、および６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬフレームワークは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３（特にＶκ１フレームワーク）と、フレームワークＦＲ４（Ｖκ ＦＲ４（特にＶκ１ ＦＲ４）とＶλフレームワーク４から選択される）を含む、項２２の多重特異性抗体。

２４．前記ｈＳＡ－ＢＤが、
（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む；または
（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む；または
（ｉｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む；または
（ｉｖ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む；または
（ｖ）配列番号７９または１４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８０または１４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む；
または
（ｖｉ）配列番号８１または１４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８２または１４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、項２２または２３の多重特異性抗体。

２５．前記ＶＨドメインがＣ５１アミノ酸残基（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬドメインがＣ１４１アミノ酸残基（ＡＨｏ番号付け）を含む、項２４の多重特異性抗体。

２６．前記結合ドメインが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢからなるグループから独立に選択される、項１～２５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

２７．前記結合ドメインのそれぞれが、
（ａ）ＶＬドメインとＶＨドメインのコグネイトペア（Ｆｖ断片）；または
（ｂ）オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーによって連結されたＶＬドメインとＶＨドメインのコグネイトペア（ｓｃＦｖ断片）
から独立に選択される、項２６に記載の多重特異性抗体。

２８．タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）、Ｆａｂ－Ｆｖ２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジ－ディアボディ、ＣＯＤＶ、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ－Ｆｖ２、またはヘテロ二量体Ｆｃドメイン以外のヘテロ二量体化ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合されたＣＯＤＶ、およびＭＡＴＣＨからなるグループから選択される形式である、項１～２７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

２９．ＣＨ１領域および／またはＣＬ領域を含まない、項１～２８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

３０．ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、トリボディ、ＭＡＴＣＨであり、特にＭＡＴＣＨ形式またはトリボディ形式であり、より詳細にはＭＡＴＣＨ形式であり、より詳細にはＭＡＴＣＨ３またはＭＡＴＣＨ４である、項１～２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

３１．一本鎖タンパク質である、項１～３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

３２．前記一本鎖タンパク質が、下記の順番で配置された
（ｉ）第１のＶＬドメイン、
（ｉｉ）第１のポリペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）第１のＶＨドメイン、
（ｉｖ）第２のポリペプチドリンカー、
（ｖ）第２のＶＬドメイン、
（ｖｉ）第３のポリペプチドリンカー、および
（ｖｉｉ）第２のＶＨドメイン
からなるアミノ酸配列を含み、前記第１のＶＬドメインは前記第２のＶＨドメインと会合して第１の結合ドメインを形成し、前記第２のＶＬドメインは前記第１のＶＨドメインと会合して第２の結合ドメインを形成し、
前記一本鎖タンパク質が、
（ｖｉｉｉ）第４のポリペプチドリンカーを通じて接続された第３のＶＬドメインと第３のＶＨドメインによって形成されていて、Ｃ末端またはＮ末端が第５のポリペプチドリンカーを通じて前記アミノ酸配列に融合している第３の結合ドメイン
をさらに含み、
前記３つの結合ドメインが以下の特異性を持つ、すなわち
ａ）前記第１の結合ドメインがヒトＣＤ３に特異的に結合し（ＣＤ３－ＢＤ）；
ｂ）前記第２と第３の結合ドメインがメソテリンに特異的に結合する（ＭＳＬＮ－ＢＤ）、項３１の多重特異性抗体。

３３．前記一本鎖タンパク質が、第６のポリペプチドリンカーによって接続された第４のＶＬドメインと第４のＶＨドメインによって形成されていて、Ｃ末端またはＮ末端が第７のポリペプチドリンカーを通じて前記アミノ酸配列に融合しているｈＳＡ－ＢＤをさらに含む、項３２の多重特異性抗体。

３４．第１と第２の一本鎖タンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質であり、
前記第１の一本鎖タンパク質が、（Ｎ末端からＣ末端へと）
（ｉａ）第１のＶＬドメイン、
（ｉｉａ）第１のポリペプチドリンカー、および
（ｉｉｉａ）第２のＶＬドメイン
からなる第１のアミノ酸配列を含み、
前記第２の一本鎖タンパク質が、（Ｎ末端からＣ末端へと）
（ｉｂ）第１のＶＨドメイン、
（ｉｉｂ）第２のポリペプチドリンカー、および
（ｉｉｉｂ）第２のＶＨドメイン
からなる第２のアミノ酸配列を含み、
前記第１のＶＬドメインが前記第１または前記第２のＶＨドメインのいずれかと会合して第１の結合ドメインを形成し、前記第２のＶＬドメインが前記ＶＨドメインの他方と会合して第２の結合ドメインを形成し、
前記第１と前記第２の一本鎖タンパク質の少なくとも一方が、
（ｉｖ）第３のポリペプチドリンカーを介して接続された第３のＶＬドメインと第３のＶＨドメインによって形成されていて、第４のポリペプチドリンカーを介して前記第１または前記第２のアミノ酸配列に融合された第３の結合ドメインをさらに含み、
場合により、前記第１と前記第２の一本鎖タンパク質の少なくとも一方が、
（ｖ）第５のポリペプチドリンカーを介して接続された第４のＶＬドメインと第４のＶＨドメインによって形成されていて、第６のポリペプチドリンカーを介して前記第１または前記第２のアミノ酸配列に融合された第４の結合ドメインをさらに含み、
前記３つの、場合により４つの結合ドメインが、以下の特異性を持つ、すなわち
ａ）１つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）がヒトＣＤ３に特異的に結合し；
ｂ）別の２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）がメソテリンに特異的に結合し、前記場合による第４の結合ドメインが存在するときには、
ｃ）残りの結合ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）がヒト血清アルブミンに特異的に結合する、項１～３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

３５．前記場合による第４のドメインが存在し、前記第１と第２の結合ドメインの一方がＣＤ３－ＢＤであり、前記第１と第２の結合ドメインの他方がｈＳＡ－ＢＤである、項３４の多重特異性抗体。

３６．前記場合による第４のドメインが存在し、第３のドメインが前記第１または第２のアミノ酸配列のいずれかに融合され、前記第４のドメインが前記２つのアミノ酸配列の他方に融合されている、項３４または３５に記載の多重特異性抗体。

３７．前記ヘテロ二量体タンパク質に含まれる任意の結合ドメインが、前記第１と第２の一本鎖タンパク質の中に配置された免疫グロブリン可変ドメインだけからなる、項３４～３６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

３８．前記ヘテロ二量体タンパク質が、前記第１と第２のＶＬドメインとＶＨドメイン以外の第１と第２のタンパク質相互作用ドメインのコグネイトペアを含まず、前記第１のタンパク質相互作用ドメインが前記第１の一本鎖タンパク質に含まれ、前記第２のタンパク質相互作用ドメインが前記第２の一本鎖タンパク質に含まれる、項３４～３７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

３９．前記第１の一本鎖タンパク質と前記第２の一本鎖タンパク質が平行な向きでヘテロ二量体化する、すなわち前記第１のＶＬドメインが前記第１のＶＨドメインと会合し、前記第２のＶＬドメインが前記第２のＶＨドメインと会合する、項３４～３８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

４０．前記第１の一本鎖タンパク質と前記第２の一本鎖タンパク質が反平行な向きでヘテロ二量体化する、すなわち前記第１のＶＬドメインが前記第２のＶＨドメインと会合し、前記第２のＶＬドメインが前記第１のＶＨドメインと会合する、項３４～３８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

４１．前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号８３のアミノ酸配列を含み、特に配列番号８３のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、特に配列番号８４のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号８５のアミノ酸配列を含み、特に配列番号８５のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、特に配列番号８６のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号８７のアミノ酸配列を含み、特に配列番号８７のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、特に配列番号８８のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号８９のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号８９のアミノ酸配列を含み、特に配列番号８９のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号９０のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９０のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９０のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号９１のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９１のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９１のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号９２のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９２のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９２のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号９３のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９３のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９３のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９４のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９４のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９５のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９５のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９６のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９６のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号９７のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９７のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９７のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９８のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９８のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号９９のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号９９のアミノ酸配列を含み、特に配列番号９９のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１００のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１００のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１０１のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０１のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０２のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０３のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０３のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０４のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０４のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０５のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０６のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０６のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１０７のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０７のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０７のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０８のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０８のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１０９のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１０９のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１１０のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１０のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１０のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１１１のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１１のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１１のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１２のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１２のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１３のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１３のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１４のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１５のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１６のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１６のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１１７のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１７のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１７のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１１８のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１８のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１８のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１１９のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１１９のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２０のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２１のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１２２のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２２のアミノ酸配列からなる；または
前記第１の一本鎖タンパク質が、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１２３のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２３のアミノ酸配列からなり、かつ
前記第２の一本鎖タンパク質が、配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント一致するアミノ酸配列を含み、より詳細には、配列番号１２４のアミノ酸配列を含み、特に配列番号１２４のアミノ酸配列からなる、項３４～４０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

４２．前記抗体可変ドメインの少なくとも１つが親ウサギ抗体に由来するＣＤＲ領域を含む、項１～４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

４３．前記ＭＳＬＮ－ＢＤの少なくとも１つと前記ＣＤ３－ＢＤがそのそれぞれの抗原に同時に結合することができ、特に前記ＭＳＬＮ－ＢＤと前記ＣＤ３－ＢＤの両方がそのそれぞれの抗原に結合することができる、項１～４２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

４４．項１１～１５のいずれか１項に規定されているＭＳＬＮ結合ドメイン。

４５．項１～４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体または項４４のＭＳＬＮ結合ドメインをコードする１つの核酸配列または２つの核酸配列。

４６．項４５の１つの核酸配列または２つの核酸配列を含む１つのベクターまたは２つのベクター。

４７．項４６の１つのベクターまたは２つのベクターを含む１つの宿主細胞または複数の宿主細胞。

４８．項１～４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体または項４４のＭＳＬＮ結合ドメインを作製する方法であって、（ｉ）項４５の１つの核酸配列または２つの核酸配列、または項４６の１つのベクターまたは２つのベクターを用意し、前記１つの核酸配列または複数の核酸配列、または前記１つのベクターまたは複数のベクターを発現させ、発現系から前記多重特異性抗体または前記ＭＳＬＮ結合ドメインを回収する、または（ｉｉ）項４７による１つの宿主細胞または複数の宿主細胞を用意し、前記１つの宿主細胞または前記複数の宿主細胞を培養し；細胞培養物から前記多重特異性抗体または前記ＭＳＬＮ結合ドメインを回収することを含む方法。

４９．項１～４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。

５０．疾患、特にヒト疾患、より詳細にはがん、炎症性疾患、および自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療で使用するための、項１～４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

５１．前記疾患が、がん、特に中皮腫、膵臓がん、および卵巣がんから選択されるがんである、項５０による疾患の治療で使用するための、項１～４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

５２．疾患、特にヒト疾患、より詳細にはがん、炎症性疾患、および自己免疫疾患から選択されるヒト疾患を治療する方法であって、項１～４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を投与する工程を含む方法。

５３．前記疾患ががんであり、特に中皮腫、膵臓がん、および卵巣がんから選択されるがんである、項５２に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、ヒトＭＳＬＮを高レベルで発現しているＨ２２６細胞系に由来する細胞の形質膜への抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、ＰＲＯ２３０９、および参照抗体アマツキシマブの結合を示す。Ｈ２２６細胞系へのＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、ＰＲＯ２３０９、およびアマツキシマブの結合は競合ＥＬＩＳＡ（「ｃＥＬＩＳＡ」）で調べた。ｃＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰにカップルしたタンパク質 ＬとＨＲＰにカップルした抗ヒトＩｇＧ抗体をそれぞれ用い、Ｈ２２６細胞に結合したＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、ＰＲＯ２３０９、およびアマツキシマブを検出した。光学密度（ＯＤ_{４５０ｎｍ－６９０ｎｍ}）が抗体濃度（単位はｎＭ）の関数として表わされている。値が増加していく濃度だけをフィットさせたことに注意されたい。ＰＲＯ１７８３のＥＣ_５０値は参照抗体アマツキシマブで見られた値よりも大まかに６倍大きい。ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、ＰＲＯ２３０９のＥＣ_５０値はＰＲＯ１７８３と同じ範囲であるのに対し、ＰＲＯ１９２２のＥＣ_５０値はアマツキシマブの値に近い。

【0029】

【図2】図２は、カニクイザルＭＳＬＮを発現しているＣＨＯ細胞系からの細胞の形質膜への抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１７８３と参照抗体アマツキシマブの結合を示す。カニクイザルＭＳＬＮを発現しているＣＨＯ細胞系の形質膜へのＰＲＯ１７８３とアマツキシマブの結合はｃＥＬＩＳＡで調べた。ＰＲＯ１７８３とアマツキシマブの結合は、それぞれＨＲＰにカップルしたタンパク質 ＬとＨＲＰにカップルした抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。光学密度（ＯＤ_{４５０ｎｍ－６９０ｎｍ}）が抗体濃度（単位はｎＭ）の関数として表わされている。アマツキシマブのほかＰＲＯ１７８３がカニクイザルＭＳＬＮに結合することが実証された。

【0030】

【図3】図３は、抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、およびＰＲＯ１９２５によるヒトＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用の阻止を示す。ＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、およびアマツキシマブがヒトＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用を阻止する効力はｃＥＬＩＳＡで調べた。光学密度（ＯＤ_{４５０ｎｍ－６９０ｎｍ}）が抗体濃度（単位はｎＭ）の関数として表わされている。ＰＲＯ１７８３のＩＣ_５０は０．５ｎＭであったのに対し、参照抗体アマツキシマブはＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用をより強力に中和した（ＩＣ_５０＝０．０１４ｎＭ）。ＰＲＯ１９２５はＰＲＯ１７８３と似たＩＣ_５０を持つのに対し、ＰＲＯ１９２２のＩＣ_５０はアマツキシマブのＩＣ_５０に近い。

【0031】

【図4】図４はｈＭＳＬＮ／ｍＭＳＬＮのキメラバリアントを示す。濃い灰色で強調されているドメインは、対応するマウス配列で置換されたヒトＭＳＬＮ配列のセグメントである。セグメントＶＩは、形質膜に最も近いＭＳＬＮ細胞外ドメインのＣ末端部に対応する。セグメントＩとＩＩはＭＳＬＮの領域Ｉに対応し；セグメントＩＩＩとＩＶはＭＳＬＮの領域ＩＩに対応し；セグメントＶとＶＩはＭＳＬＮの領域ＩＩＩに対応する。

【0032】

【図5】図５は異なるＭＡＴＣＨ形式を示す。（左）反平行ＭＡＴＣＨ４形式のアーキテクチャであり、ここではそれぞれの鎖上の分割されたヘテロ二量体形成可変ドメインが、そのコグネイト可変ドメインとして相補的ＭＡＴＣＨ鎖上に、逆のＮ末端からＣ末端への順番に編成されている。（右）ｓｃＭＡＴＣＨ３形式の代表的なアーキテクチャであり、ここでは分割された可変ドメインが単一のペプチド鎖上に位置し、組み立てられて三重特異性分子になる。代替配置（ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ｓｃＦｖなど）もｓｃＭＡＴＣＨ３形式の考え方の範囲内である。ドメイン間の接続に使用したＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーが線で示されている。表１７は、作製された異なる分子に含まれるドメインと、分子内のその位置を記述している（ドメイン１～４）。請求項に規定されているように、ドメインの番号は結合ドメインの番号と相関していない。

【0033】

【図6】図６は、ヒト血清アルブミンの存在下におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に対するＰＲＯ２０００とＰＲＯ１８７２の細胞毒性の活性と効果を示す。（Ａ）高ＭＳＬＮ発現がん細胞（Ｈ２２６細胞）の特異的殺傷。高レベルのメソテリンを発現しているがん細胞では、ＰＲＯ２０００で観察された標的細胞殺傷力はＰＲＯ１８７２よりも７５倍優れている。（Ｂ）低ＭＳＬＮ発現中皮細胞（ＭｅＴ－５Ａ細胞）の特異的殺傷。低レベルのメソテリンを発現している健康な中皮組織（ＭｅＴ－５Ａ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）に由来する細胞では、１価メソテリン結合タンパク質ＰＲＯ１８７２が最高の殺傷力を示す。（Ｃ）高ＭＳＬＮ発現がん細胞（Ｈ２２６細胞）の存在下でのＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化と、（Ｄ）低ＭＳＬＮ発現中皮細胞（ＭｅＴ－５Ａ細胞）の存在下でのＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化。同様のデータが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化で観察された。ドナー＃１からのＰＢＭＣを使用した。標的細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞を、それぞれの分子とともにインキュベートし始めてから４０時間後にフローサイトメトリーによって分析し、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を利用してデータをフィットさせた。

【0034】

【図7】図７は、ヒト血清アルブミンの存在下におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に対するＰＲＯ２０００とＰＲＯ１８７２の細胞毒性の活性と効果を示す。（Ａ）低ＭＳＬＮ発現がん細胞（Ｈ２９２細胞）の特異的殺傷。低レベルのメソテリンを発現しているがん細胞では、ＰＲＯ１８７２で観察された標的細胞殺傷力はＰＲＯ２０００よりも７倍優れている。（Ｂ）中間ＭＳＬＮ発現がん細胞（ＨＰＡＣ細胞）の特異的殺傷。中間レベルのメソテリンを発現しているがん細胞では、１価と２価両方のメソテリンバインダＰＲＯ１８７２とＰＲＯ２０００が似た殺傷力を示す。（Ｃ）低ＭＳＬＮ発現がん細胞（Ｈ２９２細胞）の存在下でのＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化と、（Ｄ）中間ＭＳＬＮ発現がん細胞（ＨＰＡＣ細胞）の存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞活性化。同様のデータがＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化で観察されたが、例外としてＰＲＯ２０００はＨＰＡＣ細胞の存在下でＰＲＯ１８７２よりも明らかに強力であった（４倍）。ドナー＃１からのＰＢＭＣを使用した。標的細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞を、それぞれの分子とともにインキュベートし始めてから４０時間後にフローサイトメトリーによって分析し、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を利用してデータをフィットさせた。

【0035】

【図8】図８は、ｓＭＳＬＮの非存在下または存在下におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に対するＰＲＯ２０００とＰＲＯ１８７２の細胞毒性の活性と効果を示す。（Ａ～Ｃ）Ｈ２２６標的細胞に対するＰＲＯ２０００とＰＲＯ１８７２の細胞毒性活性。ｓＭＳＬＮの非存在下（Ａ）、５０ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下（Ｂ）、または５００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下（Ｃ）でのＨ２２６細胞の特異的殺傷。ＰＲＯ２０００の殺傷力は、ＰＲＯ１８７２と比べ、増加していく濃度のｓＭＳＬＮの影響をより受けにくい（Ｄ～Ｆ）同様のデータが、対応する条件におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化で観察される。Ｈ２２６細胞の存在下でｓＭＳＬＮなし（Ｄ）、５０ｎｇ／ｍｌのｓＭＬＳＮの存在下（Ｅ）、または５００ｎｇ／ｍｌのｓＭＬＳＮの存在下（Ｆ）におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化。ドナー＃２からのＰＢＭＣを使用した。標的細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞を、それぞれの分子とともにインキュベートし始めてから４０時間後にフローサイトメトリーによって分析し、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を利用してデータをフィットさせた。

【0036】

【図9】図９は、１００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの非存在下または存在下でのＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２１００、およびＰＲＯ１８７２の細胞毒性活性を示す：ｓＭＳＬＮの非存在下（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下（Ｂ）におけるＨ２２６細胞の特異的殺傷；ｓＭＳＬＮの非存在下（Ｃ）または１００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下（Ｄ）におけるＭｅｔ－５Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）の特異的殺傷。ドナー＃３からのＰＢＭＣを使用した。標的細胞を、それぞれの分子とともにインキュベートし始めてから４０時間後にフローサイトメトリーによって分析し、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を利用してデータをフィットさせた。

【0037】

【図10】図１０は、高ＭＳＬＮ発現がん細胞（Ｈ２２６細胞）、中間ＭＳＬＮ発現がん細胞（ＯＶＣＡＲ－３細胞）、および低ＭＳＬＮ発現がん細胞（Ｍｅｔ－５Ａ細胞）に対するＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、およびＰＲＯ２６６０の細胞毒性活性を示す。パリビズマブを陰性対照（「対照」）として使用した。

【0038】

【図11】図１１は、Ｈ２２６細胞の特異的殺傷（Ａ）、ＯＶＣＡＲ３細胞の特異的殺傷（Ｂ、左側）、およびＭｅｔ－５Ａ細胞の特異的殺傷（Ｂ、右側）に関するＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２６６０、および１価参照抗体ＰＲＯ１８７２のＥＣ_５０値のまとめを示す。

【0039】

【図12】図１２は、５０ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮまたは５００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの非存在下または存在下でのＨ２２６細胞に対するＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２６６０、および１価参照抗体ＰＲＯ１８７２の細胞毒性活性を示す。

【0040】

【図13】図１３は、５０ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮまたは５００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの非存在下または存在下でのＨ２２６細胞の特異的殺傷に関するＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２６６０、および１価参照抗体ＰＲＯ１８７２のＥＣ_５０値のまとめを示す。

【0041】

【図14-1】図１４は、細胞表面で異なるレベルのメソテリンを発現している標的細胞系に対するＭＡＴＣＨ分子の結合を示す。（Ａ）高メソテリン発現Ｈ２２６細胞、（Ｃ）中間メソテリン発現ＨＰＡＣ細胞、（Ｂ）低メソテリン発現Ｈ２９２がん細胞、および（Ｄ）低メソテリン発現中皮細胞ＭｅＴ－５Ａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）に対するＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２１００、およびＰＲＯ１８７２の結合と、（Ｅ）高メソテリン発現Ｈ２２６細胞、（Ｆ）中間メソテリン発現ＯＶＣＡＲ－３細胞、および（Ｇ）低メソテリン発現中皮細胞ＭｅＴ－５Ａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）に対するＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、およびＰＲＯ２６６０の結合をフローサイトメトリーによって評価し、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を利用してデータをフィットさせた。

【図14-2】図１４は、細胞表面で異なるレベルのメソテリンを発現している標的細胞系に対するＭＡＴＣＨ分子の結合を示す。（Ａ）高メソテリン発現Ｈ２２６細胞、（Ｃ）中間メソテリン発現ＨＰＡＣ細胞、（Ｂ）低メソテリン発現Ｈ２９２がん細胞、および（Ｄ）低メソテリン発現中皮細胞ＭｅＴ－５Ａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）に対するＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２１００、およびＰＲＯ１８７２の結合と、（Ｅ）高メソテリン発現Ｈ２２６細胞、（Ｆ）中間メソテリン発現ＯＶＣＡＲ－３細胞、および（Ｇ）低メソテリン発現中皮細胞ＭｅＴ－５Ａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）に対するＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、およびＰＲＯ２６６０の結合をフローサイトメトリーによって評価し、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を利用してデータをフィットさせた。

【0042】

【図15】図１５は、分子ＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ．ＣＤ３）を用いた治療の結果として対照条件と比べてＨ２９２異種移植片モデルで腫瘍増殖が阻害されることを示す。（Ａ）biＭＳＬＮ．ＣＤ３治療の存在下または非存在下での腫瘍増殖の縦断分析。線は中央値を示す。動物の皮下に１×１０^７個のＨ２９２腫瘍細胞と１×１０^７個のＰＢＭＣを同時に移植し、治療の静脈内投与を５日目に開始し、実験終了まで５日ごとに繰り返した。（Ｂ）散乱プロットとして示した４０日目のデータ。それぞれの点は１匹の動物に対応し、データは平均値と標準偏差で表わされている。二元配置反復測定分散分析の後、テューキーの多重比較検定を実施し、各データセットの有意性を、パリビズマブ対照（Ｃｔｒｌ、下方の線）、または治療なし（上方の線）と比べて示してある。ｎｓ＝有意でない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。灰色の点線はｙ軸の０を示す。

【0043】

【図16-1】図１６は、分子ＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ．ＣＤ３）を用いた治療の結果として対照条件と比べてヒト膵臓がん（ＨＰＡＣ）異種移植片モデルで腫瘍増殖が阻害されることを示す。（Ａ）増加していく濃度のＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ．ＣＤ３）の存在下での腫瘍増殖の縦断分析。線は中央値を示す。動物の皮下に１×１０^７個のＨＰＡＣ腫瘍細胞と２．５×１０^６個のＰＢＭＣを同時に移植し、治療の静脈内投与を５日目に開始し、実験の終了まで５日ごとに繰り返した。

【図16-2】（Ｂ）増加していく濃度のＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ．ＣＤ３）の存在下と、比較としての増加していく濃度のＰＲＯ１８７２（ＭＳＬＮ．ＣＤ３）の存在下での腫瘍増殖の対応する縦断分析。線は中央値を示す。パリビズマブを陰性対照として使用した。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；^{＊＊＊＊＊}ｐ＜０．００００１。（Ｃ）（Ｂ）に示されているグラフの中の最低用量だけの時間経過を示す部分図。

【発明を実施するための形態】

【0044】

既知のＭＳＬＮ／ＣＤ３ ｂｓＡｂに基づく免疫療法は、典型的には、用量制限毒性と、生体内での限られた有効性の問題を抱えている。そこで医学分野では、現在利用できるアプローチよりも用量制限毒性が少ないか存在せず、有効性がより大きい、ＭＳＬＮ／ＣＤ３ ｂｓＡｂに基づく新規な免疫療法が必要とされている。

【0045】

本発明により、２つのメソテリン結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と、ＣＤ３のための少なくとも１つの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）の組み合わせを含んでいて、高ＭＳＬＮ発現標的細胞の表面への効率的な局在化を可能にする一方で、低ＭＳＬＮ発現の健康な中皮細胞が受ける影響ははるかに少なくなるようにＭＳＬＮに対するＭＳＬＮ－ＢＤの親和性をチューニングした多重特異性抗体が提供される。２つのＭＳＬＮ－ＢＤが存在し、それらが、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを欠く明確でコンパクトな多ドメイン抗体アーキテクチャの中に埋め込まれていることに、よくバランスの取れたＭＳＬＮとＣＤ３の結合親和性が組み合わさることで、これら多重特異性抗体は、大きなオンターゲット効力を示す一方で、小さな腫瘍外副作用を示す。本発明の多重特異性抗体のコンパクトな２価設計（古典的なＩｇＧアーキテクチャに基づく２価多重特異性抗体では実現できない）のほか、そのよくチューニングされたＭＳＬＮとＣＤ３の結合親和性は、所望の選択性と有効性のプロファイルを実現するための決定的に重要な特徴である。

【0046】

本発明の多重特異性抗体は、アビディティ効果を活用することにより抗原密度に大きく依存したやり方で２つのＭＳＬＮ－ＢＤを通じて標的細胞に結合することができる。それと同時に、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ３－ＢＤを通じてＣＤ３に結合することによりＴ－細胞活性化を誘導し、腫瘍細胞を殺傷することができる。本発明の多重特異性抗体は、高ＭＳＬＮ発現細胞に対するその増強された選択性が効率的な腫瘍局在化へとつながるため、Ｔ細胞の非特異的活性化によって起こる用量制限毒性のない治療を可能にする。

【0047】

それに加え、驚くべきことに、高ＭＳＬＮ発現標的細胞を殺傷する効力は、患者の血清においてしばしば観察される高レベルの可溶性メソテリンの存在下で有意に低下しないことが見いだされた。さらに、（ａ）２つのＭＳＬＮ結合ドメインと、（ｂ）少なくとも１つのＣＤ３－ＢＤを含んでいて上記の設計と抗原－結合親和性を持つ本発明の多重特異性抗体は、実施例と添付の図面に示されているようなさらに有益な特性を示した。さらに、半減期を延長する抗ｈＳＡドメインをオプションで付加すると、便利な投与が可能になるだけでなく、腫瘍微小環境への分子の送達も促進される。

【0048】

したがって本発明の多重特異性抗体は、従来の組成物および療法と比べて明確な治療上の利点を提供する。

【0049】

特に断わらない限り、本明細書で使用されているあらゆる科学技術用語は、本発明の分野に関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持つ。

【0050】

「含む（comprising）」と「含有する(including)」という用語は本明細書では、特に断わらない限り、その制限がなく非限定的な意味で用いられる。したがってそのような後者の実施形態に関し、「含む（comprising）」という用語に、より狭い用語「からなる（consisting of）」が包含される。

【0051】

本発明を記述する文脈（特に以下の請求項の文脈）における「ａ」ならびに「ａｎ」と「その（ｔｈｅ）」という用語、および同様の言及は単数形と複数形の両方を含むと解釈されるが、本明細書にそうでないことが示されているか、文脈と明らかに矛盾する場合は別である。例えば「１つの細胞(a cell)」という用語には複数の細胞（その混合物が含まれる）が含まれる。化合物、塩などに複数形が用いられている場合には、これは、単一の化合物、塩なども意味すると理解される。

【0052】

１つの態様では、本発明は、
ａ）メソテリンに特異的に結合する２つの抗体ベースの結合ドメイン（ＭＳＬＮ－ＢＤ）と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗体ベースの結合ドメイン（ＣＤ３－ＢＤ）を含み；
免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まず、前記ＭＳＬＮ－ＢＤのそれぞれが、ＳＰＲによって測定するとき０．１～２０ｎＭの範囲の１価解離定数（Ｋ_Ｄ）でメソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する多重特異性抗体に関する。

【0053】

「抗体」などの用語は、本明細書では、抗体全体またはその単一の鎖；および任意の抗原－結合断片（すなわち「抗原－結合部分」）またはその単一の鎖；および抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域、またはＶＬ領域を含む分子（その非限定的な例に多重特異性抗体が含まれる）を包含する。天然の「全抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域とＶＬ領域はさらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へと分割することができ、間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。それぞれのＶＨとＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順番、すなわちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重鎖と軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主の組織または因子（その中に、免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）が含まれる）への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0054】

「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、本明細書では、重鎖定常領域のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを意味する。

【0055】

抗体の「結合ドメイン」、「その抗原結合断片」、「抗原－結合部分」などの用語は、本明細書では、完全な抗体の１つ以上の断片で、所与の抗原（例えばＭＳＬＮ、ＣＤ３、ｈＳＡ）に特異的に結合する能力を保持しているものを意味する。抗体の抗原結合機能は完全な抗体の断片によって実行することができる。いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインの選択は、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価断片）；Ｆ（ａｂ）２断片（ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片）；ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはｄＡｂ）、単一ドメイン重鎖抗体と単一ドメイン軽鎖抗体、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、サメからのＶＮＡＲ構造に基づく単一ドメイン抗体、および代替足場（非限定的な例に含まれるのは、アンキリンに基づくドメイン、フィノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、および抗体の定常領域に組み込まれる結合部位（例えばｆ－スター技術（Ｆ－スターのモジュール式抗体技術ＴＭ）である）に基づく結合ドメインからなるグループからなされる。本発明の結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）または単一の抗体可変ドメインであることが適切である。好ましい一実施形態では、本発明の結合ドメインは一本鎖鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。特別な実施形態では、抗原結合断片の２つの可変ドメインは、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片におけるように、ドメイン間ジスルフィド結合によって安定化され、特に前記ＶＨドメインは５１位（ＡＨｏ番号付け）に単一のシステイン残基を含み、前記ＶＬドメインは１４１位（ＡＨｏ番号付け）に単一のシステイン残基を含む。

【0056】

「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、多数ある周知のスキームのいずれかを利用して決定される境界を持つアミノ酸配列を意味する。そのようなスキームに含まれるのは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） ＪＭＢ ２７３， ９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）；ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ， ７， １３２－１３６ （１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ５５－７７ （２００３））（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）によって記載されているスキーム；およびＨｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９ （２００１） ６５７－６７０に記載されている番号付けスキーム（「ＡＨｏ」番号付け）である。例えば古典的形式に関しては、Ｋａｂａｔのもとでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、９５～１０２（ＨＣＤＲ３）であり；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａのもとでは、ＶＨの中のＣＤＲアミノ酸の番号は２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）であり；ＶＬの中のアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。ＣＤＲの定義をＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方の定義と組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨではアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）からなり、ヒトＶＬではアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴのもとでは、ＶＨの中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は、ほぼ２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５１～５７（ＨＣＤＲ２）、および９３～１０２（ＨＣＤＲ３）であり、ＶＬの中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は、ほぼ２７～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）である（「Ｋａｂａｔ」に従う番号付け）。ＩＭＧＴのもとでは、抗体のＣＤＲは、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎを用いて決定することができる。

【0057】

本発明の文脈では、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによって提案された番号付けシステム（「ＡＨｏ」）を使用する（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９ （２００１） ６５７－６７０）が、そうでない特別な言及がある場合は別である。特に、以下の残基がＡＨｏ番号付けスキームに従ってＣＤＲと定義される：ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１とも呼ばれる）：Ｌ２４－Ｌ４２；ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２とも呼ばれる）：Ｌ５８－Ｌ７２；ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる）：Ｌ１０７－Ｌ１３８；ＨＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１とも呼ばれる）：Ｈ２７－Ｈ４２；ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２とも呼ばれる）：Ｈ５７－Ｈ７６；ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる）：Ｈ１０８－Ｈ１３８。明確にするため、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによる番号付けシステムは、天然の抗体（異なるＶＨサブファミリーとＶＬサブファミリーの両方とＣＤＲ、特にＣＤＲ）に見られる長さの多様性を考慮しており、配列内にギャップを提供する。したがって所与の抗体可変ドメインでは、通常、１～１４９位のすべてがアミノ酸残基によって占められることはない。

【0058】

「結合特異性」という用語は、本明細書では、個々の抗体が１つの抗原決定基と反応し、異なる抗原決定基とは反応しない能力を意味する。本明細書では、「特異的に結合する」または「に対して特異的」であるという表現は、生物分子を含む異種集団の分子の存在下で標的の存在を決定づける測定可能かつ再現可能な相互作用（標的と抗体の間の結合など）を意味する。例えば標的（エピトープが可能）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも大きな親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長くこの標的に結合する抗体である。「特異的結合」は、最も一般的な形態（そして規定された基準に言及されていないとき）では、例えば本分野で知られている特異性アッセイに従って調べるときに抗体が、興味ある標的と、無関係な分子とを識別する能力を意味する。このようなアッセイの非限定的な例に含まれるのは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験、およびペプチド走査である。例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。数値化は、標準的発色（例えば二次抗体とセイヨウワサビの過酸化物、およびテトラメチルベンジジンと過酸化水素）によって実施することができる。あるウエルにおける反応を例えば４５０ｎｍでの光学密度によって数値にする。典型的なバックグラウンド（＝マイナスの反応）は約０．１ＯＤになり；典型的なプラスの反応は約１ＯＤになろう。これは、プラスの数値とマイナスの数値の比が１０倍以上になりうることを意味する。さらなる一例では、ＳＰＲアッセイを実施することができ、そのときバックグラウンドとシグナルの間の少なくとも１０倍、特に少なくとも１００倍の差が特異的結合を示す。典型的には、結合特異性の判断は、単一の参照分子を用いるのではなく、約３～５個の無関係な分子のセット（粉乳、トランスフェリンなど）を用いることによってなされる。

【0059】

本発明の抗体は単離された抗体であることが適切である。「単離された抗体」という用語は、本明細書では、異なる抗原特異性を持つ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えばＭＳＬＮとＣＤ３に特異的に結合する単離された抗体は、ＭＳＬＮとＣＤ３以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まず、ＭＳＬＮ、ＣＤ３、およびヒト血清アルブミンに特異的に結合する単離された抗体は、ＭＳＬＮ、ＣＤ３、およびヒト血清アルブミン以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。

【0060】

本発明の抗体はモノクローナル抗体であることが適切である。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書では、アミノ酸配列が実質的に同じである抗体、または同じ遺伝源に由来する抗体を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定の１つまたは複数のエピトープに対する結合の特異性と親和性を示す。

【0061】

本発明の抗体の非限定的な例に含まれるのは、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体である。

【0062】

「キメラ抗体」（またはその抗原結合断片）という用語は、（ａ）定常領域またはその一部が変更、置換、または交換されて、抗原結合部位（可変領域）が、異なっているか変化したクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域に連結されるか、新たな特性をそのキメラ抗体に与えるまったく異なる分子（例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬など）に連結された抗体分子（またはその抗原結合断片）；または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なっているか変化した抗原特異性を持つ可変領域で変更、置換、または交換された抗体分子（またはその抗原結合断片）である。例えばマウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域で置換することによって改変することができる。キメラ抗体は、ヒト定常領域で置換されているため、抗原の認識におけるその特異性を保持することができるが、ヒトでは原初のマウス抗体と比べて抗原性が低下している。

【0063】

「ヒト抗体」（またはその抗原結合断片）という用語は、本明細書では、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を持つ抗体（とその抗原－結合断片）を含むことが想定されている。さらに、抗体が定常領域を含む場合には、定常領域もそのようなヒト配列（例えばヒト生殖細胞系列配列、またはヒト生殖細胞系列配列の変異バージョン）に由来する。本発明のヒト抗体とその抗原－結合断片は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムな、または部位特異的な突然変異誘発、または生体内での体細胞変異によって導入される変異）を含有している可能性がある。ヒト抗体のこの定義では、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が特に除外される。ヒト抗体は本分野で知られているさまざまな技術を利用して作製することができ、その技術に含まれるのは、ファージ提示ライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２７：３８１ （１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２２：５８１ （１９９１））である。やはりヒトモノクローナル抗体の調製に利用できるのは、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ．７７ （１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １４７（ｌ）：８６－９５ （１９９１）に記載されている方法である。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ５： ３６８－７４ （２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するよう改変されているが内在性遺伝子座が機能不能にされたトランスジェニック動物（例えば免疫化されたゼノマウス（例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関するアメリカ合衆国特許第６，０７５，１８１号と第６，１５０，５８４号を参照されたい））に抗原を投与することによって調製できる。例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されるヒト抗体に関するＬｉ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０３：３５５７－３５６２ （２００６）も参照されたい。

【0064】

「ヒト化」抗体（またはその抗原結合断片）は、本明細書では、非ヒト抗体の反応性を保持している一方でヒトにおける免疫原性がより小さい抗体（またはその抗原結合断片）である。これは、例えば非ヒトＣＤＲ領域を保持しつつ抗体の残部をそのヒト対応部分（すなわち定常領域のほか、可変領域のフレームワーク部分）で置き換えることによって実現できる。追加のフレームワーク領域改変は、ヒトフレームワーク配列内のほか、別の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列内で実施することができる。本発明のヒト化抗体は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムな、または部位特異的な突然変異誘発によって、または生体内での体細胞変異によって導入される変異、または安定性または製造を促進する保存的置換）を含有している可能性がある。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１－６８５５， １９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４４：６５－９２， １９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４－１５３６， １９８８；Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．， ２８：４８９－４９８， １９９１；およびＰａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．， ３１：１６９－２１７， １９９４を参照されたい。ヒト操作技術の他の非限定的な例に含まれるのは、アメリカ合衆国特許第５，７６６，８８６号に開示されているＸｏｍａ技術である。

【0065】

「組み換えヒト化抗体」という用語は、本明細書では、組み換え手段によって調製された、発現された、作製された、または単離されたあらゆるヒト抗体を包含する（ヒト化抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ）から単離された抗体と、１つのヒト免疫グロブリン遺伝子の全体または一部のスプライシングにより配列を他のＤＮＡ配列にすることを含む他の任意の手段によって調製された、発現された、作製された、または単離された抗体など）。

【0066】

本発明の抗体またはその抗原結合断片はヒト化されていることが適切である。本発明の抗体またはその抗原結合断片はヒト化されていてウサギ由来のＣＤＲを含むことが適切である。

【0067】

「多重特異性抗体」という用語は、本明細書では、少なくとも２つ以上の異なる標的（例えばＭＳＬＮとＣＤ３）上の２つ以上の異なるエピトープに結合する抗体を意味する。「多重特異性抗体」という用語に、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性、および六重特異性が含まれる。「二重特異性抗体」という用語は、本明細書では、２つの異なる標的（例えばＭＳＬＮとＣＤ３）上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を意味する。「三重特異性抗体」という用語は、本明細書では、３つの異なる標的（例えばＭＳＬＮ、ＣＤ３、およびｈＳＡ）上の３つの異なるエピトープに結合する抗体を意味する。

【0068】

「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することのできるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常は分子の化学的に活性な表面基（アミノ酸または糖側鎖など）からなり、通常は特定の三次元構造特性のほか、特定の電荷特性を持つ。「立体的」エピトープと「直線状」エピトープは、変性溶媒の存在下で後者ではなく前者への結合が失われることにより識別される。

【0069】

「立体的エピトープ」という用語は、本明細書では、ポリペプチド鎖が折り畳まれて天然のタンパク質を形成するときに表面上に集まる抗原のアミノ酸残基を意味する。

【0070】

「直線状エピトープ」という用語は、タンパク質の一次アミノ酸配列（連続的）に直線的に沿ってタンパク質と相互作用分子（抗体など）の間で起こる相互作用の点のすべてを持つエピトープを意味する。

【0071】

「認識する」という用語は、本明細書では、対応する立体的エピトープを見つけてそれと相互作用する（例えば結合する）その抗体抗原結合断片を意味する。

【0072】

本明細書では、「親和性」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原の間の相互作用の強さを意味する。各抗原性部位内で、抗体「アーム」の可変領域は多数の部位で弱い非共有力を通じて抗原と相互作用する；相互作用が大きいほど親和性は強くなる。

【0073】

「親和性」は一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用をすべて合計した強度を意味する。特に断わらない限り、本明細書では、「親和性」、「に結合する」、「に結合する」または「への結合」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体断片と抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の親和性を意味する。ある分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表わすことができる。親和性は本分野で知られている一般的な方法（本明細書に記載されている方法が含まれる）によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般に抗原により早く結合し、より長く結合した状態に留まる傾向がある。親和性を測定する多彩な方法が本分野で知られており、そのいずれかを本発明の目的で利用することができる。親和性（すなわち結合）の強度を測定するための具体的な説明的で代表的な実施形態は以下に記載する。

【0074】

「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」、または「Ｋｏｎ」という用語は、本明細書では、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を意味することが想定されているのに対し、「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」、または「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書では、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を意味することが想定されている。一実施形態では、「Ｋ_Ｄ」という用語は、本明細書では、Ｋａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を意味することが想定されており、モル濃度（Ｍ）として表わされる。本発明による「Ｋ_Ｄ」または「Ｋ_Ｄ値」または「ＫＤ」または「ＫＤ値」は、一実施形態では、表面プラズモン共鳴アッセイを利用して測定する。組み換えヒトメソテリン（ヒトＭＳＬＮ）と組み換えカニクイザルＭＳＬＮ（カニクイザルＭＳＬＮ）に対する親和性は段落［０１６８］に記載されているようにして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって求めた。組み換えヒトＣＤ３に対する親和性は段落［０１９６］に記載されているようにしてＳＰＲによって測定した。

【0075】

本発明の多重特異性抗体はＭＳＬＮ特異性に関して２価であることが適切である。

【0076】

本発明の多重特異性抗体はＣＤ３特異性に関して１価、２価、または多価であることが適切である。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はＣＤ３特異性に関して２価である。好ましい一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はＣＤ３特異性に関して１価である。

【0077】

「多価抗体」という用語は２以上の価数を持つ単一の結合分子を意味し、ここに「価数」は同じ標的分子上のエピトープに結合する抗原－結合部分の数として記述される。そのため単一の結合分子が標的分子上の２つ以上の結合部位に結合することができる。多価抗体の非限定的な例に含まれるのは、２価抗体、３価抗体、４価抗体、５価抗体などである。

【0078】

「１価抗体」という用語は、本明細書では、標的分子（ＣＤ３など）上の単一のエピトープに結合する抗体を意味する。また、「結合ドメイン」または「１価結合ドメイン」という用語は、本明細書では、標的分子（ＣＤ３など）上の単一のエピトープに結合する結合ドメインを意味する。

【0079】

「２価抗体」という用語は、本明細書では、２つの同じ標的分子（ＭＳＬＮ標的分子など）上の２つのエピトープに結合する抗体を意味する。

【0080】

本発明の多重特異性抗体の２つのＭＳＬＮ－ＢＤは、ＭＳＬＮの細胞外部分の任意の領域（例えばＭＳＬＮの領域Ｉ、領域ＩＩ、および／または領域ＩＩＩ）に結合する。本発明の多重特異性抗体の２つのＭＳＬＮ－ＢＤは、ＭＳＬＮの領域Ｉおよび／または領域ＩＩに、特にＭＳＬＮの領域Ｉに結合することが好ましい。領域Ｉは、ＭＳＬＮの部分のうちで、ＭＳＬＮが付着する細胞表面から最も遠位にある部分である。

【0081】

本発明の多重特異性抗体の２つのＭＳＬＮ－ＢＤは、ＭＳＬＮ標的分子上の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合する。本発明の多重特異性抗体の２つのＭＳＬＮ－ＢＤは、ＭＳＬＮ標的分子上の同じエピトープに結合することが好ましい。「同じエピトープ」という用語は、本明細書では、同じタンパク質の表面にあって抗体に特異的に結合することのできる個々のタンパク質決定基で、それぞれが同じであるもの、すなわち分子の同じ化学的に活性な表面基（同じ三次元構造特性のほか、同じ電荷特性を持つアミノ酸または糖側鎖など）からなるものを意味する。「異なるエピトープ」という用語は、本明細書で特定のタンパク質標的との関係で用いられるとき、抗体に特異的に結合することのできる同じタンパク質上の個々のタンパク質決定基で、それぞれが同じでないもの、すなわち分子の同じでない化学的に活性な表面基（異なる三次元構造特性のほか、異なる電荷特性を持つアミノ酸または糖側鎖など）からなるものを意味する。これらの異なるエピトープは、重複する可能性、または重複していない可能性がある。

【0082】

本発明の発明者らは、今や驚くべきことに、例えば三重特異性分子（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６５、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７が、フローサイトメトリーによって求めたときに健康なＭｅＴ－５Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９４４４）よりも約７倍大きいＭＳＬＮ発現レベルを持つ標的細胞を高効率に、そして前記標的細胞と前記ＭｅＴ－５Ａ細胞に対するＴ細胞駆動細胞毒性アッセイにおいて求めたときに前記ＭｅＴ－５Ａ細胞の殺傷に関するＥＣ_５０よりも少なくとも２５倍小さいＥＣ_５０で殺傷できることを見いだした（例えば表３１参照）。したがってＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７は高ＭＳＬＮ発現標的分子に関して非常に大きな殺傷力を示すが健康な細胞に向けられるその殺傷力ははるかに小さいため、ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７を用いた治療のための治療濃度域が潜在的に広いことを示している。それとは対照的に、前記高ＭＳＬＮ発現標的細胞と前記健康なＭｅｔ－５Ａ細胞の殺傷に関してＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７のＭＳＬＮ－ＢＤよりも５倍超優れた親和性（Ｋ_Ｄ）を持つ１つのＭＳＬＮ－ＢＤを含む三重特異性参照分子ＰＲＯ１８７２（ＭＳＬＮ_低ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）の効力は有意に異なってはいない。この知見は、がん患者の治療で本発明の多重特異性抗体を用いるための治療濃度域が顕著に広がることを示す。それに加え、本発明の発明者らは驚くべきことに、フローサイトメトリーによって求めたときに前記健康なＭｅＴ－５Ａ細胞よりもほぼ７倍大きいＭＳＬＮ発現レベルの標的細胞の殺傷に関する三重特異性分子ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）のＥＣ_５０値が、前記標的細胞に対するＴ細胞駆動細胞毒性アッセイで求めたとき、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性メソテリン（ｓＭＳＬＮ）の存在下では６倍超に増加することがなく、５００ｎｇ／ｍｌの可溶性メソテリン（ｓＭＳＬＮ）の存在下では４０倍を超えて増加することがないことを見いだした。他方で、前記標的細胞の殺傷に関する三重特異性参照分子ＰＲＯ１８７２（ＭＳＬＮ_低ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）のＥＣ_５０値は、５０ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下でほぼ８倍に、５００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下で７５倍超に増大した。したがって高ＭＳＬＮ発現標的細胞に対する三重特異性分子ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７の大きな殺傷力は、高濃度のｓＭＳＬＮによる影響がほんのわずかである。他方、健康な細胞にとっての三重特異性分子ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７の殺傷力は、高濃度のｓＭＳＬＮの存在下でさらに低下する（データは示さない）。これは、臨床でこれらを使用するための治療濃度域がｓＭＳＬＮの存在によってさらに広がることを示す。これは重要な１つの知見である。なぜなら高血漿レベルの可溶性メソテリン関連タンパク質（ＳＭＲＰ）が患者でしばしば観察されるからである。発明者らは、ＰＲＯ２０００のＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化効力に関して同様の有利な結果を得た。上記の知見はより一層の驚きである。というのも全部で４つの結合ドメインが複雑な多標的、多細胞の状況で立体的に、またはそれ以外のやり方で互いに阻害することなく機能的なままであるというのは先験的には予想できないと考えられるからである。

【0083】

本発明の多重特異性抗体で用いるのに適したＭＳＬＮ－ＢＤは、本開示に提示されている結合ドメインである。本発明のメソテリン－ＢＤの非限定的な例に含まれるのは、表１に配列が掲載されているヒト化ＭＳＬＮ－結合ドメインである。

【0084】

本発明の多重特異性抗体で用いるのに適したＣＤ３－ＢＤは、本開示に提示されている結合ドメインである。本発明のＣＤ３－ＢＤの非限定的な例に含まれるのは、表３に配列が掲載されているヒト化ＣＤ３－結合ドメインである。

【0085】

本発明の多重特異性抗体は２つの異なる特異性（ＭＳＬＮとＣＤ３）を持つことが適切である。本発明の多重特異性抗体は、ＭＳＬＮに関して２価の二重特異性抗体であることが適切である。本発明の多重特異性抗体は、さらなる１つの特異性（三重特異性抗体）または複数の特異性（四重特異性または五重特異性または六重特異性抗体）を含むことができる。一実施形態では、多重特異性抗体は二重特異性である（ＭＳＬＮとＣＤ３）。別の一時間形態では、多重特異性抗体は三重特異性である（ＭＳＬＮ、ＣＤ３、およびｈＳＡ）。

【0086】

本発明の抗体は免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まないことが適切である。

【0087】

同じかより小さな分子量で特異性／機能の数を増やすには、抗体断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片や、他の抗体断片など）を含む抗体を使用することが有利である。これらのより小さな分子は、抗体全体の抗原－結合活性を保持していることに加え、免疫グロブリン分子全体と比べて改善された組織侵入と薬物動態特性も示す可能性がある。このような断片は免疫グロブリン全体よりも多くの利点を示すように見える一方で、生体内の長い半減期を与えるＦｃドメインを欠いているため血清からのクリアランス速度の増大に悩まされてもいる（Ｍｅｄａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：２２１１－２２１７）。分子量がより小さな分子はより効率的に標的組織（例えば固形がん）の中に侵入するため、同じかより少ない用量で有効性が改善される見通しがある。

【0088】

発明者らは驚くべきことに、本発明の多重特異性抗体にヒト血清アルブミン結合ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）を付加しても、他の結合ドメインがそのそれぞれの標的に結合する能力を妨害しないことを見いだした。この知見はより一層の驚きである。というのも全部で４つの結合ドメインが複雑な多標的、多細胞の生体内状況で立体的に、またはそれ以外のやり方で互いに阻害することなく機能的なままであるというのは先験的には予想できないと考えられるからである。

【0089】

本発明の多重特異性抗体はヒト血清アルブミンに対する特異性を持つさらなる結合ドメインを含みうることが適切である。一実施形態では、多重特異性抗体は、（ｉ）２つのＭＳＬＮ－ＢＤ；（ｉｉ）少なくとも１つのＣＤ３－ＢＤ；および（ｉｉｉ）少なくとも１つのｈＳＡ－ＢＤを含む。

【0090】

「ｈＳＡ」という用語は特に、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０２７６８を持つヒト血清アルブミンを意味する。ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）はヒト血清の中に豊富な６６．４ｋＤａのタンパク質（全タンパク質の５０％）であり、５８５個のアミノ酸からなる（Ｓｕｇｉｏ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ， Ｖｏｌ． １２， １９９９， ４３９－４４６）。多機能性ｈＳＡタンパク質は、多数の代謝産物（脂肪酸など）、金属イオン、ビリルビン、およびいくつかの薬の結合と輸送を可能にする構造を伴っている（Ｆａｎａｌｉ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌ．３３， ２０１２， ２０９－２９０）。血清中のＨＳＡの濃度はほぼ３．５～５ｇ／ｄＬである。アルブミン結合抗体とその断片は、例えばそれと複合体を形成する薬またはタンパク質の生体内血清半減期を延ばすのに使用することができる。

【0091】

いくつかの実施形態では、ｈＳＡ－ＢＤはモノクローナル抗体または抗体断片に由来する。

【0092】

本発明の多重特異性抗体で用いるのに適したｈＳＡ－ＢＤは、本開示に提示されている結合ドメインである。本発明のｈＳＡ－ＢＤの非限定的な例に含まれるのは、表４に配列が掲載されているヒト化ｈＳＡ結合ドメインである。

【0093】

特に本発明のｈＳＡ－ＢＤはヒト血清アルブミンに特異的に結合する。

【0094】

本発明の多重特異性抗体で用いるのに適した他のｈＳＡ－ＢＤは、（ｉ）血清アルブミンに結合するポリペプチド（例えばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １２：７５０－７５６；欧州特許第ＥＰ０４８６５２５号；アメリカ合衆国特許第６２６７９６４号；ＷＯ２００４／００１０６４；ＷＯ２００２／０７６４８９；およびＷＯ２００１／４５７４６を参照されたい）；（ｉｉ）抗血清アルブミン結合単一可変ドメイン（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ｖｏｌ ２１， ５， ｐｐ２８３－２８８、ＷＯ２００４／００３０１９、ＷＯ２００８／０９６１５８、ＷＯ２００５／１１８６４２、ＷＯ２００６／０５９１０５６、およびＷＯ２０１１／００６９１５に記載）；（ｉｉｉ）抗血清アルブミン抗体（ＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２、およびＷＯ２０１１／０８６０９１に記載）からなるグループから選択される抗体を含む、またはその抗体に由来する。

【0095】

本発明の他の可変ドメインは、変異しているがそれでも表１、３、および４に記載されている配列内に示されているＣＤＲ領域とＣＤＲ領域内で少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントが一致するアミノ酸配列を含有する。本発明の他の可変ドメインは、表１、３、および４に記載されている配列内に示されているＣＤＲ領域と比べたとき１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸がＣＤＲ領域内で変異している変異アミノ酸配列を含有する。

【0096】

本発明の結合ドメインのＶＨドメインはＶＨ３ファミリーまたはＶＨ４ファミリーに属することが適切である。一実施形態では、本発明の結合ドメインはＶＨ３ファミリーに属するＶＨドメインを含む。本発明の文脈では、「ＶＨｘファミリー（またはＶＬｘファミリー）に属する」という表現は、フレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ３が前記ＶＨｘファミリー（またはＶＬｘ、それぞれ）と最大の相同性を示すことを意味する。ＶＨファミリーとＶＬファミリーの例は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６ （２０００） ５７－８６、またはＷＯ２０１９／０５７７８７に与えられている。ＶＨ３ファミリーに属するＶＨドメインの特別な一例は配列番号１２９によって表わされ、ＶＨ４ファミリーに属するＶＨドメインの特別な一例は配列番号１３０によって表わされる。特に、配列番号１２９からのフレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ３は、ＶＨ３ファミリーに属する（表７、領域が非太字で記されている）。ＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、本明細書では、配列番号１２９のＦＲ１～ＦＲ３と少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より詳細には少なくとも９５％配列一致するＦＲ１～ＦＲ３を含むＶＨであることが適切である。ＶＨ３配列の代替例とＶＨ４配列の例は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６ （２０００） ５７－８６、またはＷＯ２０１９／０５７７８７に見いだすことができる。本発明のｈＳＡ－ＢＤは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３（特にＶκ１またはＶκ３フレームワーク、特にＶκ１フレームワークＦＲ１～３）と、フレームワークＦＲ４（Ｖκ ＦＲ４とＶλ ＦＲ４から選択され、特にＶλ ＦＲ４が選択される）を含むことが適切である。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１～３のほか、代表的なＶλ ＦＲ４が配列番号１３１の中に示されている（表７、ＦＲ領域は非太字で記されている）。Ｖκ１配列の代替例と、Ｖκ２、Ｖκ３、またはＶκ４配列の例は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６ （２０００） ５７－８６に見いだすことができる。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１～３は、ＦＲ１～３に対応していて配列番号１３１からのアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５パーセント一致するアミノ酸配列を含む（表７、ＦＲ領域は非太字で記されている）。適切なＶλ ＦＲ４は、単一のシステイン残基を含む配列番号１３２～配列番号１３８と配列番号１３９の中に示されており、特に第２の単一のシステインが存在する場合には、ドメイン間ジスルフィド結合の形成のため、対応するＶＨ鎖に、特にＶＨの５１位（ＡＨｏ番号付け）に存在する。一実施形態では、本発明のＶＬドメインは、配列番号１３２～配列番号１３９のいずれかから選択されたアミノ酸配列（特に配列番号１３２または１３９）と少なくとも７０、８０、または９０パーセント一致するＶλ ＦＲ４を含む。

【0097】

本発明の結合ドメインは、表１、３、および４に掲載されているＶＨドメインを含む。本発明の結合ドメインは、表１、３、および４の１つに掲載されているＶＨアミノ酸配列を含むことが適切であり、そこではフレームワーク配列（例えばＣＤＲではない配列）の中の２０個以下のアミノ酸が変異している（変異は、さまざまな非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。本発明の結合ドメインは、表１、３、および４の１つに掲載されているＶＨアミノ酸配列を含むことが適切であり、そこではフレームワーク配列（例えばＣＤＲではない配列）の中の１５個以下のアミノ酸、特に１０個以下のアミノ酸、特に５個以下のアミノ酸が変異している（変異は、さまざまな非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。本発明の他の結合ドメインは、変異しているがそれでも表１、３、および４の１つに記載されている対応する配列の中に示されているＶＨ領域（表１、３、および４に示されている配列の１つの少なくとも５～１４０位（ＡＨｏ番号付け）、特に少なくとも３～１４５位を含むＶＨドメインが含まれる）と、ＶＨ領域内の少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントが一致するアミノ酸を含有する。

【0098】

特に、本発明の結合ドメインは、表１、３、および４の１つに掲載されているＶＬドメインを含む。本発明の結合ドメインは、表１、３、および４の１つに掲載されているＶＬアミノ酸配列を含むことが適切であり、そこではフレームワーク配列（例えばＣＤＲではない配列）内の２０個以下のアミノ酸が変異している（変異は、さまざまな非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。本発明の結合ドメインは、表１、３、および４の１つに掲載されているＶＬアミノ酸配列を含むことが適切であり、そこではフレームワーク配列（例えばＣＤＲではない配列）の中の１５個以下のアミノ酸、特に１０個以下のアミノ酸、特に５個以下のアミノ酸が変異している（変異は、さまざまな非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。本発明の他の結合ドメインは、変異しているがそれでも表１、３、および４の１つに記載されている対応する配列の中に示されているＶＬ領域（表１、３、および４に示されている配列の１つの少なくとも５～１４０位（ＡＨｏ番号付け）、特に少なくとも３～１４５位を含むＶＬドメインが含まれる）と、ＶＬ領域内の少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントが一致するアミノ酸を含有する。

【0099】

本発明の文脈では、「本発明の結合ドメイン」という表現は、そのままの、すなわち多重特異性の文脈とは独立な結合ドメインと、多重特異性コンストラクトに含まれる結合ドメイン（例えば二重特異性、三重特異性、または四重特異性コンストラクトに含まれる結合ドメインの１つ）の両方、特に後者に関係する。

【0100】

本発明の結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、およびＳＴＡＢからなるグループから選択されることが適切である。

【0101】

本発明の結合ドメインはｓｃＦｖ抗体断片であることが適切である。

【0102】

本発明の多重特異性抗体は適切な任意の形式にすることができる。

【0103】

多重特異性抗体の結合ドメインは機能可能に連結されていることが適切である。本発明の多重特異性抗体の結合ドメインはそのそれぞれの抗原または受容体に同時に結合することができる。「同時に」という用語は、この関連で用いられるときには、ＭＳＬＮ－ＢＤとＣＤ３－ＢＤの少なくとも１つの同時結合を意味する。特別な場合、例えば細胞表面に高密度のＭＳＬＮを持つ標的細胞の場合には、３つの結合ドメイン、すなわちＭＳＬＮ－ＢＤとＣＤ３－ＢＤの両方が同時に結合することも可能であろう。

【0104】

本発明の多重特異性抗体は２つのＭＳＬＮ－ＢＤと少なくとも１つのＣＤ３－ＢＤを含み、前記ＭＳＬＮ－ＢＤと前記ＣＤ３－ＢＤは互いに機能可能に連結されている。

【0105】

「機能可能に連結された」という表現は、本明細書では、２つの分子（例えばポリペプチド、ドメイン、結合ドメイン）が、それぞれが機能的活性を保持するようにして付加していることを示す。２つの分子は、直接的に付加していても（例えばリンカーを介して、部分を介して、リンカーを介して部分に）間接的に付加していても「機能可能に連結されている」ことが可能である。「リンカー」という用語は、場合により結合ドメインまたは本発明の抗体断片の間に位置するペプチドまたは他の部分を意味する。多数の戦略を利用して分子を互いに共有結合させることができる。その非限定的な例に含まれるのは、タンパク質またはタンパク質ドメインの間のＮ末端とＣ末端のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介した連結、および化学的架橋試薬を介した連結である。この実施形態の１つの態様では、リンカーは、組み換え技術またはペプチド合成によって生じるペプチド結合である。２つのポリペプチド鎖が接続されるある特定のケースに適したリンカーの選択はさまざまなパラメータに依存しており、パラメータの非限定的な例に含まれるのは、２つのポリペプチド鎖の性質（例えばそれらが自然にオリゴマー化するかどうか）、わかるのであれば接続されるＮ末端とＣ末端の間の距離、および／またはタンパク質の分解と酸化に対するリンカーの安定性である。さらに、リンカーは可撓性を与えるアミノ酸残基を含有することができる。

【0106】

本発明の文脈では、「ポリペプチドリンカー」という用語は、２つのドメインを接続するペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖からなるリンカーを意味し、各ドメインはリンカーの一端に付加している。ポリペプチドリンカーは、互いに対して正しい立体配座を取って所望の活性が保持されるように２つの分子を連結させるのに十分な長さを持たねばならない。特別な実施形態では、ポリペプチドリンカーは２～３０個のアミノ酸残基（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸残基）の連続的な鎖を持つ。それに加え、ポリペプチドリンカーに含めるために選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性に顕著に干渉することのない特性を示さねばならない。したがってリンカーペプチドは全体として電荷を示してはならない。電荷があると、ポリペプチドの活性と適合しないことで、または内部折り畳みに干渉することで、または単量体の１つ以上の中のアミノ酸残基と結合を形成したりそれ以外の相互作用をしたりすることで、受容体単量体ドメインの結合を大きく妨げると考えられるからである。特別な実施形態では、ポリペプチドリンカーは構造が簡単なポリペプチドである。有用なリンカーに含まれるのは、グリシン－セリンまたはＧＳリンカーである。「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーは、当業者にはわかるように、グリシンとセリンが直列になったポリマー（例えば（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、および（ＧＧＧＳ）_ｎが含まれる（ただしｎは少なくとも１の整数））、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および他の可撓性リンカー（シェイカーカリウムチャネルのための接続鎖など）と他の多彩な可撓性リンカーを意味する。グリシン－セリンポリマーが好ましい。なぜならこれらアミノ酸の両方とも比較的構造が簡単であるため、構成要素間の中性の接続鎖として機能できるからである。第２に、セリンは親水性であるため、球状グリシン鎖になりうるものを可溶化することができる。第３に、同様の鎖が、組み換えタンパク質（一本鎖抗体など）のサブユニットの接合に有効であることが示されている。

【0107】

多重特異性抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域を含まない本分野で知られている適切な任意の多重特異性（例えば少なくとも二重特異性）形式から選択される形式であることが適切であり、その非限定的な例に含まれるのは、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）_２）、Ｆａｂ－Ｆｖ_２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジ－ディアボディ、ＣＯＤＶ、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ－Ｆｖ_２、またはヘテロ二量体Ｆｃドメイン以外のヘテロ二量体化ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合したＣＯＤＶ、およびＭＡＴＣＨ（ＷＯ２０１６／０２０２４５７；Ｅｇａｎ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ＭＡＢＳ ９ （２０１７） ６８－８４に記載）、およびＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙ技術によって調製される二重特異性ＩｇＧ）（ＭＡｂｓ． ２０１７ Ｆｅｂ／Ｍａｒ；９（２）：１８２－２１２． ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１２６８３０７）に基づく形式である。多重特異性抗体は、一本鎖ディアボディ（ｓｃＤｂ）－ｓｃＦｖまたはＭＡＴＣＨであることが特に適している。

【0108】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はＣＨ１領域および／またはＣＬ領域を含まない。

【0109】

別の一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、トリアボディ、およびトリボディからなるリストから選択される形式である。本明細書で用いるのに特に適しているのはｓｃＤｂ－ｓｃＦｖであり、特に前記ＭＳＬＮ－ＢＤと前記ＣＤ３－ＢＤの１つはｓｃＤｂの形態であり、第２のＭＳＬＮ－ＢＤは前記ｓｃＤｂに機能可能に連結されたｓｃＦｖである。

【0110】

「ディアボディ」という用語は、２つの抗原－結合部位を持つ抗体断片を意味し、その断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）の中のＶＬに接続されたＶＨを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間のペア形成が可能であるには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアを形成し、２つの抗原－結合部位を生み出す。ディアボディは２価または二重特異性であることが可能である。ディアボディは例えば欧州特許第ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４ （２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４－６４４８ （１９９３）に、より十分に記載されている。トリアボディとテトラボディはＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４ （２００３）にも記載されている。

【0111】

二重特異性ｓｃＤｂ（特に二重特異性単量体ｓｃＤｂ）は、リンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３によって接続された２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）またはその断片と２つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）またはその断片を特に含み、その順番は、ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＬＢ－Ｌ２－ＶＨＢ－Ｌ３－ＶＬＡ、ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＬＢ－Ｌ３－ＶＬＡ、ＶＬＡ－Ｌ１－ＶＬＢ－Ｌ２－ＶＨＢ－Ｌ３－ＶＨＡ、ＶＬＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＬＢ－Ｌ３－ＶＨＡ、ＶＨＢ－Ｌ１－ＶＬＡ－Ｌ２－ＶＨＡ－Ｌ３－ＶＬＢ、ＶＨＢ－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＬＢ、ＶＬＢ－Ｌ１－ＶＬＡ－Ｌ２－ＶＨＡ－Ｌ３－ＶＨＢ、またはＶＬＢ－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＨＢであり、その中のＶＬＡドメインとＶＨＡドメインが合わさって第１の抗原のための抗原結合部位を形成し、ＶＬＢとＶＨＢが合わさって第２の抗原のための抗原結合部位を形成する。

【0112】

リンカーＬ１は特にアミノ酸が２～１０個のペプチド、より詳細にはアミノ酸が３～７個、最も詳細にはアミノ酸が５個であり、リンカーＬ３は特にアミノ酸１～１０個、より詳細にはアミノ酸２～７個、最も詳細にはアミノ酸５個のペプチドである。特別な実施形態では、リンカーＬ１および／またはＬ３は、四個（４）のグリシンアミノ酸残基と一個（１）のセリンアミノ酸残基からなる１つまたは２つのユニットを含む（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ただしｎ＝１または２、特にｎ＝１）。

【0113】

中央のリンカーＬ２は、特に１０～４０個のアミノ酸、より詳細には１５～３０個のアミノ酸、最も詳細には２０～２５個のアミノ酸からなるペプチドである。特別な実施形態では、前記リンカーＬ２は、四個（４）のグリシンアミノ酸残基と一個（１）のセリンアミノ酸残基からなる１つ以上のユニットを含む（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ただしｎ＝１、２、３、４、５、６、７、または８、特にｎ＝４）。

【0114】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はｓｃＤｂ－ｓｃＦｖである。「ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ」という用語は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片が可撓性Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーによって一本鎖ディアボディ（ｓｃＤｂ）に融合した抗体形式を意味する。一実施形態では、前記可撓性Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、２～４０個のアミノ酸（例えば２～３５、２～３０、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０個のアミノ酸、特に１０個のアミノ酸）からなるペプチドである。特別な実施形態では、前記リンカーは、四個（４）のグリシンアミノ酸残基と一個（１）のセリンアミノ酸残基からなる１つ以上のユニットを含む（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ただしｎ＝１、２、３、４、５、６、７、または８、特にｎ＝２）。

【0115】

本発明の一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＷＯ２０１６／０２０２４５７；Ｅｇａｎ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ＭＡＢＳ ９ （２０１７） ６８－８４に記載されているＭＡＴＣＨ形式である。特にこの実施形態では、本発明の多重特異性抗体はＭＡＴＣＨ３形式またはＭＡＴＣＨ４形式である。

【0116】

本発明の多重特異性抗体は、本分野で知られている任意の便利な抗体作製法を利用して作製することができる（例えば二重特異性コンストラクトの生成に関してはＦｉｓｃｈｅｒ， Ｎ． ＆ Ｌｅｇｅｒ， Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４ （２００７） ３－１４を；二重特異性ディアボディとタンデムｓｃＦｖに関してはＨｏｒｎｉｇ， Ｎ． ＆ Ｆａｒｂｅｒ－Ｓｃｈｗａｒｚ， Ａ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９０７ （２０１２）７１３－７２７と、ＷＯ９９／５７１５０を参照されたい）。本発明の二重特異性コンストラクトの調製に適した方法の具体例は、特にＧｅｎｍａｂ（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１０ （２０１３） ５１４５－５１５０参照）技術とＭｅｒｕｓ（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０６ （２０１０） ７４１－７５０参照）技術にさらに含まれている。機能性抗体Ｆｃ部分を含む二重特異性抗体を作製する方法も本分野で周知である（例えばＺｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ８６ （１９９４） １２７－１３４）と；Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １２１ （１９８６） ２１０－２２８を参照されたい）。

【0117】

これらの方法は、典型的には、例えば骨髄腫細胞を、所望の抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞とハイブリドーマ技術を利用して融合させること（例えばＹｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ｕｎｉｔ ２．５， ２００６参照）により、または組み換え抗体工学（レパートリークローニング、またはファージ提示／酵母提示）（例えばＣｈａｍｅｓ ＆ Ｂａｔｙ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １８９ （２０００） １－８参照）によりモノクローナル抗体を生成させ、既知の分子クローニング技術を利用して２つ以上の異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメインまたはその断片または部分を組み合わせて二重特異性または多重特異性のコンストラクトを得ることを含む。

【0118】

本発明の多重特異性分子は、本分野で知られている方法を利用して構成要素となる結合特異性との複合体にすることによって調製できる。例えば二重特異性分子のそれぞれの結合特異性を別々に生成させた後、互いに複合体化することができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるときには、多彩なカップリング剤または架橋剤を共有結合による複合体のために利用することができる。架橋剤の例に含まれるのは、プロテインＡ、カルボジイミド、５－アセチル－チオ酢酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、および４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－ｌ－カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ－ＳＭＣＣ）である（例えばＫａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６０：１６８６；Ｌｉｕ， Ｍ Ａ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：８６４８を参照されたい）。他の方法に含まれるのは、Ｐａｕｌｕｓ， １９８５ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ． Ｍｉｔｔ． Ｎｏ．７８， １１８－１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３）、およびＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：２３６７－２３７５）に記載されている方法である。複合体形成剤はＳＡＴＡとスルホ－ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， １１１）から入手できる。

【0119】

結合特異性が複数の抗体であるとき、それらを２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって複合体にすることができる。特別な一実施形態では、複合体化の前にヒンジ領域を改変して奇数（例えば１個）のスルフヒドリル残基が含まれるようにする。

【0120】

あるいは２つ以上の結合特異性を同じベクターにコードし、同じ宿主細胞の中で発現させて組み立てることができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ Ｘ ｍＡｂ、ｍＡｂ Ｘ Ｆａｂ、Ｆａｂ Ｘ Ｆ （ａｂ’）_２、またはリガンドＸ Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の多重特異性抗体として、１つの一本鎖抗体と１つの結合決定基を含む一本鎖分子、または２つの結合決定基を含む一本鎖多重特異性抗体が可能である。多重特異性抗体は少なくとも２つの一本鎖分子を含むことができる。多重特異性抗体と分子を調製するための方法は、例えばアメリカ合衆国特許第５，２６０，２０３号；アメリカ合衆国特許第５，４５５，０３０号；アメリカ合衆国特許第４，８８１，１７５号；アメリカ合衆国特許第５，１３２，４０５号；アメリカ合衆国特許第５，０９１，５１３号；アメリカ合衆国特許第５，４７６，７８６号；アメリカ合衆国特許第５，０１３，６５３号；アメリカ合衆国特許第５，２５８，４９８号；およびアメリカ合衆国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。

【0121】

多重特異性抗体の、その特異的標的への結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらアッセイのぞれぞれは一般に、興味ある複合体に対して特異的な標識した試薬（例えば抗体）を用いることによって特に興味あるタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。

【0122】

さらなる１つの態様では、本発明により、本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインをコードする核酸が提供される。このような核酸配列は、哺乳類細胞において発現するように最適化することができる。

【0123】

「核酸」という用語は、本明細書では「ポリヌクレオチド」という用語と交換可能に用いられ、一本鎖または二本鎖の形態になった１つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドとそのポリマーを意味する。この用語には、既知のヌクレオチド類似体を含有するか、修飾された骨格残基または連結を含有する核酸が包含され、その核酸は、合成、天然、および非天然であり、参照核酸と似た結合特性を持ち、参照ヌクレオチドと似たやり方で代謝される。このような類似体の非限定的な例に含まれるのは、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホン酸メチル、キラル－メチルホスホレート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）である。特に断わらない限り、ある特定の核酸配列には、その保存的修飾バリアント（例えば縮重コドン置換）および相補的配列のほか、明示的に示された配列も、暗黙のうちに包含される。具体的には、下に詳述するように、縮重コドン置換は、１つ以上の選択されたコドン（またはすべてのコドン）の３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることによって実現できる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１， １９９１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８， １９８５；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８， １９９４）。

【0124】

本発明により、上記の多重特異性抗体のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸分子が提供される。これら核酸分子によってコードされるポリペプチドは、適切な発現ベクターによって発現されると、本発明の多重特異性抗体の１つまたは複数の抗原結合能力を示すことができる。

【0125】

本発明では、表１、３、および４に示されている本発明の多重特異性抗体の結合ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドと、通常は全部で３つのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。暗号は縮重しているため、多彩な核酸配列が免疫グロブリンのアミノ酸配列のそれぞれをコードすることになる。

【0126】

ポリヌクレオチド配列は、本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインをコードする既存の配列（例えば下記の実施例に記載されている配列）のデノボ固相ＤＮＡ合成またはＰＣＲ突然変異誘発によって生成させることができる。核酸の直接的な化学合成は、本分野で知られている方法（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９， １９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ．， ２２：１８５９， １９８１のジエチルホスホロアミダイト法；およびアメリカ合衆国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法など）によって実現することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異導入は、例えばＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｈ． Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ （Ｅｄ．）， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｎ．Ｙ．， １９９２；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ， １９９０；Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：９６７， １９９１；およびＥｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７， １９９１に記載されているようにして実施することができる。

【0127】

本発明では、本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインを生成させる発現ベクターと宿主細胞も提供される。

【0128】

「ベクター」という用語は、連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することのできるポリヌクレオチド分子を意味することが想定されている。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、中に追加ＤＮＡセグメントを連結させることのできる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結させることができる。あるベクターは、そのベクターが導入される宿主細胞の中での自律的複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターと、エピソーマル哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーマル哺乳類ベクター）は、宿主細胞の中に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、そのことによって宿主ゲノムとともに複製される。

【0129】

さらに、あるベクターは、そのベクターに機能可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターを本明細書では「組み換え発現ベクター」（または簡単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。プラスミドは最も一般的に用いられる形態のベクターであるため、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に用いることができる。しかし本発明は、同等な機能を果たすそのような他の形態の発現ベクター（ウイルスベクターなど（例えば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス））を包含することが想定されている。この特別な文脈では、「機能可能に連結された」という表現は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を意味する。典型的にはそれは、転写された配列に対する転写調節配列の機能的関係を意味する。例えばプロモーター配列またはエンハンサー配列がコード配列に機能可能に連結されているのは、それが適切な宿主細胞または他の発現系の中でコード配列の転写を刺激するか変化させる場合である。一般に、転写された配列に機能可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、その転写された配列と物理的に連続である、すなわちシス作用性である。しかしいくつかの転写調節配列（エンハンサーなど）は、物理的に連続していたり、コード配列（その転写が転写調節配列によって増強される）の近くに位置していたりする必要はない。

【0130】

さまざまな発現ベクターを用いて多重特異性抗体鎖または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスに基づく発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を用いて哺乳類宿主細胞の中で抗体を生成させることができる。非ウイルスベクターと非ウイルス系に含まれるのは、プラスミド、エピソーマルベクター（典型的にはタンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを有する）、およびヒト人工染色体（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５， １９９７参照）である。例えば哺乳類（例えばヒト）細胞の中でＭＳＬＮ結合ポリヌクレオチドとポリペプチドを発現させるのに有用な非ウイルスベクターに含まれるのは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）、ＭＰＳ Ｖベクター、および他のタンパク質を発現させるための本分野で知られている他の多くのベクターである。有用なウイルスベクターに含まれるのは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターである。Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．、上記文献；Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４９：８０７， １９９５；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：１４３， １９９２を参照されたい。

【0131】

発現ベクターの選択は、ベクターを中で発現させる予定の宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、多重特異性抗体の鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターと他の調節配列（例えばエンハンサー）を含有する。一実施形態では、誘導性プロモーターを用いて誘導条件のとき以外は挿入された配列の発現を阻止する。誘導性プロモーターに含まれるのは、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターである。形質転換された生物の培養物は非誘導条件下でコード配列の集団を偏りなく増殖させることができ、その発現産物は宿主細胞によってよりよく忍容される。多重特異性抗体の鎖または断片の効率的な発現には、プロモーターに加え、他の調節エレメントも必要とされる可能性、または望まれる可能性がある。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドンと、隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含有する。それに加え、発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーを含めることによって増強させることができる（例えばＳｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５， １９９４と；Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５３：５１６， １９８７を参照されたい）。例えばＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを用いて哺乳類宿主細胞における発現を増大させることができる。

【0132】

発現ベクターは、挿入された本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインの配列によってコードされるポリペプチドと融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列の位置も提供することができる。より多くの場合に、挿入された本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインの配列がシグナル配列に連結された後、ベクターに組み込まれる。多重特異性抗体の軽鎖と重鎖の可変ドメインの結合ドメインをコードする配列を受け入れるのに用いるベクターが定常領域またはその一部もコードすることがときどきある。

【0133】

「組み換え宿主細胞」（または簡単に「宿主細胞」）という用語は、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。このような用語は、その特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も意味することが想定されていると理解すべきである。変異または環境の影響である改変があとに続く世代に発生する可能性があるため、そのような子孫は、実際、親細胞と同じではない可能性があるが、それでも本明細書で用いられている「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。

【0134】

本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインを取り込んで発現させる宿主細胞として、原核細胞または真核細胞が可能である。大腸菌（E. coli）は本発明のポリヌクレオチドのクローニングと発現にとって有用な１つの原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主に含まれるのは、桿菌（bacilli）（枯草菌（Bacillus subtilis）など）、および他の腸内細菌科（サルモネラ、セラチア、およびさまざまなシュードモナスの種など）である。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞に適合した発現制御配列（例えば複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。それに加え、任意の数の多彩な周知のプロモーター（ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ－ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダからのプロモーター系など）が存在することになろう。プロモーターは、典型的には、場合によってオペレータ配列とともに発現を制御しており、転写と翻訳を開始させて完了させるためリボソーム結合部位配列などを有する。他の微生物（酵母など）を用いて本発明のＭＳＬＮ結合ポリペプチドを発現させることもできる。昆虫細胞をバキュロウイルスベクターと組み合わせて使用することもできる。

【0135】

一実施形態では、哺乳類宿主細胞を用いて本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインを発現させ、生成させる。例えばその宿主細胞として、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現しているハイブリドーマ細胞系、または外来性発現ベクターを有する哺乳類細胞系が可能である。その宿主細胞には、動物細胞またはヒト細胞で、死ぬ運命にある正常な任意のもの、または不死である正常または異常な任意のものが含有される。例えば完全な免疫グロブリンを分泌することのできる多数の適切な宿主細胞系が開発されており、その中には、ＣＨＯ細胞系、さまざまなＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換されたＢ細胞、およびハイブリドーマが含まれる。ポリペプチドを発現させるため哺乳類組織細胞培養物を使用することが、例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ， ＦＲＯＭ ＧＥＮＥＳ ＴＯ ＣＬＯＮＥＳ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｎ．Ｙ．， １９８７の中で一般に議論されている。哺乳類宿主細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなど（例えばＱｕｅｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ８９：４９－６８， １９８６参照））と、必要な情報処理部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終止配列など）を含むことができる。これら発現ベクターは通常、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的、細胞のタイプ特異的、段階特異的、および／または調整可能または調節可能であるものが可能である。有用なプロモーターの非限定的な例に含まれるのは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩ プロモーター、構成的ＭＰＳ Ｖプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および本分野で知られているプロモーター－エンハンサーの組み合わせである。

【0136】

興味あるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は細胞宿主のタイプに応じて異なる。例えば塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞では一般に利用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔を他の細胞宿主では用いることができる。（一般にＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．、上記文献を参照されたい）。他の方法に含まれるのは、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソームを媒介とした形質転換、注入と微量注入、バリスティック法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ， Ｃｅｌｌ ８８：２２３， １９９７）、薬剤で増強されたＤＮＡの取り込み、および生体外形質導入である。組み換えタンパク質を長期にわたって高収率で産生させるには、安定な発現が望ましいことがしばしばあろう。例えば本発明の多重特異性抗体またはその断片またはその結合ドメインを安定に発現する細胞系は、ウイルス複製起点または内在性発現エレメントと選択マーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを用いて調製することができる。ベクターを導入した後、細胞を強化培地の中で１～２日間増殖させてからその培地を選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を与えることであり、その存在により、導入された配列を選択培地の中で発現させることのできる細胞の増殖が可能になる。耐性がある安定にトランスフェクトされた細胞は、細胞のタイプに合った組織培養技術を利用して増殖させることができる。したがって本発明により、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作製する方法が提供され、この方法は、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養し、そのことによって本開示の前記抗体またはその断片を発現させる工程を含む。

【0137】

１つの態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体またはその結合ドメインまたはその断片を作製する方法であって、本発明の多重特異性抗体またはその結合ドメインまたはその断片をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養する工程を含む方法に関する。特に本発明は、本発明の多重特異性抗体またはその結合ドメインまたはその断片を作製する方法であって、（ｉ）本発明の多重特異性抗体またはその結合ドメインをコードする１つの核酸配列または２つの核酸配列、または本発明の多重特異性抗体またはその結合ドメインをコードする１つのベクターまたは２つのベクターを用意し、前記１つの核酸配列または前記２つの核酸配列を、または前記１つのベクターまたは前記２つのベクターを発現させ、前記多重特異性抗体または前記結合ドメインを発現系から回収すること、または（ｉｉ）本発明の多重特異性抗体またはその結合ドメインをコードする核酸を発現する１つの宿主細胞または複数の宿主細胞を用意し、前記１つの宿主細胞または前記複数の宿主細胞を培養し；細胞培養物から前記多重特異性抗体または前記結合ドメインを回収することを含む方法に関する。

【0138】

さらなる１つの態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。医薬として許容可能な担体は、組成物を増強するか安定化する、または組成物の調製を容易にする。医薬として許容可能な担体に含まれるのは、生理学的に適合している溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤と吸収遅延剤などである。

【0139】

本発明の医薬組成物は本分野で知られている多彩な方法によって投与することができる。投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じてさまざまである。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下にすること、または標的の部位の近くになすことができる。医薬として許容可能な担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊椎、または表皮への投与（例えば注射または輸液による）に適していなければならない。投与経路に応じ、活性化合物（すなわち本発明の多重特異性抗体）は、その化合物を不活化する可能性がある酸の作用と他の天然条件から保護する材料で被覆することができる。

【0140】

本発明の医薬組成物は、本分野で周知であって定型的に実践される方法に従って調製することができる。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ２０ｔｈ ｅｄ．， ２０００と；Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照されたい。医薬組成物はＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。典型的には、本発明の多重特異性抗体の治療に有効な用量または有効用量が本発明の医薬組成物で使用される。本発明の多重特異性抗体は当業者に知られている従来法によって製剤化されて医薬として許容可能な剤型になる。投与計画を調整して所望の最適な応答（例えば治療応答）を提供する。例えばボーラスを単回投与すること、いくつかに分割した用量を時間をかけて投与すること、または用量を治療状況の要請によって示されるようにして比例的に減少または増加させることができる。非経口組成物は、投与が容易で用量が一定になるという理由で単位剤型にすることが特に有利である。単位剤型は、本明細書では、治療する対象のための単位用量として適した物理的に離散したユニットを意味する；それぞれの単位は、必要な医薬担体と組み合わさって所望の治療効果が生じるように計算したあらかじめ決められた量の活性化合物を含有する。

【0141】

本発明の医薬組成物の中の活性成分の実際の用量レベルを変えて、特定の患者、組成物、および投与様式において、患者にとって毒になることなく所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量が得られるようにすることができる。選択される用量レベルは多彩な薬物動態因子に依存しており、その中に含まれるのは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用している特定の化合物の排泄速度、治療期間、他の薬、使用される具体的な組成物と組み合わせて使用される化合物および／または材料、治療中の患者の年齢、性別、体重、全体的な健康、および以前の病歴などの因子である。

【0142】

本発明の多重特異性抗体は通常は複数の機会に投与される。単回投与の間隔は、週、月、または年が可能である。間隔は、患者で本発明の多重特異性抗体の血中レベルを測定することによって示される数値に応じて不規則にすることもできる。あるいは本発明の多重特異性抗体は持続放出製剤として投与することができ、その場合にはより少ない頻度で投与する必要がある。用量と頻度は、患者の体内における抗体の半減期に応じて変わる。一般にヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与の用量と頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかに応じて変わる可能性がある。予防の用途では、比較的低用量が、比較的頻度が少なくなる間隔で長期にわたって投与される。患者によっては、残りの人生を通じて治療を受け続ける。治療の用途では、疾患の進行が減速するか停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または全面的な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的多い用量が必要とされることがときどきある。その後は、患者に予防投与計画で投与することができる。

【0143】

１つの態様では、本発明は、薬として使用するための本発明の多重特異性抗体または本発明の医薬組成物に関する。適切な一実施形態では、本発明により、増殖性疾患（特にがん）の治療を必要とする対象でその治療に用いるための多重特異性抗体または医薬組成物が提供される。

【0144】

別の１つの態様では、本発明により、増殖性疾患（特にがん）を治療するための薬の製造で使用するための多重特異性抗体または医薬組成物が提供される。

【0145】

別の１つの態様では、本発明は、増殖性疾患（特にがん）の治療を必要とする対象でそれを治療するための、多重特異性抗体または医薬組成物の利用に関する。

【0146】

さらなる１つの態様では、本発明は、増殖性疾患（特にがん）の治療を必要とする対象でそれを治療するための薬の製造における多重特異性抗体または医薬組成物の利用に関する。

【0147】

別の１つの態様では、本発明は対象を治療する方法に関するものであり、この方法は、その対象に治療に有効な量の本発明の多重特異性抗体を投与することを含む。適切な一実施形態では、本発明は、対象の増殖性疾患（特にがん）を治療する方法に関するものであり、この方法は、その対象に治療に有効な量の本発明の多重特異性抗体を投与することを含む。

【0148】

「対象」という用語にはヒトと非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物に含まれるのは、すべての脊椎動物、例えば哺乳類と非哺乳類（非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など）である。注記した場合を除き、「患者」または「対象」という用語は本明細書では交換可能に用いられる。

【0149】

「治療」、「治療している」、「治療する」、「治療された」などの用語は、本明細書では、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患および／またはその疾患に帰することのできる有害な効果の部分的治癒または完全治癒、または疾患進行の遅延という意味で治療的である可能性がある。「治療」は、本明細書では、哺乳類（例えばヒト）における疾患のあらゆる治療をカバーし、その中に含まれるのは、（ａ）疾患の阻害、すなわちその発達の停止；および（ｂ）疾患の緩和、すなわち疾患の退行を引き起こすことである。

【0150】

「治療に有効な量」または「有効な量」という表現は、疾患を治療するため哺乳類または他の対象に投与されたとき、疾患のためのそのような治療が効果をもたらすのに十分な薬剤の量を意味する。「治療に有効な量」は、薬剤、疾患とその重症度、および治療する対象の年齢、体重などに応じて変わるであろう。

【0151】

一実施形態では、増殖性疾患はがんである。「がん」という用語は、異常な細胞の急速かつ制御されない増殖を特徴とする疾患を意味する。がん細胞は、局所的に広がること、または血流とリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることができる。「腫瘍」と「がん」という用語は本明細書では交換可能に用いられ、例えば両方の用語には、固形と液体、例えばびまん性または循環している腫瘍が包含される。本明細書では、「がん」または「腫瘍」という用語には、悪性化前のがんと腫瘍のほか、悪性のがんと腫瘍が含まれる。「がん」という用語は、本明細書では広いスペクトルの腫瘍を意味するのに使用され、その中にはすべての固形悪性腫瘍と血液悪性腫瘍が含まれる。このような腫瘍の非限定的な例に含まれるのは、良性または悪性の（特に悪性の）悪性腫瘍、固形腫瘍、脳腫瘍、腎臓がん、肝臓がん、副腎がん、膀胱がん、乳がん、胃がん（例えば胃腫瘍）、食道がん、卵巣がん、子宮頸がん、大腸がん、直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん（例えば非小細胞肺がんと小細胞肺がん）、膣がん、甲状腺がん、黒色腫（例えば切除不能な、または転移した黒色腫）、腎細胞癌腫、肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸がん（特に大腸癌または結腸直腸腺腫）、頭頸部の腫瘍、子宮内膜がん、カウデン症候群、レルミット－デュクロ病、バナヤン－ゾナナ症候群、前立腺肥大症、新形成（特に上皮的特徴のもの、好ましくは乳癌または扁平上皮癌）、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（例えばフィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病）、急性リンパ性白血病（例えばフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞骨髄腫、ホジキンリンパ腫、白血病、およびこれらの任意の組み合わせである。好ましい一実施形態では、がんは、中皮腫、膵臓がん、および卵巣がんから選択されるがんである。

【0152】

本発明の多重特異性抗体、または本発明の組成物は、固形腫瘍の増殖だけでなく液体腫瘍の増殖も阻害する。さらなる一実施形態では、増殖性疾患は固形腫瘍である。「固形腫瘍」という用語は特に、乳がん、卵巣がん、大腸がん、直腸がん、前立腺がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（特に胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん）、子宮頚がん、肺がん（例えば非小細胞肺がんと小細胞肺がん）、および頭頸部の腫瘍を意味する。さらに、腫瘍のタイプと使用する具体的な組み合わせに応じ、腫瘍体積の減少を得ることができる。本発明の多重特異性抗体または本発明の組成物は、がんを持つ対象における転移による腫瘍の広がりと、微小転移の増殖または発達を阻止するのにも適する。

配列リスト（ＡＨｏ番号付けスキームに従って指定される変異、Ｎｕｍａｂ ＣＤＲの定義に従って定義されるＣＤＲ）

【表1-1】

【表1-2】

【表2】

【表3】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【表5-6】

【表5-7】

【表6】

【表7】

【0153】

本出願の文章の全体を通じ、明細書の文章（例えば表１～７）と配列リストの間に相違がある場合には、明細書の文章が優先する。

【0154】

明確にするため別々の実施形態の文脈で記述されている本発明のある特徴は、単一の実施形態の中で組み合わせて提示してもよいことがわかる。逆に、簡潔にするため単一の実施形態の文脈で記述されている本発明のさまざまな特徴は、別々に、または適切な任意の部分的組み合わせで提示してもよい。本発明に関する実施形態のあらゆる組み合わせが本発明によって明確に包含され、それぞれのあらゆる組み合わせが、個別かつ明示的に開示されているかのようにして本明細書に開示されている。それに加え、さまざまな実施形態とその要素のあらゆる部分的組み合わせも、本発明によって明確に包含され、そのようなそれぞれのあらゆる部分的組み合わせが、個別かつ明示的に開示されているかのようにして本明細書に開示されている。

【0155】

本発明が、本明細書に記載されている具体的な実施形態による範囲に限定されることはない。実際、本発明のさまざまな改変は、本明細書に記載されているもの以外も、上記の記述から当業者には明らかになろう。そのような改変は添付の請求項の範囲に入るものとする。

【0156】

本明細書で引用されているあらゆる特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の材料は、それぞれの特許法のもとで可能な範囲で参照によって本明細書に組み込まれている。

【0157】

以下の実施例は上記の発明を説明しているが、本発明の範囲をいかなるやり方でも制限することは意図していない。関係分野の当業者に知られている現状の他の試験モデルも、請求項に記載された本発明の有益な効果を明らかにすることができる。

【実施例】

【0158】

実施例１：抗ＭＳＬＮ分子の生成と薬力学的特徴づけ
第１の工程では、ＭＳＬＮへの中間から低い親和性を持つ抗ＭＳＬＮ抗体断片を同定すべきである。抗ＭＳＬＮ抗体断片は、多重特異性抗体形式（特にＭＡＴＣＨ３形式とＭＡＴＣＨ４抗体形式）で使用するのに適していなければならない。

【0159】

本発明の抗ＭＳＬＮ結合ドメインの同定、選択、および生成
本発明のヒト化ｓｃＦｖ抗ＭＳＬＮ結合ドメインの同定、選択、ヒト化、および作製を、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４６３０（参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されているｓｃＦｖ抗ＣＤ３結合ドメインと同様にして実施した。

【0160】

所望の特性（特に所望の親和性）を持つ同定されたモノクローナル抗体のいくつかから、以下の手続きに従ってｓｃＦｖ分子を作製した。

【0161】

ヒト化と発現：
λキャップ付きＶｋ１／ＶＨ３ Ｆｖ足場へのＣＤＲ移植と場合による特定のウサギフレームワーク残基の移植により、ウサギ抗体をヒト化した。それぞれのｓｃＦｖは、Ｎ末端-ＶＬ-ペプチドリンカー-ＶＨ-Ｃ末端の向き（ペプチドリンカー：（Ｇ_４Ｓ）_４）で設計した。

【0162】

組み換えアミノ酸配列を新たに合成し、ＣＨＯｇｒｏ一過性トランスフェクションキット（Ｍｉｒｕｓ）を用いてＣＨＯ－Ｓ細胞の中でｓｃＦｖコンストラクトを発現させた。培養物を発現の５～７日後（細胞生存率７０％未満）に３７℃で遠心分離によって回収し、タンパク質を透明になった培養物上清からプロテインＬまたはＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、必要な場合にはその後にＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による最終精製工程を続けた。

【0163】

品質管理：
製造された材料を品質管理するため、標準的分析法（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥなど）を利用した。

【0164】

ＳＥ－ＨＰＬＣ
ＳＥ－ＨＰＬＣ分析サンプルを、Ｓｈｏｄｅｘ（商標）（昭和電工、カタログ番号５５４-１７４０） ＫＷ４０２．５-４Ｆカラム（ｓｃＦｖ分析のため）またはＳｈｏｄｅｘ（商標）（昭和電工、カタログ番号５５４-１７４１） ＫＷ４０３- ４Ｆカラム（ＭＡＴＣＨタンパク質分析）のいずれかの中を、ランニングバッファー（Ｓｈｏｄｅｘ（商標）ＫＷ４０２．５-４Ｆ：２５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ（カタログ番号Ａ １０４５）、ｐＨ６．０；Ｓｈｏｄｅｘ（商標）ＫＷ４０３-４Ｆ：３５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（カタログ番号Ａ ３９０５）、１５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４（カタログ番号Ａ１３７２）、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）とともに０．３５ｍＬ／分の流速で通過させた。溶離したタンパク質はλ＝２８０ｎｍでの吸光度によって検出した。

【0165】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
タンパク質の素性と分解をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって評価し、変性したタンパク質をＭｉｎｉＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号４５６９０３６）に装填し、電気泳動されたタンパク質をクマシーブリリアントブルー溶液で染色した。分子量基準：ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（商標）Ｐｌｕｓ（カタログ番号１６１－０３／０４）。

【0166】

生成したｓｃＦｖ分子の製造データが表８にまとめられている。

【0167】

抗メソテリンｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、ＰＲＯ２３０９（低親和性）、およびＰＲＯ１９２２の薬力学的特徴づけ
ヒト化抗メソテリンｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７８３の主要な薬力学的特性を評価した（ＳＰＲでの組み換えヒトＭＳＬＮと組み換えカニクイザルＭＳＬＮへの結合動態と親和性の測定、ｃＥＬＩＳＡでのヒトＭＳＬＮ発現細胞系とカニクイザルＭＳＬＮ発現細胞系の形質膜への結合の評価、およびｃＥＬＩＳＡでのＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６の阻止の評価が含まれる）。それに加え、ヒト化抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、およびＰＲＯ２３０９の主要な薬力学的特性を評価した（ＳＰＲでの組み換えヒトＭＳＬＮへの結合動態と親和性測定、ｃＥＬＩＳＡでのヒトＭＳＬＮ発現細胞系の形質膜への結合の評価、およびｃＥＬＩＳＡでのＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６の阻止の評価（ＰＲＯ１９２２とＰＲＯ１９２５）が含まれる）。結果が表９～１３にまとめられている。

【0168】

ＳＰＲにおけるヒトＭＳＬＮとカニクイザルＭＳＬＮに対する親和性
組み換えヒトＭＳＬＮと組み換えカニクイザルＭＳＬＮに対する（モノクローナル抗体５４－０１－Ｇ０２由来の）ｓｃＦｖ ＰＲＯ１７８３の親和性をＴ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲ分析によって求めた。この実験では、組み換えヒトＭＳＬＮと組み換えカニクイザルＭＳＬＮ（それぞれＰｅｐｒｏｔｅｃｈとＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）を、標準的アミンカップリング手続きを利用してＣＭ５センサーチップの異なるフローセルの表面に固定化した。次いでｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７８３を９０～０．１２ｎＭの範囲の濃度でフローセルの中に５分間かけて注入し、タンパク質を１２分間にわたって解離させた。解離（ｋ_ｄ）と会合（ｋ_ａ）の速度定数と平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、１：１ラングミュア結合モデルを用いてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウエア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で計算した。ｓｃＦｖ ＰＲＯ１９２２とＰＲＯ１９２５の親和性は上記のようにしてＳＰＲによって評価したが、１５～０．１２ｎＭの濃度範囲を使用した。ｓｃＦｖ ＰＲＯ２３０６とＰＲＯ２３０９の親和性は上記のようにしてＳＰＲによって評価したが、９０～０．３５ｎＭの濃度範囲を使用した。

【0169】

表９に示されているように、ＳＰＲにおいてＰＲＯ１７８３は組み換えヒトＭＳＬＮに低いナノモル範囲の親和性（Ｋ_Ｄ＝２．９１ ｎＭ）で結合した。ＳＰＲにおいてＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、およびＰＲＯ２３０９は組み換えヒトＭＳＬＮに大きな１ナノモル未満の範囲の親和性で結合した。ＳＰＲ測定によって組み換えカニクイザルＭＳＬＮへのＰＲＯ１７８３の結合も実証されたが、親和性は低下した（Ｋ_Ｄ＝３０．０６ｎＭ、表１０）。

【0170】

ｃＥＬＩＳＡによるＭＳＬＮ発現細胞系への結合
ヒトＭＳＬＮを高レベルで発現している細胞（Ｈ２２６細胞系）への結合
Ｈ２２６がん細胞でのｃＥＬＩＳＡにより、形質膜上のＭＳＬＮへの抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７８３の結合を評価した。簡単に述べると、ＭＳＬＮまたはＨＥＫ２９３Ｔ（ＭＳＬＮ陰性）を発現している２０’０００個のＮＣＩ－Ｈ２２６細胞を平底組織培養用９６ウエルのプレートに分配した。翌日、プレートをオーバーフローモードでウエル１つ当たり４５０μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．２％のＢＳＡ）を用いて３回洗浄し、ＰＲＯ１７８３の各時点の段階希釈液と抗ＭＳＬＮ参照抗体アマツキシマブを５０μｌ添加し、軽く撹拌しながらプレートを室温（ＲＴ）で１．５時間インキュベートした。４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した後、ＨＲＰがカップルしたプロテインＬ、またはＨＲＰがカップルした抗ヒトＩｇＧ抗体を５０μｌ、各ウエルに添加した。章動ミキサーの上で室温にて１時間インキュベートした後、プレートをウエル１つ当たり４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄してから５０μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ）を添加した。１０分間の発色の後、ウエル１つ当たり１ＭのＨＣｌを５０μｌ添加することによって酵素反応を停止させ、参照波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ｎｍで読み取った。

【0171】

高レベルのＭＳＬＮを発現しているＨ２２６細胞系の形質膜へのＰＲＯ１７８３の結合を評価する実験の結果が表１１に示されている。Ｈ２２６細胞系へのＰＲＯ１７８３の結合のＥＣ_５０は１．４４ｎＭの濃度であることが見い出された。これは参照抗体アマツキシマブで得られた値と比べて大まかに６倍悪い（相対的ＥＣ_５０値を比較されたい、表１１）。Ｈ２２６細胞へのＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、およびＰＲＯ２３０９の結合のＥＣ_５０値はＰＲＯ１７８３とほぼ同じであることが見いだされた。Ｈ２２６細胞へのＰＲＯ１９２２の結合のＥＣ_５０値はアマツキシマブとほぼ同じであることが見いだされた。メソテリン陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｃＥＬＩＳＡで調べたときには、アマツキシマブ、ＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、およびＰＲＯ２３０９の結合は検出されなかった（データは示さない）。Ｈ２２６細胞系を用いたｃＥＬＩＳＡにおけるＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、ＰＲＯ２３０６、ＰＲＯ２３０９、およびアマツキシマブの濃度－応答曲線が図１に示されている。

【0172】

カニクイザルＭＳＬＮを発現している細胞（ＣＨＯ組み換え細胞系）への結合
カニクイザルＭＳＬＮに対する抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７８３の交差反応性を、ｃＥＬＩＳＡにおいて、カニクイザルＭＳＬＮを発現している組み換えＣＨＯ細胞系を用いて調べた。カニクイザルＭＳＬＮを発現しているＣＨＯ細胞、またはＣＨＯ－Ｋ１細胞（カニクイザルＭＳＬＮ陰性）２０’０００個を平底組織培養用９６ウエルのプレートに分配した。翌日、プレートを洗浄し、Ｈ２２６細胞系を用いるｃＥＬＩＳＡプロトコルに記載されているようにして、ＰＲＯ１７８３と抗ＭＳＬＮ参照抗体アマツキシマブの段階希釈液を添加した。軽く撹拌しながら室温で１．５時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄し、ＨＲＰがカップルしたプロテインＬまたはＨＲＰがカップルした抗ヒトＩｇＧ抗体を添加してＰＲＯ１７８３とアマツキシマブそれぞれの結合を検出した。章動ミキサー上で室温にて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢを各ウエルに添加した。発色の１０分後、１ＭのＨＣｌをウエル１つ当たり５０μｌ添加することによって酵素反応を停止させ、参照波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ ｎｍで読み取った。

【0173】

カニクイザルＭＳＬＮを発現しているＣＨＯ細胞系を用いたｃＥＬＩＳＡの結果が表１２に示されている。形質膜へのカニクイザルＭＳＬＮの結合に関するＰＲＯ１７８３のＥＣ_５０は１２ｎＭの濃度であることが見いだされた。これは、参照抗体アマツキシマブ（相対的ＥＣ_５０＝０．０３）よりも明らかに劣っている。他方で、形質膜へのヒトＭＳＬＮの結合と比較すると、ＰＲＯ１７８３の半値結合濃度の上昇が明らかである。これはＳＰＲ分析の結果に合致しており、組み換えカニクイザルＭＳＬＮタンパク質に対するＰＲＯ１７８３の親和性が低下したことを実証している。カニクイザルＭＳＬＮを発現しているＣＨＯ細胞系を用いたｃＥＬＩＳＡにおけるＰＲＯ１７８３とアマツキシマブの濃度－応答曲線が図２に示されている。ＣＨＯ－Ｋ１野生型細胞をｃＥＬＩＳＡで調べたとき、アマツキシマブの結合とＰＲＯ１７８３の結合は検出されなかった（データは示さない）。

【0174】

競合ＥＬＩＳＡによるＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用の中和
抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、およびＰＲＯ１９２５がＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用を阻止する効力を競合ＥＬＩＳＡで評価した。１μｇ／ｍｌのＭＵＣ１６を含有する５０μｌのＰＢＳを４℃で一晩添加することによってＥＬＩＳＡプレートを被覆した。翌日、プレートをオーバーフローモードでウエル１つ当たり４５０μｌの洗浄バッファーを用いて３回洗浄し、章動ミキサー上で３００μｌのブロッキングバッファーを室温で各ウエルに１時間かけて添加した。次いでビオチニル化されたＭＳＬＮをブロッキングバッファーの中で希釈して１ ｎｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。次に、ＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、およびアマツキシマブをビオチニル化されたＭＳＬＮを含有するブロッキングバッファーの中で滴定し、章動ミキサー上で室温にて１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをオーバーフローモードでウエル１つ当たり４５０μｌの洗浄バッファーを用いて３回洗浄し、滴定曲線の各濃度のＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、およびアマツキシマブを５０μｌ、二連でＥＬＩＳＡプレートに添加した。軽く撹拌しながらプレートを室温で１．５時間インキュベートした。ウエル１つ当たり４５０μｌの洗浄バッファーを用いて３回洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン－ポリＨＲＰ４０を５０μｌ、ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢを添加した後に５～１０分間発色させた。最後に、１ＭのＨＣｌを５０μｌ添加することによって酵素反応を停止させ、参照波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ｎｍで読み取った。

【0175】

競合ＥＬＩＳＡの結果が表１３に示されている。ＰＲＯ１７８３によってヒトＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用を阻止するＩＣ_５０は０．５ｎＭの濃度であることが見いだされた。これは、相対的ＩＣ_５０値によって示されるように参照抗体アマツキシマブよりも小さい。したがってＰＲＯ１７８３は、ヒトＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用の中和に関しては参照抗体アマツキシマブよりも効力が小さい。ＰＲＯ１９２２とＰＲＯ１９２５はＰＲＯ１７８３よりも有意に小さいＩＣ_５０値でヒトＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６相互作用を阻止できると考えられる。競合ＥＬＩＳＡにおけるＰＲＯ１７８３、ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ１９２５、およびアマツキシマブの濃度－応答曲線が図３に示されている。

【0176】

参照抗ＭＳＬＮ分子ＰＲＯ１７９５の生成と薬力学的特徴づけ
ＭＳＬＮに対する大きな親和性を持つ抗ＭＳＬＮ結合ドメインＰＲＯ１７９５を参照結合ドメインとして使用する。

【0177】

ヒト化参照抗ＭＳＬＮ結合ドメインＰＲＯ１７９５の同定、選択、ヒト化、および作製を、本発明の抗ＭＳＬＮ結合ドメインおよび本明細書に記載されている抗ＣＤ３分子と同様にして実施した。

【0178】

また、ＰＲＯ１７９５の主要な薬力学的特性（その中には、ＳＰＲにおける組み換えヒトとカニクイザルＭＳＬＮへの結合動態と親和性の測定、ｃＥＬＩＳＡにおけるヒトＭＳＬＮ発現細胞系とカニクイザルＭＳＬＮ発現細胞系の形質膜への結合の評価、およびｃＥＬＩＳＡにおけるＭＳＬＮ／ＭＵＣ１６の阻止の評価が含まれる）を評価した。結果が表９～１３にまとめられている。

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【0179】

抗ＭＳＬＮウサギＩｇＧクローン５４－０１－Ｇ０２（低親和性抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖドメインＰＲＯ１７８３の先駆（ｐｒｅｄｅｃｅｓｓｏｒ）クローン）のエピトープマッピング：
ｃＥＬＩＳＡによるヒト／マウスＭＬＳＮバリアントへの結合
選択された抗ＭＳＬＮウサギＩｇＧの結合領域を正確に特定するため、ＭＳＬＮの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の７つのヒト／マウスバリアント（Ｖ５タグ付き）を一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞への結合レベルをｃＥＬＩＳＡによって評価した（図４）。プレートをウエル１つ当たり２５’０００個の細胞で被覆して平底ポリ－Ｄリシン処理９６ウエルプレートにした。翌日、対応するコンストラクトを細胞にトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。２４時間後、細胞を４５０μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．２％のＢＳＡ）で洗浄し、軽く撹拌しながらサンプル（２５０ ｎｇ／ｍｌのｒＩｇＧまたは抗Ｖ５タグ抗体段階希釈液）を室温（ＲＴ）で１．５時間にわたって添加した。４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した後、ＨＲＰがカップルしたヤギＩｇＧ抗体とウサギＩｇＧ抗体を５０μｌ、各ウエルに添加した。章動ミキサー上で室温にて１時間インキュベートした後、プレートをウエル１つ当たり４５０μｌの洗浄バッファーで３回してから５０μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ、カタログ番号５３－００－００）を添加した。１０分間発色させた後、１ＭのＨＣｌをウエル１つ当たり５０μｌ添加することにより酵素反応を停止させ、参照波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ｎｍで読み取った。抗Ｖ５抗体と比較した結合レベルを計算した。参照抗体（抗Ｖ５タグ）と比べて特定のバリアントへのｒＩｇＧの結合レベルが明確に低下したことは、それぞれのマウス配列で置換されたヒトＭＳＬＮのセグメントの中にｒＩｇＧエピトープが局在化していることを示すと考えられる。

【0180】

抗ＭＳＬＮウサギＩｇＧクローン５４－０１－Ｇ０２（低親和性抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖドメインＰＲＯ１７８３の先駆クローン）をｃＥＬＩＳＡで調べたとき、キメラヒト／マウスバリアントＶ１（ヒトＭＳＬＮのＥＣＤの最も遠位領域）への結合の減少が観察された（Ｖ５参照抗体と比べて６５％の結合への減少、表１４）のに対し、他のあらゆるバリアントへの５４－０１－Ｇ０２の結合は９０％超であった。これらのデータは、ヒトＭＳＬＮのＶ１領域が５４－０１－Ｇ０２の結合にとって重要な領域であることを示唆する。しかし５４－０１－Ｇ０２はＶ１領域が非存在下であってさえヒトＭＳＬＮに相変わらず実質的に結合することができるため、ヒトＭＳＬＮのＥＣＤの他の領域も５４－０１－Ｇ０２の結合に関与する（表１４）。ウサギＩｇＧ ５４２２－Ｈ０３（高親和性抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖドメインＰＲＯ１７９５の先駆クローン）に関しては、ｃＥＬＩＳＡにおいてヒトＭＳＬＮのＥＣＤのキメラヒト／マウスバリアントを用いて結合領域を同定することはできないと考えられる（データは示さない）。

【表14】

【0181】

実施例２：抗ＣＤ３分子の生成と試験
ヒト化抗ＣＤ３結合ドメイン２８－２１－Ｄ０９ ｓｃ０４の同定、選択、ヒト化のほか、生成と特徴づけを特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４６３０（参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されているようにして実施した。

【0182】

実施例３：抗ｈＳＡ分子の生成と試験
ヒト化抗ｈＳ結合ドメイン１９－０１－Ｈ０４－ｓｃ０３と２３－１３－Ａ０１－ｓｃ０３の同定、選択、ヒト化のほか、生成と特徴づけを特許出願ＥＰ１９２０６９５９．９（参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されているようにして実施した。ヒト化抗ｈＳ結合ドメイン１９－０４－Ａ１０－ｓｃ０２（ＰＲＯ２１５５）の同定、選択、ヒト化のほか、生成と特徴づけを特許出願ＥＰ１９２０６９５９．９に記載されている手続きと同様にして実施した。抗ｈＳＡ ｓｃＦｖ ＰＲＯ２１５５の特徴づけを以下に簡単に概説する。

【0183】

抗ｈＳＡ ｓｃＦｖ １９－０４－Ａ１０－ｓｃ０２（ＰＲＯ２１５５）の特徴づけ
結合親和性と種交差反応性
ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ３７８２）への選択されたドメイン１９－０４－Ａ１０－ｓｃ０２の結合動態（親和性を含む）をＴ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｃｙｔｉｖａ）でｐＨ７．４とｐＨ５．５の両方にてＳＰＲ分析によって求めた。ｈＳＡ分子をカルボキシメチル化されたデキストランの表面（ＣＭ５センサーチップ、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｃｙｔｉｖａ）に共有結合で固定化し、各ｓｃＦｖ分子の滴定シリーズを分析物として注入した。各分析物注入サイクルの後、センサーチップ上のすべてのフローチャネルを再生させ（グリシンｐＨ２．０）、新たな濃度のｓｃＦｖ分子を注入した。関連するランニングバッファー（ＰＢＳ０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、またはＰＢＳ０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ５．５）の中の０．０４４～４５ ｎＭ（１：２）の１１通りの濃度でｈＳＡへの結合動態を多サイクル動態アッセイを利用して測定した。見かけの解離（ｋ_ｄ）と会合（ｋ_ａ）の速度定数、および見かけの解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を１：１ラングミュア結合モデルを利用してＢｉａｃｏｒｅ分析ソフトウエア（Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウエアバージョン３．２、Ｃｙｔｉｖａ）で計算し、フィットの質を相対カイ２に基づいてモニタした。結合レベルを、Ｒｍａｘ理論値に規格化した実現された最も安定な結合として計算した。

【0184】

選択されたｓｃＦｖの結合動態も上記のようにしてカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＣＹＳＡ）とマウス血清アルブミン（ｍＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ３５５９）について求めたが、ｃＳＡまたはｍＳＡをｈＳＡの代わりに用いた点が異なる。ｐＨ５．５とｐＨ７．４でのｈＳＡ、ｍＳＡ、およびｃＳＡに対する結合動態が表１５にまとめられている。

【表15】

【0185】

生物物理学的特徴づけ
ＨＳＡ－ドメイン１９－０４－Ａ１０－ｓｃ０２（ＰＲＯ２１５５）と１９－０４－Ａ１０－ｓｃ０６（ＶＬ－ＶＨジスルフィドを持つｓｃ０２ドメイン、ＶＬ－Ｔ１４１Ｃ／ＶＨ－Ｇ５１Ｃ、ＡＨｏ番号付け；ＰＲＯ２３１７）に対して４週間安定性研究を実施した。そのときｓｃＦｖは水性バッファー（５０ｍＭのＮａＣｉＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４）の中で１０ｍｇ／ｍｌの製剤にし、－８０℃未満、４℃、および４０℃の温度で４週間保管した。製剤中の単量体とオリゴマーの割合を全研究期間中の異なる時点でＳＥ－ＨＰＬＣピーク面積の積分によって評価した。表１６に、ｄ０と比べた単量体含量（単位は％）と％単量体損失がまとめられている。全研究期間を通じ、タンパク質濃度の変化を２８０ｎｍでのＵＶ－可視光測定によってモニタした。どのサンプルでもｄ０と比べて注目すべきタンパク質含量損失は観察されなかったため、データは示さない。熱安定性をｎＤＳＦ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）によって分析し、アンフォールディング開始（Ｔオンセット）とアンフォールディングの中点（Ｔｍ）を求めた。ＤＳＦの結果が表１６に示されている。

【表16】

【0186】

実施例４：本発明の多重特異性コンストラクト（biＭＳＬＮ_低親和性 ｘ ＣＤ３ ｘ ｈＳＡコンストラクト）の生成と薬力学的特徴づけ：
分子アーキテクチャ
ＭＡＴＣＨはＮｕｍａｂによって発明された形式であり、マッチするドメインのペアだけの特別なペア化を可能にする異なるリンカーによって接続された可変ドメインだけからなる（Ｅｇａｎ ＴＪ ｅｔ ａｌ．、可変ドメイン断片のモジュール式組み立てを可能にする新規な多重特異性ヘテロ二量体抗体形式。ＭＡＢＳ ９ （２０１７） ６８－８４）。この形式は、最適な協調性にするために異なる組み合わせの抗原結合ドメインを簡単にスクリーニングするのに特によく適している。ＭＡＴＣＨは哺乳類細胞から組み換え発現させることができる。精製には従来のアフィニティクロマトグラフィ工程を利用することができる。

【0187】

ＭＡＴＣＨ分子のアーキテクチャが図５に示されている。ＭＡＴＣＨ４形式が必要とするのは、二量体のサブユニットが２つの分割された可変ドメインのペアのコアで構成されていて、それぞれのサブユニットが、直列に位置する２つのＶＬドメインまたは２つのＶＨドメインのいずれかを持つことであり、そのことによってその２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化が駆動される。それぞれのＭＡＴＣＨ４鎖の上で二量体を形成する直列な可変ドメインは、その対応する鎖として反平行なＮ末端－Ｃ末端の向きに編成されている。両方の鎖が哺乳類細胞の中で同時に発現して完全に機能する四重特異性分子になる。可変ドメイン間の伝統的なＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを用いて両者を図５に示されているように接続した。典型的には、異なるリンカー長をＭＡＴＣＨ分子で用いる（表５のＭＡＴＣＨ分子の配列リスト参照）。さらに、反平行ＭＡＴＣＨ４形式は、図５に示されているように、コアドメインの１つにジスルフィド架橋を導入しやすい。（示していない）対応するＭＡＴＣＨ３形式は同様に構成されて編成されるが、ＭＡＴＣＨ４の場合のような２つのｓｃＦｖ結合ドメインの代わりに１つのｓｃＦｖ結合ドメインだけが２つの分割された可変ドメインのペアのコアに付加する点が異なる。

【0188】

ＭＡＴＣＨ４形式およびＭＡＴＣＨ３形式と同様、ｓｃＭＡＴＣＨ３形式は、図 ５（右）に示されているように、異なるリンカーによって接続された可変ドメインだけからなる。しかしこの形式では、図５（右）に示されているように、分割された可変ドメインは単一のペプチド鎖（ｓｃ）の上に位置し、組み立てられて完全に機能する三重特異性分子になる。ＭＡＴＣＨ４形式とＭＡＴＣＨ３形式のようにｓｃＭＡＴＣＨ３分子も哺乳類細胞の中で組み換え発現させることができ、その精製には従来のアフィニティクロマトグラフィ工程を利用することができる。

【0189】

λキャップ付きＦｖ足場でヒト化した２～３つのウサギ抗体を組み合わせることにより、高親和性ＭＳＬＮ－ＢＤを１つだけ持つ本発明による反平行四重特異性ＭＡＴＣＨ４分子と、参照三重特異性ｓｃＭＡＴＣＨ３分子を、表１７にまとめられているように設計した。

【0190】

製造
ＣＨＯｇｒｏ一過性トランスフェクションキット（Ｍｉｒｕｓ）を用いてＣＨＯ－Ｓ細胞の中でＭＡＴＣＨコンストラクトを発現させた。培養物を発現の５～７日後（細胞生存率７０％未満）に３７℃で遠心分離によって回収し、タンパク質を透明になった培養物上清からプロテインＬまたはＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、必要な場合にはその後にＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による最終精製工程をｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸塩－クエン酸塩バッファーと３００ ｍＭのスクロースの中で続けた。ＳＥＣ画分の単量体含量をＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって評価し、単量体含量が９５％超の画分をプールした。製造された材料の品質管理のため、標準的な分析法（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ_２８０、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥなど）を利用した。

【0191】

生成した分子の製造に関する詳細が表１８にまとめられている。

【0192】

多重特異性抗体の薬力学的特徴づけ
以下の部分に、ヒトＭＳＬＮに関して１価または２価、ヒトＣＤ３εに関して１価、そしてヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に関して１価である代表的な多重特異性分子の特徴づけを記述する。２価の抗ＭＳＬＮ抗体ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２１００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、およびＰＲＯ２６６０（すなわちbiＭＳＬＮｘＣＤ３ｘｈＳＡ）と、１価の抗ＭＳＬＮ抗体ＰＲＯ１８７２（すなわちＭＳＬＮ_低ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）をＳＰＲにおいて調べ、組み換えヒトＭＳＬＮとヒトＣＤ３εへのその結合動態と親和性をＳＰＲにおいて評価した。

【0193】

ＳＰＲにおけるヒトＭＳＬＮに対する親和性
組み換えヒトＭＳＬＮへの多重特異性抗ＭＳＬＮ抗体の親和性をＴ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲ分析によって求めた。この実験では、（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した）組み換えヒトＭＳＬＮをＣＭ５センサーチップの表面に上記のようにして固定化した。多重特異性抗体をフローセルの中に注入し、結合動態のほか平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を上記のようにして計算した。

【0194】

アビディティの非存在下での組み換えヒトＭＳＬＮへの多重特異性抗ＭＳＬＮ抗体の親和性をＴ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲ分析によって求めた。この実験では、専用の抗フレームワークウサギＩｇＧ（ＰＲＯ２６７９）をＣＭ５センサーチップの表面に上記のようにして固定化した。多重特異性抗体を２０秒間注入することによってそれぞれのフローセルに捕獲した。その後、（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した）組み換えヒトＭＳＬＮをフローセルの中に注入し、結合動態のほか平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を上記のようにして計算した。

【0195】

表１９に示されているように、１価の抗ＭＳＬＮ抗体ＰＲＯ１８７２はＳＰＲにおいて組み換えヒトＭＳＬＮに１ナノモル未満の範囲の親和性（Ｋ_Ｄ＝０．１８７ｎＭ）で結合した。ヒトＭＳＬＮと同様の親和性が、対応する抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７９５で見いだされた（Ｋ_Ｄ＝０．３２１ｎＭ、ドメイン５４－２２－Ｈ０３－ｓｃ０１、データは示さない）。２価の抗ＭＳＬＮ抗体ＰＲＯ２０００は低いナノモル範囲（Ｋ_Ｄ＝１．０６ｎＭ）で組み換えヒトＭＳＬＮへの親和性を示した。これは、対応する抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ抗体ＰＲＯ１７８３（Ｋ_Ｄ＝２．９１ｎＭ、ドメイン５４－０１－Ｇ０２－ｓｃ０１、表９）で見いだされた親和性よりも優れている。ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６７はこのアッセイでヒトＭＳＬＮと非常に似た親和性を示し、Ｋ_Ｄ値は１．３９と１．５２ｎＭの間の小さなｎＭの範囲である。

【0196】

ＳＰＲにおけるヒトＣＤ３εへの親和性
組み換えヒトＣＤ３εに対する多重特異性抗ＭＳＬＮ抗体の親和性をＴ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲ分析によって求めた。この実験では、ヒト組み換えＣＤ３εタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面にアミンカップリングによって固定化した。ＨＢＳ－Ｔ＋バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）の中での抗ＭＳＬＮ多重特異性抗体の段階希釈液をフローセルの中に３０μｌ／分の流速で５分間注入した。ＣＭ５チップ上のＣＤ３εから抗体を１２分間にわたって解離させた。各注入サイクルの後、１０ｍＭのグリシンＨＣｌ、ｐＨ２を１回注入して表面を再生させた。見かけの解離（ｋ_ｄ）と会合（ｋ_ａ）の速度定数と見かけの解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を１：１ラングミュア結合モデルを利用してＢｉａｃｏｒｅ分析ソフトウエア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で計算し、フィットの質をカイ２とＵ値（曲線フィッティングの質の１つの指標）に基づいてモニタした。１：１ラングミュア結合モデルを利用したフィットは準最適品質の曲線フィッティングを示したため、２状態反応モデルを利用してＫ_Ｄを追加して計算した。このモデルは、固定化されたリガンドへの分析物の１：１結合の後に立体配座が変化して複合体が安定化することを説明する。

【0197】

表２０に示されているように、抗ＭＳＬＮ抗体ＰＲＯ１８７２とＰＲＯ２０００は両方ともＣＤ３εに関して１価であり、同じ抗ＣＤ３ドメイン（２８－２１－Ｄ０９－ｓｃ０４）を持ち、ＳＰＲにおいて組み換えヒトＣＤ３εにナノモルの範囲の似た親和性（ＰＲＯ１８７２、Ｋ_Ｄ＝１２．１ｎＭ；ＰＲＯ２０００、Ｋ_Ｄ＝２０．０ｎＭ）で結合した。ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、およびＰＲＯ２６６０は組み換えヒトＣＤ３εに対していくらか優れた親和性を示し、Ｋ_Ｄ値は２．９７と６．４５ｎＭの間の小さいｎＭの範囲である。

【0198】

ＳＰＲにおけるｐＨ５．５でのヒト血清アルブミンへの親和性
ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＡ３７８２）への結合動態をＴ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲによって評価した。ＨＳＡをセンサーチップ（ＣＭ５センサーチップ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面にアミンカップリングによって固定化した。ｐＨ５．５のランニングバッファー（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）の中で希釈した０．７～１８０ｎＭの範囲の抗ＭＳＬＮ多重特異性抗体の段階希釈液をフローセルに５分間注入した。解離時間は１２分間に設定した。見かけの解離（ｋ_ｄ）と会合（ｋ_ａ）の速度定数と見かけの解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を上記のように１：１ラングミュア結合モデルを利用して計算した。

【0199】

表２１に示されているように、抗ＭＳＬＮ抗体ＰＲＯ１８７２（抗ｈＳＡドメイン：２３－１３－Ａ０１－ｓｃ０２）はＳＰＲにおいて組み換えｈＳＡに１ナノモル未満の範囲の親和性（Ｋ_Ｄ＝０．１７５ｎＭ）で結合した。ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、およびＰＲＯ２６６０は組み換えｈＳＡに対していくらか小さい親和性を示し、Ｋ_Ｄ値は５．７１と８．８０ｎＭの間の小さいｎＭの範囲である。

【表17】

【表18】

【表19】

【表20】

【表21】

【0200】

代表的なＭＡＴＣＨ４分子の生物物理学的特徴づけ
ｎＤＳＦによる保管安定性と融点
ＭＡＴＣＨ４分子で２８日安定性研究を実施した。ここでは分子を水性バッファーー（ｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸塩－クエン酸塩バッファーと３００ｍＭのスクロース）の中で１ｍｇ／ｍＬの製剤にし、－８０℃未満、４℃、および４０℃で２８日間保管した。製剤中の単量体とオリゴマーの割合を、全研究期間中の異なる時点でＳＥ－ＨＰＬＣピーク面積の積分によって評価した。表２２に、０日目と比べた単量体含量（単位は％）と％単量体損失がまとめられている。全研究期間を通じ、タンパク質濃度の変化を２８０ｎｍでのＵＶ－可視光測定によってモニタした。それが表２３に示されている。熱安定性をｎＤＳＦ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）によって分析し、アンフォールディングの開始（Ｔ_{オンセット}）、アンフォールディングの中点（Ｔ_ｍ）、および散乱オンセット温度を求めた。二連／三連で測定したＴ_ｍの結果が標準偏差（ＳＤ）を含めて表２４に示されている。
４つのＭＡＴＣＨ４分子のすべてが良好な安定性プロファイルを示し、２８日間インキュベートした後にわずかな単量体含量損失またはタンパク質含量損失を示すだけである。温度が－８０℃と４℃での単量体含量のほか、ＳＥ－ＨＰＬＣ／ＵＶ測定の前に２８日目／－８０℃のサンプルで反復して凍結－解凍（５×）実施したときの単量体含量には、注目すべき変化はない。

【表22】

【表23】

【表24】

【0201】

実施例５：細胞系の細胞表面上のメソテリン密度の測定：
緒言
１つの目的は、メソテリン結合に関して１価または２価の多重特異性分子が、細胞表面に異なるレベルのメソテリンを示している標的細胞系に結合する能力を比較することである。したがって形質膜上のメソテリン発現を異なる細胞系で定量した。

【0202】

方法
さまざまなレベルのメソテリンを発現しているがん細胞系と健康な中皮組織に関する抗体結合能力（ＡＢＣ）をＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗ヒトＩｇＧキット（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を利用してＦＣ（フローサイトメトリー）によって評価した。簡単に述べると、１ｍｇの抗メソテリン抗体（７Ｄ９．３、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ Ｒａｐｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎキット（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を製造者の指示に従って用いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８との複合体にした。受容体の密度値は抗体結合能力（ＡＢＣ）として報告される。ＡＢＣ値はＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒビーズ抗ヒトＩｇＧ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて作成した標準曲線から導出された。これらのビーズはマイクロスフェアの４つの集団からなり、各集団は、ビーズ１個当たりの数が異なる抗ヒトＩｇＧ分子との複合体になっている。第１の工程として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した増加していく濃度の抗メソテリン抗体を結合部位の量が最大のビーズ集団で試験して飽和抗体濃度を求め、それを製造者のプロトコルに記載されているようにして定量の間に使用した。その後、ビーズと試験サンプルを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した対応する飽和濃度の抗メソテリン抗体で製造者の指示に従って染色し、同日に、試験サンプルと同じ光電子増倍管設定でランを実施した。ＡＢＣ値を計算するため、４つのＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒビーズ集団のための幾何学的手段をＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウエア（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＱｕｉｃｋＣａｌ ｖ． ２．３ Ｅｘｃｅｌスプレッドシートに基づく分析テンプレート（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）を使用して線形回帰により標準曲線を作成した。Ｒ自乗値は典型的には０．９９以上であった。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－抗メソテリン抗体で標識したサンプルのＡＢＣ値は標準曲線から内挿した。

【0203】

結果
３つのがん細胞系（Ｈ２２６、Ｈ２９２、およびＨＰＡＣ）と、健康な中皮組織に由来する１つの細胞系（ＭｅＴ－５Ａ；（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９４４４（商標））；供給者：ＡＴＣＣ）の形質膜上のメソテリン密度をＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒビーズを用いて求めた。得られたデータが表２５に示されている。Ｈ２２６細胞は最高レベルの発現を示し、その後に発現が４倍少ないＨＰＡＣ細胞系が続いた。同等なメソテリン発現レベルがＨ２９２細胞系とＭｅＴ－５Ａ細胞系で見いだされたが、Ｈ２２６細胞の細胞表面で観察された発現よりも８～１０倍少なかった。

【表25】

【0204】

実施例６：細胞毒性アッセイ（Ｔ細胞に駆動される標的細胞の枯渇）：
緒言
biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡが、メソテリンを発現している細胞にＴ細胞を選択的に向かわせて殺傷する能力をＭＳＬＮ_低ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡと比較して評価するため、細胞表面にメソテリンを異なる密度で発現している細胞系を用いた細胞毒性アッセイをヒトＰＢＭＣの存在下で実施した。それに加え、分子の効力に対する可溶性メソテリン（ｓＭＳＬＮ）の存在の影響もこのアッセイで評価した。がん細胞上のメソテリンとＣＤ３εにＭＳＬＮ_{低 ＫＤ}ｘＣＤ３ｘｈＳＡ三重特異性分子が同時に結合するとＴ細胞上のＣＤ３εの架橋につながり、シグナル伝達カスケードが活性化され、Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９の上方調節、サイトカインの分泌）と細胞傷害性顆粒の放出が開始され、その結果として最終的に標的細胞が殺傷される。

【0205】

方法
血液細胞分別
リンパ球分離媒体Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示に従って用い、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なボランティアの新鮮な血液から単離した。実験のこのセットでは、異なる３人のドナーからの血液（ドナー＃１、ドナー＃２、およびドナー＃３）を使用した。個々のドナーの血液の特性は、特にその中に含まれるＣＤ８＋ Ｔ細胞の量と反応性に関して大きく異なっている。その帰結として、これら血液由来ＣＤ８＋ Ｔ細胞サンプルの間で殺傷力は広い範囲で変化する。その結果として、本明細書に開示されている実施例で観察されたように、同じ標的細胞の存在下で同じ試験分子を用いて異なる殺傷力とＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化力が得られる。

【0206】

簡単に述べると、血液をヒトＰＢＭＣ単離バッファー（ＰＢＳ、２％のＦＣＳ、２ ｍＭのＥＤＴＡ）で１：２に希釈し、推奨量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地を収容したＬｅｕｃｏｓｅｐチューブに適用した。ＬｅｕｃｏＳｅｐチューブを室温で３０分間にわたって中断することなく８００×ｇで遠心分離した。次いでＰＢＭＣを含有する細胞層を回収し、ヒトＰＢＭＣ単離バッファーで２回洗浄し、赤血球細胞溶解バッファーを室温で５分間用いて赤血球細胞を溶解させた。その後、単離されたヒト細胞をそれぞれの単離バッファーで１回と、アッセイ培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＣＳ）で１回洗浄した。血小板を除去した後、単離されたＰＢＭＣをアッセイ培地に１ｍｌ当たり３×１０^６個の生存細胞の密度で再懸濁させた。

【0207】

フローサイトメトリーに基づくインビトロ細胞毒性アッセイ（ＦＣアッセイ）とＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化：
３つのがん細胞系、すなわちＨ２２６細胞（高メソテリン密度）、ＨＰＡＣ細胞（中間メソテリン密度）、およびＨ２９２細胞（低メソテリン密度）のほか、健康な中皮組織に由来するＭｅＴ－５Ａ細胞系（低メソテリン密度）を標的細胞として使用した。以前にＰＫＨ６７で標識した５’０００個の生きている標的細胞を７５μｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＣＳ）の中で希釈し、９６ウエルのプレートに添加した。適用できるときには、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌの可溶性メソテリンを含有するアッセイバッファーを使用した。２５μｌの６倍濃縮試験タンパク質をアッセイ培地で希釈し、適切なウエルに添加した。１５０’０００個の生きているエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を５０μｌのアッセイ培地の中で希釈し、各ウエルに添加し（Ｅ：Ｔ比が３０：１）、プレートを章動ミキサーの上で室温にて混合した後、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。４０時間後、細胞をトリプシン処理し、染色バッファー（ＰＢＳ、２％のＢＣＳ、２ ｍＭのＥＤＴＡ）の中に再懸濁させ、非結合プレートに移した。

【0208】

細胞を異なるマーカー（ＣＤ６９、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、およびアネキシン－Ｖなど）について染色した。分析のため、アポトーシスする標的細胞と死んだ標的細胞、活性化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞に焦点を絞った。標的細胞を緑色蛍光（ＰＫＨ６７）によって同定し、その生存をアネキシン－Ｖ ＡＰＣによって分析した。エフェクター細胞（ＣＤ８＋細胞）はその表面でＣＤ８を検出することによって同定した（抗ＣＤ８ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を最後にＣＤ６９発現の定量によって検出した（抗ＣＤ６９ ＰＥ）。ＣＤ４を用いてＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞を識別した。ＣＤ１１ｃを用いて単球と樹状細胞を染色し、標的細胞のゲーティングを改善した。アネキシン－Ｖを除くすべてのマーカーについて、細胞を軽く撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした。細胞を染色バッファーで１回、アネキシン結合バッファーで１回洗浄し、撹拌しながらアネキシン－Ｖ染色を室温で３０分間実施した。細胞をアネキシン－Ｖ結合バッファーで１回洗浄し、フローサイトメトリー分析をＮｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメータで実施した。

【0209】

特定の標的細胞の溶解率は以下の式に従って計算した：
標的細胞の特異的溶解［単位は％］＝［１－サンプルの標的細胞生存率／対照サンプルの平均生存率］×１００
活性化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合はＣＤ６９＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の比率に対応する。

【0210】

ＬＤＨ放出に基づく細胞毒性：
サイトゾルからのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の放出は細胞死の１つの指標である。比色ＬＤＨ放出アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を設定し、興味あるリード分子によって媒介される細胞毒性を調べた。２つのがん細胞系、すなわちＨ２２６細胞（高メソテリン密度）とＯＶＣＡＲ－３細胞（中間メソテリン密度）のほか、健康な中皮組織に由来するＭｅＴ－５Ａ細胞系（低いメソテリン密度）を標的細胞として使用した。１０，０００個の生きている標的細胞を９６ウエルのプレートに添加して一晩接着させた。翌日、３００，０００個の生きているエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）をｈＳＡ含有バッファーの中の各ウエルに添加した（Ｅ：Ｔ比が３０：１）。図面に示されているそれぞれの分子を５０ｎＭから開始する５倍希釈工程で添加した。適用できる場合には、最終濃度が０ｎｇ／ｍＬのｓＭＳＬＮ、５０ｎｇ／ｍＬのｓＭＳＬＮ、および５００ｎｇ／ｍＬのｓＭＳＬＮをウエルに添加した。４０時間後、上清を取り出してＬＤＨ放出分析を実施し、細胞をＴ細胞マーカー（活性化を含む）に関して染色した。

【0211】

特異的溶解の割合は以下のようにして計算した：
１．培地バックグラウンドの平均ＯＤ値を全ＯＤ値から差し引く
２．％細胞毒性＝（（サンプル-自発的殺傷）／（最大殺傷-自発的殺傷））×１００を計算する
注：自発的殺傷：治療なし（無治療）のエフェクター＋標的細胞の平均ＯＤ値。
注：最大殺傷：１％のＴｒｉｔｏｎで４０時間処理した標的細胞の平均ＯＤ値。

【0212】

結果
ＭＡＴＣＨ分子ＰＲＯ２０００（ＭＡＴＣＨ－４：biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）とＰＲＯ１８７２（ｓｃＭＡＴＣＨ－３：ＭＳＬＮ_低ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）のＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に対する細胞毒性の能力と効果を、フローサイトメトリーに基づく細胞毒性アッセイを利用して評価した。高メソテリン発現細胞系Ｈ２２６と、健康な組織に由来する低メソテリン発現ＭｅＴ－５Ａ細胞を用いて得られたデータが表 ２６と２７に提示され、ＭＡＴＣＨ分子の濃度応答曲線が図６に提示されている。両方の分子が高メソテリン発現Ｈ２２６細胞に対して大きな効力を持つ。ＰＲＯ２０００を標的とする２価メソテリンは、ＰＲＯ１８７２を標的とする１価メソテリンよりも効力が７５倍大きい。逆に、低レベルのメソテリンを発現しているＭｅＴ－５Ａ細胞に対し、１価メソテリン結合分子ＰＲＯ１８７２は標的細胞の殺傷に関してＰＲＯ２０００と比べて１６倍大きい効力を示す。高発現細胞に対しては、ＰＲＯ２０００は０．０７ｐＭの殺傷力（ＥＣ_５０）を持ち、ＰＲＯ１８７２は５．３１ｐＭを持つのに対し、ＭｅＴ－５Ａ細胞に対しては、ＰＲＯ２０００は１４４．７０ｐＭのＥＣ_５０を示し、ＰＲＯ１８７２は８．８８ｐＭを示す。同様のデータが、それぞれの条件でＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化について観察される。

【0213】

さらに、ＰＲＯ２０００とＰＲＯ１８７２のＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に対する細胞毒性の活性と効果を、それぞれ中間レベルと低レベルのメソテリンを発現している他の２つの標的がん細胞系ＨＰＡＣ細胞とＨ２９２細胞で調べた（表２７と図７）。以前に観察されたように、ＰＲＯ１８７２は、メソテリンを標的とする２価分子ＰＲＯ２０００よりも、低メソテリン発現の細胞に対する効力が大きい。逆にＰＲＯ２０００とＰＲＯ１８７２は、中間メソテリン密度を示すＨＰＡＣ細胞に対して似た効力を持つ。ＨＰＡＣに対しては、ＰＲＯ２０００は殺傷力が４０．７５ｐＭ、ＰＲＯ１８７２は３０．２６ｐＭであるのに対し、低メソテリン発現Ｈ２９２細胞に対しては、ＰＲＯ２０００は６５２．２ｐＭのＥＣ_５０を示し、ＰＲＯ１８７２は９１．０３ｐＭを示す。同様のデータがそれぞれの条件でのＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に関して観察されたが、ＨＰＡＣ細胞の存在下ではＰＲＯ２０００がＰＲＯ１８７２の４倍の効力である点が異なる。

【0214】

いくつかの研究が、がん患者で数百ｎｇ／ｍｌという可溶性メソテリンの血清濃度を報告している。したがってわれわれは、分子が標的細胞を殺傷する効力に対する可溶性メソテリンの存在の影響を評価した。

【0215】

ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に対するＭＡＴＣＨ分子ＰＲＯ２０００とＰＲＯ１８７２の細胞毒性の能力と効果を、５０ｎｇ／ｍｌまたは５００ｎｇ／ｍｌの可溶性メソテリン（ｓＭＳＬＮ）の非存在下または存在下で高メソテリン発現Ｈ２２６細胞を用いて比較した。得られたデータが表２８と２９に示されており、分子の濃度応答曲線が図８に示されている。両方の分子の効力は、用量に依存したやり方で可溶性メソテリンによるマイナスの影響を受けた。ＰＲＯ２０００を標的とする２価メソテリン（メソテリンに対してＰＲＯ１８７２よりも小さい１価親和性を持つ）は、５００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下ではｓＭＳＬＮの非存在下で観察された効力と比べて殺傷力の１７倍の低下を示す。逆に、メソテリンに対して１価でメソテリンに対してより優れた１価親和性を持つ分子ＰＲＯ１８７２は、５００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下ではｓＭＳＬＮの非存在下での効力と比べて１０６倍小さい効力を示す。同様のデータが、それぞれの条件でのＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に関して観察される。

【0216】

それに加え、ＰＲＯ２０００のバリアントであるＰＲＯ２１００を特徴づけて、両方の分子が標的細胞の殺傷に関して同等の効力を持つことを示した。ＰＲＯ２１００では、潜在的なグリコシル化部位が変異してグリコシル化を阻止した。

【0217】

ＭＡＴＣＨ４分子であるＰＲＯ２０００とＰＲＯ２１００の細胞毒性能力を、高メソテリン発現Ｈ２２６細胞と低メソテリン発現中皮細胞ＭｅＴ－５Ａの存在下でフローサイトメトリーに基づく細胞毒性アッセイを利用して比較した。ＰＲＯ１８７２も含めた。得られたデータは表３０に示され、濃度応答曲線は図９に示されている。試験したどの分子も低メソテリン発現ＭｅＴ－５Ａ細胞の殺傷を示さない。Ｈ２２６標的細胞の存在下では、ＰＲＯ２０００とＰＲＯ２１００はｓＭＳＬＮの非存在下または存在下で非常によく似た効力を示す。ｓＭＳＬＮの非存在下では、効力は、ＰＲＯ２０００では０．７ｐＭ、ＰＲＯ２１００では１．５４ｐＭである。１００ｎｇ／ｍｌのｓＭＳＬＮの存在下では効力のシフトが２倍（ＰＲＯ２１００で３．５６ｐＭ）と５倍（ＰＲＯ２０００で３．４５ｐＭ）である。逆にｓＭＳＬＮの非存在下では、より優れた１価親和性を持つ分子ＰＲＯ１８７２は、ＰＲＯ２１００とＰＲＯ２０００のそれぞれよりも効力が１０倍と２０倍小さい（ＥＣ_５０ ＰＲＯ１８７２＝１３．３８ｐＭ）。さらに、ＰＲＯ１８７２は、１００ｎｇ／ｍｌ ｓＭＳＬＮの存在下では効力が１０倍小さい。

【0218】

上で得られたデータに基づき、さらなる代表的なＭＡＴＣＨ分子ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６２、およびＰＲＯ２６６０（ＭＡＴＣＨ－４：biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）の細胞毒性能力を、方法の部分に概説されているようにしてＬＤＨ放出によって評価した。ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６２を調べるとき、これらの分子は、高ＭＳＬＮ発現Ｈ２２６細胞に対してＰＲＯ２６６０よりも大きな効力と、同様の用量応答曲線を示した（図１０）。これら分子の効力のわずかな低下が中間ＯＶＣＡＲ－３発現細胞で観察され、活性のさらなる低下が、Ｍｅｔ－５Ａ細胞を低ＭＳＬＮ発現標的として用いたときに見られた（図１０）。これらのデータはまとめの図１１にまとめられており、そこでは実験全体でのＥＣ_５０値が、参照としてのＰＲＯ１８７２との比較を含めて与えられている。ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６２、およびＰＲＯ２６６０のＥＣ_５０値は、Ｈ２２６細胞を標的として使用するとき、ＰＲＯ１８７２で観察された値よりも小さいように見えることが観察される（図１１Ａ）。ＯＶＣＡＲ－３細胞に対するＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６２について同様の傾向が観察される（図１１Ｂ）。平均Ｍｅｔ－５Ａ ＥＣ_５０と平均Ｈ２２６ ＥＣ_５０値の間のｘ倍差を計算することによって活性の範囲を調べるとき、ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６２に関する活性の範囲がＰＲＯ１８７２の範囲よりも有意に広いことが観察される（表３１参照）。

【0219】

リード分子の効力の変化と用量応答曲線を、５０ｎｇ／ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのｓＭＳＬＮの存在下で調べた（図１２）。ＭＡＴＣＨ４ biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ分子はｓＭＳＬＮの存在下でその効力を維持することが観察された。例えばＰＲＯ２５６６とＰＲＯ２５６７は、ｓＭＳＬＮの存在下ではＰＲＯ１８７２と比べ、高ｓＭＳＬＮ濃度でさえ、その効力を維持する（０から５００ｎｇ／ｍＬまででの効力のｘ倍変化：１４．２倍と２３．８倍であるのに対して７８．２倍；表３２参照）。まとめの図 １３では、絶対ＥＣ_５０値の差が実証される。ＰＲＯ２５６６とＰＲＯ２５６７のＥＣ_５０値はｓＭＳＬＮの添加の影響を比較的受けないのに対し、１価ＰＲＯ１８７２のＥＣ_５０値はｓＭＳＬＮの添加による影響を比較的大きく受ける。ＰＲＯ２６６０はｓＭＳＬＮに対してより感受性であるように見えるが、それでもＰＲＯ１８７２と比べると感受性が劣る。これらのデータは、ＭＡＴＣＨ４ biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳ形式がｓＭＳＬＮの存在下で十分な抗腫瘍効力の保持に関して優れていることを実証している。

【0220】

実施例７：標的細胞へのＭＡＴＣＨ分子の結合
緒言
異なる細胞表面密度のメソテリンを発現している標的細胞（Ｈ２２６、ＨＰＡＣ、Ｈ２９２、ＯＶＣＡＲ－３、およびＭｅＴ－５Ａ）を用いて得られた細胞毒性データをサポートするため、これら細胞系のうちの少なくとも２つへのＭＡＴＣＨ分子の細胞結合をフローサイトメトリーによって評価した。代表的なＭＡＴＣＨ４分子ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２１００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、およびＰＲＯ２６６０を試験して両方の分子が似た結合特性を持つことを確認した。比較のためｓｃＭＡＴＣＨ３ ＰＲＯ１８７２も含めた。

【0221】

方法
細胞を１００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、５０’０００～０．００５ｐＭの範囲の染色バッファー（ＰＢＳ、２％の熱不活化ＢＣＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）の中でのＰＲＯ１８７２、ＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２１００、ＰＲＯ２５６２、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６７、またはＰＲＯ２６６０の５倍段階希釈液とともにインキュベートした。細胞を染色バッファーで２回洗浄し、ＭＡＴＣＨ４分子の結合をプロテインＬ－ＰＥ（２μｇ／ｍｌ）によって可視化した。プレートを章動ミキサー上で室温にて３０分間インキュベートし、染色バッファーで２回洗浄し、２００ｇで５分間遠心分離し、最終体積５０μｌの染色バッファーに再懸濁させた。ウエル１つ当たり２０’０００イベントのＰＥシグナルを、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメータ装置を用いたフローサイトメトリーによって分析し、ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウエア（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してデータを分析した。ブランク（ゼロ濃度の抗体）を差し引くことにより、ＭＡＴＣＨ分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を非特異的結合に関して補正した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてΔＭＦＩデータを４パラメータロジスティック曲線フィットで分析し、５０％の標的細胞結合（ＥＣ_５０）に到達するのに必要な興味ある分子の濃度を計算した。

【0222】

結果
異なる細胞系へのＰＲＯ２０００、ＰＲＯ２１００、およびＰＲＯ１８７２の結合をフローサイトメトリーによって評価した。半値結合が観察された濃度（ＥＣ_５０）と、到達した最大結合値（ＭＦＩ）が表３３に示され、対応する滴定曲線が図１４（Ａ～Ｄ）に示されている。ＰＲＯ２０００とＰＲＯ２１００は、試験した全細胞系に対して同等な結合データを示す。ＰＲＯ１８７２と比べると、ＰＲＯ２０００とＰＲＯ２１００は、高メソテリン発現がん細胞Ｈ２２６に対して３倍多い結合を、中間メソテリン発現がん細胞ＨＰＡＣに対して１．５～２倍多い結合を、そして低メソテリン発現がん細胞Ｈ２９２に対して２倍少ない結合を示す。これらのデータは、細胞毒性アッセイで得られたデータと相関している。試験した各分子で観察された最大の結合から、細胞表面メソテリン発現に関する細胞系のランキングが確認される。
さらに、異なる細胞系へのＭＡＴＣＨ４分子ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６２、およびＰＲＯ２６６０（biＭＳＬＮｘＣＤ３ｘｈＳＡ）の細胞結合も上記のようにして評価した。半値結合が観察された濃度（ＥＣ_５０）と到達した最大結合値（ＭＦＩ）が表３４に示され、対応する滴定曲線が図１４（Ｅ～Ｇ）に示されている。リードＭＡＴＣＨ４分子ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、およびＰＲＯ２５６２は、高ＭＳＬＮ発現Ｈ２２６細胞へのＥＣ_５０結合がＰＲＯ２０００およびＰＲＯ２１００と同等であることが実証された（表３３を表３４と比較されたい）。中間レベルのＭＳＬＮを発現しているＯＶＣＡＲ－３細胞への結合を評価したとき、全ＭＡＴＣＨ４分子（ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６２、およびＰＲＯ２６６０）のＥＣ_５０結合の減少がさらに観察された。２価ＭＡＴＣＨ４分子のＥＣ_５０結合の減少は、ＯＶＣＡＲ－３細胞上のＭＳＬＮの発現レベルがより低いことに起因しており（得られた最大ＭＦＩ値によって示される）、結合強度へのアビディティ効果の寄与を減らす。低ＭＳＬＮ発現Ｍｅｔ－５Ａ細胞に関し、Ｈ２２６細胞およびＯＶＣＡＲ－３細胞と比べたときに最大ＭＦＩ値が実質的に低下することが見いだされ、ＥＣ_５０値は、Ｈ２２６細胞への結合に関して得られたＥＣ_５０値よりもほぼ５倍小さかった。ＰＲＯ２０００とＰＲＯ２１００でも同様の結果が得られた。Ｍｅｔ－５Ａ細胞上のＭＳＬＮは膜マイクロドメインの中に局所的に集中することでＭＡＴＣＨ４分子の強固でアビディティに駆動される結合につながり、その帰結として小さなＥＣ_５０値になるのに対し、これらの細胞の表面でのＭＳＬＮの発現は全体的に少ないため最大のＭＦＩ値は小さいままであると推定することができよう。
まとめると、リードＭＡＴＣＨ４分子ＰＲＯ２５６７、ＰＲＯ２５６６、ＰＲＯ２５６２のＥＣ_５０結合は、ＰＲＯ２０００とＰＲＯ２１００で得られた細胞結合データと同等である。中間ＭＳＬＮ発現ＯＶＣＡＲ－３細胞への結合強度の低下は、おそらくアビディティの損失が原因であり、細胞毒性実験でも見られ、高ＭＳＬＮ発現Ｈ２２６細胞の殺傷と比べてＯＶＣＡＲ－３細胞を殺傷する効力が低下することがＭＡＴＣＨ４分子で見いだされた。

【表26】

【表27】

【表28】

【表29】

【表30】

【表31】

【表32】

【表33】

【表34】

【0223】

実施例８：ＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）を用いた生体内腫瘍増殖阻害：
緒言
ＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）が対照動物と比べて腫瘍増殖を効果的に制御する能力を明らかにするため、２つの生体内メソテリン発現細胞系異種移植片実験をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで実施した。１つの実験ではＨ２９２異種移植片モデルの腫瘍増殖阻害を調べ、別の１つの実験ではＨＰＡＣ異種移植片モデルの腫瘍腫瘍増殖阻害を調べた。

【0224】

方法
動物
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの雌のＮＣＧマウスを、ヒト化マウスが機能するのに適した条件下で育て、収容した。両方の研究で動物を８～１２週齢で使用した。

【0225】

研究設計
治療群の動物（Ｈ２９２群１つ当たりｎ＝５～６、ＨＰＡＣ群１つ当たりｎ＝１０）の脇腹の皮下に１×１０^７個のＨ２９２ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞と１×１０^７個のＰＢＭＣ、または１×１０^７個のＨＰＡＣ腫瘍細胞と２．５×１０^６個のＰＢＭＣを同時に移植した。５日後、興味ある分子を動物に静脈内投与し、実験終了まで５日ごとに追加投与した。この実験の間、定期的な間隔で、動物でキャリパー測定を利用して腫瘍の増殖をモニタするとともに体重減少をモニタした。対照群の平均腫瘍体積が８００ｍｍ^３になるか４０日目になるかのどちらか早い方に動物を安楽死させた。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物の健康と福祉の規制に従って動物をモニタし、安楽死させた。

【0226】

結果
方法の箇所に記載されているように、ＰＢＭＣ／Ｈ２９２同時移植モデルを利用して腫瘍増殖阻害の促進におけるＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）の有効性を評価した。Ｈ２９２細胞は中間レベルのＭＳＬＮを発現し、非小細胞肺癌から確立される。図１５に示されているように複数の用量レベルのＰＲＯ２０００を静脈内投与した。比較として、対照ＩｇＧ治療としてのパリビズマブ（抗ＲＳＶ抗体）のほか、ＰＢＭＣの非存在下（治療なし）で移植した腫瘍細胞を使用した。対照条件では腫瘍が増殖することが観察された（薄い灰色の線、図１５Ａ）。ＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ．ＣＤ３）分子を用いた治療では、１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇで対照と比べて腫瘍増殖が阻害された（図１５Ａのそれぞれ黒い線と濃い灰色の線）。二元配置分散分析の後にテューキーの多重比較検定を用いて治療の有意性を調べた；４０日目のデータが図１５Ｂに示されており、それぞれの点は個々の動物を表わす。２つのより大きな用量（１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇ）では、パリビズマブで治療した動物（ｃｔｒｌ）および無治療の動物と比べて腫瘍体積が有意に小さかった。最低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）は次善最適であるように見えた。というのもこれらの比較はパリビズマブで治療した動物と比べて有意でなかったからである。動物の体重は実験全体を通じて比較的安定していたため、全体として動物の健康に有害な効果はないように見えた（データは示さない）。合わせると、これらのデータは、多重特異性抗体ＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）が生体内腫瘍増殖阻害活性を持ち、がん免疫療法にとっての有望な概念的候補であることを示す。

【0227】

方法の箇所に記載されているように、ＰＢＭＣ／ＨＰＡＣ同時移植モデルを利用して腫瘍増殖阻害の促進におけるＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）の有効性をさらに評価した。ＨＰＡＣ腫瘍細胞はＨ２９２と比べて高いレベルのＭＳＬＮを発現する。Ｈ２９２モデルと同様、対照条件では増殖が観察され（図１６、パリビズマブ）、試験条件では用量に依存した腫瘍増殖阻害が観察された。二元配置分散分析の後にテューキーの多重比較検定を用いて治療の有意性を調べた。最低用量のＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）で、１価ＭＳＬＮを標的とする分子であるＰＲＯ１８７２（ＭＳＬＮｘＣＤ３ｘｈＳＡ）の最低用量と比べて複数の時点で有意な腫瘍増殖阻害の結果になることが観察された。このデータは、より高レベルのＭＳＬＮを発現している細胞に対するＰＲＯ２０００（biＭＳＬＮ_高ＫＤｘＣＤ３ｘｈＳＡ）のアビディティに基づく活性が、改善された有効性をもたらすことを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【配列表】

2023526976000001.app

【国際調査報告】