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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-26
(54)【発明の名称】強化された合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20230619BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230619BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230619BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230619BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230619BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230619BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230619BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/12 ZNA
C07K14/725
C07K16/00
C12N5/10
A61K35/17
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022572623
(86)(22)【出願日】2021-05-25
(85)【翻訳文提出日】2023-01-20
(86)【国際出願番号】 CN2021095733
(87)【国際公開番号】W WO2021238903
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】202011549176.4
(32)【優先日】2020-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010449454.2
(32)【優先日】2020-05-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522260986
【氏名又は名称】ブリスター イムノテック リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】513244281
【氏名又は名称】チンファ ユニヴァーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＴＳＩＮＧＨＵＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ルイ， ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ジアシェン
(72)【発明者】
【氏名】レイ， レイ
(72)【発明者】
【氏名】ユー， リ
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ， シュエチアン
(72)【発明者】
【氏名】リン， シン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087CA12
4C087NA05
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、バイオ医薬品の分野、特にＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする強化された合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）、合成Ｔ細胞受容体抗原受容体を含むＴ細胞、並びにそれらの使用に関する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ） α鎖とＴＣＲ β鎖とを含むαβ ＴＣＲであって、少なくとも１つの機能的ドメインが、前記αβ ＴＣＲの前記ＴＣＲ α鎖及び／又は前記ＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結しており、前記ＴＣＲ α鎖が第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ β鎖が第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域が第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域が第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合する、αβ ＴＣＲ、
或いは、
ｉｉ）ＴＣＲ γ鎖とＴＣＲδ鎖とを含むγδ ＴＣＲであって、少なくとも１つの機能的ドメインが、前記γδ ＴＣＲの前記ＴＣＲ γ鎖及び／又は前記ＴＣＲ δ鎖のＣ末端と連結しており、
前記ＴＣＲ γ鎖が第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ δ鎖が第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域が第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域が第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、
好ましくは、前記第１の抗原がＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原がＣＤ２０であるか、又は前記第１の抗原がＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原がＣＤ１９である、γδ ＴＣＲ
である、改変されたＴ細胞受容体。
【請求項2】
前記抗原結合領域が抗体に由来する、請求項１に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項3】
ｉ）の前記αβ ＴＣＲの前記ＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖の天然エンドドメインが欠損しているか、或いはｉｉ）の前記γδ ＴＣＲの前記ＴＣＲ γ鎖及び／又はＴＣＲ δ鎖の天然エンドドメインが欠損している、請求項１又は２に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項4】
ｉ）の前記αβ ＴＣＲにおいて、前記機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損している前記ＴＣＲ α鎖及び／又は前記ＴＣＲ β鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結しているか、或いはｉｉ）の前記γδ ＴＣＲにおいて、前記機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損している前記ＴＣＲ γ鎖及び／又は前記ＴＣＲ δ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、請求項３に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項5】
前記リンカーが（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは３である、請求項４に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項6】
少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子のエンドドメイン等が、ｉ）の前記αβ ＴＣＲのＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の一方のみのＣ末端に連結しているか、又は少なくとも１つの機能的ドメインが、ｉｉ）の前記γδ ＴＣＲのＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖の一方のみのＣ末端に連結している、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項7】
少なくとも１つの機能的ドメインが、ｉ）の前記αβ ＴＣＲのＴＣＲ α鎖のＣ末端に連結している、請求項６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項8】
前記ＴＣＲ α鎖の天然エンドドメインが欠損している、請求項７に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項9】
前記機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損している前記ＴＣＲ α鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、請求項８に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項10】
前記リンカーが例えば（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である、請求項９に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項11】
少なくとも１つの機能的ドメインが、ｉ）の前記αβ ＴＣＲのＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結している、請求項６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項12】
前記ＴＣＲ β鎖の天然エンドドメインが欠損している、請求項１１に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項13】
前記機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損している前記ＴＣＲ β鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、請求項１２に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項14】
前記リンカーが例えば（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である、請求項１３に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項15】
少なくとも１つの機能的ドメインが、ｉｉ）の前記γ δ ＴＣＲのＴＣＲ γ鎖のＣ末端に連結している、請求項６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項16】
前記ＴＣＲ γ鎖の天然エンドドメインが欠損している、請求項１５に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項17】
前記機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損している前記ＴＣＲ γ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、請求項１６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項18】
前記リンカーが、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である、請求項１７に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項19】
少なくとも１つの機能的ドメインが、ｉｉ）の前記γδ ＴＣＲのＴＣＲ δ鎖のＣ末端に連結している、請求項６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項20】
前記ＴＣＲ δ鎖の天然エンドドメインが欠損している、請求項１９に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項21】
前記機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損している前記ＴＣＲ δ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、請求項２０に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項22】
前記リンカーが、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎ、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である、請求項２１に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項23】
少なくとも１つの機能的ドメインが、ｉ）の前記αβ ＴＣＲのＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖の各Ｃ末端に連結している、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項24】
前記ＴＣＲ α鎖及び前記ＴＣＲ β鎖の両方の天然エンドドメインが欠損している、請求項２３に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項25】
前記機能的ドメインが、天然エンドドメインがそれぞれ欠損している前記ＴＣＲ α鎖及び前記ＴＣＲβ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介してそれぞれ連結している、請求項２４に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項26】
前記リンカーが、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である、請求項２５に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項27】
少なくとも１つの機能的ドメインが、ｉｉ）の前記γδ ＴＣＲのＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖の各Ｃ末端に連結している、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項28】
前記ＴＣＲ γ鎖及び前記ＴＣＲ δ鎖の両方の天然エンドドメインが欠損している、請求項２７に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項29】
前記機能的ドメインが、天然エンドドメインがそれぞれ欠損している前記ＴＣＲ γ鎖及び前記ＴＣＲ δ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、請求項２８に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項30】
前記リンカーが、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である、請求項２９に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項31】
ｉ）の前記αβ ＴＣＲの前記ＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖が、同一の若しくは異なる機能的ドメインと連結しているか、又はｉｉ）の前記γδ ＴＣＲの前記ＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖が、同一の若しくは異なる機能的ドメインと連結している、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項32】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを上回る機能的ドメインが、ｉ）の前記αβ ＴＣＲの前記ＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結しているか、或いは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを上回る機能的ドメインが、ｉｉ）の前記γδ ＴＣＲのＴＣＲ γ鎖及び／又はＴＣＲ δ鎖のＣ末端に連結している、請求項１～３１のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項33】
前記少なくとも１つの機能的ドメインが、共刺激分子、例えばＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、及びＣＤ１３７等のエンドドメイン、又は共阻害分子、例えばＴＩＭ３、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、及びＬＡＧ３等のエンドドメイン、又はサイトカイン受容体、例えばインターロイキン受容体（例えばＩＬ－２受容体等）、インターフェロン受容体、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体、コロニー刺激因子受容体、ケモカイン受容体、増殖因子受容体等、若しくはその他の膜タンパク質のエンドドメイン、又は細胞内タンパク質、例えばＮＩＫ等のドメインから選択される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項34】
前記共刺激分子のエンドドメインが、ＯＸ４０又はＩＣＯＳ、好ましくはＯＸ４０である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項35】
前記第１の定常領域が、天然ＴＣＲ α鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ α鎖定常領域若しくは天然マウスＴＣＲ α鎖定常領域であるか、又は前記第１の定常領域が、天然ＴＣＲ γ鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ γ鎖定常領域若しくは天然マウスＴＣＲ γ鎖定常領域である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項36】
前記第１の定常領域が、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域又は改変されたＴＣＲ γ鎖定常領域である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項37】
前記改変されたＴＣＲ α鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、４８位のアミノ酸、例えばトレオニン（Ｔ）等がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する、請求項３６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項38】
前記改変されたＴＣＲ α鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、１１２位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸、例えばメチオニン（Ｍ）等がイソロイシンＩに変異しており、及び１１５位のアミノ酸、例えばグリシン（Ｇ）等がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する、請求項３６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項39】
前記改変されたＴＣＲ α鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、アミノ酸、例えば６位のＥ等がＤに置換しており、１３位のＫがＲに置換しており、及び１５～１８位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する、請求項３６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項40】
前記改変されたＴＣＲ α鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、４８位のアミノ酸、例えばトレオニン（Ｔ）等がシステイン（Ｃ）に変異しており、１１２位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸、例えばメチオニン（Ｍ）等がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、及び１１５位のアミノ酸、例えばグリシン（Ｇ）等がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する、請求項３６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項41】
前記改変されたＴＣＲ α鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、アミノ酸、例えば６位のＥ等がＤに置換しており、１３位のＫがＲに置換しており、１５～１８位のアミノ酸が欠損しており、４８位のアミノ酸、例えばトレオニン（Ｔ）等がシステイン（Ｃ）に変異しており、１１２位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸、例えばメチオニン（Ｍ）等がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、及び１１５位のアミノ酸、例えばグリシン（Ｇ）等がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する、請求項３６に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項42】
前記第１の定常領域が、配列番号１、３、５、７、８、２６、４１、４２、及び４８のうちの１つで表されたヌクレオチド配列を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項43】
前記第２の定常領域が、天然ＴＣＲ β鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ β鎖定常領域若しくは天然マウスＴＣＲ β鎖定常領域であるか、又は前記第２の定常領域が、天然ＴＣＲ δ鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ δ鎖定常領域若しくは天然マウスＴＣＲ δ鎖定常領域である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項44】
前記第２の定常領域が、改変されたＴＣＲ β鎖定常領域又は改変されたＴＣＲ δ鎖定常領域である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項45】
前記改変されたＴＣＲ β鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲ β鎖定常領域と比較して、５６位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲ β鎖定常領域に由来する、請求項４４に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項46】
前記改変されたＴＣＲ β鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲ β鎖定常領域と比較して、３位のアミノ酸、例えばＲ等がＫに置換しており、６位のアミノ酸、例えばＴ等がＦに置換しており、９位のＫがＥに置換しており、１１位のＳがＡに置換しており、１２位のＬがＶに置換しており、並びに１７位及び２１～２５位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ β鎖定常領域に由来する、請求項４５に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項47】
前記改変されたＴＣＲ β鎖定常領域が、野生型マウスＴＣＲ β鎖定常領域と比較して、５６位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がシステイン（Ｃ）に変異しており、３位のアミノ酸、例えばＲ等がＫに置換しており、６位のアミノ酸、例えばＴ等がＦに置換しており、９位のＫがＥに置換しており、１１位のＳがＡに置換しており、１２位のＬがＶに置換しており、並びに１７位及び２１～２５位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ β鎖定常領域に由来する、請求項４４に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項48】
配列番号２、４、６、９、２７、４３、及び４９のうちの１つで表されたヌクレオチド配列を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項49】
前記抗原結合領域が、抗体に由来する、請求項１～４８のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項50】
前記抗原結合領域が単鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含み、例えば、前記単鎖抗体が、ｎが１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは１又は３である（Ｇ４Ｓ）ｎ等のリンカーによりリンクした重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項51】
ＣＤ１９に特異的に結合する前記抗原結合領域が、配列番号４４で表された重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号４５で表された軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項52】
ＣＤ１９に特異的に結合する前記抗原結合領域が、配列番号４６で表された重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号４７で表された軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項53】
ＣＤ１９に特異的に結合する前記抗原結合領域が、配列番号３９で表されたｓｃＦｖアミノ酸配列を含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項54】
ＣＤ２０に特異的に結合する前記抗原結合領域が、配列番号５４で表された重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５５で表された軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項55】
ＣＤ２０に特異的に結合する前記抗原結合領域が、配列番号５６で表された重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５７で表された軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項56】
ＣＤ２０に特異的に結合する前記抗原結合領域が、配列番号３８で表されたｓｃＦｖアミノ酸配列を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項57】
前記ＴＣＲ α鎖が、配列番号５９で表されたアミノ酸配列を含み、前記ＴＣＲ β鎖が、配列番号６０で表されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項58】
ｉ）前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、第１の抗原及び第２の抗原の両方に特異的に結合するように、前記第１の抗原結合領域が、前記第１の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域と前記第２の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域とを含む一方、前記第２の抗原結合領域が、前記第１の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域と前記第２の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域とを含むか、又はｉｉ）前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、第１の抗原及び第２の抗原の両方に特異的に結合するように、前記第１の抗原結合領域が、前記第１の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域と前記第２の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域とを含む一方、前記第２の抗原結合領域が、前記第１の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域と前記第２の抗原と特異的とに結合する抗体重鎖可変領域を含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、第１の抗原及び第２の抗原の両方に特異的に結合するように、前記第１の抗原結合領域が、前記第１の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域と前記第２の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域とを含む一方、前記第２の抗原結合領域が、前記第１の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域と前記第２の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域とを含み、
好ましくは、前記第１の抗原がＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原がＣＤ２０であるか、又は前記第１の抗原がＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原がＣＤ１９である、
請求項１～４９のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体。
【請求項59】
請求項１～５８のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞受容体を含む、単離された治療用免疫細胞。
【請求項60】
Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、請求項５９に記載の治療用免疫細胞。
【請求項61】
請求項５９又は６０に記載の治療用免疫細胞及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項62】
対象における疾患、例えばがん等を処置するための薬物を調製する際の、請求項５９若しくは６０に記載の治療用免疫細胞、又は請求項６１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品の分野、特にＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする強化された合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）、合成Ｔ細胞受容体抗原受容体を含むＴ細胞、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞療法、特にＴ細胞関連療法が今年になって急速に発展したが、Ｔ細胞関連療法の中でも、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法及びＴＣＲ－Ｔ療法が多くの注目を浴びた。
【0003】
ＣＡＲ－Ｔ療法は、Ｔ細胞内でのＣＡＲ分子の発現に基づく。ＣＡＲ分子は、３つの部分：エクトドメイン（抗体に由来する抗原認識ドメインであり、また標的抗原の認識に関与する）；膜貫通ドメイン；及びエンドドメイン（Ｔ細胞受容体に由来するシグナル分子及び共刺激シグナル分子であり、また刺激を受け取った後のＴ細胞活性化シグナルの伝達に関与する）から構成される。ＣＡＲ分子が対応するその抗原と結合すると凝集し、Ｔ細胞のエフェクター機能が開始し、そして標的腫瘍細胞を殺滅する。
【0004】
ＴＣＲ－Ｔ療法はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づく。ＴＣＲはＴ細胞の主体であり、ＴＣＲの種類に基づき、αβ Ｔ細胞及びγ δ Ｔ細胞に分けることができる。発生過程において、Ｔ前駆体細胞は、ＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖においてＶＤＪ再構成を受け、再構成が成功すればγδ Ｔ細胞へと発生し、又は再構成が不成功に終わればＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖においてＶＤＪ組み換えを受け、そしてαβ Ｔ細胞へと発生する。αβ Ｔ細胞は末梢血液Ｔ細胞の９０％～９５％を占める一方、γ δ Ｔ細胞は末梢血液Ｔ細胞の５％～１０％を占める。２種類のＴ細胞が、ＭＨＣ拘束性及びＭＨＣ非拘束性の様式でそれぞれ抗原を認識し、病原体及び腫瘍に対する免疫性において重要な役割を演ずる。
【0005】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体分子は複数の鎖を含有し、複数の鎖のうちＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖（又はＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖）が、ＭＨＣポリペプチド分子の認識に関与し、そしてその他６つのＣＤ３サブユニットがＴＣＲ α／β鎖（又はＴＣＲ γ／δ鎖）と結合してシグナル伝達の役割を演ずる。天然のＴＣＲ複合体は、１０個のＩＴＡＭシグナル配列を含有し、理論的には、ＣＡＲよりも強いシグナルを伝達することができる。天然ＴＣＲのシグナル伝達機能を利用することにより、Ｔ細胞の障害を緩和するための新たな受容体を構築することが可能であり、これは、抗固形腫瘍の役割においてより良好にふるまうことができる。ＴＣＲのエクトドメインは、抗体のＦａｂドメインと非常に類似しており、従って抗体特異性を有するだけでなく、Ｔ細胞の活性化を媒介する際の天然ＴＣＲの優れたシグナル伝達機能も有する合成ＴＣＲ及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）を取得するために、ＴＣＲの可変領域配列を抗体の可変領域配列と置き換えることが可能である。
【0006】
しかしながら、天然ＴＣＲに由来するＳＴＡＲ－ＴはＴ細胞の活性化において共刺激シグナルを欠いており、またその増殖及び活性化能力が多くの場合毀損している。従って、改善されたＴＣＲ及び対応するＴＣＲ－Ｔ療法が、この分野においてなおも必要とされる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】定常領域システイン改変、膜貫通ドメイン及びエンドドメイン改変によるＳＴＡＲの最適化の概略図。
【図2】共刺激分子受容体エンドドメインをα及び／又はβ鎖に付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図。
【図3】α及び／又はβ鎖エンドドメインの欠損後に共刺激分子受容体エンドドメインを直接又はリンカーを介して付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図。
【図4】共刺激分子受容体エンドドメインをＣＤ３サブユニットに付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図。
【図5】サイトカイン受容体シグナル伝達ドメインをα及び／又はβ鎖に付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図。
【図6】ＷＴ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞とｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の間での腫瘍標的細胞殺滅能力の比較。
【図7】異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比における、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する各種共刺激受容体エンドドメインの効果。
【図8】異なる共培養時間における、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する各種共刺激受容体エンドドメインの効果。
【図9】異なるＥ：Ｔ比における、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、α鎖、β鎖、並びにα鎖及びβ鎖に付加されたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図10】異なる共培養時間における、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、α鎖、β鎖、並びにα鎖及びβ鎖に付加されたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図11】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン分泌に対する各種共刺激受容体エンドドメインの効果。
【図12】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖に対する各種共刺激受容体エンドドメインの効果。
【図13】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、α鎖、β鎖、並びにα鎖及びβ鎖に付加されたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図14】ＴＣＲα鎖に連結された異なる共刺激受容体エンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺滅能力。
【図15】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、異なるＣＤ３サブユニットに付加された各種共刺激受容体エンドドメインの効果。
【図16】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖に対する、異なるＣＤ３サブユニットに付加された各種共刺激受容体エンドドメインの効果。
【図17】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠損α鎖にリンクしたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図18】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠損β鎖にリンクしたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図19】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２分泌に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠損α及び／又はβ鎖にリンクしたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図20】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠損α及び／又はβ鎖にリンクしたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図21】セントラルメモリーＴ細胞分化に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠損α鎖にリンクしたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図22】Ｔ細胞分化に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠損α鎖にリンクしたＯＸ４０エンドドメインの効果。
【図23】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリシン改変の効果。
【図24】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌に対する、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリシン改変の効果。
【図25】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２分泌に対する、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリシン改変の効果。
【図26】セントラルメモリーＴ細胞分化に対する、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリシン改変の効果。
【図27】Ｔ細胞分化に対する、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリシン改変の効果。
【図28】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺滅能力に対する、α及び／又はβ鎖にリンクした各種サイトカイン受容体シグナル伝達ドメインの効果。
【図29】異なるサイトカイン受容体刺激ドメインが連結した変異ＳＴＡＲとα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲの間における、殺滅効果の比較。
【図30】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２分泌に対する、α及び／又はβ鎖にリンクした各種サイトカイン受容体シグナル伝達ドメインの効果。
【図31】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌に対する、α及び／又はβ鎖にリンクした各種サイトカイン受容体シグナル伝達ドメインの効果。
【図32】セントラルメモリーＴ細胞分化に対する、α及び／又はβ鎖にリンクした各種サイトカイン受容体シグナル伝達ドメインの効果。
【図33】Ｔ細胞分化に対する、α及び／又はβ鎖にリンクした各種サイトカイン受容体シグナル伝達ドメインの効果。
【図34】ｉｎ ｖｉｖｏでの、マウス腫瘍モデルにおける、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ及びＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍ｉｎ ｖｉｖｏ効果。
【図35】αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ及びＣＡＲ－Ｔを投与されたマウスの生残曲線。
【図36】マウスにおける、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ及びＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｖｏでの増殖。
【図37】マウス腫瘍モデルにおける、各種ＳＴＡＲ構造及びＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍ｉｎ ｖｉｖｏ効果。
【図38】定常領域システイン改変、膜貫通ドメイン及びＮ末端再配置によるＳＴＡＲの最適化の概略図。
【図39】共刺激分子ドメインとＳＴＡＲ構造の間の連結位置の例。α鎖への連結のみを示す。
【図40】共刺激分子ドメインを含むＳＴＡＲ構造の例。
【図41】ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むＳＴＡＲの殺滅能力。
【図42】ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むＳＴＡＲの増殖シグナルと関連する、核ＲＥＬＢレベル。
【図43】抗ＣＤ１９である各種ＳＴＡＲの結果。
【図44】共刺激因子がα及びβ鎖に付加された、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２０である各種ＳＴＡＲの結果。
【図45】共刺激因子がα鎖に付加された、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２０ＳＴＡＲの結果。
【発明を実施するための形態】
【0008】
別途、表示又は定義されない限り、使用されるすべての用語は、当業者によって理解される、当分野における一般的な意味を有する。例えば、標準マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｌｅｗｉｎの「Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ」、及びＲｏｉｔｔらの「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）等、並びに本明細書で引用される一般的な先行技術を参照；それに加えて、別途記載がなければ、すべての方法、ステップ、技術、及び操作は、具体的に詳記されなくても当業者により理解されるはずであり、それ自体公知の方式で実施することができ、またすでに実施されている。例えば、標準マニュアル、上記一般的先行技術、及びその中で引用されたその他の参考資料も参照されたい。
【0009】
本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」は、該用語により結びつけられた項目のすべての組合せを包含し、また本明細書において個別にリスト化されたものと認識されなければならない。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ」、「Ａ及びＢ」、及び「Ｂ」を網羅する。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ及びＢ」、「Ａ及びＣ」、「Ｂ及びＣ」、及び「Ａ及びＢ及びＣ」を網羅する。
【0010】
用語「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、タンパク質又は核酸の配列を記載するのに本明細書において使用され、該タンパク質又は核酸は前記配列から構成される場合もあれば、また前記タンパク質又は核酸の一方又は両方の端部において追加のアミノ酸又はヌクレオチドを有し得るが、しかし本明細書に記載される活性をなおも有する場合もある。それに加えて、当業者は、ポリペプチドのＮ末端において開始コドンによりコードされるメチオニンがある特定の実用的状況において保持されるが（例えば、特定の発現系内で発現されるとき）、しかしポリペプチドの機能に実質的に影響を及ぼさないことを理解する。従って、特定のポリペプチドアミノ酸配列を記載する際には、開始コドンによりコードされるメチオニンを特定のポリペプチドアミノ酸配列のＮ末端に含有しない場合もあるが、しかしあるときまでメチオニンを含む配列もなおも網羅し、同様に特定のポリペプチドアミノ酸配列のコーディングヌクレオチド配列も開始コドンを含有し得るが、但しその逆も成り立つ。
【0011】
本明細書で使用される場合、「配列番号ｘに紐づけられるアミノ酸番号」（配列番号ｘは、本明細書においてリスト化されている具体的な配列である）とは、記載される特定のアミノ酸の位置番号が、配列番号ｘ上の当該アミノ酸に対応するアミノ酸の位置番号であることを意味する。異なるアミノ酸配列間のアミノ酸の対応性は、当技術分野において公知の配列アラインメント法により決定可能である。例えば、アミノ酸の対応性は、２つの配列がＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用しながらデフォルトパラメーターを用いてアライメントされ得るＥＭＢＬ－ＥＢＩオンラインアライメントツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／）により決定可能である。例えば、ポリペプチドのＮ末端から開始して、４６位のアラニンが、配列番号ｘの４８位のアミノ酸と、配列アライメントにおいてアライメントされる場合、該ポリペプチド内のアミノ酸は、「ポリペプチドの４８位のアラニン、但し配列番号ｘに紐付けられるアミノ酸位置」としても本明細書においてやはり記載され得る。本発明では、α鎖定常領域と関連するアミノ酸位置について、配列番号３が紐付けられる。本発明では、β鎖定常領域と関連するアミノ酸位置について、配列番号４が紐付けられる。
【0012】
１つの態様では、改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体が本明細書において提供され、その場合、
ｉ）ＴＣＲはαβ ＴＣＲであり得、αβ ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζを含み、少なくとも１つの機能的ドメインが、ＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に連結しており、
前記ＴＣＲ α鎖は、第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ β鎖は、第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域は第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域は第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域は相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原はＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原はＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原はＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原はＣＤ１９であり、
或いは、
ｉｉ）ＴＣＲはγ δ ＴＣＲであり得、γ δ ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζを含み；少なくとも１つの機能的ドメインが、ＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に連結しており、
前記ＴＣＲ γ鎖は、第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ δ鎖は、第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域は第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域は第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域は相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原はＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原はＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原はＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原はＣＤ１９である。
ｉ）ＴＣＲはαβ ＴＣＲであり得、αβ ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζを含み、少なくとも１つの機能的ドメインが、ＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に連結しており、
前記ＴＣＲ α鎖は、第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ β鎖は、第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域は第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域は第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域は相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原はＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原はＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原はＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原はＣＤ１９であり、
或いは、
ｉｉ）ＴＣＲはγ δ ＴＣＲであり得、γ δ ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζを含み；少なくとも１つの機能的ドメインが、ＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に連結しており、
前記ＴＣＲ γ鎖は、第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ δ鎖は、第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域は第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域は第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域は相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原はＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原はＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原はＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原はＣＤ１９である。
【0013】
一般的に、ＴＣＲにおいて、抗原結合領域は定常領域のＮ末端に位置し、その両方は直接又はリンカーを介して連結され得る。
【0014】
１つの態様では、改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供され、その場合、ＴＣＲは、
ｉ）ＴＣＲ α鎖とＴＣＲ β鎖とを含むαβ ＴＣＲであって、少なくとも１つの機能的ドメインが、前記αβ ＴＣＲのＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結しており、
前記ＴＣＲ α鎖が第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ β鎖が第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域が第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域が第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原はＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原はＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原はＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原はＣＤ１９である、αβ ＴＣＲ、
或いは、
ｉｉ）ＴＣＲ γ鎖とＴＣＲδ鎖とを含むγδ ＴＣＲであって、少なくとも１つの機能的ドメインが、前記γδ ＴＣＲの前記ＴＣＲ γ鎖及び／又は前記ＴＣＲ δ鎖のＣ末端と連結しており、
前記ＴＣＲ γ鎖が第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ δ鎖が第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域が第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域が第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原がＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原がＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原がＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原がＣＤ１９である、γδ ＴＣＲ
であり得る。
ｉ）ＴＣＲ α鎖とＴＣＲ β鎖とを含むαβ ＴＣＲであって、少なくとも１つの機能的ドメインが、前記αβ ＴＣＲのＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結しており、
前記ＴＣＲ α鎖が第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ β鎖が第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域が第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域が第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原はＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原はＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原はＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原はＣＤ１９である、αβ ＴＣＲ、
或いは、
ｉｉ）ＴＣＲ γ鎖とＴＣＲδ鎖とを含むγδ ＴＣＲであって、少なくとも１つの機能的ドメインが、前記γδ ＴＣＲの前記ＴＣＲ γ鎖及び／又は前記ＴＣＲ δ鎖のＣ末端と連結しており、
前記ＴＣＲ γ鎖が第１の定常領域と第１の抗原結合領域とを含み、且つ前記ＴＣＲ δ鎖が第２の定常領域と第２の抗原結合領域とを含み、
前記第１の抗原結合領域が第１の抗原と特異的に結合し、且つ前記第２の抗原結合領域が第２の抗原と特異的に結合するか、又は前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、相互に組み合わされて、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原がＣＤ１９であり且つ前記第２の抗原がＣＤ２０であるか又は前記第１の抗原がＣＤ２０であり且つ前記第２の抗原がＣＤ１９である、γδ ＴＣＲ
であり得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つの天然エンドドメインが欠損しているか、又はγδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つの天然エンドドメインが欠損している。
【0016】
いくつかの実施形態では、αβ ＴＣＲ内のＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖の天然エンドドメインが欠損しているか、或いはγδ ＴＣＲ内のＴＣＲ γ鎖及び／又はＴＣＲ δ鎖の天然エンドドメインが欠損している。
【0017】
いくつかの実施形態では、αβ ＴＣＲ複合体において、機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。
【0018】
いくつかの実施形態では、αβ ＴＣＲ複合体において、機能的ドメインが、欠損した天然エンドドメインを有するＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。
【0019】
いくつかの実施形態では、γδ ＴＣＲ複合体において、機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。
【0020】
いくつかの実施形態では、γδ ＴＣＲ複合体において、機能的ドメインが、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖の少なくとも１つのＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。
【0021】
いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表す。好ましくは、ｎは１～６の整数であり、より好ましくは、ｎは２～５の整数であり、及び最も好ましくは、ｎは３である。
【0022】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの１つのＣ末端に連結している。
【0023】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ内のＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結している。
【0024】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの１つのＣ末端に連結している。
【0025】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ内のＴＣＲ γ鎖及び／又はＴＣＲ δ鎖のＣ末端に連結している。
【0026】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ複合体内のＣＤ３ δ、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ ε、及びＣＤ３ ζは、それらのＣ末端にさらに連結した少なくとも１つの機能的ドメインを含まない。
【0027】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ α鎖のＣ末端に連結している。
【0028】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ内のＴＣＲ α鎖のＣ末端に連結している。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ α鎖の天然エンドドメインが欠損している。
【0030】
いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ α鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、及び最も好ましくは、ｎは３である。
【0031】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結している。
【0032】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ内のＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結している。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ β鎖の天然エンドドメインは欠損している。
【0034】
いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ β鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、及び最も好ましくは、ｎは３である。
【0035】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ γ鎖のＣ末端に連結している。
【0036】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ内のＴＣＲγ鎖のＣ末端に連結している。
【0037】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ γ鎖の天然エンドドメインが欠損している。
【0038】
いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ γ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、及び最も好ましくは、ｎは３である。
【0039】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ δ鎖のＣ末端に連結している。
【0040】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ内のＴＣＲ δ鎖のＣ末端に連結している。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ δ鎖の天然エンドドメインが欠損している。
【0042】
いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ δ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、及び最も好ましくは、ｎは３である。
【0043】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの２つのＣ末端に連結している。
【0044】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの２つのＣ末端に連結している。
【0045】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖の各Ｃ末端に連結している。
【0046】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβ ＴＣＲ内のＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖の各Ｃ末端に連結している。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲ β鎖のそれぞれの天然エンドドメインが欠損している。
【0048】
いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖のそれぞれのＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、及び最も好ましくは、ｎは３である。
【0049】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖の各Ｃ末端に連結している。
【0050】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδ ＴＣＲ内のＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖の各Ｃ末端に連結している。
【0051】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖のそれぞれの天然エンドドメインが欠損している。
【0052】
いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、天然エンドドメインが欠損しているＴＣＲ γ鎖及びＴＣＲ δ鎖のそれぞれのＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、及び最も好ましくは、ｎは３である。
【0053】
いくつかの実施形態では、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの２つ以上が、同一の又は異なる機能的ドメインと連結している。
【0054】
いくつかの実施形態では、αβ ＴＣＲ内のＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖は、同一の又は異なる機能的ドメインと連結している。
【0055】
いくつかの実施形態では、γδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの２つ以上が、同一の又は異なる機能的ドメインと連結している。
【0056】
いくつかの実施形態では、γδ ＴＣＲ内のＴＣＲ γ鎖及び／又はＴＣＲ δ鎖は、同一の又は異なる機能的ドメインと連結している。
【0057】
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを上回る機能的ドメインが、αβ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に連結している。
【0058】
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを上回る機能的ドメインが、αβ ＴＣＲ内のＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結している。
【0059】
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを上回る機能的ドメインが、γδ ＴＣＲ複合体内のＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に連結している。
【0060】
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを上回る機能的ドメインが、γδ ＴＣＲ内のＴＣＲ γ鎖及び／又はＴＣＲ δ鎖のＣ末端に連結している。
【0061】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等が、複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの１、２、３、４、５、又は６個のＣ末端に連結している。
【0062】
いくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等が、複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの１つのＣ末端に連結している。
【0063】
例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等が、複合体内のＴＣＲ α鎖のＣ末端に連結している。いくつかの好ましい実施形態では、共刺激分子エンドドメインは、ＯＸ４０又はＩＣＯＳである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ δ、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ ε、及びＣＤ３ ζは、それらのＣ末端にさらに連結した少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等を含有しない可能性がある。
【0064】
或いは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等が、複合体内のＣＤ３δのＣ末端に連結している。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ α、ＴＣＲ β、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ ε、及びＣＤ３ ζは、それらのＣ末端に連結した少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等を含有しない可能性がある。
【0065】
いくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等が、複合体内のＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの２つのＣ末端に連結している。
【0066】
例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等が、複合体内のＴＣＲ α鎖及びＴＣＲ β鎖のＣ末端に連結している。いくつかの好ましい実施形態では、共刺激分子エンドドメインは、ＯＸ４０又はＩＣＯＳである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ δ、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ ε、及びＣＤ３ ζは、それらのＣ末端にさらに連結した少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば共刺激分子エンドドメイン等を含有しない。
【0067】
いくつかの実施形態では、機能的ドメインは外因性の機能的ドメインである。いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、外因性エンドドメイン、例えば細胞内伝達機能に関与するドメイン等である。
【0068】
本明細書で使用される場合、「外因性」とは、外来種に由来するタンパク質又は核酸配列を意味し、或いは同一種に由来する場合には、計画的な人的介入により、タンパク質又は核酸配列の天然の形態から組成及び／又は位置において有意な変化を被ったタンパク質又は核酸配列を意味する。
【0069】
本明細書で使用される場合、「機能的ドメイン」は、共刺激分子、例えばＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、及びＣＤ１３７等のエンドドメイン、又は共阻害分子、例えばＴＩＭ３、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、及びＬＡＧ３等のエンドドメイン、又はサイトカイン受容体、例えばインターロイキン受容体（例えば、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７α受容体、又はＩＬ－２１受容体等）、インターフェロン受容体、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体、コロニー刺激因子受容体、ケモカイン受容体、増殖因子受容体等、若しくはその他の膜タンパク質のエンドドメイン、又は細胞内タンパク質、例えばＮＩＫ等のドメインから選択される。機能的ドメインは、サイトカイン受容体エンドドメインとヒトＳＴＡＴ５活性化部分（配列番号３５で表されるアミノ酸配列）との、直接又はリンカーを介した（例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、式中、ｎは１～１０の整数を表す）融合体でもあり得る。
【0070】
いくつかの好ましい実施形態では、機能的ドメインは、共刺激分子エンドドメイン、好ましくはＯＸ４０エンドドメイン又はＩＣＯＳエンドドメイン、及びより好ましくはＯＸ４０エンドドメインである。
【0071】
例示的ＣＤ４０エンドドメインは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的ＯＸ４０エンドドメインは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的ＩＣＯＳエンドドメインは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的ＣＤ２８エンドドメインは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的４－１ＢＢエンドドメインは、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的ＣＤ２７エンドドメインは、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的ＩＬ－２β受容体エンドドメインは、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的ＩＬ－１７α受容体エンドドメインは、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含有する。例示的ＩＬ－２１受容体エンドドメインは、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含有する。ＩＬ－２β受容体エンドドメインとヒトＳＴＡＴ５活性化部分との例示的な融合体アミノ酸配列は、配列番号３６で表される。ＩＬ－１７α受容体エンドドメインとヒトＳＴＡＴ５活性化部分との例示的な融合体アミノ酸配列は、配列番号３７で表される。
【0072】
いくつかの実施形態では、第１の定常領域は、天然ＴＣＲ α鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ α鎖定常領域（例示的ヒトＴＣＲ α鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号１で表される）若しくは天然マウスＴＣＲ α鎖定常領域（例示的マウスＴＣＲ α鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３で表される）であるか、又は第１の定常領域は、天然ＴＣＲ γ鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ γ鎖定常領域（例示的ヒトＴＣＲ γ鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号５０で表される）若しくは天然マウスＴＣＲ γ鎖定常領域（例示的マウスＴＣＲ γ鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号５１で表される）である。
【0073】
いくつかの実施形態では、第１の定常領域は、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域又は改変されたＴＣＲ γ鎖定常領域である。
【0074】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、４８位のアミノ酸、例えばトレオニン（Ｔ）等がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する。
【0075】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、１１２位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸、例えばメチオニン（Ｍ）等がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、及び１１５位のアミノ酸、例えばグリシン（Ｇ）等が、バリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する。
【0076】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、６位のアミノ酸（例えばＥ）がＤに置換し、１３位のＫがＲに置換し、及び１５～１８位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する。
【0077】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、４８位のアミノ酸、例えばトレオニン（Ｔ）等がシステイン（Ｃ）に変異しており、１１２位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸、例えばメチオニン（Ｍ）等がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、及び１１５位のアミノ酸、例えばグリシン（Ｇ）等がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する。
【0078】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、６位のアミノ酸（例えばＥ）がＤに置換しており、１３位のＫがＲに置換しており、１５～１８位のアミノ酸が欠損しており、４８位のアミノ酸、例えばトレオニン（Ｔ）等がシステイン（Ｃ）に変異しており、１１２位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸、例えばメチオニン（Ｍ）等がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、及び１１５位のアミノ酸、例えばグリシン（Ｇ）等がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する。
【0079】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ α鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ α鎖定常領域と比較して、定常領域エンドドメインが欠損し、例えば１３６～１３７位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ α鎖定常領域に由来する。
【0080】
いくつかの実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１、３、５、７、８、２６、４１、４２、及び５６のうちの１つで表されるアミノ酸配列を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、第２の定常領域は、天然ＴＣＲ β鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ β鎖定常領域（例示的ヒトＴＣＲ β鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号２で表される）若しくは天然マウスＴＣＲ β鎖定常領域（例示的マウスＴＣＲ β鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４で表される）、又は第２の定常領域は、天然ＴＣＲ δ鎖定常領域、例えば天然ヒトＴＣＲ δ鎖定常領域（例示的ヒトＴＣＲ δ鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号５２で表される）若しくは天然マウスＴＣＲ δ鎖定常領域（例示的マウスＴＣＲ δ鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号５３で表される）である。
【0082】
いくつかの実施形態では、第２の定常領域は、改変されたＴＣＲ β鎖定常領域又は改変されたＴＣＲ δ鎖定常領域である。
【0083】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ β鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ β鎖定常領域と比較して、５６位のアミノ酸、例えばトレオニン（Ｓ）等がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲ β鎖定常領域に由来する。
【0084】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ β鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ β鎖定常領域と比較して、３位のアミノ酸（例えばＲ）がＫに置換しており、６位のアミノ酸（例えばＴ）がＦに置換しており、９位のＫがＥに置換しており、１１位のＳがＡに置換しており、１２位のＬがＶに置換しており、並びに１７位及び２１～２５位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ β鎖定常領域に由来する。
【0085】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ β鎖定常領域と比較して、５６位のアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）等がシステイン（Ｃ）に変異しており、３位のアミノ酸（例えばＲ）がＫに置換しており、６位のアミノ酸（例えばＴ）がＦに置換しており、９位のＫがＥに置換しており、１１位のＳがＡに置換しており、１２位のＬがＶに置換しており、並びに１７位及び２１～２５位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ β鎖定常領域に由来する。
【0086】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ β鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲ β鎖定常領域と比較して、定常領域エンドドメインが欠損し、例えば１６７～１７２位のアミノ酸が欠損しているマウスＴＣＲ β鎖定常領域に由来する。
【0087】
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ β鎖定常領域は、配列番号２、４、６、９、２７、４３、及び４９のうちの１つで表されるアミノ酸配列を含む。
【0088】
「抗原結合領域」とは、単独で又は別の抗原結合領域と組み合わせて標的抗原に特異的に結合することができるドメインを指す。
【0089】
いくつかの実施形態では、抗原結合領域は、標的抗原と特異的に結合する抗体に由来する。
【0090】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域又は第２の抗原結合領域は、それぞれ同一の又は異なる標的抗原に対して独立的に、特異的に結合する能力を有し、例えば第１の抗原結合領域は第１の抗原と特異的に結合し、且つ第２の抗原結合領域は第２の抗原と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合領域は、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ抗体）であり、好ましくは、抗原結合領域は単鎖抗体、例えばｓｃＦｖ等である。ある特定の実施形態では、単鎖抗体は、リンカーを介して連結した重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは１又は３である。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的に結合する抗原結合領域は、配列番号４４で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号４５で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号４４で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号４５で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは１又は３である。
【0092】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的に結合する抗原結合領域は、配列番号４６で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号４７で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号４６で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号４７で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは１又は３である。
【0093】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的に結合する抗原結合領域は、配列番号３９で表されるｓｃＦｖアミノ酸配列を含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に特異的に結合する抗原結合領域は、配列番号５４で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５５で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号５４で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５５で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは１又は３である。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に特異的に結合する抗原結合領域は、配列番号５６で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５７で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号５６で表される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５７で表される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは１又は３である。
【0096】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に特異的に結合する抗原結合領域は、配列番号３８で表されるｓｃＦｖアミノ酸配列を含む。
【0097】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、相互に組み合わされて標的抗原に特異的に結合する。例えば、第１の抗原結合領域は抗体の重鎖を含む一方、第２の抗原結合領域は抗体の軽鎖を含み、その逆も成り立つ。
【0098】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域と第２の抗原結合領域とが相互に組み合わされて、第１の抗原及び第２の抗原の両方に特異的に結合するように、第１の抗原結合領域が、第１の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域と第２の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域とを含む一方、第２の抗原結合領域が、第１の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域と第２の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域とを含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域と第２の抗原結合領域とが相互に組み合わされて、第１の抗原及び第２の抗原の両方に特異的に結合するように、第１の抗原結合領域が、第１の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域と第２の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域とを含む一方、第２の抗原結合領域が、第１の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域と第２の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域とを含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域が相互に組み合わされて、第１の抗原及び第２の抗原の両方に特異的に結合するように、第１の抗原結合領域が、第１の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域と第２の抗原と特異的に結合する抗体軽鎖可変領域を含む一方、第２の抗原結合領域が、第１の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域と第２の抗原と特異的に結合する抗体重鎖可変領域とを含む。
【0101】
いくつかの好ましい実施形態では、第１の抗原はＣＤ１９であり且つ第２の抗原はＣＤ２０である。或いは、いくつかの好ましい実施形態では、第１の抗原はＣＤ２０であり且つ第２の抗原はＣＤ１９である。
【0102】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１９と特異的に結合する抗体重鎖可変領域は、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含み、及び軽鎖可変領域は、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む。
【0103】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１９と特異的に結合する抗体重鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含み、及び軽鎖可変領域は、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む。
【0104】
ある特定の実施形態では、ＣＤ２０と特異的に結合する抗体重鎖可変領域は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含み、及び軽鎖可変領域は、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む。
【0105】
ある特定の実施形態では、ＣＤ２０と特異的に結合する抗体重鎖可変領域は、配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含み、及び軽鎖可変領域は、配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、及び／又はＣＤ３ζは、ヒトＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、及び／又はＣＤ３ζである。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３γは配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３γは配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３γは配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３γは配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む。
【0107】
いくつかの実施形態では、本発明の改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＴＣＲ複合体は、配列番号５９で表されるようなＴＣＲ α鎖、及び配列番号６０で表されるようなＴＣＲ β鎖を含む。
【0108】
別の態様では、本発明の改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＴＣＲ複合体を含む、単離された治療用免疫細胞が本明細書に提示される。
【0109】
いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。その他の実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。
【0110】
別の態様では、本発明は、上記で定義したような、ＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの外因性の機能的エンドドメインが、ＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ＴＣＲ γ鎖、ＴＣＲ δ鎖、ＣＤ３ ε、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、及びＣＤ３ ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に連結している、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0111】
別の態様では、本発明は、上記で定義したようなＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0112】
いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも１つの共刺激分子エンドドメインとそのＣ末端において連結しているＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉ）α鎖をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）β鎖をコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）同一のリーディングフレーム内の、ｉ）とｉｉ）の間に位置する自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。α鎖をコードするヌクレオチド配列は、β鎖をコードするヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に位置し得る。
【0114】
いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも１つの共刺激分子エンドドメインとそのＣ末端において連結しているＴＣＲ γ鎖及び／又はＴＣＲ δ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉ）γ鎖をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）δ鎖をコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）同一のリーディングフレーム内の、ｉ）とｉｉ）の間に位置する自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。γ鎖をコードするヌクレオチド配列は、δ鎖をコードするヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に位置し得る。
【0116】
本明細書で使用される場合、「自己切断ペプチド」とは、細胞内で自己切断を実行することができるペプチドを意味する。例えば、自己切断ペプチドは、細胞内でプロテアーゼにより認識され、特異的に切断されるように、プロテアーゼ認識部位を含有し得る。
【0117】
或いは、自己切断ペプチドは２Ａポリペプチドであり得る。２Ａポリペプチドはウイルスからの短鎖ペプチドの種類であり、そして２Ａポリペプチドの自己切断は翻訳期間中に生ずる。２つの異なる標的タンパク質が２Ａポリペプチドによってリンクしており、且つ同一リーディングフレーム内で発現しているとき、２つの標的タンパク質はほぼ１：１の比で生成される。一般的な２Ａポリペプチドは、ブタテコウイルス（ｔｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）－１からのＰ２Ａ、トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルスからのＴ２Ａ、ウマ鼻炎ＡウイルスからのＥ２Ａ、及び口蹄疫ウイルスからのＦ２Ａであり得る。とりわけ、Ｐ２Ａが最高切断効率を有し、従って好ましい。これら２Ａポリペプチドの様々な機能的バリアントも当技術分野において公知であり、本発明においても使用可能である。
【0118】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５８で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0119】
別の態様では、本発明は、制御配列と作動可能にリンクした、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【0120】
本発明の「発現ベクター」は、直鎖状核酸断片、環状プラスミド、ウイルスベクター、又は翻訳可能なＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター等である。
【0121】
用語「制御配列」及び「制御エレメント」は交換可能に使用され、コーディング配列の上流（５’ノンコーディング配列）、中間、又は下流（３’ノンコーディング配列）に位置し、そして転写、ＲＮＡ処理、又は安定性、又は関連するコーディング配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。発現制御エレメントとは、転写、ＲＮＡ処理、又は安定性、又は目的のヌクレオチド配列の翻訳をコントロールすることができるヌクレオチド配列を指す。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、及びポリアデニル化認識配列を挙げることができるが、但しこれらに限定されない。
【0122】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能にリンクした」とは、ヌクレオチド配列の転写がコントロールされ、そして転写制御エレメントにより制御されるように、制御エレメント（例えば、プロモーター配列、転写終結配列等、但しこれらに限定されない）が、核酸配列（例えば、コーディング配列又はオープンリーディングフレーム）にリンクしていることを意味する。制御エレメント領域を核酸分子に作動可能にリンクさせる技術は当技術分野において公知である。
【0123】
別の態様では、本発明は、本発明の治療用免疫細胞を調製するための方法であって、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを免疫細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。
【0124】
本発明の免疫細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞等は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの非限定的な供給源から、様々な非限定的な方法により取得され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、健常ドナー又はがんと診断された患者に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型プロファイルを示す複数種の細胞からなる混合集団の一部分であり得る。例えば、Ｔ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、次にそれを活性化させ、そして特異抗体を用いて増幅することにより取得可能である。
【0125】
本発明の態様のいくつかの実施形態では、免疫細胞、例えばＴ細胞等は対象の自己細胞に由来する。本明細書で使用される場合、「自己」とは、対象を処置するのに使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が対象に由来することを意味する。いくつかの実施形態では、免疫細胞、例えばＴ細胞等は、同種異系細胞、例えば対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と適合性があるドナー等に由来する。ドナーからの細胞は、標準プロトコールを使用して非アロ反応性細胞に変換され得、そして１人又は複数の患者に投与可能である細胞を生成するために、必要に応じて複製され得る。
【0126】
別の態様では、本発明は、本発明の治療用免疫細胞及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【0127】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」には、あらゆるすべての生理学的に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、並びに吸収抑制剤等が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮への投与に適する（例えば、注射又は輸液による）。
【0128】
別の態様では、本発明は、対象における疾患を処置するための薬を調製する際の、本発明の治療用免疫細胞の使用を提供する。
【0129】
本明細書で使用される場合、「対象」とは、本発明の細胞、方法、又は医薬組成物により処置可能である疾患（例えば、がん）に罹患しているか、又は罹患しやすい生物を指す。非限定的な例として、ヒト、畜牛、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、及びその他の非哺乳動物が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【0130】
別の態様では、本発明は、対象における疾患、例えばがん等を処置するための方法を提供し、該方法は、対象に有効量の本発明の治療用免疫細胞又は医薬組成物を投与するステップを含む。
【0131】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」又は「治療上有効な用量」又は「有効量」とは、対象に投与した後に、少なくとも治療効果を生成するのに十分である物質、化合物、材料、又は細胞の量を指す。従って、そのような量は、疾患又は障害の症状を防止、是正、改善、ブロックし、又は部分的にブロックするのに必要な量である。例えば、「有効量」の本発明の細胞又は医薬組成物は、好ましくは、障害の症状の重症度の減少、障害の無症候期間の頻度及び期間の増加、又は障害に罹患した結果としての傷害若しくは能力障害の防止を引き起こす可能性がある。例えば、腫瘍を処置する場合、「有効量」の本発明の細胞又は医薬組成物は、好ましくは、未処置対象と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、及びより好ましくは少なくとも約８０％、腫瘍細胞増殖又は腫瘍増殖を阻害する可能性がある。腫瘍増殖を阻害する能力が、ヒト腫瘍における有効性を予測し得る動物モデル系において評価可能である。或いは、当業者にとって公知のテストによりｉｎ ｖｉｔｒｏで決定され得る、腫瘍細胞の増殖に対する阻害能力を検査することにより、評価を実施することが可能である。
【0132】
実際には、特定の患者に対して所望の治療応答を効果的に実現可能である有効成分の量、患者に対して毒性を有さない組成物及び投与経路が得られるように、本発明の医薬組成物内の細胞の用量レベルは変化させ得る。選択される用量レベルは、適用される本発明の具体的な組成物の活性、投与経路、投与時間、適用される具体的化合物の排泄速度、処置期間、適用される具体的な組成物と組み合わせて適用されるその他の薬物、化合物、及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身的健康、及び病歴、並びに当医学分野において公知の類似した因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存する。
【0133】
本発明に基づく治療用免疫細胞又は医薬組成物又は薬物の投与は、任意の好都合な方式で、例えば注射、輸液、埋込み、又は移植等を通じて実行され得る。本明細書に記載される細胞又は組成物の投与は、静脈内、リンパ内、皮内、腫瘍内、髄内、筋肉内、又は腹腔内投与であり得る。１つの実施形態では、本発明の細胞又は組成物は、好ましくは静脈内注射により投与される。
【0134】
本発明の様々な態様の複数の実施形態では、疾患は、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２０に関連する疾患、例えばＣＤ１９及び／又はＣＤ２０の異常発現に関連する疾患等、例えばＣＤ１９及び／又はＣＤ２０に関連するがん等である。がんは、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病を含む）、リンパ球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫等、及びそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、がんは、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２０陽性のがんである。
【実施例】
【0135】
実施例１：ＳＴＡＲの改善
１．野生型Ｔ細胞受容体及びその定常領域が変異したＳＴＡＲ分子の設計
１．１ ＳＴＡＲのプロトタイプ設計
Ｂ細胞によって産生される分泌抗体（抗体、Ａｂ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）は、遺伝子構造、タンパク質構造及び空間的コンフォメーションの点で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と大きな類似性を有する。抗体とＴＣＲのいずれもが、可変領域及び定常領域からなり、可変領域は抗原認識及び結合の役割を果たし、一方、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達の役割を果たす。ＴＣＲα及びβ鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）の可変領域を抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）で置き換えることにより、合成Ｔ細胞受容体及び抗体受容体（ＳＴＡＲ／ＷＴ－ＳＴＡＲ）と呼ばれる人工的な合成キメラ分子を構築することができ、その構造を図１（左）に示す。
１．野生型Ｔ細胞受容体及びその定常領域が変異したＳＴＡＲ分子の設計
１．１ ＳＴＡＲのプロトタイプ設計
Ｂ細胞によって産生される分泌抗体（抗体、Ａｂ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）は、遺伝子構造、タンパク質構造及び空間的コンフォメーションの点で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と大きな類似性を有する。抗体とＴＣＲのいずれもが、可変領域及び定常領域からなり、可変領域は抗原認識及び結合の役割を果たし、一方、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達の役割を果たす。ＴＣＲα及びβ鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）の可変領域を抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）で置き換えることにより、合成Ｔ細胞受容体及び抗体受容体（ＳＴＡＲ／ＷＴ－ＳＴＡＲ）と呼ばれる人工的な合成キメラ分子を構築することができ、その構造を図１（左）に示す。
【0136】
ＳＴＡＲ分子は２本の鎖を有しており、第１の鎖は、抗原認識配列（例えば、抗体重鎖可変領域）をＴ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）の定常領域（Ｃα）と融合することによって得られ、第２の鎖は、抗原認識配列（例えば、抗体軽鎖可変領域）をＴ細胞受容体β鎖（ＴＣＲβ）の定常領域（Ｃβ）と融合することによって得られる。構築物中の抗原認識ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖ）及び定常ドメイン（ＴＣＲα、β、γ及びδの定常ドメイン）を配置し組み合わせることで、異なる立体配置を有しつつも類似の機能を有する、様々な構築物を形成することができる。
【0137】
ＳＴＡＲ分子の第１及び第２の鎖は、Ｔ細胞中での発現後、小胞体中の内因性ＣＤ３εδ、ＣＤ３γε及びＣＤ３ζ鎖と組み合わされて、複合体の形態で細胞膜の表面上に存在する８サブユニット複合体を形成する。免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）は、ＹｘｘＬ／Ｖの保存された配列を有する、ＴＣＲ分子中のシグナル伝達モチーフである。ＣＤ３ε、δ、γ及びε鎖のエンドドメインは１つのＩＴＡＭ配列を含み、ＣＤ３ζ鎖のエンドドメインは３つのＩＴＡＭ配列を含み、したがって、完全なＳＴＡＲ複合体は合計１０個のＩＴＡＭ配列を有する。ＳＴＡＲ受容体の抗原認識配列がその特異的抗原に結合すると、細胞内ＩＴＡＭ配列は逐次的にリン酸化され、次いで今度は下流のシグナル伝達経路を活性化し、転写因子、例えば、ＮＦ－κβ、ＮＦＡＴ、及びＡＰ－１等を活性化して、Ｔ細胞の活性化を開始し、エフェクター機能を生み出す。本発明者による過去の研究において、ＳＴＡＲは従来のキメラ抗原受容体であるＣＡＲより良好にＴ細胞を活性化することができ、抗原刺激の非存在下においてバックグラウンド活性化が有意に低下し、よって、ＳＴＡＲは顕著な利点を有することが示されている（中国特許出願第２０１８１０８９８７２０．２号を参照）。しかし、ＳＴＡＲに対するさらなる改善がなお望まれる。
【0138】
１．２．変異体ＳＴＡＲ（ｍｕｔ－ＳＴＡＲ）並びに膜貫通ドメイン及びエンドドメインが改変されたＳＴＡＲ（ｕｂ－ＳＴＡＲ）
ＳＴＡＲプロトタイプ設計では、ヒト化ＴＣＲα／β鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）定常領域配列（野生型ヒトＴＣＲα定常領域、配列番号１；野生型ヒトＴＣＲβ定常領域、配列番号２）を使用する。ヒト、霊長類及びマウスＴＣＲα／β鎖（マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ、配列番号３；マウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ、配列番号４）の定常領域配列が高度に保存されており、また、同じ重要なアミノ酸配列を有しているため、これらのＴＣＲα／β鎖を互いに置き換えることができる。
ＳＴＡＲプロトタイプ設計では、ヒト化ＴＣＲα／β鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）定常領域配列（野生型ヒトＴＣＲα定常領域、配列番号１；野生型ヒトＴＣＲβ定常領域、配列番号２）を使用する。ヒト、霊長類及びマウスＴＣＲα／β鎖（マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ、配列番号３；マウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ、配列番号４）の定常領域配列が高度に保存されており、また、同じ重要なアミノ酸配列を有しているため、これらのＴＣＲα／β鎖を互いに置き換えることができる。
【0139】
ＳＴＡＲ分子は、Ｔ細胞中に移行された後、定常領域を通じてＴ細胞の内因性ＴＣＲとミスマッチすることになる。一方では、このミスマッチ問題がＳＴＡＲ分子の正しい対形成の効率を低下させる可能性があり、ＳＴＡＲ分子の機能を低下させるが、このことは、他方では、ミスマッチに起因する未知の特異性の可能性を増加させる可能性があり、安全性リスクを増加させる。この問題を解決するため、本発明者らは、ヒトＴ細胞中へ移行された後でＳＴＡＲ分子の機能を増強させるように、ＳＴＡＲ分子の定常領域をマウス配列で置き換えた。ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するため、本発明者らは、システイン変異をＳＴＡＲ分子に対して行って分子間ジスルフィド結合を導入し、これにより、ＳＴＡＲ分子の２本の鎖間の相互対形成を増強させ、内因性ＴＣＲとのミスマッチを低減させた。具体的には、ＴＣＲα鎖定常領域における４８位のトレオニン（Ｔ）をシステイン（Ｃ）に変異させ（マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ、配列番号５）、ＴＣＲβ鎖定常領域における５６位のセリン（Ｓ）をシステイン（Ｃ）に変異させた（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ、配列番号６）。２つの新たに付加されたシステインは、ＳＴＡＲの２本の鎖間でジスルフィド結合を形成することになり、これにより、ＳＴＡＲの２本の鎖と内因性ＴＣＲ鎖の間のミスマッチを低減し、ＳＴＡＲ分子がより安定な複合体を形成するのを補助し、よって、より良好な機能が得られる。加えて、ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するため、本発明者らは、疎水性アミノ酸置換をＳＴＡＲ分子の膜貫通ドメインに対して実施して、ＳＴＡＲ分子の安定性を増加させ、ＳＴＡＲ分子がより持続的な機能を果たす補助をした。具体的には、ＴＣＲα鎖定常領域の膜貫通ドメイン中のアミノ酸１１１～１１９位において３つのアミノ酸変異を行った。具体的には、１１２位のセリン（Ｓ）をロイシン（Ｌ）に変異させ、１１４位のメチオニン（Ｍ）をイソロイシン（Ｉ）に変異させ、１１５位のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｖ）に変異させた。この領域の全体のアミノ酸配列をＬＳＶＭＧＬＲＩＬからＬＬＶＩＶＬＲＩＬに変化させたが、この改変をマウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９と呼び、これにより、配列番号７の定常領域配列が生成された。この設計は膜貫通ドメインの疎水性を増加させ、ＴＣＲ膜貫通ドメインが保有する正電荷によって引き起こされる不安定性を相殺し、細胞膜上でＳＴＡＲ分子をより安定にし、よって、より良好な機能が得られる。この設計の構造を図１（中段）に示す。
【0140】
ＴＣＲを抗原に結合させ、活性化が完了した後、ＴＣＲ分子のエンドドメイン及び膜貫通ドメインにおけるリシンを、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素及びユビキチンリガーゼによる一連のユビキチン化反応によるユビキチン改変に供してユビキチン化し、これによりＴ細胞エンドサイトーシスを生じさせ、リソソームによるさらなる分解に向けたＴＣＲ分子の細胞中へのエンドサイトーシスをもたらし、これによりＴ細胞膜の表面上のＴＣＲ分子の濃度を減少させ、結果としてＴ細胞活性化の効果の連続的な落ち込みを生じさせる。本発明者らは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ分子におけるα及びβ鎖の膜貫通ドメイン又はエンドドメイン中のアミノ酸を改変させたが、この改変は、ＳＴＡＲ分子のα鎖定常領域のエンドドメイン及びβ鎖定常領域の膜貫通ドメイン中のリシンをアルギニンに変異させ、マウスＴＣＲα Ｃ－Ａｒｇ ｍｕｔの定常領域配列（配列番号８）及びマウスＴＣＲβ Ｃ－Ａｒｇ ｍｕｔの定常領域配列（配列番号９）をそれぞれ生成して、リシンのユビキチン化によって引き起こされるＳＴＡＲ分子のエンドサイトーシスを低減させることを含んでいた。この設計は、ＳＴＡＲ分子の膜貫通ドメイン及びエンドドメインのユビキチン化の可能性を低下させ、よってＳＴＡＲ分子のエンドサイトーシスを低減し、ＳＴＡＲ分子が細胞膜上でより安定になること及びより良好な機能を得ることを可能にする。この設計の構造を図１（右）に示す。
【0141】
２．野生型ＳＴＡＲ分子及び共刺激受容体エンドドメインを含む変異体ＳＴＡＲ分子の設計
ｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖能力、生残時間に対する効果及び腫瘍微小環境中に浸潤して標的細胞を効率的に殺滅する能力を改善するため、本発明者らはｍｕｔ－ＳＴＡＲ複合体を改変して新たな構造を設計したが、増強されたｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞は、ＴＣＲ－Ｔの臨床応答を改善し、持続的な治癒効果を実現できるように、必要に応じてテーラーメイドすることができる。
ｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖能力、生残時間に対する効果及び腫瘍微小環境中に浸潤して標的細胞を効率的に殺滅する能力を改善するため、本発明者らはｍｕｔ－ＳＴＡＲ複合体を改変して新たな構造を設計したが、増強されたｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞は、ＴＣＲ－Ｔの臨床応答を改善し、持続的な治癒効果を実現できるように、必要に応じてテーラーメイドすることができる。
【0142】
２．１．共刺激分子受容体エンドドメインを含むｍｕｔ－ＳＴＡＲ分子（ｃｏ－ＳＴＡＲ）の設計
ＴＣＲは、すべてのＴ細胞の表面上における特別なマーカーであり、αβＴＣＲ及びγδＴＣＲに分けることができ、それらの対応するＴ細胞は、それぞれαβＴ細胞及びγδＴ細胞である。本発明者らは、αβＴ細胞及びγδＴ細胞それぞれの性能を改善するため、αβ－ＳＴＡＲ及びｔγδ－ＳＴＡＲをそれぞれ共刺激シグナルで改変した。
ＴＣＲは、すべてのＴ細胞の表面上における特別なマーカーであり、αβＴＣＲ及びγδＴＣＲに分けることができ、それらの対応するＴ細胞は、それぞれαβＴ細胞及びγδＴ細胞である。本発明者らは、αβＴ細胞及びγδＴ細胞それぞれの性能を改善するため、αβ－ＳＴＡＲ及びｔγδ－ＳＴＡＲをそれぞれ共刺激シグナルで改変した。
【0143】
αβＴ細胞のＴＣＲは、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖とからなり、全Ｔ細胞の９０％～９５％を占める。αβＴＣＲは可変領域と定常領域とからなり、可変領域は大きな多様性を有し、抗原認識及び結合の役割を果たす一方、定常領域ドメインは、構造的相互作用及びシグナル伝達の役割を果たす。Ｔ細胞の毒性及び増殖持続性を増強するため、本発明に従い、ヒト化共刺激受容体のエンドドメイン配列をαβ－ＳＴＡＲ定常領域のＣ末端に導入して（図２）、ＳＴＡＲ Ｔ細胞機能に対する影響を研究する。本発明のＳＴＡＲ定常領域は、未改変のＷＴ－ＳＴＡＲ定常領域と、さらなる分子内ジスルフィド結合を含むｃｙｓ－ＳＴＡＲ定常領域と、マウス化ｈｍ－ＳＴＡＲ定常領域と、小節１で記載された３つの改変の組合せを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲとを含む。共刺激シグナル伝達構造は、それぞれ配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の配列を有する、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。共刺激エンドドメインを、ＴＣＲα鎖若しくはＴＣＲβ鎖又はＴＣＲα鎖とβ鎖の両方のＣ末端に連結することができる（ｃｏ－ＳＴＡＲ）。さらに、共刺激エンドドメインを、直接又はリンカーＧ４Ｓ／（Ｇ４Ｓ）ｎ（Ｇ４Ｓリンカー配列は、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５である）を介して、ＴＣＲ定常領域のＣ末端、又はＴＣＲ分子のエンドドメイン配列が欠損したＴＣＲ定常領域（システイン置換と疎水性領域改変の両方を含むエンドドメイン欠損ＴＣＲα鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ、配列番号２６）、システイン置換を含むエンドドメイン欠損ＴＣＲβ鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ、配列番号２７））のＣ末端に連結することができる（ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ、図３）。
【0144】
γδＴ細胞のＴＣＲは、ＴＣＲγ鎖とＴＣＲδ鎖とからなり、γδＴ細胞は、ＴＣＲδ鎖の種類に基づいて、γδ１、γδ２及びγδ３の３つのサブグループに分けることができ、ヒト身体中において、異なるサブグループは異なる分布を有する。γδＴ細胞はＭＨＣ拘束性に抗原を認識し、このことが、病原体及び腫瘍の監視において重要な役割を果たす。実験により、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ、及び類似の共刺激シグナルがγδＴ細胞の活性化及び増殖において重要な役割を果たすことが示された。本発明者らは、γδＴ細胞の性能を改善するため、ヒト共刺激分子受容体のエンドドメイン配列を、ＴＣＲγ及びＴＣＲδそれぞれのＣ末端に導入した（図２、右）。
【0145】
２．２．共刺激分子受容体エンドドメインを含むＣＤ３分子（ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ）の設計
ＣＤ３サブユニットは、γ鎖、δ鎖、ε鎖及びζ鎖を含み、ＴＣＲ分子と共にＴ細胞受容体複合体を形成し、Ｔ細胞受容体複合体は、細胞の状態を制御し刺激に応答できるようにエクトドメインからエンドドメインへとシグナルを伝達する。増強されたＴＣＲ Ｔ細胞を設計し、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍殺滅能力、増殖能力及び生残時間を改善するため、本発明者らは、ヒト共刺激分子受容体エンドドメインをＣＤ３γ鎖（配列番号２８）、δ鎖（配列番号２９）、ε鎖（配列番号３０）及びζ鎖（配列番号３１）のＣ末端に導入することにより、ＣＤ３分子を改変した（図４）。改変されたＣＤ３分子を、その機能を改善するため、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞中で発現させた。
ＣＤ３サブユニットは、γ鎖、δ鎖、ε鎖及びζ鎖を含み、ＴＣＲ分子と共にＴ細胞受容体複合体を形成し、Ｔ細胞受容体複合体は、細胞の状態を制御し刺激に応答できるようにエクトドメインからエンドドメインへとシグナルを伝達する。増強されたＴＣＲ Ｔ細胞を設計し、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍殺滅能力、増殖能力及び生残時間を改善するため、本発明者らは、ヒト共刺激分子受容体エンドドメインをＣＤ３γ鎖（配列番号２８）、δ鎖（配列番号２９）、ε鎖（配列番号３０）及びζ鎖（配列番号３１）のＣ末端に導入することにより、ＣＤ３分子を改変した（図４）。改変されたＣＤ３分子を、その機能を改善するため、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞中で発現させた。
【0146】
２．３．サイトカイン受容体の刺激領域を含むＣＤ３分子（サイトカイン－ＳＴＡＲ、ＣＫ－ＳＴＡＲ）の設計
サイトカインは、Ｔ細胞の増殖、抗腫瘍及び分化において重要な役割を果たす。異なるサイトカインがそれらのそれぞれの受容体と組み合わされて、細胞の状態を制御し刺激に応答できるように、エクトドメインからエンドドメインへとシグナルを伝達する。さらに、研究により、下流の分子であるＳＴＡＴ５（配列番号３５）がＩＬ－２受容体エンドドメインにおけるカスケード反応によって活性化され、これにより、Ｔ細胞増殖関連分子の転写を増強し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力を増強することが示された。増強されたＳＴＡＲ－Ｔ細胞を設計し、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍殺滅能力、増殖能力及び生残時間を改善するため、本発明者らは、ヒトサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＬ－２β受容体エンドドメインＩＬ２Ｒｂ、配列番号３２；ＩＬ－７α受容体エンドドメイン、配列番号３３；ＩＬ－２１受容体エンドドメイン、配列番号３４等））をＴＣＲα鎖若しくはβ鎖若しくはα鎖とβ鎖の両方のＣ末端にリンクすることにより、又はＧ４Ｓ（ＩＬ－２ＲｂＱ、配列番号３６；ＩＬ－７ＲｂＱ、配列番号３７）を介してＩＬ－２β若しくはＩＬ－７Ｒα受容体エンドドメインにＳＴＡＴ５活性化部分をさらにリンクすることにより、ＳＴＡＲ分子を改変した（図５）。
サイトカインは、Ｔ細胞の増殖、抗腫瘍及び分化において重要な役割を果たす。異なるサイトカインがそれらのそれぞれの受容体と組み合わされて、細胞の状態を制御し刺激に応答できるように、エクトドメインからエンドドメインへとシグナルを伝達する。さらに、研究により、下流の分子であるＳＴＡＴ５（配列番号３５）がＩＬ－２受容体エンドドメインにおけるカスケード反応によって活性化され、これにより、Ｔ細胞増殖関連分子の転写を増強し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力を増強することが示された。増強されたＳＴＡＲ－Ｔ細胞を設計し、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍殺滅能力、増殖能力及び生残時間を改善するため、本発明者らは、ヒトサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＬ－２β受容体エンドドメインＩＬ２Ｒｂ、配列番号３２；ＩＬ－７α受容体エンドドメイン、配列番号３３；ＩＬ－２１受容体エンドドメイン、配列番号３４等））をＴＣＲα鎖若しくはβ鎖若しくはα鎖とβ鎖の両方のＣ末端にリンクすることにより、又はＧ４Ｓ（ＩＬ－２ＲｂＱ、配列番号３６；ＩＬ－７ＲｂＱ、配列番号３７）を介してＩＬ－２β若しくはＩＬ－７Ｒα受容体エンドドメインにＳＴＡＴ５活性化部分をさらにリンクすることにより、ＳＴＡＲ分子を改変した（図５）。
【0147】
３．野生型ＳＴＡＲ分子及び共刺激分子受容体エンドドメインを含む変異体ＳＴＡＲ分子のベクターの構築
３．１ ベクターの供給源
本発明において使用したベクターはウイルスベクター、プラスミドベクター等を含むが、営利企業から購入又は営利企業によって合成されたものであり、これらのベクターの全長配列が得られており、特定の切断部位が既知である。
３．１ ベクターの供給源
本発明において使用したベクターはウイルスベクター、プラスミドベクター等を含むが、営利企業から購入又は営利企業によって合成されたものであり、これらのベクターの全長配列が得られており、特定の切断部位が既知である。
【0148】
３．２．断片の供給源
本発明で言及されるＴＣＲは、本発明において使用されるＷＴ－ＳＴＡＲ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、ｕｂ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ、ＣＫ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲなどを含む、任意の機能的ＴＣＲとすることができる。遺伝子断片、例えば、本発明において使用されるＴＣＲの可変領域、ＴＣＲの定常領域、共刺激分子受容体のエンドドメイン、サイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達領域、タグ配列、リンカーなどは、すべて営利企業によって合成された。これらの遺伝子断片をＰＣＲによってリンクした。
本発明で言及されるＴＣＲは、本発明において使用されるＷＴ－ＳＴＡＲ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、ｕｂ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ、ＣＫ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲなどを含む、任意の機能的ＴＣＲとすることができる。遺伝子断片、例えば、本発明において使用されるＴＣＲの可変領域、ＴＣＲの定常領域、共刺激分子受容体のエンドドメイン、サイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達領域、タグ配列、リンカーなどは、すべて営利企業によって合成された。これらの遺伝子断片をＰＣＲによってリンクした。
【0149】
この実施例では、配列番号３８に示されるＳｃＦｖ（ＣＤ２０を標的とする抗体であるＯＦＡに由来）及び／又は配列番号３９に示されるＳｃＦｖ（ＣＤ１９を標的とする抗体であるＦＭＣ６３に由来）を含むＳＴＡＲを使用して、ＴＣＲ複合体の最適化を検証し、配列番号４０に示されるＲＦＰタンパク質（赤色蛍光タンパク質、ＲＦＰ）のみを発現しているブランク対照群であるＭｏｃｋと比較した。
【0150】
３．３．ベクター構築
本明細書で使用したレンチウイルスベクターはｐＨＡＧＥ－ＥＦ１ α－ＩＲＥＳ－ＲＦＰであり、制限酵素Ｎｏｔ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉによって直鎖状ベクターを得、合成及びＰＣＲによって遺伝子断片を得、相同組換えによって完全ベクターを得た。
本明細書で使用したレンチウイルスベクターはｐＨＡＧＥ－ＥＦ１ α－ＩＲＥＳ－ＲＦＰであり、制限酵素Ｎｏｔ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉによって直鎖状ベクターを得、合成及びＰＣＲによって遺伝子断片を得、相同組換えによって完全ベクターを得た。
【0151】
４．細胞株の構築
４．１ プラスミドｐＨＡＧＥ－ルシフェラーゼ－ＧＦＰの構築
レンチウイルスベクターとして、ｐＨＡＧＥは標的遺伝子を標的細胞のゲノム中へ安定的に挿入することができ、これは安定な細胞株を構築するための重要な方法である。ルシフェラーゼは酵素の一種であり、基質の化学的自己発光を触媒することができる触媒活性を有し、標的細胞にルシフェラーゼを安定的に発現させ、基質の添加後に標的細胞の数を指示することができ、このため、標的細胞に対する機能的細胞の効果を反映する。制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ／ＣｌａＩ切断部位を保有するｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａベクターを２つの酵素によって切断し、ＮＣＢＩによってルシフェラーゼ及びＧＦＰ配列を得、営利企業であるＲｕｉｂｏｘｉｎｇｋｅにより、オーバーラップＰＣＲを使用してルシフェラーゼ遺伝子をＧＦＰ遺伝子と組み合わせることで断片を合成し、次いで、相同組換えによってルシフェラーゼ－ＧＦＰ断片をｐＨＡＧＥベクターに連結した。
４．１ プラスミドｐＨＡＧＥ－ルシフェラーゼ－ＧＦＰの構築
レンチウイルスベクターとして、ｐＨＡＧＥは標的遺伝子を標的細胞のゲノム中へ安定的に挿入することができ、これは安定な細胞株を構築するための重要な方法である。ルシフェラーゼは酵素の一種であり、基質の化学的自己発光を触媒することができる触媒活性を有し、標的細胞にルシフェラーゼを安定的に発現させ、基質の添加後に標的細胞の数を指示することができ、このため、標的細胞に対する機能的細胞の効果を反映する。制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ／ＣｌａＩ切断部位を保有するｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａベクターを２つの酵素によって切断し、ＮＣＢＩによってルシフェラーゼ及びＧＦＰ配列を得、営利企業であるＲｕｉｂｏｘｉｎｇｋｅにより、オーバーラップＰＣＲを使用してルシフェラーゼ遺伝子をＧＦＰ遺伝子と組み合わせることで断片を合成し、次いで、相同組換えによってルシフェラーゼ－ＧＦＰ断片をｐＨＡＧＥベクターに連結した。
【0152】
４．２ ルシフェラーゼを保有する標的細胞株の構築
ルシフェラーゼ及びＧＦＰを有するレンチウイルスベクターを首尾良く構築した後、レンチウイルスをＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔによってパッキングし、レンチウイルス溶液をＰＥＧ８０００によって濃縮し、勾配希釈法によってウイルス力価を測定し、次いで、リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを感染させ、感染から７２時間後、ＧＦＰ陽性細胞が存在するかどうかを蛍光顕微鏡によって観察し、次いで、ＧＦＰ陽性細胞をフローソーターによって選別し、モノクローナル細胞をライブラリ作製及び保存のために選択した。同時に、ルシフェラーゼ基質を使用して標的細胞と共にインキュベートし、ルシフェラーゼの発現及び検出レベルを検出して、発現レベルを決定した。
ルシフェラーゼ及びＧＦＰを有するレンチウイルスベクターを首尾良く構築した後、レンチウイルスをＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔによってパッキングし、レンチウイルス溶液をＰＥＧ８０００によって濃縮し、勾配希釈法によってウイルス力価を測定し、次いで、リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを感染させ、感染から７２時間後、ＧＦＰ陽性細胞が存在するかどうかを蛍光顕微鏡によって観察し、次いで、ＧＦＰ陽性細胞をフローソーターによって選別し、モノクローナル細胞をライブラリ作製及び保存のために選択した。同時に、ルシフェラーゼ基質を使用して標的細胞と共にインキュベートし、ルシフェラーゼの発現及び検出レベルを検出して、発現レベルを決定した。
【0153】
４．３ ＴＣＲα－βノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞株の構築
ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞株を構築するために、ＴＣＲの構造及び配列の特徴に基づいて、α及びβ鎖の定常領域においてガイド配列を設計した。ＮＣＢＩにおいてＴＣＲα及びβ鎖の定常領域のエクソン配列を得、ガイド配列を設計するため、ＴＣＲα及びβ鎖の定常領域のエクソン１配列をウェブサイトｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇに提出し、その結果に基づいてオリゴ配列を合成し、次いで、ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクター（Ａｉｄｉ ｇｅｎｅから購入）を構築した。α鎖のガイド配列をＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏにリンクし、β鎖のガイド配列をＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤにリンクした。
ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞株を構築するために、ＴＣＲの構造及び配列の特徴に基づいて、α及びβ鎖の定常領域においてガイド配列を設計した。ＮＣＢＩにおいてＴＣＲα及びβ鎖の定常領域のエクソン配列を得、ガイド配列を設計するため、ＴＣＲα及びβ鎖の定常領域のエクソン１配列をウェブサイトｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇに提出し、その結果に基づいてオリゴ配列を合成し、次いで、ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクター（Ａｉｄｉ ｇｅｎｅから購入）を構築した。α鎖のガイド配列をＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏにリンクし、β鎖のガイド配列をＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤにリンクした。
【0154】
ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスのパッケージング：ＨＥＫ－２９３Ｔを予め１０ｃｍディッシュに播種し、細胞が８０％～９０％に成長したとき、トランスフェクション系をＨＥＫ－２９３Ｔに添加し、培養のために細胞を３７℃のインキュベーター中に戻した。この時間を０時間とし、トランスフェクションから１２時間後、新鮮な１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを添加した。トランスフェクションから４８時間後及び７２時間後にウイルスを採取した。ウイルスを含有する培養培地を遠心分離及び濾過し、ＰＥＧ８０００と混合し、４℃で１２時間超の間置き、次いで、３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を捨てた後、適当な体積の培地を用いて再懸濁及び沈殿させた。得られたものを－８０℃で凍結するか、又は直接使用した。
【0155】
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の感染及びスクリーニング並びにモノクローナル細胞株の特定：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を１２又は２４ウェルプレート中に接種し、その後、ポリブレン（総体積基準で１：１０００の比で添加）と共にα鎖及びβ鎖のｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲウイルスを同時に適当な体積で添加し、十分に混合した。１０００ｒｐｍ、３２℃で９０分間、遠心感染を実施した。得られたものを３７℃のインキュベーター内に置き、これを０時間とした。１０～１２時間後に液体を交換した。４８時間後、ピューロマイシン及びＢＳＤを適当な最終濃度まで添加し、さらに４８時間処理した後、示されるように、未感染の対照群の細胞はすべて殺滅した。生残細胞を吸い出し、遠心分離し、完全培地中で培養して、ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞バンクを得た。２週間の培養後、フローソーターＡｒｉａによってＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞バンクから単一細胞を９６ウェルプレート中に選別し、増幅培養のために成長したモノクローンを吸い出した。ＴＣＲα鎖及びβ鎖抗体をそれぞれ用いてモノクローナル細胞株を特定し、両鎖を欠く細胞株を増幅して、内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔ－Ｔ細胞株を得た。
【0156】
５．Ｔ細胞を形質転換するためのウイルスパッケージング系の構築
５．１ レンチウイルス系及びパッケージング方法（異なる世代）
Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ培養ディッシュに５×１０５／ｍＬで接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養し、細胞密度が約８０％に達したときに（顕微鏡下で観察）トランスフェクションを行った。３つのプラスミドを、１：２：３のＰＭＤ２．Ｇ：ＰＳＰＡＸ：トランスファープラスミド比にて、５００μＬの無血清ＤＭＥＭと混合した。５４μＬのＰＥＩ－Ｍａｘ及び５００ｕＬの無血清ＤＭＥＭを一様に混合し、室温で５分間放置した（プラスミドに対するＰＥＩ－Ｍａｘの体積－質量比で３：１）。ＰＥＩ－ｍａｘ混合物をプラスミド混合物にゆっくりと添加し、優しく送風し、均一に混合し、次いで、室温で１５分間放置した。最終的な混合物を培養培地にゆっくりと添加し、均一に混合し、次いで、インキュベーター中に戻してさらに１２時間～１６時間培養し、次いで、６％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に交換してさらに培養し、４８時間及び７２時間の時点でウイルス溶液を採取した。
５．１ レンチウイルス系及びパッケージング方法（異なる世代）
Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ培養ディッシュに５×１０５／ｍＬで接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養し、細胞密度が約８０％に達したときに（顕微鏡下で観察）トランスフェクションを行った。３つのプラスミドを、１：２：３のＰＭＤ２．Ｇ：ＰＳＰＡＸ：トランスファープラスミド比にて、５００μＬの無血清ＤＭＥＭと混合した。５４μＬのＰＥＩ－Ｍａｘ及び５００ｕＬの無血清ＤＭＥＭを一様に混合し、室温で５分間放置した（プラスミドに対するＰＥＩ－Ｍａｘの体積－質量比で３：１）。ＰＥＩ－ｍａｘ混合物をプラスミド混合物にゆっくりと添加し、優しく送風し、均一に混合し、次いで、室温で１５分間放置した。最終的な混合物を培養培地にゆっくりと添加し、均一に混合し、次いで、インキュベーター中に戻してさらに１２時間～１６時間培養し、次いで、６％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に交換してさらに培養し、４８時間及び７２時間の時点でウイルス溶液を採取した。
【0157】
５．２ ウイルス力価測定
Ｊｕｒｋａｔ－Ｃ５細胞を平底９６ウェルプレート中に１．５×１０５細胞／ｍＬで接種し、１０％ ＦＢＳを含有する１００ｕＬの１６４０培地及び０．２μＬの１０００×ポリブレンを各ウェルに添加した。１６４０完全培地を用いて１０倍希釈でウイルス希釈を行い、第１のウェルにおけるウイルス量は、ウイルス原液として決定した場合は１００μＬとし、濃縮溶液として決定した場合は１μＬとした。希釈された細胞をウイルスウェルに１００μＬ／ウェルで添加し、３２℃で混合し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で７２時間培養した。平底９６ウェルプレートから丸底９６ウェルプレート中へと細胞を吸い出し、４℃及び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。２００μＬの１×ＰＢＳを添加した後、４℃及び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を捨てた。２００ｕＬの４％組織固定溶液を添加し、得られた溶液を光から遠ざけ、フローアイトメトリーを用いて測定した。感染効率をフローサイトメトリーによって測定し、式：力価（ＴＵ／ｍＬ）＝１．５×１０４×陽性率／ウイルス体積（μＬ）×１０００に従って力価を計算した際、２～３０％の感染率を有するウェルを選択した。以下のプラスミドのウイルスを上記の方法によってパッケージングした：ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ、ＷＴ－ＳＴＡＲ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＷＴ－ＳＴＡＲ（αβ－４－１ＢＢ－ＷＴ、αβ－ＣＤ２７－ＷＴ、αβ－ＣＤ２８－ＷＴ、αβ－ＩＣＯＳ－ＷＴ、αβ－ＯＸ４０－ＷＴ、αβ－ＯＸ４０－ＷＴ）、ｃｏ－ＳＴＡＲ（αβ－４－１ＢＢ、αβ－ＣＤ２７、αβ－ＣＤ２８、αβ－ＩＣＯＳ、αβ－ＯＸ４０、αβ－ＯＸ４０）、ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ（ＣＤ３δ－４－１ＢＢ、ＣＤ３δ－ＣＤ２８、ＣＤ３δ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ε－４－１ＢＢ、ＣＤ３ε－ＣＤ２８、ＣＤ３ε－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ε－ＯＸ４０、ＣＤ３γ－ＯＸ４０、ＣＤ３γ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３γ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－４１ＢＢ、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ－ＯＸ４０）、ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ（ＴＣＲβ－ｄｅｌ－ＯＸ４０、ＴＣＲα－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ＴＣＲα－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ＴＣＲβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０、ＴＣＲβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）７－ＯＸ４０）、Ｃ Ｋ－ＳＴＡＲ（β－ＩＬ－２Ｒｂ ＳＴＡＲ、β－ＩＬ－２ＲｂＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－２ＲｂＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－７ＲＡ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－７ＲＡＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－２１Ｒ ＳＴＡＲ）など。
Ｊｕｒｋａｔ－Ｃ５細胞を平底９６ウェルプレート中に１．５×１０５細胞／ｍＬで接種し、１０％ ＦＢＳを含有する１００ｕＬの１６４０培地及び０．２μＬの１０００×ポリブレンを各ウェルに添加した。１６４０完全培地を用いて１０倍希釈でウイルス希釈を行い、第１のウェルにおけるウイルス量は、ウイルス原液として決定した場合は１００μＬとし、濃縮溶液として決定した場合は１μＬとした。希釈された細胞をウイルスウェルに１００μＬ／ウェルで添加し、３２℃で混合し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で７２時間培養した。平底９６ウェルプレートから丸底９６ウェルプレート中へと細胞を吸い出し、４℃及び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。２００μＬの１×ＰＢＳを添加した後、４℃及び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を捨てた。２００ｕＬの４％組織固定溶液を添加し、得られた溶液を光から遠ざけ、フローアイトメトリーを用いて測定した。感染効率をフローサイトメトリーによって測定し、式：力価（ＴＵ／ｍＬ）＝１．５×１０４×陽性率／ウイルス体積（μＬ）×１０００に従って力価を計算した際、２～３０％の感染率を有するウェルを選択した。以下のプラスミドのウイルスを上記の方法によってパッケージングした：ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ、ＷＴ－ＳＴＡＲ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＷＴ－ＳＴＡＲ（αβ－４－１ＢＢ－ＷＴ、αβ－ＣＤ２７－ＷＴ、αβ－ＣＤ２８－ＷＴ、αβ－ＩＣＯＳ－ＷＴ、αβ－ＯＸ４０－ＷＴ、αβ－ＯＸ４０－ＷＴ）、ｃｏ－ＳＴＡＲ（αβ－４－１ＢＢ、αβ－ＣＤ２７、αβ－ＣＤ２８、αβ－ＩＣＯＳ、αβ－ＯＸ４０、αβ－ＯＸ４０）、ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ（ＣＤ３δ－４－１ＢＢ、ＣＤ３δ－ＣＤ２８、ＣＤ３δ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ε－４－１ＢＢ、ＣＤ３ε－ＣＤ２８、ＣＤ３ε－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ε－ＯＸ４０、ＣＤ３γ－ＯＸ４０、ＣＤ３γ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３γ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－４１ＢＢ、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ－ＯＸ４０）、ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ（ＴＣＲβ－ｄｅｌ－ＯＸ４０、ＴＣＲα－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ＴＣＲα－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ＴＣＲβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０、ＴＣＲβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）７－ＯＸ４０）、Ｃ Ｋ－ＳＴＡＲ（β－ＩＬ－２Ｒｂ ＳＴＡＲ、β－ＩＬ－２ＲｂＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－２ＲｂＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－７ＲＡ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－７ＲＡＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－２１Ｒ ＳＴＡＲ）など。
【0158】
６．Ｔ細胞培養及び感染方法の確立
６．１ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の培養
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で３×１０５／ｍｌから最大で３×１０６／ｍｌの培養密度で培養し、１～２日毎に継代した。細胞計数後、必要な数の細胞を取り、培養培地を補充して上記密度に調整し、培養のためにＣＯ２インキュベーター内に置いた。
６．１ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の培養
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で３×１０５／ｍｌから最大で３×１０６／ｍｌの培養密度で培養し、１～２日毎に継代した。細胞計数後、必要な数の細胞を取り、培養培地を補充して上記密度に調整し、培養のためにＣＯ２インキュベーター内に置いた。
【0159】
６．２ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の感染
細胞を計数し、１×１０６／ｍｌの細胞を取り、遠心分離し、液体を用いて交換し、１０％ ＦＢＳを含有する１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を用いて再懸濁し、２４ウェルプレートに添加し、適量のウイルス溶液も同様に添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、培養のためにＣＯ２インキュベーター内に置いた。感染から１２時間後、液体を１０％ ＦＢＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地と完全に交換し、７２時間後に陽性率を検出した。
細胞を計数し、１×１０６／ｍｌの細胞を取り、遠心分離し、液体を用いて交換し、１０％ ＦＢＳを含有する１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を用いて再懸濁し、２４ウェルプレートに添加し、適量のウイルス溶液も同様に添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、培養のためにＣＯ２インキュベーター内に置いた。感染から１２時間後、液体を１０％ ＦＢＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地と完全に交換し、７２時間後に陽性率を検出した。
【0160】
６．３ ヒト初代Ｔ細胞の培養
Ｆｉｃｏｉｌ法によって初代Ｔ細胞を単離し、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ培地中で、初期培養密度を１×１０６／ｍＬとして培養し、次いで、ＣＤ３－及びレトロネクチンｒ－フィブロネクチン（各々、５ｕｇ／ｍｌの最終濃度）で予備被覆されたウェルプレートに添加した。分裂後期培養の密度は５×１０５／ｍＬから最大で３×１０６／ｍＬであり、１～２日毎に継代を行った。
Ｆｉｃｏｉｌ法によって初代Ｔ細胞を単離し、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ培地中で、初期培養密度を１×１０６／ｍＬとして培養し、次いで、ＣＤ３－及びレトロネクチンｒ－フィブロネクチン（各々、５ｕｇ／ｍｌの最終濃度）で予備被覆されたウェルプレートに添加した。分裂後期培養の密度は５×１０５／ｍＬから最大で３×１０６／ｍＬであり、１～２日毎に継代を行った。
【0161】
６．４ ヒト初代Ｔ細胞の感染
４８時間の培養後、初代Ｔ細胞をＭＯＩ＝２０でウイルス溶液と共に添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、次いで、培養のためにＣＯ２インキュベーター内に置いた。２４時間の感染後、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ培地を補充し、ウェルを回転させ、７２時間後、タグタンパク質又は抗体によって感染効率を検出した。
４８時間の培養後、初代Ｔ細胞をＭＯＩ＝２０でウイルス溶液と共に添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、次いで、培養のためにＣＯ２インキュベーター内に置いた。２４時間の感染後、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ培地を補充し、ウェルを回転させ、７２時間後、タグタンパク質又は抗体によって感染効率を検出した。
【0162】
６．５．感染効率の検出方法
７２時間の感染後、細胞に均一に送気し、計数し、５×１０５／ｍｌを取り、遠心分離し、次いで、上清を捨てた。使用した染色溶液はＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡであり、対応する抗体を添加して３０分間インキュベーションを行い、次いで、ＰＢＳを添加して２回洗浄し、コンピュータ上で検出を行った。
７２時間の感染後、細胞に均一に送気し、計数し、５×１０５／ｍｌを取り、遠心分離し、次いで、上清を捨てた。使用した染色溶液はＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡであり、対応する抗体を添加して３０分間インキュベーションを行い、次いで、ＰＢＳを添加して２回洗浄し、コンピュータ上で検出を行った。
【0163】
７．ＷＴ－ＳＴＡＲ受容体及びその変異体ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
７．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ１９ＫＯ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ２０ＫＯ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、１：１の比で通常使用し、Ｔ細胞の総数を感染効率に従って計算し、標的細胞の通常の使用量を１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
７．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ１９ＫＯ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ２０ＫＯ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、１：１の比で通常使用し、Ｔ細胞の総数を感染効率に従って計算し、標的細胞の通常の使用量を１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
【0164】
７．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であるが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞活性化に直接使用することができる。陽性Ｔ細胞を通常１×１０５／ウェルで添加し、遠心分離し、２４時間活性化させ、次いで、Ｔ細胞機能を検出するためにＴ細胞又は標的細胞を採取した。
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であるが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞活性化に直接使用することができる。陽性Ｔ細胞を通常１×１０５／ウェルで添加し、遠心分離し、２４時間活性化させ、次いで、Ｔ細胞機能を検出するためにＴ細胞又は標的細胞を採取した。
【0165】
７．３．Ｔ細胞殺滅機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を取り、白色９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を取り、白色９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
【0166】
７．４．ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺滅機能試験の検出結果によれば、図６及び表１に示されるように、変異体ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞はより強力なＴ細胞腫瘍殺滅能力を呈し、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とするｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞標的がＲａｊｉ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ１９ＫＯ－ルシフェラーゼ及びＲａｊｉＣＤ２０ＫＯ－ルシフェラーゼを殺滅させた後、残留腫瘍の生残率は、それぞれ２．４１％、１３．９４％及び２４．４０％であったが、これらは、ＷＴ－ＳＴＡＲの生残率より４５．７３％、７７．００％及び７６．１６％有意に良好であり、変異体ｍｕｔ－ＳＴＡＲがより有意な腫瘍殺滅効果を有していたことを示す。
【0167】
【表1】
【0168】
８．ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端、又はＴＣＲα鎖若しくはＴＣＲβ鎖のＣ末端に連結した共刺激エンドドメインの効果
８．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、共インキュベーションを、通常は８：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４及び１：８の比で行い、通常は６時間、１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間の時点において、経時的な共インキュベーションの差異も検出した。ｃｏ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の増殖を検出するため、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼを初代Ｔ細胞と共に７日間インキュベートして細胞増殖数及びＩＬ－２分泌の変化を観察し、次いで、陽性Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって選別し、抗原刺激のない静止培養に２日間供し、次いで、これを再び標的細胞と２４時間共培養して、Ｔ細胞による殺滅を検出し、標的細胞の通常の使用量を、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
８．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、共インキュベーションを、通常は８：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４及び１：８の比で行い、通常は６時間、１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間の時点において、経時的な共インキュベーションの差異も検出した。ｃｏ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の増殖を検出するため、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼを初代Ｔ細胞と共に７日間インキュベートして細胞増殖数及びＩＬ－２分泌の変化を観察し、次いで、陽性Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって選別し、抗原刺激のない静止培養に２日間供し、次いで、これを再び標的細胞と２４時間共培養して、Ｔ細胞による殺滅を検出し、標的細胞の通常の使用量を、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
【0169】
８．２．標的抗原によるＴ細胞を刺激する方法
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液若しくは培養上清を採取してＴ細胞機能を検出するか、又は６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間若しくは７日間活性化させて、Ｔ細胞の殺滅機能を検出した。
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液若しくは培養上清を採取してＴ細胞機能を検出するか、又は６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間若しくは７日間活性化させて、Ｔ細胞の殺滅機能を検出した。
【0170】
８．３．Ｔ細胞殺滅機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を取り、白色９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を取り、白色９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
【0171】
ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺滅機能試験の検出結果によれば、図７及び表２に示されるように、共刺激エンドドメインがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端に連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲは、Ｔ細胞及び標的細胞の異なるＥ：Ｔ比において類似した腫瘍殺滅効果を呈し、異なるＥ：Ｔ比において残留腫瘍生残率に有意差はなかった。しかし、異なる時間における腫瘍殺滅の検出結果の点では、図８及び表３に示されるように、Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼと共に４８時間インキュベーションした、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端に連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）とｍｕｔ－ＳＴＡＲとは、それぞれ約２４％及び１９％という類似した腫瘍殺滅効果を示し、これらは、他の共刺激エンドドメインがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端に連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－４１ＢＢ、αβ－ＣＤ２７、αβ－ＣＤ２８、αβ－ＩＣＯＳ）を有意に上回っていた。上記の結果より、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端に共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインをリンクさせることは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの殺滅効果に影響を与えなかったことが見出された。さらに、上記の結果より、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖（α－ＯＸ４０）又はβ鎖（β－ＯＸ４０）単独のＣ末端にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲが、Ｔ細胞殺滅機能についてルシフェラーゼアッセイにより検出され、検出結果によれば、図９及び１０並びに表４及び５に示されるように、共インキュベーションされた腫瘍細胞に対するＴ細胞の異なるＥ：Ｔ比又は２４時間の共インキュベーションにおいて、α－ＯＸ４０及びβ－ＯＸ４０はα－β－ＯＸ４０と有意差を示さなかった。上記の殺滅結果より、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）と、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインがＴＣＲα鎖（α－ＯＸ４０）又はβ鎖（β－ＯＸ４０）単独のＣ末端にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲの間に有意差はなかったが、これらの腫瘍殺滅能力はｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺滅能力より有意に良好であった。
【0172】
８．４．Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。使用したＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、及びＨｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従って希釈された試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。使用したＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、及びＨｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従って希釈された試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
【0173】
ＥＬＩＳＡの結果によれば、図１１及び表６に示されるように、Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共インキュベートした後、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）のＩＬ－２分泌は約１００００ｐｇ／ｍｌであり、これは他の構造を有するＳＴＡＲのＩＬ－２分泌より有意に多く、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、αβ－４１ＢＢ、αβ－ＣＤ２７、αβ－ＣＤ２８及びαβ－ＩＣＯＳのＩＬ－２分泌は、それぞれ約７７００ｐｇ／ｍｌ、６４５０ｐｇ／ｍｌ、６６９０ｐｇ／ｍｌ、６０００ｐｇ／ｍｌ、及び６０５０ｐｇ／ｍｌであったが、ＴＮＦα及びＩＦＮ－γ分泌については、αβ－ＯＸ４０は同様にｍｕｔ－ＳＴＡＲと類似の結果を示した一方、他の構造は異なる減少を示した。ＥＬＩＳＡの結果より、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）のＩＬ－２分泌が、ｍｕｔ－ＳＴＡＲによるＩＬ－２分泌より有意に多いことが示された。
【0174】
８．５．Ｔ細胞増殖の変化の検出：フローサイトメトリーによる計数
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進し、Ｔ細胞増殖において最も明白に出現したのは、Ｔ細胞の数の顕著な変化であった。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、ＰＢＳを用いて再懸濁して２００ｕＬとし、陽性Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。Ｔ細胞増殖の変化：増殖倍率＝７日後の陽性Ｔ細胞の数／添加された陽性Ｔ細胞の初期数。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進し、Ｔ細胞増殖において最も明白に出現したのは、Ｔ細胞の数の顕著な変化であった。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、ＰＢＳを用いて再懸濁して２００ｕＬとし、陽性Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。Ｔ細胞増殖の変化：増殖倍率＝７日後の陽性Ｔ細胞の数／添加された陽性Ｔ細胞の初期数。
【0175】
選別後、様々な構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞と１：３のＥ：Ｔ比で共培養し、この日を０日目とし、その後、それぞれ１日目及び７日目に細胞を採取して、フロー解析を行った。それらのうち、使用した培地はＩＬ－２を含まない１６４０完全培地であり、ＴＣＲ Ｔ細胞の初期数は１×１０５細胞であって、各時点において試料を独立にインキュベートし、翌日、液体を用いて残留する共インキュベートされた試料を半量交換し、標的細胞を補充した。フロー解析に使用した細胞は事前に抗ヒトＣＤ３抗体で染色しておき、規定の体積の細胞を採取し、機械上で分析を実施した際に記録し、系におけるＴ細胞の数及び割合は変換により知ることができた。図１２及び表７に示されるように、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞の絶対数の増殖倍率曲線から、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端に連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）が、標的細胞エピトープを認識後により良好な活性化及び増殖を示したことがわかるが、これはｍｕｔ－ＳＴＡＲによる活性化及び増殖より有意に高度であった。ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖（α－ＯＸ４０）又はβ鎖（β－ＯＸ４０）単独のＣ末端に連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲの増殖を図１３及び表８に示したが、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖単独のＣ末端に連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ（α－ＯＸ４０）の７日後におけるＴ細胞増殖は１１．７５倍であった一方、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、β－ＯＸ４０及びαβ－ＯＸ４０のような他の構造のＴ細胞増殖は、ぞれぞれ、２．７５５倍、４．１２８倍及び６．７４４倍であり、よって、α－ＯＸ４０の増殖効果は他の構造の増殖効果より有意に高かった。上記の腫瘍殺滅の結果、ＥＬＩＳＡの結果及びＴ細胞増殖の結果を合わせると、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖単独のＣ末端に連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ（α－ＯＸ４０）は、他の構造より増強された増殖及び腫瘍殺滅能力を示した。
【0176】
上記の結果により、共刺激分子ＯＸ４０をＴＣＲ－α鎖にリンクすることにより、Ｔ細胞の殺滅効果に影響を与えることもなく最良の増殖効果が得られたことが見出された。したがって、異なる共刺激分子のエンドドメインがＴＣＲα鎖にリンクしたｍｕ－ＳＴＡＲによる、標的細胞に対するＴ細胞の異なるＥ：Ｔ比における殺滅効果に対する結果によれば、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインがリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲの殺滅効果は、他の共刺激ドメインがリンクしたＳＴＡＲの殺滅効果より良好であった。１：２及び１：４のＥ：Ｔ比において、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインが連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞（α－ＯＸ４０）の効果はαβ－ＯＸ４０の効果と類似しており、他の共刺激分子が連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の効果より良好であった。結果を図１４及び表９に示した。上記の殺滅の結果より、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（α－ＯＸ４０）によって得られた腫瘍殺滅及び増殖能力は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺滅及び増殖能力を有意に上回っていた。
【0177】
【表2】
【0178】
【表3】
【0179】
【表4】
【0180】
【表5】
【0181】
【表6】
【0182】
【表7】
【0183】
【表8】
【0184】
【表9】
【0185】
９．ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する異なるＣＤ３鎖に連結した共刺激構造（ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ）の効果
９．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量を、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
９．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量を、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
【0186】
９．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であるが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞活性化に直接使用することができる。陽性Ｔ細胞を通常１×１０５／ウェルで添加し、遠心分離し、２４時間活性化させ、細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であるが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞活性化に直接使用することができる。陽性Ｔ細胞を通常１×１０５／ウェルで添加し、遠心分離し、２４時間活性化させ、細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
【0187】
９．３．Ｔ細胞殺滅機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに取り、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに取り、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
【0188】
ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺滅機能試験の検出結果によれば、図１５及び表１０に示されるように、共刺激エンドドメインをＣＤ３δ又はＣＤ３γ又はＣＤ３ε又はＣＤ３ζ鎖のＣ末端に連結し、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔで共発現させた場合、標的細胞に対する各種Ｔ細胞のＥ：Ｔ比が１：１における結果が示すところでは、いずれのｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲもαβ－ＯＸ４０より良好な標的細胞殺滅効果を呈さなかったが、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－４１ＢＢ、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ－ＯＸ４０が、ｍｕｔ－ＳＴＡＲと比較して類似の殺滅効果を呈し、その残留腫瘍生残率は、１：１のＥ：Ｔ比では有意差がなかった。上記の結果より、共刺激エンドドメインを種々のＣＤ３鎖のＣ末端にリンクすることによってｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺滅効果は有意には改善されなかったが、共刺激エンドドメインがＣＤ３ζ鎖のＣ末端にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲの効果は有意には低下しなかった。
【0189】
９．４．Ｔ細胞増殖の変化の検出：フローサイトメトリーによる計数
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進し、Ｔ細胞増殖において最も明白に出現したのは、Ｔ細胞の数の顕著な変化であった。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、ＰＢＳを用いて再懸濁して２００ｕＬとし、陽性Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。Ｔ細胞増殖の変化：増殖倍率＝７日後の陽性Ｔ細胞の数／添加された陽性Ｔ細胞の初期数。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進し、Ｔ細胞増殖において最も明白に出現したのは、Ｔ細胞の数の顕著な変化であった。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、ＰＢＳを用いて再懸濁して２００ｕＬとし、陽性Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。Ｔ細胞増殖の変化：増殖倍率＝７日後の陽性Ｔ細胞の数／添加された陽性Ｔ細胞の初期数。
【0190】
選別後、様々な構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞と１：３のＥ：Ｔ比で共培養し、この日を０日目とし、その後、それぞれ１日目及び７日目に細胞を採取して、フロー解析を行った。それらのうち、使用した培地はＩＬ－２を含まない１６４０完全培地であり、ＴＣＲ Ｔ細胞の初期数は１×１０５細胞であって、各時点において試料を独立にインキュベートし、翌日、液体を用いて残留する共インキュベートされた試料を半量交換し、標的細胞を補充した。フロー解析に使用した細胞は事前に抗ヒトＣＤ３抗体で染色しておき、規定の体積の細胞を採取し、機械上で分析を実施した際に記録し、系におけるＴ細胞の数及び割合は変換により知ることができた。図１６及び表１１に示されるように、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞の絶対数の増殖倍率曲線から、いずれのｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲもαβ－ＯＸ４０－ｍｕｔ－ＳＴＡＲと比較してより良好な標的細胞殺滅効果を呈さなかったが、ＣＤ３ε－ＣＤ２８、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ－ＯＸ４０などは類似の増殖効果を呈したことがわかる。ルシフェラーゼアッセイによる殺滅の検出結果及びＴ細胞増殖の結果を合わせると、共刺激エンドドメインがＣＤ３δ又はＣＤ３γ又はＣＤ３ε又はＣＤ３ζ鎖のＣ末端に連結しｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔで共発現されている構造は、αβ－ＯＸ４０－ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞と比較して、腫瘍殺滅及び増殖のより良好な効果を示さなかった。
【0191】
【表10】
【0192】
【表11】
【0193】
１０．ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対するエンドドメイン欠損α又はβ定常領域に連結したリンカーＧ４Ｓを含む共刺激エンドドメインの効果
１０．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量は、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
１０．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量は、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
【0194】
１０．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
本発明の標的抗原は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
【0195】
１０．３．Ｔ細胞殺滅機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに取り、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに取り、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
【0196】
ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺滅機能試験の検出結果によれば、異なる長さのＧ４Ｓリンカーを有する共刺激エンドドメインがエンドドメイン欠損α又はβ定常領域に連結されたが、標的細胞に対するＴ細胞のＥ：Ｔ比が１：１における結果が示すところでは、リンカーがα定常領域エンドドメインに連結された場合、α－ｄｅｌ－ＯＸ４０、α－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０及びα－β－ｏｘ４０は類似の殺滅効果を示し、これはα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）７－ＯＸ４０及びα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）１０－ＯＸ４０の殺滅効果を上回っており、リンカーが長い程Ｔ細胞殺滅効果は弱く、リンカーがβ定常領域エンドドメインに連結された場合、β－ｄｅｌ－ＯＸ４０、β－ｏｘ４０、β－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０及びα－β－ｏｘ４０は類似の殺滅効果を示し、こちらも、リンカーが長い程Ｔ細胞殺滅効果は弱かった。定常領域エンドドメインの除去後におけるＯＸ４０（α－ｄｅｌ－ＯＸ４０又はβ－ｄｅｌ－ＯＸ４０）への連結は、そのような除去を行わない連結と比較して効果にほとんど差を示さなかったが、リンカーの付加後（リンカーの数は３以下であった）、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）１－３－ＯＸ４０又はβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）１－３－ＯＸ４０の効果は、α－ｄｅｌ－ＯＸ４０又はβ－ｄｅｌ－ＯＸ４０の効果より良好であった。リンカーをα定常領域エンドドメインに連結した場合の効果とリンカーをβ定常領域エンドドメインに連結した場合の効果の間の比較したところ、リンカーをα定常領域エンドドメインに連結した場合の効果は、リンカーをβ定常領域エンドドメインに連結した場合の効果より良好であった。しかし、図１７及び１８、並びに表１２及び１３に示されるように、２：１のＥ：Ｔ比における残留腫瘍生残率に有意差はなかった。上記の結果より、Ｇ４Ｓリンカーを含む共刺激エンドドメインがエンドドメイン欠損α又はβ定常領域にリンクしたｍｕｔ－ＳＴＡＲは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺滅効果に影響を与えず、α定常領域エンドドメインにリンクした場合の効果は、β定常領域エンドドメインにリンクした場合の効果より良好であったが、リンカー長が大きいほど腫瘍殺滅効果は逆に弱かった。
【0197】
１０．４．Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。使用したＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、及びＨｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（洗浄緩衝剤とも呼ばれる、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従う試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。使用したＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、及びＨｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（洗浄緩衝剤とも呼ばれる、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従う試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
【0198】
ＥＬＩＳＡの結果によれば、図１９及び２０、並びに表１４及び１５に示されるように、Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共インキュベートした後、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）７－ＯＸ４０ＯＸ４０の構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２及びＩＦＮ－γの分泌は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２及びＩＦＮ－γの分泌より有意に少なかったが、一方、他の構造β－ｄｅｌ－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０及びα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０の各々の構造のＩＬ－２分泌は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２分泌と類似しており、β－ｄｅｌ－ＯＸ４０のみがｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＦＮ－γ分泌と類似のＩＦＮ－γ分泌を呈した一方、他の構造のＩＦＮ－γ分泌は異なる減少を呈した。ＥＬＩＳＡの結果によれば、α又はβ定常領域のエンドドメインが欠損した構造において、α鎖のエンドドメインの欠損は、ＩＦＮ－γ分泌に影響を与えたがＩＬ－２分泌には影響を与えず、一方、β鎖のエンドドメインの欠損は、ＩＬ－２の分泌にもＩＦＮ－γの分泌にも影響を与えなかった。同時に、α鎖のエンドドメインを欠損させた後、リンカーを使用してＯＸ４０エンドドメインにリンクしたが、７未満の長さを有するリンカーの場合、これはＩＬ－２分泌に影響を与えなかったがＩＦＮ－γ分泌を減少させた。
【0199】
１０．５．Ｔ細胞分化の変化の検出：フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞の活性化中、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、Ｔ細胞の分化を制御するようにシグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を通じて核内へと伝達された。Ｔ細胞は原始Ｔ細胞（ナイーブ）からセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）、最後にはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）へと分化する。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖及び持続は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）へと分化したＴ細胞の数よって影響を受ける。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類することができる。セントラルメモリーＴ細胞の分化比は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の持続的殺滅効果に影響を与える。エフェクターＴ細胞に対する原始Ｔ細胞の比は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の腫瘍殺滅効果及び持続に影響を与える。Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーによって検出したが、これにより、Ｔ細胞の分化を知ることができる。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。
Ｔ細胞の活性化中、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、Ｔ細胞の分化を制御するようにシグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を通じて核内へと伝達された。Ｔ細胞は原始Ｔ細胞（ナイーブ）からセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）、最後にはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）へと分化する。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖及び持続は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）へと分化したＴ細胞の数よって影響を受ける。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類することができる。セントラルメモリーＴ細胞の分化比は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の持続的殺滅効果に影響を与える。エフェクターＴ細胞に対する原始Ｔ細胞の比は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の腫瘍殺滅効果及び持続に影響を与える。Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーによって検出したが、これにより、Ｔ細胞の分化を知ることができる。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。
【0200】
フローサイトメトリーの結果によれば、図２１及び表１６に示されるように、Ｇ４Ｓリンカーを含む共刺激エンドドメインをα又はβ定常領域のエンドドメインが欠損した構造にリンクした場合、得られたα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０はセントラルメモリーＴ細胞の顕著な分化を示したが、一方、ＯＸ４０がα（α－ｄｅｌ－ＯＸ４０）又はβ（β－ｄｅｌ－ＯＸ４０）定常領域のエンドドメインに直接連結した構造もまた、セントラルメモリーＴ細胞の分化を促進した。同時に、図２２及び表１７に示されるように、様々な改変された構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞の数はｍｕｔ－ＳＴＡＲのエフェクターＴ細胞の数より有意に少なかったが、各々のナイーブＴ細胞の割合は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲのナイーブＴ細胞の割合（２８．３％）より有意に高かった。腫瘍殺滅の結果、ＥＬＩＳＡの結果及び細胞分化のフローサイトメトリー検出の結果を合わせると、α又はβ定常領域のエンドドメインが欠損し、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介してＯＸ４０エンドドメインに連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲは、腫瘍殺滅効果及びＩＬ－２分泌に影響を与えることなくＴ細胞のメモリー細胞集団の分化を顕著に改善することができる。
【0201】
【表12】
【0202】
【表13】
【0203】
【表14】
【0204】
【表15】
【0205】
【表16】
【0206】
【表17】
【0207】
１１．変異体ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるアルギニンへのＴＣＲエンドサイトーシス関連リシン改変の効果
１１．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量は、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
１１．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量は、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
【0208】
１１．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
本発明の標的は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
【0209】
１１．３．Ｔ細胞殺滅機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに取り、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに取り、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
【0210】
ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺滅機能試験の検出結果によれば、図２３及び表１８に示されるように、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるＴＣＲエンドサイトーシス関連リシンがアルギニンに改変されたｍｕｔ－ＳＴＡＲであるｕｂ－ＳＴＡＲの腫瘍細胞殺滅効果は、標的細胞に対するＴ細胞のＥ：Ｔ比が２：１又は１：１において、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞殺滅効果より有意に低かった。
【0211】
１１．４．Ｔ細胞によって分泌されたサイトカインの分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。使用したＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（洗浄緩衝剤とも呼ばれる、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従って希釈された試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。使用したＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（洗浄緩衝剤とも呼ばれる、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従って希釈された試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
【0212】
ＥＬＩＳＡの結果によれば、図２４、２５、及び表１９、２０に示されるように、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおいてＴＣＲエンドサイトーシス関連リシンがアルギニンに改変されたｍｕｔ－ＳＴＡＲであるｕｂ－ＳＴＡＲを、２：１又は１：１又は１：２の標的細胞に対するＴ細胞のＥ：Ｔ比において標的細胞と２４時間共インキュベートしたが、ｕｂ－ＳＴＡＲによるＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌より有意に低かった。
【0213】
１１．５．Ｔ細胞分化の変化の検出：フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、Ｔ細胞の分化を制御するようにシグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を通じて核内へと伝達された。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖及び持続は、メモリーＴ細胞へと分化したＴ細胞の数によって影響を受けた。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類することができる。Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーによって検出したが、これにより、Ｔ細胞の分化を知ることができる。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、Ｔ細胞の分化を制御するようにシグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を通じて核内へと伝達された。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖及び持続は、メモリーＴ細胞へと分化したＴ細胞の数によって影響を受けた。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類することができる。Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーによって検出したが、これにより、Ｔ細胞の分化を知ることができる。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。
【0214】
フローサイトメトリーの結果によれば、図２６及び２７並びに表２１及び２２に示されるように、ｍｕｔ－ＳＴＡＲと、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるＴＣＲエンドサイトーシス関連リシンがアルギニンに改変されたｍｕｔ－ＳＴＡＲであるｕｂ－ＳＴＡＲの間に、セントラルメモリーＴ細胞の分化においても、エフェクターＴ細胞に対するナイーブＴ細胞の比においても、有意差は見出されなかったが、このことは、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるアルギニンへのＴＣＲエンドサイトーシス関連リシン改変が、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の分化に有意な効果を有していなかったことを示す。腫瘍殺滅の結果、ＥＬＩＳＡの結果及び細胞分化のフローサイトメトリー試験を組み合わせると、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるＴＣＲエンドサイトーシス関連リシンがアルギニンに改変されたｍｕｔ－ＳＴＡＲであるｕｂ－ＳＴＡＲは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ改変に対する効果的な促進効果を有していなかった。
【0215】
【表18】
【0216】
【表19】
【0217】
【表20】
【0218】
【表21】
【0219】
【表22】
【0220】
１２．ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対するα又はβ定常領域エンドドメインに連結した異なるサイトカイン受容体刺激領域を有する変異体ＳＴＡＲの効果
１２．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、次いで遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量は、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
１２．１．Ｔ細胞及び標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は懸濁細胞であり、共インキュベーションのために対応する数の細胞を取り、標的細胞培地と混合し、次いで遠心分離して培養した。具体的なステップは以下の通りであった：初代Ｔ細胞をパッケージングされ精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、通常は１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、さらに、標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして、細胞増殖数の変化を観察した。Ｔ細胞の総数を感染効率に基づいて計算し、標的細胞の全般的な使用量は、１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）とした。
【0221】
１２．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
本発明の標的は概して細胞表面タンパク質であったが、これはＴ細胞の機能を検出するためのＴ細胞の活性化に直接使用することができ、具体的には、標的抗原を通常は１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞と共に添加し、遠心分離し、２４時間活性化させて細胞懸濁液又は培養上清を採取して、Ｔ細胞機能を検出した。
【0222】
１２．３．Ｔ細胞殺滅機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を取り、白色９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
異なる時間でＴ細胞を標的細胞と共培養し、次いで、細胞懸濁液に優しく均一に送気し、１ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を取り、白色９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を取り、細胞溶解液と共に添加して室温で１５分間溶解し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心分離し、次いで、各ウェルについて２つの並列するウェルを選んで上清を取り、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）と共に添加し、次いで、多機能マイクロプレートリーダーにより、ゲイン値を１００に固定して検出して、化学発光値を得た。細胞殺滅の計算：殺滅効率＝１００％－（１ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／１ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。
【0223】
ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺滅機能試験の検出結果によれば、図２８及び表２３に示されるように、２：１の標的細胞に対するＴ細胞のＥ：Ｔ比において異なるサイトカイン受容体刺激領域を変異体ＳＴＡＲのα又はβ領域エンドドメインに連結した場合、β－ＩＬ－２Ｒｂ、α－ＩＬ－２Ｒｂ、α－ＩＬ－７ＲＡ、α－ＩＬ２１Ｒは、いずれもｍｕｔ－ＳＴＡＲの殺滅効果と類似した殺滅効果を呈した一方、β－ＩＬ２ＲｂＱ、α－ＩＬ２ＲｂＱ及びα－ＩＬ７ＲＡＱは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺滅効果より有意に低い腫瘍殺滅効果を呈した。さらに、図２９及び表２４に示されるように、２：１及び１：１のＥ：Ｔ比において異なるサイトカイン受容体刺激領域がリンクした変異体ＳＴＡＲの殺滅効果を検出し、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲの殺滅効果と比較したところ、α－ＩＬ７ＲＡの殺滅効果はα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲの殺滅効果よりわずかに低く、一方、他のサイトカイン受容体構造がリンクしたＳＴＡＲの殺滅効果はα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲの殺滅効果より有意に低かった。
【0224】
１２．４．Ｔ細胞によって分泌されたサイトカインの分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（洗浄緩衝剤とも呼ばれる、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従って希釈された試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等が放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺滅することを助けるか、又はＴ細胞それ自体の増大を促進した。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、上清を取った。ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットは、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（それぞれ、物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）であった。具体的なステップは以下の通りであった：１０Ｘコーティング緩衝剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティングされた抗体（２５０Ｘ）を添加し、十分に混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加する。プラスチックラップで密閉し４℃で終夜静置した後、１Ｘ ＰＢＳＴ（洗浄緩衝剤とも呼ばれる、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した１Ｘ ＰＢＳ）を使用して、各回２６０μＬ／ウェルにて３回洗浄し、５Ｘ ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、次いで、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで添加し、その後室温で１時間放置した。ＰＢＳＴを使用して１回洗浄し、標準曲線（それぞれ、２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈を実施し、１ｘ希釈剤を用いて試料を２０～５０倍に希釈した。標準曲線に従って希釈された試料を１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加し、２つの並列するウェルを選び、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈された検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、１ｘ希釈剤で希釈されたＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、ＴＭＢを添加して１５分未満の発色時間で発色を行い、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させ、４５０ｎｍにおける吸光を検出した。
【0225】
ＥＬＩＳＡの結果によれば、図３０及び表２５に示されるように、１：１又は１：２のＥ：Ｔ比においてＴ細胞を標的細胞と共に２４時間インキュベートした場合、β－ＩＬ－２ＲｂのＩＬ－２分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２分泌より有意に高かった一方、α－ＩＬ－２Ｒｂ、β－ＩＬ－２ＲｂＱ及びα－ＩＬ－７ＲＡＱは類似のＩＬ－２分泌を呈したが、α－ＩＬ－２ＲｂＱのＩＬ－２分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２分泌より有意に低かった。図３１及び表２６に示されるように、β－ＩＬ－２ＲｂのＩＦＮ－γ分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＦＮ－γ分泌より有意に高かった一方、他の構造のＩＦＮ－γ分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＦＮ－γ分泌より有意に低かった。
【0226】
１２．５．Ｔ細胞分化の変化の検出：フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、Ｔ細胞の分化の変化を制御するようにシグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を通じて核内へと伝達された。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖及び持続は、メモリーＴ細胞へと分化したＴ細胞の数によって影響を受けた。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類することができる。Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーによって検出したが、これにより、Ｔ細胞の分化の状況が得られた。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。
Ｔ細胞活性化中、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、Ｔ細胞の分化の変化を制御するようにシグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を通じて核内へと伝達された。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖及び持続は、メモリーＴ細胞へと分化したＴ細胞の数によって影響を受けた。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類することができる。Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーによって検出したが、これにより、Ｔ細胞の分化の状況が得られた。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。
【0227】
図３２及び３３、並びに表２７及び２８に示されるように、異なるサイトカイン受容体刺激領域がα又はβ定常領域エンドドメインにリンクした変異体ＳＴＡＲは、セントラルメモリーＴ細胞の分化及びエフェクターＴ細胞に対するナイーブＴ細胞の比において様々な変化を示し、α－ＩＬ－２Ｒｂ、β－ＩＬ－２Ｒｂ、α－ＩＬ－２ＲｂＱ、β－ＩＬ－２ＲｂＱは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲと比較して有意差を示さなかったが、一方、α－ＩＬ－７ＲＡ、α－ＩＬ－７ＲＡＱ及びα－ＩＬ－２１Ｒは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲと比較して有意差を示さなかった。上記の結果より、異なるサイトカイン受容体刺激領域を変異体ＳＴＡＲのα又はβ定常領域エンドドメインに連結した場合、ｍｕｔ ＳＴＡＲ Ｔ細胞の分化は有意に影響を受けた。
【0228】
【表23】
【0229】
【表24】
【0230】
【表25】
【0231】
【表26】
【0232】
【表27】
【0233】
【表28】
【0234】
１３．様々なＳＴＡＲ様Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖及び抗腫瘍能力の評価
１）実験動物モデル
この実験では、ＮＳＧ免疫不全マウスをモデルとして使用した。マウス遺伝子型はＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６／Ｎｊｕであり、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を欠き、該マウスのマクロファージ及び樹状細胞も欠失していた。ＮＳＧマウスは現行では最も完全な免疫不全マウス株であったが、これは移植された腫瘍及びＴ細胞を拒絶しないため、Ｔ細胞療法の前臨床研究において広く使用することができる。この実験では６～８週齢の雌ＮＳＧマウスを使用し、各バッチのマウスの体重差を２ｇ以内に制御した。マウスを特定病原体除去（ＳＰＦ）障壁内の独立した換気されたケージ中に置き、通常食と、病原体の混入を防ぐためわずかに酸性のｐＨを有する飲用水とを与えた。
１）実験動物モデル
この実験では、ＮＳＧ免疫不全マウスをモデルとして使用した。マウス遺伝子型はＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６／Ｎｊｕであり、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を欠き、該マウスのマクロファージ及び樹状細胞も欠失していた。ＮＳＧマウスは現行では最も完全な免疫不全マウス株であったが、これは移植された腫瘍及びＴ細胞を拒絶しないため、Ｔ細胞療法の前臨床研究において広く使用することができる。この実験では６～８週齢の雌ＮＳＧマウスを使用し、各バッチのマウスの体重差を２ｇ以内に制御した。マウスを特定病原体除去（ＳＰＦ）障壁内の独立した換気されたケージ中に置き、通常食と、病原体の混入を防ぐためわずかに酸性のｐＨを有する飲用水とを与えた。
【0235】
２）腫瘍モデルの構築
血液腫瘍モデルを構築する際、ヒトバーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞を異種移植のために使用した。Ｒａｊｉ細胞は、レンチウイルスベクターによってルシフェラーゼ遺伝子を発現している細胞株であり、マウスにおいて、Ｒａｊｉ腫瘍の発達及び変化を、フルオレセイン化学発光及びｉｎ ｖｉｖｏイメージングによってリアルタイムでモニタリングした。このモデルにおいて、異なる用量（概ね約１～３×１０６細胞）のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞をマトリックスゲルと混合し、腹腔内注射によって６～８週齢の雌ＮＳＧマウスに接種した。３日後、マウスにフルオレセインカリウム塩溶液を腹腔内注射し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の蛍光シグナルをｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって検出した。Ｒａｊｉ細胞はマウスにおいて急速に成長し、腹腔内で固形腫瘍を生成し、マウスにおいて、症状、例えば、体重減少等を引き起こした。治療的処置の非存在下では、Ｒａｊｉ腫瘍負荷は約４０日でマウスを死に至らしめた。
血液腫瘍モデルを構築する際、ヒトバーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞を異種移植のために使用した。Ｒａｊｉ細胞は、レンチウイルスベクターによってルシフェラーゼ遺伝子を発現している細胞株であり、マウスにおいて、Ｒａｊｉ腫瘍の発達及び変化を、フルオレセイン化学発光及びｉｎ ｖｉｖｏイメージングによってリアルタイムでモニタリングした。このモデルにおいて、異なる用量（概ね約１～３×１０６細胞）のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞をマトリックスゲルと混合し、腹腔内注射によって６～８週齢の雌ＮＳＧマウスに接種した。３日後、マウスにフルオレセインカリウム塩溶液を腹腔内注射し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の蛍光シグナルをｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって検出した。Ｒａｊｉ細胞はマウスにおいて急速に成長し、腹腔内で固形腫瘍を生成し、マウスにおいて、症状、例えば、体重減少等を引き起こした。治療的処置の非存在下では、Ｒａｊｉ腫瘍負荷は約４０日でマウスを死に至らしめた。
【0236】
３）動物実験操作
すべての動物操作は動物プロトコールの認可後に行われた。
すべての動物操作は動物プロトコールの認可後に行われた。
【0237】
４）腫瘍成長をモニタリングするための手段
この実験では、基本的に、ルシフェラーゼ遺伝子を有する腫瘍細胞を動物中に注射して定着させることによる、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを使用した。マウスにフルオレセインカリウム塩溶液を腹腔内注射したが、酵素の存在下で、フルオレセインカリウム塩溶液は基質として特定の波長を有する光を発し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の蛍光シグナルをｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって検出した。蛍光シグナルの定量分析を実施し、ヒートマップを描くことで腫瘍成長を定量的に反映させた。
この実験では、基本的に、ルシフェラーゼ遺伝子を有する腫瘍細胞を動物中に注射して定着させることによる、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを使用した。マウスにフルオレセインカリウム塩溶液を腹腔内注射したが、酵素の存在下で、フルオレセインカリウム塩溶液は基質として特定の波長を有する光を発し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の蛍光シグナルをｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって検出した。蛍光シグナルの定量分析を実施し、ヒートマップを描くことで腫瘍成長を定量的に反映させた。
【0238】
５）動物におけるＴ細胞活性及び増幅を検出するための方法
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の生残及び増大を、Ｔ細胞の最終的な抗腫瘍効果に直接関連づける。動物におけるＴ細胞の活性及び増殖を検出するため、マウスから定期的に血液試料を採取し、末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の割合、細胞状態及び細胞分類を分析した。具体的な操作は以下の通りであった：３～４日毎にマウスをイソフルランで麻酔し、約１００ｕＬの血液をマウスの眼窩から採取した。血液試料に抗凝固、血漿採取及び赤血球切断を施し、次いで、残留細胞をフロー染色に供して、ＣＤ８に対するＣＤ４の比並びに分子、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３等を検出し、これらをＴ細胞サブセット分析及び細胞状態分析のために使用した。同時に、マウスの末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の絶対数を、フローサイトメトリー又はデジタルＰＣＲによって得た。さらに、実験の終了時に、マウスの他の免疫器官におけるＴ細胞の割合を検出するためにマウスを解剖することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の生残及び増大を、Ｔ細胞の最終的な抗腫瘍効果に直接関連づける。動物におけるＴ細胞の活性及び増殖を検出するため、マウスから定期的に血液試料を採取し、末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の割合、細胞状態及び細胞分類を分析した。具体的な操作は以下の通りであった：３～４日毎にマウスをイソフルランで麻酔し、約１００ｕＬの血液をマウスの眼窩から採取した。血液試料に抗凝固、血漿採取及び赤血球切断を施し、次いで、残留細胞をフロー染色に供して、ＣＤ８に対するＣＤ４の比並びに分子、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３等を検出し、これらをＴ細胞サブセット分析及び細胞状態分析のために使用した。同時に、マウスの末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の絶対数を、フローサイトメトリー又はデジタルＰＣＲによって得た。さらに、実験の終了時に、マウスの他の免疫器官におけるＴ細胞の割合を検出するためにマウスを解剖することができる。
【0239】
６）動物におけるＴ細胞安全性を評価するための方法
ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の毒性及び安全性を評価するため、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞によって実験動物に副作用が引き起こされたかどうかを検討した。マウスの行動状態の観察、マウスの病理の分析、及びマウスの重要な器官から取った切片の分析により、再注入されたＴ細胞が顕著な毒性を有しているかどうかを評価することができた。同時に、マウスの非腫瘍組織におけるＴ細胞の浸潤を分析することにより、Ｔ細胞がマウスの非腫瘍組織に対してオフターゲットの殺滅効果を有するかどうかを決定することができる。さらに、マウス血におけるサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα又はＩＬ－６等のレベルを検出することにより、Ｔ細胞が全身性サイトカインストームを引き起こし得るかどうかを決定することができる。
ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の毒性及び安全性を評価するため、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞によって実験動物に副作用が引き起こされたかどうかを検討した。マウスの行動状態の観察、マウスの病理の分析、及びマウスの重要な器官から取った切片の分析により、再注入されたＴ細胞が顕著な毒性を有しているかどうかを評価することができた。同時に、マウスの非腫瘍組織におけるＴ細胞の浸潤を分析することにより、Ｔ細胞がマウスの非腫瘍組織に対してオフターゲットの殺滅効果を有するかどうかを決定することができる。さらに、マウス血におけるサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα又はＩＬ－６等のレベルを検出することにより、Ｔ細胞が全身性サイトカインストームを引き起こし得るかどうかを決定することができる。
【0240】
７）Ｔ細胞腫瘍浸潤能力を評価するための方法
Ｔ細胞の腫瘍に浸潤する能力は、固形腫瘍を攻撃するための核となる能力である。Ｔ細胞の浸潤能力を検出するため、まずは腫瘍組織を分離し、その後消化及び粉砕することで単一細胞を得ることができ、腫瘍組織におけるＴ細胞の割合を検出するために単一細胞をフロー染色に供した。同時に、精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞が得られるように、密度勾配遠心分離（例えば、パーコール勾配、フィコール勾配等）により、腫瘍懸濁液中の腫瘍細胞、腫瘍間質細胞及び免疫細胞をさらに分離することができ、これらの特徴、例えば、ケモカイン受容体発現、Ｔ細胞枯渇及びその他等を、配列決定及び他の方法によって詳細に分析することができる。
Ｔ細胞の腫瘍に浸潤する能力は、固形腫瘍を攻撃するための核となる能力である。Ｔ細胞の浸潤能力を検出するため、まずは腫瘍組織を分離し、その後消化及び粉砕することで単一細胞を得ることができ、腫瘍組織におけるＴ細胞の割合を検出するために単一細胞をフロー染色に供した。同時に、精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞が得られるように、密度勾配遠心分離（例えば、パーコール勾配、フィコール勾配等）により、腫瘍懸濁液中の腫瘍細胞、腫瘍間質細胞及び免疫細胞をさらに分離することができ、これらの特徴、例えば、ケモカイン受容体発現、Ｔ細胞枯渇及びその他等を、配列決定及び他の方法によって詳細に分析することができる。
【0241】
８）結果
上記ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能の結果に従い、５×１０５ 個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を６～８週齢のＮＣＧ雌マウス中に尾静脈を介して接種してマウス腫瘍モデルを構築し（図３４）、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ又はｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞を発現するｉｎ ｖｉｖｏ機能をさらに評価した。６日目に、腫瘍担持マウスを、Ａ：ＰＢＳ注射群（等体積のＰＢＳを注射）、Ｂ：ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群、Ｃ：αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群、Ｄ：ＢＢｚ－ＣＡＲ－Ｔ細胞注射群の４つの群に分けた。Ｂ／Ｃ／Ｄ群のマウスに尾静脈経由で５×１０５個のＴＣＲ Ｔ細胞を注射し、Ａ群のマウスに２００μＬの等体積のＰＢＳを注射した。その後の数週間で、腫瘍細胞成長、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴＣＲ Ｔ細胞増殖及びマウスの生残をモニタリングした。図３４及び３５に示されるように、対照群と比較して、この実施例で構築されたαβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞は腫瘍担持マウスの生残時間を顕著に延長させることができるが、腫瘍が消失し異なる時点で腫瘍細胞をマウス中に再注入した後、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔは適切に腫瘍細胞を排除することができ、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔの効果はｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔの効果より良好であり、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ群におけるマウスの生残時間は、ＳＴＡＲ－Ｔ群及びＣＡＲ－Ｔ群における生残時間より長かった。さらに、図３６に示されるように、ＳＴＡＲ－Ｔ群と比較して、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖効果はＳＴＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖効果より良好であり、腫瘍再注入の場合、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞においてわずかな増殖が生じたが、これはＳＴＡＲ－Ｔ細胞では生じなかった。
上記ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能の結果に従い、５×１０５ 個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を６～８週齢のＮＣＧ雌マウス中に尾静脈を介して接種してマウス腫瘍モデルを構築し（図３４）、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ又はｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞を発現するｉｎ ｖｉｖｏ機能をさらに評価した。６日目に、腫瘍担持マウスを、Ａ：ＰＢＳ注射群（等体積のＰＢＳを注射）、Ｂ：ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群、Ｃ：αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群、Ｄ：ＢＢｚ－ＣＡＲ－Ｔ細胞注射群の４つの群に分けた。Ｂ／Ｃ／Ｄ群のマウスに尾静脈経由で５×１０５個のＴＣＲ Ｔ細胞を注射し、Ａ群のマウスに２００μＬの等体積のＰＢＳを注射した。その後の数週間で、腫瘍細胞成長、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴＣＲ Ｔ細胞増殖及びマウスの生残をモニタリングした。図３４及び３５に示されるように、対照群と比較して、この実施例で構築されたαβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞は腫瘍担持マウスの生残時間を顕著に延長させることができるが、腫瘍が消失し異なる時点で腫瘍細胞をマウス中に再注入した後、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔは適切に腫瘍細胞を排除することができ、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔの効果はｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔの効果より良好であり、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ群におけるマウスの生残時間は、ＳＴＡＲ－Ｔ群及びＣＡＲ－Ｔ群における生残時間より長かった。さらに、図３６に示されるように、ＳＴＡＲ－Ｔ群と比較して、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖効果はＳＴＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖効果より良好であり、腫瘍再注入の場合、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞においてわずかな増殖が生じたが、これはＳＴＡＲ－Ｔ細胞では生じなかった。
【0242】
上記の動物実験の結果により、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ構造のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ効果は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ効果より良好であったと見出すことができる。
【0243】
上記ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能の結果に従い、２×１０６個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を６～８週齢のＮＣＧ雌マウス中に腹腔内接種してマウス腫瘍モデルを構築し（図３７）、異なる効果を発現しているｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能をさらに評価した。８日目に、腫瘍担持マウスを、Ａ：ＰＢＳ注射群（等体積のＰＢＳを注射）、Ｂ：二重ｃａｒ、Ｃ：二重ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注射群、Ｄ：αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群、Ｅ：α－ｄｅｌ－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注射群、Ｆ：α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注射群、及びＧ：α－ＩＬ７Ｒ－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注射群の７つの群に分けた。Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ群のマウスに尾静脈経由で２×１０６個のＴＣＲ Ｔ細胞を注射し、Ａ群のマウスに２００μＬの等体積のＰＢＳを注射した。その後の数週間で、腫瘍細胞成長、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳＴＡＲ－Ｔ細胞増殖及びマウスの生残をモニタリングした。図３７に示されるように、対照群と比較して、この実施例で構築されたα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍担持マウスの腫瘍細胞を顕著に殺滅することができ、その効果は他の群より優れていた。動物実験の結果により、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ構造のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ効果は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ効果より良好であったと見出すことができる。
【0244】
実施例２ ＳＴＡＲに対する定常領域Ｎ末端改変の効果
１．ＳＴＡＲ受容体定常領域ドメインの設計
この実施例では、ｈＳＴＡＲは、ヒトＴＣＲ定常領域を含むＳＴＡＲを指す。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲは、実施例１で示されるように、システイン置換及び膜貫通ドメイン改変を有する定常領域を含むＳＴＡＲを指す。マウスＴＣＲα鎖定常領域はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲα（配列番号４１）であり、マウスＴＣＲβ鎖定常領域はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂ（配列番号６）であった。具体的な構造を図３８に示す。
１．ＳＴＡＲ受容体定常領域ドメインの設計
この実施例では、ｈＳＴＡＲは、ヒトＴＣＲ定常領域を含むＳＴＡＲを指す。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲは、実施例１で示されるように、システイン置換及び膜貫通ドメイン改変を有する定常領域を含むＳＴＡＲを指す。マウスＴＣＲα鎖定常領域はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲα（配列番号４１）であり、マウスＴＣＲβ鎖定常領域はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂ（配列番号６）であった。具体的な構造を図３８に示す。
【0245】
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するため、定常領域マウス化、α鎖定常領域におけるシステイン変異及び疎水性アミノ酸変異に基づいて、良好な結果が得られるようにＳＴＡＲ分子の定常領域のＮ末端を特異的に再配置した。再配置とは、一部の配列を欠損させた一方、一部の配列のヒト化変異を実施したことを意味していた。ヒト化変異の重要性は、臨床適用時にＳＴＡＲ－Ｔ細胞が受容体によって拒絶されるおそれを最大限に回避することができるように、ＳＴＡＲ分子の機能を確保しつつも可能な限りＳＴＡＲ分子中の非ヒト配列を減少させる点にある。
【0246】
アミノ酸分析に基づいて、ＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端における１８アミノ酸再配置（マウス配列はＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱ）のスケジュールを実施し、マウス及びヒト化配列におけるＥ６Ｄ、Ｋ１３Ｒ、Ｒ１６Ｋ及びＱ１８Ｓが相同性アミノ酸置換に属し、Ｐ１５Ｓ置換が非極性アミノ酸から極性アミノ酸への置換に属することが見出されたが、このため、このタンパク質は、この部位の近傍においてはまったく保存的ではなく、タンパク質の機能に影響を与えることなく改変することができたと考えることができる。まとめると、１～１４位のアミノ酸配列を保持及びヒト化し、１５～１８位のアミノ酸を欠損させた。
【0247】
アミノ酸分析に基づいて、ＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端における２５アミノ酸再配置（マウス配列はＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫ）のスケジュールを実施し、マウス及びヒト化配列におけるＲ３Ｋ及びＬ１２Ｖのみが相同性アミノ酸置換であって、Ｔ６Ｆ、Ｋ９Ｅ、Ｓ１１Ａ、Ｋ１７Ｅ、Ａ２１Ｓ、Ｎ２２Ｈ及びＫ２３Ｔが異種性アミノ酸置換であることが見出された。このため、タンパク質の特性は、これらの部位の近傍においてはまったく保存的ではなく、タンパク質の機能に影響を与えることなく改変することができたと考えることができる。まとめると、１～１６位のアミノ酸配列を保持及びヒト化し、１７及び２１～２５位のアミノ酸を欠損させた。
【0248】
Ｎ末端再配置後では、ＴＣＲα鎖定常領域はＮｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲａ（配列番号４２）であり、ＴＣＲβ鎖定常領域はＮｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂ（配列番号４３）であった。具体的な構造を図３８に示す。
【0249】
２．ＳＴＡＲ共刺激因子の設計
１）ＳＴＡＲの異なる最適化方法の組合せ
各種ＳＴＡＲ機能に対する共刺激因子の効果を検証するため、元の最適化されていないＳＴＡＲ構造（ヒトＴＣＲα／β ＳＴＡＲ、ｈＳＴＡＲ）と、Ｃ領域マウス化、システイン改変及び膜貫通改変を有するｈＳＴＡＲに基づくｈｍｃｔ ＳＴＡＲと、Ｎ末端改変を有するｈｍｃｔ ＳＴＡＲに基づくＮｒｅｃ ＳＴＡＲとを選択した。
１）ＳＴＡＲの異なる最適化方法の組合せ
各種ＳＴＡＲ機能に対する共刺激因子の効果を検証するため、元の最適化されていないＳＴＡＲ構造（ヒトＴＣＲα／β ＳＴＡＲ、ｈＳＴＡＲ）と、Ｃ領域マウス化、システイン改変及び膜貫通改変を有するｈＳＴＡＲに基づくｈｍｃｔ ＳＴＡＲと、Ｎ末端改変を有するｈｍｃｔ ＳＴＡＲに基づくＮｒｅｃ ＳＴＡＲとを選択した。
【0250】
２ 共刺激因子を含むＳＴＡＲ構造の設計
ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の毒性及びＴ細胞増殖持続性を増強するため、本発明に従い、ヒト化共刺激受容体のエンドドメイン配列をＳＴＡＲ定常領域のＣ末端に導入して（図３９）、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞機能に対する影響を研究した。元の最適化されていないＳＴＡＲ構造（ヒトＴＣＲα／βＳＴＡＲ、ｈＳＴＡＲ）と、ｈＳＴＡＲに基づくｈｍｃｔ ＳＴＡＲと、Ｎ末端改変を有するｈｍｃｔ ＳＴＡＲに基づくＮｒｅｃ ＳＴＡＲとを、本発明のＳＴＡＲ定常領域構造として選択した。共刺激シグナル伝達構造は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいた。本発明において、ＴＣＲα鎖、β鎖及びαβ鎖において改変が生じ得る。本発明において、図４０に示されるように、共刺激分子改変がＴＣＲαβ鎖において生じた。
ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の毒性及びＴ細胞増殖持続性を増強するため、本発明に従い、ヒト化共刺激受容体のエンドドメイン配列をＳＴＡＲ定常領域のＣ末端に導入して（図３９）、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞機能に対する影響を研究した。元の最適化されていないＳＴＡＲ構造（ヒトＴＣＲα／βＳＴＡＲ、ｈＳＴＡＲ）と、ｈＳＴＡＲに基づくｈｍｃｔ ＳＴＡＲと、Ｎ末端改変を有するｈｍｃｔ ＳＴＡＲに基づくＮｒｅｃ ＳＴＡＲとを、本発明のＳＴＡＲ定常領域構造として選択した。共刺激シグナル伝達構造は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいた。本発明において、ＴＣＲα鎖、β鎖及びαβ鎖において改変が生じ得る。本発明において、図４０に示されるように、共刺激分子改変がＴＣＲαβ鎖において生じた。
【0251】
３．ＣＤ１９標的化ＦＭＣ６３－ＳＴＡＲ－Ｔ機能
１）ＣＤ１９標的化抗体配列の決定
公開されているｓｃＦｖ配列であるＦＭＣ６３を、ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＨ、配列番号４４）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬ、配列番号４５）のために選択した。
１）ＣＤ１９標的化抗体配列の決定
公開されているｓｃＦｖ配列であるＦＭＣ６３を、ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＨ、配列番号４４）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬ、配列番号４５）のために選択した。
【0252】
２）ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むベクターの構築
ＳＴＡＲは２本のポリペプチド鎖、具体的には、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲｂＣ鎖と融合することによって形成された第１のポリペプチド鎖と、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲａＣ鎖と融合することによって形成された第２のポリペプチド鎖とを含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介して、遺伝子全体をレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ１αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子を用いて担持された。遺伝子断片のクローニング、アセンブル、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって、以下のプラスミドを得た：ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ。
ＳＴＡＲは２本のポリペプチド鎖、具体的には、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲｂＣ鎖と融合することによって形成された第１のポリペプチド鎖と、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲａＣ鎖と融合することによって形成された第２のポリペプチド鎖とを含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介して、遺伝子全体をレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ１αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子を用いて担持された。遺伝子断片のクローニング、アセンブル、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって、以下のプラスミドを得た：ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ。
【0253】
共刺激因子を含むＳＴＡＲベクターの構築：３つのＣＤ１９標的化ＳＴＡＲベクターである、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲを元にして、これらにＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４１ＢＢ及びＣＤ２７を構築し、遺伝子合成によって上記配列を得た。ＰＣＲ及び相同組換えによって同じ共刺激因子をＴＣＲα及びβ鎖に同時に付加することにより、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲベクターに共刺激因子を付加した。最終的に、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を構築した。
【0254】
３）ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むＳＴＡＲの殺滅能力の検出
２４ウェルプレート中で、未感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。合計１ｍＬの共培養系で、ＲＦＰ陽性率に従ってＴ細胞の陽性細胞数をそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数を４Ｅ５とした。２４時間の共培養後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質と共に添加し、暗所にて低速で１０分間振盪した後、蛍光値を多機能マイクロプレートリーダーによって検出し、各群の標的細胞殺滅効果を計算した。その結果によれば、ｈＳＴＡＲの殺滅効率はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲの殺滅効率より有意に低く、それらのうち、Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲが最も高かった。共刺激因子を含む同じＳＴＡＲの結果によれば、ＯＸ４０及びＩＣＯＳがＳＴＡＲの殺滅効果を有意に上昇させることができる一方、他の共刺激因子はＳＴＡＲの殺滅能力に対して有意な効果を有さず、４１ＢＢはＳＴＡＲの殺滅機能を低下させたが、有意差はなかった（図４１）。
２４ウェルプレート中で、未感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。合計１ｍＬの共培養系で、ＲＦＰ陽性率に従ってＴ細胞の陽性細胞数をそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数を４Ｅ５とした。２４時間の共培養後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質と共に添加し、暗所にて低速で１０分間振盪した後、蛍光値を多機能マイクロプレートリーダーによって検出し、各群の標的細胞殺滅効果を計算した。その結果によれば、ｈＳＴＡＲの殺滅効率はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲの殺滅効率より有意に低く、それらのうち、Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲが最も高かった。共刺激因子を含む同じＳＴＡＲの結果によれば、ＯＸ４０及びＩＣＯＳがＳＴＡＲの殺滅効果を有意に上昇させることができる一方、他の共刺激因子はＳＴＡＲの殺滅能力に対して有意な効果を有さず、４１ＢＢはＳＴＡＲの殺滅機能を低下させたが、有意差はなかった（図４１）。
【0255】
図４．ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むＳＴＡＲの核ＲｅｌＢレベルの検出
以下のウイルスＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を、ＭＯＩ＝１の力価でＪｕｒｋａｔ細胞に感染させ、感染の４日後、Ｔ細胞株及びＣＤ１９タンパク質を１２ウェルプレート（２μｇ／ｍＬ、５００μＬを１２ウェルプレート上に被覆し、４℃の冷蔵庫中に終夜放置した）中で共培養し、ここで、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞は４Ｅ６であり、標的細胞は２Ｅ５であった（１日前に標的細胞を１２ウェルプレートに接種しておいた）。細胞を６時間培養し、次いで、採取して核タンパク質の抽出を行い、核ＲｅｌＢレベルについてのウエスタンブロッティングによって核タンパク質を検出した。その結果によれば、図４２に示されるように、共刺激因子のないＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ群において核ＲｅｌＢレベルは非常に低く、未感染ＳＴＡＲ－Ｔ群と一致し、共刺激因子を付加後、ＣＤ２８を除く他の共刺激因子は核ＲｅｌＢレベルを有意に増加させ、その中でも、４１ＢＢは核ＲｅｌＢレベルを最も改善した。
以下のウイルスＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を、ＭＯＩ＝１の力価でＪｕｒｋａｔ細胞に感染させ、感染の４日後、Ｔ細胞株及びＣＤ１９タンパク質を１２ウェルプレート（２μｇ／ｍＬ、５００μＬを１２ウェルプレート上に被覆し、４℃の冷蔵庫中に終夜放置した）中で共培養し、ここで、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞は４Ｅ６であり、標的細胞は２Ｅ５であった（１日前に標的細胞を１２ウェルプレートに接種しておいた）。細胞を６時間培養し、次いで、採取して核タンパク質の抽出を行い、核ＲｅｌＢレベルについてのウエスタンブロッティングによって核タンパク質を検出した。その結果によれば、図４２に示されるように、共刺激因子のないＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ群において核ＲｅｌＢレベルは非常に低く、未感染ＳＴＡＲ－Ｔ群と一致し、共刺激因子を付加後、ＣＤ２８を除く他の共刺激因子は核ＲｅｌＢレベルを有意に増加させ、その中でも、４１ＢＢは核ＲｅｌＢレベルを最も改善した。
【0256】
４．ＣＤ１９標的化３３４－ＳＴＡＲ－Ｔ機能
１）ＣＤ１９標的化抗体配列の決定
本発明によって開発された３３４抗体配列を、ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＨ、配列番号４６）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＬ、配列番号４７）のために選択した。
１）ＣＤ１９標的化抗体配列の決定
本発明によって開発された３３４抗体配列を、ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＨ、配列番号４６）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＬ、配列番号４７）のために選択した。
【0257】
２）ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むベクターの構築
ＳＴＡＲは２本のポリペプチド鎖、具体的には、抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＬをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲｂＣ鎖と融合することによって形成された第１のポリペプチド鎖と、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲａＣ鎖と融合することによって形成された第２のポリペプチド鎖とを含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介して、遺伝子全体をレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ１αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子を用いて担持された。遺伝子断片のクローニング、アセンブル、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって、以下のプラスミドを得た：３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ。
ＳＴＡＲは２本のポリペプチド鎖、具体的には、抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＬをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲｂＣ鎖と融合することによって形成された第１のポリペプチド鎖と、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲａＣ鎖と融合することによって形成された第２のポリペプチド鎖とを含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介して、遺伝子全体をレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ１αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子を用いて担持された。遺伝子断片のクローニング、アセンブル、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって、以下のプラスミドを得た：３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ。
【0258】
共刺激因子を含むＳＴＡＲベクターの構築：ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲベクターである３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲを元にして、これらに共刺激因子ＯＸ４０を構築し、遺伝子合成によって上記配列を得た。ＰＣＲ及び相同組換えによって同じ共刺激因子をＴＣＲα及びβ鎖に同時に付加することにより、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲベクターに共刺激因子を付加した。最終的に、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を構築した。
【0259】
３）ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むＳＴＡＲの殺滅能力の検出
２４ウェルプレート中で、未感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。合計１ｍＬの共培養系で、ＲＦＰ陽性率に従ってＴ細胞の陽性細胞数をそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数を４Ｅ５とした。２４時間の共培養後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質と共に添加し、暗所にて低速で１０分間振盪した後、蛍光値を多機能マイクロプレートリーダーによって検出し、各群の標的細胞殺滅効果を計算した。その結果は、ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲと比較して、ＯＸ４０は殺滅効率を顕著に増加させることができることを示した。さらに、ＯＸ４０はＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力及び核ＲｅｌＢレベルを顕著に増加させることができる。図４３を参照されたい。
２４ウェルプレート中で、未感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。合計１ｍＬの共培養系で、ＲＦＰ陽性率に従ってＴ細胞の陽性細胞数をそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数を４Ｅ５とした。２４時間の共培養後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質と共に添加し、暗所にて低速で１０分間振盪した後、蛍光値を多機能マイクロプレートリーダーによって検出し、各群の標的細胞殺滅効果を計算した。その結果は、ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲと比較して、ＯＸ４０は殺滅効率を顕著に増加させることができることを示した。さらに、ＯＸ４０はＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力及び核ＲｅｌＢレベルを顕著に増加させることができる。図４３を参照されたい。
【0260】
５ ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲ－Ｔ機能
１）ＣＤ１９及びＣＤ ２０標的化抗体配列の決定
ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＨ、配列番号４４）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬ、配列番号４５）；ＣＤ２０標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ２０ ２Ｃ６－ＶＨ、配列番号５４）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ２０ ２Ｃ６－ＶＬ、配列番号５５）。
１）ＣＤ１９及びＣＤ ２０標的化抗体配列の決定
ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＨ、配列番号４４）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬ、配列番号４５）；ＣＤ２０標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ２０ ２Ｃ６－ＶＨ、配列番号５４）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ２０ ２Ｃ６－ＶＬ、配列番号５５）。
【0261】
２）ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲ並びに共刺激因子を含むベクターの構築
ＳＴＡＲは２本のポリペプチド鎖、具体的には、抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨをｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲｂＣ鎖と融合することによって形成された第１のポリペプチド鎖と、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨをｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲａＣ鎖と融合することによって形成された第２のポリペプチド鎖とを含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介して、遺伝子全体をレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ１αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子を用いて担持された。遺伝子断片のクローニング、アセンブル、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって、以下のプラスミドを得た：ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ。
ＳＴＡＲは２本のポリペプチド鎖、具体的には、抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨをｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲｂＣ鎖と融合することによって形成された第１のポリペプチド鎖と、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨをｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲそれぞれのＴＣＲａＣ鎖と融合することによって形成された第２のポリペプチド鎖とを含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介して、遺伝子全体をレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ１αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子を用いて担持された。遺伝子断片のクローニング、アセンブル、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって、以下のプラスミドを得た：ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ。
【0262】
共刺激因子を含むＳＴＡＲベクターの構築：ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲベクターであるＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲを元にして、これらに共刺激因子ＯＸ４０を構築し、遺伝子合成によって上記配列を得た。ＰＣＲ及び相同組換えによって同じ共刺激因子をＴＣＲα及びβ鎖に同時に付加することにより、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲベクターに共刺激因子を付加した。最終的に、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を構築した。
【0263】
３）ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲ並びに共刺激因子を含むＳＴＡＲの殺滅能力の検出
２４ウェルプレート中で、未感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。合計１ｍＬの共培養系で、ＲＦＰ陽性率に従ってＴ細胞の陽性細胞数をそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数を４Ｅ５とした。２４時間の共培養後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質と共に添加し、暗所にて低速で１０分間振盪した後、蛍光値を多機能マイクロプレートリーダーによって検出し、各群の標的細胞殺滅効果を計算した。その結果は、ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲと比較して、ＯＸ４０は殺滅効率を顕著に増加させることができることを示した。さらに、ＯＸ４０はＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力及び核ＲｅｌＢレベルを顕著に増加させることができる。図４４を参照されたい。
２４ウェルプレート中で、未感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。合計１ｍＬの共培養系で、ＲＦＰ陽性率に従ってＴ細胞の陽性細胞数をそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数を４Ｅ５とした。２４時間の共培養後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質と共に添加し、暗所にて低速で１０分間振盪した後、蛍光値を多機能マイクロプレートリーダーによって検出し、各群の標的細胞殺滅効果を計算した。その結果は、ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲと比較して、ＯＸ４０は殺滅効率を顕著に増加させることができることを示した。さらに、ＯＸ４０はＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力及び核ＲｅｌＢレベルを顕著に増加させることができる。図４４を参照されたい。
【0264】
４）共刺激因子をＴＣＲα鎖のみに付加した場合におけるＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲの増殖能力の改善
抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ をｈｍｃｔ ＳＴＡＲ構造のＴＣＲβＣ（配列番号６）と融合することによって第１のポリペプチド鎖を形成し、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－Ｖを、天然のエンドドメインが欠損し、ＯＸ４０共刺激ドメインが定常領域のＣ末端に付加したｈｍｃｔ ＳＴＡＲのＴＣＲαＣ定常領域（配列番号２６）と融合することによって第２のポリペプチド鎖を形成した。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質（配列番号５８）へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。このように、共刺激因子がＴＣＲα鎖のみにリンクしたＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲを得た：ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０。このようなＳＴＡＲと、共刺激因子がＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方にリンクしたＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ａｂＯＸ４０の間で、殺滅及び増殖能力の比較を行った。結果を図４５に示した。ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０はａｂＯＸ４０より優れている。
抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ をｈｍｃｔ ＳＴＡＲ構造のＴＣＲβＣ（配列番号６）と融合することによって第１のポリペプチド鎖を形成し、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－Ｖを、天然のエンドドメインが欠損し、ＯＸ４０共刺激ドメインが定常領域のＣ末端に付加したｈｍｃｔ ＳＴＡＲのＴＣＲαＣ定常領域（配列番号２６）と融合することによって第２のポリペプチド鎖を形成した。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両鎖において使用した。ＳＴＡＲの２本の鎖の配列を、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片を介して連結し、転写し、タンパク質（配列番号５８）へと一体に翻訳し、次いで、フューリン及びｐ２Ａの対応するプロテアーゼによって切断し、最終的に２本の独立したタンパク質鎖を生成した。このように、共刺激因子がＴＣＲα鎖のみにリンクしたＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲを得た：ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０。このようなＳＴＡＲと、共刺激因子がＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方にリンクしたＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ａｂＯＸ４０の間で、殺滅及び増殖能力の比較を行った。結果を図４５に示した。ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０はａｂＯＸ４０より優れている。
【0265】
［配列表］
配列番号１ 野生型ヒトＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
配列番号２ 野生型ヒトＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVK RKDF*
配列番号３ 野生型マウスＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４ 野生型マウスＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号５ システイン置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号６ システイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－Ｃｙｓ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号７ 疎水性アミノ酸置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号８ 膜貫通ドメインにおいてシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ａｒｇ ｍｕｔ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLRVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号９ 膜貫通ドメイン及びエンドドメインにおいてシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウス ＴＣＲβＣ－Ａｒｇ ｍｕｔ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGRATLYAVLVSTLVVMAMVRRRNS
配列番号１０ ＣＤ４０エンドドメインのアミノ酸配列
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERO
配列番号１ 野生型ヒトＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
配列番号２ 野生型ヒトＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVK RKDF*
配列番号３ 野生型マウスＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４ 野生型マウスＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号５ システイン置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号６ システイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－Ｃｙｓ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号７ 疎水性アミノ酸置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号８ 膜貫通ドメインにおいてシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ａｒｇ ｍｕｔ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLRVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号９ 膜貫通ドメイン及びエンドドメインにおいてシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウス ＴＣＲβＣ－Ａｒｇ ｍｕｔ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGRATLYAVLVSTLVVMAMVRRRNS
配列番号１０ ＣＤ４０エンドドメインのアミノ酸配列
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERO
【0266】
配列番号１１ ＯＸ４０エンドドメインのアミノ酸配列
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号１２ ＩＣＯＳエンドドメインのアミノ酸配列
KKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
配列番号１３ ＣＤ２８エンドドメインのアミノ酸配列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号１４ ４－１ＢＢエンドドメインのアミノ酸配列
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号１５ ＣＤ２７エンドドメインのアミノ酸配列
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
配列番号１６ Ｇ４Ｓリンカーのアミノ酸配列
GGGGS
配列番号１７ （Ｇ４Ｓ）２リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGS
配列番号１８ （Ｇ４Ｓ）３リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号１９ （Ｇ４Ｓ）４リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２０ （Ｇ４Ｓ）５リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号１２ ＩＣＯＳエンドドメインのアミノ酸配列
KKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
配列番号１３ ＣＤ２８エンドドメインのアミノ酸配列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号１４ ４－１ＢＢエンドドメインのアミノ酸配列
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号１５ ＣＤ２７エンドドメインのアミノ酸配列
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
配列番号１６ Ｇ４Ｓリンカーのアミノ酸配列
GGGGS
配列番号１７ （Ｇ４Ｓ）２リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGS
配列番号１８ （Ｇ４Ｓ）３リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号１９ （Ｇ４Ｓ）４リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２０ （Ｇ４Ｓ）５リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【0267】
配列番号２１ （Ｇ４Ｓ）６リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２２ （Ｇ４Ｓ）７リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２３ （Ｇ４Ｓ）８リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２４ （Ｇ４Ｓ）９リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２５ （Ｇ４Ｓ）１０リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２６ システイン置換及び疎水性改変を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲαＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号２７ システイン置換を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号２８ ヒトＣＤ３γのアミノ酸配列
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN
配列番号２９ ヒトＣＤ３δのアミノ酸配列
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK
配列番号３０ ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２２ （Ｇ４Ｓ）７リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２３ （Ｇ４Ｓ）８リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２４ （Ｇ４Ｓ）９リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２５ （Ｇ４Ｓ）１０リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２６ システイン置換及び疎水性改変を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲαＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号２７ システイン置換を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号２８ ヒトＣＤ３γのアミノ酸配列
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN
配列番号２９ ヒトＣＤ３δのアミノ酸配列
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK
配列番号３０ ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
【0268】
配列番号３１ ヒトＣＤ３ζのアミノ酸配列
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３２ ヒトＩＬ－２β受容体エンドドメインのアミノ酸配列
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
配列番号３３ ヒトＩＬ－７α受容体エンドドメインのアミノ酸配列
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
配列番号３４ ヒトＩＬ－２１受容体エンドドメインのアミノ酸配列
SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS
配列番号３５ ヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
YRHQ
配列番号３６ ヒトＩＬ－２β受容体エンドドメイン及びヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGGGGSYRHQ
配列番号３７ ヒトＩＬ－７α受容体エンドドメイン及びヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQGGGGSYRHQ
配列番号３８ 抗ＣＤ２０ ＯＦＡ ＳｃＦｖのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
配列番号３９ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖのアミノ酸配列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号４０ 赤色蛍光タンパク質のアミノ酸配列
MASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGA*
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３２ ヒトＩＬ－２β受容体エンドドメインのアミノ酸配列
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
配列番号３３ ヒトＩＬ－７α受容体エンドドメインのアミノ酸配列
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
配列番号３４ ヒトＩＬ－２１受容体エンドドメインのアミノ酸配列
SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS
配列番号３５ ヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
YRHQ
配列番号３６ ヒトＩＬ－２β受容体エンドドメイン及びヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGGGGSYRHQ
配列番号３７ ヒトＩＬ－７α受容体エンドドメイン及びヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQGGGGSYRHQ
配列番号３８ 抗ＣＤ２０ ＯＦＡ ＳｃＦｖのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
配列番号３９ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖのアミノ酸配列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号４０ 赤色蛍光タンパク質のアミノ酸配列
MASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGA*
【0269】
配列番号４１ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９（ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲａＣ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４２ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ（Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲａＣ）
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４３ Ｎ末端改変及びシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ、Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂＣ）
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号４４ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨ
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号４５ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
配列番号４６ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKALGFIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAFHPGSGGSAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTFEDSAVYHCTRQLGPDWGQGTLVTVS
配列番号４７ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCWQGTQFPWTFGGGTKLEIK
配列番号４８ 膜貫通ドメインにおいてＮ末端改変、システイン置換及び疎水性改変を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号４９ Ｎ末端改変及びシステイン置換を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体β鎖定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号５０ 野生型ヒトＴＣＲγ鎖定常領域のアミノ酸配列：
DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４２ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ（Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲａＣ）
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４３ Ｎ末端改変及びシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ、Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂＣ）
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号４４ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨ
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号４５ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
配列番号４６ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKALGFIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAFHPGSGGSAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTFEDSAVYHCTRQLGPDWGQGTLVTVS
配列番号４７ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCWQGTQFPWTFGGGTKLEIK
配列番号４８ 膜貫通ドメインにおいてＮ末端改変、システイン置換及び疎水性改変を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号４９ Ｎ末端改変及びシステイン置換を有するエンドドメイン欠損マウスＴ細胞受容体β鎖定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号５０ 野生型ヒトＴＣＲγ鎖定常領域のアミノ酸配列：
DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
【0270】
配列番号５１ 野生型マウスＴＣＲγ鎖定常領域のアミノ酸配列：
XKRLDADISPKPTIFLPSVAETNLHKTGTYLCLLEKFFPDVIRVYWKEKDGNTILDSQEGDTLKTNDTYMKFSWLTVPERAMGKEHRCIVKHENNKGGADQEIFFPSIKKVAVSTKPTTCWQDKNDVLQLQFTITSAYYTYLLLLLKSVIYLAIISFSLLRRTSVCGNEKKS
配列番号５２ 野生型ヒトＴＣＲδ鎖定常領域のアミノ酸配列：
XSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL*
配列番号５３ 野生型マウスＴＣＲδ鎖定常領域のアミノ酸配列
XSQPPAKPSVFIMKNGTNVACLVKDFYPKEVTISLRSSKKIVEFDPAIVISPSGKYSAVKLGQYGDSNSVTCSVQHNSETVHSTDFEPYANSFNNEKLPEPENDTQISEPCYGPRVTVHTEKVNMMSLTVLGLRLLFAKTIAINFLLTVKLFF*
配列番号５４ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＨ
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号５５ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号５６ 抗ＣＤ２０ ＯＦＡ ＶＨ
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
配列番号５７ 抗ＣＤ２０ ＯＦＡ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
配列番号５８ ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSAVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSSEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI*
配列番号５９ ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０のＴＣＲα鎖
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号６０ ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０のＴＣＲβ鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSAVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSSEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
XKRLDADISPKPTIFLPSVAETNLHKTGTYLCLLEKFFPDVIRVYWKEKDGNTILDSQEGDTLKTNDTYMKFSWLTVPERAMGKEHRCIVKHENNKGGADQEIFFPSIKKVAVSTKPTTCWQDKNDVLQLQFTITSAYYTYLLLLLKSVIYLAIISFSLLRRTSVCGNEKKS
配列番号５２ 野生型ヒトＴＣＲδ鎖定常領域のアミノ酸配列：
XSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL*
配列番号５３ 野生型マウスＴＣＲδ鎖定常領域のアミノ酸配列
XSQPPAKPSVFIMKNGTNVACLVKDFYPKEVTISLRSSKKIVEFDPAIVISPSGKYSAVKLGQYGDSNSVTCSVQHNSETVHSTDFEPYANSFNNEKLPEPENDTQISEPCYGPRVTVHTEKVNMMSLTVLGLRLLFAKTIAINFLLTVKLFF*
配列番号５４ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＨ
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号５５ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号５６ 抗ＣＤ２０ ＯＦＡ ＶＨ
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
配列番号５７ 抗ＣＤ２０ ＯＦＡ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
配列番号５８ ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSAVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSSEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI*
配列番号５９ ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０のＴＣＲα鎖
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号６０ ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ａ（Ｇ４Ｓ）３ＯＸ４０のＴＣＲβ鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSAVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSSEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【配列表】
【国際調査報告】