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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-26
(54)【発明の名称】養子細胞療法に有用なポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230619BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230619BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230619BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230619BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230619BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230619BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230619BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230619BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230619BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230619BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230619BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230619BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230619BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230619BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230619BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230619BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62
C07K19/00 ZNA
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12N5/0783
A61K48/00
A61K35/12
A61P35/00
A61P31/00
A61P25/00
A61P29/00
A61P37/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022572753
(86)(22)【出願日】2021-05-26
(85)【翻訳文提出日】2023-01-24
(86)【国際出願番号】 EP2021064053
(87)【国際公開番号】W WO2021239812
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】2007842.4
(32)【優先日】2020-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522164226
【氏名又は名称】クウェル セラピューティックス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】マルティネス‐ローデラ、マーク
(72)【発明者】
【氏名】ボルンシャイン、ジーモン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4C084AA13
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZB08
4C084ZB11
4C084ZB26
4C084ZB32
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087CA12
4C087MA65
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB26
4C087ZB32
4H045AA10
4H045BA09
4H045BA41
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、式Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔを有する配列を含むポリペプチドであって、式中、Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１およびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、Ｌは、Ｒ１のＣ末端とＲ２のＮ末端とをつなぐ可動性リンカー配列である、ポリペプチドを提供する。特に、前記リンカー配列は、配列番号１に記載の配列を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない。ポリペプチドは、当該ポリペプチドを発現する細胞の排除を可能にする自殺部分として機能し、養子細胞療法に有用である。本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸、このような核酸を含む細胞、およびその治療的使用を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式の配列を含むポリペプチドであって、Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列（ｓｔａｌｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、
Ｌは、Ｒ１のＣ末端とＲ２のＮ末端とをつなぎ、かつ、配列番号１に記載の配列を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない可動性リンカー配列である、ポリペプチド。
【請求項2】
Ｌが、下記（ｉ）から（ｖ）から選択される少なくとも一つである、請求項１に記載のポリペプチド：（ｉ）長さが２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、または２１アミノ酸以下である可動性リンカー配列；
（ｉｉ）Ｇｌｙ残基、またはＧｌｙ残基とＳｅｒ残基とを、少なくとも４０％含むリンカー配列；
（ｉｉｉ）Ｓｅｒ残基および／またはＧｌｙ残基と、他のアミノ酸残基１５以下、好ましくは他のアミノ酸残基１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下とを含むリンカー配列；
（ｉｖ）アミノ酸残基の少なくとも８０％、９０％、または１００％がＳｅｒ残基、Ｇｌｙ残基、Ｔｈｒ残基、Ａｌａ残基、Ｌｙｓ残基、およびＧｌｕ残基であるアミノ酸配列を有するリンカー配列；
（ｖ）Ｐｒｏ残基を含まないアミノ酸配列を有するリンカー配列。
【請求項3】
Ｌがマーカー配列を含まない、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
リンカー配列Ｌが、Ｓｅｒ残基およびＧｌｙ残基のみからなるＧｌｙ－Ｓｅｒドメインを少なくとも１つと、他のアミノ酸残基１５以下、好ましくは他のアミノ酸残基１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下とを含む、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項5】
前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインが下記式を有する、請求項４に記載のポリペプチドであって、（Ｓ）ｑ－［（Ｇ）ｍ－（Ｓ）ｍ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｑは０または１であり、ｍは１～８の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、または好ましくは１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である、ポリペプチド。
【請求項6】
前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインが下記式を有する、請求項５に記載のポリペプチドであって、（ｉ）Ｓ－［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；
（ｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；または
（ｉｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｍは２～８（好ましくは３～４）の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、または好ましくは１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である、ポリペプチド。
【請求項7】
前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインが下記式を有する、請求項４から６のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、Ｓ－［Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ］ｎ
式中、ｎは１以上（好ましくは、１～８、または１～６、１～５、１～４、もしくは１～３）の整数である、ポリペプチド。
【請求項8】
前記リンカー配列が、下記から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド：ＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬ（配列番号３２）
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）
Ｓ（ＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＳは配列番号３１である）
（ＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＳは配列番号３１である）
Ｓ（ＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＳは配列番号３４である）
（ＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＳは配列番号３４である）
Ｓ（ＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＳは配列番号３５である）
（ＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＳは配列番号３５である）
Ｓ（ＧＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＧＳは配列番号３６である）
（ＧＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＧＳは配列番号３６である）
Ｇ6（配列番号３７）
Ｇ8（配列番号３８）
ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３９）
ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号４０）
ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４１）
ＳＧＧＧＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４２）
ＳＧＧＧＬＬＬＬＬＬＬＬＧＧＧＳ（配列番号４３）
ＳＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＳ（配列番号４４）
ＳＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＳ（配列番号４５）
ＳＧＡＬＧＧＬＡＬＡＧＬＬＬＡＧＬＧＬＧＡＡＧＳ（配列番号４６）
ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＰＡＲ（配列番号４７）
ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＰＡＲＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧ（配列番号４８）
ＧＳＳＧＳＳ（配列番号４９）
ＧＳＳＳＳＳＳ（配列番号５０）
ＧＧＳＳＳＳ（配列番号５１）
ＧＳＳＳＳＳ（配列番号５２）
ＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）。
【請求項9】
前記リツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２が、それぞれ、以下（ａ）または（ｂ）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド：（ａ）コンセンサス配列Ｘ１－Ｃ－Ｘ２－Ｘ３－（Ａ／Ｓ）－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ４－Ｃ（配列番号２）のアミノ酸配列であり、前記配列中、Ｘ１はＡもしくは存在せず、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は任意のアミノ酸である、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、もしくは、当該アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、かつリツキシマブ結合活性を保持するその変異体。
【請求項10】
前記リツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２に関する前記コンセンサス配列Ｘ１－Ｃ－Ｘ２－Ｘ３－（Ａ／Ｓ）－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ４－Ｃ（配列番号１）において、Ｘ２がＰ、Ｎ、Ｓ、Ｍ、ＷまたはＥ、Ｘ３がＹ、Ｆ、Ｗ、ＡまたはＨ、Ｘ４がＬ、Ｔ、ＭまたはＱである、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項11】
前記リツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２がそれぞれ、配列番号４～１４もしくは配列番号１５～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または、当該アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、かつリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項12】
前記ストーク配列Ｓｔが、当該ストーク配列をＲ２につなぐ任意選択のリンカー配列と、細胞外ドメインと、任意選択の膜貫通ドメインと、任意選択の細胞内ドメインと、を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項13】
前記ストーク配列Ｓｔが、当該ストーク配列をＲ２につなぐリンカー配列と、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインと、を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項14】
前記ストーク配列Ｓｔが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２から選択されたタンパク質の細胞外ストーク配列に由来する細胞外ドメインを含み、任意選択的に、（ｉ）膜貫通ドメイン、または（ｉｉ）膜貫通ドメインおよび前記タンパク質由来の細胞内ドメインを共に含み、前記細胞外ストーク配列、前記膜貫通ドメイン、および前記細胞内ドメインは、同一または異なるタンパク質由来であってもよい、請求項１２または請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項15】
前記ストーク配列Ｓｔが、細胞外ストーク配列、膜貫通ドメイン、およびＣＤ８由来の細胞内ドメインを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項16】
前記ストーク配列Ｓｔが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項17】
配列番号２７、２８、７８、もしくは７９に記載の配列、または、当該配列に対して少なくとも７５％の同一性を有し、（ｉ）リツキシマブと結合し、（ｉｉ）細胞の表面に発現すると、リツキシマブの存在下で当該細胞の死滅を誘導する配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項18】
ポリペプチド融合パートナーに、任意選択的にリンカー配列を介して連結された、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項19】
前記融合パートナーが、マーカー配列、またはキメラ受容体、好ましくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むポリペプチドである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記融合タンパク質が、前記ポリペプチドとキメラ受容体またはＴＣＲとの間に自己切断ペプチドを含む、請求項１８または１９に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１８から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項22】
請求項２１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項23】
目的の導入遺伝子をさらに含み、前記導入遺伝子が、好ましくは目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードしている、請求項２２に記載のベクター。
【請求項24】
前記目的の導入遺伝子が、抗原受容体（例えば、キメラ受容体、好ましくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体）をコードし、前記ベクターが標的細胞に導入されると、前記標的細胞が請求項１から１５のいずれかに記載のポリペプチドと前記抗原受容体とを共発現するようにした、請求項２３に記載のベクター。
【請求項25】
請求項１から１７のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項26】
前記細胞が、前記ポリペプチドおよびＰＯＩを当該細胞の表面に共発現する、請求項２５に記載の細胞。
【請求項27】
請求項２１に記載の核酸分子または請求項２２から２４のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項28】
Ｔ細胞、好ましくはＴｒｅｇ細胞である、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項29】
請求項２５から２８のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、請求項２２から２４のいずれかに記載のベクターを細胞に導入（例えば、前記ベクターで前記細胞を形質導入またはトランスフェクト）する工程を含む、方法。
【請求項30】
請求項２５から２８のいずれかに記載の細胞を排除するための方法であって、前記細胞をリツキシマブの結合特異性を有する抗体に曝露する工程を含む、方法。
【請求項31】
対象の疾患を治療するための方法であって、前記対象に請求項２５から２８のいずれかに記載の細胞を投与する工程を含む、方法。
【請求項32】
以下の工程を含む、請求項３１に記載の方法：（ｉ）細胞の試料に、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のベクターを導入する（例えば、前記ベクターで前記細胞を形質導入またはトランスフェクションする）工程；および
（ｉｉ）前記細胞を前記対象に投与する工程であり、任意選択的に、工程（ｉｉ）において、前記細胞を前記対象から単離し、前記対象へと戻す工程。
【請求項33】
養子細胞移植療法に使用するための、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項34】
癌、感染症、神経変性疾患、もしくは炎症性疾患を治療するための、または免疫抑制を誘導するための、請求項３１もしくは３２のいずれか一項に記載の方法、または請求項３３に記載の使用のための細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用なポリペプチドに関する。当該ポリペプチドは、自殺部分（ｓｕｉｃｉｄｅ ｍｏｉｅｔｙ）、すなわち、このポリペプチドを発現する細胞の排除を可能にするエピトープを含む。よって、当該ポリペプチドは、細胞に対し、当該細胞を「オフ」にする、すなわち、消失させることを可能にする安全スイッチを設ける手段を提供するものである。さらに本発明は、このようなポリペプチドをコードする核酸、このような核酸を含む細胞、ならびにこれらの治療的使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、初期にその有望性が見出されて以来、悪性疾患および感染症に対する臨床応用での使用や試験が増加しつつある。ＣＤ１９を認識するように遺伝子操作されたＴ細胞が、濾胞性リンパ腫の治療に用いられており、抗腫瘍Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された自己リンパ球を用いるＡＣＴが、転移性黒色腫の治療に用いられている。黒色腫およびＥＢＶ関連悪性腫瘍におけるＡＣＴの成功を受け、他の腫瘍の治療のためにエフェクターＴ細胞を再標的化する取り組みが盛んに行われるようになり、新たな特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるようなＴ細胞の操作が行われてきた。
【0003】
Ｂ細胞系悪性腫瘍の免疫療法のためのＣＡＲ改変型Ｔリンパ球が報告されており（Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １９：４３２－４３８）、また、神経芽腫の治療のための抗ＧＤ２ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞が報告されている（Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ （２００８） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １４：１２６４－１２７０）。成人リンパ腫におけるＣＡＲの臨床研究でも有効性を示すデータが報告されており、メラノーマ抗原を認識するネイティブＴ細胞受容体を形質導入したＴ細胞は、播種性黒色腫において劇的な寛解をもたらした。
【0004】
別の種類の免疫細胞、例えば、ＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞をはじめとするＮＫ細胞もまた、ＡＣＴに使用されているか、使用が提案されている。より最近では、ＡＣＴのための制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が開発されている。Ｔｒｅｇは、免疫抑制機能を有する。Ｔｒｅｇは、細胞障害性免疫応答を制御するように作用し、免疫寛容の維持に不可欠である。Ｔｒｅｇの抑制特性は、例えば、炎症性障害、自己免疫疾患、および移植において、免疫介在性の臓器障害の改善および／または予防のため、治療的に利用することができる。
【0005】
養子免疫療法の有効性が高くなるほど、重篤な有害事象の報告が伴うことがわかっている。操作したＴ細胞の注入後におけるサイトカインストーム等の急性の有害事象が報告されている。これに加え、慢性の有害事象が発生しており、また、別の事象も動物モデルにより予測されている。例えば、腎癌により発現される抗原である炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）にリダイレクトしたＴ細胞は、数名の患者において、胆道上皮での予期せぬＣＡＩＸの発現により、肝毒性を生じた。黒色腫に対するネイティブＴ細胞受容体移入の研究では、複数の患者において、皮膚および虹彩における標的抗原の発現により、白斑および虹彩炎が起こった。ＴＣＲの交差対形成（ＴＣＲ ｃｒｏｓｓ－ｐａｉｒｉｎｇ）に起因する移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）様症候群が、ネイティブＴＣＲ移入後のマウスで報告されている。共刺激を組み込んだいくつかのＣＡＲの養子移入後の動物モデルにおいて、リンパ増殖性障害が報告されている。最後に、ベクター挿入による突然変異誘発のリスクは常に存在する。急性毒性は投薬を慎重に行うことで対処できるが、慢性毒性は、細胞用量非依存性である可能性が高い。
【0006】
操作されたＴエフェクター細胞は、投与後何年にもわたって増殖および存続する可能性があり、また、どのような免疫療法であっても患者への投与後に有害事象が発生するリスクは常に存在することを考慮すると、毒性が生じた場合には、養子注入したＴ細胞およびその他の免疫細胞の選択的排除を可能にする安全機構を備えておくことが望ましい。
【0007】
自殺遺伝子は、形質導入細胞のインビボでの選択的排除を可能にする。２種類の自殺遺伝子、ＨＳＶ－ＴＫおよびｉＣａｓｐ９について、臨床試験が既に行われている。Ｔ細胞に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）を発現させると、ガンシクロビルに対する感受性が付与される。ＨＳＶ－ＴＫの使用は、このウイルスタンパク質が高い免疫原性を有することから、ハプロタイプ一致骨髄移植等、高度に免疫抑制された臨床状況に限定される。さらに、これにより、サイトメガロウイルス治療へのガンシクロビルの使用が不可能となる。誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）は、小分子医薬（ＡＰ２０１８７）の投与により活性化することができる。ｉＣａｓｐ９の使用は、臨床グレードのＡＰ２０１８７の利用可能性に依存する。さらに、遺伝子操作された細胞生成物に加えて実験的な小分子を使用することで、規制上の問題が生じる可能性がある。
【0008】
他の自殺遺伝子も開発中であり、特許文献１では、溶解性抗体リツキシマブによって認識される、抗原ＣＤ２０の最小エピトープに基づく構築物が報告されている。リツキシマブは、主としてＢ細胞の表面に存在するタンパク質ＣＤ２０に対する免疫治療用キメラ型モノクローナル抗体である。リツキシマブは、ＣＤ２０に結合すると細胞死を誘発するものであり、よって、ＣＤ２０を発現している細胞を標的とし死滅させるために使用し得る。リツキシマブによって認識されるエピトープを模倣したペプチド（いわゆるミモトープ）が開発されており、これらは、特許文献１において、マーカー部位としてＣＤ３４最小エピトープをさらに含む自殺－マーカー複合化構築物における自殺部分として使用されていた。
【0009】
具体的には、特許文献１は、単一のコンパクトなポリペプチド内に自殺部分とマーカー部分の両方を設けることに着目したものであり、この目的のため、特許文献１の配列番号４で表される、ＲＱＲ８と呼ばれるポリペプチドを開発した。ＲＱＲ８は、モノクローナル抗体ＱＢＥｎｄ１０によって認識される、本明細書中の配列番号１（特許文献１の配列番号２に相当）の配列を有する特定のＣＤ３４エピトープ（「Ｑ」）を挟む、２つの環状ペプチドＣＤ２０ミモトープ（「Ｒ」）を含んでいる。ＱＢＥｎｄ１０抗体は、臨床現場で細胞の単離に広く用いられているＭｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ磁気細胞選択システムに用いられているため、これは重要である。したがって、Ｑエピトープをマーカーとして含めることで、このポリペプチドを発現するように改変された細胞を、一般的に利用可能な選択システムを用いて容易に選択できるようになる。重要なことは、前記ポリペプチド中のＲエピトープおよびＱエピトープが、一般式Ｓｔ－Ｒ１－Ｓ１－Ｑ－Ｓ２－Ｒ２で表されるスペーサー配列（「Ｓ」）によって互いに分離されていることである。スペーサー配列Ｓ１およびＳ２は、Ｑと合わせた組み合わせ長さが少なくとも１０アミノ酸（前記特定の構築物ＲＱＲ８では１４アミノ酸）である必要があるが、ポリペプチドがリツキシマブの両方の抗原結合部位に同時に結合できないようにＲ１エピトープおよびＲ２エピトープ間を正しい距離に保ち、ポリペプチドが細胞死を有効に誘発できることを保証するために重要であると考察されてきた。特に、Ｒ１およびＲ２間の距離は、７６．５７Åより長くてもよいと記載されている。Ｓｔは、前記ポリペプチドが細胞上に発現すると、ＲエピトープおよびＱエピトープを細胞表面から突出させるストーク配列（ｓｔａｌｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。ＲＱＲ８では、ストーク配列はＣＤ８由来である。
【0010】
ＱＢＥｎｄ１０ ＣＤ３４マーカーシステムの使用に限定されない構築物を含む、ＡＣＴに使用するための改良型もしくは代替の自殺構築物が依然として必要とされており、本発明は、この必要性に対応しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】欧州特許第２８３６５１１（Ｂ）号明細書
【発明の概要】
【0012】
特に、本発明の開発において、本発明者らは、前記ＣＤ２０エピトープ（前記Ｒエピトープ）間の物理的距離、すなわち間隔が、特許文献１で考えられている程には決定的でも重要でもないことを見出した。特に、本発明者らは、両Ｒエピトープの同一リツキシマブ分子への結合の防止は、物理的距離（すなわち、これらエピトープを分離させる配列の長さ）のみではなく、これらを分離させる配列の可動性に着目することによって達成され得ると判断した。よって、本発明者らは、実際に、Ｒエピトープ同士が特許文献１で要求されているよりもはるかに短い配列によって分離されている機能的自殺ポリペプチドを製造し得ることを示した。さらに、Ｒエピトープ間にマーカーを含まないことにより、ポリペプチドの設計上の制約を取り除くことができ、自殺ポリペプチド構築物のＲエピトープの連結および分離に、はるかに広い範囲の異なるリンカー配列を使用することができる。このようなポリペプチドは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムの使用に限定されるポリペプチドと比べて、より広い範囲の細胞改変プロトコルおよび用途において有用性を見出し得る。特に、本発明者らは、前記２つのＲエピトープを分離させる配列の可動性を高めることによって、構築物の細胞溶解誘導能、特に、構築物のリツキシマブまたはそのバイオシミラーに対する感受性もまた高まることを発見し、また、本発明は、高い細胞枯渇能を有する改良型の構築物の開発をさらに包含する。具体的には、リツキシマブ感受性が向上した構築物を使用することで、副作用が生じた場合に、患者へのリツキシマブの必要投与量を低減できる可能性がある。
【0013】
したがって、第１の態様において、本発明は、下記式の配列を含むポリペプチドを提供する。
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、Ｒ１のＣ末端とＲ２のＮ末端とをつなぎ、かつ、配列番号１に記載の配列を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない可動性リンカー配列である。
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、Ｒ１のＣ末端とＲ２のＮ末端とをつなぎ、かつ、配列番号１に記載の配列を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない可動性リンカー配列である。
【0014】
より具体的には、Ｌは、以下から選択してもよい。
（ｉ）長さが２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、または２１アミノ酸以下である可動性リンカー配列；および／または
（ｉｉ）Ｇｌｙ残基、またはＧｌｙ残基とＳｅｒ残基とを、少なくとも４０％含むリンカー配列；および／または
（ｉｉｉ）Ｓｅｒ残基および／またはＧｌｙ残基と、他のアミノ酸残基１５以下、好ましくは他のアミノ酸残基１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下とを含むリンカー配列；および／または
（ｉｖ）アミノ酸残基の少なくとも８０％、９０％、または１００％がＳｅｒ残基、Ｇｌｙ残基、Ｔｈｒ残基、Ａｌａ残基、Ｌｙｓ残基、およびＧｌｕ残基であるアミノ酸配列を有するリンカー配列；および／または
（ｖ）Ｐｒｏ残基を含まないアミノ酸配列を有するリンカー配列。
（ｉ）長さが２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、または２１アミノ酸以下である可動性リンカー配列；および／または
（ｉｉ）Ｇｌｙ残基、またはＧｌｙ残基とＳｅｒ残基とを、少なくとも４０％含むリンカー配列；および／または
（ｉｉｉ）Ｓｅｒ残基および／またはＧｌｙ残基と、他のアミノ酸残基１５以下、好ましくは他のアミノ酸残基１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下とを含むリンカー配列；および／または
（ｉｖ）アミノ酸残基の少なくとも８０％、９０％、または１００％がＳｅｒ残基、Ｇｌｙ残基、Ｔｈｒ残基、Ａｌａ残基、Ｌｙｓ残基、およびＧｌｕ残基であるアミノ酸配列を有するリンカー配列；および／または
（ｖ）Ｐｒｏ残基を含まないアミノ酸配列を有するリンカー配列。
【0015】
したがって、代替的な定義では、本発明のこの態様は、下記式の配列を含むポリペプチドを提供するものと考えることができる。
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、Ｒ１のＣ末端とＲ２のＮ末端とをつなぐ可動性リンカー配列であり、Ｌは、以下から選択される。
（ｉ）配列番号１に記載の配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない可動性リンカー；および／または
（ｉ）長さが２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、または２１アミノ酸以下である可動性リンカー配列；および／または
（ｉｉ）Ｇｌｙ残基、またはＧｌｙ残基とＳｅｒ残基とを、少なくとも４０％含むリンカー配列；および／または
（ｉｉｉ）Ｓｅｒ残基および／またはＧｌｙ残基と、他のアミノ酸残基１５以下、好ましくは他のアミノ酸残基１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下とを含むリンカー配列；および／または
（ｉｖ）アミノ酸残基の少なくとも８０％、９０％、または１００％がＳｅｒ残基、Ｇｌｙ残基、Ｔｈｒ残基、Ａｌａ残基、Ｌｙｓ残基、およびＧｌｕ残基であるアミノ酸配列を有するリンカー配列；および／または
（ｖ）Ｐｒｏ残基を含まないアミノ酸配列を有するリンカー配列。
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、Ｒ１のＣ末端とＲ２のＮ末端とをつなぐ可動性リンカー配列であり、Ｌは、以下から選択される。
（ｉ）配列番号１に記載の配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない可動性リンカー；および／または
（ｉ）長さが２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、または２１アミノ酸以下である可動性リンカー配列；および／または
（ｉｉ）Ｇｌｙ残基、またはＧｌｙ残基とＳｅｒ残基とを、少なくとも４０％含むリンカー配列；および／または
（ｉｉｉ）Ｓｅｒ残基および／またはＧｌｙ残基と、他のアミノ酸残基１５以下、好ましくは他のアミノ酸残基１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下とを含むリンカー配列；および／または
（ｉｖ）アミノ酸残基の少なくとも８０％、９０％、または１００％がＳｅｒ残基、Ｇｌｙ残基、Ｔｈｒ残基、Ａｌａ残基、Ｌｙｓ残基、およびＧｌｕ残基であるアミノ酸配列を有するリンカー配列；および／または
（ｖ）Ｐｒｏ残基を含まないアミノ酸配列を有するリンカー配列。
【0016】
より具体的には、本発明のポリペプチドは、式Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔを有していてもよい。
【0017】
ポリペプチドは、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする遺伝子等の治療用導入遺伝子と共発現させてもよい。
【0018】
ある実施形態では、リンカーＬはマーカーを含まない。しかしながら、これは、ポリペプチドがマーカーを含むことを除外するものではない。ある実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ内以外にマーカーを含んでもよい。別の実施形態では、ポリペプチドはマーカーを含まない。別の実施形態では、ポリペプチドは、マーカーと共発現させてもよい。
【0019】
前記ポリペプチドは、配列番号２７として示した配列を含むか、または配列番号２７として示した配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ、（ｉ）リツキシマブに結合し、（ｉｉ）細胞の表面に発現した場合にリツキシマブの存在下で当該細胞の死滅を誘導する、その変異体を含んでもよい。
【0020】
第２の態様において、本発明は、本明細書中に定義する本発明のポリペプチドとポリペプチド融合パートナーとを含む融合タンパク質、例えば、ポリペプチド融合パートナーに連結された、本明細書中に定義する本発明のポリペプチド、任意選択的にリンカー配列を介してポリペプチド融合パートナーに連結された、本明細書中に定義する本発明のポリペプチドを提供する。融合パートナーは、目的のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＰＯＩ）であってもよい。
【0021】
ＰＯＩは、抗原受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等のキメラ受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはマーカーであってもよい。
【0022】
融合タンパク質は、ポリペプチドと融合パートナーとの間、例えば、ポリペプチドと目的のタンパク質との間に、自己切断ペプチドを含んでもよい。
【0023】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチド融合パートナー内、例えば、ＰＯＩ内に含まれてもよい。言い換えると、ポリペプチドは、融合パートナーの内部で融合、または連結されていてもよい。この態様では、本発明のポリペプチドは、例えば、ＣＡＲ内、例えば、ＣＡＲの細胞外ドメイン内に含まれてもよい。したがって、ＣＡＲは、抗原標的部分、例えば、ｓｃＦｖおよび本発明のポリペプチドを含む、細胞外ドメインを含んでもよい。
【0024】
第３の態様において、本発明は、本明細書中で定義する本発明に係るポリペプチドまたは融合タンパク質をコードすることが可能なヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【0025】
第４の態様において、本発明は、本明細書中で定義する本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。
【0026】
ベクターはまた、別のコード配列またはその他の目的ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）をさらに含んでもよい。例えば、ベクターは、目的の導入遺伝子を表すヌクレオチド配列を含んでいてもよく、当該導入遺伝子は、一実施形態において、目的のタンパク質、例えば、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、またはマーカーをコードし得る。
【0027】
第５の態様において、本発明は、本明細書中で定義する本発明のポリペプチドを発現する細胞を提供する。
【0028】
また、本明細書中で定義される核酸分子またはベクターを含む細胞も提供される。
【0029】
前記細胞は、ポリペプチドおよびＰＯＩを細胞表面に共発現し得る。
【0030】
前記細胞は、免疫細胞、または、例えばｉＰＳＣのような多能性幹細胞（ＰＳＣ）等の免疫細胞前駆体、特に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、または骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、例えばＴｒｅｇ細胞であってもよく、前駆体に由来するこのような細胞、ならびに初代細胞および細胞株が含まれる。
【0031】
第６の態様において、本発明は、本発明の第５の態様の細胞を作製する方法であって、本発明の第４の態様のベクターを細胞に導入（例えば、形質導入またはトランスフェクト）する工程を含む方法を提供する。
【0032】
第７の態様において、本発明は、本発明の第５の態様の細胞を排除する方法であって、リツキシマブの結合特異性を有する抗体に細胞を曝露する工程を含む方法を提供する。一態様において、前記方法は、インビトロ法であってもよい。
【0033】
代替的な見方によれば、本発明のこの態様は、本明細書中で定義する本発明の細胞が投与された対象の治療において、当該細胞を排除するために使用する、リツキシマブの結合特異性を有する抗体を含んでもよい。
【0034】
さらにこの態様では、本発明は、（ａ）本明細書中で定義する本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または細胞と、（ｂ）リツキシマブの結合特異性を有する抗体と、を含む、キットまたは組み合わせ製品を提供する。前記キットまたは製品は、ＡＣＴに使用するためのものであってもよい。特に、前記キットまたは製品は、前記細胞を用いたＡＣＴによる対象の治療、あるいは、本発明の細胞の使用のための製造、ならびに、その後に行われる対象からの当該細胞の排除に使用するものであってもよい。抗体は、細胞の投与後、例えば一定期間後に対象に投与してもよいし、あるいは、対象が細胞療法の望ましくないまたは有害な症状または効果を示した場合に、対象に投与してもよい。
【0035】
ある実施形態では、抗体はリツキシマブであってもよい。
【0036】
第８の態様では、本発明は、対象の疾患を治療する方法であって、本発明の第５の態様の細胞を対象に投与する工程を含む方法を提供する。前記対象は、治療を必要としている対象であってもよく、前記細胞を、その治療に有効な量投与すればよい。
【0037】
代替的な定義では、この態様は、ＡＣＴによって対象を治療する方法、または対象のＡＣＴの方法に関するものであってもよい。
前記方法は、以下の工程を含んでもよい：
（ｉ）細胞の試料（例えば、対象から単離されるか、またはドナーから得られた細胞の試料）に、本発明の第４の態様のベクターを導入する（例えば、前記ベクターで前記細胞を形質導入またはトランスフェクトする）工程、および
（ｉｉ）前記ベクターを含む前記細胞を前記対象に投与する（例えば、自家細胞の場合、前記細胞を前記対象に戻す）工程。
前記方法は、以下の工程を含んでもよい：
（ｉ）細胞の試料（例えば、対象から単離されるか、またはドナーから得られた細胞の試料）に、本発明の第４の態様のベクターを導入する（例えば、前記ベクターで前記細胞を形質導入またはトランスフェクトする）工程、および
（ｉｉ）前記ベクターを含む前記細胞を前記対象に投与する（例えば、自家細胞の場合、前記細胞を前記対象に戻す）工程。
【0038】
前記方法は、前記対象にリツキシマブの結合特異性を有する抗体を投与する工程をさらに含んでもよい。
【0039】
第９の態様では、本発明は、治療に使用するための、本発明の第５の態様の細胞を提供する。
【0040】
第１０の態様では、本発明は、養子細胞移入による治療に使用するための、本発明の第５の態様の細胞を提供する。
【0041】
前記方法または前記使用は、癌、感染症、もしく神経変性疾患の治療、または免疫抑制のためのものであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】リツキシマブ安全スイッチの設計を示す図である（Ａ）。リツキシマブをベースとする２つのミモトープを、ＣＤ８ストーク配列に融合した。２つのリツキシマブミモトープを、異なるリンカー配列で離間した（Ｂ）。
【図2】異なるリツキシマブ安全スイッチを、レンチウイルスベクターからｅＧＦＰと共発現させた。ここで、図中に示す構築物をジャーカット細胞に形質導入し、Ａ）ｅＧＦＰ発現およびＢ）安全スイッチの発現を、フローサイトメトリーにより評価した。
【図3】異なる安全スイッチを安定的に形質導入した細胞を培養し、ｉ）幼若ウサギ補体、ｉｉ）幼若ウサギ補体およびリツキシマブ、ｉｉｉ）ＲＰＭＩ培地のみの存在下でこれらを培養することにより、補体依存性の死滅を評価した。４時間後、フローサイトメトリーにより死滅のパーセンテージを評価した。
【図4】異なるリツキシマブ安全スイッチ（ＲＱＲ８、ＲＲ８スモール（１×ＳＧＧＧＧＳ）、ＲＲ８ラージ（３×ＳＧＧＧＧＳ）、およびモック）を、レンチウイルスベクターからｅＧＦＰと共発現させた。ここで、図中に示す構築物でジャーカット細胞を形質導入し、ｅＧＦＰ発現および安全スイッチの発現を、フローサイトメトリーにより評価した。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示している。
【図5A】安定形質導入細胞およびモック形質導入細胞における安全スイッチＲＱＲ８、ＲＲ８スモール（１×ＳＧＧＧＧＳ）、およびＲＲ８ラージ（３×ＳＧＧＧＧＳ）の感度を、これらの細胞を、ｉ）幼若ウサギ補体および１００μｇ／ｍｌリツキシマブ、ｉｉ）幼若ウサギ補体および５μｇ／ｍｌリツキシマブ、ｉｉｉ）幼若ウサギ補体および２．５μｇ／ｍｌリツキシマブ、ｉｖ）幼若ウサギ補体および１．２５μｇ／ｍｌリツキシマブ、ｖ）幼若ウサギ補体および０．６２５μｇ／ｍｌリツキシマブ、ｖｉ）幼若ウサギ補体、およびｖｉｉ）ＲＰＭＩ培地のみの存在下でインキュベートして調べた。インキュベート後、生存率のパーセンテージをＦＡＣＳにより分析した。図５Ａは、ＣＤＣアッセイにおいて、生存している形質導入細胞のパーセンテージを示す。
【0043】
［詳細な説明］
本発明は、細胞の表面に発現されると、自殺構築物として使用し得るポリペプチドを提供する。これは、安全機構、すなわち安全スイッチとして有用であり、かかる安全機構とは、必要が生じた場合、あるいは、実際、より一般的には、希望または必要に応じて（例えば、細胞の治療効果が発揮されるか、もしくは治療効果が切れた後、例えば、治療用導入遺伝子が発現された後）、投与された細胞の排除を可能にするものである。
本発明は、細胞の表面に発現されると、自殺構築物として使用し得るポリペプチドを提供する。これは、安全機構、すなわち安全スイッチとして有用であり、かかる安全機構とは、必要が生じた場合、あるいは、実際、より一般的には、希望または必要に応じて（例えば、細胞の治療効果が発揮されるか、もしくは治療効果が切れた後、例えば、治療用導入遺伝子が発現された後）、投与された細胞の排除を可能にするものである。
【0044】
前記ポリペプチドは、自殺部分を含む。自殺部分は、細胞死を引き起こす誘導能を有する。自殺部分の例としては、自殺遺伝子によってコードされる自殺タンパク質が挙げられるが、前記自殺遺伝子は、所望の導入遺伝子を発現させるためのベクターに含まれていてもよく、発現されると、細胞を排除させて前記導入遺伝子の発現をオフにすることができる。
【0045】
このポリペプチドでは、自殺部分は、抗体リツキシマブによって認識されるＣＤ２０のエピトープに基づく最小エピトープを含む。より詳細には、前記ポリペプチドは、可動性リンカーＬによって離間された２つのＣＤ２０エピトープＲ１およびＲ２を含む。
【0046】
この配列を含むポリペプチドを発現する細胞は、抗体リツキシマブ、もしくはリツキシマブの結合特異性を有する抗体を用いて、選択的に死滅させることができる。前記自殺ポリペプチドは、例えば、そのコード配列のレトロウイルスによる形質導入後に、細胞表面に安定的に発現される。発現したポリペプチドがリツキシマブもしくは同じ結合特異性を有する抗体に曝露されるか、または接触すると、細胞死が起こる。
【0047】
レトロウイルス形質導入は、特に治療目的で、哺乳動物細胞に核酸を導入する一般的な方法である。しかしながら、レトロウイルスベクターにはパッケージングの限界があり、一般的には、導入する核酸のサイズをできるだけ小さく保つことが望まれる。別々のベクターを使用して自殺遺伝子と所望の導入遺伝子とを細胞に導入してもよいが、導入遺伝子と自殺遺伝子との両方を同一のベクターで導入することが望ましい、または便利な場合がある。２つのＲエピトープをつなぐ可動性リンカーを含むポリペプチドを提供することにより、ポリペプチドの長さを変化させることができ、短いが可動性を有するリンカーを提供することができる。これにより、ポリペプチドと共発現させる導入遺伝子のサイズの許容範囲を広げることができる。
【0048】
一態様によれば、または一実施形態では、本発明のポリペプチドのリンカー配列Ｌは、配列番号１として示したアミノ酸配列を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない。代替的な定義では、本発明のポリペプチドのリンカー配列Ｌは、配列番号１として示したアミノ酸配列またはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない。他の実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１として示したアミノ酸配列またはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない。
【0049】
配列番号１は、次の１６アミノ酸配列である：ＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳ。
抗体ＱＢＥｎｄ１０は、Ａｂｃａｍ社、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、およびＢｉｏ－Ｒａｄ社を含む、様々な供給元から入手可能である。抗体の詳細は、欧州特許出願公開第３２４３８３８（Ａ１）号明細書およびＣｈｉａ－Ｙｕ Ｆａｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｐ． ２０１７ Ｍａｒ； ９： ５１－６０に提供されている。
抗体ＱＢＥｎｄ１０は、Ａｂｃａｍ社、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、およびＢｉｏ－Ｒａｄ社を含む、様々な供給元から入手可能である。抗体の詳細は、欧州特許出願公開第３２４３８３８（Ａ１）号明細書およびＣｈｉａ－Ｙｕ Ｆａｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｐ． ２０１７ Ｍａｒ； ９： ５１－６０に提供されている。
【0050】
さらに、ある実施形態では、前記ポリペプチド、またはそのリンカー配列Ｌは、ＣＤ３４由来のエピトープを備えていないか、または含まない。別の実施形態では、前記ポリペプチド、またはそのリンカー配列Ｌは、最小ＣＤ３４エピトープを備えていないか、または含まない。
【0051】
変異型ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープは、配列番号１の配列に対する配列の改変を、改変された配列が少なくとも８０％の配列同一性を保持することを条件として含み得る。エピトープのＱＢＥｎｄ１０結合活性が保持される限り、意図的なアミノ酸の置換を、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行ってもよい。例えば、負の電荷を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正の電荷を有するアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンが挙げられ、親水性値が類似する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としてはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。一般的には、保存的置換を行い得る。ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープは、例えば、配列番号１として示した配列と比較して、アミノ酸変異を５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個含んでもよい。ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープは、配列番号１として示した配列、またはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体からなってもよい。
【0052】
本発明のポリペプチドのリンカー配列は、可動性リンカー配列である。可動性リンカーは、当該技術分野で周知であり、記載されているリンカー配列のカテゴリーに属する。リンカー配列は、タンパク質同士もしくはタンパク質ドメイン同士を連結または結合し、例えば、融合タンパク質もしくはキメラタンパク質、または多機能タンパク質もしくは多機能ポリペプチドを作るために使用し得る配列として一般的に知られている。リンカーは異なる特徴を備えることができ、例えば、可動性、剛性（ｒｉｇｉｄ）、または切断可能とし得る。タンパク質リンカーは、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６５， １３５７－１３６９において考察されており、当該文献では、可動性リンカーのカテゴリーを、剛性リンカーおよび切断可能リンカーのカテゴリーと比較している。可動性リンカーは、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ２７（１０）， ３２５－３３０、ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５６，６５６５－６５７４、およびＣｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２， １５３－１６７にも記載されている。
【0053】
可動性リンカーとは、連結されたドメインまたは構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）間の動きをある程度許容するリンカーを指す。可動性リンカーは、一般的には、小さな非極性アミノ酸残基（例えば、Ｇｌｙ）または小さな極性アミノ酸残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）で構成されている。アミノ酸のサイズが小さいことにより可動性がもたらされ、つながれた部分（ドメインまたは構成要素）が移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）となる。極性アミノ酸を組み込むことで、水分子と水素結合を形成し、これにより、水性環境下でのリンカーの安定性を維持することができる。
【0054】
最も一般的に使用されている可動性リンカーは、主にＳｅｒ残基およびＧｌｙ残基から構成される配列（いわゆる「ＧＳリンカー」）を有する。しかしながら、多くの他の可動性リンカーも記載されており（例えば、前述のＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，．２０１３参照）、これらのリンカーは、追加のアミノ酸、例えば、溶解性を改善し得るアミノ酸、Ｔｈｒおよび／もしくはＡｌａ、ならびに／または、Ｌｙｓおよび／もしくはＧｌｕ等を含み得る。当該技術分野で公知の報告されている任意の可動性リンカーを使用し得る。
【0055】
リンカーの長さは重要ではないが、いくつかの実施形態では、より短いリンカー配列を有することが望ましい場合がある。例えば、リンカー配列の長さは、２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、または２１アミノ酸以下であってもよい。
【0056】
他の実施形態では、より長いリンカー配列が望まれる場合があり、例えば、ＧＳドメインの複数のリピートから構成されるか、またはＧＳドメインの複数のリピートを含んでもよい。
【0057】
いくつかの実施形態では、リンカーは、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、または６アミノ酸のいずれか１つから、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、または２１アミノ酸のいずれか１つまでの長さであってもよい。他の実施形態では、リンカーは、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、または６アミノ酸のいずれか１つから、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、または１５アミノ酸のいずれか１つまでの長さであってもよい。他の実施形態では、前記長さはこれらの範囲の中間、例えば、６～２１、６～２０、７～２０、８～２０、９～２０、１０～２０、８～１８、９～１８、１０～１８、９～１７、１０～１７、９～１６、１０～１６等であってもよい。したがって、先に列挙した整数のいずれかからなる範囲内であってもよい。
【0058】
ＧＳリンカー、より詳細には、リンカーにおけるＧＳ（「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」）ドメインの使用により、ＧＳドメインリピートの数を変更することによってリンカーの長さを容易に変更することができ、よって、このようなリンカーは、本発明に係るリンカーの好ましいクラスの一つである。しかしながら、可動性リンカーは、「ＧＳ」リピートに基づくものに限定されず、リンカー配列全体に分散したＳｅｒ残基およびＧｌｙ残基を含む他のリンカーが、前述のＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．をはじめとする文献に報告されている。
【0059】
したがって、一実施形態において、リンカー配列は、Ｇｌｙ残基、またはＧｌｙ残基とＳｅｒ残基とを、少なくとも４０％含んでいてもよい。
【0060】
別の実施形態では、リンカー配列は、Ｓｅｒ残基および／またはＧｌｙ残基と、１５以下の他のアミノ酸残基とを含んでもよく、好ましくは他のアミノ酸残基を１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下含んでもよい。「他の」アミノ酸残基とは、ＳｅｒまたはＧｌｙではない任意のアミノ酸であってよいことが理解されるであろう。
【0061】
リンカー中のＰｒｏ残基は、剛性を付与する傾向があるため、一実施形態では、リンカー配列は、Ｐｒｏ残基を含んでいない。ただし、これは絶対的なものではなく、配列構成によっては、可動性リンカーがＰｒｏ残基を１以上含む場合がある。
【0062】
好ましい一実施形態では、リンカー配列は、Ｓｅｒ残基およびＧｌｙ残基のみからなるＧｌｙ－Ｓｅｒドメインを少なくとも１つ含む。このような実施形態では、前記リンカーは、他のアミノ酸残基を１５以下含んでもよく、好ましくは他のアミノ酸残基を１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下含んでもよい。
【0063】
Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインは、下記式を有してもよく、
（Ｓ）ｑ－［（Ｇ）ｍ－（Ｓ）ｍ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｑは０または１であり、ｍは１～８の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、特に１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である。
（Ｓ）ｑ－［（Ｇ）ｍ－（Ｓ）ｍ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｑは０または１であり、ｍは１～８の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、特に１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である。
【0064】
より詳細には、Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインは、下記式を有してもよく：
（ｉ）Ｓ－［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；
（ｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；または
（ｉｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｍは２～８（例えば、３～４）の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、特に１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である。
（ｉ）Ｓ－［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；
（ｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；または
（ｉｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｍは２～８（例えば、３～４）の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、特に１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である。
【0065】
代表的な例では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインは、下記式を有してもよく、
Ｓ－［Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ］ｎ
式中、ｎは１以上（好ましくは、１～８、または１～６、１～５、１～４、もしくは１～３）の整数である。上記式中、配列ＧＧＧＧＳは、配列番号３１である。
Ｓ－［Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ］ｎ
式中、ｎは１以上（好ましくは、１～８、または１～６、１～５、１～４、もしくは１～３）の整数である。上記式中、配列ＧＧＧＧＳは、配列番号３１である。
【0066】
リンカー配列は、上記で説明または定義したように、１つまたは複数のＧｌｙ－Ｓｅｒドメインのみで構成されてもよく、または、１つまたは複数のＧｌｙ－Ｓｅｒドメインからなってもよい。しかしながら、上述の通り、別の実施形態では、リンカー配列は、１つ以上のＧｌｙ－Ｓｅｒドメインと、追加のアミノ酸とを含んでもよい。追加のアミノ酸は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインの一端または両端、あるいは一続きのＧｌｙ－Ｓｅｒドメインリピートの一端または両端に存在してもよい。よって、追加のアミノ酸（他のアミノ酸であってもよい）は、リンカー配列の一端または両端に存在してもよく、例えば、これらは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメイン（１または複数）を挟んでいてもよい。他の実施形態では、追加のアミノ酸は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメイン間に存在してもよい。例えば、２つのＧｌｙ－Ｓｅｒドメインは、リンカー配列中の一続きの他のアミノ酸を挟んでいてもよい。さらに、上述したように、他のリンカーにおいて、ＧＳドメインが反復して存在している必要はなく、Ｇ残基および／もしくＳ残基、またはＧＳ等の短いドメインは、例えば、下記配列番号４１に示すように、単に長さまたは配列に沿って分散していてもよい。
【0067】
代表的な例示的リンカー配列を以下に示す。
ＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬ（配列番号３２）
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）
Ｓ（ＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＳは配列番号３１である）
（ＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＳは配列番号３１である）
Ｓ（ＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＳは配列番号３４である）
（ＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＳは配列番号３４である）
Ｓ（ＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＳは配列番号３５である）
（ＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＳは配列番号３５である）
Ｓ（ＧＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＧＳは配列番号３６である）
（ＧＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＧＳは配列番号３６である）
Ｇ6（配列番号３７）
Ｇ8（配列番号３８）
ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３９）
ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号４０）
ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４１）
ＳＧＧＧＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４２）
ＳＧＧＧＬＬＬＬＬＬＬＬＧＧＧＳ（配列番号４３）
ＳＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＳ（配列番号４４）
ＳＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＳ（配列番号４５）
ＳＧＡＬＧＧＬＡＬＡＧＬＬＬＡＧＬＧＬＧＡＡＧＳ（配列番号４６）
ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＰＡＲ（配列番号４７）
ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＰＡＲＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧ（配列番号４８）
ＧＳＳＧＳＳ（配列番号４９）
ＧＳＳＳＳＳＳ（配列番号５０）
ＧＧＳＳＳＳ（配列番号５１）
ＧＳＳＳＳＳ（配列番号５２）
ＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）
ＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬ（配列番号３２）
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）
Ｓ（ＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＳは配列番号３１である）
（ＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＳは配列番号３１である）
Ｓ（ＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＳは配列番号３４である）
（ＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＳは配列番号３４である）
Ｓ（ＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＳは配列番号３５である）
（ＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＳは配列番号３５である）
Ｓ（ＧＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＧＳは配列番号３６である）
（ＧＧＧＧＧＧＳ）1-5（ここで、ＧＧＧＧＧＧＳは配列番号３６である）
Ｇ6（配列番号３７）
Ｇ8（配列番号３８）
ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３９）
ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号４０）
ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４１）
ＳＧＧＧＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４２）
ＳＧＧＧＬＬＬＬＬＬＬＬＧＧＧＳ（配列番号４３）
ＳＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＳ（配列番号４４）
ＳＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＳ（配列番号４５）
ＳＧＡＬＧＧＬＡＬＡＧＬＬＬＡＧＬＧＬＧＡＡＧＳ（配列番号４６）
ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＰＡＲ（配列番号４７）
ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＰＡＲＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧ（配列番号４８）
ＧＳＳＧＳＳ（配列番号４９）
ＧＳＳＳＳＳＳ（配列番号５０）
ＧＧＳＳＳＳ（配列番号５１）
ＧＳＳＳＳＳ（配列番号５２）
ＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）
【0068】
当該ポリペプチドでは、リンカーの機能はＲ１とＲ２をつなぐことである。前記リンカーは、Ｒ１とＲ２とを直接つなぐ、すなわち、Ｒ１のＣ末端をＲ２のＮ末端へとつなぐ。前記ポリペプチドは、Ｒ１とＲ２との間に、リンカー配列Ｌ以外の他の構成要素または配列を含まない。前記ポリペプチドは、細胞表面に発現されるものであり、かつ、Ｒ１がＲ２につなげられてＲ１とＲ２との両方が細胞表面に発現されるようになっているため、リンカーＬは切断可能リンカーでないことがわかるであろう。
【0069】
ある実施形態では、前記リンカーは他の機能を果たさないか、または他の機能的な構成要素または配列を含まない。例えば、リンカー配列は、生物学的活性を有さないか、あるいは、生物学的活性を有するいかなる配列も含まない。ある実施形態では、前記リンカーはマーカー配列を含まない。
【0070】
本発明のポリペプチドのリンカー配列は、先に定義した通り、可動性の配列であるが、本開示には、可動性ではないリンカーおよび／または先に示した定義および要件を満たさないリンカーを含む、他のポリペプチドも含まれる。
【0071】
したがって、他の態様において、ポリペプチドは、下記式のものとして提供され、
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、Ｒ１のＣ末端をＲ２のＮ末端につなげ、かつ、（ｉ）配列番号１に記載の配列を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まず、および／または（ｉｉ）長さが２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、もしくは２１アミノ酸以下であるリンカー配列である。
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが標的細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、Ｒ１のＣ末端をＲ２のＮ末端につなげ、かつ、（ｉ）配列番号１に記載の配列を含むＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まず、および／または（ｉｉ）長さが２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、もしくは２１アミノ酸以下であるリンカー配列である。
【0072】
Ｒ１、Ｒ２、およびＳｔは、本明細書の他の箇所に定義および記載されている通りであってよい。リンカーＬは、上記（ｉ）および（ｉｉ）の制約（ならびに、リンカー配列が切断可能でないこと）を満たすことを条件として、任意のリンカー配列、すなわち、任意のアミノ酸配列を有するリンカー配列であってよい。
【0073】
このようなリンカー配列の例としては、以下が挙げられる。
ＳＧＧＧＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡ（配列番号６４）
ＳＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＡ（配列番号６５）
ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６６）
ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＳＧＧＧＳ（配列番号６７）
ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６８）
ＧＧＬＫＮＫＡＱＱＡＡＦＹＩＧＧ（配列番号６９）
ＬＣＫＮＫＡＱＱＡＡＦＹＣＩ（配列番号７０）
ＫＣＬＮＤＡＱＡＡＡＥＥＣＩ（配列番号７１）
ＧＧＧＬＫＮＫＡＱＱＡＡＦＹＩＧＧＧ（配列番号７２）
ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＥＡＡＡＫＥ（配列番号７３）
ＧＧＧＳＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＧＧＧＳ（配列番号７４）
ＳＧＧＧＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡ（配列番号６４）
ＳＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＡ（配列番号６５）
ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６６）
ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＳＧＧＧＳ（配列番号６７）
ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６８）
ＧＧＬＫＮＫＡＱＱＡＡＦＹＩＧＧ（配列番号６９）
ＬＣＫＮＫＡＱＱＡＡＦＹＣＩ（配列番号７０）
ＫＣＬＮＤＡＱＡＡＡＥＥＣＩ（配列番号７１）
ＧＧＧＬＫＮＫＡＱＱＡＡＦＹＩＧＧＧ（配列番号７２）
ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＥＡＡＡＫＥ（配列番号７３）
ＧＧＧＳＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＧＧＧＳ（配列番号７４）
【0074】
リツキシマブ結合エピトープとは、抗体リツキシマブに結合するアミノ酸配列、またはリツキシマブの結合特異性を有する抗体であり、言い換えれば、リツキシマブが結合するものと同じ天然エピトープに結合する抗体である。リツキシマブは、ヒトＣＤ２０に結合するキメラ型マウス／ヒトモノクローナルκＩｇＧ１抗体である。ＣＤ２０のリツキシマブ結合エピトープの配列は、ＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣ（配列番号２９）である。
【0075】
リツキシマブは、欧州特許第０６６９８３６号明細書に最初に記載され（ハイブリドーマ）、重鎖配列および軽鎖配列が欧州特許第２０００１４９号明細書に示されている（次の文献も参照されたい：重鎖配列および軽鎖配列を図１中に示すＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ， ２０１３， １３８， ３０５８、およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ－ＣＡＳ １７４２２－３１－７， ｃａｔｏｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ： Ｂ００８４－０６１０４３， ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。さらに、米国特許出願第２００９／０２８５７９５（Ａ１）号明細書、欧州特許出願第１６３３３９８（Ａ２）号明細書、および国際公開第２００５／０００８９８号パンフレットを参照してもよい。リツキシマブおよびそのバイオシミラーは、世界中の様々な商業的供給源から広く入手可能である。
【0076】
したがって、Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブに結合する任意のペプチドであってもよく、または言い換えれば、リツキシマブに結合可能な任意のペプチドであってもよい。ＣＤ２０に関連して述べた前記天然エピトープに加え、リツキシマブに結合する、または、より詳細には前記天然エピトープを模倣する、様々なペプチドが公知であり、報告されている。したがって、Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブエピトープのミモトープであってもよい。
【0077】
このようなミモトープは、例えば、Ｐｅｒｏｓａら（２００７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：７９６７－７９７４）に記載されており、当該文献には、システイン拘束７塩基長環状ペプチド（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ７－ｍｅｒ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の系統が開示されており、これらはリツキシマブによって認識される抗原モチーフを有するが、モチーフの周囲のアミノ酸が異なっている。Ｐｅｒｏｓａは、下記表１に示すように、配列番号１５～２５の１１個のペプチドを記載している。表中、モチーフを挟むアミノ酸を小文字で示し、モチーフを大文字で示した。最初のアミノ酸「ａ」はペプチドから除去してもよく、機能的エピトープ（またはミモトープ）を保持すればよいと判断されている。最初の「ａ」を欠いた配列番号４から１４のペプチドも、表１に示されている。
【表1】
【0078】
本発明に係るＲ１および／またはＲ２として使用し得るリツキシマブエピトープの円形（または環状）ミモトープは、下記配列番号２のコンセンサスアミノ酸配列で表すことができ、
Ｘ１－Ｃ－Ｘ２－Ｘ３－（Ａ／Ｓ）－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ４－Ｃ
ここで、Ｘ１はＡもしくは存在せず、ならびにＸ２、Ｘ３、およびＸ４は任意のアミノ酸である。
Ｘ１－Ｃ－Ｘ２－Ｘ３－（Ａ／Ｓ）－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ４－Ｃ
ここで、Ｘ１はＡもしくは存在せず、ならびにＸ２、Ｘ３、およびＸ４は任意のアミノ酸である。
【0079】
より詳細には、Ｘ２は、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｍ、Ｗ、またはＥから選択されるアミノ酸であってもよく、Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ａ、またはＨから選択されるアミノ酸であってもよく、Ｘ４は、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＱから選択されるアミノ酸であってもよい。
【0080】
リツキシマブエピトープの非円形（または非環状）ペプチドミモトープも開発されている。Ｌｉら（２００６ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３９：１３６－４３）にも、配列ＱＤＫＬＴＱＷＰＫＷＬＥ（配列番号３）のペプチドを含む、リツキシマブのミモトープが記載されている。
【0081】
前記ポリペプチドは、配列番号２、３、もしくは４～２５からなる群より選択されるアミノ酸配列をそれぞれ独立して含むリツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含んでもよい。
【0082】
２つのエピトープＲ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよい。一実施形態では、これらは同じである。別の実施形態では、これらは異なっている。
【0083】
ある実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、配列番号２～２５からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体から本質的になるか、あるいはこのようなアミノ酸配列または変異体からなる。
【0084】
代表的な実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号５もしくは１６として示すアミノ酸配列、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含むか、本質的にこのようなアミノ酸配列または変異体からなるか、あるいはこのようなアミノ酸配列または変異体からなるリツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２を含んでいてもよい。
【0085】
ある実施形態では、Ｒ１は、配列番号１６からなるか、本質的に配列番号１６からなるか、あるいは配列番号１６を含み、Ｒ２は、配列番号５からなるか、本質的に配列番号５からなるか、また配列番号５を含む。
【0086】
変異体リツキシマブ結合エピトープは、配列番号３～２５からなる群より選択される配列に基づくものであってもよいが、当該エピトープがリツキシマブ結合活性を保持することを条件として、前記配列に対し、アミノ酸の挿入、置換、または欠失等のアミノ酸変異を１つ以上含むものである。特に、前記配列は、一方または両方の末端において短かくなっていてもよく、例えば、１個または２個のアミノ酸分、短かくなっていてもよい。
【0087】
エピトープのリツキシマブ結合活性が保持される限り、意図的なアミノ酸の置換を、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行ってもよい。例えば、負の電荷を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正の電荷を有するアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンが挙げられ、親水性値が類似する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としてはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【0088】
保存的置換を、例えば、下記表２に従って行ってもよい。
２列目の同一ブロックおよび３列目の同行にあるアミノ酸を、互いに置換してもよい。
【表2】
【0089】
リツキシマブ結合エピトープは、配列番号３～２５からなる群より選択される配列と比較して、例えば、３個以下、２個以下、または１個のアミノ酸変異を含んでもよい。
【0090】
リツキシマブ結合エピトープの変異体は、配列番号３～２５のいずれか１つに対し、少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなってもよく、より詳細には、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなってもよい。
【0091】
２つの同一（または類似）のリツキシマブ結合アミノ酸配列を使用する場合、異なるヌクレオチド配列を用いて２つのＲエピトープをコードすることが有利となる場合がある。多くの発現系において、相同配列は、望ましくない組換え事象を引き起こす可能性がある。遺伝コードの縮重を用い、代替コドンを使用してタンパク質配列を変更することなくヌクレオチド配列の変異を達成し、これにより相同組換え事象を防いてもよい。
【0092】
前記ポリペプチドはストーク配列（Ｓｔ）を含み、当該ポリペプチドが標的細胞の表面で発現すると、当該ストーク配列は、ＲエピトープおよびＱエピトープを標的細胞の表面から遠ざけるように突出させる。
【0093】
前記ストーク配列は、ＲエピトープおよびＱエピトープを細胞表面から十分に遠ざけ、例えば、リツキシマブまたは同等の抗体の結合を促進する。
前記ストーク配列は、前記エピトープを細胞表面から上昇させる。
前記ストーク配列は、実質的に直鎖状のアミノ酸配列であってもよい。ストーク配列は、ＲエピトープおよびＱエピトープを標的細胞の表面から遠ざけるのに十分な長さであればよいが、そのコード配列がベクターのパッケージングや形質導入の効率を損なわない程度の長さとすればよい。ストーク配列の長さは、例えば、３０アミノ酸から１００アミノ酸の間であってもよい。ストーク配列の長さは、およそ４０アミノ酸～５０アミノ酸であってもよい。
前記ストーク配列は、高度にグリコシル化されていてもよい。
前記ストーク配列は、当該ストーク配列を上記式中のエピトープＲ２に連結する、もしくはつなげるリンカー配列を含んでいてもよい。
前記ストーク配列は、前記エピトープを細胞表面から上昇させる。
前記ストーク配列は、実質的に直鎖状のアミノ酸配列であってもよい。ストーク配列は、ＲエピトープおよびＱエピトープを標的細胞の表面から遠ざけるのに十分な長さであればよいが、そのコード配列がベクターのパッケージングや形質導入の効率を損なわない程度の長さとすればよい。ストーク配列の長さは、例えば、３０アミノ酸から１００アミノ酸の間であってもよい。ストーク配列の長さは、およそ４０アミノ酸～５０アミノ酸であってもよい。
前記ストーク配列は、高度にグリコシル化されていてもよい。
前記ストーク配列は、当該ストーク配列を上記式中のエピトープＲ２に連結する、もしくはつなげるリンカー配列を含んでいてもよい。
【0094】
哺乳動物細胞の表面で発現し、かつ、本明細書に記載のストーク配列を提供するために使用できる、またはストーク配列のベースとして使用できる、多種多様なタンパク質が知られている。このような表面発現タンパク質は、ストーク配列として使用可能またはストーク配列を得るために使用可能な天然型配列を含んでいる。例えば、このようなタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をストーク配列として使用してもよいし、あるいは、細胞外および膜貫通（ＴＭ）ドメインを使用してもよく、または細胞外ドメインと膜貫通ドメイン（ＥＣＤとＴＭＤ）に、前記ストークを膜内に保持し、前記ストークが細胞表面から突出することを可能にする細胞内アンカーとして機能する細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を設けたものを使用してもよい。
【0095】
このようなタンパク質としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２が挙げられる。
【0096】
よって、ストーク配列Ｓｔは、当該ストーク配列ＳｔをＲ２につなぐ任意選択のリンカー配列と、細胞外ドメインと、任意選択の膜貫通ドメインと、任意選択の細胞内ドメインとを含んでもよい。
【0097】
ある実施形態では、ストーク配列は、当該ストーク配列ＳｔをＲ２につなぐリンカー配列と、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含んでもよい。
【0098】
ストーク配列、またはその細胞外ドメインは、下記配列を含んでもよく、または下記配列とほぼ同等の長さであってもよく、
ＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号３０）
当該配列は、ＣＤ８由来の細胞外配列である。
ＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号３０）
当該配列は、ＣＤ８由来の細胞外配列である。
【0099】
上述のように、ストーク配列はさらに、膜貫通ドメインを、任意選択的に細胞内ドメインと共に含んでもよく、前記細胞内ドメインは細胞内アンカー配列として機能し得るものである。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、細胞外ドメインと同じタンパク質由来であってもよいし、あるいは、これらの一方または両方（ｉｔ／ｔｈｅｙ）が異なるタンパク質由来であってもよい。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、ＣＤ８から得ることができるものであってもよい。
【0100】
ストーク配列Ｓｔは、細胞外ストーク配列と、膜貫通ドメインと、ＣＤ８由来細胞内ドメインとを含んでもよい。
【0101】
膜貫通ドメインおよび細胞内アンカーを含むＣＤ８ストーク配列は、以下の配列を有してもよいし、
または、その配列に対して、少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を有してもよく、特に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有してもよい。
この配列内で、下線部分がＣＤ８ａ軸（ストーク）に相当し、中央部分が膜貫通ドメインに相当し、太字部分が細胞内ドメインに相当する。
【化1】
この配列内で、下線部分がＣＤ８ａ軸（ストーク）に相当し、中央部分が膜貫通ドメインに相当し、太字部分が細胞内ドメインに相当する。
【0102】
ストーク配列中のリンカー配列は、上述したようなリンカーであってもよい。特に、Ｓｅｒ（Ｓ）残基および／またはＧｌｙ（Ｇ）残基を含むか、またはこれら残基からなるリンカー配列であってもよい。リンカー配列（１つまたは複数）は、実質的に直鎖状であってもよい。ストークという観点では、リンカー配列は、より短い配列であってもよい。例えば、リンカー配列（１つまたは複数）は、下記の一般式を有していてもよく、
Ｓ－（Ｇ）ｎ－Ｓ
式中、ｎは２から８の間の数である。
Ｓ－（Ｇ）ｎ－Ｓ
式中、ｎは２から８の間の数である。
【0103】
リンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）を含んでいてもよいし、この配列からなってもよい。
【0104】
本発明のポリペプチドの代表的な例示的実施形態としては、ＣＤ８由来の細胞外配列、膜貫通配列、および細胞内配列を含むストーク配列にリンカーを介して連結された、配列番号５および／または１６のリツキシマブ結合エピトープを含むポリペプチドが挙げられる。特に、ストーク配列は、配列番号２６の配列を有していてもよい。Ｒ１とＲ２との間のリンカーＬは、上述の配列番号３２～５３のリンカー、またはこれらの配列に基づくリンカーのいずれかであってもよい。特に、リンカーＬは、上述の配列番号３２または３３に記載の配列を有していてもよい。
【0105】
ストーク配列は、Ｒ２につながっているリンカー配列を含んでもよい。ストークにおけるリンカー配列は、ＳＧＧＧＳ（配列番号５３）であってもよい。
【0106】
したがって、本発明のポリペプチドは、配列番号２７、２８、７８、もしくは７９として示したアミノ酸配列、またはこれらの配列に対して少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、あるいはこのような配列からなってもよい。
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号２７）
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号２８）
ＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号７８）
ＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号７９）
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号２７）
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号２８）
ＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号７８）
ＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号７９）
【0107】
前記ポリペプチドはまた、アミノ末端にシグナルペプチドを含んでもよく、またはアミノ末端のシグナルペプチドと共に発現されてもよい。多数の異なるシグナル配列が当該技術分野で公知であり、報告されており、シグナルペプチドを選択することは日常的に行われている事項であると思われる。シグナルペプチドは、例えば、配列番号５４または配列番号８０として示した配列を含んでもよいし、または当該配列からなってもよい。
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡ（配列番号５４）
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤ（配列番号８０）
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡ（配列番号５４）
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤ（配列番号８０）
【0108】
配列番号５４のシグナルペプチドと配列番号２７のアミノ酸配列とを含むポリペプチドは、配列番号５５で表される。また、配列番号５５は、配列番号８０のシグナルペプチドと配列番号７８のアミノ酸配列とを含むポリペプチドを表すことがわかるであろう。配列番号５４のシグナルペプチドと配列番号２８のアミノ酸配列とを含むポリペプチドは、配列番号５６で表される。また、配列番号５６は、配列番号８０のシグナルペプチドと配列番号７９のアミノ酸配列とを含むポリペプチドを表すことがわかるであろう。
【0109】
前記ポリペプチドが標的細胞（当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が導入された細胞）によって発現されると、前記シグナルペプチドが切断され、成熟したポリペプチド産物を生じる。
【0110】
本発明のポリペプチドは、配列番号２７もしくは２８または配列番号７８または７９のポリペプチドの機能的活性を保持する限り、配列番号２７もしくは２８または配列番号７８または７９として示した配列に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％）の同一性を有する、配列番号２７もしくは２８または配列番号７８または７９として示した配列の変異体を含んでもよく、あるいはこのような変異体からなってもよい。例えば、前記変異体の配列は、（ｉ）リツキシマブに結合し、かつ（ｉｉ）細胞の表面に発現すると、リツキシマブの存在下で当該細胞の死滅を誘発する、ものとする。
【0111】
相同性の比較は、目視で行ってもよいし、または、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ等、容易に入手可能な配列比較プログラムを利用して行ってもよい。
【0112】
ある実施形態では、ポリペプチドは、先に挙げて説明した要素Ｒ１、Ｌ、Ｒ２、およびＳｔのみからなる。一実施形態では、マーカー配列は含まれない。しかしながら、他の実施形態では、当該ポリペプチドは、マーカー配列をさらに含んでもよい。ただし、このようなマーカー配列は、Ｒ１とＲ２との間のＬに対する追加要素として存在させることはできない。例を挙げると、マーカー配列は、ストーク配列に含まれてもよいし、あるいはストークとＲ２との間に導入されてもよい。
【0113】
他の実施形態では、前記ポリペプチドを、他の部分に連結または結合してもよい。
【0114】
前記ポリペプチドは、融合タンパク質の形態としてもよく、この形態では、前記ポリペプチドは、ポリペプチド融合パートナーに対して融合するか、ポリペプチド融合パートナー中で融合するか、ポリペプチド融合パートナーに連結されるか、またはポリペプチド融合パートナー内に含まれる。融合パートナーとは、第１のポリペプチド、すなわち、本発明のポリペプチドのいずれの成分とも、その性質上共に生じることがない、別個のポリペプチド、すなわち第２のポリペプチドである。融合パートナーは、ポリペプチドに所望の特性または機能を付与する第２のポリペプチドとすることができる。例えば、融合パートナーは、マーカーであってもよいし、マーカー配列を含んでもよい。融合パートナーは、目的のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＰＯＩ）であってもよい。融合パートナーは、リンカー配列によってポリペプチドに連結されてもよい。ここでのリンカー配列は、前記タンパク質を融合パートナーに連結するために適切かつ機能的な任意の公知または所望のリンカー配列とすることができる。これには、前述のリンカー配列が含まれ得る。さらに、リンカー配列は、切断可能なリンカー配列であってもよい。
【0115】
融合タンパク質は、ポリペプチドと融合パートナー（例えば、目的のタンパク質）との間に、自己切断ペプチドを含んでもよい。このような自己切断ペプチドは、標的細胞内でのポリペプチドとＰＯＩの共発現を可能にし、これに続く切断により、ポリペプチドとＰＯＩとが別々のタンパク質として細胞表面に発現されるようにするものである。例えば、融合タンパク質は、口蹄疫２Ａ自己切断ペプチドを含んでもよい。自己切断ペプチドの選択肢は、当該技術分野で公知である。
【0116】
目的のタンパク質は、標的細胞の表面で発現させるための分子であってもよい。すなわち、本発明のポリペプチドと共に細胞の表面に発現させることが所望されるポリペプチドであってもよい。ＰＯＩは、標的細胞がインビボにある場合に、治療効果または予防効果を発揮し得る。
【0117】
ＰＯＩは、抗原受容体であってもよい。例えば、それはキメラ受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。キメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよい。
【0118】
キメラ抗原受容体は、抗原認識ドメイン（エクトドメイン）を、シグナル伝達分子（エンドドメイン）の膜貫通部分および細胞内部分に結合させることで生成される。エクトドメインは、最も一般には抗体可変鎖（例えば、ＳｃＦｖ）由来であるが、Ｔ細胞受容体可変ドメイン、またはリガンドや他の結合分子に対する受容体等、他の分子からも生成し得る。エンドドメインは、少なくともＣＤ３－ζの細胞内部分を含んでもよい。エンドドメインは、ＣＤ２８－ΟΧ４０－ＣＤ３ζ三要素細胞質ドメイン（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を含んでもよい。細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインの種々の異なる膜貫通および組み合わせが、当該技術分野で公知である。
【0119】
ＰＯＩは、疾患もしくは望まれない臨床状態、例えば、癌、感染、神経変性状態、または望まれない免疫応答、例えば、自己免疫応答もしくはアレルギー反応、またはＧｖＨＤもしくは移植拒絶反応に関連する抗原に対する特異性を有する受容体、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲであってもよい。抗原受容体を発現する細胞を用いたＡＣＴは、さらに、免疫寛容の誘導、組織修復、および／または組織再生の促進、あるいは、慢性炎症（例えば、代謝障害に続発するもの）の寛解にも使用し得る（例えば、国際公開第２０２０／０４４０５５号パンフレット参照）。
【0120】
受容体は、腫瘍関連抗原（すなわち、がん細胞上に発現または過剰発現しているタンパク質）に対する特異性を有してもよい。このようなタンパク質としては、乳がん患者の１５％～２０％において過剰発現し、より悪性度の高い疾患と関連するＥＲＢＢ２（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ）；ほとんどのＢ細胞悪性疾患において発現するＣＤ１９；腎細胞癌において過剰発現が多く見られるカルボキシ－アンヒドラーゼ－ＩＸ；神経芽腫細胞によって発現されるＧＤ２；ｐ５３；ＭＡＲＴ－１（ＤＭＦ５）；ｇｐ１００：１５４；ＮＹ－ＥＳＯ－１；およびＣＥＡが挙げられる。
【0121】
免疫異常もしくは望まれない免疫応答の治療もしくは予防、または免疫寛容等の誘導のため、ＣＡＲをＴｒｅｇ細胞に発現させてもよく、ここで、前記ＣＡＲは、例えば、国際公開第２０２０／０４４０５５号パンフレットに記載されているように、ＳＴＡＴ５会合モチーフと、ＪＡＫ１結合モチーフおよび／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含む、エンドドメインを含んでもよい。臓器移植拒絶反応、例えば、肝臓もしくは腎臓移植拒絶反応の予防または治療に使用するためのＣＡＲは、ＨＬＡ、例えば、移植ドナーとレシピエントの間で一致しないことが一般的であるＨＬＡ－Ａ２に対し、特異性を有していてもよい。
【0122】
本発明の第２の態様は、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードすることが可能なヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【0123】
当該核酸は、標的細胞によって発現されると、コードされたポリペプチドを標的細胞の細胞表面に発現させる。核酸が、（例えば、融合タンパク質として）ポリペプチドおよびＰＯＩの両方をコードする場合、前記核酸は、本発明のポリペプチドおよびＰＯＩの両方を標的細胞の表面に発現させ得る。
【0124】
核酸分子は、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ等のＤＮＡであってもよい。
【0125】
配列番号５５および５６の代表的なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５７および５８にそれぞれ示されている。したがって、本発明の核酸分子は、配列番号５７もしくは５８として示されるヌクレオチド配列、または配列番号５７もしくは５８に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。
【0126】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターはまた、目的の要素をコードするか、または提供するヌクレオチド配列である、目的の導入遺伝子を含んでもよい。このような導入遺伝子は、ＰＯＩをコードする遺伝子であってもよい。
【0127】
ベクターは、本発明のポリペプチドと、任意選択的に目的のタンパク質とを発現するように、標的細胞のトランスフェクトまたは形質導入が（例えば、単独で、または別の試薬／実体（ｅｎｔｉｔｙ）の存在下で）可能なものとする。
【0128】
ベクターは、プラスミド等の非ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、リン酸カルシウム、リポソーム、または細胞透過性ペプチド（例えば、両親媒性細胞透過性ペプチド）を用いて、細胞にトランスフェクトしてもよい。
【0129】
ベクターは、ウイルスベクターであってもよく、レトロウイルスベクター等、例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターであってもよい。
【0130】
哺乳動物細胞での発現のために核酸を送達するのに適したベクターは、当該技術分野において周知であり、そのようなベクターを使用し得る。ベクターは、例えば、プロモーター等の調節エレメントを１つ以上含んでもよい。
【0131】
細胞に核酸を導入するためのベクターに依存しない送達システムもまた、当該技術分野において公知であり使用されており、このような送達システムとしては、例えば、トランスポゾンに基づくシステム、ＣＲＩＳＰＲ／ＴＡＬＥＮ送達、およびｍＲＮＡ送達が挙げられる。このようなシステムはいずれも、本発明の核酸分子の送達に使用することができる。よって、本発明はさらに、細胞への送達のための組換え構築物を提供するものであり、前記構築物は、本明細書中に定義および記載されているような本発明の核酸分子を含んでいる。このような構築物は、別の（例えば、さらなるまたは第２の）核酸分子またはヌクレオチド配列または遺伝因子を含んでもよく、これにより、核酸分子の細胞への送達が可能となるか、または容易化する。
【0132】
ベクターまたは組換え構築物は、ポリペプチドをコードする核酸およびＰＯＩを含む核酸を、別々の実体または単一のヌクレオチド配列として含んでもよい。これらの核酸が単一のヌクレオチド配列として存在する場合、これらは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を１つ以上含んでもよいし、あるいは、下流配列の翻訳を可能にするため、２つのコード部分間に他の翻訳共役配列を含んでもよい。２Ａ切断部位（例えば、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）等の切断部位は、特に本発明のポリペプチドと任意のＰＯＩとの間において、本発明の核酸またはベクターまたは組換え構築物によってコードされてもよい。
【0133】
本発明はさらに、本発明の第１の態様に係るポリペプチドを発現する細胞を提供する。前記細胞は、前記ポリペプチドを発現してもよいし、前記ポリペプチドとＰＯＩとを細胞表面に共発現してもよい。前記細胞は、標的細胞と称される場合がある。
【0134】
本発明はさらに、本発明の第１の態様に係るポリペプチドをコードすることが可能な核酸分子を含む細胞を提供する。
【0135】
前記細胞は、本明細書に記載の核酸分子またはベクターまたは組換え構築物が導入された細胞であってもよい。前記細胞は、本発明に係るベクターまたは組換え構築物で形質導入またはトランスフェクトされたものであってもよい。
【0136】
前記細胞は、養子細胞療法に適したものとなり得る。
【0137】
前記細胞は、免疫細胞、またはその前駆体であってもよい。前駆体細胞は、前駆細胞とも称される場合があり、本明細書では、これら２つの用語を同義に用いている。よって、代表的な免疫細胞としては、Ｔ細胞、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８+Ｔ細胞）、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４+Ｔ細胞）、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が挙げられる。Ｔ細胞の他の集団もまた、ここでは有用であり、例えば、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が挙げられる。その他の免疫細胞としては、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、ＭＤＳＣ、好中球、およびマクロファージが挙げられる。免疫細胞の前駆体としては、多能性幹細胞が挙げられ、例えば、誘導性ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、または複能性幹細胞を含む、分化の指向性がより高い（ｍｏｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆細胞、またはある系統へと分化する細胞が挙げられる。前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫細胞に分化するよう誘導することができる。一態様において、前駆細胞は、目的の免疫細胞へと分化転換可能な体細胞であってもよい。
【0138】
最も注目すべきは、免疫細胞が、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＭＤＳＣ、または、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）もしくはＴｒｅｇ細胞等のＴ細胞であってもよいことである。
【0139】
Ｔ細胞は、既存の特異性を有してもよい。例えば、Ｔ細胞は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）特異的Ｔ細胞であり得る。あるいは、Ｔ細胞は、リダイレクトされた特異性を有してもよく、例えば、外因性または異種性のＴＣＲまたはキメラ受容体（例えば、ＣＡＲ）を導入することでリダイレクトされた特異性を有してもよい。
【0140】
好ましい実施形態では、免疫細胞はＴｒｅｇ細胞である。「制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）またはＴ制御性細胞」は、細胞障害性免疫応答を制御する免疫抑制機能を有する免疫細胞であり、免疫寛容の維持に不可欠である。本明細書中で使用するＴｒｅｇという用語は、免疫抑制機能を有するＴ細胞を指す。
【0141】
好適には、免疫抑制機能とは、病原体、同種抗原、または自己抗原等の刺激に反応して免疫系によって促進される多数の生理学的効果および細胞効果の１つ以上を低減または阻害するＴｒｅｇの能力を指す場合がある。このような効果の例としては、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の増殖の強化および炎症性サイトカインの分泌が挙げられる。このような効果はいずれも、免疫応答の強さの指標として使用し得る。Ｔｒｅｇの存在下でＴｃｏｎｖによる免疫応答が相対的に弱くなることは、Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能を示していると考えられる。例えば、サイトカイン分泌の相対的な減少は、免疫応答が弱まることを示すものと考えられ、よって、Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能を示していると考えられる。Ｔｒｅｇはまた、Ｂ細胞、樹状細胞、およびマクロファージ等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の共刺激分子の発現を調節することによっても免疫応答を抑制することができる。ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルを使用し、活性化Ｔｒｅｇの共培養後のインビトロでの抑制効力を評価することができる。
【0142】
免疫応答の強さの指標を測定し、これによりＴｒｅｇの抑制能を測定するためのアッセイは、当該技術分野において公知である。具体的には、抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞をＴｒｅｇと共培養し、対応する抗原のペプチドを共培養物に添加してＴｃｏｎｖ細胞からの応答を刺激すればよい。Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖の程度および／またはペプチドの添加に反応してＴｃｏｎｖ細胞が分泌するサイトカインＩＬ－２の量を、共培養したＴｒｅｇの抑制能の指標として使用し得る。本明細書中に記載のようにＴｒｅｇと共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、本明細書中に記載のようにＴｒｅｇの非存在下で培養された同Ｔｃｏｎｖ細胞と比べて、その増殖が５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、または９９％少ない場合がある。
【0143】
Ｔｒｅｇと共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、Ｔｒｅｇの非存在下で培養された対応するＴｃｏｎｖ細胞と比べて、エフェクターサイトカインの発現が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％少ない場合がある。エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３から選択されてもよい。好適には、エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－γから選択されてもよい。
【0144】
いくつかの異なるＴｒｅｇの亜集団が同定されているが、これらは異なる特定のマーカーまたは異なるレベルの特定のマーカーを発現する場合がある。Ｔｒｅｇは、一般的には、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３というマーカーを発現するＴ細胞である（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+）。「ＦＯＸＰ３」は、フォークヘッドボックスＰ３タンパク質の略称である。ＦＯＸＰ３は、転写因子のＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであり、制御性Ｔ細胞の発達および機能における調節経路の主要制御因子として機能する。
【0145】
Ｔｒｅｇはさらに、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４）またはＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体）を発現する場合もある。
【0146】
Ｔｒｅｇは、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を、表面タンパク質ＣＤ１２７の非存在下で、または低発現レベルのＣＤ１２７と組み合わせて（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７-またはＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７low）使用することで同定し得る。Ｔｒｅｇを同定するためのこのようなマーカーの使用は、当該技術分野では公知であり、例えば、Ｌｉｕら（ＪＥＭ； ２００６； ２０３； ７（１０）； １７０１－１７１１）に記載されている。
【0147】
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７-Ｔ細胞、またはＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+ＣＤ１２７-/lowＴ細胞であってもよい。
【0148】
Ｔｒｅｇは、脱メチル化されたＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を有してもよい。ＴＳＤＲは、Ｆｏｘｐ３の発現を調節する重要なメチル化感受性因子である（Ｐｏｌａｎｓｋｙ， Ｊ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ， ２００８．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３８（６）， ｐｐ．１６５４－１６６３）。
【0149】
Ｔｒｅｇには、ナイーブＴｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ+ＦｏｘＰ３low）、エフェクター／メモリーＴｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ-ＦｏｘＰ３high）、およびサイトカイン産生Ｔｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ-ＦｏｘＰ３low）を含む、異なる亜集団が存在することが知られている。「メモリーＴｒｅｇ」は、ＣＤ４５ＲＯを発現するＴｒｅｇであり、ＣＤ４５ＲＯ+であると考えられる。これらの細胞は、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＯのレベルを増加させ（例えば、ＣＤ４５ＲＯが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い）、好ましくは、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡ（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）を発現しないか、あるいはそのレベルが低い（例えば、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡが少なくとも８０％、９０％、または９５％少ない）。「サイトカイン産生Ｔｒｅｇ」とは、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡ（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）を発現しないか、あるいはそのレベルが非常に低く（例えば、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡが少なくとも８０％、９０％、または９５％少ない）、かつ、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＦＯＸＰ３のレベルが低い、例えば、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＦＯＸＰ３が５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少ないＴｒｅｇである。サイトカイン産生Ｔｒｅｇは、インターフェロンガンマを産生し得るＴｒｅｇであり、かつ、ナイーブＴｒｅｇと比較して、インビトロでの抑制力が低い（例えば、ナイーブＴｒｅｇと比較した抑制力が５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満である）Ｔｒｅｇでもよい。本明細書中での発現レベルとは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を指す場合がある。特に、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ等の細胞表面マーカーに関しては、発現とは、細胞表面発現、すなわち、細胞表面に発現されるマーカータンパク質の量または相対量を指す場合がある。発現レベルは、当該技術分野で公知の方法により決定し得る。例えば、ｍＲＮＡの発現レベルは、ノーザンブロッティング／アレイ解析によって決定してもよく、また、タンパク質の発現は、ウェスタンブロッティングによって、または好ましくは細胞表面発現用抗体染色を用いたＦＡＣＳによって決定してもよい。
【0150】
特に、Ｔｒｅｇは、ナイーブＴｒｅｇであってもよい。本明細書中で同義に用いられる「ナイーブ制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ制御性細胞、またはナイーブＴｒｅｇ」とは、ＣＤ４５ＲＡを発現する（特に、ＣＤ４５ＲＡを細胞表面に発現する）Ｔｒｅｇ細胞を指す。よって、ナイーブＴｒｅｇは、ＣＤ４５ＲＡ+と記載される。ナイーブＴｒｅｇが、一般に、ペプチド／ＭＨＣによって内因性ＴＣＲを介して活性化されていないＴｒｅｇを表すのに対し、エフェクター／メモリーＴｒｅｇは、刺激により内因性ＴＣＲを介して活性化されたＴｒｅｇに関する。典型的には、ナイーブＴｒｅｇは、ナイーブ以外のＴｒｅｇ細胞（例えば、メモリーＴｒｅｇ細胞）よりも、ＣＤ４５ＲＡを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多く発現しうる。代替的な見方によれば、ナイーブＴｒｅｇ細胞は、非ナイーブＴｒｅｇ細胞（例えば、メモリーＴｒｅｇ細胞）と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の量のＣＤ４５ＲＡを発現しうる。ＣＤ４５ＲＡの発現のレベルは、当該技術分野の方法、例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリーによって、容易に決定することができる。典型的には、非ナイーブＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４５ＲＡを発現しないか、もしくはＣＤ４５ＲＡを低レベルで発現する。
【0151】
特に、ナイーブＴｒｅｇはＣＤ４５ＲＯを発現しなくてもよく、ＣＤ４５ＲＯ-と考えられもよい。よって、ナイーブＴｒｅｇは、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＯの発現が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なくてもよく、あるいは、代替的な見方によれば、メモリーＴｒｅｇ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＯの発現が少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０、１／５０、または１／１００であってもよい。
【0152】
ナイーブＴｒｅｇは、上述の通り、ＣＤ２５を発現するが、ナイーブＴｒｅｇの由来によっては、ＣＤ２５の発現レベルが、メモリーＴｒｅｇにおける発現レベルと比べて低くなってもよい。例えば、末梢血から単離されたナイーブＴｒｅｇの場合、ＣＤ２５の発現レベルは、メモリーＴｒｅｇと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低くてもよい。このようなナイーブＴｒｅｇは、中レベルから低レベルのＣＤ２５を発現すると考えてもよい。しかしながら、当業者であれば、臍帯血から単離されたナイーブＴｒｅｇでは、このような差異が見られない場合があることを理解するであろう。
【0153】
本明細書中で定義するナイーブＴｒｅｇは、典型的には、ＣＤ４+、ＣＤ２５+、ＦＯＸＰ３+、ＣＤ１２７low、ＣＤ４５ＲＡ+であってもよい。
【0154】
本明細書中で使用するＣＤ１２７の低発現とは、同一の対象またはドナーからのＣＤ４+非制御性細胞またはＴｃｏｎ細胞と比較して、ＣＤ１２７の発現レベルが低いことを指す。詳細には、ナイーブＴｒｅｇは、同一の対象またはドナーからのＣＤ４+非制御性またはＴｃｏｎ細胞と比較して、ＣＤ１２７の発現が９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満であってもよい。ＣＤ１２７のレベルは、抗ＣＤ１２７抗体で染色した細胞のフローサイトメトリーを含む、当該技術分野で標準的な方法によって評価することができる。
【0155】
典型的には、ナイーブＴｒｅｇは、ＣＣＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸＣＲ３、および／またはＣＣＲ６を発現しないか、または低レベルで発現する。詳細には、ナイーブＴｒｅｇは、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＣＣＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸＣＲ３、およびＣＣＲ６をより低いレベルで発現してもよく、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低いレベルで発現してもよい。
【0156】
ナイーブＴｒｅｇは、さらに、ＣＣＲ７+およびＣＤ３１+を含む、さらに別のマーカーを発現してもよい。
【0157】
単離されたナイーブＴｒｅｇは、当該技術分野で公知の方法によって同定すればよく、そのような方法としては、単離された細胞の細胞表面における、上述のマーカーのいずれか１つ以上の一団の有無を決定することが挙げられる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７ｌｏｗを使用して、ある細胞がナイーブＴｒｅｇであるかどうかを決定することができる。単離された細胞がナイーブＴｒｅｇであるか、または所望の表現型を有するか否かを決定する方法は、本発明の一部として実施してもよい追加の工程に関連して後述するように実施することができ、また、細胞マーカーの存在および／または発現レベルを決定する方法は、当該技術分野では周知であり、例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリーが挙げられる。
【0158】
前記ポリペプチドを発現させる細胞は、患者由来、すなわち治療される対象由来であってもよい。例えば、前記細胞は、対象から取り除いた後、本発明のベクターまたはその他の構築物で、エクスビボで形質導入したものであってもよい。あるいは、前記細胞は、レシピエントである対象に移入するドナー細胞であるか、あるいは、細胞株由来、例えば、ＮＫ細胞株由来の細胞であってもよい。前記細胞はさらに、所望の標的細胞型、例えば、Ｔ細胞、特にＴｒｅｇへと分化させ得る多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ）であってもよい。したがって、前記細胞は、治療される対象に対し、自己由来、同系、または同種異系であってもよい。
【0159】
ＡＣＴに好適なＴ細胞集団としては、バルク末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＣＤ８+細胞（例えば、ＣＤ４枯渇ＰＢＭＣ）；制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を選択的に枯渇させたＰＢＭＣ；単離セントラルメモリー（Ｔｅｒｎ）細胞；ＥＢＶ特異的ＣＴＬ；ならびに三ウイルス特異的ＣＴＬ（ｔｒｉ－ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬｓ）および上述のＴｒｅｇ細胞製剤およびＴｒｅｇ細胞集団が挙げられる。
【0160】
本発明はまた、本発明に係る細胞を含む細胞集団を含む。前記細胞集団は、本発明に係るベクターで形質導入されたものであってもよい。前記細胞集団におけるある割合の細胞は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドを細胞表面に発現し得る。細胞集団におけるある割合の細胞は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドと、ＰＯＩとを、細胞表面に共発現し得る。細胞集団は、エクスビボ患者由来細胞集団であってもよい。
【0161】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現している細胞を排除するための方法を提供する。前記細胞は、本明細書中に定義または記載する核酸分子またはベクターまたは組換え構築物を含む細胞、すなわち、当該核酸分子またはベクターまたは構築物が導入された細胞、例えば、本発明に係るベクターによって形質導入された細胞であってもよい。前記方法は、リツキシマブ、もしくはリツキシマブの結合特異性を有する抗体（すなわち、同等の抗体）に細胞を曝露する工程を含む。
【0162】
典型的には、リツキシマブは、補体媒介性の細胞死滅を起こすことでその効果を発揮するが、他の機構、例えばＡＤＣＣが関与してもよい。したがって、一実施形態では、前記細胞は、補体と、リツキシマブ、または同等の抗体とに曝露されてもよい。
【0163】
前記方法には、細胞を排除させるためにインビトロで行われる方法、例えば、培養中に行われる方法が含まれる。ただし、主な用途は、インビボで細胞を排除すること、すなわち、以前に対象に投与された細胞を排除することである。
【0164】
これは、インビボにおいて、以前に前記細胞が投与された対象、言い換えれば、前記ポリペプチドを発現する本発明の細胞を用いたＡＣＴを以前に受けた対象に、前記リツキシマブまたは同等の抗体を投与することによって達成し得ることが理解されるであろう。補体は、対象に内因的に存在してもよい。
【0165】
よって、本発明では、前記リツキシマブ、またはその結合特異性を有する抗体を、本発明の細胞と組み合わせてＡＣＴに使用するために提供してもよい。上述したように、前記細胞または核酸またはベクターまたは前記細胞の製造のための構築物と、前記リツキシマブまたは同等の抗体とを、キットで提供してもよいし、組み合わせ製品として提供してもよい。
【0166】
本発明のポリペプチドが細胞の表面に発現すると、リツキシマブまたは同等の抗体が当該ポリペプチドのＲエピトープに結合することにより、細胞の溶解が起こる。
【0167】
本明細書中で使用する「排除」という用語は、「除去」または「除く」と同義である。この用語は、対象中の細胞の数を減少させ得るような、細胞の死滅、または細胞増殖の阻害を包含するものとして使用される。１００％完全に除去することが望ましい場合もあるが、必ずしも達成しなくともよい。対象において細胞数を減少させるか、またはその増殖を阻害すれば、有益な効果を得るには十分である場合がある。
【0168】
リツキシマブの結合特異性を有する抗体とは、リツキシマブと同じ天然エピトープに結合することが可能な抗体である。詳細には、前記抗体は、エピトープＲ１およびＲ２に結合可能である。
リツキシマブの結合特異性を有する抗体は、リツキシマブの抗原結合ドメインまたはリツキシマブ由来の抗原結合ドメインを含んでもよい。より詳細には、リツキシマブ由来のＶＬおよびＶＨドメイン、またはリツキシマブのＣＤＲを含んでもよい。さらに、リツキシマブの抗原結合ドメインは、リツキシマブの結合特異性が保持される限り、（例えば、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって）改変されてもよい。
リツキシマブの結合特異性を有する抗体は、リツキシマブの抗原結合ドメインまたはリツキシマブ由来の抗原結合ドメインを含んでもよい。より詳細には、リツキシマブ由来のＶＬおよびＶＨドメイン、またはリツキシマブのＣＤＲを含んでもよい。さらに、リツキシマブの抗原結合ドメインは、リツキシマブの結合特異性が保持される限り、（例えば、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって）改変されてもよい。
【0169】
上述のように、リツキシマブのバイオシミラーが入手可能であり、これらを使用してもよい。当業者であれば、リツキシマブの結合特異性を有する抗体を、当該抗体のための利用可能なアミノ酸配列を使用して、日常的に使用される方法を用いて容易に調製することができる。
【0170】
ある実施形態では、リツキシマブの結合特異性を有する抗体は、従来の免疫グロブリン形式である。すなわち、前記抗体は、軽鎖と重鎖、および定常領域と可変領域との両方を含み得る。前記抗体は二価であってもよい、すなわち、２つの抗原結合部位を含んでもよい。他の抗体形式を使用してもよく、例えば、単鎖形式または１価形式を使用してもよい。このように、前記抗体は、どのようなクラスもしくはタイプ、または形式であってもよい。
【0171】
細胞表面に発現するポリペプチド１つにつき、リツキシマブまたは同等の抗体の分子２つ以上が結合し得る。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、リツキシマブまたは同等の抗体の別々の分子に結合し得る。
【0172】
移入された細胞を排除するという決定は、対象において検出される、これら移入された細胞が原因と考えられる望ましくない作用を理由になされる場合がある。例えば、許容できないレベルの毒性が検出される場合がある。
【0173】
ＣＤ２０発現細胞を、抗体リツキシマブを用いた治療により、選択的に除いてもよい。ＣＤ２０発現は、形質細胞には存在しないため、Ｂ細胞区画を排除したとしても、リツキシマブ治療後も液性免疫は保たれる。
【0174】
遺伝子改変した、Ｔ細胞等の免疫細胞の養子移入は、抗腫瘍免疫応答のような望ましい免疫応答を発生させるため、あるいは、望まれない免疫応答を抑制または予防するための魅力的なアプローチである。
【0175】
本発明は、対象における疾患もしくは状態を治療および／または予防するための方法であって、本発明に係る細胞を前記対象に投与する工程を含む方法を提供する。当該方法は、細胞集団を対象に投与する工程を含んでいてもよい。
当該方法は、以下の工程を含んでもよい：
（ｉ）患者またはドナーから血液試料等の細胞の試料を採取する工程、
（ｉｉ）免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を抽出する工程、
（ｉｉｉ）ポリペプチドおよび任意選択的に目的の導入遺伝子をコードする核酸分子を含む本発明のベクターまたは構築物を、前記細胞に導入（例えば、形質導入またはトランスフェクト）する工程、
（ｉｖ）前記ベクターまたは構築物を含む前記細胞（すなわち、改変した前記細胞）をエクスビボで増殖させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）工程、
（ｖ）前記細胞を対象へ投与する工程。
当該方法は、以下の工程を含んでもよい：
（ｉ）患者またはドナーから血液試料等の細胞の試料を採取する工程、
（ｉｉ）免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を抽出する工程、
（ｉｉｉ）ポリペプチドおよび任意選択的に目的の導入遺伝子をコードする核酸分子を含む本発明のベクターまたは構築物を、前記細胞に導入（例えば、形質導入またはトランスフェクト）する工程、
（ｉｖ）前記ベクターまたは構築物を含む前記細胞（すなわち、改変した前記細胞）をエクスビボで増殖させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）工程、
（ｖ）前記細胞を対象へ投与する工程。
【0176】
前記改変細胞は、強化された腫瘍特異的な標的化および死滅または免疫抑制活性のような、望ましい治療的性質を有してもよい。当業者であれば、前記細胞は、治療される対象に対して同種異系または自己由来であってもよいことを理解するであろう。
【0177】
本発明の細胞は、癌を治療するために使用し得る。事実上全ての腫瘍は、ＡＣＴアプローチを用いた溶解に対して感受性があり、いずれの腫瘍も、腫瘍抗原に遭遇すれば、抗腫瘍リンパ球からのサイトカイン放出を刺激することができる。
【0178】
本発明の細胞は、例えば、リンパ腫、Ｂ細胞系統悪性腫瘍、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）、転移性黒色腫、または神経芽腫を治療するために使用し得る。
【0179】
あるいは、本発明の細胞は、非癌性疾患を治療または予防するために使用し得る。前記疾患は、感染症、移植に伴う状態、またはその他の望ましくないもしくは有害な免疫応答であってもよい。前記細胞は、例えば、寛容性を誘導するため、あるいは自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防するために、免疫抑制のために使用し得る。特に、前記細胞は、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患等の神経変性状態、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、ループス（特に、ＳＬＥ）、または炎症性腸疾患等の炎症性疾患を治療するために使用し得る。
【0180】
本発明の細胞は、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）もしくはＧｖＨＤを治療もしくは予防するため、あるいは、例えば、肝臓または腎臓の移植拒絶反応を予防するために使用し得る。
【0181】
ここで、本発明を、実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、当該技術分野の通常の技術者による本発明の実施を助けることを意図したものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【実施例】
【0182】
（実施例１）
リツキシマブに基づく異なる安全スイッチを、図１に示すように設計した。図１に示す配列は、ポリペプチドのＲ１－Ｌ－Ｒ２部分のみに関するものであり、ストーク配列およびシグナルペプチド（リーダー）配列は示されていない。図示されているＲＱＲ８、ＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ、ＣＤ８ａ、１×ＳＧＧＧＧＳ、および３×ＳＧＧＧＧＳ配列は、それぞれ、配列番号５９、６０、６１、６２、および６３である。
スイッチ１×ＳＧＧＧＧＳおよび３×ＳＧＧＧＧＳは、それぞれ、配列番号５５および５６のポリペプチドに相当し、これらのポリペプチドは、配列番号５４のシグナルペプチド（リーダー配列）とともに配列番号２７および２８のポリペプチドをそれぞれ含む。あるいは、上述のように、配列番号５５および５６は、配列番号８０のシグナルペプチド（リーダー配列）とともに配列番号７８および７９のポリペプチドをそれぞれ含むと見なしてもよい。
前記スイッチは全て、配列番号５４または８０のリーダー配列と、配列番号５３のリンカーとともに配列番号２６のストーク配列とを備えて発現していた。
ＲＱＲ８、ＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ、およびＣＤ８ａの全アミノ酸配列を、それぞれ配列番号７５、７６、および７７に示している。
リツキシマブに基づく異なる安全スイッチを、図１に示すように設計した。図１に示す配列は、ポリペプチドのＲ１－Ｌ－Ｒ２部分のみに関するものであり、ストーク配列およびシグナルペプチド（リーダー）配列は示されていない。図示されているＲＱＲ８、ＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ、ＣＤ８ａ、１×ＳＧＧＧＧＳ、および３×ＳＧＧＧＧＳ配列は、それぞれ、配列番号５９、６０、６１、６２、および６３である。
スイッチ１×ＳＧＧＧＧＳおよび３×ＳＧＧＧＧＳは、それぞれ、配列番号５５および５６のポリペプチドに相当し、これらのポリペプチドは、配列番号５４のシグナルペプチド（リーダー配列）とともに配列番号２７および２８のポリペプチドをそれぞれ含む。あるいは、上述のように、配列番号５５および５６は、配列番号８０のシグナルペプチド（リーダー配列）とともに配列番号７８および７９のポリペプチドをそれぞれ含むと見なしてもよい。
前記スイッチは全て、配列番号５４または８０のリーダー配列と、配列番号５３のリンカーとともに配列番号２６のストーク配列とを備えて発現していた。
ＲＱＲ８、ＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ、およびＣＤ８ａの全アミノ酸配列を、それぞれ配列番号７５、７６、および７７に示している。
【0183】
配列番号５７は、１×ＳＧＧＧＧＳのＤＮＡ配列を示し、配列番号５８は、この実施例で使用する３×ＳＧＧＧＧＳのＤＮＡ配列を示している。
ＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ（配列番号６０）、１×ＳＧＧＧＧＳ（配列番号６２）、および３×ＳＧＧＧＧＳ（配列番号６３）として特定されるスイッチ（ポリペプチド）は、本明細書中に記載の本発明に係る可動性リンカーを有している。欧州特許第２８３６５１１号明細書のＲＱＲ８（配列番号５９）、およびＣＤ８Ａ（配列番号６１）は、比較目的で含まれている。
ＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ（配列番号６０）、１×ＳＧＧＧＧＳ（配列番号６２）、および３×ＳＧＧＧＧＳ（配列番号６３）として特定されるスイッチ（ポリペプチド）は、本明細書中に記載の本発明に係る可動性リンカーを有している。欧州特許第２８３６５１１号明細書のＲＱＲ８（配列番号５９）、およびＣＤ８Ａ（配列番号６１）は、比較目的で含まれている。
【0184】
前記安全スイッチを、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、２Ａリンカー配列を介してｅＧＦＰタンパク質に連結させた。ジャーカット細胞を異なる構築物で形質導入し、ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した（図２Ａ）。次の工程において、細胞を、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートさせたリツキシマブバイオシミラー抗体（クローンＨＵ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で染色した。染色効率は、ＧＦＰ＋細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として評価した（図２Ｂ）。
【0185】
前記スイッチは全て細胞の表面に発現しており、同等のレベルのｅＧＦＰ発現が見られたことがわかる（図２Ａ）。リツキシマブバイオシミラー抗体が結合したＣＤ２０エピトープの発現の検出結果からわかるように、スイッチＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ、１×ＳＧＧＧＧＳ、および３×ＳＧＧＧＧＳは、ＲＱＲ８と比較して、優れた細胞表面発現を示した。可動性リンカーを持たないＣＤ８Ａは、細胞表面でのＣＤ２０エピトープの発現が低かった。スイッチ３×ＳＧＧＧＧＳが、特によく発現していた。
【0186】
（実施例２）
次に、異なる安全スイッチ構築物を形質導入した細胞について、補体媒介性死滅（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ：ＣＭＣ）を評価した。この目的で、細胞を、幼若ウサギ補体、リツキシマブと幼若ウサギ補体、またはＲＰＭＩ細胞培養培地単独の存在下で培養した。４時間の培養後、死滅効率をフローサイトメトリーにより評価した。ここでは、ＧＦＰ陽性細胞の残存率を評価した。
次に、異なる安全スイッチ構築物を形質導入した細胞について、補体媒介性死滅（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ：ＣＭＣ）を評価した。この目的で、細胞を、幼若ウサギ補体、リツキシマブと幼若ウサギ補体、またはＲＰＭＩ細胞培養培地単独の存在下で培養した。４時間の培養後、死滅効率をフローサイトメトリーにより評価した。ここでは、ＧＦＰ陽性細胞の残存率を評価した。
【0187】
図３は、全てのスイッチでＣＭＣが見られたことを示しているが、スイッチＣＤ８ａのＣＭＣは、他のスイッチと比べて非常に低かった。スイッチＳＧＧＧＧＳ－ＣＤ８ａ、１×ＳＧＧＧＧＳ、３×ＳＧＧＧＧＳでは、ＲＱＲ８と比較してＣＭＣが向上しており、３×ＳＧＧＧＧＳで特に向上していた。
【0188】
（実施例３）
各種安全スイッチの感度を、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイにおいてリツキシマブの連続希釈液を使用して調べた。
まず、実施例１に記載したように、安全スイッチＲＱＲ８（配列番号７５）、１×ＳＧＧＧＧＳ（ＲＲ８スモールともいう；配列番号５５）、および３×ＳＧＧＧＧＳ（ＲＲ８ラージともいう；配列番号５６）の発現を比較した。
前記安全スイッチを、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、２Ａリンカー配列を介してｅＧＦＰタンパク質に連結させた。ジャーカット細胞を異なる構築物で形質導入し、ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した（図４）。次の工程において、細胞を、フルオロフォアにコンジュゲートさせたリツキシマブバイオシミラー抗体で染色した。染色効率を、ＧＦＰ＋細胞に関する蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として評価した（図４）。
各種安全スイッチの感度を、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイにおいてリツキシマブの連続希釈液を使用して調べた。
まず、実施例１に記載したように、安全スイッチＲＱＲ８（配列番号７５）、１×ＳＧＧＧＧＳ（ＲＲ８スモールともいう；配列番号５５）、および３×ＳＧＧＧＧＳ（ＲＲ８ラージともいう；配列番号５６）の発現を比較した。
前記安全スイッチを、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、２Ａリンカー配列を介してｅＧＦＰタンパク質に連結させた。ジャーカット細胞を異なる構築物で形質導入し、ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した（図４）。次の工程において、細胞を、フルオロフォアにコンジュゲートさせたリツキシマブバイオシミラー抗体で染色した。染色効率を、ＧＦＰ＋細胞に関する蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として評価した（図４）。
【0189】
前記３つのスイッチは全て細胞の表面に発現しており、ほぼ同様のレベルのｅＧＦＰ発現が確認されたことがわかる（図４）。リツキシマブ抗体が結合したＣＤ２０エピトープの発現の検出結果からわかるように、スイッチ１×ＳＧＧＧＧＳ（ＲＲ８スモール）は、ＲＱＲ８よりもわずかに高い発現を示し、３×ＳＧＧＧＧＳ（ＲＲ８ラージ）は、ＲＱＲ８と比較して、より優れた細胞表面発現を示した（図４）。このことは、スイッチ３×ＳＧＧＧＧＳ（ＲＲ８ラージ）が特によく発現していたという、以前に確認された結果を裏付けている。
【0190】
リツキシマブ連続希釈物を、幼若ウサギ補体で調製した。配列番号７５（ＲＱＲ８）、配列番号５５（１×ＳＧＧＧＧＳ）または配列番号５６（３×ＳＧＧＧＧＳ）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入したジャーカット細胞（実施例１と同様）をカウントし、ＲＰＭＩに再懸濁させた。細胞を、各条件につき同じウェルが３つまたは２つできるように、９６ウェルプレートに添加した（１００，０００ジャーカット／ウェル）。各リツキシマブ希釈液（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ）（幼若ウサギ補体の最終体積５０％）５０μＬを、培地単独の条件および補体単独の条件で、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。プレートを静置してインキュベートさせ、インキュベート後に、生存率（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＮＩＲ ｋｉｔ）およびＱＢＥＮＤのためにプレートを染色し、ＦＡＣＳで解析した。
【0191】
（結果）
図５Ａに示す結果は、培地のみおよび補体のみの条件では、配列番号７５、５５、または５６の安全スイッチのいずれかを発現するジャーカット細胞に対し、有意な細胞死をもたらさなかったことを示している。しかしながら、リツキシマブの添加により、配列番号５５（ＲＲ８スモール）および配列番号５６（ＲＲ８ラージ）を発現する細胞では、前記リツキシマブ濃度範囲にわたって有意な死滅が起こり、最も高いリツキシマブ濃度で最も高いレベルの死滅が観察されたものの、最も低いリツキシマブ濃度でも、細胞死レベルは高いレベルであった（代替的な見方によれば、生存細胞のパーセンテージは低レベルであった）（図５Ａおよび図５Ｂ）。これとは対照的に、配列番号７５（ＲＱＲ８）を発現する細胞は、配列番号５５または５６を発現する細胞ほどはリツキシマブへの感受性が高くないようであり、リツキシマブ処理後に存在する、生存している形質導入細胞のパーセンテージは、全リツキシマブ濃度にわたって、配列番号７５を発現する細胞ではるかに高かった。このように、驚くべきかつ有利なことに、配列番号５５および５６のアミノ酸配列を有する安全スイッチは、ＲＱＲ８と比べてより効果的かつ高感度なようであり、細胞死の誘導に必要な抗体がより少ない可能性がある。ＲＱＲ８（配列番号７５）およびＲＲ８スモールリンカー（配列番号５５）は、非常によく似たＧＦＰおよびＣＤ２０ＭＦＩを有しているため、これらの結果を直接比較することができる。図５Ｂからわかるように、ＲＲ８スモールは、優れた用量依存性死滅反応を示し、最も高いＲＴＸ濃度での細胞死滅能を上回らないまでも同等の細胞死滅能を示していた。ＲＲ８ラージリンカーは、ＣＤ２０ ＭＦＩノレベルが有意に高く、結果はこれを反映しており、最も低い濃度であっても高レベルの死滅を示した。
ただし、図５からわかるように、ＲＱＲ８およびＲＲ８ラージの両方において、最も高いリツキシマブ濃度では、それに次ぐ濃度と比較して、生存細胞のパーセンテージがより高かった。このことは、死滅能が限界に達したことを示している可能性がある。
図５Ａに示す結果は、培地のみおよび補体のみの条件では、配列番号７５、５５、または５６の安全スイッチのいずれかを発現するジャーカット細胞に対し、有意な細胞死をもたらさなかったことを示している。しかしながら、リツキシマブの添加により、配列番号５５（ＲＲ８スモール）および配列番号５６（ＲＲ８ラージ）を発現する細胞では、前記リツキシマブ濃度範囲にわたって有意な死滅が起こり、最も高いリツキシマブ濃度で最も高いレベルの死滅が観察されたものの、最も低いリツキシマブ濃度でも、細胞死レベルは高いレベルであった（代替的な見方によれば、生存細胞のパーセンテージは低レベルであった）（図５Ａおよび図５Ｂ）。これとは対照的に、配列番号７５（ＲＱＲ８）を発現する細胞は、配列番号５５または５６を発現する細胞ほどはリツキシマブへの感受性が高くないようであり、リツキシマブ処理後に存在する、生存している形質導入細胞のパーセンテージは、全リツキシマブ濃度にわたって、配列番号７５を発現する細胞ではるかに高かった。このように、驚くべきかつ有利なことに、配列番号５５および５６のアミノ酸配列を有する安全スイッチは、ＲＱＲ８と比べてより効果的かつ高感度なようであり、細胞死の誘導に必要な抗体がより少ない可能性がある。ＲＱＲ８（配列番号７５）およびＲＲ８スモールリンカー（配列番号５５）は、非常によく似たＧＦＰおよびＣＤ２０ＭＦＩを有しているため、これらの結果を直接比較することができる。図５Ｂからわかるように、ＲＲ８スモールは、優れた用量依存性死滅反応を示し、最も高いＲＴＸ濃度での細胞死滅能を上回らないまでも同等の細胞死滅能を示していた。ＲＲ８ラージリンカーは、ＣＤ２０ ＭＦＩノレベルが有意に高く、結果はこれを反映しており、最も低い濃度であっても高レベルの死滅を示した。
ただし、図５からわかるように、ＲＱＲ８およびＲＲ８ラージの両方において、最も高いリツキシマブ濃度では、それに次ぐ濃度と比較して、生存細胞のパーセンテージがより高かった。このことは、死滅能が限界に達したことを示している可能性がある。
【0192】
本発明者らは、ＡＣＴのための細胞に使用し得る新たな安全スイッチを設計した。翻訳されたタンパク質は、レトロウイルス形質導入後、細胞表面に安定的に発現する。この構築物はリツキシマブと結合し、デュアルエピトープ設計により、高い効果の補体媒介性死滅を引き起こす。構築物は、そのサイズが小さいため、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体およびその他等、典型的なＴ細胞操作導入遺伝子と容易に共発現させることができ、許容できない毒性に直面しても、既製の臨床グレードの試薬／医薬品を用いて細胞を排除することを可能にする。
【0193】
上記明細書中に挙げられた出版物は全て、参照によって本明細書中に組み込まれる。記載されている本発明の方法およびシステムに対する種々の改変および変更が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、請求項に記載されている発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないものと理解されるべきである。実際に、細胞療法、Ｔ細胞操作、分子生物学、または関連する分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するために記載された形態の種々の改変もまた、下記の特許請求の範囲内であるものと意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【配列表】
【国際調査報告】