(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-27
(54)【発明の名称】質量分析のための試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20230620BHJP
C07D 249/12 20060101ALI20230620BHJP
C07D 213/20 20060101ALI20230620BHJP
C07C 243/34 20060101ALI20230620BHJP
C07C 309/81 20060101ALI20230620BHJP
C07C 211/63 20060101ALI20230620BHJP
C07F 9/54 20060101ALI20230620BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20230620BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20230620BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
C07D249/12 508
C07D213/20 ZNA
C07C243/34
C07C309/81
C07C211/63
C07F9/54
G01N30/06 E
G01N30/72 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022570528
(86)(22)【出願日】2021-05-19
(85)【翻訳文提出日】2022-12-07
(86)【国際出願番号】 EP2021063295
(87)【国際公開番号】W WO2021234002
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】20175798.6
(32)【優先日】2020-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ハインドル，ディーター
(72)【発明者】
【氏名】コボルト，ウーベ
(72)【発明者】
【氏名】クーヘルマイスター，ハンネス
(72)【発明者】
【氏名】メルツ，ヘリベルト
(72)【発明者】
【氏名】プレンシプ，ジュゼッペ
(72)【発明者】
【氏名】レンプト，マルティン
【テーマコード（参考）】
2G041
4C055
4H006
4H050
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041FA10
2G041FA11
2G041FA12
2G041FA13
2G041GA09
2G041JA04
2G041JA13
2G041JA20
4C055AA04
4C055AA09
4C055AA11
4C055AA13
4C055BA01
4C055CA01
4C055DA01
4C055FA01
4C055FA15
4C055FA31
4C055FA32
4C055GA01
4H006AA01
4H006AB80
4H050AA01
4H050AB80
(57)【要約】
本発明は、質量分析で使用するのに適した化合物、ならびに該化合物を用いる分析物分子の質量分析測定の方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分析物の質量分析測定のための、式Ｉ【化1】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムである場合、Ｂ１またはＢ５は、前記カップリング基Ｑであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まず、前記カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、前記カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物。
【請求項2】
前記カップリング基Ｑが、以下の式ＩＩ：【化2】
ｎは、０、１、２、３、４または５であり、
Ｘは式Ｉのフェニル基の炭素原子である）
によるＸに結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｋが、前記分析物のカルボニル基、フェノール基、アミン、ヒドロキシル基またはジエン基と反応し得る、請求項２に記載の化合物。
【請求項4】
Ｋが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、Ｂｒ、Ｆ－芳香族、４－置換１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＴＡＤ）、活性エステル、塩化スルホニルおよび反応性カルボニルからなる群から選択される、請求項２または３に記載の化合物。
【請求項5】
Ｑが、メチルヒドラジド、メチルヒドラジン、メチルヒドロキシルアミン、オキシアミン、４－メチル－オキシ－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＣＨ２－Ｏ－ＴＡＤ）、２，４－ジニトロ－５－フルオロアニリン誘導体、クロルスルホニルおよびメタンスルホニルクロリドからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
Ａ３が、ピリジニウム、トリメチルアンモニウム、ホスホニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、ジメチルエチルアンモニウム、メチルジエチルアンモニウムおよびトリアルキルアンモニウムからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項7】
Ａ３がＮＲ１Ｒ２Ｒ３またはＰＲ４Ｒ５Ｒ６であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６が、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、置換フェニル、非置換フェニル、アルキル、修飾アルキル、短鎖アルキルから選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
前記化合物が永久的に正に帯電しており、好ましくは前記化合物が以下の式：【化3】
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に化合物、または請求項９に記載の組成物を含む、キット。
【請求項11】
互いに共有結合した結合分析物および結合化合物を含む、質量分析測定を使用して分析物を検出するための複合体であって、特に、前記結合化合物が式ＩＩＩ【化4】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
前記カップリング基Ｑ＊が式ＩＶを含む：
【化5】
前記結合分析物は、Ｋ＊を介して共有結合しており、
Ｘ＊は式ＩＩＩのフェニル基の炭素原子であり、
Ａ３がアンモニウムであり、かつＢ１またはＢ５が前記カップリング基Ｑ＊である場合、前記カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、前記カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む））
を含む、複合体。
【請求項12】
前記分析物の質量分析測定のための請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物の使用であって、特に前記質量分析測定が、タンデム質量分析測定、特にトリプル四重極質量分析測定を含む、使用。
【請求項13】
分析物の質量分析測定のための方法であって、（ａ）前記分析物を、請求項１～９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物と反応させ、それによって請求項１１に記載の複合体を形成する工程、および
（ｂ）工程（ａ）からの前記複合体を、質量分光分析に供する工程
を含み、特に該質量分光分析工程（ｂ）は、
（ｉ）前記複合体のイオンを質量分光分析の第１段階に供し、それによって前記複合体の前記イオンをその質量／荷電（ｍ／ｚ）比に従って特徴付ける工程、
（ｉｉ）前記複合体の前記イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって第１の要素、特に第１の中性要素、特に低分子の中性要素が放出され、前記複合体の娘イオンが生成される工程であって、前記複合体の前記娘イオンはそのｍ／ｚ比が前記複合体の前記イオンと異なる、前記複合体の娘イオンが生成される工程、および
（ｉｉｉ）前記複合体の前記娘イオンを質量分光分析の第２段階に供し、それによって前記複合体の前記娘イオンをそのｍ／ｚ比に従って特徴付ける工程
を含み、ならびに／または
（ｉｉ）は、前記複合体の前記イオンの代替的なフラグメンテーションを更に含み得、それによって、第２の要素、特に前記第１の中性要素とは異なる第２の中性要素が放出され、かつ前記複合体の第２の娘イオンが生成され、
（ｉｉｉ）は、前記複合体の前記第１の娘イオンおよび前記第２の娘イオンを質量分光分析の第２段階に供することを更に含み得、それによって、前記複合体の前記第１の娘イオンおよび前記第２の娘イオンをそれらのｍ／ｚ比に従って特徴付ける、
方法。
【請求項14】
式Ｖ：【化6】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムである場合、Ｂ１またはＢ５は、前記カップリング基Ｑであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まず、前記カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、前記カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、質量分析に使用するのに適した化合物、該化合物を含む組成物、該組成物および／または化合物および複合体を含むキットに関する。さらに、本発明は、前記化合物を使用する分析物の質量分析定量方法に関する。
本発明は、質量分析に使用するのに適した化合物、該化合物を含む組成物、該組成物および／または化合物および複合体を含むキットに関する。さらに、本発明は、前記化合物を使用する分析物の質量分析定量方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
質量分析（ＭＳ）は、小分子から高分子にわたる化学物質の定性および定量分析に広く使用されている技術である。概してこれは非常に高感度で特異的な方法であり、複雑な生物学的サンプル、例えば環境または臨床サンプルの分析さえ可能である。しかしながら、いくつかの分析物、特に血清のような複雑な生物学的マトリックスから分析した場合、測定の感度は依然として問題である。
質量分析（ＭＳ）は、小分子から高分子にわたる化学物質の定性および定量分析に広く使用されている技術である。概してこれは非常に高感度で特異的な方法であり、複雑な生物学的サンプル、例えば環境または臨床サンプルの分析さえ可能である。しかしながら、いくつかの分析物、特に血清のような複雑な生物学的マトリックスから分析した場合、測定の感度は依然として問題である。
【0003】
多くの場合、ＭＳは、クロマトグラフィー技術、特にガスおよび液体クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣと組み合わされる。ここで、分析された目的の分子（分析物）は、クロマトグラフィーで分離され、個別に質量分析（Ｈｉｇａｓｈｉら（２０１６）Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ １３０ ｐ．１８１－１９０）に供される。
【0004】
しかし、ＭＳ分析法、特に存在量が少ないかまたは利用可能な材料が少ない（生検組織など）場合の分析物の分析の感度を高める必要性は、依然として存在する。
【0005】
当技術分野では、これらの分析物の測定の感度を改善することを目的とするいくつかの誘導体化試薬（化合物）が知られている。中でも、荷電ユニットおよび中性損失ユニットが１つの機能単位に結合した試薬である（例えば、国際公開第２０１１／０９１４３６号）。別個のユニットを含む他の試薬は構造的に比較的大きく、サンプル調製およびＭＳ測定の一般的なワークフローに影響を及ぼす（Ｒａｈｉｍｏｆｆら（２０１７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３９（３０），ｐ．１０３５９－１０３６４）。既知の誘導体化試薬は、例えば、ダンシルクロリド、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ（ＲＦＭＳ）、Ｃｏｏｋｓｏｎ型試薬、Ａｍｐｌｉｆｅｘ Ｄｉｅｎｅ、Ａｍｐｌｉｆｅｘ Ｋｅｔｏ、Ｇｉｒａｒｄ Ｔ、Ｇｉｒａｒｄ Ｐ、ピリジルアミンである（ＨｏｎｇおよびＷａｎｇ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，２００７，７９（１）：３２２－３２６；Ｆｒｅｙら，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，２０１６ Ｄｅｃ，１１６：６０－６６；Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２００５，３９（３－４），４１１－４１７；Ａｌｌｅｙ Ｗｉｌｌｉａｍ，２８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｊｕｌｙ １７－２１（２０１６），ＩＣＳ－２０９）。これらには、全て、しばしば、ラベル効率が不十分であること、カップリング化学に起因する構造異性体の生成、最適でないイオン化効率、カップリング後のクロマトグラフ分離に対する不利益、多くのフラグメンテーション経路に起因する最適でないフラグメンテーション挙動、および高い衝突エネルギーの必要性に起因するに起因する不利益がある。感度および選択性は、非常に少量の分析物には十分ではない。
【0006】
したがって、ＭＳ測定ワークフローに悪影響を及ぼさない化学構造を示すだけでなく、複雑な生物学的マトリックスからの分析物の高感度検出を可能にする誘導体化試薬が当該技術分野で早急に必要とされている。これは、異なる化学的特性を呈するいくつかの異なる分析物を短時間で測定しなければならない、ランダムアクセス、ハイスループットＭＳセットアップにおいて特に重要である。
【0007】
本発明は、生物学的サンプル中のステロイド、タンパク質、および他の種類の分析物などの分析物分子の高感度の検出を可能にする新規な試薬（化合物）に関する。試薬は、特定の分析物の測定で生じる特定の必要性のため、または特定のワークフロー適応のために個々の適応を可能にするようなモジュール方式で設計される。
【0008】
本発明の目的は、質量分析決定による分析物の効率的な検出のための式Ｉの化合物、これらの各々が前記化合物を含むキットおよび組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、分析物の質量分析決定のための複合体および方法を提供することである。
【0009】
この目的は、独立請求項の主題によって解決される。さらなる実施形態は、従属請求項において言及される。
【発明の概要】
【0010】
発明の概要
以下では、本発明は以下の項目に関する。
以下では、本発明は以下の項目に関する。
【0011】
第１の態様では、本発明は、分析物の質量分析決定のための、式Ｉ
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成し得るカップリング基Ｑであり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、好ましくはＡ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＱであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない）
の化合物に関する。
【化1】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、好ましくはＡ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＱであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない）
の化合物に関する。
【0012】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１項目の化合物を含む組成物に関する。
【0013】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１項目の化合物または本発明の第２項目の組成物を含むキットに関する。
【0014】
第４の態様では、本発明は、互いに共有結合した結合分析物および結合化合物を含む、質量分析決定を用いて分析物を検出するための複合体に関し、特に、複合体は、分析物と本発明の第２項目の化合物との化学反応によって形成される。
【0015】
第５の態様では、本発明は、分析物の質量分析決定のための本発明の第１項目の化合物の使用に関する。
【0016】
第６の態様では、本発明は、分析物の質量分析決定のための方法であって、
（ａ）分析物を、態様１～３２のいずれか一項で定義された式Ｉの化合物と反応させ、それによって、態様３５～３８のいずれか一項で定義された複合体を形成させる工程、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分析に供する工程
を含む、方法に関する。
（ａ）分析物を、態様１～３２のいずれか一項で定義された式Ｉの化合物と反応させ、それによって、態様３５～３８のいずれか一項で定義された複合体を形成させる工程、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分析に供する工程
を含む、方法に関する。
【0017】
第７の態様では、本発明は、式Ｖ：
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成し得るカップリング基Ｑであり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物に関する。好ましくは、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はカップリング基Ｑであり、ＱはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。
【化2】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物に関する。好ましくは、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はカップリング基Ｑであり、ＱはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。
【0018】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態および例に限定されず、これらは変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、その範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態および例に限定されず、これらは変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、その範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【0021】
いくつかの文献が本明細書中で引用されている。本明細書に引用されている各文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、説明書等を含む）は、上記であろうと以下であろうと、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。このように組み込まれた参照の定義または教示と、本明細書に引用された定義または教示との間に矛盾がある場合には、本明細書の本文が優先する。
【0022】
以下、本発明の各要素について説明する。これらの要素は特定の実施形態と共に列挙されているが、これらは任意の方法および任意の数で組み合わせて追加の実施形態を作成することができることを理解されたい。種々の説明された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示および／または好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持し、かつ包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願に記載されている全ての要素の任意の順列および組み合わせは、文脈が別段の意味を示さない限り、本出願の説明によって開示されていると考えるべきである。
【0023】
定義
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明記した整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他のいかなる整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を除外することを意味するものではないことが理解されよう。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明記した整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他のいかなる整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を除外することを意味するものではないことが理解されよう。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0024】
比率、濃度、量、および他の数値データは、「範囲」の形式で本明細書に表すまたは提示することができる。このような範囲の形式は、便宜上および簡潔にするために単に使用されているに過ぎないこと、したがって、その範囲を限定するものとして明示的に列挙されている数値を含むだけではなく、各数値および部分範囲があたかも明示的に列挙されているかのごとくその範囲に包含される個々の数値の全てまたは部分範囲を含むことを柔軟に解釈するべきであると理解される。例示として、「４％～２０％」の数値範囲は、４％～２０％という明示的に列挙されている値を含むだけではなく、表示されている範囲内の個々の値および部分範囲を含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲には、４、５、６、７、８、９、１０、．．．１８、１９、２０％等の個々の値と、４～１０％、５～１５％、１０～２０％等のサブレンジとが含まれる。この同じ原則は、最小値または最大値を列挙する範囲に適用される。さらに、このような解釈は、その範囲の幅または記載されている特性に関わらず、当てはまるはずである。
【0025】
「約」という用語は、数値に関連して使用される場合、示された数値よりも５％小さい下限値を有し、かつ示された数値よりも５％大きい上限値を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【0026】
本発明の文脈において、「化合物」という用語は、特定の化学構造を有する化学物質を指す。前記化合物は、１つ以上の反応性基を含み得る。各反応性基は種々の機能を果たし得、または２つ以上の反応性基は同じ機能を果たし得る。反応性基としては、反応性ユニット、荷電ユニットおよび中性損失ユニットが挙げられるが、これらに限定されない。化合物はラベルとして命名し得る。本発明の文脈において、「結合化合物」という用語は、分析物に結合している前記化合物を指す。原則として、化合物および結合化合物は同一であり得る。化合物および結合化合物は、実質的に同一であり得る。実質的に同一とは、反応性ユニットＫの構造および／またはカップリング基Ｑの構造が互いに異なることを除いて、両方の化合物が同一の化学構造を有することを意味し得る。好ましくは、化合物は、分析物への結合を形成し得るが、分析物にまだ結合していない。結合化合物は、分析物に結合する。
【0027】
「ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子」という用語は、置換基Ａ１、Ａ２およびＡ３が結合しているＣ原子を表す。換言すれば、「ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基」という用語における「Ｃ」は、Ａ１、Ａ２およびＡ３が結合しているＣ原子を表す。
【0028】
「Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む」という用語は、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑが、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離された第１のＣ原子を含むことを意味し得る。カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離された第２のＣ原子を含む。
【0029】
「Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む」という用語は、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑが、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離された第１のＣ原子を含むことを意味し得る。カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離された第２のＣ原子を含む。「第１」または「第２」という用語は、本明細書では２つのＣ原子を互いに区別するのに役立つ。
【0030】
「Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む」という用語は、Ａ３がアンモニウムである場合、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑを必須とすることを意味し得る。カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離された第１のＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む。好ましくは、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＱであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。
【0031】
「Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む」という用語は、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊が、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離された第１のＣ原子を含むことを意味し得る。カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離された第２のＣ原子を含む。「Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む」という用語は、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ５がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊が、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離された第１のＣ原子を含むことを意味し得る。カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子である別のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離された第２のＣ原子を含む。「第１」または「第２」という用語は、本明細書では２つのＣ原子を互いに区別するのに役立つ。
【0032】
「質量分析」（「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ」または「ＭＳ」）または「質量分析決定」という用語は、化合物をその質量によって同定するために使用される分析技術に関する。ＭＳは、その質量電荷比または「ｍ／ｚ」に基づいてイオンをフィルタにかける、検出する、および測定する方法である。ＭＳ技術は、概して、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成すること；および、（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量電荷比を計算することを含む。化合物は、任意の好適な手段によってイオン化されて、検出され得る。「質量分析計」は、一般に、イオン化装置およびイオン検出器を含む。一般に、１つ以上の目的の分子がイオン化されて、続いて、このイオンは、質量分析機器に導入されて、この機器において、磁場および電場の組み合わせにより、イオンは、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存して空間の経路をたどる。「イオン化」または「イオン化する」という用語は、１つ以上の電子単位に等しい正味の電荷を有する分析物のイオンを発生させるプロセスを指す。陰イオンは、１つ以上の電子単位の正味の負電荷を有するものである一方、陽イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味の正電荷を有するものである。ＭＳ法は、ネガティブイオンを発生させ検出する「ネガティブ・イオン・モード」、またはポジティブイオンを発生させ検出する「ポジティブ・イオン・モード」のいずれかで実施し得る。
【0033】
「タンデム質量分析」または「ＭＳ／ＭＳ」は、分析物のフラグメンテーションが段階間で生じる、質量分析の選択の複数工程を含む。タンデム質量分析計では、イオンをイオン源で生成し、質量分析の第１段階（ＭＳ１）で質量電荷比により分離する。特定の質量電荷比（前駆イオンまたは親イオン）のイオンが選択され、フラグメントイオン（娘イオン）が、衝突誘起解離、イオン分子反応、または光解離によって生成される。次いで、得られたイオンを分離し、質量分析の第２段階（ＭＳ２）で検出する。
【0034】
質量分析計は、わずかに異なる質量のイオンを分離して検出するので、所与の元素からなる異なる同位体を容易に区別する。したがって、質量分析は、以下に限定されないが、低分子量の分析物、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含めた、分析物の正確な質量測定および特徴付けのための重要な方法である。その用途は、タンパク質およびその翻訳後修飾の同定、タンパク質複合体、そのサブユニットおよび機能的相互作用の解明、ならびにプロテオミクスにおけるタンパク質の全測定を含む。質量分析によるペプチドまたはタンパク質のデノボ配列決定は、通常、アミノ酸配列のこれまでの知識なしに行い得る。
【0035】
ＭＳにおけるほとんどのサンプルワークフローは、さらに、サンプル調製および／または濃縮プロセスを含む。ここで、例えば目的の分析物は、ガスまたは液体クロマトグラフィーを用いてマトリクスから分離する。典型的には、質量分析決定のために、以下の３つの工程が実行される。
【0036】
１．目的の分析物を含むサンプルを、通常は陽イオンとの複合体形成、多くの場合は陽イオンへのプロトン化によってイオン化する。イオン化源は、エレクトロスプレイイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＣＩ）を含むが、これらに限定されない。
【0037】
２．該イオンをその質量および電荷に従って分類し、分離する。イオンフィルターとして、高磁場非対称波形イオン移動度分光法（ＦＡＩＭＳ）を用いてもよい。
【0038】
３．分離されたイオンを、例えば多重反応モード（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：ＭＲＭ）で検出し、その結果をチャートに表示する。
【0039】
「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」という用語は、溶液を長さの短いキャピラリー管に沿って通過させて、キャピラリー管の端部に高い正電位または負電位を印加する、方法を指す。チューブの端に到達した溶液は、溶媒蒸気中の非常に小さな液滴のジェットまたはスプレイへと気化（噴霧）される。液滴のこの霧は、エバポレーションチャンバーを通り、このチャンバーは、わずかに加熱されて、縮合を予防して溶媒をエバポレートする。液滴が小さくなるほど、同じ電荷間の自然な反発によってイオンと中性分子が放出されるまで、電気的な表面電荷密度が向上する。
【0040】
「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」という用語は、ＥＳＩに類似した質量分析法を指す。しかしながら、ＡＰＣＩは、大気圧のプラズマ内で起こるイオン分子反応によってイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間の電気放電により維持される。次いで、イオンは、典型的には、一連の差動励起スキマー段を使用することによって質量分析器に抽出される。溶媒の除去を改善するために、乾燥窒素ガスおよび予熱した窒素ガスの向流を使用し得る。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、低極性要素を分析するためにＥＳＩよりも効果的であり得る。
【0041】
「高磁場非対称波形イオン移動度分光法（ＦＡＩＭＳ）」は、気相イオンを強電界および弱電界での挙動によって分離する大気圧イオン移動度技術である。
【0042】
「多重反応モード」または「ＭＲＭ」は、前駆体イオンおよび１つ以上のフラグメントイオンが選択的に検出される、ＭＳ機器用の検出モードである。
【0043】
質量分析決定は、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、特にＨＰＬＣ、および／またはイオン移動度に基づく分離技法等のクロマトグラフィー法を含めた追加の分析法と組み合わされてもよい。
【0044】
本開示の文脈において、「分析物」、「分析物分子」、または「目的の分析物」という用語は、質量分析によって分析される化学種を指すために互換的に使用される。質量分析によって分析されるのに適した化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｓ）、すなわち分析物は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（例えば、細胞表面受容体、細胞質タンパク質等）、代謝産物またはホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、エストラジオール等）、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド（例えば、ビタミンＤ）、別の分子のある特定の修飾に特徴的な分子（例えば、タンパク質上の糖部分またはホスホリル残基、ゲノムＤＮＡ上のメチル残基）、もしくは生物によって内在化されている物質（例えば、治療薬、依存性薬物、毒素等）、またはそのような物質の代謝産物を含むが、これらに限定されない、生存生物内に存在する任意の種類の分子であり得る。このような被分析物は、バイオマーカーとして役立つことがある。本発明の文脈において、用語「バイオマーカー」とは、前記システムの生物学的状態の指標として使用される、生物学的システム内の物質を指す。本発明の文脈において、「結合分析物」という用語は、複合体を形成するための化合物に結合している前記分析物を指す。原則として、分析物および結合分析物は同一であり得る。分析物および結合分析物は、実質的に同一であり得る。実質的に同一とは、官能基の構造によって互いに異なることを除き、両分析物が同一の化学構造を有することを意味し得る。好ましくは、分析物は、化合物への結合を形成し得るが、化合物にまた結合していない。結合分析物は、化合物に結合される。
【0045】
「永久的に正に帯電した」という用語は、ピリジニウムまたはアンモニウムまたはホスホニウム単位の正電荷が、例えば洗浄、希釈、濾過などによって容易に可逆的ではないという本開示の文脈で使用されている。永久的な正電荷は、例えば、共有結合の結果であり得る。永久的な正電荷は、例えば静電相互作用の結果であり得る可逆正電荷（非永続的正電荷）とは対照的である。
【0046】
「検出限界」または「ＬＯＤ」という用語は、生物学分析法が分析物をバックグラウンドノイズから確実に区別することができる、分析物の最低濃度である。
【0047】
分析物は、目的のサンプル中、例えば、生体サンプルまたは臨床サンプル中に存在することがある。「サンプル」または「対象サンプル」という用語は、本明細書において互換的に使用され、組織、器官、または個体の部分または一部を指し、典型的には、組織、器官または個体の全体を表すことを意図したそのような組織、器官、または個体よりも小さい。分析に際して、サンプルは、組織状態、あるいは器官もしくは個体の健康状態または疾患状態に関する情報を提供する。サンプルの例としては、以下に限定されないが、血液、血清、血漿、滑液、髄液、尿、唾液およびリンパ液等の液体サンプル、または乾燥血液スポットおよび組織抽出物等の固体サンプルが挙げられる。サンプルの更なる例は、細胞培養物または組織培養物である。
【0048】
本開示の文脈において、サンプルは、「個体」または「対象」に由来し得る。典型的には、対象は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
質量分析による分析前に、サンプルは、サンプルおよび／または分析物に特有の方法で前処理されてもよい。本開示の文脈において、「前処理」という用語は、質量分析による所望の分析物の後の分析を可能にするために必要な任意の手段を指す。前処理手段としては、典型的には、固体サンプルの溶出（例えば、乾燥血液スポットの溶出）、全血サンプルへの溶血試薬（ｈｅｍｏｌｉｚｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ：ＨＲ）の添加、および尿サンプルへの酵素試薬の添加が挙げられるが、これらに限定されない。また、サンプルの前処理として内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ：ＩＳＴＤ）の添加が考えられる。
【0050】
「溶血試薬（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔ：ＨＲ）」という用語は、サンプル中に存在する細胞を溶解する試薬を指し、本発明の文脈においては、溶血試薬とは特に、全血サンプル中に存在する赤血球を含むがこれに限定されない、血液サンプル中に存在する細胞を溶解する試薬を指す。よく知られた溶血試薬は水（Ｈ２Ｏ）である。溶血試薬の更なる例としては、脱イオン水、高浸透圧の液体（例えば、８Ｍ尿素）、イオン性液体、および異なる界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0051】
通常、「内標準」（ＩＳＴＤ）は、質量スペクトル検出のワークフローに施すと、目的の分析物と類似の特性を示す、既知量の物質である（すなわち、任意の前処理、濃縮および実際の検出工程を含む）。ＩＳＴＤは目的の分析物と同様の特性を呈するが、目的の分析物とは明確に区別できる。例示すると、ガスまたは液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフ分離の間、ＩＳＴＤは、サンプルからの目的分析物とほぼ同じ保持時間を有する。したがって、分析物およびＩＳＴＤの両方が同時に質量分析計に入る。ＩＳＴＤは、しかしながら、サンプルからの目的分析物とは異なる分子量を呈する。これにより、異なる質量／電荷（ｍ／ｚ）比を用いて、ＩＳＴＤからのイオンと分析物からのイオンとを質量分析で区別することができる。両方をフラグメンテーションに供し、娘イオンを得る。これらの娘イオンは、互いのｍ／ｚ比およびそれぞれの親イオンによって区別することができる。結果として、ＩＳＴＤおよび分析物からのシグナルの別個の決定および定量化を行うことができる。ＩＳＴＤは既知量で添加されているので、サンプルからの分析物のシグナル強度は、特定の定量的量の分析物に帰属し得る。かくして、ＩＳＴＤの添加は、検出された分析物の量の相対的比較を可能にし、分析物（複数可）が質量分析計に到達した際、サンプル中に存在する目的の分析物の明白な同定および定量化を可能にする。典型的には、必ずしもそうではないが、ＩＳＴＤは目的の分析物の同位体ラベルされたバリアントである（例えば、２Ｈ、１３Ｃ、または１５Ｎ等のラベルを含む）。
【0052】
前処理に加えて、サンプルをまた、１つ以上の濃縮プロセスに供してもよい。本開示の文脈において、用語「第１の濃縮プロセス」または「第１の濃縮ワークフロー」とは、サンプルの前処理に続いて発生し、初回サンプルと比べて濃縮された分析物を含むサンプルを提供する、濃縮プロセスを指す。第１の濃縮ワークフローは、化学沈殿（例えば、アセトニトリルを用いる）または固相の使用を含むことができる。好適な固相は、固相抽出（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：ＳＰＥ）カートリッジおよびビーズを含むが、これらに限定されない。ビーズは、非磁性、磁性、または常磁性であり得る。ビーズは、対象の分析物に特異的であるように、異なってコーティングされてもよい。コーティングは、意図された用途、すなわち意図された捕捉分子によって異なることがある。どのコーティングがどの分析物に適しているかは当業者によく知られている。ビーズは種々の異なる材料で作ることができる。ビーズは様々なサイズを有し得、細孔のあるまたは細孔のない表面を含み得る。いう用語
【0053】
本開示の文脈において、「第２の濃縮プロセス」または「第２の濃縮ワークフロー」という用語は、サンプルの前処理および第１の濃縮プロセスに続いて発生し、初回サンプルおよび第１の濃縮プロセス後のサンプルと比べて濃縮された分析物を含むサンプルを提供する、濃縮プロセスを指す。
【0054】
「クロマトグラフィー」という用語は、液体またはガスによって運ばれる化学混合物が、静止した液相または固相の周りまたは上を流れる際に化学要素の異なる分布の結果として成分中に分離される、プロセスを指す。
【0055】
「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」という用語は、細かく分かれた物質のカラムまたは毛管路を通って流体が均一に浸透する際に、流体溶液の１つ以上の成分を選択的に遅延させるプロセスを指す。遅延は、この流体が固定相（複数可）に対して移動する際の、１つ以上の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間の混合物成分の分布に起因する。固定相が移動相よりも高い極性である（例えば、移動相としてトルエン、固定相としてシリカ）方法は順相液体クロマトグラフィー（ｎｏｒｍａｌ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＮＰＬＣ）と呼ばれ、固定相が移動相よりも低い極性である（例えば、移動相として水－メタノール混合物、固定相としてＣ１８（オクタデシルシリル））方法は逆相液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＲＰＬＣ）と呼ばれる。
【0056】
「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」とは、圧力下において固定相、典型的には高密度に充填されたカラムに移動相を通すことによって分離の程度が増加する、液体クロマトグラフィーの方法を指す。典型的に、カラムには、不規則または球形の粒子、多孔質モノリシック層、または多孔質膜で構成される固定相が充填されている。ＨＰＬＣは、歴史的に、移動相および固定相の極性に基づいて２つの異なるサブクラスに分けられる。固定相が移動相よりも高い極性である（例えば、移動相としてトルエン、固定相としてシリカ）方法は順相液体クロマトグラフィ（ＮＰＬＣ）と呼ばれ、反対の（例えば、移動相として水－メタノール混合物、固定相としてＣ１８（オクタデシルシリル））方法は逆相液体クロマトグラフィ（ＲＰＬＣ）と呼ばれる。マイクロＬＣとは、典型的には１ｍｍ未満、例えば約０．５ｍｍの狭い（ｎｏｒｒｏｗ）内径を有するカラムを用いるＨＰＬＣ法を指す。「超高速液体クロマトグラフィー」または「ＵＨＰＬＣ」とは、１２０ＭＰａ（１７，４０５ｌｂｆ／ｉｎ２）または約１２００気圧の圧力を用いるＨＰＬＣ法を指す。ラピッドＬＣとは、上記のような内径であり、長さが２ｃｍ未満、例えば１ｃｍの短いカラムを用いて、上記のような流量および上記のような圧力を加えるＬＣ法を指す（マイクロＬＣ、ＵＨＰＬＣ）。短いラピッドＬＣプロトコルは、単一の分析カラムを用いるトラッピング／洗浄／溶出工程を含み、１分未満の非常に短い時間でＬＣを実現する。
【0057】
さらに、親水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＩＬＩＣ）、サイズ排除型ＬＣ、イオン交換型ＬＣ、およびアフィニティ型ＬＣがよく知られている。
【0058】
ＬＣ分離は、並列に配置された複数のＬＣチャネルを含むシングルチャネルＬＣまたはマルチチャネルＬＣであってもよい。ＬＣにおいて、分析物は、当業者に一般的に知られているように、それらの極性またはログＰ値、サイズ、または親和性に従って分離され得る。
【0059】
「フラグメンテーション」という用語は、単一の分子が２つ以上の別個の分子へと解離することを指す。本明細書で使用される場合、フラグメンテーションという用語は、フラグメンテーションイベントが発生する親分子の破壊点が明確に定義され、フラグメンテーションイベントから生じる複数の娘分子が充分に特徴付けられる、特定のフラグメンテーションイベントを指す。親分子および得られる複数の娘分子の破壊点を決定する方法は当業者に周知である。得られる娘分子は安定であり得るか、または後続のフラグメンテーションイベントの際に解離し得る。例えば、フラグメンテーションを受ける親分子がＮ－ベンジルピリジニウム単位を含む場合、当業者は、ピリジニウム単位がフラグメンテーションしてベンジル要素を放出するか、または親分子から完全に放出されるかを分子の全体構造に基づいて決定し得る。すなわち、得られた娘分子はベンジル分子およびベンジルを欠く親分子のいずれかである。フラグメンテーションは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子捕獲解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｃａｐｔｕｒｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＣＤ）、電子移動解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＴＤ）、負電子移動解離（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＮＥＴＤ）、電子脱離解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＤＤ）、光解離、特に赤外多光子解離（ｉｎｆｒａｒｅｄ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＩＲＭＰＤ）および黒体赤外放射解離（ｂｌａｃｋｂｏｄｙ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｒａｄｉａｔｉｖｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＢＩＲＤ）、表面誘起解離（ｓｕｒｆａｃｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＳＩＤ）、高エネルギーＣトラップ解離（Ｈｉｇｈｅｒ－ｅｎｅｒｇｙ Ｃ－ｔｒａｐ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＨＣＤ）、チャージ・リモート・フラグメンテーションを介して生じ得る。
【0060】
「反応性ユニット」という用語は、別の分子と反応し得る、すなわち、対象分析物などの別の分子と共有結合を形成し得るユニットを指す。典型的には、このような共有結合は、他の分子中に存在する化学基で形成される。したがって、化学反応の際、化合物の反応性ユニットは、分析物分子中に存在する好適な化学基と共有結合を形成する。分析物分子に存在するこの化学基は化合物の反応性ユニットと反応する機能を果たすため、分析物分子中に存在する化学基は、分析物の「官能基」とも呼ばれる。共有結合の形成は、反応性基の原子と分析物の官能基との間に新たな共有結合が形成される化学反応の各場合に生じる。反応性基と分析物の官能基との間に共有結合を形成する際に、この化学反応中に原子が失われることは当業者に周知である。
【0061】
本開示の文脈において、「複合体」という用語は、化合物と分析物分子との反応によって生成される生成物を指す。この反応により、化合物と分析物との間に共有結合が形成される。したがって、複合体という用語は、化合物と分析物分子との反応によって形成される共有結合反応生成物を指す。
【0062】
「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば障害の処置のための薬品、または本発明のバイオマーカー遺伝子もしくはタンパク質を特異的に検出するためのプローブを含む、任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、好ましくは、本発明の方法を実行するためのユニットとして、奨励、流通、または販売される。典型的には、キットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器手段を密接に閉じ込めて受け入れるように区画化されたキャリア手段を更に含み得る。特に、容器手段の各々は、第１の態様の方法で使用される別個の要素のうちの１つを備える。キットは、反応触媒を含むがこれに限定されない１種以上の他の試薬を更に含み得る。キットは、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および使用説明を伴う添付文書を含むがこれらに限定されない、更なる材料を含む１つ以上の他の容器を更に含んでもよい。ラベルは、組成物が特定の用途に使用されることを示すために容器上に提示され得、インビボ使用またはインビトロ使用のいずれかに関する指示も示し得る。コンピュータ・プログラム・コードは、光記憶媒体（例えば、コンパクトディスク）等のデータ記憶媒体もしくは装置上に、またはコンピュータもしくはデータ処理装置に直接提供されてもよい。その上キットは、較正目的のために、本明細書の別の箇所に記載されるようなバイオマーカーの標準量を含み得る。
【0063】
実施形態
第１の態様では、本発明は、式Ｉ：
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成し得るカップリング基Ｑであり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
を含む、化合物、または少なくとも１つの化合物に関する。好ましくは、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＱであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。
第１の態様では、本発明は、式Ｉ：
【化3】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
を含む、化合物、または少なくとも１つの化合物に関する。好ましくは、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＱであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。
【0064】
本発明による化合物は、低い衝突エネルギー（例えば、１０ｅＶ～５０ｅＶの範囲、境界は含まれる）で質量フラグメンテーション事象を示す部分を含む。これらの化合物は、全体的にコンパクトな構造を特徴とする。これにより、標識化試薬の単純なモジュール設計が可能になり、電荷含有部分（例えば、ピリジニウム、第四級アンモニウム、イミダゾリウム、トリフェニルホスホニウム、安定な金属錯体、スルホン酸、ボレート、アリールトリフルオロボレート、サルフェート、ホスフェート、．．．）を修飾することによって様々な問題を解決し得るが、永久荷電が好ましい。これにより、試薬の疎水性を微調整して、精製プロセスにおけるサンプルマトリックスの分離を改善し得る。さらに、質量フラグメンテーションは、一次フラグメンテーション経路を優先するために低エネルギーレベルで起こり得る。これにより、ＭＳ／ＭＳモードの感度を高め得る。上記にかかわらず、さらなるフラグメンテーション経路を得るために、さらなるＭＳ実験をより高いエネルギーで実施し得る。
【0065】
本発明の第１の態様の実施形態では、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。
【0066】
本発明の第１の態様の実施形態では、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびシクロヘキシルからなる群から選択される。アルキルは、修飾アルキルを含み得る。修飾アルキルは、構造単位アルキル－Ｏ－アルキル、例えば－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。
【0067】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｎ－アシルアミノは、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、プロピオニルアミノおよびベンゾイルアミノからなる群から選択される。
【0068】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノは、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ－メチルプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ－エチルプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ－ブチルメチルアミノ、Ｎ，Ｎ－ブチルエチルアミノ、Ｎ，Ｎ－ブチルプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジブチルアミノ、Ｎ－アゼチジニル、Ｎ－ピロリジニル、Ｎ－ピペリジニルおよびＮ－ピペラジニルからなる群から選択される。
【0069】
本発明の第１の態様の実施形態では、アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、フェノキシおよびベンジルオキシからなる群から選択される。
【0070】
本発明の第１の態様の実施形態では、チオアルコキシは、チオメチル、チオエチル、チオプロピル、チオブチル、チオペンチルおよびチオヘキシルからなる群から選択される。
【0071】
本発明の第１の態様の実施形態では、アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、フェノキシカルボニルおよびベンジルオキシカルボニルからなる群から選択される。
【0072】
本発明の第１の態様の実施形態では、アルコキシチオカルボニルは、メトキシチオカルボニル、エトキシチオカルボニル、プロポキシチオカルボニル、ブトキシチオカルボニル、フェノキシチオカルボニルおよびベンジルオキシチオカルボニルからなる群から選択される。
【0073】
本発明の第１の態様の実施形態では、アシルは、ホルミル、アセチルおよびプロピオニルからなる群から選択される。
【0074】
本発明の第１の態様の実施形態では、チオアシルは、チオホルミル、チオアセチル、チオプロピオニルおよびチオベンゾイルからなる群から選択される。
【0075】
本発明の第１の態様の実施形態では、アリーロルイルは、ベンゾイル、ナフトイルおよびアントラセノイルからなる群から選択される。
【0076】
本発明の第１の態様の実施形態では、アシルオキシは、ホルミルオキシ、アセチルオキシおよびプロピオニルオキシからなる群から選択される。
【0077】
本発明の第１の態様の実施形態では、アリーロイルオキシは、ベンゾイルオキシ、ナフトイルオキシおよびアントラセノイルオキシからなる群から選択される。
【0078】
本発明の第１の態様の実施形態では、シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルからなる群から選択される。
【0079】
本発明の第１の態様の実施形態では、アリールは、フェニル、ベンジル、ナフチル、アントラセニルおよびフェナスレニルからなる群から選択される。
【0080】
本発明の第１の態様の実施形態では、ヘテロアリールは、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チオフェン、フラン、チアゾール、ピリジン、ピリミジン、ベンゾトリアゾール、ベンゾフランおよびベンゾイミダゾールからなる群から選択される。
【0081】
本発明の第１の態様の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、Ｎ－アゼチジニル、Ｎ－ピロリジニル、Ｎ－ピペリジニルおよびＮ－ピペラジニルからなる群から選択される。
【0082】
本発明の第１の態様の実施形態では、置換芳香族は、メトキシフェニル、シアノフェニルおよびエチルナフチルからなる群から選択される。
【0083】
本発明の第１の態様の実施形態では、アンモニウムまたはその誘導体は－ＮＲ１Ｒ２Ｒ３であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は独立してアルキルまたはアリールであり得る。アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびシクロヘキシルからなる群から選択し得る。アルキルは、修飾アルキルを含み得る。修飾アルキルは、構造単位アルキル－Ｏ－アルキル、例えば－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。アリールは、フェニルまたは修飾フェニル、特にメトキシ置換フェニルである。
【0084】
本発明の第１の態様の実施形態では、ピリジニウムまたはその誘導体は、ブロモピリジン、クロロピリジンおよびメチルピリジンからなる群から選択される。
【0085】
本発明の第１の態様の実施形態では、ホスホニウムまたはその誘導体は－ＰＲ１Ｒ２Ｒ３であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は独立してアルキルまたはアリールであり得る。アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびシクロヘキシルからなる群から選択し得る。アルキルは、修飾アルキルを含み得る。修飾アルキルは、構造単位アルキル－Ｏ－アルキル、例えば－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。アリールは、フェニルまたは修飾フェニル、特にメトキシ置換フェニルである。
【0086】
本発明の第１の態様の実施形態では、式Ｉの化合物は、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、以下の構造を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子と、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子とを含む：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキルまたはアリールから独立して選択される）。アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびシクロヘキシルからなる群から選択し得る。アルキルは、修飾アルキルを含み得る。修飾アルキルは、構造単位アルキル－Ｏ－アルキル、例えば－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。アリールは、フェニルまたは修飾フェニル、特にメトキシ置換フェニルである。Ｒ４は、ｎ＝０、１または２である（ＣＨ２）ｎ－Ｋであり、Ｋは、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、Ｂｒ、Ｆ芳香族、４－置換１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＴＡＤ）、活性エステル、塩化スルホニルおよび反応性カルボニルからなる群から選択される。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は、上記もしくは下記および／または請求項１に記載のものと同じ意味を有する。
【化4】
【化5】
【化6】
【0087】
本発明の第１の態様の実施形態では、式Ｉの化合物はカップリング基Ｑを含む。式Ｉの置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４またはＢ５の少なくとも１つはカップリング基Ｑである。好ましくは、Ｂ２またはＢ３またはＢ４はＱである。
【0088】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＱであり、Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。「Ｑは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない」という用語は、本明細書において、本開示の文脈において、ＱがＯもしくはＮもしくはＳもしくはＢｒまたはそれらの組み合わせを含まないことを意味する。特に、Ｑは、Ｏ、Ｎ、ＳおよびＢｒを含まない。特に、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１がＱである場合、ＱはＯ、Ｎ、ＳおよびＢｒを含まない。あるいは、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ５がＱである場合、ＱはＯ、Ｎ、ＳおよびＢｒを含まない。
【0089】
本発明の第１の態様の実施形態では、カップリング基Ｑは、以下の式ＩＩ：
（式中、Ｋは、分析物と共有結合を形成し得る反応性ユニットであり、
ｎは、０、１、２、３、４または５であり、
Ｘは式Ｉのフェニル基の炭素原子である）
によるＸに結合している。
【化7】
ｎは、０、１、２、３、４または５であり、
Ｘは式Ｉのフェニル基の炭素原子である）
によるＸに結合している。
【0090】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｑは、質量フラグメンテーションを引き起こすものよりも低いエネルギーレベルでフラグメンテーションを示さない。
【0091】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｑは共有結合を介してＸに結合する。
【0092】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｑは、メチルヒドラジド、メチルヒドラジン、メチルヒドロキシルアミン、オキシアミン、４－メチル－オキシ－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＣＨ２－Ｏ－ＴＡＤ）、２，４－ジニトロ－５－フルオロアニリン誘導体、クロルスルホニルおよびメタンスルホニルクロリドからなる群から選択される。
【0093】
本発明の第１の態様の実施形態では、式Ｉのフェニル基の炭素原子Ｘは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４またはＢ５の結合パートナーである。
【0094】
本発明の第１の態様の実施形態では、前記化合物は、以下の群Ｉ－１、Ｉ－２、Ｉ－３、Ｉ－４およびＩ－５から選択される。
（式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、ＱおよびＸは上記の意味を有する）。好ましくは、化合物は、式Ｉ－２、Ｉ－３またはＩ－４を含む。
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【0095】
本発明の第１の態様の実施形態では、本発明による式Ｉの化合物は、分析物または分析物分子と反応し得る反応性ユニットＫを含む。反応性ユニットＫは、式Ｉの化合物と分析物分子との間に共有結合が形成されるように、分析物分子と反応し得る。好ましくは、共有結合は単結合または二重結合である。
【0096】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、式Ｉの化合物と共有結合を形成する。特に、共有結合は、式Ｉの化合物の反応性ユニットＫと分析物分子中に存在する官能基との間に形成される。
【0097】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋは、分析物のカルボニル基、フェノール基、アミン、ヒドロキシル基またはジエン基と反応し得る。
【0098】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋは、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、Ｂｒ、Ｆ芳香族、４－置換－１，２，４トリアゾリン－３，５－ジオン（ＴＡＤ）、活性エステル、塩化スルホニルおよび反応性カルボニルからなる群から選択される。
【0099】
本発明の第１の態様の実施形態では、ＫはＸに直接結合している（ｎ＝０）。
【0100】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋはメチレン基を介してＸに結合している（ｎ＝１）。
【0101】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋはエチレン基を介してＸに結合している（ｎ＝２）。
【0102】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋはプロピレン基を介してＸに結合している（ｎ＝３）。
【0103】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋはブチレン基を介してＸに結合している（ｎ＝４）。
【0104】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋはペンチレン基を介してＸに結合している（ｎ＝５）。
【0105】
測定される分析物分子中に存在する官能基に応じて、当業者は、式Ｉの化合物に適切な反応性ユニットＫを選択するであろう。どの反応性ユニットＫが目的の分析物の官能基への結合に適格であるかを決定することは、一般的な知識の範囲内である。
【0106】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、カルボニル基、ジエン基、ヒドロキシル基、アミン基、イミン基、ケトン基、アルデヒド基、チオール基、ジオール基、フェノール基、エポキシ基、ジスルフィド基、核酸塩基基、カルボン酸基、末端システイン基、末端セリン基およびアジド基からなる群から選択される官能基を含み、それぞれが式Ｉの化合物の反応性ユニットＫと共有結合を形成し得る。さらに、分析物分子上に存在する官能基が最初に式Ｉの化合物の反応性ユニットＫとの反応により容易に利用可能な別の基に変換されることも本発明の範囲内で考えられる。
【0107】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、小分子代謝物および補因子、ならびに治療薬、依存性薬物、毒素、またはそれらの代謝産物を含む、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪酸、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、および他の生体分子からなる群から選択される。
【0108】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、カルボン酸基、アルデヒド基、ケト基、マスクされたアルデヒド、マスクされたケト基、エステル基、アミド基、および無水基からなる群より選択される官能基としてのカルボニル基を含む。アルドース（アルデヒドおよびケト）は、親アルデヒド／ケトの一種のマスクされた形態であるアセタールおよびヘミアセタールとして存在する。
【0109】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基はアミド基であり、当業者は、アミド基自体が安定な基であるが、アミド基を加水分解してカルボン酸基およびアミノ基に変換し得ることをよく知っている。アミド基の加水分解は、酸／塩基触媒反応を介して、またはいずれかが当業者によく知られている酵素プロセスによって達成し得る。カルボニル基がマスクされたアルデヒド基またはマスクされたケト基である本発明の第１の態様の実施形態では、それぞれの基は、ヘミアセタール基またはアセタール基、特に環状ヘミアセタール基またはアセタール基のいずれかである。本発明の第１の態様の実施形態では、アセタール基は、式Ａの化合物との反応の前に、アルデヒド基またはケト基へと変換される。
【0110】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、ケト基である。本発明の第１の態様の実施形態では、ケト基は、式Ｉの化合物の反応性ユニットと反応する前に中間体イミン基に転移されてもよい。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のケト基を含む分析物分子は、ケトステロイドである。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ケトステロイドは、テストステロン、エピテストステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、デスオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、アルドステロン、エストロン、４－ヒドロキシエストロン、２－メトキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン、１６ケトエストラジオール、１６－アルファ－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、１７－ヒドロキシプレグネノロン、１７－ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Δ４－アンドロステンジオン、１１－デオキシコルチゾール、２１－デオキシコルチゾール、１１－デオキシコルチコステロン、アロプレグナノロンおよびアルドステロンからなる群から選択される。
【0111】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、カルボキシ基である。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボキシル基は、式Ｉの化合物と直接反応するか、または式Ｉの化合物と反応する前に活性化エステル基に変換される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のカルボキシル基を含む分析物分子は、Δ８－テトラヒドロカンナビノール酸、ベンゾイルエクゴニン、サリチル酸、２－ヒドロキシ安息香酸、ガバペンチン、プレガバリン、バルプロ酸、バンコマイシン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、モンテルカスト、レパグリニド、フロセミド、テルミサルタン、ゲムフィブロジル、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、ゾメピラク、イソキセパックおよびペニシリンからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のカルボキシル基を含む分析物分子は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、およびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0112】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、アルデヒド基である。本発明の第１の態様の実施形態では、式Ｉの化合物の反応性ユニットと反応する前に、アルデヒド基を中間体イミン基に転移させ得る。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアルデヒド基を含む分析物分子は、ピリドキサール、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、アルカフタジン、ストレプトマイシンおよびジョサマイシンからなる群から選択される。
【0113】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、カルボニルエステル基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のエステル基を含む分析物分子は、コカイン、ヘロイン、リタリン、アセクロフェナク、アセチルコリン、アムシノニド、アミロキサート、アミロカイン、アニレリジン、アルニジピンアルテスネートおよびペチジンからなる群から選択される。
【0114】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、無水基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上の無水基を含む分析物分子は、カンタリジン、無水コハク酸、無水トリメリット酸、および無水マレイン酸からなる群から選択される。
【0115】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のジエン基、特にコンジュゲートしたジエン基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジエン基を含む分析物分子は、セコステロイドである。実施形態では、セコステロイドは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、カルシフェジオール、カルシトリオール、タキステロール、ルミステロールおよびタカルシトールからなる群から選択される。特に、セコステロイドは、ビタミンＤ、特にビタミンＤ２もしくはＤ３、またはそれらの誘導体である。特定の実施形態では、セコステロイドは、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３（カルシフェジオール）、３－ｅｐｉ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、３－ｅｐｉ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ２、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）、２４，２５ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５ジヒドロキシビタミンＤ３からなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジエン基を含む分析物分子は、ビタミンＡ、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、ナタマイシン、シロリムス、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、エベロリムス、テムシロリムスおよびフィダキソミシンからなる群から選択される。
【0116】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のヒドロキシル基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、単一のヒドロキシル基または２つのヒドロキシル基を含む。複数のヒドロキシル基が存在する実施形態では、２つのヒドロキシル基（１，２ジオール）は、互いに隣接して位置していてもよく、または１、２、もしくは３個のＣ原子（それぞれ、１，３－ジオール、１，４－ジオール、１，５－ジオール）によって分離されていてもよい。第１の態様の特定の実施形態では、分析物分子は１，２－ジオール基を含む。１つのヒドロキシル基のみが存在する実施形態では、該分析物は、第一級アルコール、第二級アルコール、および第三級アルコールからなる群から選択される。分析物分子が１つ以上のヒドロキシル基を含む本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、ベンジルアルコール、メントール、Ｌ－カルニチン、ピリドキシン、メトロニダゾール、一硝酸イソソルビド、グアイフェネシン、クラブラン酸、ミグリトール、ザルシタビン、イソプレナリン、アシクロビル、メトカルバモール、トラマドール、ベンラファキシン、アトロピン、クロフェダノール、アルファ－ヒドロキシアルプラゾラム、アルファ－ヒドロキシトリアゾラム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、エチルグルクロニド、エチルモルヒネ、モルヒネ、モルヒネ－３－グルクロニド、ブプレノルフィン、コデイン、ジヒドロコデイン、ｐ－ヒドロキシプロポキシフェン、Ｏ－デスメチルトラマドール、デスメタドール、ジヒドロキニジンおよびキニジンからなる群から選択される。分析物分子が１つを超えるヒドロキシル基を含む本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、ビタミンＣ、グルコサミン、マンニトール、テトラヒドロビプテリン、シタラビン、アザシチジン、リバビリン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ストレプトゾトシン、アデノシン、ビダラビン、クラドリビン、エストリオール、トリフルリジン、クロファラビン、ナドロール、ザナミビル、ラクツロース、アデノシンモノホスフェート、イドクスウリジン、レガドノソン、リンコマイシン、クリンダマイシン、カナグリフロジン、トブラマイシン、ネチルマイシン、カナマイシン、チカグレロル、エピルビシン、ドキソルビシン、アルベカシン、ストレプトマイシン、ウアバイン、アミカシン、ネオマイシン、フラミセチン、パロモマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ビンデシン、ジギトキシン、ジゴキシン、メトリザミド、アセチルジギトキシン、デスラノシド、フルダラビン、クロファラビン、ゲムシタビン、シタラビン、カペシタビン、ビダラビン、およびプリカマイシンからなる群から選択される。
【0117】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のチオール基（アルキルチオールおよびアリールチオール基を含むがこれらに限定されない）を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のチオール基を含む分析物分子は、チオマンデル酸、ＤＬ－カプトプリル、ＤＬ－チオルファン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｄ－ペニシラミン、グルタチオン、Ｌ－システイン、ゾフェノプリラート、チオプロニン、ジメルカプロール、スクシマーからなる群から選択される。
【0118】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のジスルフィド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジスルフィド基を含む分析物分子は、グルタチオンジスルフィド、ジピリチオン、硫化セレン、ジスルフィラム、リポ酸、Ｌ－シスチン、フルスルチアミン、オクトレオチド、デスモプレシン、バプレオチド、テルリプレシン、リナクロチドおよびペジネサチドからなる群から選択される。硫化セレンは、二硫化セレン、ＳｅＳ２、または六硫化セレン、Ｓｅ２Ｓ６であり得る。
【0119】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のエポキシド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のエポキシド基を含む分析物分子は、カルバマゼピン－１０，１１－エポキシド、カルフィルゾミブ、フロセミドエポキシド、ホスホマイシン、塩酸セベラマー、セルレニン、スコポラミン、チオトロピウム、チオトロピウムブロミド、メチルスコポラミンブロミド、エプレレノン、ムピロシン、ナタマイシン、およびトロレアンドマイシンからなる群から選択される。
【0120】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のフェノール基を含む。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、１つ以上のフェノール基を含む分析物分子は、ステロイドまたはステロイド様の化合物である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のフェノール基を含む分析物分子は、ｓｐ２ハイブリダイズされたＡ環と、Ａ環の３位におけるＯＨ基とを有するステロイドまたはステロイド様化合物である。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ステロイドまたはステロイド様分析物分子は、エストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、１７ａ－エストラジオール、１７ｂ－エストラジオール、エストリオール（Ｅ３）、１６－エピエストリオール、１７－エピエストリオール、および１６，１７－エピエストリオールおよび／またはそれらの代謝産物からなる群から選択される。実施形態では、代謝産物は、エストリオール、１６－エピエストリオール（１６－ｅｐｉＥ３）、１７－エピエストリオール（１７－ｅｐｉＥ３）、１６，１７－エピエストリオール（１６，１７－ｅｐｉＥ３）、１６－ケトエストラジオール（１６－ケトＥ２）、１６ａ－ヒドロキシエストロン（１６ａ－ＯＨＥｌ）、２－メトキシエストロン（２－ＭｅＯＥｌ）、４－メトキシエストロン（４－ＭｅＯＥ１）、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル（３－ＭｅＯＥｌ）、２－メトキシエストラジオール（２－ＭｅＯＥ２）、４－メトキシエストラジオール（４－ＭｅＯＥ２）、２－ヒドロキシエストロン（２－ＯＨＥ１）、４－ヒドロキシエストロン（４－ＯＨＥ１）、２－ヒドロキシエストラジオール（２－ＯＨＥ２）、エストロン（Ｅ１）、硫酸エストロン（Ｅｌ）、１７ａ－エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７ｂ－エストラジオール（Ｅ２Ｂ）、硫酸エストラジオール（Ｅ２Ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７ａ－ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７ｂ－ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７－ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７α－ジヒドロエキレニン、１７β－ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９－デヒドロエストロン（ｄＥｌ）、Δ８，９－デヒドロエストロン硫酸（ｄＥｌ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール、ミコフェノール酸からなる群から選択される。βまたはｂは交換可能に使用し得αおよびａは交換可能に使用し得る。
【0121】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基としてアミン基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、アミン基は、アルキルアミン基またはアリールアミン基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアミン基を含む分析物分子は、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、アミン基を含む分析物分子は、３，４－メチレンジオキシアンフェタミン、３，４－メチレンジオキシ－Ｎ－エチルアンフェタミン、３，４－メチレンジオキシメタンフェタミン、アンフェタミン、メタンフェタミン、Ｎ－メチル－１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、７－アミノクロナゼパム、７－アミノフルニトラゼパム、３，４－ジメチルメトカチノン、３－フルオロメトカチノン、４－メトキシメトカチノン、４－メチルエトタカチノン、４－メチルメチルメトカチノン、アンフェプラモン、ブチロン、エトカチノン、エレフェヘドロン、メトカチノン、メチロン、メチレンジオキシピロバレロン、ベンゾイルエクゴニン、デヒドロノルケタミンン、ケタミン、ノルケタミン、メサドン、ノルメサドン、６－アセチルモルヒネ、ジアセチルモルヒネ、モルヒネ、ノルヒドロコドン、オキシコドン、オキシモルホン、フェンシクリジン、ノルプロポキシフェン、アミトリプチリン、クロミプラミン、ドチエピン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、トリミプラミン、フェンタニル、グリシルキシリジド、リドカイン、モノエチルグリシルキシリジド、Ｎ－アセチルプロカインアミド、プロカインアミド、プレガバリン、２－メチルアミノ－１－（３，４－メチレンジオキシフェニル）ブタン、Ｎ－メチル－１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、２－アミノ－１－（３，４－メチレンジオキシフェニル）ブタン、１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、ノルメペリジン、Ｏ－デストラマドール、デスメタマドール、トラマドール、ラモトリギン、テオフィリン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バンコマイシン、メトトレキサート、ガバペンチンシソマイシンおよび５－メチルシトシンからなる群から選択される。
【0122】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、炭水化物、または例えば糖タンパク質またはヌクレオシドなど炭水化物部分を有する物質である。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は単糖類、特に、リボース、デソキシリボース、アラビノース、リブロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸等からなる群から選択される。実施形態では、分析物分子は、オリゴ糖、特に、二糖、三糖、四糖、多糖からなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、二糖類は、スクロース、マルトース、およびラクトースからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、上述の単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類部分を含む物質である。
【0123】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、アルキルまたはアリールアジドからなる基から選択される官能基としてアジド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアジド基を含む分析物分子は、ジドブジンおよびアジドシリンからなる群から選択される。
【0124】
そのような分析物分子は、体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液など、組織または細胞抽出物などの生物学的または臨床サンプル中に存在し得る。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、および乾燥血液スポットからなる群から選択される生物学的または臨床サンプル中に存在する。本発明の第１の態様のいくつかの実施形態では、分析物分子は、精製されたまたは部分的に精製されたサンプル、例えば、精製されたまたは部分的に精製されたタンパク質混合物または抽出物であるサンプル中に存在し得る。
【0125】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、カルボニル反応性ユニット、ジエン反応性ユニット、ヒドロキシル反応性ユニット、アミノ反応性ユニット、イミン反応性ユニット、チオール反応性ユニット、ジオール反応性ユニット、フェノール反応性ユニット、エポキシド反応性ユニット、ジスルフィド反応性ユニット、およびアジド反応性ユニットからなる群から選択される。
【0126】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫはカルボニル反応性ユニットであり、カルボニル基を有する任意の種類の分子と反応し得る。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル反応性ユニットは、カルボキシル反応性ユニット、ケト反応性ユニット、アルデヒド反応性ユニット、無水物反応性ユニット、カルボニルエステル反応性ユニット、およびイミド反応性ユニットからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル反応性ユニットは、隣接するＯもしくはＮ原子ＮＨ２－Ｎ／Ｏ、またはジチオール分子を介したα効果によって強化された超求核性Ｎ原子のいずれかを有し得る。
【0127】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル反応性ユニットは、以下の群：
（ｉ）ヒドラジンユニット、例えばＨ２Ｎ－ＮＨ－またはＨ２Ｎ－ＮＲ１－ユニット（式中、Ｒ１は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１～３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、特にカルボヒドラジドまたはスルホヒドラジドユニット、特にＨ２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－またはＨ２Ｎ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ユニット（式中、Ｒ２は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１－３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、例えばＨ２Ｎ－Ｏ－ユニット、
（ｉｖ）ジチオールユニット、特に１，２－ジチオールまたは１，３－ジチオールユニット
から選択される。
（ｉ）ヒドラジンユニット、例えばＨ２Ｎ－ＮＨ－またはＨ２Ｎ－ＮＲ１－ユニット（式中、Ｒ１は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１～３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、特にカルボヒドラジドまたはスルホヒドラジドユニット、特にＨ２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－またはＨ２Ｎ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ユニット（式中、Ｒ２は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１－３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、例えばＨ２Ｎ－Ｏ－ユニット、
（ｉｖ）ジチオールユニット、特に１，２－ジチオールまたは１，３－ジチオールユニット
から選択される。
【0128】
カルボニル反応性ユニットがカルボキシル反応性ユニットである本発明の第１の態様の実施形態では、カルボキシル反応性ユニットは、分析物分子上のカルボキシル基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボキシル反応性ユニットは、ジアゾユニット、ハロゲン化アルキル、アミン、およびヒドラジンユニットからなる群から選択される。
【0129】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子はケトンまたはアルデヒド基を含み、Ｋはカルボニル反応性ユニットであり、以下の群：
（ｉ）ヒドラジンユニット、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、および
（ｉｖ）ジチオールユニット
から選択される。
（ｉ）ヒドラジンユニット、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、および
（ｉｖ）ジチオールユニット
から選択される。
【0130】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、ジエン基を含む分析物と反応し得るジエン反応性ユニットである。
【0131】
本発明の第１の態様の実施形態では、ジエン反応性ユニットは、ジエノフィルとして作用し得コックソン型試薬、例えば１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンからなる群から選択される。
【0132】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、ヒドロキシル基を含む分析物と反応し得るヒドロキシル反応性ユニットである。本発明の第１の態様の実施形態では、ヒドロキシル反応性ユニットは、塩化スルホニル、活性化カルボン酸エステル（ＮＨＳまたはイミダゾリド）、およびフッ素の求核置換が可能なフルオロ芳香族／ヘテロ芳香族からなる群より選択される（Ｔ．Ｈｉｇａｓｈｉ、「Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．」（２０１６年９月）第１６２巻第５７～６９頁）。本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、分析物分子上のジオール基と反応するジオール反応性ユニットである。反応性ユニットが１，２ジオール反応性ユニットである本発明の第１の態様の実施形態では、１，２ジオール反応性ユニットは、ボロン酸を含む。更なる実施形態では、ジオールは、それぞれのケトンまたはアルデヒドに酸化され得、次いで、ケトン／アルデヒド反応性ユニットＫと反応され得る。
【0133】
本発明の第１の態様の実施形態では、アミノ反応性ユニットは、分析物分子上のアミノ基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、アミノ反応性ユニットは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルまたはスルホ－ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カボニルイミダゾールエステル、スクアリン酸エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル、および塩化スルホニルユニットなどの活性エステル基からなる群から選択される。
【0134】
本発明の第１の態様の実施形態では、チオール反応性ユニットは、分析物分子上のチオール基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、チオール反応性ユニットは、特にＢｒ／Ｉ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ユニット、アクリルアミド／エステルユニット、マレイミド、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール、および塩化スルホニルユニットなどの不飽和イミドユニットからなる群から選択される、ハロアセチル基からなる群から選択される。
【0135】
本発明の第１の態様の実施形態では、フェノール反応性ユニットは、分析物分子上のフェノール基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、フェノール反応性ユニットは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルまたはスルホ－ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カボニルイミダゾールエステル、スクアリン酸エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル、および塩化スルホニルユニットなどの活性エステルユニットからなる群から選択される。分析物分子上に存在するフェノール基は、反応（Ｈ．Ｂａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１０，１３２（５），ｐｐ １５２３－１５２５）を介して、またはジアゾ化によって、またはオルトニトロ化とそれに続くアミンへの還元によってトリアゾリンジオン（ＴＡＤなど）のような高反応性求電子剤と反応させ得、次いでアミン反応性試薬と反応させ得る。本発明の第１の態様の実施形態では、フェノール反応性ユニットはフルオロ－１－ピリジニウムである。
【0136】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、エポキシド基を含む分析物と反応し得るエポキシド反応性ユニットである。本発明の第１の態様の実施形態では、エポキシド反応性ユニットは、隣接するＯもしくはＮ原子ＮＨ２－Ｎ／Ｏ分子を介したα効果によって強化された、アミノ、チオール、超求核性Ｎ原子からなる群から選択される。
【0137】
本発明の第１の態様の実施形態では、エポキシド反応性ユニットは、以下の群：
（ｉ）ヒドラジンユニット、例えばＨ２Ｎ－ＮＨ－またはＨ２Ｎ－ＮＲ１－ユニット（式中、Ｒ１は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１～３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、特にカルボヒドラジドまたはスルホヒドラジドユニット、特にＨ２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－またはＨ２Ｎ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ユニット（式中、Ｒ２は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１－３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、例えばＨ２Ｎ－Ｏ－ユニット
から選択される。
（ｉ）ヒドラジンユニット、例えばＨ２Ｎ－ＮＨ－またはＨ２Ｎ－ＮＲ１－ユニット（式中、Ｒ１は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１～３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、特にカルボヒドラジドまたはスルホヒドラジドユニット、特にＨ２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－またはＨ２Ｎ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ユニット（式中、Ｒ２は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、またはＣ１－４アルキル、特にＣ１またはＣ２アルキルであり、場合により例えば、ハロ、ヒドロキシル、および／またはＣ１－３アルコキシで置換されている）、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、例えばＨ２Ｎ－Ｏ－ユニット
から選択される。
【0138】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、ジスルフィド基を含む分析物と反応し得るジスルフィド反応性ユニットである。本発明の第１の態様の実施形態では、ジスルフィド反応性ユニットは、チオールからなる群から選択される。更なる実施形態では、ジスルフィド基は、それぞれのチオール基に還元され、次いで、チオール反応性ユニットＫと反応し得る。
【0139】
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、分析物分子上のアジド基と反応するアジド反応性ユニットである。本発明の第１の態様の実施形態では、アジド反応性ユニットは、アジド－アルキン環化付加によりアジド基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、アジド反応性ユニットは、アルキン（アルキルまたはアリール）、線形アルキン、または環状アルキンからなる群から選択される。アジドとアルキンとの間の反応は、触媒の使用の有無にかかわらず進行することができる。本発明の第１の態様の更なる実施形態では、アジド基はそれぞれのアミノ基に還元され得、次いで、アミノ反応性ユニットＫと反応し得る。
【0140】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物の官能基は、表１の左の列に記載されている選択肢から選択される。分析物の対応する官能基のＫの反応性基は、表１の右の列に記載の基から選択される。
【表1】
【0141】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＫであり、ｎは３、４または５である。
【0142】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はＫであり、Ｋは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。「Ｋは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない」という用語は、本開示の文脈において、ＫがＯまたはＮまたはＳまたはＢｒまたはそれらの組み合わせを含まないことを意味する。特に、Ｋは、Ｏ、Ｎ、ＳおよびＢｒを含まない。
【0143】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ３は、ピリジニウム、トリメチルアンモニウム、ホスホニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、ジメチルエチルアンモニウム、メチルジエチルアンモニウムおよびトリアルキルアンモニウムからなる群から選択される。
【0144】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ３はＮＲ１Ｒ２Ｒ３またはＰＲ４Ｒ５Ｒ６であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、置換フェニル、非置換フェニル、アルキル、修飾アルキル、短鎖アルキルから選択される。
【0145】
特に、短鎖アルキルは、アルキル鎖中に１、２、３、４、５または６個のＣ原子を含む。
【0146】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、ＯＲ７、ＮＲ８Ｒ９、Ｈ、脂肪族から選択され、式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、置換フェニル、非置換フェニル、アルキル、修飾アルキル、短鎖アルキルから選択される。
【0147】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ１、Ａ２は、それぞれ独立して、Ｈ、脂肪族基、芳香族基から選択される。
【0148】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ１はＨまたはＣＨ３である。
【0149】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ２はＨまたはＣＨ３である。
【0150】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ１はＨであり、Ａ２はＨであり、Ａ３はピリジニウムである。
【0151】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。
【0152】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ２はＱである。
【0153】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ４はＱである。
【0154】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ１はＨまたはメトキシである。
【0155】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ２はＨまたはメトキシである
【0156】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ４はＨまたはメトキシである。
【0157】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ５はＨまたはメトキシである。
【0158】
本発明の第１の態様の実施形態では、ＱはＦを含む。
【0159】
本発明の第１の態様の実施形態では、ｎは０である。
【0160】
本発明の第１の態様の実施形態では、ｎは１である。
【0161】
本発明の第１の態様の実施形態では、ｎは０または１であり、Ｋはヒドラジドである。
【0162】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝メチルピリジニウム、Ｂ１＝Ｈ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝Ｈである。
【0163】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝メチルピリジニウム、Ｂ１＝Ｈ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝メトキシである。
【0164】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝メチルピリジニウム、Ｂ１＝メトキシ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝Ｈである。
【0165】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝メチルピリジニウム、Ｂ１＝Ｈ、Ｂ２＝メトキシ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝Ｈである。
【0166】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝メチルピリジニウム、Ｂ１＝メトキシ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝メトキシである。
【0167】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝メチルピリジニウム、Ｂ１＝メトキシ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝メトキシおよびＢ５＝メトキシである。
【0168】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝アンモニウム、Ｂ１＝Ｈ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝Ｈである。
【0169】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝アンモニウム、Ｂ１＝Ｈ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝メトキシである。
【0170】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ４はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝アンモニウム、Ｂ１＝メトキシ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ３＝ＨおよびＢ５＝Ｈである。
【0171】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ４はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝アンモニウム、Ｂ１＝Ｈ、Ｂ２＝メトキシ、Ｂ３＝ＨおよびＢ５＝Ｈである。
【0172】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、以下の群：ヒドラジン単位、メチルヒドラジン単位、エチルヒドラジン単位、ヒドラジド単位、メチルヒドラジド単位、エチルヒドラジド単位、ヒドロキシルアミノ単位から選択される。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝アンモニウム、Ｂ１＝メトキシ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝メトキシである。
【0173】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｂ３はＱである。Ｑは、ＣＨ２－Ｂｒ、ＴＡＤまたはＳＯ２Ｃｌである。Ｑではない他の置換基は、Ａ１＝Ｈ、Ａ２＝Ｈ、Ａ３＝メチルピリジニウムまたはアンモニウム、Ｂ１＝Ｈ、Ｂ２＝Ｈ、Ｂ４＝ＨおよびＢ５＝Ｈである。
【0174】
本発明の第１の態様の実施形態では、カップリング基Ｑを形成していない他の置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、Ｎ，Ｎジメチルアミン、エトキシまたはメトキシから選択される。
【0175】
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は永久に正に帯電している。
【0176】
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は単純に永久的に正に帯電している。
【0177】
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、二重または三重に永久に正に帯電している。
【0178】
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、塩を形成するための対イオンを含み、対イオンは、好ましくは以下の群から選択される。Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｆ－、ギ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ＰＦ６
－、スルホン酸塩、リン酸塩、酢酸塩。
【0179】
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、
以下の式：
を含む。
以下の式：
【化13】
【0180】
本発明の第１の態様の実施形態では、式Ｉの化合物は、以下の群から選択される（表２参照）。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0181】
上記ラベル１～２５のそれぞれは、単独でまたは対イオンと組み合わせて化合物を形成し得る。
【0182】
ベンジル位での中性損失フラグメンテーション後のカルボカチオンの安定化は、低エネルギーでの中性損失を可能にし、高いシグナル増強を可能にする非常に優勢なフラグメンテーション経路を与える。いくつかの実施形態では、特にメタ置換パターン（Ｂ２またはＢ４はＱである）を用いて、好ましいＬＣ溶出特性を観察し得る。ヒドラジドまたはオキシム（例えば、テストステロン標識化）で形成し得る２種のＥ／Ｚ立体異性体のいずれか１つが主に生成されるか、または両方の異性体が共溶出する。これにより、信号対雑音比Ｓ／Ｎが向上するため、感度が向上する。電子供与性置換基Ｂ１～Ｂ５（例えば、ＯＭｅ）は、より低いエネルギーでのフラグメンテーションを可能にする。特に高い信号増強は、Ａ１、Ａ２＝Ｈ、Ｂ１～Ｂ５＝Ｈ、ｎ＝１およびＫ＝ヒドラジド（１）で達成され得る。中性損失フラグメンテーション後に正電荷を有する炭素原子における脂肪族（例えば、メチル）および芳香族（例えば、フェニルまたは置換類似体）修飾Ａ１およびＡ２は、低エネルギー（例えば、１または２：Ｒ１、Ｒ２＝Ｍｅ、Ｐｈ）でのフラグメンテーションを可能にする。
【0183】
本発明の第１の態様の実施形態では、Ａ１、Ａ２のそれぞれは、互いに独立して、Ｈ、脂肪族（例えば、Ｍｅ）または芳香族（例えばフェニル）であり、Ａ３は、ＮＲ’３（Ｒ’、例えばＭｅ）、ピリジンまたはＰＲ’’３（Ｒ’’、例えばＭｅ、Ｐｈ）であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のそれぞれは、互いに独立して、ＯＲ’、ＮＲ’２、Ｈまたは脂肪族（例えば、Ｍｅ）である。Ｋは、抱合可能な基、例えば、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ブロモ、ＰＴＡＤまたはＴＡＤである。
【0184】
本発明の第１の態様の実施形態では、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つ超がカップリング基Ｑであり、例えば、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５の２、３または４つがカップリング基Ｑである。言い換えれば、式Ｉの化合物は、１つを超えるＱ、例えば第１のＱ、第２のＱまたは第３のＱを含み、Ｑは互いに構造的に異なっていてもよく、または互いに構造的に等しくてもよい。第１、第２、第３、第４または第５のＱは、Ｑについて上述した実施形態から互いに独立して選択し得る。
【0185】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に関して前記に詳細に開示された式Ｉの化合物を含む組成物に関する。本発明の第１の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第２の態様に適用され、逆もまた同様である。
【0186】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に関して本明細書で前記に詳細に開示される式Ｉの化合物、または本明細書で前記に詳細に開示される本発明の第２の態様の組成物を含むキットに関する。本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第３の態様に適用され、その逆も同様である。
【0187】
第４の態様では、本発明は、互いに共有結合した結合性分析物および結合性化合物を含む質量分析を用いて分析物を検出するための複合体に関し、特に、複合体は、分析物と本発明の第１の態様の化合物との化学反応によって形成される。特に、分析物は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾に特徴的な分子、生物によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第４の態様に適用され、逆もまた同様である。
【0188】
本発明の第４の態様の実施形態では、式ＩＩＩの結合複合体は、式Ｉの化合物と分析物分子中に存在する官能基との間の共有結合の形成に起因する。式Ｉの化合物の反応性ユニットＫおよび分析物分子の官能基に応じて、当業者は、２つの間に形成される共有結合を十分に決定し得る。
【0189】
本発明の第４の態様の実施形態では、結合化合物は、式ＩＩＩ
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成するカップリング基Ｑ＊であり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
カップリング基Ｑ＊が式ＩＶを含む：
（式中、ｎ＊は０、１、２、３、４、または５であり；
結合分析物は、Ｋ＊を介して共有結合しており、
Ｘ＊は式ＩＩＩのフェニル基の炭素原子であり、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む））
を含む。
【化14】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
カップリング基Ｑ＊が式ＩＶを含む：
【化15】
結合分析物は、Ｋ＊を介して共有結合しており、
Ｘ＊は式ＩＩＩのフェニル基の炭素原子であり、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む））
を含む。
【0190】
本発明の第４の態様の実施形態では、Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がＱ＊であり、Ｑ＊がＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。「Ｑ＊が、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない」という用語は、本明細書において、本開示の文脈において、Ｑ＊がＯもしくはＮもしくはＳもしくはＢｒまたはそれらの組み合わせを含まないことを意味する。
【0191】
本発明の第４の態様の実施形態では、式ＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のそれぞれは、本発明の第１の態様について上述した（式ＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５）のと同じ意味を有する。
【0192】
本発明の第４の態様の実施形態では、Ｘ＊は、本発明の第１の態様について上述したＸと同じ意味を有する。
【0193】
本発明の第４の態様の実施形態では、Ｋ＊は、式Ｉの化合物の反応性ユニットＫと分析物分子中に存在する官能基との間の共有結合の形成に起因する。式Ｉの化合物の反応性ユニットＫおよび分析物分子の官能基に応じて、当業者は、２つの間に形成される共有結合を十分に決定し得る。共有結合を充十分に決定し得る。
【0194】
さらに、分析物分子上に存在する官能基が最初に式Ｉの化合物の反応性ユニットＫとの反応により容易に利用可能な別の基に変換されることも本発明の範囲内で考えられる
【0195】
本発明の第４の態様の実施形態では、分析物は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾に特徴的な分子、生物によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0196】
発明の第４の態様の実施形態では、分析物分子は、カルボニル基、ジエン基、ヒドロキシル基、アミン基、イミン基、チオール基、ジオール基、フェノール基、エキポキシド基、ジスルフィド基、およびアジド基からなる群から選択される官能基を含み、これらの各々は、式Ｉの化合物の反応性ユニットＫと共有結合を形成し得る。
【0197】
本発明の第４の態様の実施形態では、分析物分子は、小分子代謝物および補因子、ならびに治療薬、依存性薬物、毒素、またはそれらの代謝産物を含む、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪酸、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、および他の生体分子からなる群から選択される。
【0198】
本発明の第１の態様について述べた分析物の全ての実施形態は、本発明の第４の態様に適用され、逆もまた同様である。
【0199】
本発明の第４の態様の実施形態では、結合化合物は、分析物のカルボニル基、ヒドロキシル基またはジエン基を介して共有結合して、前記複合体を形成する。
【0200】
第５の態様では、本発明は、分析物の質量分析決定のための式Ｉの化合物の使用に関する。好ましくは、質量分析決定は、タンデム質量分析決定、特にトリプル四重極質量分析決定を含む。本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様および／または本発明の第４の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第５の態様に適用され、逆もまた同様である。
【0201】
本発明の第５の態様の実施形態では、質量分析決定は、タンデム質量分析決定、特にトリプル四重極質量分析決定を含む。
【0202】
本発明の第５の態様の実施形態では、式Ｉの化合物の使用は、誘導体化試薬としての使用を含む。本発明の第５の態様の実施形態では、式Ｉの化合物を使用してＭＳ測定の感度を高める。実施形態では、式Ｉの化合物を使用して、より低い検出レベル、特により低い定量レベルで目的の分析物を検出する。
【0203】
本発明の第５の態様の実施形態では、本発明による式Ｉの化合物は、分析物分子と反応し得る反応性ユニットＫを含む。反応性ユニットＫは、式Ｉの化合物と分析物分子との間に共有結合が形成されるように、分析物分子と反応し得る。本発明の第５の態様の実施形態では、反応性ユニットＫは、式Ｉの化合物と共有結合を形成する。特に、共有結合は、式Ｉの化合物の反応性ユニットＫと分析物分子中に存在する官能基との間に形成される。
【0204】
測定される分析物分子中に存在する官能基に応じて、当業者は、式Ｉの化合物に適切な反応性ユニットＫを選択するであろう。どの反応性ユニットＫが目的の分析物の官能基への結合に適格であるかを決定することは、一般的な知識の範囲内である。
【0205】
分析物について上述したことは、本発明の第５の態様の文脈において分析物に適用される。
【0206】
分析物分子は、体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液など、組織または細胞抽出物などの生物学的サンプルまたは臨床サンプル中に存在し得る。本発明の第５の態様の実施形態では、分析物分子は、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、および乾燥血液スポットからなる群から選択される生物学的サンプルまたは臨床サンプル中に存在する。本発明の第５の態様のいくつかの実施形態では、分析物分子は、精製されたまたは部分的に精製されたサンプル、例えば、精製されたまたは部分的に精製されたタンパク質混合物または抽出物であるサンプル中に存在し得る。
【0207】
第６の態様では、本発明は、分析物の質量分析決定のための方法であって、
分析物を本発明の第１の態様に関して本明細書で前記に開示される式Ｉの化合物と反応させ、それによって本発明の第４の態様に関して本明細書で前記に開示される複合体を形成する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分析に供する工程
を含む方法に関する。
分析物を本発明の第１の態様に関して本明細書で前記に開示される式Ｉの化合物と反応させ、それによって本発明の第４の態様に関して本明細書で前記に開示される複合体を形成する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分析に供する工程
を含む方法に関する。
【0208】
本発明の第５の態様の実施形態では、質量分析工程（ｂ）は、
（ｉ）複合体のイオンを質量分析の第１段階に供し、それによって複合体のイオンをその質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付ける工程、
（ｉｉ）複合体イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって第１の要素、特に第１の中性要素、特に低分子量の中性要素が放出され、かつ複合体の娘イオンが生成される工程であって、複合体の娘イオンは複合体イオンとそのｍ／ｚ比が異なる、複合体の娘イオンが生成される工程、
（ｉｉｉ）複合体の娘イオンを質量分析の第２段階に供し、それによって複合体の娘イオンをそのｍ／ｚ比に従って特徴付ける工程
を含み、ならびに／または、
（ｉｉ）は、複合体イオンの代替的なフラグメンテーションを更に含み得、それによって、第２の要素、特に第１の要素とは異なる第２の中性要素が放出され、かつ複合体の第２の娘イオンが生成され、および、
（ｉｉｉ）は、複合体の第１の娘イオンおよび第２の娘イオンを質量分析の第２段階に供することを更に含み得、それによって、複合体の第１および第２の娘イオンをそれらのｍ／ｚ比に従って特徴付ける。
（ｉ）複合体のイオンを質量分析の第１段階に供し、それによって複合体のイオンをその質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付ける工程、
（ｉｉ）複合体イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって第１の要素、特に第１の中性要素、特に低分子量の中性要素が放出され、かつ複合体の娘イオンが生成される工程であって、複合体の娘イオンは複合体イオンとそのｍ／ｚ比が異なる、複合体の娘イオンが生成される工程、
（ｉｉｉ）複合体の娘イオンを質量分析の第２段階に供し、それによって複合体の娘イオンをそのｍ／ｚ比に従って特徴付ける工程
を含み、ならびに／または、
（ｉｉ）は、複合体イオンの代替的なフラグメンテーションを更に含み得、それによって、第２の要素、特に第１の要素とは異なる第２の中性要素が放出され、かつ複合体の第２の娘イオンが生成され、および、
（ｉｉｉ）は、複合体の第１の娘イオンおよび第２の娘イオンを質量分析の第２段階に供することを更に含み得、それによって、複合体の第１および第２の娘イオンをそれらのｍ／ｚ比に従って特徴付ける。
【0209】
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の要素および／または第２の要素は、トリメチルアミン、ピリジン、ホスフィン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルエチルアミン、メチルジエチルアミンおよびトリアルキルアミンからなる群から選択される。
【0210】
工程（ａ）は、質量分析決定に先立って、サンプル調製ワークフロー内の異なる段階で生じ得る。分析物分子を含むサンプルは、種々の方法によって前処理および／または濃縮することができる。前処理法は、血液（新鮮または乾燥）、血漿、血清、尿、または唾液といったサンプルの種類に依存し、一方で濃縮法は、目的の分析物に依存する。前処理方法がどのサンプルタイプに適しているかは、当業者によく知られている。どの濃縮法が目的のどの分析物に適しているかもまた、当業者によく知られている。
【0211】
本発明の第６の態様の実施形態では、分析物分子の質量分析決定のための本方法の工程（ａ）は、ｉ）サンプルの前処理工程に続いて、ｉｉ）サンプルの第１の濃縮に続いて、またはｉｉｉ）サンプルの第２の濃縮に続いて行われる。
【0212】
サンプルが全血サンプルである本発明の第６の態様の実施形態では、該サンプルは２つの所定のサンプル前処理（ＰＴ）ワークフローのうちの１つに割り当てられ、これら両方は内部標準（ＩＳＴＤ）および溶血試薬（ＨＲ）の添加に続いて所定のインキュベーション期間（Ｉｎｃ）を含み、ここで、２つのワークフローの差は、内部標準（ＩＳＴＤ）および溶血試薬（ＨＲ）が添加される順序である。実施形態では、水は溶血試薬として、特に０．５：１～２０：１ｍＬの水／ｍＬサンプルの量、特に１：１～１０：１ｍＬの水／ｍＬサンプルの量、特に２：１～５：１ｍＬの水／ｍＬサンプルの量で添加される。
【0213】
本発明の第６の態様の実施形態では、サンプルは尿サンプルであり、サンプルは、いずれも内部標準および酵素試薬の添加とそれに続く所定のインキュベーション期間とを含む他の２つの所定のサンプルＰＴワークフローのうちの１つに割り当てられ、２つのワークフローの違いは、内部標準および酵素試薬が添加される順序である。酵素試薬は、典型的には、グルクロニド開裂もしくはタンパク質開裂、または分析物もしくはマトリクスの任意の前処理に使用される試薬である。追加の工程では、本明細書の上記または下記で開示されるような本発明の化合物などの誘導体化試薬を加え、その後、インキュベーション期間が続く。
【0214】
本発明の第６の態様の実施形態では、酵素試薬は、グルクロニダーゼ、（部分的）エキソもしくはエンド脱グリコシル化酵素、またはエキソもしくはエンドプレオテアーゼ（ｐｒｅｏｔｅａｓｅｓ）からなる群から選択される。実施形態では、グルクロニダーゼを、０．５～１０ｍｇ／ｍＬの量で、特に１～８ｍｇ／ｍＬの量で、特に２～５ｍｇ／ｍＬの量で加える。
【0215】
本発明の第６の態様の実施形態では、該サンプルは血漿または血清であり、所定のインキュベーション時間に先立つ内部標準（ＩＳＴＤ）の添加のみを含む、別の所定のＰＴワークフローに割り当てられる。
【0216】
本明細書の前記または以下に記載されているように、考慮されるサンプルの処理、化学反応、または方法のために選択するインキュベーション時間および温度は、当業者に良く知られている。特に、当業者には、インキュベーション時間および温度が互いに依存し、例えば、高温は典型的にはより短いインキュベーション期間をもたらすが、逆もまた同様であることが既知である。本発明の第６の態様の実施形態では、インキュベーション温度は、４～４５℃の範囲、特に１０～４０℃の範囲、特に２０～３７℃である。実施形態では、インキュベーション時間は、３０秒～１２０分、特に３０秒～１分、３０秒～５分、３０秒～１０分、１分～１０分、または１分～２０分、１０分～３０分、３０分～６０分、または６０分～１２０分の範囲である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は、３６秒の倍数である。
【0217】
したがって、本方法の実施形態である工程ａ）は、上で開示されたサンプルの前処理プロセスのいずれかに続いて実施する。
【0218】
本発明の第６の態様の実施形態では、式Ｉの化合物と工程ａ）の分析物分子との反応は、任意の濃縮プロセスの前に行い、式Ｉの化合物を対象の前処理されたサンプルに加える。したがって、分析物分子の複合体および式Ｉの化合物は、前処理の後かつ第１の濃縮プロセスの前に形成される。したがって、複合体は、工程ｂ）の質量分析に供される前に、第１の濃縮プロセスおよび第２の濃縮プロセスに供される。
【0219】
前処理したサンプルは、分析物濃縮ワークフローへ更に供し得る。分析物濃縮ワークフローは、１つ以上の濃縮方法を含み得る。濃縮方法は当該技術分野においてよく知られており、化学的沈殿を含むがこれに限定されない化学的濃縮方法、ならびに固相抽出方法、ビーズワークフロー、およびクロマトグラフ法（例えば、ガスまたは液体クロマトグラフィ）を含むがこれらに限定されない固相を用いる濃縮方法を含むが、これらに限定されるものではない。
【0220】
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮ワークフローは、前処理したサンプルに分析物選択基を運ぶ固相、特に固体ビーズを加えることを含む。本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮ワークフローは、前処理したサンプルに分析物選択基を運ぶ、磁性または常磁性ビーズを加えること含む。本発明の第６の態様の実施形態では、磁性ビーズの添加は、撹拌または混合を含む。ビーズ上の対象分析物（複数可）を捕捉するための、所定のインキュベーション期間がこれに続く。本発明の第６の態様の実施形態では、ワークフローは、磁性ビーズとのインキュベーション後に洗浄工程（Ｗ１）を含む。分析物（複数可）に応じて、１つ以上の追加の洗浄工程（Ｗ２）を実施する。１つの洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）は、磁石または電磁石を含む磁気ビーズ操作ユニットによる磁気ビーズ分離、液体の吸引、洗浄緩衝液の添加、磁気ビーズの再懸濁、別の磁気ビーズ分離工程、および液体の別の吸引を含む、一連の工程からなる。その上、洗浄工程は、洗浄サイクルの容量および数または組み合わせとは別に、溶媒の種類（水／有機／塩／ｐＨ）の点で異なってもよい。各パラメータの選択方法は、当業者にはよく知られている。最後の洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）には、溶出試薬の添加、次いで磁気ビーズの再懸濁、および磁気ビーズから目的の分析物（複数可）を放出するための所定のインキュベーション期間が続く。その後、結合のない磁気ビーズを分離し、目的の誘導体化分析物（複数可）を含有する上清を捕捉する。
【0221】
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮ワークフローは、前処理したサンプルにマトリックス選択基を運ぶ、磁性ビーズを加えること含む。本発明の第６の態様の実施形態では、磁性ビーズの添加は、撹拌または混合を含む。ビーズ上のマトリクスを捕捉するための、所定のインキュベーション期間がこれに続く。ここで、目的の分析物は磁気ビーズに結合せず、上清中に残る。その後、磁気ビーズを分離し、目的の濃縮分析物（複数可）を含有する上清を収集する。
【0222】
本発明の第６の態様の実施形態では、上清を、第２の濃縮ワークフローに供する。ここで、上清はＬＣステーションへ移送されるか、または希釈液の添加による希釈工程の後にＬＣステーションへ移送される。異なる溶出手順／試薬、例えば溶媒の種類（水／有機／塩／ｐＨ）および容量を変える等も使用することができる。様々なパラメータが当業者によく知られており、容易に選択される。
【0223】
本発明の第６の態様の実施形態では、本方法の工程（ａ）は、前処理方法の直後に行われなかった。該工程ａ）は、本明細書中の上に記載されるように、磁性ビーズを用いた第１の濃縮ワークフローの後に行われてもよい。
【0224】
本発明の第６の態様の実施形態では、分析物特異的磁性ビーズが使用され、本明細書中で前記または以下に開示される式Ｉの化合物は、洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）が、溶出試薬の前、溶出試薬と共に、または溶出試薬に続くかのいずれかで終わった後に、対象のサンプルに添加され、その後、インキュベーション期間（定義された時間および温度）が続く。
【0225】
本発明の第６の態様の実施形態では、次いで、結合していない磁気ビーズを分離し、工程ａ）の複合体を含む上清を回収する。本発明の第６の態様の実施形態では、工程ａ）の複合体を含有する上清を、第２の濃縮ワークフローに、特に直接ＬＣステーションに移すか、または希釈液の添加による希釈工程の後に移す。
【0226】
本発明の第６の態様の実施形態では、マトリックス特異的磁性ビーズが使用され、本明細書中の前記または下記に開示される式Ｉの化合物は、磁気ビーズが分離される前または後に、対象サンプルへと添加される。本発明の第６の態様の実施形態では、工程ａ）の複合体を含有する上清を、特にＬＣステーションに直接、または希釈液の添加による希釈工程の後に、第２の濃縮ワークフローに移す。
【0227】
したがって、工程ａ）における式Ｉの化合物と分析物分子との反応が第１の濃縮プロセスの後に行われる本発明の第６の態様の実施形態では、式Ｉの化合物は、第１の濃縮プロセス、特に磁気ビーズを使用する第１の濃縮プロセスが終了した後に目的のサンプルに添加される。したがって、サンプルは、まず本明細書で前記に記載されるように前処理され、次いで特に、本明細書で前記に記載されるように分析物選択基を運ぶ磁性ビーズを用いる第１の濃縮プロセスに供され、ビーズからの溶出の前に、ビーズからの溶出と同時に、またはビーズからの溶出後に、式Ｉの化合物が添加される。したがって、分析物分子と式Ｉの化合物との複合体は、第１の濃縮プロセスの後、第２の濃縮プロセスの前に形成される。したがって、複合体は、工程ｂ）の質量分析に供される前に第２の濃縮プロセスに供される。
【0228】
本発明の第６の態様の別の実施形態では、本方法の工程（ａ）は、第２の分析物濃縮ワークフローの後に行われる。第２の濃縮ワークフローでは、サンプル中の対象分析物を更に濃縮するために、クロマトグラフ分離を使用する。本発明の第６の態様の実施形態では、クロマトグラフ分離は、ガスまたは液体クロマトグラフィーである。どちらの方法も当業者にはよく知られている。本発明の第６の態様の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ、高速ＬＣ、マイクロＬＣ、フローインジェクション、ならびにトラップおよび溶出からなる群から選択される。
【0229】
本発明の第６の態様の実施形態では、本方法の工程（ａ）は、クロマトグラフ分離と同時にまたはその後に行われる。本発明の第６の態様の実施形態では、式Ｉの化合物は、溶出緩衝液と共にカラムに添加される。別の実施形態では、式Ｉの化合物を、ポストカラムに添加する。
【0230】
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮プロセスは、分析物選択的磁性ビーズの使用を含む。本発明の第６の態様の実施形態では、第２の濃縮プロセスは、特に液体クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフ分離の使用を含む。
【0231】
したがって、工程ａ）における式Ｉの化合物と分析物分子との反応が第２の濃縮プロセスの後に行われる本発明の第６の態様の実施形態では、式Ｉの化合物は、クロマトグラフィー、特に液体クロマトグラフィーを使用する第２の濃縮プロセスが終了した後に目的のサンプルに添加される。したがって、この場合、該サンプルは、まず本明細書中で前記に記載されるように前処理され、次いで特に、本明細書中で前記に記載されるように磁性ビーズを用いて第１の濃縮プロセスに供され、その後、特に液体クロマトグラフィーを用いてクロマトグラフ分離に供され、続いて式Ｉの化合物が添加される。したがって、結合分析物分子と式Ｉの結合化合物との複合体は、第２の濃縮プロセスの後に形成される。したがって、複合体は、工程ｂ）の質量分析に供される前に濃縮プロセスに供されない。
【0232】
第７の態様では、本発明は、式Ｖ：
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成し得るカップリング基Ｑであり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物に関する。好ましくは、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はカップリング基Ｑであり、ＱはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。
【化16】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物に関する。好ましくは、Ａ３はアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５はカップリング基Ｑであり、ＱはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まない。
【0233】
本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様および／または本発明の第４の態様および／または本発明の第５の態様および／または本発明の第６の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第７の態様に適用され、逆もまた同様である。特に、本発明の第１の態様、例えばＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５について言及される全ての実施形態は、式Ｖの化合物に適用される。特に、式Ｖの化合物は、質量分析決定に使用し得る。あるいは、またはさらに、式Ｖの化合物は、他の技術分野、例えば化学標識および薬物送達に使用し得る。
【0234】
本発明の実施形態では、臨床診断システムは、本発明の第１の態様の化合物および／または本発明の第２の態様の組成物および／または本発明の第３の態様のキットおよび／または本発明の第４の態様の複合体を含む。さらに、または任意に、本発明の第１の態様の化合物は、分析物の質量分析決定に使用され、臨床診断システムは質量分析決定を含む。さらに、または任意に、本発明の第６の態様の分析物の質量分析決定のための方法は、臨床診断システムによって実施される。
【0235】
「臨床診断システム」は、インビトロ診断のためのサンプルの分析専用の実験室自動化装置である。臨床診断システムは、必要性に応じておよび／または所望の実験室ワークフローに応じて、異なる構成を有することができる。さらなる構成を、複数の装置および／またはモジュールを互いに結合させることによって得ることができる。「モジュール（ｍｏｄｕｌｅ）」は、専用機能を有する、臨床診断システム全体よりサイズが典型的には小さい作業セルである。この機能は、分析機能であってよいが、分析前または分析後の機能であってもよく、あるいは分析前の機能、分析機能、または分析後の機能のいずれかに対する補助機能であってよい。特に、モジュールを、例えば１つ以上の分析前および／または分析および／または分析後ステップを実行することによって、サンプル処理ワークフローのうちの専用のタスクを実行するための１つ以上の他のモジュールと協働するように構成し得る。特に、臨床診断システムは、例えば、臨床化学、免疫化学、凝固、血液学、液体クロマトグラフィー分離、質量分析などの特定の種類の分析のために最適化されたそれぞれのワークフローを実行するように設計された、１つ以上の分析装置を備え得る。したがって、臨床診断システムは、１つの分析装置、またはそれぞれのワークフローを有するそのような分析装置のいずれかの組み合わせを備え得、前分析および／または後分析モジュールは、個々の分析装置に結合されるか、または複数の分析装置によって共有され得る。あるいは、分析前および／または分析後機能を分析装置に統合されたユニットによって実行してもよい。臨床診断システムは、サンプルおよび／または試薬および／またはシステム流体のピペッティングおよび／または圧送および／または混合のための液体ハンドリングユニット等の機能ユニット、および同様に、ソートする、格納する、輸送する、識別する、分離する、検出するための機能ユニットを備えることができる。臨床診断システムは、目的の分析物を含むサンプルを自動調製するためのサンプル調製ステーション、複数のＬＣチャネルを含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離ステーション、および／または調製されたサンプルをＬＣチャネルのいずれかに入力するためのサンプル調製／ＬＣインターフェースを備え得る。臨床診断システムは、それぞれがサンプル調製ステップの予め定義された順序を含み、目的の分析物に応じて完了のために予め定義された時間を必要とする予め定義されたサンプル調製ワークフローにサンプルを割り当てるようにプログラムされたコントローラを更に備え得る。臨床診断システムは、質量分析計（ＭＳ）およびＬＣ分離ステーションを質量分析計に接続するためのＬＣ／ＭＳインターフェースとを更に備え得る。本明細書で使用される場合、「自動的に」または「自動化された」という用語は、広義の用語であり、当業者にとってのその通常かつ慣習的な意味が与えられるべきであり、特別なまたはカスタマイズされた意味に限定されるべきではない。この用語は、具体的には、特に手動の動作および／またはユーザとの相互作用を必要とせずに、少なくとも１つのコンピュータおよび／またはコンピュータネットワークおよび／または機械によって完全に実行されるプロセスを指すことができるが、それらに限られるわけではない。
【0236】
「サンプル準備ステーション」は、１つ以上の分析装置または分析装置内のユニットに結合した分析前モジュールであり、サンプル中の妨げとなるマトリクス成分を除去または少なくとも低減し、および／またはサンプル中の関心の分析対象物を濃縮することを目的とした一連のサンプル処理工程を実行するように設計される。このような処理工程は、サンプルまたは複数のサンプルについて順次、並列、または時差をつけた様相で実行される以下の処理作業、すなわち流体のピペット操作（吸引および／または送出）、流体の圧送、試薬との混合、特定の温度での培養、加熱または冷却、遠心分離、分離、フィルタ処理、ふるい分け、乾燥、洗浄、再懸濁、分取、移送、保管、のうちの１つ以上を含み得る。
【0237】
「液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離ステーション」は、目的の分析物を、例えば、マトリックス成分、例えば、その後の検出、例えば質量分析検出を依然として妨げ得るサンプル調製後の残りのマトリックス成分から分離するために、および／またはそれらの個々の検出を可能にするために目的の分析物を互いに分離するために、調製されたサンプルをクロマトグラフィー分離するように設計された分析装置またはモジュールまたは分析装置内のユニットである。一実施形態では、ＬＣ分離ステーションは、質量分析のためのサンプルを調製するように、および／または調製されたサンプルを質量分析計に移送するように設計された分析装置内の中間分析装置またはモジュールまたはユニットである。特に、ＬＣ分離ステーションは、複数のＬＣチャネルを含むマルチチャネルＬＣステーションである。
【0238】
臨床診断システム、例えばサンプル調製ステーションはまた、新しいサンプル調製開始シーケンスが開始される前に複数のサンプルを受け取るためのバッファユニットを備えてもよく、サンプルは個別にランダムにアクセス可能であってもよく、その個別の調製はサンプル調製開始順序に従って開始されてもよい。
【0239】
臨床診断システムは、質量分析に結合されたＬＣをより便利で、より信頼性のあるものとし、したがって臨床診断に適している。特に、質量分析へのオンライン結合を可能にしながら、ランダムアクセスによるサンプル調製およびＬＣ分離によりハイスループット、例えば最大１００サンプル／時間またはそれ以上を得ることが可能である。さらに、プロセスを完全に自動化して、歩留まりを向上させ、必要な技能のレベルを下げることが可能である。
【0240】
さらなる実施形態では、本発明は、以下の態様に関する。
【0241】
１．分析物の質量分析決定のための、式Ｉ
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成し得るカップリング基Ｑであり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物。
【化17】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物。
【0242】
２．カップリング基Ｑが、以下の式ＩＩ：
（式中、Ｋは、分析物と共有結合を形成し得る反応性ユニットであり、
ｎは、０、１、２、３、４または５であり、
Ｘは式Ｉのフェニル基の炭素原子である）
によるＸに結合している、態様１に記載の化合物。
【化18】
ｎは、０、１、２、３、４または５であり、
Ｘは式Ｉのフェニル基の炭素原子である）
によるＸに結合している、態様１に記載の化合物。
【0243】
３．Ｋが、分析物のカルボニル基、フェノール基、アミン、ヒドロキシル基またはジエン基と反応し得る、態様２に記載の化合物。
【0244】
４．Ｋが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、Ｂｒ、Ｆ芳香族、４－置換１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＴＡＤ）、活性エステル、塩化スルホニルおよび反応性カルボニルからなる群から選択される、態様２または３に記載の化合物。
【0245】
５．Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がＱであり、ＱがＯ、Ｎ、Ｓ、およびＢｒから選択される少なくとも１つの原子を含まず、特にＱがＯ、Ｎ、ＳおよびＢｒを含まない、態様１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【0246】
６．Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がＫであり、ｎが３、４または５である、態様１～５のいずれか１一項に記載の化合物。
【0247】
７．Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がＫであり、ＫがＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂｒから選択される少なくとも１つの原子を含まず、特にＫがＯ、Ｎ、ＳおよびＢｒを含まない、態様１～６のいずれか一項に記載の化合物。
【0248】
８．Ｑが、メチルヒドラジド、メチルヒドラジン、メチルヒドロキシルアミン、オキシアミン、４－メチル－オキシ－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＣＨ２－Ｏ－ＴＡＤ）、２，４－ジニトロ－５－フルオロアニリン誘導体、クロルスルホニルおよびメタンスルホニルクロリドからなる群から選択される、態様１～７のいずれか一項に記載の化合物。
【0249】
９．Ａ３が、ピリジニウム、トリメチルアンモニウム、ホスホニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、ジメチルエチルアンモニウム、メチルジエチルアンモニウムおよびトリアルキルアンモニウムからなる群から選択される、態様１～８のいずれか一項に記載の化合物。
【0250】
１０．Ａ３がＮＲ１Ｒ２Ｒ３またはＰＲ４Ｒ５Ｒ６であり
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６がそれぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、置換フェニル、非置換フェニル、アルキル、修飾アルキル、短鎖アルキルから選択される、態様１～９のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６がそれぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、置換フェニル、非置換フェニル、アルキル、修飾アルキル、短鎖アルキルから選択される、態様１～９のいずれか一項に記載の化合物。
【0251】
１１．Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５が、それぞれ独立して、ＯＲ７、ＮＲ８Ｒ９、Ｈ、脂肪族から選択され、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９が、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、置換フェニル、非置換フェニル、アルキル、修飾アルキル、短鎖アルキルから選択される、態様１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９が、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、置換フェニル、非置換フェニル、アルキル、修飾アルキル、短鎖アルキルから選択される、態様１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
【0252】
１２．Ａ１、Ａ２が、それぞれ独立して、Ｈ、脂肪族基、芳香族基から選択される、態様１～１１のいずれか一項に記載の化合物。
【0253】
１３．Ａ１がＨまたはＣＨ３である、態様１～１２のいずれか一項に記載の化合物。
【0254】
１４．Ａ２がＨまたはＣＨ３である、態様１～１３のいずれか一項に記載の化合物。
【0255】
１５．Ａ１がＨであり、Ａ２がＨであり、Ａ３がピリジニウムである、態様１～１４のいずれか一項に記載の化合物。
【0256】
１６．Ｂ３がＱである、態様１～１５のいずれか一項に記載の化合物。
【0257】
１７．Ｂ２がＱである、態様１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
【0258】
１８．Ｂ４がＱである、態様１～１７のいずれか一項に記載の化合物。
【0259】
１９．Ｂ１がＨまたはメトキシである、態様１～１８のいずれか一項に記載の化合物。
【0260】
２０．Ｂ２がＨまたはメトキシである、態様１～１９のいずれか一項に記載の化合物。
【0261】
２１．Ｂ４がＨまたはメトキシである、態様１～２０のいずれか一項に記載の化合物。
【0262】
２２．Ｂ５がＨまたはメトキシである、態様１～２１のいずれか一項に記載の化合物。
【0263】
２３．ＱがＦを含む、態様１～２２のいずれか一項に記載の化合物。
【0264】
２４．ｎが０である、態様１～２３のいずれか一項に記載の化合物。
【0265】
２５．ｎが１である、態様１～２４のいずれか一項に記載の化合物。
【0266】
２６．ｎが０または１であり、Ｋがヒドラジドである、態様１～２５のいずれか一項に記載の化合物。
【0267】
２７．カップリング基Ｑを形成していない他の置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５が、それぞれ独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、Ｎ，Ｎジメチルアミン、エトキシまたはメトキシから選択される、態様１～２６のいずれか一項に記載の化合物。
【0268】
２８．化合物が永久に正に帯電している、態様１～２７のいずれか一項に記載の化合物。
【0269】
２９．化合物が単純に永久的に正に帯電している、態様１～２８のいずれか一項に記載の化合物。
【0270】
３０．化合物が、二重または三重に永久に正に帯電している、態様１～２９のいずれか一項に記載の化合物。
【0271】
３１．化合物が、塩を形成するための対イオンを含み、対イオンが、好ましくは以下の群から選択される、態様１～３０のいずれか一項に記載の化合物。Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｆ－、ギ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ＰＦ６
－、スルホン酸塩、リン酸塩、酢酸塩。
【0272】
３２．以下の式
を含む、態様１～３１のいずれか一項に記載の化合物。
【化19】
【0273】
３３．態様１～３２のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
【0274】
３４．態様１～３２のいずれか一項に化記載の合物、または態様３３に記載の組成物を含む、キット。
【0275】
３５．互いに共有結合した結合分析物および結合化合物を含む、質量分析決定を使用して分析物を検出するための複合体であって、特に、複合体が、分析物と態様１～３２のいずれか一項に記載の化合物との化学反応によって形成される、複合体。
【0276】
３６．結合化合物が、式ＩＩＩ
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成するカップリング基Ｑ＊であり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
カップリング基Ｑ＊が式ＩＶを含む：
（式中、ｎ＊は０、１、２、３、４、または５であり；
結合分析物は、Ｋ＊を介して共有結合しており、
Ｘ＊は式ＩＩＩのフェニル基の炭素原子であり、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む））
を含む、態様３５に記載の複合体。
【化20】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
カップリング基Ｑ＊が式ＩＶを含む：
【化21】
結合分析物は、Ｋ＊を介して共有結合しており、
Ｘ＊は式ＩＩＩのフェニル基の炭素原子であり、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑ＊である場合、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑ＊は、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む））
を含む、態様３５に記載の複合体。
【0277】
３７．分析物が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾に特徴的な分子、生物によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、態様３５または３６に記載の複合体。
【0278】
３８．結合化合物が、分析物のカルボニル基、ヒドロキシル基またはジエン基を介して共有結合して、前記複合体を形成する、態様３５～３７のいずれか一項に記載の複合体。
【0279】
３９．分析物の質量分析決定のための、態様１～３２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【0280】
４０．質量分析決定が、タンデム質量分析決定、特にトリプル四重極質量分析決定を含む、態様３９に記載の化合物の使用。
【0281】
４１．分析物の質量分析決定のための方法であって、
（ａ）分析物を、態様１～３２のいずれか一項で定義された式Ｉの化合物と反応させ、それによって、態様３５～３８のいずれか一項で定義された複合体を形成させる工程、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分析に供する工程
を含む、方法。
（ａ）分析物を、態様１～３２のいずれか一項で定義された式Ｉの化合物と反応させ、それによって、態様３５～３８のいずれか一項で定義された複合体を形成させる工程、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分析に供する工程
を含む、方法。
【0282】
４２．質量分析工程（ｂ）が、
（ｉ）複合体のイオンを質量分析の第１段階に供し、それによって複合体のイオンをその質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付ける工程、
（ｉｉ）複合体イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって第１の要素、特に第１の中性要素、特に低分子量の中性要素が放出され、かつ複合体の娘イオンが生成される工程であって、複合体の娘イオンは複合体イオンとそのｍ／ｚ比が異なる、複合体の娘イオンが生成される工程、
（ｉｉｉ）複合体の娘イオンを質量分析の第２段階に供し、それによって複合体の娘イオンをそのｍ／ｚ比に従って特徴付ける工程
を含み、ならびに／または、
（ｉｉ）は、複合体イオンの代替的なフラグメンテーションを更に含み得、それによって、第２要素、特に第１の中性要素とは異なる第２の中性要素が放出され、かつ複合体の第２の娘イオンが生成され、および、
（ｉｉｉ）は、複合体の第１の娘イオンおよび第２の娘イオンを質量分析の第２段階に供することを更に含み得、それによって、複合体の第１および第２の娘イオンをそれらのｍ／ｚ比に従って特徴付ける、態様４１に記載の方法。
（ｉ）複合体のイオンを質量分析の第１段階に供し、それによって複合体のイオンをその質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付ける工程、
（ｉｉ）複合体イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって第１の要素、特に第１の中性要素、特に低分子量の中性要素が放出され、かつ複合体の娘イオンが生成される工程であって、複合体の娘イオンは複合体イオンとそのｍ／ｚ比が異なる、複合体の娘イオンが生成される工程、
（ｉｉｉ）複合体の娘イオンを質量分析の第２段階に供し、それによって複合体の娘イオンをそのｍ／ｚ比に従って特徴付ける工程
を含み、ならびに／または、
（ｉｉ）は、複合体イオンの代替的なフラグメンテーションを更に含み得、それによって、第２要素、特に第１の中性要素とは異なる第２の中性要素が放出され、かつ複合体の第２の娘イオンが生成され、および、
（ｉｉｉ）は、複合体の第１の娘イオンおよび第２の娘イオンを質量分析の第２段階に供することを更に含み得、それによって、複合体の第１および第２の娘イオンをそれらのｍ／ｚ比に従って特徴付ける、態様４１に記載の方法。
【0283】
４３．第１の要素および／または第２の要素が、トリメチルアミン、ピリジン、ホスフィン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルエチルアミン、メチルジエチルアミンおよびトリアルキルアミンからなる群から選択される、態様４１または４２に記載の方法。
【0284】
４４．式Ｖの化合物：
（式中、置換基Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５のうちの１つは、分析物と共有結合を形成し得るカップリング基Ｑであり、
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物。
【化22】
他の置換基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、修飾アルキル、Ｎ－アシルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルコキシチオカルボニル、アシル、ニトロ、チオアシル、アリーロルイル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、シアノメチル、シアノエチル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、ニトロエチル、アシルオキシ、アリーロイルオキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、硫黄、同位元素またはそれらの誘導体から選択され、
Ａ３は、アンモニウム、ピリジニウム、ホスホニウムまたはそれらの誘導体を含み、
Ａ３がアンモニウムであり、Ｂ１またはＢ５がカップリング基Ｑである場合、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から４つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含み、カップリング基Ｑは、ＣＡ１Ａ２Ａ３置換基のＣ原子から５つの単結合または二重結合によって分離されたＣ原子を含む）
の化合物。
【0285】
実施例
以下の実施例は、本明細書で特許請求される発明を例示するために提供されるものであって、限定するものではない。
以下の実施例は、本明細書で特許請求される発明を例示するために提供されるものであって、限定するものではない。
【0286】
実施例１：ラベル１～５の合成
ラベル１：
工程１：ピリジニウム基を有するヒドラジド誘導体の合成
５８７ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のメチル４－（ブロモメチル）フェニルアセテート、１０ｍｌのエタノールおよび３２４ｍｌ（４ｍｍｏｌ）のピリジンを混合し、３時間還流した。混合物を減圧濃縮して油状物を得た。
ラベル１：
工程１：ピリジニウム基を有するヒドラジド誘導体の合成
【化23】
【0287】
工程２：
工程１からの油状物を８ｍｌの水に溶解し、０．９ｍｌのヒドラジン水和物（Ｈ２Ｏ中８０％）を添加し、反応物を７０分間還流した。反応混合物を減圧濃縮し、分取ＲＰ ＨＰＬＣ（水からアセトニトリル）によって精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は２４２．３である。ラベル１について実験的に決定されたｍ／ｚの値は２４２．２である。ＲＰ ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）は当業者に公知であり、したがって詳細には説明しない。
【化24】
工程１からの油状物を８ｍｌの水に溶解し、０．９ｍｌのヒドラジン水和物（Ｈ２Ｏ中８０％）を添加し、反応物を７０分間還流した。反応混合物を減圧濃縮し、分取ＲＰ ＨＰＬＣ（水からアセトニトリル）によって精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は２４２．３である。ラベル１について実験的に決定されたｍ／ｚの値は２４２．２である。ＲＰ ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）は当業者に公知であり、したがって詳細には説明しない。
【0288】
ラベル２～５は、ラベル１について記載したようにそれに応じて合成される。ラベル２～５についてのＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値および実験的に決定されたｍ／ｚの値を表３に示す。
【表3】
【0289】
実施例２：ラベル６～１３の合成
ラベル６：
工程１：トリメチルアンモニウム基を有するヒドラジド誘導体の合成
５８７ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のメチル４－（ブロモメチル）フェニルアセテート、１０ｍｌのエタノールおよび０．９５ｍＬのトリメチルアミン（Ｈ２Ｏ中２５％）を混合し、３時間還流した。混合物を減圧濃縮して油状物を得た。
ラベル６：
工程１：トリメチルアンモニウム基を有するヒドラジド誘導体の合成
【化25】
【0290】
工程２：
工程１からの油状物を８ｍｌの水に溶解し、０．９ｍｌのヒドラジン水和物（Ｈ２Ｏ中８０％）を添加し、反応物を７０分間還流した。反応混合物を減圧濃縮し、分取ＲＰＨＰＬＣ（水からアセトニトリル）によって精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は２２２．３である。ラベル６について実験的に決定されたｍ／ｚの値は２２２．３である。
【化26】
【0291】
ラベル７～１３は、ラベル６について記載したようにそれに応じて合成される。ラベル７～１３についてのＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値および実験的に決定されたｍ／ｚの値を表４に示す。
【表4】
【0292】
実施例３：ラベル１４の合成：トリメチルアンモニウム基を有するヒドロキシルアミン誘導体の合成
工程１：
１ｇの４－ブロモベンジルブロミド（４ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、１．５当量の２５％トリメチルアミン水溶液を添加した。混合物を１６時間撹拌し、得られた沈殿物を濾過によって回収し、乾燥させた。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は２２９．１である。ｍ／ｚの実験的に決定された値は２３０．２である。
工程１：
【化27】
【0293】
工程２：
７．５ｍｇ（１１ｍｇ）のアリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体（２０μｍｏｌ）、４０ｍｇのｔＢｕＢｒｅｔｔＰｈｏｓ（２－（ジ－ｔｅｒｔ－ブチルホスフィノ）－２’、４’、６’－トリイソプロピル－３，６－ジメトキシ－１，１’－ビフェニル、８０μｍｏｌ）、４９０ｍｇの炭酸セシウム（１．５ｍｍｏｌ）、工程１からの３１０ｍｇの固体（１ｍｍｏｌ）を、乾燥マイクロ波バイアル中、アルゴン下で２ｍｌの無水トルエンに溶解した。１２５μｌのエチルアセトヒドロキサメート（ｌ．２５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を密閉バイアル内で６５℃で撹拌した。次いで、反応混合物をメタノール２５ｍｌに注ぎ入れ、フィルタにかけ、減圧濃縮した。得られた固体を水／メタノールに溶解し、ＲＰ ＨＰＬＣ（水からアセトニトリル、逆相ＨＰＬＣ）により精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は２５１，３である。実験的に決定されたｍ／ｚの値は２５１．３である。
【化28】
【0294】
工程３：
工程２からの１０９ｍｇ（３２９μｍｏｌ）の固体を２ｍｌのジオキサンに溶解し、水中６ＭのＨＣｌ、４００μｌ（２．３５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で８０分間撹拌した。９ｍｌの水を添加し、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（水からアセトニトリル）によって精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は１８１．３である。実験的に決定されたｍ／ｚの値は１８１．３である。
【化29】
【0295】
実施例４：ラベル１５の合成
工程１：［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾリジン－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテートの合成
４－［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］－１，２，４－トリアゾリジン－３，５－ジオン（０．３９ｍｍｏｌ）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０，１９１，１４１６－１４１７に既に報告されたようにして合成）を無水ＤＭＦに溶解し、次いで、ＰＰｈ３（０．５４ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（０．５８ｍｍｏｌ）を添加した。室温（ｒ．ｔ．）で２時間攪拌した後、ＴＭＡ（ＴＨＦ中１Ｍ溶液、０．４６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を水に懸濁し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。水相を乾燥させ、未精製の生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な生成物を、白色固体（７５ｍｇ、収率５４％）として得た。
工程１：［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾリジン－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテートの合成
【化30】
【0296】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～４０分：８０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、２０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～６０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１２（ｓ，９ Ｈ）４．５６（ｓ，２ Ｈ）７．６５－７．７２（ｍ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ５１．６８（３ Ｃ）６８．４１（１ Ｃ）１２６．２４（２ Ｃ）１２７．２３（１ Ｃ）１３３．２５（２ Ｃ）１３４．１４（１ Ｃ）１５３．６６（２ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値２４９．１３４６０、実測値２４９．３９．
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～４０分：８０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、２０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～６０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１２（ｓ，９ Ｈ）４．５６（ｓ，２ Ｈ）７．６５－７．７２（ｍ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ５１．６８（３ Ｃ）６８．４１（１ Ｃ）１２６．２４（２ Ｃ）１２７．２３（１ Ｃ）１３３．２５（２ Ｃ）１３４．１４（１ Ｃ）１５３．６６（２ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値２４９．１３４６０、実測値２４９．３９．
【0297】
工程２：［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾール－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテートの合成
４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾリジン－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテート（０．０４１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ３ＣＮ（５００μＬ）にアルゴン下で溶解した。ＤＢＨ（０．０４１ｍｍｏｌ）を添加し、赤色の溶液を、室温で暗所において１０分間撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、残渣を無水ＣＨ２Ｃｌ２に懸濁した。赤色の固体をＣＨ２Ｃｌ２で再度洗浄し、乾燥させた。固体をさらに精製することなく使用し、－２０℃で暗所で保存した。
【化31】
【0298】
実施例５：ラベル１６の合成：Ｎ－［４－［（ジメチルアミノ）メチル］フェニル］－５－フルオロ－２，４－ジニトロアニリンの合成
４－［（ジメチルアミノ）メチル］アニリン（０．５８ｍｍｏｌ）を、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（０．３５ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）中溶液に添加した。得られた溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、未精製の生成物をクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ１００：０→９５：５）によって精製した。生成物を黄色油状物として得た（９７ｍｇ、収率８３％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ２．５０（ｓ，６ Ｈ）３．７７（ｓ，２ Ｈ）６．８５（ｄ，Ｊ＝１３．３０ Ｈｚ，１ Ｈ）７．２６－７．３１（ｍ，２ Ｈ）７．５２（ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，２ Ｈ）９．１７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．６５ Ｈｚ，１ Ｈ）９．９４（ｂｒ ｓ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値３３５．１１５０１、実測値３３５．３６
【化32】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ２．５０（ｓ，６ Ｈ）３．７７（ｓ，２ Ｈ）６．８５（ｄ，Ｊ＝１３．３０ Ｈｚ，１ Ｈ）７．２６－７．３１（ｍ，２ Ｈ）７．５２（ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，２ Ｈ）９．１７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．６５ Ｈｚ，１ Ｈ）９．９４（ｂｒ ｓ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値３３５．１１５０１、実測値３３５．３６
【0299】
生成された生成物のジメチルアミノ残基はメチル化され、標識１６を形成し得る。メチル化は、分析物との複合体形成の前または後に起こり得る。
【0300】
実施例６：ラベル１７の合成：［４－（ブロモメチル）フェニル］メタンスルホニルクロリドの合成
４－メチルベンジルスルホニルクロリド（２．５９ｍｍｏｌ）、ＤＢＨ（１．８１ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．２６ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮに溶解した。溶液を６０℃で１８時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、未精製の化合物をクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ１００：０→９０：１０）によって精製した。生成物を白色固体（５０ｍｇ）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ４．４９（ｓ，２ Ｈ）４．８５（ｓ，２ Ｈ）７．３８－７．５５（ｍ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ３２．１１（１ Ｃ）７０．３６（１ Ｃ）１２６．１５（１ Ｃ）１２９．８２（２ Ｃ）１３１．７６（２ Ｃ）１４０．０９（１ Ｃ）．
【化33】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ４．４９（ｓ，２ Ｈ）４．８５（ｓ，２ Ｈ）７．３８－７．５５（ｍ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ３２．１１（１ Ｃ）７０．３６（１ Ｃ）１２６．１５（１ Ｃ）１２９．８２（２ Ｃ）１３１．７６（２ Ｃ）１４０．０９（１ Ｃ）．
【0301】
実施例７：ラベル１８の合成：ピリジニウム基を有するブロモ誘導体の合成
１．６ｇのアルファ，アルファ’－ジブロモ－ｐ－キシロールをエタノールに溶解し、ピリジンを還流中に２時間にわたって添加した。次いで、混合物を３０分間撹拌し、溶媒を真空中で除去した。未精製の物質をエーテルで２回消化し、残りの固体を水に溶解し、ＲＰ ＨＰＬＣ（水からアセトニトリル）によって精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は２６３．２である。実験的に決定されたｍ／ｚの値は２６３．１である。
【化34】
【0302】
実施例８：ラベル１９の合成：トリメチルアンモニウム基を有するブロモ誘導体の合成
１．６ｇのアルファ，アルファ’－ジブロモ－ｐ－キシロールを１００ｍＬのＴＨＦに溶解し、トリメチルアミンを添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、得られた沈殿物をフィルタにかけ、エーテルで洗浄する。未精製の物質をＲＰ ＨＰＬＣ（水からアセトニトリル）によって精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は２４３．１である。実験的に決定されたｍ／ｚの値は２４４．１である。
【化35】
【0303】
実施例９：ラベル２０の合成：
工程１：
アルゴン雰囲気下、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド（２．０６ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ１０ｍＬ中溶液に、α、α’－ジブロモ－ｐ－キシレン（２．２７ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＤＩＰＥＡ（４．５４ｍｍｏｌ）を滴下し、次いで、反応混合物を２４時間還流した。室温まで冷却した後、反応混合物を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を回収し、真空下で乾燥させた。未精製の生成物をクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ１００：０→８０：２０）によって精製した。生成物を白色固体（２６４ｍｇ、収率３７％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ４．４７（ｓ，２ Ｈ）５．１９（ｓ，２ Ｈ）７．４０（ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，２ Ｈ）７．５１（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈｚ，２ Ｈ）７．７０－７．７７（ｍ，２ Ｈ）７．７７－７．８４（ｍ，２ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ３２．８５（１ Ｃ）７７．１９（１ Ｃ）７９．３０（２ Ｃ）１２３．５３（２ Ｃ）１２８．８２（１ Ｃ）１２９．２２（２ Ｃ）１３０．１７（２ Ｃ）１３３．９２（２ Ｃ）１３４．４７（２ Ｃ）１３８．８６（２ Ｃ）１６３．４５（２ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値３４６．００７３３、実測値３４６．１９
工程１：
【化36】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ４．４７（ｓ，２ Ｈ）５．１９（ｓ，２ Ｈ）７．４０（ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，２ Ｈ）７．５１（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈｚ，２ Ｈ）７．７０－７．７７（ｍ，２ Ｈ）７．７７－７．８４（ｍ，２ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ３２．８５（１ Ｃ）７７．１９（１ Ｃ）７９．３０（２ Ｃ）１２３．５３（２ Ｃ）１２８．８２（１ Ｃ）１２９．２２（２ Ｃ）１３０．１７（２ Ｃ）１３３．９２（２ Ｃ）１３４．４７（２ Ｃ）１３８．８６（２ Ｃ）１６３．４５（２ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値３４６．００７３３、実測値３４６．１９
【0304】
工程２：［４－［（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イル）オキシメチル］フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムブロミド（ラベル１６）の合成
Ｎ－［［４－（ブロモメチル）フェニル］メトキシ］フタルイミド（０．３７ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解し、ＴＭＡ溶液（ＴＨＦ中１Ｍ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。白色固体を濾過によって回収し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。生成物を白色固体（１３０ｍｇ、収率８５％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ ３．０８（ｓ，９ Ｈ）４．５９（ｓ，２ Ｈ）５．２４（ｓ，２ Ｈ）７．５６－７．６５（ｍ，２ Ｈ）７．６８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，２ Ｈ）７．８３（ｓ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ ５２．２９（３ Ｃ）６８．３３（２ Ｃ）７８．８３（２ Ｃ）１２３．１５（２ Ｃ）１２８．７１（２ Ｃ）１２８．９５（２ Ｃ）１３０．２８（２ Ｃ）１３３．１２（２ Ｃ）１３４．７６（２ Ｃ）１３６．９６（２ Ｃ）１６３．４５（２ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値３２５．１５４６７、実測値３２５．３５．
【化37】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ ３．０８（ｓ，９ Ｈ）４．５９（ｓ，２ Ｈ）５．２４（ｓ，２ Ｈ）７．５６－７．６５（ｍ，２ Ｈ）７．６８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，２ Ｈ）７．８３（ｓ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ ５２．２９（３ Ｃ）６８．３３（２ Ｃ）７８．８３（２ Ｃ）１２３．１５（２ Ｃ）１２８．７１（２ Ｃ）１２８．９５（２ Ｃ）１３０．２８（２ Ｃ）１３３．１２（２ Ｃ）１３４．７６（２ Ｃ）１３６．９６（２ Ｃ）１６３．４５（２ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値３２５．１５４６７、実測値３２５．３５．
【0305】
工程３：［４－（アミノオキシメチル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムクロリド（ラベル２０）の合成
［４－［（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イル）オキシメチル］フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムブロミド（０．３０ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）に溶解した。ＫＯＨ水溶液（０．３３ｍｍｏｌ、１ｍＬ）を添加し、溶液を４時間還流した。次いで、濃ＨＣｌ（２００μＬ）を添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、未精製の化合物を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物を白色固体（陰イオン交換後の塩化物塩、２３ｍｇ、収率３４％）として得た。
【化38】
【0306】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～２０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
２０～２４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
２４～３４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
３４～４０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～５０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１１（ｓ，９ Ｈ）４．５５（ｓ，２ Ｈ）５．０９（ｓ，２ Ｈ）７．５７－７．６６（ｍ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ５３．２７（３ Ｃ）６９．９５（１ Ｃ）７７．２９（１ Ｃ）１３０．４２（１ Ｃ）１３１．０７（２ Ｃ）１３４．６２（２ Ｃ）１３７．３３（１ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値１９５．１４９１９、実測値１９５．３５．
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～２０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
２０～２４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
２４～３４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
３４～４０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～５０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１１（ｓ，９ Ｈ）４．５５（ｓ，２ Ｈ）５．０９（ｓ，２ Ｈ）７．５７－７．６６（ｍ，４ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ５３．２７（３ Ｃ）６９．９５（１ Ｃ）７７．２９（１ Ｃ）１３０．４２（１ Ｃ）１３１．０７（２ Ｃ）１３４．６２（２ Ｃ）１３７．３３（１ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値１９５．１４９１９、実測値１９５．３５．
【0307】
実施例１０：ラベル２１の合成：
ジブロモ－ｐ－キシロール（１ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、無水トルエン中で混合し、８０℃で９０分間撹拌した。室温に冷却した後、生成物をフィルタにかけ、トルエンで洗浄し、ＲＰ ＨＰＬＣ（アセトニトリル、水、ＲＰ＝逆相）によって精製する。
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝４４５．１；ｍ／ｚ（実測値）＝４４５．２
【化39】
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝４４５．１；ｍ／ｚ（実測値）＝４４５．２
【0308】
実施例１１：ラベル２２の合成
ジブロモ－ｐ－キシロール（１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ中の５００μＬの０．１Ｍトリメチルホスフィンをトルエン３ｍＬに溶解し、８０℃で６０分間撹拌した。室温に冷却した後、生成物をフィルタにかけ、トルエンで洗浄し、ＲＰ ＨＰＬＣ（アセトニトリル、水）によって精製する。
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝２５９．０；ｍ／ｚ（実測値）＝２５９．１
【化40】
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝２５９．０；ｍ／ｚ（実測値）＝２５９．１
【0309】
実施例１２：ラベル２５の合成
ジブロモ－ｐ－キシロール（１ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．５ｍｍｏｌ）を、Ａｒ雰囲気下、無水トルエン中で混合し、８０℃で９０分間撹拌した。室温に冷却した後、生成物をフィルタにかけ、トルエンで洗浄し、ＲＰ（アセトニトリル、水）によって精製する。
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝５３５．１；ｍ／ｚ（実測値）＝５３５．１
【化41】
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝５３５．１；ｍ／ｚ（実測値）＝５３５．１
【0310】
ラベル－分析物誘導体（複合体）の調製およびＭＳによるその分析
本開示において本明細書で言及されるラベルは、分析物、例えばテストステロン、ビタミンＤ、エストラジオールまたはそれらの誘導体と結合し得る。これは、以下のように例示される。本発明は、以下の実施例に限定されない：
本開示において本明細書で言及されるラベルは、分析物、例えばテストステロン、ビタミンＤ、エストラジオールまたはそれらの誘導体と結合し得る。これは、以下のように例示される。本発明は、以下の実施例に限定されない：
【0311】
実施例１３：ラベル－テストステロン誘導体（複合体）の調製およびＭＳによるその分析
実施例１３．１：ラベル７－テストステロン誘導体の調整
３１５ｍｇのラベル７を１３ｍＬの酢酸エチルおよび５ｍＬの氷酢酸に溶解し、テストステロンを添加し、反応物を４０℃で３０分間撹拌し、次いで、４０℃で減圧濃縮した。未精製の混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（水からアセトニトリル）によって精製した。ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は４７８．７である。実験的に決定されたｍ／ｚの値は２７８．４である。
実施例１３．１：ラベル７－テストステロン誘導体の調整
【化42】
【0312】
それに応じて、他の複合錯体を調製し得る。例えば：
【0313】
実施例１３．２：ラベル３－テストステロン誘導体：
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝４９８．７；ｍ／ｚ（実測値＝実験的に決定）＝４９８．３
【化43】
【0314】
実施例１３．３：ラベル１０－テストステロン誘導体
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚ（計算値）＝５０８．７；ｍ／ｚ（実測値）＝５０８．３
【化44】
【0315】
実施例１３．４：ラベル１～１４を使用したテストステロン誘導体の分析的誘導体化
テストステロンの５００ｎｇ／ｍｌのメタノール中溶液（Ｓ１）を調製した。誘導体化試薬ラベル１～１４および２０のいずれかを過剰に含む溶液（Ｓ１）と比較し、メタノールで希釈した溶液（Ｓ２）を加え（モル比＞１０００）、氷酢酸（２０％ｖ／ｖ）で酸性化した。溶液Ｓ１およびＳ２を混合して溶液Ｓ３を得て、６５℃で２時間保持し、続いて室温で１２時間保持した。１２時間後、溶液Ｓ３をメタノールで希釈して、１当量のテストステロンの分子量に基づいて５つの独立した濃度レベル：１／２０当量のテストステロン；１／４０当量のテストステロン；１／１００当量のテストステロンおよび１／２００当量のテストステロンを得た。１当量は依然として検出器の線形範囲内にあるように、１／２００当量のテストステロンは使用される機器の検出限界未満であるように選択される。より高感度の機器では、濃度を適切なシステム検出限界に適合するように調整した。例として、以下の濃度をＷａｔｅｒｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏシステム（１００ｎｇ／ｍｌ；５ｎｇ／ｍｌ；２、５ｎｇ／ｍｌ；１ｎｇ／ｍｌ；５００ｐｇ／ｍｌ）に使用した。溶液Ｓ２を使用することにより、０ｎｇ／ｍｌのブランク溶液を調製した。
テストステロンの５００ｎｇ／ｍｌのメタノール中溶液（Ｓ１）を調製した。誘導体化試薬ラベル１～１４および２０のいずれかを過剰に含む溶液（Ｓ１）と比較し、メタノールで希釈した溶液（Ｓ２）を加え（モル比＞１０００）、氷酢酸（２０％ｖ／ｖ）で酸性化した。溶液Ｓ１およびＳ２を混合して溶液Ｓ３を得て、６５℃で２時間保持し、続いて室温で１２時間保持した。１２時間後、溶液Ｓ３をメタノールで希釈して、１当量のテストステロンの分子量に基づいて５つの独立した濃度レベル：１／２０当量のテストステロン；１／４０当量のテストステロン；１／１００当量のテストステロンおよび１／２００当量のテストステロンを得た。１当量は依然として検出器の線形範囲内にあるように、１／２００当量のテストステロンは使用される機器の検出限界未満であるように選択される。より高感度の機器では、濃度を適切なシステム検出限界に適合するように調整した。例として、以下の濃度をＷａｔｅｒｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏシステム（１００ｎｇ／ｍｌ；５ｎｇ／ｍｌ；２、５ｎｇ／ｍｌ；１ｎｇ／ｍｌ；５００ｐｇ／ｍｌ）に使用した。溶液Ｓ２を使用することにより、０ｎｇ／ｍｌのブランク溶液を調製した。
【0316】
分析物分子の誘導体化後、異性体が誘導され、これにより、しばしば複数のピークがもたらされ得る。これらの異性体のクロマトグラフィー挙動は、それらの特性を相対的に定量する方法で対処する必要がある。例示的な図１は、絶対ピーク高さの５％において特定のクロマトグラフィー法を適用した経時的なシグナル分布（％）を示す。「分割」のパラメータは、分析物分子の誘導体化反応から生じる異性体を分離するクロマトグラフシステムの能力を記述する。異性体ピークの重心で測定された保持時間は、逆相クロマトグラフィー材料を分離に使用する場合、得られた誘導体の極性を表し得る。面積Ａ１およびＡ２は、シグナル数＊分で測定され、それぞれ得られた誘導異性体の比として報告される。ピークＡ１とＡ２との比が５０／５０である場合、得られる異性体は等量で生成される。ラベルがこの比率に影響を及ぼして５０／５０に等しくない場合、主に２種の異性体が生成される。シグナル強度はしたがって不均一に分布し、影響を受けないバックグラウンドノイズに対してシグナル高さを増大させる。
【0317】
各標識化物質について、それぞれのテストステロン誘導体を液体クロマトグラフィー分離後にエレクトロスプレイイオン化質量分析によって測定し、１５Ｖ、２０Ｖ、２５Ｖ、３０Ｖ、３５Ｖ、および４０Ｖの衝突エネルギーを持つ種々のフラグメンテーション走査を行った。
【0318】
分子イオンピークおよび最も豊富なフラグメントイオンピーク（中性損失または特定の主フラグメント）の質量シグナルは、フラグメンテーションの最適化に使用されている。フラグメンテーションエネルギーは、中性損失を有する荷電分子の信号利得、および／またはフラグメンテーション方法単位に関する場合、最も重要な調整パラメータの１つである。フラグメンテーションのエネルギーは、分子がソースおよび更なるイオン経路条件中に開裂されない必要があるために、重要である。中性損失断片を切断すること、または切断は、目的の特定の断片を形成するために、コリジョンセル（および／または関連デバイス）でのみ行うべきである。中性損失フラグメントの開裂のために衝突エネルギーを非常に高くする必要がある場合にもまた、中性損失フラグメンテーション経路に対するシグナル強度の損失をもたらす他の望ましくないフラグメンテーション経路も生じ得る。衝突エネルギーは小さくなく、かつ最適なフラグメンテーション挙動を得るのに大き過ぎないものと仮定する。それぞれの衝突エネルギーによる面積計数の最大値を、更なる検出限界定量化アプローチに使用した。
【0319】
あらゆる標識物質について、それぞれのテストステロン誘導体を、液体クロマトグラフィーを介して質量分析計に注入することによって、トリプル四重極質量分析計で調整した。調整パラメータは、５つの独立した衝突エネルギー実験において、それぞれのクロマトグラフィーピークの最も高いシグナルをもたらした衝突エネルギーであった。最適化されたＭＳパラメータは、ポイント（Ｃ）の一般的なＬＣおよびＭＳパラメータによって適用されている。
【0320】
クロマトグラフィーおよびＭＳパラメータ
● 極性 ＥＳ＋
● 較正 静的２
● キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．００
● コーン（Ｖ）５０．００ ５３．３６
● 抽出器（Ｖ）３．００ ３．５４
● ＲＦレンズ（Ｖ）０．２ ０．２
● ソース温度（℃）１４０ １３８
● 脱溶媒和温度（℃）３５０ ３４８
● コーンガス流量（Ｌ／時）５０ ４９
● 脱溶媒和ガス流量（Ｌ／時）６５０ ６４６
● ＬＭ１解像度 ５．０
● ＨＭ１解像度 １５．０
● イオンエネルギー１ １．０
● 入口 ５０－６５
● 衝突 ２－１５
● 出口 ５０－６５
● ＬＭ２解像度 ５．０
● ＨＭ２解像度 １５．０
● イオンエネルギー２ １．０
● 乗算器（Ｖ）６５０－６４７
● シリンジポンプ流量（ｕＬ／分）４０．０
● ガス・セル・ピラニ圧（ｍｂａｒ）１．８７ｅ－４
● 機器パラメータ－機能２：
● 極性 ＥＳ＋
● 較正 静的２
● キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．００
● コーン（Ｖ）５０．００ ５３．３６
● 抽出器（Ｖ）３．００ ３．５４
● ＲＦレンズ（Ｖ）０．２ ０．２
● ソース温度（℃）１４０ １３８
● 脱溶媒和温度（℃）３５０ ３４８
● コーンガス流量（Ｌ／時）５０ ４９
● 脱溶媒和ガス流量（Ｌ／時）６５０ ６４６
● ＬＭ１解像度 ５．０
● ＨＭ１解像度 １５．０
● イオンエネルギー１ １．０
● 入口 ５０－６５
● 衝突 ２－１５
● 出口 ５０－６５
● ＬＭ２解像度 ５．０
● ＨＭ２解像度 １５．０
● イオンエネルギー２ １．０
● 乗算器（Ｖ）６５０－６４７
● シリンジポンプ流量（ｕＬ／分）４０．０
● ガス・セル・ピラニ圧（ｍｂａｒ）１．８７ｅ－４
● 機器パラメータ－機能３：
● 極性 ＥＳ＋
● 較正 静的２
● キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．００
● コーン（Ｖ）５０．００ ５３．３６
● 抽出器（Ｖ）３．００ ３．５４
● ＲＦレンズ（Ｖ）０．２ ０．２
● ソース温度（℃）１４０ １３８
● 脱溶媒和温度（℃）３５０ ３４８
● コーンガス流量（Ｌ／時）５０ ４９
● 脱溶媒和ガス流量（Ｌ／時）６５０ ６４６
● ＬＭ１解像度 ５．０
● ＨＭ１解像度 １５．０
● イオンエネルギー１ １．０
● 入口 ５０－６５
● 衝突 ２－１５
● 出口 ５０－６５
● ＬＭ２解像度 ５．０
● ＨＭ２解像度 １５．０
● イオンエネルギー２ １．０
● 乗算器（Ｖ）６５０－６４７
● シリンジポンプ流量（ｕＬ／分）４０．０
● ガス・セル・ピラニ圧（ｍｂａｒ）１．８７ｅ－４
● ＡＣＥ実験記録
●－－－－－－－－－－－－－－－－メソッドパラメータ実行－－－－－－－－－－－
● Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＳＤＳ
● 運転時間：１０．００分
● コメント：
● 溶媒選択Ａ：Ａ１＝水中０．１％ギ酸
● 溶媒選択Ｂ：Ｂ１＝メタノール中０．１％ギ酸
● 低圧限界：０．０００バール
● 高圧限界：１０３４．２００バール
● 溶媒名Ａ：水
● 溶媒名Ｂ：アセトニトリル
● スイッチ１：変更せず
● スイッチ２：オン
● スイッチ３：変更せず
● シールウォッシュ：５．０分
● チャートアウト１：システム圧力
● チャートアウト２：％Ｂ
● システム圧力データチャネル：あり
● 流量データチャネル：なし
● ％Ａデータチャネル：なし
● ％Ｂデータチャネル：なし
● プライマリＡ圧力データチャネル：なし
● アキュムレータＡ圧力データチャネル：なし
● プライマリＢ圧力データチャネル：なし
● アキュムレータＢ圧力データチャネル：なし
● デガッサ圧力データチャネル：なし
● ［勾配テーブル］
● 時間（分）流量 ％Ａ ％Ｂ 曲線
● １．初期０．４００ ９８．０ ２．０
● ２．７．０００．４００２０．０８０．０６
● ３．７．１００．４０００．０１００．０６
● ４．８．０００．４０００．０１００．０６
● ５．８．１００．４００９８．０２．０６
● ６．１０．０００．４００９８．０２．０６
● イベント実行：あり
● ［イベントテーブル］
● 実行時間（分）イベント操作 パラメータ
● １．０．１０ スイッチ２オン ０．００
● ２．３．５０ スイッチ２オフ ０．００
● ３．９．００ スイッチ２オン ０．００
● Ｗａｔｅｒｓ９９６ ＰＤＡ
● 開始波長（ｎｍ）２１０．００
● 終了波長（ｎｍ）４００．００
● 解像度（ｎｍ）１．２
● サンプリングレート（スペクトル／秒）２．０００
● フィルタ応答 １
● 露出時間（ミリ秒）自動
● Ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｅ ６５６ あり
● 取得停止時間（分）１０．００
● ディスクに保存：あり
● Ｗａｔｅｒｓ ９９６ ＰＤＡアナログチャネル１
● 出力モード オフ
● Ｗａｔｅｒｓ ９９６ ＰＤＡアナログチャネル２
● 出力モード オフ
●
● Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＡｕｔｏＳａｍｐｌｅｒ
● 運転時間：１０．００分
● コメント：
● 事前ロード：無効
● ループオプション：ニードルオーバーフィルを用いたパーシャルループ
● ＬｏｏｐＯｆｆｌｉｎｅ：無効
● 弱洗浄溶媒名：メタノール
● 弱洗浄量：６００ｕＬ
● 強洗浄溶媒名：メタノール
● 強洗浄量：２００ｕＬ
● 目標カラム温度：４０．０℃
● カラム温度アラームバンド：２０．０℃
● 目標サンプル温度：１０．０℃
● サンプル温度アラームバンド：１０℃
● フル・ループ・オーバーフィル要素：自動
● シリンジ引出速度：自動
● ニードル配置：自動
● 吸引前エアギャップ：自動
● 吸引後エアギャップ：自動
● カラム温度データチャネル：あり
● 周囲温度データチャネル：あり
● サンプル温度データチャネル：なし
● サンプルオーガナイザ温度データチャネル：なし
● サンプル圧力データチャネル：なし
● スイッチ１：変更せず
● スイッチ２：オン
● スイッチ３：変更せず
● スイッチ４：変更せず
● チャートアウト：サンプル圧力
● サンプル温度アラーム：有効
● カラム温度アラーム：有効
● イベント実行：あり
● ［イベントテーブル］
● 実行時（分）イベント操作
● １．０．１０ スイッチ２オン
● ２．３．００ スイッチ２オフ
● ３．３．１０ スイッチ２トグル
● ４．８．００ スイッチ２パルス
● ５．８．１０ スイッチ２オフ
● ６．１０．００ スイッチ２オン
● ニードルオーバーフィルフラッシュ：自動
● サンプル分析注入パラメータ
● 注入量（ｕＬ）－１０．００
● 極性 ＥＳ＋
● 較正 静的２
● キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．００
● コーン（Ｖ）５０．００ ５３．３６
● 抽出器（Ｖ）３．００ ３．５４
● ＲＦレンズ（Ｖ）０．２ ０．２
● ソース温度（℃）１４０ １３８
● 脱溶媒和温度（℃）３５０ ３４８
● コーンガス流量（Ｌ／時）５０ ４９
● 脱溶媒和ガス流量（Ｌ／時）６５０ ６４６
● ＬＭ１解像度 ５．０
● ＨＭ１解像度 １５．０
● イオンエネルギー１ １．０
● 入口 ５０－６５
● 衝突 ２－１５
● 出口 ５０－６５
● ＬＭ２解像度 ５．０
● ＨＭ２解像度 １５．０
● イオンエネルギー２ １．０
● 乗算器（Ｖ）６５０－６４７
● シリンジポンプ流量（ｕＬ／分）４０．０
● ガス・セル・ピラニ圧（ｍｂａｒ）１．８７ｅ－４
● 機器パラメータ－機能２：
● 極性 ＥＳ＋
● 較正 静的２
● キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．００
● コーン（Ｖ）５０．００ ５３．３６
● 抽出器（Ｖ）３．００ ３．５４
● ＲＦレンズ（Ｖ）０．２ ０．２
● ソース温度（℃）１４０ １３８
● 脱溶媒和温度（℃）３５０ ３４８
● コーンガス流量（Ｌ／時）５０ ４９
● 脱溶媒和ガス流量（Ｌ／時）６５０ ６４６
● ＬＭ１解像度 ５．０
● ＨＭ１解像度 １５．０
● イオンエネルギー１ １．０
● 入口 ５０－６５
● 衝突 ２－１５
● 出口 ５０－６５
● ＬＭ２解像度 ５．０
● ＨＭ２解像度 １５．０
● イオンエネルギー２ １．０
● 乗算器（Ｖ）６５０－６４７
● シリンジポンプ流量（ｕＬ／分）４０．０
● ガス・セル・ピラニ圧（ｍｂａｒ）１．８７ｅ－４
● 機器パラメータ－機能３：
● 極性 ＥＳ＋
● 較正 静的２
● キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．００
● コーン（Ｖ）５０．００ ５３．３６
● 抽出器（Ｖ）３．００ ３．５４
● ＲＦレンズ（Ｖ）０．２ ０．２
● ソース温度（℃）１４０ １３８
● 脱溶媒和温度（℃）３５０ ３４８
● コーンガス流量（Ｌ／時）５０ ４９
● 脱溶媒和ガス流量（Ｌ／時）６５０ ６４６
● ＬＭ１解像度 ５．０
● ＨＭ１解像度 １５．０
● イオンエネルギー１ １．０
● 入口 ５０－６５
● 衝突 ２－１５
● 出口 ５０－６５
● ＬＭ２解像度 ５．０
● ＨＭ２解像度 １５．０
● イオンエネルギー２ １．０
● 乗算器（Ｖ）６５０－６４７
● シリンジポンプ流量（ｕＬ／分）４０．０
● ガス・セル・ピラニ圧（ｍｂａｒ）１．８７ｅ－４
● ＡＣＥ実験記録
●－－－－－－－－－－－－－－－－メソッドパラメータ実行－－－－－－－－－－－
● Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＳＤＳ
● 運転時間：１０．００分
● コメント：
● 溶媒選択Ａ：Ａ１＝水中０．１％ギ酸
● 溶媒選択Ｂ：Ｂ１＝メタノール中０．１％ギ酸
● 低圧限界：０．０００バール
● 高圧限界：１０３４．２００バール
● 溶媒名Ａ：水
● 溶媒名Ｂ：アセトニトリル
● スイッチ１：変更せず
● スイッチ２：オン
● スイッチ３：変更せず
● シールウォッシュ：５．０分
● チャートアウト１：システム圧力
● チャートアウト２：％Ｂ
● システム圧力データチャネル：あり
● 流量データチャネル：なし
● ％Ａデータチャネル：なし
● ％Ｂデータチャネル：なし
● プライマリＡ圧力データチャネル：なし
● アキュムレータＡ圧力データチャネル：なし
● プライマリＢ圧力データチャネル：なし
● アキュムレータＢ圧力データチャネル：なし
● デガッサ圧力データチャネル：なし
● ［勾配テーブル］
● 時間（分）流量 ％Ａ ％Ｂ 曲線
● １．初期０．４００ ９８．０ ２．０
● ２．７．０００．４００２０．０８０．０６
● ３．７．１００．４０００．０１００．０６
● ４．８．０００．４０００．０１００．０６
● ５．８．１００．４００９８．０２．０６
● ６．１０．０００．４００９８．０２．０６
● イベント実行：あり
● ［イベントテーブル］
● 実行時間（分）イベント操作 パラメータ
● １．０．１０ スイッチ２オン ０．００
● ２．３．５０ スイッチ２オフ ０．００
● ３．９．００ スイッチ２オン ０．００
● Ｗａｔｅｒｓ９９６ ＰＤＡ
● 開始波長（ｎｍ）２１０．００
● 終了波長（ｎｍ）４００．００
● 解像度（ｎｍ）１．２
● サンプリングレート（スペクトル／秒）２．０００
● フィルタ応答 １
● 露出時間（ミリ秒）自動
● Ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｅ ６５６ あり
● 取得停止時間（分）１０．００
● ディスクに保存：あり
● Ｗａｔｅｒｓ ９９６ ＰＤＡアナログチャネル１
● 出力モード オフ
● Ｗａｔｅｒｓ ９９６ ＰＤＡアナログチャネル２
● 出力モード オフ
●
● Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＡｕｔｏＳａｍｐｌｅｒ
● 運転時間：１０．００分
● コメント：
● 事前ロード：無効
● ループオプション：ニードルオーバーフィルを用いたパーシャルループ
● ＬｏｏｐＯｆｆｌｉｎｅ：無効
● 弱洗浄溶媒名：メタノール
● 弱洗浄量：６００ｕＬ
● 強洗浄溶媒名：メタノール
● 強洗浄量：２００ｕＬ
● 目標カラム温度：４０．０℃
● カラム温度アラームバンド：２０．０℃
● 目標サンプル温度：１０．０℃
● サンプル温度アラームバンド：１０℃
● フル・ループ・オーバーフィル要素：自動
● シリンジ引出速度：自動
● ニードル配置：自動
● 吸引前エアギャップ：自動
● 吸引後エアギャップ：自動
● カラム温度データチャネル：あり
● 周囲温度データチャネル：あり
● サンプル温度データチャネル：なし
● サンプルオーガナイザ温度データチャネル：なし
● サンプル圧力データチャネル：なし
● スイッチ１：変更せず
● スイッチ２：オン
● スイッチ３：変更せず
● スイッチ４：変更せず
● チャートアウト：サンプル圧力
● サンプル温度アラーム：有効
● カラム温度アラーム：有効
● イベント実行：あり
● ［イベントテーブル］
● 実行時（分）イベント操作
● １．０．１０ スイッチ２オン
● ２．３．００ スイッチ２オフ
● ３．３．１０ スイッチ２トグル
● ４．８．００ スイッチ２パルス
● ５．８．１０ スイッチ２オフ
● ６．１０．００ スイッチ２オン
● ニードルオーバーフィルフラッシュ：自動
● サンプル分析注入パラメータ
● 注入量（ｕＬ）－１０．００
【0321】
直線較正曲線から、それぞれの検出限界をＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ ３２６４５に記述の手順を用いて得た。増強因子は、非誘導体化された分析物ＬＯＤ、例えば非誘導体化テストステロンＬＯＤと比較して、標識された分析物の検出限界（ＬＯＤ）、例えば標識されたテストステロン検出限界（ＬＯＤ）に基づいて算出される。ワークフローを図２に示す。結果を下記表５に示す。
【表5】
【0322】
表５から分かるように、提示された全ての誘導体または複合体は、非誘導体化分析物と比較してシグナル増強を示す。新しい構造のほぼ全ての誘導体（ラベル２を除く）は、最新技術の誘導体化剤、例えばＳｃｉｅｘのＧｉｒａｒｄＴおよびＡｍｐｌｉｆｅｘよりも優れている。
【0323】
実施例１４：ラベル－ビタミンＤ誘導体（複合体）の調製およびＭＳによるその分析
実施例１４．１：ＴＡＤ（トリアゾリンジオン）のビタミンＤとの一般的反応
２５－ヒドロキシビタミンＤ一水和物（０．０２４ｍｍｏｌ）およびＴＡＤ誘導体（０．０３６ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮに溶解した。溶液を室温（ｒ．ｔ．）で１０分間攪拌した。ビタミンＤの対応する生成物への完全な変換が観察された。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を固体として得た。
実施例１４．１：ＴＡＤ（トリアゾリンジオン）のビタミンＤとの一般的反応
【化45】
【0324】
実施例１４．２：ＴＡＤ試薬（ラベル１５）に対するウラゾールのインサイチュー活性化およびビタミンＤとの反応
２５－ヒドロキシビタミンＤ一水和物（０．０２４ｍｍｏｌ）および［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾリジン－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテート（０．０２９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５００μＬ）に溶解した。ＭｅＯＨ中のヨードベンゼンジアセテート（０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液を第一の溶液に添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。ビタミンＤの対応する生成物への完全な変換が観察された。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な生成物を白色固体として得た。
【化46】
【0325】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～２０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
２０～４０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～４５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４５～５０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５０～５５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５５～６５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．５２（ｓ，３ Ｈ）０．８７－１．０１（ｍ，４ Ｈ）１．１５（ｓ，６ Ｈ）１．１９－１．４７（ｍ，１２ Ｈ）１．６５－１．７８（ｍ，４ Ｈ）１．８３－１．９２（ｍ，２ Ｈ）１．９５－２．０８（ｍ，４ Ｈ）２．１５－２．３０（ｍ，２ Ｈ）２．８６－２．９４（ｍ，１ Ｈ）３．１２（ｓ，９ Ｈ）４．０６－３．８６（ｍ，２ Ｈ）４．１２－４．２３（ｍ，１ Ｈ）４．５６（ｓ，２ Ｈ）５．０１－５．１１（ｍ，１ Ｈ）７．６２－７．７４（ｍ，４ Ｈ）．
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は６４７．４５３０８である。実験的に決定されたｍ／ｚの値は６４７．４９である。
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～２０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
２０～４０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～４５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４５～５０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５０～５５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５５～６５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．５２（ｓ，３ Ｈ）０．８７－１．０１（ｍ，４ Ｈ）１．１５（ｓ，６ Ｈ）１．１９－１．４７（ｍ，１２ Ｈ）１．６５－１．７８（ｍ，４ Ｈ）１．８３－１．９２（ｍ，２ Ｈ）１．９５－２．０８（ｍ，４ Ｈ）２．１５－２．３０（ｍ，２ Ｈ）２．８６－２．９４（ｍ，１ Ｈ）３．１２（ｓ，９ Ｈ）４．０６－３．８６（ｍ，２ Ｈ）４．１２－４．２３（ｍ，１ Ｈ）４．５６（ｓ，２ Ｈ）５．０１－５．１１（ｍ，１ Ｈ）７．６２－７．７４（ｍ，４ Ｈ）．
ＬＣ－ＥＳＩ＋ｍ／ｚの計算値は６４７．４５３０８である。実験的に決定されたｍ／ｚの値は６４７．４９である。
【0326】
実施例１４．３：上記または下記の例示的なラベルを使用したビタミンＤの分析的誘導体化
２５－ＯＨビタミンＤ３の５００ｐｇ／ｍｌのメタノール中溶液（Ｓ１）を調製した。ウマ血清はメタノール（－２０℃）を用い、ウマ血清１ｍＬ＋メタノール３ｍＬの割合で枯渇化させた。ウマ血清／メタノール混合物を混合し、遠心分離し、上清を移して溶液を得た（Ｓ２）。溶液Ｓ１およびＳ２を１：５の比で混合して溶液Ｓ３を得た。溶液Ｓ３を濃縮乾固した。過剰量の誘導体化試薬標識を含む溶液（Ｓ３）と比較して、メタノール（モル比＞１０００）で希釈した溶液（Ｓ４）を添加し、得られた溶液を混合した。２ｍｇ／ｍＬのメタノール中のヨードベンゼンジアセテートの溶液（Ｓ５）を添加し、得られた溶液（Ｓ６）を４０℃で２分間撹拌した。溶液Ｓ６をメタノール／Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸で希釈して、定量化のための適切な濃度レベルを得た。
２５－ＯＨビタミンＤ３の５００ｐｇ／ｍｌのメタノール中溶液（Ｓ１）を調製した。ウマ血清はメタノール（－２０℃）を用い、ウマ血清１ｍＬ＋メタノール３ｍＬの割合で枯渇化させた。ウマ血清／メタノール混合物を混合し、遠心分離し、上清を移して溶液を得た（Ｓ２）。溶液Ｓ１およびＳ２を１：５の比で混合して溶液Ｓ３を得た。溶液Ｓ３を濃縮乾固した。過剰量の誘導体化試薬標識を含む溶液（Ｓ３）と比較して、メタノール（モル比＞１０００）で希釈した溶液（Ｓ４）を添加し、得られた溶液を混合した。２ｍｇ／ｍＬのメタノール中のヨードベンゼンジアセテートの溶液（Ｓ５）を添加し、得られた溶液（Ｓ６）を４０℃で２分間撹拌した。溶液Ｓ６をメタノール／Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸で希釈して、定量化のための適切な濃度レベルを得た。
【0327】
直線較正曲線から、それぞれの検出限界をＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ ３２６４５に記述の手順を用いて得た。増強因子は、非誘導体化ビタミンＤＬＯＤと比較して、標識ビタミンＤ検出限界（ＬＯＤ）に基づいて算出する。複合体の結果を以下の表６に示す。
【表6】
【0328】
ビタミンＤまたはビタミンＤとの複合体のための全ての誘導体は、有意なシグナル増強を示す。誘導体の異性体は検出されていない。したがって、保持時間および分裂ならびにピーク幅のパラメータは必要ではなく、それ故、本開示では提示されない。
【0329】
実施形態では、複合体は、以下の群から選択し得る。
【化47】
【化48】
【化49】
【0330】
実施例１５：ラベル－エストラジオール誘導体（複合体）の調製およびＭＳによるその分析
実施例１５．１：［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾリジン－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテートのエストラジオール（ラベル１５およびエストラジオールまたはその誘導体を含む複合体）との反応
［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾリジン－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテート（０．０５ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（２００μＬ）に溶解し、ＤＢＨ（０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。急速に赤色に変化した溶液を室温で１０分間撹拌した。次いで、この溶液をβ－エストラジオール（０．０５ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ／リン酸緩衝液１：１（１．２ｍＬ）中溶液に滴下した。室温で３０分間撹拌した後、溶媒を真空下で除去した。未精製の生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、２つの異性体ＡおよびＢを３：１の比で単離した。
実施例１５．１：［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４トリアゾリジン－４－イル）フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテートのエストラジオール（ラベル１５およびエストラジオールまたはその誘導体を含む複合体）との反応
【化50】
【0331】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：５０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，５０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６５～７５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７５～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：５０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，５０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６５～７５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７５～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
【0332】
異性体Ａ：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７７（ｄ，Ｊ＝２．５１ Ｈｚ，３ Ｈ）１．１２－１．５８（ｍ，７ Ｈ）１．６５－１．７６（ｍ，１ Ｈ）１．９０－２．１０（ｍ，３ Ｈ）２．１２－２．２６（ｍ，１ Ｈ）２．３４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．９２ Ｈｚ，１ Ｈ）２．７１－２．８４（ｍ，１ Ｈ）２．８６－２．９６（ｍ，１ Ｈ）３．１３（ｓ，９ Ｈ）３．６１－３．７０（ｍ，１ Ｈ）４．５７（ｓ，２ Ｈ）６．７８（ｄ，Ｊ＝８．５３ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３１（ｄ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．６７－７．７３（ｍ，２ Ｈ）７．７３－７．７９（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値 ５１９．２９６５８、実測値５１９．４５．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７７（ｄ，Ｊ＝２．５１ Ｈｚ，３ Ｈ）１．１２－１．５８（ｍ，７ Ｈ）１．６５－１．７６（ｍ，１ Ｈ）１．９０－２．１０（ｍ，３ Ｈ）２．１２－２．２６（ｍ，１ Ｈ）２．３４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．９２ Ｈｚ，１ Ｈ）２．７１－２．８４（ｍ，１ Ｈ）２．８６－２．９６（ｍ，１ Ｈ）３．１３（ｓ，９ Ｈ）３．６１－３．７０（ｍ，１ Ｈ）４．５７（ｓ，２ Ｈ）６．７８（ｄ，Ｊ＝８．５３ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３１（ｄ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．６７－７．７３（ｍ，２ Ｈ）７．７３－７．７９（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値 ５１９．２９６５８、実測値５１９．４５．
【0333】
異性体Ｂ：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７８（ｓ，３ Ｈ）１．１５－１．５８（ｍ，７ Ｈ）１．６５－１．７７（ｍ，２ Ｈ）１．８６－２．０９（ｍ，２ Ｈ）２．１３－２．２２（ｍ，１ Ｈ）２．２５－２．３３（ｍ，１ Ｈ）２．８２（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝８．１６，３．７６ Ｈｚ，２ Ｈ）３．１３（ｓ，９ Ｈ）３．６５（ｂｒ ｔ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）４．５４－４．６１（ｍ，２ Ｈ）６．６８（ｓ，１ Ｈ）７．３４（ｓ，１ Ｈ）７．６６－７．７３（ｍ，２ Ｈ）７．７３－７．７９（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値５１９．２９６５８、実測値５１９．３３．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７８（ｓ，３ Ｈ）１．１５－１．５８（ｍ，７ Ｈ）１．６５－１．７７（ｍ，２ Ｈ）１．８６－２．０９（ｍ，２ Ｈ）２．１３－２．２２（ｍ，１ Ｈ）２．２５－２．３３（ｍ，１ Ｈ）２．８２（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝８．１６，３．７６ Ｈｚ，２ Ｈ）３．１３（ｓ，９ Ｈ）３．６５（ｂｒ ｔ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）４．５４－４．６１（ｍ，２ Ｈ）６．６８（ｓ，１ Ｈ）７．３４（ｓ，１ Ｈ）７．６６－７．７３（ｍ，２ Ｈ）７．７３－７．７９（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値５１９．２９６５８、実測値５１９．３３．
【0334】
実施例１５．２：ラベル１６－エストラジオール誘導体の調製
β－エストラジオール（０．０９ｍｍｏｌ）、Ｎ－［４－［（ジメチルアミノ）メチル］フェニル］－５－フルオロ－２，４－ジニトロ－アニリン（０．１１ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（０．１８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、ＭｅＩ（０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を１Ｍ ＨＣｌで酸性化し、溶媒を真空下で除去した。未精製の化合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、黄色固体を得た。分取ＨＰＬＣは当業者に公知であり、したがって詳細には説明しない。
【化51】
【0335】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：８０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，２０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：３０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，７０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７８（ｓ，３ Ｈ）１．１７－１．４５（ｍ，６ Ｈ）１．４７－１．５８（ｍ，１ Ｈ）１．６３－１．７８（ｍ，１ Ｈ）１．８４－１．９４（ｍ，１ Ｈ）１．９４－２．１１（ｍ，２ Ｈ）２．１１－２．１８（ｍ，１ Ｈ）２．２３－２．３８（ｍ，１ Ｈ）２．８２（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝８．４１，４．１４ Ｈｚ，２ Ｈ）３．０５－３．１２（ｍ，９ Ｈ）３．６７（ｔ，Ｊ＝８．６０ Ｈｚ，１ Ｈ）４．４７（ｓ，２ Ｈ）６．５６－６．６４（ｍ，１ Ｈ）６．８２（ｄ，Ｊ＝２．６４ Ｈｚ，１ Ｈ）６．８６（ｄｄ，Ｊ＝８．５３，２．６４ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３１（ｄ，Ｊ＝８．２８ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３５－７．４２（ｍ，２ Ｈ）７．４５－７．５４（ｍ，２ Ｈ）９．０５（ｓ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値６０１．３０２０６、実測値６０１．３９．
０分：８０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，２０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：３０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，７０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７８（ｓ，３ Ｈ）１．１７－１．４５（ｍ，６ Ｈ）１．４７－１．５８（ｍ，１ Ｈ）１．６３－１．７８（ｍ，１ Ｈ）１．８４－１．９４（ｍ，１ Ｈ）１．９４－２．１１（ｍ，２ Ｈ）２．１１－２．１８（ｍ，１ Ｈ）２．２３－２．３８（ｍ，１ Ｈ）２．８２（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝８．４１，４．１４ Ｈｚ，２ Ｈ）３．０５－３．１２（ｍ，９ Ｈ）３．６７（ｔ，Ｊ＝８．６０ Ｈｚ，１ Ｈ）４．４７（ｓ，２ Ｈ）６．５６－６．６４（ｍ，１ Ｈ）６．８２（ｄ，Ｊ＝２．６４ Ｈｚ，１ Ｈ）６．８６（ｄｄ，Ｊ＝８．５３，２．６４ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３１（ｄ，Ｊ＝８．２８ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３５－７．４２（ｍ，２ Ｈ）７．４５－７．５４（ｍ，２ Ｈ）９．０５（ｓ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値６０１．３０２０６、実測値６０１．３９．
【0336】
実施例１５．３：ラベル１７－エストラジオール誘導体の調製
国際公開第２０００００９４９８号に報告されているように、Ｎ－（ｐ－クロロスルホニルフェニルメチル）ピリジニウムブロミドを合成した。
【化52】
【0337】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：３０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，７０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７５（ｓ，３ Ｈ）１．１１－１．５６（ｍ，７ Ｈ）１．６２－１．７５（ｍ，１ Ｈ）１．８０－１．８９（ｍ，１ Ｈ）１．９０－２．０８（ｍ，２ Ｈ）２．１０－２．２０（ｍ，１ Ｈ）２．２３－２．３２（ｍ，１ Ｈ）２．６７－２．７５（ｍ，２ Ｈ）３．６４（ｔ，Ｊ＝８．６０ Ｈｚ，１ Ｈ）５．９７（ｓ，２ Ｈ）６．６１－６．７５（ｍ，２ Ｈ）７．１９（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，１ Ｈ）７．６６（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈｚ，２ Ｈ）７．９０（ｍ，Ｊ＝８．２８ Ｈｚ，２ Ｈ）８．１７（ｔ，Ｊ＝７．０９ Ｈｚ，２ Ｈ）８．５９－８．７２（ｍ，１ Ｈ）９．０９（ｄ，Ｊ＝５．７７ Ｈｚ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値５０４．２２０３０、実測値５０４．２８．
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：３０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，７０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７５（ｓ，３ Ｈ）１．１１－１．５６（ｍ，７ Ｈ）１．６２－１．７５（ｍ，１ Ｈ）１．８０－１．８９（ｍ，１ Ｈ）１．９０－２．０８（ｍ，２ Ｈ）２．１０－２．２０（ｍ，１ Ｈ）２．２３－２．３２（ｍ，１ Ｈ）２．６７－２．７５（ｍ，２ Ｈ）３．６４（ｔ，Ｊ＝８．６０ Ｈｚ，１ Ｈ）５．９７（ｓ，２ Ｈ）６．６１－６．７５（ｍ，２ Ｈ）７．１９（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，１ Ｈ）７．６６（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈｚ，２ Ｈ）７．９０（ｍ，Ｊ＝８．２８ Ｈｚ，２ Ｈ）８．１７（ｔ，Ｊ＝７．０９ Ｈｚ，２ Ｈ）８．５９－８．７２（ｍ，１ Ｈ）９．０９（ｄ，Ｊ＝５．７７ Ｈｚ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値５０４．２２０３０、実測値５０４．２８．
【0338】
実施例１５．４：エストラジオールと塩化スルホニル誘導体化試薬との一般的な反応（例えば、ラベル２３および２４）
β－エストラジオール（０．０７ｍｍｏｌ）および塩化スルホニル誘導体（０．０７ｍｍｏｌ）を、無水ＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）に溶解した。次いで、塩基（ＴＭＡまたはＴＥＡ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、未精製の化合物を分取ＨＰＬＣによって精製した。精製した生成物を固体として得た。
【化53】
【0339】
実施例１５．４．１：ラベル２４－エストラジオール誘導体の調製
【化54】
【0340】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：２０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，８０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７５（ｓ，３ Ｈ）１．１１－１．５５（ｍ，７ Ｈ）１．５９－１．７７（ｍ，１ Ｈ）１．８１－１．９０（ｍ，１ Ｈ）１．９０－２．０７（ｍ，２ Ｈ）２．１１－２．２２（ｍ，１ Ｈ）２．２８（ｄｑ，Ｊ＝１３．３２，３．５９ Ｈｚ，１ Ｈ）２．７０－２．７８（ｍ，２ Ｈ）３．１３（ｓ，９ Ｈ）３．６４（ｔ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）４．６３（ｓ，２ Ｈ）６．６９－６．７４（ｍ，２ Ｈ）７．２２（ｄ，Ｊ＝９．１６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，２ Ｈ）７．９８（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値４８４．２５１６０、実測値４８４．３１．
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：２０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，８０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７５（ｓ，３ Ｈ）１．１１－１．５５（ｍ，７ Ｈ）１．５９－１．７７（ｍ，１ Ｈ）１．８１－１．９０（ｍ，１ Ｈ）１．９０－２．０７（ｍ，２ Ｈ）２．１１－２．２２（ｍ，１ Ｈ）２．２８（ｄｑ，Ｊ＝１３．３２，３．５９ Ｈｚ，１ Ｈ）２．７０－２．７８（ｍ，２ Ｈ）３．１３（ｓ，９ Ｈ）３．６４（ｔ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）４．６３（ｓ，２ Ｈ）６．６９－６．７４（ｍ，２ Ｈ）７．２２（ｄ，Ｊ＝９．１６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，２ Ｈ）７．９８（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値４８４．２５１６０、実測値４８４．３１．
【0341】
実施例１５．４．２：ラベル２３－エストラジオール誘導体の調製
【化55】
【0342】
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：３０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，７０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７７（ｓ，３ Ｈ）１．１５－１．５８（ｍ，８ Ｈ）１．６４－１．７７（ｍ，１ Ｈ）１．８５－２．１０（ｍ，４ Ｈ）２．２４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．４２ Ｈｚ，１ Ｈ）２．３４（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１３．４９，３．４５ Ｈｚ，１ Ｈ）２．８５（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝８．４７，３．９５ Ｈｚ，２ Ｈ）３．１１（ｓ，９ Ｈ）３．６６（ｔ，Ｊ＝８．５３ Ｈｚ，１ Ｈ）４．５４（ｓ，２ Ｈ）４．７７（ｓ，２ Ｈ）６．９２（ｄ，Ｊ＝２．６４ Ｈｚ，１ Ｈ）６．９７（ｄｄ，Ｊ＝８．４７，２．７０ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３３（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，１ Ｈ）７．５６－７．６３（ｍ，２ Ｈ）７．６３－７．６９（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値４９８．２６７２５、実測値４９８．４２．
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ、０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：３０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，７０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～８０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７７（ｓ，３ Ｈ）１．１５－１．５８（ｍ，８ Ｈ）１．６４－１．７７（ｍ，１ Ｈ）１．８５－２．１０（ｍ，４ Ｈ）２．２４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．４２ Ｈｚ，１ Ｈ）２．３４（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１３．４９，３．４５ Ｈｚ，１ Ｈ）２．８５（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝８．４７，３．９５ Ｈｚ，２ Ｈ）３．１１（ｓ，９ Ｈ）３．６６（ｔ，Ｊ＝８．５３ Ｈｚ，１ Ｈ）４．５４（ｓ，２ Ｈ）４．７７（ｓ，２ Ｈ）６．９２（ｄ，Ｊ＝２．６４ Ｈｚ，１ Ｈ）６．９７（ｄｄ，Ｊ＝８．４７，２．７０ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３３（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，１ Ｈ）７．５６－７．６３（ｍ，２ Ｈ）７．６３－７．６９（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］＋計算値４９８．２６７２５、実測値４９８．４２．
【0343】
実施例１５．５：ラベル１５、１７、２３および２４を使用したエストラジオールの分析的誘導体化
エストラジオールの５００ｐｇ／ｍｌのアセトニトリル中溶液（Ｓ１）を調製した。ウマ血清はアセトニトリル（－２０℃）を用い、ウマ血清１ｍＬ＋アセトニトリル３ｍＬの割合で枯渇化させた。ウマ血清／アセトニトリル－混合物を混合し、遠心分離し、上清を移して溶液を得た（Ｓ２）。溶液Ｓ１およびＳ２を１：５の比で混合して溶液Ｓ３を得た。メタノールで希釈した過剰の誘導体化試薬ラベル１０～１２（モル比＞１０００）のいずれかを含む溶液（Ｓ３）と比較した溶液（Ｓ４）を添加した。アセトニトリル／Ｈ２Ｏ９０／１０＋０，１％ギ酸中の５μｇ／ｍＬのＫ２ＣＯ３（Ｓ５）の溶液を調製した。溶液Ｓ３、Ｓ４およびＳ５を混合して溶液Ｓ６を得て、５０℃で１時間保持し、続いて室温で１２時間保持した。溶液Ｓ６をアセトニトリル／Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸で希釈して、定量化のための適切な濃度レベルを得た。
エストラジオールの５００ｐｇ／ｍｌのアセトニトリル中溶液（Ｓ１）を調製した。ウマ血清はアセトニトリル（－２０℃）を用い、ウマ血清１ｍＬ＋アセトニトリル３ｍＬの割合で枯渇化させた。ウマ血清／アセトニトリル－混合物を混合し、遠心分離し、上清を移して溶液を得た（Ｓ２）。溶液Ｓ１およびＳ２を１：５の比で混合して溶液Ｓ３を得た。メタノールで希釈した過剰の誘導体化試薬ラベル１０～１２（モル比＞１０００）のいずれかを含む溶液（Ｓ３）と比較した溶液（Ｓ４）を添加した。アセトニトリル／Ｈ２Ｏ９０／１０＋０，１％ギ酸中の５μｇ／ｍＬのＫ２ＣＯ３（Ｓ５）の溶液を調製した。溶液Ｓ３、Ｓ４およびＳ５を混合して溶液Ｓ６を得て、５０℃で１時間保持し、続いて室温で１２時間保持した。溶液Ｓ６をアセトニトリル／Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸で希釈して、定量化のための適切な濃度レベルを得た。
【0344】
直線較正曲線から、それぞれの検出限界をＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ ３２６４５に記述の手順を用いて得た。増強係数は、非誘導体化エストラジオールＬＯＤと比較して、標識化エストラジオール限界検出（ＬＯＤ）に基づいて算出される。結果を下記表７に示す。
【表7-1】
【表7-2】
【0345】
表７から分かるように、提示された全ての誘導体または複合体は、この場合エストラジオールの非誘導体化分析物と比較してシグナルの増強が示される。
【0346】
実施例１６：ラベル２０－分析物誘導体（複合体）の分析およびＭＳによる分析
複合体およびラベル２０は、前述のように合成される。
複合体およびラベル２０は、前述のように合成される。
【0347】
直線較正曲線から、それぞれの検出限界をＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ ３２６４５に記述の手順を用いて得た。増強因子は、非誘導体化分析物ＬＯＤと比較して、標識された分析物の検出限界（ＬＯＤ）に基づいて算出される。結果を下記表８に示す。
【表8】
【0348】
表８から分かるように、ラベル２０は、非誘導体化分析物と比較して１０倍のシグナル増強を示す。
【0349】
上記の化合物および例示的なラベルは、それぞれの適切な分析物と組み合わせ得る。例示的なラベルまたは例示的な分析物は、保護の範囲を限定すべきではない。当業者は、他の開示された分析物を開示された化合物と組み合わせて本発明の複合体を形成する方法を知っている。
【0350】
本特許出願は、欧州特許出願２０１７５７９８．６の優先権を主張し、この欧州特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】