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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-27
(54)【発明の名称】抗原の効力を決定するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/542 20060101AFI20230620BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20230620BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230620BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20230620BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230620BHJP
【ＦＩ】
G01N33/542
A61K39/12 ZNA
A61P37/04
C07K16/10
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022571085
(86)(22)【出願日】2021-03-19
(85)【翻訳文提出日】2023-01-16
(86)【国際出願番号】 US2021023216
(87)【国際公開番号】W WO2021236223
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】63/027,553
(32)【優先日】2020-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514313764
【氏名又は名称】タケダ ワクチン，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＫＥＤＡ ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】ライヴングッド、ジル
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン、マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ギフォード、ジェームズ
(72)【発明者】
【氏名】ニード、タウニャ
(72)【発明者】
【氏名】ライオンズ、マーク
(72)【発明者】
【氏名】マークス、ジャッキー
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085BA51
4C085BB11
4C085DD03
4C085DD07
4C085DD10
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、ワクチン抗原試料などの抗原試料の効力を決定するための方法に関する。本開示はまた、前記ワクチン抗原の精製、不活性化及び製剤化を含む製造工程中に前記ワクチン抗原の効力を監視する方法、ならびにウイルスワクチンを製造する方法に関する。更に、本開示は、開示された前記方法によって得ることができるワクチンに関する。本発明の特定の実施形態において、前記抗原試料はジカウイルス抗原試料である。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワクチン抗原試料などの抗原試料の効力を示すシグナルを検出するための方法であって、前記抗原試料中の抗原は少なくとも２つのエピトープを提供し、前記方法は、ステップ１：アクセプターキット及びドナーキットを含むキットを提供するステップであって、前記アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、前記ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
前記アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、前記アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、前記ドナー抗体と結合することができず、
前記アクセプター抗体は、前記抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、前記アクセプター抗体は前記ドナーマイクロスフェアに結合することができず、
前記ドナーマイクロスフェアは、前記アクセプターマイクロスフェアによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、前記ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、前記アクセプター抗体と結合することができず、
前記ドナー抗体は、前記抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、前記ドナー抗体は前記アクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記ステップと、
ステップ２：ステップ１の前記量の前記ドナーマイクロスフェア、前記量の前記アクセプターマイクロスフェア、前記量の前記ドナー抗体及び前記量の前記アクセプター抗体と前記試料を接触させ、前記試料中の抗原と、前記ドナーマイクロスフェアに結合した前記ドナー抗体及び前記アクセプターマイクロスフェアに結合した前記アクセプター抗体ならびに前記抗原の前記少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合した前記アクセプター抗体及び前記抗原の前記少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合した前記ドナー抗体と、の複合体の形成を可能にするステップと、
ステップ３：前記抗原試料の効力を示すシグナルを生成するための近接反応を行わせるステップと、
ステップ４：前記抗原試料の効力を示す前記シグナルを検出するステップと、を含む、前記方法。
【請求項2】
請求項１に従って前記シグナルを検出することにより、前記抗原試料の効力を示す前記抗原試料中の前記抗原の量を決定するための方法であって、前記方法は更に、ステップ５：前記検出されたシグナルに基づき前記抗原試料の効力を示す前記抗原試料中の前記抗原の量を決定するステップを含む、前記方法。
【請求項3】
請求項２に従って前記抗原の量を検出することにより、ワクチン抗原試料などの前記抗原試料の効力を決定するための方法であって、前記方法は更に、ステップ６：ステップ５で決定された前記試料中の前記抗原の量に基づき前記抗原試料の効力を決定するステップを含む、前記方法。
【請求項4】
請求項３に従って前記抗原試料の効力を決定するための方法であって、ステップ６は、ステップ６．１：ヒトまたは非ヒト対象に生成される関連する平均中和抗体力価を測定することにより、前記ヒトまたは前記非ヒト対象の抗原の標準化試料の効力を決定するステップと、
ステップ６．２：前記標準化試料中の少なくとも２つのエピトープを有する前記抗原の量を請求項２の方法に従って決定するステップと、
ステップ６．３：ステップ６．１の前記平均中和抗体力価とステップ６．２の前記抗原の量から標準曲線を確立するステップと、
ステップ６．４：ステップ５で決定された前記抗原試料中の抗原の量と前記標準曲線を比較することにより抗原試料の効力を決定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項5】
前記少なくとも２つのエピトープは同じエピトープであり、前記アクセプター抗体及び前記ドナー抗体は同じ可変領域を有し、及び／または前記同じエピトープに結合することが可能である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも２つのエピトープは異なるエピトープであり、前記アクセプター抗体及び前記ドナー抗体は異なる可変領域を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ステップ１において、前記アクセプターマイクロスフェアは前記アクセプター抗体の定常領域に結合しており、及び／または前記ドナーマイクロスフェアは前記ドナー抗体の定常領域に結合している、請求項１～６に記載の方法。
【請求項8】
前記抗原試料は、ワクチン抗原試料である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ワクチン抗原試料のワクチン抗原はウイルス抗原である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記抗原試料はウイルス抗原試料である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ドナー抗体及び前記アクセプター抗体は、請求項９及び１０に記載のウイルス抗原以外の他のウイルス抗原と交差反応しない、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ドナー抗体及び前記アクセプター抗体のうちの少なくとも１つまたは両方は、プラーク減少中和試験またはレポーターウイルス粒子試験またはマイクロ中和試験またはフォーカス形成アッセイで試験した場合、それらが結合する前記ウイルス抗原を中和する、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ウイルス抗原は、ジカウイルス抗原、デングウイルス抗原、ノロウイルス抗原及びポリオウイルス抗原からなる群から選択される、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ウイルス抗原は、生ウイルス、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルス及びウイルス様粒子からなる群から選択される、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ウイルス抗原は不活性化ウイルスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ウイルス抗原は不活性化ジカウイルスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記抗原は、ミョウバンに吸着した不活性化ジカウイルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ステップ６．１の標準化試料は、強制分解試験または抗原の異なる用量によって提供される、請求項４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ステップ６．１の対象はマウスである、請求項４～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法に従って前記ワクチン抗原の効力を測定することにより、前記ワクチン抗原の精製、不活性化及び製剤化を含む製造工程中の前記ワクチン抗原の効力を監視して最終ワクチンを形成する方法。
【請求項21】
ウイルスワクチンを製造するための方法であって、前記方法は、ステップＡ：様々なバッチのワクチン抗原を調製するステップと、
ステップＢ：請求項１～２０に記載の方法に従ってステップＡで作成した前記様々なワクチン抗原バッチの前記ワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合する前記ワクチン抗原バッチを選択するステップと、
ステップＣ：ステップＢで選択した前記ワクチン抗原バッチを様々なバッチのウイルスワクチンに配合することによりワクチンバッチを調製するステップと、
ステップＤ：請求項１～２０に記載の方法に従ってステップＣで作成した前記様々なバッチのワクチンバッチの前記ワクチン抗原の効力を決定し、前記所定の効力要件に適合する前記ワクチンバッチを選択するステップと、を含む、前記方法。
【請求項22】
ステップＡは様々なサブステップを含み、ステップＢは各サブステップ後に実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記サブステップは、生ウイルスを不活性化ウイルスに不活性化することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記生ウイルスはジカウイルスであり、前記不活性化は、ホルムアルデヒドまたは紫外線照射またはガンマ線照射またはβ－プロピオラクトンにより達成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
請求項２１～２４に記載の方法により得られるワクチン。
【請求項26】
アクセプターキット及びドナーキットを含むキットであって、前記アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、前記ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、前記アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、前記アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、前記ドナー抗体と結合することができず、
前記アクセプター抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、前記アクセプター抗体は前記ドナーマイクロスフェアに結合することができず、
前記ドナーマイクロスフェアは、前記アクセプタービーズによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、前記ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、前記アクセプター抗体と結合することができず、
前記ドナー抗体は、前記ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、前記ドナー抗体は前記アクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記キット。
【請求項27】
前記ドナー抗体及び前記アクセプター抗体は、デング抗原と交差反応しない、請求項２６に記載のキット。
【請求項28】
前記ドナー抗体及び前記アクセプター抗体のうちの少なくとも１つまたは両方は、ジカウイルス中和抗体である、請求項２６～２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項29】
前記ドナー抗体及び前記アクセプター抗体は、１００ｎｇ／ｍＬ未満または８０ｎｇ／ｍＬ未満または６０ｎｇ／ｍＬ未満または４０ｎｇ／ｍＬ未満または３０ｎｇ／ｍＬ未満の前記ジカウイルス抗原に対するＥＣ５０値を提供する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項30】
前記ドナー抗体及び前記アクセプター抗体は、配列番号１によってコードされるエンベロープ糖タンパク質のジカウイルスエンベロープ糖タンパク質ドメインＩＩＩのエピトープに結合する、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項31】
前記エピトープは２つの異なるエピトープであり、前記アクセプター抗体及び前記ドナー抗体は異なる可変領域を有し、それらの一方が抗体１であり、他方が抗体２である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項32】
抗体１は配列番号１のアミノ酸Ｅ３７０に結合し、抗体２は配列番号１のアミノ酸Ｔ３９７及びＨ３９８に結合する、請求項３１に記載のキット。
【請求項33】
抗体１及び抗体２は、それぞれ重鎖及び軽鎖相補性決定領域によって特徴付けられ、前記抗体１は、配列番号４の重鎖相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号５の重鎖相補性決定領域２（ＶＨ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号６の重鎖相補性決定領域３（ＶＨ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９の軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号１１の軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、によって特徴付けられ、
前記抗体２は、配列番号１８の重鎖相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号１９の重鎖相補性決定領域２（ＶＨ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号２０の重鎖相補性決定領域３（ＶＨ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２３の軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２４の軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号２５の軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、によって特徴付けられる、請求項３１に記載のキット。
【請求項34】
抗体１及び抗体２は、重鎖及び軽鎖相補性決定領域によって特徴付けられ、前記抗体１は、配列番号３２の重鎖相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号３３の重鎖相補性決定領域２（ＶＨ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号３４の重鎖相補性決定領域３（ＶＨ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３７の軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号３８の軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号３９の軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、によって特徴付けられ、
前記抗体２は、配列番号１８の重鎖相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号１９の重鎖相補性決定領域２（ＶＨ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号２０の重鎖相補性決定領域３（ＶＨ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２３の軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２４の軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ－ＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号２５の軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、によって特徴付けられる、請求項３１に記載のキット。
【請求項35】
抗体１及び抗体２は、重鎖及び軽鎖可変領域によって特徴付けられ、前記抗体１は、配列番号３の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び配列番号８の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列によって特徴付けられ、
前記抗体２は、配列番号１７の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び配列番号２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列によって特徴付けられる、請求項３１に記載のキット。
【請求項36】
抗体１及び抗体２は、重鎖及び軽鎖可変領域によって特徴付けられ、前記抗体１は、配列番号３１の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び配列番号３６の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列によって特徴付けられ、
前記抗体２は、配列番号１７の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び配列番号２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列によって特徴付けられる、請求項３１に記載のキット。
【請求項37】
抗体１及び抗体２は、重鎖及び軽鎖によって特徴付けられ、前記抗体１は、配列番号２の重鎖（Ｈ）アミノ酸配列、及び配列番号７の軽鎖（Ｌ）アミノ酸配列によって特徴付けられ、
前記抗体２は、配列番号１６の重鎖（Ｈ）アミノ酸配列、及び配列番号２１の軽鎖（Ｌ）アミノ酸配列によって特徴付けられる、請求項３１に記載のキット。
【請求項38】
抗体１及び抗体２は、重鎖及び軽鎖によって特徴付けられ、前記抗体１は、配列番号３０の重鎖（Ｈ）アミノ酸配列、及び配列番号３５の軽鎖（Ｌ）アミノ酸配列によって特徴付けられ、
前記抗体２は、配列番号１６の重鎖（Ｈ）アミノ酸配列、及び配列番号２１の軽鎖（Ｌ）アミノ酸配列によって特徴付けられる、請求項３１に記載のキット。
【請求項39】
抗体１はドナー抗体であり、抗体２はアクセプター抗体であり、前記ドナー抗体はビオチン化され、前記ドナーマイクロスフェアはストレプトアビジンでコーティングされ、前記アクセプター抗体は前記アクセプターマイクロスフェアに共有結合している、請求項３１～３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項40】
前記抗原はジカ抗原であり、前記キットは請求項２６～３９のいずれか一項によって定義される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
請求項４０に記載の方法により得られる抗原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本国際ＰＣＴ出願は、２０２０年５月２０日に出願された米国特許仮出願第６３／０２７，５５３号に対する優先権及び利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本国際ＰＣＴ出願は、２０２０年５月２０日に出願された米国特許仮出願第６３／０２７，５５３号に対する優先権及び利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
２０２１年３月１６日午後４時１８分に作成かつ本出願と共に電子的に提出された、５２ＫＢの「Ｔ０８４９８ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の配列表の全体が、参照により本出願に組み込まれる。
２０２１年３月１６日午後４時１８分に作成かつ本出願と共に電子的に提出された、５２ＫＢの「Ｔ０８４９８ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の配列表の全体が、参照により本出願に組み込まれる。
【0003】
本発明は、ウイルス抗原を含むワクチン中に存在するような抗原の効力を決定するための方法、すなわちイムノアッセイに関する。更に、本発明は、ワクチン製造工程中に適用するためのそのような方法に関する。
【背景技術】
【0004】
ウイルスは人体の健康にとって絶え間ない脅威である。高い突然変異率が可能にする環境及び宿主の変化への迅速な対応は、様々なウイルス感染症の診断ならびに予防及び治療法を複雑にしている。更に、数種類のウイルスによって引き起こされる病気の予防のために承認されたワクチンは、まだ不足している。
【0005】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）及び黄熱ウイルス（ＹＦＶ）も含む、フラビウイルス属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科）の節足動物媒介ウイルス（アルボウイルス）である。ヒトへの感染は、主にＡｅｄｅｓ属、すなわちＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ蚊が媒介すると考えられている。ＺＩＫＶは系統発生解析により、アフリカ系とアジア系の遺伝子型に分類される。
【0006】
フラビウイルスは、二十面体や球状の形状をしたエンベロープ型である。その直径は約５０ｎｍである。ゲノム（１０～１１ｋｂ塩基）は直鎖状のポジティブセンスＲＮＡからなり、非分節型である。ＲＮＡは、複数コピーのカプシドタンパク質（Ｃ）と複合体を形成し、その周りをそれぞれ１８０コピーのエンベロープ糖タンパク質（Ｅタンパク質、約５００アミノ酸）、及び膜タンパク質（Ｍタンパク質、約７５アミノ酸）または前駆膜タンパク質（ｐｒＭタンパク質、約１６５アミノ酸）からなる二十面体のシェルで囲まれ、すべてが脂質膜に固定されている。また、ゲノムは７つの非構造タンパク質をコードしている（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５；ＷＯ２０１８０１０７８９）。
【0007】
Ｅタンパク質は、宿主細胞受容体への付着及びウイルスの脂質二重膜の融合に関与する主要な表面タンパク質であるため、ウイルス感染に対する宿主中和抗体（Ａｂ）の主要な標的である。Ｅタンパク質は、アミノ末端外部ドメイン、２つの両親媒性αヘリックス及び２つのカルボキシ末端膜貫通αヘリックスからなる。表面が露出した外部ドメインは、βバレルドメインＩ（ＥＤＩ）、フィンガー様ドメインＩＩ（ＥＤＩＩ）及びＣ末端ドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）というβシートに富んだ３つの構造上異なるドメインからなる。
【0008】
フラビウイルス中にはいくつかのエピトープが保存されているため、フラビウイルス感染症に対する抗体（Ａｂ）反応は交差反応性であり、例えばフラビウイルス特異的免疫応答の決定による、特定のフラビウイルス感染症の診断に支障をきたす。ＺＩＫＶと他のフラビウイルスＡｂとの間の交差反応性が報告されており、特にＤＥＮＶ血清複合体とは、Ｅタンパク質の高い相同性（５４～５９％）により、交差反応性を示すことが報告されている。ＺＩＫＶの流行地域の多くでは、ＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮＶ１）、２（ＤＥＮＶ２）、３（ＤＥＮＶ３）及び４（ＤＥＮＶ４）を含むＤＥＮＶならびに他のフラビウイルスも存在し、多重感染のリスクにより、交差反応性Ａｂの産生のリスクが高まるため、これは更に問題となる。更に、異なるフラビウイルス感染症による類似の臨床症状の発現が、特に懸念される。
【0009】
２００７年と２０１３年に東南アジアでの孤立した大流行により、公衆衛生上の脅威としてのＺＩＫＶの潜在的影響が高まった（Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９，３６０，２５３６－２５４３；Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１４，２０（１１）：１９６０）。近年、ＺＩＫＶの流行はブラジルをはじめアメリカ大陸に拡大し、最大規模となった（Ｍｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１７，５４６（７６５８）：４１１－４１５）。ＺＩＫＶは、神経学的後遺症、幅広い臨床症状、先天性ＺＩＫＶ症候群（ＣＺＳ）として知られる新生児異常を伴う（ＣＺＳ；Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．２０１６，９４（６９）：４０６－４０６Ａ；Ｃａｏ－Ｌｏｒｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１６，Ａｐｒ９；３８７（１００２７）：１５３１－９）。
【0010】
現在適用されているワクチンデリバリープラットフォームには、弱毒化及び不活性化生全ウイルスワクチン、例えばアデノ随伴ウイルスを利用したウイルスベクター化ワクチン、ＤＮＡ及びｍＲＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ならびにペプチド及びタンパク質サブユニットワクチンがある（Ｍａｓｌｏｗ，Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１９，４，１０４）。現在、複数のワクチン候補が臨床試験で評価されているが、ＺＩＫＶに対する治療薬はまだ承認されていない（Ｐｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２０１９，９４，２５７２－２５８６）。有望な候補は、アメリカで発生したアジア系遺伝子型株ＰＲＶＡＢＣ５９由来のＴａｋｅｄａ製の精製不活性化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）である。開発された精製不活性化ワクチンは、ＪＥＶ及びＴＢＥＶを含む他のフラビウイルスによる疾病の予防に成功しかつ安全に利用されている（Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１４，３２，１３２６－１３３７）。
【0011】
しかしながら、ワクチン中に存在するような抗原の抗原性、免疫原性及び効力は抗原表面上の特定のエピトープの有効性に依存するため、迅速、堅牢かつ信頼性の高い抗原特性評価を行うための方法が早急に必要とされている。更に、このような方法は、製造のパイプラインの中で対応する抗原をモニターすることができるため、ワクチン製造プロセスの監視にも有益である。
【発明の概要】
【0012】
本発明の目的の１つは、ワクチン抗原試料またはウイルス抗原試料などの抗原試料の効力を決定するための方法を提供することである。
【0013】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記アッセイは良好な特異性を提供する。
【0014】
本発明の更なる目的は、不活性化ウイルスまたは生ウイルスなどのウイルス抗原試料の効力を決定するための方法を提供することである。
【0015】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記アッセイは他のウイルス抗原などの他の抗原との交差反応性を示さない。
【0016】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記方法は良好な感度を提供し、それにより例えば少量の試料でも分析可能である。
【0017】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記方法は簡単な操作及び迅速な検出を提供する（例えば、手順中に洗浄する工程は不要である）。
【0018】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記方法は均質なアッセイフォーマット、安定した性能及び低いバックグラウンドシグナルを提供する。
【0019】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記方法は試料量が少ないため、低検出コストを提供する。
【0020】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記方法は低い検出限界及び広いダイナミックレンジを提供する。
【0021】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記方法は低い偽陽性率及び低い偽陰性率を提供する。
【0022】
本発明の更なる目的は、抗原試料の効力を決定するための方法を提供することであり、前記方法は例えばワクチンの製造工程中のハイスループットな適用の可能性を提供する。
【0023】
本発明の更なる目的は、ワクチン抗原の効力を決定するために抗原試料の効力を決定するための方法を適用し、それによってワクチンの製造工程のステップを監視することを含む、ウイルスワクチンを製造する方法を提供することである。
【0024】
本発明の更なる目的は、ワクチン中に存在するような抗原試料の効力を決定するための方法によって得られるワクチンを提供することである。
【0025】
本発明の更なる目的は、ジカウイルス抗原の効力を決定する方法への適用に適した、アクセプター抗体及びドナー抗体、ならびにアクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアを含む、キットを提供することである。
【0026】
したがって、本発明は、ワクチン抗原試料などの抗原試料の効力を示すシグナルを検出するための方法に関し、抗原試料中の抗原は少なくとも２つのエピトープを提供し、前記方法は、以下のステップ：
ステップ１：アクセプターキット及びドナーキットを含むキットを提供するステップであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプターマイクロスフェアによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記ステップと、
ステップ２：ステップ１の前記量の前記ドナーマイクロスフェア、前記量の前記アクセプターマイクロスフェア、前記量の前記ドナー抗体及び前記量の前記アクセプター抗体と試料を接触させ、試料中の抗原と、ドナーマイクロスフェアに結合したドナー抗体及びアクセプターマイクロスフェアに結合したアクセプター抗体ならびに抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合したアクセプター抗体及び抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合したドナー抗体との複合体の形成を可能にするステップと、
ステップ３：抗原試料の効力を示すシグナルを生成するための近接反応を行わせるステップと、
ステップ４：抗原試料の効力を示すシグナルを検出するステップと、を含む。
ステップ１：アクセプターキット及びドナーキットを含むキットを提供するステップであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプターマイクロスフェアによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記ステップと、
ステップ２：ステップ１の前記量の前記ドナーマイクロスフェア、前記量の前記アクセプターマイクロスフェア、前記量の前記ドナー抗体及び前記量の前記アクセプター抗体と試料を接触させ、試料中の抗原と、ドナーマイクロスフェアに結合したドナー抗体及びアクセプターマイクロスフェアに結合したアクセプター抗体ならびに抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合したアクセプター抗体及び抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合したドナー抗体との複合体の形成を可能にするステップと、
ステップ３：抗原試料の効力を示すシグナルを生成するための近接反応を行わせるステップと、
ステップ４：抗原試料の効力を示すシグナルを検出するステップと、を含む。
【0027】
本発明は更に、上記のような方法に従ってシグナルを検出することにより、抗原試料の効力を示す抗原試料中の抗原の量を決定するための方法に関し、前記方法は更に、
ステップ５：検出されたシグナルに基づき抗原試料の効力を示す抗原試料中の抗原の量を決定するステップを含む。
ステップ５：検出されたシグナルに基づき抗原試料の効力を示す抗原試料中の抗原の量を決定するステップを含む。
【0028】
本発明は更に、上記のような方法に従って抗原の量を検出することにより、ワクチン抗原試料などの抗原試料の効力を決定するための方法に関し、前記方法は更に、
ステップ６：ステップ５で決定された試料中の抗原の量に基づき抗原試料の効力を決定するステップを含む。
ステップ６：ステップ５で決定された試料中の抗原の量に基づき抗原試料の効力を決定するステップを含む。
【0029】
本発明は更に、
ステップＡ：様々なバッチのワクチン抗原を調製するステップと、
ステップＢ：上記のような方法に従ってステップＡで作成した様々なワクチン抗原バッチのワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチン抗原バッチを選択するステップと、
ステップＣ：ステップＢで選択したワクチン抗原バッチを様々なバッチのウイルスワクチンに配合することによりワクチンバッチを調製するステップと、
ステップＤ：上記のような方法に従ってステップＣで作成した様々なバッチのワクチンバッチ中のワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチンバッチを選択するステップと、を含む、ウイルスワクチンを生成する方法に関する。
ステップＡ：様々なバッチのワクチン抗原を調製するステップと、
ステップＢ：上記のような方法に従ってステップＡで作成した様々なワクチン抗原バッチのワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチン抗原バッチを選択するステップと、
ステップＣ：ステップＢで選択したワクチン抗原バッチを様々なバッチのウイルスワクチンに配合することによりワクチンバッチを調製するステップと、
ステップＤ：上記のような方法に従ってステップＣで作成した様々なバッチのワクチンバッチ中のワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチンバッチを選択するステップと、を含む、ウイルスワクチンを生成する方法に関する。
【0030】
本発明は更に、上記のような方法によって得られるワクチンに関する。
【0031】
本発明は更に、アクセプターキット及びドナーキットを含むキットであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプタービーズによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記キットに関する。
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプタービーズによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記キットに関する。
【0032】
本発明は更に、上記のような抗原試料の効力を決定するための方法に関し、抗原はジカ抗原であり、キットは上記のように定義される。
【0033】
本発明は更に、上記のような方法によって得られるジカ抗原に関する。
【0034】
略語及び定義
略語
「ＺＩＫＶ」とは、ジカまたはジカウイルスのことを指す。「ＤＥＮＶ」とは、デング熱またはデングウイルスのことを指す。「ＤＥＮＶ１」とは、デングウイルス血清型１のことを指す。「ＤＥＮＶ２」とは、デングウイルス血清型２のことを指す。「ＤＥＮＶ３」とは、デングウイルス血清型３のことを指す。「ＤＥＮＶ４」とは、デングウイルス血清型４のことを指す。「ＶＬＰ」とは、ウイルス様粒子のことを指す。「Ｅタンパク質」とは、エンベロープ糖タンパク質のことを指す。「ＥＤＩ」、「ＥＤＩＩ」、「ＥＤＩＩＩ」とは、Ｅタンパク質のドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩのことを指す。「Ｍタンパク質」とは、膜タンパク質のことを指す。「ｐｒＭ」とは、前駆体膜タンパク質のことを指す。「ＲＦＵ」とは、相対蛍光単位のことを指す。「Ａｂ」（複数可）とは、抗体（複数可）の略である。「Ｉｇ」とは、免疫グロブリンの略である。「ｍＡｂ」とは、モノクローナル抗体の略である。「抗ＺＩＫＶ Ａｂ」とは、ＺＩＫＶ抗原に結合するＡｂのことを指す。「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域の略である。「ＲＶＰ」とは、レポーターウイルス粒子のことを指す。「ＴＣＩＤ５０」とは、５０％組織培養感染量のことを指す。「ＺＡＰＡ」とは、ジカ抗原効力アッセイのことを指す。「ＰＩＺＶ」とは、精製不活性化ジカワクチンのことを指す。「ＰＲＮＴ」とは、プラーク減少中和試験のことを指す。「ＭＮＴ」とは、マイクロ中和試験のことを指す。「ＦＦＡ」とは、フォーカス形成アッセイのことを指す。「ＰＦＵ」とは、プラーク形成単位のことを指す。「ＦＦＵ」とは、フォーカス形成単位のことを指す。「ＡＵ」とは、抗原単位のことを指す。
略語
「ＺＩＫＶ」とは、ジカまたはジカウイルスのことを指す。「ＤＥＮＶ」とは、デング熱またはデングウイルスのことを指す。「ＤＥＮＶ１」とは、デングウイルス血清型１のことを指す。「ＤＥＮＶ２」とは、デングウイルス血清型２のことを指す。「ＤＥＮＶ３」とは、デングウイルス血清型３のことを指す。「ＤＥＮＶ４」とは、デングウイルス血清型４のことを指す。「ＶＬＰ」とは、ウイルス様粒子のことを指す。「Ｅタンパク質」とは、エンベロープ糖タンパク質のことを指す。「ＥＤＩ」、「ＥＤＩＩ」、「ＥＤＩＩＩ」とは、Ｅタンパク質のドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩのことを指す。「Ｍタンパク質」とは、膜タンパク質のことを指す。「ｐｒＭ」とは、前駆体膜タンパク質のことを指す。「ＲＦＵ」とは、相対蛍光単位のことを指す。「Ａｂ」（複数可）とは、抗体（複数可）の略である。「Ｉｇ」とは、免疫グロブリンの略である。「ｍＡｂ」とは、モノクローナル抗体の略である。「抗ＺＩＫＶ Ａｂ」とは、ＺＩＫＶ抗原に結合するＡｂのことを指す。「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域の略である。「ＲＶＰ」とは、レポーターウイルス粒子のことを指す。「ＴＣＩＤ５０」とは、５０％組織培養感染量のことを指す。「ＺＡＰＡ」とは、ジカ抗原効力アッセイのことを指す。「ＰＩＺＶ」とは、精製不活性化ジカワクチンのことを指す。「ＰＲＮＴ」とは、プラーク減少中和試験のことを指す。「ＭＮＴ」とは、マイクロ中和試験のことを指す。「ＦＦＡ」とは、フォーカス形成アッセイのことを指す。「ＰＦＵ」とは、プラーク形成単位のことを指す。「ＦＦＵ」とは、フォーカス形成単位のことを指す。「ＡＵ」とは、抗原単位のことを指す。
【0035】
定義
本開示及び本特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでない場合を除き、単数形及び複数形の両方を含むように解釈されるものとする。
本開示及び本特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでない場合を除き、単数形及び複数形の両方を含むように解釈されるものとする。
【0036】
本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用する「及び／または」という用語は、「Ａ」、「Ｂ」及び「Ａ及びＢ」を含むことを意図とする。
【0037】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などのオープンタームは、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。これらのオープンエンドな移行句は、追加の記載していない要素または方法ステップを除外しない、要素や方法ステップなどのオープンエンドのリストを導入するために使用される。
【0038】
本明細書で使用する場合、「抗体（Ａｂ）」（複数可）という用語は、一般に、ジスルフィド結合に相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（完全長Ａｂ）を指し、抗原と特異的に結合してＡｂ／抗原複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に得られる、合成されたまたは遺伝子操作された任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。Ａｂは、標準的な組換えＤＮＡ技術により得ることができる。完全長Ａｂにおいて、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインから構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域に細分され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域と共に分散され得る。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、以下の順序ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される。本発明の特定の実施形態において、ＡｂのＦＲは、ヒト生殖系配列と同一であり得るか、または自然もしくは人為的に改変され得る。Ａｂという用語はまた、その任意の機能的断片、変異体、バリアントまたは誘導体を指し得る。このような機能的断片、変異体、バリアントまたは誘導体抗体の形式は、当技術分野で既知である。ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片などのＡｂ断片は、それぞれ完全長Ａｂのパパイン消化またはペプシン消化などの従来技術を使用して、完全長Ａｂから調製することができる。機能的断片は特に、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域中ジスルフィド架橋で結合した２つのＦａｂ断片を含む２価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１号）、及び（ｖｉ）単離ＣＤＲである。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え法を用いて、それらを単一のタンパク質鎖として作製できる合成リンカーにより結合でき、この鎖中でＶＬ及びＶＨ領域が対となって１価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３参照）。特定の実施形態において、ｓｃＦｖ分子は、融合タンパク質内に組み込まれ得る。他の形態の単鎖抗体、例えばダイアボディも包含される。ダイアボディとは、ＶＨドメインとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現しているが、同じ鎖上の２つのドメインの間が対になるには短すぎるリンカーを用いているため、別の鎖の相補的なドメインと対にならざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される、２価の二重特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１－１１２３を参照のこと）。このような機能的断片は、当技術分野において既知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．７９０ ｐｐ．（ＩＳＢＮ３－５４０－４１３５４－５））。Ａｂは、どの抗原に結合できるかを表現するために、「抗抗原Ａｂ」という用語で記載され得る。例えば、「抗ＺＩＫＶ Ａｂ」とは、ＺＩＫＶ抗原に結合するＡｂのことを指す。Ａｂは、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性Ａｂは、１つの抗原の異なるエピトープに特異的に結合し得るか、または２つ以上の無関係な抗原に特異的に結合し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照のこと。本発明の多重特異性抗原結合分子のいずれか、またはそのバリアントを含むＡｂは、当業者、例えば細胞内発現系であれば既知のように、標準的な分子生物学的技術（例えば、組換えＤＮＡ及びタンパク質発現技術）を用いて構築することができる。Ａｂは、２つ以上の抗原結合部位を含む多価Ａｂであり得る。１つ以上のＣＤＲ残基の置換、または１つ以上のＣＤＲの欠損も、可能である。科学文献には、１つまたは２つのＣＤＲが欠損しても、結合にほとんど影響を与えないＡｂが記載されている。公開されている結晶構造をもとにＡｂとその抗原の間の接触領域を解析したところ、実際に抗原に接触しているのはＣＤＲ残基の約５分の１から３分の１だけであることが判明した。そのうえ、多くのＡｂは、抗原と接触しているアミノ酸がないＣＤＲを１つまたは２つ有している（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５，９：１３３－１３９，Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２００２，３２０：４１５－４２８）。抗原と接触していないＣＤＲ残基は、過去の研究に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、分子モデリングによって及び／または経験的に同定することができる（例えば、重鎖のＣＤＲ２のＨ６０～Ｈ６５残基は必要ないことが多い）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が欠損する場合、通常、別のヒトＡｂ配列またはそのようなコンセンサス配列で対応する位置を占めるアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換位置及び置換するアミノ酸はまた、経験的に選択することができる。経験的置換は、保存的または非保存的置換であり得る。Ａｂという用語は、例えばウサギ、マウス、ヒト、サルまたはラットを含む特定の種起源に由来するＡｂを指し得る（ウサギＡｂ、マウスＡｂ、ヒトＡｂ、サルＡｂ、またはラットＡｂ）。例えば、ウサギ由来とは、ウサギ生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有するＡｂを含むことを意図し得る。Ａｂは、対応する生殖系配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含み得る。Ａｂはまた、種起源の生殖系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでのランダムまたは部位特異的変異誘発によって導入された突然変異）を、例えばＣＤＲに含み得る。本明細書で使用する場合、特定の種起源（例えば、ウサギ）に由来するＡｂは、他の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系に由来するＣＤＲまたは他の配列が、種起源（例えば、ウサギ）のフレームワーク領域（ＦＲ）配列に移植されたＡｂを指し得る。Ａｂは、キメラＡｂであり得る。キメラＡｂは、異なる種の生殖系列に由来する配列を包含し、更にアミノ酸置換や挿入を含み得る。Ａｂは、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含むヒト免疫グロブリンであるヒト化Ａｂであり得る。一般的に、ヒト化抗体では、ヒトのＣＤＲの残基は、非ヒト種のＣＤＲの残基で置換されている（例えば、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターなど；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８６；３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８８，３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８８，２３９：１５３４－１５３）。ヒト化抗体を作製するために使用する方法の非限定例は、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４，ＵＳＡ ９１：９６９－９７３及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６；９：８９５－９０４に記載されている。Ａｂは、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、及びサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のものであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１アイソタイプである。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ２アイソタイプである。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる及び周知のサブユニット構造及び３次元形状を有する。Ａｂは、複数のクラスまたはサブクラスからの配列を含み得る。Ａｂは、異なる抗原特異性を有する他のＡｂを含まない場合がある（例えば、ＺＩＫＶに結合するＡｂは、ＺＩＫＶ以外の抗原に結合するＡｂを実質的に含まない）。Ａｂは、他の細胞材料及び／または化学薬品を実質的に含まなくてもよい。Ａｂという用語は、中和または非中和Ａｂを指し得る。Ａｂという用語は、モノクローナルＡｂを指し得る。Ａｂという用語は、組換えＡｂを指し得る。Ａｂという用語は、ドナーＡｂを指し得る。Ａｂという用語は、アクセプターＡｂを指し得る。
【0039】
本明細書で使用する場合、Ａｂの「定常領域」という用語は、重鎖定常領域（ＣＨ）及び／または軽鎖定常領域（ＣＬ）を指す。
【0040】
本明細書で使用する場合、Ａｂの「可変領域」という用語は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を指す。
【0041】
本明細書で使用する場合、「に結合する」、「に結合している」または「に結合できる」という用語は、特定の抗原に結合する、または結合している、または結合できるＡｂとの関連内で、特定の分子、例えば、マイクロスフェアまたは抗原に結合できるＡｂを指す。特定の抗原に対する結合能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を含む当技術分野で既知の方法によって調べることができる。それによって、Ａｂは、抗原との結合を試験したときに、方法のバックグラウンドまたはノイズを上回るシグナルを提供する。特定の実施形態において、Ａｂは、抗原への結合について試験したときにシグナルを提供し、それは、比較可能な抗原への結合について試験したときにＡｂが提供するシグナルよりも少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い。具体的な実施形態において、抗原はＺＩＫＶ抗原（すなわち、ＺＩＫＶワクチン）であり、比較可能な抗原はＤＥＮＶ抗原である。Ａｂは、Ａｂ定常領域または可変領域で前記分子に結合する可能性があり得る。分子が抗原の場合、Ａｂは抗体可変領域で抗原と結合することができる。分子がマイクロスフェアの場合、ＡｂはＡｂ定常領域でマイクロスフェアと結合することができる。
【0042】
本明細書で使用する場合、「に結合している」という用語は、結合しているＡｂとの関連内で、分子、例えばマイクロスフェアまたは抗原に結合しているＡｂを指す。Ａｂは、抗体定常領域または可変領域で前記分子に結合し得る。分子が抗原の場合、Ａｂは抗体可変領域で抗原と結合する。分子がマイクロスフェアの場合、Ａｂは抗体定常領域でマイクロスフェアと結合する。したがって、本明細書で使用する場合、「に結合している」という用語は、結合しているマイクロスフェアとの関連内で、Ａｂの定常領域に結合しているマイクロスフェアを指す。Ａｂは、マイクロスフェアに共有結合することも、その逆も可能である（「に共有結合している」）。
【0043】
本明細書で使用する場合、「複合体を形成することが可能になる」という用語は、ドナーＡｂ、ドナーマイクロスフェア、アクセプターＡｂ、アクセプターマイクロスフェア及び試料との関連内で、ある量の前記ドナーマイクロスフェア、ある量の前記アクセプターマイクロスフェア、ある量の前記ドナー抗体及びある量の前記アクセプター抗体と試料を十分な時間接触させ、試料中の抗原と、ドナーマイクロスフェアに結合したドナー抗体及びアクセプターマイクロスフェアに結合したアクセプター抗体ならびに抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合したアクセプター抗体及び抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合したドナー抗体との複合体の形成が可能になる状況を指す。ドナーＡｂとアクセプターＡｂが結合していない及び／または試料中の抗原と結合していない場合、複合体は形成されない。
【0044】
本明細書で使用する場合、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は、Ａｂ可変配列内のＣＤＲのことを指す。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域のそれぞれには３つのＣＤＲが存在し、可変領域のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３（または、具体的にはＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２及びＶＬ－ＣＤＲ３）と称される。ＣＤＲという用語は、抗原を結合することができる単一の可変領域に生じる３つのＣＤＲの群を指し得る。このＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って異なるように定義され得る。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１）））によって記述される系は、抗体の任意の可変領域に適用できる明確な残基系を指すが、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称され得る。ＶＨ領域について、超可変領域は、ＶＨ－ＣＤＲ１ではアミノ酸位置３１～３５、ＶＨ－ＣＤＲ２ではアミノ酸位置５０～６５、ＶＨ－ＣＤＲ３ではアミノ酸位置９５～１０２の範囲である。ＶＬ領域について、超可変領域は、ＶＬ－ＣＤＲ１ではアミノ酸位置２４～３４、ＶＬ－ＣＤＲ２ではアミノ酸位置５０～５６、ＶＬ－ＣＤＲ３ではアミノ酸位置８９～９７の範囲である。Ｃｈｏｔｈｉａと共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定のサブ部分が、アミノ酸配列レベルでは大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造を取り入れることを見いだした。これらのサブ部分はＬ１、Ｌ２及びＬ３、またはＨ１、Ｈ２及びＨ３と称され、「Ｌ」及び「Ｈ」はそれぞれ軽鎖領域及び重鎖領域を称する。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有するＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとして称され得る。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重なるＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２（５）：７３２－４５（１９９６））によって説明されている。また、他のＣＤＲ境界の定義は、上記の系のいずれかに厳密に従っていない場合もあるが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重なるであろうが、特定の残基もしくは残基群、もしくはＣＤＲ全体が抗原結合に大きな影響を及ぼさないという予測または実験結果に照らして、それらは短くされ得るか、または長くされ得る。本明細書で使用する方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用することができるが、好ましい実施形態では、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ定義ＣＤＲを使用する。
【0045】
本明細書で使用する場合、「フレームワーク」、「フレームワーク領域（ＦＲ）」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域の配列からＣＤＲを除いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義が異系統により決定され得るため、フレームワーク配列の意味は、それに相応して異なる解釈がなされる。６つのＣＤＲ（ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２及びＶＬ－ＣＤＲ３、ならびにＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２及びＶＨ－ＣＤＲ３）はまた、軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）上のフレームワーク領域を、各鎖上において４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割する。そこで、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定することなく、他のものにより言及されるフレームワーク領域は、単鎖の天然由来の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたＦＲを表す。本明細書で使用する場合、ＦＲは４つのサブ領域のうちの１つを表し、ＦＲｓはフレームワーク領域を構成する４つのサブ領域のうちの２つ以上を表す。
【0046】
本明細書で使用する場合、「組換えＡｂ」とは、例えば、ＤＮＡスプライシング及びトランスジェニック発現を含む組換えＤＮＡ技術のような当技術分野で既知の技術または方法によって作成、発現、単離または取得されたＡｂを指す。前記用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えばトランスジェニックマウスを含む）、または細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系で発現したＡｂ、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離したＡｂを指し得る。
【0047】
本明細書で使用する場合、「中和Ａｂ」とは、マイクロ中和試験（ＭＮＴ）、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）、フォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）及び／またはレポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）試験において検出下限及び／またはバックグラウンドを超える力価を提供するＡｂを指すことが意図される。中和Ａｂは、単独で、または他の抗ウイルス剤と適切な配合により予防剤もしくは治療薬として組み合わせて、または有効なワクチン接種に関連して、または診断ツールとして使用することができる。中和Ａｂという用語は、病原体、例えばＺＩＫＶが宿主の感染を開始及び／または永続させる能力を阻止、阻害、低減、阻害または妨害するＡｂを指し得る。中和Ａｂが結合するエピトープは、「中和エピトープ」と称され得る。
【0048】
本明細書で使用する場合、「抗体力価」という用語は、試料中の一定量のＡｂのことを指す。試料は、血漿、尿、血液または血清試料であり得る。抗体力価は、それでも陽性試験結果となる最高希釈率（連続希釈作業で）の逆数で表すことができる。したがって、「中和抗体力価」という用語は、試料中の一定量の中和Ａｂのことを指す。Ａｂ力価または中和Ａｂ力価は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、マイクロスフェアイムノアッセイ、ＲＶＰアッセイ、ＭＮＴ、ＦＦＡまたはＰＲＮＴを含む当技術分野で既知の種々の方法によって決定することができる。
【0049】
本明細書で使用する場合、「イムノアッセイ」という用語は、Ａｂまたは抗原の使用により分子の存在及び／または濃度を検出、決定、同定、特性評価、定量化、またはそれ以外に測定するアッセイを意味する。イムノアッセイによって検出される分子は、生体試料（例えば、血清または血漿）中に存在し得る。イムノアッセイで検出される分子は、それ自体がＡｂまたは抗原であり得る。
【0050】
本明細書で使用する場合、「マイクロスフェアイムノアッセイ」という用語は、Ａｂが結合することができる抗原に結合したマイクロスフェアを使用して、Ａｂの存在及び／または濃度を検出、決定、同定、特性評価、定量化または測定するアッセイを意味する。マイクロスフェアイムノアッセイで検出されるＡｂは、生体試料（例えば、血清または血漿）中に存在し得る。
【0051】
本明細書で使用する場合、「レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）」という用語は、野生型ウイルスの抗原決定基を保持する粒子を指し、カプシド（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ）、前膜（ｐｒＭ）、膜（Ｍ）タンパク質が含まれる。細胞にＲＶＰを感染させると、例えばＲｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼのレポーター遺伝子が発現する。ＲＶＰにより、ウイルス感染を経時的に追跡し、ウイルスの細胞侵入及び複製などの事象を定量化することが可能になる。
【0052】
本明細書で使用する場合、「レポーターウイルス粒子アッセイ（ＲＶＰアッセイ）」または「レポーターウイルス粒子試験（ＲＶＰ試験）」という用語は、試料中の中和Ａｂ力価を決定するためのアッセイを指す。したがって、例えばベロ細胞などの細胞を試料と一緒にインキュベートし、その後ＲＶＰを添加する。中和Ａｂの半数効果濃度（ＥＣ５０）力価は、検出可能なシグナルを生成するためにＲＶＰ感染時に発現するレポーター遺伝子によって変換される適切な基質を添加することによって決定される。例えば、基質であるセレンテラジンを変換すると、ルシフェラーゼは、検出され得る発光シグナルを生成する。試料を含まない対照と比較した発光シグナルの減少は、試料中の中和Ａｂの存在及び／または量の指標となる。
【0053】
本明細書で使用する場合、「細胞変性効果（ＣＰＥ）」という用語は、例えばベロ細胞などの単層培養細胞へのウイルス感染の際に誘導される目に見える変化を意味する。ＣＰＥには、細胞が丸くなること及び培養プレートから剥がれたりすることが含まれる。ＣＰＥは、光学顕微鏡で、または分光測定による読み取りによって観察することができる。分光測定による読み取りは、ウイルス感染による細胞死で細胞培地のｐＨが変化するという事実に基づく。このｐＨ変化は、細胞培地内に指示薬（例えばフェノールレッド）を入れることによって可視化され、約５６０ｎｍ及び約４２０ｎｍの吸光度を測定し、これら２つの値を比較することで検出することができる。
【0054】
本明細書で使用する場合、「マイクロ中和試験（ＭＮＴ）」という用語は、試料中の中和Ａｂ力価を決定するための方法を指す。ウイルスを試料の連続希釈液と混合することで、ＣＰＥの減少を観察し、それにより試料中の中和Ａｂの量を決定できる。
【0055】
本明細書で使用する場合、「エンドポイント希釈アッセイ」という用語は、試料中の感染性ウイルス力価を測定するための方法を指す。この方法は、例えばベロ細胞のような単層細胞を試料の連続希釈液でインキュベートした際にＣＰＥが発生することを利用している。インキュベーション後、ＣＰＥは各試料希釈について決定され、その結果を使用して５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の結果を数学的に算出する。ＴＣＩＤ５０とは、この文脈の中で接種された組織培養細胞の５０％に細胞変性作用を生成するのに必要なウイルス量を指す。一般的に使用されるＴＣＩＤ５０の算出の方法としては、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法及びＳｐｅａｒｍａｎ ａｎｄ Ｋａｒｂｅｒ法を含む。
【0056】
本明細書で使用する場合、「プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）」という用語は、ウイルスに対する中和Ａｂ力価を測定するための試験を指す。そのため、試料（例えば、血清）を希釈し、一定量のウイルスと混合する。その後、混合物を、コンフルエントな単層細胞（例えば、ベロ細胞）上に塗布する。続いて、細胞層の表面を、例えば寒天などの半固体重層培地の層で覆い、ウイルスが無差別に拡散するのを防止する。プラーク形成単位（ＰＦＵ）の濃度は、数日後に形成されるプラークの数（溶解した細胞の領域）によって推定することができる。ウイルスによっては、顕微鏡観察及び／または感染細胞と反応するか、または生細胞のみを染色する特異的な色素（例えば、クリスタルバイオレットなど）により、プラーク形成単位を測定する。細胞にウイルスのみを感染させた（試料の追加を含まない）対照と比較して、プラーク数を５０％減少させる試料の濃度を、「ＰＲＮＴ５０」の値で表す。
【0057】
本明細書で使用する場合、「フォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）」という用語は、ＰＲＮＴアッセイの変形を指し、感染した細胞の領域（フォーカス）をウイルス抗原に特異的な蛍光抗体で検出し、感染宿主細胞及び感染性ウイルス粒子を検出する。ＦＦＡは、細胞膜を溶解しないウイルスのクラスの定量に特に有用である。これらのウイルスは、ＰＲＮＴに適さないからである。ＦＦＡの結果は、フォーカス形成単位（ＦＦＵ）として報告される。
【0058】
本明細書で使用する場合、「プラーク形成単位（ＰＦＵ）」という用語は、単位体積あたりのプラーク（溶解した細胞の領域）を形成することができるウイルス粒子の数のことを指す。
【0059】
本明細書で使用する場合、「フォーカス形成単位（ＦＦＵ）」という用語は、単位体積あたりのフォーカス（感染細胞の領域）を形成することができるウイルス粒子の数のことを指す。
【0060】
本明細書で使用する場合、「酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）」という用語は、特定のセットアップに応じたＡｂ及び抗原の測定のためのイムノアッセイのことを指す。すべてのＥＬＩＳＡセットアップの主な特徴は、Ａｂまたは抗原を固定化したプレートを使用することである。例えば、試料中のＡｂを決定するために、Ａｂが結合する対応する抗原をプレート上に固定化する。別のセットアップでは、Ａｂをプレートに固定化し、試料中の抗原を検出する。ＥＬＩＳＡのシグナルは酵素反応によって生成され、例えば分光光度法で検出可能なシグナルを生成する。利用した酵素の一般的な例として、ホースラディッシュペルオキシダーゼがある。一般的なＥＬＩＳＡセットアップには、直接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ及び逆ＥＬＩＳＡがある。
【0061】
本明細書で使用する場合、「モノクローナルＡｂ」（「ｍＡｂ」）という用語は、同じ抗原決定基（エピトープ）に結合する実質的に均質なＡｂの集団から得られたＡｂのことを指す。「実質的に均質」とは、微量に存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除き、個々のＡｂが同一であることを意味する。これは、様々な異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含む、ポリクローナル抗体とは対照的である。モノクローナルＡｂは、当技術分野で既知の方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９７５，２５６：４９５－４９７）、ファージ選択、組換え発現及び遺伝子導入動物に従ってハイブリドーマ技術により生成し得る。
【0062】
本明細書で使用する場合、「交差反応しない」という用語は、特定の抗原、例えばフラビウイルスまたはＤＥＮＶに結合しないＡｂのことを指す。そうした文脈の中で「結合しない」とは、特定の抗原、例えばフラビウイルスまたはＤＥＮＶへの結合について試験したときに、Ａｂが別の抗原、例えばＺＩＫＶへの結合について試験したときの結合シグナルの３０％以下、２０％以下、より好ましくは１０％以下、更により好ましくは５％以下の結合シグナルを示すことを意味する。特定の実施形態において、そうした文脈の中で「結合しない」とは、抗原、例えばフラビウイルスまたはＤＥＮＶへの結合について試験したときに、Ａｂがバックグラウンドシグナル及び／または検出下限を超える結合シグナルを示さないことを意味する。例えば、結合シグナルを検出するための好適な方法としては、対応する抗原を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはマイクロスフェアイムノアッセイが挙げられる。
【0063】
本明細書で使用する場合、「検出系」という用語は、近接反応によって生成されるシグナルを決定するのに適した任意の系のことを指す。検出系という用語は、更に、ドナーマイクロスフェア内の分子を励起し、それにより近接反応を開始させ、この近接反応によって生成されるシグナルを決定するのに適した系を指し得る。
【0064】
本明細書で使用する場合、「組換えタンパク質」とは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡスプライシング及びトランスジェニック発現を含む組換えＤＮＡ技術など当技術分野で既知の技術または方法によって作成、発現、単離または取得されたタンパク質を指す。前記用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、トランスジェニックマウスを含む）、または細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞）発現系で発現するタンパク質を指し得る。組換えタンパク質は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ、例えばＨｉｓ－精製）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの当技術分野で既知のタンパク質精製方法によって精製することができる。タンパク質は、例えばタンパク質濃度の決定のためのブラッドフォードもしくはビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、またはタンパク質の結合特性の決定のためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）などの当技術分野で既知の方法によって特徴付けることができる。
【0065】
本明細書で使用する場合、用語「マイクロスフェア」（複数可）は、本発明の方法での使用のために抗体（Ａｂ）のような分子に結合し得る小粒子のことを指す。マイクロスフェア、粒子、マイクロ粒子、ビーズまたはマイクロビーズという用語は互換的に使用でき、同等の意味を有する。マイクロスフェアは、近接反応で移動するエネルギーを供与するかまたは受けとることができる。
【0066】
本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、Ａｂにより結合され得るあらゆる物質を指す。抗原は、対象内の免疫応答を誘導し得る。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なるＡｂは、抗原上の異なる領域に結合し得る。抗原は、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質またはこれらの組み合わせであり得る。抗原は、例えばＺＩＫＶ抗原、ＤＥＮＶ抗原、ポリオウイルス抗原またはノロウイルス抗原などのウイルス抗原であり得る。ウイルス抗原はまた、生ウイルス、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルスまたはウイルス様粒子であり得る。抗原は、それ自体がウイルス抗原であり得る、ワクチン抗原（ワクチン中に存在する抗原）であり得る。ワクチン抗原は不活性化され得（例えば、ホルムアルデヒド処理により）、ワクチンに配合され得る。
【0067】
本明細書で使用する場合、「ＺＩＫＶ抗原」という用語は、ＺＩＫＶである、その一部である、またはそれに由来する任意の抗原のことを指す。例としては、天然ＺＩＫＶ、不活性化ＺＩＫＶ（例えば、熱不活性化、ホルムアルデヒド不活性化）、弱毒化ＺＩＫＶ、ＺＩＫＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＺＩＫＶ構造または非構造タンパク質、ＺＩＫＶ ＮＳ１タンパク質、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質ドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）、ＺＩＫＶ免疫原性組成物（例えば、ＺＩＫＶワクチン）、ＺＩＫＶ免疫原性組成物の任意の前駆体またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ＺＩＫＶワクチンは、精製不活性化ＺＩＫＶワクチン（ＰＩＺＶ）であり得る。ＰＩＺＶは、ミョウバンに吸着され得る。
【0068】
本明細書で使用する場合、「対象」（複数可）という用語は、任意の個体を含み得る。対象は、マウス、霊長類、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、ヒツジであり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、対象は、妊娠中の哺乳動物であり得、特定の実施形態において、妊娠中のヒト女性であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、予防または治療が望まれる患者である。
【0069】
本明細書で使用する場合、「非ヒト対象」という用語は、ヒトではない任意の個体を含むことができる。非ヒト対象は、マウス、霊長類、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、ヒツジであり得るが、これらに限定されない。
【0070】
本明細書で使用する場合、「試料」という用語は、任意の起源のものであり得る試料のことを指す。試料は、対象に由来するものであり得る。試料は、体液（血清、血液、尿、脳脊髄液、リンパ液など）、免疫原性組成物（ワクチンまたはその任意の前駆体など）及び細胞培養成分（細胞培養上清、細胞溶解物など）を含むが、これらに限定されない。試料は、抗原試料（例えば、ワクチン抗原試料、ウイルス抗原試料）であり得る。試料が体液の場合、試料は、人体または動物の体外の試料であることが必要である。試料は、ワクチン抗原またはウイルス抗原など任意の種類の分析物を含むことができる（ワクチン抗原試料、ウイルス抗原試料）。試料という用語はまた、ワクチンの製造工程の異なる段階からの試料を指し得る。試料という用語はまた、異なるワクチンバッチを指し得る。試料という用語はまた、異なる品質でＺＩＫＶ抗原としての抗原を含む異なるワクチンバッチを指し得る。前記用語はまた、ＺＩＫＶ抗原としての抗原及びミョウバンなどの追加成分を含む異なるワクチンバッチを指し得る。前記試料は、血液からの血漿の調製、液体の希釈など、使用前に前処理を行うことができる。前処理のための方法は、精製、濾過、蒸留、濃縮、妨害化合物の不活性化、及び試薬の添加を含むことができる。いくつかの実施形態において、試料は、熱不活性化及び／またはホルムアルデヒドにより不活性化される。
【0071】
本明細書で使用する場合、「抗原試料」という用語は、特定の量の抗原を含有する任意の試料のことを指す。したがって、「ウイルス抗原試料」という用語は、ウイルス抗原を含有する任意の試料のことを指す。したがって、「ワクチン抗原試料」という用語は、ウイルス抗原などのワクチン抗原を含有する任意の試料のことを指す。
【0072】
本明細書で使用する場合、「バッチ」という用語は、特定の試料（例えば抗原試料）またはワクチンの特定のバッチのことを指す。異なるバッチは、例えばその品質が異なり得る。例えば、１つのワクチンバッチは、別のワクチンバッチよりも高い効力を示し得る。
【0073】
本明細書で使用する場合、「標準化試料」または「標準化抗原試料」という用語は、特徴付けられた試料のことを指す。標準化試料は、任意の対象の標準化試料の効力を決定することにより、及び試験試料中の抗原量を決定するのと同様の方法で標準化試料中の抗原量を決定し、決定した対応する効力に対して標準化試料中の抗原量をプロットすることにより、試験試料の効力を決定するための標準曲線を確立するために適用することができる。標準化試料の効力は、平均中和抗体力価として表すことができる。標準化試料は、強制分解試験または抗原の異なる用量の適用（例えば、ストック標準化試料の連続希釈）により提供され得る。
【0074】
本発明の文脈内で、「強制分解試験」という用語は、抗原を含む試料を提供及び／または使用する任意の試験のことを指し、抗原は制御された方法で異なる程度に分解される。例えば、分解は、ｐＨ変化（例えば、試料の酸性化）または熱分解（例えば、約５６℃で約３０～約６０分間の試料のインキュベーション）によって実施することができる。例えば、試料を熱分解し、この熱分解試料の特定の量を非分解試料と混合し、２５％、５０％、７５％及び１００％の熱分解試料とすることができる。
【0075】
本明細書で使用する場合、抗原の「用量」という用語は、例えば絶対量（ｍｇ、μｇ及びｎｇなど）または濃度（ｍｇ／ｍＬ、μｇ／ｍＬ及びｎｇ／μＬなど）として表される抗原の特定の量のことを指す。
【0076】
本明細書で使用する場合、「抗原性」という用語は、抗原がＡｂに結合する能力、したがって、特定のエピトープの利用可能性のことを指す。抗原性は、例えば本発明に開示される方法のようなｉｎ ｖｉｔｒｏの立体構造法によって測定される。
【0077】
本明細書で使用する場合、「効力」及び「免疫原性」という用語は、抗原（例えば、ワクチン抗原試料などの抗原試料に存在するもの）及び／またはワクチンが対象（例えば、ヒトまたはマウスなどのモデル動物）において免疫応答を誘導する能力のことを指す。免疫応答は、体液性及び／または細胞媒介性であり得る。抗原性と比較して、効力及び免疫原性は、抗原またはワクチンを対象に投与し、誘導された免疫応答を監視する、ｉｎ ｖｉｖｏ試験により測定される。
【0078】
本明細書で使用する場合、「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」（複数可）という用語は、ウイルスに酷似しているが、ウイルス遺伝物質を含まないため非感染性である分子を意味する。ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質を発現させることで組換えに調製され得、その後、ＶＬＰに自己構築化することができる。したがって、ＺＩＫＶ ＶＬＰとは、ＺＩＫＶ構造タンパク質を含むＶＬＰのことを指す。ＶＬＰは、対象において免疫応答を誘導するためのワクチンとして使用することができる。
【0079】
本明細書で使用する場合、「Ｅタンパク質」という用語は、エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）を意味する。したがって、「ＺＩＫＶ Ｅタンパク質」は、ＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）のことを指す。Ｅタンパク質は組換えタンパク質であり得る。ＺＩＫＶ Ｅタンパク質のアミノ酸配列は、ＺＩＫＶ株によってコードされるウイルスポリタンパク質の一部である。特に、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列は、ＺＩＫＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＨ１５８２３７．１）によってコードされるウイルスポリタンパク質（Ｅタンパク質はアミノ酸２９１－７９４に相当、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＷＨ６５８４９．１）の一部である。
【0080】
本明細書で使用する場合、「ＥＤＩＩＩ」という用語は、Ｅタンパク質外部ドメインのＺＩＫＶカルボキシル（Ｃ）末端ドメインＩＩＩのことを指す。ＥＤＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列は、ＺＩＫＶ株によってコードされるウイルスポリタンパク質の一部であるＥタンパク質の一部である。例えば、ＥＤＩＩＩのアミノ酸配列は、ＺＩＫＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＨ１５８２３７．１．）の配列番号１内にコードされている。
【0081】
本明細書で使用する場合、「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、パラトープとして知られるＡｂ分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原の部分のことを指す。逆に、「エピトープ」はまた、宿主上の特異的細胞受容体または結合部位と相互作用し得る。１つの抗原は、複数のエピトープを有し得る。したがって、異なるＡｂは抗原上の異なる領域に結合し、異なる生物学的効果を有し得る。例えば、「エピトープ」という用語はまた、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を指す。エピトープは、構造的なものまたは機能的なものとに分類され得る。機能的エピトープは、一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。抗体が結合するエピトープは、抗原内に位置する２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続配列、すなわち、例えばＺＩＫＶ Ｅタンパク質のドメイン内の線形エピトープからなり得る。エピトープはまた、立体構造的であり得る、すなわち、複数の非連続的アミノ酸、すなわち、非線形アミノ酸配列から構成され得る。立体構造的エピトープは通常、特有の空間配置中に少なくとも３つのアミノ酸、より一般的には少なくとも５つのアミノ酸、例えば７～１０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基である決定基を含み得、特定の実施形態において、特定の電荷特性を有し得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは通常、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは通常、変性溶媒で処理すると失われる。抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の１つ以上のアミノ酸と相互作用するかどうかを決定するために、当業者に既知の様々な技術を使用することができる。例示的な技術としては、例えば、部位特異的変異誘発（例えば、アラニンスキャニング変異解析）が挙げられる。他の方法としては、日常的なクロスブロッキングアッセイ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されているものなど）、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析結晶学的試験、及びＮＭＲ分析が挙げられる。更に、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するのに使用できる別の方法は、質量分析で検出された水素／重水素交換である。一般に、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識した後、重水素で標識されたタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンに比べて遅い速度で重水素から水素への逆交換を行う。その結果、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得、界面に含まれないアミノ酸と比較して、相対的に高い質量を示し得る。抗体が解離した後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断させ、質量分析することで、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにすることができる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。修飾補助プロファイリング（ＭＡＰ）は、抗体構造ベース抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）とも呼ばれ、同じ抗原に結合するＡｂを、異なるエピトープに結合するＡｂ群に分類するために使用され得る。ＭＡＰは、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に対する大量のＡｂを分類する方法である（米国特許第２００４／０１０１９２０号を参照）。各カテゴリは、別のカテゴリで表されるエピトープと明確に異なるまたは部分的に重複する、独自のエピトープを反映し得る。この技術により、遺伝的に同一の抗体を迅速にフィルタリングし、遺伝的に異なる抗体に焦点を当てた特性評価を行うことができる。ハイブリドーマスクリーニングに適用した場合、ＭＡＰは、所望の特性を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。
【0082】
本明細書で使用する場合、「フラビウイルス」という用語は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科フラビウイルス属に属するウイルスのことを指す。ウイルス分類学によれば、ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶ、ＷＮＶ及び関連するフラビウイルスなど約５０のウイルスがこの属に属している。本明細書では、フラビウイルス属に属するウイルスをフラビウイルスと呼ぶ。現在、これらのウイルスは、主に東アジア、東南アジア及び南アジアならびにアフリカに存在しているが、世界中の他の地域でも発見され得る。
【0083】
本明細書で使用する場合、「ジカウイルス（ＺＩＫＶ）」という用語は、フラビウイルスと称され、ウイルスに曝露した妊婦の胎児における小頭症及び他の発達異常（Ｓｃｈｕｌｅｒ－Ｆａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ． Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．２０１６，６５：５９－６２）、ならびに成人におけるギリアン・バレー症候群（Ｃａｏ－Ｌｏｒｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１６，３８７（１００２７）：１５３１－９）と関連があるとされている。ＺＩＫＶは、アフリカ系及びアジア系遺伝子型に由来し得る。ＺＩＫＶは、構造的及び非構造的ポリペプチドをコードするポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを保有する。ゲノムはまた、ウイルス複製に関与している、５’末端及び３’末端領域の両方の非コード配列を含む。これらのウイルスによってコードされる構造的ポリペプチドは、キャプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、膜（Ｍ）、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質を含むが、これらに限定されない。これらのウイルスによってコードされる非構造的（ＮＳ）ポリペプチドは、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５を含むが、これらに限定されない。「ＺＩＫＶ」という用語は、ＺｉｋａＳＰＨ（Ｂｒａｚｉｌ ２０１５、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ３２１６３９．１）、Ｂｒａｚｉｌ－ＺＫＶ（Ｂｒａｚｉｌ ２０１５、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ４９７５５５．１）、ＰＲＶＡＢＣ５９（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ ２０１５、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ５０１２１５．１）、Ｈａｉｔｉ１２２５（Ｈａｉｔｉ ２０１４、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ５０９９９８．１）、Ｎａｔａｌ ＲＧＮ（Ｂｒａｚｉｌ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ５２７０６８．１）、ＳＶ０１２７－１４（Ｔｈａｉｌａｎｄ ２０１４、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ６８１０８１．３）、ＳＰＨ２０１５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ３２１６３９．１）、ＣＰＣ－０７４０（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ ２０１２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ６８１０８２．３）、ＳＳＡＢＲ１（Ｂｒａｚｉｌ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ７０７８２６．１）、ＶＥ＿Ｇａｎｘｉａｎ（Ｃｈｉｎａ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ７４４６９３．１）、ＭＲ７６６－ＮＩＩＤ（Ｕｇａｎｄａ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＬＣ００２５２０．１）、ＭＲ７６６（Ｕｇａｎｄａ １９４７、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６３２５３５．２）、及びＨ／ＰＦ（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｏｌｙｎｅｓｉａ ２０１３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＪ７７６７９１．１）を含む、異なるＺＩＫＶ分離株から分離したＺＩＫＶ株を含む（ＷＯ２０１７／１０９２２５）。更に、ＺＩＫＶ株には、Ｃａｍｂｏｄｉａ ２０１０（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ８６０８８５）またはＭｉｃｒｏｎｅｓｉａ ２００７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＵ５４５９８８）が含まれている（Ｍｌａｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６ Ｍａｒ１０；３７４（１０）：９５１－８）。更に、ＺＩＫＶ株には、ＦＬＲ（Ｃｏｌｏｍｂｉａ ２０１５）株（ＷＯ２０１８／０１７４９７）、Ｓｕｒｉｎａｍｅで分離したＺ１１０６０３１（アジア系遺伝子型、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ３１２３１４）、Ｓｕｒｉｎａｍｅで分離したＺ１１０６０２７（アジア系遺伝子型、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ３１２３１５）、Ｓｕｒｉｎａｍｅで分離したＺ１１０６０３２（アジア系遺伝子型、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ３１２３１３）、及びＳｕｒｉｎａｍｅで分離したＺ１１０６０３３（アジア系遺伝子型、Ｅｎｆｉｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１６，３８７（１００１５）：２２７－２２８、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ３１２３１２．１）が含まれている。
【0084】
本明細書において、「デングウイルス（ＤＥＮＶ）」という用語は、構造的及び非構造的ポリペプチドをコードするポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを保有する、フラビウイルスのことを指す。ゲノムはまた、ウイルス複製に関与している、５’末端及び３’末端領域の両方の非コード配列を含む。これらのウイルスによってコードされる構造的ポリペプチドは、キャプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、膜（Ｍ）、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質を含むが、これらに限定されない。これらのウイルスによってコードされる非構造的（ＮＳ）ポリペプチドは、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５を含むが、これらに限定されない。ＤＥＮＶは、異なるデング血清型に分類され得る。「ＤＥＮＶ」という用語は、すべてのデング血清型を含むＤＥＮＶのことを指し得る。
【0085】
本明細書で使用する場合、「デング血清型」という用語は、その細胞表面抗原によって定義され、したがって当技術分野で既知の血清学的方法によって区別することができる、デングウイルスの種のことを指す。デングウイルスの血清型は、すなわち、デング血清型１（ＤＥＮＶ１）、デング血清型２（ＤＥＮＶ２）、デング血清型３（ＤＥＮＶ３）、デング血清型４（ＤＥＮＶ４）の４つが知られている。「デング血清型」という用語は、異なるＤＥＮＶ単離株、例えば、ＤＥＮＶ１株Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／ＵＳ／ＢＩＤ－Ｖ８５３／１９９８（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＵ４８２５９２．１）、ＤＥＮＶ２株Ｔｈａｉｌａｎｄ／１６６８１／８４（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ受入番号Ｕ８７４１１．１）、ＤＥＮＶ３株Ｓｒｉ Ｌａｎｋａ Ｄ３／Ｈ／ＩＭＴＳＳＡ－ＳＲＩ／２０００／１２６６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ０９９３３６．１）、及びＤＥＮＶ４株Ｄｏｍｉｎｉｃａ／８１４６６９／１９８１（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ受入番号ＡＦ３２６８２５．１）から分離されたＤＥＮＶの株を含む。
【0086】
本明細書で使用する場合、「構造タンパク質」という用語は、成熟したウイルスの構造的な構成要素であるウイルスタンパク質のことを指す。構造タンパク質には、フラビウイルスのＣタンパク質、Ｅタンパク質、ｐｒＭタンパク質、及びＭタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。「構造タンパク質」という用語は、フラビウイルスのＣタンパク質、Ｅタンパク質、ｐｒＭタンパク質及びＭタンパク質を限定することなく含む、タンパク質の少なくとも１つを指し得る。「構造タンパク質」という用語はまた、フラビウイルスのＣタンパク質、Ｅタンパク質、ｐｒＭタンパク質及びＭタンパク質を限定することなく含む、タンパク質のすべてを指し得る。フラビウイルスは、ＤＥＮＶまたはＺＩＫＶであり得る。
【0087】
本明細書で使用する場合、「ノロウイルス」という用語は、一本鎖ポジティブセンスＲＮＡを含む非エンベロープ型ウイルスのことを指す。前記ウイルスは、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科ノロウイルス属に属する。ノロウイルスは、宿主から宿主へ直接伝染し、汚染された水及び食物によって間接的に伝染する。ノロウイルス感染症は、吐き気、嘔吐、水様性下痢、腹痛、場合によっては味覚障害によって特徴付けられる。ヒトは通常、ノロウイルスに曝露されてからから１２～４８時間後に胃腸炎の症状を発症する。
【0088】
本明細書で使用する場合、「ポリオウイルス」という用語は、一本鎖ポジティブセンスＲＮＡを含む非エンベロープ型ウイルスのことを指す。前記ウイルスは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科エンテロウイルス属に属する。感染は糞口経路で生じ、筋力低下により動けなくなる可能性がある灰白髄炎を引き起こし得る。灰白髄炎はまた、発熱及び喉の痛み、頭痛、首のこりならびに手足の痛みなどの軽度の症状を伴い得る。
【0089】
本発明で使用する場合、「生ウイルス」という用語は、感染性ウイルスのことを指す。
【0090】
本明細書で使用する場合、「不活性化ウイルス」または「不活性化生ウイルス」という用語は、不活性化された、つまり病気を引き起こす能力を失うように処理された生ウイルスのことを指す。不活性化は、熱不活性化、界面活性剤による不活性化、紫外線（ＵＶ）照射、ガンマ線照射、β－プロピオラクトン不活性化、またはホルムアルデヒドによる不活性化など、当技術分野で既知の様々な方法によって実施することができる。不活性化ウイルスは、更に、濾過またはクロマトグラフィーなどの当技術分野で既知の方法によって精製することができる。不活性化ウイルスは、不活性化ジカウイルスであり得る。したがって、ワクチン抗原が不活性化ウイルス抗原である場合、そのワクチンを「不活性化ワクチン」または「不活性化生ワクチン」と称することができる。したがって、ワクチン抗原が精製不活性化ウイルス抗原である場合、そのワクチンを「精製不活性化ワクチン」または「精製不活性化生ワクチン」と称することができる。したがって、ワクチン抗原が精製不活性化ジカウイルス抗原である場合、そのワクチンを「精製不活性化ジカワクチン」と称することができる。不活性化ワクチンは生ワクチンと比較して弱い免疫応答を誘導するため、免疫学的アジュバント及び複数回の「ブースター」注射が必要となり得る。
【0091】
本明細書で使用する場合、「免疫学的アジュバント」または「アジュバント」という用語は、ワクチン接種時にこの応答を改善するために抗原に対する免疫応答を増強及び／または調節する物質のことを指す。免疫学的アジュバントには、ミョウバンなどの無機アジュバントまたはフロイントアジュバントなどの有機アジュバントが含まれる。
【0092】
本明細書で使用する場合、「ミョウバン」という用語は、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムを含む無機アジュバントのことを指す。
【0093】
本明細書で使用する場合、「弱毒化生ウイルス」または「弱毒化ウイルス」という用語は、宿主に病気を引き起こす病原菌から弱毒化（または弱体化）した生ウイルスのことを指す。弱毒化ウイルスを調製するための方法として、生ウイルスを外来宿主に定植させることがある。定植の際、ウイルスは、新しい宿主でウイルスを良好に増殖させることができる変異を蓄積する。その結果、最初のウイルス集団とは大きく異なるウイルス集団ができる。そうして、元の宿主（ヒトの場合もある）に対してもはや有害でない、つまり「弱毒化」した得られたウイルス集団を選択することが目標となる。したがって、ワクチン抗原が弱毒化生ウイルスである場合、そのワクチンを「弱毒化生ワクチン」「生ワクチン」または「弱毒化ワクチン」と称することができる。
【0094】
本明細書で使用する場合、「ワクチン」という用語は、対象に免疫応答を導入することができる少なくとも１つのワクチン抗原を提供する予防的材料のことを指す。ワクチン抗原は、ワクチン接種に適した任意の材料に由来し得る。ワクチン抗原を製剤化することにより、ワクチンを調製することができる。例えば、ワクチン抗原は、ノロウイルス抗原、ジカウイルス抗原、デングウイルス抗原またはポリオウイルス抗原などのウイルス抗原であってもよく、対応するワクチンをそれぞれノロワクチン、ジカワクチン、デングワクチンまたはポリオワクチンと称することができる。ワクチン抗原が精製不活性化ウイルスまたは弱毒化生ウイルスである場合、ワクチンは精製不活性化ワクチンまたは弱毒化生ワクチンであり得る。ワクチン抗原がＶＬＰである場合、ワクチンはまたＶＬＰワクチンであり得る。
【0095】
本明細書で使用する場合、「精製不活性化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）」という用語は、培養で増幅された後、不活性化されて疾患産生能を失ったＺＩＫＶ粒子を含むＺＩＫＶワクチンのことを指す。不活性化ステップに加えて、ＺＩＫＶワクチンは精製される。ＺＩＫＶワクチンは、ＺＩＫＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９に由来し得る。
【0096】
本明細書で使用する場合、「ワクチンの用量」という用語は、ワクチンの特定の量のことを指す。「ワクチンの用量」という用語は、対象への１回の投与によって与えられるワクチンの量、または対象へのすべての投与によって与えられるワクチンの量、すなわちブースター投与を含む量を指し得る。ワクチンは、ＺＩＫＶワクチン、ノロウイルスワクチン、デングウイルスワクチンまたはポリオウイルスワクチンであり得る。
【0097】
本明細書で使用する場合、「アクセプターマイクロスフェア」という用語は、アクセプターＡｂの定常領域に結合することができるかまたは結合していて、ドナー抗体と結合することができないマイクロスフェアのことを指す。更に、アクセプターマイクロスフェアは、近接反応で移動するエネルギーを受けとることができる。更に、アクセプターマイクロスフェアは、近接反応で移動するエネルギーを受けとり、それによって検出可能なシグナルを生成することができる１つ以上の分子を含む。
【0098】
本明細書で使用する場合、「ドナーマイクロスフェア」という用語は、ドナーＡｂの定常領域に結合することができるかまたは結合していて、アクセプターＡｂと結合することができないマイクロスフェアのことを指す。更に、ドナーマイクロスフェアは、近接反応で移動するエネルギーを供与することができる。更に、ドナーは、近接反応で移動するエネルギーを供与することができる１つ以上の分子を含む。このような分子は、光増感剤であり得る。
【0099】
本明細書で使用する場合、「近接反応」という用語は、検出可能なシグナルを生成することができる反応のことを指す。近接反応は、２つの反応パートナーの一方（「ドナー」、例えばドナーマイクロスフェア）が移動するエネルギーを供与する供与ステップと、２つの反応パートナーの他方（「アクセプター」、例えばアクセプターマイクロスフェア）が移動するエネルギーを受けとり、それによって検出可能なシグナルを生成する受けとりステップによって特徴付けられる。このように近接反応は、２つの反応パートナーの近さに依存したシグナルを提供し、そのため、特定の距離内に反応パートナーが存在することを読み出すことである。シグナルの強度は、反応パートナーの距離が長くなるにつれて減少する。シグナルが検出できない場合、反応パートナーが十分な距離にあり、近接反応が起きていない。近接反応及び前記近接反応により検出される対応する反応パートナーの距離は、同一の抗原分子または粒子と結合しているドナー及びアクセプターと、前記抗原分子または粒子と結合していないもの、すなわち、いずれの抗原分子もしくは粒子とも結合していないものまたは他の抗原分子もしくは粒子と結合していないものと、を区別するために選択される。
【0100】
本明細書で使用する場合、「複合体」という用語は、ドナーＡｂがドナーＡｂ可変領域によって抗原の１つのエピトープに、ドナーＡｂ定常領域によってドナーマイクロスフェアに結合し、アクセプターＡｂがアクセプターＡｂ可変領域によって抗原の別のエピトープに、アクセプターＡｂ定常領域によってアクセプターマイクロスフェアに結合している複合体のことを指す。複合体の形成は、ドナー及びアクセプターマイクロスフェアを特定の距離以内（例えば２００ｎｍ以内）に近づけることができる。この点について、文脈上、Ａｂ／抗原複合体、タンパク質／抗体複合体、抗体複合体などの表現は、この段落で「複合体」という用語について述べたのとは別の意味を有し得ることに注意しなければならない。
【0101】
本明細書で使用する場合、「シグナル」という用語は、測定可能な事象のことを指す。測定可能な事象としては、発光、光ルミネセンス、蛍光、化学発光及びリン光が挙げられ得るが、これらに限定されない。シグナルは、任意の適切な検出機器によって測定され得る。シグナルは、近接反応で生成され得る。
【0102】
本明細書で使用する場合、「検出系」という用語は、近接反応の存在及び／または量、したがって抗原試料の効力を示すシグナルを検出するのに適した任意の系のことを指す。適切な検出装置の例としては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）、ＥｎＳｐｉｒｅ（商標）、ＥｎＳｉｇｈｔ（登録商標）またはＶＩＣＴＯＲ（登録商標）Ｎｉｖｏ（商標）マルチラベルプレートリーダーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0103】
本明細書で使用する場合、「アクセプター抗体」という用語は、アクセプターマイクロスフェアに結合することができるかまたは結合しているＡｂのことを指す。更に、アクセプターＡｂは、ドナーマイクロスフェアに結合することができない。一実施形態において、アクセプターＡｂはモノクローナルＡｂである。
【0104】
本明細書で使用する場合、「ドナー抗体」という用語は、ドナーマイクロスフェアに結合することができるかまたは結合しているＡｂのことを指す。更に、ドナーＡｂは、アクセプターマイクロスフェアに結合することができない。一実施形態において、ドナーＡｂは、ドナーＡｂの定常領域でビオチン化される。一実施形態において、ドナーＡｂはモノクローナルＡｂである。
【0105】
本明細書で使用する場合、「ＥＣ５０値」という用語は、ドナーＡｂとアクセプターＡｂの特定のペアと飽和状態で５０％の最大複合体形成を達成するのに必要な抗原の量のことを指す。前記量は、濃度または力価（例えばｎｇ／μＬまたはＴＣＩＤ５０）として表すことができる。
【0106】
本明細書で使用する場合、「製剤化」という用語は、例えばワクチン抗原に更なる物質を添加することによる最終的なワクチンの調製のことを指す。製剤化ステップには、アジュバントの添加が含まれ得る。例えば、最終的なワクチンを製剤化する際に、ワクチン抗原をミョウバンに吸着させる。
【図面の簡単な説明】
【0107】
【図1】ＺＡＰＡによるＰＩＺＶの解析。ＰＩＺＶを連続希釈し、異なるｍＡｂペアを使用してＺＡＰＡで解析した。ｍＡｂペア＃１：アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２及びドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１、ｍＡｂペア＃２：アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２及びドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃３、ｍＡｂペア＃３：アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２及びドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃４である。ＺＡＰＡシグナル数を、各ｍＡｂペアのＰＩＺＶ濃度［ｎｇ／ｍＬ］に応じた相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表示する。
【図2】ＺＡＰＡによるＺＩＫＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９の解析。ＺＩＫＶを連続希釈し、異なるｍＡｂペアを使用してＺＡＰＡで解析した。ｍＡｂペア＃１：アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２及びドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１、ｍＡｂペア＃２：アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２及びドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃３、ｍＡｂペア＃３：アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２及びドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃４である。ＺＡＰＡシグナル数を、各ｍＡｂペアのＺＩＫＶ ＴＣＩＤ５０力価に応じた相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表示する。
【図3】原薬（ＤＳ）の強制分解試験。異なる量の熱処理したＤＳを未処理のＤＳと混合し、ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いてＺＡＰＡで解析した。ＺＡＰＡシグナル数を参照物質に内挿して、抗原単位／ｍＬ（ＡＵ／ｍＬ）のＺＡＰＡ値を算出した。未処理ＤＳの割合に応じたＺＡＰＡ値（ＡＵ／ｍＬ）を表示する。
【図4】ＰＩＺＶ中のミョウバンに吸着した原薬（ＤＳ）の強制分解試験。異なる量の熱処理したＤＳを未処理のＤＳと混合し、ＰＩＺＶの調製のためにミョウバンに吸着させ、ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いてＺＡＰＡで解析した。ＺＡＰＡシグナル数を参照物質に内挿して、抗原単位／ｍＬ（ＡＵ／ｍＬ）のＺＡＰＡ値を算出した。ＰＩＺＶ試料内の未処理ＤＳの割合に応じたＺＡＰＡ値（ＡＵ／ｍＬ）を表示する。
【図5】ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いたＺＡＰＡによる異なる原薬（ＤＳ）バッチの解析。ＤＳバッチ＃１は０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１μｇの抗原量になるように希釈され、ＺＡＰＡで分析する前にミョウバンに吸着させた。ＺＡＰＡシグナル数を参照物質に内挿して、抗原単位／１００μＬ（ＡＵ／１００μＬ）のＺＡＰＡ値を算出した。ＤＳバッチ＃１の用量に応じたＺＡＰＡ値（ＡＵ／１００μＬ）を表示する。
【図6】ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いたＺＡＰＡによる異なる原薬（ＤＳ）バッチの解析。ＤＳバッチ＃２は０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１μｇの抗原量になるように希釈され、ＺＡＰＡで分析する前にミョウバンに吸着させた。ＺＡＰＡシグナル数を参照物質に内挿して、抗原単位／１００μＬ（ＡＵ／１００μＬ）のＺＡＰＡ値を算出した。ＤＳバッチ＃２の用量に応じたＺＡＰＡ値（ＡＵ／１００μＬ）を表示する。
【図7】ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いたＺＡＰＡによる異なる原薬（ＤＳ）バッチの解析。ＤＳバッチ＃３は０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１μｇの抗原量になるように希釈され、ＺＡＰＡで分析する前にミョウバンに吸着させた。ＺＡＰＡシグナル数を参照物質に内挿して、抗原単位／１００μＬ（ＡＵ／１００μＬ）のＺＡＰＡ値を算出した。ＤＳバッチ＃３の用量に応じたＺＡＰＡ値（ＡＵ／１００μＬ）を表示する。
【図8】ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いたＺＡＰＡによる異なる原薬（ＤＳ）バッチの解析。ＤＳバッチ＃４は０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１μｇの抗原量になるように希釈され、ＺＡＰＡで分析する前にミョウバンに吸着させた。ＺＡＰＡシグナル数を参照物質に内挿して、抗原単位／１００μＬ（ＡＵ／１００μＬ）のＺＡＰＡ値を算出した。ＤＳバッチ＃４の用量に応じたＺＡＰＡ値（ＡＵ／１００μＬ）を表示する。
【図9】ミョウバンへの吸着によりＰＩＺＶに配合された異なる原薬（ＤＳ）バッチ＃１～４の０．０１μｇ用量で免疫化したマウスに誘導された中和Ａｂ力価。ＤＳバッチに依存したレポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）アッセイにより決定した平均対数化ＥＣ５０値を表示する。
【図10】ＰＩＺＶに配合された原薬（ＤＳ）バッチ＃１～４の異なる用量で免疫化したマウスに誘導された中和Ａｂ力価とＺＡＰＡ値との相関性。異なるＤＳバッチの０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１μｇの異なる抗原量をミョウバンに吸着させ、ＰＩＺＶを調製した。ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いたＺＡＰＡシグナル数の参照物質への内挿により、抗原単位／１００μＬ（ＡＵ／１００μＬ）のＺＡＰＡ値を算出した。レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）アッセイによって決定された平均対数化ＥＣ５０値に依存する、すべてのＤＳバッチ＃１～４の各用量のＺＡＰＡ値（ＡＵ／１００μＬ）を表示する。
【図11】ＰＩＺＶ試験試料＃１及び２ならびに参照物質をＺＡＰＡで解析。試料及び参照を連続希釈し、ｍＡｂペア＃１（アクセプターＡｂは抗ＺＩＫＶ＃２であり、ドナーＡｂは抗ＺＩＫＶ＃１である）を用いてＺＡＰＡで解析した。ＺＡＰＡシグナル数を、ＰＩＺＶ試験試料及び参照希釈液（１／希釈液として表示）に応じた相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表示する。
【発明を実施するための形態】
【0108】
アクセプター抗体、ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのキット
本発明は、アクセプターキット及びドナーキットを含むキットであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプターマイクロスフェアによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記キットに関する。
本発明は、アクセプターキット及びドナーキットを含むキットであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプターマイクロスフェアによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記キットに関する。
【0109】
抗原の２つのエピトープに結合する２つのＡｂを適用する他の設定には、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ設定が含まれる。これにより、１つのＡｂがプレート上に固定化され、抗原がそのプレートに適用され、固定化されたＡｂによって結合されることができる。その後、第２のＡｂを添加し、酵素を用いた検出が行われる。ＥＬＩＳＡは当技術分野で適用される一般的な方法であるが、いくつかの欠点がある。これらの欠点には、遮断不足による間違った結果のリスク、検出のために使用する酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）の活性が試料成分によって阻害されるリスク、及び作業に時間がかかること（洗浄工程を含む複数のステップが必要）が挙げられる。更に、酵素増幅を必要とするため、ＥＬＩＳＡによる比色測定は感度に欠けることが多く、したがって増幅量のばらつきや誤差が生じやすい。
【0110】
本発明に有用なマイクロスフェアは、直径が約１０～約５００ｎｍ、より好ましくは約５０～約４００ｎｍ、更により好ましくは約２００～約３００ｎｍのサイズの範囲であり、最も好ましくはマイクロスフェアは約２００～約２５０ｎｍの直径を有する。マイクロスフェアは磁性であり得る。
【0111】
マイクロスフェアは、Ａｂのような分子を付着させ得る任意の材料で構築することができる。例えば、マイクロスフェアを構築するための許容可能な材料としては、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメタクリル酸メチルまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0112】
マイクロスフェアは、本発明のＡｂなどの分子の付着に有用な官能基を含み得る。前記官能基は、カルボン酸塩、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド、アミン、硫黄酸化物、窒素酸化物またはハロゲン化物であり得るが、これらに限定されない。分子は、本明細書に記載のまたは従来技術の化学的技術を使用して、マイクロスフェアに共有結合させることができる（例えば、Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ２０１０，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓを参照のこと）。例えば、Ａｂは還元的アミノ化によってマイクロスフェアに結合させることができる。したがって、マイクロスフェア表面のアルデヒドは分子内のアミン基と反応して不安定なイミンとなり、それはシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）または水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）などの適切な還元剤を用いて更に還元されて安定なアミンとなる。
【0113】
マイクロスフェアに結合すべきＡｂが提供する以外のアミン含有化合物が還元的アミノ化を妨害する可能性があるため、アミン含有化合物は、適切な緩衝液交換法でＡｂ溶液から除去する必要がある。例えば、アミン（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、グリシン、ビシン、トリシン）を含む緩衝液は避けるべきである。例えば、好適な緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、炭酸緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液を含む。還元的アミノ化のｐＨは、約８であり得る。カップリング効率が低下する可能性があるので、Ａｂはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはゼラチンなどのタンパク質またはペプチド系安定剤を含まず、緩衝液はグリセロールを含まないものでなければならない。
【0114】
マイクロスフェアは、本発明のＡｂなどの分子を付着させる親和性基を含み得る。前記親和性基は、Ｎｉ２＋（Ｈｉｓタグ化ＡｂのようなＨｉｓタグ化分子の固定化用）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｌ、抗ヒトＩｇＧ Ａｂ、抗ウサギＩｇＧ Ａｂ、抗マウスＩｇＧ Ａｂ、抗マウスＩｇＭ Ａｂ、抗ラットＩｇＧ Ａｂ、抗ヒツジＩｇＧ Ａｂ、抗ニワトリＩｇＹ Ａｂ、抗ヤギＩｇＧ Ａｂ、抗ＦＬＡＧ Ａｂ、ストレプトアビジン、アビジン及びグルタチオンであり得るが、これらに限定されない。
【0115】
マイクロスフェアは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳ）製のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アクセプターマイクロスフェア、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アクセプターマイクロスフェア、ＡｌｐｈａＤｏｎｏｒマイクロスフェアからなるリストのうちの１つであり得る。特定の実施形態において、アクセプターマイクロスフェアは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アクセプターマイクロスフェアである。
【0116】
アクセプターマイクロスフェアは、近接反応で移動するエネルギーを受けとることが可能であり、近接反応で移動されるエネルギーを受けとることが可能な１つ以上の分子を含む。特定の実施形態において、１つ以上の分子はフルオロフォアである。フルオロフォアには、チオキセン、アントラセン、ルブレン及びユーロピウム、ユーロピウムキレートなどのランタニドまたはこれらの任意の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。フルオロフォアは、励起時に検出可能なシグナルを生成することができ、励起は、近接反応で移動するエネルギーを受けとることによって引き起こされる。
【0117】
ドナーマイクロスフェアは、近接反応で移動するエネルギーを供与することが可能であり、近接反応で移動するエネルギーを供与することが可能な１つ以上の分子を含む。特定の実施形態において、１つ以上の分子は光増感剤である。光増感剤は、光化学的プロセスで別の分子に化学変化を生じさせる分子である。特定の実施形態において、光増感剤はフタロシアニンである。移動するエネルギーの供与は、近接反応の一部として光増感剤に特定の波長を照射することによって誘発され得る。
【0118】
一実施形態において、ドナーマイクロスフェアはアクセプターマイクロスフェアと直接相互作用することができず、アクセプターマイクロスフェアはドナーマイクロスフェアと直接相互作用することができない。この文脈内の「直接」とは、アクセプター及びドナーマイクロスフェアが、近接反応中に生じるのとは別の方法で互いに反応することを意味する。例えば、ドナー及びアクセプターマイクロスフェアの官能基が互いに化学反応するか、またはドナー及びアクセプターマイクロスフェアの親和性基が互いに非共有結合的に相互作用する。例えば、タンパク質Ａをコーティングしたドナーマイクロスフェアは、抗ヒトＩｇＧ Ａｂをコーティングしたアクセプターマイクロスフェアと直接相互作用することが可能である。この相互作用は偽陽性シグナルをもたらすので、避けるべきである。
【0119】
近接反応とは、検出可能なシグナルを生成することができる反応である。近接反応は、２つの反応パートナーの一方（「ドナー」、例えばドナーマイクロスフェア）が移動するエネルギーを供与する供与ステップと、２つの反応パートナーの他方（「アクセプター」、例えばアクセプターマイクロスフェア）が移動するエネルギーを受けとり、それによって検出可能なシグナルを生成する受けとりステップによって特徴付けられる。
【0120】
一実施形態において、近接反応は、ドナーマイクロスフェアが移動するエネルギーを供与する供与ステップと、アクセプターマイクロスフェアが移動するエネルギーを受けとり、それによって検出可能なシグナルを生成する受けとりステップとによって特徴付けられる。一実施形態において、近接反応の第１ステップは、ドナーマイクロスフェアに特定の波長を照射し、それによって光増感剤によって別の分子に化学変化を誘発させることを含む。一実施形態において、ドナーマイクロスフェアはフタロシアニンを含み、約６８０ｎｍの波長で照射される。励起されたフタロシアニンは、ドナーマイクロスフェアの近傍及び／または表面で周囲酸素から一重項酸素の生成を誘発する。更に、近接反応は、一重項酸素がアクセプターマイクロスフェアに拡散することによって特徴付けられる。近接反応の次のステップでは、一重項酸素からアクセプターマイクロスフェア内のフルオロフォア（例えばルブレン、アントラセン、ユーロピウムキレートまたはチオキセンなど）にエネルギーを移動させる。エネルギーを光を発する（シグナル）最終的なフルオロフォアに移動させるまで、エネルギーは更に、フルオロフォアから１つ以上の他のフルオロフォアへと移動する。特定の実施形態において、約５２０～６８０ｎｍの波長の光が放出され、約５２０～６３０ｎｍの間で検出され得る。
【0121】
本発明の一実施形態において、アクセプターマイクロスフェア内のフルオロフォアは、チオキセン、アントラセン及びルブレンを含む。チオキセンは、一重項酸素との反応後にジケトン誘導体に変換される。エネルギーは、約３４０～約３５０ｎｍの波長の光を発光することにより、チオキセンのジケトン誘導体からアントラセンに移動し、アントラセンが励起される。励起されたアントラセンは、約４５０～約５００ｎｍの波長の光を発光することにより、最終的なフルオロフォアであるルブレンにエネルギーを移動する。励起されたルブレンは、約５４０～約６８０ｎｍの波長の光（シグナル）を発光するという形でシグナルを生成し、それは約５２０～約６２０ｎｍの間で検出することができる。チオキセン、アントラセン及びルブレンを含むアクセプターマイクロスフェアの例として、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳ）製のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アクセプターマイクロスフェアがある。
【0122】
本発明の別の実施形態において、アクセプターマイクロスフェア内のフルオロフォアは、チオキセン及びユーロピウムキレートを含む。チオキセンは、一重項酸素との反応後にジケトン誘導体に変換される。エネルギーは、約３４０～約３５０ｎｍの波長の光を発光することによりチオキセンのジケトン誘導体から最終的なフルオロフォアであるユーロピウムに移動する。励起されたユーロピウムは、約６０５～約６２５ｎｍの波長の光（シグナル）を発光するという形でシグナルを生成し、それは約６０７～約６２３ｎｍの間で検出することができる。チオキセン及びユーロピウムキレートを含むアクセプターマイクロスフェアの例として、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳ）製のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アクセプターマイクロスフェアが挙げられる。
【0123】
約６８０ｎｍの長い励起波長と約５２０～約６２０ｎｍの短い発光波長を組み合わせたものは、生体成分または他のアッセイ成分からの干渉を低減させ、それにより低バックグラウンドシグナルを確実にする。
【0124】
近接反応は、２つの反応パートナーの近さに依存し、それにより２つの反応パートナーの近さを示すものである。
【0125】
一実施形態において、十分な近接性の要件は、ドナーからアクセプターマイクロスフェアへの一重項酸素の拡散の要件によって実現され得る。一重項酸素は、基底状態に戻るまで約４μ秒の寿命を有する。その間に一重項酸素は、溶液中で約２００ｎｍ拡散することができる。近接反応の基礎としての一重項酸素の拡散は、ドナーとアクセプターマイクロスフェアの距離が２００ｎｍ以下の複合体を形成する抗原、例えば、直径約５０ｎｍのジカウイルス粒子など直径が１５０ｎｍを超えないウイルス粒子の分析に良好に適している。
【0126】
本発明の一実施形態において、抗原の少なくとも２つのエピトープは同じエピトープであり、アクセプターＡｂ及びドナーＡｂは同じエピトープに結合することができる及び／または同じ可変領域を有する。少なくとも２つの同じエピトープを持つ抗原は、その表面に構造タンパク質の複数のコピーを持つウイルスまたは二量体ウイルス抗原（例えば、ＺＩＫＶの二量体Ｅタンパク質）であり得る。
【0127】
本発明の別の実施形態において、少なくとも２つのエピトープは異なるエピトープであり、アクセプター抗体及びドナー抗体は異なる可変領域を有する。
【0128】
別の実施形態において、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂは、他の抗原と交差反応しない。例えば、抗原がＺＩＫＶ抗原である場合、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂは、ＤＥＮＶ抗原と交差反応しない。
【0129】
本発明の一実施形態において、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂの少なくとも一方は、プラーク減少中和試験またはレポーターウイルス粒子試験またはマイクロ中和試験またはフォーカス形成アッセイで試験した場合、それが結合するウイルス抗原を中和する。
【0130】
本発明の一実施形態において、ドナー抗体及びアクセプター抗体はそれぞれ、プラーク減少中和試験またはレポーターウイルス粒子試験またはマイクロ中和試験またはフォーカス形成アッセイで試験した場合に、それらが結合しているウイルス抗原を中和する。
【0131】
本発明の１つの具体的な実施形態において、抗原は、ジカウイルス抗原、デングウイルス抗原、ノロウイルス抗原及びポリオウイルス抗原からなる群から選択されるウイルス抗原を含むウイルス抗原である。ウイルス抗原は、ウイルスの構造タンパク質の１つ以上また非構造タンパク質の１つ以上であり得る。ウイルス抗原はまた、ウイルス全体であり得る。
【0132】
別の具体的な実施形態において、抗原はウイルス抗原であり、ウイルス抗原は生ウイルス、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルス及びウイルス様粒子からなる群から選択される。特定の実施形態において、抗原は、生ジカウイルス、不活性化ジカウイルス、弱毒化生ジカウイルス及びジカウイルス様粒子の群から選択される。特定の実施形態において、抗原は、生デングウイルス、不活性化デングウイルス、弱毒化生デングウイルス及びデングウイルス様粒子の群から選択される。別の実施形態において、抗原は、生ポリオウイルス、不活性化ポリオウイルス、弱毒化生ポリオウイルス及びポリオウイルス様粒子の群から選択される。別の実施形態において、抗原は、生ノロウイルス、不活性化ノロウイルス、弱毒化生ノロウイルス及びノロウイルス様粒子の群から選択される。
【0133】
一実施形態において、抗原はワクチン抗原である。具体的な実施形態において、ワクチン抗原はウイルス抗原であり、ウイルス抗原は生ウイルス、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルス及びウイルス様粒子からなる群から選択される。特定の実施形態において、抗原は、生ジカウイルス、不活性化ジカウイルス、弱毒化生ジカウイルス及びジカウイルス様粒子の群から選択される。一実施形態において、抗原は、生デングウイルス、不活性化デングウイルス、弱毒化生デングウイルス及びデングウイルス様粒子の群から選択される。別の実施形態において、抗原は、生ポリオウイルス、不活性化ポリオウイルス、弱毒化生ポリオウイルス及びポリオウイルス様粒子の群から選択される。別の実施形態において、抗原は、生ノロウイルス、不活性化ノロウイルス、弱毒化生ノロウイルス及びノロウイルス様粒子の群から選択される。この文脈内で、ウイルス抗原は更に、ジカウイルス抗原、デングウイルス抗原、ノロウイルス抗原及びポリオウイルス抗原からなる群から選択されるウイルス抗原を含む。ウイルス抗原は、ウイルスの構造タンパク質の１つ以上また非構造タンパク質の１つ以上であり得る。ウイルス抗原はまた、ウイルス全体であり得る。
【0134】
一実施形態において、ウイルス抗原はアジュバントに吸着される。特定の実施形態において、アジュバントはミョウバンである。この文脈内のミョウバンは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのことを指し得る。
【0135】
具体的な実施形態において、ウイルス抗原は不活性化ウイルスである。
【0136】
一実施形態において、ウイルス抗原は、アジュバントに吸着される不活性化ウイルスである。特定の実施形態において、アジュバントはミョウバンである。この文脈内のミョウバンは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのことを指し得る。
【0137】
１つの具体的な実施形態において、ウイルス抗原は不活性化ジカウイルスである。
【0138】
より具体的な実施形態において、ウイルス抗原はアジュバントに吸着される不活性化ジカウイルスである。特定の実施形態において、アジュバントはミョウバンである。この文脈内のミョウバンは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのことを指し得る。
【0139】
一実施形態によれば、アクセプター抗体、ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのそれぞれは、非結合状態である。
【0140】
一実施形態によれば、アクセプターマイクロスフェアはアクセプター抗体の定常領域に結合しており、及び／またはドナーマイクロスフェアはドナー抗体の定常領域に結合している。
【0141】
本発明の一実施形態によれば、ドナー抗体はビオチン化され、ドナーマイクロスフェアはストレプトアビジンでコーティングされている。
【0142】
本発明の一実施形態によれば、アクセプター抗体は、アクセプターマイクロスフェアに共有結合している。具体的な実施形態において、アクセプターＡｂは、還元的アミノ化によってアクセプターマイクロスフェアに共有結合される。
【0143】
１つの具体的な実施形態によれば、ドナー抗体はビオチン化され、ドナーマイクロスフェアはストレプトアビジンでコーティングされ、アクセプター抗体はアクセプターマイクロスフェアに共有結合される。
【0144】
ジカ結合アクセプター抗体、ジカ結合ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのキット
本発明は、アクセプターキット及びドナーキットを含むキットであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプタービーズによるシグナルを生成する近接反応で移動されるエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記キットに関する。
本発明は、アクセプターキット及びドナーキットを含むキットであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプタービーズによるシグナルを生成する近接反応で移動されるエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、ジカウイルス抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記キットに関する。
【0145】
前記キットに関しては、「アクセプター抗体、ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのキット」という名称の上述の章を参照されたい。
【0146】
一実施形態において、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂは、デング抗原と交差反応しない。
【0147】
別の実施形態において、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂの少なくとも一方は、例えばプラーク減少中和試験またはレポーターウイルス粒子試験またはマイクロ中和試験またはフォーカス形成アッセイで決定されるようなＺＩＫＶ中和Ａｂである。
【0148】
別の一実施形態において、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂは両方とも、例えばプラーク減少中和試験またはレポーターウイルス粒子試験またはマイクロ中和試験またはフォーカス形成アッセイで決定されるようなＺＩＫＶ中和Ａｂである。
【0149】
一実施形態において、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂは、１００ｎｇ／ｍＬ未満または８０ｎｇ／ｍＬ未満または６０ｎｇ／ｍＬ未満または４０ｎｇ／ｍＬ未満または３０ｎｇ／ｍＬ未満のジカウイルス抗原に対するＥＣ５０値を提供する。この文脈内の具体的な実施形態において、ジカウイルス抗原はＰＩＺＶである。
【0150】
本発明の別の実施形態において、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂは、５ｅ７ ＴＣＩＤ５０力価未満または４ｅ７ ＴＣＩＤ５０力価未満または３ｅ７ ＴＣＩＤ５０力価未満のジカウイルス抗原に対するＥＣ５０値を提供する。この文脈内の具体的な実施形態において、ジカウイルス抗原はジカ生ウイルスである。
【0151】
ＥＣ５０値は、ＺＩＫＶ抗原の連続希釈液について、後の章の方法（「抗原試料の効力を決定するための方法」）で説明するようにＺＩＫＶ抗原の効力を示すシグナルを検出することにより決定することができる。検出されたシグナルをＺＩＫＶ抗原量（例えばｎｇ／ｍＬの濃度または力価のいずれかであり得る）に対してプロットし、用量反応曲線に従って非線形回帰でデータを適合させることにより、ＥＣ５０値を計算することができる。
【0152】
本発明の一実施形態によれば、ドナーＡｂ及びアクセプターＡｂは、配列番号１によってコードされるＥタンパク質のＺＩＫＶ ＥＤＩＩＩ上のエピトープに結合する。
【0153】
一実施形態によれば、アクセプター抗体及びドナー抗体は抗体１及び抗体２であり、異なる可変領域を有する。抗体１及び抗体２は、抗ＺＩＫＶ＃１及び抗ＺＩＫＶ＃２であり得る。更に、抗体１及び抗体２は、抗ＺＩＫＶ＃２及び抗ＺＩＫＶ＃３であり得る。Ａｂの詳細及び特性評価については、実施例１を参照されたい。抗体１及び抗体２はそれぞれ、ＶＨ－ＣＤＲ１及び／またはＶＨ－ＣＤＲ２及び／またはＶＨ－ＣＤＲ３及び／またはＶＬ－ＣＤＲ１及び／またはＶＬ－ＣＤＲ２及び／またはＶＬ－ＣＤＲ３の配列によって特徴付けられ得る。抗体１及び抗体２はそれぞれ、あるいはまたは更に、ＶＨ及び／またはＶＬ及び／またはＨ及び／またはＬの配列によって特徴付けられ得る。参照される配列は、アミノ酸配列であり得るかまたはアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。配列及び結合に重要なアミノ酸残基は、それぞれ表１及び表２に示す。重要残基とは、その側鎖がＡｂ－エピトープ相互作用に最も大きくエネルギー的に寄与し、その変異がアラニンスキャニング変異導入法で最も低い結合反応性（野生型の１０％未満）を付与するアミノ酸である（Ｂｏｇａｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２８０，１－９；Ｌｏ Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２８５，２１７７－２１９８）。
【0154】
【表1-1】
【0155】
【表1-2】
【0156】
【表2】
【0157】
本発明の一実施形態によれば、抗体１はドナー抗体であり、抗体２はアクセプター抗体である。
【0158】
本発明の別の実施形態によれば、ドナー抗体はビオチン化され、ドナーマイクロスフェアはストレプトアビジンでコーティングされている。
【0159】
本発明の別の実施形態によれば、アクセプター抗体は、アクセプターマイクロスフェアに共有結合している。
【0160】
本発明の具体的な実施形態によれば、抗体１はドナー抗体であり、抗体２はアクセプター抗体であり、ドナー抗体はビオチン化され、ドナーマイクロスフェアはストレプトアビジンでコーティングされ、アクセプター抗体はアクセプターマイクロスフェアに共有結合している。
【0161】
抗原試料の効力を決定するための方法
本発明は、ワクチン抗原試料などの抗原試料の効力を示すシグナルを検出するための方法であって、抗原試料中の抗原は少なくとも２つのエピトープを提供し、前記方法は、
ステップ１：アクセプターキット及びドナーキットを含むキットを提供するステップであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプターマイクロスフェアによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記ステップと、
ステップ２：ステップ１の前記量の前記ドナーマイクロスフェア、前記量の前記アクセプターマイクロスフェア、前記量の前記ドナー抗体及び前記量の前記アクセプター抗体と試料を接触させ、試料中の抗原と、ドナーマイクロスフェアに結合したドナー抗体及びアクセプターマイクロスフェアに結合したアクセプター抗体ならびに抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合したアクセプター抗体及び抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合したドナー抗体と、の複合体の形成を可能にするステップと、
ステップ３：抗原試料の効力を示すシグナルを生成するための近接反応を行わせるステップと、
ステップ４：抗原試料の効力を示すシグナルを検出するステップと、を含む、前記方法に関する。
本発明は、ワクチン抗原試料などの抗原試料の効力を示すシグナルを検出するための方法であって、抗原試料中の抗原は少なくとも２つのエピトープを提供し、前記方法は、
ステップ１：アクセプターキット及びドナーキットを含むキットを提供するステップであって、アクセプターキットはある量のアクセプターマイクロスフェア及びある量のアクセプター抗体を含み、ドナーキットはある量のドナーマイクロスフェア及びある量のドナー抗体を含み、
アクセプターマイクロスフェアは、シグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを受けとることができ、アクセプター抗体の定常領域に結合できるかまたは結合しており、ドナー抗体と結合することができず、
アクセプター抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合できる可変領域と、前記アクセプターマイクロスフェアに結合できるかまたは結合している定常領域とを有し、アクセプター抗体はドナーマイクロスフェアに結合することができず、
ドナーマイクロスフェアは、アクセプターマイクロスフェアによるシグナルを生成する近接反応で移動するエネルギーを供与することができ、ドナー抗体の定常領域と結合できるかまたは結合しており、アクセプター抗体と結合することができず、
ドナー抗体は、抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合できる可変領域と、前記ドナーマイクロスフェアに結合できる定常領域とを有し、ドナー抗体はアクセプターマイクロスフェアに結合することができない、前記ステップと、
ステップ２：ステップ１の前記量の前記ドナーマイクロスフェア、前記量の前記アクセプターマイクロスフェア、前記量の前記ドナー抗体及び前記量の前記アクセプター抗体と試料を接触させ、試料中の抗原と、ドナーマイクロスフェアに結合したドナー抗体及びアクセプターマイクロスフェアに結合したアクセプター抗体ならびに抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合したアクセプター抗体及び抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合したドナー抗体と、の複合体の形成を可能にするステップと、
ステップ３：抗原試料の効力を示すシグナルを生成するための近接反応を行わせるステップと、
ステップ４：抗原試料の効力を示すシグナルを検出するステップと、を含む、前記方法に関する。
【0162】
本発明は更に、上記のような方法に従ってシグナルを検出することにより、抗原試料の効力を示す抗原試料中の抗原の量を決定するための方法に関し、前記方法は更に、
ステップ５：検出されたシグナルに基づき抗原試料の効力を示す抗原試料中の抗原の量を決定するステップを含む。
ステップ５：検出されたシグナルに基づき抗原試料の効力を示す抗原試料中の抗原の量を決定するステップを含む。
【0163】
本発明は更に、上記のような方法に従って抗原の量を検出することにより、ワクチン抗原試料などの抗原試料の効力を決定するための方法に関し、前記方法は更に、
ステップ６：ステップ５で決定された試料中の抗原の量に基づき抗原試料の効力を決定するステップを含む。
ステップ６：ステップ５で決定された試料中の抗原の量に基づき抗原試料の効力を決定するステップを含む。
【0164】
前記キットに関しては、「アクセプター抗体、ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのキット」及び「ジカ結合アクセプター抗体、ジカ結合ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのキット」という名称の前の章を参照されたい。
【0165】
一実施形態によれば、抗原試料はワクチン抗原試料である。
【0166】
一実施形態によれば、ワクチン抗原試料中のワクチン抗原は、ウイルス抗原である。
【0167】
一実施形態によれば、抗原試料はウイルス抗原試料である。
【0168】
ウイルス抗原に関しては、「アクセプター抗体、ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのキット」及び「ジカ結合アクセプター抗体、ジカ結合ドナー抗体、アクセプターマイクロスフェア及びドナーマイクロスフェアのキット」という名称の前の章を参照されたい。
【0169】
一実施形態において、ステップ１の前記量の前記ドナーマイクロスフェア、前記量の前記アクセプターマイクロスフェア、前記量の前記ドナー抗体及び前記量の前記アクセプター抗体と試料を接触させ、ステップ２の試料中の抗原と、ドナーマイクロスフェアに結合したドナー抗体及びアクセプターマイクロスフェアに結合したアクセプター抗体ならびに抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合したアクセプター抗体及び抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合したドナー抗体と、の複合体を形成させることは、約１４～２８時間実施される。
【0170】
ステップ１の前記量の前記ドナーマイクロスフェア、前記量の前記アクセプターマイクロスフェア、前記量の前記ドナー抗体及び前記量の前記アクセプター抗体と試料を接触させ、ステップ２の試料中の抗原と、ドナーマイクロスフェアに結合したドナー抗体及びアクセプターマイクロスフェアに結合したアクセプター抗体ならびに抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの１つに結合したアクセプター抗体及び抗原の少なくとも２つのエピトープのうちの残りの１つに結合したドナー抗体と、の複合体を形成させる順番は異なり得る。
【0171】
一実施形態において、第１のステップで前記量のドナーＡｂ及び前記量のアクセプターＡｂと試料を特定の接触時間の間、接触させ、その後、第２のステップで前記量のドナーマイクロスフェア及び前記量のアクセプターマイクロスフェアと前記量のドナーＡｂ、前記量のアクセプターＡｂ及び試料を特定の接触時間の間、接触させる。
【0172】
別の実施形態において、アクセプターマイクロスフェアはアクセプターＡｂの定常領域に結合し、ドナーマイクロスフェアはドナーＡｂの定常領域に結合し、アクセプターＡｂの定常領域に結合した前記量のアクセプターマイクロスフェアとドナーＡｂの定常領域に結合した前記量のドナーマイクロスフェアは、特定の接触時間の間、試料に同時接触させる。
【0173】
別の実施形態において、第１のステップで、ドナーＡｂはビオチン化され、ドナーマイクロスフェアはストレプトアビジンでコーティングされ、アクセプターマイクロスフェアはアクセプターＡｂの定常領域に結合され、前記量のドナーＡｂとアクセプターＡｂの定常領域に結合した前記量のアクセプターマイクロスフェアとを特定の接触時間の間、試料と接触させ、続いて第２のステップで、試料、前記量のドナーＡｂ及びアクセプターＡｂに結合した前記量のアクセプターマイクロスフェアと前記量のドナーマイクロスフェアとを第２の接触時間の間、接触させる。第１のステップの接触は約１６～約２４時間行われ得、第２のステップの接触は約２時間行われ得る。
【0174】
ステップ２で形成させた複合体により、ドナーマイクロスフェア及びアクセプターマイクロスフェアは近接反応が起こり得るのに十分な近さまで接近している。その結果、複合体が形成されない場合は、ドナーマイクロスフェア及びアクセプターマイクロスフェアは近接反応で反応しない。したがって、ステップ３の近接反応で生成されるシグナルは、形成された複合体の量に比例し、したがって、抗原試料中の抗原量に比例する。
【0175】
本発明の一実施形態において、ステップ３の近接反応で生成されるシグナルは、アクセプターマイクロスフェア内の最終的なフルオロフォアによって作製される。この文脈で、最終的なフルオロフォアは、ユーロピウムキレートまたはルブレンであり得る。シグナルは、約５２０～約６８０ｎｍ、特に約６１５ｎｍの範囲の波長を有する光の発光である。前記シグナルは、任意の適切な検出機器によって検出することができる。
【0176】
一実施形態において、検出装置は、約６８０ｎｍで励起し、約５２０～約６３０ｎｍ、特に約６１５ｎｍでの発光を読み出すことが可能である。励起源としては、レーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることができる。好適な検出装置としては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）、ＥｎＳｐｉｒｅ（商標）、ＥｎＳｉｇｈｔ（商標）またはＶＩＣＴＯＲ（登録商標）Ｎｉｖｏ（商標）マルチラベルプレートリーダーが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0177】
ステップ３の近接反応で生成されるシグナルは、形成された複合体の量に比例し、したがって、抗原試料中の抗原量に比例する。したがって、ステップ５の抗原試料中の抗原量を決定することは、抗原試料の効力を示すシグナルを標準曲線と比較することにより行うことができる。標準曲線は、Ｓ字形用量反応曲線である得るか、または試料内の分析されるべき抗原の種類の異なる量を対応するシグナルに対してプロットした線状曲線であり得る。抗原の量は、例えば濃度または力価として表すことができる。
【0178】
抗原の効力、すなわち対象の免疫応答を誘導する抗原の能力は、抗原試料中の抗原量に依存するので、抗原の量は抗原試料の効力を示し、したがって、抗原の量を示すシグナルは抗原試料の効力も示す。
【0179】
本発明は更に、上記のような方法に従って抗原試料の効力を決定するためのそのような方法であって、ステップ６は、
ステップ６．１：ヒトまたは非ヒト対象に生成される関連する平均中和抗体力価を測定することにより、前記ヒトまたは前記非ヒト対象の抗原の標準化試料の効力を決定するステップと、
ステップ６．２：前記標準化試料中の少なくとも２つのエピトープを有する抗原の量を上記のような方法に従って決定するステップと、
ステップ６．３：ステップ６．１の平均中和抗体力価とステップ６．２の抗原の量から標準曲線を確立するステップと、
ステップ６．４：ステップ５で決定された抗原試料中の抗原の量と標準曲線を比較することにより抗原試料の効力を決定するステップと、を含む、前記方法に関する。
ステップ６．１：ヒトまたは非ヒト対象に生成される関連する平均中和抗体力価を測定することにより、前記ヒトまたは前記非ヒト対象の抗原の標準化試料の効力を決定するステップと、
ステップ６．２：前記標準化試料中の少なくとも２つのエピトープを有する抗原の量を上記のような方法に従って決定するステップと、
ステップ６．３：ステップ６．１の平均中和抗体力価とステップ６．２の抗原の量から標準曲線を確立するステップと、
ステップ６．４：ステップ５で決定された抗原試料中の抗原の量と標準曲線を比較することにより抗原試料の効力を決定するステップと、を含む、前記方法に関する。
【0180】
一実施形態によれば、標準化抗原試料は、強制分解試験または抗原の異なる用量によって提供される。
【0181】
一実施形態によれば、ステップ６．１の非ヒト対象は、マウス、ラット、ネコ、ウサギ、霊長類及び非ヒト霊長類を含む。
【0182】
一実施形態によれば、工程６．１の対象はマウスである。
【0183】
平均中和Ａｂ力価は、ＭＮＴ、ＰＲＮＴ、ＲＶＰアッセイまたはＦＦＡを含む当技術分野で周知の方法によって決定することができる。本発明の一実施形態によれば、平均中和Ａｂ力価は、ＲＶＰアッセイによって決定される。
【0184】
一実施形態によれば、標準曲線は、平均中和Ａｂ力価として表される標準化抗原試料の効力を、標準化試料中の抗原の決定量に対してプロットすることにより作製される。
【0185】
本発明は更に、抗原試料がジカ抗原試料である、上記のような方法に関する。ジカ抗原は、不活性化ウイルスであり得る。本発明の特定の実施形態において、ＺＩＫＶ抗原試料の効力を監視するための方法は、ジカ抗原効力アッセイ（Ｚｉｋａ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙ）（ＺＡＰＡ）と称される。
【0186】
製造工程中のワクチン抗原の効力を監視するための方法
本発明は更に、上記のような方法に従ってワクチン抗原の効力を測定することにより、前記ワクチン抗原の精製、不活性化及び製剤化を含む製造工程中のワクチン抗原の効力を監視して最終ワクチンを形成する方法に関する。
本発明は更に、上記のような方法に従ってワクチン抗原の効力を測定することにより、前記ワクチン抗原の精製、不活性化及び製剤化を含む製造工程中のワクチン抗原の効力を監視して最終ワクチンを形成する方法に関する。
【0187】
一実施形態において、ワクチン抗原はＺＩＫＶ抗原であり、ＺＩＫＶ抗原の効力は、上記のようなＺＡＰＡ法に従ってＺＩＫＶ抗原の効力を測定することによって、最終的なＺＩＫＶワクチンを形成するための前記ＺＩＫＶ抗原の精製、不活性化及び製剤化を含む製造工程中に監視される。
【0188】
精製は、濾過及び／またはクロマトグラフィーによって行うことができる。
【0189】
ウイルスワクチンの製造方法
本発明は、ウイルスワクチンの製造方法であって、
ステップＡ：様々なバッチのワクチン抗原を調製するステップと、
ステップＢ：上記のような方法に従ってステップＡで作成した様々なワクチン抗原バッチのワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチン抗原バッチを選択するステップと、
ステップＣ：ステップＢで選択したワクチン抗原バッチを様々なバッチのウイルスワクチンに配合することによりワクチンバッチを調製するステップと、
ステップＤ：上記のような方法に従ってステップＣで作成した様々なバッチのワクチンバッチのワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチンバッチを選択するステップと、を含む、前記方法に関する。
本発明は、ウイルスワクチンの製造方法であって、
ステップＡ：様々なバッチのワクチン抗原を調製するステップと、
ステップＢ：上記のような方法に従ってステップＡで作成した様々なワクチン抗原バッチのワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチン抗原バッチを選択するステップと、
ステップＣ：ステップＢで選択したワクチン抗原バッチを様々なバッチのウイルスワクチンに配合することによりワクチンバッチを調製するステップと、
ステップＤ：上記のような方法に従ってステップＣで作成した様々なバッチのワクチンバッチのワクチン抗原の効力を決定し、所定の効力要件に適合するワクチンバッチを選択するステップと、を含む、前記方法に関する。
【0190】
ワクチン抗原の効力を決定するための方法に関しては、「抗原試料の効力を決定するための方法」及び「製造工程中のワクチン抗原の効力の監視」という名称の前の章を参照されたい。
【0191】
本発明の一実施形態において、ステップＡは様々なサブステップを含み、ステップＢは各サブステップ後に実施される。
【0192】
本発明の特定の実施形態において、サブステップは、精製（例えばクロマトグラフィーまたは濾過による）及び不活性化（例えばホルムアルデヒドまたは紫外線照射またはガンマ線照射またはβ－プロピオラクトンによる）を含む。
【0193】
具体的な実施形態において、サブステップは、生ウイルスを不活性化ウイルスに不活性化することを含む。
【0194】
本発明の具体的な実施形態において、生ウイルスはジカウイルスであり、不活性化は、ホルムアルデヒドまたは紫外線照射またはガンマ線照射またはβ－プロピオラクトンにより達成される。
【0195】
本発明は更に、ワクチン抗原がジカ抗原である、上記のような方法に関する。
【0196】
ウイルスワクチンを生成するための方法によって得られるワクチン
本発明は更に、上記の方法によって得られるワクチンに関する。
本発明は更に、上記の方法によって得られるワクチンに関する。
【0197】
本発明は更に、上記の方法によって得られるジカ抗原に関する。
【0198】
代替的なドナー構造及びアクセプター構造
近接反応が可能なアクセプターとドナーの好適な構造の１つとして、マイクロスフェアを説明してきた。しかしながら、本発明は、代替的なドナー構造及びアクセプター構造が適用される他の実施形態も包含する。
近接反応が可能なアクセプターとドナーの好適な構造の１つとして、マイクロスフェアを説明してきた。しかしながら、本発明は、代替的なドナー構造及びアクセプター構造が適用される他の実施形態も包含する。
【0199】
代替的なアクセプター構造及びドナー構造の一例は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により反応することができるペアである。例えば、１つの具体的な実施形態において、２つの感光性分子（発色団）のペアは、ドナー及びアクセプターとして近接反応において反応する。ドナー発色団は励起され、非放射性双極子－双極子カップリングによって、励起からのエネルギーをアクセプター発色団に移動させることができる。励起されたアクセプター発色団は、検出可能なシグナルを生成することができる（例えば、光の発光によって）。エネルギー移動の効率は、ドナーとアクセプター間の距離の６乗に反比例する。例えば、発色団の一般的なＦＲＥＴペアの１つはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）及び黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であり、その両方は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の色変異である。
【0200】
また、代替的なアクセプター構造及びドナー構造の別の例として、生物発光共鳴エネルギー移動（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＢＲＥＴ）での反応が可能なペアがある。この技術は、ドナーとして生物発光酵素（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼ）を用い、アクセプターとしてＹＦＰなどのフルオロフォアに適合する初期光子放出を生成する。ＢＲＥＴは、エネルギー移動を開始するために外部照明を必要とせず、バックグラウンドノイズの可能性を低減する。
【0201】
これらの実施形態において、ドナー抗体はドナー構造（ドナー発色団または生物発光酵素など）に共有結合し得、アクセプター抗体はアクセプター構造（アクセプター発色団など）に共有結合し得、両方の構造が互いに十分に接近している場合に、ドナー構造は、エネルギー（ドナー発色団の場合の励起エネルギーなど）をアクセプター構造へ移動させることができる。
【0202】
したがって、本発明は更に、マイクロスフェアが代替的なドナー構造及びアクセプター構造によって交換される、上記のようなキット及び方法に関する。
【実施例】
【0203】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の特定の態様及び実施形態を示すために含まれる。しかしながら、以下の説明は例示にすぎず、本発明を制限するものとして何ら考慮されるべきではないことは、当業者には理解されるべきである。
【0204】
実施例１：ドナーＡｂのビオチン化及びアクセプターＡｂのアクセプターマイクロスフェアへのカップリング
ジカ抗原効力アッセイ（ＺＡＰＡ）セットアップに適用したｍＡｂを表１及び表３に示す。
ジカ抗原効力アッセイ（ＺＡＰＡ）セットアップに適用したｍＡｂを表１及び表３に示す。
【0205】
【表3】
【0206】
抗ＺＩＫＶ＃１及び２ ｍＡｂは、同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５２１８９号（Ｔａｋｅｄａ Ｉｇ出願）に記載されているように作製され、特徴付けられた。簡単に説明すると、ウサギを、精製不活性化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）及びＺＩＫＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）で免疫化した。その後、ハイブリドーマ細胞を作製するために脾臓を分離した。ハイブリドーマ上清は、ＺＩＫＶ ＶＬＰ及びＥタンパク質に対する反応性、ならびに不活性化ＤＥＮＶ１～４に対する交差反応性について酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により試験した。したがって、ハイブリドーマ上清は、不活性化ＤＥＮＶ１（Ｗｅｓｔ Ｐａｃｉｆｉｃ７４、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）、ＤＥＮＶ２（１６６８１、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）、ＤＥＮＶ３（ＣＨ５３４８９、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）、ＤＥＮＶ４（ＴＶＰ－３６０、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質（Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）及びＺＩＫＶ ＶＬＰ（Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）に対してスクリーニングされた。製造工程の一部として製造元により、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ３及びＤＥＮＶ４はガンマ線照射で、ＤＥＮＶ２はホルマリンで不活性化した。ＺＩＫＶ Ｅタンパク質及びＺＩＫＶ ＶＬＰの両方を、陽性対照抗原として使用した。簡単に言えば、抗原は、使用前に４℃で一晩、炭酸コーティング緩衝液（ｐＨ９．４）中で１μｇ／ｍＬでＮｕｎｃ Ｐｏｌｙｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされた。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）でプレートを洗浄した。非特異的結合を低減させるため、室温で最低１時間５％脱脂乾燥ミルクブロッキング溶液をプレートに加えた。プレートを洗浄し、ハイブリドーマ上清をプレートに加えた。次いでプレートを、３７℃で１～２時間インキュベートした。プレートを再度ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号Ｌ２４１６－Ｘ３２６Ｆ）を５％のミルクブロッキング溶液で１：５０００に希釈し、プレートに添加した。プレートを３７℃で１．５時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで再度洗浄した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質を加え、室温で１０分間インキュベートした。反応は１Ｎ ＨＣｌで停止し、プレートはＥｎＳｐｉｒｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍ及び６３０ｎｍで吸光度をスキャンした。陽性結合のカットオフは、０．５光学密度の読み出しで設定された。抗ＺＩＫＶ＃１及び２は両方とも、ＤＥＮＶ１～４のいずれにも結合を示さず、両方のＡｂがＺＩＫＶ選択的であることが確認された（表４）。更に、ハイブリドーマ上清は、マイクロ中和試験（ＭＮＴ）及びレポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）アッセイで中和活性についてスクリーニングした。抗ＺＩＫＶ＃１は強い中和活性を示したが、抗ＺＩＫＶ＃２は弱い中和活性を示した。ハイブリドーマ上清のＺＩＫＶ ＶＬＰに対する親和性は、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）アッセイによって決定された。更に、エピトープビニングは、競合ＢＬＩアッセイを用いて一次ｍＡｂをＶＬＰに結合させ、その後、二次ｍＡｂを交差結合させて試験した。ビニング実験により、抗ＺＩＫＶ＃１及び２は、抗原内の異なる領域に結合することが示された。更に、ｍＡｂは配列決定された（表１で比較）。最後に、ｍＡｂの結合に重要な抗原内のアミノ酸残基を、アラニンスキャニング変異ライブラリーを用いて評価した。重要残基とは、その側鎖がＡｂ－エピトープ相互作用に最も大きくエネルギー的に寄与し、その変異が最も低い結合反応性を付与するアミノ酸である（野生型の１０％未満、Ｂｏｇａｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２８０，１－９；Ｌｏ Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２８５，２１７７－２１９８）。両方のｍＡｂは、ＺＩＫＶ ＥＤＩＩＩに結合することが示された（表２で比較）。抗ＺＩＫＶ＃１及び２は、ｐＨ７．４、最終濃度１．３～１．４ｍｇ／ｍＬの範囲のＰＢＳ中で保存した。
【0207】
【表4】
【0208】
マウスの免疫化のために、ＤＥＮＶ－２全ウイルスを使用して、抗ＺＩＫＶ＃３を前述したように独自に作製した（Ｇｅｎｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ １９８２，３１（３）：５４８－５５５）。ｍＡｂはＥＤＩＩの融合ループに結合し、ＺＩＫＶなど他のフラビウイルスと交差反応性を示す（Ａｕｂｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０１６，５６：３３－４０）。免疫化のために、ＤＥＮＶ－２全タンパク質を使用して、抗ＺＩＫＶ＃４を前述したように独自に作製した。ｍＡｂはＥタンパク質二量体エピトープに結合し、ＺＩＫＶと交差反応性を示す（Ｂａｒｂａ－Ｓｐａｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１６；５３６：４８－５３）。
【0209】
抗ＺＩＫＶ＃３及び＃４は、Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃから市販されている。抗ＺＩＫＶ＃３は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎから追加で入手可能である（精製したタンパク質Ａ、１ｍｇ／ｍＬの０．０２％Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００を加えてＰＢＳ中にてｐＨ７．４で供給、カタログ番号Ａｂ００２３０．２．０）。Ｗｕｘｉは、両方のＡｂをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。トランスフェクトした細胞の上清を、タンパク質Ｇ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてアフィニティ精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した。抗ＺＩＫＶ＃３の重鎖（Ｈ）配列（配列番号３０及び４０）は、受入コードＡＨＸ４２４２４．１（アミノ酸配列）及びＫＪ４３８７８５．１（コーディング配列及びアミノ酸配列）下でＧｅｎＢａｎｋに寄託され、抗ＺＩＫＶ＃３の軽鎖（Ｌ）配列（配列番号３５及び４１）は、受入コードＡＨＸ４２４２３．１（アミノ酸配列）及びＫＪ４３８７８４．１（コーディング配列及びアミノ酸配列）下でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。抗ＺＩＫＶ＃４は、ＤＥＮＶ２ Ｅタンパク質（ＰＤＢ：４ＵＴ９、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１５，５２０（７５４５）：１０９－１１３）及びＺＩＫＶ（ＰＤＢ：５Ｈ３７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ２０１６，７，１３６７９）と複合化され結晶化されている。
【0210】
アクセプターＡｂとして機能するｍＡｂは、以下に記載するようにアクセプターマイクロスフェアに結合させた。コンジュゲーションのために、２５ｍｇのアクセプターマイクロスフェア（０．２５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬストック非コンジュゲーションＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アクセプターマイクロスフェア、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６７７２００１－３）を、０．５ｍｇのアクセプターＡｂと混合し、カップリング比を１：５０（ｍｇタンパク質：ｍｇマイクロスフェア）とした。次に、１６０倍に希釈した１０％Ｔｗｅｅｎ－２０の対応する体積、２０倍に希釈した２５ｍｇ／ｍＬのＮａＢＨ３ＣＮ溶液（水中で新たに調製、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１５２１５９）の対応する体積、及び０．１３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．０の対応する体積を加え、最終反応体積１ｍＬを得た。例えば、１００ｍｇ／ｍＬのマイクロスフェアストック０．２５ｍＬに、１．３４ｍｇ／ｍＬに濃縮したｍＡｂ０．３７４ｍＬを添加した。その後、０．１３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．０を０．４４５ｍＬ加え、続いて、１０％Ｔｗｅｅｎ－２０を６μＬ及び２５ｍｇ／ｍＬのＮａＢＨ３ＣＮ溶液を５０μＬ添加した。混合物を、穏やかな撹拌（６～１０ｒｐｍ）下で３７℃にて１８～１９時間インキュベートした。ブロッキングのために、０．８Ｍ ＮａＯＨ中で新たに調製したカルボキシメトキシルアミン（ＣＭＯ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ１３４０８）６５ｍｇ／ｍＬ溶液５０μＬを反応物に加え、最終濃度３．２５ｍｇ／ｍＬ ＣＭＯを得て、３７℃で１時間インキュベーションした。精製のために、管を１６，０００×ｇ、４℃で４０分間遠心分離し、上清を除去し、マイクロスフェアペレットを５ｍＬの０．１Ｍ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０に再懸濁させた。１６，０００×ｇ及び４℃にて４０分間遠心分離した後、上清を除去した。洗浄ステップは１回繰り返した。１６，０００×ｇ及び４℃にて４０分間遠心分離した後、上清を除去し、マイクロスフェアを保存用緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００を有する）に５ｍｇ／ｍＬまで再懸濁させた。コンジュゲートアクセプターマイクロスフェアは、更に使用するまで４℃で保存した。
【0211】
ドナーＡｂとして機能するｍＡｂは、以下に記載するようにビオチン化した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチン（ＮＨＳ－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチン３５４Ｓ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のストック濃度１０ｍｇ／ｍＬ、ＳｏｌｕＬｉｎｋ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ１００１－１０５、ロット番号ＷＯＴＬ２６１２７）をＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ ｐＨ７．４で新たに調製した。ＮＨＳ－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチン３５４Ｓは、ビオチンにトリエチレングリコール（ＰＥＧ３）リンカーにより結合させた３５４ｎｍで最大吸光度を持つ発色団（アリールヒドラジン）を含有する。スクシンイミジルエステル官能基により、水性緩衝液中のリジンの修飾が可能である。希釈したＮＨＳ－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチンをドナーＡｂと混合し、Ａｂに対してビオチンが３０倍モル過剰となるようにし、Ａｂの反応濃度は０．５ｍｇ／ｍＬに保たれた。ＮＨＳ－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチンを添加する前に、反応体積をＰＢＳ、ｐＨ７．４で調整した。例えば、１．２６ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ９３７μＬを、１３３３．３μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合した。次に、２ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチンを８９．７μＬ添加し、総体積２３６０μＬとし、反応物中に１．１８ｍｇのｍＡｂ（７．３７５ナノモル）及び０．１７９ｍｇのＮＨＳ－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチン（２２１．２５０ナノモル）を得た。インキュベーションを２１～２３℃で２時間行った。その後、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した脱塩カラム（Ｚｅｂａ脱塩カラム、５ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カタログ番号８９８８２）を用いて、遊離ビオチンを除去した。このステップを第２の脱塩カラムで１回繰り返した。特性評価のために、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０ｎｍ、タンパク質量を指す）及び３５４ｎｍの吸光度（Ａ３５４ｎｍ、ビオチン量を指す）を測定し、２８０ｎｍの値は、０．２３×Ａ３５４ｎｍとして求めた２８０ｎｍのラベルの吸光度に対して補正している。２８０ｎｍの消光係数（２１４，４００Ｍ－１）及びｍＡｂの分子量（１６０，０００ｇ／モル）により、タンパク質濃度をＡ２８０ｎｍ値から決定した。同様に、２９，０００Ｍ－１の３５４ｎｍのビオチンの消光係数及び８１０．９２ｇ／モルの分子量を使用して、Ａ３５４ｎｍ値からビオチンの濃度を決定した。次いで、ビオチン濃度をＡｂ濃度で割ることで、Ａｂあたりのビオチン比率を決定した。０．５μＭ（８０μｇ／ｍＬ）の最終ビオチン化Ａｂ濃度は、安定化緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０５％アジ化ナトリウム）で希釈することにより調整した。ビオチン化ｍＡｂは、更に使用するまで４℃で保存した。
【0212】
実施例２：ＺＡＰＡのためのｍＡｂペアの評価
次に、異なる組み合わせのｍＡｂを、ＺＡＰＡにおける性能について評価した（表５、ｍＡｂペア＃１～＃３）。ドナーＡｂはビオチン化され、アクセプターＡｂは実施例１に従ってアクセプターマイクロスフェアに結合させた。
次に、異なる組み合わせのｍＡｂを、ＺＡＰＡにおける性能について評価した（表５、ｍＡｂペア＃１～＃３）。ドナーＡｂはビオチン化され、アクセプターＡｂは実施例１に従ってアクセプターマイクロスフェアに結合させた。
【0213】
【表5】
【0214】
ｍＡｂペアの試験のために、精製不活性化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）及びＺＩＫＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９をＺＡＰＡで評価した。ＰＩＺＶは、ブラッドフォードアッセイで決定した１０μｇ／ｍＬの原薬（ＤＳ、精製、液体、ホルマリン不活性化ＺＩＫＶ）のストック濃度で提供された。ＰＩＺＶは、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３、ミョウバン、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、ロット番号５４１４）上でＤＳの吸光度により調製した。
【0215】
ＺＩＫＶ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）は、ベロ細胞にウイルスを接種した後の細胞変性作用（ＣＰＥ）の観察を含むエンドポイント希釈アッセイによって決定された。したがって、ベロ細胞は，１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１２００７Ｃ）、２％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン（２００ｍＭストックから、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００３４．０１）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０倍ストックから、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＶ３００１０）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号１５－０１７－ＣＶ）で３６±２℃、５％ＣＯ２にて培養した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５９６）に１００μＬの培地に１ウェルあたり１．４ｘ１０４細胞で播種し、２日間静置して増殖させ、ウイルス添加時の集密度が９０％超になるようにした。次いで、細胞から上清をデカントし、対応するウイルス希釈液を１ウェルあたり１００μＬを添加することにより、細胞を、ＺＩＫＶの連続希釈液（希釈培地で調製、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン、及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ）で５日間±４時間、培養した。連続希釈は二重に試験した。２つの同等の希釈系列のそれぞれを、４つ一組で播種した。ＺＩＫＶを欠く１００μＬの希釈培地を添加することにより、陰性対照を設けた。インキュベーション時間の後、細胞が死滅した重感染ウェルでの色の変化を考慮して、プレートを室温で１５分間インキュベートした後、５６０ｎｍと４２０ｎｍの吸光度を記録した。４２０ｎｍの吸光度を５６０ｎｍの吸光度から差し引いた。値＞０はＣＰＥ陰性、値＜０はＣＰＥ陽性として考慮された。希釈及び複製のＣＰＥ結果から、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法に従って、１ｍＬあたりの平均ＴＣＩＤ５０力価を計算した。結果は、光学顕微鏡でプレートを目視でスコア化して確認し、必要に応じて補正した。
【0216】
ＰＩＺＶ及びＺＩＫＶをアッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％カゼイン、１ｍｇ／ｍＬデキストラン－５００及び０．５％Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製の１０倍ストックから調製、カタログ番号ＡＬ０００Ｆ）中で連続希釈し、各希釈において最終アッセイ濃度または力価のそれぞれ５倍量になるようにした（最終濃度または力価については、図１及び図２を参照のこと）。白色９６ウェルプレート（１／２面積プレート－９６、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００２２９９）に、１ウェルごとに希釈液あたり１０μＬを添加した。更に、バックグラウンドシグナルを考慮し、１ウェルあたり１０μＬのアッセイ緩衝液を加えることにより、空のウェルを設けた。各希釈液及び空の対照は、二重に評価した。
【0217】
ビオチン化抗ＺＩＫＶ ｍＡｂは、８０μｇ／ｍＬのビオチン化ｍＡｂの最終濃度となるように、実施例１に記載されたように調製した。第１のステップでは、ストックを５～２０秒間ボルテックスし、アッセイ緩衝液で１：６００に希釈した（例えば、ビオチン化抗ＺＩＫＶ ｍＡｂ５μＬをアッセイ緩衝液２９８５μＬへ）。希釈液を再び５～２０秒間ボルテックスした。抗ＺＩＫＶ＃２を、実施例１で記載されたようにアクセプターマイクロスフェアにコンジュゲートした。第２のステップでは、コンジュゲートアクセプターマイクロスフェアの５ｍｇ／ｍＬストックをボルテックスし（５～２０秒）、ビオチン化抗ＺＩＫＶ ｍＡｂを希釈したのと同じ管内のアッセイ緩衝液で１：３００に希釈した（例えば、コンジュゲートアクセプターマイクロスフェア１０μＬを前のステップの希釈ビオチン化ｍＡｂ２９９０μＬに添加した）。希釈液を再び５～２０秒間ボルテックスした。ビオチン化抗ＺＩＫＶ ｍＡｂ及びコンジュゲートアクセプターマイクロスフェアの希釈液を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり３０μＬずつ添加した。プレートの側面を軽く叩いて、内容物をウェルの底に集めた。プレートをホイルシーラー（粘着性ＰＣＲ密封化ホイルシート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、カタログ番号Ａｂ－０６２６）で密閉して光を遮断し、３７℃で１６～２４時間インキュベートした。
【0218】
ストック濃度５ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンコーティングドナーマイクロスフェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号６７６０００２）をボルテックスし（５～２０秒）、アッセイ緩衝液で１：１００に希釈した。１ウェルあたり１０μＬの希釈液を添加した。プレートの側面を軽く叩いて、内容物をウェルの底に集めた。プレートをホイルシーラーで密閉して光を遮断し、３７℃で２時間±１０分間インキュベートした。
【0219】
プレートをインキュベーターから取り出し、１０分以内に読み取った。そのため、読み取り直前にホイルシーラーをプレートから剥がし、光曝露を最小限に抑えた。プレートはＥｎＳｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で「９６ウェルＡｌｐｈａＬＩＳＡプロトコル」により分析した。ＰＩＺＶ及びＺＩＫＶ希釈液からの相対蛍光単位（ＲＦＵ）でのＺＡＰＡシグナル数を、空のウェルから得られる中程度のバックグラウンドシグナルに対して正規化し、対応するＰＩＺＶ濃度及びＺＩＫＶ力価それぞれに対してプロットした。データは、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）回帰モデルを用いて、各ｍＡｂペアについて独立して適合された（図１及び図２）。
【0220】
ｍＡｂペア＃１及び２は、ＺＩＫＶ及びＰＩＺＶの両試料で高いシグナルとなった。一方、ｍＡｂペア＃３を使用して、高ＰＩＺＶ濃度で弱いシグナルしか観察されず、最高ＺＩＫＶ力価でもほとんどシグナルが観察されなかった。データから、ｍＡｂペア＃１及び２を用いたＺＡＰＡセットアップでは、濃度依存的にＰＩＺＶ及びＺＩＫＶを効率的に決定でき、良好なシグナル対ノイズ比が得られることが示される。
【0221】
要約すると、ｍＡｂペア＃１及び２は、ｍＡｂペア＃３と比較して高いシグナルになった。ＺＡＰＡ分析は、ＺＩＫＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９及びＰＩＺＶの両方の分析に適していることが示された。結論として、ＺＡＰＡ ｍＡｂペア＃１及び２は、生ウイルスからの及びＰＩＺＶからのエピトープの有効性を効率的に測定することが可能である。
【0222】
実施例３：ＺＡＰＡによる安定性表示の評価
次のステップで、ＺＡＰＡを用いて、異なる量の熱不活性化ＤＳ及びＤＳをミョウバンに吸着させることにより熱不活性化ＤＳ試料を配合したＰＩＺＶ試料を含む試料の分析を行った。この強制分解試験の目的は、ＺＡＰＡが、ＰＩＺＶ試料中に単独で存在するかまたはミョウバンに吸着したインタクトＤＳの量を確実に示すことができ、したがって抗原の安定性、すなわちインタクトエピトープの読み出しになるかを評価することであった。
次のステップで、ＺＡＰＡを用いて、異なる量の熱不活性化ＤＳ及びＤＳをミョウバンに吸着させることにより熱不活性化ＤＳ試料を配合したＰＩＺＶ試料を含む試料の分析を行った。この強制分解試験の目的は、ＺＡＰＡが、ＰＩＺＶ試料中に単独で存在するかまたはミョウバンに吸着したインタクトＤＳの量を確実に示すことができ、したがって抗原の安定性、すなわちインタクトエピトープの読み出しになるかを評価することであった。
【0223】
したがって、ＤＳの一部を８５℃で１時間熱処理し、材料の分解を行った。ＤＳ試料を、未処理ＤＳ及び熱処理ＤＳを混合することにより調製し、試料中の熱処理ＤＳの総量が０、２５、５０、７５及び１００％となった。ＰＩＺＶ試料の調製の前に、標準としてＺＩＫＶ組換えＥタンパク質（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、ロット番号１Ｊ２９３１７）を使用して、ＤＳ試料をブラッドフォードアッセイで分析した。注目すべきは、検出された総タンパク質量が熱処理の後でも安定していたことである（表６）。
【0224】
【表6】
【0225】
次に、ＤＳ試料を、体積１００μＬあたり１μｇのＤＳ量（１０μｇ／ｍＬ）となるように希釈した。ＰＩＺＶ試料の調製のために、ＤＳ試料１μｇあたり４０μｇのミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、ロット番号５４１４）を加え、試料を室温で２時間撹拌した。ＤＳ及びＰＩＺＶ試料を、分析まで５±３℃で保存した。
【0226】
ＤＳ及びＰＩＺＶ試料を、ｍＡｂペア＃１を使用してＺＡＰＡで分析した（表５参照）。ＤＳ及びＰＩＺＶ試料に加え、ＰＩＺＶ参照（ストック濃度：２０μｇ／ｍＬ）が設けられた。参照を、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％カゼイン、１ｍｇ／ｍＬデキストラン－５００及び０．５％Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製の１０倍ストックから調製、カタログ番号ＡＬ０００Ｆ）で実施例２で記載したように連続希釈した。
【0227】
白色９６ウェルプレート（１／２面積プレート－９６、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００２２９９）に１ウェルあたり、参照希釈液またはＤＳもしくはＰＩＺＶ試料につき１０μＬを添加した。更に、バックグラウンドシグナルを考慮し、１ウェルあたり１０μＬのアッセイ緩衝液を加えることにより、空のウェルを設けた。各参照希釈液ならびに試料及び空の対照は、二重に評価した。ＺＡＰＡは更に、実施例２での記載のように行った。
【0228】
参照希釈液ならびにＤＳ及びＰＩＺＶ試料からの相対蛍光単位（ＲＦＵ）でのＺＡＰＡシグナル数は、空のウェルから生じる中程度のバックグラウンドシグナルに対して正規化した。参照物質のデータは、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）回帰モデルにより独立して適合された。ＰＩＺＶ参照希釈液中の特定の量のインタクトＤＳに対応するＺＡＰＡシグナル数を、ＤＳ及びＰＩＺＶ試料からのＺＡＰＡシグナルに補間し、それによって得られたＺＡＰＡ値を、対応するＤＳ及びＰＩＺＶ試料のｍＬあたりの抗原単位（ＡＵ／ｍＬ）として報告した（図３及び図４）。
【0229】
熱処理したＤＳのみを含有するＤＳ及びＰＩＺＶ試料は、他の試料と比較してＺＡＰＡ値が最低になり、未処理のＤＳを１００％含有するＤＳ及びＰＩＺＶ試料は、ＺＡＰＡ値が最高になった。すべての試験したＤＳ及びＰＩＺＶ試料の値は、Ｒ２値０．９８６（ＤＳ試料、線形回帰：ｙ＝４３９．４４ｘ＋１５５７．２）及び０．９５４（ＰＩＺＶ試料、線形回帰：ｙ＝１２２．１４ｘ＋７１８．５３）の線形応答に適合した。このことから、本方法は、ミョウバンなどの追加の成分の存在に依存せずに、熱分解後のＤＳ及びＰＩＺＶ試料内の抗原利用可能性の変化を正確かつ選択的に検出することが示された。
【0230】
データから、ＺＡＰＡで使用されているｍＡｂの結合に関与するエピトープの一方または両方が、熱処理によって破壊されていることがわかり得る。データは、ＺＡＰＡは、熱不活性化した際に試料内のインタクトエピトープの存在を効率的に検出することを示している。結論として、本アッセイは試料の安定性の変化に対して感受性である。
【0231】
まとめると、熱分解に依存しないタンパク質の総量を提供するブラッドフォードアッセイ以外に、ＺＡＰＡはインタクト抗原の量に関する情報を提供する。ＺＡＰＡは、ＤＳ及びＰＩＺＶ試料中のインタクトエピトープ量を堅牢な性能で確実に評価し、本方法が安定性を示し、ミョウバンなどの追加の成分の存在に影響されないことを検証していることを示す。
【0232】
実施例４：ＺＡＰＡによるＰＩＺＶに配合したＤＳバッチの特性評価
次のステップで、ＰＩＺＶに配合された異なるＤＳバッチをＺＡＰＡを使用して分析し、ＣＤ－１マウスでＰＩＺＶによって誘導された免疫応答と比較して、ＺＡＰＡが効力を示すかどうかを評価した。
次のステップで、ＰＩＺＶに配合された異なるＤＳバッチをＺＡＰＡを使用して分析し、ＣＤ－１マウスでＰＩＺＶによって誘導された免疫応答と比較して、ＺＡＰＡが効力を示すかどうかを評価した。
【0233】
したがって、４つの異なるＤＳバッチ（＃１～４）を分析した。ＤＳバッチの総タンパク質濃度は、実施例３に記載したようにブラッドフォードで決定した。ＤＳバッチの連続希釈液をトリス緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｓ２７１－５００）を含有する１０ｍＭヒドロキシメチルアミノメタン塩基（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｔ３９５－５００）、ｐＨ７．６）で調製し、１００μＬ試料中０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１μｇの総抗原となった（同時係属出願ＵＳ６２／８４５，０２４号を参照）。ＰＩＺＶ試料の調製のために、抗原を、試料１００μＬあたり５０μｇのミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、ロット番号５４１４）に吸着させた。希釈試料を、分析まで５±３℃で保存した。
【0234】
次に、異なるバッチからのＰＩＺＶ試料を、ｍＡｂペア＃１を使用してＺＡＰＡで分析した（表５を参照）。ＰＩＺＶ試料に加え、ＰＩＺＶ参照（ストック濃度：２０μｇ／ｍＬ）が設けられた。参照を、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％カゼイン、１ｍｇ／ｍＬデキストラン－５００及び０．５％Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製の１０倍ストックから調製、カタログ番号ＡＬ０００Ｆ）で実施例２で記載したように連続希釈した。
【0235】
白色９６ウェルプレート（１／２面積プレート－９６、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００２２９９）に１ウェルあたり、参照希釈液またはＰＩＺＶ試料あたり１０μＬを添加した。更に、バックグラウンドシグナルを考慮し、１ウェルあたり１０μＬのアッセイ緩衝液を加えることにより、空のウェルを設けた。各参照希釈液ならびに試料及び空の対照は、二重に評価した。ＺＡＰＡは更に、実施例２での記載のように行った。
【0236】
参照希釈液から及びＰＩＺＶ試料からの相対蛍光単位（ＲＦＵ）でのＺＡＰＡシグナル数は、２つの空のウェルから生じる中程度のバックグラウンドシグナルに対して正規化した。参照物質のデータは、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）回帰モデルにより独立して適合された。ＰＩＺＶ参照希釈液中の特定の量のインタクトＤＳに対応するＺＡＰＡシグナル数を、ＰＩＺＶ試料からのＺＡＰＡシグナルに補間し、それによって得られたＺＡＰＡ値を、対応するＰＩＺＶ試料の１００μＬあたりの抗原単位（ＡＵ／１００μＬ）として報告した（図５～図８）。
【0237】
各ＤＳバッチの希釈系列のＺＡＰＡ値は線形応答に従い、ＺＡＰＡ値がエピトープ量と共に線形に増加することから、本アッセイの堅牢な性能が示された（図５～図８）。ブラッドフォード分析により算出された総タンパク質量は対応する希釈液で同じであった（１００μＬあたり０．００１～０．１μｇ）が、ＺＡＰＡ値はＤＳバッチ間で異なり、試料内のインタクトエピトープの量が異なることが示された。例えば、１００μＬあたり０．１μｇの総抗原を含有する試料は、ＤＳバッチ＃１～４から得られた１００μＬの試料あたりのＺＡＰＡ値がそれぞれ約１７０、３７、３５及び６８ＡＵとなった。このデータは、ブラッドフォードアッセイで測定された総タンパク質量は、実施例３と一致して試料内のインタクトエピトープと相関がないことを示している。
【0238】
抗原性を示すこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏのＺＡＰＡ結果を免疫原性及び効力に関連付けるため、異なるＤＳバッチから得られた対応するＰＩＺＶ試料をＣＤ－１マウスにワクチン接種した。したがって、ＰＩＺＶ試料のそれぞれについて、雄マウス４匹及び雌マウス４匹を含む８匹のマウスに、それぞれ１回量のＰＩＺＶ試料（容量１００μＬ）を筋肉内経路でワクチン接種した。免疫化の後の中和Ａｂ力価は、レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）アッセイで測定された。したがって、マウスからの血清試料、ならびに抗ＺＩＫＶ Ａｂ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号ＩＧＲＳ－ＳＥＲ）を欠く陰性対照及び陽性対照（Ｔａｋｅｄａ）を、５６±２℃の水浴で３０±２分間の間、熱不活性化させた。その後、試料ならびに陰性対照及び陽性対照を、アッセイ培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ４１３５）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１００倍ストック、Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２を補充した１ｘ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０５８－０２１））で連続希釈した。白色３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５７０）の１ウェルに希釈液あたり７．５μＬを添加した。ＺＩＫＶ ＲＶＰ粒子（Ｃ、Ｅ、ｐｒＭ及びＭタンパク質を含む、Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）をアッセイ培地で希釈し、３８４ウェルプレートに１ウェルごとに、希釈液７．５μＬを添加した。インキュベーションは、３７±２℃及び５％ＣＯ２で加湿インキュベーターで６０±２分間行った。ベロ細胞は、実施例２でＴＣＩＤ５０アッセイについて記載したように培養した。細胞はトリプシン処理し、回収し、計数前にアッセイ培地に再懸濁させた。１５μＬアッセイ培地の４６２５個の細胞を、１ウェルごとに添加した。インキュベーションは、３７±２℃及び５％ＣＯ２で加湿インキュベーターで７２±２時間行った。次に、Ｒｅｎｉｌｌａ－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２７５０）を、製造元のプロトコルに従って緩衝液で１：１００に希釈した。基質希釈液３０μＬを１ウェルごとに添加し、暗所で１５±２分間インキュベートした。最後に、プレートをＥｎｓｐｉｒｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で分析し、中和Ａｂの半数効果濃度（ＥＣ５０）力価は、異なる希釈液について記録した発光シグナルの回帰によって決定される。
【0239】
注目すべきは、すでにＺＡＰＡ値の違いによって示されているように、同じ抗原量でもＤＳバッチによって中和Ａｂ力価が異なっていたことである。例えば、ブラッドフォードアッセイによる０．０１μｇのＤＳの用量の場合、中和Ａｂ力価は、ＤＳバッチ＃１ではｌｏｇ１０ ＲＶＰ値が約３、ＤＳバッチ＃２～４ではｌｏｇ１０ ＲＶＰ値が約２．１という違いが見られた（図９）。
【0240】
ＺＡＰＡデータとマウスモデルの免疫原性及び効力に関する結果が相関しているかどうかを調べるために、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８．２．０）を用いてデータを解析した。投与量反応曲線（４パラメータロジスティック（４ＰＬ）回帰モデルによる）は、Ｆ検定を使用して比較し、２つのモデルを検討した。第１のモデル（モデル１）は、各アゴニスト（各ＰＩＺＶ希釈系列を意味する）が同じ用量反応曲線を引き出すと結論付けたのに対し、第２のモデル（モデル２）は、各アゴニストが異なる用量反応曲線を引き出すと結論付けている。Ｆ比は、モデル２からモデル１への二乗和の相対的な増加と自由度の相対的な増加の関係を定量化したものである。モデル１が正しければ、１．０に近いＦ比が測定されることが期待される。Ｆ比＞＞１．０の場合、次の２つの可能性がある。すなわち、モデル２が正しいか、またはモデル１が正しいが、ランダムな散布がモデル２を使用してより良い適合をもたらした。ｐ値出力は、この「ランダムな散布」の偶然がどれくらい稀であるかを示している。Ｆ比＞＞１及びｐ値が低い（αより小さい）場合、モデル２はモデル１より有意に良い（正しい可能性が高い）と結論付けられる。ｐ値が高い場合は、モデル２を支持する有力な証拠はないと結論付けられ、モデル１が採用される。
【0241】
ＺＡＰＡで得られたｌｏｇ１０変換したＡＵ値（試料１００μＬ用量あたり）と各希釈試料内のｌｏｇ１０変換した中央ＲＶＰ値を比較すると、Ｆ検定によりモデル１が正しく（Ｆ比＝１．０２４、ｐ値０．４３０１）、つまり、各アゴニストに対して、同じ用量反応曲線を適用できる（各ＰＩＺＶ希釈系列、図１０）。このモデルによると、ＺＡＰＡデータは、適用された異なるＤＳバッチのマウスの免疫応答と良好に相関していると結論付けることができる。
【0242】
まとめると、これらのデータは、異なるＰＩＺＶバッチの分析及び特性評価におけるＺＡＰＡの有用性を明確にする。アッセイ結果が分析試料の免疫原性と良好に相関するため、対応する効力をＺＡＰＡを使用して確実に予測することができる。これに対し、ブラッドフォード法で測定した総抗原量が同じでも、エピトープ及びしたがって試料の効力は異なり得る。エピトープが確実に決定され、ＺＡＰＡシグナルがＰＩＺＶ試料の抗原性、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性、したがって効力に関する直接的な指標となるため、ＺＡＰＡは、こうした変動を考慮する上で有用なツールである。
【0243】
実施例５：ＰＩＺＶバッチの相対的な効力の決定
ＺＡＰＡは、実施例４でＰＩＺＶ試料の抗原性、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性、したがって効力と良好に相関することが示された。したがって、ＺＡＰＡは、例えば実施例４で説明したマウスのように、ＺＡＰＡ値が誘導中和Ａｂ力価（したがって効力）と相関しているＰＩＺＶ参照と比較して、任意のＰＩＺＶバッチの相対的効力を検討するために適用することができる。
ＺＡＰＡは、実施例４でＰＩＺＶ試料の抗原性、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性、したがって効力と良好に相関することが示された。したがって、ＺＡＰＡは、例えば実施例４で説明したマウスのように、ＺＡＰＡ値が誘導中和Ａｂ力価（したがって効力）と相関しているＰＩＺＶ参照と比較して、任意のＰＩＺＶバッチの相対的効力を検討するために適用することができる。
【0244】
このため、２つのＰＩＺＶ試験試料（＃１及び２）と１つのＰＩＺＶ参照（ストック濃度：２０μｇ／ｍＬ）を、ｍＡｂペア＃１を使用してＺＡＰＡで試験した（表５を参照）。試料及び参照を、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％カゼイン、１ｍｇ／ｍＬデキストラン－５００及び０．５％Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製の１０倍ストックから調製、カタログ番号ＡＬ０００Ｆ）で実施例２で記載したように連続希釈した。
【0245】
白色９６ウェルプレート（１／２面積プレート－９６、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００２２９９）に１ウェルごとに、参照希釈液またはＰＩＺＶ試験試料希釈液あたり１０μＬを添加した。更に、バックグラウンドシグナルを考慮し、１ウェルあたり１０μＬのアッセイ緩衝液を加えることにより、空のウェルを設けた。各希釈液または試料及び空は、二重に評価した。ＺＡＰＡは更に、実施例２での記載のように行った。
【0246】
ＺＡＰＡシグナルは、実施例２で述べたように、各希釈系列について独立して４パラメータロジスティック（４ＰＬ）回帰で解析した（図１１）。２つのＰＩＺＶ試験試料の相対的な効力を評価するために、平行線検定（ＰＬＡ）によるグローバル４パラメータロジスティック（４ＰＬ）フィットが実行され、参照物質を参照プロットとして指定した。試験試料＃１は、相対効力０．５００、標準誤差０．０１８及びグローバルフィットに対するＲ２値０．９９７を示し、試験試料＃２は、相対効力０．４０８、標準誤差０．０１９及びグローバルフィットに対するＲ２値０．９９５を示した。
【0247】
要約すると、ＺＡＰＡは、迅速、効率的かつ信頼性の高い方法で特徴付けられた参照と比較した相対効力を評価することにより、異なるＰＩＺＶバッチの監視に常に適用することができる。
【0248】
特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用されている材料の量、分子量などの特性、反応条件などを表現する数字はすべて、すべての場合に用語「約」で修飾されていると理解するべきである。本明細書で使用する場合、「およそ」及び「約」という用語は、１０～１５％以内、好ましくは５～１０％以内を意味する。したがって、特に異議を唱えない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性に応じて変更可能な近似値である。最低限でも、及び特許請求の範囲へ均等論の適用を制限するための試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数の数を考慮して、及び通常の四捨五入法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広範囲で示す数値範囲及びパラメータは近似値であるが、具体例に記載の数値は可能な限り正確に報告する。しかし、いずれの数値も、本質的にそれらそれぞれの試験測定で見いだされる標準偏差から必然的に生じる、一定の誤差を含む。
【0249】
本明細書では、特許や印刷出版物を多数引用している。上述で引用した文献及び印刷出版物のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に独立して組み込まれる。
【0250】
特許出願におけるヌクレオチド及びアミノ酸の配列表の表示に関するＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５内の要件に関して、配列表で使用されるフリーテキストは「合成ペプチド」「合成ヌクレオチド」で繰り返される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】